PL220107B1 - Preparat immunogenny, szczepionka oraz zastosowanie tej szczepionki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat immunogenny, szczepionka oraz zastosowanie tej szczepionki.

Szczepy Neisseria są czynnikami wywołującymi kilka patologii ludzi oraz istnieje potrzeba opracowania skutecznych szczepionek przeciwko nim. W szczególności Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis wywołują patologie, które mogą być leczone przez szczepienie.

Neisseria gonorrhoeae jest czynnikiem etiologicznym rzeżączki, jednej z najpowszechniej na świecie notowanych chorób przenoszonych drogą płciową z oszacowaną coroczną zapadalnością 62 milionów przypadków (Gerbase i in., 1998 Lancet 351; (Suppl 3) 2-4). Objawy kliniczne rzeżączki obejmują zapalenie błon śluzowych dróg moczowo-płciowych, gardła lub odbytu oraz zakażenia oka u noworodków. Wstępujące zakażenia gonokokowe u kobiet mogą prowadzić do niepłodności, ciąży pozamacicznej, przewlekłej choroby zapalnej miednicy mniejszej oraz powstawania ropni jajowodowojajnikowych. Posocznica, zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia oraz zapalenie opon mózgowych należą do powikłań związanych z rzeżączką.

Duża liczba szczepów gonokoków opornych na antybiotyki przyczynia się do zwiększonej zachorowalności oraz powikłań związanych z rzeżączką. Zatem atrakcyjną alternatywą leczenia rzeżączki antybiotykami będzie jej zapobieganie przez szczepienie. Obecnie nie istnieje żadna szczepionka przeciw zakażeniom N. gonorrhoeae.

Neisseria meningitidis jest istotnym patogenem, w szczególności u dzieci i młodych osób dorosłych. Posocznica oraz zapalenie opon mózgowych są najbardziej zagrażającymi życiu postaciami inwazyjnej choroby meningokokowej (IMD). Choroba ta stała się problemem zdrowotnym na świecie ze względu na jej wysoką zachorowalność i śmiertelność.

Zidentyfikowano trzynaście grup serologicznych N. meningitidis w oparciu o antygenowe różnice polisacharydów otoczki, przy czym najpowszechniejszymi z nich są A, B i C, które są odpowiedzialne za 90% zachorowań na świecie. Grupa serologiczna B jest najpowszechniejszą chorobą meningokokową w Europie, USA i kilku krajów Ameryki Łacińskiej.

Opracowano szczepionki oparte na polisacharydzie otoczki grup serologicznych A, C, W i Y i wykazano, że powstrzymują one wybuchy choroby meningokokowej (Peltola i in., 1985 Pediatrics 76; 91-96). Jednakże grupa serologiczna B jest słabo immunogenna i wywołuje tylko przejściową odpowiedź przeciwciał głównie o izotypie IgM (Ala'Aldeen D i Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157). Zatem obecnie nie istnieje szeroko skuteczna szczepionka przeciw meningokokowi grupy serologicznej B, która jest odpowiedzialna za większość chorób w większości krajów o kl imacie umiarkowanym. Jest to szczególnie problematyczne, gdyż częstość występowania choroby wywołanej przez typ serologiczny B wzrasta w Europie, Australii i Ameryce, głównie w grupie dzieci poniżej piątego roku życia. Opracowanie szczepionki przeciw meninngokokowi grupy se rologicznej B stanowi szczególną trudność, gdyż otoczka polisacharydowa jest słabo immunogenna ze względu na jej immunologiczne podobieństwo do cząsteczki adhezyjnej ludzkich komó rek nerwowych. Zatem strategie wytwarzania szczepionki skupi ły się na strukturach eksponowanych na powierzchni błony zewnętrznej meningokoka, ale ich opracowanie utrudnia wyraźna zmienność tych antygenów pomiędzy szczepami.

Dalsze prace doprowadziły do wprowadzenia szczepionek złożonych z pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV), które zawierają kilka białek, które stanowią normalne składniki błony bakteryjnej. Jedną z tych szczepionek jest kubańska szczepionka VA-MENGOC-BC® przeciw N. meningitidis grup serologicznych B i C (Rodriguez i in., 1999 Mem Inst. Oswalde Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440). Szczepionka została zaprojektowana do zwalczenia inwazyjnego wybuchu choroby meningokokowej na Kubie, który nie został wyeliminowany przez program szczepienia z zastosowaniem szczepionki z polisacharydem otoczkowym AC. Dominującymi grupami serologicznymi były B _® i C oraz szczepionka VA-MENGOC-BC była skuteczna w kontrolowaniu wy buchu choroby przy oszacowanej skuteczności szczepionki 83% przeciw szczepom N. meningitidis grupy serologicznej B (Sierra i in., 1990 w Neisseria, Walter Gruyter, Berlin, M. Atchman i in., (red) str. 129-134, Sierra i in., 1991, NIPH Ann 14; 195-210). Szczepionka ta była skuteczna przeciw specyficznemu wybuchowi choroby, jednakże wywołana odpowiedź immunologiczna nie chroniła przed innymi szczepami N. meningitidis.

Dalsze badania skuteczności przeprowadzone w Ameryce Łacińskiej podczas epidemii wywołanej przez homologiczne i heterologiczne szczepy meningokoków grupy serologicznej B wykazały

PL 220 107 B1 pewną skuteczność u starszych dzieci i dorosłych, ale jej skuteczność była znacząco niższa u młodszych dzieci, u których występuje największe ryzyko zakażenia (Milagres i in., 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424). Wątpliwość budzi skuteczność takiej szczepionki w krajach z endemiczną chorobą wieloszczepową, takich jak Wielka Brytania. Badania immunogenności przeciw heterologicznym szczepom wykazały tylko ograniczoną aktywność bakteriobójczą reaktywnej - krzyżowo surowicy, w szczególności u dzieci (Tappero i in., 1999, JAMA 281; 1520-1527).

Druga szczepionka na bazie pęcherzyków błony zewnętrznej została opracowana w Norwegii przy zastosowaniu izolatu typu serologicznego B typowego wśród rozpowszechnionych w Skandynawii (Fredriksen i in., 1991, NIPH Ann, 14; 67-80). Szczepionkę tą zbadano w próbach klinicznych i stwierdzono jej skuteczność ochronną 57% po 29 miesiącach (Bjune i in., 1991, Lancet, 338; 1093-1096).

Jednakże zastosowanie pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) w szczepionkach jest związane z kilkoma problemami. Przykładowo, OMV zawierają toksyczne lipopolisacharydy i mogą one zawierać antygeny immunodominujące, które są albo specyficzne dla szczepu albo wyrażane zmiennie. Opisano kilka procesów, które można zastosować do pokonania kilku problemów związanych z przygotowaniem szczepionek z preparatem pęcherzyków błony zewnętrznej. W WO 01/09350 opisano proces rozwiązujący kilka z tych problemów, przykładowo przez obniżenie toksyczności i modyfikację antygenów obecnych na pęcherzykach błony zewnętrznej.

W WO 01/52885 opisano możliwość łączenia pęcherzyków błony zewnętrznej z innymi antygenami i dołączona jest lista ponad 2000 potencjalnych białek Neisseria na podstawie której rozważa się, że można opracować szczepionki o skuteczności przeciw szerszemu zakresowi serotypów.

Obecnie dostępne szczepionki przeciw-meningokokowe stwarzają różne problemy. Oparte na białkach szczepionki z błony zewnętrznej przejawiają tendencję do bycia specyficznymi i skutecznymi przeciw tylko kilku szczepom. Szczepionki polisacharydowe są także suboptymalne, gdyż przejawiają one tendencję do wywoływania słabych i krótkich odpowiedzi immunologicznych, w szczególności przeciw grupie serologicznej B (Lepow i in., 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96).

Zakażenia Neisseria stanowią znaczący problem zdrowotny dla którego brak jest dostępnych szczepionek w przypadku N. gonorrhoeae lub dostępne są szczepionki o ograniczonej skuteczności lub zdolności do ochrony przed heterologicznymi w przypadku N. meningitidis. Wyraźnie istnieje potrzeba opracowania lepszych szczepionek przeciw zakażeniom Neisseria, które będą ulepszone pod względem skuteczności w stosunku do obecnie dostępnych szczepionek oraz umożliwią ochronę przed szerszym zakresem szczepów.

Wynalazek dotyczy preparatu immunogennego zawierającego antygeny Neisseria:

a) GNA1870,

b) Hsf lub NadA; oraz

c) TbpA lub Lipo28.

Korzystnie preparat zawiera preparat podjednostkowy i preparat pęcherzyków błony zewnętrznej.

Korzystny jest preparat, w którym wszystkie antygeny pochodzą z N. meningitidis.

Korzystny jest preparat, w którym wszystkie antygeny pochodzą z N. meningitidis grupy serologicznej B.

Korzystnie preparat zawiera ponadto jeden lub większą liczbę bakteryjnych polisacharydów lub oligosacharydów otoczki.

Korzystny jest preparat, w którym polisacharydy lub oligosacharydy otoczki pochodzą z Neisseria meningitidis grupy serologicznej A, C, Y i/lub W-135.

Korzystnie preparat zawiera ponadto adiuwant.

Korzystny jest preparat, w którym adiuwant stanowi sól glinu.

Korzystny jest preparat, w którym sól glinu stanowi żel wodorotlenku glinu.

Korzystnie preparat zawiera GNA1870, Hsf i TbpA.

Korzystnie preparat zawiera GNA1870, NadA i Lipo28.

Wynalazek dotyczy także szczepionki zawierającej składnik czynny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, która jako składnik czynny zawiera preparat immunogenny zdefiniowany powyżej.

Wynalazek dotyczy również zastosowania szczepionki zdefiniowanej powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia wywołanego przez Neisseria.

Ponadto, wynalazek dotyczy szczepionki zdefiniowanej powyżej do stosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia wywołanego przez Neisseria.

PL 220 107 B1

Wynalazek ujawnia szczególne połączenia antygenów Neisseria, które po połączeniu prowadzą do nieoczekiwanego zwiększenia wydajności szczepionki przeciw zakażeniu Neisseria.

Zakażenia Neisseria postępują przez kilka różnych etapów. Przykładowo, cykl życiowy meningokoka obejmuje kolonizację przewodu nosowo-gardłowego, przyczepienie się do śluzówki, przejście do krwioobiegu, namnożenie w krwioobiegu, wywołanie szoku toksycznego, przejście bariery krew/mózg i namnożenie w płynie mózgowo-rdzeniowym i/lub oponach. Różne cząsteczki na powierzchni bakterii będą uczestniczyć w różnych etapach cyklu infekcyjnego. Przez skierowanie odpowiedzi immunologicznej przeciw skutecznej ilości połączenia konkretnych antygenów, uczestniczących w różnych procesach zakażenia Neisseria, można uzyskać szczepionkę przeciw Neisseria o nieoczekiwanie wysokiej skuteczności.

W szczególności, połączenia pewnych antygenów z różnych klas, z których niektóre uczestniczą w adhezji do komórki gospodarza, z których niektóre uczestniczą w pozyskiwaniu żelaza, z których niektóre są autotransporterami oraz z których niektóre są toksynami, mogą wywołać odpowiedź immunologiczną, która chroni przed wieloma etapami zakażenia. Takie połączenia antygenów mogą nieoczekiwanie prowadzić do ulepszonej (korzystnie synergistycznie ulepszonej) wydajności szczepionki przeciw zakażeniu Neisseria, odpowiedź immunologiczna jest skierowana do więcej niż jednej funkcji bakterii w optymalny sposób.

Skuteczność szczepionek można zbadać z zastosowaniem wielu różnych testów. Testy ochrony na modelach zwierzęcych są dobrze znane. Ponadto, test bakteriobójczości surowicy (SBA) jest najpowszechniej przyjętym wyznacznikiem do oszacowania skuteczności szczepionki meningokokowej (Perkins i in., J Infect Dis. 1998, 177:683-691).

Niektóre połączenia antygenów (przykładowo, połączenia pewnych białek autotransportujących z pewnymi białkami pozyskiwania żelaza) może wywołać lepszą ochronę w testach na modelach zwierzęcych i/lub synergistycznie wyższe miana SBA. Bez zamiaru ograniczania się przez teorię, takie synergistyczne połączenia antygenów są możliwe dzięki kilku cechom odpowiedzi immunologicznej na połączenie antygenów. Antygeny same z siebie są zazwyczaj eksponowane na komórkach Neisseria i wykazują tendencję do bycia konserwatywnymi, ale wykazują także tendencję do obecności na powierzchni komórki w ilości niewystarczającej do optymalnej odpowiedzi bakteriobójczej zachodzącej za pośrednictwem przeciwciał wywołanych przeciw samemu antygenowi. Połączenie antygenów według wynalazku może spowodować powstanie preparatu wywołującego korzystne połączenie przeciwciał bakteriobójczych, które oddziaływają z komórką Neisseria poniżej krytycznej wartości progowej. W konsekwencji, na tym krytycznym poziomie, obserwuje się wystarczającą ilość przeciwciał o jakości wiązania z powierzchnią bakterii wystarczającej do umożliwienia wydajnego zabicia bakterii przez dopełniacz oraz wyższe efekty bakteriobójcze.

Ponieważ testy bakteriobójczości surowicy (SBA) dobrze odzwierciedlają wydajność kandydatów na szczepionki, osiągnięcie dobrych mian SBA przez połączenie antygenów jest dobrym wskazaniem wydajności ochronnej szczepionki zawierającej to połączenie antygenów. Wynalazek dotyczy zastosowania połączenia dwóch antygenów, izolowanych lub wzbogaconych w mieszaninie z innymi antygenami. Po połączeniu, takie połączenia antygenów oddziaływują korzystnie oraz preferencyjnie synergistycznie w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej, która jest wyższa w odniesieniu do aktywności bakteriobójczej (przykładowo mierzonej w teście bakteriobójczości surowicy lub SBA) oraz korzystnie wyższa niż suma odpowiedzi wywołanych przez poszczegółne antygeny, w szczególności o współczynnik 1,2, 1,5, dwu-, trzy-, cztero-, pięcio-, sześcio-, siedmio-, ośmio-, dziewięciokrotnie, najkorzystniej co najmniej dziesięciokrotnie.

Dodatkową zaletą wynalazku jest to, że połączenie antygenów według wynalazku z różnych rodzin białek w preparacie immunogennym może umożliwić ochronę przed szerszym zakresem szczepów.

Wynalazek dotyczy preparatów immunogennych zawierających wiele (dwa lub większą liczbę) białek wybranych z co najmniej dwóch kategorii białek, mających różne funkcje w Neisseria. Przykładami takich kategorii białek są adhezyny, białka autotransportujące, toksyny, integralne białka błony zewnętrznej oraz białka pozyskiwania Fe. Połączenia szczepionkowe według wynalazku wykazują nieoczekiwane ulepszenie wydajności szczepionki przeciw homologicznym szczepom Neisseria (szczepom z których pochodzącą antygeny) oraz także przeciw heterologicznym szczepom Neisseria.

Wszystkie antygeny według wynalazku są wyizolowane, co oznacza, że wszystkie są zmienione przez człowieka. Korzystnie są one oczyszczone w pewnym stopniu, najkorzystniej wyższym niż 40,

PL 220 107 B1

50, 60, 70, 80, 90, 95 lub 99% czystości (przed połączeniem z innymi składnikami preparatów immunogennych według wynalazku).

Gdy białko jest tutaj specyficznie wymienione, jest to korzystnie odniesieniem do natywnego, pełnej długości białka oraz jego naturalnych wariantów (tj. do natywnego białka uzyskiwanego z Neisseria, korzystnie ze szczepu meningokoka), ale obejmuje to także jego fragmenty antygenowe (w szczególności w kontekście szczepionek podjednostkowych). Są to fragmenty (często specyficznie tutaj opisane) zawierające lub składające się z co najmniej 10 aminokwasów, korzystnie 20 aminokwasów, korzystniej 30 aminokwasów, korzystniej 40 aminokwasów lub najkorzystniej 50 aminokwasów, występujących obok siebie w sekwencji aminokwasowej białka. Ponadto, fragmenty antygenowe oznaczają fragmenty, które są reaktywne immunologicznie z przeciwciałami wytworzonymi przeciw pełnej długości białkom Neisseria lub z przeciwciałami wytworzonymi przez zakażenie Neisseria gospodarza będącego ssakiem. Antygenowe fragmenty obejmują także fragmenty, które po podaniu w skutecznej dawce, wywołują ochronną odpowiedź immunologiczną przeciw zakażeniu Neisseria, korzystniej przeciw zakażeniu N. meningitidis i/lub N. gonorrhoeae, najkorzystniej chroniącą przed zakażeniem N. meningitidis grupy serologicznej B.

Wynalazek umożliwia stosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych białek Neisseria lub ich fragmentów. Mogą one łączyć różne białka Neisseria lub ich fragmenty w tym samym polipeptydzie. Alternatywnie wynalazek umożliwia stosowanie oddzielnych białek fuzyjnych białek Neisseria lub ich fragmentów, jako białek fuzyjnych z heterologicznymi sekwencjami, takimi jak dostarczone przez epitopy komórek T lub znaczniki do oczyszczania, przykładowo: β-galaktozydaza, S-transferaza glutationowa, białka zielonej fluorescencji (GFP), znaczniki epitopowe, takie jak FLAG, znacznik myc, polihistydyna lub wirusowe białka powierzchniowe, takie jak hemaglutynina wirusa grypy, anatoksyna tężcowa, anatoksyna błonicza lub CRM197.

Antygeny według wynalazku

Odnośniki NMB dotyczą numerów odniesienia do sekwencji, które są dostępne z www.neisseria.org.

1. Adhezyny

Adhezyny obejmują FhaB (WO 98/02547), NadA (J. Exp. Med (2002) 195:1445; NMB 1994), Hsf znane także jako NhhA (NMB 0992) (WO 99/31132), Hap (NMB 1985) (WO 99/55873), NspA(WO 96/29412), MafA (NMB 0652) i MafB (NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000); Nature Biotech 20; 914-921 (2002)), Omp26 (NMB 0181), NMB 0315, NMB 0995, NMB 1119 i Pile (Mol. Microbiol. 1997, 23; 879-892). Są to białka uczestniczące w wiązaniu Neisseria z powierzchnią komórek gospodarzy. Przykładowo Hsf jest adhezyną, a także jest białkiem autotransportującym. Zatem preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać połączenia Hsf oraz innych białek autotransportujących, gdzie Hsf wnosi swoją właściwość adhezyny. Adhezyny te mogą pochodzić z Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae lub innych szczepów Neisseria. Preparat może zawierać także inne adhezyny z Neisseria.

FhaB

Antygen ten opisano w WO 98/02547 jako SEQ ID NO:38 (nu kleotydy 3083-9025) - patrz także NMB0497. W niniejszym wynalazku stwierdzono, że FhaB jest szczególnie skuteczne w indukowaniu przeciwciał przeciw-adhezyjnych samodzielnie, a w szczególności z innymi antygenami według wynalazku. Pomimo tego, że można zastosować FhaB pełnej długości, stwierdzono, że konkretne postacie skrócone na C-końcu są nieoczekiwanie tak samo skuteczne oraz korzystnie nawet jeszcze skuteczniejze w odniesieniu do efektu krzyżowo-szczepowego. Wykazano, że takie skrócone postacie są znacznie łatwiejsze do sklonowania. Skrócone postacie FhaB według wynalazku zazwyczaj odpowiadają N-końcowej części stanowiącej 2/3 cząsteczki FhaB, korzystnie nowy C-koniec jest umiejscowiony w pozycji 1200-1600, korzystniej w pozycji 1300-1500, a najkorzystniej w pozycji 1430-1440. Specyficzne postaci mają C-koniec w pozycji 1433 lub 1436. Zgodnie z tym, takie skrócone postacie FhaB według wynalazku oraz szczepionki zawierające takie skrócone postacie są niezależnymi aspektami wynalazku, a także są składnikami połączonych preparatów immunogennych według wynalazku. N-koniec może być także skrócony o 10, 20, 30, 40 lub 50 aminokwasów.

2. Białka autotransportujące

Białka autotransportujące zazwyczaj składają się z sekwencji sygnałowej, domeny pasażerskiej oraz domeny zakotwiczającej do przyłączenia do błony zewnętrznej. Przykłady białek autotransportujących obejmują Hsf (WO 99/31132) (NMB 0992), HMW, Hia (van Ulsen i in. Inmunol. Med. Microbiol.

PL 220 107 B1

2001 32; 53-64), Hap (NMB1985) (WO 99/55873; van Ulsen i in., Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64), UspA, UspA2, NadA (NMB 1994) (Comanducci i in., J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454), AspA (Infection and Inmunity 2002, 70(8); 4447-4461; NMB 1029), białko Aida-podobne 1, SSh-2 i Tsh. NadA (J. Exp. Med (2002) 195: 1445) jest innym przykładem białek autotransportujących oraz jest także adhezyną. Zatem preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać połączenia NadA oraz adhezyn, przy czym NadA wnosi swoją właściwość białka autotransportującego. Białka te mogą pochodzić z Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae lub innych szczepów Neisseria. Preparat może zawierać także inne białka autotransportujące z Neisseria.

Hsf

Hsf ma strukturę wspólną dla białek autotransportujących. Przykładowo, Hsf ze szczepu H44/76 N. meningitidis zawiera sekwencję sygnałową obejmującą aminokwasy 1-51, region głowy na N-końcu dojrzałego białka (aminokwasy 52-479), który jest eksponowany na powierzchni oraz zawiera regiony zmienne (aminokwasy 52-106, 121-124, 191-210 i 230-234), region szyi (aminokwasy 480-509), hydrofobowy region α-helisy (aminokwasy 518-529) oraz domenę zakotwiczającą, w której cztery nici transbłonowe przecinają błonę zewnętrzną (aminokwasy 539-591).

Pomimo, że pełnej długości Hsf można zastosować w preparatach immunogennych według wynalazku, różne skrócenia i delecje Hsf mogą być także korzystnie stosowane zależnie od typu szczepionki.

Gdy Hsf stosuje się w szczepionce podjednostkowej korzystne jest zastosowanie części rozpuszczalnej domeny pasażerskiej, przykładowo pełnej domeny aminokwasów 52 do 479, korzystniej jej części konserwatywnej, przykładowo szczególnie korzystnej sekwencji aminokwasów 134 do 479. Korzystne postacie Hsf mogą być skrócone tak żeby wydeletować zmienne regiony białka ujawnione w WO 01/55182. Korzystne warianty będą zawierać delecję jednego, dwóch, trzech, czterech lub pięciu regionów zmiennych, jak zdefiniowano w WO 01/55182. Powyższe sekwencje oraz sekwencje opisane poniżej mogą być wydłużone lub skrócone o 1,3, 5, 7, 10 lub 15 aminokwasów na jednym lub obydwu spośród N- i C-końca.

Zatem korzystne fragmenty obejmują cały region głowy Hsf, korzystnie zawierający aminokwasy 52-473. Dodatkowe korzystne fragmenty Hsf obejmują regiony eksponowane na powierzchni głowy, włącznie z jedną lub większą liczbą poniższych sekwencji aminokwasowych; 52-62, 76-93, 116-134, 147-157, 157-175, 199-211, 230-252, 252-270, 284-306, 328-338, 362-391,408-418, 430-440 i 469-479.

Gdy Hsf jest obecne w preparacie pęcherzyków błony zewnętrznej, może być eksprymowane jako pełnej długości białko lub preferencyjnie jako korzystny wariant stworzony przez fuzję aminokwasów 1-51 i 134-591 (z wytworzeniem dojrzałego białka błony zewnętrznej o sekwencji aminokwasowej od 134 do C-końca). Korzystne postacie Hsf mogą być skrócone w celu wydeletowania regionów zmiennych białka ujawnionych w WO 01/55182. Korzystne warianty zawierają delecję jednego, dwóch, trzech, czterech lupięciu regionów zmiennych zdefiniowanych w WO 01/55182. Korzystnie wydeletowane są pierwszy i drugi region zmienny. Korzystne warianty będą zawierać delecje reszt od pomiędzy aminokwasem 52 sekwencji do 237 lub od 54 do 237, korzystniej delecje reszt pomiędzy aminokwasem 52 a 133 lub 55 a 133. W dojrzałym białku brak będzie peptydu sygnałowego.

3. Białka pozyskiwania żelaza

Białka pozyskiwania żelaza obejmują TbpA (NMB 0461) (WO 92/03467, US5912336, WO 93/06861 i EP586266), TbpB (NMB 0460) (WO 93/06861 i EP586266), LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32:1117), LbpB (NMB 1541) (WO/99/09176), HpuA (U73112.2) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749), HpuB (NC_003116.1) (Mol Microbiol. 1997, 23; 737-749), P2086 (NMB 0399) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002), FbpA (NMB 0634), FbpB, BfrA (NMB 1207), BfrB (NMB 1206), Lipo28 znane także jako GNA2132 (NMB 2132), Sibp (NMB 1882), HmbR, HemH, Bcp (NMB 0750), białko transporter żelaza (III) typu ABC-permeaza (Tettelin i in., Science 287; 18091815 2000), białko transporter żelaza (III) typu ABC-periplazmatyczne (Tettelin i in. Science 287; 1809-1815 2000), receptor TonB-zależny (NMB 0964 i NMB 0293) (Tettelin i in. Science 287; 1809-1815 2000) oraz białko pokrewne białku wiążącemu transferynę (Tettelin i in. Science 287; 1809-1815 2000). Białka te mogą pochodzić ze szczepów Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae lub innych szczepów Neisseria. Preparat może zawierać także inne białka pozyskiwania żelaza z Neisseria.

