KR20050039839A - Ｌｇｔｂ- 나이세리아 메닌기티디스로부터의 ｌ2 및/또는ｌ3 면역유형 리포올리고사카라이드를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Ｌｇｔｂ- 나이세리아 메닌기티디스로부터의 ｌ2 및/또는ｌ3 면역유형 리포올리고사카라이드를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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필립 드노엘
크리스티안 페론
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얀 풀만
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Abstract

본 발명은 나이세리아 백신 조성물, 이의 제법 및 약제로서의 당해 조성물의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 나이세리아, 특히, 수막구균의 외막 소포(또는 수포) 백신을 제조하는데 보다 적합한 신규 가공된 수막구균 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 유리한 방법 및 백신 생성물은 사람 대상체에 사용하기 위해 보다 안전하고/하거나 보다 효과적인 신규 LOS 서브유니트 또는 수막구균 외막 소포(또는 수포) 백신의 사용을 기초로 기재되어 있다. 특히, PorA와 OpA, PorA 및 OpC, OpA 및 OpC, 및 PorA 및 OpA 및 OpC와 같은 유전자 조합의 하향 조절이 기재되어 있다. 다르게 또는 추가로, lgtB-는 나이세리아 백신 조성물에서 L3 및/또는 L2 LOS를 효과적으로 및 안전하게 사용하기 위한 최적의 돌연변이인 것으로 밝혀졌다. lgtB- 및 캡슐 폴리사카라이드 결핍된 수막구균 돌연변이로부터 유래된 수포 백신이 추가로 기재되어 있다; 이것은 LOS가 중요한 항원으로서 보유되어야만 하는 수포 제제를 제조하는 유리한 방법이다.

Description

ＬＧＴＢ- 나이세리아 메닌기티디스로부터의 Ｌ2 및/또는 Ｌ3 면역유형 리포올리고사카라이드를 포함하는 백신 조성물{VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING L2 AND/OR L3 IMMUNOTYPE LIPOOLIGOSACCHARIDES FROM LGTB- NEISSERIA MINIGITIDIS}
본 발명은 나이세리아(neisseria) 백신 조성물, 이의 제법 및 약제로서의 당해 조성물의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나이세리아, 특히 수막구균의 외막 소포(또는 수포) 백신의 제조에 보다 적합한 신규 가공된 수막구균 균주의 작제 방법에 관한 것이다. 사람 대상체에 사용하기에 보다 안정하고 보다 효과적인 신규 LOS 서브유니트 또는 수막구균 외막 소포(또는 수포) 백신의 사용을 기초로 하는 유리한 방법 및 백신 제품이 또한 기재되어 있다.
나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(수막구균)은 그람 음성 세균으로서 흔히 사람 상부 호흡기로부터 분리되며 이것은 균혈증 및 뇌막염과 같은 위독한 침투 세균성 질환을 유발하는 원인이 된다. 수막염 질환의 발병율은 지리학적, 계절적 및 해마다 차이를 나타낸다[문헌참조:Schwartz, B. , Moore, P. S. , Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989]. 이와 같은 세균은 일반적으로 이의 캡슐 폴리사카라이드의 혈청군에 따라 분류된다.
온대성 국가의 대부분의 질환은 혈청군 B의 균주에 기인하며, 발병율이 총 인구100,000명당 연간 1 내지 10명의 건수로서 다양하고 때때로 보다 높은 수치에 달한다[문헌참조: Kaczmarski, E. B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A. , Poolman, J. T. et al. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246,1993 ; Cruz, C., Pavez, G. , Aguilar, E. , et al. Epidemiol. Infect. 105: 119-126,1990].
중앙아프리카의 대부분에서 혈청군 A 수막구균에 의한 전염병은 때때로 연간 100,000명당 1000명 이하의 발병 수준에 이른다[문헌참조: Schwartz, B. , Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989]. 대체로 거의 모든 경우의 수막염 질환은 혈청군 A, B, C, W-135 및 Y 수막구균에 의해 발병되고 4원 A, C, W-135, Y 캡슐 폴리사카라이드 백신이 유용하다[문헌참조: Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C. , Lafaix, C. , J. Biol. Stand. 10: 335- 339,1982].
과거 몇십년 동안에 많은 유럽 국가에서 나이세리아 메닌기티디스 감염 빈도수가 상승하였다. 이것은 사회적 활동(예를 들어, 수영장, 극장등)이 활발해짐으로 인해 전염성이 증가되었기 때문이다. 일부 표준 항생제에 대해 덜 민감하거나 내성인 나이세리아 메닌기티디스 균주를 분리한다는 것은 더 이상 특별한 일이 아니다. 이러한 현상은 신규한 항미생물 제제, 백신, 약물 스크리닝 방법 및 당해 유기체에 대한 진단 시험에 대한 불만족스런 의학적 필요성 및 요구를 창출하였다.
유용한 폴리사카라이드 백신은 현재 이들을 캐리어 단백질에 화학적으로 접합시키는 방법을 통해 개선되고 있다[문헌참조: Lieberman, J. M. , Chiu, S. S. , Wong, V. K., et al. JAMA 275: 1499-1503,1996].
그러나, 혈청군 B 백신은 유용하지 못하다. 혈청군 B 캡슐 폴리사카라이드는 비면역원성인 것으로 밝혀졌는데 이는 이것이 숙주 성분과 유사한 구조를 공유하기 때문일 가능성이 높다[문헌참조: Wyle, F. A. , Artenstein, M. S. , Brandt, M. L. et al. J. Infect. Dis. 126: 514-522,1972 ; Finne, J. M. , Leinonen, M., Makela, P. M. Lancet ii.: 355-357,1983]. 따라서, 외막 소포(또는 수포) 또는 이로부터 유래된 정제된 단백질 성분 기원의 혈청군 B 백신을 개발하는데 노력이 집중되어 왔다.
백신 개발을 위한 또 다른 수막구균 항원은 수막구균의 리포올리고사카라이드(LOS)이다. 이들은 외막과 결합한 당지질이고 O 측쇄가 결핍되어 있어 장내세균의 리포폴리사카라이드(LPS)와는 상이함에 따라서 대략적으로 LPS의 형태와 유사하다[문헌참조: Griffiss et al. Rev Infect Dis 1988; 10: S287-295]. LOS의 올리고사카라이드 잔기내의 이종성은 상이한 수막구균 균주간에 구조 및 항원의 다양성을 발생시킨다[문헌참조: Griffiss et al. Inf. Immun. 1987; 55: 1792-1800]. 이것은 균주를 12개의 면역유형으로 세분하는데 사용되었다[문헌참조: Scholtan et al. J Med Microbiol 1994,41 : 236-243]. 면역유형 L3, L7 및 L9는 면역학적으로 동일하고 구조적으로 유사(또는 심지어 동일하다)하여 L3, 7, 9로서 명명되거나 표기를 목적으로 일반적으로 "L3"으로서 명명된다. 수막구균의 LOS L3,7,9(L3), L2 및 L5는 시알릴화에 의해 또는 시티딘 5'-모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산을 첨가함에 의해 변형시킬 수 있다. L2, L4 및 L6 LOS가 면역학적으로 명백하게 구분될 수 있지만 이들은 구조적으로 유사하고 L2가 본원에 언급되는 경우, 본 발명의 범위 내에서 임의로 L4 또는 L6을 대신할 수 있다. LOS에 대한 항체는 실험 래트를 감염으로부터 보호하고 엔. 메닌기티디스로 감염된 어린이의 살균 활성에 기여하는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Griffiss et al J Infect Dis 1984; 150: 71-79].
그러나, 수막구균 백신에서 LOS의 사용과 관련된 문제점은 이의 지질 A 잔기에 의한 독성이다.
LOS는 또한 수막구균 수포 표면상에 존재한다. 수년 동안 수막구균 외막 소포(또는 수포)계 백신을 개발하는데 노력이 집중되어 왔다[문헌참조: de Moraes, J. C. , Perkins, B. , Camargo, M. C. et al. Lancet 340: 1074-1078,1992 ; Bjune, G. , Hoiby, E. A. Gronnesby, J. K. et al. 338: 1093-1096, 1991]. 당해 백신은 적당히 폴딩된 형태로 여러 통합 외막 단백질을 함유하여 숙주에게 투여되는 경우 면역학적 보호 반응을 유발할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 추가로, 나이세리아 균주(엔. 메닌기티디스 혈청군 B - menB를 포함)는 충분한 양의 외막 수포를 분비하여 산업적 규모로 이들을 제조할 수 있다. 그러나 종종 수포는 세균 세포(예를 들어, EP 11243)의 0.5% 세제(예를 들어, 데옥시콜레이트) 추출법을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 이것은 상기된 바와 같이 LOS(또는 내독소로서 호칭됨)의 독성 때문에 바람직하지만 또한 백신으로부터 대부분의 LOS 항원을 제거하는 효과를 갖는다.
백신 항원으로서 LOS를 사용하는 추가의 문제점은 12개의 LPS 면역유형이 다양한 범위의 탄수화물-구조와 공존한다는 것이다[문헌참조: M. P. Jennings et al, Microbiology 1999,145, 3013-3021; Mol Microbiol 2002,43 : 931-43]. 하나의 면역유형에 대해 유도된 항체는 상이한 면역유형을 인지하지 못한다. LOS 면역유형의 올리고사카라이드 부분의 속칭 "코어" 영역을 생산하는데 노력이 집중되어 왔지만(문헌참조: WO 94/08021), 변형된 LOS에 대해 생성된 항체의 살균 활성은 상실된다. 따라서, 백신이 효과적이기 위해서는 많은 상이한 면역유형의 LOS 성분을 가질 필요성이 있을 수 있다.
추가의 문제점은 사람 백신에서 항원으로서 LOS(또한 LPS 또는 리포폴리사카라이드로서 공지됨)를 사용한다는 것인데 즉, 이들은 사람 사카라이드 구조(예를 들어, 사람 적혈구 세포상에 존재하는)와 유사한 사카라이드 구조를 갖고 있어서 이들을 사용하는데 안정성 문제를 대두시킨다. 그러나, LOS의 구조를 변화시킨다는 것은 LOS 항원의 살균 효과의 구조적 민감성으로 인해 문제가 된다.
본 발명은 상기 문제점중 하나 이상을 개선시키는 방법을 제공하고, 특히, 외막 소포상에 존재하는 경우, 보호 항원으로서 수막구균 LOS를 기초로 하는 신규 백신의 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에 언급된 공개 공보 및 특허 공보 또는 특허원내에 기재된 정보의 주요 요지가 본원에 참조로서 인용된다.
"리포올리고사카라이드"(또는 "LOS")에 대한 언급은 또한 "리포폴리사카라이드" 또는 "LPS"로서 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)", "포함한다(복수형 comprise 및 단수형 comprises)"는 임의로 본 발명자가 모든 경우에 각각 "로 이루어진" 및 "로 이루어진다(복수형 consist of 및 단수형 consists of)"와 같은 용어로 대용할 수 있는 것으로 의도된다.
본 발명자는 LOS 올리고사카라이드 구조의 감축이 살균 면역 반응을 유발할 수 있는 에피토프의 상실을 유도함을 밝혔다. 이로써, 본 발명자는 백신 제형화에 가장 효과적으로 LOS를 사용하기 위해서는 LOS 올리고사카라이드 구조를 가능한한 유지시켜야만 하지만 단지 2개의 LOS 항원을 조합하여 범용적으로 효과적인 나이세리아(바람직하게는 수막구균) 백신을 개발할 수 있음을 밝혔다. 본 발명의 제1 측면은 면역유형 L2의 나이세리아(바람직하게는 수막구균) LOS 및 면역유형 L3의 LOS를 포함하는 나이세리아(바람직하게 수막구균 또는 수막구균 B) 질환의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물이다. LOS는 기타 공지된 정제 방법에 의해 분리될 수 있거나 L2 및 L3 나이세리아 균주로부터 유래하는 2개 이상의 외막 소포(또는 수포) 제제로 존재할 수 있다. 수포 제제로부터 느슨하게 보유된 독성 LOS를 제거하면서도 수포내에 고수준의 통합된 LOS항원을 유지하기 위해, 수포는 0 내지 0.3%, 바람직하게는 0.05 내지 0.2%, 가장 바람직하게는 약 0.1%의 저농도의 세제, 바람직하게는 데옥시콜레이트( 또는 DOC)를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다. 특히, 수포 백신에서 LOS 항원의 조합은 놀랍게도 엔. 메닌기티디스 균주의 90% 이상에 대해 효과적일 만큼 유리하다.
본 발명자는 또한 본 발명의 상기 수포 면역원성 조성물 및 실질적으로 임의의 나이세리아(바람직하게는 임질균 또는 수막구균) 유래 수포 면역원성 조성물은, 면역우성 외막 단백질의 특정 조합체가 발현에서 하향 조절(바람직하게는 고갈)되는 경우 이들의 표면상에서 증진된 보호 항원(LOS를 포함) 효과를 가질 수 있음을 밝혔다. 따라서, 본 발명의 제2 측면은, 천연 비변형 균주와 비교하여 발현에 있어 하향 조절되고 바람직하게는 고갈된 하기의 2개의 이상의 외막 단백질을 갖는 나이세리아 균주로부터 유래된 나이세리아 수포 제제이다: PorA, PorB, OpA, OpC 또는 PilC. 바람직하게, PorA 및 OpA, PorA 및 OpC, OpA 및 OpC, 또는 PorA 및 OpA 및 OpC는 하향 조절되거나 고갈된다. FrpB 발현의 하향 조절(바람직하게는 고갈)은, 특히, 철 제한 조건 하에서 증식한 나이세리아 균주로부터 제조된 수포 제제에서 교차 보호 항원 효과를 증진시키는데 이로울 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 당해 돌연변이를 갖는 균주로부터 유래된 나이세리아 수포는 상기 언급된 하나 이상의 하향 조절과 FrpB 하향 조절의 조합으로부터 유래된 수포와 같이 본 발명의 추가의 양태이다. PorA가 하향 조절되는 경우, PorB는 하향 조절되지 말아야하고 그 반대의 경우에도 그러한 것이 바람직하다.
