PT1678212E - Sacáridos capsulares meningocócicos hipo- e hiperacetilados - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "SACÁRIDOS CAPSULARES MENINGOCÓCICOS HIPO- E HIPER- ACETILADOS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção insere-se no campo dos sacáridos capsulares meningocócicos e seus derivados conjugados.

TÉCNICA ANTERIOR

Os polissacáridos são moléculas biológicas importantes e têm sido largamente usados na indústria farmacêutica para a prevenção e tratamento de doenças. Por exemplo, os polissacáridos capsulares têm sido usados desde há vários anos em vacinas contra bactérias capsuladas, tais como meningococos (Neisseria meningitidis) , pneumococos (Streptococcus pneumoniae) e Hib (Haemophilus influenzae type B) .

Para aumentar a imunogenicidade dos polissacáridos capsulares, particularmente nas crianças, foram desenvolvidas as vacinas conjugadas. Estas compreendem um sacárido capsular conjugado com uma proteína transportadora [por ex., refs. 1-3]. A conjugação converte antigénios T-independentes em antigénios T-dependentes. 0 sacárido capsular do serogrupo W125 da Neisseria meningitidis ("MenW135") compreende um polímero de unidades de dissacárido ácido siálico-galactose: —»4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—>6) -D-Gal-a-(1—» onde "Neu" se refere ao ácido neuramínico, geralmente conhecido como ácido siálico.

Semelhantemente, o sacárido capsular do serogrupo Y da Neisseria meningitidis (MenY) comprende um polímero de unidades de dissacárido ácido siálico-glucose: —>4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-a-(2—>6 ) -D-Glc-a-(1—» 2

Na natureza, estes sacáridos capsulares têm sido encontrados O-acetilados em algumas das posições 7 e 9 de alguns dos resíduos de ácido siálico. A O-acetilação do sacárido W135 foi "descrita pela primeira vez" na referência 4, onde se descreveu a O-acetilação nas posições 0-7 e 0-9. A acetilação nas posições 0-7 e 0-9 também foi observada no sacárido do serogrupo Y, apesar de os autores terem notado que trabalhos prévios tinham indicado 0-acetilação nas posições 0-7, 0'-3 ou 0'-4. Mais estudos sobre o conteúdo 0-acetil dos sacáridos foram descritos na referência 5. A referência 5 descreve que "existe um crescente conjunto de evidências que indica que a 0-acetilação não é importante para provocar uma resposta protetora de anticorpos", para o serogrupo W135. Em contraste, a referência 6 descreve que "há evidências que a 0-acetilação afeta a imunogenicidade das vacinas polisacarídicas". No pressuposto de que "a O-acetilação do CPS (polissacárido capsular) pode não ser importante em provocar imunidade protetora", contudo, os autores da referência 5 investigaram a acetilação no serogrupos W135 e Y. Entre os seus resultados, não se observou alteração na O-acetilação para estes dois serogrupos após armazenamento em condições básicas durante 9 dias à temperatura ambiente. A referência 7 descreveu que "o estado da O-acetilação das estirpes W135 e Y" usado em vacinas polisacarídicas tetravalentes "não foi descrito" anteriormente. Os autores prosseguiram na referência 8 para descrever que "pouco se conhece sobre o estado de O-acetilação dos serogrupos W135 e Y" e eles afirmaram que trabalho adicional "pode fornecer perspetivas úteis na formulação ideal de vacinas", apesar da natureza de tal trabalho adicional e das perspetivas possíveis não terem sido explicadas. A referência 9 descreve que "a relevância da O-acetilação para o desenvolvimento das vacinas continua incerta" para o 3 serogrupo W135. A referência 6 concorda que os dados "do impacto da O-acetilação na imunogenicidade dos polissacáridos dos serogrupos W135 e Y ainda não estão disponíveis" (Janeiro de 2004).

Esta confusão e falta de informação para os serogrupos W135 e Y contrastam com os outros dois serogrupos para os quais as vacinas de sacáridos são atualmente usadas. A variação na O-acetilação do polissacárido capsular do serogrupo C da Neisseria meningitidis tem sido vastamente descrita [10,11], mas parece não ter qualquer tipo de impacto negativo na imunogenicidade, visto que os produtos Menjugate e NeisVac-C sao ambos eficazes. Em contraste, a des-O-acetilação do polissacárido do serogrupo A tem sido associada a uma "dramática redução na imunogenicidade" [12] . É um objeto da invenção fornecer derivados de sacáridos capsulares que possam ser usados para fazer composições imunogénicas, particularmente quando conjugados a proteínas transportadoras e particularmente para serogrupos meningocócicos W135 e Y.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Apesar da incerteza no que diz respeito ao papel da 0-acetilação nas vacinas para os serogrupos meningocócicos W135 e Y, os inventores descobriram que a O-acetilação pode mesmo ser relevante, particularmente durante a preparação de vacinas conjugadas. A invenção baseia-se na descoberta de que sacáridos capsulares modificados derivados de MenW135 e McnY que tenham níveis alterados de O-acetilação nas posições 7 e 9 dos resíduos de ácido siálico, possam ser usados para fazer composições imunogénicas. Relativamente a sacáridos nativos não modificados, os derivados da invenção são preferencialmente selecionados durante a conjugação com proteínas transportadoras. Além 4 disso, os conjugados destes derivados mostram uma melhoria da imunogenicidade comparada com os polissacáridos nativos.

Sacáridos modificados

Deste modo a invenção fornece um sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 modificado de acordo com a reivindicação 1. Da mesma forma, a invenção fornece um sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y modificado de acordo com a reivindicação 2.

Sacáridos da invenção

De um modo geral, a invenção fornece um sacárido capsular meningocócico modificado, conjugado com uma proteína transportadora, onde o sacárido compreende n ou mais unidades repetidas da unidade do dissacárido { [ácido siálico] - [hexose] } onde a hexose é ou galactose ou glucose e n é um número inteiro de 1 a 100, e onde (a) x% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 7, e/ou (b) quando a hexose é galactose, y% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são 0-acetilados na posição 9 e quando a hexose é glucose, y% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetiladas na posição 9. 0 valor de x está entre 2-9. O valor de y está entre 35-55.

Preferivelmente, x>m, onde m é selecionado entre: 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8.

Preferivelmente o ácido siálico é ácido N-acetil neuramínico.

Quando a hexose é galactose, a unidade do dissacárido {[ácido siálico] - [hexose]} é preferivelmente: —>4) -D-Neup5Ac ( 7/ 90Ac) -a- (2—>6) -D-Gal-a- (1—>

Quando a hexose é glucose, a unidade do dissacárido { [ácido siálico] - [hexose] } é preferivelmente: 5 —>4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-α-(2-6)-D-Glc-α-(1—» 0 sacárido capsular meningocócico modificado está conjugado com uma proteína transportadora. Em tais conjugados: (i) entre 2-9%, preferencialmente entre 4-8%, mais preferencialmente entre 5-7%, e ainda mais preferível de cerca de 6% dos resíduos de ácido siálico são 0-acetilados na posição 7; (ii) entre 35-55%, preferencialmente entre 40-50%, mais preferível entre 42-46%, ainda mais preferível cerca de 43% (quando a hexose é Gal) ou cerca de 45% (quando a hexose é Glc) de resíduos de ácido siálico são O-acetilados na posição 9. A invenção também fornece uma composição que compreende a moléculas do sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135, onde o número médio de resíduos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular é b, e onde: (a) x% dos resíduos a-b de ácido siálico do serogrupo W135 presentes na composição são O-acetilados na posição 7; e/ou (b) y% dos resíduos a-b de ácido siálico do serogrupo W135 presentes na composição são O-acetilados na posição 9, e onde x e y são como foram definidos acima. A invenção também fornece uma composição que compreende a moléculas do sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y, onde o número médio de resíduos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular é b, e onde: (a) <x% dos resíduos a-b de ácido siálico do serogrupo Y presentes na composição são O-acetilados na posição 7; e/ou (b) y% dos resíduos a-b de ácido siálico do serogrupo Y presentes na composição são O-acetilados na posição 9, e onde x e y são como foram definidos acima.

Os sacáridos nas referidas populações podem ser conjugados com proteínas transportadoras e/ou estarem livres em solução. Preferencialmente os sacáridos ou conjugados da invenção estão na forma purificada, por exemplo, substancialmente na ausência de polissacárido nativo. 6

Representações estruturais

Esta invenção também fornece um sacárido conjugado com uma proteína transportadora, contendo n ou mais repetições da seguinte unidade dissacarídica:

Onde: - n é um número inteiro entre 1 e 100, - X e Y são diferentes grupos selecionados de -H e - OH, - R1 é independentemente selecionado de -H e -COCH3 e pode ser o mesmo ou diferente em cada unidade dissacarídica - R2 é independentemente selecionado de -H e -COCH3 e pode ser o mesmo ou diferente em cada unidade dissacarídica, e quando - X é -OH e Y é -H, (a) x% de R1 são -COCH3 e/ou (b) y% de R2 são -C0CH3 - X é -H e Y é -OH, (a) x% de R1 são -COCH3 e/ou (b) y% de R2 são -COCH3.

Preferencialmente, x>m, quando m é como acima definido.

Os sacáridos estão conjugados com uma proteína transportadora.

Quando o sacárido está conjugado com uma proteína transportadora e X é -OH e Y é -H: (a)x é 2-10, preferivelmente cerca de 4-8, mais preferivelmente cerca de 5-7, ainda mais preferivelmente cerca de 6 e/ou (b) y é 35-55, preferencialmente cerca de 40-50, mais 7 preferencialmente cerca de 42-44, ainda mais preferível cerca de 43.

Quando o sacárido está conjugado com uma proteína transportadora e X é -OH e Y é -H: (a)x é 2-9, preferivelmente cerca de 4-8, mais preferivelmente cerca de 5-7, ainda mais preferivelmente cerca de 6 e/ou (b) y é 35-55, preferencialmente cerca de 40-50, mais preferencialmente cerca de 42-46, ainda mais preferível cerca de 45. 0 estado de O-acetilação dos resíduos de ácido siálico nas posições 7 e 9 em sacáridos e conjugados da invenção pode ser medido usando RMN de protões 1D e 2D, como abaixo descrito. HPAEC pode ser usado para medir a O-acetilação total, mas não consegue distinguir entre diferentes posições [234] . EM de ionização por spray tem sido usada para analisar a O-acetilação na MenA [235].

Processo para preparar um sacárido modificado A invenção também fornece um processo para preparar um conjugado imunogénico compreendendo os passos de: (1) fornecimento de um sacárido capsular meningocócico de partida e uma proteína transportadora, cada um ou ambos dos quais é/são opcionalmente modificados para torná-lo/torná-los reativos um relativamente ao outro; (2) formação de uma ligação covalente entre o sacárido e a proteína transportadora; e (3) purificação dos glicoconjugados resultantes, onde, entre os passos (1) e (3) (por ex., durante o passo de reação (2)), o grau de O-acetilação na posição 9 dos resíduos de ácido siálico no sacárido de partida aumenta para 35-55%. O sacárido capsular meningocócico é do serogrupo W135 ou Y.

Materiais de partida do sacárido capsular

Os sacáridos capsulares modificados da invenção podem ser obtidos a partir dos sacáridos encontrados na cápsula dos serogrupos W135 ou Y da N. meningitidis. Os sacáridos da invenção são, por isso, preferencialmente sacáridos do serogrupo W135 da N. meningitidis modificados e sacáridos do serogrupo Y da N. meningitidis modificados.

Os polissacáridos capsulares meningocócicos são tipicamente preparados por um processo que comprrende os passos de precipitação de polissacárido (por exemplo, usando um detergente catiónico), fracionamento de etanol, extração de fenol a frio (para remover a proteína) e ultracentrifugação (para remover LPS) [por ex., ref.13].

Um processo mais preferível [14] envolve a precipitação de polissacáridos, seguida de solubilização do polissacárido precipitado, usando um álcool de cadeia curta. A precipitação pode ser conseguida usando um detergente catiónico tal como os sais tetrabutilamónio e cetiltrimetilamónio (por ex., os sais brometo), ou sais brometo de hexadimetrino e miristil trimetil-amónio. 0 brometo de cetiltrimetilamónio ("CTAB") é particularmente preferível [15]. A solubilização do material precipitado pode ser conseguida usando um álcool de cadeia curta tal como o metanol, o propano-l-ol, propano-2-ol, butan-l-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol, 2-metil-propan-2-ol, dióis, etc, mas o etanol é particularmente adequado para a solubilização dos complexos CTAB-polissacárido. 0 etanol é preferencialmente adicionado ao polissacárido precipitado para dar uma concentração final (baseado no conteúdo total de etanol e água) de entre 50% e 95%.

Após a re-solubilização, o polissacárido pode ser adicionalmente tratado para remover contaminantes. Isto é particularmente importante em situações onde a mais pequena contaminação não é aceitável (por ex., para a produção de vacinas humanas). Isto irá tipicamente envolver um ou mais passos de filtração, por exemplo, filtração de profundidade, filtração através de carbono ativado pode ser usada, filtração por tamanho e/ou ultrafiltração. Uma vez filtrado para remover contaminantes, o polissacárido pode 9 ser precipitado para mais tratamentos e/ou processamento. Isto pode-se conseguir convenientemente através de permuta catiónica (por ex., pela adição de sais de cálcio ou sódio) .

