JP2005501532A - キメラフラビウイルスベクター - Google Patents
キメラフラビウイルスベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005501532A JP2005501532A JP2003506300A JP2003506300A JP2005501532A JP 2005501532 A JP2005501532 A JP 2005501532A JP 2003506300 A JP2003506300 A JP 2003506300A JP 2003506300 A JP2003506300 A JP 2003506300A JP 2005501532 A JP2005501532 A JP 2005501532A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- flavivirus
- encephalitis
- vector
- envelope
- fever
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 title claims abstract description 97
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims abstract 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 46
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 claims description 42
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 claims description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 34
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 34
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 17
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 claims description 15
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 claims description 15
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 13
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 claims description 13
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 claims description 5
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 claims description 5
- 208000037404 Central European encephalitis Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005805 Murray valley encephalitis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000011448 Omsk hemorrhagic fever Diseases 0.000 claims description 5
- 206010041896 St. Louis Encephalitis Diseases 0.000 claims description 5
- 230000009191 jumping Effects 0.000 claims description 5
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 208000032108 Russian spring-summer encephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 101100124795 Caenorhabditis elegans hsp-110 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000609530 Ilheus virus Species 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150045091 PSA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000879121 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) Sulfide dehydrogenase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000879118 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) Sulfide dehydrogenase subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000538730 Rocio Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241001529801 Tick-borne flavivirus Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 229940124926 Yellow fever virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N tetramethyl orthosilicate Chemical compound CO[Si](OC)(OC)OC LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、ベクターのエンベロープタンパク質に挿入された外来ペプチドを含むキメラフラビウイルスベクター、およびこのようなベクターの使用法を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラフラビウイルスベクター、およびこのようなベクターを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フラビウイルスは、小型でエンベロープに包まれた（+）鎖RNAウイルスである。フラビウイルスのタンパク質は、一つの長い読み枠の翻訳によってポリタンパク質が産生された後に、ポリタンパク質が宿主およびウイルスのプロテアーゼの組み合わせによる複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断を受けて成熟ウイルスタンパク質が産生されることで作られる（Ambergら、J.Virol. 73：8083-8094、1999；Rice、「Flaviviridae」、Virology、Fields編、Raven-Lippincott、New York、1995、第1巻、p.937）。このウイルスの構造タンパク質は、ポリタンパク質中にC-prM-Eの順序に配置されている（「C」はカプシドを意味し、「prM」はウイルスのエンベロープに結合したMタンパク質前駆体を意味し、また「E」はエンベロープタンパク質を意味する）。これらのタンパク質はポリタンパク質のN末端領域に存在し、非構造タンパク質（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5）はポリタンパク質のC末端領域に存在する。
【０００３】
黄熱病ウイルスワクチン株（YF 17D）のCおよび非構造タンパク質、ならびに弱毒化日本脳炎ウイルス（SA 14-14-2）のある株のprMおよびEタンパク質を含むキメラフラビウイルスが作製されている。このキメラは「ChimeriVax（商標）-JE」と命名されており、非免疫対照と比較して、免疫化されたアカゲザルでJEに対する中和抗体の産生を誘導すること、またこのようなサルが、JEの注射後に臨床的脳炎の発症を予防することが報告されている。ChimeriVax（商標）-JEは、ヒト用ワクチンの前臨床安全基準に適合することが報告されている（Monathら、J.Virol. 74（4）：1742-1751、2000）。
【０００４】
YF 17DのCおよび非構造タンパク質、ならびにデング熱2型ウイルス株のprMおよびEタンパク質を含む類似のキメラが作製されている。このキメラはChimeriVax-D2と命名されており、非免疫化対照と比較して、デング熱2型ウイルスに対する中和抗体をアカゲザルで誘導すること、またこのようなサルが、デング熱2型ウイルスの注射後にウイルス血症の発症を予防することが報告されている。ChimeriVax-D2は、安全で遺伝的に安定であることも報告されている（Guirakhooら、J.Virol. 74（12）：5477-5485、2000）。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスのエンベロープタンパク質における、外来ペプチドの挿入を許容する部位を同定する方法を提供する。この方法は以下の段階を含む：（i）外来ペプチドをコードする核酸分子を、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子に導入する段階；（ii）遺伝子にコードされたエンベロープタンパク質を含むフラビウイルスベクターを作製する段階（エンベロープタンパク質は外来ペプチドを含む）；ならびに（iii）段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが挿入を許容するか否かを判定する段階。
【０００６】
本発明のフラビウイルスベクターは、例えば、第1のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質を含むキメラフラビウイルスベクターの場合がある。第1および第2のフラビウイルスは、日本脳炎、デング熱（血清型1型、2型、3型、または4型）、黄熱病（例えばYF 17D）、マレーバレー（Murray Valley）脳炎、セントルイス（St. Louis）脳炎、西ナイル（West Nile）脳炎、クンジン（Kunjin）、ロシオ（Rocio）脳炎、イルヘウス（Ilheus）脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール（Kyasanur）森林病、オムスク（Omsk）出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ（Absettarov）、ハンサロバ（Hansalova）、アポイ（Apoi）、およびHyprからなる群より選択される。
【０００７】
本発明のベクターに挿入される外来ペプチドは、例えばウイルス、細菌、または寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープを含んでもよく、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含んでもよい。これらのペプチドを含む例を以下に示す。
【０００８】
本発明の核酸分子は、本発明の方法で、例えばトランスポゾン変異誘発法で無作為にフラビウイルスのエンベロープ遺伝子に導入することができる。また本発明の方法の段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、挿入を許容するか否かの判定は、例えば（a）フラビウイルスベクターの感染性、（b）ベクターを複数回継代した時の外来タンパク質の配列の安定性、（c）フラビウイルスベクターの成長特性、および/または（d）フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体で中和されるか否か、を解析することで実施することができる。本発明の方法はさらに、フラビウイルスベクターの解析を、それが由来するフラビウイルスの類似の解析と比較する段階を含む場合がある。
【０００９】
本発明は、外来ペプチドを含むエンベロープタンパク質を含む、フラビウイルスベクターも含む。本発明のフラビウイルスベクターは、第1のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合がある。第1および第2のフラビウイルスは、日本脳炎、デング熱（血清型1型、2型、3型、または4型）、黄熱病（例えばYF 17D）、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択することができる。あるいは本発明のフラビウイルスベクターは、黄熱病YF 17Dなどの遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスの場合がある。
【００１０】
本発明のベクターに挿入される外来ペプチドは、ウイルス、細菌、または寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープを含む場合がある。あるいは外来ペプチドは、腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む場合がある。
