CN101142230A - 耶尔森氏菌属物种的多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可从耶尔森氏菌属物种中分离的分离的多肽。本发明还提供了包括一种或多种所述多肽的组合物，和制备所述多肽的方法以及使用所述多肽的方法。

Description

耶尔森氏菌属物种的多肽及其使用方法
继续申请数据
本申请要求于2005年1月21日提交的美国临时申请序列号60/646,106的利益，所述临时申请引入本文作为参考。
背景
存在3种对人类致病的耶尔森氏菌属物种：鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)和小结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。鼠疫耶尔森氏菌是鼠疫的病原体，而假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性致病血清型引起胃肠病。耶尔森氏菌属的其他物种，包括罗氏耶尔森氏菌(Y.rohdei)、阿氏耶尔森氏菌(Y.aldovae)、伯氏耶尔森氏菌(Y.bercovieri)、弗氏耶尔森氏菌(Y.frederiksenii)、中间耶尔森氏菌(Y.intermedia)、克氏耶尔森氏菌(Y.kristensenii)和莫氏耶尔森氏菌(Y.moolaretti)，被视为小肠结肠炎样机会致病菌，其能够在易感的个体中引起腹泻病(Agbonlahor，J Clin Microbiol，23，891-6，(1986)，Cafferkey，等人，J Hosp Infect，24，109-15，(1993)，Loftus，等人，Dig Dis Sci，47，2805-10，(2002))。耶尔森氏菌还可感染其他动物物种，从而引起各种病。大多数野生和家养的哺乳动物物种易于感染肠病原体小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌，尽管大多数这些感染是亚临床的，并且此类动物通常只充当病原体用于传播给人类的无症状携带者(Fantasia，等人，J Clin Microbiol，22，314-5，(1985)，Fantasia，等人，Vet Rec，132，532-4，(1993)，Fukushima，等人，J ClinMicrobiol，18，981-2，(1983)，Kageyama，等人，J Med Primatol，31，129-35，(2002)，Kato，等人，Appl Environ Microbiol，49，198-200，(1985)，Poelma，等人，Acta Zool Pathol Antverp，3-9，(1977)，Shayegani，等人，Appl Environ Microbiol，52，420-4，(1986)，Yanagawa，等人，Microbiol Immunol，22，643-6，(1978))。然而，有报道肠致病性耶尔森氏菌已与家养动物例如绵羊、牛、山羊、猪、狗、鸟和饲养的鹿中的腹泻病和全身不适相关(Jerrett，I.V，等人AustVet J，67，212-4，(1990)，Slee，K.J.，等人，Aust Vet J，65，271-5，(1988)，Slee，K.J.和C.Button，Aust Vet J，67，396-8，(1990)，Slee，K.J.和C.Button，Aust Vet J，67，320-2，(1990)，Zheng，X.B.，J Appl Bacteriol，62，521-5，(1987))。鼠疫耶尔森氏菌可以引起各种啮齿类动物物种以及非人灵长类中的疾病(Davis，K.J.，等人，Arch Pathol Lab Med，120，156-63，(1996)，Meyer，K.F.，等人，J Infect Dis，129，Suppl：S85-12，(1974)。鼠疫耶尔森氏菌还与家猫中潜在的严重感染相关(Gasper，P.W.，等人，J MedEntomol，30，20-6，(1993))，并且已报道了在狗中感染鼠疫耶尔森氏菌的少数病例(Orloski，K.A.和M.Eidson，J Am Vet Med Assoc，207，316-8，(1995))。此外，鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)是鱼的病原体，从而引起鲑科鱼(salmonid)中的红口病(redmouthdisease)(Furones，M.D.，等人，Ann.Rev.Fish Dis.，3，105-125，(1993))。
鼠疫无疑是人类有记录的历史上最具破坏性的急性传染病之一，估计已杀死全世界1亿-2亿人(Perry，R.D.和J.D.Fetherston，ClinMicrobiol Rev，10，35-66，(1997))。近年来，鼠疫爆发在美国和其他工业国家中已相对罕见，尽管地方性疫源地存在于除澳大利亚外的所有洲。世界性的调查表明最近几年中每年报道了2000-5000个鼠疫病例，尽管流行病学家怀疑许多人类鼠疫病例未被报道。假结核耶尔森氏菌爆发相当罕见，并且主要在芬兰、日本和前苏联发生(Inoue，M.，等人，Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg[B]，186，504-511，(1988)，Nuorti，J.P.，等人，J Infect Dis，189，766-774，(2004)，Rodina，L.V.，等人，Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，116-118，(1998)，Toyokawa，Y.，等人，Kansenshogaku Zasshi，67，36-44，(1993))。大多数假结核耶尔森氏菌感染假定通过口-粪传播途径进行传播；然而，许多病例中的传播载体仍未被鉴别。在美国，小肠结肠炎耶尔森氏菌感染比假结核耶尔森氏菌感染更常见，并且一般与被污染的猪肉产品消费相关(Ray，S.M.，等人，Clin Infect Dis，38 Suppl3，S181-189，(2004))。在美国由小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的人类疾病的发病率难以确定，这仅仅是因为与这种生物相关的感染一般是自限性的并且不充足的检测技术已限制了正确诊断病原体的能力。然而，FoodNet的1996-1999监视估计在美国有大约1例小肠结肠炎耶尔森氏菌感染/100,000(Ray，S.M.，等人，Clin Infect Dis，38 Suppl3，S181-189，(2004))。
鼠疫是具有地方性动物病和动物流行病性传播组分的动物和人的传染病。最天然发生的传播方式是从感染的啮齿类动物宿主到跳蚤，所述跳蚤充当传播到人类的天然载体。然而，人到人的传播还可通过直接接触或被污染的飞沫的呼吸吸入(肺形式)而发生。然而，在天然感染中，鼠疫耶尔森氏菌一般通过皮下途径进入血流而进入人中，在血流中它们运送至淋巴结并开始增殖。鼠疫的临床表现包括靠近淋巴结的大肿胀块，称为腹股沟淋巴结炎。偶然地，鼠疫耶尔森氏菌在血流中快速增殖，从而引起伴随全身不适包括发烧、头痛、寒战和偶尔的胃肠紊乱的败血病。这些症状在早期常被误诊，并且抗生素疗法因此可能太迟施用而不能有效干预。鼠疫耶尔森氏菌的败血性感染有50％的致死率(Perry，R.D.和J.D.Fetherston，Clin Microbiol Rev，10，35-66，(1997))，并且可以导致肺感染。鼠疫的肺形式通过气溶胶途径极易传染，并且特征为疾病的快速发作和接近100％的死亡率。因此，虽然如果早期施用抗生素疗法是有用且有效的，但肺鼠疫的快速发作和败血性鼠疫的误诊是该疾病治疗中的主要障碍。
小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌被视为肠病原体，因为大多数人传染通过粪-口传播途径进行传播并且限于胃肠道。在正常宿主中，小肠结肠炎耶尔森氏菌引起腹泻病，这可能伴随发烧和模仿阑尾炎的下象限的疼痛。假结核耶尔森氏菌一般不引起腹泻病，并且更可能引起肠系膜淋巴结炎，这可能被误诊为阑尾炎。摄食后，2种生物附着至肠淋巴组织并穿过粘膜层，在其中它们可以随后在肠系膜淋巴结中增殖并迁移至脾和肝(Lian，C.J.，等人，J Med Microbiol，24，219-226，(1987)，Une，T.，Microbiol Immunol，21，505-516，(1977))。假结核耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的某些血清型还可散布至血管系统并引起败血病的致命情况(Bottone，E.J.，Clin.Microbiol.Rev.，10，257-276，(1997)，Lenz，T.，等人，J Infect Dis，150，963，(1984))，尽管这些更具侵入性的感染一般限于易感的个体。小肠结肠炎耶尔森氏菌还已与输血后的败血病相关；在这些情况下，血液供给被该生物污染，所述生物可以在冷藏温度下存活和生长(Natkin，J.B.，KG，Clin Lab Med，19，523-536，(1999))。此外，耶尔森氏菌的肠感染可以导致延迟的后遗症，例如反应性关节炎和甲状腺炎(Bottone，E.J.，Clin.Microbiol.Rev.，10，257-276，(1997)，Gaston，J.S.，等人，Arthritis Rheum.，42，2239-2242，(1999)，Taccetti，G.，等人，Clin Exp Rheumatol，12，681-684，(1994))。抗生素疗法仍未被证实减少由这2种病原体引起的胃肠病的严重性或持续时间(Hoogkamp-Korstanje，J.，J Antimicrob Chemother，20，123，(1987)，Pai，C.H.，等人，J Pediatr，104，308-11，(1984))。然而，易感宿主一般用抗生素治疗以预防疾病更严重的临床疾病表现。由这些肠病原体的任何一种引起的败血病一般也可用抗生素治疗，并且此类疗法通常成功对抗小肠结肠炎耶尔森氏菌(Gayraud，M.，等人，Clin Infect Dis，17，405-10，(1993))。相反，抗生素疗法一般在其中败血病由假结核耶尔森氏菌引起的患者中较不有效，并且与假结核耶尔森氏菌败血病相关的死亡率是大约75％(Natkin，J.B.，KG，Clin Lab Med，19，523-536，(1999))。
尽管鼠疫耶尔森氏菌的天然感染在这个国很罕见，但存在该生物将成为生物恐怖主义试剂的担心。作为故意的大量感染的工具，鼠疫耶尔森氏菌生物由于几个特征而是最佳候选物。首先，该生物当通过气溶胶散布时是高度传染性的，所述气溶胶是大量传播的方便方法。其次，如果未治疗，那么与鼠疫耶尔森氏菌感染相关的死亡率高，并且鼠疫的肺形式通过症状的快速发作加以区别，其可能识别得太晚而不能有效干预。最后，鼠疫耶尔森氏菌具有明确的遗传系统，因此抗生素抗性菌株相对容易工程改造。
已研究了具有各种功效和安全性水平的几种鼠疫疫苗。最早的疫苗之一由鼠疫耶尔森氏菌被杀死的全细胞(KWC)组成；这种类型的疫苗在19世纪90年代晚期首次使用，并且给予针对腹股沟淋巴结炎形式的鼠疫的保护。然而，存在KWC免疫接种提供针对肺鼠疫的很少保护的证据(Cohen，R.J.和J.L.Stockard，JAMA，202，365-366，(1967)，Meyer，K.F.，Bull World Health Organ，42，653-666，(1970))，并且这些疫苗的另外的缺点是为了保护性免疫需要经过几个月的多次注射。鼠疫耶尔森氏菌的减毒株，EV76菌株，已作为鼠疫活疫苗进行研究。在小鼠研究中，这种疫苗已显示出针对皮下和吸入攻击两者的保护，并且只需要少至一剂用于保护(Russell，P.，等人Vaccine，13，1551-1556，(1995))。然而，EV76菌株不是完全无毒的，从而导致大约1％的已接种小鼠死亡(Russell，P.，等人Vaccine，13，1551-1556，(1995))。有趣的是，已有生成适合用作活疫苗的鼠疫耶尔森氏菌无毒株的几次不成功的尝试(Titball，R.W.和E.D.Williamson，Vaccine，19，4175-4184，(2001))。
亚单位疫苗被视为用于安全且有效预防鼠疫的最有希望类型的疫苗，这主要是因为在人宿主中不用担心不利作用。测试了与耶尔森氏菌毒力相关的几种表面蛋白的免疫原性；所有这些蛋白都诱导抗体应答，但只有F1被膜和分泌的V抗原引起针对攻击的良好保护(Titball，R.W.和E.D.Williamson，Vaccine，19，4175-4184，(2001))。F1和V抗原在动物模型中都作为单个抗原提供保护，尽管2种抗原的组合提供更好的保护。许多近期研究已测试了用可替代的佐剂配制的F1/V疫苗，以试图发现关于F1和V抗原的最佳递送系统(Alpar，H.O.，等人Adv.Drug Deliv.Rev.，51，173-201，(2001)，Eyles，J.E.，等人J Control Release，63，191-200，(2000)，Jones，S.M.，等人Vaccine，19，358-366，(2001)，Reddin，K.M.，等人Vaccine，16，761-767，(1998)，Williamson，E.D.，等人Vaccine，19，566-571，(2000)，Williamson，E.D.，等人Vaccine，14，1613-9，(1996))。
其他创新策略已使用减毒的沙门氏菌属(Salmonella)菌株作为鼠疫耶尔森氏菌抗原的疫苗载体。当表达F1/V融合蛋白的沙门氏菌aroA突变体用作疫苗株时，86％的小鼠在后来的致死攻击剂量的鼠疫耶尔森氏菌后生还(Leary，S.E.，等人Microb Pathog，23，167-179，(1997))。类似地，由DNA质粒组成、具有编码截短的F1被膜的基因的疫苗在不同的小鼠品系中提供了80-100％的保护(Grosfeld，H.，等人Infect Immun，71，374-383，(2003))。此外，一组研究者对F1抗原的B和T细胞表位进行作图并在疫苗制剂中使用了免疫反应肽(Sabhnani，L.，等人FEMS Immunol MedMicrobiol，38，215-29，(2003))。他们的结果表明表位肽的混合物保护83％的小鼠不受致死剂量的鼠疫耶尔森氏菌的影响。
与保护性鼠疫疫苗的广泛研究相反，极少的研究努力已集中在预防肠致病性耶尔森氏菌属物种的传染上。然而，少数研究已证明了有希望的结果。例如，给小鼠经口施用减毒的小肠结肠炎耶尔森氏菌株显示了保护作用，从而减少了经口攻击后脾和肝中的细菌接种量(Igwe，E.I.，等人Infect Immun，67，5500-5507，(1999))。然而，这些菌株主要工程改造为活的经口疫苗载体，并且没有进一步测试这些菌株预防耶尔森氏菌病(yersiniosis)的报道。2种亚单位疫苗证实在感染动物模型中有效。第一种由来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的细胞提取物组成并且鼻内施用于小鼠。免疫的小鼠证明鼻内攻击剂量的小肠结肠炎耶尔森氏菌从肺的增强清除  (Di Genaro，M.S.，等人Microbiol.Immunol.，42，781-788，(1998))。第二种亚单位疫苗使用来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的热激蛋白HSP60进行配制，其使用白细胞介素-12作为佐剂(Noll，A.和AutenriethIb，Infect Immun，64，2955-2961，(1996))。用这种疫苗免疫接种导致攻击后小鼠脾中明显更少的细菌，从而说明了保护作用。另外的工作在小鼠肌内免疫接种中使用了由编码小肠结肠炎耶尔森氏菌HSP60的DNA组成的疫苗(Noll，A.，等人Eur J Immunol，29，986-996，(1999))。这项研究证实hsp60 mRNA在免疫接种后存在于各种宿主组织中，但针对小肠结肠炎耶尔森氏菌攻击的保护局限于脾并且在肠粘膜内没有观察到保护。
由致病性耶尔森氏菌属物种引起的疾病之间的相似性和差异在过去10年中已成为许多研究的焦点。这部分归因于提示致病性耶尔森氏菌提供病原体进化的有用模型的几项观察。首先，完全测序的鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌株的DNA杂交研究和近期的基因组比较已表明这2种病原体高度相关(Chain，P.S.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，101，13826-13831，(2004)，Ibrahim，A.，等人FEMSMicrobiol Lett，114，173-177，(1993))，并且已估计鼠疫耶尔森氏菌最近1,500-20,000年前由假结核耶尔森氏菌进化而来(Achtman，M.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，96，14043-14048，(1999))。然而，尽管它们具有亲密的进化关系，但假结核耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌在人类中引起非常不同的疾病。此外，部分测序和16s RNA杂交研究提示小肠结肠炎耶尔森氏菌与该属的其他致病物种关系更远(Ibrahim，A.，等人FEMS Microbiol Lett，114，173-177，(1993)，Moore，R.L.和R.R.Brubaker，Int J Syst Bacteriol，25，336-339，(1975))，尽管小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的胃肠感染类似于使用假结核耶尔森氏菌观察到的那些。因此近期研究已集中在3种致病性耶尔森氏菌属物种的毒力基因上，以试图阐明它们用于引起疾病的不同机制。小鼠模型在研究耶尔森氏菌发病机理中特别有益，因为所有3种物种当静脉内注射时都在小鼠中引起相似的疾病，并且在小鼠中通过口和肺攻击途径可以有效模拟更多天然的感染。
少数毒力因子是鼠疫耶尔森氏菌独有的。这些包括在鼠疫耶尔森氏菌质粒pPCP和pMT上编码的蛋白质，所述质粒在小肠结肠炎耶尔森氏菌或假结核耶尔森氏菌中没有找到。pPCP质粒编码纤溶酶原激活物，这是皮下注射后细菌快速传播进入哺乳动物宿主组织中涉及的蛋白质(Sodeinde，O.A.，等人Science，258，1004-1007，(1992))。pMT质粒含有至少2种基因帮助感染非人类宿主。pMT编码的caf1基因是F1被膜装配所必需的，这是抑制鼠宿主中的吞噬作用的因子，但不是灵长类中的毒性所必需的(Friedlander，A.M.，等人Clin.Infect.Dis.，21 Suppl 2，S178-181，(1995))。鼠毒素也在pMT质粒上编码，并且认为其促进在跳蚤中的存活，尽管这不是鼠宿主中所必需的毒力因子(Hinnebusch，B.J.，等人Science，296，733-735，(2002)，Hinnebusch，J.，等人Int J Med Microbiol，290，483-487，(2000))。物种间的其他差异是由耶尔森氏菌产生的脂多糖(LPS)分子的结构。小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌都表达可变的O-抗原侧链，这推论增强在胃肠道中的存活(Reeves，P.，TrendsMicrobiol.，3，381-386，(1995))，并且可以抑制在侵袭性疾病过程中补体介导的溶解作用(Karlyshev，A.V.，等人Infect Immun，69，7810-7819，(2001))。相反，由于几种O-抗原生物合成基因中的突变，鼠疫耶尔森氏菌具有不含O-特异性侧链的粗糙LPS表型(Prior，J.G.，等人Microb.Pathog.，30，48-57，(2001)，Skurnik，M.P.，A；Ervela，E，Mol Microbiol，37，316-330，(2000))。
有趣的是，基因组测序计划揭示在所有3种致病性耶尔森氏菌属物种中存在的几种毒力基因在鼠疫耶尔森氏菌中已获得突变，这使得它们没有功能(Chain，P.S.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，101，13826-13831，(2004)，Parkhill，J.，等人Nature，413，523-527，(2001))。这些基因中的一些编码侵袭素蛋白，它在肠致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌物种的肠侵袭过程中起作用，即没有鼠疫耶尔森氏菌建群的宿主小生境(Simonet，M.，等人InfectImmun，64，375-379，(1996))。在鼠疫耶尔森氏菌中丧失功能的其他基因包括涉及中间代谢的那些，并且这些功能的丧失推论是鼠疫耶尔森氏菌进化为不能在宿主外存活的专性寄生物种的部分(Parkhill，J.，等人Nature，413，523-527，(2001))。关于耶尔森氏菌发病机理的研究大部分已集中于在所有耶尔森氏菌致病物种中发现的70 kb毒力质粒。这种质粒的序列在假结核耶尔森氏菌和致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌中称为pYV，而在鼠疫耶尔森氏菌中称为pCD1，其在假结核耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌之间是非常保守的(Chain，P.S.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，101，13826-13831，(2004))。因此，关系更远的小肠结肠炎耶尔森氏菌物种具有较趋异的pYV质粒，但毒力基因序列在所有3个物种中是高度保守的(Hu，P.，等人JBacteriol，180，5192-5202，(1998)，Snellings，N.J.，等人InfectImmun，69，4627-38，(2001))。当实验确定pYV质粒是耶尔森氏菌的毒力绝对需要时开始了对这种质粒的关注，尽管该质粒单独不能恢复特定无毒株的毒力，从而提示非pVY基因也涉及发病机理(Heesemann，J.，等人Infect Immun，46，105-110，(1984)，Heesemann，J.和R.Laufs，J Bacteriol，155，761-767，(1983))。这种质粒上的大基因座编码Ysc-Yop系统，III型分泌系统及其相关的效应物蛋白。这个系统是III型分泌装置的第一个实例，现在在许多动物和植物微生物病原体中鉴别出来(关于综述，参见Cornelis，G.R.，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，3，742-752，(2002))。耶尔森氏菌Yop-Ysc分泌系统包括“注射体(injectisome)”蛋白、易位体效应物蛋白和Yop效应物蛋白。各种III型分泌系统的电子显微镜术和标记研究揭示注射体蛋白形成跨越细菌细胞质和外膜的孔并且从细胞表面凸出针状结构(Blocker，A.，等人Mol.Microbiol.，39，652-663，(2001)，Kimbrough，T.G.和S.I.Miller，Proc Natl Acad Sci U S A，97，11008-11013，(2000)，Kubori，T.，等人Science，280，602-605，(1998)，Sukhan，A.，等人J Bacteriol，183，1159-1167，(2001))。转位体蛋白似乎与宿主的巨噬细胞和多形核嗜中性粒细胞(PMN)相互作用，从而在宿主细胞膜中形成孔状结构(Neyt，C.和G.R.Cornelis，Mol Microbiol，33，971-981，(1999))。装配的分泌装置随后允许效应物Yop易位通过细菌细胞膜并注射到宿主细胞中，在其中它们通过干扰各种免疫应答途径起作用(Bleves，S.和G.R.Cornelis，Microbes Infect.，2，1451-1460，(2000)，Cornelis，G.R.，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，3，742-752，(2002))。yadA基因也存在于pYV质粒上，从而编码能够结合并附着至真核细胞的YadA粘附素(Eitel，J.和P.Dersch，Infect Immun，70，4880-91，(2002)，Skurnik，M.，等人Infect Immun，62，1252-61，(1994))。这种蛋白质似乎只在肠致病性耶尔森氏菌中起作用，因为鼠疫耶尔森氏菌yadA基因中的移码突变使得它没有功能(Hu，P.，等人J Bacteriol，180，5192-5202，(1998))。