Os sacáridos da invenção podem ser polissacáridos ou oligossacáridos. Os oligossacáridos têm um grau de polimerização inferior ao encontrado nos polissacáridos capsulares nativos presentes na bactéria.

Esta invenção usa preferencialmente oligossacáridos. Estes têm preferencialmente um grau médio de polimerização inferior a 30, por exemplo, entre 15 e 25, preferencialmente à volta de 15-20. O grau de polimerização pode ser convenientemente medido por cromatografia de permuta iónica ou por ensaios colorimétricos [16].

Os oligossacáridos são convenientemente formados por fragmentação de polissacárido capsular purificado (por ex., por hidrólise, por tratamento com ácido suave, por aquecimento, etc.), que irá habitualmente ser seguida de purificação dos fragmentos do tamanho desejado. Se se realizar hidrólise, o hidrolisado irá geralmente ser dimensionado de forma a remover oligossacáridos de comprimento curto. Isto pode ser conseguido de várias maneiras, tal como ultrafiltração seguida de cromatografia de permuta iónica. Os oligossacáridos com um grau de polimerização inferior a cerca de 4 são preferencialmente removidos para os serogrupos W135 e Y.

Como alternativa à purificação a partir de fontes nativas, os sacáridos capsulares (e oligossacáridos em particular) podem ser obtidos por síntese total ou parcial, por exemplo, a síntese de Hib é revelada na ref. 17, e a síntese de MenA na ref. 18.

Conjugação covalente

Os sacáridos modificados da invenção podem ser submetidos a qualquer processamento a jusante usual que é aplicado a sacáridos (ex. derivação, conjugação, 10 fragmentação, etc.). Para melhorar a imunogenicidade, os sacáridos modificados da invenção são conjugados a uma proteina transportadora: a conjugação a proteínas transportadoras é particularmente útil para vacinas pediátricas [19] e é uma técnica bem conhecida [por ex., revisto nas refs. 20 a 28 etc.]. A invenção fornece assim um conjugado de uma proteína transportadora com o sacárido desta invenção.

As proteínas transportadoras preferíveis são toxinas ou toxóides de bactérias, tais como toxóides da difteria ou toxóides do tétano. O derivado CRM197 da toxina da difteria [29-31] é particularmente preferível. Outras proteínas transportadoras adequadas incluem a proteína da membrana externa da N. meningitidis [32], péptidos sintéticos [33,34], proteínas de choque térmico [35,36], proteínas pertussis [37,38], citocinas [39], linfocinas [39], hormonas [39], fatores de crescimento [39], proteínas artificiais que compreende múltiplos epítopos de células T CD4+ humanas de vários antigénios derivados de patogénicos [40] tais como a proteína N19 [41], a proteína D de H. influenzae [42,43], a proteína de superfície pneumocócica PspA [44], pneumolisina [45], proteínas de captação de ferro [46], toxina A e B de C. difficile [47], toxinas bacterianas mutantes (por ex., toxina da cólera "CT" ou toxina termolábil de E. coli "LT"), tais como a CT com uma substituição na Glu-29 [48], etc. Os transportadores preferíveis são o toxóide da difteria, toxóide do tétano, proteína D do H. influenza e CRMi97.

Dentro da composição da invenção é possível usar mais do que uma proteína transportadora, por exemplo, para reduzir o risco de supressão do transportador. Assim, diferentes proteínas transportadoras podem ser usadas para diferentes serogrupos, por exemplo, sacáridos do serogrupo W135 podem ser conjugados ao CRM197 enquanto que os sacáridos do serogrupo Y podem ser conjugados ao toxóide do 11 tétano. Também é possível usar mais do que uma proteína transportadora para um antigénio sacarídico particular, como por exemplo, sacáridos do serogrupo Y podem estar em dois grupos, com alguns conjugados ao CRMi97 e outros conjugados ao toxóide do tétano. Em geral, contudo, é preferível usar a mesma proteína transportadora para todos os serogrupos, com CRM197 a ser a escolha preferível.

Uma única proteína transportadora pode transportar mais do que um antigénio sacarídico [49]. Por exemplo, uma única proteína transportadora pode ter conjugados a si sacáridos dos serogrupos W135 e Y. Em geral, contudo, é preferível ter conjugados separados para cada serogrupo.

Os conjugados com uma relação sacárido:transportador (p/p) de entre 1:5 (isto é, excesso de proteína) e 5:1 (isto é, excesso de sacárido) são preferíveis. Relações entre 1:2 e 5:1 são preferíveis, tal como relações entre 1:1,25 e 1:2,5 são mais preferíveis. A relação pode ser de cerca de 1:1, para conjugados de MenW135. Baseado numa quantidade de sacárido de MenW135 ou MenY de 10 pg, os conjugados preferenciais compreendem de 6,6-20 pg de transportador CRMi97.

Os conjugados podem ser usados em conjunto com a proteína transportadora livre [50]. Quando uma dada proteína transportadora está presente em ambas as formas livre e conjugada na composição da invenção, a forma não conjugada é preferencialmente não mais do que 5% da quantidade total de proteína transportadora na composição como um todo, e mais preferivelmente presente em menos de 2% por peso.

Qualquer reação de conjugação adequada pode ser usada, com qualquer ligando adequado quando for necessário. O sacárido irá tipicamente ser ativado ou funcionalizado antes da conjugação. A ativação pode envolver, por exemplo, reagentes de cianetação tal como o CD AP (por ex., tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino 12 piridínio [51,52, etc.]). Outras técnicas adequadas usam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver também introdução à referência 26).

Ligações via um grupo ligando podem ser realizadas usando qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 3 e 53. Um tipo de ligação envolve aminação redutora do polissacárido, acoplando o grupo amino resultante com uma extremidade de um grupo ligando de ácido adipico, e depois acoplando uma proteína à outra extremidade do gripo ligando do ácido adipico [24,54,55]. Um tipo preferível de ligação é um ligando carbonil, que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxilo livre do sacárido modificado com CDI [56,57] seguido da reação com uma proteína para formar uma ligação carbamato. Outro tipo preferencial de ligação é um ligando de ácido adipico, que pode ser formado através do acoplamento de um grupo -NH2 livre no sacárido modificado com ácido adipico (usando, por exemplo, a ativação de diimida), e depois acoplando a proteína ao intermediário sacárido-ácido adipico resultante. [24,54,58]. Outro tipo preferencial de ligação pode ser formada por reação de um grupo hidroxilo livre de um sacárido com um agente de cianetação (por exemplo, p-nitrofenilcianato, tetrafluoroborato de l-ciano-4-(diametilamino)-piridinio (CDAP), tetrafluoroborato de N- cianotrietilamónio (CTEA)ou), seguido de reação com um grupo amino na proteína (opcionalmente através de um espaçador, por exemplo, uma hidrazina) [59,60]. Outros ligandos incluem o B-propionamido [61], nitrofenil-etilamina [62], halogenetos de haloacilo [63], ligações glicosídicas [2,64], ácido 6-aminocaproico [65], ADH [66], frações de C4 a Ci2 [67], etc. Como alternativa à utilização de um ligando, a ligação direta pode ser usada. As ligações diretas à proteína podem compreender oxidação do polissacárido seguido de aminação 13 redutora com a proteína, como descrito, por exemplo, nas referências 2 e 68. A conjugação pode envolver: redução da terminação anomérica a um grupo hidroxilo primário, opcional proteção/desproteção do grupo hidroxilo primário; reação do grupo hidroxilo primário com CDI para formar um intermediário de carbamato CDI; e acoplamento do intermediário de carbamato CDI com um grupo amino numa proteína.

Um processo que envolve a introdução de grupos amino no sacárido (por ex., por substituição dos grupos terminais =0 com -NH2) seguido de derivação com um diéster adípico (ex. o diéster N-hidroxisuccinimídico do ácido adípico) e reação com proteína transportadora é preferível. Outra reação preferível usa a ativação CDAP com uma proteína D transportadora.

Após conjugação, sacáridos livres e conjugados podem ser separados. Existem vários métodos adequados, incluindo a cromatografia hidrofóbica, ultrafiltração tangencial, diafiltração, etc. [ver também refs 69 e 70, etc.].

Quando a composição da invenção incluir um oligossacárido conjugado, é preferível que a preparação do oligossacárido preceda a conjugação.

Composições farmacêuticas A invenção fornece uma composição imunogénica (por ex., uma vacina) que compreende (a) um conjugado sacárido capsular modificado da invenção, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. As vacinas baseadas nos sacáridos ou conjugados de proteína-sacárido são bem conhecidos na técnica, incluindo conjugados baseados em sacáridos des-O-acetilados (NeisVac-C™) . As vacinas da invenção podem ou ser profiláticas (isto é, para prevenir infeções) ou terapêuticas (i.e. para tratar infeções), mas irão ser tipicamente profiláticas. 14

Os "transportadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer transportador que não induza a ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais ao individuo recetor da composição farmacêutica. Transportadores adequados são tipicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como as proteínas, polissacáridos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, co-polímeros de aminoácidos, trehalose [71] agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas), e partículas virais inativas. Tais transportadores são bem conhecidos dos peritos na especialidade. As vacinas podem também conter diluentes, tal como a água, solução salina, glicerol, etc. Para além disso, podem estar presentes substâncias auxiliares, tais como agentes de umidificação ou emulsionantes, substâncias de tamponamento de pH, e semelhantes. Uma discussão aprofundada dos excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível na referência 72.

Tipicamente, as composições farmacêuticas são preparadas como injetáveis, como soluções liquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção podem também ser preparados. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas para um efeito adjuvante melhorado. A distribuição direta das composições farmacêuticas será geralmente parentérica (por ex., por injeção, quer subcutânea, intraperitonial, intravenosa ou intramuscular, ou administrada ao espaço intersticial de um tecido). As composições farmacêuticas podem também ser administradas numa lesão. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, retal (supositórios), e aplicações transdérmicad ou transcutâneas [por ex., ref. 73], agulhas e Hyposprays. 0 pH da composição é preferencialmente entre 6 e 8, preferencialmente cerca de 7. Um pH estável deve ser 15 mantido através do uso de um tampão. Quando a composição compreende um sal de hidróxido de aluminio, é preferivel usar um tampão de histidina [74]. A composição deve ser estéril e/ou livre de pirogénios. As composições da invenção devem ser isotónicas no que diz respeito aos seres humanos.

As composições da invenção podem estar em forma aquosa (isto é, soluções ou suspensões) ou em forma seca (por ex., pós liofilizados). A formunação liquida permite que as composições sejam administradas diretamente da sua forma empacotada, sem a necessidade de reconstituição num meio aquoso, e são por isso ideais para injeção. Tais composições podem estar presentes em frascos, ou podem ser apresentadas em seringas já prontas. As seringas podem ser fornecidas com ou sem agulhas. Uma seringa irá incluir uma dose única da composição, enquanto que um frasco pode incluir uma dose única ou múltiplas doses.

As composições liquidas da invenção são também adequadas para a reconstituição de outras vacinas a partir de uma forma liofilizada, por exemplo, para reconstituir o antigénio Hib ou DTP liofilizados. Quando uma composição da invenção é para ser usada para tal reconstituição extemporânea, a invenção fornece um kit, que pode compreender dois frascos, ou pode compreender uma seringa pronta e um frasco, com os conteúdos da seringa a serem usados para reativar os conteúdos do frasco antes da injeção.

As composições secas da invenção oferecem estabilidade de armazenamento, mas devem ser reconstituídas na forma líquida antes da administração. A invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente contendo uma composição seca da invenção e um segundo recipiente contendo uma composição aquosa para reconstituir os conteúdos do primeiro recipiente. A composição aquosa no segundo recipiente pode conter antigénios (por ex., não- 16 meningocócicos), ou pode conter apenas excipientes. 0 primeiro recipiente será geralmente um frasco; o segundo recipiente pode ser também um frasco, ou poderá ser uma seringa pronta.

Para a preparação de composições secas, podem ser usados estabilizadores, por exemplo, dissacáridos tal como a trehalose e sacarose, ou álcoois de açúcar tal como o manitol. Estes componentes irão ser adicionados antes da liofilização e irão aparecer na composição reconstituída.

Componentes adicionais das composições incluem: cloreto de sódio (para a tonicidade), por exemplo, cerca de 9 mg/ml; detergentes, por ex., um Tween (polisorbato), tal como o Tween 80, geralmente em baixos níveis, por ex., <0,01%; e sais tampão, por exemplo, tampão fosfato. A composição pode incluir um agente antibiótico.

As composições da invenção podem ser empacotadas em forma de doses unitária ou na forma de dose múltipla. Para a forma de dose múltipla líquida, os frascos são preferenciais às seringas prontas. As doses eficazes podem ser rotineiramente estabelecidas, mas uma dose típica humana da composição para injeção tem um volume de 0,5 ml.

As composições imunogénicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antigénio(s), bem como de qualquer outros componentes, conforme seja necessário. "Quantidade imunologicamente eficaz" significa que a administração dessa quantidade a um indivíduo, ou numa dose única ou como parte de uma série, é eficaz no tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da condição física e de saúde do indivíduo a ser tratado, idade, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (ex. primatas não humanos, primatas, etc.), a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, o grau de proteção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico responsável da situação médica, e outros fatores relevantes. Espera-se que 17 a quantidade esteja num intervalo relativamente amplo que pode ser determinada através de ensaios de rotina.

