NL7907287A - Werkwijze ter bereiding van ethanol uit cellulose. - Google Patents

Description

1 * N.O. 28.148 ^ *

Werkwijze ter bereiding van ethanol uit cellulose.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een verbeterde werkwijze voor de bereiding van ethanol uit cellulose. Volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding wordt een cellulose bevattend substraat in één trap omgezét met cellulase-enzymen en met 5 een middel ter bereiding van ethanol.

De bereiding van ethanol uit cellulose en cellulose bevattende materialen in één trap is beschreven in het Amerikaanse oc-trooischrift 3*990*944. Variaties van de werkwijze zijn onder andere beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.009*075* 10 Voorts wordt in de Amerikaanse octrooischriften 3*711*392, 4.094*740 en 4*093*516 de bereiding beschreven van ethanol uit organisch afvalmateriaal·

In het Amerikaanse octrooischrift 4.009*075 wordt het gebruik beschreven van Saccharomyces cerevisiae als de gist, die ge-15 schikt is voor de omzetting van het in situ voortgebrachte glucose tot ethanol. In het Amerikaanse octrooischrift 5*990.944 wordt het gebruik beschreven voor hetzelfde doel van Sac charomyc es cerevisiae en Bhizonus javanicus. In de Amerikaanse octrooischriften 3*711*392, 4.094.740 en 4.093*516 worden geen specifieke gisten beschreven, 20 die glucose tot ethanol zullen omzetten· Tot andere gisten, die bekend zijn vanwege hun vermogen glucose tot ethanol om te zetten, behoren Baker’s gist en Saccharomyces carlsbergensis«

Amano c.s., ”A Strongly Ethanol Assimilating New least”,

The Society of Fermentation Technology, Japan, 53, (1975)* 311 be-25 schrijven de gist Candida brassicae. IFO 1664, ATCC 32196 en de unieke en niet voor de· hand liggende verschillen van andere bekende Candida species. Volgens Amano c.s. vormt het volgende een.beschrijving van Candida brassicae. ATCC 32196.

Cultura in extracto malti: add 25°C, post dies cellulae 30 ovoideae ad cylindricae, 2.5-5^3-17.5^, singulares vel catenatae; pseudomycelium praesens. Sedimentum et pellicula formantur.

Cultura in striis agaro malti: add 17°C, post unum mensera color albidus ad flavalbidus, pagina opaca, elevata, mollis et laevis vel crispulata. Pseudomycelium praesens abundanter.

35 Ascosporae, ballistosporae et teliosporae nullae.

Fermentatio: glucosum.

Assimilatio originum carbinum: glucosum, galactosum, sucrosum, maltosum (valde exigue), raffinosum (exigue), D-xylosum 790 72 8 7 2 tr · (exigue), ethanolum, glycerolum, acidum lacticum et acidum succinicum.

Kalii nitras non assimilatur, arbutinum non finditur, ureum non finditur. Vitamina addita non necessaria sunt.

5 Temperatura maxima crescentiae Kb - if5°C.

TYPHUS: culture.RIFY E-17 in collectione Research Institute of Fermentation, Yamanashi University, Kofu, isolata e flio Brassica oleracea var. capitata in Kofu, Japonia, 1973

Groei in moutextract: na 3 dagen bij 25°C zijn de cellen 10 kort ovaal tot cilindervormig, (2,5-5)x(3-17»5)yum, enkelvoudig, in paren of in ketens (fig. 1). Pseudomycelvormige cellen zijn gevormd (fig. 2). Een sediment en een dun gerimpeld vliesje zijn gevormd.

Groei op moutagar: na een maand bij 17°C is de streek cul-15 tuur wit tot enigszins geelachtig, mat, verhoogd, zacht en glad of enigszins geplooid.

Plaatjes cultures op aardappelagar: een pseudomycelium met een boomachtige vorming is overvloedig gevormd (fig. 3 en^). Vorming van sporen: geen ascospore, ballistospore of 20 teliospore is gevormd:

Fermentatie:

Glucose + Trehalose

Galactose - Lactose

Sucrose - Raffinose 25 Maltose - Xylose

Assimulatie van koolstofverbindingen:

Glucose + D-Ribose

Galactose + L-Rhamnose - L-Sorbose - Ethanol + 30 Sucrose + Glycerol +

Maltose vw Erytritol

Cellobiose - Ribitol

Trehalose - Galactitol

Lactose - D-Mannitol 35 Melibiose - D-Glucitol

Raffinose w α-Methyl-D-glucoside -

Melezitóse - Salicine

Inuline - DL-melkzuur +

Oplosbaar zetmeel - barnsteenzuur +

IfO D-Xylose w .Citroenzuur 7907287 3 - L-Arabinose — Inositol - D-Arabinose

Assimilatie van kaliumnitraat: afwezig.

Groei in een vitamine-vrij milieu: goede groei.

