ES2272945T3

ES2272945T3 - Delta-6-desaturadas de primulaceas, plantas expresantes y aceites que contienen pufa.

Info

Publication number: ES2272945T3
Application number: ES03704553T
Authority: ES
Inventors: Johnathan A. Napier; Olga Sayanova
Original assignee: ROTHAMSTED EX STATION; ROTHAMSTED EXPERIMENTAL STATION
Current assignee: ROTHAMSTED EX STATION; ROTHAMSTED EXPERIMENTAL STATION
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2023-02-06
Also published as: AU2003206846A1; US20090222955A1; CA2476041A1; JP4540988B2; EP1726652A3; EP1481063B1; CA2476041C; AU2003206846C1; WO2003072784A1; NO20043890L; EP1726652A2; AU2003206846B2; ATE520778T1; DE60309136D1; US20050089865A1; US7554008B2; ATE342987T1; DK1481063T3; EP1726652B1; GB2385852A

Abstract

Secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos que tienen actividad de Delta-6-desaturasa, en donde las Delta-6-desaturasas codificadas por las secuencias de ácido nucleico convierten específicamente ácidos grasos omega-3, selec- cionadas del grupo: a) una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia representada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3, b) secuencias de ácido nucleico que pueden derivarse como resultado del có- digo genético degenerado de la secuencia de codificación contenida en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3, c) derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3 que codifican polipéptidos que usan las secuencias de aminoácidos representadas en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 y tienen al menos 75% de homología a nivel de aminoácidos con el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 y poseen actividad de Delta-6-desaturasa.

Description

\Delta-6-desaturasas de primuláceas, plantas expresantes y aceites que contienen PUFA.

La presente invención se refiere a un método mejorado para la producción específica de ácidos grasos \omega-3 insaturados y a un método para la producción de triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados, en particular ácidos grasos \omega-3 que tienen mas de tres dobles enlaces. La invención se refiere a la producción de un organismo transgénico, preferiblemente una planta transgénica o un microorganismo transgénico, que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen dobles enlaces \Delta6 debido a la expresión de una \Delta6-desaturasa de primuláceas.

La invención se refiere adicionalmente a casetes de expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico, a un vector y a organismos que contienen al menos una secuencia de ácido nucleico o un casete de expresión. La invención se refiere además a ácidos grasos insaturados y triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados y al uso de los mismos.

Los ácidos grasos y los triglicéridos tienen numerosas aplicaciones en la industria alimenticia, la nutrición animal, la cosmética y en el sector farmacológico. Dependiendo de si son ácidos grasos saturados o insaturados libres o son triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para las aplicaciones más variadas. Así, por ejemplo, se añaden ácidos grasos poliinsaturados a fórmulas infantiles para incrementar su valor nutricional. Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos tales como Mortierella o de plantas productoras de aceites tales como soja, colza oleaginosa, girasol y otras, y generalmente están presentes en la forma de sus triacilglicéridos. Sin embargo, también pueden obtenerse de animales, por ejemplo péptidos. Los ácidos grasos libres se producen ventajosamente mediante saponificación.

Dependiendo del propósito de aplicación, se prefieren aceites que contienen ácidos grasos saturados o insaturados. Así, en la nutrición humana, por ejemplo, se prefieren lípidos que contienen ácidos grasos insaturados, especialmente ácidos grasos poliinsaturados, debido a que tienen un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en sangre y de ahí sobre la posibilidad de una enfermedad cardíaca. Se emplean en diversos alimentos dietéticos o fármacos medicinales.

Debido a sus propiedades positivas, no han faltado en el pasado intentos de elaborar genes disponibles que participen en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción de aceites en diversos organismos que tienen un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Así, en WO 91/13972 y su equivalente de EE.UU., se describe una \Delta9-desaturasa. En WO 93/11245, se reivindica una \Delta15-desaturasa y en WO 94/11516 una \Delta12-desaturasa. Otras desaturasas se describen, por ejemplo, en EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey y otros, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada y otros, Nature 347, 1990: 200-203 o Huang y otros, Lipids 34, 1999: 649-659. Sin embargo, hasta la fecha, las diversas desaturasas solo se han caracterizado inadecuadamente bioquímicamente ya que las enzimas en forma de proteínas unidas a la membrana se aíslan y caracterizan solo con mucha dificultad (McKeon y otros, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang y otros, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Generalmente, las desaturasas unidas a la membrana se caracterizan por la introducción en un organismo adecuado que a continuación se investiga con respecto a la actividad enzimática por medio de análisis de materiales de partida y productos. \Delta6-desaturasas se describen en WO 93/06712, US 5.614.393, US 5614393, WO 96/21022, WO0021557 y WO 99/27111 y su aplicación para la producción en organismos transgénicos también se describe, por ejemplo en WO 9846763, WO 9846764 y WO 9846765. Al mismo tiempo, también se describen y reivindican la expresión de diversas desaturasas, como en WO 9964616 o WO 9846776, y la formación de ácidos grasos poliinsaturados. Con respecto a la eficacia de la expresión de desaturasas y su efecto sobre la formación de ácidos grasos poliinsaturados, puede apuntarse que a través de la expresión de una sola desaturasa, según se describe hasta la fecha, solo se han alcanzado bajos contenidos de ácidos grasos/lípidos \Delta6-insaturados, tales como, a modo de ejemplo, ácido gamma-linoleico y ácido estearidónico. Por otra parte, se obtenía habitualmente una mezcla de ácidos grasos \omega-3 y \omega-6 ya que todas las \Delta6-desaturasas descritas hasta ahora convertían, por ejemplo, ácido linoleico (ácido graso \omega-6) así como ácido \alpha-linoleico (ácido graso \omega-3).

De acuerdo con esto, todavía existe una gran demanda de genes nuevos más adecuados que codifiquen enzimas que participen en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y hagan posible producir ciertos ácidos grasos específicamente a escala industrial sin que se formen subproductos no deseados. En la selección de genes para biosíntesis son particularmente importantes dos características por encima de todo. Por una parte, existe como siempre una necesidad de procedimientos mejorados para obtener los contenidos de ácidos grasos poliinsaturados más altos posibles. Por otra parte, las enzimas empleadas deben ser altamente específicas para un cierto substrato ya que en la medida de lo posible no deben producirse subproductos no deseados que podrían tener efectos fisiológicos negativos o hasta ahora no descubiertos en seres humanos o animales debido a la toma de alimentos/piensos.

De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es introducir genes adicionales de enzimas desaturasa para la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados en las semillas de una semilla oleaginosa y al hacer esto evitar la producción de subproductos no deseados. Se ha encontrado que este objetivo se alcanza mediante las secuencias de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la invención que codifican polipéptidos que tienen actividad de \Delta6-desaturasa, en donde las \Delta6-desaturasas codificadas por las secuencias de ácido nucleico convierten específicamente ácidos grasos \omega-3. Este objetivo se alcanzó en particular clonando las secuencias de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la invención, en donde las secuencias de ácido nucleico codifican un polipéptido que tiene una actividad de \Delta6-desaturasa, en donde las \Delta6-desaturasas codificadas por las secuencias de ácido nucleico convierten específicamente ácidos grasos \omega-3, seleccionadas del grupo:

a): una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia representada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3,

b): secuencias de ácido nucleico que pueden derivarse como resultado del código genético degenerado de la secuencia de codificación contenida en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3,

c): derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3 que codifican polipéptidos que usan las secuencias de aminoácidos representadas en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 y tienen al menos 75% de homología a nivel de aminoácidos con el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 y poseen actividad de \Delta6-desaturasa.

Las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifican polipéptidos que tienen una actividad de \Delta6-desaturasa y se originan de plantas, ventajosamente primuláceas tales como Muscariodides o Aleuritia, son específicas para la conversión de ácidos grasos \omega-3 y así convierten preferiblemente, a modo de ejemplo, ácido \alpha-linoleico y ácido linoleico cuando se expresan en un sistema heterólogo y ambos ácidos grasos están disponibles en el organismo. Por este medio, se producen, por ejemplo, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico en los organismos huésped, tales como plantas o microorganismos, sin formación de ácido araquidónico. Esto da como resultado una síntesis ventajosa de ácidos grasos de la familia de ácidos grasos \omega-3, mientras que los ácidos grasos \omega-6 se forman escasamente si es que lo hacen. Las \Delta6-desaturasas de acuerdo con la invención exhiben una actividad superior hacia ácidos grasos \omega-3 en comparación con ácidos grasos \omega-6 en al menos el factor 1,5, ventajosamente en al menos el factor 2, preferiblemente en al menos el factor 3, de forma particularmente preferible en al menos el factor 4 y de la forma más particularmente preferible en al menos el factor 5. Debido a esta especificidad, la formación de ácidos grasos no deseados puede suprimirse o evitarse completamente.

Por derivado o derivados de las secuencias de acuerdo con la invención se entienden, por ejemplo, homólogos funcionales de los polipéptidos o las enzimas codificados por el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3 que exhiben la misma actividad enzimática específica mencionada. Esta actividad enzimática específica permite ventajosamente la síntesis de ácidos grasos insaturados que tienen más de tres dobles enlaces en la molécula de ácido graso. Por ácidos grasos insaturados se entiende en lo que sigue ácidos grasos diinsaturados o poliinsaturados que poseen dobles enlaces. Los dobles enlaces pueden estar conjugados o no conjugados. Dichas secuencias codifican enzimas que exhiben actividad de \Delta6-desaturasa.

La enzima de acuerdo con la invención, \Delta6-desaturasa, introduce ventajosamente un doble enlace cis en residuos de ácido graso de glicerolípidos en la posición C_{6}-C_{7} (véanse el Nº ID SEC: 1 y el Nº ID SEC: 3). Las enzimas tienen adicionalmente una actividad de \Delta6-desaturasa que introduce ventajosamente de forma exclusiva un doble enlace cis en residuos de ácido graso de glicerolípidos en la posición C_{6}-C_{7}. Esta actividad también es poseída por las enzimas que tienen las secuencias especificadas en el Nº ID SEC: 1 y Nº 3 que son \Delta6-desaturasas monofuncionales.