Uma quantidade tipica de cada antigénio sacaridico meningocócico por dose está entre 1 pg e 20 pg, por exemplo, cerca de 1 pg, cerca de 2,5 pg, cerca de 4 pg, cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg (expresso como sacárido).

Cada sacárido pode estar presente substancialmente na mesma quantidade por dose. Contudo, um excesso de sacárido MenY pode ser preferível, por exemplo, uma relação (p/p) MenY:MenW135 de 1.5:1 ou superior.

Quando um conjugado está presente, uma composição pode também compreender uma proteína transportadora livre [50]. Preferencialmente, a proteína transportadora livre está presente em menos de 5% por peso da composição; mais preferencialmente, está presente em menos de 2% por peso.

As composições desta invenção irão geralmente incluir um ou mais adjuvantes. Tais adjuvantes incluem, mais não estão limitados a: A. Composições que contêm mineral

Composições que contêm mineral adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tal como sais de alumínio e sais de cálcio. A invenção inclui sais minerais tal como hidróxidos (por ex., oxi-hidróxidos), fosfatos (por ex., hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ex., ver capítulos 8 e 9 da ref. 75], ou misturas de diferentes compostos minerais, com os compostos a ter qualquer forma adequada (por ex., gel, cristalina, amorfa, etc.), e com a adsorção a ser preferível. As composições que contêm mineral podem também ser formuladas como uma partícula de sal metálico [76]. B. Emulsões de óleo

As composições com emulsões de óleo adequadas para usar como adjuvantes na invenção incluem emulsões de esqualeno-água, tal como a MF59 [Capítulo 10 da ref. 75; ver também ref. 77] (5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 18 0,5% de Span 85, formulado em partículas submicrónicas, utilizando um microfluidizador). O adjuvante Freund's completo (CFA) e o adjuvante Freund's incompleto (IFA) podem também ser usados. C. Formulações de saponina [capítulo 22 da ref. 75]

As formulações de saponina podem também ser usadas como adjuvantes na invenção. As saponinas são um grupo heterólogo de glicósidos de esterol e glicósidos triterpenóides que são encontrados em cascas, folhas, caules, raízes e até flores de uma vasta gama de espécies de plantas. A saponina da casca da árvore Qulllala saponaria Molina tem sido vastamente estudada como adjuvante. Saponina pode também ser comercialmente obtida a partir de Smilax ornata (salsaparilla), Gypsophila paniculata (véu de noiva), e Saponaria officianalis (raiz de sabão). As formulações de adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, tal como QS21, bem como formulações lipídicas, tal como ISCOMs. QS21 é comercializado como Stimulon™.

As composições de saponina têm sido purificadas usando HPLC e RP-HPLC. Foram identificadas frações específicas purificadas usando estas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH—A, QH—B e QH-C. Preferencialmente, a saponina é QS21. Um método para a produção de QS21 é revelado na ref. 78. As formulações de saponina podem também compreender um esterol, tal como colesterol [79].

Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas únicas chamadas complexos imunoestimuladores (ISCOMs) [capítulo 23 da ref. 75]. Os ISCOMs também incluem tipicamente um fosfolípido tal como o fosfatildiletanoamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. Preferencialmente, o ISCOM inclui um ou mais QuilA, QHA e QHC. Os ISCOMs também são descritos nas refs. 79-81. 19

Opcionalmente, os ISCOMs podem ser desprovidos de detergente adicional [82].

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes baseados em saponina pode ser encontrada nas refs. 83 e 84. D. Virossomas e partículas semelhantes a vírus

Virossomas e partículas semelhantes a vírus (VLPs) podem também ser usados como adjuvantes na invenção. Estas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de um vírus opcionalmente combinada ou formulada com um fosfolípido. Elas são geralmente não patogénicas, não replicativas e geralmente não contêm nenhum genoma virai nativo. As proteínas virais podem ser recombinantemente produzidas ou isoladas de vírus inteiros. Estas proteínas virais adequadas para o uso em virossomas ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus influenza (tal como HA ou NA) , vírus da Hepatite B (tal como proteínas nucleares ou capsulares), vírus da Hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, Rotavírus, vírus da doença da febre aftosa, Retrovírus, vírus Norwalk, vírus do Papiloma humano, HIV, fagos de ARN, fago ζ)β (tal como proteínas de revestimento) , fago GA, fago fr, fago AP205 e Ty (tal como a proteína pl do retrotransposão Ty) . As VLPs estão mais discutidas nas refs. 85-90. Os virossomas estão mais discutidos, por exemplo, na ref. 91. E. Derivados microbianos ou bacterianos

Os adjuvantes adequados para usar na invenção incluem derivados microbianos ou bacterianos tais como derivados não tóxicos de lipopilossacáridos (LPS) de enterobactérias, derivados do Lípido A, oligonucleótidos imunoestimuladores e toxinas ADP-ribosilantes e derivados dos mesmos desintoxicados.

Derivados não tóxicos de LPS incluem lípido A monofosforil (MPL) e MPL 3-O-desacetilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura de lípido A monofosforil 3 des-O-acetilado com 20 4, 5 ou 6 cadeias acetiladas. Uma forma de "partícula pequena" preferível do lípido A monofosforil 3 des-O-acetilado está revelada na ref. 92. Tais "partículas pequenas" de 3dMPL são pequenas o suficiente para serem estéreis filtradas através de uma membrana de 0,22 pm [92]. Outros derivados de LPS não tóxicos incluem imitadores de lípido A monofosforil, tais como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ex., RC-529 [93,94].

Derivados do lípido A incluem derivados do lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. O OM-174 está descrito por exemplo nas refs. 95 e 96.

Os oligonucleótidos imunoestimuladores adequados para o uso como adjuvantes na invenção incluem sequências de nucleótidos contendo um motivo CpG (uma sequência dinucleotídica contendo uma citosina não metilada ligada por uma ponte de fosfato a uma guanosina) . ARN de cadeia dupla e oligonucleótidos contendo sequências palindrómicas ou poli(dG) também foram demonstradas como sendo imunoestimuladoras.

As CpG's podem incluir modificações/análogos de nucleótidos, tal como modificações fosforotiorato e podem ser de dupla cadeia ou cadeia simples. As referências 97, 98 e 99 revelam possíveis substituições análogas, por exemplo, a substituição de guanosina por 2'-desoxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante dos oligonucleótidos CpG está mais discutido nas refs. 100-105. A sequência CpG pode ser direcionada para o TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [106]. A sequência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imunitária Thl, tal como uma CpG-A ODN, ou pode ser mais específica para induzir uma resposta de células B, tal como uma CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs estão discutidos nas refs. 107-109. Preferencialmente, a CpG é uma CpG-A ODN.

Preferencialmente, o oligonucleótido CpG é construído para que a extremidade 5' fique acessível para o 21 reconhecimento pelo recetor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleótidos CpG podem ser ligados às suas extremidades 3' para formar "imunómeros". Ver, por exemplo, refs. 106 e 110-112.

As toxinas ADP-ribosilação bacterianas e derivados desintoxicados dos mesmos podem ser usados como adjuvantes nesta invenção. De preferência, a proteína é derivada de E. coli (enterotoxina termolábil "LT" de E.coli), cólera ("CT") ou pertussis ("PT"). O uso de toxinas ADP-ribosilantes desintoxicadas como adjuvantes da mucosa está descrito na ref. 113 e como adjuvantes parentéricos na ref. 114. A toxina ou toxóide está de preferência na forma de uma holotoxina, que compreende ambas as subunidades A e B. De preferência, a subunidade A contém uma mutação de desintoxicação; de preferência, a subunidade B é não mutada. De preferência, o adjuvante é um mutante LT desintoxicado tal como o LT-K63, LT-R72 e LT-G192. O uso de toxinas ADP-ribosilante e derivados desintoxicados das mesmas, particularmente LT-K63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrado nas refs. 115-122. Referência numérica para substituições de aminoácidos baseia-se preferencialmente nos alinhamentos das subunidades A e B de toxinas ADP-ribosilantes estabelecidos na ref. 123. F. Imunomoduladores humanos

Imunomoduladores humanos favoráveis para uso como adjuvantes na invenção incluem citocinas, tal como interleucinas (ex. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 12, etc.) [124], interferões (ex. interferão-γ) , fator estimulador de colónias de macrófagos e fator de necrose tumoral. G. Bioadesivos e Mucoadesivos

Os bioadesivos e os mucoadesivos também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Bioadesivos adequados incluem microesferas de ácido hialurónico esterifiçados 22 [125] ou mucoadesivos tal como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, polissacáridos e carboximetilcelulose. Quitosano e seus derivados podem também ser usados como adjuvantes na invenção [126]. H. Microparticulas

As microparticulas podem também ser usadas como adjuvantes na invenção. As microparticulas (isto é, uma partícula de 100 nm a -150 μ m de diâmetro, mais preferivelmente de -200 nm a -30 pm de diâmetro, e mais preferencialmente -500 nm a -10 pm de diâmetro) formadas a partir de materiais que sejam biodegradáveis e não tóxicos (por ex., um poli (α-hidroxi ácido), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, uma polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli(lactida-co-glicolida) são de preferência, opcionalmente tratados para ter uma superfície carregada negativamente (por ex., com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por ex., com um detergente catiónico, tal como o CTAB). I. Lipossomas (capítulos 13 e 14 da ref. 75)

Exemplos de formulações de lipossomas adequadas para uso como adjuvantes estão descritas nas refs. 127-129. J. Formulações de éter polioxietileno e éster polioxietileno

Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem éteres polioxietileno e ésteres polioxietileno [130]. Tais formulações incluem adicionalmente tensioativos éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol [131] bem como tensioativos éteres ou ésteres de polioxietileno alquil em combinação com pelo menos um tensioativo adicional não iónico, como um octoxinol [132]. Os éteres de polioxietileno preferidos são selecionados a partir do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9-lauril (laureth 9), éter polioxietileno-9-esteoril, éter polioxietileno-8-esteoril, éter polioxietileno-4-lauril, 23 éter polioxietileno-35-lauril, e éter polioxietileno-23-lauril. K. Polifosfazeno (PCPP)

As formulações de PCPP estão descritas, por exemplo, nas refs 133 e 134. L. Muramil péptidos

Exemplos de muramil péptidos adequados para usar como adjuvantes na invenção incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) e N-acetilmuramil-L-alanil_D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipanitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE). M. Compostos Imidazoquinolona

Exemplos de compostos imidazoquinolona adequados para o uso como adjuvantes na invenção incluem Imiquamod e seus homólogos (ex. "Resiquimod 3M") , mais descritos nas refs. 135 e 136. A invenção pode também compreender combinações de aspetos de um ou mais dos adjuvantes acima identificados. Por exemplo, as seguintes composições de adjuvantes podem ser usadas na invenção: (1) uma saponina e uma emulsão de óleo-em-água [137]; (2) uma saponina (por ex., QS21) + um derivado de LPS não tóxico (por ex., 3dMPL) [138]; (3) uma saponina (por ex., QS21) + um derivado de LPS não tóxico (por ex., 3dMPL) + um colesterol; (4) uma saponina (por ex., QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) [139]; (5) combinações de 3sMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões de óleo-em-água [140]; (6) SAF, contendo 10% de esqualano, 0,4% de Tween 80™, 5% de polímero de bloco L121 plurónico e thr-MDP, ou microfluidizado numa emulsão submicrónica, ou submetido a vórtex para gerar uma emulsão com partículas de tamanhos maiores. (7) o sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contém 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular de bactérias do grupo que consiste em monofosforilipido A (MPL), trehalose dimicolato (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox™) e (8) um ou mais sais minerais (tal como um sal de alumínio) + um derivado não tóxico de LPS (tal como o 3dMPL).

Outras substâncias que atuam como agentes imunoestimuladores estão reveladas no capítulo 7 da ref. 75.

Sais de alumínio e fosfato de cálcio são adjuvantes parentéricos preferenciais. Toxinas mutantes são adjuvantes preferenciais da mucosa.

As composições da invenção que incluem um adjuvante de fosfato de alumínio são preferenciais. Hidróxido de alumínio está, de preferência, ausente. Adjuvante de fosfato de alumínio pode ser incluído em cerca de 0,6 mg de Al3+ por ml.

Combinações de imunogénios

As composições da invenção podem compreender ambos o sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 da invenção e o sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y da invenção.