【００１１】
また本発明は、上述のフラビウイルスベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物、ならびにこのような組成物を患者に投与することによりペプチドを患者に輸送する方法も含む。このような方法は例えば、ペプチドが抗原である場合、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために実施することができる。本発明は、ペプチドを輸送するための、このような組成物の用途、ならびにペプチドの輸送のための薬剤の調製における用途も含む。
【００１２】
本発明は、上述のフラビウイルスのゲノム、またはその相補物を含む核酸分子も含む。
【００１３】
本発明には複数の利点がある。例えば、本発明で使用可能なキメラフラビウイルスベクターは、安全性を考慮して十分弱毒化されており、さらにキメラのエンベロープタンパク質（特にキメラに挿入されたエピトープ）が由来するフラビウイルスに対する防御免疫を誘導することができる。さらなる安全性は、本発明で使用されるベクターがキメラであり、したがって野生型に復帰する恐れがないという事実によって得られる。本発明で使用されるベクターのさらなる利点は、フラビウイルスが細胞の細胞質で複製し、このためウイルスの複製法が、ウイルスゲノムの宿主細胞への組み込みを伴わず、重要な安全対策を提供する点である。また、詳しく後述するように、本発明の単一のベクターを用いて、単一の抗原に由来する複数のエピトープ、または複数の抗原に由来するエピトープを輸送することができる。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、外来ペプチドを導入可能な、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルス（例えばYF 17D）のエンベロープタンパク質中の部位を同定する方法（ここでキメラフラビウイルスベクターは、このようなペプチドを含むエンベロープタンパク質を有する）、および、例えば導入されるペプチドが由来する病原体に対する免疫応答を誘導するために、ベクターを投与することによりこのようなペプチドを輸送する方法を提供する。このようなベクター、ペプチド、および方法の詳細を以下に示す。
【００１６】
キメラフラビウイルスベクター
本発明で使用可能なキメラウイルスは、構造タンパク質（または複数のタンパク質）が、第2のウイルスの対応する構造タンパク質（または複数のタンパク質）と置換された第1のフラビウイルス（バックボーンフラビウイルス）を含む。例えばキメラは、prMおよびEタンパク質が、第2のウイルスのprMおよびEタンパク質と置換された第1のフラビウイルスからなる場合がある。
【００１７】
本発明で使用されるキメラウイルスは、任意の組み合わせのウイルスから作製することができる。第1または第2のウイルスとして、本発明で使用可能な特定のフラビウイルスの例には、蚊が媒介するフラビウイルス（日本脳炎、デング熱（血清型1〜4型）、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、クンジン、ロシオ脳炎、およびイルヘウスウイルスなど）；ダニが媒介するフラビウイルス（中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprのウイルスなど）；ならびにヘパシウイルス属のウイルス（例えばC型肝炎ウイルス）などが含まれる。
【００１８】
本発明で使用可能なキメラウイルス作製の詳細は、例えば、米国特許出願第09/007,664号、第09/121,587号、および第09/452,638号；国際出願第PCT/US98/03894号、および第PCT/US00/32821号；ならびにChambersら、J.Virol. 73：3095〜3101、1999において提供され、それぞれは参照として全体が本明細書に組み入れられる。
【００１９】
本発明で使用可能なキメラウイルスの種類の具体的な例は、prMおよびEタンパク質が、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、または上記の一つなどの他の任意のフラビウイルスなどの、別のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質と置換された、黄熱病のヒト用ワクチン株YF 17Dである。例えば、American Type Culture Collection（ATCC；Manassas、Virginia、U.S.A.）にブタペスト条約に基づく規定で登録されている（登録日は1998年1月6日）、以下のキメラフラビウイルスを本発明で使用することができる：キメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス（YF/JE A1.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594）、およびキメラ黄熱病17D/デング熱2型ウイルス（YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593）。
【００２０】
キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中の許容部位の同定法
キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中の、外来配列の挿入を許容する部位は以下のように同定することができる。ペプチドをコードする核酸配列をエンベロープ遺伝子に、分子生物学の標準的な方法で挿入する。好ましくは、このような核酸配列は、エンベロープ遺伝子中に無作為に挿入されて、挿入変異体のライブラリーの作製が促される。しかし核酸配列は、エンベロープ遺伝子の特定の点に挿入されて、効率に関して試験される場合もある。後者の方法は、例えば特定の部位が第1の外来配列の挿入を許容することがわかっていて、例えば長さまたは推定二次構造が第1の外来配列と異なりうる第2の配列の挿入も許容することを確認することが望ましい場合に、望ましい可能性がある。
【００２１】
核酸配列の無作為な挿入は、例えばトランスポゾン変異誘発法で達成される場合がある。これには例えばTn5転移系を用いることができる（Goryshinら、J.Biol.Chem. 273：7367、1998）。具体的な例として、Epicentre Technologies（Madison、WI、U.S.A.）製のEZ::TN Insertion Systemを使用することができる。本発明における同システムの用途の詳細について以下に提供する。要約すると、クローン化されたフラビウイルスのエンベロープ遺伝子を、ペプチドをコードする配列を含むトランスポゾンを用いた変異誘発法に供する。フラビウイルスのエンベロープ遺伝子に無作為に組み込まれたトランスポゾンを含む変異体のライブラリーを作製し、望ましい場合は挿入部位のマッピングを行うか、および/または配列決定を行う。次に、変異体エンベロープ遺伝子を含む完全長のゲノムRNAを作製し、それを変異体ウイルスの作製に使用し、次にそれをトランスポゾンの挿入許容性に関して特徴付ける。ウイルスは、許容性に関して、例えば感染性、ゲノム安定性、成長特性、および中和の判定によって解析されうる。このトランスポゾン変異誘発系の用途の詳細を、キメラフラビウイルスChimeriVax（商標）-JEに関して以下に説明する（図1も参照）。ただし、この方法は、本明細書に記載された任意のキメラに用いることができる。
【００２２】
外来ペプチド
本発明のベクターは、予防的価値または治療的価値のある任意のペプチドまたはタンパク質の輸送に使用することができる。例えば本発明のベクターは、キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中に挿入される、任意のタンパク質ベースの抗原に対する（予防的または治療的な）免疫応答の誘導に使用することができる。好ましくは、このような抗原は、キメラの第2のフラビウイルスに由来しない。必要なことは、抗原をコードする核酸配列が、本明細書に記載されているように、キメラフラビウイルスのエンベロープ遺伝子内の許容部位に挿入されることである。本明細書に記載されるようにして同定されるキメラエンベロープ遺伝子の許容部位に、抗原をコードする核酸分子を、分子生物学の標準的な方法を用いて挿入することができる。
【００２３】
本発明のベクターは、それぞれ単一のエピトープを含みうる。あるいは複数のエピトープを、単一の部位に（すなわち異なるエピトープが、アミノ酸のポリグリシンの連続などの柔軟なリンカーで隔てられる、ポリトープとして）、さまざまな部位に、またはその任意の組み合わせでベクターに挿入することができる。さまざまなエピトープは、1種類の病原体に由来してもよく、またはさまざまな種、および/またはさまざまな属に由来してもよい。
【００２４】
本発明で使用可能な抗原は、例えば、ウイルス、細菌、および寄生性生物などの感染性因子に由来する場合がある。例えば、表2に挙げた病原体に由来する抗原を使用することができる。このような抗原の具体的な例には、表3に挙げた抗原などがある。また、本発明のベクターに挿入可能なエピトープの具体的な例を表4に示す。表4に示すように、本発明のベクターに使用されるエピトープは、B細胞のエピトープ（中和エピトープ）、またはT細胞のエピトープ（Tヘルパーおよび細胞傷害性T細胞に特異的なエピトープ）の場合がある。
【００２５】
本発明のベクターを用いて、病原体に由来する抗原の他に、抗原を輸送することができる。例えば本発明のベクターを用いて、癌の免疫療法に使用するための腫瘍関連抗原を輸送することができる。数多くの腫瘍関連抗原が当技術分野で公知であり、本発明で使用することができる。癌（および対応する腫瘍関連抗原）の例を以下に示す：黒色腫（NY-ESO-1タンパク質（具体的にはアミノ酸157〜165位に位置するCTLエピトープ）、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUC1））；腺癌（ErbB2タンパク質）；結腸直腸癌（17-1A、791Tgp72、および癌胎児性抗原）；前立腺癌（PSA1およびPSA3）。熱ショックタンパク質（hsp 110）も、このような抗原として使用することができる。
【００２６】
本発明の別の態様では、免疫応答が望まれる、アレルギー誘導性抗原のエピトープをコードする外来タンパク質を使用することができる。また本発明のベクターは、抗原などのペプチドを、ベクターが投与される被験者の特定の細胞（例えばリガンドに対する受容体を含む細胞）へ輸送するようにベクターを導くために使用されるリガンドを含みうる。
【００２７】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、長さが例えば5〜500アミノ酸、例えば長さが10〜100アミノ酸、20〜55アミノ酸、25〜45アミノ酸、または35〜40アミノ酸の範囲にあってよい。任意の特定の所望のペプチドを使用できる可能性は、本明細書に記載された方法で容易に判定することができる。
【００２８】
外来ペプチドを輸送するためのキメラフラビウイルスベクターの用途
本発明のベクターは、当業者が容易に決定可能な量および方法で投与される。本発明のベクターは、例えば黄熱病17Dワクチンの場合と同様に、例えば、感染ニワトリ胚組織の清澄化懸濁物（clarified suspension）、またはキメラ黄熱病ウイルスが感染した細胞培養物から回収した液体として、投与かつ製剤化することができる。したがって本発明のベクターは、例えば筋肉内経路、皮下経路、または皮内経路で投与される、0.1〜1.0 mlの投与用量中に100〜1,000,000感染単位（例えば、プラーク形成単位または組織培養感染用量）を含む無菌水溶液として製剤化することができる。また、フラビウイルスはヒト宿主に経口経路などの粘膜経路を介して感染可能なので（Gresikovaら、「Tick-borne Encephalitis」、The Arboviruses, Ecology and Epidemiology、Monath編、CRC Press、Boca Raton、Florida、1988、第IV巻、177-203）、本発明のベクターを粘膜経路で投与することができる。
【００２９】
免疫化法で使用する場合は、本発明のベクターを、一次予防的薬剤として、特定の病原体の感染リスクがある成人または小児に投与することができる。本発明のベクターは、ペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することにより、感染患者治療用の二次薬剤として使用されうる。
【００３０】
ワクチン適用に関しては、当業者に周知のアジュバントを使用することができる。本発明のキメラベクターの免疫原性を促進するために使用可能なアジュバントには、例えばリポソーム製剤、例えば（例えばQS21）、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質A、またはポリホスファジン（polyphosphazine）などの合成アジュバントなどがある。これらのアジュバントは、典型的には、不活性化ワクチンに対する免疫応答を高めるために使用されるが、生ワクチンとともに使用することもできる。例えば、粘膜経路（例えば経口）で輸送されるキメラベクターの場合、大腸菌の易熱性毒素（LT）、またはLTの変異体誘導体などの粘膜アジュバントをアジュバントとして使用することができる。また、アジュバント活性をもつサイトカインをコードする遺伝子をベクターに挿入することができる。したがって、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5などのサイトカインをコードする遺伝子を、外来抗原遺伝子とともに挿入して、強い免疫応答を生じるワクチンを作ることができ、または、より具体的には細胞性、体液性、または粘膜性の反応に向けられる免疫を調節することができる。