La secuencia o las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención (para los propósitos de la solicitud el singular abarca el plural y viceversa) o fragmentos de las mismas pueden usarse ventajosamente para aislar otras secuencias genómicas a través de rastreo de homología.

Dichos derivados pueden aislarse, por ejemplo, de otros organismos, organismos eucarióticos tales como plantas, especialmente mohos, dinoflagelados u hongos.

Variantes alélicas incluyen en particular variantes funcionales obtenibles mediante deleción, inserción o substitución de nucleótidos en las secuencias representadas en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3, reteniéndose la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas derivadas.

Partiendo de la secuencia de DNA descrita en el Nº ID SEC: 1 y el Nº ID SEC: 3 o partes de dichas secuencias, tales secuencias de DNA pueden aislarse usando, por ejemplo, métodos de hibridación normales o la técnica de PCR a partir de otros eucariotas tales como los identificados anteriormente, por ejemplo. Estas secuencias de DNA se hibridan bajo condiciones estándar con dichas secuencias. Para la hibridación, se hace uso ventajosamente de oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas, por ejemplo, que pueden determinarse mediante comparaciones con otros genes de desaturasa de la manera conocida por los expertos en la técnica. Las secuencias de caja de histidina se emplean ventajosamente. Sin embargo, también pueden usarse para la hibridación fragmentos más largos de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o las secuencias completas. Dependiendo del ácido nucleico empleado: oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa, o dependiendo de qué tipo de ácido nucleico, DNA o RNA, se use para la hibridación, estas condiciones estándar varían. Así, por ejemplo, las temperaturas de fusión de híbridos de DNA:DNA son aproximadamente 10ºC inferiores que las de híbridos de DNA:RNA de la misma longitud.

Por condiciones estándar se entiende, por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico en cuestión, temperaturas entre 42ºC y 58ºC en una solución tamponadora acuosa que tiene una concentración de entre 0,1 y 5 x SSC (1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de formamida al 50%, tal como, a modo de ejemplo, 42ºC en 5 x SSC, formamida al 50%. Condiciones de hibridación para híbridos de DNA:DNA son ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20ºC y 45ºC, preferiblemente entre aproximadamente 30ºC y 45ºC. Para híbridos de DNA:RNA, las condiciones de hibridación son ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30ºC y 55ºC, preferiblemente entre aproximadamente 45ºC y 55ºC. Estas temperaturas especificadas para la hibridación son valores de temperatura de fusión calculados a modo de ejemplo para un ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido de G + C de 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de DNA se describen en libros de texto de genética pertinentes tales como, a modo de ejemplo, Sambrook y otros, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse mediante fórmulas conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo como una función de la longitud de los ácidos nucleicos, la naturaleza de los híbridos o el contenido de G + C. Los expertos en la técnica pueden extraer de los siguientes libros de texto información adicional sobre la hibridación: Ausubel y otros (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Hames y Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Por otra parte, por derivados se entiende homólogos de las secuencias Nº ID SEC: 1 y Nº: 3, por ejemplo homólogos eucarióticos, secuencias truncadas, DNA de una sola hebra de la secuencia de DNA codificante y no codificante o RNA de la secuencia de DNA codificante y no codificante.

Además, por homólogos de las secuencias Nº ID SEC: 1 y Nº ID SEC: 3 se entiende derivados tales como, a modo de ejemplo, variantes promotoras. Estas variantes pueden modificarse mediante uno o más intercambios de nucleótidos, mediante inserción o inserciones y/o deleción o deleciones, sin afectar adversamente sin embargo a la funcionalidad o eficacia de los promotores. Por otra parte, los promotores pueden tener su eficacia incrementada alterando
su secuencia o pueden reemplazarse completamente por promotores más eficaces incluso de organismos extraños.

Por derivados también se entiende ventajosamente variantes cuyas secuencias de nucleótidos se han alterado en la región de -1 a -2000 delante del codón de iniciación de tal modo que la expresión génica y/o la expresión proteínica se modifican, preferiblemente se incrementan. Por otra parte, por derivados también se entiende variantes que se han modificado en el extremo 3’.

Por derivados también se entiende los DNAs antisentido que pueden emplearse para inhibir la biosíntesis proteínica de las proteínas de acuerdo con la invención. Estos DNAs antisentido se enumeran entre los derivados no funcionales de acuerdo con la invención, tales como derivados que no exhiben actividad enzimática. Otros métodos conocidos por los expertos en la técnica para la producción de derivados no funcionales son lo que se conoce como cosupresión, el uso de ribozimas e intrones y el método de RNAi. Las ribozimas son moléculas de RNA catalíticas que tienen actividad de ribonucleasa que pueden trocear ácidos nucleicos de una sola hebra, tales como mRNA, con los que son complementarias. De este modo, usando estas ribozimas (Haselhoff y Gerlach, Nature, 334, 1988: 585-591), tanscritos de mRNA pueden segmentarse catalíticamente y, así, la traducción de este mRNA se suprime. Las ribozimas de este tipo pueden adaptarse especialmente para su propósito (US 4.987.071; US 5.116.742 y Bartel y otros, Science 261, 1993: 1411-1418). Por este medio, con la ayuda del DNA antisentido, pueden producirse ácidos grasos, lípidos o aceites que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados.

La secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica una \Delta6-desaturasa puede producirse mediante síntesis u obtenerse naturalmente o contiene una mezcla de componentes de DNA sintéticos y naturales así como consiste en diversos segmentos génicos de \Delta6-desaturasa heterólogos procedentes de diversos organismos. En general, las secuencias de nucleótidos sintéticas se producen con codones que son preferidos por los organismos huésped correspondientes, plantas por ejemplo. Esto da como resultado habitualmente una expresión óptima del gen heterólogo. Estos codones preferidos por las plantas pueden determinarse a partir de codones que tienen la frecuencia proteínica más alta que se expresan en la mayoría de las especies de plantas de interés. Un ejemplo relativo a Corynebacterium glutamicum se proporciona en Wada y otros (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tales experimentos pueden llevarse a cabo usando métodos estándar y son conocidos por el experto en la técnica.

Secuencias funcionalmente equivalentes que codifican el gen de \Delta6-desaturasa son los derivados de la secuencia de acuerdo con la invención que a pesar de una secuencia de nucleótidos diferente todavía poseen las funciones deseadas, es decir la actividad enzimática y la selectividad específica de las proteínas. Así, equivalentes funcionales incluyen variantes presentes en la naturaleza de las secuencias descritas aquí, así como las artificiales, por ejemplo secuencias de nucleótidos artificiales adaptadas al uso de codones de una planta que se ha obtenido mediante síntesis química.

Además, son adecuadas secuencias de DNA artificiales, con tal de que, según se describe anteriormente, medien en la propiedad deseada, por ejemplo un incremento en el contenido de dobles enlaces \Delta6 en ácidos grasos, aceites o lípidos en organismos tales como en una planta mediante la sobreexpresión del gen de \Delta6-desaturasa en plantas de cultivo. Tales secuencias de DNA artificiales pueden exhibir actividad de \Delta6-desaturasa, por ejemplo mediante retrotraducción de proteínas construidas por medio de modelado molecular, o pueden determinarse mediante selección in vitro. Técnicas posibles para la evolución in vitro de DNA para modificar o mejorar las secuencias de DNA se describen en Patten, P.A. y otros, Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997) o en Moore, J.C. y otros, Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). Particularmente adecuadas son secuencias de DNA codificantes que se obtienen mediante retrotraducción de una secuencia polipeptídica de acuerdo con el uso de codones específico para la planta huésped. Los expertos en la técnica familiarizados con los métodos de la genética de plantas pueden determinar fácilmente el uso de codones específico mediante análisis informático de otros genes conocidos de la planta que ha de transformarse.

Otras secuencias de ácido nucleico equivalentes adecuadas que pueden mencionarse son secuencias que codifican proteínas de fusión, siendo un componente de la proteína de fusión un polipéptido de \Delta6-desaturasa o una parte funcionalmente equivalente del mismo. La segunda parte de la proteína de fusión puede ser, por ejemplo, otro polipéptido que tiene actividad enzimática o una secuencia polipeptídica antigénica por medio de la cual es posible demostrar la expresión de \Delta6-desaturasa (por ejemplo la etiqueta myc o la etiqueta his). Preferiblemente, sin embargo, esta es una secuencia proteínica reguladora, tal como, a modo de ejemplo, una secuencia de señal para el retículo endoplásmico (= ER) que dirige la proteína de \Delta6-desaturasa al punto de acción deseado, o secuencias reguladoras que influyen en la expresión de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, tales como promotores o terminadores.

Ventajosamente, los genes de \Delta6-desaturasa en el método de acuerdo con la invención pueden combinarse con otros genes para la biosíntesis de ácidos grasos. Ejemplos de tales genes son las acetiltransferasas, otras desaturasas o elongasas tales como \Delta4-, \Delta5-, \Delta6- o \Delta8-desaturasas o desaturasas específicas para \omega-3 y/o \omega-6, tales como \Delta12 (para ácidos grasos C_{18}), \Delta15 (para ácidos grasos C_{18}) o \Delta19 (para ácidos grasos C_{22}) o tales como \Delta5- o \Delta6-elongasas. Para la síntesis in vivo y especialmente in vitro, es ventajosa la combinación con, por ejemplo, NADH citocromo B5 reductasas que pueden recoger o liberar equivalentes de reducción.