铁在耶尔森氏菌感染中的涉及已确定很久。例如，铁-过载的患者例如患有β-地中海贫血的那些对耶尔森氏菌感染高度易感(Farmakis，D.，等人Med.Sci.Monit.，9，RA19-22，(2003))。此外，通过添加血红素或含血红素的化合物可以恢复特定无毒鼠疫耶尔森氏菌突变体的毒力(Burrows，T.W.和S.Jackson，Br.J.Exp.Pathol.，37，577-583，(1956))。关于耶尔森氏菌和其他细菌的这些早期观察导致研究者研究一些微生物铁摄取机制。在哺乳动物宿主中，可用的铁是极其有限的；细胞内的铁与贮存蛋白复合，而细胞外的铁由宿主蛋白转铁蛋白和乳铁蛋白结合。这些铁限制条件限制了微生物侵入物的生长，因此充当针对感染的防御屏障。许多病原体已进化出在这些贫铁条件下搜寻铁的能力，从而从转铁蛋白或含血红素的化合物中有效“偷”铁。细菌采用的最常见的机制之一是合成并分泌铁载体，这是对铁具有高度亲和力的小分子(Andrews，S.C.，等人FEMS Microbiol.Rev.，27，215-237，(2003))。铁-铁载体复合物由细菌细胞表面上的外膜受体结合，并且通过外膜、周质和ABC转运蛋白的协同作用，将铁转运到细胞中。其他外膜受体可以直接结合血红素和含血红素的化合物，从而从这些分子中搜寻铁。几种耶尔森氏菌的铁摄取系统的作用已被阐明，而许多更假定的系统已被鉴别但未表征。
尽管耶尔森氏菌可以使用由其他细菌和真菌产生的各种铁载体来获得铁，但耶尔森氏菌素是已检测出的耶尔森氏菌生产的唯一铁载体(Baumler，A.，等人Zentralbl.Bakteriol.，278，416-424，(1993)，Rabsch，W.和G.Winkelmann，Biol Met，4，244-250，(1991)，Reissbrodt，R.和W.Rabsch，Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg[A]，268，306-317，(1988))。耶尔森氏菌素系统由染色体高致病性岛(HPI)上存在的ybt基因编码，所述高致病岛是与高致病性耶尔森氏菌株相关的基因座(de Almeida，A.M.，等人Microb.Pathog.，14，9-21，(1993)，Rakin，A.，等人J Bacteriol，177，2292-2298，(1995))。ybt基因编码的蛋白涉及铁载体耶尔森氏菌素(ybtS、irp1、irp2、ybtE、ybtT)，以及摄取铁-耶尔森氏菌素复合物所需的细胞质(ybtP、ybtQ)和外膜蛋白(psn/fyuA)的合成和分泌(Carniel，E.，Microbes Infect.，3，561-569，(2001))。关于耶尔森氏菌素合成和/或摄取的基因中的突变导致小鼠感染模型中的耶尔森氏菌毒力减少(Bearden，S.W.，等人Infect.Immun.，65，1659-1668，(1997)，Brem，D.，等人Microbiology，147，1115-1127，(2001)，Rakin，A.，等人MolMicrobiol，13，253-263，(1994))，从而表明这个系统是耶尔森氏菌发病机理中的重要毒力因子。ybt基因的核苷酸序列在3种致病性耶尔森氏菌属物种之间至少97％同一(Carniel，E.，Microbes Infect.，3，561-569，(2001)，Chain，P.S.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，101，13826-13831，(2004))，并且鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的ybt系统被证实是可互换的(Perry，R.D.，等人Microbiology，145(Pt 5)，1181-1190，(1999))。这些分析表明这些同源物的功能在3个物种中很可能是保守的。此外，HP1已在各种致病物种中发现，包括大肠杆菌(E.coli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)的一些菌株(Bach，S.，等人FEMS Microbiol.Lett.，183，289-294，(2000))。由这些生物表达的Ybt蛋白非常相似；实际上，针对几种耶尔森氏菌Ybt蛋白产生的抗体识别来自其他病原体的相应蛋白(Bach，S.，等人FEMS Microbiol.Lett.，183，289-294，(2000)，Karch，H.，等人Infect Immun，67，5994-6001，(1999))。这些结果提示ybt系统的获得在这些病原体中相对近期并且其已促进与许多这些血清型相关的侵袭性表型。
基于突变分析、与已知的铁获取蛋白的同源性或铁-应答性调节元件的存在，已在耶尔森氏菌属物种中检测出几种另外的ybt-非依赖性铁摄取系统。一种此类调节元件是“Fur框”，这是当调节蛋白Fur与铁复合时结合所述调节蛋白Fur的核苷酸序列。Fe-Fur与Fur框的结合抑制下游启动子的转录，并且当铁变得有限时，apo-Fur与DNA解离并且转录脱抑制。Fur及其同源物已在大多数细菌物种中发现，并且在不同生物中调节除铁摄取系统以外的多种基因(Campoy，S.，等人Microbiology，148，1039-1048，(2002)，Horsburgh，M.J.，等人Infect Immun，69，3744-3754，(2001)，Sebastian，S.，等人JBacteriol，184，3965-3974，(2002)，Stojiljkovic，I.，等人J Mol Biol，236，531-545，(1994))。鼠疫耶尔森氏菌基因组分析鉴别出在其各自的启动子上游有Fur框的多种基因，其中大多数编码与已知的铁摄取系统同源的蛋白质(Panina，E.M.，等人Nucleic Acids Res，29，5195-5206，(2001))。尽管已研究了这些基因中的少数的功能，但几种基因似乎编码铁-铁载体受体蛋白(omrA、irgA、itrA、ihaB、fauA)和铁ABC转运蛋白(itsTUS、itpPTS)。因为耶尔森氏菌可以利用由其他生物产生的铁载体，所以这些蛋白质可能负责利用耶尔森氏菌观察到的“铁载体抢劫行为”。此类铁获取方法在细菌病原体中是常见的。
几项研究已阐明了其他假定的铁摄取系统的功能。例如，鼠疫耶尔森氏菌的Hmu系统被证实通过摄取血红素和含血红素的化合物来获取铁(Hornung，J.M.，等人Mol Microbiol，20，725-39，(1996))。尽管使用血红素作为铁源的能力看起来对病原体有利，但鼠疫耶尔森氏菌hmu突变体在小鼠感染模型中具有完全毒力(Thompson，J.M.，等人Infect Immun，67，3879-92，(1999))。第二种假定的血红素摄取系统基于序列同源性在鼠疫耶尔森氏菌中鉴别出来。鼠疫耶尔森氏菌的has基因是假单胞菌属(Pseudomonas)和沙雷氏菌属(Serratia)的血运载体(hemophore)依赖性血红素获取基因的同源物(Rossi，M.S.，等人Infect Immun，69，6707-6717，(2001))。在这些生物中，分泌结合血红素的血运载体(HasA)并将其递送至细菌表面受体(HasR)以将血红素转运到细胞中。确定鼠疫耶尔森氏菌HasA蛋白是Fur调节的、分泌的，并且能够结合血红素。然而，这些基因中的突变对小鼠中的毒力没有影响，甚至当测试双重突变体时(Rossi，M.S.，等人Infect Immun，69，6707-6717，(2001))。因此，假定的血红素摄取系统在发病机理中的作用仍难以捉摸，并且可以表明血红素的摄取在非鼠宿主感染过程中更为重要。
还研究了2种假定的铁ABC转运系统在耶尔森氏菌中的功能。Yfe系统在鼠疫耶尔森氏菌中可以转运铁和锰，并且yfe突变体证实小鼠感染模型中毒力减少(Bearden，S.W.和R.D.Perry，Mol.Microbiol.，32，403-414，(1999))。第二种假定的铁ABC转运蛋白由yfu基因编码，通过上游Fur框的存在进行鉴别(Gong，S.，等人Infect.Immun.，69，2829-2837，(2001))。当在大肠杆菌中表达时，yfu基因在贫铁培养基中恢复生长；然而，在鼠疫耶尔森氏菌中的可比较的研究不能确定Yfu在铁获取中的作用，并且yfu-突变体显示在小鼠毒力中没有缺陷(Gong，S.，等人Infect.Immun.，69，2829-2837，(2001))。
发明概述
本发明提供了组合物，其包括具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有40kDa、38kDa、或37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定。具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不合铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。在某些方面，组合物可以包括2种不同的83kDa多肽，所述多肽当小肠结肠炎耶尔森氏菌在包括铁螯合剂的培养基中温育时可以分离。组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。多肽可以是可分离的，或在某些方面从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。组合物可以进一步包括分离的多肽，其具有268kDa、92kDa、79kDa、54kDa、45kDa、31kDa、28kDa的分子量或其组合，并且可从在不含铁螯合剂的培养基中生长的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离。
本发明还提供了组合物，其包括具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有268kDa、79kDa、或45kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定。具有83kDa、70kDa、或66kDa分子量的多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。多肽可以是可分离的，或在某些方面从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。
本发明进一步提供了组合物，其包括具有268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、45kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、和28kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定。多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。多肽可以是可分离的，或在某些方面从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。
本发明提供了组合物，其包括具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有46kDa、37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定。具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。多肽可以是可分离的，或在某些方面从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。组合物可以进一步包括分离的多肽，其具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、或20kDa的分子量，并且可从在不含铁螯合剂的培养基中生长的鼠疫耶尔森氏菌中分离。多肽可以是可分离的，或在某些方面从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+中分离。
本发明还提供了组合物，其包括具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、20kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定。具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。多肽可以是可分离的，或在某些方面从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+中分离。
本发明进一步提供了组合物，其包括具有254kDa、104kDa、99kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、60kDa、46kDa、44kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、和20kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定。多肽可从鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。多肽可以是可分离的，或在某些方面从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+中分离。
本发明提供了用于治疗受试者中感染的方法，其包括给患有或处于患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的危险中的受试者施用有效量的本发明组合物。受试者可以是动物例如鱼，或哺乳动物例如人。耶尔森氏菌属物种可以是，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌、或鲁氏耶尔森氏菌。
本发明还提供了用于治疗受试者中症状的方法，其包括给患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的受试者施用有效量的本发明组合物。受试者可以是动物例如鱼，或哺乳动物例如人。耶尔森氏菌属物种可以是，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌、或鲁氏耶尔森氏菌。症状可以是，例如腹泻、肠炎、鼠疫、红口病或其组合。
本发明进一步提供了治疗受试者中的感染，其包括给患有或处于患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的危险中的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括特异性结合本发明多肽的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆的。在一个实例中，抗体特异性结合具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。在另一实例中，抗体特异性结合具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
本发明还提供了用于治疗受试者中症状的方法，其包括给患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括特异性结合本发明多肽的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆的。在一个实例中，抗体特异性结合具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。在另一实例中，抗体特异性结合具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
本发明进一步提供了用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的试剂盒。试剂盒包括本发明的分离的多肽，和检测特异性结合多肽的抗体的试剂。多肽和试剂一般存在于分开的容器中。在一个实例中，多肽可以具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量或其组合，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。在另一实例中，多肽可以具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
附图简述
图1.小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729和鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的富含不溶于去污剂的蛋白质的提取物通过在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行分离。凝胶图像左侧的数字指以kDa表示的泳道1中显示的标准的分子量。泳道1，分子量标准；泳道2，在补加有300μM FeCl3的培养基中生长的鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+；泳道3，在补加有160μM 2，2-联吡啶(2，2-diprydyl)的培养基中生长的鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+；泳道4，在补加有160μM 2，2-联吡啶的培养基中生长的小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729；泳道5，在补加有300μM FeCl3的培养基中生长的小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729。
图2.小肠结肠炎耶尔森氏菌攻击后已接种和未接种的小鼠的存活。图表显示用来源于在铁限制条件下生长的小肠结肠炎耶尔森氏菌株27729的膜蛋白质免疫接种、并随后用菌株27729活攻击后的小鼠的生存分析。记录攻击后7天的死亡率。
图3.SEQ ID NO：1-23的核苷酸序列。
本发明的优选实施方案的详述
本发明提供了多肽和包括多肽的组合物。如本文所使用的，“多肽”指由肽键连接的氨基酸聚合物。因此，例如，术语肽、寡肽、蛋白质和酶包括在多肽定义中。这个术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。术语多肽不意味着特定长度的氨基酸聚合物。多肽可以直接从天然来源中分离，或可以借助于重组、酶或化学技术进行制备。在多肽天然存在的情况下，此类多肽一般是分离的。“分离的”多肽是已移出其天然环境的多肽。例如，分离的多肽是已移出细胞质或细胞外膜的多肽，并且许多多肽、核酸及其天然环境的其他细胞材料不再存在。“可分离的”多肽是可从特殊来源中分离的多肽。“纯化的”多肽是至少60％、优选至少75％，并最优选至少90％不含与其天然结合的其他组分的多肽。在其天然存在的生物外生产(例如通过化学或重组方法)的多肽通过定义被视为分离并纯化的，因为它们从不存在于天然环境中。如本文所使用的，“多肽片段”指由蛋白酶消化多肽产生的部分多肽。除非另有说明，“一种(a)”、“一种(an)”、“该(the)”  和“至少一个”可互换使用并且指一个或超过一个。术语“包括”及其变体当出现在说明书和权利要求中时没有限制性含义。
本发明多肽可以通过分子量、质量指纹图谱或其组合进行表征。多肽的分子量一般以千道尔顿(kDa)表示，可以使用常规方法进行测定，所述方法包括例如凝胶过滤，凝胶电泳，包括十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，毛细管电泳，质谱分析法，和液相层析，包括HPLC。优选地，通过在还原和变性条件下使用SDS聚丙烯酰胺凝胶分离多肽来测定分子量，所述凝胶具有约4％的浓缩胶和约10％的分离胶。除非另有说明，分子量指根据SDS-PAGE测定的分子量。如本文所使用的，“质量指纹图谱”指在蛋白酶消化后从多肽获得的一组多肽片段。一般地，使用质谱分析法分析由消化产生的多肽片段。每个多肽片段的特征在于质量、或质量(m)与电荷(z)的比，这称为“m/z比”或“m/z值”。用于产生多肽质量指纹图谱的方法是常规的。实施例9中公开了此类方法的一个实例。
本发明多肽可以是金属调节的多肽。如本文所使用的，“金属调节的多肽”是当微生物在低金属条件下生长时，与在高金属条件下生长的相同微生物相比，微生物以更高水平表达的多肽。本文描述了低金属和高金属条件。例如，由耶尔森氏菌属物种产生的一类金属调节的多肽在微生物在高金属条件下生长期间不以可检测的水平表达，但在微生物在低金属条件下生长期间以可检测的水平表达。可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离的此类金属调节的多肽的实例具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量。在某些方面，小肠结肠炎耶尔森氏菌可以产生2种不同的多肽，其每种具有83kDa的分子量并且在微生物在低金属条件下生长期间各自以可检测的水平表达，并且在微生物在高金属条件下生长期间不以可检测的水平表达。可从鼠疫耶尔森氏菌中分离的此类金属调节的多肽的实例具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量。
由耶尔森氏菌属物种产生的另一类型的金属调节的多肽在微生物在高金属条件下生长期间以可检测的水平表达，但在微生物在低金属条件下生长期间表达明显更多的多肽。在低金属条件下生长期间此类多肽的表达在本文中称为  “增强的”。一般地，在低金属条件下生长期间的多肽表达比在高金属条件下生长期间的多肽表达高至少10％或至少50％。显示增强的表达并可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离的金属调节的多肽的实例具有268kDa、79kDa、或45kDa的分子量。显示增强的表达并可从鼠疫耶尔森氏菌中分离的金属调节的多肽的实例具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、或20kDa的分子量。在某些方面，鼠疫耶尔森氏菌可以产生2种不同的多肽，其每种具有31kDa的分子量并且各自显示出增强的表达。
本发明的某些多肽的表达不受金属存在的明显影响。可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离的此类多肽的实例具有92kDa、54kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、或28kDa的分子量。在某些方面，小肠结肠炎耶尔森氏菌可以产生2种不同的多肽，其每种具有31kDa的分子量并且各自不受金属存在的明显影响。可从鼠疫耶尔森氏菌中分离的此类多肽的实例具有104kDa、99kDa、60kDa、或44kDa的分子量。
无论多肽是否是金属调节的多肽都可以由对比较多肽存在有用的方法测定，所述方法包括凝胶过滤，凝胶电泳，包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，毛细管电泳，质谱分析法，和液相层析，包括HPLC。分开的微生物培养物在高金属条件和低金属条件下生长，本发明多肽如本文所述进行分离，并且将在每种培养物中存在的多肽进行分离和比较。一般地，使用来自每种培养物的等量多肽。优选地，通过在还原和变性条件下使用SDS聚丙烯酰胺凝胶来分离多肽，所述凝胶具有约4％的浓缩胶和约10％的分离胶。例如可以使用来自每种培养物的30微克(μg)总多肽并且加样到凝胶孔中。凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色多肽后，可以比较2个泳道。当确定多肽是否以可检测水平表达时，使用本领域已知方法在SDS-PAGE凝胶上分离来自培养物的30μg总多肽并用考马斯亮蓝染色。肉眼可见的多肽被认为是以可检测的水平表达的，而肉眼看不见的多肽被认为是不以可检测的水平表达的。