PL 220 107 B1

TbpA

TbpA oddziałuje z TbpB z wytworzeniem kompleksu białkowego na zewnętrznej błonie Neisseria, który wiąże transferynę. Strukturalnie, TbpA zawiera wewnątrzkomórkową domenę N-końcową z kasetą TonB oraz domeną zakotwiczającą, wiele transbłonowych nici β połączonych przez krótkie wewnątrzkomórkowe oraz dłuższe zewnątrzkomórkowe pętle.

Rozróżniono dwie rodziny TbpB, odpowiednio o wysokiej masie cząsteczkowej i niskiej masie cząsteczkowej. Postacie TbpB o wysokiej i o niskiej masie cząsteczkowej wiążą się różnymi rodzinami TbpA, które są odróżnialne na podstawie homologii. Pomimo posiadania takiej samej masy cząsteczkowej, są one znane jako rodziny o wysokiej masie cząsteczkowej oraz o niskiej masie cząsteczkowej, ze względu na ich wiązanie się z postaciami TbpB o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej (Rokbi i in., FEMS Microbiol. Lett. 100; 51, 1993). Określenia TbpA(wysoka) i TbpA(niska) stosuje się w odniesieniu do tych dwóch postaci TbpA oraz podobnie dla TbpB. Preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać TbpA i TbpB z N. meningitidis grup serologicznych A, B, C, Y i W-135, a także białka pozyskiwania żelaza z innych bakterii, włącznie z N. gonorrhoeae. Wiążące transferynę białka TbpA i TbpB nazywano także odpowiednio Tbp1 i Tbp2 (Cornelissen i in., Infection and Immunity 65; 822, 1997).

TbpA zawiera kilka oddzielnych regionów. Przykładowo, w przypadku TbpA ze szczepu H44/76 N. meningitidis, 186 N-końcowych aminokwasów tworzy wewnętrzną domenę globularną, 22 nici β przecinają błonę tworząc strukturę podobną do baryłki. Są one połączone przez krótkie pętle wewnątrzkomórkowe oraz dłuższe pętle zewnątrzkomórkowe. Zewnątrzkomórkowe pętle 2, 3 i 5 wykazują największą zmienność sekwencji, a pętla 5 jest eksponowana na powierzchni. Pętle 5 i 4 uczestniczą w wiązaniu ligandu.

Korzystne fragmenty TbpA obejmują zewnątrzkomórkowe pę tle TbpA. Dla sekwencji TbpA ze szczepu H44/76 N. meningitidis pętle te odpowiadają aminokwasom 200-202 dla pętli 1, aminokwasom 226-303 dla pętli 2, aminokwasom 348-395 dla pętli 3, aminokwasom 438-471 dla pętli 4, aminokwasom 512-576 dla pętli 5, aminokwasom 609-625 dla pętli 6, aminokwasom 661-671 dla pętli 7, aminokwasom 707-723 dla pętli 8, aminokwasom 769-790 dla pętli 9, aminokwasom 814-844 dla pętli 10 oraz aminokwasom 872-903 dla pętli 11. Odpowiednie sekwe ncje, po przeprowadzeniu porównania sekwencji, w innych białka Tbp będą także stanowić korzystne fragmenty. Najkorzystniejsze fragmenty będą także obejmować sekwencje aminokwas owe stanowiące pętlę 2, pętlę 3, pętlę 4 lub pętlę 5 Tbp.

Gdy preparaty immunogenne według wynalazku zawierają TbpA, korzystne jest aby zawierały zarówno TbpA(wysoka), jak i TbpA(niska).

Pomimo tego, że TbpA jest korzystnie obecne w szczepionce na bazie OMV, może ono być także częścią szczepionki podjednostkowej. Przykładowo, wyizolowane białka pozyskiwania żelaza, które można wprowadzić do immunogennego preparatu są znane (WO 0025811). Mogą one być eksprymowane w bakteryjnym gospodarzu, wyekstrahowane z zastosowaniem detergentu (np. 2% Elugent) i oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa lub z zastosowaniem standardowych dobrze znanych technik chromatografii kolumnowej (Oakhill i in., Biochem J. 2002 364; 613-6).

Gdy TbpA jest obecne w szczepionce na bazie OMV, jego ekspresja może być podwyższona omówionymi technikami genetycznymi lub korzystnie podwyższona przez hodowanie szczepu wyjściowego w warunkach ograniczenia żelaza, jak opisano poniżej. Proces ten powoduje także podwyższenie ekspresji zmiennych białek regulowanych żelazem, w szczególności FrpB, które mogą stać się immunodominujące, a zatem korzystne jest obniżenie ekspresji (oraz korzystnie wydeletowanie genów kodujących) takie białka (w szczególności Frb), jak opisano poniżej, aby dostarczyć preparat immunogenny według wynalazku wywołujący odpowiedź immunologiczną przeciw antygenom obecnym w szerokim zakresie szczepów Neisseria. Szczególnie korzystne jest aby zarówno TbpA(wysoka), jak i TbpA(niska) były obecne w preparacie immunogennym i korzystnie osiąga się to przez połączenie OMV pochodzących z dwóch szczepów, eksprymujących alternatywne postacie TbpA.

4. Toksyny

Toksyny obejmują FrpA (NMB 0585; NMB 1405), FrpA/C (definicja, patrz poniżej), FrpC (NMB 1415; NMB 1405) (WO 92/01460), NM-ADPRT (NMB 1343) (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani i in., plakat 135), VapD (NMB 1753), lipopolisacharyd (LPS; nazywany także lipooligosacharydem lub LOS) immunotypu L2 oraz LPS immunotypu L3. FrpA i FrpC zawierają region, który jest konserwatywny dla tych dwóch białek, a korzystnym fragmentem tych białek jest polipeptyd zawierający ten konserwatywny fragment, korzystnie zawierający aminokwasy 227-1004

PL 220 107 B1 sekwencji FrpA/C. Antygeny te mogą pochodzić z Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae lub innych szczepów Neisseria. Preparat może zawierać także inne toksyny z Neisseria.

W alternatywnej postaci toksyny mogą obejmować antygeny związane z regulacją toksyczności, np. OstA, które działa w syntezie lipopolisacharydów.

FrpA i FrpC

Neisseria meningitidis koduje dwa białka RTX, nazywane FrpA i FrpC wydzielane przy ograniczeniu żelaza (Thompson i in., (1993) J. Bacteriol. 175:811-818; Thompson i in., (1993) Infect. Immun. 61:2906-2911). Rodzina białek RTX (toksyn z powtórzeniami, ang. Repeat ToXin) ma wspólną serię powtórzeń 9 aminokwasów w pobliżu swojego C-końca: Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa. (LXGGXGN/DDX). Uważa się, że powtórzenia w E. coli HlyA są miejscem wiązania Ca²+. Jak przedstawiono na fig. 4, meningokokowe białka FrpA i FrpC, jak scharakteryzowane w szczepie FAM20, wykazują duże podobieństwo aminokwasowe w swoich regionach centralnych oraz C-końcowych, ale bardzo ograniczone podobieństwo (jeżeli jakiekolwiek) na N-końcu. Ponadto, region konserwatywny dla FrpA i FrpC wykazuje pewien polimorfizm ze względu na liczbę powtórzeń (13 razy w FrpA oraz 43 razy w FrpC) motywu 9-aminokwasowego.

Preparaty immunogenne według wynalazku zawierają pełnej długości FrpA i/lub FrpC lub korzystnie, fragment zawierający sekwencję konserwatywną pomiędzy FrpA i FrpC. Konserwatywna sekwencja składa się z powtórzeń jednostek 9-aminokwasowych. Preparaty immunogenne według wynalazku korzystnie będą zawierać więcej niż 3 powtórzenia, więcej niż 10 powtórzeń, więcej niż 13 powtórzeń, więcej niż 20 powtórzeń lub więcej niż 23 powtórzenia.

Takie skrócone postacie mają korzystne właściwości względem cząsteczek pełnej długości oraz szczepionki zawierające takie antygeny stanowią niezależny aspekt wynalazku, a także są włączone do preparatów immunogennych według wynalazku.

Sekwencje konserwatywne dla FrpA i FrpC są nazwane FrpA/C i kiedykolwiek FrpA lub FrpC stanowi składnik preparatów immunogennych według wynalazku, korzystnie może być stosowane FrpA/C. Aminokwasy 277-1004 sekwencji FrpA stanowią korzystny region konserwatywny. Powyższa sekwencja może zostać skrócona lub wydłużona o 1, 3, 5, 7, 10 lub 15 aminokwasów na jednym lub obydwu spośród N- i C-końca.

LPS

LPS (lipopolisacharyd, znany także jako LOS-lipooligosacharyd) jest endotoksyną zewnętrznej błony Neisseria. Wiadomo, że ugrupowanie polisacharydowe LPS indukuje bakteriobójcze przeciwciała.

Heterogenność ugrupowań oligosacharydowych LPS zapewnia zmienność strukturalną i antygenową wśród różnych szczepów Neisseria (Griffiss i in., Inf. Immun. 1987; 55:1792-1800). Zastosowano to do podzielenia szczepów meningokoków na 12 immunotypów (Scholtan i in., J Med Microbiol 1994, 41:236-243). Immunotypy L3 L7, i L9 są immunologicznie identyczne oraz strukturalnie podobne (lub nawet takie same), a zatem oznaczono je L3, 7, 9 (lub, w opisie, ogólnie jako „L3”). Meningokokowe LPS L3, 7, 9 (L3), L2 i L5 mogą być zmodyfikowane przez sjalowanie lub przez addycję cytydyno-5'-monofosforanu kwasu N-acetyloneuraminowego. Pomimo, że LPS L2, L4 i L6 są rozróżnialne immunologicznie mogą być one strukturalnie podobne i gdy wspomina się tutaj L2 może być on ewentualnie zastąpiony L4 lub L6 w zakresie objętym wynalazkiem. Dalsza ilustracja struktury i heterogenności LPS, patrz M. P. Jennings i in., Microbiology 1999, 145, 3013-3021 i Mol Microbiol 2002, 43:931-43.

Gdy LPS, korzystnie meningokokowy LPS, jest włączony do szczepionki według wynalazku, preferencyjnie i korzystnie obecne są jeden lub obydwa spośród immunotypów L2 i L3. LPS jest korzystnie obecny w pęcherzyku błony zewnętrznej (korzystnie gdy pęcherzyk ekstrahuje się detergentem w niskim udziale procentowym, korzystniej 0-0,5%, 0,02-0,4%, 0,04-0,3%, 0,06-0,2%, 0,08-0,15% lub 0,1%, najkorzystniej dezoksyholanu [DOC]), ale może on także stanowić część szczepionki podjednostkowej. LPS można wydzielić przez zastosowanie dobrze znanej procedury, włącznie z procedurą z gorącą wodą-fenolem (Wesphal i Jann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965). Patrz także Galanos i in., 1969, Eur J Biochem 9:245-249 oraz Wu i in., 1987, Anal Bio Chem 160:281-289. LPS może być stosowany sam lub sprzężony z epitopami dla komórek T, takimi jak anatoksyna tężcowa, anatoksyna błonicza, CRM-197 lub białka OMV błony zewnętrznej. Znane są także techniki sprzęgania wyizolowanych LOS (patrz przykładowo EP 941738 wprowadzony tutaj jako pozycja literaturowa).

PL 220 107 B1

Gdy LOS (w szczególności LOS) jest obecny w preparacie pęcherzyków, LOS jest korzystnie sprzęgany in situ sposobami umożliwiającymi sprzężenie LOS z jednym lub większą liczbą białek błonowych także obecnych w preparacie pęcherzyków (np. PorA i PorB meningokoka).

Proces ten korzystnie może zwiększyć stabilność i/lub immunogenność (dostarczając pomoc komórek T) i/lub antygenowość antygenu LOS w preparacie pęcherzyków, w ten sposób dostarczając pomoc komórek T dla T-niezależnego immunogenu oligosacharydowego w jego najbardziej ochronnej konfromacji, takiej jak LOS w jego naturalnym środowisku na powierzchni błony zewnętrznej meningokoka. Ponadto, sprzęganie LOS może spowodować detoksykację LOS (część lipidu A zostaje stabilnie ukryta błonie zewnętrznej i tak staje się mniej dostępna do wywoływania toksyczności). Zatem, wspomniane tutaj sposoby detoksykacji przez izolowanie pęcherzyków z mutantów herb^- lub msbB lub przez dodawanie do preparatu nietoksycznego peptydu będącego funkcjonalnym odpowiednikiem polimyksyny B [cząsteczki o dużym powinowactwie do Lipidu A] (dalsze szczegóły nietoksycznych peptydów będących funkcjonalnymi odpowiednikami polimyksyny B, w szczególności zastosowania peptydu SAEP 2 (o sekwencji KTKCKFLKKC w której 2 cysteiny tworzą mostek dwusiarczkowy) patrz, WO 93/14115, WO 95/03327, Velucchi i in., (1997) J Endotoxin Res 4:1-12 i EP 976402) mogą nie być wymagane (ale mogą być one włączone do preparatu w celu zwiększenia bezpieczeństwa). Tak też, wynalazcy stwierdzili, że preparat zawierający pęcherzyki, w których LOS obecny w pęcherzykach został sprzężony, wewnątrz pęcherzyków, z białkami błony zewnętrznej także obecnymi w pęcherzyku mogą stanowić podstawę szczepionki do leczenia lub profilaktyki chorób wywołanych przez organizm z którego pochodzą pęcherzyki, przy czym taka szczepionka jest zasadniczo nietoksyczna i jest zdolna do indukowania T-zależnej odpowiedzi bakteriobójczej przeciw LOS w jego naturalnym środowisku.

Zatem wynalazek umożliwia stosowanie preparatu pęcherzyków meningokoków z LOS sprzężonym wewnątrz pęcherzyka.

Takie preparaty pęcherzyków mogą zostać wyizolowane z danej bakterii (patrz WO 01/09350), a następnie poddane reakcjom sprzęgania w celu połączenia grup (np. NH₂ lub COOH) na części oligosacharydowej LOS z grupami (np. NH₂ lub COOH) na białkach pęcherzyków błony zewnętrznej. Można zastosować techniki sieciowania aldehydem glutarowym, formaldehydem lub mieszankami aldehyd glutarowy/formaldehyd, ale korzystne jest zastosowanie bardziej wybiórczych reakcji, takich jak z użyciem EDAC lub EDAC/NHS (J. V. Staros, R. W. Wright i D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156:220-222 (1986); oraz Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) strony 173-176). Inne reakcje sprzęgania lub obróbkę zdolną do wytworzenia kowalencyjnych wiązań pomiędzy LOS i cząsteczkami białka, które można zastosować, opisano w EP 941738.

Korzystnie preparaty pęcherzyków są sprzęgane przy braku polisacharydu otoczkowego. Pęcherzyki mogą być wyizolowane ze szczepu, który nie wytwarza polisacharydu otoczkowego (naturalnie lub przez opisaną poniżej mutację) lub mogą być oczyszczone z preparatów zawierających większość lub wszystkie zanieczyszczające polisacharydy otoczkowe. Tak też, reakcja sprzęgania LOS wewnątrz pęcherzyka jest bardziej wydajna.

Korzystnie więcej niż 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 lub 95% LOS obecnego w pęcherzykach jest usieciowane/sprzężone.

Sprzęganie wewnątrz pęcherzyka powinno korzystnie obejmować 1, 2 lub wszystkie 3 z poniższych cech procesu: pH sprzęgania powinno być wyższe niż pH 7,0, korzystnie wyższe lub równe pH 7,5 (najkorzystniej poniżej pH 9); powinny być utrzymywane podczas reakcji warunki 1-5%, korzystnie 2-4%, najkorzystniej około 3% sacharozy; NaCl powinien być zminimalizowany w reakcji, korzystnie poniżej 0,1 M, 0,05 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M, a najkorzystniej w ogólnie nieobecny. Wszystkie te cechy procesu zapewniają, że pęcherzyki pozostają stabilne w roztworze podczas procesu sprzęgania.

Proces sprzęgania EDAC/NHS jest korzystnym procesem do sprzęgania wewnątrz pęcherzyka. EDAC/NHS jest korzystniejszy niż formalydehyd, który sieciuje w zbyt dużym stopniu, zatem negatywnie wpływa na filtrowalność. EDAC reaguje z kwasem karboksylowym (takim jak KDO w LOS) z wytworzeniem związku pośredniego w postaci aktywnego estru. W obecności nukleofilu aminowego (takiego jak lizyny białek błony zewnętrznej, takich jak PorB) tworzy się wiązanie amidowe z uwolnieniem produktu ubocznego w postaci izomocznika. Jednakże, wydajność reakcji za pośrednictwem EDAC może być zwiększona przez wytworzenie estru sulfo-NHS jako związku pośredniego. Ester sulfo-NHS jest bardziej stabilny w roztworze wodnym niż aktywny ester wytworzony w reakcji samego

PL 220 107 B1

EDAC z karboksylanem. Zatem, w tym procesie dwuetapowym uzyskuje się wyższą wydajność tworzenia wiązania amidowego. Sprzęganie EDAC/NHS omówiono w J. V. Staros, R. W. Wright i D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimidemediated coupling reactions. Analytical chemistry 156:220-222(1986); oraz Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) strony 173-176. Korzystnie w tej reakcji stosuje się 0,01-5 mg EDAC/mg pęcherzyków, korzystniej 0,05-1 mg EDAC/mg pęcherzyków. Ilość zastosowanego EDAC zależy od ilości LOS obecnego w próbce, co z kolei zależy od udziału procentowego deozoksyholanu (DOC) zastosowanego do wyekstrahowania pęcherzyków. Przy niskim udziale procentowym DOC (np. 0,1%) stosuje się duże ilości EDAC (1 mg/mg i poniżej), jednakże przy wyższym udziale procentowym DOC (np. 0,5%), stosuje się mniejsze ilości EDAC (0,025-0,1 mg/mg) aby zapobiec zbyt dużemu sieciowaniu pomiędzy pęcherzykami.

Wynalazek umożliwia proces wytwarzania LOS (korzystnie meningokokowego) sprzężonego wewnątrz pęcherzyka obejmujący etapy sprzęgania pęcherzyków w obecności EDAC/NHS w pH pomiędzy pH 7,0 a pH 9,0 (korzystnie około pH 7,5), w 1-5% (korzystnie około 3%) sacharozie oraz ewentualnie w warunkach zasadniczego braku NaCl (jak opisano powyżej) oraz wydzielania sprzężonych pęcherzyków z mieszaniny reakcyjnej.

Po reakcji można przeprowadzić rozdział mieszaniny reakcyjnej w żelach z analizą Western z zastosowaniem mAb przeciw-LOS (np. przeciw-L2 lub przeciw-L3) aby wykazać wzrost masy cząsteczkowej LOS, ze względu pozostawanie większej części LOS w pęcherzykach wraz z postępem reakcji.

Takimi technikami można uzyskać wydajność 99% pęcherzyków.

Stwierdzono, że EDAC jest bardzo dobrym środkiem do sieciowania wewnątrz pęcherzyka, pod tym względem, że sieciuje on LOS z OMP wystarczająco dobrze dla poprawienia T-zależnej immunogenności LOS, ale nie sieciuje on go w tak wysokim stopniu aby wystąpiły takie problemy jak słaba filtrowalność, agregacja i sieciowanie pomiędzy pęcherzykami. Morfologia wytworzonych pęcherzyków jest podobna do niesprzężonych pęcherzyków (metodą mikroskopii elektronowej). Ponadto, powyższa procedura pozwala zapobiec występowaniu zbyt intensywnego sieciowania (które może obniżyć immunogenność ochronnych OMP naturalnie obecnych na powierzchni pęcherzyka, np. TbpA lub Hsf).

Korzystne jest aby szczep meningokoka z którego pochodzą pęcherzyki był szczepem zmutowanym, który nie może wytwarzać polisacharydu otoczkowego (np. jednym z opisanych poniżej zmutowanych szczepów, w szczególności siaD^-). Korzystne jest także aby preparaty immunogenne skuteczne przeciw chorobie meningokokowej zawierały pęcherzyki zarówno L2, jak i L3, przy czym L2 i L3 LOS są obydwa sprzężone z białkami błony zewnętrznej pęcherzyków. Ponadto, korzystne jest aby struktura LOS w pęcherzyku sprzężonym wewnątrz pęcherzyka była zgodna z pochodzącym ze szczepu meningokoka IgtB” (jak opisano poniżej). Najkorzystniej preparaty immunogenne zawierają pęcherzyki sprzężone wewnątrz pęcherzyków: pochodzące ze zmutowanego szczepu meningokoka, który nie może wytwarzać polisacharydu otoczkowego i jest IgtB^-; zawierają pęcherzyki L2 i L3 pochodzące ze zmutowanych szczepów meningokokowych, które nie mogą wytwarzać polisacharydu otoczkowego; zawierają pęcherzyki L2 i L3 pochodzące ze zmutowanych szczepów meningokokowych, które są IgtB^-; lub najkorzystniej zawierają pęcherzyki L2 i L3 pochodzące ze zmutowanych szczepów meningokokowych, które nie mogą wytwarzać polisacharydu otoczkowego i są IgtB^-.

Typowym szczepem meningokoka L3, który może być stosowany zgodnie z wynalazkiem jest szczep H44/76 menB. Typowym szczepem L2 jest szczep B16B6 menB lub szczep 39E meningokoka typu C.

Jak stwierdzono powyżej, pęcherzyki zgodne z wynalazkiem zostały detoksykowane przez przeprowadzenie sprzęgania, a zatem nie muszą być ponadto detoksykowane, jednakże kolejne sposoby detoksykacji mogą być stosowane w celu poprawienia bezpieczeństwa, przykładowo przez zastosowanie pęcherzyków pochodzących ze szczepu meningokoka, który jest herb^- lub msbB^- lub przez dodanie do preparatu pęcherzyków nietoksycznego peptydu będącego funkcjonalnym odpowiednikiem polimyksyny B [cząsteczki o dużym powinowactwie do Lipidu A] (korzystnie SEAP 2) (jak opisano powyżej).

W opisanych powyżej sposobach dostarcza się pęcherzyki meningokokowe oraz preparaty immunogenne zawierające pęcherzyki, które zawierają jako istotny antygen LOS, który jest zasadniczo nietoksyczny, pozbawiony problemów autoimmunizacji, ma charakter T-zależny, jest obecny w swoim naturalnym środowisku oraz jest zdolny do indukowania odpowiedzi przeciwciał bakteriobójczych skierowanej przeciw ponad 90% szczepów meningokoków (w przypadku preparatów L2+L3).

PL 220 107 B1

Korzystnie, sprzęganie LOS wewnątrz pęcherzyka powinno obejmować 1, 2 lub wszystkie 3 z poniższych cech procesu: pH sprzęgania powinno być wyższe niż pH 7,0, korzystnie wyższe lub równe pH 7,5 (najkorzystniej poniżej pH 9); podczas reakcji powinny być utrzymywane warunki 1-5%, korzystnie 2-4%, najkorzystniej około 3% sacharozy; NaCl powinien być zminimalizowany w reakcji, korzystnie poniżej 0,1 M, 0,05 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M, a najkorzystniej w ogólnie nieobecny. Wszystkie te cechy procesu zapewniają, że pęcherzyki pozostają stabilne w roztworze podczas procesu sprzęgania.

Pomimo tego, że LOS można sprzęgać w pęcherzykach z białkami błony zewnętrznej z zastosowaniem różnych technik i reakcji, proces sprzęgania z użyciem EDAC/NHS jest procesem korzystnym do sprzęgania wewnątrz pęcherzyka. EDAC/NHS jest korzystniejszy niż formaldehyd, który może w dużym stopniu sieciować, a zatem negatywnie wpływać na filtrowalność. EDAC reaguje z kwasami karboksylowymi z wytworzeniem związku pośredniego w postaci aktywnego estru. W obecności nukleofilu aminowego tworzy się wiązanie amidowe z uwolnieniem produktu ubocznego w postaci izomocznika. Jednakże wydajność reakcji za pośrednictwem EDAC może być zwiększona przez wytworzenie estru sulfo-NHS jako związku pośredniego. Ester sulfo-NHS jest bardziej stabilny w roztworze wodnym niż aktywny ester wytworzony w reakcji samego EDAC z karboksylanem. Zatem, w tym procesie dwuetapowym uzyskuje się wyższą wydajność tworzenia wiązania amidowego. Sprzęganie EDAC/NHS omówiono w J. V. Staros, R. W. Wright i D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156:220-222(1986); oraz Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996) strony 173-176.

Zatem korzystnym procesem zgodnie z wynalazkiem jest proces wytwarzania LOS (korzystnie meningokowego) sprzężonego wewnątrz pęcherzyka obejmujący etapy sprzęgania pęcherzyków w obecności EDAC/NHS w pH pomiędzy pH 7,0 a pH 9,0 (korzystnie około pH 7,5), w 1-5% (korzystnie około 3%) sacharozie oraz ewentualnie w warunkach zasadniczego braku NaCl (jak opisano powyżej) oraz wydzielania sprzężonych pęcherzyków z mieszaniny reakcyjnej.

