MXPA06003729A - Sacaridos capsulares de meningococos hipo-e hiperacetilados. - Google Patents

Sacaridos capsulares de meningococos hipo-e hiperacetilados.

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Abstract

Los sacaridos capsulares derivados de los serogrupos W135 de Neisseria meningitidis tienen niveles alterados de O-acetilacion en las posiciones 7 y 9 de sus residuos de acido sialico, y pueden ser usados para hacer composiciones inmunogenicas. Con relacion a los sacaridos nativos no modificados, los derivados de la invencion son seleccionados preferentemente durante la conjugacion a proteinas portadoras, y los conjugados de los derivados muestran inmunogenicidad mejorada comparada con los polisacaridos nativos.

Description

SACARIDOS CAPSULARES DE MENINGOCOCOS HIPO- E HIPERACETILADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está relacionada con el campo de los sacáridos capsulares de meningococos y sus derivados conjugados . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polisacáridos son moléculas biológicas importantes y han sido usados ampliamente en la industria farmacéutica para la prevención y tratamiento de las enfermedades. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares han sido usados por muchos años en vacunas contra bacterias con cápsula, tales como meningococos (Neisseria meningitidis) , neumococos (Streptococcus pneumonía) y Hib {Haemophilus influenza del tipo B) . Para incrementar la inmunogenicidad de los polisacáridos capsulares, particularmente en niños, se desarrollan vacunas de conjugados. Estos comprenden un sacárido capsular conjugado a una proteína portadora (por ejemplo, referencias 1-3). La conjugación convierte antigenos independientes a células T en antígenos dependientes a células T. El sacárido capsular del serogrupo W135 Neisseria meningitidis ("MenW135") comprende un polímero de unidades de disacárido de ácido siálico-galactosa : Reí.: 172059 ?4-Il^e^5Ác7/9OAc^&^6)- -0al- í? Donde "Neu" se refiere a ácido neuramínico, conocido comúnmente como ácido siálico. Similármente, el sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis (Men Y) comprende un polímero de unidades de disacárido de ácido sialico-glucosa ?4 J>-N^>5Ac(7/90Ac)-a-(2--HS D-Glc -(l? En la naturaleza, estos sacáridos capsulares han sido encontrados para ser O-acetilados en algunas de las posiciones 7 y 9 de algunos de los residuos de ácido siálico. La O-acetilación del sacárido W135 es "reportada por primera vez" en la referencia 4, con la O-acetilación en las posiciones 0-7 y 0-9 que se reportan. La acetilación en las posiciones 0-7 y 0-9 es también observada para el sacárido del serogrupo Y, aunque los autores notaron que el trabajo previo ha indicado la O-acetilación en las posiciones 0-7, 0" -3 ó 0"-4. Se reportan estudios adicionales sobre el contenido de 0-acetilo de los sacáridos en la referencia 5. La referencia 5 reporta que "hay un cuerpo de evidencia creciente que la O-acetilación no es importante para producir una respuesta de anticuerpo protectora" para el serogrupo W135. En contraste, la referencia 6 reporta que hay "evidencia de que la O-acetilación afecta la inmunogenicidad de las vacunas de polisacáridos" . En la premisa de que la "O-acetilación del CPS (por sus siglas en inglés) (polisacárido capsular) puede no ser importante para producir inmunidad protectora", sin embargo, los autores de la referencia 5 investigaron la acetilación en los serogrupos W135 y Y. Entre sus resultados, no se observa cambio en la O-acetilación para estos dos serogrupos después de almacenamiento en condiciones básicas por 9 días en temperatura ambiente.- La referencia 7 reporta que "el estado de la 0-acetilación de las cepas 135 y Y" usadas en vacunas de polisacaridos tetravalentes "no se reporta" previamente. Los autores en la referencia 8 reportan que "se conoce poco acerca del estado de la O-acetilación de los serogrupos W135 y Y" , y establecen que trabajo adicional "puede proporcionar señales útiles en la formulación óptima de vacunas" , aunque la naturaleza de tal trabajo adicional y las posibles señales no son elaboradas. La referencia 9 reporta que la "relevancia de la O-acetilación para desarrollo de vacunas permanece incierto" para el serogrupo W135. La referencia 6 está de acuerdo con esos datos "sobre el impacto de la O-acetilación en la inmunogenicidad de polisacáridos del serogrupo W-135 o Y no están aún disponibles" (Enero de 2004) . Esta confusión y carencia de información para los serogrupos W135 y Y contrasta con los otros dos serogrupos para los cuales las vacunas de sacáridos están actualmente en uso. La variación en la O-acetilación del polisacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis ha sido ampliamente reportada (10,11), pero no parece tener ningún impacto negativo en la inmunogenicidad, ya que los productos Menjugate™ y NeisVac-C™ son ambos efectivos. En contraste, la des-O-acetilación del polisacárido del serogrupo A ha sido asociado con una "reducción dramática en la inmunogenicidad" (12) . Es un objeto de la invención proporcionar derivados de sacárido capsular que pueden ser usados para hacer composiciones inmunogénicas , particularmente cuando se conjugan a proteínas portadoras, y particularmente para serogrupos W135 y Y de meningococos . DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A pesar de la cuestión incierta del papel de la O-acetilación en vacunas para serogrupos W135 y Y, los inventores han encontrado que la O-acetilación puede en efecto ser relevante, particularmente durante la preparación de vacunas de conjugados. La invención se basa en el descubrimiento de que los sacáridos capsulares modificados derivados de Men W135 y MenY que tienen niveles alterados de O-acetilación en las posiciones 7 y 9 de los residuos de ácido siálico pueden ser usados para hacer composiciones inmunológicas . Con relación a los sacáridos nativos no modificados, los derivados de la invención son seleccionados preferentemente durante la conjugación a proteínas portadoras. Por otra parte, los conjugados de estos derivados muestra inmunogenicidad mejorada comparada con los polisacáridos nativos. Almidones Modificados De esta forma la invención proporciona un sacárido capsular de meningococo del serogrupo W135 modificado, en donde: (a) < x% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) y% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 9. Similarmente, la invención proporciona un sacárido capsular de meningococo del serogrupo Y modificado, en donde: (a) < x% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) > y% ó <_ z% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 9. El valor de x depende del serogrupo: para el serogrupo 135, x es 29 ó menos (por ejemplo, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) ; para el serogrupo Y; x es 9 ó menos (por ejemplo, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0). El valor de y también depende del serogrupo : para el serogrupo 135, y es 26 ó más (por ejemplo 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 6 100 ) . Para el serogrupo Y, y es 29 ó más (por ejemplo 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, .60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, Ó 100) . El valor de z es 27 ó menos (por ej emplo 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 , 6, 5, 4 , 3, 2, 1, 0.5 6 0). Preferentemente, x > m, donde m se selecciona de: o, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 y 10. Preferentemente, z > p, donde p se selecciona de: 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Sacáridos de la Invención Más generalmente, la invención proporciona un sacárido capsular de meningococo modificado, opcionalmente conjugado a una proteína portadora, en donde el sacárido comprende n o más unidades de repetición de la unidad de disacárido {[ácido siálico]-[hexosa]} donde la hexosa es ya sea galactosa o glucosa y n es un entero de 1 a 100, y en donde (a) <_ x% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 7; y/o (b) cuando la hexosa es galactosa y% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son 0-acetiladas en la posición 9, y en donde cuando la hexosa es glucosa, _> y¾ ó <_ z% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son 0-acetiladas en la posición 9. El valor de x depende de la hexosa: cuando la hexosa es galactosa, x es 29 ó menos (por ejemplo, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) ; cuando la hexosa es glucosa, x es 9 6 menos (por ejemplo, 8, 1, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) . El valor de y depende de la hexosa: cuando la hexosa es galactosa, y es 26 ó más (por ejemplo 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100) . Cuando la hexosa es glucosa, y es 29 ó más (por ejemplo 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100) .
