CN102007206A - 葡萄糖制备用酵母及使用其的葡萄糖制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酵母，所述酵母具备纤维素分解能力和葡萄糖蓄积能力，所述纤维素分解能力是在细胞外分解纤维素的能力，所述葡萄糖蓄积能力是使葡萄糖在反应液中蓄积的能力，所述葡萄糖是在反应液中酵母与纤维素接触时利用上述纤维素分解能力由纤维素生成的。本发明提供一种由纤维素制备葡萄糖的葡萄糖制备方法，包括下述步骤：使上述酵母在反应液中与纤维素接触的步骤；将通过上述酵母与纤维素的接触而蓄积在反应液中的葡萄糖从反应液中分离并回收的步骤。

Description

葡萄糖制备用酵母及使用其的葡萄糖制备方法
技术领域
本发明涉及葡萄糖制备用酵母及使用其的葡萄糖制备方法。
背景技术
近年来，从资源的有效利用及环境保护这两方面考虑，作为化石资源的替代品，生物质资源(biomass resources)的利用备受关注。其中，考虑到粮食用与工业用的生产平衡，目前为止集中开发了利用木材等以纤维素为主要成分的非可食(工业用)生物质的方法。上述利用工业用生物质的技术中，对从工业用生物质中分离或精制纤维素的步骤、和将所得纤维素分解后转化为单糖的糖化步骤进行了大量的技术开发。
糖化大致分为酸糖化法和酶糖化法。其中，酶糖化法为常温·常压反应，而且不使用危险药品且没有副反应，因此与酸糖化法相比，从降低能量消耗及环境负荷方面考虑，较为优选。
酶糖化法使用分解纤维素的酶(纤维素酶)来进行糖化。利用精制的纤维素酶由纤维素原料制备葡萄糖，已知有下述方法：使用木霉(Trichoderma)属丝状菌(非专利文献1)、或曲霉(Aspergillus)属丝状菌(非专利文献2)等微生物分泌的酶。但是，使用精制酶的步骤中，由于难以分离生成的葡萄糖溶液和酶，所以结果不得不舍去酶，在工业上于成本方面是不利的，考虑到以葡萄糖为原料的常用化学品的生产时，必须进行创新的工艺开发。
另一方面，利用基因重组技术，可以使微生物生产大量的纤维素酶。但是，存在下述缺点：在微生物的菌体内生产纤维素酶时，作为基质的纤维素原料与纤维素酶无法接触，无法进行糖化。
作为克服了上述缺点的技术，近年来开发了称作武装酵母(Arming yeast)的、在细胞表面呈递酶的酵母(非专利文献3)。上述技术是使用酵母作为酶的载体的技术，可以利用通常进行的酵母培养方法来生成酶。进而，由于在细胞表面呈递酶，所以存在于反应液中的基质可以与酶接触。进而，上述武装酵母具有凝集性和沉淀性，可以容易地从反应液中回收。因此，通过将酵母回收，可以简便地将酶与生成的葡萄糖溶液分离，将酶进行再利用。
至今为止，开发了在表面呈递脂肪酶来制备光学活性体的技术(专利文献1)、和将分解淀粉的葡糖淀粉酶呈递、直接由淀粉生成乙醇的酵母(非专利文献4)。进而，报道了一种武装酵母，所述武装酵母使纤维素酶呈递在细胞表面，从纤维素原料中直接发酵生成乙醇(非专利文献5及专利文献2)。但是，非专利文献5中报道了在未检测到葡萄糖的情况下，将生成的葡萄糖立即用于乙醇生产。如上所述，虽然存在由纤维素原料生成葡萄糖的微生物，但是由于生成的葡萄糖是微生物生命活动中重要的碳源，所以会被该微生物迅速地代谢，难以使葡萄糖蓄积在反应液中。
非专利文献1：Montenecourt，Trends in Biotechnology，Vol.1，No.5，pp.156-161(1983)
非专利文献2：Takada et.al.，Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，62(8)，pp.1615-1618(1998)
非专利文献3：Ueda et.al.，Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol.90，No.2，pp.125-136(2000)
非专利文献4：Teik Seong Khaw et.al.，Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol.103，No.1，pp.95-97(2007)
非专利文献5：Fujita et.al.，Applied and Environmental Microbiology，Vol.70，No.2，pp.1207-1212(2004)
专利文献1：日本特开平11-290078号公报
专利文献2：国际公开第01/79483号说明书
发明内容
如上所述，使用精制酶的方法的工业化通常在成本方面不利。另外，在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母，因酵母的糖代谢功能而立即利用生成的葡萄糖，无法蓄积葡萄糖。因此，迫切期望开发出显示纤维素分解活性、且不利用生成的葡萄糖的生物催化剂。除此之外，还迫切期望开发出能够重复使用的酶。
本发明的目的在于提供葡萄糖制备用酵母、及使用其的葡萄糖制备方法，所述葡萄糖制备用酵母可以以高收量高效地由纤维素制备葡萄糖、且可以重复使用。
本发明是鉴于上述情况而完成的，本发明提供葡萄糖制备用酵母及使用其的葡萄糖制备方法。
本发明的第一方案提供一种酵母，所述酵母具备纤维素分解能力和葡萄糖蓄积能力，所述纤维素分解能力是在细胞外分解纤维素的能力，所述葡萄糖蓄积能力是使葡萄糖在反应液中蓄积的能力，所述葡萄糖是在反应液中酵母与纤维素接触时利用上述纤维素分解能力由纤维素生成的。
本发明的第二方案提供一种由纤维素制备葡萄糖的葡萄糖制备方法，所述方法包括下述步骤：使上述酵母在反应液中与纤维素接触的步骤；将通过上述酵母与纤维素的接触而在反应液中生成及蓄积的葡萄糖从反应液中分离并回收的步骤。
根据本发明，可以提供葡萄糖制备用酵母及使用其的葡萄糖制备方法，所述葡萄糖制备用酵母可以以高收量高效地由纤维素制备葡萄糖，且可以重复使用。
附图说明
[图1]为表示本发明的实施例中在各温度下由武装酵母导致的葡萄糖消耗量变化的曲线图。
[图2]为表示本发明的实施例中在各温度下由武装酵母导致的葡萄糖蓄积量变化的曲线图。
具体实施方式
<葡萄糖制备用酵母>
本发明的酵母为具备纤维素分解能力和葡萄糖蓄积能力的酵母，所述纤维素分解能力是在细胞外分解纤维素的能力，所述葡萄糖蓄积能力是使葡萄糖在反应液中蓄积的能力，所述葡萄糖是在反应液中酵母与纤维素接触时利用上述纤维素分解能力由纤维素生成的。
由于本发明的酵母(以下称作葡萄糖制备用酵母)具有细胞外的纤维素分解能力、和在反应液中与纤维素接触时使葡萄糖在反应液中蓄积的葡萄糖蓄积能力，所以可以在反应液中在细胞外生成葡萄糖，并使其蓄积在反应液中。
另外，葡萄糖制备用酵母本身具有细胞外的纤维素分解能力，因此与作为化合物的酶不同，通过将酵母回收再利用，可以容易地对酶进行再利用。
因此，可以在成本方面有利地、以高收量制备葡萄糖。
本发明中的“步骤”，不仅为独立的步骤，而且在无法与其他步骤明确地区分时，只要可以实现该步骤所期望的作用则也属于该步骤。
本说明书中，用数值范围表示时，只要没有特别说明，则表示含有其前后记载的数值分别作为最小值及最大值的范围。
