JP5554646B2 - フラビウイルスワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、フラビウイルス(flavivirus)ワクチンに関する。
フラビウイルスは、小さく、エンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスであり、そのいくつかは、世界的な公衆衛生に対して現在も脅威であり、今後も脅威となる。例えば、黄熱病はサハラ下アフリカの特定のジャングル地域と共に南アフリカのいくつかの地域での流行病の原因である。多くの黄熱病感染症は軽度であるが、疾患は重度の生命を脅かす病気を引き起こしうる。疾患の状態は、二つの期を有する。初期または急性期は通常、高熱、悪寒、頭痛、背中痛、筋肉痛、食欲喪失、悪心および嘔吐を特徴とする。3〜4日後これらの症状は消失する。患者によっては、疾患がいわゆる毒性期に入ると症状が再発する。この期のあいだに、高熱が再発して、ショック、出血(例えば、口、鼻、目、および/または胃からの出血)、腎不全、および肝不全が起こりうる。実際に、肝不全は黄疸を引き起こし、これが皮膚の黄化と眼の白化を引き起こし、これによってその名前に「黄熱」が与えられている。毒性期に入った約半数の患者が10〜14日以内に死亡する。しかし、黄熱病から回復した人は、再感染に対して生涯免疫を獲得する。過去20年のあいだに黄熱病ウイルス(yellow fever virus)に感染した人の数は増加しつつあり、現在では黄熱病症例は約200,000人であり、毎年約30,000人が死亡する。このように黄熱病ウイルスの再出現は、重篤な公衆衛生問題である。
本発明は、向臓器性が低下した一つまたはそれ以上の変異を有するフラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルスおよびキメラフラビウイルス)、そのようなフラビウイルスを作製する方法、およびフラビウイルス感染症を予防または治療するためにこれらのフラビウイルスを用いる方法を提供する。本発明のフラビウイルスにおける1つ(または複数の)変異は、エンベロープタンパク質のヒンジ領域に存在し、このことは向臓器性を決定するために何らかの役割を有することを本発明者らは示した。本発明のウイルスおよび方法は、以下のようにさらに説明される。
I.ヒンジ領域変異を含む黄熱病/日本脳炎キメラ
概要
キメラ黄熱病(YF)-日本脳炎(JE)ワクチン(ChimeriVax(商標)-JE)は、弱毒化JE SA14-14-2ワクチン株のprM-E遺伝子を、YF 17Dウイルスの完全長のcDNAクローンに挿入することによって構築した。アカゲザル胎児肺(FRhL)細胞での継代により、E279位で単一のMet→Lysアミノ酸変異を含む小さいプラークのウイルスが出現し、SA14-14-2からのこの残基を野生型アミノ酸に復帰変異させた。部位特異的変異誘発によって類似のウイルスを構築した。E279変異は、Eタンパク質のヒンジ領域におけるβ-シートに存在し、これは、感染細胞の細胞質へのエンドソームからのウイルス侵入の際のpH依存的構造変化に関与する。FRhLまたはVero細胞における独立したトランスフェクション継代試験において、変異はヒンジ4(アミノ酸E266〜E284によって結合される)において最も頻繁に出現し、この機能的に重要な領域におけるゲノムの不安定性を反映している。E279復帰変異は、哺乳期マウスのLD50および生存分布によって、ならびにアカゲザルにおける組織病理学によって測定すると、神経ビルレンスの有意な増加を引き起こした。サルでの結果の感度および同等性に基づくと、哺乳期のマウスは、向神経性のフラビウイルスワクチン候補物質の安全性試験の適当な宿主である。E279 Lysウイルスは、ウイルス血症と抗体レベル(向臓器性のマーカー)がE279 Metウイルスと比較して有意に減少したことから、サルにおいて神経外複製に関して限定された。
キメラウイルスの研究は、ビルレンスの分子的基礎に新しい洞察を与え、ワクチン開発の新しい展望を与えた。例えば、プラス鎖アルファウイルス(Morris-Downesら、Vaccine 19:3877〜3884、2001;Xiongら、Science 243:1188〜1191、1991)およびフラビウイルス(Brayら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10342〜10346、1991;Chambersら、J. Virol. 73:3095〜3101、1999;Guirakhooら、J. Virol. 75:7290〜7304、2001;Huangら、J. Virol. 74:3020〜2038、2000)の分子クローンは、ウイルスエンベロープならびに中和、細胞接着、融合およびインターナリゼーションに関与する決定因子をコードする構造遺伝子の挿入によって改変されている。これらのキメラウイルスの複製は、親株によって発現される非構造タンパク質および非コード末端によって制御されるが、ドナー遺伝子からの構造タンパク質は特異的免疫を与える。キメラウイルスの生物学的特徴は、ドナーおよびレシピエントウイルス遺伝子の双方によって決定される。ドナー遺伝子の全域でヌクレオチド配列の差を有する構築物を比較することによって、ビルレンスおよび弱毒化における個々のアミノ酸残基の機能的役割を詳細に調べることが可能となる。
ウイルス