상기 돌연변이는, 수포 면역원성 조성물이 유래되어야만 하는 임의의 나이세리아(바람직하게, 수막구균, 가장 바람직하게는 menB)균주, 특히 본원에 기재된 것들에서 유익하지만, 전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 낮은 DOC % 추출 방법을 사용하여 추출된 L2 또는 L3 면역유형 나이세리아(바람직하게는 수막구균, 가장 바람직하게는 menB) 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 수포 면역원성 조성물은 L2 및 L3 수포 둘 다를 함유하고 여기에서 적어도 하나(및 바람직하게는 둘 다)는 상기 조합된 면역우성 외막 단백질(또는 OMP)에서 결핍되어 있다. 당해 유전자를 하향 조절하기 위한 기술은 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: WO 01/09350]에서 논의된다. 4개의 상이한 Opa 유전자는 수막구균 게놈내에 존재하는 것으로 공지되어 있고[문헌참조: Aho et al. 1991 Mol. Microbiol. 5: 1429-37] 따라서 여기서 Opa는 발현에서 하향 조절되는 것으로 기재되어 있고 이것은 바람직하게 수막구균에 존재하는 1, 2, 3 또는 (바람직하게) 모든 4개의 유전자가 하향 조절됨을 의미한다. 당해 하향 조절은 유전학적으로 문헌[참조: WO 01/09350]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있거나 Opa 좌위로부터 발현되지 않거나 발현율이 낮은 용이하게 발견되는 천연의 안정한 수막구균 균주를 모색함에 의해 수행될 수 있다. 당해 균주는 문헌[참조: Poolman et al (1985 J. Med. Micro. 19: 203-209]에 기재된 기술을 사용하여 발견될 수 있고 여기서 Opa-인 세포는 플레이트상에서 또는 현미경 하에서 세포의 외형을 관찰하여 보여질 수 있는 Opa를 발현하는 세포와는 상이한 표현형을 갖는다. 일단 발견된 균주는 Opa의 결핍을 설정한 발효를 수행한 후 세포 내용물에 대한 웨스턴 블롯을 수행하여 안정하게 Opa-인 것으로 밝혀질 수 있다.
상기 LOS 면역원성 조성물의 안정성
L3 또는 L2 LOS에 대해 유도된 항체의 안정성은 사람 글리코스핑고지질에 존재하는 락토-N-네오테트라오스 올리고사카라이드 그룹(Galß1-4GlcNAcß1-3Galß1-4Glcß1-; 도 1)과 유사한 구조가 존재함으로 인해 의문시되었다. 다수의 사람들은 잔여량의 L3 LOS를 함유하는 데옥시콜레이트로 추출한 소포 백신으로 안정하게 백신처리 되었지만[문헌참조: G. Bjune et al, Lancet (1991), 338,1093-1096 ; GVG. Sierra et al, NIPH ann (1991), 14,195-210], LOS가 본원의 논의된 바와 같은 항원으로부터 유지되어야만 하는 경우, LOS 사카라이드 구조의 말단 부분의 결실이 사람 조직의 표면에 존재하는 구조와 항-LOS 면역 반응의 교차 반응을 차단하는데 유리한 것으로 본 발명자에 의해 밝혀졌다. 바람직한 양태에서, lgtB 유전자의 불활성화는 말단 갈락토스 잔기 및 시알산이 부재인 중간체 LOS 구조를 유도한다[도 1 및 2 참조, 당해 돌연변이는 4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- 구조를 L2 및 L3 LOS에 잔류시킨다). 당해 중간체는 L3 및/또는 L2 LOS 균주에서 수득될 수 있다. 또 다른 대체성의 덜 바람직한(단축된) 버젼의 LOS는 lgtE 유전자를 차단함에 의해 수득될 수 있다. 추가의 대체성의 덜 바람직한 버젼의 LOS는 lgtA 유전자를 차단시킴에 의해 수득될 수 있다. 당해 lgtA- 돌연변이가 선별되는 경우, 또한 lgtC 발현을 차단하여 비면역원성 L1 면역유형의 형성을 예방하는 것이 바람직하다.
본 발명자가 밝힌 바와 같이, 여전히 살균성(및 심지어 교차 살균성) 항체 반응을 유발할 수 있는 LOS 보호 올리고사카라이드 에피토프를 유지하면서 안정성 문제를 해결하기 위한 최적의 절단체로 LgtB- 돌연변이가 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명의 당해 L2 및/또는 L3 제제(정제되거나 분리된 수포이든지간에) 또는 일반적인 수막구균 수포 제제(특히, L2 및/또는 L3)는 유전학적으로 조작되어 바람직하게는 유전자를 차단함에 의해, 가장 바람직하게는 당해 유전자의 모든 또는 일부의 프로모터 및/또는 개방 판독 프레임을 결실시킴에 의해 lgtB, lgtA 또는 lgtE 유전자로부터의 기능성 유전자 생성물의 발현이 영구적으로 하향 조절된 나이세리아 균주(바람직하게는 수막구균)으로부터 유래되는 것이 유리하다.
바람직하게, 본 발명의 나이세리아 균주는 캡슐 폴리사카라이드의 합성이 결핍되어 있다.
본 발명의 상기 수포 제제가 수막구균 B 균주로부터 유래하는 경우, 캡슐 폴리사카라이드(또한 사람 유사 사카라이드 구조를 함유하는)가 또한 제거되는 것이 특히 바람직하다. 많은 유전자를 차단하여 이를 성취할 수 있지만 유리하게도 본 발명자는 수포 생산 균주를 유전학적으로 조작하여, 바람직하게는 유전자를 차단하고, 가장 바람직하게는 당해 유전자의 모든 또는 일부의 프로모터 및/또는 개방 판독 프레임을 결실시킴에 의해 siaD 유전자로부터의 기능성 유전자 생성물의 발현을 영구적으로 하향 조절(즉, α-2-8 폴리시알릴트랜스퍼라제 활성의 하향 조절)시키는 것이 바람직함을 밝혔다. 당해 불활성화는 문헌[참조: WO 01/09350]에 기재되어 있다. siaD(또한 synD로서 공지됨) 돌연변이는 LOS의 보호 에피토프의 생합성에 영향을 주지 않아 궁극적으로 보호 항원으로서 LOS의 사용을 목적으로 하는 방법에 유리하고 세균의 증식에 최소 효과를 갖는 유일한 돌연변이중 하나이기 때문에 캡슐 폴리사카라이드로부터 사람 유사 에피토프를 제거시킬 수 있는 많은 돌연변이 중에서 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 측면은 lgtE- siaD-, lgtA- siaD- 또는 바람직하게, lgtB- siaD- 수막구균 B 돌연변이 균주로부터 유래된 상기된 바와 같은 수포 면역원성 제제이다. 당해 균주 자체는 본 발명의 추가의 측면이다.
siaD- 돌연변이는 상기 이유 때문에 바람직할 수 있지만, 수막구균 B(또는 일반적인 수막구균) 캡슐 폴리사카라이드 합성을 차단하는 기타 돌연변이가 사용될 수 있다. 따라서, 수포 생산 균주는 유전학적으로 조작되어 바람직하게는 유전자를 차단하고, 가장 바람직하게는 당해 유전자의 모든 또는 일부의 프로모터 및/또는 개방 판독 프레임을 결실시킴에 의해 하기의 유전자중 하나 이상으로부터 기능성 유전자 생성물의 발현을 영구적으로 하향 조절시킬 수 있다: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA(synX 및 siaA와 동일함), synB(siaB와 동일함) 또는 synC(siaC와 동일함) 유전자. lgtE- 돌연변이는 당해 돌연변이중 하나 이상과 조합될 수 있다. 바람직하게, lgtB- 돌연변이가 당해 돌연변이중 하나 이상과 조합될 수 있다. 본 발명의 추가의 측면은 따라서 수막구균 B(또는 일반적인 수막구균)의 조합된 돌연변이 균주로부터 유래된 상기된 바와 같은 수포 면역원성 제제이다. 균주 자체는 본 발명의 추가의 측면이다.
lgtB 및 lgtE를 포함하는 다양한 lgt 유전자 함유 나이세리아 좌위 및 이의 서열은 문헌[참조: M. P. Jennings et al, Microbiology 1999,145, 3013-3021; 본원에 참조로서 인용되는 J. Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994]; WO 96/10086]에 공지되어 있다.
전장(비-트렁케이팅된) LOS가 최종 생성물에 사용되어야만 하는 경우, 시알화되지 않은 LOS가 바람직할 수 있다(당해 LOS는 또한 시알화되지 않은 가장 위험한 침투성 수막구균 B 균주에 대해 면역반응을 생성하기 때문에). 그러한 경우, 당해 돌연변이는 또한 menB LOS가 시알화될 수 없도록 하기 때문에 synA(synX 및 siaA와 동일함), synB(siaB와 동일함) 또는 synC(siaC와 동일함) 유전자가 결실된 캡슐 부재 균주를 사용하는 것이 유리하다.
당해 돌연변이는 수포 면역원성 조성물이 유래되어야만 하는 임의의 나이세리아(바람직하게는 수막구균, 가장 바람직하게는 menB)균주, 특히, 본원에 기재된 균주들에서 유리하지만 전형적으로 본원에 기재된 바와 같이 낮은 DOC% 추출 방법으로 추출된 L2 또는 L3 면역유형 나이세리아(바람직하게는, 수막구균, 가장 바람직하게는 menB)균주를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 수포 면역원성 조성물은 L2 및 L3 수포 둘 다를 함유하고 여기서 적어도 하나(및 바람직하게는 둘 다)는 당해 유전자들의 발현이 결핍된 균주로부터 유래된다.
LOS의 독성
본 발명의 상기 정제된 LOS 또는 수포 면역원성 조성물은 또한 이들이 유래된 세균 생산 균주내 특정 유전자들의 발현을 하향 조절함에 의해 독성이 적게 부여될 수 있다. 당해 무독화는 천연 OMV(문헌참조: J. J. Drabick et al, Vaccine (2000), 18,160-172)를 사용한 비강내 면역화의 경우 필요하지 않을 수 있지만 비경구 백신 처리를 위해서는 무독화 시키는 것이 유리하다. 바람직하게, 본 발명의 LOS 정제된 LOS 또는 수포 면역원성 조성물은 지질 A 생합성에 관여하는 유전자들, 특히, 2급 아실 쇄를 지질 A로 부가하는데 관여하는 유전자들의 돌연변이/변형/불활성화, 특히, msbB 및/또는 htrB 유전자로부터 기능성 유전자 생성물의 발현을 하향 조절하고 바람직하게는 유전자를 차단하고 가장 바람직하게는 당해 유전자의 모든 또는 일부의 프로모터 및/또는 개방 판독 프레임을 결실시킴에 의해 나이세리아 생산 균주를 유전학적으로 조작함으로써 무독화 된다. 다르게는 (또는 추가로) 정제된 LOS 또는 수포 면역원성 조성물은 유전학적으로 변형되어 하나 이상의 하기 유전자가 상향 조절(보다 강한 프로모터를 도입하거나 여분의 유전자 복제물을 통합시킴에 의해)된 나이세리아 균주로부터 유래할 수 있다: pmrA, pmrB, pmrE 및 pmrF. 다르게는 (또한 추가로) 정제된 LOS 또는 수포 면역원성 조성물은 비독성 펩타이드 기능성 등가물의 폴리믹신 B[지질 A에 대해 고친화성을 갖는 분자]를 당해 조성물에 첨가함에 의해 무독화 될 수 있다.
상기 무독화 방법 및 적절한 프로모터/유전자 서열 및 상향 조절 및 하향 조절 방법에 대한 보다 세부적인 사항에 대해서는 문헌[참조: WO 01/09350]을 참조한다. 나이세리아 msbB 및 htrB 유전자는 또한 각각 lpxL1 및 lpxL2로 명명되고(문헌참조: WO 00/26384) 당해 유전자들의 결실 돌연변이는 야생형과 비교하여 표현형적으로 msbB- 돌연변이 LOS에서 1개의 2급 아실 쇄가 결실되어(4개의 1급 및 하나의 2급 아실 쇄를 보유하는) 있고 htrB- 돌연변이 LOS에서 2급 아실 쇄 둘 다가 결실되어 있음을 특징으로 한다. 당해 돌연변이는 바람직하게 돌연변이와 조합되어 나이세리아 생산 균주가 캡슐 폴리사카라이드가 결핍되어(상기 참조) 수포상에 LOS가 무독화 되어 있음을 보장하거나 무독화된 서브유니트 LOS의 정제를 도와준다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 폴리믹신 B의 비독성 펩타이드 기능성 등가물, 특히, 펩타이드 SAEP 2(이의 서열은 KTKCKFLKKC이고 여기서 2개의 시스테인이 디설파이드 브릿지를 형성한다)의 사용에 대한 추가의 상세한 사항은 문헌[참조: WO 93/14115, WO 95/03327, Velucchi et al (1997) J Endotoxin Res 4: 1-12, and EP 976402]을 참조한다.
"기능성 유전자 생성물의 발현을 하향 조절하는" 이란 용어는 본원에서 미지의 유전자의 프로모터 또는 개방 판독 프레임이 부가, 결실 또는 치환되도록 하여 총 유전자 생성물의 생합성 활성을 60, 70, 80, 90, 95% 또는 가장 바람직하게 100%까지 감소시키는 것을 의미한다. 명백하게 프레임 전이 돌연변이가 도입될 수 있거나 보다 약한 프로모터로 치환될 수 있지만, 가장 바람직하게는, 대부분 또는 모든 개방 판독 프레임 및/또는 프로모터를 결실시켜 (활성) 유전자 생성물이 영구적으로 확실히 하향 조절되도록 하는 것이다[문헌참조: WO 01/09350].
당해 돌연변이는 수포 면역원성 조성물이 유래되어야만 하는 임의의 나이세리아(바람직하게는 수막구균, 가장 바람직하게는 menB)균주, 특히, 본원에 기재된 균주들에서 유리하지만, 전형적으로, 본원에 기재된 바와 같이 낮은 DOC% 추출 방법으로 추출된 L2 또는 L3 면역유형 나이세리아(바람직하게는, 수막구균, 가장 바람직하게는 menB)균주를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 본 발명의 수포 면역원성 조성물은 L2 및 L3 수포 둘 다를 함유하고 여기서 적어도 하나(및 바람직하게는 둘 다)는 당해 유전자들의 발현이 결핍된 균주로부터 유래된다.
본 발명의 추가의 측면은, 본 발명의 LOS 또는 수포 면역원성 제제가 유래된 상기된 유전학적으로 변형된 나이세리아(바람직하게는, 수막구균 또는 임질 또는 수막구균 B) 균주를 포함한다.
본 발명의 LOS 또는 LOS 함유 수포 제제
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 나이세리아 균주로부터 분리된 LOS 제제(특히, 상기된 것들 중 하나)이다. 바람직하게, 분리된 LOS(또는 LOS 함유 수포)는 L2 또는 L3 면역유형이고 바람직하게 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 L2 및 L3 LOS (또는 수포) 제제 둘 다를 포함한다.