Po reakcji można przeprowadzić rozdział mieszaniny reakcyjnej w żelach z zastosowaniem mAb przeciw-LOS (np. przeciw-L2 lub przeciw-L3) aby wykazać wzrost masy cząsteczkowej LOS, ze względu na pozostawanie większej części LOS w pęcherzykach wraz z postępem reakcji.

Takimi technikami można uzyskać wydajność 99% pęcherzyków.

Stwierdzono, że EDAC jest bardzo dobrym środkiem do sieciowania wewnątrz pęcherzyka, pod tym względem, że sieciuje on LOS z OMP wystarczająco dobrze dla poprawienia T-zależnej immunogenności LOS, ale nie sieciuje on go w tak wysokim stopniu aby wystąpiły takie problemy jak słaba filtrowalność i sieciowanie pomiędzy pęcherzykami. Zapobieżenie zbyt silnemu sieciowaniu powinno także przeciwdziałać jakiemukolwiek obniżeniu immunogenności ochronnych OMP naturalnie obecnych na powierzchni pęcherzyka, np. TbpA.

5. Integralne białka błony zewnętrznej

Inne kategorie białek Neisseria mogą być także kandydatami do włączenia do szczepionek przeciw Neisseria według wynalazku i można je łączyć z innymi antygenami w nieoczekiwanie skuteczny sposób. Białka związane z błoną, w szczególności integralne białka błonowe, a najkorzystniej białka błony zewnętrznej, w szczególności integralne białka błony zewnętrznej można stosować w preparatach według wynalazku. Przykładem takiego białka jest PldA, znane także jako Omp1A (NMB 0464) (WO 00/15801), które jest białkiem fosfolipazy zewnętrznej błony Neisseria. Kolejnymi przykładami są TspA (NMB 0341) (Infect. Immun. 1999, 67; 3533-3541) i TspB (białko stymulujące komórki T) (WO 00/03003; NMB 1548, NMB1628 lub NMB 1747). Kolejne przykłady obejmują PilQ (NMB 1812) (WO 99/61620), OMP85, znane także jako D15 (NMB0182) (WO 00/23593), NspA (U52066) (WO 96/29412), FhaC (NMB 0496 lub NMB 1780), PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370, 1995), HpuB (NC_003116.1), TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001, 147; 1277-1290), OstA (NMB0280), MltA, znane także jako GNA33 i Lipo30 (NMB 0033), HtrA (NMB 0532; WO 99/55872), HimD (NMB 1302), HisD (NMB 1581), GNA 1870 (NMB 1870), HlpA (NMB 1946), NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, TbpA (NMB 0461) (WO 92/03467) (patrz także białka pozyskiwania żelaza) i LbpA (NMB 1541).

OMP 85

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać pełnej długości OMP85, korzystnie jako część preparatu OMV. Fragmenty OMP85 mogą być także stosowane w preparatach immunogennych według wynalazku, w szczególności eksponowana na powierzchni domena OMP85 utworzo12

PL 220 107 B1 na przez reszty aminokwasowe 1-475 lub 50-475 jest korzystnie wprowadzona jako podjednostkowy składnik preparatów immunogennych według wynalazku. Powyższa sekwencja eksponowanej na powierzchni domeny OMP85 może być wydłużona o 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, lub 30 na jednym lub obydwu spośród N- i C-końca. Korzystne jest aby sekwencja sygnałowa była pominięta we fragmencie OMP85.

OstA

OstA funkcjonuje w syntezie lipopolisacharydu i może być uznane za regulator toksyczności. OstA może być ewentualnie włączone do kategorii toksyn, gdy kategorię toksyn poszerzy się jako obejmującą regulatory toksyczności, jak też toksyny.

Preparaty immunogenne

Preparat immunogenny jest preparatem zawierającym co najmniej jeden antygen, który jest zdolny do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej po podaniu gospodarzowi. Korzystnie, takie preparaty immunogenne są zdolne do wytworzenia ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciw zakażeniu Neisseria, korzystnie Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae.

Wynalazek dotyczy preparatów immunogennych zawierających co najmniej dwa antygeny, które korzystnie wywołują co najmniej jedną lub większą liczbę z synergistycznych odpowiedzi bakteriobójczych, ochronnych lub blokujących adhezję.

Testy bakteriobójczości SBA według wynalazku

Taką synergistyczną odpowiedź charakteryzuje się przez SBA wywołaną przez połączenie antygenów wynoszącą co najmniej 50%, dwukrotność, trzykrotność, korzystnie czterokrotność, pięciokrotność, sześciokrotność, siedmiokrotność, ośmiokrotność, dziewięciokrotność a najkorzystniej dziesięciokrotność SBA wywołanej przez każdy z antygenów osobno. Korzystnie SBA mierzy się wobec homologicznego szczepu z którego pochodzą antygeny, a korzystnie także wobec zestawu heterologicznych szczepów. (Patrz poniżej, reprezentatywny zestaw np. BZ10 (B:2b:P1.2) należący do klastru A-4; B16B6 (B:2a:P1.2) należący do kompleksu ET-37 i H44/76 (B:15:P1.7,16)). SBA jest najpowszechniej uznanym wskaźnikiem immunologicznym do oszacowania wydajności szczepionki meningokokowej (Perkins i in., J Infect Dis. 1998, 177:683-691). Zadowalającą SBA można oszacować dowolnym sposobem. SBA można przeprowadzić przy zastosowaniu surowic uzyskanych z modeli zwierzęcych (patrz przykłady 17-20) lub od pacjentów będących ludźmi.

Korzystny sposób przeprowadzania SBA z surowicą ludzką jest następujący. Próbkę krwi pobiera się przed pierwszym szczepieniem, dwa miesiące po drugim szczepieniu oraz miesiąc po trzecim szczepieniu (trzy szczepienia w ciągu roku są typowym schematem pierwotnego szczepienia człowieka i zastrzyki wykonuje się, np., w miesiącach 0, 2 i 4 lub 0, 1 i 6). Takie schematy pierwotnego szczepienia człowieka można przeprowadzić u dzieci poniżej jednego roku życia (np. w tym samym momencie w którym przeprowadza się szczepienia Hib) lub dzieci w wieku 2-4 lat lub dorastającą młodzież można także szczepić w celu zbadania SBA z zastosowaniem takiego schematu pierwotnego szczepienia. Kolejną próbkę krwi można pobrać po 6 do 12 miesiącach po pierwotnym szczepieniu lub po jednym miesiącu od dawki przypominającej, jeżeli ma to zastosowanie.

SBA będzie satysfakcjonująca dla antygenu lub preparatu pęcherzyków o homologicznej aktywności bakteriobójczej gdy, miesiąc po trzeciej dawce szczepionki (schematu pierwotnego szczepienia) (u dwu-czteroletnich dzieci lub dorastającej młodzieży, ale korzystnie u dzieci w pierwszym roku życia), procent pacjentów z czterokrotnym wzrostem miana (rozcieńczenie przeciwciała), w odniesieniu do SBA, (w porównaniu z mianem przed szczepieniem) względem szczepu meningokoka z którego pochodzą antygeny zgodnie z wynalazkiem jest wyższy niż 30%, korzystnie wyższy niż 40%, korzystniej wyższy niż 50%, a najkorzystniej wyższy niż 60% ogółu pacjentów.

Oczywiście antygen lub preparat pęcherzyków o heterologicznej aktywności bakteriobójczej może także stanowić preparat o homologicznej aktywności bakteriobójczej, jeżeli może on także wywołać satysfakcjonującą SBA względem szczepu meningokoka z którego pochodzi.

SBA będzie satysfakcjonująca dla antygenu lub preparatu pęcherzyków o heterologicznej aktywności bakteriobójczej gdy, miesiąc po trzeciej dawce szczepionki (schematu pierwotnego szczepienia) (u dwu-czteroletnich dzieci lub dorastającej młodzieży, ale korzystnie u dzieci w pierwszym roku życia), procent pacjentów z czterokrotnym wzrostem miana (rozcieńczenie przeciwciała), w odniesieniu do SBA, (w porównaniu z mianem przed szczepieniem) względem trzech heterologicznych szczepów meningokoka jest wyższy niż 20%, korzystnie wyższy niż 30%, korzystniej wyższy niż 35%, a najkorzystniej wyższy niż 40% ogółu pacjentów. Taki test jest dobrym wskazaniem tego czy antygen

PL 220 107 B1 lub preparat pęcherzyków o heterologicznej aktywności bakteriobójczej może wywołać reagujące krzyżowo przeciwciała bakteriobójcze przeciw różnym szczepom meningokoków. Trzy szczepy heterologiczne powinny mieć korzystnie różniące się od siebie kompleks typu elektroforetycznego (ET) lub wzór typowania sekwencji multilocusowej (MLST) (patrz Maiden i in., PNAS USA 1998, 95:3140-5) oraz korzystnie różniące się od szczepu, z którego wytworzono lub z którego pochodzi antygen lub preparat pęcherzyków o heterologicznej aktywności bakteriobójczej. Fachowiec będzie w stanie łatwo wyznaczyć trzy szczepy o różnych kompleksach ET, które odzwierciedlają zmienność genetyczną obserwowaną wśród meningokoków, w szczególności wśród szczepów meningokoków typu B, które są uważane za przyczynę znaczącego obciążenia chorobą i/lub które stanowią rozpoznane hiperzmienne linie MenB (patrz Maiden i in., jak wyżej). Przykładowo trzy szczepy, które mogą być zastosowane są następujące: BZ10 (B:2b:P1.2) należący do klastru A-4; B16B6 (B:2a:P1.2) należący do kompleksu ET-37; oraz H44/76 (B:15:P1.7,16) należący do kompleksu ET-5, lub jakiekolwiek inne szczepy należące do tego samego ET/klastru. Takie szczepy można zastosować do zbadania antygenu lub preparatu pęcherzyków o heterologicznej aktywności bakteriobójczej wytworzonego z lub pochodzącego przykładowo ze szczepu meningokoka CU385 (B:4:P1.15), który należy do kompleksu ET-5. Inny przykładowy sczep, który może być zastosowany pochodzi z linii 3 klonu epidemicznego (np. NZ124 [B:4:P1.7,4]). Innym szczepem ET-37 jest NGP165 (B:2a:P1.2).

Procesy mierzenia aktywności SBA są znane. Przykładowo, sposób który można zastosować opisano w WO 99/09176 w przykładzie 10C. Ogólnie prowadzi się hodowlę badanego szczepu (korzystnie w warunkach ograniczenia żelaza przez dodanie do pożywki hodowlanej związku chelatującego żelazo, takiego jak EDDA) do logarytmicznej fazy wzrostu. Szczep ten można przeprowadzić w zawiesinę w pożywce z BSA (takiej jak pożywka Hanksa z 0,3% BSA) w celu uzyskania roboczej zawiesiny komórek doprowadzonej do około 20000 CFU/ml. Serię mieszanin reakcyjnych można przygotować przez zmieszanie serii dwukrotnych rozcieńczeń badanej surowicy (korzystnie inaktywowanej temperaturowo w 56°C przez 30 minut) [przykładowo w objętości 50 μl/studzienkę] oraz zawiesiny 20000 CFU/ml badanego szczepu meningokoka [przykładowo w objętości 25 μl/studzienkę]. Następnie próbki reakcyjne inkubuje się (np. 37°C przez 15 minut) z wytrząsaniem (np. przy 210 obr./min). Końcowa mieszanina reakcyjna [np. w objętości 100 μθ dodatkowo zawiera źródło dopełniacza [takie jak 25% końcowej objętości wstępnie zbadanej surowicy noworodków królika] i inkubuje się ją jak powyżej [np. 37°C przez 60 minut]. Do tego testu można zastosować jałową polistyrenową płytkę 96studzienkową ze studzienkami o dnach w kształcie litery U. Próbki [np. 10 μθ można pobrać z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, nakropić na płytki agarowe Mueller-Hinton (korzystnie zawierające 1% Isovitalex i 1% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej) i inkubować (np. przez 18 godzin w 37°C w 5% CO₂). Korzystnie pojedyncze kolonie można zliczyć do 80 CFU na próbkę. Jako kontrole można zastosować następujące trzy próbki badane: bufor + bakterie + dopełniacz; bufor + bakterie + inaktywowany dopełniacz; surowica + bakterie + inaktywowany dopełniacz. Miana SBA można bezpośrednio obliczyć stosując program do obróbki danych dający w wyniku miano odpowiadające 50% uśmiercenia komórek przez obliczania regresji.

Testy odpowiedzi ochronnej przeprowadzane na zwierzętach

Alternatywnie odpowiedź synergistyczną można scharakteryzować przez wydajność połączenia antygenów w teście odpowiedzi ochronnej przeprowadzanym na zwierzętach. Przykładowo, można zastosować takie testy opisane w przykładach 12 lub 13. Korzystnie, liczba zwierząt z odpowiedzią ochronną po połączeniu antygenów jest istotnie podwyższona w porównaniu z tymi antygenami stosowanymi pojedynczo, w szczególności w suboptymalnych dawkach antygenu.

Skuteczna szczepionka do profilaktyki zakażenia przez N. gonorrheae może wymagać wystąpienia więcej niż jednego z poniższych elementów: wytworzenia przeciwciał surowiczych i/lub śluzówkowych ułatwiających uśmiercanie gonokoków za pośrednictwem dopełniacza i/lub zwiększenia fagocytozy oraz uśmiercania bakterii przez leukocyty, takie jak leukocyty z segmentowanym jądrem (granulocyty) i/lub zapobiegania przyczepienia gonokoków do tkanek gospodarza; wywołanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej może także uczestniczyć w ochronie.

Ulepszenie wydajności preparatu szczepionki na bazie pęcherzyków gonokoków zgodnie z wynalazkiem można ocenić przez analizę wywołanej odpowiedzi pod względem przeciwciał s urowicy i/lub śluzówki, wykazujących właściwości przeciwadhezyjne i/lub opsonizujące i/lub akty wność bakteriobójczą, jak wcześniej opisano (McChesney D i in., Infect. Immun. 36:1006, 1982; Boslego J i in.: Efficacy trial of a purified gonococcal pilus vaccine, w Program and Abstracts of the 24 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, Ameri14

PL 220 107 B1 can Society for Microbiology, 1984; Siegel M i in., J. Infect. Dis 145:300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20, 1995).

Ostatnio opisano mysi model zakażenia narządów rozrodczych przez N. gonorrheae (Plante M, J. Infect. Dis., 182:848-55, 2000). Ulepszenie wydajności szczepionki na bazie pęcherzyków gonokoków zgodnie z wynalazkiem można także ocenić przez jej zdolność do profilaktyki lub obniżania kolonizacji przez N. gonorrheae w tym mysim modelu zakażenia.

Test blokowania adhezji

Alternatywnie synergistyczną odpowiedź można scharakteryzować przez skuteczność połączenia antygenów w teście blokowania adhezji. Przykładowo można zastosować test opisany w przykładzie 11. Korzystnie, stopień blokowania wywołany przez surowicę odpornościową wytworzoną przeciw połączeniu antygenów jest istotnie podwyższony w porównaniu z surowicą wytworzoną przeciw samym antygenom, w szczególności w suboptymalnych dawkach przeciwciała.

Preparaty podjednostkowe

Preparat immunogenny według wynalazku może być preparatem podjednostkowym.

Preparaty podjednostkowe są preparatami, w których składniki zostały wyizolowane i oczyszczone do co najmniej 50%, korzystnie do co najmniej 60%, 70%, 80%, 90% czystości przed zmieszaniem składników z wytworzeniem preparatu antygenowego.

Preparaty podjednostkowe mogą być wodnymi roztworami białek rozpuszczalnych w wodzie. Mogą one zawierać detergent, korzystnie niejonowy, amfoteryczny lub jonowy detergent w celu ułatwienia solubilizacji hydrofobowych części antygenów. Mogą one zawierać lipidy, tak aby mogły zostać utworzone struktury liposomów, umożliwiające prezentację antygenów o strukturze przecinającej błonę lipidową.

Preparaty pęcherzyków błony zewnętrznej

N. meningitidis grupy serologicznej B (menB) wydziela pęcherzyki błony zewnętrznej w wystarczających ilościach aby umożliwić ich wytwarzanie na skalę przemysłową. Pęcherzyki błony zewnętrznej można także wydzielić sposobem ekstrakcji detergentem komórek bakteryjnych (patrz, przykładowo EP 11243).

Preparat immunogenny według wynalazku może także zawierać preparat pęcherzyków błony zewnętrznej z podwyższoną ekspresją co najmniej dwóch antygenów, rekombinacyjnie lub innymi sposobami, włącznie ze wzrostem w warunkach ograniczenia żelaza. Przykłady antygenów, które będą miały podwyższoną ekspresję w takim preparacie pęcherzyków błony zewnętrznej obejmują; NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA(wysoka), TbpA(niska), LbpA, TbpB, LbpB, Pi10, AspA, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NMADPRT, MafA, MafB i PldA. Takie preparaty mogą ewentualnie także zawierać jeden lub obydwa spośród LPS immunotypu L2 i LPS immunotypu L3.

Preparaty pęcherzyków szczepów Neisseria można otrzymać którymkolwiek ze sposobów znanych fachowcom. Korzystnie stosuje się sposoby ujawnione w EP 301992, US 5597572, EP 11243 lub US 4271147, Frederikson i in. (NIPH Annals [1991], 14:67-80), Zollinger i in. (J. Clin. Invest. [1979], 63:836-848), Saunders i in. (Infect. Immun. [1999], 67:113-119), Drabick i in. (Vaccine [2000], 18:160-172) lub WO 01/09350 (przykład 8). Ogólnie OMV ekstrahuje się detergentem, korzystnie dezoksycholanem i ewentualnie enzymatycznie usuwa się kwasy nukleinowe. Oczyszczenie osiąga się przez ultrawirowanie po którym ewentualnie przeprowadza się chromatografię wykluczenia pod względem wielkości. Jeżeli włączone są dwa lub większa liczba pęcherzyków zgodnie z wynalazkiem mogą być one połączone w pojedynczym pojemniku z wytworzeniem wieloważnego preparatu według wynalazku (chociaż preparat uważa się także za wieloważny jeżeli różne pęcherzyki zgodnie z wynalazkiem są osobnymi preparatami w osobnych pojemnikach, które podaje się gospodarzowi w tym samym czasie [podczas tej samej wizyty u lekarza]). Preparaty OMV zazwyczaj jałowi się przez filtrację przez filtr 0,2 μm i korzystnie przechowuje w roztworze sacharozy (np. 3%), co do którego wiadomo, że stabilizuje preparaty pęcherzyków.

Podwyższenie ekspresji białek w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej można osiągnąć przez wstawienie dodatkowej kopii genu do szczepu Neisseria z którego pochodzi preparat OMV. Alternatywnie promotor genu można zamienić na silniejszy promotor w szczepie Neisseria z którego pochodzi preparat OMV. Takie techniki opisano w WO 01/09350. Podwyższenie ekspresji białka doprowadzi do zawartości większej ilości białka obecnego w OMV w porównaniu z zawartością białka obecnego w OMV pochodzących z niezmodyfikowanych N. meningitidis (np. szczepu H44/76). Korzystnie poziom będzie co najmniej 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 7, 10 lub 20 razy wyższy.

PL 220 107 B1

Gdy LPS rozważa się jak dodatkowy antygen w OMV, w sposobie wytwarzania OMV, korzystnie można zastosować procedurę z użyciem niskiego stężenia ekstrahującego detergentu (np. dezoksycholanu lub DOC), tak aby zachować wyższy poziom związanego LPS przy równoczesnym usunięciu szczególnie toksycznego, słabo związanego LPS. Stosowanym stężeniem DOC jest 0-0,5% DOC, 0,02%-0,4% DOC, 0,04%-0,3% DOC, korzystniej 0,06%-0,2% DOC lub 0,08%-0,15%, najkorzystniej około lub dokładnie 0,1% DOC.

Określenie „silniejsza sekwencja promotorowa” dotyczy regulatorowego elementu kontrolnego, który podwyższa transkrypcję genu kodującego interesujący antygen.

Określenie „podwyższenie ekspresji” dotyczy jakichkolwiek sposobów wzmocnienia ekspresji interesującego antygenu względem nie modyfikowanego (tj. naturalnie występującego) pęcherzyka. Należy rozumieć, że stopień „podwyższenia ekspresji” będzie się różnić zależnie od konkretnego interesującego antygenu, ale nie przekroczy stopnia, który zaburzy integralność pęcherzyka. Podwyższenie ekspresji antygenu dotyczy ekspresji która jest co najmniej o 10% wyższa niż dla nie zmodyfikowanego pęcherzyka. Korzystnie jest ona co najmniej o 50% wyższa. Korzystniej jest ona o 100% (dwukrotnie) wyższa. Korzystnie jest ona 3-, 4-, 5-, 7-, 10-, 20-krotnie wyższa. Ewentualnie lub dodatkowo, podwyższenie ekspresji może dotyczyć uniezależnienia ekspresji od zmian metabolicznych lub odżywczych, w szczególności w przypadku TbpA, TbpB, LbpA i LbpB. Korzystnie poziom ekspresji mierzy się gdy pęcherzyki pochodzą z bakterii hodowanych w warunkach ograniczenia żelaza (przykładowo w obecności związku chelatującego żelazo).

Ponownie celem wyjaśnienia, określenia „zmiana technikami inżynierii genetycznej szczepu bakteryjnego tak by wytwarzał mniej wspomnianego antygenu” lub obniżenie ekspresji dotyczą jakichkolwiek sposobów zmniejszania ekspresji interesującego antygenu (lub ekspresji funkcjonalnego produktu genu), względem nie zmodyfikowanego (tj. występującego naturalnie) pęcherzyka, korzystnie przez delecję, tak że ekspresja jest niższa o co najmniej 10% niż dla niezmodyfikowanego pęcherzyka. Korzystnie jest niższa o co najmniej 50%, a najkorzystniej w ogóle nie występuje. Gdy białko o obniżonej ekspresji jest enzymem lub funkcjonalnym białkiem, obniżenie ekspresji można osiągnąć przez wprowadzenie jednej lub większej liczby mutacji wywołujących 10%, 20%, 50%, 80% lub korzystnie 100% obniżenie aktywności enzymatycznej lub funkcjonalnej.

Etapy modyfikacji genetycznej wymagane do modulacji ekspresji białek Neisseria można przeprowadzić na wiele różnych sposobów znanych fachowcom. Przykładowo można wstawić sekwencje (np. promotory lub otwartej ramki odczytu) oraz promotory/geny można unieczynnić techniką wstawiania transpozonu. Przykładowo w celu podwyższenia ekspresji genu silny promotor można wstawić z zastosowaniem transpozonu w miejsce leżące do 2 kb w górę od inicjacyjnego kodonu genu (korzystniej 200-600 pz w górę, najkorzystniej około 400 pz w górę). Można także zastosować mutację punktową lub delecję (w szczególności do obniżenia ekspresji genu).

Jednakże sposoby takie mogą być całkiem niestabilne lub niepewne, a zatem korzystne jest aby etap modyfikacji genetycznej był przeprowadzany przez zajście rekombinacji homologicznej. Korzystnie, zachodzi ona pomiędzy sekwencją (region rekombinogenny) długości co najmniej 30 nukleotydów w chromosomie bakteryjnym, a sekwencją (drugi region rekombinogenny) długości co najmniej 30 nukleotydów w wektorze wtransformowanym do szczepu. Korzystnie regiony te są wielkości 40-1000 nukleotydów, korzystniej 100-800 nukleotydów, najkorzystniej 500 nukleotydów). Te regiony rekombinogenne powinny być wystarczająco podobne aby były zdolne do shybrydyzowania ze sobą w bardzo ostrych warunkach.

Opisane sposoby stosowane do przeprowadzania modyfikacji genetycznych (takie jak podwyższenie lub obniżenie ekspresji genów przez zajście rekombinacji oraz wprowadzenie kolejnych sekwencji genów do genomu Neisseria) opisano w WO 01/09350. Typowymi silnymi promotorami, które mogą zostać wprowadzone do Neisseria są porA, porB, IgtF, Opa, p110, lst i hpuAB. PorA i PorB są korzystne jako konstytutywne, silne promotory. Ustalono, że aktywność promotorowa PorB jest zawarta we fragmencie odpowiadającym nukleotydom -1 do -250 w górę od kodonu inicjacyjnego porB.

Podwyższenie ekspresji antygenów przez wzrost w warunkach ograniczenia żelaza

Podwyższenie ekspresji niektórych antygenów w preparacie pęcherzyków błony zewnętrznej zgodnie z wynalazkiem korzystnie osiąga się przez wydzielanie pęcherzyków błony zewnętrznej ze szczepu wyjściowego Neisseria hodowanego w warunkach ograniczenia żelaza. Niskie stężenie żelaza w pożywce powoduje podwyższenie ekspresji białek związanych z pozyskiwaniem żełaza, włącznie z TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB i P2086. Zatem ekspresja tych białek jest podwyższana bez potrzeby rekombinacyjnej modyfikacji genów kodujących te białka, przykładowo przez wstawienie

PL 220 107 B1 silniejszego promotora lub wstawienie dodatkowej kopii genu. Wynalazek umożliwia zatem także podwyższenie ekspresji białek pozyskiwania żelaza przez wzrost w pożywce z ograniczeniem żelaza, przy czym gen także został zmodyfikowany rekombinacyjnie.