【００３１】
ワクチン適用に加えて、当業者であれば容易に理解できるように、本発明のベクターは、治療的遺伝子産物を患者の細胞に導入する遺伝子治療法、および癌の治療法に使用することができる。このような方法では、治療的遺伝子産物をコードする遺伝子を、ベクターの許容部位に挿入する。
【００３２】
実施例
以下の実験例は、ChimeriVax（商標）-JE中の許容部位の同定に関する。この実施例に記載された方法は、上記のような他のキメラフラビウイルスについても使用することができる。
【００３３】
黄熱病17D（YF 17D）弱毒生ワクチン株は、過去60年間にわたってヒトで使用されており、優れた安定性の記録があり、1回の投与で長期間の免疫をもたらす。上述したように、ChimeriVax（商標）-JEは、YF 17Dの構造タンパク質（PrME）をコードする遺伝子が、遺伝的に弱毒化された日本脳炎（JE）ウイルスSA14-14-2に由来する対応遺伝子と置換された弱毒生組換え体ワクチン株である。カプシド、およびこのキメラの細胞内複製に関連するすべての非構造（NS）遺伝子のいずれもYF 17Dワクチン株に由来する。上述したように、ChimeriVax（商標）-JEの感染分子クローン（YF/JE）については既に説明されている。後述する実験で、ChimeriVax（商標）-JEを対象に、生物学的に関連のあるペプチドの輸送用媒介物としての妥当性に関する評価を行った。
【００３４】
EZ::TN In-Frame Linker Insertion Kit（商標）（Epicentre）は、さまざまな適用のために、クローン化されたDNAにコードされたタンパク質に、19アミノ酸のペプチドをインフレームで無作為に挿入するための、迅速かつ効率のよい方法である。この方法で発明者らは、外来DNAを許容するChimeriVax（商標）-JEのエンベロープ遺伝子内の部位を同定することにした。以下に詳述するように、JEエンベロープタンパク質をコードする遺伝子の、EZ::TNを用いた大腸菌における無作為変異誘発法により、19アミノ酸のペプチドをコードする57塩基対の断片をもつ、多くの安定な挿入変異体を同定した。DNA配列解析、制限酵素マッピング、およびPCR法で、トランスポゾンの正確な位置と、挿入が無作為に起こることの両方を確認した。変異型のJEエンベロープ遺伝子を操作して、ChimeriVax（商標）-JE感染クローンに戻すことにより細胞培養物の感染を調べることが可能となり、かつ外来抗原の輸送用媒介物としての組換え型フラビウイルスの用途に関する有用な情報を提供することが可能となる。発明者らは、ベロ（Vero）細胞に感染する変異体クローンのパネルを同定し、その生物学的性質を調べた。具体的には、発明者らは、細胞培養物中の親ChimeriVax（商標）-JEキメラに対する、安定な感染クローンの成長特性、ならびにJE特異的ポリクローナル抗血清を用いたプラーク減少中和試験（PRNT）による被中和能力の比較を行った。発明者らは、JEエンベロープ内の外来DNAの挿入を許容する部位を同定し、これらの部位は、生物学的に関連のあるエピトープの輸送のために活用されうる。詳細を以下に説明する。
【００３５】
JEエンベロープをコードする遺伝子のpUC19へのクローニング
YF/JEウイルスRNAを、感染ベロ細胞からTrizol試薬（Gibco BRL）を用いて抽出した。FNORアンチセンスプライマー（下記参照）を用いてcDNAを合成した後に、JE SA14-14-2エンベロープをコードする遺伝子を、TN1.F/TN2.Rプライマー（下記参照）を用いたXL-PCRで増幅し、pUCl9（New England Biologicals、NEB、U.S.A.）に、各オリゴヌクレオチドの5'端に組み込んだKpnIおよびPstIの認識配列を利用して、従来の方法で指向的にクローン化してpJEe1を得た。PCRは、GeneAmp PCR System 2400（Perkin Elmer）を使用して実施した。
【００３６】
トランスポゾン変異誘発法および挿入部位のマッピング
挿入変異誘発法は、pJEe1を対象にEZ::TN（商標）In-Frame Linker Insertion Kit（EPICENTRE Technologies、U.S.A.）を用いて、製造業者の指示書にしたがって実施した。EZ::TN <NotI/Kan-3>トランスポゾンは、NotI制限部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子を含む。詳しく後述するように、NotIによる切断と再連結によってカナマイシン耐性遺伝子を除去することで、3つすべての読み枠で読まれうる19コドンの挿入が生じた。
【００３７】
挿入変異体は、カナマイシン（50 μg/ml）を添加したLB寒天上で大腸菌を選択することにより同定した。転移後に、選択カナマイシン耐性クローンを対象にTN1.F/TN2.Rを用いてPCRを行ったところ、40%のクローンがJEエンベロープ内にトランスポゾンを安定に維持していることがわかった（図2）。挿入部位を、Tn5特異的プライマーTN1.FおよびNotI/KAN-3 RP-2を用いたPCR（Pwo DNAポリメラーゼ、Boehringer Mannheim/Roche）でマッピングし、Tn5トランスポゾンがJEエンベロープに無作為に挿入されていることを示した（図3）。特有のクローンを選択して、配列決定と、完全長変異体ゲノムRNAの作製に用いた。
【００３８】
配列決定
ベロ細胞のトランスフェクション用に選択された5個の変異体クローンのアミノ酸配列を図4に示す。JEウイルスのエンベロープタンパク質上の、確定された構造エピトープに対する挿入物の位置を図5に示す。挿入部位をDNA配列決定法で決定し、JEエンベロープの推定3次元構造の比較により挿入物の位置を決定した（Kolaskarら、Virology 261：31-42、1999）。5か所の挿入部位のうち4か所が表面に露出していると考えられる。配列決定はCEQ（商標） 2000 DNA Analysisシステム（Beckman Coulter）、およびCEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kitを用いて行った。データは、SEQUENCHER（商標）、バージョン4.0.5.（Gene Codes Corporation）を使用して解析した。
【００３９】
Tn5挿入を含む感染クローンの構築
安定な大腸菌クローンから抗生物質耐性マーカーを除去して再連結し、トランスポゾンに隣接する9塩基対の標的部位配列の重複を含む57塩基対の、インフレームの挿入を残した。次に、再連結後のJEエンベロープを含む試料クローン（n=5）をNheI/NarI（NEB、U.S.A.）で切断し、完全長のYF/JEゲノムの作製に関する文献（Chambersら、1999、前掲）に既に記載されている2つのプラスミド系へのクローニングに適合可能とした。
【００４０】
転写およびトランスフェクション
JEエンベロープをコードする遺伝子中に外来DNAを有する、直線化された完全長のゲノムDNAの転写を、AmpliScribe（商標）SP6 High Yield Transcription Kit（EPICENTRE Technologies）を用いてSP6プロモーターから行った。ベロ細胞を播種した6ウェルプレートに、インビトロで転写したゲノムRNAをLIPOFECTIN試薬（Life Technologies）の存在下でトランスフェクトし、5% FBS（Hyclone）、NEAA（Life Technologies）、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン（Sigma Chemicals）を添加したMEM（Life Technologies）中で維持した。細胞上清（500 mL）を、新鮮な細胞に6日毎にP6まで継代し、単層を対象に細胞変性効果（CPE）に関してモニターした。ウイルスRNAを、各継代時に単層細胞および上清から抽出した。
【００４１】
図6に示すように、すべての変異体クローンはP2においてベロ細胞に対して感染性を示した。特に、単層細胞のRNA抽出物から合成したcDNAを対象とする、TN1.F/TN2.Rを用いたRT-PCRでは、57塩基対のリンカーを有する1.9キロ塩基対の挿入物が増幅され、子孫ウイルスの産生が確認された。P2〜P6のクローンI-10を対象としたPCR解析から、同クローンがP6まで安定であること、またアミノ酸287位における挿入部位が外来DNAの挿入を許容することがわかる。PCRは、JEエンベロープ遺伝子に特異的なプライマー（TN1.F/TN2.R）、およびトランスポゾンに特異的なプライマー（TN1.F/TMOS.R）（図7）を用いて実施した。
【００４２】
P2〜P6のRT-PCR産物のDNA配列を決定したところ、図8に示すように、各継代時の配列は元のクローンI-10の配列と同一であった。興味深いことに、I-10トランスポゾン挿入物は、エンベロープタンパク質上の外来ペプチドを安定化させ、これを分子の表面に呈示しうる、ジスルフィド結合を形成する可能性を有する2個のシステイン残基を含んでいる。図9は、JEウイルスのエンベロープ糖タンパク質の3次元構造を示し、287位が中央（I）ドメインと二量体化（II）ドメイン間に位置し、表面に露出していると考えられることを示す。
【００４３】
トランスポゾン変異体I-10の生物学的性質を決定し、ChimeriVax（商標）-JEの性質と比較した。最初に、クローンI-10の成長特性を決定した。図10に示すように、変異体感染クローンI-10は、ChimeriVax（商標）-JE親に似た成長動態を示すが、わずかにより低い力価で成長し、YF/JEの場合の1×107 PFU/mlと比較して8×105 PFU/mlである。また、変異体感染クローンI-10は、ベロ細胞においてYF/JE親に似た細胞変性効果を誘導することがわかった。
【００４４】
次にプラーク減少中和（PRNT）アッセイ法を行った。抗JEポリクローナル抗血清の調製物は、クローンI-10およびChimeriVax（商標）-JEを同程度（1：64,000）に中和することが示され、ウイルスエンベロープの構造の完全性に過度に影響を及ぼすことなく、外来DNAをJEキメラのエンベロープに挿入可能であることが確認された（図11および図12）。以上の実験から、ChimeriVax（商標）-JE中のJEエンベロープのアミノ酸の287位が、外来DNAの挿入を許容することがわかる。発明者らは、アミノ酸59位、231位、340位、および436位が、外来配列の挿入を許容する証拠も提供する。
【００４５】
（表１）PCRプライマー
【００４６】
（表２）抗原/ペプチドが由来する病原体の例
【００４７】
（表３）ウイルスの選択用抗原の例
【００４８】
（表４）上記ウイルス/抗原に由来するB細胞およびT細胞のエピトープの例
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】JEエンベロープをコードする遺伝子を用いて実施されるトランスポゾン変異誘発法の略図。
【図２】JEエンベロープをコードする遺伝子のTn5挿入変異体のPCR解析の結果を示す。JEエンベロープにトランスポゾンを有する安定なクローンをレーン1、2、8、および10に示し、pUC19ベクター内にトランスポゾンを有するクローンをレーン3および4に示し、JEエンベロープ内にトランスポゾンを有する不安定なクローンをレーン5〜7、および9に示し、また1キロベースのマーカーをレーン11に示す。
【図３】選択変異体プラスミドのPCRマッピングの結果。この解析によって、JEエンベロープへの挿入が無作為に起こることが確認された。レーン1〜13は、13個のクローンのPCR産物を示し、レーン14は、1キロベースのマーカーを含む。
【図４】ベロ細胞のトランスフェクションで選択された5個の変異体クローンのアミノ酸配列。JEエンベロープの配列を太字で示し、転移による挿入配列に下線を付す。3個のアミノ酸が繰り返される残りの配列（各ラインで、第1のダッシュの左側、および第2のダッシュの左側）は、トランスポゾン変異誘発法で生じた人為産物である。
【図５】JEのエンベロープ糖タンパク質の略図（タンパク質の確定された高次構造エピトープに対する挿入物の位置を示す）。矢印は、ベロ細胞のトランスフェクションに関して選択された、5種の独立したJEエンベロープ変異体のおおよその挿入部位を示す。括弧内の数字は、19残基のアミノ酸挿入物に先行するJEエンベロープのアミノ酸を意味する。
【図６】5個の特有のクローン（2個は2つ組）から作製したRNAをトランスフェクトした、ベロ細胞から抽出したRNAから合成したcDNAのRT-PCR解析の結果（2回実施）を示す。57塩基対のリンカーを含む1.9キロベースの挿入物を各クローンから増幅し、子孫ウイルスの産生を確認した。1キロベースのマーカーをレーン1で分画した。レーン2〜8は、クローンI-10-2、クローンI-10-3、クローンII-4-3、クローンII-4-6、クローンI-1、クローンIII-6、およびクローンIV-8-1にそれぞれ対応する。
【図７】P2〜P6（それぞれレーン2〜6および8〜12）におけるクローンI-10 cDNAのPCR解析の結果を示す。左側のパネルで分画された試料は、JEエンベロープに特異的なプライマーを用いて得た。また右側のパネルで分画された試料は、トランスポゾンに特異的なプライマーで得た。1キロベースのマーカーをレーン1において分画し、100塩基対のマーカーをレーン7において分画する。