Rl valor de z es 27 ó menos (por ejemplo 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) . Preferentemente, x > m, como se define anteriormente. Preferentemente z > p, como se define anteriormente . Preferentemente, el ácido siálico es ácido N-acetil neuramínico . Cuando la hexosa es galactosa, la unidad de disacárido {[ácido siálico]-[hexosa]} es preferentemente: ^0-?ß??5?^ ½ ?-(3·'·-÷¾-?^3?-«· ?? Cuando la hexosa es glucosa, la unidad de disacárido {[ácido siálico]-[hexosa]} es preferentemente: Preferentemente, el sacárido capsular de meningococo modificado es conjugado a una proteina portadora. En tales conjugados: (i) preferentemente entre 2-9%, más preferentemente entre 4-8%, más preferentemente entre 5-7%, incluso más preferente y aproximadamente 6% de los residuos de ácido siálico son O-acetilados en la posición 7; (ii) preferentemente entre 35-55%-, más preferentemente entre 40-50%, más preferentemente entre 42-46%, incluso más preferente y aproximadamente 43% (cuando la hexosa es Gal) o aproximadamente 45% (cuando la hexosa es Glc) de los residuos de ácido siálico son O-acetilados en la posición 9. La invención también proporciona una composición la cual comprende moléculas a del sacárido capsular de meningococo del serogrupo W135, en donde el número promedio de residuos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular es b, y en donde: (a) x% de los a-b residuos de ácido siálico del serogrupo W136 en la composición son 0-acetilados en la posición 7; y/o (b) > y% de los a-b residuos de ácido siálico del serogrupo W135 en la composición son O-acetilados y en donde x y y son como se definen anteriormente . La invención también proporciona una composición la cual comprende moléculas a del sacárido capsular de meningococo del serogrupo Y, en donde el número promedio de residuos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular es b, y en donde: (a) < x% de los a-b residuos de ácido siálico del serogrupo ? en la composición son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) _ y% o < z% de los a-b residuos de ácido siálico del serogrupo Y en la composición son O-acetilados en la posición 9, y en donde x, y y z son como se definen anteriormente. Los sacáridos en las poblaciones pueden ser conjugados a portadores de proteínas y/o estar libres en solución.
Preferentemente los sacáridos o conjugados de la invención están en forma purifica, por ejemplo substancialmente en la ausencia de polisacarido nativo. Representaciones estructurales Esta invención también proporciona un sacárido, opcionalmente conjugado a una proteína portadora, el cual comprende n o más repeticiones de la siguiente unidad de disacárido: en donde : n es un entero de 1 a 100, X y Y son grupos diferentes seleccionados de -H y -OH. R1 es seleccionado independientemente de -H y - COCH3 y puede ser el mismo o diferente en cada unidad de disacárido, R2 es seleccionado independientemente de -H y - COCH3 y puede ser el mismo o diferente en cada unidad de disacárido, cuando - X es -OH y Y es -H, (a) < x% de R1 son -C0CH3 y/o (b) > y% de 1 son -COCH3. - X es -E y Y es -OH, (a) < x% de R1 son -COCH3 y/o (b) > y% 6 < z% de R2 son -COCH3. Cuando X es -OH y Y es -H, x es 29 ó menos (por ejemplo, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) ; y y es 26 ó más (por ejemplo 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100) . Cuando X es -H y Y es -OH, x es 9 ó menos (por ejemplo, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) ; y y es 29 6 más (por ejemplo 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100) y z es 27 ó menos (por ejemplo 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0) . Preferentemente, x > m, donde m es como se define anteriormente. Preferentemente, z > p, donde p es como se define anteriormente .
Preferentemente, el sacárido es conjugado a una proteína portadora. Cuando el sacárido es conjugado a una proteína portadora y X es -OH y Y es -H: (a) preferente y aproximadamente 2-10%, más preferente y aproximadamente 4-8%, más preferente y aproximadamente 5-7%, incluso más preferente y aproximadamente 6% de R1 es -C0CH3; y/o (b) preferente y aproximadamente 35-55%, más preferente y aproximadamente 40-50%, más preferente y aproximadamente 42-44%, incluso más preferente y aproximadamente 43% de R2 son -COCH3. Cuando el sacárido es conjugado a una proteína portadora y X es -H y Y es -OH: (a) preferente y aproximadamente 2-9%, más preferente y aproximadamente 4-8%, más preferente y aproximadamente 5-7%, incluso más preferente y aproximadamente 6% de R1 es -COCH3; y/o (b) preferente y aproximadamente 35-55%, más preferente y aproximadamente 40-50%, más preferente y aproximadamente 42-46%, incluso más preferente y aproximadamente 45% de R2 son -COCH3. El estado de O-acetilación de los residuos de ácido siálico en las posiciones 7 y 9 en los sacáridos y conjugados de la invención pueden ser medidos usando NMR de protones ID y 2D, como se describe posteriormente, HPAEC puede ser usada para medir la O-acetilación total, pero no puede distinguir entre las diferentes posiciones (234) . Se ha usado MS de aspersión de iones para analizar la O-acetilación en MenA (235) . Proceso para preparar un sacárido modificado La invención también proporciona un proceso para preparar un conjugado inmunogénico el cual comprende las etapas de: (1) proporcionar un sacárido capsular de meningococo de partida y una proteína portadora, ya sea o ambos que es/son opcionalmente modificado (s) para llevarlo/llevarlos a ser reactivos uno hacia el otro; (2) formar un enlace covalente entre el sacárido y la proteina portadora; y (3) purificar los glicoconjugados resultantes en donde, entre las etapas (1) y (3) (por ejemplo durante la etapa de reacción (2) ) , se incrementa el grado de 0-acetilación en la posición 9 de los residuos de ácido siálico en el sacárido de partida. El sacárido capsular de meningococo es preferen emente del serogrupo W135 o Y. Materiales de partida del sacárido capsular Los sacáridos capsulares modificados de la invención son obtenibles a partir de los sacáridos encontrados en la cápsula de N. meningitidis serogrupos 135 y, Y. Los sacáridos de la invención son de esta forma preferentemente sacáridos modificados de N. meningitidis del serogrupo W135 y sacáridos modificados de N. meningitidis del serogrupo Y. Los polisacáridos capsulares de meningococos son preparados típicamente por un proceso el cual comprende las etapas de precipitación de polisacáridos (por ejemplo usando un detergente catiónico) , fraccionamiento