JP2010011868A - 機能活性抗体を誘発する髄膜炎菌性bエピトープの分子模倣物 - Google Patents
機能活性抗体を誘発する髄膜炎菌性bエピトープの分子模倣物 Download PDFInfo
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Abstract
る薬剤を提供すること。
【解決手段】本発明は、Neisseria meningitidis血清型B(Me
nB)P1.2血清亜型のPorAのループ4に対する表面に露出したエピトープの分子
模倣物およびこの模倣物に対して産生される抗体を開示する。アミノ酸配列QTPを含む
GNA33ペプチドであって、このペプチドが、Neisseria meningit
idis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および/またはオプソニン活性を
示す抗体の産生を誘発し得る。このような分子模倣物またはこれに対する抗体を含有する
組成物は、MenB疾患を予防するため、およびMenB感染の診断のために使用され得
る。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的には、細菌性病原体に関する。特に、本発明は、Neisseria
meningitidis血清型B(MenB)P1.2血清亜型のPorAのループ
4に対する表面に露出したエピトープの分子模倣物およびこの模倣物に対して産生される
抗体に関する。
Neisseria meningitidisは、細菌性の髄膜炎および敗血症の原
因物質である。髄膜炎菌は、莢膜抗原および細胞壁抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学
的な群に分類される。現在認識されている血清型は、A、B、C、W−135、X、Y、
Zおよび29Eを含む。血清型特異性の原因である多糖類は、これらの群のいくつかから
精製され、A、B、C、W−135およびYが挙げられる。
と呼ばれる)は、アメリカ合衆国およびヨーロッパに居住している未成年者および小児に
おける大部分の細菌性髄膜炎の原因となる。この生物はまた、若年成人における致死的な
敗血症を引き起こす。青年では、外膜タンパク質(OMP)小胞からなる実験的なMen
Bワクチンが、幾分防御性である。しかし、ワクチン接種した未成年者(疾患の危険性が
最大の年齢層)では、防御性は、観察されていない。さらに、OMPワクチンは、血清型
特異性および亜型特異性であり、そして優性MenB株は、地理的な変異および時間的な
変異の両方に制約され、このようなワクチンの有用性を制限している。
引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しかし、MenB多糖類ワクチ
ンを開発する同様な試みは、莢膜MenB多糖類(本明細書中で「MenB PS」と呼
ばれる)の乏しい免疫原性に起因して失敗している。MenB PSは、N−アセチル(
α2−>8)ノイラミン酸のホモポリマーである。Escherichia coli
K1は、同一の莢膜多糖類を有する。MenB PSにより誘発される抗体は、宿主のポ
リシアル酸(PSA)と交差反応する。PSAは、胎児および新生児の組織、特に、脳組
織に見られる神経細胞接着分子(「NCAM」)上で大量に発現される。PSAはまた、
腎臓、心臓および嗅神経を含む成人組織で、より少ない程度に見出される。従って、ほと
んどの抗MenB PS抗体はまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎
児の発育に悪影響を与えるか、または自己免疫疾患をもたらす可能性を有する。
これらの試みにも関わらず、従来のアプローチは、安全かつMenB感染に対して広範な防御性を付与し得る抗原の同定に失敗している。
患の処置のために、分子模倣性抗原を使用することに、相当な関心が存在する。感染性疾
患の予防のためにワクチンを開発するこのアプローチは、名目上の抗原が毒性であるかも
しくは精製が困難である場合、または限定した数のエピトープに免疫応答を指向すること
が望ましい場合、最大の有用性を有する。それにも関わらず、病原体に対する防御性抗体
を誘発する模倣性ワクチンの成功を報告する研究は、比較的わずかしかない。
MenBに対して安全かつ有効なワクチンの産生が、特に望ましいことが容易に理解さ
れる。
本発明は、GNA33が、P1.2血清型亜型を有する株のPorAのループ4において
、表面に露出したエピトープを模倣することによってMenBに対する保護抗体を誘発す
るという、思いがけない発見に基づく。このような抗体の機能活性は、本明細書中に記載
されるように、ヒトにおける髄膜炎菌性疾患に対して保護する分子因子の能力を予測する
インビトロおよびインビボでの機能アッセイを用いることによって評価されている。
の産生に有用なエピトープを含む、GNA33ペプチドに関する。このペプチドは、全長
未満のGNA33配列を含む。特に好ましい実施形態において、このペプチドは、アミノ
酸配列QTPおよび、必要に応じて、QTP配列に対してC末端またはN末端のいずれか
に生じる、さらなるQTP配列の前または後ろのフランキング配列(好ましくは1〜50
またはそれ以上であるが全長配列ではない(例えば、1〜3、1〜5、もしくは1〜10
または1〜25あるいはこれらの範囲間の任意の整数値)アミノ酸)を含む。代表的なG
NA33配列を図3(配列番号1)に示す。このQTPは、図3の106〜108位に生
じる。この配列は、種々のMenB株(例えば、本明細書中に記載される)が異なるフラ
ンキング配列を有するように、図3に示されるように、QTPに隣接する配列に限定され
ないことが理解される。種々の菌株におけるPorA領域の配列は公知であり、そのいく
つかが、表2に示される。
ノ酸配列を含む:FQTPV(配列番号2)、FQTPVHS(配列番号3)、AFQT
PVHS(配列番号4)、QAFQTPVHS(配列番号5)、AQAFQTPVHS(
配列番号6)、AQAFQTPVH(配列番号7)、AQAFQTPV(配列番号8)、
QAFQTPVHSF(配列番号9)、AFQTPVHSFQ(配列番号10)、FQT
PVHSFQA(配列番号11)、QTPVHSFQAK(配列番号12)、DVSAQ
AFQTP(配列番号12)、VSAQAFQTPV(配列番号13)およびSAQAF
QTPVH(配列番号14)。
を挿入するためのキャリア、ならびに一般的なキャリアとしての、GNA33ポリペプチ
ドの使用に関する。
よびこのポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、このベクターを含む宿主細胞、なら
びにこのペプチドを組み換え生成する方法に関する。
こで、この抗体は、GNA33エピトープによって結合され得、そして/またはMenB
細菌に対する機能活性を立証する。さらに以下に説明されるように、本明細書中に記載さ
れるアッセイを用いて決定されるように、この抗体分子がMenBに対して補体が媒介す
る殺菌活性および/またはオプソニン活性を示す場合、抗体は、MenB生物に対する機
能活性を示す。代表的なGNA33エピトープとしては、QTP、FQTPV(配列番号
2)、FQTPVHS(配列番号3)、AFQTPVHS(配列番号4)、QAFQTP
VHS(配列番号5)、AQAFQTPVHS(配列番号6)、AQAFQTPVH(配
列番号7)、AQAFQTPV(配列番号8)、QAFQTPVHSF(配列番号9)、
AFQTPVHSFQ(配列番号10)、FQTPVHSFQA(配列番号11)、QT
PVHSFQAK(配列番号12)、DVSAQAFQTP(配列番号12)、VSAQ
AFQTPV(配列番号13)およびSAQAFQTPVH(配列番号14)が挙げられ
る。
れらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。好ましくは、このモノク
ローナル抗体は、MenB生物に対する機能活性を示す。
metic)を単離するための方法およびこの方法を用いて同定される分子模倣物に関す
る。この方法は、以下の工程を包含する:
(a)MenBのエピトープの推定分子模倣物を含む分子集団を提供する工程;
(b)存在する場合、複合体を提供するために、抗体および分子模倣物の間の免疫学的
結合を可能にする条件下で、この分子集団を、本明細書中に記載される抗体と接触させる
工程;および
(c)非結合分子から複合体を分離する工程。
33、または上記のようなエピトープを含むGNA33のペプチドを含む組成物に関する
。
NA33ポリペプチドに対する抗体を含む組成物に関する。
ningitidis血清型Bに対する免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、被
験体に対し、上記のようなGNA33ペプチドを投与する工程を包含する。
予防するための方法に関し、この方法は、有効量の上記組成物を被験体に投与する工程を
包含する。
ingitidis血清型B抗体を検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程
を包含する:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)Neisseria meningitidis血清型B抗体を、上記生物学的
サンプル中に存在する場合、GNA33ポリペプチドに結合し得る条件下で、生物学的サ
ンプルをGNA33ポリペプチドと反応させ、抗体/GNA33ポリペプチド複合体を形
成する工程;および
(c)この複合体の存在または非存在を検出し、
これによって、サンプル中のNeisseria meningitidis血清型B
抗体の存在または非存在を検出する工程。
列を含む、GNA33ペプチドが挙げられる:QTP、FQTPV(配列番号2)、FQ
TPVHS(配列番号3)、AFQTPVHS(配列番号4)、QAFQTPVHS(配
列番号5)、AQAFQTPVHS(配列番号6)、AQAFQTPVH(配列番号7)
、AQAFQTPV(配列番号8)、QAFQTPVHSF(配列番号9)、AFQTP
VHSFQ(配列番号10)、FQTPVHSFQA(配列番号11)、QTPVHSF
QAK(配列番号12)、DVSAQAFQTP(配列番号12)、VSAQAFQTP
V(配列番号13)およびSAQAFQTPVH(配列番号14)。したがって、本発明
は、以下を提供する。
(1)アミノ酸配列QTPを含むGNA33ペプチドであって、該ペプチドが、Neis
seria meningitidis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性お
よび/またはオプソニン活性を示す抗体の産生を誘発し得る、GNA33ペプチド。
(2)項目1に記載のGNA33ペプチドであって、該ペプチドが、FQTPV(配列番
号2)、FQTPVHS(配列番号3)、AFQTPVHS(配列番号4)、QAFQT
PVHS(配列番号5)、AQAFQTPVHS(配列番号6)、AQAFQTPVH(
配列番号7)、AQAFQTPV(配列番号8)、QAFQTPVHSF(配列番号9)
、AFQTPVHSFQ(配列番号10)、FQTPVHSFQA(配列番号11)、Q
TPVHSFQAK(配列番号12)、DVSAQAFQTP(配列番号12)、VSA
QAFQTPV(配列番号13)およびSAQAFQTPVH(配列番号14)からなる
群より選択されるアミノ酸配列を含む、GNA33ペプチド。
(3)前記ペプチドが、アミノ酸配列FQTPV(配列番号2)を含む、項目2に記載の
GNA33ペプチド。
(4)項目1〜3のいずれか1項に記載のGNA33ペプチド、および薬学的に受容可能
な賦形剤を含む、組成物。
(5)哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清型
B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目4に記載の組成物の使用。
(6)哺乳動物被験体においてNeisseria meningitidis血清型B
細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目4に記載
の組成物を投与する工程を包含する、方法。
(7)項目1〜3のいずれか1項に記載のGNA33ペプチドに対して指向されるモノク
ローナル抗体であって、該抗体が、Neisseria meningitidis血清
型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および/またはオプソニン活性を示す、モノク
ローナル抗体。
(8)項目7に記載のモノクローナル抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組
成物。
(9)GNA33ポリペプチドに対する抗体を含む組成物であって、該抗体が、Neis
seria meningitidis血清型B細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性お
よび/またはオプソニン活性を示す、組成物。
(10)前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目9に記載の組成物。
(11)哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清
型B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目8〜10のいずれか1項
に記載の組成物の使用。
(12)哺乳動物被験体において、Neisseria meningitidis血清
型B細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目8〜
10のいずれか1項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
(13)
項目1〜3のいずれか1項に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
(14)組換えベクターであって、以下:
(a)項目13に記載のポリヌクレオチド;および
(b)該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される、少なくとも1つの異種制御エレメ
ント、
を含む、組換えベクターであって、該組換えベクターによって、該ポリヌクレオチドが、
宿主細胞中で転写および翻訳され得、そして該制御エレメントの少なくとも1つが、該ポ
リヌクレオチドに対して異種である、組換えベクター。
(15)項目14に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
(16)GNA33ペプチドを産生するための方法であって、該方法が、タンパク質を産
生するための条件下で、項目15に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
(17)Neisseria meningitidis血清型B細菌のエピトープの分
子模倣物を単離するための方法であって、該方法が、以下:
(a)Neisseria meningitidis血清型B細菌のエピトープの推
定上の分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程;
(b)該分子の集団を抗GNA33抗体と接触させる工程であって、該抗体と該分子模
倣物(存在する場合)との間の免疫学的結合を可能にして、複合体を提供する条件下で接
触させる工程;および
(c)非結合分子から該複合体を分離する工程、
を包含する、方法。
(18)生物学的サンプル中でNeisseria meningitidis血清型B
抗体を検出するための方法における、GNA33ポリペプチドの使用。
(19)生物学的サンプル中でNeisseria meningitidis血清型B
抗体を検出するための方法における、項目1〜3のいずれか1項に記載のGNA33ペプ
チドの使用。
(20)生物学的サンプル中でNeisseria meningitidis血清型B
抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)該生物学的サンプルをGNA33ポリペプチドと反応させる工程であって、該生
物学的サンプル中に存在する場合、Neisseria meningitidis血清
型B抗体を、該GNA33ポリペプチドと結合させて、抗体/GNA33ポリペプチド複
合体を形成する条件下で反応させる工程、および
(c)該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプ
ル中のNeisseria meningitidis血清型B抗体の存在または非存在
を検出する工程、
を包含する、方法。
(21)生物学的サンプル中のNeisseria meningitidis血清型B
抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下:
(a)生物学的サンプルを提供する工程;
(b)該生物学的サンプルを項目1〜3に記載のいずれか1項に記載のGNA33ペプ
チドと反応させる工程であって、該生物学的サンプル中に存在する場合、Neisser
ia meningitidis血清型B抗体を、該GNA33ポリペプチドと結合さ
せて、抗体/GNA33ポリペプチド複合体を形成する条件下で反応させる工程;および
(c)該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプ
ル中のNeisseria meningitidis血清型B抗体の存在または非存在
を検出する工程、
を包含する、方法。
本発明のこれらまたは他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に
なされ得る。
本発明の実施は、他に示されなければ、免疫学、微生物学および分子生物学の慣習的な
技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で
十分説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual(第2版、1989);Sambrook
およびRussell、Molecular Cloning:A Laborator
y Manual(2001);MorrisonおよびBoyd、Organic C
hemistry(第3版、1973);CareyおよびSundberg、Adva