당해 제제는 또한 상기 LOS의 올리고사카라이드 부분(정제되거나 수포 제제로 존재하든지 간에)을 T 세포 에피토프 공급원을 포함하는 캐리어에 접합시켜서 LOS에 보다 우수한 T-의존성 면역원을 부여함에 의해 개선될 수 있다. 본 발명의 정제된 LOS 제제는 또한 문헌[참조: 예를 들어, WO 96/40063 및 본원에 인용된 참조문헌]에 공지된 리포좀 제형에 이를 제공하여 보다 우수한 항원이 되게 할 수 있다.
세균으로부터 LOS의 분리 방법은 문헌[참조:Wesphal & Jann (Meth. Carbo. Chem. 1965,5 : 83-91)의 고온 물-페놀 과정]에 널리 공지되어 있다. 또한, 문헌[참조: Galanos et al. 1969, Eur J Biochem 9: 245-249, and Wu et al. 1987, Anal Bio Chem 160: 281-289]을 참조한다. 분리된 LOS를 접합시키는 기술은 또한 예를 들어, 문헌[본원에 참조문헌으로서 인용된 EP 941738]에 공지되어 있다.
본 발명의 목적을 위해, "T 세포 에피토프의 공급원을 포함하는 캐리어"는 일반적으로 펩타이드이거나 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 접합 기술은 선행 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 전형적인 담체는 분류될 수 없는 에이취. 인플루엔자(H. influenzae)로 부터 유래하는 단백질 D, 파상풍 독소, 디프테리아 독소, CRM197 또는 수포(특히, 나이세리아 또는 수막구균) 제제 중에 존재하는 외막 단백질을 포함한다.
본 발명의 바람직하게 분리된 LOS 조성물은, 각각의 LOS의 올리고사카라이드 부분이 임의로 T 세포 에피토프의 공급원을 포함하는 캐리어에 접합되어 있는 L2 및 L3 분리된 LOS를 포함하는 조성물, 각각의 LOS의 올리고사카라이드 부분이 임의로 T 세포 에피토프의 공급원을 포함하는 캐리어에 접합되어 있는 lgtB- 수막구균 균주로부터 유래된 것과 일관된 구조를 갖는 L2 또는 L3 LOS를 포함하는 조성물 및 가장 바람직하게 각각의 LOS의 올리고사카라이드 부분이 임의로 T 세포 에피토프의 공급원을 포함하는 담체에 접합되어 있는, lgtB- 수막구균 균주로부터 유래하는 것들과 일관된 구조를 갖는 L2 및 L3 분리된 LOS를 포함하는 조성물이다.
바람직하게, 본 발명의 LOS 조성물은 무독화 되었다. 이것은 분자로부터 아실 쇄를 제거하지만 분자의 보호 효능을 감소시킬 수 있는 하이드라진 또는 알칼리 가수분해 화학적 처리에 대한 공지된 기술에 의해 수행될 수 있지만, 바람직하게는, htrB- 또는 msbB- 수막구균 돌연변이(상기된 바와 같음; 특히, 캡슐 폴리사카라이드 부재 균주)로부터 LOS를 분리하거나 폴리믹신 B[지질 A에 대해 고친화성인 분자]의 비독성 펩타이드 기능성 등가물을 당해 조성물, 특히 상기된 바와 같은 SAEP 2에 부가함으로써 수행된다.
본 발명의 LOS는 분리된 상태(보통 지질 A 잔기가 여전히 온전한 경우 마이셀 형태로)로 투여될 수 있거나 리포좀으로 투여될 수 있다. 그러한 경우, 외막 단백질은 리포좀에 부가될 수 있고 LOS는 올리고사카라이드에 T 의존성 항원을 부여하기 위해 당해 외막 단백질에 접합된 내부 리포좀일 수 있다. 이것은 상기된 바와 같은 내부 수포 LOS 가교 결합에 대해 기재된 바와 같은 유사한 화학적 처리로 수행될 수 있다.
LOS의 올리고사카라이드 부분의 수포의 표면상에 존재하는 외막 단백질로의 내부 수포 가교 결합(접합)
LOS(특히, 본 발명의 LOS)가 수포 제형에 존재하는 경우, LOS는 바람직하게 LOS를, 수포 제제상에 존재하는 하나 이상의 외막 단백질(예를 들어, 수막구균내 PorA 또는 PorB)에 접합시키는 방법에 의해 동일계에서 접합된다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 LOS에 접합된 외막 단백질에 통합된 외막을 갖는 그람 음성 세균 균주 기원의 수포 제제이다. LOS가 접합용 수포 제제에 첨가될 수 있지만 LOS는 천연적으로 수포 제제의 표면상에 존재하는 것이 바람직하다.
당해 방법은 외막 표면상의 천연 환경내 LOS와 같이, 수포 제형내에 LOS 항원의 안정성 및/또는 면역원성(T 세포 도움을 제공하는) 및/또는 항원성을 유리하게 증진시켜 가장 보호적인 형태인 T비의존성 올리고사카라이드 면역원에 대해 T 세포 도움을 제공할 수 있다. 추가로, 수포내 LOS의 접합은 LOS의 무독화를 유도할 수 있다(특정 이론에 얽매이는 것 없이, 지질 A 부분은 접합되는 경우 외막에 보다 안정하게 매립되어 독성이 적다). 따라서, htrB- 또는 msbB- 돌연변이로부터 수포를 분리하는 상기 언급된 무독화 방법 또는 폴리믹신 B의 비독성 펩타이드 기능성 등가물을 당해 조성물에 부가함에 의한 무독화 방법이 요구되지 않을 수 있다(그러나, 추가의 안전을 위해 조합하여 부가될 수 있다).
본 발명의 접합된 수포 제제는 전형적으로, 수포내 LOS의 독성이, 전반적으로 동일한 양의 비접합된 LOS를 사용한 동일한 수포와 비교하여 감소되어 있도록 구성된다. LOS 독성은 예를 들어, 유럽 약전에서의 LOS 래빗 발열물질 분석을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다(실시예 7 참조).
본 발명의 접합된 수포 제제는 유리하게는 접합된 LOS가 숙주(이의 혈청은, 수포 제제가 유래하는 세균상에 존재하고 가장 바람직하게는 SBA 분석에서 살균 방식으로 존재하는 비접합된 LOS와 반응성(결합할 수 있는)이다)에서 면역 반응을 유발하는데 적합한 형태를 갖도록 구성되어 있다.
나이세리아 수포가 LOS에 접합되고 수포가 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 면역우성 외막 단백질이 하향 조절된 균주로부터 유래하는 경우에 있어서, PorA가 하향 조절되는 경우, PorB는 하향 조절되지 말아야만 하고 그 반대인 경우도 그러한 것이 바람직하다. 이것은 다수의 LOS가 주요 외막 단백질에 가교 결합되도록 함에 따라서 수포내에 존재하는 교차 보호 소수 외막 항원상의 임의의 접합 효과를 최소화한다.
특히, 본 발명자는, 수포내 존재하는 LOS가 또한 수포에 존재하는 외막 단백질에 내부-수포 양상으로 접합되어 있는 수포를 포함하는 조성물이 수포가 유래된 유기체에 의해 발병되는 질환의 치료 또는 예방용 백신에 대한 기초가 될 수 있음을 밝혔고 여기서 당해 백신은 감소된 독성(바람직하게는 실질적으로 비독성)을 갖고/갖거나 이의 천연 환경에서 LOS에 대해 T 의존성 살균 반응을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 당해 내부 수포 LOS 접합된 수포 제제를 제공한다. "내부 수포"란 수포내에 천연적으로 존재하는 LOS가 동일한 수포상에 존재하는 외막 단백질에 접합되어 있음을 의미한다. 바람직하게, 수포는, 수포가 제조될 수 있는 임의의 그람 음성 유기체(문헌참조: WO 01/09350), 바람직하게 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 분류될 수 없는 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 또는 나이세리아(가장 바람직하게는 수막구균)으로부터 유래되었다.
당해 수포 제제는 상기된 세균으로부터 분리될 수 있고(문헌참조: WO 01/09350) 공지된 접합 화학 처리에 의해 LOS의 올리고사카라이드 부분상의 그룹(예를 들어, NH2 또는 COOH)이 수포 외막 단백질상의 그룹(예를 들어, NH2 또는 COOH)에 연결된다. 글루타르알데하이드, 포름알데하이드 또는 글루타르알데하이드/포름알데하이드 혼합물을 사용한 가교 연결 기술을 사용할 수 있지만, 보다 선택적인 화학물질(예를 들어, EDAC 또는 EDAC/NHS)을 사용하는 것이 바람직하다[문헌참조: J. V. Staros, R. W. Wright and D. M. Swingle, Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water- soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); and Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp 173-176)]. 본 발명에 사용될 수 있는 LOS와 단백질 분자 사이를 공유 연결시킬 수 있는 기타 접합 화학 처리 또는 요법은 EP 941738에 기재되어 있다.
바람직하게, 수포 제제는 캡슐 폴리사카라이드의 부재 하에 접합되어 있다. 수포는 캡슐 폴리사카라이드를 생산하지 않는 (천연적으로 또는 돌연변이에 의해) 균주로부터 분리할 수 있거나 대부분의 균주(60, 70, 80, 90 또는 99% 이상 제거된)로부터 정제될 수 있고 바람직하게는 캡슐 폴리사카라이드로 오염된 것으로부터 정제될 수 있다. 당해 방식으로, 내부 수포 LOS 접합 반응은 보다 효율적이다.
바람직하게, 수포내 존재하는 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상의 LOS는 가교 결합/접합되어 있다.
바람직하게, 본 발명의 수포는 수포의 LOS 함량이, 표준물로서 정제된 LOS를 사용한 SDS-PAGE 전기영동 후 은 염색에 의해 측정되는 바와 같이 3 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 22%의 LOS 함량 및 가장 바람직하게는 약 20% 또는 정확하게 20%의 LOS 함량이 되도록 제조된다[문헌(참조: Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14: 25-33)의 방법]. 수막구균 수포내 20%의 LOS는 느슨하게 결합된 LOS 분자를 제거할 수 있지만 항원의 주요 부분을 보존하는 0.1%의 낮은 DOC 추출법으로 성취될 수 있다.
내부 수포 접합된 수포가 수막구균으로부터 유래하는 경우, 이들이 유래하는 균주가 캡슐 폴리사카라이드를 생산할 수 없는 돌연변이 균주(예를 들어, 상기된 돌연변이 균주중 하나, 특히 siaD-)인 것이 바람직하다. 또한, 수막구균 질환에 대해 효과적인 면역원성 조성물이 L2 및 L3 수포를 포함하는 것이 바람직하고, 여기서, L2 및 L3 LOS 둘 다는 수포 외막 단백질에 접합되어 있다. 추가로, 내부 수포 접합된 수포내의 LOS 구조는 lgtB- 수막구균 균주로부터 유래된 것과 일치하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 면역원성 조성물은, 캡슐 폴리사카라이드를 생산할 수 없고 lgtB-인 L2 또는 L3 돌연변이 수막구균 균주로부터 유래된 내부 수포 접합된 수포를 포함하고 캡슐 폴리사카라이드를 생산할 수 없는 돌연변이 수막구균 균주로부터 유래된 L2 및 L3 수포를 포함하고 lgtB-인 돌연변이 수막구균 균주로부터 유래된 L2 및 L3 수포를 포함하고 가장 바람직하게는 캡슐 폴리사카라이드를 생산할 수 없는 lgtB_인 돌연변이 수막구균 균주로부터 유래하는 L2 및 L3 수포를 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 전형적인 L3 수막구균 균주는 H44/76 menB 균주이다. 전형적인 L2 균주는 B16B6 menB 균주 또는 39E 수막구균 C형 균주 또는 균주 760676이다.
상기된 바와 같이, 본 발명의 수포는 접합 작용에 의해 어느 정도 무독화 되었고 더 이상 무독화될 필요는 없지만 추가의 무독화 방법이 추가의 안전을 위해, 예를 들어, htrB- 또는 msbB-인 수막구균 균주로부터 유래된 수포를 사용하거나 폴리믹신 B[지질 A에 대해 고친화성인 분자](바람직하게는 SEAP 2)의 비독성 펩타이드 기능성 등가물을 상기된 바와 같은 수포 조성물에 부가함에 의해 사용될 수 있다. 따라서, LOS(특히, 내부 수포 방식으로)의 접합은 놀랍게도 동일한 양의 비접합된 LOS를 포함하는 제제와 비교하여 보다 낮은 독성의 LOS를 나타낸다. 따라서, 수포(특히, 수막구균)를 무독화시키기 위한 일반적인 방법은 추가로 LOS를 수포 외막 단백질에 내부 수포 접합시켜 제공되고 LOS를 무독화시키기 위한 방법은 또한 LOS를 수포 외막 단백질에 접합시킴으로써 제공된다.
상기 방식에서, 중요한 항원으로서 독성이 감소되고(특히, 실질적으로 무독성) 자가면역 문제가 없는 LOS를 갖고 T-의존성 특성을 갖고 있으며 천연 환경내에 존재하고 잠재적으로 99% 이상의 수막구균에 대해 살균 항체 반응을 유도할 수 있는(L2 + L3 조성물의 경우) 균주 수막구균 수포 및 수포를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
하나 이상의 Men A, C, Y 또는 W 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드(바람직하게 적어도 MenC, 또는 MenA 및 MenC 또는 MenC 및 MenY)는 또한 본 발명의 수포의 외막 단백질에 접합될 수 있다. 이것은 LOS 가교 결합 반응과 동일하게 수행될 수 있지만 별도의 (바람직하게는 후반) 반응으로 수행되는 것이 바람직하다.
최적의 내부 수포 LOS를 접합시키는 방법은 본 발명의 추가의 측면이다. 당해 방법은, 그람 음성 세균으로부터 수포를 분리하는 단계(바람직하게 본원에 기재된 바와 같이 낮은 %의 DOC를 사용하여), 수포내에 존재하는 LOS를 동일한 수포상에 존재하는 외막 단백질에 접합(바람직하게 LOS의 올리고사카라이드 잔기를 통해)시키는데 적합한 화학적 처리를 수행하는 단계, 내부 수포 접합된 수포 제제를 분리하는 단계 및 임의로 내부 수포 접합된 수포 제제를, 동일한 방법에 의해 제조되지만 상이한 LOS 면역유형을 갖는 추가의 내부 수포 접합된 수포 제제와 제형화하는 단계(바람직하게는 L2 및 L3 나이세리아/수막구균 수포를 혼합하는 단계) 및/또는 수포 제제를 약제학적으로 허용되는 부형제와 제형화하여 백신 조성물을 제조하는 단계를 포함해야만 한다.
