JP2007514420A - 飽和脂肪酸のレベルが低減されたトランスジェニック植物およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、種油中の飽和脂肪酸のレベルが低減されたトランスジェニック植物およびその製造方法を提供する。この方法により発生したトランスジェニック植物は種油中に低減されたレベルの飽和脂肪酸を含有するが、この低減されたレベルは小胞体保留および回収シグナル配列に機能的に連結された原核生物のデルタ-9不飽和化酵素(すなわち飽和脂肪酸のデルタ-9位にcis二重結合を導入する酵素)の発現に起因するものである。本発明の一つの例はシアノバクテリアであるAnacystis nidulans由来の異種デルタ-9不飽和化酵素を発現する植物であるが、この酵素はKKSS(配列番号5)小胞体保留および回収シグナル配列と機能的に連結されており、脂質結合型16:0および18:0脂肪酸をそれぞれ16:1および18:1へと変換するものである。
【選択図】 なし
Description
本出願は、「METHOD OF CREATING PLANTS WITH REDUCED LEVEL OF SATURATED FATTY ACID IN SEED OIL」と題され、2003年12月18日に出願された、カナダ特許出願番号第2,450,000号からの優先権を主張するものである。
本発明は広くは、トランスジェニック植物の分野に関する。より詳細には、本発明は、植物によって産生される種油の飽和脂肪酸含量を低減させるために、植物中の脂肪酸代謝を変更する分子技術に関する。この技術は、例えば油産生植物と比較して栄養価の改善された種油の量産において有用である。
特定の目的のために設計された植物由来の油を創り出すために、植物中の脂肪酸(FA)代謝を変更することには特別な関心が寄せられてきた。油の性質はその脂肪酸組成によって決まり、脂肪酸組成は栄養組成と酸化安定性の両方に影響を及ぼす。
本発明は、植物により産生される種油中の飽和脂肪酸のレベルを低減させるための分子技術を提供する。より詳細には、本発明の分子技術は、植物により産生される種油中の飽和脂肪酸含量を低減させるのに有効なレベルで、植物中にデルタ-9不飽和化酵素活性を有する酵素(すなわちデルタ-9位で脂肪酸を不飽和化する酵素)を発現させる。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(b) (a)において定義したポリペプチドの変異体または相同体であって、該ポリペプチドと少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の同一性を有し、かつデルタ-9不飽和化酵素活性を有するもの、あるいは
(c) (a)において定義したポリペプチドの断片であって、該ポリペプチドと同一の少なくとも連続した50アミノ酸を有し、かつデルタ-9不飽和化酵素活性を有するもの、
を含む。
本発明の一例として、本出願人らは、トランスジェニックキャノーラ植物を開発し、現行の商用品種と比較して飽和脂肪酸含量%が約40%低減されたことを実証した。この低減は、キャノーラ植物中で、小胞体(ER)保留および回収シグナルであるKKSS(配列番号5)に融合された配列番号2に記載のデルタ-9不飽和化酵素を含む組換えポリペプチドを発現させることにより達成された。KKSS(配列番号5)に融合された不飽和化デルタ-9酵素の発現はキャノーラ種油の飽和FA含量を著しく低減させるのに対して、不飽和化酵素遺伝子単独(すなわちKKSS(配列番号5)に融合されていないもの)はキャノーラ種油中の飽和脂肪酸レベルを低減させるのにさほど効果的ではないことを本出願人らは見出した。野生型キャノーラからの種油中の飽和脂肪酸含量約7.2%と比較して、本明細書に記載するトランスジェニックキャノーラ系統は約4.3%もの少なさの飽和脂肪酸しか含有しなかった。キャノーラ中の両方の主要な飽和脂肪酸(16:0と18:0)がこれらの系統で低減された。
本実施例で用いるデルタ-9不飽和化酵素は、シアノバクテリアであるAnacystis nidulans (Ishizaki-Nishizawaら1996)由来であり、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する。このタンパク質は、脂質に結合した飽和脂肪酸のデルタ-9位にcis-二重結合(すなわち不飽和化)を導入する。このタンパク質は、16:0脂肪酸に対してより高い特異性を有するが、例えば18:0などのより長い飽和脂肪酸も不飽和化する。このタンパク質は、Nishizawaらの米国特許第6,043,411号およびNature Biotechnology 14: 1003-1006に詳細に記載されており、EMBL GeneBankに登録番号X77367として登録されているが、これらの引用物の全てを参照により本明細書に組み入れる。この不飽和化酵素をコードする遺伝子を本明細書では「Anacystis nidulans由来のdes9遺伝子(配列番号1)」と呼ぶが、ときには同酵素は当技術分野ではDSG遺伝子と呼ばれる。