nced Organic Chemistry(第2版、1985);Smith,M
.B.,Organic Synthesis(1994);Perbal,A Pra
ctical Guide to Molecular Cloning(1984);
およびHandbook of Experimental Immunology,第
I巻−第IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1986,B
lackwell Scientific Publications)を参照のこと。
n」および「the」は、他に指示されなければ、複数の言及を含む。
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義され
ることが意図される。
、このポリペプチドは、MenBに対する免疫学的応答(例えば、以下に示すようなMe
nB細菌に対する機能的活性を実証する抗体の産生)を誘発し得る。この用語は、GNA
33由来の個々の高分子または抗原性高分子の相同性集団もしくは異種集団を示すために
用いられ得る。本発明の目的のために、GNA33ポリペプチドは、種々の公知のMen
B株のいずれかから誘導され得る。2996株についてのGNA33配列を、図3(配列
番号1)に示す。しかし、他のMenB株由来の多数のGNA33配列が知られている。
例えば、GenBank登録番号C81244、B82023、AF226395、AF
226392、AF226390、AF226403、AF226413、AF2264
12、AF226387、AF226409、AF22641、AF226397、AF
226389、AF226393、AF226416、AF226414、AF2264
02、AF226404、AF235145、AF235144、AF235143、N
eisseria meningitidis;E83491、Pseudomonas
aeruginosa(PAO1株);AF300471、Zymomonas mo
bilis;AAK85834、Agrobacterium tumefaciens
;CAC41396、Sinorhizobium meliloti;AAK2570
2、Caulobacter crescentus;S76334、Synechoc
ystis sp.(PCC 6803株);AAK03012、Pasteurell
a multocida;Q9KPQ4、Vibrio cholerae;AAB40
463、AAC45723、P46885、Escherichia coli;P57
531、Buchnera aphidicola(Acyrthosiphon pi
sum);NP143714、Pyrococcus horikoshiiを参照のこ
と。
3のアミノ酸1〜21)を有するか、またはそれを有さない、全長GNA33参照配列を
含む、ネイティブのGNA33配列由来の分子、および組換え産生または化学合成された
GNA33ポリペプチド、ならびに下記のように免疫原性を保持するGNA33ペプチド
を含む。
的活性(例えば、MenBに対する機能的活性を有する抗体の形成を誘発する能力)を保
持し得る。一般に、用語「アナログ」とは、改変が活性を損なわない限りにおける、ネイ
ティブの分子に対して1以上のアミノ酸の付加、(一般的には、性質が保存される)置換
、および/または欠失を有するネイティブのポリペプチドの配列および構造を有する化合
物をいう。好ましくは、アナログは、親分子と少なくとも同じ生物学的活性を有し、そし
て親分子よりも増強された活性さえ示し得る。ポリペプチドアナログを作製するための方
法は、当該分野において公知であり、以下にさらに記載される。
一性を有し、より好ましくは、問題のネイティブペプチド配列の関連する部分に対して約
75〜85%の同一性、そして最も好ましくはそれに対して約90〜95%以上の同一性
を有する。そのアミノ酸配列は、約10〜75アミノ酸以下の置換を有するか、約5〜5
0アミノ酸以下の置換を有するか、または1、2、3もしくは5つまでの置換有するのみ
であるか、あるいは上記の範囲の間の任意の置換を有する。特に好ましい置換は、一般に
、性質を保存する(すなわち、これらの置換は、アミノ酸のファミリー内で起こり得る)
。この事について、アミノ酸は、一般的に、以下の4つのファミリーに分類される:(1
)酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸;(2)塩基性−−リジン、アルギニン、
ヒスチジン;(3)非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、
フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、;ならびに(4)非荷電極性−−グリ
シン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニ
ルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類
される。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの単発的置換、またはその逆;
アスパラギン酸とグルタミン酸との単発的置換またはその逆;トレオニンとセリンとの単
発的置換またはその逆;あるいは、アミノ酸と、構造的に関連するアミノ酸との類似の保
存的置換が、その活性に対する主要な効果を有さないことは、理論的に予想できる。従っ
て、参照分子と本質的に同じアミノ酸配列を有するが、そのタンパク質の免疫原性に実質
的に影響しない、主要でないアミノ酸置換を有するタンパク質は、GNA33ポリペプチ
ドの定義の範囲内である。当業者は、本明細書中で規定される生物学的活性を保持すると
いう理論的な見こみをもって改変され得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
以下に規定される少なくとも1つのエピトープを含む、本明細書中に記載されるGNA3
3ポリペプチドである。従って、GNA33ペプチドを含む組成物は、全長分子の一部を
含むが、問題のGNA33ペプチドの全ては含まない。GNA33ペプチドの非限定の例
としては、QTP、FQTPV(配列番号2)、FQTRVHS(配列番号3)、AFQ
TPVHS(配列番号4)、QAFQTPVHS(配列番号5)、AQAFQTPVHS
(配列番号6)、AQAFQTPVH(配列番号7)、AQAFQTPV(配列番号8)
、QAFQTPVHSF(配列番号9)、AFQTPVHSFQ(配列番号10)、FQ
TPVHSFQA(配列番号11)、QTPVHSFQAK(配列番号12)、DVSA
QAFQTP(配列番号12)、VSAQAFQTPV(配列番号13)およびSAQA
FQTPVH(配列番号14)が挙げられる。
ープを機能的に模倣する分子である。そのような分子模倣物は、ワクチン組成物として、
および以下にさらに記載されるような、診断適用または治療適用のための抗体の誘発に有
用である。分子模倣物としては、以下:低分子有機化合物、核酸および核酸誘導体;多糖
またはオリゴ糖;ペプチド、タンパク質およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣物(例
えば、非ペプチド有機部分を含有するペプチド、合成ペプチド(これらはアミノ酸結合お
よび/またはペプチド結合を保有していても、保有してなくてもよいが、ペプチドリガン
ドの構造的特徴および機能的特徴を保持している));ピロリジン;ペプトイドおよびオ
リゴペプトイド(これらはN置換グリシン(例えば、Simonら、(1992)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA89:9367により記載されるN置換グリシ
ン)を含む分子である)ならびに抗体(抗イディオタイプ抗体を含む)が挙げられるが、
これらに限定されない。分子模倣物を同定および産生するための方法が、以下により詳細
に記載される。
にハイブリッド抗体、変更された抗体、ヒト化抗体、F(ab’)2フラグメント、F(
ab)分子、Fvフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント改変体(sc
Fv)、単一ドメイン抗体、キメラ抗体および本発明の抗体分子の免疫学的結合特性を示
すそれらの機能性フラグメントを含む調製物を包含する。
抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式により限定されない。この用語は
、免疫グロブリン分子、ならびにFab分子、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグ
メント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント改変体(scFv)、ヒト化抗体およ
び本発明のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を包含する。ポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当該分野において公知であ
り、そして以下により十分に記載される。
。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に使用され得る。タ
ンパク質、多糖、またはその他の生体ポリマー上のB細胞エピトープ部位は、折りたたみ
によって同時に送達される高分子の異なる部分由来の部分で構成され得る。この種のエピ
トープは、コンフォメーショナルエピトープまたは不連続なエピトープとして参照される
。なぜなら、この部位は、そのポリマーが直鎖状配列においては不連続だが、折りたたま
れたコンフォメーションにおいて連続的であるポリマーのセグメントからなるためである
。生体ポリマーまたは他の分子の単一セグメントからなるエピトープは、連続的エピトー
プまたは直鎖状エピトープと呼ばれる。T細胞エピトープは、一般的に、直鎖状のペプチ
ドに切断される。ペプチドエピトープは、このエピトープに特異的な空間的なコンフォメ
ーションの5以上のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも5〜8の
そのようなアミノ酸からなり、より一般には、少なくとも8〜10以上のそのようなアミ
ノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野におい
て公知であり、例えば、X線結晶解析および二次元核磁気共鳴分光法を含む。
て同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in
Methods in Molecular Biology、Vol.66(Gle
nn E. Morris編、1996)Humana Press、Totowa、N
ew Jerseyを参照のこと。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上
に多数のペプチドを同時に合成し(これらのペプチドは、タンパク質分子の部分に対応す
る)そしてこれらのペプチドがなお、支持体に付着されている状態で、これらのペプチド
と抗体とを反応させることによって決定される。そのような技術は、当該分野において公
知であり、例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら(1984)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002;Geysen
ら、(1986)Molec.Immunol.23:709−715(これらのすべて
は、その全体が本明細書中に参考として援用される)に記載される。同様に、コンフォメ
ーショナルエピトープは、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴分光法により、ア
ミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、
Epitope Mapping Protocols(前出)を参照のこと。例えば、
Kyteら、J.Mol.Biol.(1982)157:105−132;ならびにH
oppおよびWoods、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)
78:3824−3828に記載されるように、20のアミノ酸の各々の疎水特性および
親水特性を利用して、タンパク質のアミノ酸配列からヒドロパシー(hydropath
y)スケールを公式化するコンピュータープログラムもまた用いられて、所定の分子の抗
原性部分を決定し得る。例えば、HoppおよびWoodの技術は、各々のアミノ酸に複
数の親水性値を割り当て、次いでペプチド鎖に沿って、反復的にこれらの値を平均する。
局所的平均親水性の最も高い点は、その分子の抗原性部分を示す。
書中に記載されるアッセイを用いて決定されるようなMenBに対するオプソニン活性を
示す場合に、MenB生物に対する「機能的活性」を示す。
された」とは、同じ型の他の生体高分子の実質的非存在下で、指示された分子が存在する
ことを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「精製された」とは、同じ型の生物
学的高分子が、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%
、なおより好ましくは少なくとも95重量%、そして最も好ましくは少なくとも98重量
%が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」ポリヌク
レオチドとは、目的のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸
分子をいう;しかし、この分子は、その組成物の塩基特性に有害な影響を与えない幾分か
の追加の塩基または部分を含み得る。
を有し、本明細書中に記載されるような組換えDNA技術により調製される、GNA33
ポリペプチドが意図される。一般的に、所望のGNA33ポリペプチドをコードする遺伝
子は、以下でさらに記載されるように、クローニングされ、次いで形質転換された生物中
で発現される。宿主生物は、発現条件下で、外来遺伝子を発現してGNA33ポリペプチ
ドを産生する。組換え的に調製される場合、本発明のポリペプチドは、通常細胞中に存在
する他の分子の非存在下で産生され得る。例えば、組換え非MenB宿主細胞により産生
される唯一のMenBタンパク質は、組換えGNA33ポリペプチドであるので、Men
Bタンパク質汚染のいかなる痕跡もないGNA33ポリペプチド組成物は、容易に得るこ
とができる。
意の長さのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、ヌクレオチ
ドの重合体形態をいう。この用語は、この分子の1次構造のみをいい、従って、二本鎖お
よび一本鎖のDNAおよびRNAを含む。それはまた、公知の型の改変、例えば、当該分
野において公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在する1つ以上のヌクレオチ
ドとアナログとの置換、例えば、非荷電の連結(例えば、メチルホスフェート、ホスホト
リエステル、ホスホアミデート、カルバメート等)および荷電された連結(例えば、ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート等)を有する内部ヌクレオチド改変、例えば、タ
ンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリLリジン等を含
む)のようなペンダント基を有する改変、インターカレーター(intercalato
r)(例えば、アクリジン、ソラレン等)での改変、キレート(例えば、金属、放射性金
属、ホウ素、酸化金属等)を含む改変、アルキル化剤(alkylator)を含む改変
、改変された連結(例えば、αアノマー核酸等)での改変、ならびに改変されていない形
態のポリヌクレオチドもまた含む。
は、ゲノム起源のポリヌクレオチド、cDNA起源のポリヌクレオチド、半合成起源ポリ
ヌクレオチド、または合成起源のポリヌクレオチドをいい、それらは、その起源または操
作によって、以下:(1)それが天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部と会
合していないか、(2)それが天然で連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド
に連結しているか、(3)天然に存在しないポリヌクレオチドである。従って、この用語
は、「合成により誘導された」核酸分子を包含する。
介して、ポリペプチドへと翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、5’末端の
翻訳開始コドンおよび3’末端の翻訳終結コドンにより決定され得る。コード配列として
は、cDNAおよび組換えヌクレオチド配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
配列をいう。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる;原核生物におい
て、そのような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写
終結配列を含む;真核生物において、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終
結配列を含む。用語「制御配列」とは、最小で、コード配列の発現に必要な全ての成分を
含み、そして追加の成分(例えば、リーダー配列および融合パートナー配列)も含み得る
ことが意図される。
に結合し、そしてコード配列をmRNAに転写するときに細胞内のコード配列の「転写を
指向し」、次いでこのmRNAは、そのコード配列によりコードされるポリヌクレオチド
へと翻訳される。
式にて機能することを可能にする関係にある近位をいう。コード配列に「作動可能に連結
される」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるよう
な方法にて連結される。制御エレメントは、そのコード配列の発現を方向づけるように機
能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳さ
れないが転写される配列は、プロモーターとコード配列との間に存在し得、そのプロモー
ターは、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
配列のクローニングされたコピーの転写および適切な宿主細胞におけるmRNAの翻訳に
必要な全てのヌクレオチド配列を含む)に作動可能に連結される少なくとも1つのコード
配列を含む分子をいう。このような発現カセットは、細菌、藍藻類、植物細胞、酵母細胞
、昆虫細胞および動物細胞のような種々の宿主において真核生物遺伝子を発現させるため
に使用され得る。本発明において、発現カセットとしては、クローニングベクター、具体
的に指定されたプラスミド、ウイルスまたはウイルス粒子が挙げられ得るが、これらに限
定されない。このカセットは、宿主細胞中での自律複製のための複製起点、選択マーカー
、種々の制限部位、高コピー数のための能力および強いプロモーターをさらに含み得る。
ルスなどのような任意の遺伝エレメントを意味する。これらは、適切な制御エレメントと
関連づけられた場合に複製し得、細胞間で遺伝子配列を移動させ得る。従って、この用語
は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
より「形質転換される」。この外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムを構成する染色
体DNAに組み込まれても(共有結合されても)よいし、されなくてもよい。原核生物細
胞および酵母において、例えば、外因性DNAは、エピソームエレメント(例えば、プラ
スミド)上で維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外因
性DNAが染色体複製を通じて娘細胞により遺伝されるように染色体へと組み込まれた細
胞である。この安定性は、真核生物細胞が、この外因性DNAを含む細胞株または娘細胞
の集団から構成されるクローンを樹立する能力により示される。
胞である。
性%をいう。2つのDNA、または2つのポリペプチドの配列が、その分子の規定の長さ
にわたり、少なくとも約50%、好ましくは、少なくとも約75%、より好ましくは、少
なくとも約80〜85%、好ましくは、少なくとも約90%、そしてもっとも好ましくは
、少なくとも約95〜98%の配列同一性を示すか、または特定の範囲の間で任意の同一
性%を示す場合、これら2つのDNA、または2つのポリペプチド配列は、互いに「実質
的に同じ」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同な、はまた、特定のDN
A配列または特定のポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
に、それぞれ、正確なヌクレオチド間の対応またはアミノ酸間の対応があることをいう。
同一性%は、2つの分子の配列を整列させ、この2つの整列された配列間の正確なマッチ
数を係数し、短い方の配列の長さで除し、結果に100をかけることによるこれら分子間
の配列情報の直接比較により決定され得る。整列は、目的の配列と同一数のアミノ酸を有
する配列を用いて行われ得る。
体は、図3(配列番号1)に由来する特定のGNA33ポリペプチドと、少なくとも70
%、80%、85%、90%、92%または95%以上同一のアミノ酸配列を有する。よ
り好ましくは、この分子は、98%または99%同一である。配列同一性%は、ギャップ
オープンペナルティー12およびギャップ伸長ペナルティー2、BLOSUMマトリクス
62による、アフィンギャップ検索を使用するSmith−Waterman相同性検索
アルゴリズムを使用して決定される。このSmith−Waterman相同性検索アル
ゴリズムは、SmithおよびWaterman,Adv.Appl.Math.2:4
82−489(1981)において教示される。
のハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化した
フラグメントのサイズ決定により決定され得る。実質的に相同なDNA配列は、例えば、
特定の系について規定されるストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーショ
ン実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当
該分野の技術範囲内である。例えば、Sambrookら(前出);DNA Cloni
ng(前出);Nucleic Acid Hybridization(前出)を参照
のこと。
果を提供するに十分な薬剤の量をいう。その結果は、本明細書中のアッセイを使用して決
定される、MenBに対する機能的活性を有する抗体の生成であり得る。さらに、その量
は、髄膜炎菌性疾患の症状、徴候または原因の軽減および/または改善を引き起こすに十
分であり得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験法を使用し
て、当業者により決定され得る。
なければ所望でない材料を意味する。すなわち、その材料は、所望でない生物学的効果を
引き起こすことも、含まれる組成物の成分のいずれによっても有害な様式にて相互作用す
ることもなく、個体に投与され得る。
、より代表的には、約7.2〜7.6の範囲のpHを意味する。
ー:ヒト、非ヒト霊長類(例えば、チンパンジー)、および他のサル(ape)およびサ
ル(monkey)種:家畜(farm animal)(例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ
、ヤギ、ブタ);ペット(domestic animal)(例えば、ウサギ、イヌ、
およびネコ);実験動物(ラット、マウスおよびモルモットなどのような齧歯類を含む)
が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢も性別も意味しない。
合特性」とは、免疫グロブリン分子と抗原(これに、その免疫グロブリンが特異的である
)との間に生じる、非共有結合的相互作用の型をいう。
または流体のサンプル(このサンプルとしては、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、
骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、腸管および尿生殖管の外分
泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検が挙げられるが、これらに限定されない)そし
てまた、インビトロの細胞培養物の構成成分のサンプル(このサンプルとしては、培養培
地中の細胞および組織(例えば、組換え細胞)および細胞成分の増殖から得られた馴化培
地が挙げられるが、これらに限定されない)をいう。
る分子をいい、これらとしては、放射活性同位体、蛍光剤(fluorescer)、化
学発光剤(chemiluminescer)、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素イン
ヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチンまたはハ
プテン)などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光分子」とは、検出可能
な範囲にて蛍光を示し得る物質またはその部分をいう。本発明において使用され得る標識
の特定の例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキ
サスレッド、ルミノール、NADPH、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
本発明は、GNA33(E.coli ムレイントランスグリコシラーゼと相同性を有
するリポタンパク質)が、血清型P1.2の株においてPorAのループ4上のエピトー
プを模倣する結果として、防御抗体を惹起するという発見に基づく。GNA33は、生細
菌では表面に露出していないが、細胞質周辺腔に位置する。重複ペプチドを使用した殺菌
性抗GNA33 mAbのエピトープマッピングにより、このmAbがGNA33由来の
ペプチドおよびPorA(結合に必要なQTP配列を共有する)由来のペプチドを認識す
ることが示される。フローサイトメトリーにより、抗GNA33 mAbは、コントロー
ル抗PorA(P1.2)mAbと同様に、P1.2血清型の大部分のMenB株の細菌
表面に結合する。抗GNA33抗体は、P1.2株でチャレンジした新生仔ラットにおい
て受動性防御を付与する。従って、GNA33は、PorAに対する防御抗体を惹起する
新規な模倣物である。PorAとは異なり、GNA33は、投与された場合、タンパク質
を再生する必要性なくして防御抗体を惹起する。本明細書中において本発明者らは、GN
A33が今日までに同定されたもっとも強力な模倣抗原のうちの1つであることを発見し
た。
1.2株(これは、米国における血清型B単離株の約8%を示す(Tondellaら、
J.Clin.Microbiol.(2000)38:3323−3328))により
引き起こされる疾患の予防のためのワクチンにおける使用についてのGNA33の有用性
を立証する。さらに、他のPorAループをGNA33またはGNA33のサブドメイン
に弛緩することにより、髄膜炎菌の多価ワクチンにおける抗原として有用な他の血清亜型
PorAエピトープの免疫学的模倣物を生成することが可能である。このようなワクチン
は、組換えPorAに基づくワクチンを超える多くの利点を有する。例えば、このような
ワクチンの調製は、界面活性剤による抽出も、再折りたたみも、脂質ビヒクル中での再構
成もする必要なく、従来のように非感染性E.coliにおいて大量に発現され得るrG
NA33として非常に簡単にされる。また、疾患を引き起こす新たに出現したNmB株由
来のPorA改変体のエピトープ含有セグメントは、必要に応じて、GNA33に置換さ
れ得る。
enB模倣物は、診断試薬として、および/またはMenB疾患を予防するための組成物
中で使用され得る。GNA33に対して調製される抗体は、MenB細菌に対する機能的
活性を示し、ここで、機能的活性は、MenB疾患に対する防御を付与する際に重要であ
る。この抗体は、アイソタイプに関して、抗原的特異性および機能的活性が十分に特徴づ
けられ得る。
、このポリペプチドを生成する細菌から直接単離され得る。あるいは、このポリペプチド
は、ペプチド分野の当業者に公知のいくつかの技術のいずれかにより、化学合成され得る
。例えば、固相ペプチド合成技術については、J.M.StewartおよびJ.D.Y
oung,Solid Phase Peptide Synthesis(Pierc
e Chemical Co.,Rockford,IL,1984)ならびにG.Ba
ranyおよびR.B.Merrifield,The Peptides:Analy
sis,Synthesis,Biology,E.GrossおよびJ.Meienh
ofer編,第2巻(Academic Press,New York,1980),
pp.3−254、ならびに従来の溶液合成については、M.Bodansky,Pri
nciples of Peptide Synthesis(Springer−Ve
rlag,Berlin 1984)ならびにE.GrossおよびJ.Meienho
fer編,The Peptides:Analysis,Synthesis,Bio
logy,第1巻を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、同時に複数のペプチドを
合成する方法により化学的に調製され得る。例えば、Houghten Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA(1985)82:5131−5135;米国特許第4
,631,211号を参照のこと。
ドをコードするポリヌクレオチドの発現により組換え生成される。例えば、上記の分子を
コードするポリヌクレオチド配列は、例えば、その遺伝子を発現する細菌に由来する、c
DNAライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするか、またはこの遺伝
子を含むことが公知のベクターからこの遺伝子を得ることにより、組換え方法を使用して
得られ得る。さらに所望の遺伝子は、この遺伝子を含む細胞から、標準的な技術(例えば
、フェノール抽出およびcDNAまたはゲノムDNAのPCR)を使用して、直接単離さ
れ得る。例えば、DNAを獲得および単離するために使用される技術の記載については、
Sambrookら(前出)を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローニングされるよ
りむしろ、合成により生成され得る。この分子は、特定の配列についての適切なコドンを
使用して設計され得る。次いで、完全な配列は、標準的な方法により調製される重複オリ
ゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ed
ge(1981)Nature 292:756;Nambairら(1984)Sci
ence 223:1299;およびJayら(1984)J.Biol.Chem.2
59:6311を参照のこと。
または当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術(例えば、適切な場合、ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)技術)を使用して完全にまたは一部合成され得る。例えば、
Sambrookら(前出)を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド
配列を得る1つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機にて生成された重複合成
オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングさせ、続いて、適切なDNAリガー
ゼと連結し、連結したヌクレオチド配列を、PCRを介して増幅させることによる。例え
ば、Jayaramanら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
88:4084−4088を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成(J
onesら(1986)Nature 54:75−82)、すでに存在するヌクレオチ
ド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発(Riechmannら(1988)Nat
ure 332:323−327およびVerhoeyenら(1988)Scienc
e 239:1534−1536)、およびギャップ形成されたオリゴヌクレオチド(g
apped oligonucleotide)のT4 DNAポリメラーゼを使用した
酵素的充填(Queenら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:10029−10033)は、改変された抗原結合能力または増強された抗原結
合能力を有する分子を提供するために、本発明にて使用され得る。
ーまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知
であり、そして適切なクローニングベクターの選択が可能である。適切なベクターとして
は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体または適切なコントロー
ルエレメントと会合した場合に複製し得るウイルスが挙げられるが、これらに限定されな
い。
レメントの制御下に置かれる。従って、このコード配列は、プロモータ、リボソーム結合
部位(細菌の発現のため)、および必要に応じて、オペレーターの制御下に置かれ得、そ
の結果、目的のDNA配列は、適切な形質転換体によってRNAに転写される。このコー
ド配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列をコードする配列(これは後に、翻訳後
プロセシングにおいて、宿主によって除去され得る)を含んでも含まなくても良い。例え
ば、米国特許第4,431,739号;同第4,425,437号;同第4,338,3
97号を参照のこと。シグナル配列が存在する場合、ネイティブな配列であり得るか、ま
たは非相同的なシグナル配列のいずれかであり得る。
を加えることが所望であり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、
調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に対してオンまたはオフにされる
遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントはまた、ベクター
中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加するた
めに本明細書中で使用され得る。例としては、SV40初期遺伝子エンハンサー(Dij
kemaら(1985)EMBO J.4:761)、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復
(LTR)に由来するエンハンサー/プロモーター(Gormanら(1982)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)およびヒトCMVに由来す
るエレメント(Boshartら(1985)Cell 41:521)(例えば、CM
VイントロンA配列に含まれるエレメント(米国特許第5,688,688))が挙げら
れる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点
、1つ以上の選択マーカー、1つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および
強力なプロモーターを含む。
に構築され、制御配列に対するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御配列の
「制御」下で転写されるように存在する(すなわち、制御配列のDNA分子に結合するR