Outros antigénios podem também ser incluídos nas composições da invenção. Assim, a invenção fornece uma composição que compreende um sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 modificado da invenção e/ou um sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y modificado da invenção, e ainda compreendem um ou mais antigénio(s) selecionados da seguinte lista: - um antigénio sacarídico capsular do serogrupo A de N. meningitidis. - um antigénio sacarídico capsular do serogrupo C de N. meningitidis. um antigénio proteico do serogrupo B de N. meningitidis, tal como os que estão nas refs. 141 a 150. 25 - preparações de microvesícuias do serogrupo B de N. meningitidis [151], OMVs nativos [152], bolhas ou vesículas da membrana externa [ex. refs. 153 a 158 etc]. Estas podem ser preparadas a partir de bactérias que tenham sido geneticamente manipuladas [159-162], por exemplo, para aumentar a imunogenicidade (ex. imunogénios de híper expressão), para reduzir a toxicidade, para inibir a síntese de polissacáridos capsulares, para regular de forma negativa a expressão de PorA, etc. Podem ser preparadas a partir de estirpes hiper-vesiculares [163-166]. Vesículas de uma Neisseria não patogénica podem ser incluídas [167]. OMVs podem ser preparados sem o uso de detergentes [168,169]. Eles podem expressar proteínas não-Neisseria na sua superfície [170]. Eles podem ser desprovidos de LPS. Eles podem ser misturados com antigénios recombinantes [153, 171]. As vesículas das bactérias com diferentes subtipos de membrana externa classe I podem ser usadas, por exemplo, seis diferentes subtipos [172,173] usando duas diferentes populações de vesículas geneticamente modificadas, cada uma exibindo três subtipos, ou nove diferentes subtipos usando três diferentes populações de vesículas geneticamente modificadas, cada uma exibindo três subtipos, etc. Os subtipos úteis incluem: P1.7, 16; Pl.5-1, 2-2; Pl.19,15-1; Pl.5-2,10; PI.12-1,13; Pl.7-2,4; Pl.22,14; Pl. 7-1,1; Pl.18-1,3,6. - um antigénio sacarídico de Haemophilus influenzae B [ex. 174]. - um antigénio de Streptococcus pneumoniae [ex. 208, 209, 210]. - um antigénio do vírus da hepatite A, tal como vírus inativado [ex. 175,176]. um antigénio do vírus da hepatite B, tal como antigénios de superfície e/ou núcleo [ex. 176, 177]. - um antigénio de Bordetella pertussis, tal como a holotoxina pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) 26 de B. pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3 [por ex., refs. 178 e 179]. Antigénios celulares pertussis podem ser usados. - um antigénio da difteria, tal como um toxóide da difteria [por ex., ver capitulo 3 da ref. 180], por exemplo 0 mutante CRMi97 [por ex., 181]. - um antigénio do tétano, tal como um toxóide do tétano [por ex., capitulo 4 da ref. 180]. - Polio antigénio(s) [por ex., 182, 183], tal como o IPV.

Antigénios de proteínas tóxicos podem ser destoxifiçados quando for necessário (por ex. destoxificação da toxina pertussis por meios químicos e/ou genéticos [179] ) .

Quando um antigénio da difteria está incluído na composição farmacêutica é preferível que também se incluam antigénios do tétano e antigénios pertussis. Semelhantemente, quando um antigénio do tétano é incluído é preferível que também se incluam os antigénios da difteria e pertussis. Da mesma forma, quando um antigénio pertussis é incluído, é preferível que também se incluam antigénios da difteria e do tétano.

Os antigénios na composição farmacêutica irão tipicamente estar presentes numa concentração de pelo menos 1 pg/ml cada. Em geral, a concentração de um dado antigénio será suficiente para obter uma resposta imunitária contra esse antigénio.

Os antigénios são preferencialmente adsorvidos a um adjuvante de sal de alumínio.

Como alternativa para usar antigénios de proteínas na composição farmacêutica da invenção, o ácido nucleico que codifica o antigénio pode ser usado [por ex., refs. 184 a 192]. Os componentes protéicos das composições farmacêuticas da invenção podem então ser substituídos por ácido nucleico (preferencialmente ADN, por exemplo na forma 27 de um plasmídeo) que codifica a proteína. Da mesma forma, as composições da invenção podem compreender proteínas que imitem antigénios sacarídicos, por exemplo, mimotopes [193] ou anticorpos anti-idiotipo. Estes podem substituir os componentes sacarídicos individuais, ou podem complementá-los. Como exemplo, a vacina pode compreender um péptido imitador do polissacárido capsular MenC [194] ou o MenA [195, no lugar do próprio sacárido].

Vacinas meningocócicas combinadas

As composições preferenciais da invenção compreendem um sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 modificado da invenção, um sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y modificado da invenção e um sacárido capsular do serogrupo C, em que os sacáridos capsulares estão conjugados a proteínas transportadoras. A composição pode também incluir um sacárido capsular do serogrupo A, de preferência conjugado com uma proteína transportadora. Os sacáridos nestas composições são preferencialmente oligossacáridos. Os oligossacáridos conjugados podem ser preparados como está revelado na referência 14.

Os sacáridos do serogrupo A podem ser O-acetilados ou des-O-acetilados. Os sacáridos do serogrupo C podem ser 0-acetilados ou des-0-acetilados.

Os conjugados MenC preferíveis incluem, com base em 10 pg de sacárido, 12,5-25 pg do transportador CRM197. Os conjugados MenA preferíveis incluem, com base em 10 pg de sacárido, 12,5-33 pg do transportador CRM197.

As doses típicas para conjugados MenC e MenA são as mesmas para MenW135 e MEnY, isto é, entre 1 pg e 20 pg, por exemplo, cerca de 1 pg, cerca de 2,5 pg, cerca de 4 pg, cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg.

As relações (p/p) preferenciais para os sacáridos de serogrupos C:W135:Y são: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:2 e 2:1:1. As relações preferenciais para os sacáridos dos serogrupos A:C:W135:Y são: 1:1:1:1; 28 1:1:1:2; 2:1:1:1,- 4:2:1:1,- 8:4:2:1,- 4:2:1:2,- 8:4:1:2,- 4:2:2:1,- 2:2:1:1,- 4:4:2:1,- 2:2:1:2,- 4:4:1:2,- e 2:2:2:1.

Preferivelmente usa-se uma massa substancialmente igual de cada sacárido por dose.

Quando uma composição inclui um sacárido do serogrupo A, deve-se preparar por reconstituição o sacárido do serogrupo A a partir de uma forma liofilizada, usando uma composição aquosa que contenha um ou mais sacárido do serogrupo C, W135 e/ou Y.

Quando uma composição inclui um sacárido do serogrupo A, deve ser um sacárido modificado no qual um ou mais dos grupos hidroxilo no sacárido nativo tenha/tenham sido substituído(s) por um grupo bloqueador [196]. Esta modificação melhora a resistência à hidrólise. E preferível que todas, ou substancialmente todas, as unidades monossacarídicas possam ter substituições do grupo bloqueador.

Para além de incluir antigénios sacarídicos dos serogrupos Y, W135 e C (e, opcionalmente A), as composições da invenção podem incluir um ou mais antigénios do serogrupo B. Ao contrário dos serogrupos A, C, W135 e Y, o sacárido capsular do MenB é inadequando para usar como imunogénio em seres humanos devido à sua semelhança com os próprios antigénio. Se um antigénio sacarídico é para ser usado para MenB, por conseguinte, é necessário usar um sacárido modificado, tal como um em que os grupos N-acetil nos resíduos de ácido siálico do sacárido sejam substituídos por grupos N-acil. Os grupos N-acil adequados são os grupos acil Ci a C8, tal como N-propionil [197] . Em vez de usar um antigénio sacarídico, contudo, é preferível usar um antigénio polipeptídico.

Assim a composição pode incluir um ou mais antigénios polipeptídicos que induzem uma resposta imunitária que proteje contra a infeção pelo MenB. Mais geralmente, a composição pode, após a administração a um indivíduo, 29 induzir uma resposta mediada por anticorpos no indivíduo que é bactericida contra dois ou mais (por ex., 2 ou 3) linhagens A4 hiper-virulentas, ET-5 e linhagem 3 do serogrupo B de N. meningitidis. A sequência do genoma do serogrupo B de N. meningitidis foi publicada [148] e antigénios adequados podem ser selecionados a partir dos polipéptidos codificados [150]. Exemplos de antigénios estão descritos nas referências 141 a 150. As composições preferenciais incluem um ou mais dos seguintes cinco antigénios [198]: (1) uma proteína "NadA", preferencialmente na forma oligomérica (por ex., na forma trimérica); (2) uma proteína "741"; (3) uma proteína "936" (4) uma proteína '953' e (5) uma proteína "287".

As sequências protótipos para estas cinco proteínas encontram-se na referência 143 como se segue:

Proteína NadA 741 936 953 287 SEQ ID 2943 e 2535 e 2883 e 2917 e 3103 e NOs 2944 2536 2884 2918 3104

Quando é usado em composições da invenção, a proteína do serogrupo B pode compreender a sequência de aminoácidos de um destes sequências protótipos, ou pode compreender uma sequência de aminoácidos que: (a) tenha 50% ou mais de identidade (por ex., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) da sequência protótipo; e/ou (b) contenha um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos da sequência protótipo, onde n é 7 ou superior (por ex., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou superior). Os fragmentos preferenciais para (b) falta de um ou mais aminoácido (ex. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do C-terminal e/ou N-terminal da sequência protótipo. Outros fragmentos preferenciais contêm um epítopo da sequência. 30

Estes cinco antigénios MenB podem estar presentes na composição como cinco proteínas separadas, mas é preferível que pelo menos dois dos antigénios sejam expressos como uma cadeia polipeptídica individual (uma proteína "híbrida" [refs. 145-147]), isto é, tal que os cinco antigénios formem menos de cinco polipéptidos. As proteínas híbridas oferecem duas vantagens principais: primeiro, uma proteína que pode ser instável ou pobremente expressa por si própria pode ser assistida adicionando um parceiro híbrido adequado que resolva o problema; segundo, o fabrico comercial é simplificado para que apenas uma expressão e purificação sejam necessárias de forma a produzir duas proteínas separadamente úteis. Uma proteína híbrida incluída numa composição da invenção pode compreender dois ou mais (isto é, 2, 3, 4 ou 5) dos cinco antigénios básicos. Híbridos que consistem em dois dos cinco antigénios são preferenciais, por exemplo aqueles que compreendem: NadA e 741; NadA e 936; NadA e 953; NadA e 287; 741 e 936; 741 e 953; 741 e 287; 936 e 953; 936 e 287; 953 e 287.

Três antigénios MenB preferíveis para inclusão combinada nas composições da invenção são:

NadA da estirpe 2996, com deleção C terminal e péptido lider processado

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Como foi mencionado anteriormente, as composições da invenção que incluem antigénios MenB podem preferencialmente induzir uma resposta mediada por anticorpos bactericida no soro que é eficaz contra dois ou três linhagens hiper-virulentas de MenB A4 , ET-5 e linhagem 3. Elas podem adicionalmente induzir respostas mediadas por anticorpos bactericidas contra um ou mais linhagens hiper-virulentas subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 ou complexo ET-37, e contra outras linhagens, por exemplo linhagens hiper-invasivas. Estas respostas mediadas por anticorpos são convenientemente medidas em ratinhos e são um indicador padrão da eficácia da vacina [por ex., ver nota final 14 da referência 150]. A composição não necessita induzir anticorpos bactericidas contra cada e toda a estirpe MenB nestas linhagens hiper-virulentas; aliás, para cada dado grupo de quatro ou mais estirpes do meningococo do serogrupo B numa linhagem híper-virulenta particular, os anticorpos induzidos pela composição são bactericidas contra pelo menos 50% (por ex., 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) do grupo. Grupos preferenciais de estirpes irão incluir estirpes isoladas em pelo menos quatro dos seguintes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR e CU. O soro tem preferencialmente um título bactericida de pelo menos 1024 (ex. 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 ou superior, de preferência pelo menos 214) isto é, , o soro é capaz de matar pelo menos 50% de bactérias de teste de uma estirpe particular quando diluído 1/1024, como descrito na referência 150. As composições preferenciais podem induzir respostas bactericidas contra as seguintes estirpes do meningococo do serogrupo B: (i) do 32 agrupamento de A4, estirpe 961-5945 (B:2b:PI.21,16) e/ou estirpe G2136 (B:-); do complexo ET-5, estirpe MC58 (B:15:PI.7,16b) e/ou estirpe 44/76 (B:15:PI.7,16); (iii) da linhagem 3, estirpe 394/98 (B:4:P1.4) e/ou estirpe BZ198 (B:NT:-). As composições mais preferenciais podem induzir respostas bactericidas contra estirpes 961-5945, 44/76 e 394/98. As estirpes 961-5945 e G2136 são ambas estirpes de referência de ML ST Neisseria [ids 638 e 1002 na ref. 199]. A estirpe MC58 está amplamente disponível (por ex., ATCC BAA-335) e foi a estirpe seguenciada na referência 148. A estirpe 44/76 tem sido amplamente usada e caracterizada (por ex., ref. 200) e é uma das estirpes de referência de MLST Neisseria [id 237 na ref. 199; linha 32 do quadro 2 na ref. 201]. A estirpe 394/98 foi originalmente isolada na Nova Zelândia em 1998, e tem havido vários estudos publicados usando esta estirpe (por ex., refs. 202 e 203). A estirpe BZ198 é outra estirpe de referência de MLST [id 409 na ref. 199; linha 41 do quadro 2 na ref. 201] . A composição pode adicionalmente induzir uma resposta bactericida contra a estirpe LNP17592 do serogrupo W135 (W135:2a:PI.5, 2) , do complexo ET-37. Esta é uma estirpe Haji isolada na França em 2000.