Por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la invención se entiende proteínas que contienen una secuencia de aminoácidos representada en las secuencias Nº ID SEC: 2 y Nº ID SEC: 4 o una secuencia obtenible a partir de las mismas mediante substitución, inversión, inserción o deleción de uno o más grupos de aminoácidos, reteniéndose o no reduciéndose substancialmente las actividades enzimáticas de las proteínas representadas en el Nº ID SEC: 2 y Nº: 4. Esto es, todavía poseen la misma actividad específica. Por "no substancialmente reducida" o "la misma actividad enzimática" se entiende todas las enzimas que todavía exhiben al menos 10%, preferiblemente 20%, de forma particularmente preferible 30% de la actividad enzimática de la enzima inicial obtenida a partir de la forma silvestre de dicho organismo de primulácea. Al hacer esto, por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden reemplazarse por otros que tienen propiedades fisicoquímicas similares (relleno de espacios, basicidad, hidrofobia, etc.). Por ejemplo, los residuos de arginina se intercambian por residuos de valina, los residuos de valina por residuos de isoleucina o los residuos de ácido aspártico por residuos de ácido glutámico. Sin embargo, uno o más aminoácidos también pueden intercambiarse en secuencia, añadirse o retirarse, o una pluralidad de estas medidas puede combinarse entre sí.

Por derivados también se entiende equivalentes funcionales que en particular también contienen mutaciones naturales o artificiales de una secuencia originalmente aislada que codifica \Delta6-desaturasa que continúa exhibiendo la función deseada, esto es, la actividad enzimática y la selectividad para el substrato de la misma no se reduce substancialmente. Las mutaciones comprenden substituciones, adiciones, deleciones, intercambios o inserciones de uno o más residuos de nucleótido. Así, por ejemplo, la presente invención también abarca las secuencias de nucleótidos que se obtienen mediante modificación de la secuencia de nucleótidos de \Delta6-desaturasa. El objetivo de tal modificación puede ser, por ejemplo, unir adicionalmente la secuencia codificante contenida allí o, además, por ejemplo, insertar interfases de enzimas de restricción adicionales.

Los equivalentes funcionales también incluyen las variantes cuya función mediante comparación con el gen o el fragmento génico inicial está debilitada (= no substancialmente reducida) o reforzada (= actividad enzimática superior que la actividad de la enzima inicial, esto es la actividad es superior que 100%, preferiblemente superior que 110%, de forma particularmente preferible superior que 130%).

Al mismo tiempo, la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, puede ser ventajosamente una secuencia de DNA o cDNA. Secuencias codificantes adecuadas para la inserción en un casete de expresión de acuerdo con la invención incluyen a modo de ejemplo las que codifican una \Delta6-desaturasa con las secuencias descritas anteriormente y dan al huésped la capacidad de sobreproducir ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen dobles enlaces en la posición \Delta6, siendo ventajoso que al mismo tiempo se produzcan ácidos grasos \omega-3 que tienen al menos cuatro dobles enlaces. Estas secuencias pueden ser de origen homólogo o heterólogo.

Por el casete de expresión (= constructo o fragmento de ácido nucleico o constructo génico) de acuerdo con la invención se entiende las secuencias especificadas en el Nº ID SEC: 1 y el Nº ID SEC: 3 que resultan del código genético y/o derivados funcionales o no funcionales de las mismas que están funcionalmente conectados con una o más señales de regulación ventajosamente para incrementar la expresión génica y que controlan la expresión de la secuencia codificante en la célula huésped. Estas secuencias reguladoras deben permitir la expresión selectiva de los genes y la expresión de la proteína. Dependiendo del organismo huésped esto puede significar, por ejemplo, que el gen se expresa y/o se sobreexpresa solo después de la inducción o que se expresa y/o se sobreexpresa inmediatamente. Ejemplos de estas secuencias reguladoras son secuencias a las que se unen inductores o represores y de este modo regulan la expresión del ácido nucleico. Además de estas nuevas secuencias de regulación o en lugar de estas secuencias, todavía puede estar presente la regulación natural de estas secuencias delante de los genes estructurales reales y opcionalmente se han modificado genéticamente de forma que la regulación natural se cortaría y la expresión de los genes se incrementaría. Sin embargo, el constructo génico también puede construirse de forma más simple, esto es no se han insertado señales de regulación delante de la secuencia de ácido nucleico o los derivados de la misma y el promotor natural con su regulación no se ha retirado. En lugar de esto, la secuencia de regulación natural se mutaba de tal modo que no se producía regulación adicional y/o la expresión génica se elevaba. Estos promotores modificados en forma de secuencias de partes (= promotor que contiene partes de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención) también pueden conducirse por sí mismas delante del gen natural para incrementar la actividad. Además, el constructo génico también puede contener ventajosamente una o más de las llamadas secuencias potenciadoras funcionalmente conectadas al promotor que permiten la expresión potenciada de la secuencia de ácido nucleico. En el extremo 3’ de las secuencias de DNA también pueden insertarse secuencias ventajosas adicionales, tales como elementos reguladores o terminadores adicionales. El gen de \Delta6-desaturasa puede estar presente en una o más copias en el casete de expresión (= constructo génico).

Según se describe anteriormente, las secuencias o factores reguladores pueden preferiblemente influir positivamente y así incrementar la expresión génica de los genes introducidos. Así, el refuerzo de los elementos reguladores ventajosamente a nivel de transcripción puede efectuarse usando señales de transcripción poderosas tales como promotores y/o potenciadores. Sin embargo, además, también es posible el refuerzo de la traducción, por ejemplo mejorando la estabilidad del mRNA.

Promotores adecuados en el casete de expresión son en principio todos los promotores que pueden controlar la expresión de genes extraños en organismos tales como microorganismos, como protozoos tales como ciliados, algas tales como algas verdes, pardas, rojas o azules, bacterias tales como bacterias Gram positivas o Gram negativas, levaduras tales como Saccharomyces, Pichia o Schizosaccharomyces u hongos tales como Mortierella, Traustochytrium o Schizochytrium, ventajosamente en plantas u hongos. En particular, se hace uso preferiblemente de promotores de plantas o promotores derivados de un virus de planta. Secuencias de regulación ventajosas para el método de acuerdo con la invención se encuentran, por ejemplo, en promotores tales como cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacI^{q-}, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, \lambda-P_{R} o en promotores \lambda-P_{L} que se emplean ventajosamente en bacterias Gram negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas se encuentran, por ejemplo, en los promotores Gram positivos amy y SPO2, en los promotores de levadura o fúngicos ADC1, MF\alpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de planta CaMV/35S [Franck y otros, Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Promotor de Nopalina Sintasa) o en el promotor de ubiquitina. El casete de expresión también puede contener un promotor químicamente inducible por medio del cual la expresión del gen de \Delta6-desaturasa exógeno en los organismos puede controlarse ventajosamente en las plantas en un momento particular. Promotores de planta ventajosos de este tipo son, a modo de ejemplo, el promotor PRP1 [Ward y otros, Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366], un promotor inducible por bencenosulfonamida (EP 388186), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y otros, (1992) Plant J. 2,397-404), un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible por ácido abscísico (EP335528) y un promotor inducible por etanol o ciclohexanona (WO93/21334). Otros ejemplos de promotores de plantas que pueden usarse ventajosamente son el promotor de FBPasa citosólica de patata, el promotor ST-LSI de patata (Stockhaus y otros, EMBO J. 8 (1989) 2445-245), el promotor de fosforribosil pirofosfato amidotransferasa de Glycine max (véase también el número de registro del banco de genes U87999) o un promotor específico de nodieno como el descrito en EP 249676. Particularmente ventajosos son los promotores de planta que aseguran la expresión en tejidos o partes/órganos de planta en los que se produce la biosíntesis de ácidos grasos o las fases precursoras de la misma, como en el endospermo o en el embrión en desarrollo, por ejemplo. Particularmente notables son promotores ventajosos que aseguran una expresión específica para la semilla, tales como, a modo de ejemplo, el promotor USP o derivados del mismo, el promotor LEB4, el promotor de faseolina o el promotor de napina. El promotor USP particularmente ventajoso citado de acuerdo con la invención o sus derivados median en la expresión génica muy temprana en el desarrollo de semillas (Baeumlein y otros, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67). Otros promotores ventajosos específicos para semillas que pueden usarse para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas son los promotores adecuados para dicotiledóneas tales como promotores del gen de napina, citados asimismo a modo de ejemplo, de colza oleaginosa (US 5.608.152), el promotor de oleosina procedente de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina procedente de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), el promotor Bce4 procedente de Brassica (WO 91/13980) o el promotor B4 de leguminosas (LeB4, Baeumlein y otros, Plant J., 2, 2, 1992: 233 - 239) o promotores adecuados para monocotiledóneas tales como los promotores del gen Ipt2 o Ipt1 en la cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores del gen de hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de karisina de sorgo o el gen de secalina de centeno que se describen en
WO99/16890.

Por otra parte, se prefieren particularmente los promotores que aseguran la expresión en tejidos o partes de plantas en los que, por ejemplo, tiene lugar la biosíntesis de ácidos grasos, aceites y lípidos o las fases precursoras de la misma. Particularmente notables son promotores que aseguran la expresión específica para semillas. Son notables el promotor del gen de napina procedente de colza oleaginosa (US 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (USP = proteína de semilla desconocida, Baeumlein y otros, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), el promotor del gen de oleosina procedente de Arabidopsis (WO98/45461), el promotor de faseolina (US 5.504.200) o el promotor del gen de legumina B4 (LeB4; Baeumlein y otros, 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9). Otros promotores que han de mencionarse son los del gen Ipt2 o Ipt1 procedentes de cebada (WO95/15389 y WO95/23230) que median en la expresión específica para semillas en plantas monocotiledóneas.

Según se describe anteriormente, el constructo (= constructo génico, constructo de ácido nucleico) de expresión puede contener otros genes más que han de introducirse en los organismos. Estos genes pueden someterse a regulación separada o someterse a la misma región de regulación que el gen de \Delta6-desaturasa. Estos genes son, a modo de ejemplo, otros genes de biosíntesis, ventajosamente para la biosíntesis de ácidos grasos, que permiten una síntesis incrementada. Ejemplos que pueden mencionarse son los genes para \Delta15-, \Delta12-, \Delta9-, \Delta6-, \Delta5-, \Delta4-desaturasa, \beta-cetoacil reductasas, \beta-cetoacil sintasas, elongasas o las diversas hidrolasas y acil-ACP tioesterasas. Los genes de desaturasa se usan ventajosamente en el constructo de ácido nucleico.