Ograniczenie żelaza osiąga się przez dodanie do pożywki hodowlanej związku chelatującego żelazo. Odpowiednie związki chelatujące żelazo obejmują 2,2-Dipirydyl, EDDHA (kwas etylenodiamino-di(o-hydroksyfenylooctowy) i Desferal (metanosulfonian deferoksyaminy. Sigma). Desferal jest korzystnym związkiem chelatującym żelazo i dodaje się go do pożywki hodowlanej w stężeniu pomiędzy 10 a 100 μM, korzystnie 25-75 μM, korzystniej 50-70 μM, najkorzystniej 60 μΜ. Żelazo zawarte w pożywce pochodzi głównie ze składników ekstraktu drożdżowego i peptonu sojowego oraz obecna ilość może różnić się pomiędzy partiami. Zatem różne stężenia Desferal mogą być optymalne do osiągnięcia podwyższenia ekspresji białek pozyskiwania żelaza w różnych partiach pożywki. Fachowiec powinien być w stanie łatwo wyznaczyć optymalne stężenie. Ogólnie do pożywki powinno się dodać wystarczającą ilość związku chelatującego żelazo tak aby podwyższyć ekspresję wymaganego białka regulowanego żelazem, ale nie tak dużo aby niekorzystnie wpływać na wzrost bakterii.

Korzystnie podwyższenie ekspresji białek pozyskiwania żelaza przez wzrost w warunkach ograniczających żelazo łączy się z rekombinacyjnym podwyższeniem innych antygenów tak aby uzyskać pęcherzyk błony zewnętrznej, zgodnie z wynalazkiem.

Obniżenie ekspresji/usunięcie zmiennych oraz nieochronnych antygenów immunodominujących

Wiele antygenów powierzchniowych jest zmiennych wśród szczepów bakterii i w konsekwencji mogą one chronić tylko przed ograniczonym zestawem blisko spokrewnionych szczepów. Wynalazek umożliwia stosowanie pęcherzyków błony zewnętrznej w których ekspresja innych białek jest obniżona lub korzystnie gen(-y) kodujący(-e) zmienne białko(-a) powierzchniowe jest/są wydeletowany(-e). Taka delecja daje szczep bakteryjny wytwarzający pęcherzyki które, po podaniu w szczepionce, mają silniejszy potencjał reaktywności krzyżowej przeciw różnym szczepom ze względu na większy wpływ wywierany przez konserwatywne białka (zatrzymane na błonach zewnętrznych) na układ immunologiczny szczepionego pacjenta. Przykłady takich zmiennych antygenów Neisseria, których ekspresja może zostać obniżona w preparatach immunogennych pęcherzyków zgodnie z wynalazkiem obejmują PorA, PorB, Opa.

Innymi typami genów, których ekspresję można obniżyć lub wyłączyć są geny które, in vivo, mogą być łatwo włączone (eksprymowane) lub wyłączone w bakterii. Ponieważ białka błony zewnętrznej kodowane przez takie geny nie zawsze są obecne na bakteriach, obecność takich białek w preparatach pęcherzyków może także wpływać negatywnie na skuteczność szczepionki ze względu na wymienione powyżej przyczyny. Korzystnym przykładem do obniżenia ekspresji lub wydeletowania jest białko Opc Neisseria. Odporność przeciw-Opc wywołana przez szczepionkę pęcherzyków zawierających Opc będzie mieć ograniczoną wydajność ochronną, gdyż zakażający organizm łatwo może się stać Opc^-.

Przykładowo można obniżyć lub ostatecznie wyłączyć ekspresję tych zmiennych lub nieuchronnych genów. Ma to zaletę skupienia się układu immunologicznego na lepszych antygenach, które są obecne w niewielkich ilościach na powierzchni zewnętrznej pęcherzyków. Przez obniżenie ekspresji rozumie się także, że eksponowane na powierzchni, zmienne pętle immunodominujące powyższych białek błony zewnętrznej mogą być zmienione lub wydeletowane aby tak powstałe białka błony zewnętrznej były mniej immunodominujące.

Sposoby obniżania ekspresji ujawniono w WO 01/09350. Korzystne połączenia białek do obniżenia ekspresji w preparatach immunogennych zgodnie z wynalazkiem obejmują PorA i OpA; PorA i OpC; OpA i OpC; PorA i OpA oraz OpC.

Wiadomo, że w genomie meningokoka występują cztery różne geny Opa (Aho i in., 1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37), zatem gdy mówi się o obniżeniu ekspresji Opa oznacza to, że korzystnie 1,2, 3 lub (korzystnie) wszystkie 4 geny obecne w meningokoku mają obniżoną ekspresję. Takie obniżenie ekspresji można przeprowadzić genetycznie, jak opisano w WO 01/09350 lub przez wyszukanie dających się łatwo znaleźć, naturalnych, stabilnych szczepów meningokoków w których brak jest ekspresji lub występuje niska ekspresja z loci Opa. Taie szczepy można znaleźć stosując technikę opisaną w Poolman i in., (1985 J. Med. Micro. 19:203-209), w której komórki Opa^- mają inny fenotyp niż komórki eksprymujące Opa, co można obserwować przez analizę wyglądu komórek lub pod mikroskopem. Po znalezieniu można wykazać, że szczep jest stabilnie Opa^- przez przeprowadzenie analizy Western blot na zawartości komórek po przeprowadzeniu fermentacji prowadzonej w celu ustalenia braku Opa.

PL 220 107 B1

Po osiągnięciu podwyższenia ekspresji niektórych antygenów w pęcherzykach błony zewnętrznej zgodnie z wynalazkiem przez wzrost w warunkach ograniczenia żelaza wzrasta także ekspresja zmiennego białka FrpB (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)). Wynalazcy stwierdzili, że korzystne jest obniżenie ekspresji FrpB w tych warunkach przez obniżenie ekspresji całego białka, jak opisano w WO 01/09350 lub przez delecję zmiennego(-ych) regionu(-ów) FrpB. Zagwarantuje to, że odpowiedź immunologiczna wywołana przez preparat immunogenny jest skierowana przeciw antygenom, które są obecne w szerokim zakresie szczepów. Obniżenie ekspresji FrpB korzystnie łączy się z obniżeniem ekspresji PorA i OpA; PorA i OpC; OpA i OpC; PorA i OpA i OpC w immunogennych preparatach pęcherzyków zgodnie z wynalazkiem.

W alternatywnej postaci, FrpB ma obniżoną ekspresję w pęcherzykach błony zewnętrznej, które przygotowano ze szczepów Neisseria nie hodowanych w warunkach ograniczenia żelaza.

Detoksykacja LPS

Pęcherzyki w preparacie immunogennym według wynalazku mogą być detoksykowane sposobami detoksykacji LPS, które ujawniono w WO 01/09350. W szczególności, sposoby detoksykacji LPS obejmują obniżenie ekspresji/delecję enzymów htrB i/lub msbB, które ujawniono w WO 01/09350. Geny msbB i htrB Neisseria są także nazywane odpowiednio IpxL1 i lpxL2 (WO 00/26384), a mutanty delecyjne tych genów charakteryzują się fenotypowo tym, że LPS mutantów msbB^- traci jeden drugorzędowy łańcuch acylowy, a LPS mutantów herb^- traci obydwa drugorzędowe łańcuchy acylowe. W WO 93/14155 i WO 95/03327 opisano nietoksyczne peptydy będące funkcjonalnymi odpowiednikami polimyksyny B, które mogą być stosowane w preparatach według wynalazku.

Takie sposoby korzystnie łączy się ze sposobami ekstrakcji pęcherzyków z użyciem niskiego poziomu DOC, korzystnie 0-0,3% DOC, korzystniej 0,05-0,2% DOC, najkorzystniej około lub dokładnie 0,1% DOC.

Kolejne sposoby detoksykacji LPS obejmują dodanie do preparatów pęcherzyków nietoksycznego peptydu będącego funkcjonalnym odpowiednikiem polimyksyny B (korzystnie SAEP 2), jak opisano powyżej.

Polisacharydy reaktywne krzyżowo

Izolacja pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii z otoczkowych bakterii Gram ujemnych często powoduje jednoczesne oczyszczenie polisacharydu otoczkowego. W niektórych przypadkach materiał „zanieczyszczający” może okazać się użyteczny, gdyż polisacharyd może wzmocnić odpowiedź immunologiczną nadawaną przez inne składniki pęcherzyków. Jednakże w innych przypadkach, obecność zanieczyszczającego materiału polisacharydowego w preparatach pęcherzyków bakteryjnych może okazać się szkodliwa przy stosowaniu pęcherzyków w szczepionce. Przykładowo, wykazano, że co najmniej w przypadku N. meningitidis, że polisacharyd otoczkowy grupy serologicznej B nie wywołuje odporności ochronnej oraz jest podatny na wywoływanie niepożądanej odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi. W konsekwencji, pęcherzyki błony zewnętrznej według wynalazku można izolować ze szczepu bakterii do wytwarzania pęcherzyków, który został zmodyfikowany tak, że jest wolny od polisacharydu otoczkowego. Takie pęcherzyki będą odpowiednie do stosowania u ludzi. Szczególnie korzystnym przykładem takiego preparatu pęcherzyków jest preparat z N. meningitidis grupy serologicznej B pozbawionej polisacharydu otoczkowego.

Można to osiągnąć przez zastosowanie szczepów wytwarzających zmodyfikowane pęcherzyki, w których geny niezbędne do biosyntezy i/lub eksportu otoczki zostały uszkodzone. Inaktywację genu kodującego biosyntezę lub eksport polisacharydu otoczkowego można osiągnąć przez zmutowanie (mutację punktową, delecję lub insercję) regionu kontrolnego, regionu kodującego lub obydwu z nich (korzystnie przez zastosowanie opisanych powyżej technik rekombinacji homologicznej) lub jakimkolwiek innym sposobem obniżenia funkcji enzymatycznej takich genów. Ponadto, inaktywację genów biosyntezy otoczki można także osiągnąć przez antysensowną nadekspresję lub mutagenezę transpozonem. Korzystnym sposobem jest delecja części lub wszystkich genów cps Neisseria meningitidis wymaganych do biosyntezy i eksportu polisacharydu. W tym celu wymieniający plazmid pMF121 (opisany w Frosh i in. 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218) można zastosować do dostarczenia mutacji deletującej klaster genu cpsCAD (+ galE).

Bezpieczeństwo przeciwciał wytworzonych przeciw L3 lub L2 LPS zakwestionowano ze względu na obecność struktury podobnej do grupy oligosacharydu lakto-N-neotetraozy (Gal31-4GlcNAc31-3Gal31-4Glc31^-) obecnej w ludzkich glikosfingolipiach. Pomimo, że dużą liczbę osób bezpiecznie zaszczepiono szczepionkami na bazie pęcherzyków, ekstrahowanych dezoksyholanem, zawierający18

PL 220 107 B1 mi śladowe ilości L3 LPS (G. Bjune i in., Lancet (1991), 338, 1093-1096; GVG. Sierra i in., NIPH ann (1991), 14, 195-210), delecja końcowej części LOS sacharydowej jest korzystna w przeciwdziałaniu jakimkolwiek reakcjom krzyżowym ze strukturami obecnymi na powierzchni ludzkich tkanek. W korzystnej postaci, inaktywacja genu IgtB powoduje wytworzenie przejściowej struktury LPS, w której brak jest końcowych reszt galaktozy i kwasu sjalowego (mutacja zostawia strukturę 4GlcNAc31-3Gal31-4Glc31- w L2 i L3 LOS). Takie struktury pośrednie można uzyskać w LPS szczepu L3 i L2. Alternatywną ale mniej korzystną (krótszą) wersję LPS można uzyskać przez wyłączenie genu IgtE. Kolejną alternatywą ale mniej korzystną wersję LPS można uzyskać przez wyłączenie genu IgtA. Jeżeli taka mutacja IgtA^- jest wybrana, korzystne jest także wyłączenie ekspresji IgtC aby zapobiec wytworzeniu nie immunogennego immunotypu L1.

Mutanty IgtB^- są najkorzystniejsze, gdyż wynalazcy stwierdzili, że jest to skrócenie optymalne do rozwiązania problemów z bezpieczeństwem przy zachowaniu ochronnego epitopu oligosacharydowego LPS, który nadal może wywoływać bakteriobójczą odpowiedź przeciwciał.

Zatem, preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać ponadto preparaty L2 lub L3 (jakkolwiek oczyszczone lub w wyizolowanych pęcherzykach) lub meningokokowe preparaty pęcherzyków ogólnie korzystnie pochodzą ze szczepu Neisseria (korzystnie meningokoka), który został zmodyfikowany genetycznie tak by miał stale obniżoną ekspresję funkcjonalnego produktu genu z genu IgtB, IgtA lub IgtE, korzystnie przez wyłączenie genu, najkorzystniej przez delecję całego lub części promotora i/lub otwartej ramki odczytu genu.

Gdy powyższe preparaty immunogenne według wynalazku pochodzą z meningokoka szczepu B korzystne ponadto jest aby polisacharyd otoczkowy (który także zawiera struktury sacharydowe podobne do ludzkich) także został usunięty. Pomimo, że wiele genów można wyłączyć aby to osiągnąć wynalazcy korzystnie wykazali, że korzystne jest aby szczep wytwarzający pęcherzyki był tak zmodyfikowany genetycznie, aby miał stale zmniejszoną ekspresję funkcjonalnego produktu genu z siad (tj. zmniejszoną ekspresję aktywności a-2-8 polisjalotransferazy), korzystnie przez wyłączenie genu, najkorzystniej przez delecję części lub całego promotora i/lub otwartej ramki odczytu genu. Taką inaktywację opisano w WO 01/09350. Mutacja siaD (także znanego jako synD) jest najkorzystniejszą z wielu mutacji, które mogą spowodować usunięcie z polisacharydu otoczkowego epitopu podobnego do ludzkiego, gdyż jest ona jedyną mutacją, która nie wywiera wpływu na biosyntezę ochronnych epitopów LOS, zatem jest ona korzystna w procesie mającym na celu ostateczne zastosowanie LOS jako antygenu ochronnego oraz wywiera minimalny wpływ na wzrost bakterii. Zatem korzystnym aspektem wynalazku jest opisany powyżej immunogenny preparat pęcherzyków, który pochodzi z IgtE^- siad^-, IgtA^- siaD^- lub, korzystnie, IgtB^- siad^- zmutowanego szczepu meningokoka B.

Pomimo, że mutacja siaD^- jest korzystna ze względu na wymienione powyżej przyczyny, można zastosować inne mutacje, które wyłączają syntezę polisacharydu otoczkowego meningokoka B. Tak też, szczep wytwarzający pęcherzyki może być tak zmodyfikowany genetycznie, aby miał stale obniżoną ekspresję funkcjonalnego produktu genu z jednego lub większej liczby poniższych genów: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (odpowiednik synX i siaA), synB (odpowiednik siaB) i synC (odpowiednik siaC), korzystnie przez wyłączenie genu, najkorzystniej przez delecję całego lub części promotora i/lub otwartej ramki odczytu genu. Mutacja IgtE^- może być połączona z jedną lub większą liczbą tych mutacji. Korzystnie mutacja IgtB^- jest połączona z jedną lub większą liczbą tych mutacji. Zatem wynalazek umożliwia stosowanie opisanego powyżej immunogennego preparatu pęcherzyków pochodzącego z takiego połączonego mutanta szczepu meningokoka B.

Locus Neisseria zawierające różne geny Igt, włącznie z IgtB i IgtE oraz jego sekwencja są znane w wynalazku (patrz M. P. Jennings i in., Microbiology 1993, 145, 3013-3021 oraz zacytowane tam pozycje literaturowe, oraz J. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994]).

Gdy w końcowym produkcie stosowany jest pełnej długości (nie skrócony) LOS, wymagane jest aby LOS nie był sjalowany (LOS jako taki wytwarza odpowiedź immunologiczną przeciw najgroźniejszym, inwazyjnym szczepom meningokoka B, które także nie są sjalowane). W takim przypadku korzystne jest zastosowanie szczepu negatywnego pod względem otoczki, który ma wydeletowane geny synA (odpowiednik synX i siaA), synB (odpowiednik siaB) lub synC (odpowiednik siaC), gdyż jako taka mutacja sprawia, że LOS menB nie może być sjalowany.

W preparatach pęcherzyków, w szczególności w preparatach pęcherzyków wyekstrahowanych niskimi stężeniami DOC, LPS można stosować jako antygen w preparacie immunogennym według wynalazku. Jednakże korzystne jest obniżenie ekspresji/wydeletowanie/inaktywacja funkcji enzymatycznej IgtE, IgtA (szczególnie w połączeniu z IgtC) lub, korzystnie genu/produktów genu IgtB w celu

PL 220 107 B1 usunięcia podobnych do ludzkich struktur lakto-N-neotetraozy. Locus Neisseria (oraz jego sekwencja) zawierające geny Igt biosyntezy struktury oligosacharydu LPS jest znane (Jennings i in., Microbiology 1999 145; 3013-3021 oraz zacytowane tam pozycje literaturowe, oraz J. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994]). Obniżenie ekspresji/delecja IgtB (lub funkcjonalnego produktu genu) jest korzystna gdyż zostawia to nienaruszony ochronny epitop LPS.

W preparatach pęcherzyków N. meningitidis grupy serologicznej B według wynalazku, korzystne jest obniżenie ekspresji/delecja zarówno siaD, jak i IgtB, (jednakże do wytwarzania pęcherzyków szczepu meningokoka B można także zastosować połączenie IgtB^- z którymkolwiek z ctrA^-, ctrB^-, ctrC^-, ctrD^-, synA^- (odpowiednik synX^- i siaA^-), synB^- (odpowiednik siaB^-) lub synC^- (odpowiednik siaC^-)) prowadzące do uzyskania preparatu pęcherzyków o optymalnym bezpieczeństwie oraz zachowującego ochronny epitop LPS.

Zatem wynalazek umożliwia stosowanie opisanego powyżej immunogennego preparatu pęcherzyków, jak opisano powyżej, pochodzącego z takiego połączonego mutanta szczepu meningokoka B.

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać co najmniej jeden, dwa, trzy, cztery lub pięć różnych preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej. Gdy włączone są dwa lub większa liczba OMV, co najmniej jeden antygen według wynalazku ma podwyższoną zawartość w każdym z OMV. Takie preparaty OMV mogą pochodzić ze szczepów Neisseria tego samego gatunku lub grupy serologicznej lub korzystnie ze szczepów Neisseria różnej klasy, grupy serologicznej, serotypu, subserotypu lub immunotypu. Przykładowo preparat immunogenny może zawierać jeden lub większą liczbę preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej, które zawierają LPS immunotypu L2 oraz jeden lub większą liczbę preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej, które zawierają LPS immunotypu L3. Preparaty OMV L2 lub L3 korzystnie pochodzą ze stabilnego szczepu, który wykazuje minimalną zmienność fazową w locus genów syntezy oligosacharydu LPS.

Pęcherzyki błony zewnętrznej połączone z preparatami podjednostkowymi

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą także zawierać zarówno preparat podjednostkowy, jak i pęcherzyki błony zewnętrznej. Istnieje kilka antygenów, które są szczególnie korzystne do włączenia do preparatu podjednostkowego ze względu na ich rozpuszczalność. Przykłady takich białek obejmują FhaB, NspA, domenę pasażerską Hsf, domenę pasażerską Hap, domenę pasażerską AspA, AspA, OMP85, FrpA, FrpC, TbpB, LbpB, PilQ. Preparat pęcherzyków błony zewnętrznej będzie zawierać co najmniej jeden inny antygen wybrany z poniższej listy, który ma rekombinacyjnie podwyższoną ekspresję w pęcherzyku błony zewnętrznej: NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA(wysoka), TbpA(niska), LbpA, TbpB, LbpB, NadA, TspA, TspB, PilC, PilQ, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NMADPRT, MafA, MafB i PldA; oraz ewentualnie zawiera jeden lub obydwa spośród LPS immunotypu L2 i LPS immunotypu L3.

Preparaty immunogenne według wynalazku, które zawierają LPS będą korzystnie zawierać LPS sprzężony ze źródłem epitopów dla komórek T pomocniczych, korzystnie białkami, a w przypadku LPS w OMV, korzystnie białkami błony zewnętrznej. Szczególnie korzystna postać zawiera LPS, który został (korzystnie wewnątrz pęcherzyka) sprzężony z OMP in situ w preparacie pęcherzyków błony zewnętrznej (np. jak opisano powyżej).

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać antygeny (białka, LPS i polisacharydy) pochodzące z Neisseria meningitidis grup serologicznych A, B, C, Y, W-135 lub Neisseria gonorrhoeae.

Korzystnie preparaty immunogenne lub szczepionki według wynalazku nie składają się z i/lub nie zawierają konkretnych połączeń o SEQ ID wymienionych w tabeli od strony 3, wiersz 18 do strony 52, wiersz 2 w WO 00/71725 i/lub któregokolwiek z indywidualnych połączeń opisanych w przykładach 1-11 WO 00/71725.

Korzystne są którekolwiek indywidualne połączenia ujawnione w WO 01/52885.

Kolejne połączenia

Preparat immunogenny według wynalazku może ponadto zawierać polisacharydy lub oligosacharydy otoczki bakteryjnej. Polisacharydy lub oligosacharydy otoczkowe mogą pochodzić z jednego lub większej liczby z: Neisseria meningitidis grupy serologicznej A, C, Y i/lub W-135, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupy A, Streptococcus grupy B, Staphylococcus aureus oraz Staphylococcus epidermidis.

PL 220 107 B1

Kolejnym udogodnieniem są połączenia szczepionkowe zawierające preparat antygenowy według wynalazku z innymi antygenami, które korzystnie stosuje się przeciw pewnym stanom chorobowym obejmującym stany związane z wirusami i bakteriami Gram pozytywnymi.

W jednym korzystnym połączeniu, preparaty antygenowe według wynalazku formułuje się z 1, 2, 3 lub korzystnie wszystkimi 4 z poniższych polisacharydów lub oligosacharydów otoczki meningokoka, które mogą być obecne samodzielnie lub w postaci sprzężonej z nośnikiem białkowym: A, C, Y lub W-135. Korzystnie preparaty immunogenne według wynalazku formułuje się z A i C; lub C; lub C i Y. Taką szczepionkę zawierającą białka z N. meningitidis, korzystnie grupy serologicznej B, można stosować jako globalną szczepionkę przeciw meningokokom.

Preparaty antygenowe według wynalazku, korzystnie sformułowane z 1, 2, 3 lub korzystnie wszystkimi 4 z samodzielnych lub sprzężonych polisacharydów lub oligosacharydów otoczki meningokoka A, C, Y lub W-135 (jak opisano powyżej), formułuje się ze sprzężonym polisacharydem lub oligosacharydem otoczki H. influenzae b i/lub jednym lub większą liczbą samodzielnych lub sprzężonych polisacharydów lub oligosacharydów otoczki pneumokoka. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub większą liczbę antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przed zakażeniem Streptococcus pneumoniae. Taka szczepionka może być korzystnie stosowana jako globalna szczepionka przeciw meningokokom.

W kolejnej postaci, preparat immunogenny według wynalazku formułuje się z polisacharydami lub oligosacharydami otoczkowymi pochodzącymi z jednej lub większej liczby bakterii spośród Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b. Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupy A, Streptococcus grupy B, Staphylococcus aureus lub Staphylococcus epidermidis. Polisacharydowe antygeny otoczki pneumokoka są korzystnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F). Kolejna korzystna postać będzie obejmować polisacharydy otoczkowe PRP Haemophilus influenzae. Kolejna korzystna postać będzie obejmować polisacharydy otoczkowe typu 5, typu 8 lub 336 Staphylococcus aureus. Kolejna korzystna postać będzie obejmować polisacharydy otoczkowe typu I, typu II lub typu III Staphylococcus epidermidis. Kolejna korzystna postać będzie obejmować polisacharydy otoczkowe typu la, typu Ic, typu II lub typu III Streptococcus grupy B. Kolejna korzystna postać będzie obejmować polisacharydy otoczkowe Streptococcus grupy A, korzystnie zawiera ponadto co najmniej jedno białko M oraz korzystnie wiele typów białek M.

Takie polisacharydy otoczkowe według wynalazku mogą być niesprzężone lub sprzężone z nośnikiem białkowym, takim jak anatoksyna tężcowa, fragment C anatoksyny tężcowej, anatoksyna błonicza, CRM197, pneumolizyna, białko D (US6342224). Koniugat polisacharydu można otrzymać dowolnym znanym sposobem sprzęgania. Przykładowo, polisacharyd może być sprzęgany przez wiązanie tioeterowe. Taki sposób sprzęgania polega na aktywacji polisacharydu tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetylaminopirydyniowym (CDAP) z wytworzeniem estru cjanianowego. Następnie aktywowany polisacharyd może zostać sprzęgnięty bezpośrednio lub przez grupę odstępnikową z grupą aminową na białku nośnikowym. Korzystnie ester cjanianowy sprzęga się z heksanodiaminą i aminoderywatyzowany polisacharyd sprzęga się z białkiem nośnikowym drogą reakcji heteroligacji obejmującej wytworzenie wiązania tioeterowego. Takie koniugaty opisano w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/15760 Uniformed Services University.