de etanol, extracción de fenol frío (para remover la proteína) y ultracentrifugación (para remover LPS) (por ejemplo, referencia 13) . Un proceso más preferido (14) implica la precipitación de polisacáridos seguido por solubilizacion del polisacárido precipitado usando un alcohol inferior. La precipitación puede ser lograda usando un detergente catiónico tal como sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo las sales de bromuro) , o bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio . Es particularmente preferido el bromuro de cetiltrimetilamonio ("CTAB" por sus siglas en inglés) (15) . La solubilizacion del material precipitado puede ser lograda usando un alcohol inferior tal como metanol , propan-l-ol, propan-2-ol, butan-l-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol , 2-metil-propan-2 -ol , dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar complejos de CTAB y polisacárido. Se agrega preferentemente etanol al polisacárido precipitado para dar una concentración final (en base al contenido total de etanol y agua) de entre 50% y 95%. Después de volverlo a solubilizar, puede ser tratado además el polisacárido para remover los contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones donde no es aceptable incluso contaminación menor (por ejemplo, para producción de vacunas humanas) . Esto implicará típicamente una o más etapas de filtración por ejemplo filtración profunda, filtración a través de carbón activo puede ser usada, filtración de tamaño y/o ultrafiltración. Una vez filtrado para remover los contaminantes, el polisacárido puede ser precipitado para tratamiento adicional y/o procesamiento. Esto puede ser logrado convenientemente por intercambiar cationes (por ejemplo por la adición de sales de calcio o sodio) . Los sacáridos de la invención pueden ser polisacáridos u oligosacáridos . Los oligosacáridos tienen un grado de polimerización menor que el encontrado en polisacáridos capsulares nativos presentes en bacterias. La invención usa preferentemente oligosacáridos . Estos tienen preferentemente un grado promedio de polimerización de menos de 30 por ejemplo entre 15 y 25, preferente y aproximadamente 15-20) . El grado de polimerización pude ser medido convenientemente por cromatografía de intercambio de iones o por ensayos colorimétricos (16) . Los oligosacáridos son formados convenientemente por fragmentación de polisacárido capsular purificado (por ejemplo por hidrólisis, por tratamiento de ácidos suaves, por calentamiento, etc.), la cual será seguida usualmente por la purificación de los fragmentos del tamaño deseado. Si se realiza la hidrólisis, el hidrolizado puede generalmente ser dimensionado con el fin de remover los oligosacáridos de corta longitud. Esto puede ser logrado en varias formas, tales como ultracentrifugación seguida por cromatografía de intercambio de iones . Los oligosacáridos con un grado de polimerización de menos de aproximadamente 4 son removidos preferentemente para los serogrupos W135 y Y. Como una alternativa para la purificación a partir de fuentes nativas, pueden ser obtenidos sacáridos capsulares (y oligosacáridos en particular) por una síntesis total o parcial por ejemplo se describe la síntesis de Hib en la referencia 17 y la síntesis MenA en la referencia 18. Conjugación covalente Los sacáridos modificados de la invención pueden ser sometidos a cualquier procesamiento en dirección 3 ' usual el cual se aplica a los sacáridos (por ejemplo, derivación, conjugación, fragmentación, etc.). Para incrementar su capacidad inmune, los sacáridos modificados de la invención son conjugados preferentemente a una proteína portadora: La conjugación a proteínas portadoras es particularmente útil para vacunas pediátricas (19) y es una técnica bien conocida (por ejemplo, como se observa en las referencias 20 a 28, etc.) .
La invención de esta forma proporciona un conjugado dé una proteína portadora y un sacárido de la invención. Las proteínas portadores preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de difteria o toxoide de tétanos . El derivado CRMi97 de la toxina de difteria (29-31) es particularmente preferido. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningitidis (32) , los péptidos sintéticos (33, 34), las proteínas de choque térmico (36, 36), proteínas de pertussis (37, 38), citosinas (39), linfocinas (39) , hormonas (39) , factores de crecimiento (39) , proteínas artificiales que comprenden epitopos de células T CD4+ a partir de varios antígenos derivados de patógenos (40) tales como la proteína NI9 (41) , proteína D a partir de H. Influenza (42, 43), proteína de superficie de neumococo PspA (44) , neumolisina (45) , proteínas de captación de fierro (46) , toxina A o B a partir de C. Difficile (47) , toxinas bacterianas mutantes (por ejemplo, toxina de cólera "CT" (por sus siglas en inglés) o toxina termolábil de E. coli "LT" (por sus siglas en inglés) ) , tales como una CT con una substitución en Glu-29 (48), etc. Los portadores preferidos son toxoide de difteria, toxoide de tétanos, proteína D de H influenza y CRMiS7. Dentro de una composición de la invención, es posible usar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de supresión de portador. De esta forma pueden ser usadas proteínas portadoras diferentes para diferentes serogrupos por ejemplo los sac ridos del serogrupo W135 pueden ser conjugados a toxoide de tétanos. Es también posible usar más de una proteína portadora para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo los sacáridos del serogrupo Y pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM197 y otros conjugados a toxoide de tétanos. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína portadora para todos los serogrupos, con CRMig-7 que es la elección preferida. Una sola proteína portadora puede portar más de un antígeno de sacárido (49) . Por ejemplo, una sola proteína portadora puede tener conjugada a ella sacáridos de los serogrupos W135 y Y. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo. Los conjugados con una proporción de sacárido :portador (p/p) de entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir sacárido en exceso) son preferidos. Las proporciones entre 1:2 y 5:1 son preferidas, así como las proporciones entre 1:1.25 y 1:2.5 son más preferidas. La proporción puede ser aproximadamente 1.1, para los conjugados Men 135 y 0.7 para los conjugados MenY. En base a la cantidad 10 µg de sacárido menW135 o MenY, conjugados preferidos comprenden de 66-20 µg de portador CRM197.