本发明多肽可以具有免疫原性活性。“免疫原性活性”指多肽在动物中引起免疫应答的能力。针对多肽的免疫应答是动物中针对多肽的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，免疫应答包括但不限于一种或多种下列作用：针对一个或多个多肽表位的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。“表位”指抗原上的位点，特异性B细胞和/或T细胞针对其进行应答从而产生抗体。免疫原性活性可以是保护性的。“保护性免疫原性活性”指多肽在动物中引起免疫应答的能力，所述免疫应答预防或抑制耶尔森氏菌属物种，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌的感染。多肽是否具有保护性免疫原性活性可以由本领域已知的方法测定，例如如实施例4或实施例7中所述方法。例如，本发明多肽或本发明多肽的组合保护啮齿类动物例如小鼠不受耶尔森氏菌属物种的攻击。本发明多肽可以具有血清反应活性。“血清反应活性”指候选多肽与恢复期血清中存在的抗体反应的能力，所述血清来自用耶尔森氏菌属物种，优选小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌感染的动物。本发明多肽可以具有免疫调节活性。“免疫调节活性”指多肽以非特异性方式起作用以增强针对特定抗原的免疫应答的能力。用于确定多肽是否具有免疫调节活性的方法是本领域已知的。
本发明多肽具有由参照微生物表达的多肽的特征。特征包括分子量和质量指纹图谱两者。参照微生物可以是小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲁氏耶尔森氏菌、罗氏耶尔森氏菌、阿氏耶尔森氏菌、伯氏耶尔森氏菌、弗氏耶尔森氏菌、中间耶尔森氏菌、克氏耶尔森氏菌、或莫氏耶尔森氏菌，优选小肠结肠炎耶尔森氏菌，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729，或鼠疫耶尔森氏菌，例如鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+(Gong等人Infect.Immun.，69：2829-2837(2001))。
当参照微生物是小肠结肠炎耶尔森氏菌，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729时，候选多肽被视为本发明多肽，如果其具有268kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、或45kDa的分子量，并且具有的质量指纹图谱类似于由参照微生物表达、并分别具有268kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、或45kDa的分子量的金属调节的多肽的质量指纹图谱的话。优选地，此类多肽是金属调节的。例如，候选多肽是本发明多肽，如果其具有83kDa的分子量，并且具有的质量指纹图谱类似于由参照菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729产生的金属调节的83kDa多肽之一的质量指纹图谱的话。候选多肽还视为本发明多肽，如果其具有92kDa、54kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、或28kDa的分子量，并且具有的质量指纹图谱类似于由参照微生物表达、并分别具有92kDa、54kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、或28kDa的分子量的多肽的质量指纹图谱的话。
当参照微生物是鼠疫耶尔森氏菌例如鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+时，候选多肽被视为本发明多肽，如果其具有254kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、或20kDa的分子量，并且具有的质量指纹图谱类似于由参照微生物表达、并分别具有254kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、或20kDa的分子量的金属调节的多肽的质量指纹图谱的话。优选地，此类多肽是金属调节的。例如，候选多肽是本发明多肽，如果其具有94kDa的分子量，并且具有的质量指纹图谱类似于由参照菌株鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+产生的金属调节的94kDa多肽之一的质量指纹图谱的话。候选多肽还视为本发明多肽，如果其具有104kDa、99kDa、60kDa、或44kDa的分子量，并且具有的质量指纹图谱类似于由参照微生物表达且分别具有104kDa、99kDa、60kDa、或44kDa的分子量的多肽的质量指纹图谱的话。
由参照微生物表达且具有上文提到的分子量的多肽可以通过在低金属条件下培养参照微生物并且通过本文公开的方法随后分离多肽而获得。候选多肽可从微生物中分离，优选革兰氏阴性微生物，更优选肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员，优选耶尔森氏菌属的成员，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、或鼠疫耶尔森氏菌。候选多肽还可利用重组、酶或化学技术产生。
候选多肽可以通过质谱分析进行评估，以确定该候选多肽具有的质量指纹图谱是否类似于由参照微生物表达且具有上文提到的分子量的多肽之一的质量指纹图谱。一般地，例如通过凝胶电泳分离候选多肽并切下含有候选多肽的凝胶部分来分离候选多肽。可以使用基于不同特征分开多肽的任何凝胶电泳方法，包括1维或2维凝胶电泳，以及基于例如疏水性、pI或大小的液相层析分离。候选多肽通过例如用蛋白酶消化片段化。优选地，蛋白酶切割在氨基酸赖氨酸和氨基酸精氨酸的羧基末端侧的肽键，除了当赖氨酸或精氨酸后的氨基酸为脯氨酸时。此类蛋白酶的一个实例是胰蛋白酶。用胰蛋白酶消化多肽的方法是本领域常规和已知的。实施例9中公开了此类方法的一个实例。
关于多肽的质谱分析方法是本领域常规和已知的，并且包括但不限于，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)。一般地，将包含从候选多肽获得的多肽片段的混合物与基质混合，所述基质用于将激光能量转化至样品，并产生电离的、优选单种同位素的多肽片段。可以使用的基质的实例包括例如介子酸或氰基-4-羟基肉桂酸。实施例9中描述了通过MALDI-TOF MS分析多肽的方法的实例。电离的多肽片段按照其m/z比分开，并进行检测以产生m/z比对强度的谱。谱包括代表来源于候选多肽的多肽片段的m/z值。对于任何给定的多肽，由胰蛋白酶消化产生的每个多肽片段的量应该是等摩尔的。然而，已知胰蛋白酶消化不总是100％有效，例如，某些位点更有效地切割。因此，当使用MALDI-TOF MS测定m/z值时，每个m/z值的强度一般不同。一般地，谱具有穿过大部分x轴(即，具有m/z比值的轴)存在的噪音背景水平。噪音背景水平依运行条件和使用的机器而变，并且通过谱的目测检察易于鉴别。当强度至少为噪音背景水平的2倍、3倍或4倍时，m/z值一般被视为表示多肽片段。谱一般包括其他m/z值，这些是由下列产生的假象：例如不完全消化、过度消化、混合物中可能存在的其他多肽、或用于消化多肽的蛋白酶包括由蛋白酶自体分解产生的m/z值。用蛋白酶消化多肽的这种方法在本领域公认为产生更大特异性的质量指纹图谱，其可以用于精确表征多肽并将它与其他多肽区分开。
在本发明的这个方面，当候选多肽通过质谱法进行分析时，优选候选多肽和来自参照微生物的多肽一起制备和分析，从而减少由样品处理和运行条件中的差异产生的、任何可能的假象。优选地，用于制备和分析2种多肽的所有试剂都是相同的。例如，来自参照微生物的多肽和候选多肽在基本上相同的条件下分离、在基本上相同的条件下片段化、并且在相同机器上在基本上相同的条件下通过MALDI-TOFMS分析。当参照微生物多肽谱中存在且高于噪音背景水平的至少80％、至少90％、至少95％、或基本上所有的m/z值也存在于候选多肽的谱中时，候选多肽的质量指纹图谱被视为类似于来自参照微生物的多肽的质量指纹图谱。
在另一方面，多肽被视为本发明多肽，如果其具有表1或表2中描述的参照多肽的分子量，并且具有的质量指纹图谱包括如表1或表2中列出的参照多肽的多肽片段群的话。例如，本发明多肽包括83kDa且具有如下质量指纹图谱的多肽，所述质量指纹图谱包括质量为686.37、975.45、1000.53、1015.46、1140.65、1169.68、1170.64、1197.57、1342.55、1356.74、1394.67、1452.73、1476.72、1520.76、1692.77、1715.75、1828.79、1960.91、2013.02、2018.95、2040.97、2163.05、2225.03、2416.19、和3174.44的多肽片段，或包括质量为1001.49、1103.57、1139.57、1154.51、1170.49、1208.59、1213.67、1337.70、1452.86、1567.84、1633.85、1650.82、1659.91、1708.77、1748.95、1849.92、1986.98、2103.95、2111.03、2163.11、2386.19、2452.09、2537.34、和3422.66的多肽片段。候选多肽的质量指纹图谱可以通过质谱分析法，例如通过MALDI-TOF MS来测定。候选多肽的质量指纹图谱一般将具有另外的多肽片段，并且因此将具有除列出的关于表1或表2中多肽的那些值以外的另外的m/z值。优选地，当候选多肽与表1或表2中的多肽比较时，候选多肽从鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、或小肠结肠炎耶尔森氏菌中获得，更优选从小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌中获得。通过在低金属条件下培养微生物并随后通过本文所述方法分离多肽可以获得候选多肽。
本领域众所周知的是氨基酸的修饰可以在样品处理过程中偶然导入，例如氧化，和脲基甲基衍生物的形成。此外，这些类型的修饰改变了多肽片段的m/z值。例如，如果多肽片段包含氧化的甲硫氨酸，那么m/z值相对于不包含氧化的甲硫氨酸的相同片段将增加16。因此，表1和2中具有符号“氧化(M)”的那些多肽片段具有的m/z值相对于不包含氧化的甲硫氨酸的相同片段增加16。应当理解表1和表2的多肽片段可以在样品处理过程中被修饰。
表1.从小肠结肠炎耶尔森氏菌中获得的多肽的特征。
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  Lw545   268   928.45   FHQLDNR(SEQ ID No：24)
  1139.57   VNFTAGVGGYR(SEQ ID No：25)
  1311.65   NSVSIGHESLNR(SEQ ID No：26)
  1439.69   ASTSDTGVAVGFNSK(SEQ ID No：27)
  1525.73   SAETLASANVYADSK(SEQ ID No：28)
  1554.69   EAFDLSNDALDMAK+氧化(M)(SEQ ID No：29)
  1580.77   SAEVLGIANNYTDSK(SEQ ID No：30)
  1595.78   ALGDSAVTYGAGSTAQK(SEQ ID No：31)
  1682.78   EAFDLSNDALDMAKK+氧化(M)(SEQ ID No：32)
  2109.18   AAVAVGAGSIATGVNSVAIGPLSK(SEQ ID No：33)
  Lw391A   83   686.37   DIGNIR(SEQ ID No：34)
  975.45   FFVSYQW(SEQ ID No：35)
  1000.53   VNGQDVTLR(SEQ ID No：36)
  1015.46   ASYFDTNAK(SEQ ID No：37)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  1140.65   DLPVSILAGTR(SEQ ID No：38)
  1169.68   QGVLTLVDGIR(SEQ ID No：39)
  1170.64   NIPGLTVTGSGR(SEQ ID No：40)
  1197.57   YYNNSALEPK(SEQ ID No：41)
  1342.55   APTMGEMYNDSK(SEQ ID No：42)
  1356.74   IDQIQSLSANLR(SEQ ID No：43)
  1394.67   TDDVDGILSFGTR(SEQ ID No：44)
  1452.73   GMTTTVVLGNAFDK(SEQ ID No：45)
  1476.72   IADTMVVTATGNER(SEQ ID No：46)
  1520.76   FGSGWLQDEITLR(SEQ ID No：47)
  1692.77   NPQTSAASSTNLMTDR(SEQ ID No：48)
  1715.75   FNDLMMAEDDLQFK(SEQ ID No：49)
  1828.79   GSSEGYADVDADKWSSR(SEQ ID No：50)
  1960.91   QEQTPSGATESFPQADIR(SEQ ID No：51)
  2013.02   QGTDTGHLNSTFLDPALVK(SEQ ID No：52)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  2018.95   QSDGFNAPNDETISNVLAK(SEQ ID No：53)
  2040.97   VYSAAATGDHSFGLGASAFGR(SEQ ID No：54)
  2163.05   LFTDSFASHLLTYGTEAYK(SEQ ID No：55)
  2225.03   VSSSGTPQAGYGVNDFYVSYK(SEQ ID No：56)
  2416.19   GAVSVTPTDWLMLFGSYAQAFR(SEQ ID No：57)
  3174.44   SSFEAPMMVTVVEADTPTSETATSATDMLR(SEQ ID No：58)
  Lw391B   83   1001.49   NDASVQNVR(SEQ ID No：59)
  1103.57   IGFLGQQDAR(SEQ ID No：60)
  1139.57   VNLGYAANYR(SEQ ID No：61)
  1154.51   GYGNPSQNYR(SEQ ID No：62)
  1170.49   YGDDDQFGVR(SEQ ID No：63)
  1208.59   GHFDTGPITHK(SEQ ID No：64)
  1213.67   LLASATWLDPK(SEQ ID No：65)
  1337.70   NVPFNVIGYTSK(SEQ ID No：66)
  1452.86   LKPWTRLDLGVR(SEQ ID No：67)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  1567.84   VSLYANHIEALGPGK(SEQ ID No：68)
  1633.85   GIELNVFGEPVFGTR(SEQ ID No：69)
  1650.82   TNDTITVVGAQETFR(SEQ ID No：70)
  1659.91   VTPIYGIMVKPWEK(SEQ ID No：71)
  1708.77   NFDSGVPNSAGSLDAMK(SEQ ID No：72)
  1748.95   LYVPYVADSVAGLGGIR(SEQ ID No：73)
  1849.92   VTVDYGSASQVGGALDVGR(SEQ ID No：74)
  1986.98   AGGNDLIPTYLDGQVANGGR(SEQ ID No：75)
  2103.95   SEYDVSQNWTVYGSVGASR(SEQ ID No：76)
  2111.03   GYNLDGDDISFGGLFGVLPR(SEQ ID No：77)
  2163.11   SGSQYANEANTLKLKPWTR(SEQ ID No：78)
  2386.19   GANAFINGISPSGSGVGGMINLEPK(SEQ ID No：79)
  2452.09   NEETGQYGAPMLTNNNGDATISR(SEQ ID No：80)
  2537.34   SAPYQYNGKPVVNAGQIPGIIHSK(SEQ ID No：81)
  3422.66   YGGTLALFEITRPTGMVDPATNVYGFYGEQR(SEQ ID No：82)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  Lw392   79   836.44   YDTVALR(SEQ ID No：83)
  1017.59   VLLGVDFQK(SEQ ID No：84)
  1070.48   FDDVWSFR(SEQ ID No：85)
  1085.50   SVQATVGYDF(SEQ ID No：86)
  1131.59   ADLGTWAASLK(SEQ ID No：87)
  1188.55   QWADDANTLR(SEQ ID No：88)
  1214.63   VNSQGLELEAR(SEQ ID No：89)
  1235.65   AVPATYYVPAGK(SEQ ID No：90)
  1255.66   LSVIAGYTYNR(SEQ ID No：91)
  1263.65   VPSYTLGDASVR(SEQ ID No：92)
  1360.66   RPQFTSEGHFR(SEQ ID No：93)
  1496.67   GFFDGESNHNVFK(SEQ ID No：94)
  1501.79   GAFVQLNVNNIADK(SEQ ID No：95)
  1614.75   WQQIYSYEFSHK(SEQ ID No：96)
  1652.77   GFFDGESNHNVFKR(SEQ ID No：97)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  1717.82   GFHGGDVNNTFLDGLR(SEQ ID No：98)
  1770.85   RWQQIYSYEFSHK(SEQ ID No：99)
  1819.86   AGHEADLPTSGYTATTTK(SEQ ID No：100)
  1827.01   TDQPLILTAQSVSVVTR(SEQ ID No：101)
  2004.92   DPSGGYHSAVPADGSIYGQK(SEQ ID No：102)
  2066.02   GPSSALYGQSIPGGVVMMTSK(EQ ID No：103)
  2119.91   KYVAACYSTSYCYWGAER(SEQ ID No：104)
  2299.22   YAIAPSLLWQPDENTSLLLR(SEQ ID No：105)
  2307.15   LLSDGGSYNVLQVDPWFLER(SEQ ID No：106)
  2782.23   QNASYTHSNTQLEQVYQGGWNSDR(SEQ ID No：107)
  2911.35   LTAGNNNTQVAAFDYTDAISEHWAFR(SEQ ID No：108)
  3023.42   RYEQSGVYLQDEMTLDNWHLNLSGR(SEQ ID No：109)
  3286.53   QQMDDQNVATVNQALNYTPGVFTGFSGGATR(SEQ ID No：110)
  Lw393   70   713.42   VPFVPR(SEQ ID No：111)
  759.42   TVGINTR(SEQ ID No：112)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  806.41   YGALMPR(SEQ ID No：113)
  819.42   FDIGGGVR(SEQ ID No：114)
  919.48   GPQGTLYGK(SEQ ID No：115)
  1023.50   GYIEGGVSSR(SEQ ID No：116)
  1051.53   SINYELGTR(SEQ ID No：117)
  1186.57   WNQDVQELR(SEQ ID No：118)
  1199.60   TVDMVFGLYR(SEQ ID No：119)
  1394.68   YGAGSSVNGVIDTR(SEQ ID No：120)
  1436.66   LSLSDGSPDPYMR(SEQ ID No：121)
  1479.70   ATQDAYVGWNDIK(SEQ ID No：122)
  1540.80   INISVHVDNLFDR(SEQ ID No：123)
  1545.80   TFPSGSLIVNMPQR(SEQ ID No：124)
  1564.76   KLSLSDGSPDPYMR(SEQ ID No：125)
  1667.72   SEFTNDSELYHGNR(SEQ ID No：126)
  1730.85   FAPGWSWDINGNVIR(SEQ ID No：127)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  1789.81   LAPDDQPWEMGFAASR(SEQ ID No：128)
  1904.85   TYGYMNGSSAVAQVNMGR(SEQ ID No：129)
  1981.02   SAQGGIINIVTQQPDSTPR(SEQ ID No：130)
  1982.93   QGTYATLDSSLGWQATER(SEQ ID No：131)
  1995.94   DMQLYSGPVGMQTLSNAGK(SEQ ID No：132)
  2009.89   SSTQYHGSMLGNPFGDQGK(SEQ ID No：133)
  2027.02   LAVNLVGPHYFDGDNQLR(SEQ ID No：134)
  2058.99   LRLAPDDQPWEMGFAASR(SEQ ID No：135)
  2132.93   QVDDGDMINPATGSDDLGGTR(SEQ ID No：136)
  2162.17   FNLSGPIQDGLLYGSVTLLR(SEQ ID No：137)
  2274.20   VLPGLNIENSGNMLFSTISLR(SEQ ID No：138)
  2363.13   SEFTNDSELYHGNRVPFVPR(SEQ ID No：139)
  2377.30   SKFNLSGPIQDGLLYGSVTLLR(SEQ ID No：140)
  2383.07   SNDDQVLGQLSAGYMLTDDWR(SEQ ID No：141)
  2563.22   SASANNVSSTVVSAPELSDAGVTASDK(SEQ ID No：142)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  2657.23   YTTDDWVFNLISAWQQQHYSR(SEQ ID No：143)
  2833.50   IAQGYKPSGYNIVPTAGLDAKPFVAEK(SEQ ID No：144)
  2929.46   SASANNVSSTVVSAPELSDAGVTASDKLPR(SEQ ID No：145)
  Lw550   66   867.49   VSGLLSHR(SEQ ID No：146)
  881.42   TSEYLNR(SEQ ID No：147)
  883.43   EWHGTVR(SEQ ID No：148)
  1020.59   YTLILVDGK(SEQ ID No：149)
  1086.57   RVDIEVNDK(SEQ ID No：150)
  1167.61   VGKEWHGTVR(SEQ ID No：151)
  1176.69   YTLILVDGKR(SEQ ID No：152)
  1207.63   LMGGVYNVLDK(SEQ ID No：153)
  1345.72   IQDSAASISVVTR(SEQ ID No：154)
  1748.72   MDQDENYGTHWTPR(SEQ ID No：155)
  1753.77   NEFDFDIGHYVQDR(SEQ ID No：156)