【図８】トランスフェクション前のプラスミドI-10の配列と並べた、P2〜P6における感染クローンI-10のRT-PCR産物のヌクレオチド配列。矢印は、ジスルフィド結合を形成する可能性を有し、エンベロープタンパク質上のペプチドを安定化させ、それを分子の表面に呈示しうる、挿入物中の2個のシステイン残基を示す。
【図９】アミノ酸287位における許容部位が、中央ドメイン（I）と二量体化ドメイン（II）との間に位置し、表面に露出されると考えられることを示す、JEエンベロープ糖タンパク質の3次元構造の略図。
【図１０】I-10感染クローンの成長特性を示すグラフ。三角形の印を有する線は、トランスポゾン変異体I-10の力価に対応し、四角形の印を有する線は、YF/JE親ウイルスの力価に対応する。
【図１１】トランスポゾン変異体I-10の中和アッセイ法の結果を示すグラフ。ダイヤモンドの印を有する線は、抗JE血清とインキュベートした試料の力価に対応し、四角形の印を有する線は、正常血清とインキュベートした試料に対応し、点線は平均を示す。
【図１２】YF/JE標準の中和アッセイ法の結果を示すグラフ。ダイヤモンドの印を有する線は、抗JE血清とインキュベートした試料の力価に対応し、四角形の印を有する線は、正常血清とインキュベートした試料に対応する。また点線は平均を示す。
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラフラビウイルスベクター、およびこのようなベクターを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フラビウイルスは、小型でエンベロープに包まれた（+）鎖RNAウイルスである。フラビウイルスのタンパク質は、一つの長い読み枠の翻訳によってポリタンパク質が産生された後に、ポリタンパク質が宿主およびウイルスのプロテアーゼの組み合わせによる複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断を受けて成熟ウイルスタンパク質が産生されることで作られる（Ambergら、J.Virol. 73：8083-8094、1999；Rice、「Flaviviridae」、Virology、Fields編、Raven-Lippincott、New York、1995、第1巻、p.937）。このウイルスの構造タンパク質は、ポリタンパク質中にC-prM-Eの順序に配置されている（「C」はカプシドを意味し、「prM」はウイルスのエンベロープに結合したMタンパク質前駆体を意味し、また「E」はエンベロープタンパク質を意味する）。これらのタンパク質はポリタンパク質のN末端領域に存在し、非構造タンパク質（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5）はポリタンパク質のC末端領域に存在する。
【０００３】
黄熱病ウイルスワクチン株（YF 17D）のCおよび非構造タンパク質、ならびに弱毒化日本脳炎ウイルス（SA 14-14-2）のある株のprMおよびEタンパク質を含むキメラフラビウイルスが作製されている。このキメラは「ChimeriVax（商標）-JE」と命名されており、非免疫対照と比較して、免疫化されたアカゲザルでJEに対する中和抗体の産生を誘導すること、またこのようなサルが、JEの注射後に臨床的脳炎の発症を予防することが報告されている。ChimeriVax（商標）-JEは、ヒト用ワクチンの前臨床安全基準に適合することが報告されている（Monathら、J.Virol. 74（4）：1742-1751、2000）。
【０００４】
YF 17DのCおよび非構造タンパク質、ならびにデング熱2型ウイルス株のprMおよびEタンパク質を含む類似のキメラが作製されている。このキメラはChimeriVax-D2と命名されており、非免疫化対照と比較して、デング熱2型ウイルスに対する中和抗体をアカゲザルで誘導すること、またこのようなサルが、デング熱2型ウイルスの注射後にウイルス血症の発症を予防することが報告されている。ChimeriVax-D2は、安全で遺伝的に安定であることも報告されている（Guirakhooら、J.Virol. 74（12）：5477-5485、2000）。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスのエンベロープタンパク質における、外来ペプチドの挿入を許容する部位を同定する方法を提供する。この方法は以下の段階を含む：（i）外来ペプチドをコードする核酸分子を、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子に導入する段階；（ii）遺伝子にコードされたエンベロープタンパク質を含むフラビウイルスベクターを作製する段階（エンベロープタンパク質は外来ペプチドを含む）；ならびに（iii）段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが挿入を許容するか否かを判定する段階。
【０００６】
本発明のフラビウイルスベクターは、例えば、第1のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質を含むキメラフラビウイルスベクターの場合がある。第1および第2のフラビウイルスは、日本脳炎、デング熱（血清型1型、2型、3型、または4型）、黄熱病（例えばYF 17D）、マレーバレー（Murray Valley）脳炎、セントルイス（St. Louis）脳炎、西ナイル（West Nile）脳炎、クンジン（Kunjin）、ロシオ（Rocio）脳炎、イルヘウス（Ilheus）脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール（Kyasanur）森林病、オムスク（Omsk）出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ（Absettarov）、ハンサロバ（Hansalova）、アポイ（Apoi）、およびHyprからなる群より選択される。
【０００７】
本発明のベクターに挿入される外来ペプチドは、例えばウイルス、細菌、または寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープを含んでもよく、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含んでもよい。これらのペプチドを含む例を以下に示す。
【０００８】
本発明の核酸分子は、本発明の方法で、例えばトランスポゾン変異誘発法で無作為にフラビウイルスのエンベロープ遺伝子に導入することができる。また本発明の方法の段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、挿入を許容するか否かの判定は、例えば（a）フラビウイルスベクターの感染性、（b）ベクターを複数回継代した時の外来タンパク質の配列の安定性、（c）フラビウイルスベクターの成長特性、および/または（d）フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体で中和されるか否か、を解析することで実施することができる。本発明の方法はさらに、フラビウイルスベクターの解析を、それが由来するフラビウイルスの類似の解析と比較する段階を含む場合がある。
【０００９】
本発明は、外来ペプチドを含むエンベロープタンパク質を含む、フラビウイルスベクターも含む。本発明のフラビウイルスベクターは、第1のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合がある。第1および第2のフラビウイルスは、日本脳炎、デング熱（血清型1型、2型、3型、または4型）、黄熱病（例えばYF 17D）、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択することができる。あるいは本発明のフラビウイルスベクターは、黄熱病YF 17Dなどの遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスの場合がある。
【００１０】
本発明のベクターに挿入される外来ペプチドは、ウイルス、細菌、または寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープを含む場合がある。あるいは外来ペプチドは、腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む場合がある。
【００１１】
また本発明は、上述のフラビウイルスベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物、ならびにこのような組成物を患者に投与することによりペプチドを患者に輸送する方法も含む。このような方法は例えば、ペプチドが抗原である場合、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために実施することができる。本発明は、ペプチドを輸送するための、このような組成物の用途、ならびにペプチドの輸送のための薬剤の調製における用途も含む。
【００１２】
本発明は、上述のフラビウイルスのゲノム、またはその相補物を含む核酸分子も含む。
【００１３】
本発明には複数の利点がある。例えば、本発明で使用可能なキメラフラビウイルスベクターは、安全性を考慮して十分弱毒化されており、さらにキメラのエンベロープタンパク質（特にキメラに挿入されたエピトープ）が由来するフラビウイルスに対する防御免疫を誘導することができる。さらなる安全性は、本発明で使用されるベクターがキメラであり、したがって野生型に復帰する恐れがないという事実によって得られる。本発明で使用されるベクターのさらなる利点は、フラビウイルスが細胞の細胞質で複製し、このためウイルスの複製法が、ウイルスゲノムの宿主細胞への組み込みを伴わず、重要な安全対策を提供する点である。また、詳しく後述するように、本発明の単一のベクターを用いて、単一の抗原に由来する複数のエピトープ、または複数の抗原に由来するエピトープを輸送することができる。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、外来ペプチドを導入可能な、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルス（例えばYF 17D）のエンベロープタンパク質中の部位を同定する方法（ここでキメラフラビウイルスベクターは、このようなペプチドを含むエンベロープタンパク質を有する）、および、例えば導入されるペプチドが由来する病原体に対する免疫応答を誘導するために、ベクターを投与することによりこのようなペプチドを輸送する方法を提供する。このようなベクター、ペプチド、および方法の詳細を以下に示す。
【００１６】
キメラフラビウイルスベクター
本発明で使用可能なキメラウイルスは、構造タンパク質（または複数のタンパク質）が、第2のウイルスの対応する構造タンパク質（または複数のタンパク質）と置換された第1のフラビウイルス（バックボーンフラビウイルス）を含む。例えばキメラは、prMおよびEタンパク質が、第2のウイルスのprMおよびEタンパク質と置換された第1のフラビウイルスからなる場合がある。
【００１７】
本発明で使用されるキメラウイルスは、任意の組み合わせのウイルスから作製することができる。第1または第2のウイルスとして、本発明で使用可能な特定のフラビウイルスの例には、蚊が媒介するフラビウイルス（日本脳炎、デング熱（血清型1〜4型）、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、クンジン、ロシオ脳炎、およびイルヘウスウイルスなど）；ダニが媒介するフラビウイルス（中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprのウイルスなど）；ならびにヘパシウイルス属のウイルス（例えばC型肝炎ウイルス）などが含まれる。
【００１８】
本発明で使用可能なキメラウイルス作製の詳細は、例えば、米国特許出願第09/007,664号、第09/121,587号、および第09/452,638号；国際出願第PCT/US98/03894号、および第PCT/US00/32821号；ならびにChambersら、J.Virol. 73：3095〜3101、1999において提供され、それぞれは参照として全体が本明細書に組み入れられる。
【００１９】
本発明で使用可能なキメラウイルスの種類の具体的な例は、prMおよびEタンパク質が、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、または上記の一つなどの他の任意のフラビウイルスなどの、別のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質と置換された、黄熱病のヒト用ワクチン株YF 17Dである。例えば、American Type Culture Collection（ATCC；Manassas、Virginia、U.S.A.）にブタペスト条約に基づく規定で登録されている（登録日は1998年1月6日）、以下のキメラフラビウイルスを本発明で使用することができる：キメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス（YF/JE A1.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594）、およびキメラ黄熱病17D/デング熱2型ウイルス（YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593）。