내부 수포 접합은 바람직하게 1개, 2개 또는 3개의 모든 하기의 공정 단계를 포함해야만 한다: 접합 pH는 pH 7.0 초과, 바람직하게는 pH 7.5 이상(가장 바람직하게는 pH 9 이하)이어야만 한다; 반응 동안에 슈크로스 1 내지 5%, 바람직하게는 2 내지 4%, 가장 바람직하게는 약 3%의 조건이 유지되어야만 한다; NaCl은 접합 반응에서 최소화되어야만 하고 바람직하게 0.1M, 0.05M, 0.01M, 0.005M, 0.001M 이하이어야만 하고 가장 바람직하게는 전혀 존재하지 않아야 한다. 모든 이들의 공정 특징은 수포가 접합 공정 전반에 걸쳐 안정한 상태로 유지되고 용액으로 존재하도록 보장한다.
EDAC/NHS 접합 반응은 내부 수포 접합을 위한 바람직한 방법이다. 너무 과도하게 가교 결합시켜 여과성에 역효과를 나타내는 포름알데하이드 보다 EDAC/NHS가 바람직하다. EDAC는 카복실산(예를 들어, LOS중의 KDO)과 반응하여 활성 에스테르 중간체를 생성시킨다. 친핵성 아민(예를 들어, PorB와 같은 외막 단백질중의 라이신)의 존재 하에 아미드 결합은 이소우레아 부산물의 방출과 함께 형성된다. 그러나, EDAC 매개 반응의 효능은 설포 NHS 에스테르 중간체의 형성을 통해 증가될 수 있다. 당해 설포-NHS 에스테르는 단독의 EDAC와 카복실레이트의 반응으로부터 형성된 활성 에스테르 보다 길게 수용액에 잔류한다. 따라서, 고수율의 아미드 결합 형성은 당해 2단계 공정을 사용하여 실현될 수 있다. EDAC/NHS 접합은 문헌[참조: J.V. Staros, R.W. Wright and D.M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide- mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); and Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp173-176]에서 논의된다. 반응에서 바람직하게 0.01 내지 5mg의 EDAC/mg 수포가 사용되고 보다 바람직하게는 0.05 내지 1mg의 EDAC/mg 수포가 사용된다. 사용되는 EDAC의 양은 수포를 추출하는데 사용되는 데옥시콜레이트(DOC)%에 의존하는 샘플 중에 존재하는 LOS의 양에 의존한다. 낮은 %의 DOC(예를 들어, 0.1%)에서, 고량의 EDAC(1mg/mg 및 그 이상)가 사용되지만 보다 높은 %의 DOC(예를 들어, 0.5%)가 사용되고 너무 많은 내부 수포 가교결합을 피하기 위해 보다 낮은 양의 EDAC(0.025 내지 0.1mg/mg)가 사용된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 방법은 pH 7.0 내지 pH 9.0의 pH(바람직하게는 약 pH 7.5)에서 EDAC/NHS의 존재, 1 내지 5%(바람직하게는 약 3%)의 슈크로스 및 임의로 실질적으로 NaCl이 부재인(상기된 바와 같이) 조건 하에서 수포를 접합시키는 단계 및 접합된 수포를 반응 혼합물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 내부 수포 접합된 LOS(바람직하게는 수막구균)를 제조하는 방법이다.
당해 반응은 항-LOS(예를 들어, 항-L2 또는 항-L3)mABs를 사용한 반응 혼합물의 웨스턴 분리 겔상에서 수행되어 반응 시간이 지남에 따라서 수포내 LOS의 비율이 높아짐에 따라 LOS 분자량이 증가함을 보여줄 수 있다.
수포가 당해 기술을 사용하여 99%의 수율로 회수될 수 있다.
EDAC는, 이것이 LOS T-의존성 면역원성이 개선되기에 충분히 LOS를 OMP로 가교결합 시키지만 이것을 불량한 여과성, 응집 및 내부 수포 가교결합이 발생할 정도로 너무 과하게 가교결합 시키지 않는다는 점에서 우수한 내부 수포 가교 결합제인 것으로 밝혀졌다. 생성된 수포의 형태는 비접합된 수포의 형태와 유사하다(전자 현미경 하에). 추가로, 상기 프로토콜은 너무 과도한 가교 결합이 발생되지 않도록 하였다(이것은 수포의 표면상에 천연적으로 존재하는 보호 OMPs, 예를 들어, TbpA 또는 Hsf의 면역원성을 감소시킬 수 있다).
수포를 분리하기 위한 기술
본 발명의 외막 소포(OMV 또는 수포)는 많은 공지된 기술에 의해 분리할 수 있다[문헌참조: Fredriksen et al, NIPH Annals (1991), 14,67-79 ; Zollinger et al, J. Clin Invest (1979), 63,836-848 ; Saunders et al, Infect Immun (1999), 67,113-119 ; J. J. Drabick et al, Vaccine (1999), 18,160-172]. 이들은 2개의 주요 그룹, 즉, 수막구균으로부터 수포를 추출하기 위해 데옥시콜레이트(약 0.5%)를 사용하는 기술 및 저수준의 데옥시콜레이트(DOC)를 사용하거나 전혀 데옥시콜레이트를 사용하지 않는 기술로 나누어진다. DOC 부재 방법 수포는 LOS가 보호 항원인 백신에서 유리한 OMV내 고수준의 LOS를 유지한다는 흥미로운 특징을 갖는다. DOC 추출된 수포와 비교하여, DOC 부재 방법에 의해 수득된 OMV내 L3 Ags의 농도는 약 10배 높다. 수포를 제조하기 위한 세제 부재(바람직하게는 DOC 부재) 방법은 상기 이유때문에 본 발명의 방법의 목적을 위해 바람직하지만 저수준의 세제(바람직하게는 DOC)를 함유하는 완충액을 사용한 추출은 또한 당해 단계가 수포내에서 LOS 대부분이 밀접하게 상호작용 하도록 하면서도 보다 독성인 임의의 느슨하게 보유된 LOS를 제거한다는 점에서 유용할 수도 있다. 전형적으로, 0 내지 0.5% 및 바람직하게 0.02 내지 0.4%, 0.04 내지 3% 또는 0.06 내지 2%의 세제(바람직하게 DOC)는 수포 추출을 위해 사용되고 보다 바람직하게는 0.08 내지 0.15% 및 가장 바람직하게는 약 또는 정확하게 0.1%가 수포내 안정하게 존재하는 최적량의 LOS를 수득하는데 사용된다. DOC 부재(또는 낮은 DOC-0.3% 이하의 DOC) 추출 방법은 특히 LOS가 상기 상세하게 기재한 하나 이상의 방법으로 무독화되는 경우 바람직하다.
본 발명의 모든 양태에서 수포의 LOS 함량은 표준물로서 정제된 LOS를 사용하는 SDS-PAGE 전기영동 후 은 염색에 의해 측정되는 바와 같이 3 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 22% 및 가장 바람직하게는 약 또는 정확하게 20%의 LOS 함량인 것이 바람직하다[문헌(참조: Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14: 25-33)의 방법]. 당해 방법에서 표준물로서 Nmen L3 LOS를 사용하여, 0.1% DOC로 추출된 Nmen L3 면역유형 수포에서의 일반적인 LOS 함량은 약 20% LOS이고 0.2% DOC로 추출된 LOS의 함량은 약 15% LOS이고, 0.3% DOC로 추출된 LOS 함량은 약 10% LOS이고 0.5% DOC로 추출된 LOS의 함량은 약 5% LOS이다.
백신 조성물
본 발명의 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 첨가함에 의해 백신 조성물로서 용이하게 제형화될 수 있다.
상기된 바와 같이 본 발명의 정제된 LOS(바람직하게 L2 또는 L3)를 분리하는 단계 또는 상기된 바와 같이 본 발명의 분리된 수포(바람직하게는 L2 또는 L3 면역유형인)를 제조하는 단계 및 LOS 또는 수포를 약제학적으로 허용되는 부형제와 제형화하는 단계를 포함하는, 본 발명의 나이세리아(바람직하게는 수막구균) 면역원성 조성물 또는 백신을 제조하는 방법이 추가로 제공된다. 바람직하게, 본 발명의 면역유형 L2 및 L3 둘 다의 정제된 LOS 또는 본 발명의 면역유형 L2 및 L3 둘 다의 수포 또는 L2의 정제된 LOS 및 L3의 수포(또는 그 반대)는 혼합 단계에서 배합된다. 바람직하게, 본 발명의 정제된 LOS 또는 수포는 분리후 상기된 바와 같이 접합되었다. 추가의 리포좀 제형화 단계는 또한 정제된 LOS를 위해 추가될 수 있다(당업계에 공지된 기술을 사용하여- 예를 들어, WO 96/40063 및 본원에 인용된 문헌). 바람직하게, 수포 제제는 상기된 바와 같이 저농도(또는 부재)의 DOC로 추출함에 의해 분리된다.
당해 L2 및 L3 배합 과정은 거의 모든 수막구균 B 균주에 대해 효과적인 백신을 제조할 수 있다.
상기 면역원성 조성물(또는 방법)에 혈청군 A, C, Y 또는 W 기원의 하나 이상의 (2개, 3개 또는 4개) 수막구균 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드(상기된 바와 같이 T 세포 에피토프를 포함하는 캐리어에 접합되거나 단순하게)가 첨가될 수 있다. 바람직하게, 적어도 C가 첨가되고(가장 바람직하게는 접합된 상태로), 보다 바람직하게는, A 및 C 또는 Y 및 C(바람직하게는 모두 접합된 상태로) 및 가장 바람직하게는, A, C, Y 및 W(바람직하게 모두 접합된 상태로)가 첨가된다. 유리하게, 접합된 에이취. 인플루엔자 B 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 또한 상기 조성물에 포함시켜 범용 수막염 백신을 제조한다.
바람직하게, WO 94/08021에 특별히 언급된 조성물로 이루어지거나 이를 포함하는 조성물은 본 발명에 청구되지 않는다.
본 발명의 백신 제형
본 발명의 면역원성 조성물을 적합한 보조제와 제형화하여 본 발명의 백신 조성물을 수득할 수 있다.
적합한 보조제는 수산화알루미늄 겔(alum) 또는 인산알루미늄(바람직하게는 수산화알루미늄)과 같은 알루미늄 염을 포함하지만 또한 칼슘(특히, 탄산칼슘), 철 또는 아연의 염일 수 있거나 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴릭사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.
첨가될 수 있는 적합한 Th1 보조제 시스템은 모노포스포릴 지질 A, 특히, 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A( 또는 LPS의 기타 비독성 유도체) 및 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)[또는 비독성 LPS 유도체]과 알루미늄 염(바람직하게는 인산알루미늄)과의 배합물을 포함한다. 증진된 시스템은 문헌[WO 94/00153]에 기재된 바와 같이, 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 배합물, 특히, QS21(또는 기타 사포닌)과 3D-MPL[또는 비독성 LPS 유도체]의 배합물을 포함하거나 QS21[또는 사포닌]이 문헌[WO96/33739]에 기재된 바와 같이 콜레스테롤로 켄칭되는 경우의 반응성이 적은 조성물을 포함한다. 수중유 에멀젼 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 강력한 보조제 제형은 문헌[WO 95/17210]에 기재되어 있고 첨가될 수 있는 바람직한 제형이다. 첨가될 수 있는 기타 보조제는 사포닌, 보다 특히, QS21 및/또는 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 비메틸화된 CpG(WO96/02555)가 첨가될 수 있다.
백신 제제는 일반적으로 문헌[참조: Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J. ) (1995) Plenum Press New YORK]에 기재되어 있다.
백신의 면역보호 용량은 전신 또는 점막 경로를 통해 투여될 수 있다. 이들 투여는 근육내, 복강내 또는 피하 경로를 통해 또는 구강/소화기(바람직하게는 비강내 투여), 호흡기, 비뇨생식기에 대한 점막 투여를 통한 주입을 포함할 수 있다. 각각의 백신 용량에서의 전형적인 수포 양은 전형적인 백신에서의 상당한 부작용 없이 면역보호적인 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 당해 양은 어떠한 특정 면역원이 사용되고 어떻게 제공되는냐에 따라 다양하다. 일반적으로, 각각의 용량은 각각의 수포를 1 내지 100㎍, 바람직하게는 5 내지 50㎍ 및 가장 전형적으로는 5 내지 25㎍의 범위로 포함할 것으로 예상된다.
본 발명의 수포 면역원성 조성물에 대한 추가 개선
본 발명의 상기 수포 조성물은 이들이 유래하는 나이세리아 균주(임질균 및 바람직하게 수막구균, 가장 바람직하게는 엔. 메닌기티디스 B)가, 추가 복제물의 유전자를 게놈내로 삽입하거나 기존의 유전자의 상부에 보다 강한 프로모터를 도입함에 의해 또는 비변형된 균주에 비해 변형된 균주의 항원 수준이 1.2, 1.5, 2, 3, 5 또는 10배 이상이 되도록 유도할 수 있는 문헌[참조: WO 01/09350]에서 논의된 기타 방법중 하나에 의해 상향 조절되는 하나 이상의 하기 유전자(보호 항원을 암호화하는)를 갖는 경우, 본 발명의 백신 효율 측면에서 추가로 개선될 수 있다: NspA (WO 96/29412), Hsf 또는 이의 절단물 (WO 99/31132 & WO 01/55182 ; 또한 NhhA로서 공지됨), Hap (PCT/EP99/02766), OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA (W092/03467, US5912336, W093/06861 및 EP586266), TbpB (W093/06861 및 EP586266), NadA (Comanducci et al J. Exp. Med. 2002 195 ; 1445-1454; NMB 1994), FrpA/FrpC 또는 5개 이상의 반복 서열을 포함하는, 이들 항원에서 공통된 부분(WO 92/01460; Thompson et al., (1993) J. Bacteriol. 175: 811-818; Thompson et al., (1993) Infect. Immun.. 61: 2906-2911), LbpA, LbpB (PCT/EP98/05117), FhaB (W098/02547 SEQ ID NO 38 [nucleotides 3083-9025] ), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2 (WO 99/57280; NMB 0460), MltA (WO 99/57280; NMB 0033), TspA (WO 00/03003), TspB (WO 00/03003), ctrA (PCT/EP00/00135), MafA (NMB 0652), MafB (NMB0643), Omp26 (NMB 0181), 어드헤신 X (NMB 0315), 어드헤신 Y (NMB 0995), 어드헤신 Z (NMB 1119) 및 OstA (NMB 0280). NMB 서열의 예는 인터넷 사이트(www.neisseria.org)의 데이터베이스에서 검색할 수 있다. Hsf가 본원에 언급되는 경우, 용어는 모든 경우에 Hsf 절단물, 특히, 문헌[WO 01/55182]에 기재된 바와 같은 것들로서 대체될 수 있다.