Outros antigénios polipeptídicos de MenB que podem ser incluídos nas composições da invenção incluem aqueles que compreendem uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 650 da ref. 141; SEQ ID NO: 878 da ref. 141; SEQ ID NO: 884 da ref . 141; SEQ ID NO : 4 da ref. 142; SEQ ID NO: 598 da ref. 143; SEQ ID NO: 818 da ref . 143; SEQ ID NO: 864 da ref. 143; SEQ ID NO: 866 da ref. 143; SEQ ID NO: 1196 da ref . 143; SEQ ID NO: 1272 da ref. 143; SEQ ID NO: 1274 da ref . 143; SEQ ID NO: 1640 da ref. 143; SEQ ID NO: 1788 da ref . 143; SEQ ID NO: 2288 da ref. 143; SEQ ID NO: 2466 da ref . 143; SEQ ID NO: 2554 da ref. 143; SEQ ID NO: 2576 da ref . 143; SEQ ID NO: 2606 da ref. 143; SEQ ID NO: 2608 da ref . 143; SEQ ID NO: 2616 da ref. 143; SEQ ID NO: 33 2668 da ref. 143; SEQ ID NO: 2780 da ref. 143; SEQ ID NO: 2932 da ref. 143; SEQ ID NO: 2958 da ref. 143; SEQ ID NO: 2970 da ref. 143; SEQ ID NO: 2988 da ref. 143, ou um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais de identidade (por ex., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) das sequências referidas; e/ou (b) compreende um fragmento de pelo menos n aminoácidos consecutivos das referidas sequências, onde n é 7 ou mais (por ex., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Fragmentos preferíveis para (b) compreendem um epítopo da sequência relevante. Mais do que um (por ex., 2, 3, 4, 5, 6) destes polipéptidos podem ser incluídos.

Combinações com sacáridos Hib

Quando a composição incluir um antigénio tipo B de H. influenzae, tipicamente será um antigénio sacarídico capsular Hib. Antigénios de sacáridos de H. influenzae b são bem conhecidos.

Vantajosamente, o sacárido Hib está conjugado covalentemente a uma proteína transportadora, de forma a melhorar a sua imunogenicidade, especialmente nas crianças. A preparação de conjugados polisacarídicos em geral, e no polissacárido capsular Hib em particular, está bem documentado. A invenção pode usar qualquer conjugado Hib adequado. As proteínas transportadoras adequadas estão descritas acima, e os transportadores preferíveis para sacáridos Hib são CRM197 ("HbOC"), toxóide do tétano ("PRP-T") e o complexo da membrana externa de N. meningitidis ("PRP-OMP"). A porção do sacárido do conjugado pode ser um polissacárido (por ex., fosfato de poliribisilribitol de comprimento completo (PRP)) , mas é preferível hidrolisar polissacáridos para formar oligossacáridos (por ex., PM de ~1 a 5 kDa). 34

Um conjugado preferível compreende um oligossacárido covalentemente ligado a CRMi97 através de um ligando de ácido adípico [16, 204] . O toxóide do tétano é também um transportador preferível. A administração do antigénio Hib resulta preferivelmente numa concentração de anticorpo anti-PRP de á 0,15 pg/ml, e mais preferivelmente á 1 pg/ml.

Quando a composição inclui um antigénio sacaridico Hib, é preferível que não se inclua também um adjuvante de hidróxido de alumínio. Se a composição incluir um adjuvante fosfato de alumínio, o antigénio Hib pode ser adsorvido ao adjuvante [205] ou pode ser não adsorvido [206] . A prevenção da adsorção pode-se conseguir selecionando o pH correto durante a mistura de antigénio/adjuvante, um adjuvante com ponto adeguado de carga zero, e uma ordem adeguada de mistura para os vários antigénios diferentes numa composição [207].

As composições da invenção podem compreender mais do que um antigénio Hib. Os antigénios Hib podem ser liofilizados, por exemplo, para reconstituição pelas composições meningocócicas da invenção.

Combinações com antigénios pneumocócicos

Quando a composição inclui um antigénio de S. pneumoniae, tipicamente será um antigénio sacaridico capsular que é preferencialmente conjugado com uma proteína transportadora [por ex., refs. 208 a 210]. É preferível incluir sacáridos de mais do que um tipo de S. pneumoniae. Por exemplo, misturas de polissacáridos de 23 serotipos diferentes são amplamente usadas, como são vacinas conjugadas com polissacáridos de entre 5 e 11 serotipos diferentes [211]. Por exemplo, PrevNar™ [212] contém antigénios de sete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) com cada sacárido individualmente conjugado com CRM197 através de aminação redutora, com 2 pg de cada sacárido por 0,5 ml de dose (4 pg de serotipo 6B) e com conjugados 35 adsorvidos num adjuvante de fosfato de alumínio. Composições da invenção incluem preferencialmente pelo menos serotipos 6B, 14, 19F e 23F. Os conjugados podem ser adsorvidos sobre um fosfato de alumínio.

Como alternativa ao uso de antigénios sacarídicos de pneumococos, a composição pode incluir um ou mais antigénios polipeptídicos. As sequências do genoma para várias estirpes de pneumococos estão disponíveis [213, 214] e podem ser submetidas a vacinologia reversa [215-218] para identificar antigénios polipeptídicos adequados [219,220]. Poe exemplo, a composição pode incluir um ou mais dos seguintes antigénios: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 e Sipl30, como definido na referência 221. A composição pode incluir mais do que um (por ex., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14) destes antigénios.

Em algumas realizações, a composição pode incluir tanto antigénios de sacárido como de polipéptido de pneumococos. Estes podem ser usados numa mistura simples, ou o antigénio sacarídico pneumocócico pode ser conjugado com uma proteína pneumocócica. As proteínas transportadoras adequadas para tais realizações incluem os antigénios listados no parágrafo anterior [221].

Os antigénios pneumocócicos podem ser liofilizados, por exemplo, juntamente com antigénio Hib. Métodos do tratamento A invenção também fornece uma composição farmacêutica da invenção para usar num método para elevar uma resposta de anticorpos num mamífero, que compreende a administração da composição farmacêutica da invenção ao mamífero. A invenção fornece uma composição da invenção para usar num método para aumentar a resposta imunitária em mamíferos que compreende o passo de administração de uma quantidade eficaz da composição da invenção. A resposta imunitária é preferencialmente protetora e preferivelmente 36 envolve anticorpos. 0 método pode criar uma resposta de reforço. 0 mamífero é preferivelmente um ser humano. Quando as vacinas são para uso profilático, o ser humano é preferencialmente uma criança, (ex. uma criança que começa a andar ou menino) ou um adolescente; quando a vacina é para uso terapêutico, o ser humano é preferivelmente um adulto. A vacina destinada a crianças pode também ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade, etc. A invenção também fornece uma composição da invenção para uso como medicamento. 0 medicamento é preferivelmente capaz de aumentar a resposta imunitária num mamífero (isto é, é uma composição imunogénica) e é mais preferivelmente uma vacina. A invenção também fornece o uso de um sacárido capsular meningocócico modificado do serogrupo W135 da invenção e/ou um sacárido capsular meningocócico modificado do serogrupo Y da invenção no fabrico de um medicamento para aumentar uma resposta imunitária num mamífero. Os sacáridos são preferivelmente conjugados. 0 medicamento é preferivelmente uma vacina.

Estas utilizações e métodos são, de preferência, para a prevenção e/ou o tratamento de uma doença causada por Neisseria (ex. meningite, septicemia, bacteremia, gonorreia, etc.). A prevenção e/ou o tratamento de meningite bacteriana e/ou meningocócica é preferível.

Uma forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve a monitorização de infecção por Neisseria após a administração da composição da invenção. Uma forma de verificar a eficácia do tratamento profilático envolve a monitorização de respostas imunitárias contra os cinco antigénios básicos após a administração da composição. A imunogenicidade das composições da invenção pode ser determinada através da sua administração a 37 indivíduos de teste (por ex., crianças com idade de 12-16 meses de idado ou modelos animais [222]) e depois determinando parâmetros padrão incluindo a atividade bactericida do soro (SBA) e títulos de ELISA (GMT) da IgG anti-cápsula total e de elevada avidez. Estas respostas imunitárias irão geralmente ser determinadas à volta de 4 semanas após a administração, da composição, e comparadas com valores determinados antes da administração da composição. 0 SBA mede a morte bacteriana mediada pelo complemento, e pode ser ensaiada usando complemento humano ou de coelhos bebés. As normas da OMS requerem uma vacina para induzir pelo menos um aumento de 4 vezes no SBA em mais de 90% dos recetores. Um aumento de SBA de pelo menos 4 vezes ou 8 vezes é preferencial. Quando mais do que uma dose da composição é administrada, mais do que uma determinação pós-administração pode ser realizada.

As composições preferenciais da invenção podem conferir um título de anticorpo num paciente que é superior ao critério para sero-proteção para cada componente antigénico para uma percentagem aceitável de indivíduos humanos. Os antigénios com um título de anticorpo associado acima do qual um hospedeiro é considerado sero-convertido contra o antigénio são bem conhecidos, e tais títulos estão publicados por organizações tal como a OMS. Preferencialmente mais do que 80% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos é sero-convertida, mais preferencialmente mais do que 90%, ainda mais preferivelmente mais de 93% e mais preferivelmente 96-100%.

As composições da invenção irão geralmente ser administradas diretamente a um paciente. A distribuição direta pode ser conseguida de injeção parentérica (por ex., subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, ou ao espaço intersticial de um tecido), ou por via retal, oral, vaginal, tópica, 38 transdérmica, intranasal, ocular, auricular, pulmonar ou outra administração da mucosa. A administração intramuscular na coxa ou na parte superior do braço é preferível. A injeção pode ser através de uma agulha (por ex., uma agulha hipodérmica), mas a injeção sem agulha pode alternativamente ser usada. Uma dose típica intramuscular é de 0,5 ml. A invenção pode ser usada para provocar imunidade sistémica e/ou da mucosa. A dosagem do tratamento pode ser um programa de dosagem única ou um programa de múltiplas doses. As doses múltiplas podem ser usadas num programa de imunização primário e/ou num programa de imunização de reforço. Um programa de dose primária pode ser seguido de um programa de reforço de dose. O intervalo adequado entre as doses de sensibilização (por ex., entre 4-16 semanas), e entre sensibilização e reforço, pode ser rotineiramente determinado.

As infeções de Neisseria afetam várias áreas do corpo e, por isso, as composições da invenção podem ser preparadas de várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas de forma injetável, ou como soluções líquidas ou como suspensões. Formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção podem também ser preparados (por ex., uma composição liofilizada). A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, auricular ou ocular, por exemplo, como 39 sprays, gotas, gel ou pó [por ex., refs. 223 e 224] . 0 sucesso com a administração nasal de sacáridos pneumocócicos [225,226], polipéptidos pneumocócicos [227], sacáridos de Hib [228], sacáridos de MenC [229], e misturas de conjugados de sacáridos de Hib e MenC [230] foram descritos.

Geral O termo "compreendendo" significa "incluindo" bem como "consistindo", por exemplo uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X+Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Quando for necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omissa da definição da invenção. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x±10%.

Expressões como "^x% de resíduos de ácido siálico são O-acetilados na posição 7", não significa que cada molécula de sacárido numa composição tenha necessariamente de ter o mesmo grau de O-acetilação na posição 7. Nem significa que cada molécula de sacárido numa composição tenha necessariamente ^x% O-acetilação na posição 7. Ainda, alguns podem ter > x% enquanto que outros têm <x%, mas o grau médio de acetilação ao longo de todas as posições 7 dos resíduos de ácido siálico na população total de sacáridos é ^x%. O mesmo se aplica a expressões como "b y% dos resíduos de ácido siálico são O-acetilados na posição 9", e semelhantes.

Será apreciado que os anéis de açúcar possam existir nas formas aberta e fechada e que, enquanto que as formas fechadas estão aqui apresentadas em fórmulas estruturais, as formas abertas também são abrangidas pela invenção. 40 O ácido siálico é também conhecido como ácido neuraminico.

BREVE DESCRIÇÃO DE FIGURAS

As figuras 1 e 2 mostram espectros RMN anotados de MenW135 e MenY hidrolisados, respetivamente.

As figuras 3 e 4 mostram o estado de O-acetilação de resíduos de ácido siálico nas posições 7 e 9 durante a preparação de conjugados MenW135-CRM197 e MenY-CRM197, respetivamente

As figuras 5 e 6 mostram títulos IgG obtidos em ratinhos contra antigénios oligossacarídicos, usando MenW135 e MenY, respetivamente.

MEIOS PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO A. Produção e purificação de polissacáridos meningocócicos

Polissacáridos capsulares foram purificados a partir de MenW135 e MenY como descrito na ref. 14.