Los conjugados pueden ser usados junto con proteína portadora libre (50) . Cuando se presenta una proteína portadora dada en tanto la forma libre y conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferentemente no más de 5% de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como un todo, y más preferentemente presente en menos de 2% en peso. Cualquier reacción de conjugación adecuada puede ser usada, con cualquier enlazador adecuado donde sea necesario. El sacárido será activado típicamente o funcional!zado antes a la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridinio (51,52, etc) ) . Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ásteres activos, noroborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver también la introducción de la referencia 26) . Los enlaces por medio de un grupo enlazador pueden ser hechos usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 3 y 53. Un tipo de enlace implica la aminación reductiva del polisacárido, copulando el grupo amino resultante con un extremo de un grupo enlazador de ácido adípico, y después copulando una proteína al otro extremo del grupo enlazador del ácido adípico (24, 54, 55) . Un tipo preferido de enlace es un enlazador de carbonilo, el cual puede ser formado por reacción de un grupo hidroxilo libre del sacárido modificado con CDI (56, 57) seguido por la reacción con una proteína para formar un enlace de carbamato. Otro tipo preferido de enlace es un enlazador de ácido adípico, el cual puede ser formado por copular un grupo - H2 libre en el sacárido modificado con ácido adípico (usando, por ejemplo, activación de diimida) , y después copulando una proteína al intermediario de sacárido-ácido adípico resulante. (24, 54, 58) . Otro tipo preferido de enlace puede ser formado por la reacción de un grupo hidroxilo libre de un sacárido con un agente cianilante (por ejemplo, p-nitrofenilcianato, tetrafluoroborato de l-ciano-4- (dimetilamino) -piridinio (CDAP por sus siglas en inglés) , tetrafluoroborato de N-cianotrietilamonio (CTEA por sus siglas en inglés) o) , seguido por la reacción con un grupo amina en la proteína (opcionalmente por medio de un separador, por ejemplo una hidracina) (50, 60) . Otros enlaces incluyen B-propionamido (61) , nitrofenil-etilamina (62) , haluros de haloacilo (63) , enlaces glicosídicos (2, 64), ácido 6-aminocaproico (65), ADH (66) , porciones de C4 a CX2 (67) , etc. Como una alternativa para usar un enlazador, puede ser usado enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender la oxidación del polisacárido seguido por aminación reductiva con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 2 y 68. La conjugación puede implicar: la reducción de las terminaciones anoméricas a un grupo hidroxilo primario, protección/desprotección opcional del grupo hidroxilo primario; reacción del grupo hidroxilo primario con CDI para formar un intermediario de carbamato CDI ; y copulando el intermediario de carbamato CDI con un grupo amino en una proteína. Se prefiere un proceso el cual implica la introducción de los grupos amino en el sacárido (por ejemplo por reemplazar los grupos terminales =0 con - H2) seguido por la derivación con un diéster adípico (por ejemplo éster de N-hidroxisuccinimido del ácido adípico) y reacción con la proteína portadora. Otra reacción preferida usa activación de CDAP con un portador de proteína D. Después de la conjugación, pueden ser separados los sacáridos libres y conjugados. Hay muchos métodos adecuados, los cuales incluyen cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. (ver también las referencias 69 y 70, etc) . Donde la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación de oligosac rido preceda la conjugación Composiciones farmacéuticas La invención proporciona una composición inmunogénica (por ejemplo una vacuna) la cual comprende (a) un sacárido capsular modificado de la invención y/o un conjugado de la invención, y (b) un portador aceptable f rmacéuticamente. Las vacunas basadas en conjugados de sacáridos o sacáridos-proteínas son bien conocidos en la técnica, incluyendo los conjugados a base de sacáridos des-O-acetilados (NeisVac-C™) . Las vacunas de la invención puede ya sea ser profilácticas (es decir prevenir infecciones) o terapéuticas (es decir, para tratar infecciones) , pero típicamente serán profilácticas. "Portadores aceptables farmacéuticamente" incluyen cualquier portador que no induce por sí mismo a la producción de anticuerpos peligrosos para el individuo que recibe la composición farmacéutica. Portadores adecuados son típicamente macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos, aminoácidos poli éricos, copolímeros de aminoácido, agregados de trehalosa (71) y lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas) , y partículas virales inactivas . Tales portadores son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Las vacunas pueden también contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes substancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsificación, substancias de amortiguamiento de pH, y similares. Está disponible una discusión total de los excipientes aceptables farmacéuticamente en la referencia 72. Típicamente, las composiciones farmacéuticas son preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes a la inyección pueden también ser preparados . La preparación puede también ser emulsificada o encapsulada en liposomas para efecto adyuvante incrementado. El suministro directo de las composiciones farmacéuticas generalmente será parental (por ejemplo por inyección, ya sea subcutánea, intraperitoneal , intravenosa o intramuscularmente, o suministrada al espacio intersticial de un tejido). Las composiciones farmacéutica pueden ser también administradas en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, aplicaciones rectales (supositorios) y transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, referencia 73), agujas e hipoaspersiones . El pH de la composición es preferentemente entre 6 y 8, preferente y aproximadamente 7. El pH estable puede ser mantenido por el uso de un amortiguador. Donde una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un amortiguador de histidina (74) . La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos . Las composiciones de la invención pueden estar en forma acuosa (es decir soluciones o suspensiones) o en forma seca (por ejemplo polvos liofilizados) . La formulación líquida permite a las composiciones ser administradas directamente desde su forma empacada, sin la necesidad para reconstitución en un medio acuoso, y son de esta forma ideales para inyección. Tales composiciones pueden estar presentes en viales, o pueden estar presentes en jeringas ya llenas. Las jeringas pueden ser suministradas con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis sencilla de la composición, mientras que un vial puede incluir una dosis sencilla o dosis múltiples. Las composiciones liquidas de la invención son también adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada por ejemplo para reconstituir antigenos Hib o DTP liofilizados . Donde una composición de la invención es para ser usada para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un equipo, el cual puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa ya llena y un vial, con los contenidos de la jeringa que es usada para reactivar los contenidos del vial antes a la inyección. Las composiciones secas de la invención ofrecen estabilidad en almacenamiento, pero deben ser reconstituidas en forma líquida antes a su administración. La invención proporciona un equipo el cual comprende un primer recipiente el cual contiene una composición seca de la invención y un segundo recipiente el cual contiene una composición acuosa para reconstituir los contenidos del primer recipiente. La composición acuosa en el segundo recipiente puede contener antígenos (por ejemplo, no meningococos) , o puede contener solo excipientes . El primer recipiente será generalmente un vial; el segundo recipiente puede también ser un vial, o puede ser una jeringa ya llena. Para preparar las composiciones secas, pueden ser usados estabilizantes por ejemplo los disacáridos tales como trehalosa y sacarosa, o alcoholes de azúcar tales como manitol . Estos componentes serán agregados antes a la liofilización y aparecerán en la composición reconstituida. Componentes adicionales de las composiciones incluyen: cloruro de sodio (para tonicidad) , por ejemplo en aproximadamente 9 mg/ml; detergente por ejemplo un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80, generalmente en bajos niveles por ejemplo <0.01%; y sales de amortiguador por ejemplo un amortiguador de fosfato. La composición puede incluir un agente antibiótico. Las composiciones de la invención pueden ser empacadas en una forma de dosis de unidad o en una forma de dosis múltiples. Para formas de dosis múltiples, liquidas, los viales son preferidos para las jeringas prellenadas. Las dosis efectivas pueden ser establecidas rutinariamente, pero una dosis humana típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0.5 mi. Las composiciones inmunogenicas usadas como vacunas comprenden una cantidad efectiva inmunológicamente de antígeno, así como también cualesquiera otros componentes, como sea necesario. Por "cantidad efectiva inmunológicamente" , se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis sencilla o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc) , la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor que está tratando la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de las pruebas de rutina. Una cantidad típica de cada antígeno de sacárido de meningococo por dosis está entre 1 µg y 20 µg por ejemplo aproximadamente 1 µg, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µg, aproximadamente 5 µg, o aproximadamente 10 µg (expresada como sacárido) .
Cada sacárido puede estar presente en substancialmente la misma cantidad por dosis. Sin embargo, un exceso de sacárido MenY puede ser preferido, por ejemplo una proporción MenY :MenW135 (p/p) de 1.5:1 ó más. Donde está presente un conjugado, una composición puede comprender también una proteína portadora libre (50) . Preferentemente, la proteina portadora libre está presente en menos de 5% en peso de la composición; más preferentemente, está presente en menos de 2% en peso. Las composiciones de la invención generalmente incluirá uno o más adyuvantes. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a: A. Composiciones que contieneni Mineral Composiciones que contienen minerales adecuadas para uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos , ortofosfatos) , sulfatos, etc. (por ejemplo, ver los capítulos 8 y 9 de la referencia 75) , o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.), y con la adsorción que es preferida. Las composiciones que contienen mineral pueden también ser formuladas como una partícula de la sal metálica (76) .