Koniugaty można także wytwarzać sposobami bezpośredniego aminowania redukcyjnego, jak opisano w US 4365170 (Jennings) i US 4673574 (Anderson). Inne sposoby opisano w EP-0-161-188, EP-208375 i EP-0-477508. Kolejny sposób obejmuje sprzęganie aktywowanego bromocjanem polisacharydu derywatyzowanego hydrazydem kwasu adypinowego (ADH) z białkiem nośnikowym przez kondensację z użyciem karbodiimidu (Chu C. i in., Infect. Immunity, 1983 245-256). Gdy włączane są ołigosacharydy korzystne jest aby były one sprzęgnięte.

Korzystnymi białkowymi antygenami pneumokokowymi są te białka pneumokokowe, które są eksponowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (które mogą być rozpoznane przez układ immunologiczny gospodarza podczas ostatniej fazy cyklu życiowego pneumokoka) lub są białkami, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoki. Najkorzystniej takim białkiem jest toksyna, adhezyna, dwuskładnikowy przekaźnik sygnału lub lipoproteina Streptococcus pneumoniae lub ich fragmenty. Szczególnie korzystne białka obejmują, ale nie tylko: pneumolizynę (korzystnie detoksykowaną przez obróbkę chemiczną lub mutację) [Mitchell i in., Nucleic Acids Res. 11 lipca 1990; 18(13):4010 „Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2”, Mitchell i in. Biochim Biophys Acta 23 stycznia 1989; 1007 (1): 67-72 „Expression of the pneumolysin

PL 220 107 B1 gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties”, WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton i in.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA oraz jego warianty z delecją regionu transbłonowego (US5804193-Briles i in.); PspC oraz jego warianty z delecją regionu transbłonowego (WO 97/09994-Briles i in.); PsaA oraz jego warianty z delecją regionu transbłonowego (Berry i Paton, Infect Immun grudzień 1996; 64 (12):5255-62 „Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae”); pneumokokowe białka wiążące cholinę oraz ich warianty z delecją regionu transbłonowego; CbpA oraz jego warianty z delecją regionu transbłonowego (WO 97/41151; WO 99/51266); dehydrogenazę 3-fosforanu aldehydu glicerolowego (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i in., FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); białko M-podobne (EP 0837130) oraz adhezynę 18627, (EP 0834568). Kolejnymi korzystnymi białkowymi antygenami pneumokokowymi są te ujawnione w WO 98/18931, w szczególności te wybrane w WO 98/18930 i PCT/US99/30390.

Preparat immunogenny/szczepionka według wynalazku może ewentualnie zawierać preparaty pęcherzyków błony zewnętrznej pochodzące z bakterii Gram ujemnych, np. Moraxella catarrhalis lub Haemophilus influenzae.

Preparaty Moraxella catarrhalis

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą ponadto zawierać preparaty OMY pochodzące z Moraxella catarrhalis. Preparaty zmodyfikowanych OMV można przygotować z Moraxella catarrhalis jak opisano w WO 01/09350. Jeden lub większa liczba genów (kodujących antygeny ochronne) jest korzystnych do podwyższenia ekspresji: OMP106 (WO 97/41731 i WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipo10 (GB 9918208.1), lipo11 (GB 9918302.2), lipo18 (GB 9918038.2), P6 (PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (HelminenME, i in., (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010), DIS (PCT/EP99/03822), Omp1A1 (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA i LbpB (WO 98/55606), TbpA i TbpB (WO 97/13785 i WO 97/32980), OmpE, UspA1 i UspA2 (WO 93/03761) oraz Omp21. Są one także korzystne jako geny, które mogą być heterologicznie wprowadzone do innych bakterii Gram ujemnych.

Jeden lub większa liczba z poniższych genów jest korzystnych do obniżenia ekspresji: CopB, OMP106, OmpB1, TbpB, LbpA i LbpB.

Jeden lub większa liczba z poniższych genów jest korzystnych do obniżenia ekspresji: htrB, msbB i lpxK.

Jeden lub większa liczba z poniższych genów jest korzystnych do podwyższenia ekspresji: pmrA, pmrB, pmrE i pmrF.

Preparaty Haemophilus influenzae

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą ponadto zawierać preparaty OMV pochodzące z Haemophilus influenzae. Preparaty zmodyfikowanych OMV można przygotować z Haemophilus influenzae jak opisano w WO 01/09350. Jeden lub większa liczba genów (kodujących antygeny ochronne) jest korzystnych do podwyższenia ekspresji: D15 (WO 94/12641), P6 (EP 281673), TbpA (WO 96/40929; WO 95/13370), TbpB (WO 96/40929; WO 95/13370), P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 i Hif (wszystkie geny w tym operonie powinny mieć podwyższoną ekspresję w celu podwyższenia ekspresji piliny). Są one także korzystne jako geny do heterologicznego wprowadzenia do bakterii Gram ujemnych.

Jeden lub większa liczba z poniższych genów jest korzystnych do obniżenia ekspresji: P2, P5, Hif, proteazy IgA1, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, htrB, msbB oraz lpxK.

Jeden lub większa liczba z poniższych genów jest korzystnych do podwyższenia ekspresji: pmrA, pmrB, pmrE oraz pmrF.

Preparat immunogenny/szczepionka może dodatkowo zawierać antygeny zapewniające ochronę przed zakażeniami błonicą, tężcem i Bordetella pertussis. Składnikiem krztuścowym mogą być całe uśmiercone komórki B. pertussis (Pw) lub bezkomórkowe składniki krztuścowe (Pa), które zawierają co najmniej jeden antygen (korzystnie 2 lub 3) wybrany z PT, FHA i pertaktyny 69 kDa. Zazwyczaj antygenami zapewniającymi ochronę przed błonicą i tężcem będą anatoksyna błonicza i anatoksyna tężcowa. Anatoksyny są toksynami inaktywowanymi chemicznie lub toksynami inaktywowanymi przez wprowadzenie mutacji punktowych.

Preparat immunogenny/szczepionka może dodatkowo zawierać jeden lub większą liczbę antygenów, które mogą chronić przed nietypowalnymi Haemophilus influenzae, RSV i/lub jeden lub więk22

PL 220 107 B1 szą liczbę antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Taka szczepionka może być korzystnie stosowana jako globalna szczepionka przeciw zapaleniu ucha środkowego.

Korzystne antygeny białkowe nietypowalnych H. influenzae obejmują białko fimbrynę (US 5766608) oraz fuzje zawierające pochodzące z niej peptydy (np. fuzja LB1l) (US 5843464-Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, białko D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap i D15.

Korzystne antygeny wirusa grypy obejmują cały, żywy lub inaktywowaiiy wirus, rozszczepiony wirus grypy, hodowany w jajkach lub komórkach MDCK lub komórkach Vero lub całe wirosomy wirusa grypy (jak opisano w R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) lub jego oczyszczone lub rekombinowane białka, takie jak białka HA, NP, NA lub M lub ich połączenia.

Korzystne antygeny RSV (wirusa syncytium nabłonka oddechowego) obejmują glikoproteinę F, glikoproteinę G, białko HN, białko M lub ich pochodne.

Preparaty immunogenne według wynalazku mogą zawierać białka Moraxella catarrhalis obejmujące TbpA (WO 97/13785; WO 99/52947), TbpB (WO 97/13785; WO 99/52947; Mathers i in., FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236; Myers i in. Infect Immun 1998 66; 4183-4192), LbpA, LbpB (Du i in., Infect Immun 1998 66; 3656-3665), UspA1, UspA2 (Aebi i in., Infect Immun. 1997 65; 4361-4311), OMP106 (US6214981), receptor Ton- B-zależny (WO 00/78968), CopB (Sethi i in. Infect. Immun. 1997 65; 3666-3671) oraz receptor HasR (WO 00/78968); białka Haemophilus influenzae obejmujące HMW (St Geme i in., Infect Immun 1998 66; 364-368), Hia (St Gerne i in., J. Bacteriol. 182; 6005-6013), Tbp1 (WO 96/40929; WO 95/13370), Tbp2 (WO 96/40929; WO 95/13370; Gray-Owen i in., Infect Immun 1995 63; 1201-1210), LbpA, LbpB (Schryvers i in., 1989, 29:121-130), HasR, receptor TonB-zależny (Fleishmann i in., Science 1995 269; 496-512), białko wiążące hemoglobinę, HhuA (Cope i in., Infect Immun 2000 68; 4092-4101), HgpA (Maciver i in. Infect Immun 1996 64; 3703-3712), HgbA, HgbB i HgbC (Jin i in. Infect Immun 1996 64; 3134-3141), HxuA (Cope i in., Mol Microbiol 1994 13; 863-873), HxuC (Cope i in. Infect Immun 69; 2353-2363); białka Neisseria meningitidis obejmujące Tbp1, Tbp2, FbpA, FbpB, BfrA, BfrB (Tettelin i in., Science 2000 287; 1809-1815), LbpA, LbpB i HmbR.

Preparaty szczepionek

Korzystną postacią wynalazku jest kompozycja preparatu immunogennego według wynalazku w szczepionce, która może także zawierać farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę lub nośnik.

Wytwarzanie preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej z któregokolwiek z wymienionych powyżej zmodyfikowanych szczepów można przeprowadzić którymkolwiek ze sposobów dobrze znanych fachowcom. Korzystnie stosuje się sposoby ujawnione w EP 301992, US 5597572, EP 11243 lub US 4271147. Najkorzystniej stosuje się sposób ujawniony w WO 01/09350.

Przygotowanie szczepionki ogólnie opisano w Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach” (red. Powell M. F. i Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York).

Preparaty antygenowe według wynalazku mogą zawierać adiuwant w preparacie szczepionki według wynalazku. Odpowiednie adiuwanty obejmują sole glinu, takie jak żel wodorotlenku glinu (ałun) lub fosforan glinu, ale mogą nimi być także sól wapnia (w szczególności węglan wapnia), żelaza lub cynku, lub mogą nimi być nierozpuszczalne zawiesiny acylowanej tyrozyny lub acylowanych cukrów, kationowe lub anionowe derywatyzowanych polisacharydów lub polifosfazenów.

Odpowiednie układy adiuwantów Th1, które mogą być zastosowane, obejmują Monofosforylolipid A, w szczególności 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A oraz połączenie monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL) z solą glinu (korzystnie fosforanem glinu). Wzmocniony układ obejmuje połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, w szczególności połączenie QS21 i 3D-MPL, jak ujawniono w WO 94/00153 lub mniej reaktogenną kompozycję w której działanie QS21 jest tłumione przez cholesterol, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie silny preparat adiuwantowy zawierający QS21 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w-wodzie opisano w WO 95/17210 i jest on korzystnym preparatem.

Szczepionka może zawierać saponinę, korzystniej QS21. Może ona także zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol. Oligonukleotydy zawierające niemetylowane CpG (WO 96/02555) są także preferencyjnymi induktorami odpowiedzi TH1 i są one odpowiednie do zastosowania w wynalazku.

Preparat szczepionki według wynalazku można stosować do ochrony lub leczenia ssaka podatnego na zakażenie przez podanie wspomnianej szczepionki drogą ogólnoustrojową lub śluzówkową. Takie podanie może obejmować wstrzyknięcie drogą domięśniową, śródotrzewnową, śródskórną lub podskórną; lub podanie śluzówkowe doustne/do przewodu pokarmowego, oddechowego lub moczowo-płciowego. Zatem jednym aspektem wynalazku jest sposób immunizacji gospodarza, będącego

PL 220 107 B1 człowiekiem, przeciw chorobie spowodowanej przez zakażenie bakteria Gram ujemną, który to sposób obejmuje podanie gospodarzowi immunoochronnej dawki preparatu OMV według wynalazku.

Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybrana jako ilość, która wywołuje odpowiedź immunoochronną bez istotnych, niepożądanych działań ubocznych u typowego szczepionego pacjenta. Ilość ta będzie się różnić zależnie od tego który konkretny immunogen jest stosowany oraz od tego w jakiej postaci on występuje. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierać 1-100 μg antygenu białkowego lub preparatu OMV, korzystnie 5-50 μg, a najczęściej w zakresie 5-25 μg.

Optymalną ilość konkretnej szczepionki można ustalić na podstawie standardowych badań obejmujących obserwację odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u pacjentów. Po początkowym zaszczepieniu pacjenci mogą otrzymać jedną lub kilka odpowiednio rozdzielonych immunizacji przypominających.

Szczepionki według wynalazku są korzystnie immunoochronne i nietoksyczne oraz odpowiednie do zastosowania pediatrycznego oraz u dorastającej młodzieży.

Przez określenie zastosowanie pediatryczne rozumie się zastosowanie u dzieci poniżej czwartego roku życia.

Przez określenie immunoochronny rozumie się, że spełniane są opisane powyżej założenia SBA i/lub modelu ochrony zwierząt i/lub testu blokującego adhezję.

Przez określenie nietoksyczny rozumie się, że w szczepionce nie występuje wyższy niż satysfakcjonujący poziom aktywności endotoksyn, co mierzy się z zastosowaniem dobrze znanych testów LAL oraz pirogenności.

Polinukleotydy

Określenie „polinukleotydy” ogólnie dotyczy polirybonukleotydu lub polidezoksyrybonukleotydu, który może być niemodyfikowanym RNA lub DNA lub modyfikowanym RNA lub DNA. „Polinukleotydy” obejmują, bez ograniczania, jednoniciowy i dwuniciowy DNA, DNA, który jest mieszaniną regionów jedno- i dwuniciowych, jednoniciowy i dwuniciowy RNA oraz RNA który jest mieszaniną regionów jedno- i dwuniciowych, hybrydowe cząsteczki zawierające DNA i RNA, które mogą być jednoniciowe lub, zazwyczaj, dwuniciowe lub mogą być jest mieszaniną regionów jedno- i dwuniciowych. Ponadto określenie „polinukleotydy” dotyczy regionów trójniciowych RNA lub DNA lub zarówno RNA i DNA. Określenie polinukleotyd obejmuje także DNA lub RNA zawierające jedną lub większą liczbę zmodyfikowanych zasad oraz DNA lub RNA ze szkieletami zmodyfikowanymi ze względu na stabilność lub z innego powodu. „Modyfikowane” zasady obejmują przykładowo zasady trytylowane lub zasady nietypowe, takie jak inozyna. Wiele różnych modyfikacji wprowadzono do DNA i RNA; zatem „polinukleotyd” obejmuje chemicznie, enzymatycznie lub metabolicznie zmodyfikowane postacie polinukleotydów typowo znajdywane w naturze, a także chemiczne postacie DNA i RNA charakterystyczne dla wirusów i komórek. Określenie „polinukleotydy” także obejmuje stosunkowo krótkie polinukleotydy często nazywane oligonukleotydami.

Kolejne aspekty wynalazku

Inny aspekt obejmuje zastosowanie sposobu leczenia lub profilaktyki choroby wywołanej przez Neisseria obejmującej podanie ochronnej dawki (lub skutecznej ilości) szczepionki według wynalazku gospodarzowi potrzebującemu takiego leczenia. Zakażeniu Neisseria meningitidis grup serologicznych A, B, C, Y lub W135 i/lub Neisseria gonorrhoeae można korzystnie zapobiegać lub leczyć.

Wynalazek także obejmuje zastosowanie szczepionki według wynalazku w preparacie leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia Neisseria. Ponownie, zakażenie Neisseria obejmuje zakażenie przez Neisseria meningitidis grupy serologicznej A, B, C, Y, W-135 i/lub Neisseria gonorrhoeae.

Innym aspektem jest modyfikowany genetycznie szczep Neisseria, z którego mogą pochodzić pęcherzyki błony zewnętrznej według wynalazku (z rekombinacyjnie podwyższoną ekspresją co najmniej dwóch białek według wynalazku, jak opisano powyżej). Takie szczepy Neisseria mogą być Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae.

Szczep może być także zmodyfikowany (jak opisano powyżej) tak by obniżyć ekspresję innych białek Neisseria, włącznie z ekspresją jednego, dwóch, trzech, czterech, pięciu, sześciu, siedmiu lub ośmiu z LgtB, LgtE, SiaD, OpC, OpA, PorA, FrpB, msbB i HtrB. Korzystne połączenia do obniżenia ekspresji obejmują obniżenie ekspresji (korzystnie delecję) co najmniej LgtB i SiaD, obniżenie ekspresji co najmniej PorA i OpC, obniżenie ekspresji co najmniej PorA i OpA oraz obniżenie ekspresji co najmniej PorA, OpA i OpC.

PL 220 107 B1

Kolejnymi aspektami są sposoby wytwarzania preparatu immunogennego lub szczepionki według wynalazku. Obejmują one sposób obejmujący etap mieszania ze sobą co najmniej dwóch wyizolowanych antygenów lub białek z Neisseria, które mogą być obecne w postaci pęcherzyków pochodzących ze szczepów Neisseria według wynalazku, z wytworzeniem immunogennego preparatu według wynalazku, oraz sposób wytwarzania szczepionki według wynalazku obejmujący etap łączenia preparatu immunogennego według wynalazku z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Wynalazek umożliwia wytwarzanie preparatu immunogennego według wynalazku obejmujące etap wydzielania pęcherzyków błony zewnętrznej według wynalazku z hodowli Neisseria. Taki sposób może obejmować kolejny etap łączenia co najmniej dwóch preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej, przy czym korzystnie co najmniej jeden preparat pęcherzyków błony zewnętrznej zawiera LPS immunotypu L2 oraz co najmniej jeden preparat pęcherzyków błony zewnętrznej zawiera LPS immunotypu L3. Wynalazek także umożliwia sposoby, w których pęcherzyki błony zewnętrznej izoluje się przez ekstrakcję DOC o stężeniu 0-0,5%. Stężenia DOC 0,3%-0,5% stosuje się do minimalizacji zawartości LPS. W preparatach OMV, w których LPS ma być zachowany jako antygen, do ekstrakcji stosuje się DOC w stężeniach 0-0,3%, korzystnie 0,05%-0,2%, najkorzystniej około 0,1%.

Szczepionki na bazie „duchów” komórek lub całych uśmierconych komórek

Wynalazcy przewidują, że powyższe ulepszenia preparatów pęcherzyków oraz szczepionek można łatwo rozszerzyć na preparaty i szczepionki na bazie „duchów” komórek lub całych uśmierconych komórek (z identycznymi zaletami). Zmodyfikowane szczepy bakterii gram ujemnych zgodnie z wynalazkiem, z których wytwarza się preparaty pęcherzyków można także zastosować do wytworzenia preparatów „duchów” komórek lub całych uśmierconych komórek. Sposoby wytwarzania preparatów „duchów” komórek (pustych komórek z nienaruszonymi otoczkami) ze szczepów bakterii Gram ujemnych są dobrze znane (patrz np. WO 92/01791). Sposoby uśmiercania całych komórek w celu wytworzenia preparatów inaktywowanych komórek do zastosowania w szczepionkach są także dobrze znane. Zatem, dla celów wynalazku, określenia „preparaty pęcherzyków [lub OMV]” oraz „szczepionki na bazie pęcherzyków [lub OMV]”, a także procesy opisane w tym dokumencie stosują się do określeń odpowiednio „preparat 'duchów' komórek i „szczepionka na bazie 'duchów' komórek” oraz „preparat całych uśmierconych komórek” i „szczepionka na bazie całych uśmierconych komórek”.

Przeciwciała i bierna immunizacja

Innym aspektem jest sposób wytwarzania immunoglobuliny do zastosowania do leczenia lub profilaktyki zakażenia bakteriami Neisseria, obejmujący etapy immunizacji biorcy szczepionką według wynalazku oraz wydzielania od biorcy immunoglobuliny. Preparat farmaceutyczny zawierający immunoglobulinę według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest kolejnym aspektem wynalazku, który może być stosowany do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby wywołanej Neisseria. Sposób leczenia lub profilaktyki zakażenia Neisseria obejmujący etap podawania pacjentowi skutecznej ilości preparatu farmaceutycznego według wynalazku stanowi kolejny aspekt.

Inokulum do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych zazwyczaj przygotowuje się przez zdyspergowanie preparatu antygenowego w tolerowanym fizjologicznie rozcieńczalniku, takim jak sól fizjologiczna lub inne adiuwanty odpowiednie do stosowania u ludzi, z wytworzeniem wodnego roztworu. Immunostymulującą ilość inokulum podaje się ssakowi, a następnie zaszczepionego ssaka hoduje się przez czas niezbędny do tego aby preparat antygenowy wywołał wytworzenie ochronnych przeciwciał.

Przeciwciała można wydzielić w wymaganym stopniu dobrze znanymi technikami, takimi jak chromatografia powinowactwa (Harlow i Lane Antibodies; a laboratory manual 1988).

Przeciwciała mogą obejmować preparaty surowicy uzyskane od różnych powszechnie stosowanych zwierząt, np. kóz, naczelnych, osłów, świń, koni, świnek morskich lub szczurów, albo człowieka. Od zwierząt pobiera się krew i odzyskuje surowicę.

Immunoglobulina wytwarzana zgodnie z wynalazkiem może zawierać całe przeciwciała, fragmenty przeciwciał lub subfrag menty. Przeciwciała mogą być całymi immunoglobu linami którejkolwiek klasy, np. IgG, IgM, IgA, IgD lub IgE, chimerycznymi przeciwciałami lub hybrydowymi przeciwciałami o podwójnej specyficzności względem dwóch lub większej liczby antygenów według wynalazku. Mogą one także być fragmentami, np. F(ab')2, Faib', Fab, Fv itp., włącznie z hybrydowymi fragmentami. Immunoglobulina obejmuje także naturalne, syntetyczne lub zmodyfikowane technikami inżynierii genetycznej białka, które działają jak przeciwciało przez wiązanie ze specyficznymi antygenami z wytworzeniem kompleksu.

PL 220 107 B1

Szczepionka według wynalazku może być także podawana biorcy, który następnie służy jako źródło immunoglobuliny, wytwarzanej w odpowiedzi na prowokację specyficzną szczepionką. Od tak potraktowanego pacjenta jest pobierane osocze z którego następnie uzyskuje się hiperimmunoglobulinę metodą standardowego frakcjonowania osocza. Hiperimmunoglobulina jest podawana innemu pacjentowi aby wywołać odporność na lub leczyć zakażenie Neisseria. Hiperimmunoglobuliny według wynalazku są szczególnie użyteczne do leczenia lub profilaktyki choroby wywołanej przez Neisseria u dzieci, osobników z upośledzoną odpornością lub gdy wymagane jest leczenie oraz brak jest czasu aby osobnik wytworzył przeciwciała w odpowiedzi na szczepienie. Dodatkowym aspektem wynalazku jest preparat farmaceutyczny zawierający dwa lub większą liczbę przeciwciał monoklonalnych (lub ich fragmentów, korzystnie ludzkich lub humanizowanych), reaktywnych względem co najmniej dwóch składników preparatu immunogennego według wynalazku, które mogą być stosowane do leczenia lub profilaktyki zakażenia bakteriami Gram ujemnymi lub korzystnie Neisseria, korzystniej Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae, a najkorzystniej Neisseria meningitidis grupy serologicznej B.

Takie preparaty farmaceutyczne zawierają przeciwciała monoklonalne, którymi mogą być całe immunoglobuliny którejkolwiek klasy, np. IgG, IgM, IgA, IgD lub IgE, chimeryczne przeciwciała lub hybrydowe przeciwciała o specyficzności względem dwóch lub większej liczbie antygenów według wynalazku. Mogą one także być także fragmentami, np. F(ab')2, Fab', Fab, Fv itp., włącznie z fragmentami hybrydowymi.

Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych są dobrze znane i mogą obejmować fuzję limfocytów śledzionowych z komórkami szpiczaka (Kohler i Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow i Lane 1988). Alternatywnie monoklonalne fragmenty Fv można uzyskać przez przeszukanie odpowiedniej biblioteki prezentacji fagowej (Vaughan TJ i in., 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Przeciwciała monoklonalne mogą być także humanizowane lub częściowo humanizowane dobrze znanymi technikami.

Zamieszczone tutaj określenia „zawierający”, „zawierać” oraz „zawiera” w zamierzeniu wynalazców można w każdym przypadku zastąpić określeniami odpowiednio „składający się z”, „składać się z” lub „składa się z”.

Opis figur

Fig. 1. - Wykrycie TbpA i Hsf w OMV przygotowanych z rekombinowanego szczepu N. meningitidis z podwyższoną ekspresją tbpA i hsf. Rozdział preparatów OMV (10 μg) metodą analizy SDS-PAGE (żele gradientowe 4-20%) z wybarwianiem błękitem Coomassie brilliant.

Fig. 2. - Wykrycie rekombinowanej domeny pasażerskiej Hsf wytworzonej w E. coli, 10 μg oczyszczonego białka domeny pasażerskiej Hsf (ścieżka 2 i 3) rozdzielono metodą SDS-PAGE na 12% żelu w porównaniu ze znacznikiem masy cząsteczkowej (ścieżka 1).

Fig. 3. - Analiza czystości domeny pasażerskiej Hap przez barwienie (A) Coomassie, (B) barwienie srebrem, (C) metodą analizy western blot z przeciwciałem przeciw-His5 oraz (D) przeciw-E. coli. 10 μg oczyszczonych antygenów rozdzielono metodą SDS-PAGE w gradientowym żelu poliakrylamidowym 4-20%.