本发明中所谓纤维素，是指D-葡萄糖经β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子物质，具有还原性和非还原性的两端。纤维素分子在纤维素纤维中高度排列形成结晶区域，但上述排列在多处发生紊乱，形成非结晶区域或与其类似的区域。通过X射线法，可知天然纤维素具有约70％的结晶度，再生纤维素具有约40％的结晶度。
对于纤维素的结晶结构，在天然纤维素中均显示称作纤维素Ⅰ的结构，不仅连接成链状，而且还横向结合形成束状，形成微原纤维。目前，纤维素存在4种结晶形态，通常大致分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在高浓度的盐溶液、酸或碱中使纤维素Ⅰ较强地膨润、溶解后，再次形成纤维素，为再生纤维素，该再生纤维素具有纤维素Ⅱ的结晶形。将纤维素Ⅰ或Ⅱ浸渍在氨水中缓慢地再生、或者将与胺类的加成化合物分解所得的纤维素，具有纤维素Ⅲ的形态。另外，纤维素Ⅳ为将纤维素Ⅱ在甘油中于250℃以上的高温下进行加热等得到的结晶结构。本发明中的纤维素包括呈现上述任一种纤维素结构的全部纤维素。
另外，本发明中的纤维素包含纤维素衍生物。例如可以选择乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、硝酸纤维素、硫酸纤维素、磷酸纤维素等纤维素酯；甲基纤维素、乙基纤维素、苄基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素等纤维素醚；及粘胶等。
本发明中的纤维素分解，是指切断纤维素的糖苷键的反应，被切断的糖苷键可以存在于结晶区域、非结晶区域中的任一区域，还可以在纤维素纤维的非还原末端、还原末端及它们中间。只要纤维素酶或其他催化剂能够吸附在纤维素表面、发挥切断分子链的功能即可，对纤维素结晶的大小没有限定。
作为本发明中的具备在细胞外分解纤维素的纤维素分解能力的酵母，只要在细胞外具有纤维素分解酶活性即可，作为上述酵母，可以举出在表层呈递纤维素分解酶的武装酵母。通过使用武装酵母，可以有效地对酵母表面赋予纤维素分解能力，同时可以容易地进行酶处理。
(武装酵母)
本发明中所说的武装酵母是指，通过使各种功能性蛋白质或肽与局部存在于细胞表层的蛋白质融合，使其在细胞表层呈递，由此而被附加了起因于该被呈递的蛋白质或肽的功能性的酵母细胞。
关于上述武装酵母的制作方法，根据局部存在于酵母细胞表层的蛋白质种类，目前为止已知有几种方法。
例如，使用α-凝集素作为局部存在于细胞表层的蛋白质的方法。所述方法为：使编码α-凝集素的基因和编码目标功能性蛋白质的基因融合使其表达，由此使功能性蛋白质呈递在细胞表层，所述编码α-凝集素的基因在C末端区域带有GPI(糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol))锚定附着信号。另外，还有使用FLO蛋白质作为局部存在于细胞表层的蛋白质的方法。FLO蛋白质为酵母的凝集性蛋白质，通过疏水键与细胞壁结合。通过使编码该FLO蛋白质的基因(Flo1)和编码功能性蛋白质的基因融合、表达，将功能性蛋白质呈递在表层。除此之外，还有使用Pir(蛋白质内部重复(Protein Internal Repeat))作为局部存在于细胞表层的蛋白质的方法。Pir为与酵母的细胞壁共价键合的蛋白质，与上述方法同样地通过使其与功能性蛋白质融合并表达，可以将功能性蛋白质呈递在细胞表层。
本发明中的武装酵母可以使用上述任一种方法制作。
作为本发明中的武装酵母，优选使用α-凝集素制备得到的酵母，其原因在于由此得到的酵母能够稳定地将分子量大的蛋白质呈递在表层，例如优选使用Appl.Environ.Microbiol.，Vol.70(2)，pp.1207-1212(2004)中记载的MT8-1/pBG211/pEG23u31H6/pFCBH2w3株的武装酵母。
另外，作为酶的载体的酵母，只要为可以实施武装的酵母即可，没有特别限定，可以举出例如酵母属(Saccharomyces)及毕赤酵母属(Pichia)等。酵母中，如果为有实际效果的酵母属，则可以期待稳定的酶活性。
作为呈递在细胞表层的功能性蛋白质，本发明的武装酵母优选具有分解纤维素的纤维素酶。
所谓纤维素酶，通常是指β1，4-葡聚糖酶，但在本发明中是指切断β1，4-糖苷键、由纤维素生成葡萄糖的一组酶。例如可以举出内切β1，4-葡聚糖酶(有时也称作羧甲基纤维素酶)、外切β1，4-葡聚糖酶(有时也称作纤维二糖水解酶)、β-葡糖苷酶等。
对上述酶的来源没有特别限定，例如可以举出木霉属菌、曲霉属菌、热袍菌(Thermotoga)属菌、念珠菌(Candida)属菌、酵母属菌、腐质霉(Humicola)属菌、耙菌(Irpex)属菌、踝节菌(Talaromyces)属菌、平革菌(Phanerochaete)属菌、Piromyces属菌、Orpinomyces属菌、Neocallimastix属菌、链霉菌(Streptomyces)属菌、青霉(Penicillium)属菌、隐球菌(Cryptococcus)属菌、纤维单胞菌(Cellulomonas)属菌、梭菌(Clostridium)属菌、嗜热裂孢菌(Thermobifida)属菌、杆菌(Bacillus)属菌、嗜热子囊菌(Thermoascus)属菌、壳梭袍菌(Fusicoccum)属菌、瘤胃球菌(Ruminococcus)属菌、弧菌(Vibrio)属菌、昆虫等。组合使用各种酶时，酶的来源可以相同也可以不同。
本发明中，上述纤维素酶可以单独使用或组合2种以上使用，从能够有效地分解纤维素或纤维素的分解中间化合物、生成葡萄糖的观点考虑，特别优选组合内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶及β葡糖苷酶。
使用多种纤维素酶时，只要使至少1种纤维素酶呈递到酵母的细胞表层即可，还可以与游离的纤维素酶同时使用。从酶的回收效率及再利用效率的观点考虑，优选使用将所用纤维素酶呈递到细胞表层的酵母。使用游离的纤维素酶时，也可以直接采用在所用纤维素酶中通常使用的浓度。
本发明中的酵母，除具有上述纤维素分解能力之外，还具有使葡萄糖蓄积在反应液中的葡萄糖蓄积能力。此处所谓“使葡萄糖蓄积在反应液中”，是指对在细胞外有效地得到的来自纤维素的葡萄糖不进行有效的利用。即，即使葡萄糖位于酵母细胞外、以与酵母可接触的状态存在，也可以不被酵母利用残留，因此可以在反应液中确认到葡萄糖的量。作为此时的葡萄糖的量，例如可以为，在存在有5g/L葡萄糖的反应液中以3％(w/v)的浓度使武装酵母接触、经过60小时以上后，存在于反应液中的葡萄糖为0.3g/L以上。
作为不对葡萄糖进行有效的利用的酵母，优选葡萄糖代谢活性被降低的酵母。由此，生成的葡萄糖可以降低酵母的消耗量，可以有效地将葡萄糖蓄积在反应液中。