NAポリメラーゼは、コード配列を転写する)。目的の分子をコードする配列の改変は、
この目的を達成するために所望であり得る。例えば、いくつかの場合において、適切な配
向で配列が制御配列に付着し得るように配列を改変することすなわち、リーディングフレ
ームを維持することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿
入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制
限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
ることが所望であり得る。変異体またはアナログは、GNA33ポリペプチドをコードす
る配列の一部の欠損によって、配列の挿入によって、および/または配列内での1つ以上
のヌクレオチドの置換によって、調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術
(例えば、部位特異的変異誘発など)は、当業者に周知である。例えば、Sambroo
kら、前出;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA(1985)82:448;Geisselsoderら(1987)Bio
Techniques 5:786;ZollerおよびSmith(1983)Met
hods Enzymol.100:468;Dalbabie−McFarlandら
(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:6409を参照の
こと。
を含む広範な種々の系において発現され得、これらは全て当該分野で公知である。例えば
、昆虫細胞発現系(例えば、バキュロウイルス系)は、当業者に公知であり、そして例え
ば、SummersおよびSmith,Texas Agricultural Exp
eriment Station Bulletin No.1555(1987)にお
いて記載されている。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特
に、Invitrogen,San Diego CA(「MaxBac」キット)から
キットの形態で市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で
周知であり、そして例えば、Sambrookら、前出、において記載されている。酵母
発現系はまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Yeast Genetic E
ngineering(Barrら編、1989)Butterworths,Lond
onにおいて記載されている。
物細胞株は、当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CH
O)細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒ
ト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、Madin−Darbyウシ
腎(「MDBK」)細胞、およびその他を含むがこれらに限定されない、America
n Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な不死
化細胞株を含む。同様に、E.coli、Bacillus subtilis、および
Streptococcus spp.のような細菌宿主は、本発明の発現構築物を用い
る用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Saccharomyc
es cerevisiae、Candida albicans、Candida m
altosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyce
s fragilis、Kluyveromyces lactis、Pichia g
uillerimondii、Pichia pastoris、Schizosacc
haromyces pombeおよびYarrowia lipolyticaが挙げ
られる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、A
edes aegypti、Autographa californica、Bomb
yx mori、Drosophila melanogaster、Spodopte
ra frugiperdaおよびTrichoplusia niが挙げられる。
使用して、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定な
エピソームエレメント上に維持され得る。例えば、米国特許第5,399,346号を参
照のこと。
上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することによって生成される
。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系
が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、この培地から直接精製され得る
。生成物が分泌されない場合、この生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条
件および回収方法の選択は、当該分野内である。
リペプチドは、哺乳動物の被験体(げっ歯類およびウサギのような標準実験動物を含む)
を免疫するための組成物中に提供される。この組成物は、ポリクローナル血清の生成を誘
発するための適切なアジュバントを含む。動物のグループは、この組成物を用いて、一般
的に免疫され、そして数回追加免疫される。免疫された動物由来の抗血清が、得られ得る
。殺菌性抗血清の形成を誘発し得るGNA33ポリペプチドは、モノクローナル抗体の生
成においての使用のために適切である。これらの抗体を、順に使用して、抗MenBワク
チンに対するエピトープを提供するMenB抗原のさらなる模倣物を検索し得る。
クローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。特定のモノクローナル抗体に対して
の用語「機能的等価物」は、本明細書中で使用される場合、以下に記載される標準アッセ
イによって決定されるように、以下のような分子を意味する:(a)例証されたモノクロ
ーナル抗体を相互にブロックする;(b)問題のGNA33ポリペプチドに選択的に結合
する;(c)そして、必要に応じてに、MenB細菌細胞に対して機能的活性(例えば、
補体媒介殺菌および/またはオプソニン活性)を示す。さらに、本発明の特定のモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマに関して本明細書中で使用される場合、用語「子孫」は、
世代または核型同一性に関係なく、親によって産生されるモノクローナル抗体を産生する
親ハイブリドーマ全ての誘導体、子孫(issueおよびoffspring)を含む。
lstein,Nature(1975)256:495の方法、またはその改変、Bu
ckら(1982)In Vitro 18:377によって記載される)を用いて調製
される。代表的に、マウスまたはラットは、タンパク質キャリアに結合されたGNA33
ポリペプチドを用いて免疫され、追加免疫され、そして脾臓(および必要であれば、いく
つかの大きさのリンパ節)は、除去されそして単一細胞へと分離される。所望である場合
、脾臓細胞は、(非特異性接着細胞の除去後)抗原でコーティングされたプレートまたは
ウェルに細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。抗原に対して特
異的な膜結合免疫グロブリンを発現するB細胞は、プレートに結合し、そして残りの懸濁
液で洗い流されない。得られたB細胞または全ての分離された脾臓細胞は、次いで、骨髄
腫細胞と融合するように誘導され、ハイブリドーマを形成する。ハイブリダイゼーション
での使用のための代表的なマウス骨髄腫株は、American Type Cultu
re Collection(ATCC)から入手可能なものを含む。
P3X63−Ag8.653(ATCCから入手可能)を用いてBuckら(前出)の方
法によって調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に、限界希釈によってクローン
化され、そして免疫化抗原に特異的に結合し、そして無関係な抗原に結合しない抗体の産
生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ
は、インビトロ(例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維リアクター内で)か、またはイ
ンビボ(例えば、マウス中の腹水として)のいずれかで培養される。
Aか、または標的抗原としてMenB細菌を用いる間接的な免疫蛍光アッセイのいずれか
を使用して抗MenB反応性抗体についてアッセイされ得る。ハイブリドーマによって分
泌されるモノクローナル抗体の選択性は、競合特異的結合アッセイ(例えば、阻害ELI
SAなど)を用いてアッセイされ得る。例えば、緩衝液か、または可溶性GNA33ポリ
ペプチドを含む緩衝液のいずれかに希釈される抗体分子を、結合GNA33ポリペプチド
の存在下、ELISA容器中で反応させる。洗浄の後、結合抗体は、二次抗体としての標
識化抗Ig(抗IgM、IgGおよびIgA)によって決定される。可溶性GNA33ポ
リペプチドによって阻害される抗体は、特異的とみなされ得、従って、アイソタイピング
およびMenB結合および機能的活性についてのさらなるスクリーニングを含むさらなる
研究のために選択される。
るような標準アッセイを用いて、MenBの表面に結合するそれらの能力について個々に
評価され得る。機能的活性は、補体媒介殺菌活性および/またはオプソニン活性を評価す
ることによって決定され得る。特に、抗体の補体媒介殺菌活性は、Goldら(1970
)Infect.Immun.1:479,Westerinkら(1988)Infe
ct.Immun.56:1120,Mandrellら(1995)J Infect
.Dis.172:1279,およびGranoffら(1995)Clin.Diag
n.Laboratory Immunol.2:574によって記載されような標準ア
ッセイを用いて評価され得る。これらのアッセイにおいて、N.meningitidi
sは、補体供給源ならびに試験されるべき抗体と反応される。細菌の計数は、種々のサン
プリング時間でなされる。抗体および相補体と共に60分間インキュベートした後決定さ
れた、時間0でのコロニー数と比較される場合、生存可能な細菌細胞数において最少50
%の減少によって示されるような補体媒介殺菌活性を示す抗体は、本発明の目的に対する
殺菌活性を示すと考えられ、そしてさらなる使用のために適切である。
えられる。しかし、証拠はまた、オプソニン作用に対する重要な保護的役割を支持する(
例えば、Bjerknesら(1995)Infect.Immun.63:160を参
照のこと)。従って、本明細書中で産生される抗体のオプソニン活性は、機能的活性を評
価するために、二次手段かまたは代替の手段として評価され得る。オプソニンアッセイか
らの結果を使用して、殺菌データを追加し、そして保護を与え得る抗体の選択を助ける。
オプソニン活性の評価はまた、IgG1アイソタイプを有する本発明のマウスモノクロー
ナル抗体の評価のために本明細書中で特に有用である。マウスIgG1(ヒトIgG1と
は著しく異なる)は、補体の活性化において効果がない。従って、マウスIgG1抗体は
、上記のアッセイにおいてMenBの補体媒介溶菌を活性化しない。しかし、IgG1抗
GNA33モノクローナル抗体の機能的活性は、補体の非存在下でオプソニン作用によっ
て評価され得る。
ナル抗体の機能的活性を評価するために使用され得る。このような標準アッセイとしては
、Sjursenら(1987)Acta Path.Microbiol.Immun
ol.Scand.,Sec.C 95:283,Halstensenら(1989)
Scand.J.Infect.Dis.21:267,Lehmannら(1991)
APMIS 99:769,Halstensenら(1991)NIPH Annal
s 14:157,Fredlundら(1992)APMIS 100:449,Gu
ttormsenら(1992)Infect.Immun.60:2777,Gutt
ormsenら(1993)J.Infec.Dis.167:1314,Bjerkn
esら(1995)Infect.Immun.63:160,Hayrinenら(1
995)J.Infect.Dis.171:1481,de Velascoら(19
95)J.Infect.Dis.172:262、およびVerheul,A.F.M
.(1991)「Meningococcal LPS Derived Oligos
accharide−Protein Conjugate Vaccines,Imm
unochemical and Immunological Aspects」、T
hesis,Utrecht University,The Netherlands
,pp.112−135によって記載されるものが挙げられる。
、または哺乳動物の被験体を用いてインビボで、拡大され得る。例えば、プリスタンプラ
イム化マウスは、腹水産生のために、PBS中のlog期のハイブリドーマ細胞を播種さ
れ得る。腹水は、さらなる精製の前に−70℃で保存され得る。
製物中ならびにMenB診断用調製物において、抗体が使用される場合、キメラ抗体を提
供することが所望され得る。ヒトおよび非ヒトアミノ酸配列から構成されるキメラ抗体は
、マウスモノクローナル抗体分子から形成され得、ヒトにおけるそれらの免疫原性を減少
する(Winterら(1991)Nature 349:293;Lobuglioら
(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:4220;Shaw
ら(1987)J Immunol.138:4534;およびBrownら(1987
)Cancer Res.47:3577;Riechmannら(1988)Natu
re 332:323;Verhoeyenら(1988)Science 239:1
534;およびJonesら(1986)Nature 321:522;1992年1
2月23日に公開された欧州公開番号第519,596号;および1994年9月21日
に公開された英国特許公開番号第GB 2,276,169号)。
(例えば、F(ab’)2、FvおよびsFvの分子)は、公知の技術を使用して産生さ
れ得る(Inbarら(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69
:2659;Hochmanら(1976)Biochem 15:2706;Ehrl
ichら(1980)Biochem 19:4091;Hustonら(1988)P
roc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879;ならびにHus
tonらに対する米国特許第5,091,513号および同第5,132,405号;お
よびLadnerらに対する同第4,946,778号)。
集団を拡大し得る。Saikiら(1986)Nature 324:163;Scha
rfら(1986)Science 233:1076;米国特許第4,683,195
および同第4,683,202号;Yangら(1995)J Mol Biol 25
4:392;Barbas,IIIら(1995)Methods:Comp.Meth
Enzymol 8:94;Barbas,IIIら(1991)Proc Natl
Acad Sci USA 88:7978。
して、Fab分子の免疫学的結合アフィニティーを改善し得る。例えば、Figiniら
(1994)J.Mol.Biol.239:68を参照のこと。
分のコード配列を、単離または合成し得、そして発現のために任意の適切なベクターまた
はレプリコンの中にクローニングし得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳
動物の系を含む、任意の適切な発現系を使用し得る。細菌における発現系としては、以下
に記載される系が挙げられる:Changら(1978)Nature 275:615
、Goeddelら(1979)Nature 281:544、Goeddelら(1
980)Nucleic Acids Res.8:4057、欧州特許出願第EP36
,776号、米国特許第4,551,433号、deBoerら(1983)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 80:21〜25、およびSiebenlist
ら(1980)Cell 20:269。
978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929、Itoら(
1983)J.Bacteriol.153:163、Kurtzら(1986)Mol
.Cell.Biol.6:142、Kunzeら(1985)J.Basic Mic
robiol.25:141、Gleesonら(1986)J.Gen.Microb
iol.132:3459、Roggenkampら(1986)Mol.Gen.Ge
net.202:302、Dasら(1984)J.Bacteriol.158:11
65、De Louvencourtら(1983)J.Bacteriol.154:
737、Van den Bergら(1990)Bio/Technology 8:
135、Kunzeら(1985)J.Basic Microbiol.25:141
、Creggら(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376、米国特許第4
,837,148号および同第4,929,555号、Beachら(1981)Nat
ure 300:706、Davidowら(1985)Curr.Genet.10:
380、Gaillardinら(1985)Curr.Genet.10:49、Ba
llanceら(1983)Biochem.Biophys.Res.Commun.