油産生植物においては、油の合成と脂質結合型脂肪酸の不飽和化は、とりわけ種子では、細胞の小胞体で行われる。従って、真核細胞中では、脂肪酸代謝に関わる原核生物酵素(例えば不飽和化酵素)の活性を、その酵素をERに標的化することにより、増加させることができるかもしれない。
(a) KDEL(配列番号4)(例えばVan den Broeckら(1985) Nature 313, 358;およびMichaelisら(1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425を参照されたい)、
(b) KKXX(配列番号3)、ここでXは任意のアミノ酸であり、特にKKSS(配列番号5)(Vincentら(1998) J. Biol. Chem. 273:950-6)、
(c) HDEF(配列番号6)(Lehmann K.ら(2001) Plant Physiol. Oct;127(2):436-49)、
(d) KEEL(配列番号7)およびKDQL(配列番号8)(Manabu Murakami, Takayoshi Ohba, Feng Xu, Seiji Shida, Eisaku Satoh, Kyoichi Ono, Ichiro Miyoshi, Hiroyuki Watanabe, Hiroshi Ito, and Toshihiko Iijima「Genomic organization and functional analysis of murine PKD2L1」(2004) JBC印刷中の論文。原稿番号M411496200として、2004年11月17日に刊行された)。
本明細書において「DNA構築物」という用語は、細胞を形質転換するために用いる遺伝子のDNA配列を言う。
本発明の核酸を含む形質転換植物細胞およびトランスジェニック植物は、当業者に知られた任意のDNA送達法(例えば「Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual」, Draper J. ら 編 Blackwell Scientific Publications, 1988を参照されたい)を用いて作製することが出来る。こうした方法としては、限定するものではないが、アグロバクテリウム仲介トランスフェクション法、遺伝子銃(biolistic)DNA送達法、プロトプラストのエレクトロポレーション法、直接DNA取り込み法、プロトプラストのPEG処理法、UVレーザーマイクロビーム照射法、ジェミニウイルスベクター法、リポソーム仲介DNA取り込み法、プロトプラストのリン酸カルシウム処理法、および形質転換するDNAでコーティングされた微粒子との細胞懸濁物の撹拌法が挙げられる。これらの方法のなかでも、キャノーラのような双子葉植物についてはアグロバクテリウムの使用が好ましい。なぜならばアグロバクテリウム法は安定な形質転換を保証するからである。アグロバクテリウムを用いる方法としては、野生型腫瘍プラスミドを用いる中間ベクター法(nature, 287(1980) p. 654; Cell, 32 (1983) p.1033; EMBO J., 3 (1984) p. 1525)、T-DNAの腫瘍形成遺伝子領域を欠失したベクターを用いる中間ベクター法(EMBO J., 2 (1983) p. 2143; Bio/Technoloy, 3(1985) p. 629)、バイナリーベクター法(Bio/Technology, 1 (1983) p. 262; Nature, 303 (1983) p. 179; Nucl. Acids Res., 12 (1984) p. 8711)などが挙げられる。これらの方法のうちのどれを用いてもよい。アグロバクテリウムを植物に感染させる方法としては、培養細胞への直接接種法、プロトプラスト共存培養法(co-cultivation)、およびリーフディスク法が挙げられる。リーフディスク法は、直接的かつ簡便に、多数の形質転換植物を作製するのに、多くの場合都合がよい。