此处，所谓葡萄糖代谢活性降低，是指对象酵母的葡萄糖摄取速度小于该酵母的最大葡萄糖摄取速度。上述酵母的葡萄糖摄取速度的降低可以为暂时性降低，也可以为半永久性降低。此处，葡萄糖摄取速度为最大时，是在具有充分的营养源的培养基中在最佳温度条件下一边进行充分的通气一边对该酵母进行培养时的速度，上述情况，例如是指在YPD培养基中于30℃～35℃的培养温度下一边进行充分的通气一边培养该酵母，将经充分增殖的该酵母回收，将其悬浮于含有葡萄糖的水中，在30℃～35℃的温度下培养的情况。
另外，本发明中的葡萄糖代谢活性的“降低”，不仅包括酵母固有的葡萄糖代谢活性与通常状态相比降低，还包括失去代谢活性完全不摄取葡萄糖的情况。
作为如上所述葡萄糖代谢活性降低的酵母，可以举出通过热处理葡萄糖代谢活性降低被诱导的酵母、通过表面活性剂处理葡萄糖代谢活性降低被诱导的酵母、通过暴露于抗生素或UV下葡萄糖代谢活性降低被诱导的酵母等。
用于诱导生成葡萄糖代谢活性降低的酵母的上述热处理，是指在高于该酵母的最适生长温度的温度下进行的处理。如果为高于最适生长温度的温度，则可以确实地降低葡萄糖代谢活性，故优选。此处，所谓“酵母的最适生长温度”，是指对象酵母的增殖速度为最大时的温度。所谓高于酵母的最适生长温度的温度条件，根据所使用的酵母种类而不同，通常为高于30℃的温度，从降低葡萄糖消耗的观点考虑，优选高于35℃的温度，从确实地抑制葡萄糖消耗的观点考虑，更优选为40℃以上。
另一方面，从维持纤维素酶活性的观点考虑，较优选为高于酵母的最适生长温度的温度且低于纤维素酶的变性温度。由此，可以确实地诱导葡萄糖代谢降低，同时可以维持高的酶活性。此处，所谓纤维素酶的变性温度，是指纤维素酶经热变性丧失其活性的温度。因为根据纤维素酶的种类而最适温度不同，所以可以根据使用的纤维素酶适当选择，例如为热袍菌属(Themotoga sp.)纤维素酶的情况下，优选为105℃以下的温度。另外，从确实地抑制大多数纤维素酶活性降低的观点考虑，优选为90℃以下，更优选为80℃以下，最优选为70℃以下。
另外，在诱导葡萄糖代谢活性降低的酵母中，为了充分地发挥纤维素酶的酶功能，优选将作为载体的酵母形态维持为正常。因此，更优选为高于酵母的最适生长温度的温度且低于酵母的热变性温度。此处所谓酵母的热变性温度，是指酵母经热变性无法维持正常形态的温度。根据酵母的种类而不同，但从确实地维持酵母形态的观点考虑，优选为70℃以下，更优选为60℃以下，最优选为50℃以下。例如为使来自里氏木霉(Tricoderma reesei)的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β葡糖苷酶呈递在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表层的武装酵母的情况下，优选为50℃以下的温度。
由此，根据能够维持酵母形态且能够维持纤维素酶活性的温度范围，在40℃～70℃、优选40℃～60℃、更优选40℃～50℃的热处理下，可以形成葡萄糖蓄积能力被诱导的酵母。如上所述，从确实地诱导葡萄糖代谢降低、同时以高收量将葡萄糖蓄积在反应液中的观点考虑，最优选通过40℃至50℃的范围的热处理能够被诱导的葡萄糖蓄积能力。
另外，通过上述热处理进行的诱导，根据温度及酵母种类等而不同，通常可以为1～120小时，从可以确实地进行诱导的观点考虑，可以为3～48小时。
为了诱导生成葡萄糖代谢活性被降低的酵母而利用上述表面活性剂进行处理时，所使用的表面活性剂可以为离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂中的任一种，较优选对生物体分子产生不良影响的可能性低的非离子型表面活性剂。
作为上述非离子型表面活性剂，从葡萄糖代谢降低诱导效果的观点考虑，优选酯型非离子型表面活性剂、酯·醚型非离子型表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、失水山梨糖醇倍半油酸酯、4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、失水山梨醇单油酸酯。上述表面活性剂例如以Nonidet P-40、Tween85、Aracel C、TritonX-100、Span80等商品名被销售。
作为用于诱导葡萄糖代谢活性降低的表面活性剂的浓度，可以为0.015(w/v)以上10％(w/v)以下，优选为0.02～5％(w/v)，更优选为0.05～1％(w/v)。需要说明的是，表面活性剂的浓度中的符号％为相对于进行表面活性剂处理的处理液整体容量的质量％。如果表面活性剂的浓度在上述范围内，则不会较大地损害纤维素酶的活性，可以确实地诱导代谢活性的降低。使酵母与上述浓度的表面活性剂接触1小时～120小时，从确实地进行诱导的观点考虑，接触3小时～48小时，由此可以得到上述葡萄糖制备用酵母。
为了诱导生成葡萄糖代谢活性被降低的酵母而使用的上述抗生素的种类及浓度、或UV照射的条件，通常可以直接采用能够不杀死酵母且使生物体活性降低的条件。
作为降低了葡萄糖代谢活性的酵母，从成本及处理效率的方面考虑，较优选通过热处理、表面活性剂处理、或它们的组合被诱导的酵母。热处理和表面活性剂处理可以分别单独进行，也可以将两者先后进行，还可以将两者同时进行。由此，可以容易地得到具有上述纤维素分解能力、且降低了葡萄糖代谢活性的酵母。
<葡萄糖制备方法>
本发明的葡萄糖制备方法包括下述步骤：使上述葡萄糖制备用酵母在反应液中与纤维素接触的步骤(接触步骤)；将通过上述酵母与纤维素的接触而在反应液中生成及蓄积的葡萄糖从反应液中分离并回收的步骤(分离·回收步骤)。
根据该方法，在细胞外有效地由纤维素生成葡萄糖，同时将生成的葡萄糖蓄积在反应液中，因此与使用不具有葡萄糖蓄积能力的酵母时相比，可以有效地制备葡萄糖。
本发明中使用的葡萄糖制备用酵母在用于该葡萄糖制备方法之前，也可以包括使酵母增殖到规定数量的前培养步骤。
上述前培养的条件，只要能够将武装酵母等葡萄糖制备用酵母增殖达到目标的菌体重量即可。用于培养的培养基，只要以通常用于酵母培养的基本培养基为主体即可，根据武装酵母的种类，为通常使用的培养基时，可以使用任一种。
上述基本培养基只要为含有碳源、氮源、无机离子及根据需要含有其他微量成分的培养基即可，没有特别限定。作为碳源，可以适当使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类；富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸；甲醇、乙醇、丙三醇等醇类；等。此处作为碳源，优选比葡萄糖更廉价的碳源，例如可以使用废糖蜜等或纤维素原料等来自植物的原料。
作为通常的碳源，可以举出淀粉、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖等糖类，或含有大量上述成分的木材分解产物或纤维素水解物等。进而，来自植物油的甘油及脂肪酸也属于本发明的碳源。
作为本发明中的来自植物的原料，可以优选使用谷物等农作物、玉米、大米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等，其作为原料的使用形态可以为未加工品、压榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以仅为上述碳源的形态。