  1850.95   DVPGVVVTGGGSHSDISIR(SEQ ID No：157)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  2520.27   GTRPNSDGSGIEQGWLPPLAAIER(SEQ ID No：158)
  2606.16   NNYAITHHGYYDFGNSTSYVQR(SEQ ID No：159)
  2942.50   AYTDITDALKDVPGVVVTGGGSHSDISIR(SEQ ID No：160)
  3085.41   NGAATFTLTPDDKNEFDFDIGHYVQDR(SEQ ID No：161)
  Lw552   45   1139.57   VNFTAGVGGYR(SEQ ID No：162)
  1208.61   SSQALAIGSGYR(SEQ IDNo：163)
  1311.65   NSVSIGHESLNR(SEQ ID No：164)
  1439.69   ASTSDTGVAVGFNSK(SEQ ID No：165)
  1500.74   TTLETAEEHTNKK(SEQ ID No：166)
  1525.73   SAETLASANVYADSK(SEQ ID No：167)
  1580.77   SAEVLGLANNYTDSK(SEQ ID No：168)
  1595.78   ALGDSAVTYGAGSTAQK(SEQ ID No：169)
  Lw555   37   704.42   LGFAGLK(SEQ ID No：170)
  880.43   ADAYSGGLK(SEQ ID No：171)
  970.38   DGDQSYMR(SEQ ID No：172)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  1121.57   DGNKLDLYGK(SEQ ID No：173)
  1279.54   AEDQDQGNFTR(SEQ ID No：174)
  1294.58   VDGLHYFSDDK(SEQ ID No：175)
  1334.67   INLLDENEFTK(SEQ ID No：176)
  1509.71   VDGLHYFSDDKSK(SEQ ID No：177)
  1907.96   NAGINTDDIVAVGLVYQF(SEQ ID No：178)
  2245.12   NTNFFGLVDGLNFALQYQGK(SEQ ID No：179)
  2324.11   YDANNVYLAATYAQTYNLTR(SEQ ID No：180)
  2642.22   GETQISDQLTGYGQWEYQANLNK(SEQ ID No：181)
  2984.54   AQNIELVAQYQFDFGLRPSVAYLQSK(SEQ ID No：182)
  3087.49   FGLKGETQISDQLTGYGQWEYQANLNK(SEQ ID No：183)
  Lw557   31   863.51   TVYLQIK(SEQ ID No：184)
  1403.71   NTSDKNMLGLAPK+氧化(M)(SEQ ID No：185)
  1615.81   FEEAQPVLEDQLAK(SEQ ID No：186)
  1779.83   TQMSETIWLEPSSQK+氧化(M)(SEQ ID No：187)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列(括号中列出了SEQ ID号)
  1875.92   VQTSTQTGNKHQYQTR(SEQ ID No：188)
  2070.10   VNLKFEEAQPVLEDQLAK(SEQ ID No：189)
  2378.15   GYTVTSSPEDAHYWIQANVLK(SEQ ID No：190)
1.通过SDS-PAGE测定的分子量。
2.通过给质量加1可以将多肽片段的质量转换为m/z值。每个质量包括加或减1Da或加或减300ppm的范围。
表2.从鼠疫耶尔森氏菌中获得的多肽的特征。
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  Lw529   104   643.43   ALISLK(SEQ ID No：191)
  684.36   SIYFR(SEQ ID No：192)
  770.49   ILIGEVK(SEQ ID No：193)
  840.46   NPVARER(SEQ ID No：194)
  898.55   AVQDIILK(SEQ ID No：195)
  961.55   YPLISELK(SEQ ID No：196)
  1136.61   NGIIFSPHPR(SEQ ID No：197)
  1276.63   EAGVQEADFLAK(SEQ ID No：198)
  1292.62   NFEEAVEKAEK(SEQ ID No：199)
  1385.65   VVDESEPFAHEK(SEQ ID No：200)
  1409.76   NGGLNAAIVGQPATK(SEQ ID No：201)
  1421.84   AAALAAADARIPLAK(SEQ ID No：202)
  1497.82   AVTNVAELNELVAR(SEQ ID No：203)
  1566.75   QTAFSQYDRPQAR(SEQ ID No：204)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1678.89   LLKEFLPASYNEGAK(SEQ ID No：205)
  1683.82   YAEIADHLGLSAPGDR(SEQ ID No：206)
  1725.93   GSLPIALEEVATDGAKR(SEQ ID No：207)
  1872.90   EYANFSQEQVDKIFR(SEQ ID No：208)
  1990.91   NHFASEYIYNAYKDEK(SEQ ID No：209)
  2020.06   ILINTPASQGGIGDLYNFK(SEQ ID No：210)
  2182.01   EYVEEFDREEEVAAATAPK(SEQ ID No：211)
  2584.21   YNANDNPTKQTAFSQYDRPQAR(SEQ ID No：212)
  2842.48   AAYSSGKPAIGVGAGNTPVVVDETADIKR(SEQ ID No：213)
  Lw530   99   1190.64   ILFYTGVNHK(SEQ ID No：214)
  1513.80   YRNIGISAHIDAGK(SEQ ID No：215)
  1590.77   HSDDKEPFSALAFK(SEQ ID No：216)
  1596.83   IATDPFVGNLTFFR(SEQ ID No：217)
  1636.82   YLGGEELTEEEIKK(SEQ ID No：218)
  1670.86   MEFPEPVISVAVEPK(SEQ ID No：219)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1713.93   EFIPAVDKGIQEQLK(SEQ ID No：220)
  1718.96   LGANPVPLQLAIGAEEK(SEQ ID No：221)
  1750.91   VYSGIVNSGDTVLNSVK(SEQ ID No：222)
  1819.92   EFNVEANVGKPQVAYR(SEQ ID No：223)
  1863.01   EEIKEVHAGDIAAAIGLK(SEQ ID No：224)
  1966.91   LHYGSYHDVDSSELAFK(SEQ ID No：225)
  2122.10   VYSGIVNSGDTVLNSVKSQR(SEQ ID No：226)
  LW531   94   961.44   NRDEWSR(SEQ ID No：227)
  1167.49   YEYGMFSQK+氧化(M)(SEQ ID No：228)
  1257.64   VSVIDENNGRR(SEQ ID No：229)
  1371.63   VLYPDDSTYSGR(SEQ ID No：230)
  1383.64   EENDPGLGNGGLGR(SEQ ID No：231)
  1408.71   IIDAPDNNWVPR(SEQ ID No：232)
  1520.82   NLDYPSFLLALQK(SEQ ID No：233)
  1668.86   EYADEIWHIKPIR(SEQ ID No：234)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1685.79   SYVDTQEQVDALYR(SEQ ID No：235)
  1713.78   GYGIRYEYGMFSQK+氧化(M)(SEQ ID No：236)
  1716.81   TLLNIANMGYFSSDR+氧化(M)(SEQ ID No：237)
  1796.92   TSPFSYTSPVVSVDALK(SEQ ID No：238)
  1832.92   LVEEQYPDDKELLSR(SEQ ID No：239)
  1844.91   KTLLNIANMGYFSSDR+氧化(M)(SEQ ID No：240)
  2218.12   IAIHLNDTHPVLSIPEMMR+2氧化(M)(SEQ ID No：241)
  2426.09   FNQGDYFAAVEDKNHSENVSR(SEQ ID No：242)
  Lw532   88   888.51   YIQAAVPK(SEQ ID No：243)
  926.46   FNINYTR(SEQ ID No：244)
  945.53   SGFLIPNAK(SEQ ID No：245)
  960.54   IGFNIELR(SEQ ID No：246)
  1171.60   AQYLYVPYR(SEQ ID No：247)
  1176.57   GLQWQNEFR(SEQ ID No：248)
  1289.64   ITGWNAQGQTSK(SEQ ID No：249)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1332.67   RGLQWQNEFR(SEQ ID No：250)
  1357.66   EEQVVEVWNAR(SEQ ID No：251)
  1403.74   IASANQVSTGLTSR(SEQ ID No：252)
  1418.68   FTSVNPTNPEASR(SEQ ID No：253)
  1507.73   IYTGPDGTDKNATR(SEQ ID No：254)
  1578.78   FNVSVGQIYYFSR(SEQ ID No：255)
  1672.80   QFQVFTAAGNSNAYR(SEQ ID No：256)
  1735.83   TVTATGDVNYDDPQIK(SEQ ID No：257)
  2400.17   LLATHYQQDIPASFADNASNPK(SEQ ID No：258)
  2665.28   VYNPDYQQGISQVGTTASWPIADR(SEQ ID No：259)
  Lw533   77   686.37   DIGNIR(SEQ ID No：260)
  784.49   RIEIVR(SEQ ID No：261)
  858.41   VSYFDTK(SEQ ID No：262)
  952.50   AKDYISTR(SEQ ID No：263)
  1140.65   DLPVSILAGTR(SEQ ID No：264)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1155.66   QGVLTLVDGVR(SEQ ID No：265)
  1170.64   QVPGLTVTGSGR(SEQ ID No：266)
  1197.57   YYNNSAIEPK(SEQ ID No：267)
  1402.71   EQTTEGVKLENR(SEQ ID No：268)
  1408.68   TDDLDGILSFGTR(SEQ ID No：269)
  1482.73   TALFNWDLAYNR(SEQ ID No：270)
  1522.71   EYYTPQGIPQDGR(SEQ ID No：271)
  1550.77   FSSGWLQDEITLR(SEQ ID No：272)
  1617.74   HSTDTMVVTATGNER(SEQ ID No：273)
  1674.78   QEQTPGGATESFPQAK(SEQ ID No：274)
  1745.84   KHSTDTMVVTATGNER(SEQ ID No：275)
  1787.92   GTWQIDSIQSLSANLR(SEQ ID No：276)
  1819.96   IRFSSGWLQDEITLR(SEQ ID No：277)
  1851.87   VDMQAMTTTSVNIDQAK(SEQ ID No：278)
  1940.75   YDNYSGSSDGYADVDADK(SEQ ID No：279)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  2013.02   QGTDTGHLNSTFLDPALVK(SEQ ID No：280)
  2017.97   QSNGFNAPNDETISNVLAK(SEQ ID No：281)
  2056.96   VYS SAATGDHSFGLGASAFGR(SEQ ID No：282)
  2168.01   VSSSTPQAGYGVNDFYVSYK(SEQ ID No：283)
  2169.10   LFIESPASHLLTYGTETYK(SEQ ID No：284)
  2426.25   TRLFIESPASHLLTYGTETYK(SEQ ID No：285)
  2457.00   YDNYSGSSDGYADVDADKWSSR(SEQ ID No：286)
  2828.33   VSSSTPQAGYGVNDFYVSYKGQEAFK(SEQ ID No：287)
  Lw534   73   628.39   IEVIR(SEQ ID No：288)
  748.43   GTIFRR(SEQ ID No：289)
  909.42   GGYEDTLR(SEQ ID No：290)
  930.51   TGGLDISIR(SEQ ID No：291)
  1291.71   LLDSLALTYGAR(SEQ ID No：292)
  1370.81   LLKNTNIILDSK(SEQ ID No：293)
  1440.70   FTQNYANLSAANK(SEQ ID No：294)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1478.71   YDNSANQLGTIGAR(SEQ ID No：295)
  1586.83   EAAASISVISQNELR(SEQ ID No：296)
  1604.86   GMPSAYTLILVDGIR(SEQ ID No：297)
  1640.87   LITNASVPQGSGLAGEK(SEQ ID No：298)
  1654.77   YEYQTTFGGHISPR(SEQ ID No：299)
  1705.82   DASRVESSNTGVELSR(SEQ ID No：300)
  1707.83   AYLVWDAQDNWTVK(SEQ ID No：301)
  1757.91   LNWNINEQLSTWLK(SEQ ID No：302)
  1796.97   LITNASVPQGSGLAGEKR(SEQ ID No：303)
  1856.01   IREAAASISVISQNELR(SEQ ID No：303)
  1912.94   INSVSIDNTTSTYTNVGK(SEQ ID No：304)
  2004.03   DVTLNGAVNNLLDKDFTR(SEQ ID No：305)
  2072.02   FSFYSSGPAVEDQLGLSLR(SEQ ID No：306)
  2155.08   NKINSVSIDNTTSTYTNVGK(SEQ ID No：307)
  2301.07   LDFGTWNSSLSYNQTENIGR(SEQ ID No：308)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  2395.11   NYNDLAQALSDVEGVDVNSSTGK(SEQ ID No：309)
  2484.12   AWASSATLEHTFQENTAFGDSSK(SEQ ID No：310)
  2557.36   VVYNNLGSEFKPFSVLNLGVAYK(SEQ ID No：311)
  2557.36   VVYNNLGSEFKPFSVINLGVAYK(SEQ ID No：312)
  2675.42   TPTLAQLHNGISGVTGQGTITTIGNPK(SEQ ID No：313)
  2983.33   DGIVLANNGDEFAQDAWSLFSEDEWR(SEQ ID No：314)
  3161.51   THIFAVGNGTTTAGDYFTSSQSTAGYVVPGR(SEQ ID No：315)
  3184.52   ITLGNDNRLDFGTWNSSLSYNQTENIGR(SEQ ID No：316)
  3424.79   GGVSTGYKTPTILAQLHNGISGVTGQGTITTIGNPK(SEQ ID No：317)
  3471.62   LEPESSVNTEVGVYYENETGFGANVTLFHNR(SEQ ID No：318)
  Lw535   64   713.42   VPFVPR(SEQ ID No：319)
  759.42   TVGINTR(SEQ ID No：320)
  773.40   AATLGDAR(SEQ ID No：321)
  806.41   YGALMPR(SEQ ID No：322)
  919.48   GPQGTLYGK(SEQ ID No：323)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1023.50   GYIEGGVSSR(SEQ ID No：324)
  1051.53   SINYELGTR(SEQ ID No：325)
  1102.55   ADATGVELEAK(SEQ ID No：326)
  1164.56   DMQLYSGPVR(SEQ ID No：327)
  1186.57   WNQDVQELR(SEQ ID No：328)
  1199.60   TVDMVFGLYR(SEQ ID No：329)
  1281.67   TVGINTRIDFF(SEQ ID No：330)
  1394.68   YGAGSSVNGVIDTR(SEQ ID No：331)
  1444.73   ADATGVELEAKWR(SEQ ID No：332)
  1479.70   ATQDAYVGWNDIK(SEQ ID No：333)
  1545.80   TFPSGSLTVNMPQR(SEQ ID No：334)
  1667.72   SEFTNDSELYHGNR(SEQ ID No：335)
  1692.82   ATQDAYVGWNDIKGR(SEQ ID No：336)
  1730.85   FAPGWSWDINGNVIR(SEQ ID No：337)
  1789.81   LAPDDQPWEMGFAASR(SEQ ID No：338)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1904.85   TYGYMNGSAVAQVNMGR(SEQ ID No：339)
  1968.90   ECTRATQDAYVGWNDIK(SEQ ID No：340)
  1981.02   SAQGGIINIVTQQPDSTPR(SEQ ID No：341)
  2009.89   SSTQYHGSMLGNPFGDQGK(SEQ ID No：342)
  2027.02   LAVNLVGPHYFDGDNQLR(SEQ ID No：343)
  2058.99   YETADVTLQAATFYTHTK(SEQ ID No：344)
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  2377.30   SKFNLSGPIQDGLLYGSVTLLR(SEQ ID No：347)
  2819.49   VAQGYKPSGYNIVPTAGLDAKPFVAEK(SEQ ID No：348)
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  Lw536   60   1010.51   VEDALHATR(SEQ ID No：350)
  1186.65   VAAVKAPGFGDR(SEQ ID No：351)
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  1237.65   ARVEDALHATR(SEQ ID No：353)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1290.65   VGAATEVEMKEK(SEQ ID No：354)
  1566.87   AAVEEGVVAGGGVALIR(SEQ ID No：355)
  1604.88   NVVLDKSFGSPTITK(SEQ ID No：356)
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  1000.53   QTVTTPRAQ(SEQ ID No：362)
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  1257.63   NNLDNALESLR(SEQ ID No：364)
  1299.71   LSQDLAREQIK(SEQ ID No：365)
  1306.65   DAAYEKINEVR(SEQ ID No：366)
  1324.65   AIDSLSYTEAQK(SEQ ID No：367)
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  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1394.76   YNYLINQLNIK(SEQ ID No：369)
  1435.73   ASYDTVLAAEVAAR(SEQ ID No：370)
  1608.93   LKTQRPDAVNNLLK(SEQ ID No：371)
  1615.87   FNVGLVAITDVQNAR(SEQ ID No：372)
  1779.96   TILDVLTATTNLYQSK(SEQ ID No：373)
  1951.01   QITGVYYPELASLNVER(SEQ ID No：374)
  1957.97   AIDSLSYTEAQKQSVYR(SEQ ID No：375)
  2018.98   QAQYNFVGASELLESAHR(SEQ ID No：376)
  2098.10   SPLLPQLGLSAGYTHANGFR(SEQ ID No：377)
  2177.16   QQLADARYNYLINQLNIK(SEQ ID No：378)
  2709.43   INEVRSPLLPQLGLSAGYTHANGFR(SEQ ID No：379)
  Lw538   44   775.40   HTPFFK(SEQ ID No：380)
  836.49   EHILLGR(SEQ ID No：381)
  904.49   FAIREGGR(SEQ ID No：382)
  1026.58   AGENVGVLLR(SEQ ID No：383)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1072.60   GTVVTGRVER(SEQ ID No：384)