Hsf 및 TbpA 둘 다 (저분자량의 형태 또는 고분자량의 형태, 또는 저분자량의 형태 및 고분자량의 형태 둘 다 [EP 586266]), 또는 Hsf 및 OMP85, 또는 OMP85 및 TbpA (저분자량의 형태 또는 고분자량의 형태, 또는 저분자량의 형태 및 고분자량의 형태 둘 다), 또는 NspA 및 Hsf, 또는 NspA 및 OMP85, 또는 NspA 및 TbpA (저분자량의 형태 또는 고분자량의 형태, 또는 저분자량의 형태 및 고분자량의 형태 둘 다)가 모두 상향 조절되는 경우 특히 바람직하다. 2개의 수포가 당해 조성물에 포함되는 경우, 각각의 수포는 상이하게 상향 조절되는 것이 바람직하다. 저분자량 및 고분자량의 TbpA 둘 다가 상향 조절되어야만 하는 경우, 이들은 천연적으로 2개 형태의 TbpA를 포함하는 2개의 균주로부터 유래된 조성물 중에 존재하는 2개의 별도의 수포에서 상향 조절되는 것이 바람직할 수 있다. 가장 바람직하게는, 2개의 균주는 L2 및 L3 LOS 면역유형을 갖는다. TbpA는 유전학적으로 상향 조절되거나 철 제한된 조건, 예를 들어, 50 내지 70μM의 데스페랄(Desferal)(데페록스아민 메실레이트, 시그마로부터 시판됨)의 존재 하에 나이세리아/수막구균 생산 균주를 증식시킴에 의해 상향 조절될 수 있다. 후자 방법을 취하는 경우, FrpB 유전자 발현은, 당해 가변성 항원이 철 제한된 조건에서 분리된 수막구균 균주로부터 분리된 수포에서 면역우성이 될 수 있기 때문에 하향 조절(바람직하게는 제거)되는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게 고분자량의 TbpA 및 Hsf가 상향 조절된 lgtB- 캡슐 폴리사카라이드- msbB- 균주 기원의 L3 수포 및 바람직하게 저분자량의 TbpA 및 Omp85가 상향 조절된 lgtB- 캡슐 폴리사카라이드-msbB - 균주 기원의 L2 수포를 포함한다. 보다 바람직하게는 당해 2개의 수포는 PorA 및/또는 FrpB 발현에서 및 임의로 OpC 및/또는 OpA 발현에서 추가로 하향 조절된다. 수포가 상기된 바와 같이 저농도의 DOC 방법을 통해 분리되는 것이 가장 바람직하고 당해 2개의 수포내 LOS는 외막 단백질에 가교결합된 내부 수포이다.
고스트(Ghost) 또는 사멸된 전세포 백신
본 발명자는 수포에 관한 당해 조성물 및 백신은 용이하게 고스트 또는 사멸된 전세포 제제 및 백신(동일한 이점을 갖고 있음)에 관한 방법으로 확장될 수 있음을 고려한다. 그람 음성 균주로부터 고스트 제제(완전한 외피를 갖는 공(empty) 세포)를 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[문헌참조: WO 92/01791]. 백신에 사용하기 위해 불활성화된 세포 제제를 제조하기 위해 전세포를 사멸시키는 방법은 또한 널리 공지되어 있다. 따라서, 당해 문헌의 전반에 걸쳐 기재된 수포를 포함하는 조성물 및 백신은 본 발명의 동일한 고스트 및 사멸된 전세포 제제를 포함하는 동일한 조성물 또는 백신에 적용될 수 있을 것으로 고려된다.
본 발명의 조성물에 대한 혈청 살균 분석
혈청 살균 분석은 본 발명의 면역원성 조성물에 배합되는 경우 항원들간의 공동상승작용의 관계를 평가하는데 바람직한 방법이다.
당해 공동상승작용 반응은, 별도로 각각의 항원에 의해 유발된 SBA 보다 50% 이상, 2배, 3배, 바람직하게는 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 및 가장 바람직하게는 10배 이상으로 항원의 배합에 의해 유발되는 SBA를 특징으로 할 수 있다. 바람직하게 SBA는 항원이 유래된 동종 균주에 대해 및 바람직하게는 또한 이종 균주의 패널에 대해 측정된다(예를 들어, 대표적인 패널에 대해서 A-4 클러스터에 속하는 BZ10(B:2b:P1.2); ET-37 복합체에 속하는 B16B6(B:2a:P1.2) 및 H44/76(B:15:P1.7,16)를 참조한다). SBA는 수막구균 백신의 효능을 평가하기 위한 가장 일반적으로 승인된 면역학적 표식자이다[문헌참조: Perkins et al. J Infect Dis. 1998,177 : 683-691]. 임의의 공지된 방법에 의해 만족스런 SBA를 확인할 수 있다. SBA는 동물 모델 또는 사람 대상체로부터 수득된 혈청을 사용하여 수행될 수 있다.
사람 혈청을 사용하여 SBA를 수행하는 바람직한 방법은 하기와 같다. 혈액 샘플을 제1 백신 처리 전에 채취하고 제2 백신 처리 2개월 후 채취하고 제3 백신 처리 1개월 후 채취한다(1년에 3회의 백신 처리는 예를 들어, 0, 2개월 및 4월 또는 0, 1개월 및 6개월에 투여되는 전형적인 사람 1차 백신 처리 스케줄이다). 당해 사람 1차 백신 처리 스케줄은 1세 이하(예를 들어, Hib 백신 처리 수행함과 동시에) 또는 2 내지 4세 이하의 어린이에서 수행될 수 있거나 청소년은 또한 당해 1차 백신 처리 스케줄에 따라 SBA를 시험하기 위해 백신 처리될 수 있다. 추가의 혈액 샘플은 1차 백신 처리 6 내지 12개월 후 및 가능한 경우 부스터 투여 1개월 후 채취될 수 있다.
SBA는, (2 내지 4세 또는 청소년기에서 그러나 바람직하게는 1세의 어린이에서)(1차 백신 처리 스케줄의) 제3 백신 투여 1개월 후, SBA(항체 희석물) 역가(백신 처리 전 역가와 비교됨)의 관점에서 본 발명의 항원이 유래된 수막구균의 균주에 대해 4배 증가된 환자의 %가 30%, 바람직하게는 40%, 보다 바람직하게는 50% 및 가장 바람직하게는 60%를 초과하는 경우 동종 살균 활성을 갖는 항원 또는 수포 제제에 대해 만족스러울 것이다.
물론, 이종성 살균 활성을 갖는 항원 또는 수포 제제는 또한 이것이 유래된 수막구균 균주에 대해 만족스런 SBA를 유발할 수 있는 경우 동종 살균 활성을 갖는 수포 제제를 구성할 수 있다.
SBA는, (2 내지 4세 또는 청소년기에서 그러나 바람직하게는 1세의 어린이에서)(1차 백신 처리 스케줄의) 제3 백신 투여 1개월 후, SBA(항체 희석물) 역가(백신 처리 전 역가와 비교됨)의 관점에서 본 발명의 항원이 유래된 수막구균의 균주에 대해 4배 증가된 환자의 %가 20%, 바람직하게는 30%, 보다 바람직하게는 35% 및 가장 바람직하게는 40%를 초과하는 경우 동종 살균 활성을 갖는 항원 또는 수포 제제에 대해 만족스러울 것이다. 당해 시험은 이종성 살균 활성을 갖는 항원 또는 수포 제제가 다양한 수막구균 균주에 대해 교차 살균 항체를 유도할 수 있는지에 대한 우수한 지표가 된다. 3개의 이종성 균주는 바람직하게 서로 간에 또한 바람직하게는 이종 살균 활성을 갖는 항원 또는 수포 제제가 제조되거나 유래된 균주에 대해 상이한 전기영동적 유형(ET)-복합체 또는 다중좌위 서열 분류(MLST) 패턴(문헌참조: Maiden et al. PNAS USA 1998,95 : 3140-5)을 가져야만 한다. 당업자는 수막구균 중에서, 특히, 중대한 질환의 원인으로서 인지되고 인지된 MenB의 높은 치명적 계열을 대표하는 수막구균 B형 중에서 관찰되는 유전학적 다변성을 반영하는 상이한 ET 복합체를 갖는 3개의 균주를 용이하게 결정할 수 있다[문헌참조: Maiden et al(상기)]. 예를 들어, 사용될 수 있는 3개의 균주는 하기와 같다: A-4 클러스터에 속하는 BZ10(B:2b:P1.2); ET-37 복합체에 속하는 B16B6(B:2a:P1.2) 및 ET-5 복합체에 속하는 H44/76(B:15:P1.7, 16) 또는 동일한 ET/클러스터에 속하는 임의의 기타 균주. 예를 들어, ET-5 복합체에 속하는 수막구균 균주 CU385(B:4:P1.15)로부터 제조되거나 유래된 이종성 살균 활성을 갖는 항원 또는 수포 제제를 시험하기 위해 당해 균주들이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 샘플 균주는 계열 3 전염성 클론(예를 들어, NZ124[B:4:P1.7,4])으로부터 기원하는 것이다. 또 다른 ET-37 균주는 NGP165(B:2a:P1.2)이다.
SBA 활성을 측정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법은 실시예 10C(문헌참조: WO 99/09176)에 기재되어 있다. 일반적인 관점에서, 시험될 균주의 배양물은 대수 증식 단계에서 증식시킨다(바람직하게는 철 고갈 조건 하에-EDDA와 같은 철 킬레이터를 증식 배지에 첨가함에 의해). 이것을 BSA를 갖는 배지(0.3% BSA를 갖는 행크스 배지와 같이)에 현탁시켜 약 20000 CFU/ml로 조정된 작용성 세포 현탁액을 얻을 수 있다. 일련의 반응 혼합물은 시험될 일련의 2배 희석된 혈청(바람직하게는 56℃에서 30분동안 열 불활성화됨)[예를 들어, 50㎕/웰 용적에서] 및 시험될 20000 CFU/ml 수막구균 균주 현탁액[예를 들어, 25㎕/웰 용적에서]를 혼합하여 제조될 수 있다. 이 반응 용기는 배양(예를 들어, 15분동안 37℃)되고 진탕(예를 들어, 210rpm으로)되어야만 한다. 최종 반응 혼합물[예를 들어, 100㎕ 용적]은 추가로 보충 공급원[예를 들어, 예비 시험된 새끼 래빗 혈청 또는 사람 혈청학에 있어서 사람 혈청의 25% 최종 용적]을 함유하고 상기와 같이 배양[예를 들어, 37℃에서 60분동안]된다. 당해 분석을 위해 멸균 폴리스티렌 U자 바닥의 96-웰 미세역가 플레이트를 사용할 수 있다. 적정액(예를 들어, 10㎕]은 다중채널 피펫을 사용하여 각각의 웰에 첨가될 수 있고 뮤엘러-힌톤(Mueller-Hinton) 한천 플레이트(바람직하게, 1% 이소비탈렉스 및 1% 열 불활성화된 말 혈청을 포함함)로 적가하고 배양(예를 들어, 5% CO2하에 37℃에서 18시간동안)한다. 바람직하게, 각각의 콜로니를 적정액당 80CFU까지 계수할 수 있다. 하기의 3개의 시험 샘플을 대조군으로서 사용할 수 있다: 완충액 + 세균 + 보충물; 완충액 + 세균 + 불활성화된 보충물; 혈청 + 세균 + 불활성화된 보충물. SBA 역가는 데이터를 처리하여 회귀 계산법에 의해 50%의 세포 사멸에 상응하는 희석물을 측정하는 프로그램을 사용하여 직접 계산될 수 있다.
본원에 인용된 모든 참조문헌 또는 특허원은 본원에 참조로서 인용된다.
하기의 실시예는 당업자에게 널리 공지되고 통상적인 표준 기술을 사용하여 수행되고 단, 하기에 상세하게 기재된 경우는 제외한다. 당해 실시예는 설명을 위한 것이지 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
수막구균 B의 B 캡슐 폴리사카라이드 생산에 관여하는 단백질을 암호화하는 결실 유전자, PorA 유전자의 결실, 수막구균 수포의 표면상의 다양한 보호 외막 단백질의 상향 조절, 면역우성 단백질 또는 생합성 효소의 하향 조절 및 수포를 분리하기 위한 방법을 기재하는 예는 문헌[참조: WO 01/09350]에 기재되어 있다.
실시예 2: LOS: 주요 교차 보호 항원
잠재적인 교차 보호 항원으로서 LOS의 역할을 평가하기 위해, H44/76 야생형(WT) 수막구균 B 균주(L3 LOS를 발현) 및 "galE--형 LOS"(lgtE- LOS에서와 같이 단축된 구조를 갖는)를 발현하는 변형된 H44/76 균주를 사용하여 2개의 상이한 방법에 따른 수포를 생산한다. 제1 공정은 수포내 고수준의 LOS를 갖기 위해 0.1% DOC를 사용하였고 제2 공정은 수득한 수포내 저수준의 LOS를 갖기 위해 0.5%의 DOC를 사용하였다.
IM 경로를 통해 Al3+염(인산알루미늄)과 투여당 3D-MPL에 흡수된 수포 5㎍ 을 마우스에 3회(0일, 21일 및 28일째에) 주사하였다. 혈액 샘플은 세 번째 주사한지 14일 후에 채취하였다.
항-L3 LOS ELISA를 풀된 혈청에 대해 정제된 L3 LOS를 사용하여 수행하였다. 도 3A에서의 결과는 명백하게 0.1% DOC 방법이 마우스내에서 항-LOS 반응을 유발할 수 있는 수포를 생성시킴을 보여준다. 이것은 galE- LOS 및 L3 LOS가 항체의 생성을 유도할 수 있음을 입증한다. 한편 0.5% DOC는 이것이 수포 백신내 주요 항원으로 작용하기에 너무 많은 LOS를 추출시켰다.