B. Emulsiones de aceite Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de esqualeno-agua, tales como MF59 (Capitulo 10 de la referencia 75; ver también la referencia 77) (Esqualeno al 5%, Tween 80 al 0.5% y Span 85 al 0.5%, formulado en partículas de submicras usando un microfluidizador) . El adyuvante completo de Freund (CFA por sus siglas en inglés) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA por sus siglas en inglés) pueden ser también usados. C. Formulaciones de saponinas (capítulo 22 de la referencia 75) Pueden también ser usadas formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glicósidos de esterol y glicósidos de triterpenoide que son encontrados en corteza, hojas, tallos, raíces, e incluso flores de un intervalo amplio de especies vegetales. La saponina a partir de corteza del árbol Molina Quillaia saponaria ha sido ampliamente estudiada como adyuvante . La saponina puede también ser obtenida comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (brides veil) , y Saponaria officianalis (raíz de sapo) . Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como también formulaciones lípidas, tales como ISCOM, QS21 es vendida como Stimulon™. Las composiciones de saponina han sido purificadas usando HPLC, y RP-HPLC. Fracciones purificadas especificas usando estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Se describe un método de producción de QS21 en la referencia 78. Las formulaciones de saponina pueden también comprender un esterol, tal como colesterol (79) . Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden ser usadas para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM por sus siglas en inglés) (capitulo 23 de la referencia 75) . ISCOM también incluye típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede ser usada en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC Los ISCOM son además descritos en las referencias 79-81. Opcionalmente, los ISCOM pueden no poseer detergente adicional (82) . Una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina puede ser encontrada en las referencias 83 y 84. D. Virosomas y partículas similares a virus Los virosomas y partículas similares a virus (VLP por sus siglas en inglés) pueden ser usados también como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas a partir de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Son generalmente no patogénicos, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden ser producidas recombinantemente o aisladas a partir de virus enteros . Estas proteínas virales adecuadas para uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la influenzia (tales como HA o NA) , virus de la Hepatitis B (tales como proteínas de núcleo o cápside) , virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, otavirus, virus de la enfermedad de Pie y Boca, Retrovirus, virus de Norwalk, virus de Papilloma humano, VIH, fagos de AR , fagos de ?)ß (tales como proteínas de recubrimientos) , fagos de GA, fago de FR, fago de AP205, y Ty (tales como retrotransposon proteína Ty pl) . Los VLP son discutidos además en las referencias 85-90. Los virosomas son discutidos además en, por ejemplo, la referencia 91. E. Derivados bacteriales o microbianos Los adyuvantes adecuados para uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacterial (LPS por sus siglas en inglés) , derivados de Lípidos A, oligonucleótidos inmunoestimulatoraos y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificantes de los mismos . Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL por sus siglas en inglés) y PL 3-O-deacilado (3 dMPL) , 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A des-O-acilado con 4, 5, ó 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferida de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado es descrito en la referencia 92. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas en estéril a través de una membrana de 0.22 µp? (92). Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitaciones de monofosforil lípido A, tales como derivados de aminoalquilglucosaminida fosfato, por ejemplo RC-529 (93 , 94) . Derivados de lípidos A incluyen derivados del lípido A a partir de Escherichia coli tal como OM-174. Se describe OM-174 por ejemplo en las referencias 95 y 96. Los oligonucleótidos inmunoestimulatorios adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contiene un patrón CpG (una secuencia de dinucleótido la cual contiene una citosina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARN de doble cadena y oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) han sido también mostrados para ser inmunoestimulatorios . Las CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble cadena o de cadena sencilla. Las referencias 97, 98, y 99 describen substituciones posibles de análogos por ejemplo reemplazamiento de guanosina con 2"-deoxi-7-deazaguanosina . El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG es además discutido en las referencias 100-105. La secuencia de CpG puede ser dirigida a TLR9, tal como la porción GTCGTT o TTCGTT (106) . La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Thl, tal como CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODM. CpG-A y CpG-B ODN son discutidos en las referencias 107-109. preferentemente, el CpG es CpG-A ODM. Preferentemente, se construye el oligonucleótido CpG de tal forma que el extremo 5" es accesible para reconocimiento de receptor. Opcionalmente, pueden ser unidas dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3" para formar "inmunomonómeros" . Ver, por ejemplo, las referencias 106 y 110-112. Las toxinas de ribosilación de ADP bacterinas y derivados destoxifxcados de las mismas pueden ser usados como adyuvantes en la invención. Preferentemente la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina termolábil de E. coli "LT por sus siglas en inglés"), de colera ("CT") o pertusis (""PT"). El uso de toxinas de ribosilación de ADP destoxificadas como adyuvantes mucosales es descrito en la referencia 113 y como adyuvantes parentales en la referencia 114. La toxina o toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, la cual comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación de destoxifación; preferentemente la subunidad B no es mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT- 72, y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de los mismos, particularmente LT-K63 y LT-R72 como adyuvantes puede ser encontrado en las referencias 115-122. la referencia numérica para las substituciones de aminoácidos es preferentemente en base a las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas de ribosilación de ADP indicadas en la referencia 123, específicamente incorporada en la presente para referencia en su totalidad. F. Inmunomoduladores Humanos Los inmunomoduladores humanos adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen citosinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, ¦ IL-6, IL-7, IL-12, etc.) (124) interferones (por ejemplo (interferon-?) , factor estimulantes de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral . G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y mucoadhesivos pueden ser usados también como adyuvantes en la invención. Bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico y microesferas (125) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados o poli (ácido acrílico) , alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos , y carboximetilcelulosa. El quitosan y derivados de los mismos pueden también ser usados como adyuvantes en la invención (126) . H. Micropartículas. Las micropartículas pueden ser usadas también como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir una partícula de ~100 nm a ~150 µt? de diámetro, más preferen emente ~200 nm a ~30 µp? en diámetro, y más preferen emente ~500 nm a ~10 µ?? en diámetro formados de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (ácido a-hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc) con poli (láctido-co-glicólido) que son preferidos, opcionalmente tratados para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB) . I. Liposomas (capítulos 13 y 14 de la referencia 75) Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuados para uso como adyuvantes están descritos en las referencias 127-129. J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes adecuados para uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y esteres de polioxietielno (130) . Tales formulaciones además incluyen tensioactivos de éster de polioxietilensorbitan en combinación con un octoxinol (131) así como también tensioactivos de éteres o ésteres de polioxietilenalquilo en combinación con por lo menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (132) . Los étres de polioxietileno preferidos son seleccionados del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril éter (laureth 9) , polioxietilen-9-esteoril éter, polioxietilen-8-esteoril éter, polioxietilen-4 -lauril éter, polioxietilen-35-lauril éter, y polioxietilen-23 -lauril éter. K. Poliofosfaceno (PCPP) Las formulaciones de PCPP son descritas, por ejemplo en las referencias 133 y 134. L. Péptidos de muramilo Ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen N-actil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (l'-2 '-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) . M. Compuestos de imidazoquinolona Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para uso en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M" ) , descritos además en las referencias 135 y 136. La invención puede también comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes pueden ser usadas en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua (137) ; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) (138); (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + esterol) (139) ; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (140) ; (6) SAF, que contiene 10% de esqualeno, Tween 80™ al 0.4%, polímero de bloque de pluronico al 5% L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicras o llevado a vortex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor. (7) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS) , (Ribi Immunochem) el cual contiene esqualeno al 2%. Tween 80 al 0.2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana a partir del grupo que consiste de monofosforilípidos A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TD ) , y esqueleto de pared celular (CWS) , preferentemente MPL + CWS (Detox™1 ; y (8) una o más sales minerales (tales como sal de aluminnio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . Otras substancias que actúan como agentes inmunoestimulantes son descritos en el capitulo 7 de la referencia 75. Son preferidas sales de aluminio y fosfato de calcio como adyuvantes parentales. Las toxinas mutantes son adyuvantes mucosales preferidos . Las composiciones de la invención que incluyen un adyuvante de fosfato de aluminio son preferidas. El hidróxido de aluminio está preferentemente ausente. El adyuvante de fosfato de aluminio puede ser incluido en aproximadamente 0.5 mg Al3+ por mi . Combinaciones de Inmunógenos Las composiciones de la invención pueden comprender tanto un sacárido capsular de meningococo del serogrupo 135 modificado de la invención y un sacárido capsular de meningococo del serogrupo Y modificado . Otros antígenos pueden también ser incluidos en composiciones de la invención. De esta forma la invención proporciona una composición la cual comprende un sacárido capsular de meningococo del serogrupo W135 modificado de la invención, y además comprende uno o más antígenos seleccionados de la siguiente lista: - un antígeno de sacárido capsular a partir del serogrupo N de N. meningitidis .