112:284〜289、Tilburnら(1983)Gene 26:205−22
1、Yeltonら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81
:l470〜1474、Kellyら(1985)EMBO J.4:475479;欧
州特許出願第EP244,234号、ならびに国際公開第WO91/00357号。
第4,745,051号、欧州特許出願第EP127,839および同EP155,47
6号、Vlakら(1988)J.Gen.Virol.69:765〜776、Mil
lerら(1988)Ann.Rev.Microbiol.42:177、Carbo
nellら(1988)Gene 73:409、Maedaら(1985)Natur
e 315:592〜594、Lebacq−Verheydenら(1988)Mol
.Cell.Biol.8:3129、Smithら(1985)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 82:8404、Miyajimaら(1987)Gene
58:273、ならびにMartinら(1988)DNA 7:99。多くのバキュ
ロウイルスの株および改変体、ならびに宿主由来の対応の許容な昆虫宿主細胞は、以下に
記載される:Luckowら(1988)Bio/Technology 6:47〜5
5,Millerら(1986)GENERIC ENGINEERING、Setlo
w,J.K.ら編、Vol.8,Plenum Publishing,277〜279
頁、およびMaedaら(1985)Nature 315:592〜594。
5)EMBO J.4:761、Gormanら(1982)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 79:6777、Boshartら(1985)Cell 41
:521、および米国特許第4,399,216号。哺乳動物の発現の他の特徴は、以下
に記載されるように容易にされ得る:Hamら(1979)Meth.Enz.58:4
4、Barnesら(1980)Anal.Biochem.102:255、米国特許
第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第
4,560,655号および再登録された米国特許第RE30,985、ならびに国際公
開第WO90/103430号、同WO87/00195号。
剤を提供し得る。さらに、例示のマウスモノクローナル抗体由来の抗原結合部位を含む、
「ヒト化」抗体分子を、上記に記載される技術を使用して産生し得る。
6,048,527号(本明細書中で参考としてそれらの全体が援用される)に記載され
るような方法を使用して、レセプターとして便利に使用して、多様な分子ライブラリーを
スクリーニングして、MenB由来のエピトープの分子模倣物を同定し得る。分子ライブ
ラリーにおいて模倣物を同定する方法は、一般的に、以下の手順のうちの1つ以上の使用
を含む:(1)固定化した標的レセプターを用いたアフィニティー精製;(2)連結され
たリガンドとの可溶性レセプターの結合;および(3)可溶性化合物を直接的に抗原競合
アッセイにおいて、または生物学的活性について試験する行程。分子模倣物についてスク
リーニングされる分子としては、低分子有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルライ
ブラリー、核酸、核酸誘導体、サッカライドもしくはオリゴサッカライド、ペプトイド、
可溶性ペプチド、固相上に連結されたペプチド、細菌ファージ表面タンパク質上に提示さ
れるペプチド、細菌表面のタンパク質もしくは抗体、および/または非ペプチド有機部分
を含むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
得る。例えば、Gordonら(1994)J.Med.Chem.37:1335を参
照のこと。例示としては、ピロリジン;オリゴカルバメート(Choら(1993)Sc
ience 261:1303);N置換されたグリシンポリマーのようなペプトイド(
Simonら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:93
67);およびビニル基化(vinylogous)ペプチド(Hagiharaら(1
992)J.Am.Chem.Soc.114:6568)が挙げられるが、これらに限
定されない。
して、その結果個々のライブラリーのメンバーの変遷(history)を決定し得る。
これらのアプローチとしては、以下が挙げられる:フォトリトグラフのチップ上のアドレ
ス可能な位置(オリゴカルバメート)、部分的に合成された(ペプトイド、ピロリジン、
ペプチド)ライブラリーおよびヌクレオチドの分離合成によるコードのコンビナトリアル
ライブラリー(Nielsenら(1993)J.Am.Chem.Soc.115:9
812)または他の有機部分の分離合成によるコードのコンビナトリアルライブラリー(
Ohlmeyerら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90
:10922)(「タグ(tag)」)へのモノマーの再帰的な付加により「ヒット」を
同定する脱回旋(deconvolution)ストラテジー。次いで、模倣物を選択し
た後、各々のライブラリーのメンバーと結合するコードされるタグを、解読し得る。例え
ば、核酸タグを、DNA配列決定法によって解読し得る。
するために特に有用である。ペプトイドは、N置換されたグリシンのオリゴマーであり(
Simonら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9
367)、そしてこれらを使用して、新規分子の多様なライブラリーを化学的に作製し得
る。モノマーは、t−ブチルベースの側鎖保護および9−フルオレニル−メトキシ−カル
ボニルのα−アミン(a−amine)保護を含み得る。例えば、Zuckermann
ら(1992)J.Am.Chem.Soc.114:10646らの「副モノマー方法
(submonomer method)」を使用して、固相上でモノマーのペプトイド
オリゴマーへの組み立てを実施し得る。この方法において、Rinkアミドポリスチレン
樹脂(Rinkら(1987)Tetrahedron Lett.28:3787)と
の化学合成を行い得る。ブロモ酢酸のジイソプロピロカルボジイミドとのインサイチュ活
性化によって、樹脂に結合したアミンをブロモアセチル化する。その後、この樹脂に結合
したブロモアセトアミドをアミンの付加によって置換する。このアミンは、さらなる反応
基のt−ブチルベースの保護を含み得る。この2工程のサイクルを、所望の数のモノマー
が付加するまで繰り返す。次いで、このオリゴペプチドを95%トリフルオロ酢酸/5%
水での処置によって樹脂から切り離す。この合成を、好ましくはロボットの合成機を使用
して実施する。例えば、Zuckermannら(1992)Pept.Protein
Res.40:498;およびZuckermannら(1996)Methods
in Enzymology 267:437を参照のこと。代替的には、ベンゾトリア
ゾール−1−イルオキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
(hexafluorphosphate)またはブロモトリス(ピロリジノ)ホスホニ
ウムヘキサフルオロホスフェートのどちらかによるインサイチュ活性化によって、ペプト
イドモノマーのオリゴマー化を実施し得る。この代替の方法において、その他は、a−(
9−フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ酸を使用して従来のペプチド合成と同じで
ある(例えば、Simonら、(1992)、上述を参照のこと)。
ポリペプトイドまたはMenB細菌でコーティングされたマイクロリッタープレートのウ
ェルに、コンビナトリアルペプトイドの様々なプールと一緒に本発明のモノクローナル抗
体を添加することによって、スクリーニングし得る。インキュベーションの期間および非
結合抗体の除去のための洗浄の後、結合した抗体の存在を、標準的なELISAアッセイ
によって決定する。例えば、HarlowおよびLane,Antibodies:A
Laboratory Manual(1988),Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,553を
参照のこと。結合した抗体を含まないウェルは、抗体に結合するペプトイド模倣物の存在
を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定の同定を、モノマー単位をライブラリーの部
分的に合成したメンバーに再帰的に添加することによって決定する。Zuckerman
nら(1994)J.Med.Chem.37:2678。低分子プール中の活性化合物
を同定する他の方法は、そのプールを逆相HPLCまたはアフィニティー選択/質量分析
によって分画する工程を包含する(Nedved M.L.ら(1996)Anal.C
hem.68:4228)。
の、および/またはオプソニンの)抗体を導く能力について、それらを試験する。これら
の特性を有する分子模倣物は、さらなる使用(例えば、ワクチン組成物における使用)に
ついて適切である。
33抗体をまた使用して、診断アッセイにおける使用のための抗体試薬を作製し得る。例
えば、分子模倣物と反応性のさらなる抗体、および本明細書中に記載されるGNA33抗
体を使用して、競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチ型アッセイのような
免疫診断技術を使用して、生物学的サンプル中の細菌の抗原を検出し得る。このようなア
ッセイとしては、ウエスタンブロット;凝集試験;酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介
免疫アッセイ(例えば、ELISA);ビオチン/アビジン型アッセイ;放射性免疫アッ
セイ;免疫電気泳動;免疫沈殿などが挙げられる。これらの反応は、一般的に、蛍光、化
学発光、放射性、酵素性の標識分子もしくは色素分子のような標識を検出する工程、また
は模倣物とそれに反応した抗体との間の複合体形成を検出する他の方法を包含する。
中の非結合抗体の分離を包含する。本発明の実施において使用され得る固体支持体は、ニ
トロセルロース(例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態で);ポリビニルクロ
ライド(例えば、シートまたはマイクロタイターウェルの形態で);ポリスチレンラテッ
クス(例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートの形態で);ポリビニリジンフル
オリド;ジアゾ化ペーパー;ナイロン膜;活性化ビーズ;磁気反応ビーズなどのような、
基材を含む。
のMenB抗原またはMenB分子模倣物)と反応させて、その結果、その成分は支持体
に十分に固定化される。時々、支持体への固定化を、最初により良い結合特性を有するタ
ンパク質にカップリングすることによって増強し得る。適切なカップリングタンパク質と
して、血清アルブミン(ウシ血清アルブミン(BSA))、鍵穴吸着(keyhole
limpet)ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オブアルブミン、
および当業者に周知の他のタンパク質のような高分子が挙げられるが、これに限定されな
い。その抗原または模倣物を支持体に固定化するために使用され得る他の分子としては、
ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリ
マーなどが挙げられる。これらの分子およびこれらの分子を抗原とカップリングさせるこ
れらの方法は、当業者に周知である。例えば、Brinkley,M.A.Biocon
jugate Chem.(1992)3:2−13;HashidaらJ.Appl.
Biochem.(1984)6:56−63;ならびにAnjaneyuluおよびS
taros,International J.of Peptide and Pro
tein Res.(1987)30:117−124を参照のこと。
持体から除去し、次いで支持体に結合した成分を、適切な結合条件下でリガンド部分(例
えば、MenB抗体)を含むと推定される生物学的サンプルと接触させる。洗浄して任意
の非結合のリガンドを除去した後、二次的な結合体部分を、適切な結合条件下で添加する
。ここで、二次的結合体は、結合したリガンドと選択的に結合し得る。次いで、二次的結
合体の存在を、当該分野で周知の技術を使用して検出し得る。
ウェルを、本発明に従うMenBエピトープまたはMenB模倣物でコーティングする。
次いで、抗MenB免疫グロブリン分子を含む、またはこれを含むと推定される生物学的
サンプルを、コーティングされたウェルに添加する。抗体が固定化された分子に結合し得
るのに十分な期間のインキュベーションの後、そのプレートを洗浄して、非結合部分を除
去し、そして検出可能に標識された二次的な結合分子を添加する。この二次的結合分子は
、任意の捕捉されたサンプル抗体と反応し得、そのプレートを洗浄し、そして二次的結合
分子の存在を、当該分野で周知の方法を使用して検出する。
ドの存在を、抗体リガンドに対して特異的な抗体を含む二次的結合体を使用して、容易に
検出し得る。当業者に公知の方法を使用して、検出可能な酵素標識(例えば、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはウレアーゼ)と容易に結合体化され
得る多くの抗ウシ免疫グロブリン(Ig)分子が、当該分野で公知である。次いで、適切
な酵素基質を使用して、検出可能なシグナルを生成する。他の関連の実施形態において、
当業者に公知の方法を使用して、競合型ELISA技術を実行し得る。
よびこれらの分子に対して特異的な抗体は、沈殿条件下で複合体を形成する。1つの特定
の実施形態において、これらの分子は、当該分野で公知のカップリング技術を使用して、
例えば、直接的な化学的カップリングまたは間接的なカップリングによって、固相粒子(
例えば、アガロースビーズなど)に結合され得る。次いでコーティングされた粒子を、適
切な結合条件下で、MenBに対する抗体を含むことが予想される生物学的サンプルと接
触させる。結合した抗体の間の架橋は、粒子−エピトープ−抗体または粒子−模倣物−抗
体の複合凝集体の形成を生じ、この凝集体を、洗浄および/または遠心分離を使用して、
サンプルから沈殿させ得、かつ分離させ得る。反応混合物を、任意の多くの標準的な方法
(例えば、上記に記載のそれらの免疫診断方法)を使用して分析して、複合体の存在また
は不在を決定し得る。
MenB抗体を含むことが予想される生物学的サンプルから抗体のポリクローナル集団を
、基材に固定化する。これに関して、サンプルの最初のアフィニティー精製を、固定化さ
れた抗原を使用して実施し得る。従って、生じたサンプル調製物は、アフィニティー支持
中での潜在的な非特異的結合特性を回避しつつ、抗MenB部分のみを含む。高収量で、
かつ抗原結合活性を良く保存して、免疫グロブリン(完全かまたは特定のフラグメントに
おいて)を固定化する多くの方法は、当該分野で公知である。任意の特定の方法に限定さ
れずに、固定化されたプロテインAおよびプロテインGを使用して、免疫グロブリンを固
定化し得る。
定化すると、標識された分子は適切な結合条件下で結合した抗体と接触する。非特異的に
結合された任意のMenBエピトープまたはその模倣物を、免疫アフィニティー支持体か
ら洗い落とした後、結合した抗原の存在を、当該分野で公知の方法を使用して、標識に対
してアッセイすることによって決定し得る。
体を含む、上に記載されたアッセイ試薬は、上に記載される免疫アッセイを行うために、
適切な指示書および他の必要な試薬と共に、キットで提供され得る。このキットはまた、
使用される特定の免疫アッセイに依存して、適切な標識ならびに他の包装される試薬およ
び材料(すなわち、洗浄緩衝液など)を含み得る。標準的な免疫アッセイ(例えば、上に
記載されるアッセイ)を、これらのキットを使用して行い得る。
、哺乳動物の被験体においてMenBを妨げ得る。特に、これらの分子を含むワクチン組
成物を、ワクチン接種された被験体においてMenB疾患の防止のために使用し得る。こ
のワクチンを、他の抗原または免疫調節因子(例えば、IL−2、改変体IL−2(cy
s125からser125への改変体)、GM−CSF、IL−12、g−インターフェ
ロン、IP−10、MIP1bおよびRANTESを含むがこれらに限定されない、免疫
グロブリン、サイトカイン、リンフォカインおよびケモカイン)と組み合わせて投与し得
る。
、1つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」を含む。さらに、補助物質(
例えば、保湿剤または乳化剤、pH緩衝剤など)がそのようなビヒクル中に存在し得る。
チン組成物に直接添加し得るか、またはワクチン投与の同時もしくはその直後のいずれか
で別々に投与し得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない:(1)アルミニウム塩(alum)(例えば、水酸化アルミニウム、リン
酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、など);(2)O/Wのエマルジョン処方物(ムラ
ミルペプチド(以下を参照のこと)もしくは細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激
因子を含むか、または含まない)(例えば、(a)MF59(国際出願公報第WO 90
/14837;Vaccine design:the subunit and ad
juvant approach、PowellおよびNewman編、Plenum
Press 1995、第10節)、これは、Model 110Yマイクロフリューダ
イザ(Microfluidics,Newton,MA)のようなマイクロフリューダ
イザを使用してサブミクロンの粒子中に処方され、5% スクアレン、0.5% TWE
EN 80TM、および0.5% SPAN85TM(必要ではないが、随意に種々の量
のMTP−PE(以下を参照のこと)を含む)を含む;(b)SAF、(これは、サブミ
クロンのエマルジョン中にフリューダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマ
ルジョンを生成するようボルテックスされるかのいずれかで、10% スクアレン、0.