B. Preparação de conjugados de polissacáridos modificados do serogrupo W135 e Y

Os polissacáridos purificados foram hidrolisados em tampão acetato de sódio 50 nM acético, pH 4, 7 durante cerca de 3 horas a 80°C. isto resultou em oligossacáridos com um DP médio de cerca de 15 a 20 como determinado pela relação entre ácido siálico (SA) e SA com terminal reduzido. O hidrolisado foi ultracentrifugado através de uma membrana com core de 30 kDa (12 a 20 volumes de diafiltração de 5 mM de tampão acetato/15-30 mM de NaCl pH 6,5) . O retido, contendo as espécies de elevado peso molecular, foi descartado enquanto que o permeato foi carregado numa coluna Q-Sepharose Fast Flow equilibrada em 5 mM de tampão acetato/15 mM de NaCl pH 6.5. A coluna foi depois lavada com 10 CV de tampão de equilíbrio, com o intuito de retirar oligossacáridos com DP^3-4 e eluído com 3 CV 5 mM de tampão acetato/500 mM de NaCl pH 6,5. 41

Cloreto de amónio ou acetato de amónio foi adicionado à solução dimensionada de oligossacáridos para uma concentração final de 300 g/L, depois borohidreto de sódio-ciano foi adicionado para uma concentração final de 49 g/L ou 73 g/L. A mistura foi incubada a 50°C durante 3 dias para produzir amino-oligossacáridos, que foram então purificados por ultrafiltração de fluxo tangencial com uma membrana de corte de 1 kDa ou 3 kDa usando 13 volumes de diafiltração de NaCl 0,5 M seguido de 7 volumes de diafiltração de NaCl 20 mM. Os oligossacáridos purificados foram então secados com um evaporador rotativo para retirar a água.

Os oligossacáridos secos foram solubilizados em água destilada a uma concentração de grupos amino de 40 mM, depois 9 volumes de DMSO foram adicionados seguidos de trietil-amina a uma concentração final de 200 mM. À solução resultante, foi adicionado diéster N-hidroxisuccinimido do ácido adipico para uma concentração final de 480 mM. A reação foi mantida sob agitação à temperatura ambiente durante 2 horas, depois o oligossacárido ativado foi precipitado com acetona (concentração final 80% v/v) . O precipitado foi recolhido por centrifugação e lavado várias vezes com acetona para retirar o diéster N-hidroxisuccinimido de ácido adipico que não reagiu e subprodutos. Finalmente o oligossacárido ativado foi seco sob vácuo. A quantidade de grupos éster ativos introduzidos na estrutura do oligossacárido foi determinada por um método colorimétrico como está descrito na ref. 231.

O oligossacárido ativado seco foi adicionado a uma solução de 45 mg/ml de CRMi97 em tampão fosfato 0,01 M pH 7,2 para uma relação éster ativo/proteína (mole/mole) de 12:1. A reação foi mantida sob agitação à temperatura ambiente durante a noite. Após este período, o conjugado foi purificado por diafiltração com uma membrana de 30 kDa (50 volumes de diafiltração de tampão fosfato 10 mM, pH 42 7,2). 0 conjugado purificado foi esterilizado por filtração e armazenado a -20°C ou -60°C até à formulação da vacina. C. Estado de O-acetilação dos polissacáridos durante a conjugação O estado de O-acetilação das posições C7 e C9 dos resíduos de ácido siálico na população de sacáridos modificados derivados de MenW135 e MenY foi avaliado por análise de RMN.

Os poli- e oligossacáridos intermediários do processo de conjugação (polissacáridos nativos, após hidrólise, antes da aminação, após ativação e após a conjugação) foram caracterizados usando experiências de RMN de protão 1D e 2D. As amostras de RMN 1H foram preparadas através da dissolução de oligossacáridos liofilizados em 0,75 ml de 99,9% de água deuterada 2H20 (Aldrich™) para dar soluções concentradas 10-15 mM. Em todos as experiências, foram usados tubos de RMN Wilmad de 5 mm.

Espectros 2Η RMN foram registados a 298K num espectrómetro de RMNB Bruker Avance DRX 600 MHz equipado com uma unidade BGU e usando programas de pulso padrão Bruker. Foi usada uma sonda de ressonância tripla TBI de 5 mm com z-gradientes com blindagem própria. Para o processamento de dados foi usado o software Bruker XWINNMR 3.0.

As condições de aquisição do espectro padrão de protões são recolher pontos de dados de 32 k ao longo de uma janela espectral de 6000 Hz com 4 varrimentos. Os espectros RMN 1H foram transformados pela lei de Fourier após a aplicação de uma função de alargamento de linha de 0,1 Hz e referenciado relativo à água mono-deuterada (HDO) a 4,72 ppm. A atribuição das ressonâncias e, consequentemente, a determinação da estrutura molecular foram realizadas baseando-se nos dados da literatura [232,4]. 43

Para mostrar a atribuição do pico, o espectro RMN registado do MenW135 hidrolisado e MenY hidrolisado são apresentadas nas figuras 1 e 2, respetivamente. 0 seguinte quadro fornece a proporção de todas posições C7 e C9 de ácido siálico (ácido N-acetil-neuramínico) na população de sacáridos derivada de MenW135 que foram encontradas como sendo O-acetiladas durante a preparação do conjugado:

Passo de preparação % de O-acetilação na posição 7 % de O-acetilação na posição 9 Polissacárido nativo 30,1 25, 0 Após hidrólise 16,9 26, 4 Antes da aminação 15, 0 26,2 Após ativação 5,1 26,3 Após conjugação 6,3 43, 1

Assim, a percentagem global da O-acetilação do ácido siálico na posição 7 caiu durante a preparação do conjugado, de cerca de 30% para cerca de 6%. Ao mesmo tempo, a percentagem de O-acetilação na posição 9 aumentou de cerca de 25% para cerca de 43% (figura 3) . A mudança dramática observada na posição 9 no passo final mostra que a conjugação seleciona preferencialmente aqueles sacáridos que são O-acetilados na posição 9.

Da mesma forma, o estado de O-acetilação dos resíduos de ácido siálico na população dos sacáridos modificados derivados de MenY após cada passo do processo de conjugação é dado na seguinte tabela:

Passo de preparação % de O-acetilação na posição 7 % de O-acetilação na posição 9 Polissacárido nativo 10,3 28,0 44

Após hidrólise 3,3 24, 1 Antes da aminação 5,1 25, 1 Após ativação 2,4 20,9 Após conjugação i—1 45, 1

Assim, a percentagem de O-acetilação do ácido siálico na posição 7 caiu durante a preparação do conjugado da presente invenção de cerca de 10% para cerca de 2%, antes de finalmente subir para cerca de 6% durante a reação de conjugação. Ao mesmo tempo, a percentagem de O-acetilação na posição 9 caiu de cerca de 28% para cerca de 21%, antes de finalmente subir para cerca de 45% durante a reação de conjugação (figura 4). A mudança dramática observada na posição 9 no passo final mostra que a conjugação escolhe preferencialmente aqueles sacáridos que são O-acetilados na posição 9. D. Imunogenicidade dos conjugados

Os conjugados em massa congelados foram descongelados. Cada um foi diluído, sob agitação, para uma concentração final de 20 yg de sacárido/ml, fosfato 5 mM, NaCl 9 mg/ml, fosfato de alumínio (para dar uma concentração de Al3+ de 0,6 mg/ml), pH 7,2. As misturas foram então mantidas, sem agitação, a 2-8°C durante a noite e diluídas adicionalmente com solução salina a 4 yg de sacárido/ml para a imunização de ratinho.

Um segundo conjunto de vacinas foi preparado para ambos os serogrupos da mesma maneira, mas a adição de fosfato de alumínio foi substituída com o mesmo volume de água.

Dez ratinhos Balb/c para cada grupo de imunização foram injetados s.c. duas vezes com 0,5 ml de vacina nas semanas 0 e 4. As hemorragias foram realizadas antes da imunização, no dia antes da segunda dose e 2 semanas após a segunda dose. As imunizações foram realizadas com (a) a vacina conjugada com ou sem alumínio, (b) controlo de solução salina e (c) controlo de polissacárido não conjugado. 45

Os anticorpos específicos IgG anti-polissacáridos foram determinados no soro dos animais imunizados essencialmente como descrito na ref. 233. Cada soro de ratinho individual foi analisado em duplicado através de uma curva de titulação e o GMT foi calculado para cada grupo de imunização. Os títulos foram calculados em Mouse Elisa Units (MEU) usando o software "Titerun" (FDA). A especificidade dos títulos anti polissacárido foi determinada por Elisa competitivo com o polissacárido relevante como competidor.

Como é mostrado na Figura 5, o conjugado MenW135 induziu elevados títulos anticorpo em animais. Como esperado, o polissacárido não conjugado não foi imunogénico. A formulação do conjugado com um fosfato de alumínio como adjuvante induziu um elevado nível de anticorpos comparado com o título obtido pelo conjugado sozinho. Resultados semelhantes foram observados para o MenY (Figura 6).

Os soros Post-II foram testados para atividade bactericida usando um ensaio in vitro para medir a lise mediada pelo complemento das bactérias. Os soros Post-II foram inativados durante 30 min a 56°C antes do uso no ensaio, e 25% do complemento de coelho bebé foi usado como fonte de complemento. O título bactericida foi expresso como a diluição recíproca do soro rendendo a morte de 50% das bactérias contras as seguintes estirpes: MenW135, 5554 (OAc+); MenY, 242975 (OAc+).

Um polissacárido capsular derivado de MenW135 não rendeu um valor de GMT e deu uma atividade bactericida de apenas 4. Em contraste, os conjugados des-O-acetilados da invenção deram valores entre 14 e 565, com títulos bactericidas entre 64 e 2048.

Um polissacárido capsular derivado de MenY não rendeu um valor de GMT e deu uma atividade bactericida de apenas 256. Em contraste, os conjugados des-O-acetilados da 46 invenção deram valores de GMT entre 253 e 1618, com títulos bactericidas entre 256 e 16384.

Será entendido que a invenção foi descrita como forma de exemplo apenas e que modificações podem ser feitas, enquanto permanece no âmbito da invenção, que é definido nas reivindicações anexas. Em particular, modificações menores que não afetem a imunogenicidade do sacárido capsular modificado da presente invenção são também previstas.

REFERENCIAS

[1] US patent 4,711,779 [2] US patent 4,761,283 [3] US patent 4,882,317 [4] Lemercinier et al. (1996) Carbohydr Res 296: 83-96.

[5] Jones & Lemercinier (2002) J Pharm Biomed Anal 30:1233-47 .

[6] Claus et al. (2004) Molecular Microbiology 51:227-39.

[7] Longworth et al. (2002) 13th International Pathogenic

Neisseria Conference. Abstract, p.272.

[8] Longworth et al. (2002) FEMS Immunol Med Microbiol 32:119-23 .

[9] Pollard et al. (2003) Emerging Infectious Diseases 9:1503-4.

[10] Glode Μ. P. et al. (1979) J Inflect Dis 139:52-56 [11] WO94/05325; US patent 5,425,946.

[12] Berry et al. (2002) Infect Immun 70:3707-13.

[13] Frash (1990) p.123-145 of Advances in Biotechnological Processes vol. 13 (eds. Mizrahi & Van Wezel) [14] W003/007985.

[15] Inzana (1987) Infect. Immun. 55:1573-1579.

[16] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816.

[17] Kandil et al. (1997) Glycoconj J 14:13-17.

[18] Berkin et al. (2002) Chemistry 8:4424-4433.

[19] Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195-6 [20] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:528-36 [21] Buttery & Μοχοη (2000) J R Coll Physicians Lond 34 :163-8 [22] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii [23] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567 [24] EP-B-0 477 508 [25] US patent 5,306,492 [26] W098/42721 [27] Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, Vol. 10, 48-114 [28] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego CA (1996) [29] Anonymous (Jan 2002) Research Disclosure, 453077.

[30] Anderson (1983) Infect Immun 39(1):233-238.

[31] Anderson et al. (1985) J Clin Invest 76(1):52-59.

[32] EP-A-03 72501.

[33] EP-A-0378881.

[34] EP-A-0 42 7347.

[35] W093/17712 [36] W094/03208.

[37] W098/58668.

[38] EP-A-0 4 7117 7. - [39] WO91/01146 [40] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[41] Baraldo et al, (2004) Infect Immun.72:4884-7 [42] EP-A-0594610.

[43] WO00/56360.

[44] W002/091998.

[45] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[46] WOOl/72337 [47] WOOO/61761.

[48] WO2004/083251.

[49] WO99/42130 [50] WO96/40242 [51] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198. 48 [52] WO95/08348.

[53] US patent 4,695,624 [54] Mol. Immunol., 1985, 22, 907-919 [55] EP-A-0208375 [56] Bethell G.S. et al., J. Biol. Chem., 1979, 254, 2572-4 [57] HeamM.T.W., J. Chromatogr., 1981, 218, 509-18 [58] EP-A-0208375 [59] EPO 720485 [60] EP0814833.

[61] WO00/10599 [62] Gever et al. (1979) Med. Microbiol. Immunol 165:171- 288 .

[63] US patent 4,057,685.

[64] US patents 4,673,574 & 4,808,700.

[65] US patent 4,459,286.

[66] US patent 4,965,338 [67] US patent 4,663,160.

[68] US patent 4,356,170 [69] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103 :259-264.

[70] WO00/38711; US patent 6,146,902.

[71] WOOO/56365 [72] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[73] WO98/20734 [74] WO03/009869.

[75] Vaccine design:the subunit and adjuvant approach (1995) Powell & Newman. ISBN 0-306-44867-X.

[76] WO00/23105.

[77] WO90/14837.

[78] US patent 5,057,540.

[79] WO 96/33739.

[80] EP-A-0109942.

[81] W096/11711.

[82] WO00/07621. 49 [83] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delively Reviews 32 :247-271.

[84] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery

Reviews 32:321-338.

[85] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.

[86] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.

[87] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.

[88] Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760.

[89] W003/024480 [90] W003/024481 [91] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16.

[92] EP-A-0689454.

[93] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273- 2278 .