En principio, todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación pueden usarse como los nombrados anteriormente para el casete de expresión de acuerdo con la invención y el método de acuerdo con la invención. Por encima de todo, también pueden usarse ventajosamente promotores sintéticos.

En la preparación de un casete de expresión, diversos fragmentos de DNA pueden manipularse para obtener una secuencia de nucleótidos que se lee útilmente en la dirección correcta y está equipada con una trama de lectura correcta. Para conectar los fragmentos de DNA (= ácidos nucleicos de acuerdo con la invención) entre sí pueden ligarse a los fragmentos otros adaptadores o conectores.

El promotor y las regiones terminadoras pueden proporcionarse útilmente en la dirección de transcripción con un conector o policonector que contiene uno o más puntos de restricción para la inserción de esta secuencia. Generalmente, el conector tiene de 1 a 10, principalmente de 1 a 8, preferiblemente de 2 a 6, puntos de restricción. En general, el tamaño del conector dentro de la región reguladora es menor que 100 pb, frecuentemente menor que 60 pb, pero al menos 5 pb. El promotor puede ser tanto natural u homólogo como extraño o heterólogo para el organismo huésped, por ejemplo para la planta huésped. En la dirección de transcripción 5’-3’, el casete de expresión contiene el promotor, una secuencia de DNA que codifica un gen de \Delta6-desaturasa y una región para la terminación de la transcripción. Diferentes regiones de terminación pueden intercambiarse entre sí de cualquier modo deseado.

Por otra parte, pueden emplearse manipulaciones que proporcionan interfases de restricción adecuadas o que retiran DNA o interfases de restricción en exceso. Cuando se tienen en cuenta inserciones, deleciones o substituciones, tales como transiciones o transversiones, pueden usarse mutagénesis in vitro, reparación con cebadores, restricción o ligación. En manipulaciones adecuadas tales como restricción, remasticado ("chewing back") o relleno de salientes para extremos romos, pueden proporcionarse extremos complementarios de los fragmentos para la ligación.

Para una expresión alta ventajosa, puede ser de importancia la ligación de la señal de retención del ER específica SEKDEL, entre otras cosas, (Schouten, A. y otros, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792). De este modo, el nivel de expresión medio se triplica o incluso se cuadruplica. Otras señales de retención que se producen naturalmente en proteínas de plantas y animales situadas en el ER también pueden emplearse para la construcción del casete.

Señales de poliadenilación preferidas son señales de poliadenilación de plantas, preferiblemente las que corresponden substancialmente a señales de poliadenilación de T-DNA procedentes de Agrobacterium tumefaciens, en particular el gen 3 del T-DNA (octopina sintasa) del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y otros, EMBO J.3 (1984), 835 y siguientes) o equivalentes funcionales correspondientes.

Un casete de expresión se produce mediante la fusión de un promotor adecuado con una secuencia de DNA de \Delta6-desaturasa adecuada junto con una señal de poliadenilación mediante técnicas de recombinación y clonación comunes como las descritas, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) así como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. y otros, Current Protocols en Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).

En la preparación de un casete de expresión, diversos fragmentos de DNA pueden manipularse para producir una secuencia de nucleótidos que se lee útilmente en la dirección correcta y está equipada con una trama de lectura correcta. Adaptadores o conectores pueden ligarse a los fragmentos para empalmar los fragmentos de DNA.

El promotor y las regiones terminadoras pueden proporcionarse útilmente en la dirección de la transcripción con un conector o policonector que contiene uno o más puntos de restricción para la inserción de esta secuencia. Generalmente, el conector tiene de 1 a 10, principalmente de 1 a 8, preferiblemente de 2 a 6, puntos de restricción. En general, el tamaño del conector dentro de la región reguladora es menor que 100 pb, frecuentemente menor que 70 pb, pero al menos 5 pb. El promotor puede ser tanto natural u homólogo como extraño o heterólogo para el organismo huésped, por ejemplo para la planta huésped. En la dirección de transcripción 5’-3’, el casete de expresión contiene el promotor, una secuencia de DNA que codifica un gen de \Delta6-desaturasa y una región para la terminación de la transcripción. Diferentes regiones de terminación pueden intercambiarse entre sí de cualquier modo deseable.

Las secuencias de DNA que codifican dos \Delta6-desaturasas procedentes de Muscariodides vialii y Aleuritia farinosa contienen todas las características de secuencia necesarias para alcanzar la localización correcta del sitio de biosíntesis de ácidos grasos, lípidos o aceites. De acuerdo con esto, no son necesarias de por sí secuencias de orientación a la diana adicionales. Sin embargo, tal localización puede ser deseable y ventajosa y de ahí modificarse o reforzarse artificialmente de modo que tales constructos de fusión también sean una modalidad ventajosa preferida de la inven-
ción.

Particularmente preferidas son las secuencias que aseguran la orientación a la diana en plástidos. Bajo ciertas circunstancias, la orientación hacia otros compartimentos (presentada en: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) también puede ser deseable, por ejemplo hacia vacuolas, la mitocondria, el retículo endoplásmico (ER), peroxisomas, estructuras lipídicas o, debido a la falta de secuencias operativas correspondientes, la retención en el compartimento de origen, el citosol.

Ventajosamente, las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el constructo génico junto con al menos un gen informador se clonan en un casete de expresión que se introduce en el organismo a través de un vector o directamente en el genoma. Este gen informador debe permitir una detección fácil a través de un ensayo de crecimiento, fluorescencia, químico, de bioluminiscencia o de resistencia o a través de una medida fotométrica. Ejemplos de genes informadores que pueden mencionarse son genes de resistencia a antibióticos o herbicidas, genes de hidrolasa, genes de proteínas para fluorescencia, genes de bioluminiscencia, genes metabólicos de azúcares o nucleótidos o genes de biosíntesis tales como el gen Ura3, el gen Ilv2, el gen de luciferasa, el gen de \beta-galactosidasa, el gen gfp, el gen de 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa, el gen de \beta-glucuronidasa, el gen de \beta-lactamasa, el gen de neomicina fosfotransferasa, el gen de higromicina fosfotransferasa o el gen BASTA (= resistencia a glufosinato). Estos genes permiten una medida y una cuantificación fáciles de la actividad de transcripción y de ahí de la expresión de los genes. De este modo, pueden identificarse posiciones del genoma que exhiben productividad diferente.

En una modalidad preferida, un casete de expresión comprende aguas arriba, es decir, en el extremo 5’ de la secuencia codificante, un promotor y aguas abajo, es decir en el extremo 3’, una señal de poliadenilación y opcionalmente otros elementos reguladores que están conectados operablemente a la secuencia codificante intermedia para \Delta6-desaturasa y/o la secuencia de DNA de \Delta6-desaturasa. Por una conexión operable se entiende la disposición secuencial de promotor, secuencia codificante, terminador y opcionalmente otros elementos reguladores de tal modo que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función en la expresión de la secuencia codificante de la manera debida. Las secuencias preferidas para una conexión operable son secuencias de orientación a la diana para asegurar la localización subcelular en plástidos. Sin embargo, también pueden emplearse secuencias de orientación a la diana para asegurar la localización subcelular en la mitocondria, en el retículo endoplásmico (= ER), en el núcleo, en corpúsculos oleosos u otros compartimentos así como promotores de traducción tales como la secuencia líder 5’ en el virus del mosaico del tabaco (Gallie y otros, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711).

Un casete de expresión puede contener, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor específico para un tejido (preferiblemente el promotor USP o de napina), el gen que ha de expresarse y la señal de retención del ER. Para la señal de retención del ER, se emplea preferiblemente la secuencia de aminoácidos KEL (lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina) o la secuencia de aminoácidos KKX (lisina-lisina-X-parada, en la que X significa cualquier otro aminoácido conocido).

Para la expresión en un organismo huésped procariótico o eucariótico, por ejemplo un microorganismo tal como un hongo, o una planta, el casete de expresión se inserta ventajosamente en un vector tal como, a modo de ejemplo, un plásmido, un fago u otro DNA que permita la expresión óptima de los genes en el organismo huésped. Ejemplos de plásmidos adecuados son: en E. coli, pLG338, pACYC184, la serie pBR tal como, por ejemplo, pBR322, la serie pUC tal como pUC18 o pUC19, la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III^{113}-B1, \lambdagt11 o pBdCI; en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361; en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214; en Corynebacterium pSA77 o pAJ667; en hongos pALS1, pIL2 o pBB116; otros vectores fúngicos ventajosos son descritos por Romanos, M.A. y otros, [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] y por van den Hondel, C.A.M.J.J. y otros [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" así como en More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet y L.L. Lasure, eds., pp. 396-428: Academic Press: San Diego] y en "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. y Punt, P.J. (1991) en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. y otros, eds., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]. Ejemplos de promotores de levadura ventajosos son 2\muM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMB-LYe23. Ejemplos de promotores de algas o plantas son pLGV23, pGHlac^{+}, pBIN19, pAK2004, pVKH o pDH51 (véase Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988). Los vectores identificados anteriormente o los derivados de los vectores identificados anteriormente son una pequeña selección de los posibles plásmidos. Plásmidos adicionales son bien conocidos para los expertos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. y otros, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Vectores de plantas adecuados se describen, entre otros, en "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Capítulo 6/7, pp. 71-119. Vectores ventajosos son conocidos como vectores lanzadera o vectores binarios que se replican en E. coli y Agrobacterium.

Se entiende por vectores, con la excepción de los plásmidos, todos los otros vectores conocidos por los expertos en la técnica, tales como, a modo de ejemplo, fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, DNA lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse autónomamente en el organismo huésped o replicarse cromosómicamente, prefiriéndose la replicación cromosómica.

En una modalidad adicional del vector, el casete de expresión de acuerdo con la invención también puede introducirse ventajosamente en los organismos en forma de un DNA lineal e integrarse en el genoma del organismo huésped por medio de recombinación heteróloga u homóloga. Este DNA lineal puede estar compuesto por un plásmido linealizado o solo por el casete de expresión como vector o las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

En una modalidad ventajosa adicional, la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención también puede producirse en un organismo por sí misma.