ChimeriVax(商標)-JEワクチンの開発は、YF 17Dウイルスの全11-キロベースゲノムのcDNAコピーをクローニングすることによって始まった(Chambersら、J. Virol. 73:3095〜3101、1999)。これを行うため、ヌクレオチド1〜2276位および8279〜10,861位(プラスミドYF5'3'IV)、ならびにヌクレオチド1373〜8704位(プラスミドYFM5.2)からのYF配列をそれぞれコードするYF 17Dゲノム配列を、二つのプラスミドにおいて増殖させた。これらのプラスミドに由来する適当な制限断片のライゲーションによって、完全長のcDNA鋳型を作製した。YF5'3'IVおよびYFM5.2プラスミド内のYF配列は、対応するJE(SA14-14-2)pr-ME配列によって置換され、TF5'3'IV/JE(prM-E')およびYFM5.2/JE(E'-E)プラスミドが作製された。これらのプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼNheIおよびBspEIによって連続的に消化した。適当な断片をT4 DNAリガーゼによってライゲーションして、cDNAをXhoI酵素によって消化して転写させ、Sp6プロモーターからRNAを産生した。完全長のRNAによる二倍体アカゲザル胎児肺(FRhL)細胞のトランスフェクションは、電気穿孔によって行った。細胞変性作用が認められた際に(通常、3日)、ウイルスを含む上清を採取して、低速遠心によって透明にし、0.22 μmで濾過滅菌した。最終濃度50%v/vのウシ胎児血清(FBS)を安定化剤として加えた。ウイルスは、既に記述されているように(Monathら、Vaccine 17:1869〜1882、1999)Vero細胞におけるプラークアッセイによって力価を測定した。キメラウイルスは感染多重度約0.001でFRhLまたはVero細胞(Vero-PM、アベンティス・パスツール(Aventis Pasteur)、Marcy 1' Etoile、フランス)において連続的に継代した。市販の黄熱病17Dワクチン(YF-VAX(登録商標))は、ペンシルバニア州スウィフトウォーターのアベンティス・パスツール(前Pasteur-Merieux-Connaught)から入手した。
残基E279での一部位Met→Lys復帰変異を含むウイルスは、記述のようにオリゴ特異的変異誘発によって作製した(Arroyoら、J. Virol. 75:934〜942、2001)。簡単に説明すると、ヌクレオチド1108〜2472位のJE SA14-14-2 E遺伝子領域を含むプラスミド(pBS/JE SA14-14-2)(Ceciliaら、Virology 181:70〜77、1991)を部位特異的変異誘発の鋳型として用いた。変異誘発は、Transformer部位特異的変異誘発キット(クロンテック(Clontech)、パロアルト、カリフォルニア州)およびライフテクノロジーズ(Life Technologies、グランドアイランド、ニューヨーク州)で合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。プラスミドは、唯一の変化が遺伝子操作された変異であることを確認するためにE領域全域についてシークエンシングした。E279変異を含む領域を、NheIおよびEheI(KasI)制限部位を用いてpBS/JEプラスミドからpYFM5.2/JE SA14-14-2(Ceciliaら、Virology 181:70〜77、1991)にサブクローニングした。完全長のDNAおよびSP6転写の構築は上記の通りに行った;しかし、Vero細胞のRNAトランスフェクションは、リポフェクチン(ギブコ/BRL)を用いて行った。
感染した単層からTrizol(登録商標)(ライフテクノロジーズ)を用いてRNAを単離した。Superscript II逆転写酵素(RT)およびロングRTプロトコール(ライフテクノロジーズ)によって逆転写を行った後、RNアーゼH処理(プロメガ)およびロングPCR(XL-PCR、パーキン・エルマー/ABI(Perkin-Elmer/ABI))を行った。RT、PCR、およびシークエンシングプライマーは、参照としてYF 17D株の配列(ゲンバンクアクセッション番号K02749)およびJE-SA14-14-2株の配列(ゲンバンクアクセッション番号D90195)を用いてデザインした。PCR産物をゲル精製して(キアゲン(Qiagen)のQiaquickゲル抽出キット)、色素-ターミネーター・dローダミンシークエンシング反応ミクス(パーキン-エルマー/ABI)を用いてシークエンシングした。シークエンシング反応は、モデル310ジェネティックアナライザ(パーキン・エルマー/ABI)において分析して、DNA配列をSequencher 3.0(ジーンコーズ(GeneCodes))ソフトウェアを用いて評価した。
プラークアッセイは、Vero細胞の単層培養の6ウェルプレートにおいて行った。37℃で1時間インキュベートしてウイルスを吸着させた後、細胞を栄養培地においてアガロースと共に重層した。4日目に、3%ニュートラルレッドを含む第二の層を加えた。血清希釈、プラーク減少中和試験は、既に記述されたとおりに実施した(Monathら、Vaccine 17:1869〜1882、1999)。
1群8〜10匹の雌性4週齢ICRマウス(タコニックファームズインク(Taconic Farms, Inc.)、ジャーマンタウン、ニューヨーク州)に、E279変異を有する(用量4.0 log10 PFU)、または有しない(3.1 log10 PFU)キメラYF/JE SA14-14-2(ChimeriVax(商標)-JE)構築物30 μlをIC接種した。同数のマウスにYF-VAX(登録商標)または希釈剤を接種した。マウスを病気および死亡に関して21日間追跡した。