Fig. 4. - Regiony identyczności sekwencji pomiędzy białkami FrpA i FrpC wyizolowanymi ze szczepu FAM20 N. meningitidis. (A) Organizacja domen białek FrpA i FrpC szczepu FAM20 RTX N. meningitidis. (B) Produkty amplifikacji FrpA/C uzyskane ze szczepu H44/76 N. meningitidis.

Fig. 5. - Ekspresja rekombinowanego antygenu Frp23 (region konserwowany FrpA/C z 23 powtórzeniami) w E. coli. Analiza SDS-PAGE nie indukowanych (NI) oraz indukowanych (I) całkowitych ekstraktów komórkowych E. coli BL21DE3 transformowanych wektorami kontrolnymi (pET24d) lub rekombinowanymi konstruktami (odpowiednio Frp3, Frp13 i Frp23). Żele wybarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na nitrocelulozę i wykrywano immunologicznie z zastosowaniem mysiej surowicy przeciw-His6.

Fig. 6. - Korzystna sekwencja DNA fragmentu FHAB2/3 eksprymowanego w E. coli.

Fig. 7. - Oczyszczanie rekombinowanego FHAB2/3 z ekstraktów indukowanych E. coli B121DE3. (A) Główne etapy procesu oczyszczania. (B) Analiza SDS-PAGE frakcji białkowych badanych na różnych etapach procesu oczyszczania.

Fig. 8. - Aktywności blokowania adhezji surowicy odpornościowej przeciw antygenom FHAB2/3, Hap, domeny pasażerskiej Hap, Hsf i domeny pasażerskiej Hsf N. meningitidis.

Fig. 9. - Wybarwiony Coomassie żel przedstawiający poziomy ekspresji Hsf, TbpA i NspA w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej pochodzących z różnych szczepów N. meningitidis. Ścieżka 1 - znaczniki masy cząsteczkowej; ścieżka 2 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze

PL 220 107 B1 szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych; ścieżka 3 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych oraz PorA; ścieżka 4 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych oraz PorA, a ekspresja NspA została podwyższona; ścieżka 5 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych oraz PorA, a ekspresja Hsf została podwyższona; ścieżka 6 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych oraz PorA, a ekspresja TbpA została podwyższona; ścieżka 7 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych oraz PorA, a ekspresja TbpA i Hsf została podwyższona; ścieżka 8 - pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone ze szczepu H44/76, w którym obniżona została ekspresja polisacharydów otoczkowych oraz PorA, a ekspresja TbpA i NspA została podwyższona.

Sposób przemysłowego zastosowania wynalazku

Poniższe przykłady przeprowadzono stosując standardowe techniki, które są dobrze znane oraz rutynowe dla fachowca, za wyjątkiem przypadków w których opisano je bardziej szczegółowo.

P r z y k ł a d 1: Sposoby konstruowania szczepów Neisseria meningitidis grupy serologicznej B stosowanych w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej

WO 01/09350 dostarcza szczegółowe sposoby wytwarzania pęcherzyków błony zewnętrznej oraz manipulacji na szczepach bakteryjnych z których pochodzą pęcherzyki błony zewnętrznej. Gdy pęcherzyki błony zewnętrznej mają zachować lipoproteiny, takie jak TbpB i/lub lipopolisacharydy, korzystne są sposoby z zastosowaniem niskich poziomów dezoksycholanu lub bez jego stosowania.

P r z y k ł a d 2: Podwyższenie ekspresji antygenu białka Hsf w rekombinowanym szczepie Neisseria meningitidis grupy seroogicznej B nie zawierającym funkcjonalnych genów cps, ale eksprrymującym PorA.

Jak opisano w przykładach WO 01/09350, w pewnych krajach obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna oraz może wzmocnić skuteczność szczepionki rekombinowanych ulepszonych pęcherzyków. W poniższym przykładzie zastosowano zmodyfikowany wektor pCMK(+) do podwyższenia ekspresji antygenu białka Hsf w szczepie nie zawierającym funk cjonalnych genów cps, ale eksprymującym PorA. Oryginalny wektor pCMK(+) zawierał chimeryczny promotor porA/lacO reprymowany przy ekspresji w gospodarzu E. coli, ale transkrybcyjnie aktywny Neisseria meningitidis. W zmodyfikowanym pCMK(+), natywny promotor porA zastosowano do kierowania transkrypcją genu hsf. Gen kodujący Hsf zamplifikowano metodą PCR stosując startery oligonukleotydowe HSF 01-NdeI i HSF 02-Nhel, zamieszczone w tabeli poniżej. Ze względu na sekwencję startera HSF 01-Ndel eksprymowane białko Hsf zawierało dwie reszty metioniny na 5'-końcu. Warunkami zastosowanymi do amplifikacji PCR były warunki opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Gykle temperaturowe były następujące: 25 razy (94°G 1 minuta, 48°C 1 minuta, 72°C 3 minuty) oraz 1 raz (72°C 10 minut, 4°C do końca). Następnie odpowiadający amplikon wklonowano w odpowiednie miejsca restrykcyjne wektora dostarczającego pCMK(+). W tym rekombinowanym plazmidzie, nazwanym pCMK(+)-Hsf, wydeletowano lacO obecny w chimerycznym promotorze porA/lacO z zastosowaniem strategii rekombinacyjnego PCR. Plazmid pCMK(+)-Hsf zastosowano jako matrycę do amplifikacji metodą PCR dwóch osobnych fragmentów DNA:

- fragment 1 zawierał region rekombinogenny porA 5', gen oporności na kanamycynę oraz promotor porA. Zastosowane startery oligonukleotydowe, RP1(SacII) i RP2, przedstawiono w tabeli poniżej. Starter RP1 był homologiczny do sekwencji leżącej bezpośrednio w górę od operatora lac.

- fragment 2 zawierał sekwencję Shine-Dalgarno z genu porA, gen hsf oraz region rekombinogenny porA 3'. Zastosowane startery oligonukleotydowe, RP3 i RP4(Apal), przedstawiono w tabeli poniżej. Starter RP3 był homologiczny do sekwencji leżącej bezpośrednio w dół od operatora lac. 3'-koniec fragmentu 1 i 5'-koniec fragmentu 2 zawierały 48 pokrywających się zasad. 500 ng każdego z PCR (1 i 2) zastosowano do końcowej reakcji PCR ze starterami RP1 i RP4. Uzyskany końcowy amplikon subklonowano do wektora pSL1180 strawionego restrykcyjnie SacII i Apal. Zmodyfikowany plazmid pCMK(+)-Hsf oczyszczono na dużą skalę stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 pg tego m ateriału zastosowano do transformacji szczepu Neisseria meningitidis grupy serologicznej B nie zawierającego funkcjonalnych genów cps. Aby zachować ekspresję porA, integrację powstałą w wyniku pojedynczego crossing-over wyselekcjonowano przez połączenie procedur przeszukiwania PCR oraz Western blot. Klony oporne na kanamycynę pozytywne w specyficznych dla porA testach PCR i WePL 220 107 B1 stern blot przechowywano w -70°C w glicerolowych permanentach i stosowano w dalszych badaniach. Bakterie (odpowiadające około 5x10⁸ bakterii) przeprowadzono ponownie w zawiesinę w 50 μl buforu do PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie rozdzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS w 12,5% żelu. Ekspresję Hsf badano w lizatach bakteryjnych całych komórek (WCBL) pochodzących z NmB [Cps-, PorA+] lub NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. Przez wybarwienie Coomassie wykryto istotny wzrost ekspresji Hsf (w stosunku do endogennego poziomu Hsf). Wynik ten potwierdził, że zmodyfikowany wektor pCMK(+)-Hsf jest funkcjonalny i może być skutecznie stosowany do podwyższenia ekspresji białek błony zewnętrznej, bez zaburzenia wytwarzania głównego antygenu białkowego błony zewnętrznej PorA.

Oligonukleotydy zastosowane w badaniach

Oligonukleotydy	Sekwencja	Uwagi
Hsf 01-Nde	5'-GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAA AAT ATA CCG C-3'	Miejsce klonowania Ndel
Hsf02-Nhe	5'-GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACT GAT AAC CGA C-3'	Miejsce klonowania Nhel
GFP-mut-Asn	5'-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3'	Miejsce klonowania Asnl kompatybilne z Ndel
GFP-Spe	5'-GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG-3'	Miejsce klonowania Spel kompatybilne z Nhel
RP1 (Sacll)	5'-TCC CCG CGG GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC-3'	Miejsce klonowania Sacll
RP2	5'-CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA GGG CAA ACA CCC GAT ACG TCT TCA-3'
RP3	5'-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG-3'
RP4 (Apal)	5'-GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGA CGG CGC AGC AGG-3'	Miejsce klonowania ApaI

P r z y k ł a d 3: Podwyższenie ekspresji genu tbpA szczepu N. meningitidis grupy serologicznej B przez zastąpienie promotora

Celem tego doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu tbpA przez silny promotor porA w celu podwyższenia wytwarzania antygenu TbpA. W tym celu plazmid do zastąpienia promotora skonstruowano stosując sposoby klonowania E. coli. Region DNA (731 pz) umiejscowiony w górę od sekwencji kodującej tbpA wykryto w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu ATCC 13090 Neisseria meningitidis. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą antygen TbpB. Geny są zorganizowane w operonie. Gen tbpB został wydeletowany i zastąpiony kasetą promotorową CmR/porA. W tym celu fragment DNA długości 3218 pz, odpowiadający 509 pz 5'-regionu flankującego gen tbpB, 2139 pz sekwencji kodującej tbpB, 87 pz sekwencji międzygenowej oraz 483 pierwszym nukleotydom sekwencji kodującej tbpA, zamplifikowano metodą PCR z DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis grupy serologicznej B stosując oligonukleotydy BAD16 (5'-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3') i BAD17 (5'-GGC CAAGCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') zawierające sekwencje pobierania oraz miejsca restrykcyjne Nhel i Hindlll (podkreślone). Ten fragment PCR oczyszczono z zastosowaniem zestawu High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Niemcy) i bezpośrednio wklonowano do wektora pGemT (Promega, USA). Plazmid ten poddano cyklom mutagenezy PCR (Jones i Winistofer (1992)) w celu (i) wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających wklonowanie kasety promotorowej CmR/PorA oraz (ii) wydeletowania 209 pz sekwencji 5'-flankującej tbpB oraz sekwencji kodującej tbpB. Cykliczny PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3') i BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG

PL 220 107 B1

CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGTTCC G-3') zawierające odpowiednie miejsca restrykcyjne Xmal, Bglll i XhoI (podkreślone). Kasetę promotorową CmR/PorA zamplifikowano z opisanego wcześniej plazmidu pUCD15/Omp85, stosując startery BAD21 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') i BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') zawierające odpowiednie miejsca Restrykcyjne Xmal, Spel, Bglll i XhoI (podkreślone). Ten fragment PCR wklonowano do plazmidu z cyklicznego PCR. Plazmid ten zastosowano do transformacji szczepów Neisseria meningitidis grupy serologicznej B (cps-) i (cpsporA-). Integracja przez podwójny crossing-over regionie leżącym w górę od tbpA pokieruje insercją promotora porA bezpośrednio w górę od tbpA ATG.

P r z y k ł a d 4: Konstrukcja szczepu N. meningitidis grupy serologicznej B z podwyższoną ekspresją dwóch antygenów: TbpA i Hsf.

Celem tego doświadczenia było równoczesne podwyższenie ekspresji TbpA i Hsf w tym samym szczepie N. meningitidis grupy serologicznej B. Wytwarzanie TbpA podwyższono przez zastąpienie jego endogennego regionu promotorowego przez silny promotor porA (zastąpienie promotora). W tym kontekście, wydeletowano gen tbpB zlokalizowany w górę od tbpA i białko TbpB nie było już obecne w błonie zewnętrznej. Ekspresję Hsf podwyższono przez wstawienie (rekombinacja homologiczna) drugiej kopii odpowiedniego genu w locus porA (dostarczenie genu). Oba szczepy opisano w osobnym zgłoszeniu patentowym o numerze WO 01/09350. Markery selekcyjne zastosowane w obu straRR tegiach (Cm lub Kan ) umożliwiły połączenie obu integracji w tym samym chromosomie.

Całkowity genomowy DNA wyekstrahowano ze zrekombinowanego szczepu Nm.B cps/TbpA+/PorA+ zgodnie z procedurą Qiagen Genomic tip 500-G. Dziesięć μg DNA strawiono restrykcyjnie przez noc enzymem restrykcyjnym Dralll i zastosowano do stransformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy serologicznej B z zastosowaniem klasycznej procedury. Komórkami zastosowanymi do transformacji były albo rekombinowane NmB eps-/Hsf+/PorA+ (rekombinacja homologiczna przez pojedynczy crossing-over w locus porA) lub rekombinowane NmB cps-/Hsf+/PorA- (wymiana alleli/rekombinacja homologiczna przez podwójny crossing-over w locus porA). Wysiano je na noc na płytki z agarem GC zawierającym 200 μg/ml kanamycyny, rozcieńczono do OD₆₅₀ = 0,1 w ciekłej pożywce GC z 10 mM MgCl₂ i inkubowano przez 6 godzin w 37°C z intensywnym wytrząsaniem z 10 μg genomowego DNA strawionego restrykcyjnie Dralll. Rekombinowane Neisseria meningitidis powstałe w wyniku podwójnego crossing-over (przeszukiwanie PCR) wyselekcjonowano na pożywce GC zawierającej 200 μg/ml kanamycyny i 5 μg/ml chloramfenikolu i analizowano pod względem ekspresji TbpA i Hsf w preparatach OMV. Jak przedstawiono na fig. 1, wytwarzanie zarówno TbpA, jak i Hsf było istotnie podwyższone w OMV przygotowanych z rekombinowanego względem TbpA/Hsf szczepu NmB w porównaniu z OMV przygotowanymi z kontrolnych szczepów NmB cps-. Poziom nadekspresji każdego z białek w podwójnie rekombinowanym szczepie był porównywalny z poziomem ekspresji uzyskiwanym w odpowiadających pojedynczych rekombinantach. Poziom nadekspresji TbpA i Hsf był porównywalny w szczepach PorA+ i PorA- (dane nie prezentowane). Podsumowując, dane te wykazują, że: (i) ekspresja TbpA i Hsf może być wspólnie i równocześnie podwyższona w N. meningitidis oraz (ii) rekombinowane pęcherzyki wzbogacone pod względem TbpA i Hsf mogą być uzyskane i stosowane do immunizacji.

P r z y k ł a d 5: Konstrukcja szczepu N. meningitidis grupy serologicznej B z podwyższoną ekspresją dwóch antygenów: TbpA i NspA.

Celem doświadczenia było podwyższenie ekspresji równocześnie TbpA i NspA w tym samym szczepie N. meningitidis grupy serologicznej B. Wytwarzanie TbpA podwyższono przez zastąpienie jego endogennego regionu promotorowego silnym promotorem porA (zastąpienie promotora). Ekspresję NspA podwyższono przez wstawienie (rekombinacja homologiczna) drugiej kopii odpowiedniego genu w locus porA (dostarczenie genu). Obydwa szczepy opisano w osobnym zgłoszeniu patentowym

RR

WO 01/09350. Markery selekcyjne zastosowane w obydwu strategiach (Cm lub Kan ) umożliwiły połączenie obydwu integracji w tym samym chromosomie.

Całkowity genomowy DNA wyekstrahowano z rekombinowanego szczepu NmB cps/TbpA+/PorA+ z zastosowaniem procedury Qiagen Genomic tip 500-G. Dziesięć μg z DNA strawiono restrykcyjnie przez noc z enzymem restrykcyjnym Aatll i zastosowano do transformacji Neisseria meningitidis grupy serologicznej B z zastosowaniem klasycznej procedury transformacji. Komórkami zastosowanymi do transformacji były rekombinowane NmB cps-/NspA+/PorA-. Wysiano je na noc na agar GC zawierający 200 μg/ml kanamycyny, rozcieńczono do OD₆₅₀ = 0,1 w ciekłej pożywce GC z 10 mM MgCl₂ i inkubowano 6 godzin w 37°C z intensywnym wytrząsaniem z 10 μg genomowego

PL 220 107 B1

DNA strawionego restrykcyjnie Aatll. Rekombinowane Neisseria meningitidis powstałe w wyniku podwójnego crossing-over (przeszukiwanie PCR) wyselekcjonowano na pożywce GC zawierającej 200 μg/ml kanamycyny i 5 μg/ml chloramfenikolu i analizowano pod względem ekspresji TbpA i NspA w preparatach OMV. Wytwarzanie TbpA, jak i NspA było istotnie podwyższone w OMV przygotowanych z TbpA/NspA rekombinowanego szczepu NmB w porównaniu z OMV przygotowanymi z kontrolnych szczepów NmB cps-. Poziom nadekspresji każdego białka w podwójnie rekombinowanym szczepie był porównywalny z poziomem ekspresji uzyskanym w odpowiednich pojedynczych rekombinantach. Podsumowując, dane te pokazują, że: (i) ekspresja TbpA i NspA może być łącznie i równocześnie podwyższana w N. meningitidis oraz (ii) można uzyskiwać rekombinowane pęcherzyki wzbogacone w TbpA i NspA i stosować je do immunizacji.

P r z y k ł a d 6: Konstrukcja szczepu N. meningitidis grupy serologicznej B z podwyższoną ekspresją dwóch antygenów: NspA i D15/Omp85.

Celem doświadczenia było równoczesne podwyższenie ekspresji NspA i D15/Omp85 w tym samym szczepie N. meningitidis grupy serologicznej. Wytwarzanie D15/Omp85 podwyższono przez zastąpienie jego endogennego regionu promotorowego silnym promotorem porA (zastąpienie promotora). Ekspresję NspA podwyższono przez wstawienie (rekombinacja homologiczna) drugiej kopii odpowiedniego genu w locus porA (dostarczenie genu). Obydwa szczepy opisano w osobnym zgłosze_R niu patentowym WO 01/09350. Markery selekcyjne zastosowane w obydwu strategiach (Cm lub _R

Kan ) umożliwiły połączenie obydwu integracji w tym samym chromosomie.

Całkowity genomowy DNA wyekstrahowano z rekombinowanego szczepu NmB cps-/D15Omp85/PorA+ z zastosowaniem procedury Qiagen Genomic tip 500-G. Dziesięć μg z DNA strawiono restrykcyjnie przez noc z enzymem restrykcyjnym Aatll i zastosowano do transformacji Neisseria meningitidis grupy serologicznej B z zastosowaniem klasycznej procedury transformacji. Komórkami zastosowanymi do transformacji były rekombinowane NmB cps-/NspA+/PorA-. Wysiano je na noc na agar GC zawierający 200 μg/ml kanamycyny, rozcieńczono do OD₆₅₀ = 0,1 w ciekłej pożywce GC z 10 mM MgCl₂ i inkubowano 6 godzin w 37°C z intensywnym wytrząsaniem z 10 μg genomowego DNA strawionego restrykcyjnie Aatll. Rekombinowane Neisseria meningitidis powstałe w wyniku podwójnego crossing-over (przeszukiwanie PCR) wyselekcjonowano na pożywce GC zawierającej 200 μg/ml kanamycyny i 5 μg/ml chloramfenikolu i analizowano pod względem ekspresji NspA i D15/Omp85 w preparatach OMV. Wytwarzanie NspA, jak i D15/Omp85 było istotnie podwyższone w OMV przygotowanych z NspA/D15-Omp85 rekombinowanego szczepu NmB w porównaniu z OMV przygotowanymi z kontrolnych szczepów NmB cps. Poziom nadekspresji każdego białka w podwójnie rekombinowanym szczepie był porównywalny z poziomem ekspresji uzyskanym w odpowiednich pojedynczych rekombinantach. Podsumowując, dane te pokazują, że: (i) ekspresja NspA i Omp85 może być łącznie i równocześnie podwyższana w N. meningitidis oraz (ii) można uzyskiwać rekombinowane pęcherzyki wzbogacone w NspA i Omp85 i stosować je do immunizacji.

P r z y k ł a d 7: Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanych postaci Hsf w E. coli

Analiza komputerowa białka Hsf-podobnego z Neisseria meningitidis ujawniła co najmniej cztery domeny strukturalne. Przy uznaniu sekwencji Hsf ze szczepu H44/76 jako odniesienia, Domena. 1, zawierająca aminokwasy 1 do 51, koduje sec- zależny peptyd sygnałowy charakterystyczny dla rodziny białek autotransportujących. Domena 2, zawierająca aminokwasy 52 do 473, koduje domenę pasażerską, która przypuszczalnie jest eksponowana na powierzchni i dostępna dla układu immunologicznego, Domena 3, zawierająca aminokwasy 474 do 534, koduje przypuszczalną superskręconą domenę wymaganą do oligomeryzacji białka oraz zawias (szyję), dla domeny 4, zawierającej aminokwasy 535 do C-końca, przewiduje się, że koduje β-nici, które przypuszczalnie składają się w strukturę podobną do baryłki i zakotwiczają w błonie zewnętrznej (Henderson i in., (1998), Trends Microbiol. 6:370-378; Hoiczyk i in., (2000), EMBO 22:5989-5999). Ponieważ domeny 2 i 3 są prawdopodobnie eksponowane na powierzchni, są silnie konserwatywne (ponad 80% we wszystkich badanych szczepach; jak opisano w Pizza i in., (2000), Science 287:1816-1820), są one interesującymi kandydatami na szczepionkę. Z tego powodu domenę 2 (nazywaną tutaj domeną pasażerską Hsf) oraz domenę 2+3 (nazywane tutaj domeną Hsf szyi (nc) + superskręconą (cc)) eksprymowono i oczyszczono z E. coli. Fragmenty DNA kodujące aminokwasy 52-473 (pasażerka domena Hsf) i 52-534 (Hsf n+cc) amplifikowano metodą PCR przy zastosowaniu oligonukleotydów dodających końcowe miejsca restrykcyjnej Rcal (starter w przód) i Xhol (starter w tył). Oczyszczone amplikony strawiono Rcal/XhoI w warunkach zalecanych przez dostawcę, a następnie wklonowano w miejsca Ncol (kompatybilne z Rcal)/XhoI wektora ekspresyjnego E. coli pET24d (Novagen Inc., Madison WI). Rekombinowane

PL 220 107 B1 plazmidy wyselekcjonowano i zastosowano do przygotowania rekombinowanych plazmidów. Do badań ekspresji, wektory te (pET-Hsf pas i pET-Hsf ncc) wprowadzono do szczepu B121DE3 Escherichia coli (Novagen), w którym gen polimerazy T7 jest umieszczony pod kontrolą promotora lac regulowanego izopropylo-ji-D-tiogalaktozydem (IPTG). Ciekłe hodowle (700 ml) rekombinowanego szczepu Novablue (DE3) [pET-24b/BASB029] E. coli prowadzono w 37°C z wytrząsaniem do czasu uzyskania gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₅₀) 0,6. W tym punkcie czasowym IPTG dodano do końcowego stężenia 1 mM i hodowlę prowadzono przez kolejne 4 godziny. Następnie hodowlę odwirowano przy 10000 obr./min i osad zamrożono w -20°C przez co najmniej 10 godzin. Po rozmrożeniu osad (680 ml hodowli) przeprowadzono ponownie w zawiesinę przez 30 minut w 22°C w 20 mM buforze fosforanowym, pH 7,0, przed lizą komórek przez dwukrotne przepuszczenie przez homogenizator Rannie. Zlizowane komórki odwirowano 30 minut 15000 obr./min (wirówka Beckman J2-HS, wirnik JA-20) w 4°C. Supernatant naniesiono na kolumnę Q-Sepharose fast flow (Pharmacia) zrównoważoną buforem 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Po przejściu frakcji przepływającej, kolumnę przemyto pięcioma objętościami kolumny buforu 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Rekombinowane białko wymyto z kolumny 250 mM NaCl w buforze 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Frakcje pozytywne pod względem antygenu połączono i dializowano przez noc wobec 20 mM buforu fosforanowego pH 7,0. 0,5 M NaCl i 20 mM Imidazol dodano do przedializowanej próbki. Następnie próbkę naniesiono na kolumnę Ni-NTA Agarose (Qiagen) zrównoważoną 20 mM buforem fosforanowym, pH 7,0, zawierającym 500 mM NaCl i 20 mM Imidazol. Po przejściu frakcji przepływającej kolumnę przemyto pięcioma objętościami kolumny 20 mM buforu fosforaowego, pH 7,0, zawierającego 500 mM NaCl i 20 mM Imidazol. Zanieczyszczenia wymyto 100 mM Imidazolem w 20 mM buforze fosforanowym pH 7,0. Rekombinowane białko wymyto z kolumny 250 mM Imidazolem w 20 mM buforze fosforanowym, pH 7,0. Frakcje pozytywne pod względem antygenu połączono i dializowano wobec 10 mM buforu fosforanowego, pH 6,8, zawierającego 150 mM NaCl. Jak przedstawiono na fig. 2, wzbogaconą (czystość oszacowana jako wyższa niż 90% w SDS-PAGE z barwieniem CBB) domenę pasażerską białka Hsf-podobnego, migrującą w okolicy 47 kDa (oszacowana względna masa cząsteczkowa), wymyto z kolumny. Polipeptyd ten był reaktywny względem mysiego przeciwciała monoklonalnego wytworzonego przeciw motywowi 5-histydyn. Podsumowując, dane te sugerują, że zarówno domena pasażerska Hsf, jak i gen ncc Hsf mogą być eksprymowane i oczyszczone z rekombinowanego szczepu E. coli.