  1199.66   EGGRTVGAGVVAK(SEQ ID No：385)
  1231.57   ALEGEAEWEAK(SEQ ID No：386)
  1232.61   GYRPQFYFR(SEQ ID No：387)
  1289.62   DEGGRHTPFFK(SEQ ID No：388)
  1375.63   AFDQIDNAPEEK(SEQ ID No：389)
  1602.76   AFDQIDNAPEEKAR(SEQ ID No：390)
  1613.89   VGEEVEIVGIKDTVK(SEQ ID No：391).
  1709.94   LLDEGRAGENVGVLLR(SEQ ID No：392)
  1772.87   GITINTSHVEYDTPAR(SEQ ID No：393)
  1794.95   TKPHVNVGTIGHVDHGK(SEQ ID No：394)
  1904.95   ELLSAYDFPGDDLPVVR(SEQ ID No：395)
  1977.01   IIELAGYLDSYIPEPER(SEQ ID No：396)
  2000.01   ARGITINTSHVEYDTPAR(SEQ ID No：397)
  Lw683   37   690.4064   VGFAGLK(SEQ ID No：398)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  893.4606   ANAYTGGLK(SEQ ID No：399)
  910.4330   GNGMLTYR(SEQ ID No：400)
  1049.5617   RANAYTGGLK(SEQ ID No：401)
  1114.4931   SSDAAFGFADK(SEQ ID No：402)
  1119.4906   NMSTYVDYK(SEQ ID No：403)
  1121.4697   NGSSSETNNGR(SEQ ID No：404)
  1197.5084   NLDGDQSYMR(SEQ ID No：405)
  1262.5567   FADYGSLDYGR(SEQ ID No：406)
  1307.6146   IDGLHYFSDNK(SEQ ID No：407)
  1319.7085   INLLDKNDFTK(SEQ ID No：408)
  1422.6739   TTAQNDLQYGQGK(SEQ ID No：409)
  1436.6976   YVDIGATYFFNK(SEQ ID No：410)
  1490.6022   AENEDGNHDSFTR(SEQ ID No：411)
  1533.8038   GKDIGIYGDQDLLK(SEQ ID No：412)
  1578.7750   TTAQNDLQYGQGKR(SEQ ID No：413)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  2245.1167   NTNFFGLVDGLNFALQYQGK(SEQ ID No：414)
  2367.1131   YDANNVYLAANYTQTYNLTR(SEQ ID No：415)
  2487.1124   IDGLHYFSDNKNLDGDQSYMR(SEQ ID No：416)
  2684.2718   GETQITDQLTGYGQWEYQVNLNK(SEQ ID No：417)
  2979.5242   AHNIEVVAQYQFDFGLRPSVAYLQSK(SEQ ID No：418)
  3292.4764   GVADQNGDGYGMSLSYDLGWGVSASAAMASSLR(SEQ ID No：419)
  Lw541   31   1019.58   ALASNILYR(SEQ ID No：420)
  1074.51   SDPGAAFPWK(SEQ ID No：421)
  1202.61   KSDPGAAFPWK(SEQ ID No：422)
  1247.61   IFNLVDENER(SEQ ID No：423)
  1321.58   MYNIDYNSFR(SEQ ID No：424)
  1403.64   AWHAGVSYWDGR(SEQ ID No：425)
  1786.80   ALYDAGIGAWYDDETK(SEQ ID No：426)
  1990.03   FPDITPVNVVGHSDIAPGR(SEQ ID No：427)
  2090.99   YGYDTSGAVSEVGYNQLIR(SEQ ID No：428)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  2118.12   FPDITPVNVVGHSDIAPGRK(SEQ ID No：429)
  Lw542   31   1142.58   SDPGPLFPWK(SEQ ID No：430)
  1298.68   SDPGPLFPWKR(SEQ ID No：431)
  1307.76   AIALQLVPEAQR(SEQ ID No：432)
  1340.64   AWHAGVSSWQGR(SEQ ID No：433)
  1370.68   IPQNGQLDTETR(SEQ ID No：434)
  1578.77   GTYQIDTHYPSVAK(SEQ ID No：435)
  1779.95   GAASVAVIQQALAAYGYK(SEQ ID No：436)
  1789.94   FLVLHYTAVGDAESLR(SEQ ID No：437)
  1953.00   YNISPSDVVAHSDIAPLR(SEQ ID No：438)
  2190.12   NNLNDTSIGIEIVNLGFTEK(SEQ ID No：439)
  2630.38   AIALQLVPEAQRAWHAGVSSWQGR(SEQ ID No：440)
  Lw544   20   806.42   LIDGDFK(SEQ ID No：441)
  1113.50   GFEESVDGFK(SEQ ID No：442)
  1209.60   VGTWMLGAGYR(SEQ ID No：443)
  多肽名称   以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的质量2   多肽片段的预测氨基酸序列
  1243.58   FSSIFGQSESR(SEQ ID No：444)
  1258.63   YYSVTAGPVFR(SEQ ID No：445)
  1269.60   RGFEESVDGFK(SEQ ID No：446)
  1356.66   VGTWMLGAGYRF(SEQ ID No：447)
  1789.94   INEYVSLYGLLGAGHGK(SEQ ID No：448)
  2002.92   YEFNNDWGVIGSFAQTR(SEQ ID No：449)
  2988.43   TSLAYGAGLQFNPHPNFVIDASYEYSK(SEQ ID No：450)
1.通过SDS-PAGE测定的分子量。
2.通过给质量加1可以将多肽片段的质量转换为m/z值。每个质量包括加或减300ppm的范围。
在另一方面，本发明进一步包括与氨基酸序列具有相似性的多肽。该相似性称为结构相似性，并且一般通过比对2个氨基酸序列(即候选氨基酸序列和参照氨基酸序列)的残基，以沿其序列的长度最优化相同氨基酸的数目来确定；在进行比对时允许任一或两个序列中的缺口，以最优化相同氨基酸的数目，尽管每个序列中的氨基酸仍必须保持其正确顺序。表3和表4中公开了参照氨基酸序列。使用商购可得的算法可以比较2个氨基酸序列。优选地，2个氨基酸序列可以使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序比较，如Tatusova，等人(FEMSMicrobiol Lett 1999，174：247-250)所描述的，并且可以通过环球网获得，例如在国立卫生研究院、国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，National Institutes of Health)维护的因特网网站上。优选地，使用所有BLAST 2搜索参数的缺省值，包括矩阵＝BLOSUM62；开放缺口罚分(open gap penalty)＝11，延伸缺口罚分(extension gap penalty)＝1，缺口x_减少(dropoff)＝50，期望＝10，字长(wordsize)＝3，并且任选地，开启过滤器。使用BLAST搜索算法比较2个氨基酸序列时，结构相似性称为“同一性”。优选地，候选氨基酸序列与参照氨基酸序列具有至少80％的同一性，至少90％的同一性，至少95％的同一性，至少96％的同一性，至少97％的同一性，至少98％的同一性，或至少99％的同一性。优选地，候选氨基酸序列和参照氨基酸序列的分子量是基本上相同的值。优选地，候选氨基酸序列和参照氨基酸序列的分子量通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定。通过在低金属条件下培养微生物并随后通过本文公开的程序分离多肽可以获得候选多肽。
表3
  参照多肽的分子量(kDa)1   通过计算机算法鉴别为与参照多肽的质量指纹图谱具有最佳匹配的多肽的NCBI序列标识符  SEQ ID NO：
  268   23630568，粘附素YadA  1
  83   282049，氯高铁血红素受体前体  2
  83   49114，高铁色素受体FcuA  3
  79   565634，铁草铵受体  4
  70   517386，FyuA前体  5
66   77958488，ferrienterochelin和大肠杆菌素的外膜受体 6
  45   23630568，粘附素YadA  7
  37   77956419，外膜蛋白(孔蛋白)  8
  31   48605，YlpA蛋白  9
1.通过SDS-PAGE测定的分子量。
表4
  参照多肽的分子量(kDa)1   通过计算机算法鉴别为与参照多肽的质量指纹图谱具有最佳匹配的多肽的NCBI序列标识符  SEQ IDNO：
104   22125915，CoA-连接的乙醛脱氢酶 10
  99   51597993，延伸因子G  11
  94   15981846，糖原磷酸化酶  12
88   45443416，有机溶剂耐受蛋白前体 13
77   22124457，TonB-依赖性外膜受体 14
73   51595142，假定的外源铁的铁载体受体；Iha粘附素 15
64   22126288，鼠疫菌素/耶尔森氏菌素外膜受体 16
  60   51594757，陪伴蛋白GroEL  17
  46   22127390，外膜通道前体蛋白  18
  44   51597992，延伸因子Tu  19
  37   77633559，外膜蛋白(孔蛋白)  20
  31   22125738，假定的调节物  21
  31   22125770，假定的调节物  22
  20   22125223，外膜蛋白X  23
1.通过SDS-PAGE测定的分子量。
一般地，与参照氨基酸序列具有结构相似性的候选氨基酸序列具有免疫原性活性、保护性免疫原性活性、血清反应活性、免疫调节活性、或其组合。
通过在低金属条件下培养参照微生物并随后通过本文公开的方法分离多肽可以获得由参照微生物表达且具有上文提及的分子量的多肽。候选多肽可从微生物中分离，优选革兰氏阴性微生物，更优选肠杆菌科的成员，优选耶尔森氏菌属的成员，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、或鼠疫耶尔森氏菌。候选多肽还可利用重组、酶或化学技术产生。
本发明还提供了微生物的全细胞制剂，其中所述微生物表达一种或多种本发明多肽。存在于全细胞制剂中的细胞优选是灭活的，从而使得细胞不能复制，但维持了由微生物表达的本发明多肽的免疫原性活性。一般地，通过暴露于试剂例如戊二醛、福尔马林或甲醛来杀死细胞。
本发明组合物可以包括至少一种本文描述的多肽，或是大于1的整数(例如，至少2、至少3、至少4的许多多肽。在某些方面，组合物可以包括至少2种金属调节的多肽和其表达不受金属存在的明显影响的至少2种多肽。例如，当多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离时，组合物可以包括2、3、4、5或更多种分离的金属调节的多肽，其具有268kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、45kDa的分子量，或其任何子集或组合，和2种分离的多肽，其具有92kDa、54kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、28kDa的分子量，或其任何子集或组合。在另一实例中，当多肽从鼠疫耶尔森氏菌中分离时，组合物可以包括2、3、4、5或更多种分离的金属调节的多肽，其具有254kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、31kDa、28kDa、20kDa的分子量，或其任何子集或组合，和2种分离的多肽，其具有104kDa、99kDa、60kDa、44kDa、46kDa、37kDa、36kDa的分子量，或其任何子集或组合。组合物可以包括从1种微生物中可分离，或可以从2种或更多种微生物的组合中可分离的多肽。例如，组合物可以包括从2种或更多种耶尔森氏菌属物种、从2种或更多种小肠结肠炎耶尔森氏菌株、或从耶尔森氏菌属物种和不是耶尔森氏菌属成员的不同微生物中可分离的多肽。本发明还提供了包括一种或多种耶尔森氏菌属物种的全细胞制剂的组合物。
任选地，本发明多肽可以共价结合或缀合至载体多肽，以提高多肽的免疫特性。有用的载体多肽是本领域已知的。例如，本发明多肽可以偶联至已知的耶尔森氏菌外膜免疫原，例如F1抗原或V抗原。同样地，多糖组分可以缀合至本发明的蛋白质以增强组合物的保护作用。利用已知和常规方法可以进行本发明多肽的化学偶联。例如，可以使用各种同双功能和/或异双功能交联剂，例如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、双(重氮联苯胺)、己二酰亚氨酸二甲酯、庚二亚胺酸二甲酯、dimethyl superimidate、辛二酸双琥珀酰亚胺酯、戊二醛、间-马来酸亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺、磺基-间-马来酸亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酸亚胺基甲基)环己烷(cycloheane)-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基-苯基)丁酸酯和(1-乙基-3-(二甲基-氨丙基)碳二亚胺(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，一般地和第5章，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，NY(1988))。
优选地，本发明的此类组合物包括低浓度的脂多糖(LPS)。LPS是大多数革兰氏阴性微生物的外膜组分(参见，例如，Nikaido和Vaara，Outer Membrane，In：Escherichia coli and Salmonellatyphimurium，Cellular and Molecular Biology，Neidhardt等人(eds.)American Society for Microbiology，Washington，D.C.，pp.7-22(1987))，且一般包括多糖(O-特异性链，外和内核)和脂质A区域。LPS的脂质A组分是LPS结构中最具生物学活性的组分，并且一起在哺乳动物中诱导广谱的病理生理学作用。最引入注目的作用是发烧、弥散性血管内凝血、补体激活、低血压性休克和死亡。LPS的非特异性免疫刺激活性可以增强包括LPS的组合物施用部位的肉芽肿的形成。
使用本领域已知的常规方法可以确定LPS的浓度。此类方法一般包括测量由LPS的染料结合(参见，例如，Keler和Nowotny，Analyt.Biochem.，156，189(1986))或使用鲎变形细胞溶解物(LAL)试验(参见，例如，Endotoxins and Their Detection With the LimulusAmebocyte Lystate Test，Alan R.Liss，Inc.，150 Fifth Avenue，NewYork，NY(1982))。有4种基本的商购可得的方法一般与LAL试验一起使用：凝胶-凝结测试；比浊(分光光度)测试；比色测试；和生色测试。凝胶-凝结测定的实例在商标名E-TOXATE(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO；参见Sigma Technical Bulletin No.210)和PYROTELL(Associates of Cape Cod，Inc.，East Falmouth，MA)下可获得。一般地，测定条件包括使组合物与包含鲎(美洲鲎(Limuluspolyphemus))的循环变形细胞裂解物的制剂接触。当暴露于LPS时，裂解物的不透明性以及粘性增加并且可以胶凝。向裂解物中加入约0.1毫升组合物。一般地，组合物的pH为6-8，优选6.8-7.5。组合物和裂解物的混合物在约37℃不受干扰地温育约1小时。温育后，观察混合物以确定混合物是否有胶凝作用。胶凝作用表明内毒素的存在。为了确定组合物中存在的内毒素的量，制备内毒素标准化溶液的稀释物并在测试组合物的同时进行测试。内毒素标准化溶液从例如SigmaChemical(目录号210-SE)、U.S.Pharmacopeia(Rockville，MD，目录号235503)和Associates of Cape Cod，Inc.，(目录号E0005)商购可得。一般而言，当本发明组合物通过如本文所述方法(例如，包括破裂和增溶细胞，并收集不溶性多肽的方法)从微生物中分离多肽进行制备时，本发明组合物中的LPS量少于已在相同条件下破裂但未增溶的相同量微生物混合物中存在的LPS量。一般地，相对于通过破裂但未增溶相同微生物制备的组合物中的LPS水平，本发明组合物中的LPS水平，以优选渐增的顺序，降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。
本发明组合物任选进一步包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的”指稀释剂、载体、赋形剂、盐等，它们与组合物的其他成分相容，且对其受体无害。一般地，当组合物如本文所述进行使用时，组合物包括药学上可接受的载体。本发明组合物可以以适合于所选施用途径的各种形式在药物制剂中进行配制，所述途径包括适合于刺激针对抗原的免疫应答的途径。因此，本发明组合物可以经由已知途径进行施用，包括例如，经口的；肠胃外的(parental)，包括皮内、经皮和皮下、肌内、静脉内、腹膜内等，和局部地，例如鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、皮内、经皮和经直肠等。可以预见组合物可以施用于粘膜表面，例如通过施用于鼻或呼吸粘膜(例如喷雾剂或气溶胶)，以刺激粘膜免疫，例如产生遍及动物身体的分泌型IgA抗体。
本发明组合物还可经由持续释放或延迟释放植入物施用。适合于根据本发明使用的植入物是已知的并且包括，例如，Emery和Straub(WO 01/37810(2001))，和Emery等人(WO 96/01620(1996))公开的那些。可以生产尺寸足够小以通过气溶胶或喷雾剂施用的植入物。植入物还包括纳米球体(nanosphere)和微球体。
本发明组合物可以以足以治疗如本文所述的特定状况的量施用。本发明组合物中存在的多肽或全细胞的量可以改变。例如，多肽的剂量可以为0.01微克(μg)-300mg，一般为0.01mg-10mg。当组合物是全细胞制剂时，细胞可以存在的浓度是例如，102细菌/ml、103细菌/ml、104细菌/ml、105细菌/ml、106细菌/ml、107细菌/ml、108细菌/ml、或109细菌/ml。对于可注射的组合物(例如，皮下、肌内等)，多肽可以以这样的量存在于组合物中，从而使得施用的组合物的总体积为0.5ml-5.0ml，一般为1.0-2.0ml。当组合物是全细胞制剂时，细胞优选以这样的量存在于组合物中，从而使得施用的组合物的总体积为0.5ml-5.0ml，一般为1.0-2.0ml。施用的量将依各种因素而变，所述因素包括但不限于，所选择的特定多肽，动物的重量、身体状况和年龄，以及施用途径。因此，在给定单位剂量形式中包括的多肽的绝对重量可以在很大程度上变化，并且取决于下列因素：动物的物种、年龄、重量和身体状况，以及施用方法。此类因素可以由本领域技术人员来确定。Emery等人(美国专利6,027,736)公开了适合于本发明的剂量的其他实例。
制剂可以常规地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域众所周知的方法进行制备。制备包括药学上可接受的载体的组合物的所有方法包括使活性化合物(例如，本发明多肽或全细胞)与构成一种或多种附属成分的载体结合的步骤。一般而言，通过下列步骤制备制剂：使活性化合物与液体载体、精细分开的固体载体或两者均匀且密切地结合，并且随后，如果需要，将产品塑造成所需制剂。
包括药学上可接受的载体的组合物还可包括佐剂。“佐剂”指可以以非特异性方式起作用以增强针对特定抗原的免疫应答的试剂，从而有效减少在任何给定免疫组合物中必需的抗原量，和/或减少为了产生针对目的抗原的适当免疫应答必需的注射频率。佐剂可以包括例如，IL-1、IL-2、乳化剂、胞壁酰二肽、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)、阿夫立定、氢氧化铝、油、皂苷、α-生育酚、多糖、乳化的石蜡(包括，例如在商标名EMULSIGEN下从MVPLaboratories，Ralston，Nebraska可获得的那些)、ISA-70、RIBI和本领域已知的其他物质。预期本发明多肽将具有免疫调节活性，并且此类多肽可以用作直接充当T和/或B细胞激活物或对特定细胞类型起作用的佐剂，所述佐剂增强各种细胞因子的合成或激活细胞内的信号传导途径。此类多肽预期增加免疫应答以增加现有组合物的保护指数。
在另一实施方案中，包括药学上可接受的载体的本发明组合物可以包括生物学应答调节物，例如，IL-2、IL-4和/或IL-6、TNF、IFN-α、IFN-γ、以及影响免疫细胞的其他细胞因子。免疫组合物还可包括本领域已知的其他组分，例如抗生素、防腐剂、抗氧化剂或螯合剂。
本发明还提供了用于获得本文描述的多肽的方法。本发明多肽和全细胞可从耶尔森氏菌属物种中分离。优选的实例包括小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、和假结核耶尔森氏菌。对获得本发明多肽和制备全细胞制剂有用的微生物很容易获得。此外，此类微生物可容易地利用本领域常规和已知的技术分离。微生物可以作为野外分离物来源于感染的动物，并且用于获得本发明多肽和/或全细胞制剂，或在包含20％甘油的细菌学培养基及其他相似的培养基中贮存在例如-20℃--95℃的冷冻贮藏室中，用于未来使用。