혈청 살균 분석
SBA를 상이한 NmenB 균주를 사용한 각각의 혈청에 대해 수행하였다: 동종 균주 WT H44/76 균주, PorA(-) H44/76 균주 및 2개의 이종 균주(혈청 아형을 기준으로) Cu385 및 NZ124. 이들 4개의 균주는 L3 LOS를 발현한다. 다섯 번째 균주를 첨가하였다. H44/76과 비교하여, 당해 균주(B16B6)는 PorA 뿐만 아니라 LOS(이것은 면역유형 L2 균주이다)에 대해서 이종성이다.
도 3B의 결과는 DOC 0.1% WT 수포를 사용한 단지 L3 균주에 대한 교차 살균 반응을 나타낸다. 어떠한 교차 살균 반응도 DOC 0.1% galE- 수포 및 DOC 0.5% WT 수포에 대해 관찰되지 않는다. 추가로, PorA 항체에 의해 유도된 살균 반응은 혈청형에 의존한다는 것이 널리 공지되어 있다. 이것은 또한 DOC 0.5% WT 수포 또는 galE- 수포를 이용한 본 실험 및 또한 PorA(-) H44/76 균주를 가지고 수행된 SBA 데이터에서도 관찰된다.
모든 이들 결과는 높은 %의 L3 LOS를 함유하는 수포에 의해 유도된 교차 살균 반응은 LOS 항원에 대해 유도된 항체의 생산으로 인한 것임을 시사한다.
유일하게 L3 LOS(및 galE- LOS가 아님)만이 살균 항체의 생성을 유도할 수 있다. ELISA에서 우수한 항-LOS 반응이 DOC 0.1% galE- 수포에서 관찰되지만 이러한 반응은 생물학적으로 적절하지 않다(SBA 없음).
추가로, 또한 반응은, 항-L3 LOS 항체가 단지 L3 균주만을 사멸시키고 L2 균주를 사멸시키지는 않기 때문에 LOS 면역유형에 특이적인 것으로 나타나고 이는 최적의 백신은 최적의 보호를 위해 L3 및 L2 LOS를 함유하는 것이 이상적임을 지적한다.
방혈 실험
WT DOC 0.1% 수포에 의해 유도된 반응이 주로 항-LOS 항체 때문임을 입증하기 위해, 혈청 풀은 상이한 농도의 정제된 L3 LOS를 사용하여 방혈시킨다. 방혈 후, 동종 WT H44/76 균주에 대한 살균 분석에 혈청을 사용하였다.
DOC 0.1% WT 수포에 대해 유도된 혈청을 사용하여 수득된 결과(도 3C 참조)는 명백한 용량 범위 억제를 보여주고 이것은 당해 제제에 의해 유도된 항체의 대부분이 LOS에 대항하도록 지시되어 있음을 입증한다(PorA(-) H44/76 균주를 사용하여 수득한 SBA 결과를 확인시켜줌). 대조적으로, WT DOC 0.5%에 의해 유도된 반응은 PorA(-) H44/76 균주에 의해 수행된 SBA에 의해서 입증되고 또한 LOS 방혈에 의해 지적되는 바와 같이 LSO에 대항하도록 지시되어 있지 않다.
당해 결과는 L2 LOS에 대한 결과와 유사하다.
실시예 3: L3 및 중간체(lgtB-) DOC 부재 수포(무독화 되지 않은 LOS)로 유도된 교차 살균 항체를 사용한 실험
사용된 MC58 수막구균 유도체 균주는 B:P1.7.16, opc-, siaD-이다. 당해 균주는 유전학적으로 변형되어 L3(균주 2G2) 또는 중간체 에피토프(균주 2G EcoNlb-1, 2G2로서 그러나 추가로 lgtN-) 또는 단축 버젼의 LPS(lgtE_인 균주 C6)를 발현한다. OMV는 정상적인 높은(0.5%) DOC 공정 또는 DOC 부재 공정중 하나에 따라 제조된다.
마우스(그룹당 10마리)는 0, 20일 및 28일째에 근육내 경로에 의해 3회 면역화시켰다. 이들에게 Al(OH)3로 제형화된 수포 1 또는 10㎍(단백질 함량)을 투여하였다. 혈액 샘플은 28일 후(II 단계 후) 및 42일 후(III 단계 후)에 채취하였다.
살균 분석을 풀된 혈청상에서 외인성 보충물의 공급원으로서 새끼 래빗 혈청과 함께 동종 균주(MC58 및 H44/76) 및 2개의 이종 균주(M97250687 및 M9725078)를 사용하여 수행하였다.
하기의 표는 당해 결과(50% 사멸에 대한 살균 역가)를 요약한다.
항원 혈액 샘플 균주 및 혈청타입
MC58P1.7.16 H44/76TTP1.7.16 M97250687P1.19.15 M97252078P1.4
c6 no 10㎍ 1Mc6 no 10㎍ 1Mc6 no 1㎍ 1Mc6 no 1㎍ 1M II 단계후III 단계후II 단계후III 단계후 >25601353247411 >2560>2560620878 >2560>2560247748 9890<20<20
2g2 no doc 10㎍ 1M2g2 no doc 10㎍ 1M2g2 no doc 1㎍ 1M2g2 no doc 1㎍ 1M II 단계후III 단계후II 단계후III 단계후 >320>2560>2560>2560 >2560>2560>2560>2560 >2560>2560>2560>2560 >25601407119348
2gecoN1b-1 no doc 10㎍ 1M2gecoN1b-1 no doc 10㎍ 1M2gecoN1b-1 no doc 1㎍ 1M2gecoN1b-1 no doc 1㎍ 1M II 단계후III 단계후II 단계후III 단계후 >2560>256011512220 >2560>2560>2560>2560 >2560>256016961947 1162121322135
c6 10㎍ 1Mc6 10㎍ 1Mc6 1㎍ 1Mc6 1㎍ 1M II 단계후III 단계후II 단계후III 단계후 30818933NC(>20) 2481044324 34140063156 <20<20<20<20
2g2 doc 10㎍ 1M2g2 doc 10㎍ 1M2g2 doc 1㎍ 1M2g2 doc 1㎍ 1M II 단계후III 단계후II 단계후III 단계후 NC(>20)201275237 25<20<20<20 360647299/644728 <20<20<20<20
2gecoN1b-1 doc 10㎍ 1M2gecoN1b-1 doc 10㎍ 1M2gecoN1b-1 doc 1㎍ 1M2gecoN1b-1 doc 1㎍ 1M II 단계후III 단계후II 단계후III 단계후 573NC(>40)261348 3121NCNC 6851140118692 <20<20<20<20
명백하게, L3(2g2) 또는 중간체(2geconlb-1) 에피토프의 존재는 교차 살균 항체를 유도하는 반면 트렁케이팅된 LPS 균주(C6)로부터의 수포는 보다 낮은 수준의 교차 반응 항체를 유도한다. 이것은 특히 1㎍의 OMV가 주사되는 경우 설명된다.
더욱이, DOC로 정제된 OMV를 사용하여 나타나는 바와 같이, 수포의 LPS 함량감소는 교차 살균 항체의 유도를 감소시킨다. LPS가 증가된 것뿐만 아니라, DOC 부재 수포는 유리한 측면으로 지질단백질과 같은 OMV와 느슨하게 상호 작용하는 몇몇 단백질을 보유하는 것도 가능하다.
실시예 4: L3 LOS 및 외막 단백질의 내부 수포 가교 결합
사용되는 MenB 수포는 SiaD_(따라서, 캡슐 폴리사카라이드를 발현하지 않음) 및 PorA-인 H44/76 균주(LOS 면역유형 L3)로부터 유래하였다. 2개의 상이한 균주를 사용하였다. 전장 L3(균주 B1717, siad(-) PorA(-) 전체 L3) 및 트렁케이팅된 L3(균주 B1727, siad(-)PorA(-)lgtB(-)TrL3).
EDAC/NHS 접합 방법은 수포내 LOS 및 OMP를 가교결합시켜 LOS의 올리고사카라이드 성분에 T 의존성 항원을 부여하는 공지된 방법에 따라 사용하였다(EDAC/NHS는 여과성에 역효과를 나타낼정도 너무 높은 정도로 가교결합시키는 것으로 밝혀진 포름알데하이드 보다 바람직하다). EDAC는 카복실산과 반응하여 활성 에스테르 중간체를 생성시킨다. 아민 친핵체의 존재 하에, 아미드 결합은 이소우레아 부산물의 방출과 함께 형성된다. 그러나, EDAC 매개 반응의 효율은 설포-NHS 에스테르 중간체의 형성을 통해 증가될 수 있다. 설포-NHS 에스테르는 단독의 EDAC와 카복실레이트의 반응으로부터 형성된 활성 에스테르보다 오랫동안 수용액 중에 잔존한다. 따라서, 보다 높은 수율의 아미드 결합 형성은 당해 2단계 공정을 사용하여 실현될 수 있다. EDAC/NHS 접합은 문헌[참조: J. V. Staros, R. W. Wright and D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); and Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) pp173- 176]에서 논의된다.
당해 반응 혼합물은 3% 슈크로스 중에 1ml의 용적에서 1.5mg의 설포-NHS 및 5mg의 EDAC를 함유하였다. 수포는 0.025mg의 EDAC/ 1mg 수포의 비율로 존재하였다. 수포는 2mg/ml의 농도로 존재하였고 pH는 HCl 0.1N 또는 NaOH 0.1N을 사용하여 7.5로 조정하였다.
반응물은 실온에서 4시간동안 방치하였고 혼합물은 3% 슈크로스를 함유하는 2mM 인산 완충액(pH 7.5)에 대해 투석하였다. 이어서 혼합물은 스테리벡스(Sterivex) G10 0.22㎛상에 여과하였다. 99% 수율의 수포가 회수되었다.
반응은 항-L3 mAb를 사용하는 웨스턴 블롯상에서 수행될 수 있다. 반응을 통해, 저분자량의 LOS밴드는 보다 약해지고 새로운 고분자량의 밴드가 겔상에 나타난다. 이러한 고분자량의 밴드가 주요 성분으로서 나타나고 이는 PorB에 공유적으로 결합된 다수의 접합된 LOS를 나타내는 것으로 보인다.
EDAC는 이것이 LOS를 OMP로 비가역적으로 가교결합시키고 LOS를 T 의존성 면역원성으로 충분히 개선시키면서도 이를 너무 과중하게 가교결합시키지 않아 불량한 여과성, 응집 및 내부 수포 가교결합과 같은 문제가 발생하지 않는다. 생성된 수포의 형태는 비접합된 수포(전자 현미경으로 관찰된 바와 같이)의 형태와 유사하다. 추가로, 상기 프로토콜은 과중하게 높은 가교 결합의 발생을 회피하였다(수포의 표면상에 천연적으로 존재하는 보호 OMP, 예를 들어, TbpA의 면역원성을 감소시킬 수 있다).
실시예 5: L3 및 트렁케이팅된(중간체, lgtB-) L3은 트렁케이팅된(중간체 lgtB-; TrL3) L3 LOS를 인지하는 살균 항체를 유도할 수 있다.
OMV(수포)는 MenB 균주 H44/76 siaD- PorA-L3 또는 H44/76 siad- porA-TrL3으로부터 제조하였다. 2개의 상이한 추출법을 수행하였다. 사용되는 DOC %는 0.1 또는 0.5%였다. 2개의 상이한 보조제 제형을 또한 평가하였다: Al(OH)3 또는 알루미늄 + 3D-MPL. 마우스(OF1 암컷 마우스, 6 내지 8주, 그룹당 30마리)에 IM 경로(주사당 5㎍의 수포)로 3회(0일, 21일 및 28일) 주사하였다. SBA는 II 단계 후(28일) 및 III 단계 후(42일) 혈청(풀된 혈청 또는 각각의 혈청)상에서 수거하였다.
세포를 50% 사멸시키는 기하학적 평균 역가 및 풀된 혈청 역가는 0.5%의 DOC 추출과 비교되는 바와 같이 0.1% DOC로 추출된 수포에 의해 유도된 혈청의 경우에 높게 나타난다. 이것은 후자와 비교하여 전자의 수포에서 LOS가 2.5배 더 많은 경향이 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 전장 L3 LOS 또는 트렁케이팅된 L3 LOS를 함유하는 수포로 유도된 혈청의 SBA간에는 별다른 차이가 없다. 수포는 인산알루미늄 + 3D-MPL의 보조제를 함유하는 경우 수산화알루미늄과 비교하여 SBA가 증가한다.
혈청 방혈 실험을 또한 수행하였다. 혈청은 1mg/ml 정제된 L3 또는 trL3 LOS를 사용하여 방혈시킴에 이어서 SBA를 이들 방혈된 혈청에 대해 수행하였다. 당해 결과는, 살균성항체(항-L3 항체를 함유)가 거의 전반적으로 혈청의 trL3 LOS 전처리에 의해 고갈될 수 있고 살균성항체(항-trL3 항체를 함유)는 거의 전반적으로 혈청의 L3 LOS 전처리에 의해 고갈될 수 있음을 보여주었다. 항-L3 살균성항체는 따라서 trL3 LOS와 반응할 수 있고 항-trL3 살균성항체는 L3 LOS와 반응할 수 있다. 추가로, L3 및 trL3 LOS에 존재하는 LOS 구조에 대한 살균성항체의 특이성이 입증되었다.
결론적으로, 본 발명자는 TrL3 구조(OMV내)가 L3 균주에 대한 살균성항체의 생산을 유도할 수 있음을 입증하였다. 방혈 실험과 조합하여, 본 발명자는 TrL3 및 L3 LOS의 구조가 면역학적 분석을 토대로 매우 유사하고 trL3이 L3 균주를 사멸시킬 수 있는 항체를 생성하는데 사용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 6: TrL3은 온전한 L3 구조와 함께 자가면역의 잠재적인 문제를 해결한다.
L3 및 trL3 구조가 보호 항체의 관점에서 면역학적으로 매우 밀접하게 관련되어 있는 경우, L3( 및 L2)와 연관된(락토-N-네오테트라오스 잔기를 통해) 가능한 자가면역 문제와 관련하여 구조간에 어떠한 차이가 있을지 의심된다. 본 발명자는 냉각 애글루티닌(agglutinin)이 trL3 LOS를 인지할 수 있을지를 관찰하여 당해 문제점을 해결하였다.
MAb 1B2-1B7(문헌참조: J Bio Chem 256 (1981) 10967-10972; 및 ATCC 기탁번호 TIB-189)는 저온에서 사람 성인 적혈구 세포(RBC)를 응집시키고 LNnT(락토-N-네오테트라오스)와 반응하는 것으로 공지되어 있다. 이것은 전형적인 냉각된 애글루티닌이다.