妊娠中の雌性ICRマウス(タコニックファームズ)を、正確な年齢の哺乳マウスの同腹子を得るために分娩の間観察した。48時間以内に生まれた多数の同腹子からの哺乳期マウスをプールして、マウス121匹までの群の母親に無作為に再分配した。同腹子にウイルスの連続10倍希釈液20 μlをIC接種して、病気および死亡の兆候に関して21日間追跡した。ウイルス接種物を逆滴定した。ReedおよびMuench(Morris-Downesら、Vaccine 19:3877〜3884、2001)の方法によって50%致死量(LD50)値を計算した。単分散生存分布をプロットして、対数階級検定(log rank test)によって比較した。
サル神経ビルレンス試験は、Levenbookら(Levenbookら、J. Biol. Stand. 15:305〜313、1987)によって記述され、YF 17Dシードウイルスの安全性試験に関するWHO規則によって規制されている(Wangら、J. Gen. Virol. 76:2749〜2755、1995)とおりに実施した。この試験はこれまで、ChimeriVax(商標)-JEワクチンの評価に適用されており、FRhL3ウイルスに対する試験結果が記述された(Monathら、Curr. Drugs-Infect. Dis. 1:37〜50、2001;Monathら、Vaccine 17:1869〜1882、1999)。試験は、シエラ・バイオメディカルインク(Sierra Biomedical Inc.、スパークス、ネバダ州)で、米国食品医薬品局の医薬品の安全性試験の実施に関する基準(GLP)規則(21 C.F.R.、58編)に従って実施した。1日目に、体重3.0〜6.5 kgのアカゲザル10匹(雄性5匹、雌性5匹)に、E279 Met→Lys変異を有するもしくは有しない非希釈ChimeriVax(商標)-JEウイルス、またはYF-VAX(登録商標)0.25 mlを脳の前頭葉に1回接種した。サルを臨床兆候に関して毎日調べて、0(兆候なし)、1(ざらざらした被毛、食欲なし)、2(高声、非活動的、遅い動作)、3(震える動作、振せん、協調障害、脚の虚弱)、および4(立つことができない、脚の麻痺、死亡)として採点した。それぞれのサルの臨床スコアは、動物の毎日のスコアの平均値であり、治療群の臨床スコアは個々の臨床スコアの数学的平均値である。ウイルス血症レベルは、2〜10日目に採取した血清を用いたVero細胞におけるプラークアッセイによって測定した。31日目に、動物を安楽死させて、等張生理食塩液-5%酢酸を還流してから中性緩衝10%ホルマリンを還流して、剖検を行った。脳および脊髄を固定して、切片にしてガロシアニンによって染色した。神経ビルレンスは、中枢神経系の様々な解剖学的形成における病変の存在および重症度によって評価した。重症度はWHOによって明記された尺度を用いてそれぞれの組織片内で採点した(Wangら、J. Gen. Virol. 76:2749〜2755、1995):
段階1:最小:小さい巣状炎症浸潤物1〜3個。少数のニューロンが変化または失われることがある。
段階2:中等度:より広範囲の巣状炎症浸潤物。ニューロンの変化または喪失は、ニューロンの3分の1を超えて罹患していることはない。
段階3:重度:ニューロンの33〜90%に罹患するニューロンの変化または喪失;中等度の巣状または散在性の炎症変化。
段階4:圧倒的:90%を超えるニューロンが変化または失われ、多様なしかし頻繁に重度の炎症性浸潤物を認める。
YF/JEキメラウイルスの遺伝的安定性を確認するため、およびワクチンゲノムにおいて変異に対して感受性がある「ホットスポット」を検索するため、RNAを用いて細胞をトランスフェクトして、子孫ウイルスをインビトロで連続継代し、部分的または完全なゲノムシークエンシングを低いおよび高い継代レベルで行う、多数の実験を行った。継代シリーズは、FRhLまたはVero-PM細胞におけるトランスフェクション段階と共に開始して行った。ウイルスの連続継代はT25またはT75フラスコにおいて増殖させた細胞培養において低いMOIで行った。選択された継代レベルで、ウイルスゲノムRNAの試料2個ずつを抽出して、逆転写し、PCRによって増幅して、prM-E領域または完全なゲノム配列を決定した。
経験的継代による一部位変異体ウイルスの作製
トランスフェクトしたFRhL細胞(FRhL1)から回収したキメラYF/JE SA14-14-2(ChimeriVax(商標)-JE)ウイルスを、MOI約0.001でこれらの細胞の液体培養において連続的に継代した。下記のように、4代目において、本発明者らはプラーク形態の変化を認め、これはその後ヌクレオチド1818位でのT→G転換に関連することが示され、Eタンパク質の279位でのアミノ酸変化(Met→Lys)が起こった。
マウスおよびヒト以外の霊長類を含む試験は全て、実験動物の飼育および使用に関する基準に記述されるUSDA動物福祉条例(9 C.F.R.、1〜3編)に従って実施した。
4週齢の雌性ICRマウス10匹に、異なる実験においてFRhL3、FRhL4、およびFRhL5ウイルスの3.0 log10 PFUをIC接種した;それぞれの試験において、マウス10匹に、市販の黄熱病ワクチン(YF-VAX(登録商標)、アベンティス・パスツール、スイフトウォーター、ペンシルバニア州)の同等量(約3.3 log10 PFU)を与えた。キメラウイルスを接種したマウスはいずれも病気の兆候または死亡を示さなかったのに対し、YF-VAX(登録商標)を接種した対照マウスの70〜100%が麻痺または死亡を示した。もう一つの実験において、マウス8匹にFRhL5(3.1 log10 PFU)またはYF/JE一部位E279復帰変異体(4.0 log10PFU)をIC接種して、マウス9匹にYF-VAX(登録商標)(2.3 log10 PFU)を接種した。キメラ構築物を接種したマウスはいずれも病気にならなかったが、YF-VAX(登録商標)を接種したマウス9匹中6匹(67%)が死亡した。