4% TWEEN 80TM、5% プルロニックブロック(pluronic−blo
cked)ポリマー L121、およびthr−MDPを含む)、ならびに(c)RIB
ITMアジュバントシステム(RAS)、(Ribi Immunochem,Hami
lton,MT)、これは、2% スクアレン、0.2% TWEEN 80TM、なら
びにモノリン脂質A(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)および1つ以上の
細胞壁骨格(CWS)からなる群からの細菌細胞壁成分(好ましくは、MPL+CWS(
DETOXTM))を含む;(3)サポニンアジュバント(例えば、Q21またはSTI
MULONTM(Cambridge Bioscience,Worcester,M
A)を使用し得るか、またはこれらから生成される粒子(例えば、ISCOM(免疫刺激
複合体))、ここで、ISCOMはさらなる界面活性剤を欠き得る(例えば、国際出願公
開番号WO 00/07621を参照のこと);(4)完全フロイントアジュバント(C
FA)および不完全フロイントアジュバント(IFA);(5)サイトカイン(例えば、
インターロイキン(IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、I
L−12(国際公開番号第WO 99/44636号)など)、インターフェロン(例え
ば、γインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死
因子(TNF)、など;(6)細菌のADP−リボシル化を行う毒素の無害化変異体(例
えば、コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)またはE.coli熱不安定毒素(LT
)、具体的にはLT−K63(ここで、63位の野生型アミノ酸がリジンで置換される)
、LT−R72(ここで、72位の野生型アミノ酸がアルギニンで置換される)、CT−
S109(ここで、109位の野生型アミノ酸がセリンで置換される)、およびPT−K
9/G129(ここで、9位の野生型アミノ酸がリジンで置換され、そして129位の野
生型アミノ酸がグリシンで置換される))(例えば、国際特許公開番号第WO93/13
202号および同第WO92/19265号を参照のこと);(7)MPLまたは3−O
−脱アセチル化MPL(3dMPL)(例えば、GB 2220221を参照のこと)、
EP−A−0689454、肺炎球菌のサッカライドで使用される場合、必要に応じて、
alumの実質的非存在下である、(例えば、国際特許公開第WO 00/56358号
を参照のこと);(8)3dMPLと、例えばQS21および/またはO/Wエマルジョ
ンの組み合わせ(例えば、EP−A−0835318、EP−A−0735898、EP
−A−0761231を参照こと);(9)CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチド(
例えば、Romanら(1997)Nat.Med.3:849−854;Weiner
ら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:10833−1
0837;Davisら(1998)J.Immunol.160:870−876;C
huら(1997)J.Exp.Med.186:1623−1631;Lipford
ら(1997)Eur.J.Immunol.27:2340−2344;Moldov
eanuら(1988)Vaccine 16:1216−1224;Kriegら(1
995)Nature 374:546−549;Klinmanら(1996)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 93:2879−2883;Ballasら
(1996)J.Immunol.157:1840−1845;Cowderyら(1
996)J.Immunol.156:4570−4575;Halpernら(199
6)Cell Immunol.167:72−78;Yamamotoら(1988)
Jpn.J.Cancer Res.79:866−873;Staceyら(1996
)J.Immunol.157:2116−2122;Messinaら(1991)J
.Immunol.147:1759−1764;Yiら(1996)J.Immuno
l.157:4918−4925;Yiら(1996)J.Immunol.157:5
394−5402;Yiら(1998)J.Immunol.160:4755−476
1;Yiら(1998)J.Immunol.160:5898−5906;国際公開第
WO 96/02555号,同第WO 98/16247号,同第WO 98/1881
0号、同第WO 98/40100同,同第WO 98/55495号,同第WO 98
/37919号および同第WO 98/52581号)、(例えば、これらを少なくとも
CGジヌクレオチド上に含み、シトシンは必要に応じて5−メチルシトシンで置換される
);(10)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル(例えば、
国際公開第WO 99/52549号を参照のこと);(11)オクトキシノールと組み
合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(例えば、国際公開第WO
01/21207号)、または少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性剤(例えば
、オクトキシノール)と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤
もしくはエステル界面活性剤(例えば、国際公開第WO 01/21152号);(12
)CpGオリゴヌクレオチドのような、サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド(
例えば、国際公開第WO 00/62800号);(13)免疫刺激剤および金属塩の粒
子(例えば、国際公開第WO 00/23105号を参照のこと);ならびに(14)組
成物の有効性を増強させるための免疫刺激因子として作用する他の物質。
タミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグル
タミン(isogluatme)(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラ
ニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn
−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PR)などが
挙げられるが、これらに限定されない。
であり得る。このようなキャリア分子は、それ自体は有害な抗体の産生を誘導しない。適
切なキャリアは、代表的に大きく、代謝の遅い巨大分子(例えば、タンパク質、多糖類、
ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体(
例えば、油滴またはリポソーム)、不活性化ウイルス粒子、CRM197(無毒な変異ジ
フテリア毒素)など)である。このようなキャリアは、当業者に周知である。
かとして調製される;注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もま
た調製され得る。これらの調製はまた、上に記載するように、アジュバントの効果を増強
するために、エマルジョン化もしくはリポソーム中でカプセル封入され得るか、または粒
子に吸収され得る。
する抗体)、および必要に応じて他の任意の上述の成分およびインヒビターを含む。「有
効量」によって、ワクチンが投与される個体において免疫学的な応答を誘導する分子の量
を意味する。このような応答は、一般的に、ワクチンに対して、分泌性免疫応答、細胞性
免疫応答および/または抗体媒介性免疫応答の被験体における発達を生じる。通常は、こ
のような応答としては、以下の効果のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定され
ない:任意の免疫学的クラスの抗体の産生(例えば、免疫グロブリンA,免疫グロブリン
D、免疫グロブリンE、免疫グロブリンGまたは免疫グロブリンM);Bリンパ球および
Tリンパ球の増殖;免疫学的細胞の活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルの
提供;ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞および/もしくは細胞傷害性T細胞、ならび
に/またはgdT細胞集団の増殖。
口で通常通りに投与される。他の投与形態に適切なさらなる処方物としては、経口処方物
または肺の処方物、坐薬、ならびに経皮的適用が挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケ
ジュールか、または複数回投薬スケジュールであり得る。
本発明を実施する為の具体的な実施形態の例を以下である。これらの例は、例示目的の
みのために、提供され、そして、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。
ているが、実験誤差および偏差は、当然のこととして、許容されるべきである。
(細菌株)
本研究に含まれるN.meningitidis血清型B株を、異なる国に滞在する、
髄膜炎菌性疾患を有する患者から単離し、36年の期間にわたって収集した。21株が、
血清型B株であり、1株が血清型C株であった。これらの株を、表1に要約する。電気泳
動分類(ET)に基づいて、これらの収集物は、疾患を引き起こすMenB株についての
広範な遺伝的多様性を表す。
、BZ232ΔGNA33およびNMBΔGNA33)(これらの株において、gna3
3遺伝子が欠失され、そして、抗生物質カセットを用いた対立遺伝子交換によって置きか
えられている)を、プラスミドpBSUD33ERMで親株を形質転換することによって
調製した。このプラスミドは、対立遺伝子交換のための上流および下流の隣接遺伝子領域
およびermC遺伝子(エリスロマイシン耐性)を含む。簡潔には、−867から+75
の上流隣接領域(開始コドンを含む)、および+1268から+1744の下流隣接領域
(終止コドンを含む)を、以下のプライマーを使用して、MC58から増幅した:
,Italy)にクローニングし、標準的技術(Sambrook and Russe
ll,Molecular Cloning.A Laboratoty Manual
(2001))を使用してE.coli DH5に形質転換した。一旦、全てのサブクロ
ーニングが完遂されると、天然のコンピテントNeisseria MC58株、Nei
sseria BZ232株およびNeisseria NMB株を、チョコレート寒天
プレート(chocolate agar)(Remel,Laztakas,KA)上
で一晩増殖したいくつかのコロニーを選択し、これらを、1μgのプラスミドDNAを含
有する20μlの10mM Tris−HCl(pH6.5)と混合することによって形
質転換した。この混合物をチョコレート寒天プレート上にスポティングし、5%CO2、
37℃で、6時間インキュベートし、次いで、PBS中に希釈し、そして、7μg/ml
のエリスロマイシンを含有するチョコレート寒天プレートに塗った。これらの3つの株の
各々についてエリスロマイシン耐性コロニーのゲノム中のgna33遺伝子の非存在を、
以下のプライマーを使用するPCRによって確認した:
。これらのプライマーは、それぞれ、gna33遺伝子の5’センス鎖およびgna33
遺伝子の3’アンチセンス鎖に対応した。GNA33発現の欠失は、以下で説明されるよ
うなウェスタンブロット分析によって確認された。
フローサイトメトリー、殺菌剤、およびインビボ保護実験(in vivo prot
ection experiment)に使用される抗体としては、以下が挙げられた:
Rijksinstituut Voor Volksgezondheid en M
ileu,Bilthoven,The Netherlands、またはWendel
l Zollinger,Walter Reed Army Institute o
f Research,Washington DCから得られる髄膜炎菌Por A
P 1.2特異的サブタイプmAb(MN 16C 13F4、サブクラスIgG2a)
;カプセル化した、血清型B,SEAM 12およびSEAM 3(Granoffら、
J.Immunol.(1998)160:5028−5036),サブクラスIgG2
a)ならびに、血清型C(mAb 181.1(Garcia−Ojedaら、Infe
ct.Immun.(2000)68:239−246,サブクラスIgG3)に特異的
である抗ポリサッカリドmAb。MAb 181.1は、Kathryn Stein,
U.S.Food and Drug Administrationによって提供され
た。このネガティブコントロールは、関連のない特異性のマウスIgG mAb(VIG
10)、またはrGNA33を発現するのに使用された株由来のE.coliタンパク質
に対して調製されたマウスポリクローナル抗血清からなった。
gna33 ORFを、プライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドを用いて
、2996株(P.van der Ley and J.T.Poolman,Inf
ect.Immun.(1992)60:3156,1992)由来の染色体DNAにお
けるPCRによって増幅された。増幅されたDNAフラグメントを、Hisタグ化(HT
−GNA33)されたタンパク質またはシグナル配列または脂質改変配列のない可溶性タ
ンパク質(rGNA33)として、タンパク質を発現するためにpET−21b+ベクタ
ー(Novagen,Madison,WI)にクローニングした。組換えタンパク質の
発現を、上述のように実施されたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価
した。このHisタグ化タンパク質は、Ni2+結合体化キレートファーストフローSe
pharose(Amersham−Pharmacia Biotech,Uppsa
la,Sweden)のアフィニティクロマトグラグフィによって精製し、そして非タグ
化形態を、モノSイオン交換樹脂(Amersham−Pharmacia)を使用する
FPLCによって精製した。
GNA33に対する抗血清を調製するために、20μgの精製した、HT−GNA33
または非タグ化rGNA33を、6週齢のCD1雌性マウス(1グループ当たり4〜10
のマウス)を免疫するために使用された。これらのマウスを、Charles Rive
r(Italia S.P.A.,Calco,Italy,またはHollister
,California)から入手した。組換えタンパク質は、初回投薬について完全フ
ロイントアジュバント(CFA)と共にi.p.で投与し、第2回追加免疫投薬(第21
日目)および第3回投薬(第35日目)について不完全フロイントアジュバント(IFA
)と共にi.p.で投与した。血液サンプルを第34日目および第49日目に採取した。
4〜6週齢の雌性CD1マウスを、第3回目の投薬はアジュバントなしで投与した以外
、上述のように免疫した。3日後に、マウスを屠殺し、そして、それらの肝細胞を、1黒
色腫細胞に対して5脾臓細胞の比で黒色腫細胞P3X63−Ag8.653と融合した。
HAT選択培地中での2週間のインキュベーション後に、ハイブリドーマ上清は、ELI
SAによって抗体結合活性についてスクリーニングした。このELISAを、このN.m
eningitidis M7株は、0.025%パラホルムアルデヒドで処理すること
によって不活性化されているナノカプセル化したN.meningitidis M7株
(Stephensら、Infect.Immun.(1991)59:4097−41
02)でコートされたマイクロタイタープレート上で実施した。GNA33特異的抗体を
分泌するハイブリドーマを、限界希釈によって2回クローン化し、次いで、増殖し、組織
培養における次なる使用またはBALB/cマウスにおける腹水産生の為に凍結した。
ングキット(Amersham−Pharmacia.)を使用して決定した。選択され
たmAbの中に、1つのIgG2a抗GNA33mAb(mAb 25と命名した)を、
以下に説明した、結合研究または機能研究の全てにおいて使用された。このモノクローナ
ル抗体を、Hi−Trap親和性カラム(Amersham−Pharmacia)によ
ってマウス腹水から精製し、PBS緩衝液での徹底的な透析の後に、精製したmAbの濃
度は、基準としてBSAを使用する改変Lowry法(DC,Bio−Rad,Rome
,Italy)を使用して決定した。mAb 25結合の特異性を、MC58株、BZ2
32株およびNMB株ならびにそれぞれのGNA33ノックアウト体(MC58ΔGNA
33,BZ232ΔGNA33およびNMBΔGNA33;以下を参照のこと)から調製
された膜タンパク質を使用するウェスタンブロットによって決定された。
ポリクローナル抗GNA33抗血清およびmAb 25の、生NmB株の表面に結合す
る能力は、以前に記載されたように実行される(Moeら,Infect.Immun.