(a) ガスクロマトグラフィー(GS):脂肪酸メチルエステル(FAME)、ブチル/ブタノールエステル、プロパン-2-オールエステル(例えば国際標準化機構の手法参照番号ISO 5508:1990 (E)、「Animal and vegetable fats and oils - Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids」を参照されたい)、
(b) 高速液体クロマトグラフィー(HPLC):吸着クロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィー、銀イオンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
(c) 質量分析法(MS):ピコリニルエステル、ジメチルオキサゾリン(DMOX)、ピロリジド、ジメチルジスルフィド誘導体(DMSO)、
(d) 赤外分光法(IR)、および
(e) フーリエ変換赤外分光法(FTIR)。
des9遺伝子(配列番号1、837bp)のオープンリーディングフレーム(ORF)を、Anacystis nidulans(Synechococcus sp.、ATCC番号33912)から増幅したが、これには、両方のプライマーについて、開始コドンおよび終止コドンのすぐ外側にXhoIサイトを導入した次のプライマーを用いた:
DSG-XhoI-5’:
CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG(配列番号9)
およびDSG-XhoI-3’:
CCCCCCTCGAGTTAGTTGTTTGGAGACGCCACTTTG(配列番号10)
PCR産物をゲル精製し、XhoIで消化し、大腸菌(E. coli)ベクターpBluescript(BS/KS)に連結して、その正体を確認するために配列決定した。その後、des9遺伝子(配列番号1)をXhoIでBS/KSから切り出し、植物ベクターpKYLX-Napinに連結させた。このベクターpKYLX-Napinは、pKYLX71ベクター(Schardl ら 1987)の二重35Sプロモーターをセイヨウアブラナ由来の種子特異的ナピン(napin)プロモーターで置き換えることにより創作されたものである。複数の組換えベクターを制限酵素消化により解析して、プロモーターおよびターミネーターに対して正しい方向のdes9遺伝子挿入物を有するクローンを特定した。組換えベクター(pC7)を配列決定し、適当な連結が行われたこと、および導入されたdes9遺伝子挿入物が植物ベクター中で再配置されていないことを確認した。
des9遺伝子(配列番号1)のORF(837bp)を、Anacystis nidulans(Synechococcus sp.、ATCC 番号33912)から増幅したが、これには、両方のプライマーについて開始コドンおよび終止コドンのすぐ外側にXhoIサイトを導入した次のプライマーを用いた:
DSG-XhoI-5’:
CCCCCCTCGAGATGACCCTTGCTATCCGACCCAAG (配列番号9)
およびdes9-3’-ER:
CCCCCCCTCGAGTTAAGAAGACTTTTTGTTGTTTGGAGACGCCAC (配列番号11)
des9-3’-ERプライマーについては、des9遺伝子の終止コドンをアミノ酸Kに変え、その後ろにさらに3つのアミノ酸(KSS)を付加し、その後に新たな終止コドンおよびXhoIサイトを追加した。PCR産物(4アミノ酸の付加のため849bpとなった)をゲル精製し、XhoIで消化し、BS/KSに連結して、その正体を確認するために配列決定した。その後、des9遺伝子をXhoIでBS/KSから切り出し、植物ベクターpKYLX-Napinに連結させた。複数の組換えベクターを解析して、プロモーターおよびターミネーターに対して正しい方向のdes9遺伝子挿入物を有するクローンを特定した。組換えベクター(pC8)を配列決定し、適当な連結が行われたこと、および導入されたdes9遺伝子挿入物が植物ベクター中で再配置されていないことを確認した。
両方の構築物(pC7およびpC8)をその後、Triparental mating法により大腸菌(E. coli)DH5α株からAgrobacterium tumefacience GV3101株へと導入した。大腸菌(E. coli)HB101中のpRK2013(Dittaら, 1980)をヘルパープラスミドとして用いた。トランス接合個体を、数サイクルに渡り50 mg/L リファンピシン(rifampicin)、20 mg/Lゲンタマイシンおよび15 mg/L テトラサイクリンプレート上で選択した。再配置が起こらなかったことを確認にするために、トランス接合個体からプラスミドを抽出し、制限酵素で消化し、大腸菌(E. coli)DH5αから精製されたプラスミドと比較した。