E279変異を有するおよび有しないYF/JESA14-14-2キメラウイルスを哺乳期マウスに段階的な用量でIC接種する、という異なる二つの実験を行った(表2)。これらの実験においてYF-VAX(登録商標)を参照対照として用いた。LD50および平均生存時間(average survival time:AST)を、それぞれのウイルスに関して決定した。
ChimeriVax(商標)-JE FRhL3またはFRhL5ウイルスを接種したサル20匹はいずれも脳炎の兆候を発症しなかったが、YF-VAX(登録商標)を接種したサル10匹中4匹は、15〜29日のあいだに段階3の兆候(振せん)を示し、これは発症から6日以内に消失した。臨床スコアの平均値および最高平均値は、YF-VAX(登録商標)群では二つのChimeriVax(商標)-JE群より有意に高かった。E279変異を有するおよび有しないChimeriVax(商標)-JEウイルスを接種した群の臨床スコアには差を認めなかった(表3)。
三つ全ての群における全てのサルは、試料を採取できなかったために試験できなかった動物1匹(FRhL5、RAK22F)を除き、黄熱病(YF-VAX(登録商標)群)またはChimeriVax(商標)-JE(ChimeriVax(商標)群)の接種後31日目に同種中和抗体を産生した。しかし、幾何学的平均抗体力価(geometric mean antibody titer:GMT)は、FRhL3を接種したサル(GMT 501)ではFRhL5を接種したサル(GMT 169、p=0.0386、t検定)より有意に高かった。
ChimeriVax(商標)-JE RNAの異なる二つのトランスフェクションを、二つの細胞株、FRhLおよびVeroのそれぞれにおいて実施し、子孫ウイルスを図4に示すように継代した。FRhL継代シリーズBでは、上記のようにFRhL4でE279復帰変異体が出現した。興味深いことに、FRhL細胞における異なる継代シリーズ(A)によっても、隣接する残基であるE281で変異(Thr→Lys)が出現し、Vero細胞における継代シリーズの1つでは、E271でVal→Lysが生じた。Vero細胞において選択された他の変異は、ドメインIIIまたは膜貫通ドメイン内に存在した。図2に示した変異を含むウイルスを全て、成体マウスの神経ビルレンス試験において評価して、非ビルレントであることが判明した。
概要
黄熱病ウイルス(株17D)骨格(Guirakhooら、J. Virol. 75:7290〜7304、2001)に挿入したデング1型ウイルスの野生型株[1980年にタイで単離された(Puo359)]のprME遺伝子を用いて、ChimeriVax(商標)-DEN1ウイルスを作製した。Vero細胞においてChimeriVax(商標)-DEN1のプレマスターシードウイルスを産生する間、1590位でAからGへの一ヌクレオチド変化を含み、それによってエンベロープタンパク質Eの204位でKからRへのアミノ酸置換が起こるクローン(クローンE)を単離してプラークを精製した。ウイルスは、皮下経路によってサルに接種した場合、4日齢の哺乳期マウスに関して弱毒化を示し、その親(非変異体)ウイルスより低いウイルス血症を示した。変異を有しないもう一つのクローン(クローンJ-2)を選択して、プラークを精製し、これを用いて継代7回目(P7)にPMSウイルス保存液を作製した。このウイルスは、Vero細胞においてP10まで実験条件で継代したところ、如何なる変異も受けなかった。しかし、PMS保存液からマスターシードウイルス(P8)を産生するcGMP条件で1回継代すると、1590位で同じ変異(A→G)が出現した。クローンEと同様に、P8ウイルスは、P7ウイルスより大きいプラークを産生し、哺乳期マウスに関して弱毒化された。このように、全てのデングウイルスにおいて保存されているE204位は、ChimeriVax(商標)-DEN1(血清型1〜4)ウイルスにおいて、ヒトに関するワクチン候補物質の弱毒化と免疫原性とのバランスを得るために操作することができる。
ChimeriVax-DEN1ウイルスのプレマスターシードの産生
DEN1に関するプラーク精製プレマスターシード(Pre-Master Seed:PMS)ウイルスの産生は、以下のように実施した。プラークの精製は、RNAトランスフェクション後継代2(P2)のウイルスで開始した。二つのPMSウイルス(P2でクローン化されていないおよびP7でクローン化された)は、継代140でアベンティスから得られた認定された細胞バンクを用いて、継代142でアベンティスVero LS10細胞において産生された。プラーク精製の3ラウンド後にクローン化されたウイルスを得て、変異がないことを確認するために完全なゲノムの全域についてシークエンシングした。一般的に、クローンがアミノ酸置換を含む場合、これは、PMSウイルス候補物質として用いなかった。他のクローンを調製して、変異を有しないクローンが同定されるまでシークエンシングした後、これにプラーク精製およびシークエンシングを行った。