Un antlgeno de sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis. Un antígeno de proteína a partir del serogrupo B, tal como aquellos de las referencias 141 a 150. Preparaciones de microvesículas del serogrupo B de N meningitidis (151) , "OMV nativos" (152) , vesículas de membrana externa o ampollas (por ejemplo las referencias 153 a 158, etc.) . Estas pueden ser preparadas a partir de bacterias las cuales han sido manipuladas genéticamente (159-162) por ejemplo para incrementar la inmunogenicidad (por ejemplo inmunógenos hiperexpresados) , para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacáridos capsulares, para regular descendentemente la expresión de PorA, etc . Pueden ser preparadas a partir de cepas hiperampolladas (163-166) . Las vesículas a partir de Neisseria no patogénica pueden ser incluidas (167) . Las OMV pueden ser preparadas sin el uso de detergentes (168, 169) . Pueden expresar proteínas no de Neisseria en la superficie (170) . Pueden ser agotadas en LPS'. Pueden ser mezcladas con antígenos recombinantes (153, 171) . Las vesículas a partir de bacterias con diferentes subtipos de proteína de membrana externa de la clase I pueden ser usadas por ejemplo seis subtipos diferentes (172 173) usando dos poblaciones de vesículas modificadas genéticamente diferentes cada una que exhibe tres subtipos, o nueve subtipos diferentes usando tres diferentes poblaciones de vesículas modificadas genéticamente cada una que exhibe tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen Pl.7,16; Pl.5-1, 2-2; Pl.19, 15-1; Pl.5-2.10; Pl.12-1.13; Pl.7-2.4; Pl.22,14; Pl.7-1.1; Pl.18-1, 3, 6. Un antígeno de sacárido de Haemophilis influenzae B (por ejemplo 174) . Un antígeno de Streptococcus pneumoniae (por ejemplo 208, 209, 210) . Un antígeno a partir del virus de la hepatitis A, tales como virus inactivado (por ejemplo 175, 176). Un antígeno a partir del virus de la hepatitis B, tales como un antígeno de superficie y/o de núcleo (por ejemplo, 176, 177) . Un antígeno de Bordetella pertussis, tales como holotoxina de pertussis (PT por sus siglas en inglés) y hemaglutinina filamentosa (FHA por sus siglas en inglés) a partir de B. Pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 (por ejemplo las referencias 178 y 179) . Los antígenos de pertussis celular pueden ser usados .
Un antígeno de difteria, tal como un toxoide tetánico (por e emplo capítulo 4 de la referencia 180) . Polioantígeno (por ejemplo 182, 183) tal como IPV. Los antígenos de proteína tóxica pueden ser destoxificados donde sea necesario (por ejemplo destoxificación de toxina pertussis por medio químico y/o genético (179) ) . Donde se incluye un antígeno de difteria en la composición farmacéutica se prefiere también incluir antígeno de tétanos y antígenos de pertussis. Similármente, donde se incluye un antígeno de tétanos se prefiere también incluir antígenos de difteria y de pertussis. Similarmente, donde se incluye un antígeno de pertussis se prefiere también incluir antígenos de difteria y tétanos . Los antígenos en la composición farmacéutica estarán típicamente presentes en una concentración de por lo menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para producir una respuesta inmune contra ese antígeno. Los antígenos son adsorbidos preferentemente a un adyuvante de sal de aluminio. Como una alternativa para usar antígenos de proteínas en la composición farmacéutica de la invención, el ácido nucleico que codifica el antígeno puede ser usado (por e emplo, referencias 184 a 192) . Los componentes de proteínas de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden de esta forma ser reemplazadas por ácido nucleico (preferentemente ADM por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica la proteína. Similármente, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas las cuales imitan antígenos de sacáridos por ejemplo mimotopos (193) o anticuerpos anti-idiotipo . Estos pueden reemplazar componentes de sacarina, o pueden complementarlos. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un mímico de péptido del polisacárido capsular MenC (194) o MenA (195) en Iguar del sacárido por si mismo. Vacunas de meningococos combinadas Las composiciones preferidas de la invención comprenden un sacárido capsular de meningococos del serogrupo W135 modificado de la invención, un sacárido capsular de meningococo del serogrupo Y modificado de la invención, y un sacárido capsular del serogrupo C, en donde los sacáridos capsulares son conjugados a proteínas portadoras. La composición puede también incluir un sacárido capsular del serogrupo A, preferentemente conjugado a una proteína portadora. Los sacáridos en estas composiciones son preferentemente oligosacáridos . Los conjugados de oligosacáridos pueden ser preparados como se describe en la referencia 14. - Los sacáridos del serogrupo A pueden ser O-acetilados o des-O-acetilados . Los sacáridos del serogrupo C pueden ser O-acetilados o des-O-acetilados. Los conjugados de MenC preferidos incluyen, en base a 10 µg de sacárido, 12.5-25 µg de portador CRM197. Los conjugados preferidos de enA incluyen, a base de 10 µg de sacáridos 12.5-33 g de portador CRMi97. Las dosis típicas para los conjugados de MenC y MenA son los mismos como para Men 135 y MenY es decir, entre 1 ^ Y 20 He Por ejemplo aproximadament 1 µg, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µgí aproximadamente g, o aproximadamente 10 µg. Las proporciones preferidas (p/p) para los sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1, y 2:1:1. las proporciones preferidas para los sacáridos de los serogrupos A:C:W135:Y son 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2 y 2:2:2:1. Se prefiere usar una masa substancialmente igual de cada sacárido por dosis. Donde una composición incluye un sacárido del serogrupo A, este puede ser preparado por reconstituir el sacárido del serogrupo A a partir de una forma liofilizada usando una composición que comprende uno o más de los sacáridos del serogrupo C, W135 y/o Y. Donde una composición incluye un sacárido del l serogrupo A, este puede ser un sacárido modificado en el cual uno o más de los grupos hidroxilo en el sacárido nativo ha sido/tiene que ser reempleado por un grupo de bloqueo (196) . Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis. Se prefiere que todas o substancialmente todas las unidades de monosacárido pueden tener substituciones del grupo de bloqueo. Así como también incluyen antígenos de sacáridos de los serogrupos Y, W135 y C (y, opcionalmente, A) , las composiciones de la invención pueden incluir uno o más antígenos a partir del serogrupo B. A diferencia de los serogrupos A, C, W135 y Y, el sacárido capsular de MenB es no adecuado para uso como un inmunogen en humanos debido a su similitud a auto antígenos . Si un antígeno de sacárido es usado para MenB, por lo tanto, es necesario usar un sacárido modificado, tal como uno en el cual los grupos N-acetilo en los residuos de ácido siálico del sacárido son reemplazados con los grupos N-acilo. Los grupos N-acilo adecuados son grupos acilo de Ci a C8, tales como N-propionilo (197) . Más que el uso de un antígeno de sacárido, sin embargo, ser prefiere usar un. antígeno de polipéptido. De esta forma, la composición puede incluir uno o más antígenos de polipéptido lo cual induce una respuesta inmune que la protege contra de infección de MenB. Más generalmente, la composición puede, después de la administración' a un sujeto, inducir una respuesta de anticuerpos en el sujeto que es bactericida contra dos o más (por ejemplo 2 ó3) de linajes hipervirulentos A4, Et-5 y linaje 3 del serogrupo B de N meningitidis . La secuencia del genoma de N meningitidis del serogrupo B ha sido publicada (48) y pueden ser seleccionados antigenos adecuados a partir de los polipéptidos codificados (150). Ejemplos de antigenos son descritos en las referencias 141 a 150. Las composiciones preferidas incluyen -uno o más de los siguientes cinco antigenos (198) : (1) una proteina "NadA", preferentemente en forma oligomérica (por ejemplo en forma trimérica) ; (2) una proteina "741" (3) una proteina "936"; (4) una proteina "953"; y (5) una proteina "287". Las secuencias del prototipo para estas cinco proteínas son encontradas en la referencia 143 como a continuación : Cuando se usa en composiciones de la invención, la proteína del serogrupo B puede comprender la secuencia de aminoácidos de una de estas secuencias prototipo, o puede comprender una secuencia de aminoácidos la cual: (a) tiene 50% ó más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ó más) a la secuencia prototipo; y/o (b) comprende un fragmento de por lo menos n aminoácidos consecutivos de la secuencia prototipo, donde n es 7 ó más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ó más). Fragmentos preferidos para (b) carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ó más) a partir de la terminación C y/o la terminación N de la secuencia prototipo. Otros fragmentos preferidos comprenden un epitopo a partir de la secuencia. Estos cinco antígenos de MenB pueden estar presente en la composición como cinco proteínas separadas, pero es preferido que por lo menos dos de los antígenos, sean expresados como una sola cadena de polipéptido (una proteína "híbrida" (referencias 145-147) ) , es decir de tal forma que los cinco antígenos forma poco menos de cinco polipéptidos . Las proteínas híbridas ofrecen dos ventajas principales: primero, una proteína que puede ser no estable o deficientemente expresada por si misma puede ser asistida por agregar un patrón híbrido adecuado que soluciona el problema; segundo, se simplifica la fabricación comercial ya que solamente una expresión y purificación necesitan ser empleadas con el fin de producir dos proteínas separadamente útiles. Una proteína híbrida incluida en una composición de la invención puede comprender dos o más (es decir, 2, 3, 4 ó 5) de los cinco antígenos básicos. Los híbridos que consisten de dos de los cinco antlgenos son preferidos por ejemplo, aquellos que comprenden: NadA y 741; NadA y 936; NadA y 953; NadA y 287; 741 y 936; 741 y 953; 741 y 287; 936 y 953; 936 y 287; 953 y 287. Tres antígenos preferidos de MenB para inclusión combinada en composiciones de la invención son: NadA de la cepa 2996, con la eliminación de la terminación C y péptido líder procesado Híbrido 287-953 Híbrido 936-741 Como se menciona anteriormente, las composiciones de la invención que incluyen los antígenos MenB pueden inducir preferentemente una respuesta de anticuerpo bactericida sérica que es efectiva contra dos o tres de linajes hipervirulentos de MenB A4, ET-5 y linaje 3. Pueden adicionalmente inducir las respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más linajes hipervirulentos del subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o complejo ET-37, y contra otros linajes por ejemplo linajes hiperinvasivos . Estas respuestas de anticuerpo son medidas convenientemente en ratones y son un indicador estándar de eficacia de vacuna (por ejemplo, ver la nota final 14 de la referencia 150) la composición no necesita inducir anticuerpos bactericidas contra cada una y cada cepa de MenB dentro de estos linajes hipervirulentos; más aún, para cualquier grupo dado de cuatro de más cepas de meningococos del serogrupo B dentro de un linaje particular hipervirulento, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra por lo menos 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90% ó más) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas en por lo menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, B y CU. El suero preferentemente tiene un título bactericida de por lo menos 1024 (por ejemplo 210, 211, 212, 213, 214, 215, 21d, 217, 218 o superior) , preferentemente por lo menos 214) , es decir el suero es capaz de matar por lo menos 50% de las bacterias de prueba o de una cepa particular cuando se diluye a 1/1024, como se describe en la referencia 150. Las composiciones preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las siguientes cepas de meningococos del serogrupo B: (i) del glomérulo A4, cepa 961-5945 (B:2b:P1.21,16) y/o cepa G2136 (B : -) ; (ii) a partir del complejo de ET-5, cepa MC 58 (B : 15 : Pl .7, 16b) y/o cepa 44/76 (B:15:P1.7,16) ; (ii) a partir del linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B :N : - ) . Composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945, 44/76 y 394/98. Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas las cepas de referencia MLST de Neisseria (ids 638 y 1002 en la referencia 199) . La cepa MC58 es ampliamente disponible (por ejemplo ATCC BAA-335) y es la cepa secuencia en la referencia 148. La cepa 44/76 ha sido usada ampliamente y caracterizada (por ejemplo la referencia 200) . La cepa 394/98 es aislada originalmente en New Zealand en 1998, y ha habido varios estudios publicados que usan esta cepa (por ejemplo las referencias 202 y 203) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia MLST (id 409 en la referencia 199, líneas 41 de la Tabla 2 en la referencia 201) . La composición puede adicionalmente inducir una respuesta bactericida contra la cepa LNP17592 del serogrupo W135 (W135 : 2a :P1.5 , 2) , a partir del complejo ET-37. Esto es una cepa Ají aislada en Francia en 2000. Otros antígenos de polipéptido MenB los cuales pueden ser incluidos en composiciones de la invención incluyen aquellos que comprenden una de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 650 de la referencia 141; SEQ ID NO: 650 de la referencia 141; SEQ ID NO: 878 de la referencia 141; SEQ ID NO: 884 de la referencia 141; SEQ ID NO: 4 de la referencia 141; SEQ ID NO: 598 de la referencia 143; SEQ ID NO: 818 de la referencia 143; SEQ ID NO: 864 de la referencia 143; SEQ ID NO: 866 de la referencia 143; SEQ ID NO: 1196 de la referencia 143; SEQ ID NO: 1272 de la referencia 143; SEQ ID NO: 1274 de la referencia 143; SEQ ID NO: 1640 de la referencia 143; SEQ ID NO: 1788 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2288 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2466 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2554 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2576 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2606 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2608 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2616 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2668 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2780 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2932 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2958 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2970 de la referencia 143; SEQ ID NO: 2988 de la referencia 143; o un polipéptido el cual comprende un secuencia de aminoácidos la cual: (a) tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a las secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de por lo menos n aminoácidos consecutivos a partir de las secuencias, en donde n es 7 ó más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 200, 250 ó más) . Fragmentos preferidos para (b) comprenden un epitopo a partir de la secuencia relevante. Más de uno (por ejemplo 2, 3, 4, 5,6) de estos polipéptidos pueden ser incluidos. Combinaciones con sacáridos Hib Donde la composición incluye un antígeno del tipo B de H. influenzae, será típicamente un antígeno de sac rido capsular de Hib. Los antígenos de sacárido a partir de H. influenzae b son bien conocidos . Ventajosamente, el sacárido Hib es conjugado covalentemente a una proteína portadora, con el fin de mejorar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de los conjugados de polisacárido en general, y del polisacárido capsular Hib en particular, es bien documentado. La invención puede usar cualquier conjugado de Hib adecuado. Las proteínas portadoras adecuadas son descritas anteriormente, y portadores preferidos para sacáridos de Hib son CRMig7 ("HbOC") , toxoide de tétanos ("PRP-T") y el complejo de membrana externa de N. meningitidis ("PRP-OMP") . La porción de sacárido del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo un fosfato de poliribosilribitol de longitud completa (PRP) ) , pero es preferido idrolizar polisacáridos para formar oligosac ridos (por ejemplo MW de ~1 a ~5 kDa) . Un conjugado preferido comprende un oligosacárido de Hib enlazado covalentemente a CRMi97 por medio de un enlazador de ácido adípico (16,204). El toxoide tetánico es también un portador preferido. La administración del antigeno Hib resulta preferentemente en una concentración de anticuerpo anti-PRP de > 0.15 µg/ml y más preferentemente > 1 µg/ml. Donde una composición incluye un antígeno de sacárido Hib, se prefiere que no incluya también un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio entonces el antigeno de Hib puede ser adsorbido por el adyuvante (205) o puede no ser adsorbido (206) . La prevención de la adsorción puede ser lograda por seleccionar el pH correcto durante el mezclado de antígeno/adyuvante, un adyuvante con un punto apropiado de carga cero, y un orden apropiado de mezclado para los varios diferentes antigenos en una composición (207) . Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib. Los antígenos Hib pueden ser liofilizados , por ejemplo por reconstitución por composiciones de meningococos de la invención. Combinaciones con antígenos de neumococos Donde la combinación incluye un antígeno de S. Pneu oniae, será típicamente un antígeno de sacárido capsular el cual es preferentemente conjugado a una proteína portadora (por ejemplo, referencias 208 a 210) . Se prefiere incluir sacáridos a partir de más de un serotipo de S. pneumoniae.