作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、硝态氮(nitrate nitrogen)、氨气、氨水、蛋白质水解物等无机及有机氮源等。作为无机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子、锰离子等。作为有机微量成分，可以适当使用维生素、氨基酸等及含有它们的酵母提取物、胨、聚胨、玉米浆、酪蛋白分解物等。前培养步骤为独立于其他步骤的步骤时，也可以使用葡萄糖，由此，可以更有效地使酵母增殖。前培养的培养液中含有葡萄糖时，从前培养步骤的培养液中将酵母集菌、回收后，用于其他步骤。
另外，在培养基中也可以以常用的量含有添加到通常微生物的培养基中的其他添加成分，例如抗生素等。为了抑制培养时的发泡，也可以添加适量的消泡剂。
作为本发明中使用的培养基，可以举出以水性介质为基础的液体培养基、及以琼脂等固相为基础的固体培养基，如果从用于工业生产的方面考虑，则优选液体培养基。作为构成液体培养基的水性介质，可以使用蒸馏水、缓冲液等通常使用的水性介质。
作为用于培养葡萄糖制备用酵母的培养条件，没有特别限制，例如可以在需氧或厌氧条件下在pH4～9、优选pH6～8、温度20℃～40℃、优选25℃～35℃的范围内。需要说明的是，将葡萄糖制备用酵母作为武装酵母时，可以将武装酵母在与通常的酵母同样的培养条件维持并增殖。
本发明的制备方法中，在接触步骤之前，还可以包括用于制作上述葡萄糖制备用酵母的前处理步骤。由此，可以连续进行葡萄糖制备用酵母的制作和利用该酵母制备葡萄糖。
作为前处理步骤，优选上述热处理、表面活性剂处理及将它们组合的处理，对于这些处理，也可以直接使用用于制备上述各葡萄糖制备用酵母的条件。
作为前处理步骤中使用的前处理液，只要不破坏纤维素分解能力即可，可以举出水(灭菌水)、磷酸缓冲液(PBS)、Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl)、柠檬酸缓冲液、柠檬酸磷酸缓冲液等各种缓冲液。
上述前处理液的温度、pH可以根据使用的纤维素酶的活性适当选择。从上述观点考虑，例如从维持木霉属纤维素酶活性的观点考虑，较优选50～200mM的磷酸缓冲液(pH4～7)。需要说明的是，前处理液，只要不影响酵母的葡萄糖代谢活性降低即可，也可以为通常的培养中使用的培养液。
采用上述前处理步骤，可以降低葡萄糖代谢活性。
前处理时间根据武装酵母表层呈递的纤维素酶的种类而不同，因此不能一概地限定时间，但通常前处理时间越长，武装酵母的葡萄糖利用能力越降低，另一方面，从维持纤维素酶的酶活性的观点考虑，优选进行限制。例如从上述观点考虑，为来自木霉属(Trichoderma)的纤维素酶的情况下，优选3～24小时的前处理。
需要说明的是，将前培养步骤后的上述武装酵母用于前处理步骤时，为了抑制在细胞表面呈递的纤维素酶的分解，优选从培养液中集菌，将其悬浮于上述反应液例如水或适当的缓冲液中后，用于前处理步骤。由此，可以确实地抑制由酵母分泌的蛋白酶等蛋白质分解酶导致的纤维素酶的分解。
(接触步骤)
本发明的接触步骤中，使上述本发明中的酵母在反应液中与纤维素接触。此处的接触，可以在含有纤维素的反应液中添加酵母，也可以在含有酵母的反应液中添加纤维素。
本发明中，用作葡萄糖制备原料的纤维素，除单纯的纤维素之外，还可以举出含有纤维素作为构成成分的木材、甘蔗渣、玉米等较宽范围的生物质，由木材等得到的纸浆也包括在其中。
纸浆为从木材等中以纤维状物的形式提取的、以纤维素为主要成分的原料的总称，大致分为使用药品来除去木素的化学纸浆；在残留有木素的状态下通过研磨机及精炼机等的机械力进行纸浆化的机械纸浆；利用两种工艺的化学机械纸浆；和旧纸纸浆。本发明中能够用作原料的纤维素可以为上述任一种纸浆，也可以为它们2种以上的组合。
作为纸浆的原料，可以举出木材原料和非木材原料，均可。木材原料包括针叶树、阔叶树等，作为非木材原料，可以举出稻秸、麦秸、甘蔗渣、竹、各种麻、棉绒、洋麻(kenaf)、楮树(paper mulberry)、结香(Edgeworthia chrysantha)等，也可以为它们的组合。另外，纸浆可以为经漂白的漂白纸浆，也可以为未漂白纸浆。
因此，本发明中，成为葡萄糖制备原料的纤维素，除纤维素之外，还可以包括半纤维素、木素等，只要最终能够通过水解得到用于葡萄糖或木糖等的发酵的糖即可，没有特别限制，也包含在本申请发明中的纤维素中。
纤维素分解的反应液，只要能够使本发明中的酵母显示出纤维素分解能力即可，没有特别限定，可以为水或缓冲液，例如可以直接举出前处理步骤中所述的反应液。
(反应步骤)
本发明的反应步骤中，利用本发明中的具备纤维素分解能力和葡萄糖蓄积能力的酵母，由纤维素生成葡萄糖，所述纤维素分解能力是在细胞外分解纤维素的能力，所述葡萄糖蓄积能力是使葡萄糖在反应液中蓄积的能力，所述葡萄糖是在反应液中酵母与纤维素接触时利用上述纤维素分解能力由纤维素生成的。其反应时间根据在细胞表层呈递的纤维素酶的种类及实施前处理的武装酵母的添加量而不同，因此不能一概地限定时间，但一般情况下在24小时～250小时内葡萄糖的蓄积量通常达到最大。
另外，作为反应形态，可以举出添加反应成分使其反应的分批反应形式；一边将随时生成的葡萄糖用UF膜等除去，一边连续地进行反应的连续反应形式等。
对于反应步骤中的反应温度及pH，由于无法在短时间内恢复因前处理而降低的葡萄糖代谢能力，所以优选使用不适于本发明中的酵母增殖的反应温度及pH。
特别优选使用与前处理步骤中采用的温度及pH相同的温度及pH。
(分离并回收的步骤)
反应步骤结束时，在反应液中葡萄糖以高浓度蓄积。可以采用常用的方法从上述反应液中分离并回收葡萄糖，例如可以举出过滤器过滤、离心分离、色谱法等。
本发明的酵母也可以在上述反应步骤结束后，重复用于由纤维素制备葡萄糖的反应步骤。即，本发明的制备方法还可以包括使分离并回收步骤后的反应液中的酵母与新的纤维素接触的步骤(再利用步骤)。由此，可以重复使用本发明的葡萄糖制备用酵母，进一步提高葡萄糖的收量。
本发明中所谓重复使用，包括下述情况：在分批反应形式中将反应步骤结束后的反应液中的酵母回收，然后使其与含有新的纤维素的反应液接触进行使用的情况；和在连续反应形式中通过反应步骤与流动添加的新的纤维素接触的情况。
重复次数的计算方法如下：为分批反应形式的情况下，将前一批使用的该酵母与含有新的纤维素的反应液接触时作为1次；为连续反应形式的情况下，将反应步骤开始时存在的该酵母与流动添加的新的纤维素接触时作为1次。重复次数无论是分批反应形式的情况还是连续反应形式的情况，只要为1次以上即可，没有上限。
本发明的制备方法中，也可以包括将分离并回收步骤后的反应液中的酵母回收。作为酵母的回收方法，可以直接采用与葡萄糖的分离并回收的步骤中记载的方法。由此，可以将本发明的葡萄糖制备用酵母保存到再利用时为止。酵母的回收步骤只要在反应步骤后即可，也可以与葡萄糖的分离并回收的步骤同时进行。葡萄糖制备用酵母的保存方法可以直接采用用于保存酵母通常使用的条件。