シークエンシングに関して、ウイルスRNAをTRI-試薬LS(モレキュラーリサーチセンター(Molecular Research Center))またはTrizol LS(ギブコ(Gibco)からの類似の試薬)を用いて、それぞれの個々のウイルス試料(一般的に0.25 ml)から抽出して、RNアーゼ不含水0.20 mlに溶解した。抽出されたRNAをRT-PCRの鋳型として使用した。ゲノム全体を、Titan One-Tube RT-PCRキット(ロシュ(Roche))によって、長さが2〜3 kbのオーバーラップしたアンプリコン5個(断片I〜V)において増幅した。RT-PCR断片は、QIA quick PCR精製キット(キアゲン)を用いて精製するか、またはQIA quickゲル抽出キット(キアゲン)を用いてアガロースゲル精製した。シークエンシング反応は、CEQ Dyeターミネータサイクルシークエンシングキット(ベックマン(Beckman))、ならびにアンプリコンの双方の鎖を読み取るためにプラス方向およびマイナス方向の双方のYF特異的オリゴヌクレオチドプライマーのコレクションを用いて行った。シークエンシング反応産物は、DyeEx Spinキット(キアゲン)を用いて精製し、CEQ2000自動シークエンサー(ベックマン・コールター(Beckman Coulter))によって分離した。生成したシークエンシングデータを、Sequencher 3.0(ジーンコーズ(GeneCodes))ソフトウェアによって整列させて分析した。ヌクレオチドの不均一性は、不均一なシグナルが、プラス鎖およびマイナス鎖のシークエンシング反応の双方を表すクロマトグラム全てに認められた場合に限って登録した。
3〜4週齢のマウスを用いたマウス神経ビルレンス試験は、キメラの神経ビルレンスがChimeriVax(商標)ウイルスを構築するために用いたウイルスベクター(YF-VAX(登録商標))の神経ビルレンスを確実に超えないようにリリーステストとして行った。これまで構築された全てのキメラ(変異を有するまたは有しない)は、成体マウス(3〜4週齢)に関してビルレントではないため、これらの動物は、一アミノ酸置換に関連したキメラの神経ビルレンスにおける微妙な差を同定するために用いることができない。対照的に、4〜10日齢の哺乳期のマウスは、ビルレンスに関与するキメラのゲノムにおける軽微な変化に対してより感受性が高い。ChimeriVax(商標)-DENウイルスの発達の過程において。四つ全てのキメラのゲノムの全域についていくつかの変異を認めた(Guirakhooら、J. Virol. 75:7290〜7304、2001)。これらの変異は、全てのキメラにおいて修正され、再構築されたウイルス(DEN1キメラを除く)は、サルにおいて安全性および免疫原性に関して首尾よく評価された。DEN1プラスミドの不安定性のために、このキメラ(変異を有しない)の再構築は、時間通りに行うことができず、したがって、サルにおいて試験することができなかった。DEN1キメラに関するPMSを産生するためのプラーク精製のあいだ、異なるクローン10個(A-J)をシークエンシングして、変異を有しないクローンを同定した(表5)。一つ(J)を除く全てのクローンが、エンベロープタンパク質E内に1または2個の変異を含んだ。4日齢の哺乳期マウスを用いて、DEN1キメラの代表的なクローンの神経ビルレンスを評価した(表6)。動物に、各キメラDEN1ウイルスの非希釈、1:10、1:100の希釈液0.02 mlをi.c.経路によって2回接種して、21日間観察した。実際の用量は、プラークアッセイにおける接種量の逆滴定によって決定した。表6に示すように、クローンEの属全てのクローンが、4日齢のマウスに関して類似の神経ビルレンスを示し、平均生存時間(AST)は、YF-VAX(登録商標)より有意に短かった(JMPソフトウェア、バージョン4.0.2を用いてp<0.001)。クローンE(E204K>R)は、他の全てのDEN1クローンより有意にビルレンスが低かった(p<0.0001)。興味深いことに、当初のDEN1キメラにおいて同定された変異2個のうち1個は、E204K>R置換であった。このウイルスをサルに接種したところ、1.3日間低レベルのウイルス血症を誘導した(平均最大力価0.7 log10 PFU/ml)。如何なる変異も含まず、4日齢マウスにおいてYF-VAX(登録商標)より有意にビルレンスが低いことが示された(p=0.001)クローンJを、cGMP MSウイルスを産生するために選択した。
ウイルスの向臓器性(ウイルス血症)に及ぼすE204変異の影響を、E204変異を有する(クローンE、P6)または有しない(クローンJ、P7)ChimeriVax-DEN1ウイルスをサルに接種することによって評価した。当初のDEN1キメラ(ChimeriVax-DEN1、非クローン化P4、1999、1群)は、そのウイルス血症および免疫原性プロフィールが既にサルにおいて一価または四価(他のキメラ3個と組み合わせて)ワクチン(Guirakhooら、J. Virol. 75:7290〜7304、2001)として評価されていることから、これを対照として選択した。
1 Nitayaphan, S.ら、1990、Virology 177:541〜552
2 Ni H.ら、1994、J. Gen. Virol. 75:1505〜1510;PDK=初代培養イヌ腎臓
3 Aihara S.ら、1991、Virus Genes 5:95〜109;PHK=初代培養ハムスター腎臓
4 McAda P.ら、1987、Virology 158:348〜360
1 逆滴定
2 臨床スコア:0=兆候なし;1=ざらざらした外皮、食欲なし;2=高声、非活動的、遅い動作;3=振せん、協調障害、震える動作、脚の虚弱、4=立つことができない、麻痺、瀕死または死亡。任意の日での最高スコアと30日の観察期間の平均スコアを示す。