Si además de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención han de introducirse genes adicionales en el organismo, conjuntamente con un gen informador en un solo vector o cada gen simple con un gen informador en un vector pueden introducirse en cada caso en el organismo, con lo que los diferentes vectores pueden introducirse simultáneamente o sucesivamente.

El vector contiene ventajosamente al menos una copia de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o el casete de expresión (= constructo génico) de acuerdo con la invención.

A modo de ejemplo, el casete de expresión de planta puede instalarse en el vector de transformación pRT ((a) Toepfer y otros, 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer y otros 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff.).

Alternativamente, un vector recombinante (= vector de expresión) también puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando el promotor T7 y la RNA polimerasa de T7.

Vectores de expresión empleados en procariotas hacen uso frecuentemente de sistemas inducibles con y sin proteínas de fusión u oligopéptidos de fusión, en donde estas fusiones pueden sobrevenir de manera tanto N-terminal como C-terminal o en otros dominios útiles de una proteína. Tales vectores de fusión tienen habitualmente los siguientes propósitos: i) incrementar la velocidad de expresión de RNA; ii) incrementar la velocidad alcanzable de síntesis de proteínas; iii) incrementar la solubilidad de la proteína; iv) o simplificar la purificación por medio de una secuencia de unión utilizable para cromatografía de afinidad. También se introducen frecuentemente puntos de segmentación proteolítica a través de proteínas de fusión que permiten la segmentación de una porción de la proteína de fusión y la purificación. Tales secuencias de reconocimiento para proteasas son reconocidas, por ejemplo factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de fusión y expresión ventajosos típicos son pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que contiene glutationa S-transferasa (GST), proteína que se une a maltosa o proteína A.

Otros ejemplos de vectores de expresión de E. coli son vectores pTrc [Amann y otros, (1988) Gene 69:301-315] y vectores pET [Studier y otros, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos].

Otros vectores ventajosos para usar en levadura son pYepSec1 (Baldari y otros, (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y otros, (1987) Gene 54:113-123) y derivados de pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores para usar en hongos filamentosos se describen en: van den Hondel, C.A.M.J.J. y Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy y otros, eds., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativamente, también pueden utilizarse ventajosamente vectores de expresión de células de insectos, por ejemplo para la expresión en células Sf9. Estos son, por ejemplo, los vectores de la serie pAc (Smith y otros (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

Por otra parte, células de planta o células de alga pueden usarse ventajosamente para la expresión génica. Ejemplos de vectores de expresión de plantas pueden encontrarse en Becker, D. y otros (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 o en Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.

Por otra parte, las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden expresarse en células de mamífero, ventajosamente en células de mamífero no humano. Ejemplos de vectores de expresión correspondientes son pCDM8 y pMT2PC, mencionados en: Seed, B. (1987) Nature 329:840 o Kaufman y otros (1987) EMBO J. 6: 187-195). A la vez, promotores preferidos para el uso son de origen viral, tales como, a modo de ejemplo, promotores de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus o virus de simio 40. Otros sistemas de expresión porcarióticos y eucarióticos se mencionan en los capítulos 16 y 17 de Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

La introducción de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, el casete de expresión o el vector en organismos, plantas por ejemplo, puede realizase en principio mediante todos los métodos conocidos por los expertos en la técnica. La introducción de las secuencias de ácido nucleico da lugar a organismos recombinantes o transgénicos.

En el caso de los microorganismos, los expertos en la técnica pueden encontrar apropiados métodos de los libros de texto de Sambrook, J. y otros (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, de F.M. Ausubel y otros (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, de D.M. Glover y otros, DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), de Kaiser y otros (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Guthrie y otros Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. Al hacer esto, los métodos descritos para la transformación y generación de plantas a partir de tejidos de planta o células de planta se utilizan para la transformación transitoria o estable. Métodos adecuados son transformación de protoplastos mediante captación de DNA inducida por polietilenglicol, el método "biolístico" que usa el cañón génico - denominado el método de bombardeo de partículas, electroporación, la incubación de embriones secos en solución de DNA, microinyección y transferencia génica mediada por Agrobacterium. Dichos métodos se describen a modo de ejemplo en B. Jenes y otros, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). El constructo que ha de expresarse se clona preferiblemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan y otros, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas mediante tal vector pueden usarse a continuación de manera conocida para la transformación de plantas, en particular de plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sometiendo a un baño hojas machacadas u hojas troceadas en una solución agrobacteriana y a continuación cultivándolas en medios adecuados. La transformación de plantas por medo de Agrobacterium tumefaciens es descrita, por ejemplo, por Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Las agrobacterias transformadas mediante un vector de expresión de acuerdo con la invención pueden usarse asimismo de manera conocida para la transformación de plantas tales como plantas de prueba como Arabidopsis o plantas de cultivo tales como cultivos de cereales, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, canola, girasol, lino, cáñamo, patatas, tabaco, tomates, zanahorias, pimentón, colza oleaginosa, tapioca, yuca, maranta, tagetes, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, nueces y vides, en particular de plantas de cultivo que contienen aceite tales como soja, cacahuete, planta de aceite de ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza oleaginosa, coco, palma oleaginosa, cártamo (Carthamus tinctorius) o haba de cacao, por ejemplo sometiendo a un baño hojas machacadas u hojas troceadas en una solución agrobacteriana y a continuación cultivándolas en medios adecuados. Para la producción de PUFAs, por ejemplo ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, son ventajosamente adecuadas borraja o primuláceas.

Las células de planta genéticamente modificadas pueden regenerarse mediante todos los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Métodos apropiados pueden encontrarse en las publicaciones mencionadas anteriormente de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer.

De acuerdo con esto, un aspecto adicional de la invención se refiere a organismos transgénicos transformados mediante al menos una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión o un vector de acuerdo con la invención, así como células, cultivos celulares, tejidos, partes - tales como, por ejemplo, hojas, raíces, etc. en el caso de organismos de planta - o material reproductivo derivado de tales organismos. Los términos "organismo huésped", "célula huésped", "organismo (huésped) recombinante" y "célula (huésped) transgénica" se usan aquí intercambiablemente. Por supuesto, estos términos se refieren no solo al organismo huésped particular o la célula diana particular sino también a los descendientes o descendientes potenciales de estos organismos o células. Puesto que, debido a mutación o efectos medioambientales, pueden surgir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas, estos descendientes no tienen necesariamente que ser idénticos a la célula parental pero sin embargo todavía están abarcados por el término según se usa aquí.

Para los propósitos de la invención "transgénico" o "recombinante" significa, con respecto por ejemplo a una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión (= constructo génico) o un vector que contiene la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un organismo transformado por las secuencias de ácido nucleico, el casete de expresión o el vector de acuerdo con la invención, todas las construcciones producidas mediante métodos de manipulación genética en las que

a): la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención o

b): una secuencia de control genético conectada funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o

c): (a) y (b)

no se encuentran en su ambiente genético natural o se han modificado mediante métodos de manipulación genética, en donde la manipulación, a modo de ejemplo, puede ser una substitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Ambiente genético natural significa el locus genómico o cromosómico natural en el organismo de origen o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferiblemente al menos en parte. El ambiente limita la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 500 pb, de forma particularmente preferida al menos 1000 pb, de la forma más particularmente preferida al menos 5000 pb. Un casete de expresión presente en la naturaleza - por ejemplo la combinación presente en la naturaleza del promotor natural de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención con el gen PSE correspondiente -
se convierte en un casete de expresión transgénico cuando el último es modificado mediante métodos sintéticos ("artificiales") no naturales, tales como, a modo de ejemplo, una mutagenación. Métodos apropiados se describen, a modo de ejemplo, en US 5.565.350 o WO 00/15815.

Organismos u organismos huésped adecuados para el ácido nucleico, el casete de expresión o el vector de acuerdo con la invención son ventajosamente en principio todos los organismos que son capaces de sintetizar ácidos grasos, especialmente ácidos grasos insaturados, o son adecuados para la expresión de genes recombinantes. Ejemplos que pueden mencionarse son plantas tales como Arabidopsis, Asteraceas tales como caléndula o plantas de cultivo tales como soja, cacahuete, planta de aceite de ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza oleaginosa, coco, aceite de palma, cártamo (Carthamus tinctorius) o haba de cacao, microorganismos tales como hongos, por ejemplo los géneros Mortierella, Saprolegnia o Pythium, bacterias tales como el género Escherichia, levaduras tales como el género Saccharomyces, cianobacterias, ciliados, algas o protozoos tales como dinoflagelados tales como Crypthecodinium. Se da preferencia a organismos que pueden sintetizar naturalmente aceite en cantidades relativamente grandes, tales como hongos como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soja, colza oleaginosa, coco, palma oleaginosa, cártamo, lino, planta de aceite de ricino, caléndula, cacahuete, haba de cacao o girasol, o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, y se da preferencia particular a soja, lino, colza oleaginosa, girasol, caléndula, Mortierella o Saccharomyces cerevisiae. En principio, aparte de los organismos transgénicos identificados anteriormente, son adecuados animales no humanos transgénicos, por ejemplo C. elegans.

Células huésped útiles adicionales se identifican en: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Cepas de expresión utilizables, por ejemplo las que exhiben una actividad de proteasa relativamente baja, se describen en: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Un objetivo adicional de la invención se refiere al uso de un casete de expresión que contiene secuencias de DNA que codifican un gen de \Delta6-desaturasa o secuencias de DNA que se hibridan con las mismas para la transformación de células de planta, tejidos o partes de plantas. El objetivo del uso es incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen un contenido incrementado de dobles enlaces en la posición \Delta6.