【００２０】
キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中の許容部位の同定法
キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中の、外来配列の挿入を許容する部位は以下のように同定することができる。ペプチドをコードする核酸配列をエンベロープ遺伝子に、分子生物学の標準的な方法で挿入する。好ましくは、このような核酸配列は、エンベロープ遺伝子中に無作為に挿入されて、挿入変異体のライブラリーの作製が促される。しかし核酸配列は、エンベロープ遺伝子の特定の点に挿入されて、効率に関して試験される場合もある。後者の方法は、例えば特定の部位が第1の外来配列の挿入を許容することがわかっていて、例えば長さまたは推定二次構造が第1の外来配列と異なりうる第2の配列の挿入も許容することを確認することが望ましい場合に、望ましい可能性がある。
【００２１】
核酸配列の無作為な挿入は、例えばトランスポゾン変異誘発法で達成される場合がある。これには例えばTn5転移系を用いることができる（Goryshinら、J.Biol.Chem. 273：7367、1998）。具体的な例として、Epicentre Technologies（Madison、WI、U.S.A.）製のEZ::TN Insertion Systemを使用することができる。本発明における同システムの用途の詳細について以下に提供する。要約すると、クローン化されたフラビウイルスのエンベロープ遺伝子を、ペプチドをコードする配列を含むトランスポゾンを用いた変異誘発法に供する。フラビウイルスのエンベロープ遺伝子に無作為に組み込まれたトランスポゾンを含む変異体のライブラリーを作製し、望ましい場合は挿入部位のマッピングを行うか、および/または配列決定を行う。次に、変異体エンベロープ遺伝子を含む完全長のゲノムRNAを作製し、それを変異体ウイルスの作製に使用し、次にそれをトランスポゾンの挿入許容性に関して特徴付ける。ウイルスは、許容性に関して、例えば感染性、ゲノム安定性、成長特性、および中和の判定によって解析されうる。このトランスポゾン変異誘発系の用途の詳細を、キメラフラビウイルスChimeriVax（商標）-JEに関して以下に説明する（図1も参照）。ただし、この方法は、本明細書に記載された任意のキメラに用いることができる。
【００２２】
外来ペプチド
本発明のベクターは、予防的価値または治療的価値のある任意のペプチドまたはタンパク質の輸送に使用することができる。例えば本発明のベクターは、キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中に挿入される、任意のタンパク質ベースの抗原に対する（予防的または治療的な）免疫応答の誘導に使用することができる。好ましくは、このような抗原は、キメラの第2のフラビウイルスに由来しない。必要なことは、抗原をコードする核酸配列が、本明細書に記載されているように、キメラフラビウイルスのエンベロープ遺伝子内の許容部位に挿入されることである。本明細書に記載されるようにして同定されるキメラエンベロープ遺伝子の許容部位に、抗原をコードする核酸分子を、分子生物学の標準的な方法を用いて挿入することができる。
【００２３】
本発明のベクターは、それぞれ単一のエピトープを含みうる。あるいは複数のエピトープを、単一の部位に（すなわち異なるエピトープが、アミノ酸のポリグリシンの連続などの柔軟なリンカーで隔てられる、ポリトープとして）、さまざまな部位に、またはその任意の組み合わせでベクターに挿入することができる。さまざまなエピトープは、1種類の病原体に由来してもよく、またはさまざまな種、および/またはさまざまな属に由来してもよい。
【００２４】
本発明で使用可能な抗原は、例えば、ウイルス、細菌、および寄生性生物などの感染性因子に由来する場合がある。例えば、表2に挙げた病原体に由来する抗原を使用することができる。このような抗原の具体的な例には、表3に挙げた抗原などがある。また、本発明のベクターに挿入可能なエピトープの具体的な例を表4に示す。表4に示すように、本発明のベクターに使用されるエピトープは、B細胞のエピトープ（中和エピトープ）、またはT細胞のエピトープ（Tヘルパーおよび細胞傷害性T細胞に特異的なエピトープ）の場合がある。
【００２５】
本発明のベクターを用いて、病原体に由来する抗原の他に、抗原を輸送することができる。例えば本発明のベクターを用いて、癌の免疫療法に使用するための腫瘍関連抗原を輸送することができる。数多くの腫瘍関連抗原が当技術分野で公知であり、本発明で使用することができる。癌（および対応する腫瘍関連抗原）の例を以下に示す：黒色腫（NY-ESO-1タンパク質（具体的にはアミノ酸157〜165位に位置するCTLエピトープ）、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUC1））；腺癌（ErbB2タンパク質）；結腸直腸癌（17-1A、791Tgp72、および癌胎児性抗原）；前立腺癌（PSA1およびPSA3）。熱ショックタンパク質（hsp 110）も、このような抗原として使用することができる。
【００２６】
本発明の別の態様では、免疫応答が望まれる、アレルギー誘導性抗原のエピトープをコードする外来タンパク質を使用することができる。また本発明のベクターは、抗原などのペプチドを、ベクターが投与される被験者の特定の細胞（例えばリガンドに対する受容体を含む細胞）へ輸送するようにベクターを導くために使用されるリガンドを含みうる。
【００２７】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、長さが例えば5〜500アミノ酸、例えば長さが10〜100アミノ酸、20〜55アミノ酸、25〜45アミノ酸、または35〜40アミノ酸の範囲にあってよい。任意の特定の所望のペプチドを使用できる可能性は、本明細書に記載された方法で容易に判定することができる。
【００２８】
外来ペプチドを輸送するためのキメラフラビウイルスベクターの用途
本発明のベクターは、当業者が容易に決定可能な量および方法で投与される。本発明のベクターは、例えば黄熱病17Dワクチンの場合と同様に、例えば、感染ニワトリ胚組織の清澄化懸濁物（clarified suspension）、またはキメラ黄熱病ウイルスが感染した細胞培養物から回収した液体として、投与かつ製剤化することができる。したがって本発明のベクターは、例えば筋肉内経路、皮下経路、または皮内経路で投与される、0.1〜1.0 mlの投与用量中に100〜1,000,000感染単位（例えば、プラーク形成単位または組織培養感染用量）を含む無菌水溶液として製剤化することができる。また、フラビウイルスはヒト宿主に経口経路などの粘膜経路を介して感染可能なので（Gresikovaら、「Tick-borne Encephalitis」、The Arboviruses, Ecology and Epidemiology、Monath編、CRC Press、Boca Raton、Florida、1988、第IV巻、177-203）、本発明のベクターを粘膜経路で投与することができる。
【００２９】
免疫化法で使用する場合は、本発明のベクターを、一次予防的薬剤として、特定の病原体の感染リスクがある成人または小児に投与することができる。本発明のベクターは、ペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することにより、感染患者治療用の二次薬剤として使用されうる。
【００３０】
ワクチン適用に関しては、当業者に周知のアジュバントを使用することができる。本発明のキメラベクターの免疫原性を促進するために使用可能なアジュバントには、例えばリポソーム製剤、例えば（例えばQS21）、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質A、またはポリホスファジン（polyphosphazine）などの合成アジュバントなどがある。これらのアジュバントは、典型的には、不活性化ワクチンに対する免疫応答を高めるために使用されるが、生ワクチンとともに使用することもできる。例えば、粘膜経路（例えば経口）で輸送されるキメラベクターの場合、大腸菌の易熱性毒素（LT）、またはLTの変異体誘導体などの粘膜アジュバントをアジュバントとして使用することができる。また、アジュバント活性をもつサイトカインをコードする遺伝子をベクターに挿入することができる。したがって、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5などのサイトカインをコードする遺伝子を、外来抗原遺伝子とともに挿入して、強い免疫応答を生じるワクチンを作ることができ、または、より具体的には細胞性、体液性、または粘膜性の反応に向けられる免疫を調節することができる。
【００３１】
ワクチン適用に加えて、当業者であれば容易に理解できるように、本発明のベクターは、治療的遺伝子産物を患者の細胞に導入する遺伝子治療法、および癌の治療法に使用することができる。このような方法では、治療的遺伝子産物をコードする遺伝子を、ベクターの許容部位に挿入する。
【００３２】
実施例
以下の実験例は、ChimeriVax（商標）-JE中の許容部位の同定に関する。この実施例に記載された方法は、上記のような他のキメラフラビウイルスについても使用することができる。
【００３３】
黄熱病17D（YF 17D）弱毒生ワクチン株は、過去60年間にわたってヒトで使用されており、優れた安定性の記録があり、1回の投与で長期間の免疫をもたらす。上述したように、ChimeriVax（商標）-JEは、YF 17Dの構造タンパク質（PrME）をコードする遺伝子が、遺伝的に弱毒化された日本脳炎（JE）ウイルスSA14-14-2に由来する対応遺伝子と置換された弱毒生組換え体ワクチン株である。カプシド、およびこのキメラの細胞内複製に関連するすべての非構造（NS）遺伝子のいずれもYF 17Dワクチン株に由来する。上述したように、ChimeriVax（商標）-JEの感染分子クローン（YF/JE）については既に説明されている。後述する実験で、ChimeriVax（商標）-JEを対象に、生物学的に関連のあるペプチドの輸送用媒介物としての妥当性に関する評価を行った。
【００３４】
EZ::TN In-Frame Linker Insertion Kit（商標）（Epicentre）は、さまざまな適用のために、クローン化されたDNAにコードされたタンパク質に、19アミノ酸のペプチドをインフレームで無作為に挿入するための、迅速かつ効率のよい方法である。この方法で発明者らは、外来DNAを許容するChimeriVax（商標）-JEのエンベロープ遺伝子内の部位を同定することにした。以下に詳述するように、JEエンベロープタンパク質をコードする遺伝子の、EZ::TNを用いた大腸菌における無作為変異誘発法により、19アミノ酸のペプチドをコードする57塩基対の断片をもつ、多くの安定な挿入変異体を同定した。DNA配列解析、制限酵素マッピング、およびPCR法で、トランスポゾンの正確な位置と、挿入が無作為に起こることの両方を確認した。変異型のJEエンベロープ遺伝子を操作して、ChimeriVax（商標）-JE感染クローンに戻すことにより細胞培養物の感染を調べることが可能となり、かつ外来抗原の輸送用媒介物としての組換え型フラビウイルスの用途に関する有用な情報を提供することが可能となる。発明者らは、ベロ（Vero）細胞に感染する変異体クローンのパネルを同定し、その生物学的性質を調べた。具体的には、発明者らは、細胞培養物中の親ChimeriVax（商標）-JEキメラに対する、安定な感染クローンの成長特性、ならびにJE特異的ポリクローナル抗血清を用いたプラーク減少中和試験（PRNT）による被中和能力の比較を行った。発明者らは、JEエンベロープ内の外来DNAの挿入を許容する部位を同定し、これらの部位は、生物学的に関連のあるエピトープの輸送のために活用されうる。詳細を以下に説明する。
【００３５】
JEエンベロープをコードする遺伝子のpUC19へのクローニング
YF/JEウイルスRNAを、感染ベロ細胞からTrizol試薬（Gibco BRL）を用いて抽出した。FNORアンチセンスプライマー（下記参照）を用いてcDNAを合成した後に、JE SA14-14-2エンベロープをコードする遺伝子を、TN1.F/TN2.Rプライマー（下記参照）を用いたXL-PCRで増幅し、pUCl9（New England Biologicals、NEB、U.S.A.）に、各オリゴヌクレオチドの5'端に組み込んだKpnIおよびPstIの認識配列を利用して、従来の方法で指向的にクローン化してpJEe1を得た。PCRは、GeneAmp PCR System 2400（Perkin Elmer）を使用して実施した。
【００３６】
トランスポゾン変異誘発法および挿入部位のマッピング
挿入変異誘発法は、pJEe1を対象にEZ::TN（商標）In-Frame Linker Insertion Kit（EPICENTRE Technologies、U.S.A.）を用いて、製造業者の指示書にしたがって実施した。EZ::TN <NotI/Kan-3>トランスポゾンは、NotI制限部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子を含む。詳しく後述するように、NotIによる切断と再連結によってカナマイシン耐性遺伝子を除去することで、3つすべての読み枠で読まれうる19コドンの挿入が生じた。
【００３７】