(1999)67:5664−5675)、間接蛍光アッセイのフローサイトメトリー検
出を使用して決定された。図1Aは、代表的な4つのNmB株、親株2996(P1.5
,2)および他の3つの株である、M3735(P1.5,2)、M4207(P1.5
)およびMC58(P1.7,16)に対するポリクローナル抗rGNA33抗血清の結
合を示す。抗GNA33ポリクローナル抗血清は、2996株およびM3735株とのみ
反応した。この抗カプセルポジティブコントロールmAbは、4つ全ての株に結合した一
方、E.coliのタンパク質で免疫された動物から調製されたネガティブコントロール
抗血清は、バックグラウンド結合のみを示した。図lBは、3つの株(M3735[P1
.5,2],M4207[P1.5]およびMC58[P1.7,16])の細菌細胞表
面への抗GNA33 mAb 25の結合を測定する類似の実験の結果を示す。このmA
bは、M3735(P1.5,2)株にのみ結合した。
つの血清型C)由来の生きている細菌の表面に結合する、抗GNA33抗血清またはmA
b 25の能力を測定するフローサイトメトリの結果をまとめている。この抗GNA33
抗体は、P1.5,2血清亜型またはP1.2血清亜型を有する株にのみ結合した(9の
うち9に対して、他のPorA血清亜型を有する13株のうち0である;P<0.001
)。9つのポジティブ株のうちの1つである、M986は、他の8つの株よりも弱い結合
を示した(以下を参照のこと)。PorAのループ1上に存在するP 1.5エピトープ
を発現するが、P1.2エピトープ(ループ4)を発現しない3つの株(M4207、1
000およびBZ83)に対して結合はなかった。PorA(すなわち、P1−)を発現
しないM136株に対する結合も存在なかった。これらのデータは、細菌表面に対する抗
GNA33抗体の結合はPorA血清亜型P1.2の発現と相関することを示している。
殺菌活性を、以前に説明されたように測定された(Moeら,Infect.Immu
n.(2001)69:3762−3771)。述べない限り、この補体供給源は、EL
ISAで試験した場合に、血清型Bまたは血清型Cのポリサッカリドに対して検出可能な
抗カプセル抗体も、20%または40%の最終血清濃度で、標的株に対する検出可能な内
因性の殺菌活性を有さない健康な成人(MAS)に由来するヒト血清であった。以下のよ
うないくつかの実施形態において、未処置の無ガンマグロブリン血症の患者に由来する血
清(Steeleら,Infect.Immun.(1984)44:452−458)
、仔ウサギ血清、または成体ラット血清を補体供給源として使用して、殺菌活性は測定し
た。
抗GNA33抗体が、N.meningitidis血清型B菌血症に対する受動的防
御を付与する能力を、腹腔内チャレンジした乳児ラットにおいて試験した。このアッセイ
を、以前に記載されるように実行した(Moeら、Infect.Immun.(199
9)67:5664−5675)。簡潔には、チャレンジの開始時にコロニーを取り、ブ
ロス培養物中に接種し、そして増殖させ、殺菌アッセイについて上記したように調製した
。感受性を最大化するために株M986を用いて、その動物に、0時点で、約5×103
のチャレンジMenB試験株と混合した試験抗血清およびコントロール抗血清の異なる希
釈物100μlを、腹腔内注射した。他の試験株を用いた実験において、この抗体を、0
時点で腹腔内投与し、そして細菌チャレンジを2時間後に腹腔内で行った。使用したポジ
ティブコントロール抗莢膜mAbは、SEAM3であった。細菌チャレンジの18時間後
に、針と約10μlのヘパリン(1000単位/ml;Fujisawa USA、De
erfield、IL)(保存料なし)を含むシリンジとを用いて、心臓穿刺によって血
液試料を獲得した。1μL、10μLおよび100μLの血液アリコートを、チョコレー
ト寒天上に配置した。血液1ml当たりのCFUを、このプレートを37℃で5%CO2
中にて一晩インキュベートした後に決定した。相乗平均CFR/mlの計算のために、滅
菌培養物を受けた動物に、1CFR/mlという値を割り当てた。
髄膜炎菌株の総細胞抽出物を、以下のように調製した。シングルコロニーを、0.25
%グルコースを補充したMueller−Hintonブロス(Difco、Detro
it、MI)7ml中で、0.5〜0.7のA620nmまで増殖させた。その細菌を、
5000×gで15分間遠心分離することによって収集し、そしてPBS中に再懸濁した
。凍結−解凍後、細菌懸濁物をサンプル緩衝液(0.06M Tris−HCl(pH6
.8)、10%(V/V)グリセロール、2%(W/V)SDS、5%(V/V)2−メル
カプトエタノール)と混合し、そして10分間煮沸した。髄膜炎菌株由来の精製タンパク
質(0.5μg/レーン)または総細胞抽出物(25μg)を、12.5%のSDS−ポ
リアクリルアミドゲル上(Laemmli、U.K、Nature(1970)227:
680−685)にロードし、そしてニトロセルロース膜上に移した(Towbinら、
Proc.Natl.Acad.Sci.(1979)76:4350−4354)。ト
ランスファー緩衝液(0.3% Tris塩基、1.44%グリシン、20%(v/v)
メタノール)を使用して、4℃にて150mAで2時間トランスファーを実行した。この
ニトロセルロース膜を、飽和緩衝液(PBS中10%スキムミルク、0.1% Trit
on X100)中で4℃で一晩インキュベートすることによって飽和した。この膜を洗
浄緩衝液(PBS中の3%スキムミルク、0.1%Triton X100)で2回洗浄
し、洗浄緩衝液で200倍希釈されたマウス抗血清、最終濃度が6μg/mlのmAb
25、または抗PorA P1.2mAbの100倍希釈希物と共にその後、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼで標識された抗マウスIg(Dako、Glostrup、D
enmark)の2000倍希釈物と共に37℃で2時間インキュベートした。膜を、P
BS中の0.1%Triton X100で2回洗浄し、Opti−4CN Subst
rate Kit(Bio−Rad)を用いて発色させた。水を加えることによって反応
を停止させた。
ペプチドスポット合成を、モデルASP 222自動スポット合成機(ABIMED)
およびジイソプロピルカーボジイミド(DIC)/N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(
HOBt)活性化(FrankおよびOverwin、Methods Mol.Bio
l.(1996)66:149−169)を用いて、アミノ−PEGセルロース膜(AB
IMED、Langerfeld,Germany)上で行なった。インサイチュ調製さ
れた、フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)−アミノ酸誘導体のHOBtエステ
ル(0.2M)をカップリング反応にした。スポット上の遊離アミノ官能基を、ジメチル
ホルムアミド中のブロモフェノールブルーの溶液で処理した。これにより、青色染色を生
じる、この染色により、全ての合成工程を可視的に観察することができた。最終サイクル
の後、全てのペプチドを2%無水酢酸でN末端をアセチル化した。合成の最後に、トリフ
ルオロ酢酸/トリイソブチルシラン/水/ジクロロメタン(50/3/2/45)の混合
物を用いて、側鎖保護基を取り除いた。
セルロース結合ペプチドを、ペプチド間の疎水性相互作用を防ぐためにエタノールに浸
した。非特異性結合を、0.05%のTween 20を含むTris緩衝化生理食塩水
(TBS:50mM Tris−HCl、137mM NaCl、27mM KCl、p
H7.0)(T−TBS)中の2%カゼイン(10ml)と共に、4℃で一晩セルロース
シートをインキュベートすることによって、ブロックした。このシートを、T−TBSブ
ロッキング緩衝液で100倍希釈した、抗GNA33mAb25(6μg/ml)または
抗PorA 1.2mAbと共に37℃で2時間インキュベートした。次にアルカリホス
フォターゼ結合体化ヤギ抗マウスIgG(BioRad)を、37℃で1時間、T−TB
Sブロッキング緩衝液中3000倍希釈で加えた。シートをT−TBSで3回洗浄し、基
質緩衝液(100mM Tris、pH8.9、100mM NaCl、2mM MgC
l2)中のブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェート(BCIP)(Sigm
a、Steinheim、Germany)および3−(4,5−ジメチルチアゾール−
2−イル)−2,5ジフェニル−テトラゾリウムブロミド(MTT;Sigma)と共に
そのシートをインキュベートすることにより、結合の検出を達成した。シグナルの定量評
価を、Umax Speedy II 2200オプティカルスキャナを用いて行なった
。
(間接蛍光フローサイトメトリーにより測定される、細菌細胞表面への抗GNA33抗
体の結合)
CD1マウスをrGNA33(2996株由来の遺伝子によってコードされる)を用い
て免疫化した。得られたポリクローナル抗体含有抗血清を、間接免疫蛍光結合アッセイの
フローサイトメトリー検出により測定される、様々なMenB株の生細菌細胞への結合能
力について試験した。図1Aは、4つの代表的なMenB株、親2996株(P1.5,
2)および3つの他の株(M3735株(P1.5,2)、M4207株(P1.5)お
よびMC58株(P1.7,16))へのポリクローナル抗rGNA33抗血清の結合を
示す。抗GNA33ポリクロナール抗血清は、2996株およびM3735株のみと反応
した。抗莢膜ポジティブコントロールmAbは4つの株全てと結合したが、E.coli
タンパク質で免疫化された動物から調製されたネガティブコントロール抗血清は、バック
グラウンド結合のみを示した。図1Bは、3つの株(M3735株(P1.5,2)、M
4207株(P1.5)およびMC58株(P1.7,16)の細菌細胞表面への抗GN
A33mAb25の結合を測定する、同様の実験の結果を示す。mAbはM3735株(
P1.5,2)のみと結合した。
清型C)からの生細菌の表面に結合する、抗GNA33抗体またはmAb25の能力を測
定するフローサイトメトリー実験の結果を要約したものである。抗GNA33抗体は、P
1.5,2血清亜型またはP1.2血清亜型を有する株にのみと結合した(9株中9株;
これに対して、他のPor A血清亜型を有する13株中0株;P<0.001)。9個
のポジティブ株の1つであるM986株は、他の8個の株より低い結合を示した(下記参
照)。P1.5エピトープ(PorAのループ1上に存在、Sacchiら、Infec
t.Dis.(2000)182:1169−1176)を発現するが、P1.2エピト
ープ(ループ4)を発現しない、3つの株(M4207株、1000株およびBZ83株
)への結合はなかった。PorAを発現しない(すなわち、P1−)M136株への結合
もまたなかった。これらのデータは、細菌表面への抗GNA−GNA33抗体の結合がP
orA血清亜型P1.2の発現と関連することを示している。
(異なるN.meningitidis B群株から調製された総膜画分のウェスタン
ブロット)
細菌表面への抗GNA33抗体の結合とP1.2血清亜型の明らか関係は、予想外であ
った。この関係を代表的な株から調製した総タンパク質のウェスタンブロットによりさら
に研究し、そしてSDS−PAGEにより解決した。4つの血清亜型B株(フローサイト
メトリーで抗GNA33表面結合についてネガティブであった2つの株(NG3/88株
(P1.7,1)およびMC58株(P1.17,16)、およびポジティブであった2
つの株(BZ232株およびNMB株(共にP1.5,2))からの結果を図2に示す。
データはまた、GNA33をコードする遺伝子が不活性化された3つの株(MC58株、
BZ232株およびNMB株)からの総膜調製物について示す。
2株(NG3/88株(レーン3)およびMC58株(レーン4))からの膜調製物中の
抗GNA33mAb25によって検出した。バンドは、rGNA33(レーン1)に予想
される見かけの分子量を有し、コントロールE.coli株(レーン2)から、およびM
C58株(レーン5)中のGNA33ノックアウトから調製された総タンパク質中に存在
しなかった。レーン6およびレーン8は、それぞれBZ232株およびNMB株から調製
される総タンパク質を含む。これらの株は共に、PorA血清亜型P1.5,2を有する
。それぞれのレーンにおいて、2つの抗GNA33反応性バンドが存在する。より高分子
量である48kDaバンドはBZ232株およびNMB株(それぞれレーン7とレーン9
)から誘導されるGNA33ノックアウトに存在せず、この結果はこのタンパク質がGN
A33であることを確証する。より低分子量である抗GNA33反応性バンドは、P1.