当本发明多肽将从微生物获得时，微生物可以在低金属条件下温育。如本文所使用的，短语“低金属条件”指环境，一般是细菌学培养基，其包含的游离金属的量引起微生物表达或增强表达金属调节的多肽。如本文所使用的，短语“高金属条件”指包含游离金属的量的环境，所述量导致微生物不以可检测水平表达本文所述的一种或多种金属调节的多肽，或减少表达此类多肽。金属是周期表中在族1-17下存在的那些(IUPAC表示法；在CAS表示法下还分别称为族I-A、II-A、III-B、IV-B、V-B、VI-B、VII-B、VIII、I-B、II-B、III-A、IV-A、V-A、VI-A、和VII-A)。优选地，金属是族2-12中的那些，更优选族3-12。再更优选地，金属是铁、锌、铜、镁、镍、钴、锰、钼或硒，最优选铁。
低金属条件一般是向细菌学培养基中添加金属螯合化合物，或使用配制为包含低量金属的细菌学培养基的结果。当螯合剂不存在于培养基中、向培养基中添加金属、或其组合时，一般存在高金属条件。金属螯合剂的实例包括天然和合成的化合物。天然化合物的实例包括植物酚类化合物，例如类黄酮(flavenoid)。类黄酮的实例包括铜螯合剂儿茶素和柚皮素，以及铁螯合剂杨梅黄酮和槲皮素。合成铜螯合剂的实例包括，例如四硫代钼酸盐，并且合成锌螯合剂的实例包括，例如N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)-乙二胺。合成铁螯合剂的实例包括2，2′-联吡啶(在本领域也称为α，α′-联吡啶)、8-羟基喹啉、乙二胺-二-O-羟基苯乙酸(EDDHA)、甲磺酸去铁胺(desferol)、转铁蛋白、乳铁蛋白、卵传铁蛋白、生物学铁载体，例如，儿茶酚酸盐(catecholate)和异羟肟酸盐和柠檬酸盐。优选地，使用2，2′-联吡啶用于螯合铁。一般地，加入培养基中的2，2′-联吡啶的浓度为至少0.0025微克/毫升(μg/ml)、至少0.025μg/ml、或至少0.25μg/ml，并且一般不大于10μg/ml、不大于20μg/ml、或不大于30μg/ml。
预期在fur基因中具有突变的耶尔森氏菌属物种将导致许多(如果不是所有的话)本发明的铁调节的多肽的组成型表达。耶尔森氏菌属物种中的fur突变的产生可以使用常规方法产生，所述方法包括例如对于在革兰氏阴性细菌中产生基因敲除突变有用的转座子、化学、或定点诱变。
用于温育微生物的培养基和用于温育微生物的培养基的体积可以改变。当评估微生物产生一种或多种本发明所述多肽的能力时，微生物可以在适当的体积中生长，例如，10毫升-1升培养基。当培养微生物以获得在例如给动物施用中使用的多肽时，微生物可以在发酵罐中生长以允许分离较大量的多肽。用于在发酵罐中培养微生物的方法是本领域常规和已知的。用于培养微生物的条件优选包括金属螯合剂，更优选铁螯合剂，例如2，2′-联吡啶，6.5-7.5、优选6.9-7.1的pH，和37℃的温度。
在本发明的某些方面，微生物可以在生长后收获。收获包括将微生物浓缩至较小体积并悬浮在不同于生长培养基的培养基中。用于浓缩微生物的方法是本领域常规和已知的，并且包括例如过滤或离心。一般地，将浓缩的微生物悬浮在减少量的缓冲液中。优选地，最终缓冲液包括阳离子螯合剂，优选乙二胺四乙酸(EDTA)。可以使用的缓冲液的实例包含Tris-碱(7.3克/升)和EDTA(0.9克/升)，pH为8.5。任选地，最终缓冲液还使蛋白水解降解最小化。这可以通过具有大于8.0、优选至少8.5的pH的最终缓冲液，和/或包括一种或多种蛋白酶抑制剂(例如苯基甲基磺酰氟)来实现。任选和优选地，浓缩的微生物冷冻于-20℃或以下直至破裂。
当微生物将用作全细胞制剂时，收获的细胞可以使用常规和已知方法处理以灭活细胞。可替代地，当微生物将用于制备本发明多肽时，使用本领域常规和已知的化学、物理或机械方法可以破裂微生物，所述方法包括，例如弗氏压碎器、超声处理、或匀浆。优选地，使用匀浆。用于匀浆的适当装置的实例是C500型Avestin Homogenizer，(Avestin Inc，Ottawa，加拿大)。如本文所使用的，“破裂”指打碎细胞。通过本领域常规和已知的方法可以测量微生物的破裂，所述方法包括，例如光密度的改变。一般地，对微生物实施破裂直至当测量1∶100稀释物时，百分比透射率增加20％。在破裂过程中的温度一般保持在低温，优选4℃，以进一步使蛋白水解降解最小化。
将破裂的微生物增溶于去污剂中，例如阴离子、两性离子、非离子、或阳离子去污剂。优选地，去污剂是肌氨酸，更优选月桂酰肌氨酸钠。如本文所使用的，术语“增溶”指将细胞材料(例如，多肽、核酸、碳水化合物)溶解于在其中破裂微生物的缓冲液的水相中，并且形成不溶性细胞材料的聚集物。用于增溶的条件优选导致本发明多肽聚集为足够大以允许通过例如离心容易分离的不溶性聚集物。
当破裂的微生物增溶于更高水平的肌氨酸中、增溶更长时间段、或其组合时，一般观察到LPS的明显减少。优选地，添加肌氨酸从而使得肌氨酸与破裂微生物的克重量的最终比是1.0克肌氨酸/4.5克沉淀质量-6.0克肌氨酸/4.5克沉淀质量，优选4.5克肌氨酸/4.5克沉淀质量。通过本领域常规和已知的方法可以测量微生物的增溶，所述方法包括，例如光密度的改变。一般地，允许增溶发生至少24小时，优选至少48小时，更优选至少72小时，最优选至少96小时。破裂过程中的温度一般保持在低温，优选4℃。
通过本领域常规和已知的方法可以分离包括一种或多种本发明多肽的不溶性聚集物。优选地，通过离心分离不溶性聚集物。一般地，离心不溶于去污剂的多肽要求至少50,000×g，一般100,000×g的离心力。此类离心力的使用要求使用超速离心机，并且对于这些类型的离心机按比例增加以处理大体积的样品通常很困难且不经济。本文描述的方法为不溶性聚集物的生产作准备，所述聚集物足够大以允许使用明显更低的离心力(例如，46,000×g)。用于在这些较低离心力下处理大体积的方法是本领域可用和已知的。因此，不溶性聚集物可以以明显更低的成本进行分离。对离心大体积有用的适当装置的实例包括T-1 Sharples(Alfa Laval Separations，Warminster，PA)和HitachiHimac CC40高速离心机(Hitachi-Koki Co，Tokyo，日本)。
任选和优选地，从分离的多肽中去除肌氨酸。用于从分离的多肽中去除肌氨酸的方法是本领域已知的，并且包括例如渗滤、沉淀、疏水层析、离子交换层析、或亲和层析、和超滤、以及通过渗滤在乙醇中洗涤多肽。分离后，将多肽悬浮于缓冲液中并贮存于低温，例如-20℃或以下。
本发明多肽还可使用本领域已知方法从耶尔森氏菌属的成员中获得。多肽的分离可以如例如Emery等人(美国专利5,830,479)和Emery等人(美国专利申请US 20030036639 A1)中所述来完成。
在其中将制备全细胞制剂的本发明的那些方面，可以使用本领域已知的方法。例如，在培养后，通过添加浓度足以灭活培养物中细胞的试剂，例如戊二醛、福尔马林或甲醛可以杀死微生物。例如，可以添加3％(体积∶体积)浓度的福尔马林。在足以灭活细胞的时间段后，通过例如渗滤和/或离心可以收获细胞并洗涤。
本发明的一个方面进一步涉及使用本发明组合物的方法。该方法包括给动物施用有效量的本发明组合物。动物可以是例如鸟类(包括例如鸡或火鸡)、牛(包括例如牛)、山羊(包括例如山羊)、羊(包括例如绵羊)、猪(包括例如猪)、野牛(包括例如水牛)、伴侣动物(包括例如猫、狗和马)、鹿科(Cervidae)的成员(包括例如鹿、麋鹿、驼鹿、北美产驯鹿、和驯鹿)、鱼(包括例如鲑鱼或鳟鱼)、甲壳动物(包括例如龙虾、蟹或虾)、鼠科(Muridae)的成员(包括例如大鼠或小鼠)、或人。
在某些方面，方法可以进一步包括给动物另外施用(例如，一次或多次加强施用)组合物以增强或刺激再次免疫应答。加强可以在第一次施用后某一时间施用，例如在组合物第一次施用后1-8周、优选2-4周。随后的加强可以每年施用1次、2次、3次、4次或更多次。不希望被理论限制，预期在本发明的某些方面每年一次的加强剂量将不必要，因为动物将通过暴露于表达组合物中存在的多肽的微生物在野外受到攻击，所述多肽具有的表位等同于给动物施用的组合物的多肽上存在的表位、或与其在结构上相关。
在一个方面，本发明涉及用于制备抗体的方法，例如诱导动物中产生抗体，或通过重组技术。产生的抗体包括特异性结合组合物中存在的至少一种多肽的抗体。在本发明的这个方面，“有效量”是在动物中有效导致抗体产生的量。用于确定动物是否已产生抗体的方法可以如本文所述进行测定，所述抗体特异性结合本发明组合物中存在的多肽。本发明进一步包括特异性结合本发明多肽的抗体，和包括此类抗体的组合物。
该方法可以用于生产特异性结合由微生物表达的多肽的抗体，所述微生物不同于从其中分离组合物多肽的微生物。如本文所使用的，可以“特异性结合”多肽的抗体是与诱导抗体合成的抗原表位相互作用，或与在结构上相关的表位相互作用的抗体。本发明组合物中存在的至少某些多肽一般包括在不同种类微生物的多肽中保守的表位。因此，使用来源于一种微生物的组合物产生的抗体预期结合由其他微生物表达的多肽，并且提供针对革兰氏阴性生物的广谱保护。抗体可以特异性结合的革兰氏阴性微生物的实例是肠病原体，例如，肠杆菌科的成员，优选耶尔森氏菌属的成员。
本发明还涉及此类抗体靶向微生物的用途，所述微生物表达本发明多肽或具有的表位与本发明多肽上存在的表位在结构上相关的多肽。化合物可以与抗体共价结合，其中所述化合物可以是例如毒素。同样地，此类化合物可以与细菌铁载体例如耶尔森氏菌素共价结合，以靶向微生物。使用已知和常规的方法可以进行本发明的抗体或其部分(例如Fab片段)的化学偶联或缀合。
在一个方面本发明还涉及治疗动物中由革兰氏阴性微生物，优选耶尔森氏菌属的成员引起的感染。如本文所使用的，术语“感染”指革兰氏阴性微生物，优选耶尔森氏菌属的成员存在于动物身体内，这在临床上可能是明显或不明显的。具有由耶尔森氏菌属成员引起、在临床上不明显的感染的动物通常称为无症状携带者。方法包括给具有由耶尔森氏菌属成员引起的感染的动物施用有效量的本发明组合物，并且确定引起感染的耶尔森氏菌属物种是否已减少。用于确定感染是否由耶尔森氏菌属成员引起的方法是本领域常规和已知的。
在另一方面，本发明涉及用于治疗动物中一种或多种特定状况症状的方法，所述动物例如绵羊、牛、山羊、猪、狗、鸟、啮齿类动物和鹿，所述症状可以由耶尔森氏菌属成员感染引起。由耶尔森氏菌属物种感染引起的状况的实例包括，例如在牛、羊和猪动物和人中的腹泻或肠炎，在家猫和人中的鼠疫样病，在牛和绵羊中的流产，在公羊中的附睾炎-睾丸炎，和在绵羊中多发性脓肿的形成。本发明的再一方面涉及治疗鱼的冷水性病，例如在幼鱼中的肠的红口病，特别是在密集水产养殖的鳟鱼和鲑鱼中。与这些状况相关的症状的治疗可以是预防性的，或可替代地，可以在本文所述状况发展后开始。如本文所使用的，术语“症状”指由耶尔森氏菌属物种成员感染引起的状况的受试者中的客观证据。本文提到的与状况相关的症状和此类症状的评估是本领域常规和已知的。预防性的治疗，例如在受试者表现由微生物引起的状况症状前开始的治疗，在本文中称为治疗“处于发展状况危险中”的受试者。一般地，“处于发展状况危险中”的动物是在其中状况已诊断和/或可能暴露于导致所述状况的耶尔森氏菌属物种的区域中存在的动物。因此，组合物的施用可以在本文所述状况发生之前、之中或之后进行。在状况发展后开始的治疗可以导致一种状况的症状严重性减少，或完全消除症状。在本发明的这个方面，“有效量”是有效预防疾病症状表现、减少疾病症状严重性、和/或完全消除症状的量。
本发明还涉及减少革兰氏阴性细菌的建群，例如封闭革兰氏阴性细菌与下列系统的组织的附着位点：骨骼系统(例如骨、软骨、腱和韧带)、肌肉系统(例如骨骼肌和平滑肌)、循环系统(例如心脏、血管、毛细血管和血液)、神经系统(例如脑、脊髓和外周神经)、呼吸系统(例如鼻、气管肺、支气管、细支气管扩张(bronchioceles)、泡)、消化系统(例如口、唾液腺、食管、肝、胃、大肠和小肠)、排泄系统(例如肾、输尿管、膀胱和尿道)、内分泌系统(例如下丘脑、垂体、甲状腺、胰和肾上腺)、生殖系统(例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸和精囊)、淋巴/免疫系统(例如淋巴，淋巴结和淋巴管，单核或白细胞，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞t和b细胞)、和特别的细胞谱系(例如前体细胞、上皮细胞、干细胞)等。优选地，革兰氏阴性细菌是耶尔森氏菌属的成员。方法包括给被耶尔森氏菌属成员建群或处于被其建群危险中的动物施用有效量的本发明组合物。在本发明的这个方面，“有效量”是有效减少微生物对动物建群的量。用于评估动物被微生物建群的方法是本领域常规和已知的。例如，通过测量动物粪便中微生物的存在可以确定动物肠道被微生物建群。预期动物被微生物建群的减少将降低微生物至人类的传播。
本发明组合物可以用于为针对细菌感染的主动或被动免疫作准备。一般地，组合物可以施用于动物以提供主动免疫。然而，组合物还可用于诱导免疫产物例如抗体的产生，这可以从生产动物中收集并施用于另一动物以提供被动免疫。可以从血清、血浆、血液、初乳等中收集免疫组分例如抗体，以制备抗体组合物用于被动免疫疗法。包括单克隆抗体和/或抗独特型的抗体组合物还可使用已知方法进行制备。此类抗体组合物包括嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体包括人类来源的重链和轻链的恒定区，以及鼠来源的抗原特异性的可变区(Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，81(21)：6851-5；LoBuglio等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(11)：4220-4；Boulianne等人Nature，1984，312(5995)：643-6.)。人源化抗体用人类配对物取代鼠恒定区和构架(FR)(可变区的)  (Jones等人Nature，1986，321(6069)：522-5；Riechmann等人Nature，1988，332(6162)：323-7；Verhoeyen等人Science，1988，239(4847)：1534-6；Queen等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(24)：10029-33；Daugherty等人Nucleic Acids Res.，1991，19(9)：2471-6.)。可替代地，可以使用特定的小鼠品系，其已被基因工程改造以产生几乎完全是人类来源的抗体；免疫接种后，收获这些小鼠的B细胞并且使之无限增殖化用于生产人单克隆抗体(Bruggeman和Taussig，Curr.Opin.Biotechnol.，1997，8(4)：455-8；Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，1995；13(1)：65-93；Lonberg等人Nature，1994，368：856-9；Taylor等人Nucleic Acids Res.，1992，20：6287-95.)。被动抗体组合物及其片段，例如scFv、Fab、F(ab′)2或Fv或其其他修饰形式，可以以血清、血浆、血液、初乳等形式施用于受体。然而，抗体还可使用已知方法从血清、血浆、血液、初乳等中分离，以浓缩或重构形式，例如灌洗液、浸渍敷料和/或局部试剂等，用于以后使用。被动免疫制剂对于治疗急性全身疾病，或幼小动物的被动免疫接种特别有利，所述幼小动物不能通过母亲的初乳接受足够水平的被动免疫。对于被动免疫接种有用的抗体还可用于缀合至各种药物或抗体，所述药物或抗体可以直接靶向在全身或局部化感染过程中表达多肽的细菌，所述多肽是本发明多肽或具有的表位与本发明多肽上存在的表位在结构上相关。
动物模型，在特定小鼠模型中，可用于在实验上评估本发明组合物(参见，例如Alpar，H.O.，等人Adv.Drug Deliv.Rev.，51，173-201，(2001)，Brem，D.，等人Microbiology，147，1115-1127，(2001)，Carter，P.B.和E M.Collins，Infect.Immun.，9，851-857，(1974)，Collyn，E，等人Infect.Immun.，72，4784-9470，(2004)，Di Genaro，M.S.，等人Microbiol.Immunol.，42，781-788，(1998)，Grosfeld，H.，等人Infect Immun，71，374-383，(2003)，Jones，S.M.，等人Vaccine，19，358-366，(2001)，Karlyshev，A.V.，等人Infect Immun，69，7810-7819，(2001)，Leary，S.E.，等人MicrobPathog，23，167-179，(1997)，Noll，A.，等人Eur J Immunol，29，986-996，(1999)，Pelludat，C.，等人Infect Immun，70，1832-1841，(2002)，Sabhnani，L.，等人FEMS Immunol Med Microbiol，38，215-29，(2003)，和Williamson，E.D.，等人Vaccine，19，566-571，(2000))。这些小鼠模型是用于研究由耶尔森氏菌属成员引起的人类疾病的通常公认的模型，并且另外已充当在针对预防耶尔森氏菌属物种引起的人类疾病的疫苗开发和最初测试中的公认模型。
本发明的另一方面提供了用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的方法。这些方法在下列方面有用：例如检测动物是否具有特异性结合本发明多肽的抗体，和诊断动物是否具有由微生物引起的状况，所述微生物表达本文所述多肽，或表达与本文所述多肽共有表位的多肽。此类诊断系统可以是试剂盒的形式。方法包括使抗体与包括本发明多肽的制剂接触，以产生混合物。抗体可以存在于生物学样品，例如血液、乳、或初乳中。方法进一步包括在允许抗体特异性结合多肽的条件下温育混合物，以形成多肽：抗体复合物。如本文所使用的，术语“多肽：抗体复合物”指当抗体特异性结合多肽时产生的复合物。包括本发明多肽的制剂还可包括提供适合于形成多肽：抗体复合物的条件的试剂，例如缓冲液。随后检测多肽：抗体复合物。抗体的检测是本领域已知的，并且可以包括例如免疫荧光和过氧化物酶。用于检测特异性结合本发明多肽的抗体存在的方法可以以各种形式使用，所述方法已用于检测抗体，包括放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。
本发明还提供了用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的试剂盒。从怀疑具有由革兰氏阴性微生物引起的感染的动物可以获得检测的抗体，所述微生物更优选肠杆菌科的成员，优选，耶尔森氏菌属成员，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、或鼠疫耶尔森氏菌。试剂盒包括在适当的包装材料中、以足够用于至少一次测定的量的至少一种本发明多肽，或是大于1的整数的许多多肽(例如，至少2、至少3等)。任选地，还包括其他试剂例如实践本发明所需的缓冲液和溶液。例如，试剂盒还可包括允许检测特异性结合本发明多肽的抗体的试剂，例如可检测地标记的第二抗体，其设计为特异性结合从动物中获得的抗体。一般还可包括关于包装多肽使用的说明书。如本文所使用的，短语“包装材料”指用于收纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料一般通过众所周知的方法构造，以提供无菌、无污染物的环境。包装材料可以具有说明多肽可以用于检测特异性结合本发明多肽的抗体的标签。此外，包装材料包含说明试剂盒内的材料如何用于检测抗体的说明书。如本文所使用的，术语“包装”指能够在固定限度内保持多肽及其他试剂，例如第二抗体的容器，例如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是已固定了微克量多肽的微量滴定板。包装还可包含第二抗体。“使用说明书”一般包括描述试剂浓度或至少一种测定方法参数的有形表达，所述参数例如将混合的试剂和样品的相对量，试剂/样品混合物的维持时间段、温度、缓冲液浓度等。
本发明通过下列实施例加以说明。应当理解特定实施例、材料、量和操作将根据如本文阐述的本发明的范围和精神广泛解释。
实施例
实施例1
金属调节的蛋白的产生和分离
在下列实施例中使用的组合物使用来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729和鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+(从R.D.Perry，Universityof Kentucky获得)的蛋白质进行制备。2种菌株各自由冷冻原种接种至包含160μM2，2-联吡啶或300μM FeCl3的25ml胰胨豆胨培养液(TSB)，并且在400rpm振荡时在37℃温育。温育12小时后，将5ml的每种培养物转移至包含160μM 2，2-联吡啶或300μMFeCl3的500ml预温育的(37℃)培养基中，并且在100rpm搅拌时在37℃温育。温育8小时后，培养物在10,000×g离心20分钟。将细菌沉淀重悬浮于100ml无菌生理盐水中并在10,000×g离心10分钟，以去除任何污染性培养基蛋白质。随后将细菌沉淀重悬浮于40mlpH7.2的Tris-缓冲盐水(TBS)中，并使用装备有半英寸破裂机臂的Branson450(Branson，Danbury CT)通过超声处理在4℃破裂1.5分钟。通过在32,000×g离心12分钟澄清破裂的细菌悬浮液。收集上清液并通过添加月桂酰肌氨酸钠(4％体积/体积)在4℃增溶24小时。通过在4℃、32,000×g离心2.5小时收集富含不溶于去污剂的蛋白质的级分。将蛋白质沉淀重悬浮于200μl Tris-缓冲液(pH 7.2)中并贮存于-90℃。每种提取物的样品根据标准方法在10％SDS-PAGE凝胶上分离并通过考马斯蓝染色显现(图3)。
实施例2
来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌的免疫组合物的制备
如实施例1中所述由小肠结肠炎耶尔森氏菌制备的蛋白质用于制备给动物施用的组合物。组合物包含具有268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、45kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、或28kDa的分子量的多肽。具有83kDa、70kDa、和66kDa的分子量的多肽只在铁限制条件下表达，并且具有268kDa、79kDa、和45kDa的分子量的多肽的表达在铁限制条件下增强。
使用IKA Ultra Turrax T-50匀浆管(IKA，Cincinnati，OH)，通过将水性蛋白质悬浮液(500μg总蛋白/ml)乳化到商业佐剂EMULSIGEN(MVP Laboratories，Ralston，Nebraska)中可以由组合物制备原种疫苗。给小鼠施用疫苗以产生在0.1ml可注射体积中50μg总蛋白的最终剂量，其中佐剂浓度为22.5％体积/体积。通过在上述制剂中用生理盐水替代抗原并将悬浮液乳化到EMULSIGEN中以产生22.5％的佐剂浓度，可以制备安慰剂。
实施例3
攻击生物的制备