5 Natriumchloride-tolerantie: 14 - 15 % (gew./voL).

Maximum temperatuur voor de groei: 43 - 45°C.

Splitsing van arbutine: negatief.

Hydrolyse van ureum: negatief.

Gevonden werd dat Candida brassicae. ATCC 32196, nieuwe en 10 niet voor de band liggende voordelen verschaft ten opzichte van de gebruikelijke gisten bij het orazetten tot ethanol van de in situ glucose verkregen door versuikering van cellulose-bestanddelen bij een gelijktijdige versuikerings-fermentatiereactie.

Derhalve wordt de werkwijze volgens het Amerikaanse octrooi-15 schrift 3*990.944 verbeterd door het gebruik van Candida brassicae in plaats van Saccharomyces cerevisiae of Rhizopus javanicus.

Zoals hiervoor beschreven en in de hierin beschreven stand der techniek met betrekking tot de gelijktijdige versuikerings-fer-mentatie wordt de onderhavige uitvinding gekenmerkt door de gelijk-20 tijdige inwerking van een'cellulase en een alcohol producerend mi-croorganisme op een substraat bestaande uit cellulose of een produkt, dat in hoofdzaak uit cellulose bestaat.

Tot de cellulose bevattende substraten, die geschikt zijn als uitgangsprodukten voor de onderhavige uitvinding, behoren ge-25 zuiverde cellulose, landbouwkundig voortgebrachte produkten zoals katoen, hout, rijststro, tarwestro, maisaren (maïskolven zonder korrels) en andere produkten in hoofdzaak bestaande uit cellulose zoals krantenpapier, geribbeld papier, tijdschriftenpapier en afval-papier. Om deze produkten op doelmatige wijze te kunnen gebruiken 30 als substraten voor de versuikeringsreactie bij aanwezigheid van cellulase, is het gewenst deze fijn te maken en te desintegreren.

Voor de hydrolyse van deze cellulose houdende substraten zal het gebruik van in de handel verkrijgbaar cellulose voldoende zijn.'

Een enzymatisch preparaat zoals bijvoorbeeld Cellulase Onotsuga 35 kan gebruikt worden. Een vloeistof, die een cellulase bevat, namelijk een cultuurvloeistof van een cellulase producerend microorganisms, zoals bijvoorbeeld een vloeibare cultuur van Trichoderma reesei QM9414 (Trichoderma viride QM9414) kan eveneens gebruikt worden.

40 Het alcohol producerende- microorganisme, dat gelijktijdig 7907287

* V

-4- werkt op de hexosen gevormd door de aftraak van cellulose is de gist Candida brassicae, ATCC 32196.

Teneinde het voor het cellulosesubstraat mogelijk te maken gelijktijdig te reageren met een cellulase en het Candida hrassicae, 5 wordt een water bevattende suspensie, die 1-30 gew.% cellulose of een produkt in hoofdzaak bestaande uit cellulose bevat, bereid en thermisch gesteriliseerd om dienst te doen als substraat, wordt een cellulase (of een cellulase bevattende vloeistof) toegevoegd aan het substraat en wordt tegelijkertijd het Candida brassicae, vooraf ge-10 kweekt, daaraan toegevoegd, zodat de reactie anaëroob zal verlopen bij temperaturen van ongeveer 30 tot 45°C.

Een extra voordeel is gebleken uit het gebruik van het organisme Candida brassicae, ATCC 32196. Zowel tijdens het kweken van het organisme voorafgaande aan de inoculatie in de gelijktijdige versui-15 keringsfermentatie en tijdens de fermentatie alleen en gelijktijdige versuikeringsfermentatie groeit het organisme tot een grotere bio-massa-opbrengst en meer in het bijzonder tot een groter aantal cellen per tijdseenheid dan de gebruikelijke gisten voor de fermentatie van hexose tot alcohol. Derhalve verschaft kweking van C,brassicae , 20 ATCC 32196 in een voedingsmiddelmilieu bij temperaturen van 30 tot 45°C meer actieve cellen voor inoculatie in het gelijktijdige ver-suikeringsfermentatiereactiemengsel en zijn biomassa-resten groter na fermentatie of gelijktijdige ver suiker ings.fermentatie, die een grotere bijproduktverdienste mogelijk maakt in de economische om-25 standigheden van de bereiding van ethanol uit cellulose, Het bio-massa-produkt is een. voedzaam diervoeder met groot proteinegehalte.

Toorts worden hoge celopbrengsten gerealiseerd in een ruimtempe-ratuurtraject. Gebleken is, dat buitengewoon grote celopbrengsten verkregen kunnen worden bij temperaturen tot 42 -43°C» een tempera-30 tuur, waarbij de meeste gisten zich niet zullen voortplanten.

Een beter begrip en een betere waardering van de uitvinding wordt verschaft door de tekeningen en de daarbij horende beschrijving, die uitsluitend ter toelichting is, niet tot beperking van de uitvinding.