3 黒質
4 線条体および視床、右および左側(尾状核、淡蒼球、被殻、視床前核/視床内側核、視床内側核;脊髄の頚膨大および腰膨大(6レベル))
5 YF-VAX(登録商標)およびChimeriVax(商標)-JEウイルスを比較する両側の異分数スチューデントt検定
6 行っていない
YF-VAX(登録商標)対照
ChimeriVax(商標)-JE FRhL3 E279 Met
ChimeriVax(商標)-JE FRhL5 E279 Lys
1 -=ウイルス血症を検出できない;ほとんどの試験において、未希釈(neat)の血清を試験して、カットオフは1.0 log10PFU/mlであった:場合によっては、未希釈の血清は細胞に対して毒性を示し、2倍または5倍希釈した血清を用いた(カットオフ1.3または1.7 log10PFU/ml)。
2 平均力価および標準偏差を計算する目的の場合、<1.0の代わりに0.7を用い、<1.3の代わりに1.0を用い、そして<1.7の代わりに1.4を用いた。
3 両側のt検定によってYF-VAX(登録商標)と比較。
4 両側のt検定によってChimeriVax(商標)-JE FRhL3と比較。
a;ゲノムの開始から。b;表記のタンパク質のN-末端から;Riceら、Science 229:726〜733、1985に従う番号づけ。204変異を有するクローンを太字で示す。
*:1群サル4匹(雄性2匹/雌性2匹)
**:Guirakhooら、2001
*:1日目にサルを免疫した。
**:<1.0 log10PFU/ml
Claims (37)
- 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質が、デング-1ウイルス、デング-2ウイルス、デング-3ウイルスおよびデング-4ウイルスからなる群より選択されるデングウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルスであって、該キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質が、デング-3ウイルスにおいては202位またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位に変異を含み、該変異が、該変異のない対応するキメラフラビウイルスと比較して、キメラフラビウイルスの向臓器性を低下させるものである、キメラフラビウイルス。
- 前記デングウイルスが、デング-1ウイルスである、請求項1に記載のキメラフラビウイルス。
- 前記デングウイルスが、デング-2ウイルスである、請求項1に記載のキメラフラビウイルス。
- 前記デングウイルスが、デング-3ウイルスである、請求項1に記載のキメラフラビウイルス。
- 前記デングウイルスが、デング-4ウイルスである、請求項1に記載のキメラフラビウイルス。
- 前記変異が置換である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のキメラフラビウイルス。
- 前記置換がリジンからアルギニンへの置換である、請求項6記載のキメラフラビウイルス。
- 前記黄熱病ウイルスが、黄熱病ウイルスワクチン株YF17Dである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のキメラフラビウイルス。
- (i) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-1ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス、
(ii) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-2ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス、
(iii) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-3ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス、ならびに
(iv) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-4ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス
を含む四価ワクチン組成物であって、該キメラフラビウイルスのいずれかまたは全てにおけるエンベロープタンパク質が、デング-3ウイルスにおいては202位またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位に変異を含み、該変異が、該変異のない対応するキメラフラビウイルスと比較して、キメラフラビウイルスの向臓器性を低下させるものである、四価ワクチン組成物。 - デング-3ウイルスにおいては202位またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位に変異を含むエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスであって、該変異が、該変異のない対応するキメラフラビウイルスと比較して、キメラフラビウイルスの向臓器性を低下させるものであるキメラフラビウイルスが、黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-1ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラフラビウイルスである、請求項9に記載の組成物。