挿入変異体は、カナマイシン（50 μg/ml）を添加したLB寒天上で大腸菌を選択することにより同定した。転移後に、選択カナマイシン耐性クローンを対象にTN1.F/TN2.Rを用いてPCRを行ったところ、40%のクローンがJEエンベロープ内にトランスポゾンを安定に維持していることがわかった（図2）。挿入部位を、Tn5特異的プライマーTN1.FおよびNotI/KAN-3 RP-2を用いたPCR（Pwo DNAポリメラーゼ、Boehringer Mannheim/Roche）でマッピングし、Tn5トランスポゾンがJEエンベロープに無作為に挿入されていることを示した（図3）。特有のクローンを選択して、配列決定と、完全長変異体ゲノムRNAの作製に用いた。
【００３８】
配列決定
ベロ細胞のトランスフェクション用に選択された5個の変異体クローンのアミノ酸配列を図4に示す。JEウイルスのエンベロープタンパク質上の、確定された構造エピトープに対する挿入物の位置を図5に示す。挿入部位をDNA配列決定法で決定し、JEエンベロープの推定3次元構造の比較により挿入物の位置を決定した（Kolaskarら、Virology 261：31-42、1999）。5か所の挿入部位のうち4か所が表面に露出していると考えられる。配列決定はCEQ（商標） 2000 DNA Analysisシステム（Beckman Coulter）、およびCEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kitを用いて行った。データは、SEQUENCHER（商標）、バージョン4.0.5.（Gene Codes Corporation）を使用して解析した。
【００３９】
Tn5挿入を含む感染クローンの構築
安定な大腸菌クローンから抗生物質耐性マーカーを除去して再連結し、トランスポゾンに隣接する9塩基対の標的部位配列の重複を含む57塩基対の、インフレームの挿入を残した。次に、再連結後のJEエンベロープを含む試料クローン（n=5）をNheI/NarI（NEB、U.S.A.）で切断し、完全長のYF/JEゲノムの作製に関する文献（Chambersら、1999、前掲）に既に記載されている2つのプラスミド系へのクローニングに適合可能とした。
【００４０】
転写およびトランスフェクション
JEエンベロープをコードする遺伝子中に外来DNAを有する、直線化された完全長のゲノムDNAの転写を、AmpliScribe（商標）SP6 High Yield Transcription Kit（EPICENTRE Technologies）を用いてSP6プロモーターから行った。ベロ細胞を播種した6ウェルプレートに、インビトロで転写したゲノムRNAをLIPOFECTIN試薬（Life Technologies）の存在下でトランスフェクトし、5% FBS（Hyclone）、NEAA（Life Technologies）、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン（Sigma Chemicals）を添加したMEM（Life Technologies）中で維持した。細胞上清（500 mL）を、新鮮な細胞に6日毎にP6まで継代し、単層を対象に細胞変性効果（CPE）に関してモニターした。ウイルスRNAを、各継代時に単層細胞および上清から抽出した。
【００４１】
図6に示すように、すべての変異体クローンはP2においてベロ細胞に対して感染性を示した。特に、単層細胞のRNA抽出物から合成したcDNAを対象とする、TN1.F/TN2.Rを用いたRT-PCRでは、57塩基対のリンカーを有する1.9キロ塩基対の挿入物が増幅され、子孫ウイルスの産生が確認された。P2〜P6のクローンI-10を対象としたPCR解析から、同クローンがP6まで安定であること、またアミノ酸287位における挿入部位が外来DNAの挿入を許容することがわかる。PCRは、JEエンベロープ遺伝子に特異的なプライマー（TN1.F/TN2.R）、およびトランスポゾンに特異的なプライマー（TN1.F/TMOS.R）（図7）を用いて実施した。
【００４２】
P2〜P6のRT-PCR産物のDNA配列を決定したところ、図8に示すように、各継代時の配列は元のクローンI-10の配列と同一であった。興味深いことに、I-10トランスポゾン挿入物は、エンベロープタンパク質上の外来ペプチドを安定化させ、これを分子の表面に呈示しうる、ジスルフィド結合を形成する可能性を有する2個のシステイン残基を含んでいる。図9は、JEウイルスのエンベロープ糖タンパク質の3次元構造を示し、287位が中央（I）ドメインと二量体化（II）ドメイン間に位置し、表面に露出していると考えられることを示す。
【００４３】
トランスポゾン変異体I-10の生物学的性質を決定し、ChimeriVax（商標）-JEの性質と比較した。最初に、クローンI-10の成長特性を決定した。図10に示すように、変異体感染クローンI-10は、ChimeriVax（商標）-JE親に似た成長動態を示すが、わずかにより低い力価で成長し、YF/JEの場合の1×107 PFU/mlと比較して8×105 PFU/mlである。また、変異体感染クローンI-10は、ベロ細胞においてYF/JE親に似た細胞変性効果を誘導することがわかった。
【００４４】
次にプラーク減少中和（PRNT）アッセイ法を行った。抗JEポリクローナル抗血清の調製物は、クローンI-10およびChimeriVax（商標）-JEを同程度（1：64,000）に中和することが示され、ウイルスエンベロープの構造の完全性に過度に影響を及ぼすことなく、外来DNAをJEキメラのエンベロープに挿入可能であることが確認された（図11および図12）。以上の実験から、ChimeriVax（商標）-JE中のJEエンベロープのアミノ酸の287位が、外来DNAの挿入を許容することがわかる。発明者らは、アミノ酸59位、231位、340位、および436位が、外来配列の挿入を許容する証拠も提供する。
【００４５】
（表１）PCRプライマー
（表２）抗原/ペプチドが由来する病原体の例
（表３）ウイルスの選択用抗原の例
（表４）上記ウイルス/抗原に由来するB細胞およびT細胞のエピトープの例
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】JEエンベロープをコードする遺伝子を用いて実施されるトランスポゾン変異誘発法の略図。
【図２】JEエンベロープをコードする遺伝子のTn5挿入変異体のPCR解析の結果を示す。JEエンベロープにトランスポゾンを有する安定なクローンをレーン1、2、8、および10に示し、pUC19ベクター内にトランスポゾンを有するクローンをレーン3および4に示し、JEエンベロープ内にトランスポゾンを有する不安定なクローンをレーン5〜7、および9に示し、また1キロベースのマーカーをレーン11に示す。
【図３】選択変異体プラスミドのPCRマッピングの結果。この解析によって、JEエンベロープへの挿入が無作為に起こることが確認された。レーン1〜13は、13個のクローンのPCR産物を示し、レーン14は、1キロベースのマーカーを含む。
【図４】ベロ細胞のトランスフェクションで選択された5個の変異体クローンのアミノ酸配列。JEエンベロープの配列を太字で示し、転移による挿入配列に下線を付す。3個のアミノ酸が繰り返される残りの配列（各ラインで、第1のダッシュの左側、および第2のダッシュの左側）は、トランスポゾン変異誘発法で生じた人為産物である。
【図５】JEのエンベロープ糖タンパク質の略図（タンパク質の確定された高次構造エピトープに対する挿入物の位置を示す）。矢印は、ベロ細胞のトランスフェクションに関して選択された、5種の独立したJEエンベロープ変異体のおおよその挿入部位を示す。括弧内の数字は、19残基のアミノ酸挿入物に先行するJEエンベロープのアミノ酸を意味する。
【図６】5個の特有のクローン（2個は2つ組）から作製したRNAをトランスフェクトした、ベロ細胞から抽出したRNAから合成したcDNAのRT-PCR解析の結果（2回実施）を示す。57塩基対のリンカーを含む1.9キロベースの挿入物を各クローンから増幅し、子孫ウイルスの産生を確認した。1キロベースのマーカーをレーン1で分画した。レーン2〜8は、クローンI-10-2、クローンI-10-3、クローンII-4-3、クローンII-4-6、クローンI-1、クローンIII-6、およびクローンIV-8-1にそれぞれ対応する。
【図７】P2〜P6（それぞれレーン2〜6および8〜12）におけるクローンI-10 cDNAのPCR解析の結果を示す。左側のパネルで分画された試料は、JEエンベロープに特異的なプライマーを用いて得た。また右側のパネルで分画された試料は、トランスポゾンに特異的なプライマーで得た。1キロベースのマーカーをレーン1において分画し、100塩基対のマーカーをレーン7において分画する。
【図８】トランスフェクション前のプラスミドI-10の配列と並べた、P2〜P6における感染クローンI-10のRT-PCR産物のヌクレオチド配列。矢印は、ジスルフィド結合を形成する可能性を有し、エンベロープタンパク質上のペプチドを安定化させ、それを分子の表面に呈示しうる、挿入物中の2個のシステイン残基を示す。
【図９】アミノ酸287位における許容部位が、中央ドメイン（I）と二量体化ドメイン（II）との間に位置し、表面に露出されると考えられることを示す、JEエンベロープ糖タンパク質の3次元構造の略図。
【図１０】I-10感染クローンの成長特性を示すグラフ。三角形の印を有する線は、トランスポゾン変異体I-10の力価に対応し、四角形の印を有する線は、YF/JE親ウイルスの力価に対応する。
【図１１】トランスポゾン変異体I-10の中和アッセイ法の結果を示すグラフ。ダイヤモンドの印を有する線は、抗JE血清とインキュベートした試料の力価に対応し、四角形の印を有する線は、正常血清とインキュベートした試料に対応し、点線は平均を示す。
【図１２】YF/JE標準の中和アッセイ法の結果を示すグラフ。ダイヤモンドの印を有する線は、抗JE血清とインキュベートした試料の力価に対応し、四角形の印を有する線は、正常血清とインキュベートした試料に対応する。また点線は平均を示す。
Claims (18)
- 以下の段階を含む、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスのエンベロープタンパク質上における、外来ペプチドの挿入を許容する部位を同定する方法であって：
（i）外来ペプチドをコードする核酸分子を、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子に導入する段階；
（ii）同遺伝子にコードされたエンベロープタンパク質を含むフラビウイルスベクターを作製する段階（ここで該エンベロープタンパク質は外来ペプチドを含む）；ならびに
（iii）段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、該挿入を許容するか否かを判定する段階
を含む方法。 - フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスベクターである、請求項1記載の方法。
- 第1のフラビウイルス、または第2のフラビウイルスが、日本脳炎、デング熱1型、デング熱2型、デング熱3型、デング熱4型、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択され、かつ第1および第2のフラビウイルスが異なるフラビウイルスである、請求項2記載の方法。
- 外来ペプチドが、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープ、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む、請求項1記載の方法。
- 核酸分子がトランスポゾン変異誘発法によりで無作為にエンベロープ遺伝子に導入される、請求項1記載の方法。
- 段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、挿入を許容するか否かの判定が、（a）フラビウイルスベクターの感染性（b）ベクターの複数回の継代時における外来タンパク質の配列の安定性、（c）フラビウイルスベクターの成長特性、または（d）フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体で中和可能か否か、を解析して行われる、請求項1記載の方法。
- フラビウイルスベクターの解析を、それが由来するフラビウイルスの解析と比較する段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
- 遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスが黄熱病YF 17Dである、請求項1記載の方法。
- 外来ペプチドを含むエンベロープタンパク質を含む、フラビウイルスベクター。
- ベクターが、第1のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスである、請求項9記載のフラビウイルスベクター。
- 第1のフラビウイルス、または第2のフラビウイルスが、日本脳炎、デング熱1型、デング熱2型、デング熱3型、デング熱4型、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択される、請求項10記載のフラビウイルスベクター。
- 外来ペプチドが、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープ、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む、請求項9記載のフラビウイルスベクター。
- ベクターが、遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスを含む、請求項9記載のフラビウイルスベクター。