キャノーラの品種である「ウェスター(Wester)」を、Moloney ら (1989)により開発されたプロトコールを用いて、pC7およびpC8遺伝子構築物で形質転換した。手短に述べると、5日齢の苗からの完全に開いた子葉を、鋭利なメスを用いて頂端分裂組織を含むことなく可能な限り頂端分裂組織の近くで、葉柄が含まれるように切り落とした。葉柄の切断された端を、des9遺伝子構築物を有するAgrobacterium tumefaciensの液体培地(光学密度約0.5)1mlに短時間浸けた。次に葉柄を、外植体が直立するように、ペトリ皿上でMMO-BA共存培養培地(ベンジルアデニン(BA)を添加したMurashige Minimal Organics (MMO, Invitrogen Corp., Burlington, Canada)培地)に埋め込んだ。プレートを外科手術用テープで密封し、2〜3日間25℃で16時間明/8時間暗、70〜80mEで、栽培室に置いた。カルスの誘導は、外植体を300mg/L チメンチン(Timentin)(GlaxoSmithKline, Missisauga, Canada)を含有するMMO-BA培地へと移し換えることにより行った。
カルスからの芽形成は、外植体を300mg/Lチメンチン(Timentin)および20mg/Lカナマイシンを含有するMMO-BA培地のプレートへと移し換えることにより誘導した。これらの芽を外植体から切り離し、芽の発達のために、(BAを含まないものの)抗生物質を含むMMO培地を含有するマゼンタの容器に入れた。正常な形態でそして頂芽優勢で芽が伸び出た場合は、芽を根誘導培地(抗生物質およびナフタレン酢酸(NAA)を含有するムラシゲ・スクーグ(MS)培地)へと移し換えた。一旦良好な根系が形成されたら、植物を容器から取り出し、流水下で大部分の寒天を洗い落とし、乾燥を避けるためにジャーで覆われた湿った鉢植え用土に移し換えた。その後、これらを湿度室に入れ、覆いを徐々に外してより多くの空気が入るのを可能にし、植物を寒さに慣れさせた。
再生された植物体は、des9遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってトランスジェニックであることを確認した。再生された形質転換植物体由来のT1種子の胚芽を小片へと刻み、カナマイシンを含有する選択プレートに配置した。トランスジェニック植物由来の胚芽は、全体が緑であるか、または緑と淡色の組み合わせ(比率は組込まれた導入遺伝子の数に依存する)であったのに対して、非トランスジェニック植物由来の種子は全て淡色であった。これは、バイナリーベクターがdes9遺伝子とタンデムにネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ(NptII)遺伝子を有するように遺伝子操作されていたためである。
成熟種子由来の総アシル脂質の脂肪酸組成は、国際標準化機構の手法参照番号ISO 5508:1990 (E)、 「Animal and vegetable fats and oils - Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids」に従って測定した。50〜100mgの種子を、鋼棒を用いて5 mLポリプロピレン製バイアル内で石油エーテル1 mLで粉砕した。ひいた粉が沈んだら、上清0.5 mLを、メチル化溶液(メタノール中の2%ナトリウムメトキシド)が1.2 mL入ったガラス管に移した。十分に混合した後、溶液を室温で30分間インキュベートした。1 mLの再蒸留水(ddH20)を溶液に添加し、よく混合して、相を分離させるために室温で10分間静置した。分離した後、上層からの200μLを、さらに石油エーテル300μLで、GCオートサンプラーバイアル中に希釈し、1μLをGCカラムに注入した。
「Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual」, Draper J. ら 編 Blackwell Scientific Publications, 1988.
Nature, 287(1980) p. 654.
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EMBO J., 2 (1983) p. 2143.