Al hacer esto, dependiendo de la elección del promotor, el gen de \Delta6-desaturasa puede expresarse específicamente en las hojas, en las semillas, los nodos, las raíces, en el tallo u otras partes de la planta. Aquellas plantas transgénicas que sobreproducen ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen dobles enlaces \Delta6, el material reproductivo de las mismas, junto con las células de planta, los tejidos o las partes de las mismas son un objetivo adicional de la presente invención. Un objetivo preferido de acuerdo con la invención comprende plantas transgénicas que contienen una secuencia de ácido nucleico funcional o no funcional (= DNA antisentido o enzima inactiva enzimáticamente) o un casete de expresión funcional o no funcional de acuerdo con la invención.

El casete de expresión o las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención que contienen una secuencia génica de \Delta6-desaturasa también pueden emplearse por otra parte para la transformación de los organismos identificados, a modo de ejemplo, anteriormente, tales como bacterias, cianobacterias, levaduras, hongos filamentosos, ciliados y algas, con el objetivo de incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que poseen dobles enlaces \Delta6.

Dentro de la estructura de la presente invención, incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que poseen dobles enlaces \Delta6 significa, por ejemplo, el rasgo adquirido artificialmente de un comportamiento biosintético incrementado debido a la sobreexpresión funcional del gen de \Delta6-desaturasa en los organismos de acuerdo con la invención, ventajosamente en las plantas transgénicas de acuerdo con la invención, en comparación con las plantas iniciales no modificadas genéticamente al menos a lo largo de la duración de al menos una generación de plantas.

El lugar preferido de biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos, por ejemplo, es generalmente la semilla o capas celulares de la semilla, de modo que es apropiada una expresión específica para la semilla del gen de \Delta6-desaturasa. Sin embargo, es obvio que la biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos no necesita limitarse al tejido de la semilla sino que también puede producirse de manera específica para los tejidos en otras partes de la planta - en células de la epidermis o en los nodos, por ejemplo.

Por otra parte, una expresión constitutiva del gen de \Delta6-desaturasa endógeno es ventajosa. Por otra parte, sin embargo, también puede parecer deseable una expresión inducible.

La eficacia de la expresión del gen de \Delta6-desaturasa puede determinarse, por ejemplo, in vitro mediante propagación del meristemo del vástago. Además, una expresión del gen de \Delta6-desaturasa modificada en naturaleza y nivel y su efecto sobre el comportamiento de biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos puede probarse sobre plantas de prueba en experimentos de invernadero.

Un objetivo adicional de la invención comprende organismos transgénicos tales como plantas transgénicas transformadas por un casete de expresión que contiene una secuencia del gen de \Delta6-desaturasa de acuerdo con la invención o secuencias de DNA que se hibridan con la misma, así como células, tejido, partes y material de reproducción transgénicos de tales plantas. Se da preferencia particular en este caso a plantas de cultivo transgénicas tales como, a modo de ejemplo, cebada, trigo, centeno, avena, maíz, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, colza oleaginosa y canola, girasol, lino, cáñamo, cardo, patatas, tabaco, tomates, colza oleaginosa, tapioca, yuca, maranta, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, nueces y vides.

Para los propósitos de la invención, las plantas son plantas mono- y di-cotiledóneas, mohos y algas.

Un refinamiento adicional de acuerdo con la invención son plantas transgénicas como las descritas anteriormente que contienen una secuencia de ácido nucleico funcional o no funcional de acuerdo con la invención o un casete de expresión funcional o no funcional de acuerdo con la invención. Por no funcional se entiende que una proteína enzimáticamente activa ya no se sintetiza. Por otra parte, por ácidos nucleicos o constructos de ácido nucleico no funcionales también se entiende lo que se conoce como un DNA antisentido que da como resultado plantas transgénicas que muestran una reducción en la actividad enzimática o ausencia de actividad enzimática. Con la ayuda de la técnica antisentido, especialmente cuando la secuencia de ácido nucleico se combina en el DNA antisentido con otros genes de síntesis de ácidos grasos, es posible sintetizar triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o ácidos grasos insaturados. Por otra parte por medio de lo que se conoce como coexpresión o por medio de la técnica del RNAi, pueden manipularse plantas transgénicas de tal modo que no se produce en las plantas actividad enzimática o se produce actividad enzimática reducida. Por plantas transgénicas se entiende células de planta simples o cultivos de las mismas sobre medios fijos o en cultivo líquido, partes de plantas y plantas enteras.

Otros objetivos de la invención son:

-: Un método para la transformación de una planta que comprende la introducción de casetes de expresión de acuerdo con la invención que contienen una secuencia de gen de \Delta6-desaturasa derivada de primuláceas o secuencias de DNA que se hibridan con la misma en una célula de plantas, en tejido calloso, una planta entera o protoplastos de planta.

-: Un método para producir PUFAs, en donde el método comprende el crecimiento de un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, un constructo génico de acuerdo con la reivindicación 6 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7, que codifica una \Delta6-desaturasa que desatura específicamente ácidos grasos \omega-3, y en donde debido a la actividad de la \Delta6-desaturasa, se forman PUFAs en el organismo que exhiben un contenido incrementado de ácidos grasos \omega-3. En este método, se producen ventajosamente ácidos grasos \omega-3, tales como ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico.

-: Uso de una secuencia génica de DNA de \Delta6-desaturasa o secuencias de DNA que se hibridan con la misma para la producción de plantas que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen dobles enlaces \Delta6 debido a la expresión de dicha secuencia de DNA de \Delta6-desaturasa en plantas.

-: Uso de una secuencia génica de DNA de \Delta6-desaturasa o secuencias de DNA que se hibridan con la misma para la producción de plantas que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lípidos que tienen dobles enlaces \Delta6, particularmente de ácidos grasos \omega-3, debido a la expresión de dicha secuencia de DNA de \Delta6-desaturasa en plantas.

-: Proteínas que contienen las secuencias de aminoácidos representadas en el Nº ID SEC: 2 o Nº: 4.

-: Uso de dichas proteínas que tienen las secuencias Nº ID SEC: 2 o Nº: 4 para producir ácidos grasos insaturados.

Un objetivo adicional de acuerdo con la invención es un método para producir ácidos grasos insaturados que comprende: introducir al menos una de dichas secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención o al menos un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una planta preferiblemente productora de aceite; hacer crecer dicho organismo; aislar aceite contenido en dicho organismo; y liberar los ácidos grasos presentes en dicho aceite. Estos ácidos grasos insaturados contienen ventajosamente dobles enlaces \Delta6. Los ácidos grasos pueden liberarse de los aceites o lípidos, por ejemplo mediante hidrólisis básica, por ejemplo usando NaOH o KOH.

También se enumera entre los objetivos de la invención un método para producir triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados que comprende: introducir al menos una de dichas secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención o al menos un casete de expresión de acuerdo con la invención en un organismo productor de aceite; hacer creer dicho organismo; y aislar aceite contenido en dicho organismo.

Un objetivo adicional de acuerdo con la invención es un método para producir triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados incubando triglicéridos que contienen ácidos grasos saturados o insaturados o saturados e insaturados con al menos una de las proteínas codificadas por las secuencias Nº ID SEC: 2 o Nº: 4. El método se lleva a cabo ventajosamente en presencia de compuestos que pueden captar o liberar equivalentes de reducción. Los ácidos grasos pueden liberarse a continuación de los triglicéridos.

Un objetivo adicional de acuerdo con la invención de dicho método para producir triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o insaturados o ácidos grasos saturados e insaturados que tienen ventajosamente un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados es un método en el que los ácidos grasos se liberan de los triglicéridos con la ayuda de hidrólisis básica conocida por los expertos en la técnica o por medio de una enzima tal como una lipasa.

Los métodos especificados anteriormente permiten ventajosamente la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos que contienen dobles enlaces \Delta6.

Los métodos identificados anteriormente permiten ventajosamente la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos que contienen dobles enlaces \Delta6, en donde el substrato usado para la reacción de la \Delta6-desaturasa es preferiblemente ácido \alpha-linoleico. De este modo, el método identificado anteriormente permite ventajosamente en particular la síntesis de ácidos grasos derivados de ácido estearidónico
(C_{18:4}^{\Delta}^{6, \ 9,} ^{12, \ 15}), tal como, a modo de ejemplo, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.

Usando lo que se conoce como tecnología antisentido, en un método también pueden producirse ácidos grasos o triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados.

Ejemplos de organismos para los que pueden mencionarse dichos métodos son plantas tales como Arabidopsis, primuláceas, borraja, cebada, trigo, centeno, avena, maíz, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, colza oleaginosa y canola, girasol, lino, cáñamo, patatas, tabaco, tomates, colza, tapioca, yuca, maranta, alfalfa, cacahuete, planta de aceite de ricino, coco, palma oleaginosa, cártamo (Carthamus tinctorius) o haba de cacao, microorganismos tales como los hongos Mortierella, Saprolegnia o Pythium, bacterias tales como el género Escherichia, cianobacterias, levaduras tales como el género Saccharomyces, algas o protozoos tales como dinoflagelados como Crypthecodinium. Se da preferencia a organismos que pueden sintetizar naturalmente aceites en cantidades relativamente grandes, tales como hongos como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soja, colza oleaginosa, coco, palma oleaginosa, cártamo, planta de aceite de ricino, caléndula, cacahuete, haba de cacao o girasol, o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, y se da particularmente preferencia a la soja, la colza oleaginosa, el girasol, el lino, las primuláceas, la borraja, Carthamus o Saccharomyces cerevisiae.

Dependiendo del organismo huésped, los organismos usados en los métodos se hacen crecer o se cultivan de una manera conocida por los expertos en la técnica. Los microorganismos se hacen crecer habitualmente en un medio líquido que contiene una fuente de carbono, habitualmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, habitualmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas tales como extracto de levadura o sales tales como sulfato amónico, elementos traza tales como sales de hierro, manganeso o magnesio y opcionalmente vitaminas, a temperaturas de entre 10ºC y 60ºC con exposición a oxígeno gaseoso. Al hacer esto, el pH del líquido nutriente puede mantenerse a un valor fijo, esto es, durante el crecimiento se regula o no. El crecimiento puede seguirse de modo discontinuo, modo semidiscontinuo o continuamente. Pueden proporcionarse nutrientes al principio de la fermentación o alimentarse semicontinuamente o continuamente.