- 遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスが黄熱病YF 17Dである、請求項13記載のフラビウイルスベクター。
- 請求項9記載のフラビウイルスベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物。
- ペプチドを患者へ輸送する、請求項15記載の薬学的組成物の用途。
- ペプチドが抗原であり、組成物を投与し、該抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導する、請求項16記載の用途。
- 請求項1記載のフラビウイルスのゲノム、またはこの相補物を含む核酸分子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29526501P | 2001-06-01 | 2001-06-01 | |
| PCT/US2002/017374 WO2002102828A2 (en) | 2001-06-01 | 2002-05-31 | Chimeric flavivirus vectors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005501532A true JP2005501532A (ja) | 2005-01-20 |
| JP2005501532A5 JP2005501532A5 (ja) | 2010-03-25 |
Family
ID=23136958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003506300A Pending JP2005501532A (ja) | 2001-06-01 | 2002-05-31 | キメラフラビウイルスベクター |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7569383B2 (ja) |
| EP (1) | EP1401859B1 (ja) |
| JP (1) | JP2005501532A (ja) |
| KR (1) | KR100921592B1 (ja) |
| CN (1) | CN1551782A (ja) |
| AU (1) | AU2002322026B2 (ja) |
| BR (1) | BR0210907A (ja) |
| CA (1) | CA2448971C (ja) |
| ES (1) | ES2439724T3 (ja) |
| PL (1) | PL371187A1 (ja) |
| WO (1) | WO2002102828A2 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962708B1 (en) * | 1997-02-28 | 2005-11-08 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| CA2448971C (en) * | 2001-06-01 | 2013-11-26 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vectors |
| US20050002968A1 (en) * | 2002-01-15 | 2005-01-06 | Monath Thomas P. | Flavivirus vaccines |
| US7459160B2 (en) * | 2002-01-15 | 2008-12-02 | Acambis Inc. | Chimeric flaviviruses |
| US20040259224A1 (en) * | 2002-05-31 | 2004-12-23 | Farshad Guirakhoo | Tetravalent Dengue vaccines |
| CA2505942C (en) * | 2002-11-15 | 2012-03-13 | Acambis, Inc. | West nile virus vaccine |
| BRPI0714721A2 (pt) * | 2006-07-14 | 2013-04-24 | Sanofi Pasteur Biologics Co | construÇço de vacinas de vÍrus recombinante por inserÇço direta mediada por transpàson de determinantes imunolàgicos estranhos em proteÍnas de vÍrus vetorial |
| WO2008100290A2 (en) * | 2006-09-29 | 2008-08-21 | Sanofi Pasteur Biologics Co | Recombinant rhinovirus vectors |
| FR2906724B1 (fr) | 2006-10-04 | 2009-03-20 | Sanofi Pasteur Sa | Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue. |
| WO2008057550A2 (en) | 2006-11-07 | 2008-05-15 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Stabilization of vaccines by lyophilization |
| US8591916B2 (en) * | 2007-01-31 | 2013-11-26 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Flavivirus vaccine vector against influenza virus |
| WO2009030872A1 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-12 | Mats Axel Atterdag Persson | Materials and methods for the treatment of hepatitis c |
| JP5689687B2 (ja) | 2008-03-05 | 2015-03-25 | サノフィ・パスツールＳａｎｏｆｉｐａｓｔｅｕｒ | アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法 |
| US8815564B2 (en) * | 2008-03-14 | 2014-08-26 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Replication-defective flavivirus vaccines and vaccine vectors |
| MX2010010457A (es) * | 2008-03-27 | 2010-11-05 | Sanofi Pasteur Biologics Co | Vectores recombinantes de rinovirus. |
| EP2143440A1 (fr) | 2008-07-09 | 2010-01-13 | Sanofi Pasteur | Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués |
| US20120128713A1 (en) * | 2009-03-16 | 2012-05-24 | Sanofi Pasteur Limited | Replication-Defective Flavivirus Vaccine Vectors Against Respiratory Syncytial Virus |
| EP2353609A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-10 | Sanofi Pasteur | Immunization compositions and methods |
| IN2014CN03925A (ja) * | 2011-10-25 | 2015-07-03 | Florida Gulf Coast University | |
| MY168959A (en) | 2012-07-24 | 2019-01-28 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions for the prevention of dengue virus infection |
| MX2015000446A (es) | 2012-07-24 | 2015-03-12 | Sanofi Pasteur | Composiciones de vacuna para la prevencion contra la infeccion por el virus del dengue. |
| BR112015012515B1 (pt) | 2012-11-30 | 2023-04-11 | Sanofi Pasteur | Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola |
| CN103352029A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用 |
| EP3158061B1 (en) * | 2014-06-20 | 2019-08-07 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric west nile/dengue viruses and methods of use |
| TW201620546A (zh) | 2014-09-02 | 2016-06-16 | 賽諾菲巴斯德公司 | 疫苗組合物 |
| EP3031923A1 (en) * | 2014-12-11 | 2016-06-15 | Institut Pasteur | Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition |
| US10857222B2 (en) | 2015-07-03 | 2020-12-08 | Sanofi Pasteur | Concomitant dengue and yellow fever vaccination |
| BE1024160A9 (fr) | 2015-12-22 | 2017-12-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Formulation immunogène |
| EP3184119A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Themis Bioscience GmbH | Chromatography based purification strategies for measles scaffold based viruses |
| SG11201908280SA (en) | 2017-03-30 | 2019-10-30 | Univ Queensland | "chimeric molecules and uses thereof" |
| SG11202002933TA (en) | 2017-10-05 | 2020-04-29 | Sanofi Pasteur | Compositions for booster vaccination against dengu |
| CN111798712B (zh) * | 2020-07-15 | 2021-10-29 | 周晓庆 | 噬菌体侵染细菌3d智能模拟方法 |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6184024B1 (en) * | 1988-07-14 | 2001-02-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses |
| ATE186744T1 (de) | 1991-09-19 | 1999-12-15 | Us Health | Chimäre und/oder wachstumsgehemmte flaviviren |
| US6136561A (en) * | 1995-05-24 | 2000-10-24 | Hawaii Biotechnology Group, Inc. | Methods of preparing carboxy-terminally truncated recombinant flavivirus envelope glycoproteins employing drosophila melanogaster expression systems |
| ES2345614T3 (es) | 1997-02-28 | 2010-09-28 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Vacunas quimericas de flavivirus. |
| US6962708B1 (en) * | 1997-02-28 | 2005-11-08 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| BRPI9701774B8 (pt) * | 1997-04-11 | 2015-09-29 | Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz | cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela. |