实施例
以下，给出实施例说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。另外，只要没有特殊说明，则实施例中的“％”为重量(质量)基准。
[实施例1]
(表层呈递纤维素酶的酵母属(Saccharomyces)武装酵母的葡萄糖代谢能力的降低)
按照Appl.Environ.Microbiol.，Vol.70(2)，pp.1207-1212(2004)中记载的方法，得到武装酵母(上述文献中记载的MT8-1/pBG211/pEG23u31H6/pFCBH2w3株)，该武装酵母使来自里氏木霉的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及来自棘孢曲霉的β葡糖苷酶呈递在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表层。
如下所述地进行上述武装酵母的葡萄糖代谢活性的降低。
(培养步骤)
将在SD(不含Trp、ura、His)琼脂培养基上生长的菌落作为种菌，预培养是在5mL SD培养基(不含Trp、ura、His)中在培养温度30℃、旋转速度150rpm的条件下振荡培养1日，将3mL培养溶液接种到已装入2L容量的挡板烧瓶(baffle bottle)的500mL SD培养基(不含Trp、ura、His)中，在培养温度30℃、旋转速度150rpm的条件下振荡培养3日。
(清洗步骤)
将如上所述培养的武装酵母在4℃、旋转数5000rpm(使用HITACHI himac CR 22G)的条件下离心分离10分钟，由此将从培养液中分离、回收的酵母悬浮于200mL纯水中，在上述离心分离条件下离心，将酵母清洗。再进行一次清洗，共进行2次。之后，将回收得到的武装酵母再次悬浮于300mL纯水中。
(前处理步骤)
将如上所述配制的武装酵母悬浮液每30mL分别注入50mL容量的烧瓶中，在30℃、35℃、40℃、45℃的各温度下，以旋转速度120rpm培养5小时。
(反应步骤)
之后，添加葡萄糖(和光纯药工业株式会社制)使浓度为2重量％，接着与前处理步骤相同地在30℃、35℃、40℃、45℃的温度下培养24小时。
(葡萄糖量的测定)
经时地考察反应液中葡萄糖的存在量。通过使用购自和光纯药工(株)的葡萄糖CII-Test Wako kit、并通过测定505nm处的吸光度，来确定葡萄糖量浓度。结果示于表1及图1。表1中的数值表示OD505nm处的吸光度。
如表1所示，在与培养温度相同的30℃下，观察到葡萄糖浓度经时地减少，24小时内2重量％的葡萄糖基本被消耗。35℃下进行培养时，与30℃相比，其减少速度降低，但可观察到经时地葡萄糖浓度减少，与30℃同样地在24小时内葡萄糖基本被消耗。另一方面，观察到在40℃和45℃下经培养的武装酵母，在24小时内基本不消耗葡萄糖。
[表1]
Figure BPA00001237998300171
[实施例2]
(利用葡萄糖代谢能力被降低的酵母属武装酵母由纤维素原料生成葡萄糖)
采用与上述实施例1同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/pBG211/pEG23u31H6/pFCBH2w3株)的培养、清洗、前处理步骤。但是，在前处理温度为30℃、40℃、45℃的温度下以处理时间为3小时进行。反应步骤如下进行。
(反应步骤)
添加磷酸膨润纤维素使浓度为0.6重量％。接着，在30℃、40℃、45℃的各温度下培养24小时。需要说明的是，在不含菌体的50mL水中添加磷酸膨润纤维素，于45℃下同样地进行处理，将其作为对照组。
如下所述地配制磷酸膨润纤维素。在100mL冰冷H3PO4(Nacalai tesque公司制、纯度85％)中添加4g纤维素(Avicel PH-101 Fluka制)搅拌一夜，同时将其完全溶解。之后，将已溶解的纤维素液一边搅拌一边缓慢流入1900mL冰冷水中，搅拌1小时。使用布氏漏斗将纤维素溶液抽滤(滤纸：使用ADVANTEC公司制、定量滤纸No.6)，采用以下步骤，进行纤维素的清洗和中和。首先，通过50mL纯水4次，进行清洗处理，接着，通过50mL 1％NaHCO32次，进行中和处理。最后，通过50mL纯水3次。将颗粒悬浮于50mL纯水，使用均化器(BRANSON公司制Sonifier cell disruptor 200)在处理时间2分钟内处理3次，得到磷酸膨润纤维素。取一部分磷酸膨润纤维素，在干燥库中使其干燥测定干燥重量，算出纤维素浓度。
(葡萄糖量的测定)
经时地考察反应液中葡萄糖的存在量。通过使用购自和光纯药工业(株)的葡萄糖CII-Test Wako kit、并测定505nm处的吸光度来确定葡萄糖量。结果示于表2及图2。如表2及图2所示，30℃的前处理及反应中，葡萄糖没有蓄积，但40℃和45℃的前处理及反应中，葡萄糖有蓄积，72小时后的葡萄糖浓度分别为0.093重量％、0.187重量％。
[表2]
Figure BPA00001237998300181
[实施例3]
(利用葡萄糖代谢能力被降低的酵母属武装酵母由纤维素原料生成葡萄糖)
采用与上述实施例1同样的方法，进行将纤维素酶呈递在细胞表层的武装酵母(MT8-1/pBG211/pEG23u31H6/pFCBH2w3株)的培养、清洗、前处理步骤。但是，前处理温度为45℃，处理时间为5小时。
反应步骤与实施例2同样地进行。但是，添加磷酸膨润纤维素使浓度为1重量％。另外，反应温度为45℃、反应时间为72小时。通过使用购自和光纯药工业(株)的葡萄糖CII-Test Wako kit、并测定505nm处的吸光度来确定葡萄糖量。结果示于表3。
如表3所示，24小时内生成0.45重量％的葡萄糖。进而，延长反应时间时，48小时内0.55重量％的葡萄糖蓄积，72小时内与添加的纤维素量的60％相当的0.6重量％葡萄糖蓄积。
[表3]
[实施例4]
(通过表面活性剂处理使表层呈递纤维素酶的武装酵母的葡萄糖代谢能力降低)
制作武装酵母，该武装酵母在表层呈递来自导入基因组的纤维素酶基因的纤维素酶，如下所述考察通过表面活性剂处理获得的葡萄糖代谢能力降低诱导效果。
<1>将来自里氏木霉的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、及来自棘孢曲霉的β葡糖苷酶的各基因导入酵母酿酒酵母(Saccharomycesce revisiae)的基因组中，构建表层呈递来自里氏木霉的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、及来自棘孢曲霉的β葡糖苷酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)