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米国特許第6,355,861号
米国特許第6,683,232号
米国特許出願公開第20040078845号
Claims (33)
- 小胞体保留および回収シグナル配列と機能的に連結された、原核生物由来のデルタ-9不飽和化酵素を含む組換えポリペプチド。
- 原核生物が細菌である、請求項1に記載の組換えポリペプチド。
- 原核生物が、Anacystis、SynechocystisおよびAnabaenaからなる群より選択される属に属するシアノバクテリア藍藻である、請求項1に記載の組換えポリペプチド。
- シアノバクテリアが、Anacystis nidulansである、請求項3に記載の組換えポリペプチド。
- デルタ-9不飽和化酵素が、
(a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(b) (a)において定義されたポリペプチドと少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の同一性を有し、かつデルタ-9不飽和化酵素活性を有する、(a)において定義されたポリペプチドの変異体または相同体、および
(c) (a)において定義されたポリペプチドと同一な少なくとも連続した約50アミノ酸を有し、かつデルタ-9不飽和化酵素活性を有する、(a)において定義されたポリペプチドの断片、
を含むものである、請求項1に記載の組換えポリペプチド。 - デルタ-9不飽和化酵素が配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組換えポリペプチド。
- 小胞体膜保留および回収シグナルが、
(a) KDEL(配列番号4)、
(b) KKXX(配列番号3)、Xは任意のアミノ酸である、
(c) HDEF(配列番号6)、
(d) KEEL(配列番号7)、および
(e) KDQL(配列番号8)、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換えポリペプチド。 - 小胞体膜保留および回収シグナルが、KKSS(配列番号5)のアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の組換えポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の組換えポリペプチドをコードする核酸分子。
- プロモーターと機能的に連結された請求項9に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 脂肪種子植物由来である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 脂肪種子植物が、キャノーラ、大豆、コーン、落花生、ヒマワリ、オリーブ、パーム、ココナッツ、紅花、綿実、カラシ、ゴマ、麻、ヒマ、アボカド、および亜麻からなる群より選択される、請求項12に記載の宿主細胞。
- 脂肪種子植物がキャノーラである、請求項12に記載の宿主細胞。
- トランスジェニック植物細胞中での組換えポリペプチドの発現をもたらすプロモーターと機能的に連結された請求項9に記載の核酸分子を含有するトランスジェニック因子を含む、トランスジェニック植物細胞。
- 脂肪種子植物由来である、請求項15に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 脂肪種子植物が、キャノーラ、大豆、コーン、落花生、ヒマワリ、オリーブ、パーム、ココナッツ、紅花、綿実、カラシ、ゴマ、麻、ヒマ、アボカド、および亜麻からなる群より選択される、請求項16に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 脂肪種子植物がキャノーラである、請求項16に記載のトランスジェニック植物細胞。
- トランスジェニック植物の製造方法であって、
(a) 植物細胞を、請求項9に記載の核酸または該核酸を含むベクターで形質転換するステップ、ただし該核酸は植物細胞中での組換えポリペプチドの発現をもたらすプロモーターと機能的に連結されており、および
(b) ステップ(a)で作製された形質転換植物細胞から植物を再生させるステップ、
を含む前記方法。 - 植物細胞が、脂肪種子植物由来である、請求項19に記載の方法。
- 脂肪種子植物が、キャノーラ、大豆、コーン、落花生、ヒマワリ、オリーブ、パーム、ココナッツ、紅花、綿実、カラシ、ゴマ、麻、ヒマ、アボカド、および亜麻からなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
- 脂肪種子植物がキャノーラである、請求項20に記載の方法。
- トランスジェニック植物中での組換えポリペプチドの発現をもたらすプロモーターと機能的に連結された請求項9に記載の核酸分子を含有するトランスジェニック因子を含む、トランスジェニック植物。
- 脂肪種子植物である、請求項23に記載のトランスジェニック植物。
- 脂肪種子植物が、キャノーラ、大豆、コーン、落花生、ヒマワリ、オリーブ、パーム、ココナッツ、紅花、綿実、カラシ、ゴマ、麻、ヒマ、アボカド、および亜麻からなる群より選択される、請求項24に記載のトランスジェニック植物。
- 脂肪種子植物がキャノーラである、請求項24に記載のトランスジェニック植物。
- 同じ種の野生型植物と比較して飽和脂肪酸含量が低減された油を産生する、請求項23〜26のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物。
- 前記野生型植物と比較して、種油の飽和脂肪酸含量が、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%またはそれより多く低減されている、請求項27に記載のトランスジェニック植物。
- 同じ種の野生型植物と比較して飽和脂肪酸含量が低減された種油を産生するための、請求項23〜28のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物の使用。
- 前記野生型植物と比較して、種油の飽和脂肪酸含量が、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%またはそれより多く低減されている、請求項29に記載の使用。
- トランスジェニック植物がキャノーラである、請求項29に記載の使用。
- 種油の飽和脂肪酸含量が、約7mol%未満である、請求項31に記載の使用。
- 種油の飽和脂肪酸含量が、約4.0%〜約4.5%である、請求項31に記載の使用。
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