Después de la transformación, las plantas se regeneran en primer lugar como se describe anteriormente y a continuación se cultivan como es normal.

Después del crecimiento, los lípidos se aíslan de los organismos de modo habitual. Para este propósito, después de la recogida, los organismos pueden en primer lugar digerirse o usarse directamente. Los lípidos se extraen ventajosamente usando disolventes adecuados tales como disolventes apolares como hexano o etanol, isopropanol o mezclas tales como hexano/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamílico a temperaturas de entre 0ºC y 80ºC, preferiblemente entre 20ºC y 50ºC. La biomasa se extrae habitualmente con un exceso de disolvente, por ejemplo un exceso de disolvente a biomasa de 1:4. El disolvente se retira a continuación, por ejemplo mediante destilación. La extracción también puede realizarse usando CO_{2} supercrítico. Después de la extracción, la biomasa restante puede retirarse, por ejemplo mediante filtración.

El aceite en bruto aislado de este modo puede purificarse a continuación adicionalmente, por ejemplo retirando turbidez mediante tratamiento con disolventes polares tales como acetona o cloroformo y a continuación filtración o centrifugación. También es posible la purificación adicional a través de columnas.

Para obtener los ácidos libres a partir de los triglicéridos, los últimos se saponifican de modo habitual.

También se describen ácidos grasos insaturados y triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados producidos mediante los métodos identificados anteriormente y el uso de los mismos para producir alimentos, piensos para animales, cosméticos o productos farmacéuticos. Para este propósito, los últimos se añaden en cantidades habituales a los alimentos, el pienso para animales, los cosméticos o los productos farmacéuticos.

Dichos ácidos grasos insaturados descritos así como los triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados producidos mediante los métodos identificados anteriormente son el resultado de la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en los diversos organismos huésped. Esto da como resultado globalmente una modificación de la composición de los compuestos en la célula huésped que contiene ácidos grasos insaturados en comparación con las células huésped de partida originales que no contienen los ácidos nucleicos. Estas modificaciones son más notables en organismos huésped, por ejemplo células de planta, que naturalmente no contienen las proteínas o enzimas codificadas por los ácidos nucleicos que en organismos huésped que naturalmente contienen las proteínas o enzimas codificadas por los ácidos nucleicos. Esto da lugar a organismos huésped que contienen aceites, lípidos, fosfolípidos, esfingolípidos, glicolípidos, triacilgliceroles y/o ácidos grasos libres que tienen un contenido superior de PUFAs. Para los propósitos de la invención, por un contenido incrementado se entiende que los organismos huésped contienen al menos 5%, ventajosamente al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, de forma particularmente preferible al menos 30%, de la forma más particularmente preferible al menos 40% más ácidos grasos poliinsaturados en comparación con el organismo inicial que no contiene los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Este es particularmente el caso para plantas que no contienen naturalmente ácidos grasos C_{20} o C_{22} poliinsaturados de cadena más larga tales como DHA, EPA o ARA. Debido a la expresión de los ácidos nucleicos, nuevas composiciones lipídicas se producen mediante dichos medios, siendo estas un aspecto adicional de la invención.

La invención se explica con más detalle mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Métodos de clonación generales

Los métodos de clonación, tales como, a modo de ejemplo, segmentaciones por restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de fragmentos de DNA, transferencia de ácidos nucleicos a membranas de nitrocelulosa y nailon, conexión de fragmentos de DNA, transformación de células de Escherichia coli, cultivo de bacterias y análisis de secuencia de DNA recombinante, se llevaron a cabo como se describe en Sambrook y otros (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).

Ejemplo 2 Análisis de secuencia de DNA recombinante

La secuenciación de moléculas de DNA recombinante se realizó usando un secuenciador de DNA de fluorescencia lasérica de la compañía ABI mediante el método de Sanger (Sanger y otros (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Los fragmentos resultantes de una reacción en cadena de la polimerasa se sometieron a secuenciación y se verificaron para evitar errores de polimerasa en los constructos que habían de expresarse.

Ejemplo 3 Clonación de la \Delta6-desaturasa de Muscariodides vialii (= Nº ID SEC: 3)

RNA total de hojas de Muscariodides vialii jóvenes se aisló con la ayuda del estuche RNAeasy de la compañía Qiagen (Valencia, CA, EE.UU. de A.). Con la ayuda de oligo-dT-celulosa, se aisló poli-A+RNA (mRNA) del RNA total (Sambrook y otros, 1989). Usando el estuche Reverse Transcription System de Promega, el RNA se transcribió inversamente y el cDNA sintetizado se usó para la amplificación por PCR de las \Delta6-desaturasas. Se usaron cebadores degenerados para la amplificación de la \Delta6-desaturasa. La secuencia de nucleótidos se derivó de los motivos de caja de histidina primero y tercero de \Delta6-desaturasa de borraja (Syanova y otros, 1997, WO9621022).

Cebador 1: GGITGGHTIGGICAYGAYKYIKSICA

Cebador 2: GGRAAIAGRTGRTGYTCDATYTG

En los cebadores identificados aquí y en las secuencias de los cebadores indicadas posteriormente, los símbolos o las letras de acuerdo con Wobble IUPAC-IUB tienen el siguiente significado:

R = A/G; Y = C/T; M = A/C ; K = G/T ; S = G/C; W = A/T; H = A/C/T; B = G/T/C; V = G/C/A; D = G/T/A y N = G/A/T/C.

Procedimiento de PCR

Temperatura de adición: 1 min a 45ºC

Temperatura de desnaturalización: 1 min a 94ºC

Temperatura de elongación: 2 min a 72ºC

Número de ciclos: 35

La mezcla de PCR se separó sobre un gel de agarosa y se aisló un fragmento de 660 pb. El fragmento de PCR se clonó en el vector pGEM-T easy (Promega) y el inserto se sometió a secuenciación a continuación.

La región 5’ y 3’ ausente del fragmento génico aislado de Muscariodides vialii se aisló con la ayuda del estuche Smart RACE cDNA (Clonetech) y a continuación se sometió a secuenciación. Partiendo de 3’ y 5’, se derivaron cebadores de secuencia para aislar el clon completo. Con este propósito, los cebadores se derivaron de las regiones de DNA alrededor de la metionina de iniciación y el codón de parada. La PCR daba una sola banda del tamaño esperado. El cDNA se clonó de nuevo en el vector pGEM T easy y el gen ahora completo se sometió a secuenciación.

Ejemplo 4 Clonación de la \Delta6-desaturasa de Aleuritia farinosa (= Nº ID SEC: 1)

RNA total de hojas de Aleuritia farinosa jóvenes se aisló con la ayuda del estuche RNAeasy de la compañía Qiagen (Valencia, CA, EE.UU. de A.). Con la ayuda de oligo-dT-celulosa, se aisló poli-A+RNA (mRNA) del RNA total (Sambrook y otros, 1989). Usando el estuche Reverse Transcription System de Promega, el RNA se transcribió inversamente y el cDNA sintetizado se usó para la amplificación por PCR de las \Delta6-desaturasas. Se usaron cebadores degenerados para la amplificación de la \Delta6-desaturasa. La secuencia de nucleótidos se derivó de los motivos de caja de histidina primero y tercero de \Delta6-desaturasa de borraja (Syanova y otros, 1997, WO9621022).

Cebador 1: GGITGGHTIGGICAYGAYKYIKSICA

Cebador 2: GGRAAIAGRTGRTGYTCDATYTG

Procedimiento de PCR

Temperatura de adición: 1 min a 45ºC

Temperatura de desnaturalización: 1 min a 94ºC

Temperatura de elongación: 2 min a 72ºC

Número de ciclos: 35

La región 5’ y 3’ ausente del fragmento génico aislado de Aleuritia farinosa se aisló con la ayuda del estuche Smart RACE cDNA (Clonetech) y a continuación se sometió a secuenciación. Partiendo de 3’ y 5’, se derivaron cebadores de secuencia para aislar el clon completo. Con este propósito, los cebadores se derivaron de las regiones de DNA alrededor de la metionina de iniciación y el codón de parada. La PCR daba una sola banda del tamaño esperado. El cDNA se clonó de nuevo en el vector pGEM T easy y el gen ahora completo se sometió a secuenciación.

Ejemplo 5 Clonación de plásmidos de expresión para expresión constitutiva en plantas

Por medio de cebadores apropiados en el extremo 5’ y 3’ de ambas nuevas desaturasas, se introdujo un ClaI y una interfase XbaI.

Diseño del cebador para la \Delta6-desaturasa de M. vialii:

: atcgatatggctaacaaatctcccacc (ClaI)

: tctagattagccgtgtgtgtggacggctt (XbaI)

Diseño del cebador para la \Delta6-desaturasa de A. farinosa:

: atcgatatggctaacaaatctcccacc (ClaI)

: tctagatcacccgagagttttaagagct (XbaI)

Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa, se digirieron con ClaI/XbaI y se ligaron en el vector apropiadamente cortado pSLJ4K1. Los plásmidos resultantes contienen promotor 35S (virus del mosaico de la coliflor; Franck y otros (1980) Cell 21, 285), la \Delta6-desaturasa de Muscariodides vialii o Aleuritia farinosa y el terminador 35S del vector pSLJ4K1. Aparte de dichos promotores o terminadores, pueden usarse todos los promotores constitutivos o todos los promotores de virus de planta tales como ventajosamente el promotor nos (Wilkinson y otros, Journal of Experimental Botany, 48, 1997: 307 y siguientes) o el promotor de ubiquitina. Los promotores y terminadores identificados en la descripción también pueden usarse ventajosamente en principio para la expresión.

Los constructos se usaron para la transformación de Arabidopsis thaliana, colza oleaginosa, tabaco y linaza.