在于Appl.Environ.Microbiol.，Vol，70(2)，pp.1207-1212(2004)中记载的质粒pBG 211(包含融合基因盒，该融合基因盒中含有分泌信号、β葡糖苷酶基因和α凝集素的3’-Half基因)、pEG23u31H6(包含融合基因盒，该融合基因盒中含有分泌信号、His标记、内切葡聚糖酶II基因和α凝集素的3’-Half基因)、pFCBH2w3(包含融合基因盒，该融合基因盒中含有FLAG肽标记、CBHII基因和α凝聚素的3’-Half基因)中，分别采用与Suihko等人的文献Suihko et al.，Applied and Environmental Microbiology，Vol.35，pp.781-787(1991)同样的方法，利用限制酶切位点，将各基因盒的启动子及终止子区域与PGK启动子及PGK终止子交换。将所得质粒分别命名为pBG211-2、pEG23u31H6-2、pFCBH2w3-2。
将pEG23u31H6-2中的、包含启动子、内切葡聚糖酶II基因的基因盒及终止子的一系列区域，利用通常条件下的PCR进行扩增。将该DNA片段的两末端、及pBG211-2的终止子区域的下游用限制酶切断，通过DNA连接酶连接。使用上述DNA将大肠菌DH5α感受态细胞进行转化，涂布到含有氨苄西林的LB板上，得到菌落。按照常规方法从上述大肠菌中回收质粒，得到具有包含内切葡聚糖酶的基因盒和包含β葡糖苷酶的基因盒的质粒。
在His3标记物上的限制酶切位点将上述质粒切断，将使用FastYeast Trans formation Kit(Takara-Bio公司制)配制的酿酒酵母MT8-1株进行转化，将其涂布到不含组氨酸的SD板培养基上，于30℃培养3日，由此制作将内切葡聚糖酶及β葡糖苷酶的基因参入基因组的酵母。
使用上述酵母，通过Fast Yeast Transformation Kit制作感受态细胞，在Trp 1标记物上的限制酶切位点将pFCBH2w3-2切断，使用得到的DNA片段进行转化，将其涂布到不含色氨酸及组氨酸的SD板培养基上，于30℃培养3日，由此得到参入了内切葡聚糖酶、β葡糖苷酶及纤维二糖水解酶三种酶的酵母。将上述酵母命名为“MT8-1/EG、CBH、BGL株”。
<2>通过表面活性剂处理诱导武装酵母的葡萄糖代谢功能活性降低
采用与上述实施例1同样的方法，进行武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗，所述武装酵母在细胞表层呈递来自基因组上的基因的纤维素酶。但是，培养基使用YPD培养基。另外，前处理步骤按照下述4个要领来进行：(1)在前处理液中以浓度为0.1％(w/v)加入表面活性剂(TritonX-100：和光纯药工业株式会社制)，同时在45℃下进行热处理；(2)仅在45℃下进行热处理；(3)在前处理液中以浓度为0.1％(w/v)加入TritonX-100，同时在30℃下进行热处理；(4)仅在30℃下进行热处理。处理时间共计3小时，其他条件与实施例1相同。
反应步骤与实施例1同样地进行。但是，添加葡萄糖使其浓度为0.25重量％。另外，使反应温度与前处理步骤的温度相同，反应时间为20小时。葡萄糖的定量与实施例2同样地进行。结果示于表4。
[表4]
Figure BPA00001237998300211
如表4所示，可知武装酵母的葡萄糖代谢能力，即使将武装酵母暴露于表面活性剂(TritonX-100)，也可以得到与45℃的热处理同样的效果。另外，可知通过同时进行暴露于表面活性剂下和在45℃下的热处理，可以完全地抑制武装酵母的葡萄糖代谢。
[实施例5]
(通过表面活性剂和热处理诱导武装酵母的葡萄糖蓄积)
采用与实施例4同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗、前处理、反应步骤。但是，在前处理液中添加浓度为1％(w/v)的TritonX-100作为表面活性剂，前处理温度为45℃，处理时间为24小时。反应步骤中，添加磷酸膨润纤维素使其为2重量％，温度为45℃，反应时间为139小时。葡萄糖的定量与实施例4同样地进行。需要说明的是，将不含表面活性剂的样品作为对照组。结果示于表5。
[表5]
Figure BPA00001237998300221
如表5所示，葡萄糖的蓄积浓度在仅进行热处理时为6g/L，同时进行热处理和暴露在TritonX-100下时约为上述的2倍，提高至11.7g/L。由此可知，前处理步骤中，通过同时进行暴露于表面活性剂(TritonX-100)下和45℃的热处理，可以显著地提高武装酵母的葡萄糖蓄积能力。
[实施例6]
(根据表面活性剂的种类，武装酵母的葡萄糖代谢能力降低诱导不同)
采用与实施例5同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗、前处理、反应步骤。但是，在前处理液中以浓度1％(W/v)分别添加每一种以下所示的表面活性剂。使用下述表面活性剂：(1)Nonidet P-40(聚氧乙烯壬基苯基醚、半井化学药品株式会社社制)；(2)Tween85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、东京化成工业株式会社制)；(3)Arlacel C(失水山梨糖醇倍半油酸酯、东京化成工业株式会社制)；(4)Tween20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、纯正化学株式会社制)；(5)Tween80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、Kishida化学株式会社制)；(6)TritonX-100(4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、和光纯药工业株式会社制)；(7)Span85(失水山梨醇三油酸酯、东京化成工业株式会社制)；(8)Span80(失水山梨醇单油酸酯、Kishida化学株式会社制)。前处理均在45℃下进行3小时。前处理后在30℃下培养30分钟后，进入反应步骤。反应步骤中，添加葡萄糖，使其浓度为0.5重量％，温度为30℃，反应时间为44小时。葡萄糖的定量与实施例4同样地进行。需要说明的是，将不含表面活性剂的样品作为对照组。结果示于表6。
[表6]
Figure BPA00001237998300231
如表6所示，可知显示出武装酵母的葡萄糖代谢能力降低诱导的表面活性剂有多种。(1)Nonidet P-40、(2)Tween85、(3)Arlacel C、(6)TritonX-100、(8)Span80的葡萄糖摄取抑制效果特别高。
[实施例7]
(通过暴露在抗生素下来诱导武装酵母的葡萄糖代谢能力降低)
采用与实施例5同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗、前处理、反应步骤。但是，在前处理液中以浓度为200μg/mL添加对真核生物具有效果的抗生素即Zeocin(Invitrogen公司制、推荐使用浓度5～300μg/mL)来代替表面活性剂，前处理温度为30℃，处理时间为24小时。在该浓度下通常酵母不能生长。反应步骤中，添加葡萄糖使其为0.5重量％，温度为45℃，反应时间为6小时。葡萄糖的定量与实施例4同样地进行。需要说明的是，将不进行前处理步骤的样品作为对照组。结果示于表7。