- デング-3ウイルスにおいては202位またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位に変異を含むエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスであって、該変異が、該変異のない対応するキメラフラビウイルスと比較して、キメラフラビウイルスの向臓器性を低下させるものであるキメラフラビウイルスが、黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-2ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラフラビウイルスである、請求項9に記載の組成物。
- デング-3ウイルスにおいては202位またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位に変異を含むエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスであって、該変異が、該変異のない対応するキメラフラビウイルスと比較して、キメラフラビウイルスの向臓器性を低下させるものであるキメラフラビウイルスが、黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-3ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラフラビウイルスである、請求項9に記載の組成物。
- デング-3ウイルスにおいては202位またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位に変異を含むエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスであって、該変異が、該変異のない対応するキメラフラビウイルスと比較して、キメラフラビウイルスの向臓器性を低下させるものであるキメラフラビウイルスが、黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-4ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラフラビウイルスである、請求項9に記載の組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のキメラフラビウイルス、または請求項9〜13のいずれか一項に記載の組成物、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、ワクチン組成物。
- 被験者におけるデングウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項14に記載のワクチン組成物。
- 前記被験者がデングウイルス感染症を有しないが発症のリスクを有する、請求項15に記載のワクチン組成物。
- 前記被験者がデングウイルス感染症を有する、請求項15記載のワクチン組成物。
- 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質が、デング-1ウイルス、デング-2ウイルス、デング-3ウイルスおよびデング-4ウイルスからなる群より選択されるデングウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラフラビウイルスに、デング-3ウイルスにおいてはエンベロープの202位のアミノ酸、またはデング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいては204位のアミノ酸の変異を導入する工程を含む、デングウイルスワクチンを製造する方法。
- 前記変異がリジンからアルギニンへの変異である、請求項18に記載の方法。
- フラビウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域における1つまたは複数の変異を含むフラビウイルスを含む、ワクチン組成物であって、該変異が、フラビウイルスの向臓器性を低下させ、該フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、または黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質が日本脳炎ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラフラビウイルスであり、該変異がエンベロープタンパク質のヒンジ領域の279位に存在する、ワクチン組成物。
- 前記変異が置換である、請求項20に記載のワクチン組成物。
- 前記置換がメチオニンからリジンへの置換である、請求項21に記載のワクチン組成物。
- 前記変異が欠失である、請求項20に記載のワクチン組成物。
- 前記黄熱病ウイルスが、黄熱病ウイルスワクチン株YF17Dである、請求項20〜23のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
- 前記変異が導入された日本脳炎ウイルスが、SA14-14-2ワクチン株である、請求項20〜24のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