当用作攻击时，如下制备小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729。简言之，来自冷冻原种的分离物在血琼脂平板上划线并在37℃温育18小时。将单个菌落传代培养到包含25μg/ml 2，2’-联吡啶的50ml胰胨豆胨培养液(Difco)中。培养物在200rpm旋转时在37℃温育6小时，在这个点上培养物在4℃、10,000×g离心10分钟以使细菌沉淀。细菌沉淀通过在生理盐水中在4℃离心来洗涤2次。将最终沉淀重悬浮于25ml生理盐水中并用于攻击。紧在攻击前，将1ml上述细菌悬浮液进行10倍连续稀释以计算CFU数目/小鼠剂量。
实施例4
小鼠接种疫苗和攻击研究以评估针对静脉内攻击的保护
在小鼠中使用活毒性攻击来评估小肠结肠炎耶尔森氏菌组合物的功效。将20只CF-1小鼠(Harlan Breeding Laboratories，Indianapolis，IN)分为2组，每组10只小鼠。对照组中的小鼠接种安慰剂，而第二组中的小鼠用50μg如实施例1中所述获得的组合物免疫。在14天的时间间隔腹膜内施用2次0.1cc的免疫接种。第二次接种疫苗后14天，在外侧尾静脉中给所有小鼠施用攻击剂量的菌株27729(9.4×104 CFU/小鼠)。攻击后7天记录死亡率。
10只接种了安慰剂的小鼠中，10只(100％)在攻击168小时内死亡，而没有一只接种疫苗的小鼠在相同时间段内死亡。此外，所有接种疫苗的小鼠在研究的剩余时间内存活，所述研究在攻击后20天时结束。Kaplan-Meier存活分析和对数秩(logrank)检验(参见图1)表明免疫接种提供了针对攻击的在统计学上显著(p＜0.0001-)的保护。这些结果提示来自在铁限制条件下培养的小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白质构成了静脉内感染小鼠模型中的有效抗原。
实施例5
小肠结肠炎耶尔森氏菌蛋白与超免疫和恢复期的小鼠多克隆血清的蛋白印迹分析
蛋白印迹分析用于评估来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌、针对超免疫小鼠的多克隆血清和恢复期血清的免疫反应性蛋白。在用实施例2中描述的组合物接种后获得超免疫小鼠的多克隆血清，并且从在实施例4中描述的试验后存活下来的接种疫苗/攻击小鼠获得恢复期血清。组合物包含具有268kDa、92kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、52kDa、41kDa、38kDa、37kDa、31kDa、28kDa的分子量的多肽，和具有83kDa的分子量的2种蛋白质。具有83kDa、70kDa、和66kDa的分子量的多肽只在铁限制条件下表达。
为了获得超免疫的血清，如实施例4中所述在14天的时间间隔使小鼠免疫2次。第二次免疫接种后14天从小鼠收集超免疫的多克隆血清。攻击后14天获得来源于接种疫苗/攻击小鼠的恢复期血清。来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌株27729的蛋白质首先在SDS-PAGE(4％的浓缩胶/10％的分离胶)上按照大小分级分离，其中使用如实施例1中所述的30ug总蛋白。使用宽范围万花筒标准(broad rangekaleidoscope standards)(BioRad)来显现条带迁移以帮助电印迹(electroblot)转移，而生物素化的宽范围标准用作印迹上的分子量参照。对于蛋白印迹分析，使用BioRad反式-印迹(Trans-Blot)传递细胞，在4℃、50伏特下，在Towbin缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、和20％甲醇)中，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶电印迹到反式-印迹硝化纤维素膜(BioRad)上过夜。通过标准方法使用3.0％鱼明胶(BioRad)封闭硝化纤维素膜。超免疫的多克隆血清和恢复期血清在Tris-缓冲盐水中1/25000稀释，所述盐水包含1.0％鱼明胶、0.05％tween 20和0.2％叠氮化钠(抗体缓冲液)。硝化纤维素膜与第一抗体溶液温育过夜。膜随后在包含0.05％tween 20的Tris-缓冲盐水(TTBS)中洗涤2次，并转移至包含1/10,000稀释、缀合至碱性磷酸酶的山羊抗小鼠抗体(BioRad)，和1/3,000稀释、缀合至碱性磷酸酶的抗生物素蛋白(BioRad)的抗体缓冲液。膜在摇床上在37℃温育2小时，并随后在TTBS中洗涤4次以去除未结合的缀合物。印迹在摇床上在37℃，在包含溶于1X AP显色缓冲液(BioRad)的碱性磷酸盐显色试剂A和B的底物溶液中分离30分钟。
将蛋白印迹分析用作工具，以有效将来源于如实施例1中所述组合物的蛋白质鉴定为与来源于超免疫和/或恢复期血清的抗体免疫反应性的。蛋白印迹分析揭示了许多免疫反应性蛋白。超免疫的血清包含与268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、52kDa、41kDa、38kDa、37kDa、31kDa和28kDa的蛋白质反应的抗体。类似地，恢复期血清显示在268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、52kDa、41kDa、38kDa、37kDa、31kDa和28kDa的相同带型。此外，在52kDa、40kDa和20kDa区域可见的3种免疫反应性蛋白在SDS-PAGE凝胶上最初看不到，在使用超免疫血清的蛋白印迹分析中也看不到。有趣的是推测这3种蛋白质浓度太低以至于无法在SDS-PAGE凝胶上显现，但可能是高度免疫原性的，从而在免疫系统致敏后产生较大的条带强度，在攻击后产生这些蛋白质的增强的条带强度。
疫苗组合物的蛋白印迹分析揭示了超免疫和恢复期血清之间的免疫反应性蛋白的条带强度差异。这些差异可能是单独的蛋白质的免疫原性特性不同以及免疫系统如何识别组合物中各个单独的蛋白质的结果。此外，组合物内蛋白质的量和比率还可影响每种蛋白质的免疫学状态，这可以影响动物对组合物中单独蛋白质的免疫学应答。然而，组合物中的每种蛋白质如蛋白印迹分析检查的那样发生免疫学反应，因此小鼠接种疫苗后的免疫学应答识别和应答设置针对组合物中每种单独的蛋白质的抗体应答。总之，如实施例4中所述的结果举例说明，与具有100％死亡率的未接种小鼠相比，蛋白质组合物在受攻击的小鼠中极其有效地提供了100％的保护。
实施例6
鼠疫耶尔森氏菌蛋白与针对小肠结肠炎耶尔森氏菌蛋白制备的超免疫血清的蛋白印迹分析
蛋白印迹分析用于评估来源于鼠疫耶尔森氏菌、针对超免疫血清的免疫反应性蛋白，所述血清如实施例5中所述针对来源于小肠结肠炎耶尔森氏菌的组合物制备。组合物包含具有254kDa、104kDa、99kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、60kDa、46kDa、44kDa、37kDa 36kDa、31kDa 28kDa和20kDa的分子量的多肽。具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、和64kDa的分子量的多肽只在铁限制条件下表达。来源于鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的蛋白质首先如先前实施例5中所述在SDS-PAGE(4％的浓缩胶/10％的分离胶)上按照大小分级分离，其中使用30ug总蛋白质。蛋白印迹分析在如实施例5中所述的相同条件下进行，只是除了下列修改；不测试针对鼠疫耶尔森氏菌的膜蛋白的恢复期血清。结果显示在大约254kDa、94kDa、88kDa、46kDa、44kDa、37kDa、36kDa和20kDa区域的蛋白质与来源于超免疫血清的抗体是免疫反应性的，所述血清针对小肠结肠炎耶尔森氏菌膜蛋白制备。
实施例7
小鼠接种疫苗和攻击研究以评估针对鼠疫耶尔森氏菌静脉内和肺攻击的保护
重16-22克的88只雌性Swiss-Webster(Harlan Laboratories)平均分为4组(22只小鼠/组)，命名为1-4。将动物圈养在HEPA-过滤的、微通风(micro-vent)正压式空气供给动物笼具系统(BSL3设施)。食物和水随意供应。
如上文实施例1中所述制备来自鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的蛋白质，并使用氢氧化铝作为佐剂(Rehydagel-HPA，Rheis NJ)配制为疫苗，最终浓度为20％体积/体积和500μg总蛋白/ml。通过用PBS替代抗原同时维持相同的佐剂浓度来制备安慰剂。组1和3中的小鼠在14天的时间间隔腹膜内接种2次0.1ml包含50μg总蛋白的疫苗，而通过相同的时间表用安慰剂免疫组2和4中的小鼠。
鼠疫耶尔森氏菌株CO92用于攻击，并在BSL3防范设施中制备。第二次接种疫苗后14天，组1和2中的小鼠在外侧尾静脉内用0.1ml菌株CO92(103 CFU或大约100 LD50/小鼠)静脉内攻击。对组3和4中的小鼠实施在生理盐水中稀释、气溶胶化的攻击剂量的鼠疫耶尔森氏菌CO92，以在30分钟内在不透气室中达到大约100 LD50 CFU/小鼠的浓度。在进行计划的攻击实验前通过小的试验型研究确定在SwissWebster小鼠中关于菌株CO92的气溶胶化的LD50。攻击后21天记录死亡率。
实施例8
鱼接种疫苗和攻击研究以评估针对鲁氏耶尔森氏菌攻击的保护
命名为组1和2的2组重约2克的20条虹鳟鱼在18℃温度维持在2个分开的60升槽中。鱼每天用商业鳟鱼饲料(Ziegler Brothers，Gardners，PA)饲喂2次。使用如实施例1中所述的相同方法利用来源于鲁氏耶尔森氏菌的组合物接种组1中的鱼。来源于鲁氏耶尔森氏菌的提取蛋白用于制备给鱼施用的疫苗组合物。通过将水性蛋白质悬浮液乳化到油包水乳剂中由组合物制备原种疫苗，所述乳剂包含Drakeol 6矿物油和Arlacel A作为乳化剂。使用0.1 cc腹膜内施用疫苗以产生在0.1cc可注射体积中25ug总蛋白的最终剂量。在上述制剂中通过用生理盐水替代抗原制备安慰剂并给予组2中的鱼(对照)。在第一次接种疫苗后28天给予鱼第二次接种疫苗。在第二次接种疫苗后14天腹膜内攻击所有鱼。
鲁氏耶尔森氏菌的毒性分离物用于攻击。攻击分离物在包含160μM 2，2-联吡啶的胰胨豆胨培养液(TSB)中进行培养，并在37℃温育生长12小时。培养物通过在10,000×g离心在生理盐水中洗涤1次并重悬浮于盐水中。将培养物调整至5.0×107CFU/ml。每条鳟鱼在腹膜内接种0.1cc最终攻击剂量为5.0×106 CFU的对应细菌。在攻击后14天每天记录死亡率。所有死亡的鱼都从槽中取出并取出肝且用板固定，以计算攻击生物的存在。将功效测量为接种和未接种的对照比较的存活率程度。
实施例9
小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729和鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的金属调节的蛋白的表征
使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间光谱测定法(MALDI-TOFMS)表征如实施例1中所述由小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729和鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+制备的组合物的蛋白质。使用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离每种组合物的样品。在组合物的蛋白质已分离后，用考马斯亮蓝染色凝胶以显现蛋白质。
材料和方法
切除和洗涤。凝胶用水洗涤10分钟，共2次。通过尽可能接近蛋白质条带切割来切除每个目的蛋白质条带，以减少样品中存在的凝胶量。将每个凝胶切片切割成1×1mm立方体并置于1.5ml管中。凝胶片用水洗涤15分钟。在洗涤步骤中使用的所有溶剂体积大约等于凝胶切片体积的2倍。凝胶切片随后用水/乙腈(1∶1)洗涤15分钟。取出水/乙腈混合物，并加入乙腈进行覆盖直至凝胶片转为粘性白色，此时取出乙腈。凝胶片在100mM NH4HCO3中再次水合，并在5分钟后，加入等于凝胶片体积2倍体积的乙腈。将其温育15分钟、取出液体，并在SpeedVac中干燥凝胶片。
还原和烷化。干燥的凝胶片在10mM DTT和100mM NH4HCO3中再次水合并在56℃温育45分钟。允许管冷却至室温后，取出液体并立即加入相同体积的55mM碘乙酰胺和100mM NH4HCO3的混合物。将其在室温下在黑暗中温育30分钟。取出液体，加入乙腈进行覆盖直至凝胶片转为粘性白色，此时取出乙腈。凝胶片在100mMNH4HCO3中再次水合，并在5分钟后，加入等于凝胶片体积2倍体积的乙腈。将其温育15分钟、取出液体，并在SpeedVac中干燥凝胶片。如果仍有残留的考马斯，则重复用100mM NH4HCO3/乙腈洗涤。
凝胶内消化。凝胶片在SpeedVac中彻底干燥。片在消化缓冲液(50mM NH4HCO3、5mM CaCl2、12.5纳克/微升(ng/μl)胰蛋白酶)中在4℃再次水合。加入足够的缓冲液以覆盖凝胶片，并在需要时加入更多的缓冲液。凝胶片在冰上温育45分钟，并取出上清液且用5-2μl不含胰蛋白酶的相同缓冲液替代。在空气培养箱中在37℃温育过夜。
肽的提取。加入足够体积的25mM NH4HCO3以覆盖凝胶片，并温育15分钟(一般在水浴超声波仪中)。加入相同体积的乙腈并温育15分钟(如果可能在水浴超声波仪中)，并回收上清液。使用5％甲酸代替NH4HCO3重复提取2次。加入足够体积的5％甲酸以覆盖凝胶片，并温育15分钟(一般在水浴超声波仪中)。加入相同体积的乙腈并温育15分钟(一般在水浴超声波仪中)，并回收上清液。汇集提取物，并加入10mM DTT至1mM DTT的最终浓度。样品在SpeedVac中干燥至大约5μl的最终体积。
肽的脱盐。使用ZIPTIP吸管端(C18，Millipore，Billerica，MA)根据制造商所建议的对样品进行脱盐。简言之，在重构溶液(5∶95乙腈∶H2O，0.1％-0.5％三氟乙酸)中重构样品，离心，并检查pH以证实pH小于3。通过吸出10μl溶液1(50∶50乙腈：H2O，0.1％三氟乙酸)并弃去吸出的等分试样将ZIPTIP水合。随后吸出10μl溶液2(溶于去离子水的0.1％三氟乙酸)并弃去吸出的等分试样。通过将10μl样品缓慢吸入端中，排出至样品管中，并重复5-6次将样品装载到端中。将10微升的溶液2吸入端中，并通过排出弃去溶液，并将该过程重复5-7次以洗涤。通过吸入2.5μl冰冷的溶液3(60∶40乙腈∶H2O，0.1％三氟乙酸)，排出，并随后将相同等分试样再次吸入和吸出端3次来洗脱肽。在溶液已从端排出后，将管盖上盖子并贮存于冰上。
肽的质谱分析作图。将肽悬浮于10μl-30μl 5％甲酸中，并通过MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Inc.，Billerica，MA)进行分析。根据制造商所建议的测定肽片段的质谱。简言之，将包含由胰蛋白酶消化产生的肽的样品与基质氰基-4-羟基肉桂酸混合，转移至靶，并允许干燥。将干燥的样品置于质谱仪中，接受照射，并检测每种离子的飞行时间并用于确定组合物中存在的每种蛋白质的肽质量指纹图谱。已知的多肽(人血管紧张素II，单种同位素质量MH+1046.5(SigmaChemical Co.)，和促肾上腺皮质激素(adenocorticotropin)激素片段18-39，MH+2465.2(Sigma Chemical Co.))用于对机器进行标准化。
数据分析。使用Mascot检索引擎的肽质量指纹图谱搜索方法(Matrix Science Ltd.，London，UK，和www.matrixscience.com，参见Perkins等人Electrophoresis 20，3551-3567(1999))，比较在实验上观察到的每个质谱中肽的质量与由已知蛋白质产生的预期质量。搜索参数包括：数据库，NCBInr；分类学，细菌(真细菌)；搜索类型，肽质量指纹图谱；酶，胰蛋白酶；固定修饰，无；可变修饰，无或氧化的甲硫氨酸；质量值，单种同位素；蛋白质质量，无限制；肽质量容许量，±1Da或±1 330ppm；肽电荷状态，Mr；最大遗漏的切割，1；查询数目，25。
结果
这次搜索的结果是组合物中存在的蛋白质的质量指纹图谱(表5和6)。
表5.来自从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729分离的蛋白质的MALDI-TOF MS分析的实验数据。
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  Lw545  268   929.46
  1140.47
  1312.57
  1440.69
  1526.68
  1555.66
  1581.70
  1596.67
  1683.69
  2110.21
  Lw391A(±1Da)  83   687.5
  976.4
  1001.6
  1016.5
  1141.6
  1170.7
  1171.7
  1198.5
  1344.5
  1357.7
  1395.6
  1453.7
  1477.7
  1521.7
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1693.8
  1716.8
  1829.8
  1962.0
  2014.1
  2020.0
  2042.0
  2164.1
  2226.1
  2417.3
  3175.5
  Lw391B(±1Da)  83   1001.6
  1104.6
  1140.6
  1155.5
  1171.7
  1209.5
  1214.7
  1338.6
  1453.7
  1568.8
  1634.9
  1651.8
  1660.9
  1709.8
  1750.0
  1851.0
  1988.1
  2105.1
  2112.1
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  2164.1
  2387.2
  2453.1
  2538.4
  3423.7
  Lw392(±1Da  79 837.5
  1018.6
  1071.5
  1086.5
  1132.7
  1189.5
  1215.6
  1236.6
  1256.6
  1264.6
  1361.6
  1497.7
  1502.8
  1615.7
  1653.8
  1718.9
  1770.9
  1820.9
  1828.1
  2006.0
  2067.1
  2120.9
  2300.3
  2308.2
  2783.3
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  2912.4
  3024.5
  3287.6
  Lw393(±1Da)  70   714.6
  760.5
  807.5
  820.5
  920.5
  1024.6
  1052.6
  1187.6
  1200.6
  1395.7
  1437.7
  1480.7
  1541.9
  1546.9
  1565.8
  1668.8
  1732.0
  1790.9
  1906.0
  1982.2
  1984.1
  1997.1
  2011.1
  2028.2
  2060.2
  2134.1
  2163.3
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  2275.4
  2364.3
  2378.5
  2384.3
  2564.4
  2658.4
  2834.7
  2930.7
  Lw550  66   868.6500
  882.5700
  884.5900
  1021.7000
  1087.7100
  1168.7300
  1177.8200
  1208.6800
  1346.8700
  1750.0100
  1755.0500
  1852.2800
  2521.8100
  2607.6700
  2944.1000
  3087.0800
  Lw552  45   1140.5500
  1209.5400
  1312.5800
  1440.6400
  1501.6900
  1526.6200
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1581.6800
  1596.6800
  Lw555  37   705.3700
  881.2400
  971.1700
  1122.3100
  1280.1900
  1295.2200
  1335.2900
  1510.3000
  1908.5300
  2245.7300
  2324.7100
  2642.7500
  2985.0200
  3087.9700
  Lw557  31   864.49
  1404.50
  1616.68
  1780.68
  1876.82
  2071.04
  2379.08
1.从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729获得的多肽的分子量，以千道尔顿表示。
2.m/z，质量(m)与电荷(z)的比。
表6.来自从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+分离的蛋白质的MALDI-TOF MS分析的实验数据。
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  Lw529  104   644.50
  685.40
  771.40
  841.40
  899.50
  962.40
  1137.40
  1.277.40
  11293.40
  1386.40
  1410.50
  1422.60
  1498.60
  1567.50
  1679.70
  1684.60
  1726.70
  1873.70
  1991.70
  2020.80
  2182.80
  2584.90
  2843.20
  Lw530  99   1191.40
  1514.50
  1591.50
  1597.50
  1637.50
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1671.50
  1714.60
  1719.60
  1751.60
  1820.60
  1863.70
  1967.60
  2122.60
  Lw531  94   962.20
  1168.20
  1258.30
  1372.30
  1384.30
  1409.30
  1521.40
  1669.50
  1686.40
  1714.40
  1717.40
  1797.50
  1833.50
  1845.50
  2218.60
  2426.60
  Lw532  88   889.30