[94] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[95] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[96] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.

[97] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31: 2393-2400.

[98] WO02/26757.

[99] W099/62923.

[100] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[101] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medicai

Microbiology 32:179-185.

[102] WO98/40100.

[103] US patent 6,207,646.

[104] US patent 6,239,116.

[105] US patent 6,429,199.

[106] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society

Transactions 31 (part 3):654-658.

[107] Black-well et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[108] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[109] WO 01/95935.

[110] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.

[111] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861. 50 [112] WO03/035836.

[113] W095/17211.

[114] W098/42375.

[115] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[116] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[117] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.

[118] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306- 5313.

[119] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.

[120] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216.

[121] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285- 293 .

[122] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.

[123] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

[124] W099/44636.

[125] Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276.

[126] WO99/27960.

[127] US patent 6,090,406 [128] US patent 5,916,588 [129] EP-A-0626169.

[130] W099/52549.

[131] W001/21207.

[132] WO01/21152.

[133] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.

[134] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185- 196 .

[135] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[136] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

[137] W099/11241.

[138] W094/00153.

[139] W098/57659.

[140] European patent applications 0835318, 0735898 and 0761231.

[141] W099/24578.

[142] W099/36544. 51 [143] WO99157280.

[144] WO00/22430.

[145] WO01/64920.

[146] WOOl/64922.

[147] W003/020756.

[148] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

[149] W096/29412.

[150] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.

[151] W002/09643.

[152] Katial et al. (2002) Infect Iminun 70 : 702-707.

[153] WOOl/52885.

[154] European patent 0301992.

[155] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096.

[156] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958.

[157] W002/09746.

[158] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323- 333 .

[159] W001/09350.

[160] European patent 0449958.

[161] EP-A-0996712.

[162] EP-A-0680512.

[163] WO02/062378.

[164] W099/59625.

[165] US patent 6,180,111.

[166] WOOl/34642.

[167] W003/051379.

[168] US patent 6,558,677 [169] W02004/019977 [170] W002/062380.

[171] WOO 0/25811.

[172] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015.

[173] Vermont et al. (2003) Infect Immun 71:1650-1655.

[174] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263.

[175] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[176] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326. 52 [177] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.

[178] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J Med. 334:349-355.

[179] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238.

[180] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.

[181] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.

[182] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287- 308.

[183] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.

[184] Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9 :271-283.

[185] Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648.

[186] Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480.

[187] Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447.

[188] Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120.

[189] Dubensky et al. (2000) Mol Med 6:723-732.

[190] Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74.

[191] Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S190-193.

[192] Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90.

[193] Charalambous & Feavers (2001) J Med Microbiol 50:937-939 .

[194] Westerink (2001) Int Rev Immunol 20:251-261.

[195] Grothaus et al. (2000) Vaccine 18:1253-1263.

[196] W003/080678.

[197] WO98/08543.

[198] W02004/032958, and UK patent applications 0223741.0, 0305831.0 & 0309115.4.

[199] http:/ /neisseria.org/nm/typing/mlst/ [200] Pettersson et al. (1994) Microb Pathog 17(6):395-408.

[201] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145. 53 [202] Welsch et al. (2002) 13th International Pathogenic

Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Genome-derived antigen (GNA) 2132 elicits protective serum antibodies to groups B and C Neisseria meningitidis strains.

[203] Santos et al. (2002) 13th International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Serum bactericidal responses in rhesus macaques immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the genome of N. meningitidis.

[204] Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of

Paediatrics 42:421-427.

[205] W097/00697.

[206] W002/00249.

[207] W096/37222; US patent 6,333,036.

[208] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[209] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[210] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[211] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440.

[212] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630.

[213] Tettelin et al. (2001) Science 293:498-506.

[214] Hoskins et al (2001) JBacteriol 183:5709-5717.

[215] Rappuoli (2000) Curr Opin Microbiol 3:445-450 [216] Rappuoli (2001) Vaccine 19:2688-2691.

[217] Masignani et al. (2002) Expert Opin Biol Ther 2:895- 905.

[218] Mora et al. (2003) Drug Discov Today 8:459-464.

[219] Wizemann et al. (2001) Infect Immun 69:1593-1598.

[220] Rigden et al. (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38 :143-168.

[221] WO02/22167.

[222] W001/30390.

[223] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.

[224] Agarwal & Mishra (1999) Indian J Exp Biol 37:6-16. 54 [225] WOOO/53221.

[226] Jakobsen et al. (2002) Infect Immun 70:1443-1452.

[227] Wu et al. (1997) J Infect Dis 175:839-846.

[228] Bergquist et al. (1998) APMIS 106:800-806.

[229] Baudner et al. (2002) Infect Immun 70:4785-4790.

[230] Ugozzoli et al. (2002) J Infect Dis 186:1358-1361.

[231] Miron & Wilchek (1982) Anal. Biochem. 126:433-435.

[232] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816.

[233] Carlone et al (1992) J.Clin. Microbiol. 30:154-159.

[234] Kao & Tsai (2004) Vaccine 22:335-44.

[235] Cescutti et al. (1996) Biochem Biophys Res Commun 224:444-50. 55

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

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Documentos de patente citados na descrição us 4711779 A [0174] us 4761283 A [0174] us 4882317 A [0174] WO 9405325 A [0174] us 5425946 A [0174] WO 03007985 A [0174] EP 0477508 B [0174] us 5306492 A [0174] WO 9842721 A [0174] EP 0372501 A [0174] EP 0378881 A [0174] EP 0427347 A [0174] WO 9317712 A [0174] WO 9403208 A [0174] WO 9858668 A [0174] EP 0471177 A [0174] WO 9101146 A [0174] EP 0594610 A [0174] WO 0056360 A [0174] WO 0209199: 8 A [0174] • WO 0172337 A [0174] • WO 0061761 A [0174] • WO 2004083251 A [0174] • WO 9942130 A [0174] • WO 9640242 A [0174] • WO 9508348 A [0174] 56 us 4695624 A [0174] EP 0208375 A [0174] EP 0720485 A [0174] EP 0814833 A [0174] WO 0010599 A [0174] US 4057685 A [0174] US 4673574 A [0174] US 4459286 A [0174] US 4965338 A [0174] US 4663160 A [0174] US 4356170 A [0174] WO 0038711 A [0174] US 6146902 A [0174] WO 0056365 A [0174] WO 9820734 A [0174] WO 0300986S ) A [0174] WO 0023105 A [0174] WO 9014837 A [0174] us 5057540 A [0174] WO 9633739 A [0174] EP 0109942 A [0174] WO 9611711 A [0174] WO 0007621 A [0174] WO 0302448C ) A [0174] WO 03024481 . A [0174] EP 0689454 A [0174] WO 0226757 A [0174] WO 9962923 A [0174] WO 9840100 A [0174] us 6207646 B [0174] us 6239116 B [0174] us 6429199 B [0174] WO 0195935 A [0174] • WO 03035836 A [0174] • WO 9517211 A [0174] 57 WO 9842375 A [0174] WO 9944636 A [0174] WO 9927960 A [0174] US 6090406 A [0174] US 5916588 A [0174] EP 0626169 A [0174] WO 9952549 A [0174] WO 0121207 A [0174] WO 0121152 A [0174] WO 9911241 A [0174] WO 9400153 A [0174] WO 9857659 A [0174] EP 0835318 A [0174] EP 0735898 A [0174] EP 0761231 A [0174] WO 9924578 A [0174] WO 9936544 A [0174] WO 9915728 0 A [0174] WO 0022430 A [0174] WO 0164920 A [0174] WO 0164922 A [0174] WO 03020756 A [0174] WO 9629412 A [0174] WO 0209643 A [0174] WO 0152885 A [0174] EP 0301992 A [0174] WO 0209746 A [0174] • WO 0109350 A [0174] • EP 0449958 A [0174] • EP 0996712 A [0174] • EP 0680512 A [0174] • WO 02062378 A [0174] • WO 9959625 A [0174] • US 6180111 B [0174] • WO 0134642 A [0174] 58 • WO 03051379 A [0174] • US 6558677 B [0174] • WO 2004019977 A [0174] • WO 02062380 A [0174] • WO 0025811 A [0174] • WO 03080678 A [0174] • WO 9808543 A [0174] • WO 2004032958 A [0174] • GB 0223741 A [0174] • GB 0305831 A [0174] • WO 9700697 A [0174] • WO 0200249 A [0174] • WO 9637222 A [0174] • US 6333036 B [0174] • WO 0222167 A [0174] • WO 0130390 A [0174] • WO 0053221 A [0174]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • LEMERCINIER et al. Carbohydr Res, 1996, vol. 296, 83- 96 [0174] • JONES ; LEMERCINIER. J Pharm Biomed Anal, 2002, vol. 30, 1233-47 [0174] • CLAUS et al. Molecular Microbiology, 2004, vol. 51, 227-39 [0174] • LONGWORTH et al. 13th International Pathogenic Neisseria Conference, 2002, 272 [0174] • LONGWORTH et al. FEMS Immunol Med Mlcrobiol,2002, vol. 32, 119-23 [0174] • POLLARD et al. Emerging Infectious Diseases, 2003, vol. 9, 1503-4 [0174] • GLODE Μ. P. et al. J Inflect Dls, 1979, vol. 139, 52-56 [0174] 59 • BERRY et al. Infect Immun, 2002, vol. 70, 3707-13 [0174] • FRASH. Advances in Biotechnological Processes. 1990, vol. 13, 123-145 [0174] • INZANA. Infect. Immun., 1987, vol. 55, 1573-1579 [0174] • RAVENSCROFT et al. Vaccine, 1999, vol. 17, 2802-2816 [0174] • KANDIL et al. Glycoconj J, 1997, vol. 14, 13-17 [0174] • BERKIN et al. Chemistry, 2002, vol. 8, 4424-4433 [0174] • RAMSAY et al. Lancet, 2001, vol. 357 (9251), 195-6 [0174] • LINDBERG. Vaccine, 1999, vol. 17 (2), 528-36 [0174] • BUTTERY ; MOXON. J R Coll Physicians Lond, 2000, vol. 34, 163-8 [0174] • AHMAD ; CHAPNICK. Infect Dis Clin North Am, 1999, vol. 13, 113-33 [0174] • GOLDBLATT. J. Med. Microbiol., 1998, vol. 47, 563-567 [0174] • DICK et al. Conjugate Vaccines. Karger, 1989, vol. 10, 48-114 [0174] • HERMANSON. Bioconjugate Techniques. Academic Press, 1996 [0174] • ANONYMOUS. Research Disclosure, January 2002 [0174] • ANDERSON. Infect Immun, 1983, vol. 39 (1), 233- 238 [0174] • ANDERSON et al. J Clin Invest, 1985, vol. 76 (1), 52-59 [0174] • FALUGI et al. Eur J Immunol, 2001, vol. 31, 3816- 3824 [0174] • BARALDO et al. Infect Immun., 2004, vol. 72, 4884-7 [0174] • KUO et al. Infect Immun, 1995, vol. 63, 2706-13 [0174] • LEES et al. Vaccine, 1996, vol. 14, 190-198 [0174] 60

Mol. Immunol., 1985, vol. 22, 907-919 [0174] BETHELL G.S. et al. J. Biol. Cheia., 1979, vol. 254, 2572-4 [0174] HEAM M.T.W. J. Chromatogr., 1981, vol. 218, 509-18 [0174] GEVER et al. Med. Microbiol. Immunol, 1979, vol. 165, 171-288 [0174] LEI et al. Dev Biol (Basel, 2000, vol. 103, 259-264 [0174] GENNARO. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 2000 [0174]