由表7可知，前处理步骤中Zeocin的添加完全无法诱导武装酵母的葡萄糖代谢能力降低。因此，可知将酵母暴露于致死量的抗生素中，不能诱导葡萄糖代谢力降低。
[表7]
Figure BPA00001237998300241
[实施例8]
(武装酵母的耐热性试验)
本发明的武装酵母催化剂可以适当地发挥呈递在表面的纤维素酶的作用，而且可以重复使用催化剂，所以呈递纤维素酶的载体即酵母的形状的维持十分重要。因此，如下所述地考察武装酵母能够维持正常形状的热处理温度。
采用与实施例3同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗。但是，培养基使用YPD培养基。在1.5mL Eppendorf管中加入0.1mL 300g/L酵母液和0.9mL纯水，搅拌后，将向0.3mL体积的塑料管中分别注入0.1mL。在30℃、45℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下分别对其进行热处理，冷却至4℃后，使用血细胞计数器(Neubauer公司制、1/400mm2；1/10mm深度)，测定保持正常形态的细胞数。细胞数的测定是在160个区域内进行计数，每区域1/400mm2，算出其平均值。需要说明的是，将未经热处理的样品作为对照组。以未经热处理的细胞数为100时的各温度处理样品中的正常细胞数的结果如表8所示。
由表8可知，武装酵母在热处理温度为60℃以上逐渐地无法保持正常的形态，在70℃以上正常形态细胞的比例变为22％以下。
[表8]
Figure BPA00001237998300251
[实施例9]
(通过热处理降低了葡萄糖代谢能力的武装酵母的葡萄糖代谢能力的恢复效果)
本发明的武装酵母催化剂的目的在于在反应液中使葡萄糖蓄积，所以如果在利用热的前处理步骤中被降低的葡萄糖代谢能力在反应步骤中恢复时，则从葡萄糖生产率的观点考虑，是不合适的。因此，如下所述，考察经前处理的武装酵母的葡萄糖代谢能力不恢复的温度范围。
采用与实施例3同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗、前处理、反应步骤。但是，培养基使用YPD培养基。另外，前处理温度为45℃，处理时间为24小时。之后，分别在25℃、35℃、45℃、55℃下进行培养0、22、47、76小时，分别进入反应步骤。反应步骤中，添加磷酸膨润纤维素使其为1重量％，温度为25℃、35℃、45℃、55℃，反应时间为48小时。葡萄糖的定量与实施例4同样地进行。蓄积的葡萄糖的浓度示于表9。
由表9可知，武装酵母在利用热进行前处理后如果将温度降低至25℃或35℃，则葡萄糖代谢能力恢复，消耗葡萄糖。相对于此，如果将前处理后的温度维持在45℃以上，则可以维持葡萄糖代谢能力降低的效果。
[表9]
[实施例10]
(武装酵母的再利用试验)
如下所述地考察是否可以将本发明的武装酵母催化剂用于纤维素糖化后，回收并再利用。
采用与实施例3同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗、前处理、反应步骤。但是，培养基使用YPD培养基。另外，前处理温度为45℃，处理时间为24小时。反应步骤如下进行：添加磷酸膨润纤维素使其为2重量％，在温度45℃、反应时间24小时的条件下进行。初次反应步骤结束后，通过离心分离处理，回收武装酵母，将回收后的酵母悬浮于含有磷酸膨润纤维素的反应液中，所述磷酸膨润纤维素含有与初次反应步骤中生成的葡萄糖的量等量的葡萄糖，再次进行反应步骤。采用同样的方法，重复武装酵母的回收和反应步骤，共进行5次再利用。葡萄糖的定量与实施例4同样地进行。
如下所述地算出各再利用反应步骤中的残留活性。测定各反应步骤的第0小时和第24小时的葡萄糖浓度，算出各再利用反应步骤中的葡萄糖生成量。将葡萄糖生成量除以各反应时间，算出每1小时的葡萄糖生成速度，将其作为各步骤中的催化活性。以初次的催化活性为100时，用相对值表示各再利用步骤中的催化活性，将其作残留活性。另外，作为对照，以0.1％(w/v)的浓度使用精制纤维素酶(ACCELLERASE：Genencor公司制)来代替武装酵母，进行同样的试验。结果示于表10。
[表10]
Figure BPA00001237998300271
如表10所示，武装酵母即使进行5次再利用也可以维持48％以上的催化活性。相对于此，ACCELLERASE随再利用次数增加，催化活性急剧地减少，第3次以后基本没有活性。由此可以确认精制酶无法再利用，而武装酵母催化剂无论回收几次，都可以用于从纤维素向葡萄糖的糖化反应。
[实施例11]
(60℃下的武装酵母的再利用试验)
对于在60℃下将本发明的武装酵母催化剂进行再利用时是否可以维持酵母的形态，如下所述进行考察。
采用与实施例8同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(MT8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗。在2.0mLEppendorf管中加入0.1mL 300g/L酵母液和0.9mL纯水，一边以旋转数1000rpm/min(TAITEK公司制、Bioshaker、M-BR-022UP)进行搅拌一边于60℃进行培养。每隔24小时采集0.01mL，进行离心处理除去上清后，再次悬浮于1mL纯水中，冷却至4℃，使用血细胞计数器(Neubauer公司制、1/400mm2；1/10mm深度)，测定保持正常形态的细胞数。细胞数的测定是在160个区域内进行计数，每区域1/400mm2，算出其平均值。准备未进行热处理的样品作为对照组。以未进行热处理的细胞数为100时再利用后样品中的正常细胞数的结果如表11所示。
如表11所示，将武装酵母在60℃下再利用时，第5次循环结束后维持了正常形态的酵母的比例为26％。
[表11]
Figure BPA00001237998300281
[实施例12]
(50℃下的武装酵母的再利用试验)
对于将本发明的武装酵母催化剂在50℃下再利用时是否可以维持酵母的形态，如下所述地进行考察。
采用与实施例11同样的方法，进行在细胞表层呈递纤维素酶的武装酵母(M T8-1/EG、CBH、BGL株)的培养、清洗。之后，与实施例11同样地进行武装酵母的再利用实验。但是，培养温度为50℃，再利用次数为7次。准备未进行热处理的样品作为对照组。以未进行热处理的细胞数为100时再利用后样品中的正常细胞数的结果如表12所示。
如表12所示，将武装酵母在50℃下再利用时，即使在第7次循环结束后也有56％的酵母维持正常的形态。
[表12]
Figure BPA00001237998300282
[实施例13]
(利用武装酵母由纸浆原料制备葡萄糖)