당해 모노클로날 항체를, L3 수막구균 균주를 사멸시킬 수 있는 MabL3.7.9 모노클로날 항체와 연계하여 하기의 실험에서 사용하였다.
폴리-L-라이신(1㎍/ml, 37℃에서 2시간)으로 예비 피복에 이어서 정제된 L3 또는 정제된 TrL3 LOS(5㎍, 4℃에서 밤새)로 피복된 마이크로플레이트를 사용하여 당해 2개의 mAbs를 ELISA에 사용하였다. 이어서 당해 플레이트를 BSA(1%, 실온에서 30분)로 포화시켰다. 이후, 2개의 항체 각각을 사용하여 표준 ELISA를 수행하였다.
당해 결과(도 4)는 명백하게, Mab L379가 L3 및 TrL3과 반응하지만(도 4B) 1B2-1B7은 단지 L3 LOS에 대해서만 반응(도 4A)함을 보여준다. 따라서, 본 발명자는 TrL3이, LNnT 테트라사카라이드(예를 들어, L3 LOS 및 사람 적혈구 세포)를 함유하는 구조에 대해서 반응하는 냉각 애글루티닌에 의해 인지되지 않는다고 말할 수 있다.
따라서, TrL3 LOS는 보호 에피토프를 보유하기에 충분히 긴 반면 사람 자가면역과 관련된 에피토프를 상실하기에 충분히 짧다는 최적의 특징을 갖는다.
이것은 또한 본원에서 제안된 트렁케이팅된 L2(lgtB-) LOS 구조에 대해 그 경우에 해당하지 않는다고 제안할 이유는 없다.
실시예 7: B1820 DOC 0.1% 수포의 발열성/항원성에 대한 가교결합의 영향력
수포(상향 조절된 siaD(-)PorA(-)FrpB(-) 트렁케이팅된 Hsf, 데스페랄의 존재 하에 배양된 lgtB(-) 돌연변이 균주를 통해 트렁케이팅된 L3와 함께 H44/76으로부터 유래된 균주 B1820 기원; 수포는 DOC 0.1%로 추출됨)를 상이한 농도의 EDAC(보다 많은 EDAC가 존재할수록 수포는 보다 많이 가교결합된다.)를 사용하여 가교결합시켰다. 가교결합은 수포의 멸균 여과에 의해 나타낸 바와 같이 내부 수포이다.
수포내 LOS 함량은 표준물로서 정제된 Nmen L3 LOS를 사용하는 SDS-PAGE 전기영동 후 은 염색에 의해 측정되는 바와 같이 18%였다[문헌참조: Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14: 25-33]. 일반적으로, 0.1% DOC로 추출된 수포내 LOS 함량은 약 20%의 LOS이고 0.2% DOC의 경우에는 약 15% LOS이고 0.3% DOC의 경우에는 약 10% LOS이고 0.5% DOC의 경우에는 약 5% LOS이다. 일반적으로, 10% 이상의 비접합된 LOS를 포함하는 수포는 허용되지 않을 정도로 발열성이다.
래빗에서의 발열성
2개의 제제를 시험하였고(수포가 Al(OH)3 또는 AlPO4상에 흡착됨) 유럽 약전에 기재된 바와 같이 발열성 시험에서 IV 경로를 통해 500ng/kg을 래빗에 투여하였다.
하기의 표에서 당해 결과는 명백하게 수포의 발열성에 대한 내부 수포 가교결합의 영향력에 대해 양성임을 보여준다. 동일한 배치의 수포는 대조군으로서 사용되거나 상이한 EDAC 농도를 사용하여 가교결합 되었다. 수포 보다 많이 가교결합될 수록(보다 많은 EDAC) 이들은 덜 발열성이다. 이것은 2개의 상이한 제형에서 관찰되었다.
처리 제형
Al(OH)3 AlPO4 제형 둘 다$
가교결합되지 않음 3.1* 2.8 5.9
EDAC 0.05￡ 2.7 2.2 4.9
EDAC 0.2 1.7 1.7 3.4
EDAC 1 1.5 1.4 2.9
￡EDAC 농도: 수포 mg당 EDAC mg
* 각각의 온도(℃)의 합은 증가한다(그룹당 3마리의 래빗)
$ 6마리의 래빗의 합(Al(OH)3 그룹으로부터 3마리 및 AlPO4 그룹으로부터 3마리)
가교결합된 수포의 항원성
상기 수포(비-흡수됨)의 항원성은 가교결합이 수포의 항원성에 어떠한 영향력을 부여하는지를 결정하여 평가하였다. 수포의 상이한 제제(가교결합되거나 가교결합 되지않음)를 미세플레이트상에 피복하였다(10㎍/ml, 4℃에서 밤새). 세척 및 포화시킨 후, MAb L379의 일련의 희석액 또는 B1820 DOC 0.1 또는 0.5%로 면역화된 마우스 기원의 혈청을 플레이트에 첨가하였다(진탕으로 실온에서 20분동안). 비오틴에 커플링된 항-마우스 Ig에 이어서 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체를 사용하고 이어서 OPD 및 H2O2로 노출시켜 항체를 피복된 수포상에 고정화시켰다. 각각의 미세 웰의 밀도는 미세역가 판독기를 사용하여 측정하였다.
당해 결과는 MAb L379(L3 LOS에 대항하도록 지시되었지만 또한 TrL3 LOS(lgtB- 돌연변이)과 반응할 수 있고 L3 균주에 대해 살균성임)는 비처리된(비접합된) B1820 수포 및 상이하게 가교결합된 수포(사용된 EDAC의 농도에 상관없이)를 동등하게 인지한다. 도 5A를 참조한다. EDAC 0.2 및 1을 사용하여 수득된 보다 높은 반응은 수포내에서 보다 우수한 LOS의 접착을 반영하거나 당해 EDAC 농도에서 가교결합된 수포내 LOS의 적어도 보다 우수한 안정성을 반영할 수 있다.
마우스 혈청을 또한 사용하여 이들 수포의 항원성을 평가하였다. 2개의 상이한 혈청을 사용하였다. 첫 번째 혈청은 B1820 DOC 0.5% 수포를 사용하여 면역화된 마우스로부터 수득하였다(LOS의 함량이 8% 이하의 저함량인 수포는 주로 항-단백질 항체를 유도한다). 두 번째 혈청은 B1820 DOC 0.1% 수포로 면역화된 마우스로부터 수득하였다(LOS의 함량이 15% 이상인 수포는 주로 LOS에 대해 지시된 교차 살균성항체를 유도한다). L379 MAb를 사용하여 관찰된 바와 같이, 이들 2개의 혈청(각각 도 5B 및 도 5C)을 사용하여 수득한 결과는 비처리된(비접합된) 수포 및 가교결합된 수포(사용되는 EDAC의 농도에 상관없이) 사이에 어떠한 차이를 나타내지 않았다.
결론적으로, LOS의 항원성은 가교결합에 의해 영향 받지 않고 수포의 "포괄적인" 항원성은 또한 EDAC 처리에 의해 변형되지 않는 것으로 나타난다. 마우스에서 면역원성 실험은 가교 결합(고농도의 EDAC를 사용함)은 주요 보호 항원의 면역원성을 파괴하지 않음을 확인시켜 준다. 그럼에도 불구하고, 예비 결과(실시예 8)는 가교결합이 DOC 0.5%상의 EDAC 0.025로 수행된 경우 추출된 수포는 EDAC 처리 후 수포의 면역원성이 증가되었음을 보여준다.
실시예 8: 가교결합된 수포의 면역원성(EDAC 0.025mg 화학 처리)
본 실험에서, 수포는 B1727 균주로부터 제조하였다. 당해 균주는 유전학적으로 변형된 H44/76 균주이고 상향 조절된 siaD(-)PorA(-)trL3(lgtB-)Hsf+TbpA이다. 수포는 0.5% DOC를 사용하여 추출하였다. 마우스는 IM 경로로 3회(0일, 21일 및 28일) 면역화시켰다. 주사 마다 이들에게 Al(OH)3 흡수된 수포 5㎍을 주사하였다.
혈청 살균 분석은 세 번째 주사 14일 후 채취한 각각 혈청에 대한 H44/76 균주에 대해 수행하였다. 당해 결과는 다수의 응답체(100 초과의 SBA 역가를 갖는 마우스는 없음)에 대한 EDAC 처리의 영향력이 양성임을 보여준다: 응답체의 37%는 EDAC 처리된 수포에 대한 것이고 비변형된 수포에 대해서는 단지 17% 였다.
제형 중에 3D-MPL의 부재 및 0.5% DOC 추출 후 수포 제제중의 비교적 낮은 %의 LOS(약 5%)는 반응이 낮은 이유를 설명한다.
마우스 B1727 SiaD(-) PorA(-) TrL3 TbpA-Hsf 가교결합 "EDAC" 수포 B1727 SiaD(-) PorA(-)TrL3 TbpA-Hsf비처리
GMT풀상의 SBA 52249 2760
응답체 11/30 5/30
가교결합이 당해 단백질의 면역원성에 영향력을 주는지의 여부를 결정하기 위해 항-Hsf ELISA를 또한 수행하였다. 풀된 혈청상에서 수득된 당해 결과는 가교결합이 IgG 항-Hsf 반응에 대해 어떠한 영향력을 나타내지 않음을 지적한다. 어떠한 IgM도 검출되지 않았다.
항-Hsf ELISA
IgM IgG
B1727 Siad(-)PorA(-)Tbp-A-Hsf TrL3가교 결합 EDAC 50 18140
B1727 Siad(-) PorA(-)TbpA-HsfTrL3 50 15627
네가티브 대조군 50 50
실시예 9: TrL3 LOS 데이터
하기의 실험을 평가하였다:
- LNnT(락토-N-네오테트라오스)와 반응할 수 있는 항체의 유도에 대한 TrL3(lgtB(-)L3 LOS)의 영향;
- 당해 작제물의 살균 항체의 유도.
수포를 2개의 유전학적으로 변형된 H44/76 균주로부터 제조하였다. 둘 다는 siaD() PorA(-)이지만 하나는 WT L3 LOS를 생산하고 다른 하나는 TrL3 LOS(lgtB(-))를 생산하였다. 이들 수포는 LOS 고함량(DOC 0.1% 추출을 사용하여 약 18%) 또는 LOS 저함량(DOC 0.5% 추출을 사용하여 5%에 근접하는)을 갖도록 하기 위해 2개의 상이한 방법에 따라 제조하였다.
3D-MPL의 존재 또는 부재 하에 Al(OH)3상에 흡수된 수포 5㎍을 IM 경로를 통해 마우스를 3회(0일, 21일 및 28일) 면역화시켰다.
항-LNnT ELISA
방법: 미세플레이트를 스페이서(ADH)를 통해 사람 혈청 알부민과 접합된 LNnT로 피복하였다(PBS중 ml당 접합체 5㎍, 미세웰당 100㎕). 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고 PBS-BSA 1%(실온에서 40분)로 포화시켰다. 세척 후, PBS-0.2% BSA-0.05%로 연속 희석된 트윈 20을 첨가하였다(실온에서 30분). 항-마우스 IgG를 퍼옥시다제에 커플링시킴에 이어서 OPDA 및 H2O2와 인큐베이션함에 의해 IgG의 LNnT로의 고정을 확인하였다.
결과: 포지티브 대조군은 1B2-1B7 MAb이다. 당해 MAb는 LNnT 및 L3LOS와 반응하지만 TrL3 LOS와는 반응하지 않고(이전의 실시예 참조) 이것은 사람 적혈구 세포를 응집시킨다. 네가티브 대조군(-)은 보조제 단독으로 면역화된 마우스 기원의 혈청이다.
당해 결과(도 6)는 LOS 함량이 높은 L3 수포(DOC 0.1%)만이 LNnT와 반응할 수 있는 IgG의 생산을 유도함을 명백하게 보여준다. LOS 함량이 유사한 TrL3 수포는 2개의 수포 제제가 낮은 양의 LOS(DOC 0.5%)를 함유하지 않음으로써 LNnT에 대해 지시된 IgG의 생산을 유도하지 않는다.
H44/76 균주에 대한 SBA
H44/76 균주에 대한 SBA 분석은 세 번째 주사 14일 후에 채취한 각각의 혈청에 대해 수행하였다. 당해 결과는 trL3(lgtB(-)) LOS 수포가 L3 LOS와 유사한 수준의 살균 항체를 유도함을 하기에 명백하게 보여준다(GMT를 참조하고 또한 1/100 초과의 SBA 역가를 갖는 마우스의 수(=SC)).
제형 L3 수포 DOC DOC 0.5% 0.1% TrL3 수포 DOC DOC 0.5% 0.1%
Al(OH)3+MPL GMTSC 331 412519/30 29/30 1029 320427/30 30/30
Al(OH)3 GMTSC 169 202914/30 29/30 138 82813/30 30/30
실시예 10: FrpB 녹-아웃
하기의 데이터는 2개의 임상전 실험에 대한 요약이다.
이들 실험에서, 2개의 유전학적으로 변형된 H44/76 균주를 사용하여 0.1% DOC를 사용한 수포를 제조하였다. 당해 방법에 의해 수득된 수포는 20%에 근접한 LOS 함량을 갖는다.
2개의 H44/76 균주는 하기와 같다:
-B1733: siaD(-)PorA(-)Tr(절단됨) Hsf 상향 조절된 lgtB(-)
-B1820: siaD(-) PorA(-) TrHsf 상향 조절된 lgtB(-) FrpB(-)
데스페랄의 존재 하에 균주를 증식시켜 철 의존성 단백질, 예를 들어, LbpA/B, TbpA/B, FrbB(B1733에서)등을 상향 조절하여 수포를 제조하였다.
이들 상이한 수포 제제는 Al(OH)3상에 흡수시키고 IM 경로로 마우스에 3주 간격으로 2회 주사하였다. 혈액 샘플을 제2 투여한지 7일 후 채취하였다. 마우스에 수포 5㎍을 주사하였다.
SBA 결과
살균 분석은 3개의 L3 균주(동종 야생형 균주 H44/76 및 2개의 이종 L3 균주: NZ124 및 M97250687)상에서 수행하였다. 당해 결과는 명백하게, FrpB(-)(녹-아웃)(B1820) 수포가 FrpB(+) 수포(B1733) 보다 우수한 이종 교차 살균 반응(고 역가 및 우수한 혈청 전환 SC)을 유도한다. FrpB 결실에 의해 저하되지만 동종 반응은 여전히 만족스럽다.