- 患者におけるフラビウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項20〜25のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
- 前記患者がフラビウイルス感染症を有しないが発症のリスクを有する、請求項26に記載のワクチン組成物。
- 前記患者がフラビウイルス感染症を有する、請求項26に記載のワクチン組成物。
- フラビウイルスの向臓器性および/または神経ビルレンスを低下させる方法であって、該フラビウイルスが、デングウイルス、または黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデングウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラウイルスであり、デング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいてはデングウイルスのエンベロープタンパク質の204位またはデング-3ウイルスにおいてはデングウイルスのエンベロープタンパク質の202位におけるリジンからアルギニンへの置換を含む、方法。
- 前記フラビウイルスの向臓器性および神経ビルレンスを低下させる、請求項29に記載の方法。
- 前記デングウイルスが、デング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスであるか、または黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質が該デングウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラウイルスであり、該デングウイルスのエンベロープタンパク質の204位におけるリジンからアルギニンへの置換を含む、請求項29または30に記載の方法。
- 前記デングウイルスが、デング-3ウイルスであるか、または黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-3ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラウイルスであり、デングウイルスのエンベロープタンパク質の202位におけるリジンからアルギニンへの置換を含む、請求項29または30に記載の方法。
- 前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデングウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラデングウイルスである、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記黄熱病ウイルスが、黄熱病ウイルスワクチン株YF17Dである、請求項33に記載の方法。
- 前記フラビウイルスを、前記フラビウイルスおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含むワクチン組成物に製剤化する段階をさらに含む、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フラビウイルスを、四価ワクチン組成物に製剤化する段階をさらに含む、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法であって、
該四価ワクチン組成物が、
(i) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-1ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス、
(ii) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-2ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス、
(iii) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-3ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス、ならびに
(iv) 黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデング-4ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含む、キメラフラビウイルス
を含み、該キメラフラビウイルスのいずれかまたは全てに、リジンからアルギニンへの置換が生じている、方法。 - デングウイルス、または黄熱病ウイルスの膜およびエンベロープタンパク質がデングウイルスの膜およびエンベロープタンパク質に置き換えられた黄熱病ウイルスを含むキメラウイルスであり、デング-1ウイルス、デング-2ウイルスもしくはデング-4ウイルスにおいてはデングウイルスのエンベロープタンパク質の204位またはデング-3ウイルスにおいてはデングウイルスのエンベロープタンパク質の202位におけるリジンからアルギニンへの置換を含む、フラビウイルスであって、該変異のない対応するフラビウイルスと比較して、向臓器性および/または神経ビルレンスを低下した、該フラビウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するためのフラビウイルス。
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