2と反応性であるmAbとの反応性に基づきPorAであるようである(図2Bを参照の
こと)。
が、一次検出抗体として抗PorA P1.2mAbを使用する。予想されるように、r
GNA33(レーン1)と、ネガティブコントロールE.coliタンパク質(レーン2
)とまたはPorA P1.2(レーン3,4および5)を発現しない株から調製される
総膜と、抗PorA mAbとの反応性はなかった。しかしながら、PorAに期待され
る見かけの質量を有するタンパク質が、BZ232株(レーン6)、BZ232ΔGNA
33(レーン7)、NMB(レーン8)およびNMBΔGNA33(レーン9)からの膜
調製物中に検出された。それらはPorA P1.2を発現する。このタンパク質はまた
、それらのそれぞれのGNA33ノックアウトからの調製物(それぞれレーン7およびレ
ーン9)中に存在する。これらの結果は、図2Aの抗GNA33 mAbと反応する41
kDaの見かけの質量を有するタンパク質がPorAであったことを確証する。対照的に
、抗PorA P1.2mAbは、ウェスタンブロットでGNA33と反応しなかった。
(抗GNA33 mAb25によって認識される表面露出したPorAエピトープのペ
プチドマッピング)
抗P1.2 mAbは、ループ4上に存在するPorA上のエピトープを認識すること
が知られている。表2は、本研究に含まれる選択されたMenB株についてのループ4可
変領域(VR2)アミノ酸配列の比較を示す(最近改訂されたPorA VR命名の慣例
会議についてSacchiら、Infect.Dis.(2000)182:1169−
1176、またはhttp://mlst.zoo.ox.ac.uk/Meningo
coccusを参照のこと)。表2中に、抗GNA33mAbによる表面結合についてネ
ガティブであった、2つの密接に関連するVR2型(それぞれ、BZ83株(P1.10
)からのP1.10およびM4207株(P1.10−1)からのP1.10−1)の配
列を含む。2つのネガティブ株のループ4配列は、6個のアミノ酸ペプチドで抗GNA3
3ポジティブ株と異なる。ポジティブP1.2株は、ヘキサペプチドQTPKSQ(配列
番号16)またはQTPQSQ(配列番号17)を含むが、ネガティブP1.10株また
はP1.10−1株は、ヘキサペプチドNKQNQR(配列番号18)またはNKQNQ
P(配列番号19)をそれぞれ含む(表2)。
めに、GNA33のアミノ酸配列全体(表3)およびPorA(2996株からのP1.
2−2)のループ4のアミノ酸配列全体に広がるオーバーラップ直鎖デカペプチド、Ge
nBank登録番号X57180)を合成した(注釈:X57180中に与えられる配列
は、配列QTPE(配列番号20)を有するVR2をコードする)。しかしながら、この
配列はその後間違いであることが見出されている(C.T.Sacchi、CDC、At
lanta、GA,私信)。正しい配列はQTPQ(配列番号21)である。mAb25
で8色素単位以上ポジティブであったペプチドが表3に詳述される。8個のポジティブG
NA33ペプチドは全て、トリペプチドQTPを共有する。QTP配列はまた、mAb2
5と反応した5つの全てのポジティブPorA P1.2ペプチドの中に存在する。しか
しながら、QTPを含むがその前のFVQ配列を含まない3つのループ4ペプチドへのm
Ab結合が存在しなかったので、QTP配列は、抗GNA33結合に十分でない。
規定するために、AQAFQTPVHS(図4A;配列番号6)から始めて、次第に小さ
くなるペプチド、およびTPAHFVQQTP(図4B;配列番号22)で始めてPor
A P1.2ペプチドを合成した。mAbは、FQTPV(配列番号2)を含むGNA3
3ペプチド、およびFVQQTP(配列番号23)を含むPorA P1.2ペプチドと
強く結合したが、より小さいどのペプチドとも結合しなかった。それぞれのタンパク質に
ついて同じ最小エピトープを、PorAのループ4の適切なペプチドおよびGNA33内
に含まれる、アミノ酸の体系的なアラニン置換またはグリシン置換により、同定した。P
orAループ4VR型P1.2−2についてのアラニン置換のデータの概要について、表
4を参照のこと。
AのP1.2エピトープとの交差反応性の結果として、P1.2エピトープを発現するN
m株に対して殺菌作用を有することを示唆している。
(抗GNA33抗体および抗PorA P1.2抗体のP1.2 NmB株への比較結
合)
抗rGNA33抗体がPorA P1.2エピトープと交差反応するという予想外の発
見は、PorA血清亜型P1.2.によって惹起された抗体の活性とrGNA33によっ
て産出された抗体の活性を比較する機会を与えた。1つの例外を除いて、試験した9個の
P1.2株について、抗GNA33mAbの濃度依存結合は、コントロール抗PorA
P1.2mAbの濃度依存結合と類似していた(図5Aの8047株およびBZ232株
についての代表的なデータを参照のこと)。例外のM986株は、他のP1.2株への結
合と比較した場合に、相対的に弱い抗GNA33抗体結合を示した(表5B)。対照的に
、抗PorA P1.2mAbによる結合は、M986を含む全てのP1.2株について
同様であった。
2912)、それは、FVQQTPKセグメント(配列番号24)を含むループ4配列に
よって定義され、8047株およびBZ232(VR2型P1.2−2;表1)について
のFVQQTPQ(配列番号25)と対照的である。このVR2型は、特定のP1.2エ
ピトープのアミノ酸配列に基づく。VR2配列型P1.2(M3735株およびM568
2株)を有することが報告されている他の2つの株は、それぞれの株中に、コントロール
抗PorA P1.2mAbのそれぞれの結合と匹敵した、強い抗GNA33抗体結合を
示した(例えば、M3735株(図1A)およびM5682(図5B)を用いた結合のデ
ータ)。M986株、M3735株およびM5682株中のPorAループ4のVR2配
列型は、2回目のヌクレオチド配列決定によってP1.2であることが確証された。従っ
て、配列の差異(Qに対するK)は、M986株との減少した抗GNA33結合活性を説
明するために十分であることが明らかではない。
(殺菌活性)
PorA P1.2(rGNA33)に対するマウスmAb(mAb25)ならびに血清B型に対するマウスmAb(SEAM12)および血清C型に対するマウスmAb(mAB181.1)多糖莢膜に対するマウスmAbの補体依存殺菌活性を比較した。NmC株M5954を試験するために使用した血清C型抗莢膜mAb(サブクラスIgG3)を除いて、他のmAbの全サブクラスはIgG2aであった。ヒト補体の存在下において抗PorA P1.2mAbのBC50は、全ての9株について0.5μg/ml未満であった。血清B型抗莢膜mAbの対応するBC50値は高く(5〜12μg/mlの範囲)、そして血清C型mAb(株M5954)については1μg/ml未満であった。表5にまとめたように、抗GNA33mAbの殺菌活性は多様であり、そして使用した補体供給源に依存した。3つの株(8047、NMBおよびM3735)について、ヒト補体の存在下において抗GNA33mAbのBC50値は、7〜15μg/mlの範囲であった。これらの株の値は、抗莢膜抗体の値と類似した。残りの6つの株(2996、BZ232、M5545、M5682、M5954およびM986)について、ヒト補体の存在下において、抗GNA33mAbを用いて観察された殺傷は存在しなかった(内在性殺菌活性のない正常成体由来の血清を用いて試験した場合、BC50は60μg/ml未満(表5)であり、そして無γグロブリン血症を有する患者由来の血清を用いて試験した場合、30μg/ml未満であった)。胎仔ウサギ血清を補体供給源として使用した場合、6株のうち1つを除いて全てが、抗GNA33誘導溶解に対して感受性であった。感受性株のBC50値は、1μg/ml以上8μg/mlの範囲であった(表5)。一方、例外は株M986であり、ここで、ヒトおよびウサギ補体で試験した場合、抗GNA33mAbを用いて観察された殺傷は存在しなかった(BC50値は、それぞれ150μg/ml超および30μg/ml超である)。この株に対する細菌溶解の欠如は、フローサイトメトリーによって測定されるように、mAbのより低い表面結合に関連し得る(図5B)。試験した5株に対して、ヒト補体を用いたポリクローナルマウス抗rGNA33抗血清のそれぞれの殺菌力価は、抗GNA33mAb25を用いて測定した結果と一致した(表5)。
(抗GNA33抗血清による受動性防御)
MenB菌血症に対する受動性防御を与えるポリクローナルマウス抗GNA33抗体の
能力を、胎仔ラットモデルにおいて評価した。3株を使用した:8047、ヒトまたはウ
サギの補体の存在下で抗GNA33細菌溶解に感受性である株;BZ232、すなわちヒ
ト補体での抗GNA33細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性で
ある株;およびM986、すなわちヒト、ウサギまたはラットの補体の存在下で抗GNA
33細菌溶解に耐性である株。このモデルにおいて試験する受動性防御の結果を、表6に
まとめる。
釈物(100μl)を株8047の5.8×103CFUと混合し、そして菌血症に対し
て完全に保護したラットにi.p.で与え、チャレンジの18時間後に測定した。同様の
実験において、株M986(抗GNA33細菌溶解に対して耐性の株)の6.5×103
CFUと混合した抗GNA33抗血清の1:5または1:25(100μl)を与えた全
ての動物は、細菌血症を発症した。殺菌活性の欠如にかかわらず、抗GNA33抗血清で
処理し、そして株M986でチャレンジした動物血液の幾何平均CFU/mlは、E.c
oliタンパク質に対して調製したネガティブコントロール抗血清を用いて試験したコン
トロール動物よりも、10〜20培低かった(P=0.02)。同様の結果は、抗GNA
33mAb25を用いた第2の実験(実験2)において観察された。全6匹のラットを、
i.p.によりmAb25の20μgで前処理し(時点0)、2時間後に株M986の3
.5×103CFUでチャレンジし、チャレンジの18時間後に採集した血液サンプルに
は細菌が存在した。しかし、幾何平均CFU/mlは、無関係のmAbを用いて前処理し
たコントロール動物の幾何平均CFU/mlの0.3%よりも少なかった(p<0.02
)。同様の実験において、ラット1匹あたり20μgの抗P1.2mAbは、株M986
に対して完全な防御であり、そしてラット1匹あたり2μgは部分的防御であった(試験
した6匹のうち1匹のみが菌血症を発症した)。
GNA33細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性である)でチャ
レンジした。この実験において、この株に対する抗GNA33mAbの保護活性は、コン
トロールの抗莢膜抗体の防御活性と同じであるか、または高く、そして抗PorA P1
.2mAbの防御活性よりもわずかに少ないだけである。
存在下においてN.meningitidis株の細菌溶解を媒介し得る。なぜなら、抗
GNA33抗体と、ポーリン(porin)タンパク質(PorA)のP1.2エピトー
プとの交差活性に起因するからである。この結果は、予測した結果ではなかった。なぜな
ら、GNA33およびPorAは十分な配列相同性を有しておらず、構造的および機能的
に関連がなく、そして異なる細菌的亜構造に物理的に局在するからである。従って、GN
A33はPorAの免疫学的模倣物として記載され得る。
うな非免疫グロブリンタンパク質であり、PorAとは関連がない。第2に、rGAN3
3は抗体反応を誘発し、これは、(多くの点において)外部膜ビヒクル調製物におけるネ
イティブなPorAによって誘発される抗体反応と機能活性が類似する。第3に、本明細
書中に記載されるポリクローナルマウス抗rGNA33抗血清を、2つの独立した研究室
において調製し、そして殺菌データを独立して繰り返した。
は、ネイティブタンパク質に結合されたか、または補体の存在下で細菌溶解を媒介する抗
体を惹起することに失敗した(McGuinnessら、J.Exp.Med(1990
)171:1871−1872)。おそらく、より小さなペプチドフラグメントは、ネイ
ティブポーリンに示される安定なコンフォメーションをとることは出来なかった。同様に
、E.coliまたはB.subtilusにおいて発現されるrPorAを用いた免疫
は、組換えタンパク質において表面受容可能なPorAエピトープのコンフォメーション
がリポソームまたは界面活性剤を用いて再構築される場合を除いては、殺菌抗体を惹起す
ることに失敗した(Christodoulidesら、Microbiology(1
998)144:3027−3037およびIdanpaan−Heikkilaら、V
accine(1995)13:1501−1508)。これらの結果は、殺菌抗体の惹
起を担うPorAのエピトープが立体的であることを示唆する。対照的に、本明細書中に
示されるように、rGNA33模倣物を用いた免疫は、PorAループ4のP1.2エピ
トープと交差反応する殺菌抗体を惹起した。rPorAと違って、免疫源として使用され
る組換えGNA33タンパク質が、組換え分子の再生についての必要性を有さず、フロイ
ントのアジュバントと単に混合される場合に、これが生じる。
よびこれらの分子の使用は、記載されている。上記より、本発明の特定の実施形態が本明
細書中に、例示目的のために記載されているが、種々の改変が、添付の特許請求の範囲に
よって規定される精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
A実験1において、細菌を、i.p.によるチャンレンジの直前に、抗血清またはコント
ロールmAbと一緒に混合した。実験2、3および4において、0時間において、動物を
mAbを用いてi.p.で処理した。2時間後、その動物を、細菌を用いてi.p.チャ
レンジした。両方の実験において、血液培養物をチャレンジの18時間後に得た。
B幾何平均のCFU/mlの計算のために、滅菌培地を用いた動物に、1CFU/mlの
値を割り当てた。実験1において、抗GNA33抗血清の1:5または1.25希釈を与
えそして、株M986(28.8×103)でチャレンジした動物の組み合わせ群の幾何
平均CFU/mlは、無関係なmAbまたはE.coli抗血清(350×103、P=
0.02)を与えたコントロールの組み合わせた群のものよりも低かった。実験2、3お
よび4において、抗GNA33 mAbで処置された動物の幾何平均CFU/mlは、無
関係なmAbを与えたコントロールの物より低かった(P<0.02)。
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- 明細書に記載のペプチド。
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