\newpage

Ejemplo 5 Clonación de plásmidos de expresión para expresión específica para semillas en plantas

Para la transformación de plantas, se produjo un vector de transformación adicional basado en pBin-USP que contiene los fragmentos de BamHI de las \Delta6-desaturasas de M. vialii o A. farinosa. Las interfases BamHI estaban como se describe en el Ejemplo 4 [¿5? ¡Este es el segundo Ejemplo 5!], unidas a los ATGs de inicio o los codones de parada con la ayuda de cebadores apropiados mediante PCR.

Diseño del cebador para la \Delta6-desaturasa de M. vialii:

: ggatccatggctaacaaatctcccacc

: ggatccttagccgtgtgtgtggacggctt

Diseño del cebador para la \Delta6-desaturasa de A. farinosa:

: ggatccatggctaacaaatctcccacc

: ggatcctcacccgagagttttaagagct

pBin-USP es un derivado del plásmido pBin19. pBin-USP se produjo a partir de pBin19 insertando un promotor USP como un fragmento EcoRI-BaMHI en pBin19 (Bevan y otros (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711). La señal de poliadenilación es la del gen 3 del T-DNA del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y otros, (1984) EMBO J. 3, 835), con lo que los nucleótidos 1149-11939 se aislaron como un fragmento PvuII-HindIII y, después de la adición de los conectores SphI a la interfase PvuII entre la interfase SpHI-HindIII del vector, se clonaron. El promotor USP corresponde a los nucleótidos 1-684 (número de registro del banco de genes X56240), en donde una parte de la región no codificante del gen USP está contenida en el promotor. El fragmento de promotor que llega hasta 684 pares de bases se amplificó mediante métodos estándar por medio de un cebador estándar T7 comercial (Stratagene) y usando un cebador sintetizado a través de una reacción de PCR (Secuencia del cebador:

5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGC-TGGCTATGAA-3’). El
fragmento de PCR se recortó usando EcoRI/SalI y se insertó en el vector pBin19 con el terminador OCS. Se obtuvo el plásmido que tenía la denominación pBinUSP. Los constructos se usaron para transformar Arabidopsis thaliana, colza oleaginosa, tabaco y linaza.

Ejemplo 6 Producción de plantas transgénicas

a) Producción de plantas transgénicas (modificada de acuerdo con Moloney y otros, 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242).

Para producir plantas de colza oleaginosa transgénicas, se usaron vectores binarios en Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 o Escherichia coli (Deblaere y otros, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para transformar plantas de colza oleaginosa (var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania) se usó una dilución 1:50 de un cultivo nocturno de una colonia de agrobacterias transformada positivamente en medio de Murashige-Skoog (Murashige y Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) que contiene 3% de sacarosa (medio 3MS). Los petiolos o los hipocotiledones de plantas de colza estériles recientemente germinadas (aproximadamente 1 cm^{2} cada uno) se incubaron en una placa Petri con una dilución de agrobacterias 1:50 durante 5-10 minutos. Esto fue seguido por una incubación de 3 días en la oscuridad a 25ºC en medio 3MS que contiene 0,8% de Bacto-Agar. Después de tres días, el cultivo se continuó con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y en un ciclo semanal en medio MS que contenía 500 mg/ml de Claforan (cefotaxima sódica), 50 mg/l de kanamicina, 20 microM de bencilaminopurina (BAP) y 1,6 g/l de glucosa. Los vástagos en crecimiento se transfirieron a medio MS que contenía 2% de sacarosa, 250 mg/l de Claforan y 0,8% de Bacto-Agar. Si después de tres semanas no se habían formado raíces, se añadía ácido 2-indolbutírico al medio como una hormona de crecimiento con propósitos de enraizamiento.

Se obtuvieron vástagos regenerados en medio 2MS usando kanamicina y Claforan, se transfirieron a suelo después del enraizamiento y después del cultivo se hicieron crecer durante 2 semanas en una cámara de clima controlado, se llevaron hasta el capullo y después de la recogida de la semilla madura se investigaron con respecto a la expresión de \Delta6-desaturasa por medio de análisis de lípidos. Se identificaron líneas que tenían contenidos incrementados de dobles enlaces en la posición \Delta6. En las líneas transgénicas establemente transformadas que expresaban funcionalmente el transgén, se encontró que hay un contenido incrementado de dobles enlaces en la posición \Delta6 en comparación con plantas de control no transformadas.

b) Pueden producirse plantas de lino transgénicas, por ejemplo, mediante el método de Bell y otros, 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465, por medio de bombardeo de partículas. Pueden producirse transformaciones me-
diadas por agrobacterias, por ejemplo, según se describe por Mlynarova y otros (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.

Ejemplo 7 Extracción de lípidos de semilla

Material de plantas se homogeneizó mecánicamente en primer lugar por medio de trituradores para hacerlo más propenso a la extracción.

Se calentó a continuación hasta 100ºC durante 10 min y después de enfriar sobre hielo se sedimentó de nuevo. El sedimento celular se hidrolizó con ácido sulfúrico metanólico 1 M y dimetoxipropano al 2% durante 1 h a 90ºC y los lípidos se transmetilaron. Los ésteres metílicos de ácido graso (FAMEs) resultantes se extrajeron finalmente en éter de petróleo. Los FAMEs extraídos se analizaron mediante cromatografía gas-líquido usando una columna capilar (Chrompack, WCOT gel de sílice, CP cera 52 CB, 25 m, 0,32 mm) y un gradiente de temperatura de 170ºC a 240ºC en 20 min y 5 min a 240ºC. La identidad de los ésteres metílicos de ácido graso se confirmó mediante comparación con patrones de FAME correspondientes (Sigma). La identidad y la posición del doble enlace se analizó adicionalmente por medio de GC-MS mediante derivación química adecuada de las mezclas de FAME, por ejemplo para formar derivados de 4,4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998). Los análisis de GC de los ésteres metílicos de ácido graso obtenidos de las semillas de colza transgénica que exhibían expresión específica para las semillas de la \Delta6-desaturasa se presentan en la Tabla 1. Las semillas de colza transgénica contenían hasta 5% de ácido \gamma-linolénico en la semilla.

Ejemplo 8 Expresión de \Delta6-desaturasas de primuláceas en levadura (Saccharomyces cerevisiae)

Las tramas de lectura abierta de la \Delta6-desaturasas obtenidas de Muscariodides vialii y Aleuritia farinosa se clonaron cada una más allá del promotor GAL-1 inducible por galactosa del vector de expresión de levadura pYES2 (Invitrogen). Las tramas de lectura abierta se amplificaron por medio de PCR. Las interfases usadas para clonar eran KpnI y EcoRI.

Diseño del cebador para M. vialii:

: ggtaccatggctaacaaatctcccacc (KpnI)

: gaattcttagccgtgtgtgtggacggctt (EcoRI)

Diseño del cebador para A. farinosa:

: ggtaccatggctaacaaatctcccacc (KpnI)

: gaattctcacccgagagttttaagagct (EcoRI)

Los vectores producidos se usaron para expresión en levadura. Las especificidades para el substrato se determinaron alimentando las cepas de levadura transformadas con ácido \alpha-linolénico y ácido linoleico. La metodología usada se describe, por ejemplo, en Napier y Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova y otros, 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling y otros, 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson y otros, 1998, FEBS Letters, 439(3):215-218.

Para comparar las especificidades, la \Delta6-desaturasa de borraja (Borago officinalis) se expresaron asimismo en levadura (Sayanova y otros, 1999, Plant Physiol. 121(2):641-646).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Expresión en levadura. Comparación de especificidades para el substrato de \Delta6-desaturasas de borraja, A. farinosa y M vialii

1

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Conversión de ácido linoleico mediante \Delta6-desaturasa de borraja y las \Delta6-desaturasas de primuláceas mediante comparación con la conversión de ácido \alpha-linolénico

2

Puede colegirse de las tablas que las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención codifican \Delta6-desaturasas que son específicas para ácidos grasos \omega-3.

<110> BASF Plant Science GmbH

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Delta 6-desaturasas de primuláceas, plantas expresantes y aceites que contienen PUFA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 2002_54

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 2002_54

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2002-02-15

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Vers. 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aleuritia farinosa

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1362)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aleuritia farinosa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Muscarioides vialii

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1362)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Muscarioides vialii

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

Claims

1. Secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos que tienen actividad de \Delta-6-desaturasa, en donde las \Delta-6-desaturasas codificadas por las secuencias de ácido nucleico convierten específicamente ácidos grasos \omega-3, seleccionadas del grupo:

c): derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en el Nº ID SEC: 1 o el Nº ID SEC: 3 que codifican polipéptidos que usan las secuencias de aminoácidos representadas en el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 y tienen al menos 75% de homología a nivel de aminoácidos con el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 y poseen actividad de \Delta-6-desaturasa.

2. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia se origina de una planta.

3. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha secuencia se deriva de los géneros Muscariodides o Aleuritia.

4. Una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un constructo génico que contiene un ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ácido nucleico está funcionalmente conectado a una o más señales de regulación

6. Un vector que contiene un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 o un constructo génico de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un organismo no humano transgénico transformado con al menos un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, un constructo génico de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6 que codifica un polipéptido que tiene actividad de \Delta-6-desaturasa.

8. El organismo no humano transgénico de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.

9. El organismo no humano transgénico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde dicho organismo es una planta.

10. Un método para producir PUFAs, en donde el método comprende hacer crecer un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, un constructo génico de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6 que codifica una \Delta-6-desaturasa que desatura específicamente ácidos grasos \omega-3, y en donde debido a la actividad de dicha \Delta-6-desaturasa, se forman PUFAs en dicho microorganismo que exhiben un contenido incrementado de ácidos grasos \omega-3.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde en el método se producen ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que las moléculas de ácido graso poliinsaturado se aíslan de dicho organismo en forma de un aceite, un lípido o un ácido graso libre.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho organismo es una planta transgénica.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dicho ácido graso poliinsaturado es un ácido graso C_{18} que tiene al menos tres dobles enlaces en la molécula.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el aceite, los lípidos o los ácidos grasos producidos se añaden en cantidades habituales a alimentos, piensos para animales, cosméticos o productos farmacéuticos.