P r z y k ł a d 8: Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanej domeny pasażerskiej Hap w E. coli

Analiza komputerowa białka Hap-podobnego z Neisseria meningitidis ujawniła co najmniej trzy domeny strukturalne. Przy uznaniu sekwencji białka Hap-podobnego ze szczepu H44/76 jako odniesienia. Domena 1, zawierająca aminokwasy 1 do 42, koduje sec-zależny peptyd sygnałowy charakterystyczny dla rodziny białek autotransportujących. Domena 2, zawierająca aminokwasy 43 do 950, koduje domenę pasażerską, która przypuszczalnie jest eksponowana na powierzchni i dostępna dla układu immunologicznego, dla Domeny 3, zawierającej aminokwasy 951 do C-końca (1457), przewiduje się, że koduje β-nici, które przypuszczalnie składają się w strukturę podobną do baryłki i zakotwiczają w błonie zewnętrznej. Ponieważ domena 2 jest prawdopodobnie eksponowana na powierzchni, jest silnie konserwatywna (ponad 80% we wszystkich badanych szczepach) i może być wytwarzana jako antygen podjednostkowy w E. coli, jest ona interesującym kandydatem na szczepionkę. Ponieważ domeny 2 i 3 są prawdopodobnie eksponowane na powierzchni, są silnie konserwatywne (ponad 80% we wszystkich badanych szczepach; jak opisano w Pizza i in., (2000), Science 287:1816-1820), są one interesującymi kandydatami na szczepionkę. Z tego powodu domenę 2 (nazywaną tutaj domeną pasażerską Hap) oraz domenę eksprymowano i oczyszczono z E. coli. Fragment DNA kodujący aminokwasy 43-950 (pasażerka domena Hap) amplifikowano metodą PCR przy zastosowaniu oligonukleotydów dodających końcowe miejsca restrykcyjne Ncol (starter w przód) i Xhol (starter w tył). Oczyszczone amplikony strawiono Ncol/XhoI w warunkach zalecanych przez dostawcę, a następnie wklonowano w miejsca Ncol/Xhol wektora ekspresyjnego E. coli pET24d (Novagen Inc., Madison WI). Rekombinowane plazmidy wyselekcjonowano i oczyszczono na dużą skalę. Do badań ekspresji, wektory te (pET-Hap pass) wprowadzono do szczepu B121DE3 Escherichia coli (Novagen), w którym gen polimerazy T7 jest umieszczony pod kontrolą promotora lac regulowanego izopropylo-ji-D-tiogalaktozydem (IPTG).

Hodowla E. coli BL21[pET-Hap pass] w fermentatorze

Próbkę (100 μθ z wyjściowego posiewu rozsiano na pytkach FEC013AA (pepton sojowy A3 20 g/l, ekstrakt drożdżowy 5 g/l, NaCl 5 g/l. Agar 18 g/l, destylowana H₂O do 1 l) i hodowano przez 20 godzin w 37°C. Warstwę bakterii zebrano i przeprowadzono w zawiesinę w jałowej wodzie zawieraPL 220 107 B1 jącej NaCl 0,9%. Ten roztwór zastosowano d zaszczepienia 20 l fermentatora stosowanego w trybie wsadowym w pożywce FECO11AC (pepton sojowy 24 g/l, ekstrakt drożdżowy 48 g/l, MgSO₄/7H₂O 0,5 g/l, K₂HPO4 2 g/l, NaH₂PO4/2H₂O 0,45 g/l, glicerol (87%) 40 g oraz destylowana H₂O do 1 l). Temperaturę (30°C), pH (6,8, NaOH 25%/H₃PO₄ 25%), ciśnienie (500 mBarów), utrzymywano na stałym poziomie i napowietrzanie ustawiono na 20 l/min. W tych warunkach ciśnienie rozpuszczonego tlenu utrzymywano przy 20% przez ustawianie wytrząsania (100 do 1000 obr./min). Induktor (IPTG, 1 mM) dodano po 8 godzinach wzrostu (OD = 27,8). Próbki (6 l) zbierano po 6 godzinach (OD = 49,2) i 16,5 godziny (OD = 48,6), biomasę zebrano przez odwirowanie i osady przechowywano w -20°C.

Oczyszczanie domeny pasażerskiej Hap:

Domenę pasażerską HAP oczyszczono z fermentatora w trybie wsadowym. Opracowano schemat oczyszczania (patrz poniżej).

Prasa Francha (Tris 50 mM/EDTA 5 mM, pH 8,0)

Φ

30' przy 10000 obr./min (JA10)

Φ

Solubilizacja osadu w Pi 20 mM/mocznik 8 M, pH 7,0 Mieszanie 1 h w temperaturze pokojowej

Φ

30' przy 10000 obr./min (JA10)

Φ

SP-Sepharose-XL

Pi 20 mM/mocznik 8 M; wymycie +/-50 mM NaCl

Φ

Chelatująca Sepharose-FF-Cu⁺⁺

Pi 20 mM/NaCl 0,5 M/mocznik 8 M; wymycie +/-100 mM imidazol

Φ

Dializa (PBS pH 6,8/arginina 0,5 M);

Jałowienie przez filtrację.

Większość domeny pasażerskiej Hap odzyskano w osadzie po wirowaniu po rozbiciu komórek. Rozpuszczenie osadu przeprowadzono przy zastosowaniu 8 M mocznika. Pomimo posiadania N-końcowego ogona Histydynowego, IMAC nie funkcjonowała w pierwszym etapie, ale dała dobre efekty po pierwszym etapie oczyszczenia na kationowymieniaczu SP-XL. Na tym złożu SP-Sepharose-XL, białko wymyto ilościowo pośrodku liniowego gradientu NaCl (0-250 mM). IMAC przeprowadzono na załadowanej Cu++ chelatującej Sepharose FF, tak jak dla FHAb. Tym razem, przeciwnie niż jak dla FHAb, IMAC dała znaczny współczynnik oczyszczenia. Na SDS-PAGE, HAP2/3 wydawała się być czysta po IMAC. Jednakże pik HAP2/3 był bardzo szeroki w gradiencie 0-200 mM imi32

PL 220 107 B1 dazolu, zatem wypróbowano wymycie stopniowo wzrastającymi stężeniami imidazolu (10 mM - 100 mM); jednakże tryb gradientowy wydawał się bardziej skuteczny pod względem czystości. W końcowym etapie spróbowano wymienić bufor z mocznikiem na bufor z argininą metodą chromatografii z sączeniem na żelu, jednakże w tym przypadku wymyto białko w dwóch pikach. Te dwa piki wykazywały porównywalny profil w SDS-PAGE; zatem można wysnuć hipotezę, że obecność tych dwóch pików wynikała z częściowego sfałdowania domeny pasażerskiej HAP. Postanowiono zatem powrócić do klasycznej metody wymiany buforu przez dializę w ostatnim etapie. Analiza SDS-PAGE wykazała dobrą czystość końcowego materiału (patrz na fig. 3). Następnie czystość domeny pasażerskiej HAP dalej potwierdzono przez WB z przeciw-his. Było ono rozpoznawane przez przeciw-E. coli. Stwierdzono masę cząsteczkową 96,1 KD.

P r z y k ł a d 9: Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanych postaci FrpA/C z E. coli

Neisseria meningitidis koduje dwa białka RTX, nazwane FrpA i FrpC, wydzielanie pod wpływem ograniczenia żelaza (Thompson i in., (1993) J. Bacterial. 175:811-818; Thompson i in., (1993) Infect Immun. 61:2906-2911). Rodzina białek RTX (toksyn z powtórzeniami, ang. Repeat ToXin) ma wspólną serię powtórzeń 9 aminokwasów w pobliżu C-końca o konsensusie: Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa (LXGGXGN/_dDX). Uważa się, że powtórzenia w E. coli HlyA są miejscem wiązania Ca2+. Jak przedstawiono na fig. 4, meningokokowe białka FrpA i FrpC, jak scharakteryzowano w szczepie FAM20, wykazują silne podobieństwo aminokwasowe w swoich regionach części centralnej oraz C-końcowej, ale bardzo ograniczone podobieństwo (jeżeli jakiekolwiek) na N-końcu. Ponadto region konserwatywny dla FrpA i FrpC wykazuje pewien polimorfizm ze względu na liczbę powtórzeń (13 razy w FrpA i 43 razy w FrpC) 9-aminokwasowego motywu.

Aby ocenić potencjał szczepionkowy FrpA i FrpC, rekombinacyjnie wytworzono w E. coli regiony białek konserwatywne dla FrpA i FrpC. W tym celu, segment DNA obejmujący aminokwasy 277 do 1007 (w odniesieniu do sekwencji peptydu FAM20 N. meningitidis) zamplifikowano metodą PCR z genomu szczepu H44/76 N. meningitidis grupy serologicznej B stosując startery w przód Fr (3'-GTGCATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3'). Uzyskano trzy amplikony wielkości ~1530 pz (3 powtórzenia), ~2130 pz (13 powtórzeń) i 2732 pz (23 powtórzenia) i strawiono je endonukleazami restrykcyjnymi Ncol i SalI. Następnie fragmenty te wstawiono w miejsca Ncol/Xhol (kompatybilne z SalI) pET24d i rekombinowane plazmidy (odpowiednio pET-Frp3, pET-Frp13 i pET-Frp23) wyselekcjonowano i zastosowano do to stransformowania komórek E. coli BL21DE3. Jak przedstawiono na fig. 5, wszystkie trzy konstrukty pod wpływem indukcji wytworzyły rekombinowane domeny konserwatywne FrpA/C. Ponadto, zwiększenie liczby powtórzeń zwiększyło rozpuszczalność rekombinowanego białka, co wyznaczono na podstawie analizy frakcjonowania komórki (dane nie prezentowane).

Oczyszczanie konserwatywnej domeny FrpA/C zawierającej 23 powtórzenia nonapeptydu LXGGXGN/13DX (ogólnie 911 aminokwasów).

3,5 litra E. coli B121DE3 [pET-Frp23] hodowano i indukowano przez 4 godziny przez dodanie 2 mM IPTG gdy OD osiągnęło 0,6. Komórki zebrano przez odwirowanie i odpowiedni osad rozbito ciśnieniowo, oczyszczono przez odwirowanie i odpowiedni supernatant naniesiono na kolumnę powinowactwa do jonów metalu Ni²+ (Ni-NTA-agarose, Qiagen GmBh). Imidazol () zastosowano do wymycia i ostatecznie usunięto przez dokładną dializę wobec 10 mM fosforanu Na, pH 6,8, 150 mM NaCl.

P r z y k ł a d 10: Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanych postaci FHA w E. coli

Klonowanie skróconego FhaB z N. meningitidis

Genomowy DNA wyekstrahowano z 10 komórek szczepu H44/76 N. meningitidis grupy serologicznej B stosując zestaw do ekstrakcji DNA genomowego QIAGEN (Qiagen Gmbh). Materiał ten (1 μg) poddano amplifikacji DNA metodą reakcji łańcuchowej polimerazy z zastosowaniem następujących starterów specyficznych dla genu FhaB: JKP:5'AAT GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CAT CGC ATT ATC3' i 57JKP 5' CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTG T3'. Uzyskano fragment DNA wielkości około 4200 pz, kodujący pierwszych 1433 N-końcowych aminokwasów białka, strawiono endonukleazami restrykcyjnymi Ndel/Spel i wstawiono w odpowiednie miejsca w pMG MCS (pochodna pMG, Proc Natl Acad Sci USA styczeń 1985; 82(1):88-92) standardowymi technikami biologii molekularnej (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, wydanie 2, red.: Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). Sekwencję DNA sklonowanego fragmentu FhaB wyznaczono z użyciem zestawu Big Dye Cycle Sequencing kit (Perkin-Elmer) oraz sekwenatora DNA ABI 373A/PRISM (patrz fig. 1). Rekombinowany plazmid pMG-FhaB (1 μg) poddano amplifikacji DNA mePL 220 107 B1 todą reakcji łańcuchowej polimerazy z zastosowaniem specyficznych starterów FhaB (XJKP03 5' AATGGAATACATATGAATAAAGGTTTACATCGCATTATCTTTAG3' i XJKP57025' GGGGCCACTCGAGGTTTTTCGCTACTTGGAGCTGTTTCAGATAGG3'). Uzyskano fragment DNA wielkości 4214 pz, strawiono go endonukleazami restrykcyjnymi Ndel/Xhol i wstawiono w odpowiednie miejsca wektora pET-24b do klonowania/ekspresji (Novagen) stosując standardowe techniki biologii molekularnej (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, wydanie 2, red.: Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). Potwierdzające sekwencjonowanie rekombinowanego pET-24b zawierającego skrócone FhaB (pET24b/FhaB2/3) przeprowadzono z użyciem zestawu Big Dyes kit (Applied biosystems) i analizy na sekwenatorze DNA ABI 373/A w warunkach opisanych przez producenta. Otrzymaną sekwencję nukleotydową przedstawiono na fig. 6.

Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego, skróconego białka FhaB w Escherichia coli.

Konstrukcję plazmidu do klonowana/ekspresji pET24b/FhaB 2/3 opisano powyżej. Wektor ten niósł skrócony gen FhaB wyizolowany ze szczepu H44/76 w fuzji z fragmentem sześciu reszt histydyny (na C-końcu rekombinowanego produktu), umiejscowiony pod kontrolą silnego promotora genu 10 bakteriofaga T7. Do badań ekspresji wektor ten wprowadzono do szczepu Novablue (DE3) Escherichia coli (Novagen), w którym gen polimerazy T7 jest umiejscowiony pod kontrolą promotora lac regulowanego izopropylo-3-D-tiogalaktozydem (IPTG). Ciekłe hodowle (100 ml) rekombinowanego szczepu Novablue (DE3) [pET-24b/FhaB2/3] E. coli hodowano w 37°C z wytrząsaniem do czasu uzyskania gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) 0,6. W tym punkcie czasowym IPTG dodano do końcowego stężenia 1 mM i hodowlę prowadzono przez kolejne 4 godziny. Następnie hodowlę odwirowano przy 10000 obr./min i osad zamrożono w -20°C przez co najmniej 10 godzin. Po rozmrożeniu osad przeprowadzono ponownie w zawiesinę przez 30 minut w 25°C w 20 mM buforze A (6 M chlowodorek guanidyny, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 8,0), trzykrotnie przepuszczono przez igłę i oczyszczono przez odwirowanie (20000 obr./min, 15 min). Następnie próbkę naniesiono przy natężeniu przepływu 1 ml/min na kolumnę Hitrap załadowaną Ni²+ (Pharmacia Biotech). Po przejściu frakcji przepływającej kolumnę przemyto kolejno 40 ml buforu B (8 M mocznik, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 8,0), 40 ml buforu C (8 M mocznik, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 6,3). Rekombinowane białko FhaB2/3/His6 wymyto z kolumny 30 ml buforu D (8 M mocznik, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 6,3) zawierającego 500 mM imidazol i zbierano frakcje o objętości 3 ml. Jak przedstawiono na fig. 7, z kolumny wymyto wysoce wzbogacone białko FhaB-2/3/His6, migrujące około 154 kDa (oszacowana względna masa cząsteczkowa). Polipeptyd ten był reaktywny względem mysiego przeciwciała wytworzonego przeciw motywowi 5-histydyn. Podsumowując, dane te oznaczają, że FhaB2/3 może być eksprymowane i oczyszczone z rekombinowanych E. coli.

Immunizacja myszy rekombinowanym FhaB2/3/His

Częściowo oczyszczone rekombinowane białko FhaB2/3/His6 eksprymowane w E. coli wstrzyknięto trzykrotnie myszom Balb/C w dniach 0, 14 i 29 (10 zwierząt/grupę). Zwierzętom wstrzykiwano podskórnie około 5 μg antygenu w dwóch różnych preparatach: zaadsorbowanego na 100 μg AIPO₄ lub sformułowanego w emulsji SBA62 (emulsja SBA zawierała 5 μg MPL i 5 μg QS21 na dawkę). W doświadczeniu także uwzględniono grupę kontroli negatywnych obejmującą myszy immunizowane samą emulsją SBAS2. Od myszy pobrano krew w dniach 29 (15 dni po II) i 35 (6 dni po III) w celu wykrycia specyficznych przeciwciał przeciw-FhaB. Specyficzne przeciwciała przeciw-FhaB zmierzono w połączonych surowicach (od 10 myszy/grupę) metodą ELISA na oczyszczonym rekombinowanym FhaB2/3/His.

P r z y k ł a d 11: Aktywności blokowania adhezji mysich i króliczych surowic wytworzonych przeciw antygenom FHA, Hap i Hsf

Wcześniej opisano, że białka homologiczne do białek meningokokowych FHAB-podobnego, Hsf-podobnego i Hap-podobnego są istotną determinantą wirulencji i kierują adhezją bakterii Bordetella pertussis (FHA) i Haemophilus influenzae (Hap i Hsf). Wiadomo, że adhezja do komórek nabłonka i śródbłonka odgrywa kluczową rolę w kolonizacji przewodu nosowogardłowego oraz przejściu bariery krew-mózg przez meningokoki. Zatem oddziaływanie na adhezję N. meningitidis stanowi wartościowe podejście w kontrolowaniu kolonizacji i zakażenia przez meningokoki. Zbadano zatem czy surowice odpornościowe skierowane przeciw meningokokowym antygenom FHAB2/3, Hap-podobnemu i Hsfpodobnemu są w stanie wpływać na adhezję Neisseria meningitidis do komórek śródbłonka. Zastosowano następującą procedurę doświadczalną:

Hamowanie adhezji do HUVEC: badanym szczepem meningokoka zastosowanym w tym doświadczeniu była nieotoczkowa, nie wytwarzająca pilii, Opa- i Opc-pochodna szczepu NmA8013. Ko34

PL 220 107 B1 ₅ mórki meningokoków (2,10 x 10 jednostek tworzących kolonie (CFU) pochodnej NmA8013) inkubowano przez 30 minut w 37°C w pożywce zawierającej 400 μl RPMI, 50 μl płodowej surowicy cielęcej i 50 μl surowicy badanej pod względem właściwości blokowania adhezji. Następnie mieszaninę tą umieszczano w studzienkach zawierających konfluentne pojedyncze warstwy komórek śródbłonka żyły pępowinowej człowieka (HUVEC), których pożywkę hodowlaną wcześniej usunięto. Bakterie i komórki HUVEC inkubowano przez 4 godziny w 37°C, w 5% CO₂. Następnie pojedyncze warstwy komórek przemywano trzykrotnie świeżą pożywką RPMI z surowicą, a następnie zdrapywano z płytki. Następnie wyznaczono CFU związane z komórkami HUVEC przez seryjne rozcieńczenia i wysiewanie lizatu komórkowego na płytki GC. Następnie płytki inkubowano przez 48 godzin w 37°C aby umożliwić odtworzenie i wzrost meningokoków związanych z komórkami.

Aktywności blokowania adhezji mysich i króliczych surowic wytworzonych przeciw rekombinowanym antygenom FHAB2/3, Hap i hsf: przeciwciała przeciw-FHA 2/3, przeciw-Hsf pełnej długości (opisane w WO 99/58683) oraz przeciw-Hap pełnej długości (WO 99/55873), a także surowice skierowane przeciw odpowiednim domenom pasażerskim Hsf i Hap, zakłócały adhezję meningokoków do komórek HUVEC. Fig. 8 przedstawia, że specyficzne przeciwciała wytworzone przez FHA 2/3 sform ułowane w AIPO₄ były w stanie zahamować adhezję Neisseria meningitidis B do komórek HUVEC w porównaniu z samym adiuwantem. W porównaniu z samym adiuwantem SBAS2 (bez antygenu, grupa 4), przeciwciało przeciw-FHA 2/3 (preparat SBAS2) było nadal skuteczne, jednakże słabsze niż w AIPO₄. Sam adiuwant SBAS2 (bez antygenu) nie indukował przeciwciał zdolnych do zakłócania adhezji. W porównaniu z grupą 4, przeciwciała przeciw-Hap (grupa 1) mogą mieć niewielki wpływ hamujący. W grupie 5, gdy zbadano mieszaninę przeciwciał przeciw-FHA 2/3, przeciw-Hsf i przeciwHap, zahamowanie adhezji było silniejsze niż dla sa mego przeciwciała przeciw-FHA 2/3, co sugeruje synergistyczny efekt wywoływany przez przeciwciała przeciw-Hap i przeciw-Hsf. W drugim doświadczeniu hamowania (fig. 2), specyficzna królicza surowica odpornościowa skierowana przeciw-OMV na- deksprymującym Hsf (białko kandydat) była w stanie częściowo zahamować utrwalenie Neisseria meningitidis B na komórkach śródbłonka w porównaniu z negatywną kontrolą (grupa 3 względem 4). Wykazano, że ta surowica królicza zawierała bardzo wysokie miano specyficznych przeciwciał przeciw-Hsf. Przeciwciała przeciw rec Hsf (domena pasażerska Hsf i Hsf pełnej długości) także były w stanie hamować adhezję bakterii do komórek HUVEC. Było to prawdą zarówno dla surowic mysich (grupy 5-6), jak i króliczych (w mniejszym stopniu) (grupy 7-8). W drugim doświadczeniu, specyficzne przeciwciała przeciw-rec FHA 2/3 (grupa 1), wcześniej zbadane w pierwszym doświadczeniu, potwierdziły swój bardzo silny wpływ hamujący. Wyniki te wskazują, że te specyficzne antygeny (Hap, FHA2/3 i Hsf), samodzielnie lub w połączeniu, są interesującymi antygenami szczepionkowymi.

P r z y k ł a d 12: Ochronny wpływ rekombinowanych OMV w mysim modelu prowokacji

Kilka rekombinowanych OMV zbadano na myszach Balb/C pod względem ich ochronnego wpływu po letalnej prowokacji. Ten model immunizacji czynnej obejmował śródotrzewnowe wstrzyknięcie meningokoków z kilku szczepów (przeprowadzonych w zawiesinę w pożywce TSB pozbawionej żelaza) dorosłym myszom Balb/C lub myszom OF1 (w wieku 6-8 tygodni), po serii immunizacji drogą podskórną. Dekstran żelaza, zastosowany jako zewnętrzne źródło żelaza, wydawał się być niezbędny do utrzymania bakteremii i wywołania śmierci zakażonego zwierzęcia. Pomimo tego, że ten model IP okazał się być skuteczny do oznaczania wirulencji, ochrony immunologicznej i roli żelaza w zakażeniu, nie obejmował on fazy przejścia przez gardło, która poprzedza bakteremię i zapalenie opon u ludzi. Model ten stosowano do zbadania kilku kandydatów OMV nadeksprymujących NspA, TbpA lub Hsf. W poniższych doświadczeniach, myszy Balb/C (chów wsobny) lub OFl (hodowla niekrewniacza) immunizowano trzykrotnie w dniach 0, 14 i 28 drogą podskórną 3 (PV00N049) do 5 μg (doświadczenia PV00N035 i PV00N043) rekombinowanych OMV nadeksprymujących Hsf, NspA lub TbpA sformułowanych w Al(OH)₃ (100 μg Al(OH)₃/zwierzę) (PV00N035 i PV00N043) lub AIPO4 (100 μg AlPO₄/zwierzę). Następnie od zwierząt pobierano krew w dniach 28 (dzień 14 po II) i 35 (dzień 7 po III) w celu oszacowania specyficznych Ab. Dnia 35 wstrzyknięto śródotrzewnowo 10 mg dekstranu żelaza na godzinę przed przeprowadzeniem prowokacji. Prowokacje przeprowadzono szczepami H44/76 (B:15:P1.7,16) lub CU-385 (B:4:P1.19,15) przy około 1,10 x 10⁵ CFU/zwierzę (dokładne dawki prowokacji, patrz tabela wyników). Heterologiczny szczep pochodzący ze szczepu CU-385 był silniejszy niż szczep homologiczny. Śmiertelność notowano w dniach 1 do 5. Poniższa tabela 1 ilustruje, że przy porównaniu z OMV porA(-) oraz z OMV porA(+) w mniejszym stopniu, zaobserwowano lepszą ochronę dla OMV TbpA(+) (1/10 i 3/5 dla porA(-) oraz 9/10 i 3/5 dla porA(+)), OMV NspA(+) (4/10 i 4/5) oraz OMV Hsf(+) (3/10, 2/10 i 3/5). Na podstawie tych trzech doświadczeń można wysnuć taką ogólną

PL 220 107 B1 obserwację. Dane te potwierdzają, że antygeny TbpA, Hsf i NspA, eksprymowane na powierzchni pęcherzyków, są interesujące z punktu widzenia przyszłej szczepionki przeciw menB.

T a b e l a 1: Aktywność ochronna w mysim modelu rekombinowanych pęcherzyków błony zewnętrznej.