35 In alle figuren stellen de krommen een behoorlijke interpre tatie voor van de activiteit als functie van de temperatuur, waarbij de activiteit werd waargenomen. De krommen werden getekend ter illustratie van de verzamelde gegevens en specifieke punten zijn experimenteel bepaalde waarden.

40 In. elke kromme worden de specifieke punten als volgt toege- 790 7 2 8 7 -5- ** licht:

Cirkels (O ) Candida brassicae ATCC 52196 driehoeken (Δ ) Saccharomyoes oerevisiae ATCC 4126 kruisen .(^^) Saccharomyoes oerevisiae ATCC 4132 5 vierkanten (Q) Saccharomyoes carlsbergensis IAM 4787 rniten (O ) Saccharomyoes cerevisiae ATCC 24858

Fig. 1 stelt de vormingssnelheid van ethanol voor bij een periode van 24 uren bij de aangegeven temperatuur voor verschillende gisten, die gekweekt werden in een 100 g per liter glucose bevattend.

10 milieu dat de gebruikelijke groeibestanddelen bevat.

Fig. 2 stelt de feitelijke glucoseconcentratie voor van een gistcultuur, die gekweekt is in een voedingsmiddelmilieu, dat 20 g per liter gLucose bevat 12 uren na inoculatie en reactie bij de verschillende aangegeven temperaturen.

15 Pig. 3 stelt het aantal gistcellen voor in de biomassa-rest na 24 uren bij de aangegeven temperaturen van een gelijktijdige ver-suikeringsfermentatie van cellulose volgens de werkwijze van het Amerikaanse octrooischrift 3«990.944 na inoculatie met een equivalente concentratie cellulase afkomstig van Triohoderma reesei QM 9414 en 20 identieke aantallen cellen van de verschillende gisten.

Fig. 4 stelt de massaconcentratie voor van celeenheden verkrijgbaar na 12 uren groei van de geïdentificeerde gist op het glucose bevattende voedingsmilieu, zoals hiervoor gedfinieerd voor fig. 2, bij de verschillende temperaturen. De figuren 3 en 4 laten de toege-25 voegde celgroei-eigenschappen zien van Candida brassicae ATCC 32196.

Pig. 5 stelt de totale ethanolopbrengst voor na 24 uren van een gelijktijdige versuikeringsfermentatie uitgevoerd bij verschillende temperaturen. De krommen geven aan dat bij temperaturen van 37» 5-40°C de gist Candida brassicae ATCC 32196 ongeveer equivalent is 50 aan de gebruikelijke Saccharomyoes cerevisiae en Saccharomyoes oarls-bergensis. evenwel blijft bij temperaturen boven 40°C de activiteit van de gisüt hoog zonder uitputting in de alcoholproduktie. Aangezien de gelijktijdige versuikeringsfermentatie een totaal exotherm proces is, dat in het algemeen wordt uitgevoerd tussen 37,5 en 40°C, is het 35 vermogen van de gist de activiteit te handhaven boven 40°C commercieel doelmatig omdat kostbare en onnatuurlijke koelinrichtingen niet vereist zijn en een partiële op hol slaande reactie toegelaten kan worden zonder verlies aan alcoholopbrengst.

Fermentatie en gistproduktie wordt uitgevoerd door toevoeging 40 van een water bevattende suspensie van de gist aan een voedingsmid 790 7 28 7 -6- delmilieu, dat glucose 2% gistextract 0,5% moutextract 0,5% si 5 pepton 0,5% bevat met langzame tot middelmatige roering (120 omwentelingen per minuut) en een beluchtingssnelheid van 1 v/v/m. Be pH wordt op 5>0 gehandhaafd door .onderbroken toevoeging van genormaliseerde reagentia. Cellen worden geisoleerd door centrifugeren na een groei van 10 24 uren bij 38°C en de celkoek wordt gebruikt voor de fermentatie van glucose of bij een gelijktijdige versuikeringsfermentatiereac-tie volgens de werkwijze van het Amerikaanse octrooischrift 5.990.944· 7907287

Claims (3)

1. Werkwijze ter bereiding van alcohol uit cellulose door de gelijktijdige toevoeging van cellulase en een gist aan een cellulose bevattend produkt en afscheiding en winning van de verkregen 5 ethanol, met het kenmerk, dat men als gist Candida brassicae ATCC 32196 toepast.

2. Werkwijze ter bereiding van ethanol uit fermenteerbare suikers door fermentatie, met het kenmerk, dat men als gist Candida brassicae ATCC 32196 toepast. 10

3» Werkwijze ter bereiding van gistproteine uit de kweek van een fermentatiegist in een voedingsmiddelmilieu, met het kenmerk, dat men als gist Candida brassicae ATCC 32196 toepast · * * * * * * * 790 7 28 7 *