  927.30
  946.40
  961.40
  1172.40
  1177.40
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1290.40
  1333.50
  1358.40
  1404.50
  1419.50
  1508.50
  1579.60
  1673.60
  1736.60
  2401.00
  2666.00
  Lw533  77   687.40
  785.40
  859.30
  953.40
  1141.50
  1156.50
  1171.50
  1198.40
  1403.50
  1409.50
  1483.50
  1523.50
  1551.60
  1618.60
  1675.50
  1746.60
  1788.70
  1820.70
  1852.80
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1941.60
  2013.90
  2018.80
  2057.80
  2168.80
  2170.00
  2427.00
  2457.80
  2829.10
  Lw534  73   629.40
  749.40
  910.30
  931.40
  1292.50
  1371.50
  1441.40
  1479.50
  1587.60
  1605.60
  1641.60
  1655.50
  1706.60
  1708.60
  1758.70
  1797.80
  1856.80
  1913.70
  2004.80
  2072.80
  2155.90
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  2301.90
  2395.90
  2484.90
  2558.20
  2676.20
  2984.10
  3162.30
  3185.30
  3425.50
  3472.40
  Lw535  64 714.40
  760.40
  774.40
  807.40
  920.40
  1024.40
  1052.40
  1103.40
  1165.40
  1187.40
  1200.40
  1282.50
  1395.40
  1445.50
  1480.50
  1546.60
  1668.50
  1693.60
  1731.60
  1790.60
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1905.70
  1969.70
  1981.80
  2010.80
  2027.80
  2059.80
  2163.00
  2363.90
  2378.10
  2820.20
  2930.20
  Lw536  60   1011.46
  1187.55
  1231.54
  1238.57
  1291.57
  1567.76
  1605.78
  1621.74
  1669.68
  2021.02
  2397.21
  Lw537  46   873.53
  1001.53
  1180.50
  1258.60
  1300.67
  1307.58
  1325.59
  1368.72
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  1395.70
  1436.67
  1609.91
  1616.82
  1780.94
  1952.05
  1959.02
  2020.04
  2099.15
  2178.22
  2710.51
  Lw538  44   776.51
  837.65
  905.62
  1027.71
  1073.74
  1200.79
  1232.67
  1233.72
  1290.81
  1376.71
  1603.90
  1615.01
  1711.08
  1774.04
  1796.13
  1906.14
  1978.16
  2001.23
  Lw683  37   691.26
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  894.21
  911.21
  1050.26
  1115.19
  1120.19
  1122.24
  1198.17
  1263.19
  1308.24
  1320.34
  1423.28
  1437.31
  1491.23
  1534.41
  1579.39
  2245.71
  2367.68
  2487.63
  2684.79
  2980.02
  3292.91
  Lw541  31   1020.84
  1075.77
  1203.86
  1248.88
  1322.87
  1404.95
  1788.29
  1991.60
  2092.61
  多肽名称  以千道尔顿(kDa)表示的近似分子量1   由胰蛋白酶消化产生的多肽片段的m/z值2
  2119.74
  Lw542  31   1143.91
  1299.97
  1309.09
  1341.97
  1372.04
  1580.12
  1781.45
  1791.43
  1954.57
  2191.78
  2632.11
  Lw544  20   807.40
  1114.43
  1210.48
  1244.46
  1259.51
  1270.49
  1357.49
  1790.90
  2003.91
  2989.45
1.从鼠疫耶尔森氏菌株KIM66+获得的多肽的分子量，以千道尔顿表示。
2.m/z，质量(m)与电荷(z)的比。
所有专利、专利申请和出版物的全部公开内容，以及本文引用的可电子获得的材料(包括，例如，在例如GenBank和RefSeq中提交的核苷酸序列，和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中提交的氨基酸序列，以及来自GenBank和RefSeq中注释的编码区的翻译)都引入本文作为参考。已给出的前述详细描述和实施例仅用于清楚的理解。应当理解那里没有不必要的限制。本发明不限于显示和描述的确切细节，因为对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求限定的本发明中。
除非另有说明，在说明书和权利要求中使用的表达组分、分子量等的量的所有数字应当理解为在所有情况中由术语“约”修饰。相应地，除非另有相反的说明，在说明书和权利要求中列出的数字参数是近似值，它可以依通过本发明搜索获得的所需性质而变。丝毫并且不作为限制与权利要求范围等价的学说的企图，每个数字参数应当至少按照报道的有效数字的数目并通过应用普通的四舍五入技术进行解释。
虽然阐述本发明广泛范围的数字范围和参数是近似值，但尽可能精确地报道具体实施例中列出的数字值。然而，所有数字值固有地包含由其各自的测试测量中发现的标准差必然产生的范围。
所有标题是为了读者的方便设置的，并且不应用于限制标题后正文的含义，除非这样说明。

Claims (62)

1.一种组合物，其包括：
具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有40kDa、38kDa、或37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。
2.权利要求1的组合物，其进一步包括药学上可接受的载体。
3.权利要求1的组合物，其中所述多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。
4.权利要求1的组合物，其进一步包括分离的多肽，其具有268kDa、92kDa、79kDa、54kDa、45kDa、31kDa、28kDa的分子量或其组合，并且可从在不含铁螯合剂的培养基中生长时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离。
5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包括当小肠结肠炎耶尔森氏菌在包含铁螯合剂的培养基中温育时可以分离出的2种83kDa多肽。
6.一种组合物，其包括：
具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有268kDa、79kDa、或45kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。
7.权利要求6的组合物，其中所述多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。
8.权利要求6的组合物，其进一步包括药学上可接受的载体。
9.一种组合物，其包括：
具有268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、45kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、和28kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。
10.权利要求9的组合物，其中所述多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729中分离。
11.一种组合物，其包括：
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有46kDa、37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。
12.权利要求11的组合物，其进一步包括药学上可接受的载体。
13.权利要求11的组合物，其进一步包括分离的多肽，其具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、或20kDa的分子量，并且可从在不含铁螯合剂的培养基中生长时的鼠疫耶尔森氏菌中分离。
14.权利要求11的组合物，其中所述多肽可从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+中分离。
15.一种组合物，其包括：
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、20kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。
16.权利要求15的组合物，其进一步包括药学上可接受的载体。
17.权利要求15的组合物，其中所述多肽可从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+中分离。
18.一种组合物，其包括：
具有254kDa、104kDa、99kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、60kDa、46kDa、44kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、和20kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。
19.权利要求18的组合物，其中所述多肽可从鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+中分离。
20.一种用于治疗受试者中感染的方法，其包括：
给患有或处于患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的危险中的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有40kDa、38kDa、37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击，
具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有268kDa、79kDa、45kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击，或
具有268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、45kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、和28kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
22.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物是人。
23.权利要求20的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
24.一种用于治疗受试者中症状的方法，其包括：
给患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有40kDa、38kDa、或37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击，
具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有268kDa、79kDa、或45kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击，或
具有268kDa、92kDa、83kDa、79kDa、70kDa、66kDa、54kDa、45kDa、40kDa、38kDa、37kDa、31kDa、和28kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC株27729的攻击。
25.权利要求24的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
26.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物是人。
27.权利要求24的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
28.权利要求24的方法，其中所述症状是腹泻、肠炎、或鼠疫、或其组合。
29.一种用于治疗受试者中感染的方法，其包括：
给患有或处于患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的危险中的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有46kDa、37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击，
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、20kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击，或
具有254kDa、104kDa、99kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、60kDa、46kDa、44kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、和20kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。
30.权利要求29的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
31.权利要求30的方法，其中所述哺乳动物是人。
32.权利要求29的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
33.一种用于治疗受试者中症状的方法，其包括：
给患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有46kDa、37kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击，
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，和具有254kDa、46kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、20kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量的所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击，或
具有254kDa、104kDa、99kDa、94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、64kDa、60kDa、46kDa、44kDa、37kDa、36kDa、31kDa、28kDa、和20kDa的分子量的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且其中所述组合物保护小鼠不受鼠疫耶尔森氏菌株KIM6+的攻击。
34.权利要求33的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
35.权利要求34的方法，其中所述哺乳动物是人。
36.权利要求33的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
37.权利要求33的方法，其中所述症状是腹泻、肠炎、或鼠疫、或其组合。
38.一种用于治疗受试者中感染的方法，其包括：
给患有或处于患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的危险中的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
特异性结合具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
39.权利要求38的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
40.权利要求39的方法，其中所述哺乳动物是人。
41.权利要求38的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
42.权利要求38的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
43.一种用于治疗受试者中症状的方法，其包括：
给患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
特异性结合具有83kDa、70kDa、66kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
44.权利要求43的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
45.权利要求44的方法，其中所述哺乳动物是人。
46.权利要求43的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
47.权利要求43的方法，其中所述症状是腹泻、肠炎、或鼠疫、或其组合。
48.权利要求43的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
49.一种用于治疗受试者中感染的方法，其包括：
给患有或处于患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的危险中的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
特异性结合具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
50.权利要求49的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
51.权利要求50的方法，其中所述哺乳动物是人。
52.权利要求49的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
53.权利要求49的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
54.一种用于治疗受试者中症状的方法，其包括：
给患有由耶尔森氏菌属物种引起的感染的受试者施用有效量的组合物，其中所述组合物包括：
特异性结合具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的2种分离的多肽的抗体，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离。
55.权利要求54的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
56.权利要求55的方法，其中所述哺乳动物是人。
57.权利要求54的方法，其中所述耶尔森氏菌属物种是小肠结肠炎耶尔森氏菌或鼠疫耶尔森氏菌。
58.权利要求54的方法，其中所述症状是腹泻、肠炎、或鼠疫、或其组合。
59.权利要求54的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
60.一种用于治疗红口病症状的方法，其包括：
给处于患有由鲁氏耶尔森氏菌引起的感染的危险中、或患有由鲁氏耶尔森氏菌引起的感染的鱼施用有效量的组合物，其中所述组合物包括从鲁氏耶尔森氏菌中分离的不溶于肌氨酸的多肽。
61.一种用于检测特异性结合多肽的抗体的试剂盒，其在分开的容器中包括：
具有83kDa、70kDa、或66kDa的分子量或其组合的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，并且其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的小肠结肠炎耶尔森氏菌中分离，并且当小肠结肠炎耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离；和
检测特异性结合所述多肽的抗体的试剂。
62.一种用于检测特异性结合多肽的抗体的试剂盒，其在分开的容器中包括：
具有94kDa、88kDa、77kDa、73kDa、或64kDa的分子量或其组合的分离的多肽，其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行测定，并且其中所述多肽可从在包括铁螯合剂的培养基中温育时的鼠疫耶尔森氏菌中分离，并且当鼠疫耶尔森氏菌在不含铁螯合剂的培养基中生长时不能分离；和
检测特异性结合所述多肽的抗体的试剂。
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