如下所述，使用本发明的武装酵母及使本发明的武装酵母进一步表达来自肥粪纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的纤维二糖水解酶(Cex)的酵母，由牛皮纸浆进行葡萄糖的制备。
<1>使MT8-1/EG、CBH、BGL株表达来自肥粪纤维单胞菌的纤维二糖水解酶(Cex)的武装酵母的构建
来自肥粪纤维单胞菌的纤维二糖水解酶(Cex)的碱基序列已经被报道(Genbank accession number M15199)。构建2种引物CGCGGCAGAAACGAGCAAAGAAAAGTAAG(序列号1)、AGATCTCCATGGCTCGAGCGCCAAAAGCTC(序列号2)，上述2种引物可以扩增作为锚定蛋白表达用质粒的pEG23u31H6(记载于Fujitaet.al.Applied and Environmental Microbiology，Vol.68(10)，pp.5136-5141(2002))的载体区域。进而，构建在5’末端具有与上述引物互补的序列、且在3’末端具有与Cex的成熟蛋白质部分相同的序列的2种引物，即，TACTTTTCTTTGCTCGTTTCTGCCGCGGGAGCGACCACGCTCAAGGAGGC(序列号3)、GCTTTTGGCGCTCGAGCCATGGAGATCTA GGCCGACCGTGCAGGGCGTG(序列号4)。
以pEG23u31H6为模板，使用序列号1和序列号2的引物，在通常的条件下进行PCR，由此得到约10kbp的DNA片段(以下称作pEG23u31H6片段)。另外，以肥粪纤维单胞菌ATCC484株的基因组基因为模板，使用序列号3和序列号4的引物，在通常的条件下进行PCR，由此将约1.3kbp的DNA片段(以下称作Cex片段)扩增。使用所得pEG23u31H6片段和Cex片段的混合液，将通过Fast Yeast Transformation Kit(Takara-Bio公司制)配制的MT8-1/EG、CBH、BGL株进行转化，将其涂布到不含尿嘧啶的SD板培养基上，在30℃下培养5日。将所得转化体命名为MT8-1/EG、CBH、BGL/pCex株。
需要说明的是，肥粪纤维单胞菌ATCC484株可以购自细胞·微生物·基因库即美国典型培养物保藏机构(American Type Culture Collection)。
<2>利用MT8-1/EG，CBH，BGL株和MT8-1/EG，CBH，BGL/pCex株由牛皮纸浆制备葡萄糖试验
首先，如下所述地制备牛皮纸浆。
将含有率50％(dry w/w)的片状牛皮纸浆(日本大昭和板纸株式会社制：来自阔叶树、晒干)撕碎，加入搅拌机中，用灭菌水混悬，使其为7％(dry w/w)。将其加入高压灭菌器中进行灭菌处理，收集一部分测定干燥重量。将高压灭菌后的纸浆用灭菌水进一步稀释并混悬，使其浓度为3％(dry w/w)，用100mM柠檬酸缓冲液(pH4.8)调节pH为4.8。将其作为纸浆储备液。
采用与实施例5同样的方法，进行武装酵母的培养、清洗、前处理、反应步骤。但是，武装酵母准备MT8-1/EG、CBH、BGL株和MT8-1/EG、CBH、BGL/pCex株2种。进而，作为对照，准备宿主酵母(MT8-1)，所述宿主酵母完全不能使纤维素酶呈递到表层。在前处理液中添加浓度为0.1％(w/v)的TritonX-100作为表面活性剂，前处理温度为45℃，处理时间为24小时。反应步骤中，添加牛皮纸浆，使其为0.5重量％，温度为45℃，反应时间为216小时。葡萄糖的定量与实施例4同样地进行。结果示于表13。
由表13可以证实，利用本发明的武装酵母催化剂，可以由牛皮纸浆制备葡萄糖。另外，可知在本发明的武装酵母的表层进一步呈递其他种类的纤维素酶(例如来自肥粪纤维单胞菌的纤维二糖水解酶(Cex))时，可以提高葡萄糖的生产率。
[表13]
Figure BPA00001237998300311
如上所述，根据本发明，通过将武装酵母在规定的温度条件下或在暴露于表面活性剂中的条件下进行前处理，可以简便地降低葡萄糖代谢活性，通过使用该前处理后的武装酵母，可以使葡萄糖以高浓度蓄积在反应液中。进而，本发明的武装酵母可以容易地从蓄积有葡萄糖的反应液中回收，可以再利用使用。
因此，通过重复使用上述使葡萄糖代谢活性降低的武装酵母，可以以高收量高效地由纤维素得到葡萄糖。
将日本申请号第2008-105050号公开的全文引入本说明书。
本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准。
Figure ISB00000324756600011

Claims (13)

1.一种酵母，所述酵母具备纤维素分解能力和葡萄糖蓄积能力，
所述纤维素分解能力是在细胞外分解纤维素的能力，
所述葡萄糖蓄积能力是使葡萄糖在反应液中蓄积的能力，所述葡萄糖是在反应液中酵母与纤维素接触时利用所述纤维素分解能力由纤维素生成的。
2.如权利要求1所述的酵母，其中，所述葡萄糖蓄积能力是由葡萄糖代谢活性降低而产生的。
3.如权利要求1或2所述的酵母，其中，所述葡萄糖蓄积能力是通过热处理而诱导产生的，所述热处理的温度高于所述酵母的最适生长温度、低于赋予所述纤维素分解能力的纤维素分解酶的变性温度。
4.如权利要求1～3中任一项所述的酵母，其中，所述葡萄糖蓄积能力是通过40℃至70℃范围内的热处理而诱导产生的。
5.如权利要求1～4中任一项所述的酵母，其中，所述葡萄糖蓄积能力是通过使用表面活性剂的处理而诱导产生的。
6.如权利要求1～5中任一项所述的酵母，其中，所述葡萄糖蓄积能力是通过下述处理而诱导产生的，所述处理为使酵母与浓度为0.015％(w/v)以上10％(w/v)以下的表面活性剂溶液接触。
7.如权利要求1～6中任一项所述的酵母，其中，所述酵母为酵母属(Saccharomyces)酵母。
8.如权利要求1～7中任一项所述的酵母，其中，所述酵母为在表层具有纤维素分解酶的酵母。
9.由纤维素制备葡萄糖的葡萄糖制备方法，包括下述步骤：
使权利要求1～8中任一项所述的酵母在反应液中与纤维素接触的步骤；
将通过所述酵母与纤维素的接触而在反应液中生成及蓄积的葡萄糖从反应液中分离并回收的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其中，还包括使所述分离并回收步骤后的反应液中的所述酵母与新的纤维素接触，将所述分离并回收后的反应液中的酵母重复使用1次以上。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中，还包括将所述分离并回收步骤后的反应液中的所述酵母回收。
12.如权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，还包括在与所述纤维素的接触步骤之前进行用于诱导所述葡萄糖蓄积能力的前处理。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述前处理为40℃至70℃范围内的热处理或利用表面活性剂进行的处理。
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