| US6416763B1 (en) * | 1998-08-28 | 2002-07-09 | Hawaii Biotechnology Group, Inc. | Recombinant nonstructural protein subunit vaccine against flaviviral infection |
| CA2383100A1 (en) * | 1999-08-20 | 2001-03-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Aspartic and malic acid inhibition of .beta.-glucuronidase |
| AU1813901A (en) | 1999-12-01 | 2001-06-12 | Oravax, Inc | Chimeric flavivirus vaccines |
| GB2372991B (en) * | 2001-03-09 | 2004-11-17 | Fiocruz Fundacao Oswaldo Cruz | Flavivirus expression vector |
| CA2448971C (en) | 2001-06-01 | 2013-11-26 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vectors |
| US6682883B1 (en) * | 2001-07-19 | 2004-01-27 | Acambis, Inc. | Diagnosis of flavivirus infection |
| EP1441761B1 (en) * | 2001-10-19 | 2007-04-18 | Acambis, Inc. | Methods of preventing and treating flavivirus infection in animals |
| US7459160B2 (en) | 2002-01-15 | 2008-12-02 | Acambis Inc. | Chimeric flaviviruses |
| US20050002968A1 (en) | 2002-01-15 | 2005-01-06 | Monath Thomas P. | Flavivirus vaccines |
| US20040259224A1 (en) * | 2002-05-31 | 2004-12-23 | Farshad Guirakhoo | Tetravalent Dengue vaccines |
| CA2505942C (en) | 2002-11-15 | 2012-03-13 | Acambis, Inc. | West nile virus vaccine |
| US7189403B2 (en) * | 2003-06-30 | 2007-03-13 | Institut Pasteur | Attenuated flavivirus strains containing a mutated M-ectodomain and their applications |
| WO2005040390A1 (fr) | 2003-07-21 | 2005-05-06 | Shanghai Tengen Biomedical Co., Ltd. | Vaccin recombine utilisant le virus de la fievre jaune comme vecteur |
| WO2005049815A1 (en) | 2003-11-21 | 2005-06-02 | K.U.Leuven Research & Development | Flavivirus replication |
| AU2005295438B2 (en) | 2004-10-20 | 2012-07-05 | Sanofi Pasteur Biologics, Llc | Vaccines against Japanese encephalitis virus and West Nile virus |
| CN103031279B (zh) | 2005-04-24 | 2015-11-18 | 赛诺菲巴斯德生物制药有限责任公司 | 重组黄病毒疫苗 |
| BRPI0504945B8 (pt) | 2005-10-31 | 2022-08-02 | Fundacao Oswaldo Cruz | Método para a produção de flavivirus recombinante contendo sequências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, constructo de dna, flavivirus, e, composição vacinal para imunizar contra flavivirus e/ou outros patógenos. |
-
2002
- 2002-05-31 CA CA2448971A patent/CA2448971C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-31 PL PL02371187A patent/PL371187A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-05-31 BR BR0210907-7A patent/BR0210907A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-31 JP JP2003506300A patent/JP2005501532A/ja active Pending
- 2002-05-31 AU AU2002322026A patent/AU2002322026B2/en not_active Ceased
- 2002-05-31 ES ES02756112.5T patent/ES2439724T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-31 WO PCT/US2002/017374 patent/WO2002102828A2/en active Application Filing
- 2002-05-31 US US10/160,939 patent/US7569383B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-31 KR KR1020037015734A patent/KR100921592B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-05-31 EP EP02756112.5A patent/EP1401859B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-31 CN CNA028149602A patent/CN1551782A/zh active Pending
-
2009
- 2009-07-14 US US12/460,110 patent/US20110014229A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JPN6007011104, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ, 1992, Ｖｏｌ． ８９, ｐ． ２０７−２１１ * |
| JPN6007011106, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 1998, Ｖｏｌ． ２７３, ｐ． ７３６７−７３７４ * |
| JPN6007011118, Ｍｅｍ． Ｉｎｓｔ． Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ, 2000, Ｖｏｌ． ９５， Ｓｕｐｐｌ． １, ｐ． ２１５−２２３ * |
| JPN6007011119, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ, 1999, Ｖｏｌ． ７３, ｐ． ３０９５−３１０１ * |
| JPN6007011121, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ, 2000, Ｖｏｌ． ７４, ｐ． ９１９７−９２０５ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7569383B2 (en) | 2009-08-04 |
| EP1401859A4 (en) | 2004-12-29 |
| EP1401859A2 (en) | 2004-03-31 |
| US20030044773A1 (en) | 2003-03-06 |
| CN1551782A (zh) | 2004-12-01 |
| WO2002102828A2 (en) | 2002-12-27 |
| WO2002102828A3 (en) | 2003-10-09 |
| CA2448971A1 (en) | 2002-12-27 |
| KR100921592B1 (ko) | 2009-10-14 |
| US20110014229A1 (en) | 2011-01-20 |
| ES2439724T3 (es) | 2014-01-24 |
| EP1401859B1 (en) | 2013-08-07 |
| KR20040003043A (ko) | 2004-01-07 |
| PL371187A1 (en) | 2005-06-13 |
| AU2002322026B2 (en) | 2008-03-13 |
| BR0210907A (pt) | 2004-12-21 |
| CA2448971C (en) | 2013-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100921592B1 (ko) | 키메라 플라비바이러스 벡터 | |
| JP4504464B2 (ja) | キメラフラビウイルスワクチン | |
| AU2002322026A1 (en) | Chimeric flavivirus vectors | |
| US8088391B2 (en) | West nile virus vaccine | |
| US6589522B1 (en) | Vaccines against infections caused by YF virus; YF infectious cDNA, method for producing a recombinant YF virus from the YF infectious cDNA and plasmids to assemble the YF infectious cDNA | |
| WO1998037911A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| JP2002325593A (ja) | キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス | |
| KR20090008193A (ko) | 가감염성 플라비바이러스 및 이들의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20050419 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050524 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071205 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080229 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080307 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080401 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080408 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080502 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080513 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080605 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090917 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100118 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100317 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100317 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100408 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20100813 |