W tabeli podsumowano wyniki uzyskane podczas doświadczeń (PV00N35, PV00N043 i PV00N049)

OMV (pęcherzyki)

Rekombinowane OMV (tło H44/76 = porA P1.17,16)	Współczynnik przeżycia (dnia) Czynna ochrona myszy	Przeciwciała immunospecyficzne Metodą Elisa Średnia tylko PV00N049
PV00N035 w myszach OF1	PV00N043 w myszach Balb/C	PV00N049 w myszach OF1
Szczep prowokujący (+)
H44/76 (B:15:P1.7 1,27	H44/76 (B:15:P1.7. 1,0	CU-385 (B:4:P1.19,1 1,1
OMV porA(-)	1/10	0/10	1/5	/
OMV porA(+)	2/10	9/10	4/5	/
OMV TbpA porA(+)	NB	9/10	3/5	<
OMV TbpA porA(-)	NB	1/10	3/5	<
OMV NspA porA(-)	1/10	4/10	4/5	155-(<
OMV Hsf porA(-)	3/10	2/10	3/5	7802-(5496)
OMV Hsf porA(+)	NB	9/9	NB	/
Bez antygenu	0/10	0/10	1/5	/

NB : nie badano

P r z y k ł a d 13: Ochronny wpływ rekombinowanych antygenów podjednostkowych w modelu prowokacji myszy

Kilka rekombinowanych oczyszczonych białek zbadano na myszach Balb/C pod względem ich ochronnego wpływu po letalnej prowokacji. Ten model immunizacji czynnej obejmował śródotrzewnowe wstrzyknięcie meningokoków z kilku szczepów (przeprowadzonych w zawiesinę w pożywce TSB pozbawionej żelaza) dorosłym myszom Balb/C lub myszom OF1 (w wieku 6-8 tygodni), po serii immunizacji drogą podskórną.

Dekstran żelaza, zastosowany jako zewnętrzne źródło żelaza, wydawał się być niezbędny do utrzymania bakteremii i wywołania śmierci zakażonego zwierzęcia. Pomimo tego, że ten model IP okazał się być skuteczny do oznaczania wirulencji, ochrony immunologicznej i roli żelaza w zakażeniu, nie obejmował on fazy przejścia przez gardło, która poprzedza bakteremię i zapalenie opon u ludzi. Model ten stosowano do zbadania kilku podjednostkowych kandydatów na szczepionki przeciw menB, takich jak rekombinowane cząsteczki FrpC, TbpA, FHA2/3 i Hap.

W tym doświadczeniu, myszy OF1 (hodowla niekrewniacza) immunizowano trzykrotnie w dniach 0, 14 i 28 drogą podskórną 5 μg (PV00N050) tych białek sformułowanych na AIPO₄ (100 μg) lub w obecności 10 μg MPL (na zwierzę).

Następnie od zwierząt pobierano krew w dniach 28 (dzień 14 po II) i 35 (dzień 7 po III) w celu oszacowania specyficznych Ab i poddano je prowokacji dnia 35. W dniu prowokacji śródotrzwenowo wstrzyknięto 10 mg dekstranu żelaza na godzinę przed przeprowadzeniem prowokacji. Prowokacje przeprowadzono szczepami CU-385 (B:4;P1.19,15), które były heterologiczne w tym przypadku, a w rzeczywistości sekwencja antygenów pochodziła ze szczepu H44/76 (B:15:P1.7,16), za wyjątkiem TbpA, którego sekwencja pochodziła ze szczepu B16B6 (B:2a:P1.2).

Wyniki przedstawione w tabeli 2 wykazują, że FrpC, TbpA, FHAB2/3, Hap indukowały znaczną ochronę w tym modelu: od 2 do 4 z pięciu myszy przeżyło po prowokacji, w porównaniu z tylko 1/5 myszy, które przeżyły przy zastosowaniu samego adiuwantu. We wszystkich grupach, za wyjątkiem jednej, miano specyficznych przeciwciał było wysokie (miano specyficznych przeciwciał przeciw-TbpA było średnio wysokie). Wszystkie te dane potwierdzają, że FrpC, FrpA, konserwatywna domena FrpA/C, TbpA, FHA2/3, Hap obecne jako antygeny podjednostkowe, samodzielnie lub w połączeniu, są interesujące z punktu widzenia opracowania szczepionki przeciw menB.

PL 220 107 B1

T a b e l a 2: Aktywność ochronna w mysim modelu rekombinowanych pęcherzyków błony zewnętrznej.

W tabeli podsumowano wyniki uzyskane podczas jednego doświadczenia (PV00N050).

Antygeny podjednostkowe

Rekombinowane antygeny podjednostkowe (z H44/76, sekwencja Ag)	Współczynnik przeżycia (piątego dnia) Model czynnej ochrony myszy	Przeciwciała immunospecyficzne Metodą Elisa Średnia - (GMT)
PV00N050 (w myszach OF1)
Szczep którym prowokowano (+ dawka)
CU-385 (B:4:P1.19,15) 1,4 x 107
FrpC traktowany Ca2++	3/5	31477-(27068)
FHAB 2/3 sfałdowany	2/5	98200-(73220)
FHAB 2/3 nie sfałdowany	3/5	55939-(35347)
Hap N-końcowa	4/5	9960-(12811)
RecTbpa na SBAS4	3/5	875-(520)
SBS4	1/5	/

P r z y k ł a d 14: Sposób wykazujący synergistyczne działanie antygenów szczepionkowych w połączeniach

Różne dostępne rekombinowane OMV (OMV porA(+)rmp-LbpB, OMV porA(-)TbpA(+)Hsf(+), OMV porA(-)TbpA(+), OMV porA(-) NspA(+), OMV porA(-)Hsf(+), OMV porA(-)TbpA(+)NspA(+)) można zbadać samodzielnie lub w połączeniu w celu wyznaczenia statystycznie najlepszych połączeń, pod względem wykrycia synergistycznego działania takich połączeń w kandydatach szczepionek. Doświadczenia te można także przeprowadzić z połączeniami antygenów podjednostkowych, a także połączeniami antygenów podjednostkowych i rekombinowanych OMV. 32 grupom po 5 myszy OF1/grupę można wstrzyknąć badane preparaty i zbadać aktywność bakteriobójczą i aktywność opsoninową surowicy, czynną i bierną ochronę w modelu mysim (jeżeli konieczne będzie stosowanie suboptymalnych ilości poszczególnych antygenów). Wskazaniem synergistycznych połączeń antygenów jest fakt, że poziom odpowiedzi ochronnej nadawanej po immunizacji połączonym preparatem jest wyższy niż dla sumy poszczególnych antygenów.

P r z y k ł a d 15: Analiza zawartości Hsf i TbpA w pęcherzykach błony zewnętrznej

SDS-PAGE z barwieniem błękitem Coommassie μg białka w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej z podwyższoną ekspresją Hsf lub TbpA lub zarówno Hsf, jak i TbpA, rozcieńczono w buforze do próbek zawierającym β-merkaptoetanol i ogrzewano w 95°C przez 10 minut. Następnie próbki naniesiono na poliakrylamidowy żel SDS-PAGE (Novex 4-20% Tris-glicyna 1,5 mm 2Dwell SDS Page), wybarwiono w błękicie Coomassie przez godzinę i odbarwiono kilkukrotnie płucząc w odbarwiaczu. Wyniki przedstawiono na fig. 9, która pokazuje, że poziomy Hsf i TbpA były znacząco wyższe w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej, pochodzących z N. meningitidis w których podwyższono ich poziom ekspresji.

P r z y k ł a d 16: Immunogenność OMV z podwyższoną ekspresją Hsf i/lub TbpA

Grupy po 20 myszy immunizowano trzy razy OMV drogą domięśniową w dniach 0, 21 i 28. Każde szczepienie przeprowadzano 5 μg (zawartość białka) OMV sformułowanych na AIPO₄ z MPL. OMV pochodzi ze szczepu H44/76 N. meningitidis tak zmodyfikowanego technikami inżynierii genetycznej, aby ekspresja polisacharydów oraz PorA była obniżona. Porównano wyniki z OMV w których była podwyższona ekspresja Hsf, TbpA, zarówno Hsf, jak i TbpA lub żadnego z nich. Dnia 41 pobrano próbki krwi do analizy ELISA oraz testu bakteriobójczości surowicy.

ELISA do wykrywania przeciwciał przeciw Hsf

96-Studzienkowe płytki do mikromianowania (Nunc, Maxisorb) powleczono przez noc w 4°C 100 μl 1 μ/ml specyficznego antygenu w PBS. Po przemyciu NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%, płytki wysycano 100 μl PBS-BSA 1% z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Pomiędzy każdym etapem (przeprowadzanym z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 30 minut z PBSBSA 0,2% jako buforem rozcieńczającym), nadmiar odczynników usuwano przez przemycie NaClPL 220 107 B1

Tween 20. Do każdej mikrostudzienki dodano po 100 μl rozcieńczonych próbek surowicy. Związane przeciwciała rozpoznano przy pomocy biotynylowanych przeciwciał przeciw mysiej Ig (Prosan) (1/2000). Kompleks antygen-przeciwciało uwidoczniono przez inkubację z koniugatem streptawidynabiotynylowana peroksydaza (Amersham) (1/4000). Ortofenylenodiaminę/H₂O₂ (4 mg/10 ml bufor cytrynianowy 0,1 M, pH 4,5, +5 μl H₂O₂) zastosowano do wywołania testu. Płytki inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności do czasu zatrzymania reakcji przez dodanie 50 μl 1N HCl. Absorbancję odczytywano przy 490 nm.

	Miano środkowe (na połączonych surowicach)
g1, pęcherzyki TbpA-HSF, IM	15471
g2, pęcherzyki TbpA, IM	15,41
g3, pęcherzyki HSF, IM	14508
g4, pęcherzyki CPS(-)PorA(-), IM	-
g5, MPL/AIPO4, IM	-

Wyniki przedstawione w powyższej tabeli pokazują, że wysokie i równoważne miana przeciwciał przeciw Hsf zostały wytworzone przez zaszczepienie OMV z podwyższoną ekspresją Hsf lub zarówno Hsf, jak i TbpA. Praktycznie nie można było wykryć przeciwciał przeciw Hsf w surowicach wytworzonych po zaszczepieniu samym adiuwantem lub OMV, w których ani Hsf, ani TbpA nie miały podwyższonej ekspresji lub OMV, w których tylko TbpA miało podwyższoną ekspresję.

P r z y k ł a d 17: Aktywność bakteriobójcza surowicy odpornościowej wytworzonej przeciw OMV z podwyższoną ekspresją Hsf i/lub TbpA

Aktywność bakteriobójczą surowicy pobranej od myszy szczepionych OMV z podwyższoną ekspresją Hsf, TbpA, zarówno Hsf, jak i TbpA lub bez podwyższenia ich ekspresji porównano w testach z zastosowaniem homologicznego szczepu H44/76 lub heterologicznego szczepu Cu385. Test bakteriobójczości surowicy wykazał dobrą korelację z ochroną przed zakażeniem, a zatem jest dobrym wskazaniem tego jak skuteczny będzie badany preparat w wywoływaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej.

Szczepy typu dzikiego Neisseria meningitidis grupy serologicznej B (szczep H44/76 = B:15 P1.7,16 L3,7,9 i szczep CU385 = B:4 P1.19,15 L3,7,9) hodowano na szalkach Petriego z pożywką MH + 1% Polyvitex + 1% surowicy końskiej w 37°C + 5% CO₂. Podhodowle prowadzono przez 3 godziny w ciekłej pożywce TSB wzbogaconej 50 μM Desferal (związek chelatujący żelazo) w 37°C z wytrząsaniem do momentu osiągnięcia gęstości optycznej około 0,5 przy 470 nm.

Połączone lub poszczególne surowice osobno inaktywowano przez 40 minut w 56°C. Próbki surowicy rozcieńczono do 1/100 w HBSS-BSA 0,3%, a następnie wykonano kolejne dwukrotne rozcieńczenia (8 rozcieńczeń) w 50 μl w mikropłytkach z okrągłym dnem.

Bakterie o odpowiednim OD rozcieńczono w HBSS-BSA 0,3% do 1,3 x 10⁴ CFU na ml. 37,5 μl tego rozcieńczenia dodano do rozcieńczeń surowicy i mikropłytki inkubowano przez 15 minut w 37°C z wytrząsaniem. Następnie do każdej studzienki dodano 12,5 μl dopełniacza królika. Po 1 godzinie inkubacji w 37°C z wytrząsaniem mikropłytki umieszczono na lodzie aby zatrzymać uśmiercanie bakterii.

Metodą „przechylania” 20 μl z każdej studzienki wysiano na płytki Petriego z pożywką MH + 1% Polyvitex + 1% surowicy końskiej i inkubowano przez noc w 31°C + CO₂. Obliczono CFU i wyznaczono procent uśmiercania bakterii. Mianem bakterio bójczości surowicy było ostatnie rozcieńczenie dające > 50% uśmiercania bakterii.

	H44/76	CU385
OMV	GMT	% odpowiadających	GMT	% odpowiadających
CPS(-)PorA(-)	93	30%	58	5%
CPS(-)PorA(-)Hsf	158	40%	108	20%
CPS(-)PorA(-)TbpA	327	60%	147	30%
CPS(-)PorA(-)Hsf-TbpA	3355	100%	1174	80%

PL 220 107 B1

Wyniki podobne do przedstawionych powyżej uzyskano w dwóch innych podobnych doświadczeniach.

Spektakularny wzrost mian bakteriobójczych (GMT) przeciw szczepowi homologicznemu i szczepowi heterologicznemu zaobserwowano po zaszczepieniu OMV w których zarówno Hsf, jak i TbpA były podwyższone. Dla porównania, bakteriobójcze GMT zmierzone u myszy zaszczepionych OMV z podwyższoną ekspresją Hsf lub TbpA były podobne do uzyskanych u myszy szczepionych kontrolnymi OMV.

Zalety podwójnego podwyższenia ekspresji można było także zaobserwować w procencie myszy wytwarzających istotny poziom przeciwciał bakteriobójczych (miana wyższe niż 1/100), w szczególności w doświadczeniach z zastosowaniem szczepu heterologicznego.

P r z y k ł a d 18: Wpływ zmieszania surowic przeciw-Hsf i przeciw-TbpA na aktywność bakteriobójczą

Grupy po 20 myszy immunizowano trzy razy OMV drogą domięśniową w dniach 0, 21 i 28. Każde szczepienie przeprowadzano 5 μg (zawartość białka) OMV sformułowanych na AIPO₄ z MPL. OMV pochodzi ze szczepu H44/76 N. meningitidis tak zmodyfikowanego technikami inżynierii genetycznej, aby ekspresja polisacharydów oraz PorA była obniżona. Jedną grupę myszy immunizowano kontrolnymi OMV w których brak było podwyższenia ekspresji białek. W drugiej grupie podwyższona była ekspresja Hsf, w trzeciej grupie podwyższona była ekspresja TbpA, a w czwartej grupie podwyższona była ekspresja zarówno Hsf, jak i TbpA.

Surowice połączono stosując surowice od myszy z tej samej grupy lub mieszając surowice wyizolowane z grupy, w której podwyższone było samo Hsf lub samo TbpA. Aktywność bakteriobójczą surowicy zmierzono w każdej z połączonych surowicy i wyniki przedstawiono w tabeli poniżej.

SBA przeprowadzony na połączonych surowicach myszy immunizowanych	Miano SBA
Pęcherzykami TbpA-Hsf	774
Pęcherzykami ThpA	200
Pęcherzykami Hsf	50
Pęcherzykami CPS(-)PorA(-)	50
Mieszanina surowic przeciw-TbpA + przeciw-Hsf	1162

Wyniki w powyższej tabeli pokazują, że zmieszanie surowic przeciw-Hsf i przeciw-TbpA wywołało znacznie wyższą aktywność bakteriobójczą surowicy niż ta uzyskana dla każdej z surowic odpornościowych pojedynczo. Wydaje się, że synergistyczny efekt jest uzyskiwany przez obecność przeciwciał przeciw zarówno Hsf, jak i TbpA.

P r z y k ł a d 19: Skrócone białka Hsf można połączyć synergistycznie z TbpA

Serię skróconych konstruktów Hsf skonstruowano stosując standardowe procedury biologii molekularnej. Obejmowały one konstrukt kodujący aminokwasy 1 do 54, który zawiera sekwencję sygnałową Hsf oraz aminokwasy 134 do 592 Hsf (Tr1Hsf). Drugie skrócone Hsf zawierało aminokwasy 1-53 sekwencji sygnałowej Hsf, a następnie aminokwasy 238-592 Hsf (Tr2Hsf). Te dwa skrócone konstrukty Hsf oraz pełnej długości Hsf wprowadzono do szczepu MC58 N. meningitidis B siaD-, Opc-, PorAtak, że ich ekspresja była podwyższona i wytworzono pęcherzyki błony zewnętrznej stosując sposoby opisane powyżej.

Preparaty pęcherzyków błony zewnętrznej zaabsorbowano na Al(OH)₃ i wstrzyknięto myszom dnia 0, 21 i 28. Dnia 42 od myszy pobrano krew i przygotowano surowice. Surowice zmieszano z surowicami uzyskanymi od myszy zaszczepionych OMV z podwyższoną ekspresją TbpA i przeprowadzono testy bakteriobójczości surowicy w sposób opisany powyżej.

Wyniki

	Miana bakteriobójczości surowicy
Grupa	H44/76	CU385
MC58 PorA+siaD+	25600	25600
MC58 PorA-siaD-Hsf	1530	800
MC58 PorA-siaD-Tr1Hsf	1015	1360

PL 220 107 B1

MC58 PorA-siaD-Tr2Hsf	50	50
Kontrola negatywna	50	50
TbpA + MC58 PorA+siaD+	25600	24182
TbpA + MC58 PorA-siaD-Hsf	2595	1438
TbpA + MC58 PorA-siaD-TrlHsf	4383	2891
TbpA + MC58 PorA-siaD-Tr2Hsf	1568	742
TbpA + kontrola negatywna	778	532

Wyniki przedstawione powyżej wykazują, że pierwsza postać skrócona (Tr1 Hsf) wywołuje odpowiedź immunologiczną, która może być połączona z surowicą odpornościową przeciw TbpA z wytworzeniem wyższej aktywności bakteriobójczej surowicy niż przy stosowaniu Hsf pełnej długości. Jednakże rozmiar skrócenia jest także ważny i skrócenie wytworzone w Tr2 miało działanie szkodliwe w porównaniu z pełnej długości Hsf. Podwyższoną aktywność bakteriobójczą Tr1Hsf obserwowano względem obydwu stosowanych szczepów.

P r z y k ł a d 20: Aktywność bakteriobójcza surowicy z przeciwciałami przeciw TbpA, Hsf i trzeciemu białku meningokokowemu.

Szczep H66/76 N. meningitidis w którym obniżona jest ekspresja PorA i polisacharydów otoczkowych, jak opisano powyżej, zastosowano jako szczep podstawowy do podwyższenia ekspresji TbpA i Hsf, LbpB, D15, PilQ lub NspA, z zastosowaniem procedury opisanej powyżej. Pęcherzyki błony zewnętrznej przygotowano z każdego ze szczepów, jak opisano powyżej. Rekombinowane FhaB, FrpC, FrpA/C i Hap wytworzono dobrze znanymi technikami, takimi jak opisane w PCT/EP99/02766, WO 92/01460 i WO 98/02547.

Preparaty pęcherzyków błony zewnętrznej oraz rekombinowane białka absorbowano na Al(OH)₃ i wstrzyknięto myszom dnia 0, 21 i 28. Dnia 42 od myszy pobrano krew i przygotowano surowice. Surowice przeciw OMV z podwyższoną ekspresją TbpA i Hsf zmieszano z surowicami od myszy szczepionych OMV z podwyższoną ekspresją LbpB, D15, PilQ lub NspA lub rekombinowanymi FhaB, FrpC, FrpA/C lub Hap i przeprowadzono testy bakteriobójczości surowicy w sposób opisany powyżej.

Wyniki

Wyniki przedstawiono w tabeli poniżej. W testach z zastosowaniem homologicznego szczepu H44/76 dodanie przeciwciał przeciw trzeciemu antygenowi meningokokowemu, za wyjątkiem FrpC, nie wytworzyło miana bakteriobójczości surowicy wyższego niż miano wytwarzane przy pomocy przeciwciał przeciw samym TbpA i Hsf.

Jednakże, dodanie przeciwciał przeciw trzeciemu antygenowi było korzystne w testach bakteriobójczości surowicy przy zastosowaniu szczepu heterologicznego. Przeciwciała przeciw D15 (OMP85), Hap, FrpA/C i LbpB były szczególnie skuteczne w podwyższenia miana bakteriobójczości surowicy przeciw szczepowi CU385.

	Miano bakteriobójczości surowicy
Mieszanina surowic odpornościowych	H44/76	CU385
przeciw-TbpA-Hsf i surowica nie odpornościowa	5378	2141
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-FHA	5260	2563
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-Hap	4577	5150
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-FrpA/C	5034	4358
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-LbpB	5400	4834
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-D15	4823	4657
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-PilQ	4708	2242
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-NspA	4738	2518
przeciw-TbpA-Hsf i przeciw-FrpC	6082	2300

PL 220 107 B1

P r z y k ł a d 21: Wpływ FrpB KO w pęcherzykach błony zewnętrznej na ich zdolność do wywoływania bakteriobójczej od powiedzi immunologicznej w szczepach homologicznych i heterologicznych.

Dwa szczepy H44/76 N. meningitidis zastosowano do przygotowania preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej, jak opisano w WO 01/09350, przy zastosowaniu ekstrakcji 0,1% DOG, tak że zawartość LOS wynosiła około 20%. Szczep B1733 jest siaD(-), PorA(-), ma nadekspresję Tr1 Hsf (przykład 19) i nokaut IgtB. Szczep B1820 B1733 jest siaD(-), PorA(-), ma nadekspresję Tr1 Hsf, nokaut IgtB i także nokaut FrpB. Obydwa szczepy hodowano w pożywce wzbogaconej 60 μM Desferal, tak aby białka regulowane przez żelazo, takie jak LbpA/B i TbpA/B miały podwyższoną ekspresję.

Preparaty pęcherzyków zaadsorbowano na Al(OH)₃ i 5 μg wstrzyknięto domięśniowo grupom po 30 myszy dnia 0 oraz dnia 21. Próbki krwi pobrano dnia 28.

Testy bakteriobójczości surowicy przeprowadzono na trzech szczepach L3 (homologicznym szczepie typu dzikiego H44/76 oraz dwóch heterologicznych szczepach L3; NZ124 i M97250687), jak opisano w przykładzie 17.

Wyniki

Pęcherzyki zastosowane do zaszczepienia	H44/76	M97250687	NZ124
GMT	SC	GMT	SC	GMT	SC
B1733	1518	30/30	151	11/30	70	4/29
B1820	781	19/30	1316	24/30	276	19/30

GMT oznacza geometryczną średnią miana surowicy w SBA.

SC oznacza liczbę myszy przechodzących serokonwersję (miano SBA > 1/100).

Wyniki wyraźnie pokazują, że pęcherzyki FrpB KO (B1820) wywołują lepszą heterologiczną krzyżową odpowiedź bakteriobójczą niż pęcherzyki FrpB(+) (B1733). Miana SBA były wyższe i większa część myszy przeszła serokonwersję dla szczepów M97250687 i NZ124. Wyniki w szczepie homologicznym nie były takie dobre gdy FrpB zostało wydeletowane.

Dane te sugerują, że FrpB kieruje odpowiedzią immunologiczną, jednakże ze względu na to, że to białko błony zewnętrznej jest wysoce zmienne, przeciwciała przeciw temu białku są w stanie wywołać uśmiercanie bakterii szczepu homologicznego.

Claims (14)

1. Preparat immunogenny, znamienny tym, że zawiera antygeny Neisseria:

a) GNA1870,

b) Hsf lub NadA; oraz

c) TbpA lub Lipo28.

2. Preparat immunogenny według zastrz. 1, znamienny tym, że ten preparat zawiera preparat podjednostkowy i preparat pęcherzyków błony zewnętrznej.

3. Preparat immnunogenny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wszystkie antygeny pochodzą z N. meningitidis.

4. Preparat immunogenny według zastrz. 3, znamienny tym, że wszystkie antygeny pochodzą z N. meningitidis grupy serologicznej B.

5. Preparat immunogenny według zastrz. 1-4, znamienny tym, że zawiera ponadto jeden lub większą liczbę bakteryjnych polisacharydów lub oligosacharydów otoczki.

6. Preparat immunogenny według zastrz. 5, znamienny tym, że polisacharydy lub oligosacharydy otoczki pochodzą z Neisseria meningitidis grupy serologicznej A, C, Y i/lub W-135.

7. Preparat immunogenny według zastrz. 1-6, znamienny tym, że zawiera ponadto adiuwant.

8. Preparat immunogenny według zastrz. 7, znamienny tym, że adiuwant stanowi sól glinu.

9. Preparat immunogenny według zastrz. 8, znamienny tym, że sól glinu stanowi żel wodorotlenku glinu.

10. Preparat immunogenny według zastrz. 1-9, znamienny tym, że zawiera GNA1870, Hsf i TbpA.

PL 220 107 B1

11. Preparat immunogenny według zastrz. 1-9, znamienny tym, że zawiera GNA1870, NadA i Lipo28.

12. Szczepionka zawierająca składnik czynny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako składnik czynny zawiera preparat immunogenny zdefiniowany w zastrz. 1-11.

13. Zastosowanie szczepionki zdefiniowanej w zastrz. 12 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zakażenia wywołanego przez Neisseria.

14. Szczepionka zdefiniowana w zastrz. 12 do stosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia wywołanego przez Neisseria.