이들 데이터는 FrpB가 수포에 의해 유발된 면역 반응에서 주요 구동체이지만 이러한 외막 단백질은 고도로 가변성이기 때문에 이러한 단백질에 대해 지시된 항체는 동종 균주의 사멸을 유도할 수 있을 뿐임을 시사한다. 수포 생산 균주내 FrpB의 결실은 따라서 제조된 수포 백신의 적용범위를 개선시키는 유리한 수단이다.
수포 H44/76GMT SC M97250687GMT SC NZ124GMT SC
B1733B1820 1518 30/30781 19/30 151 11/301316 24/30 70 4/29276 19/30
실시예 11: 수포의 발열성에 대한 msbB(lpxL1) 돌연변이의 영향력
2개의 NmenB 균주를 본 평가를 위해 사용하였다:
-galE(-)(따라서 캡슐 폴리사카라이드를 제조할 수 없음)인 대조군 균주
-msbB 돌연변이 균주: galE(-) 및 msbB(-)
OMV(수포) 내 15% 이상의 LOS 함량을 갖도록 0.1% DOC를 사용하여 이들 2개의 균주로부터 수포를 제조하였다. 이전의 실시예에서 기재한 바와 같이, LOS 함량이 10% 초과인 수포 제제는 발열성 관점에서 만족스럽지 못하고 유럽 약전의 래빗 발열성 분석에 실패한다.
상기 수포는 래빗에서 발열성 분석(IV 경로로 주사된 kg당 수포 500ng)을 위해 Al(OH)3(50㎍의 OMV/500㎍의 Al3 + 염)에 대해 제형화하였다.
하기의 결과는 명백하게, msbB이 결실(특히, 캡슐 폴리사카라이드를 제조할 수 없는 균주)됨으로써 심지어 LOS 함량이 15%를 초과해도 래빗에서 비발열성인 수포가 제조될 수 있음을 입증한다.
수포 희석 각각의 t°증가(℃) t°의 합 결론
대조군 DOC0.1% 0.5㎍/kg 0.7 - 1.4 - 1.2 3.3 실패
msbB(-)DOC 0.1% 0.5㎍/kg 0.1 - 0.2 - 0.2 0.5 성공
유럽 약전 규정
- 각각의 t°의 합이 1.15℃ 미만인 경우 "성공"
- 각각의 t°의 합이 1.15℃ 내지 2.65℃인 경우 "반복되지 않는 경우의 실패"
- 각각의 t°의 합이 2.65℃ 초과인 경우 "실패"
결론:
lgtB(-) 및 msbB(-) 돌연변이를 갖고 보다 낮은(예를 들어, 0.1%) 데옥시콜레이트 농도로 추출된 수막구균 균주로부터 유래된 L3 및 L2 수포를 포함하는 조성물은 수막구균 B에 대해 효과적이고 안전한 백신을 위한 강력한 바탕을 제공한다. 수포 생산 균주는 이상적으로 캡슐 폴리사카라이드 합성 결핍이고 수포는 외막 단백질에 가교결합된 내부 수포인 LOS를 갖는다. PorA(-) 및 FrpB(-)중 하나 또는 둘 다는 Hsf 및/또는 TbpA 항원이 상향 조절됨으로써 추가로 교차 살균 효능을 개선시키는데 도움이된다.

Claims (52)

  1. L2 LOS 면역유형을 갖는 나이세리아(Neisseria) 균주 또는 L3 LOS 면역유형을 갖는 나이세리아 균주(여기서 각각의 균주는 lgtB-이다)로부터 유래하거나 L2 LOS 면역유형을 갖는 나이세리아 균주 및 L3 LOS 면역유형을 갖는 나이세리아 균주(여기서, 임의로 각각의 균주는 lgtB-이다)로부터 유래된 수포 배합물을 포함하는 나이세리아 수포 제제.
  2. 제1항에 있어서, 나이세리아 균주가 수막구균, 바람직하게는 혈청군 B인 나이세리아 수포 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 나이세리아 균주가 캡슐 폴리사카라이드를 합성할 수 없는 나이세리아 수포 제제.
  4. 제3항에 있어서, 나이세리아 균주(들)가, 이들이 유래된 천연 균주와 비교하여 ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA, synB, synC, 바람직하게는, siaD의 캡슐 폴리사카라이드 유전자들중 하나의 발현이 하향 조절되고, 바람직하게는 결실되어 있고, L2 및 L3 수포 둘 다가 존재하는 경우, 이들이 유래하는 균주가 바람직하게 각각의 균주에서 동일한 캡슐 폴리사카라이드 유전자의 발현이 하향 조절된 나이세리아 수포 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 나이세리아 균주(들)가, 이들이 유래된 천연 균주와 비교하여 msbB 또는 htrB의 지질 A 유전자들중 하나(바람직하게는 전자) 또는 둘 다의 발현이 하향 조절되고, 바람직하게는 결실되어 있고, L2 및 L3 수포 둘 다가 존재하는 경우, 이들이 유래하는 균주가 바람직하게 각각의 균주에서 동일한 지질 A 유전자(들)의 발현이 하향 조절된 나이세리아 수포 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 나이세리아 균주(들)가, 이들이 유래된 천연 균주와 비교하여 porA, porB, opA, opC, pilC 또는 frpB의 외막 단백질 유전자들중 하나 이상의 발현이 하향 조절되고, 바람직하게는 결실되어 있고, L2 및 L3 수포 둘 다가 존재하는 경우, 이들이 유래하는 균주가 바람직하게 각각의 균주에서 동일한 외막 단백질 유전자(들)의 발현이 하향 조절된 나이세리아 수포 제제.
  7. 제6항에 있어서, 나이세리아 균주(들)가, 이들이 유래된 천연 균주와 비교하여 PorA와 OpA, PorA와 OpC, OpA와 OpC, PorA와 OpA와 OpC, PorA와 FrpB, OpC와 FrpB, OpA와 FrpB, PorA와 OpA 및 OpC와 FrpB의 외막 단백질 유전자들의 임의의 조합물중 어느 하나의 발현이 하향 조절되고 바람직하게는 결실되어 있는 나이세리아 수포 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 나이세리아 균주(들)가, NspA, 저분자량의 TbpA, 고분자량의 TbpA, Hsf, Hap, OMP85, PilQ, NadA, LbpA, MltA의 외막 단백질 항원중 하나 이상의 발현이 상향 조절되고, L2 및 L3 수포 둘 다가 존재하는 경우, 이들이 유래하는 균주가 바람직하게 각각의 균주에서 하나 이상의 상이한 외막 단백질 항원의 발현이 상향 조절된 나이세리아 수포 제제.
  9. 천연 균주와 비교하여 PorA, PorB, OpA, OpC, PILC 또는 FrpB의 외막 단백질중 2개 이상의 발현이 하향 조절되고 바람직하게는 결실되어 있는 나이세리아 수포 제제.
  10. 제9항에 있어서, 나이세리아 균주(들)가, 이들이 유래된 천연 균주와 비교하여 PorA와 OpA, PorA와 OpC, OpA와 OpC, PorA와 OpA와 OpC, PorA와 FrpB, OpC와 FrpB, OpA와 FrpB, PorA와 OpA 및 OpC와 FrpB의 외막 단백질 유전자들의 임의의 조합물중 어느 하나의 발현이 하향 조절되고 바람직하게는 결실되어 있는 나이세리아 수포 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 나이세리아 수포 제제가 유래된 나이세리아 균주(들).
  12. 면역유형 L2 및/또는 L3 LOS를 포함하는 제11항에 따른 나이세리아 균주로부터 분리된 LOS 제제.
  13. 제12항에 있어서, 리포좀 제형의 LOS 제제.
  14. 함유된 LOS가 T 헬퍼 에피토프 공급원, 바람직하게는 단백질 또는 외막 단백질에 접합된, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 나이세리아 수포 제제 또는 제12항 또는 제13항에 따른 LOS 제제.
  15. 제14항에 있어서, 내부 수포 가교 결합의 방법을 통해 수득할 수 있는 나이세리아 수포 제제.
  16. 제1항 내지 제10항 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 나이세리아 수포 제제 또는 LOS 제제 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역학적 조성물 또는 백신.
  17. 제16항에 있어서, 보조제, 바람직하게는 수산화알루미늄 또는 3D-MPL 및 인산알루미늄을 추가로 포함하는 백신.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 수막구균 혈청군 A, 수막구균 혈청군 C, 수막구균 혈청군 W-135, 수막구균 혈청군 Y 및 에이취, 인플루엔자(H. influenzae) b형의 균주로부터 유래된 하나 이상의 접합된 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 추가로 포함하는 백신.
  19. 제11항에 따른 나이세리아 균주(들)를 배양하는 단계, 이로부터 수포를 분리하는 단계, 임의로 적절한 경우 L2 및 L3 수포를 배합하는 단계 및 수포를 약제학적으로 허용되는 부형제와 제형화하는 단계를 포함하는, 제16항에 따른 나이세리아 수포 제제 백신을 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 분리 단계가 0-0.5, 0.02-0.4, 0.04-0.3, 0.06-0.2, 또는 0.08-0.15%의 데옥시콜레이트, 바람직하게는 약 또는 정확하게 0.1%의 데옥시콜레이트로 추출함에 의해 수행되는 방법.
  21. LOS와 접합된 외막 단백질이 통합된 외막에서 그람 음성 세균 균주 기원의 수포 제제.
  22. 제21항에 있어서, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상의 접합된 LOS가 수포의 외막 및/또는 특정 환경에서 통합된 지질 A 잔기를 가져 이의 독성이 감소되거나 투여된 숙주로부터 보호되는 수포 제제.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 수포내 LOS의 독성이 동일양의 비접합된 LOS를 갖는 수포와 비교하여 감소된 수포 제제.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상의 접합된 LOS가, 숙주의 면역계에 투여되는 경우 이에 대한 살균 항체 반응을 유도하는데 적합한 천연 형태로 존재하는 수포 제제.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 접합된 LOS가 비접합된 LOS에 대해 반응하는 숙주에서 면역 반응을 유발하는데 적합한 형태를 갖는 수포 제제.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 외막 단백질이 LOS 분자의 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드 잔기에 접합되어 있는 수포 제제.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 외막 단백질 및 LOS 분자가 수포가 유래하는 그람 음성 세균 균주의 천연 형태인 수포 제제.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 수포 가교 결합 방법에 의해 수득가능한 수포 제제.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 수포내에 존재하는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상의 LOS가 외막 단백질에 가교결합되거나 접합된 수포 제제.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐 폴리사카라이드를 생산하지 않는 그람 음성 균주로부터 유래하거나 캡슐 폴리사카라이드를 포함하지 않는 수포 제제로부터 유래하는 수포 제제.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐 폴리사카라이드가 수포 제제 중에 통합된 외막 단백질에 접합되어 있지 않은 수포 제제.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 또는 분류될 수 없는 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 균주로부터 유래하는 수포 제제.
  33. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 나이세리아 균주, 바람직하게는 나이세리아 메닌기티스(Neisseria meningitis)로부터 유래된 수포 제제.
  34. 제33항에 있어서, 접합된 L2 LOS, 접합된 L3 LOS, 또는 접합된 L2와 바람직하게는 2개 이상의 상이한 수포에 별도로 접합된 L3 LOS의 혼합물을 포함하는 수포 제제.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, lgtB- 균주로부터 유래하거나, LOS가 lgtB-인 균주로부터 유래된 것과 일치된 트렁케이팅된 구조를 갖는 수포 제제.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, htrB- 및/또는 msbB_ 균주로부터 유래하거나, LOS 지질 A 잔기가 htrB- 및/또는 msbB_ 수막구균 균주로부터 분리된 것과 일치된 2급 아실 쇄가 결실된 수포 제제.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 수포 제제 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역학적 조성물 또는 백신.
  38. 제37항에 있어서, 보조제, 바람직하게는 수산화알루미늄 또는 3D-MPL 및 인산알루미늄을 추가로 포함하는 면역학적 조성물 또는 백신.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 수막구균 혈청군 A, 수막구균 혈청군 C, 수막구균 혈청군 W-135, 수막구균 혈청군 Y 및 에이취, 인플루엔자 b형의 균주로부터 유래된 하나 이상의 접합된 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 추가로 포함하는 면역학적 조성물 또는 백신.
  40. a) 그람 음성 균주로부터 수포를 분리하는 단계,
    b) 수포내에 존재하는 LOS의 올리고사카라이드 잔기를 동일한 수포상에 존재하는 외막 단백질에 접합시키는데 적합한 화학적 처리를 수행하는 단계,
    c) 내부 수포 접합된 수포 제제를 분리하는 단계 및
    d) 임의로, 내부 수포 접합된 수포 제제를, 동일한 방법에 의해 제조되지만 상이한 LOS 면역유형을 갖는 추가의 내부 수포 접합된 수포 제제와 제형화하고/하거나 수포 제제를 약제학적으로 허용되는 부형제와 제형화하여 백신 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, LOS 접합된 외막 단백질이 외막에서 통합된 그람 음성 세균 균주로부터 내부 수포 접합된 수포 제제를 제조하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 단계 a)에서 수포가 0 내지 0.3%, 바람직하게는 약 또는 정확하게 0.1%와 같은 저농도의 데옥시콜레이트를 사용하여 추출되는 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 단계 b)에서 pH가 7 내지 9, 바람직하게는 약 pH 7.5인 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 1 내지 5%의 슈크로스, 바람직하게는 약 3%의 슈크로스에서 수행되는 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 저농도의 NaCl 조건에서 수행되는 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 EDAC/NHS 화학 처리로 수행되는 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 수포가 나이세리아 균주, 바람직하게는 수막구균 균주, 가장 바람직하게는 수막구균 B 균주로부터 분리되는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 균주가 캡슐 폴리사카라이드를 제조할 수 없고 바람직하게 siaD- 돌연변이인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 균주가 lgtB- 돌연변이인 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 균주가 msbB_ 및/또는 htrB-인 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 균주가 L2 LOS 면역유형을 갖는 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 균주가 L3 LOS 면역유형을 갖는 방법.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 제50항에 따른 방법에 의해 제조된 L2 면역유형을 갖는 수막구균 내부 수포 접합된 수포 제제가 제51항에 따른 방법에 의해 제조된 L3 면역유형을 갖는 추가의 수막구균 내부 수포 접합된 수포 제제와 배합되는 방법.
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