Vaccine design:the subunit and adjuvant approach. Powell & Newman, 1995 [0174] BARR et al. Advanced Drug Delively Reviews, 1998, vol. 32, 247-271 [0174] SJOLANDERET et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, vol. 32, 321-338 [0174] NIIKURA et al. Virology, 2002, vol. 293, 273-280 [0174] LENZ et al. J Immunol, 2001, vol. 166, 5346-5355 [0174] PINTO et al. J Infect Dis, 2003, vol. 188, 327-338 [0174] GERBER et al. Virol, 2001, vol. 75, 4752-4760 [0174] GLUCK et al. Vaccine, 2002, vol. 20, B10-B16 [0174] JOHNSON et al. Bioorg Med Chem Lett, 1999, vol. 9, 2273-2278 [0174] EVANS et al. Expert Rev Vaccines, 2 003, vol. 2, 219- 229 [0174] MERALDI et al. Vaccine, 2003, vol. 21, 2485-2491 [0174] PAJAK et al. Vaccine, 2003, vol. 21, 836-842 [0174] KANDIMALLA et al. Nucleic Acids Research, 2003, vol. 31, 2393-2400 [0174] KRIEG. Nature Medicine, 2003, vol. 9, 831-835 [0174] 61 MCCLUSKIE et al. FEMS Immunology and Medicai Microbiology, 2002, vol. 32, 179-185 [0174] KANDIMALLA et al. Biochemical Society Transactions, vol. 31, 654-658 [0174] BLACK—WELL et al. J Immunol, 2003, vol. 170, 4061-4068 [0174] KRIEG. Trends Immunol, 2002, vol. 23, 64-65 [0174] KANDIMALLA et al. BBRC, 2003, vol. 306, 948-953 [0174] BHAGAT et al. BBRC, 2003, vol. 300, 853-861 [0174] BEIGNON et al. Infect Immun, 2002, vol. 70, 3012-3019 [0174] PIZZA et al. Vaccine, 2001, vol. 19, 2534-2541 [0174] PIZZA et al. Int J Med Microbiol, 2000, vol. 290, 455-461 [0174] SCHARTON—KERSTEN et al. Infect Immun, vol. 68, 5306- 5313 [0174] RYAN et al. Infect Immun, 1999, vol. 67, 6270-6280 [0174] PARTIDOS et al. Immunol Lett, 1999, vol. 67, 209-216 [0174] PEPPOLONI et al. Expert Rev Vaccines, 2 0 03, vol. 2, 285-293 [0174] PINE et al. J Control Release, 2002, vol. 85, 263-270 [0174] DOMENIGHINI et al. Mol Microbiol, 1995, vol. 15, 1165-1167 [0174] SINGH et al. J Cont Release, 2001, vol. 70, 267-276 [0174] ANDRIANOV et al. Biomaterials, 1998, vol. 19, 109-115 [0174] PAYNE et al. Adv Drug Delivery Review, 1998, vol. 31, 185-196 [0174] STANLEY. Clin Exp Dermatol, 2002, vol. 27, 571-577 [0174] 62 JONES. Curr Opin Investig Drugs, 2003, vol. 4, 214-218 [0174] TETTELIN et al. Science, 2000, vol. 287, 1809-1815 [0174] PIZZA et al. Science, 2000, vol. 287, 1816-1820 [0174] KATIAL et al. Infect Immun, 2002, vol. 70, 702-707 [0174] BJUNE et al. Lancet, 1991, vol. 338 (8775), 1093-1096 [0174] FUKASAWA et al. Vaccine, 1999, vol. 17, 2951-2958 [0174] ROSENQVIST et al. Dev. Biol. Stand., 1998, vol. 92, 323-333 [0174] PEETERS et al. Vaccine, 1996, vol. 14, 1008-1015 [0174] VERMONT et al. Infect Immun, 2003, vol. 71, 1650-1655 [0174] COSTANTINO et al. Vaccine, 1999, vol. 17, 1251-1263 [0174] BELL. Pediatr Infect Dis J, 2000, vol. 19, 1187-1188 [0174] IWARSON. APMIS, 1995, vol. 103, 321-326 [0174] GERLICH et al. Vaccine, 1990, vol. 8, 63-6879-80 [0174] GUSTAFSSON et al. N. Engl. J Med., 1996, vol. 334, 349-355 [0174] RAPPUOLI et al. TIBTECH, 1991, vol. 9, 232-238 [0174] Vaccines. 1988 [0174] DEL GUIDICE et al. Molecular Aspects of Medicine, 1998, vol. 19, 1-70 [0174] SUTTER et al. Pediatr Clin North Am, 2000, vol. 47, 287-308 [0174] ZIMMERMAN ; SPANN. Am Fam Physician, 1999, vol. 59, 113-118125-126 [0174] 63 ROBINSON ; TORRES. Seminars in Immunology, 1997, vol. 9, 271-283 [0174] DONNELLY et al. Annu Rev Immunol, 1997, vol. 15, 617- 648 [0174] SCOTT-TAYLOR ; DALGLEISH. Expert Opin In-vestig Drugs, 2000, vol. 9, 471-480 [0174] APOSTOLOPOULOS ; PLEBANSKI. Curr Opin Mol Ther, 2000, vol. 2, 441-447 [0174] ILAN. Curr Opin Mol Ther, 1999, vol. 1, 116-120 [0174] DUBENSKY et al. Mol Med, 2000, vol. 6, 723-732 [0174] ROBINSON ; PERTMER. Adv Vírus Res, vol. 55, 1-74 [0174] DONNELLY et al. Am J Respir Crit Care Med, 2000, vol. 162, 190-193 [0174] DAVIS. Mt. Sinai J. Med., 1999, vol. 66, 84-90 [0174] CHARALAMBOUS ; FEAVERS. J Med Microbiol, 2001, vol. 50, 937-939 [0174] WESTERINK. Int Rev Immunol, 2001, vol. 20, 251-261 [0174] GROTHAUS et al. Vaccine, 2000, vol. 18, 1253-1263 [0174] PETTERSSON et al. Microb Pathog, 1994, vol. 17 (6), 395-408 [0174] MAIDEN et al. PNAS USA, 1998, vol. 95, 3140-3145 [0174] WELSCH et al. Genome-derived antigen (GNA) 2132 elicits protective serum antibodies to groups B and C Neisseria meningitidis strains. 13th International Pathogenic Neisseria Conference, 01 September 2008 [0174] SANTOS et al. Serum bactericidal responses in rhesus macaques immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the genome of N. meningitidis. 13th International Pathogenic Neisseria Conference, 01 September 2002 [0174] 64 KANRA et al. The Turkish Journal of Paediatrics, 1999, vol. 42, 421-427 [0174] WATSON. Pediatr Infect Dis [0174] RUBIN. Pediatr Clin North [0174] JEDRZEJAS. Microbiol Mol Bi 207 [0174] ZIELEN et al. Infect. 1435-1440 [0174] DARKES ; PLOSKER. Paediatr 630 [0174] TETTELIN et al. Science, [0174] 2000, vol. 19, 331- -332 2000, vol. 47, 269- -285 ol Rev, 2001, vol. 65, 187- Immun. 2000 , vol. co Drugs, 2002, vol. 4, 609- 2001, vol. 293, 498 -506 JBacteriol, 2001, vol. 183, 5709-5717 [0174] Curr Opin Microbiol, 2000, vol. 3, 445-450 HO et al RAPPUOLI [0174] RAPPUOLI. Vaccine, 2001, vol. 19, 2688-2691 [0174] MASIGNANI et al. Expert Opin Biol Ther, 2002, vol. 2, 895-905 [0174] MORA et al. Drug Discov Today, 2003, vol. 8, 459-464 [0174] WIZEMANN et al. Infect Immun, 2001, vol. 69, 1593-1598 [0174] RIGDEN et al. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2003, vol. 38, 143-168 [0174] ALMEIDA ; ALPAR. J. Drug Targeting, 1996, vol. 3, 455-467 [0174] AGARWAL ; MISHRA. Indian J Exp Biol, 1999, vol. 37, 6-16 [0174] JAKOBSEN [0174] et al. Infect Immun, 2002, vol . 70, 1443-1452 WU et al. J Infect Dis, 1997, vol. 175, 839-846 [0174] BERGQUIST et al. APMIS, 1998, vol. 106, 800-806 [0174] 65 65 159 [0174] - · r — — — f - — - — t • KAO ; TSAI. Vaccine, 2004, vol. 22, 335-44 [0174] • CESCUTTI et al. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 224, 444-50 [0174] BAUDNER et al. Infect Immun, 2002, vol. 70, 4785 [0174] UGOZZOLI et al. J Infect Dis, 2002, vol. 186, 1361 [0174] MIRON ; WILCHEK. Anal. Biochem., 1982, vol. 126, 435 [0174] CARLONE et al. J.Clin. Microbiol., 1992, vol. 30, -4790 1358- 433- 154- vol.

Claims (26)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 modificado, conjugado com uma proteína transportadora, onde: (a) entre 2-9% dos resíduos de ácido siálico no sacárido são O-acetilados na posição 7; e/ou (b) entre 35-55% dos resíduos de ácido siálico no sacárido são 0- acetilados na posição 9.

2. Um sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y modificado, conjugado com uma proteína transportadora, onde: (a) entre 2-9% dos resíduos de ácido siálico no sacárido são O-acetilados na posição 7; e/ou (b) entre 35-55% de resíduos de ácido siálico no sacárido são 0- acetilados na posição 9.

3. 0 sacárido capsular meningocócico modificado da reivindicação 1 ou reivindicação 2, onde entre 4-8% dos resíduos de ácido siálico no sacárido são O-acetilados na posição 7.

4. 0 sacárido capsular meningocócico modificado da reivindicação 1 ou reivindicação 2, onde entre 40-50% dos resíduos de ácido siálico no sacárido são O-acetilados na posição 9.

5. Um sacárido capsular meningocócico modificado, conjugado com uma proteína transportadora, onde o sacárido compreende n ou mais unidades repetidas da unidade do dissacárido: [ácido siálico] - [hexose] onde a hexose é ou galactose ou glucose e n é um número inteiro de 1 a 100, e onde: 2 (a) x% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 7; e/ou (b) quando a hexose é galactose, y% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 9, e quando a hexose é glucose, y% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n unidades repetidas são O-acetilados na posição 9, onde: quando a hexose é galactose, x está entre 2-9 e y está entre 35-55; e quando a hexose é glucose, x está entre 2-9, y está entre 35-55.

6. 0 sacárido da reivindicação 5, onde a hexose é a galactose, 6±0,6% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 7, e 43±4,3% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 9.

7. 0 sacárido da reivindicação 5, onde a hexose é glucose, 6±0,6% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 7, e 43±4,5% dos resíduos de ácido siálico nas referidas n ou mais unidades repetidas são O-acetilados na posição 9.

8. Uma composição que compreende a moléculas do sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135, onde: (i) o número médio de resíduos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular é b, e onde: (a) entre 2-9% dos resíduos de ácido siálico do serogrupo W135 a ·b na composição são O-acetilados na posição 7; e/ou (b) entre 35-55% dos resíduos de ácido siálico do serogrupo W135 a-b na composição são O-acetilados na posição 9; e (ii) o sacárido está conjugado com uma proteína transportadora. 3

9. Uma composição que compreende a moléculas do sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y, onde: (i) o número médio de resíduos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular é b, e onde: (a) entre 2-9% dos resíduos de ácido siálico do serogrupo Y a-b na composição são 0-acetilados na posição 7; e/ou (b) entre 35-55% dos resíduos de ácido siálico do serogrupo Y a»b na composição são 0-acetilados na posição 9; e (ii) o sacárido está conjugado com uma proteína transportadora.

10. Um sacárido que compreende n ou mais repetições da seguinte unidade de dissacárido:

onde: - n é um número inteiro entre 1 e 100, - X e Y são grupos diferentes selecionados entre -H e -OH, - Ri é independentemente selecionado de -H e -COCH3 e pode ser o mesmo ou diferente em cada unidade do dissacárido, - R2 é independentemente selecionado de -H e -COCH3 e pode ser o mesmo ou diferente em cada unidade do dissacárido, e, 4 quando X é -OH e Y é -H, (a) 2-10% de Ri sao - COCH3 e/ou (b) 35-55% de R2 são -COCH3, quando X é -H e Y é -OH, (a) 2-9% de R1 são - COCH3 e/ou (b) 35-55% de R2 são -COCH3, e onde 0 sacárido está conjugado a uma proteína transportadora.

11. 0 sacárido de qualquer reivindicação anterior, onde o sacárido tem um grau médio de polimerização inferior a 30.

12. O sacárido de qualquer reivindicação anterior, onde a proteína transportadora é selecionada a partir de um grupo que consiste em: toxóide da difteria, toxóide do tétano, proteína D do H. influenzae e CRMi97.

13. Uma composição imunogénica que compreende (a) um conjugado de sacárido capsular modificado de qualquer reivindicação anterior, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. A composição da reivindicação 13, em forma aquosa.

15. A composição da reivindicação 13, em forma liofilizada.

16. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 15, que compreende ainda um antigénio do sacárido capsular do serogrupo C de N. meningitidis.

17. A composição de qualquer uma das reclamações 13 a 16, que compreende ainda um antigénio do sacárido capsular do serogrupo A de N. meningitidis. 5

18. A composição da reivindicação 17, onde o antigénio do serogrupo A é um sacárido modificado no qual um ou mais dos grupos hidroxilo no sacárido nativo foi/foram substituído(s) por um grupo bloqueador.

19. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 18, que compreende ainda um antigénio do serogrupo B de N. meningitidis.

20. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 19, que compreende ainda um antigénio de sacárido de Haemophilus influenzae tipo B.

21. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 20, que compreende ainda um antigénio de Streptococcus pneumoniae.

22. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 21, que compreende ainda um ou mais de: um antigénio do vírus da hepatite A; um antigénio do vírus da hepatite B; um antigénio de Bordetella pertussis; um toxóide de difteria; um toxóide do tétano; e/ou um antigénio de poliovírus.

23. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 22, para uso como medicamento.

24. A composição de qualquer uma das reivindicações 13 a 22, para uso num método para aumentar a resposta de anticorpos num mamífero.

25. 0 uso de um conjugado de sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 modificado e/ou um conjugado de sacárido capsular meningocócico do serogrupo Y modificado, como definido em qualquer uma das 6 reivindicações 1 a 12, no fabrico de um medicamento para proteger contra a meningite meningocócica.

26. Um processo para preparar um conjugado imunogénico que compreende os passos de: (1) fornecer um sacárido capsular meningocócico do serogrupo W135 ou serogrupo Y de partida e uma proteína transportadora, um ou ambos dos quais é/são opcionalmente modificados para torná-lo/los reativos entre si; (2) formar uma ligação covalente entre o sacárido e a proteína transportadora; e (3) purificar os glicoconjugados resultantes, onde, entre os passos (1) e (3), o grau de O-acetilação na posição 9 dos resíduos de ácido siálico no sacárido de partida aumenta para 35-55%.