Por ejemplo, mezclas de polisacáridos de 23 serotipos diferentes son usadas ampliamente, ya que son vacunas de conjugados con polisacáridos de entre 5 y 11 serotipos diferentes (211)-. Por ejemplo, PrevNar™ (212) contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F) con cada sacárido conjugado individualmente a CRM197 por aminación reductiva, con 2 µg de cada sacárido por 0.5 mi de dosis (4 µg de serotipo 6B) , y con conjugados adsorbidos en un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen preferentemente por lo menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden ser adsorbidos en un fosfato de aluminio. Como una alternativa para usar antígenos de sacáridos a partir de neumococos, la composición puede incluir uno o más antígenos de polipeptido. Las secuencias de genomas para varias cepas de neumococos son disponibles de (213, 214) y pueden ser sometidas a formación de vacunas inversa (215-218) para identificar antígenos de polipeptido adecuados: PhtA, PDT, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 y Spl30 como se define en la referencia 221. La composición puede incluir también más de una (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ó 14) de estos antígenos. En algunas modalidades, la composición puede incluir ambos antígenos de sacárido y polipeptido a partir de neumococos. Estos pueden ser usados en mezcla simple, o el antígeno de sacárido de neumococo puede ser conjugado a una proteína de neumococo. Las proteínas portadoras adecuados para tales modalidades incluyen los antigenos enlistados en el párrafo previo (221) . Los antígenos de neumococos pueden ser liofilizados , por ejemplo junto con el antígeno Hib. Métodos de tratamiento La invención también proporciona un método para incrementar una respuesta de anticuerpos en un mamífero, el cual comprende administrar una composición farmacéutica de la invención a un mamífero. La invención proporciona un método para incrementar una respuesta inmune en un mamífero el cual comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención. La respuesta inmune es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos. El método puede incrementar una respuesta de refuerzo. El mamífero es preferentemente un humano. Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un bebé o infante) o un adolescente; en donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adulto. Una vacuna propuesta para los niños puede también ser administrada a adultos por ejemplo para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
La invención también proporciona una composición de la invención para uso como un medicamento. El medicamento es capaz preferentemente de incrementar una respuesta inmune en un mamífero (es decir es una composición inmunogénica) , y es más preferentemente una vacuna. La invención también proporciona el uso de un sacárido capsular de meningococos del serogrupo W135 modificado de la invención y/o un sacárido capsular de meningococos del serogrupo Y modificado de la invención en la fabricación de un medicamento para incrementar una respuesta inmune en un mamífero. Los sacáridos son conjugados preferentemente . El medicamento es preferentemente una vacuna. Estos usos y métodos son preferentemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por Neisseria (por ejemplo meningitidis , septicemia, bacteremia, gonorrea, etc.). La prevención y/o tratamiento de meningitidis bacteriana o de meningococos son preferidos. Una forma de checar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorear la infección de Neisseria después de la administración de la composición de la invención. Una forma para verificar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorear las respuestas inmunes contra los cinco antígenos básicos después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede ser determinada por administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales (222) ) y después determinar los parámetros estándar los cuales incluyen actividad bactericida sérica (SBA por sus siglas en inglés) y títulos de ELISA (GMT) de IgG anti cápsula total y concentrada en avidina. Estas respuestas inmune generalmente serán determinadas alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y se compara con valores determinados después de la administración de la composición. SBA mide la muerte bacterial mediada por el complemento, y puede ser ensayada usando complemento humano o de conejo bebé . Los estándares HO requieren una vacuna para inducir por lo menos 4 veces un incremento en SBA en más del 90% de los receptores. Un incremento de SBA de por lo menos 4 veces u 8 veces es preferido. Donde más de una dosis de la composición se administra, más de una determinación post administración puede ser hecha. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente que es superior al criterio para seroprotecion para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpo asociado arriba del cual un huésped es considerado para ser seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y tales títulos son publicados por organizaciones tales como OMS . Preferentemente más de 80% de una muestra estadísticamente significativa de sujetos es seroconvertida, más preferentemente más de 90%, todavía más preferent mente más de 93% y más preferentemente 96-100%. Las composiciones de la invención serán administradas generalmente a un paciente. El suministro directo puede ser realizado por inyección parental (por e emplo subcutánea, intraperitoneal , intravenosa, intramusculármente, o al espacio intersticial de un tejido) , o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosa. Es preferida la administración intramuscular al muslo o el brazo superior. La inyección puede ser por medio de una agua (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero la inyección libre de aguja puede ser usada alternativamente. Una dosis intramuscular típica es 0.5 mi. La invención puede ser usada para producir inmunidad sistémica y/o mucosal . El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiples. Las dosis múltiples pueden ser usadas en un programa de inmunización primario y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. La sincronización adecuada entre las dosis primarias (por ejemplo entre 4-16 semanas) , y entre la primaria y refuerzo, puede ser determinada rutinariamente. Las infecciones por Neisseria afectan varias áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones de la invención pueden ser preparadas en varias formas. Por ejemplo, las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, en vehículos líquidos antes a la inyección pueden también ser preparados (por ejemplo, una composición liofilizada) . La composición puede ser preparada para administración tópica por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición es preparada para administración oral por ejemplo como tableta o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente con sabor) . La composición puede ser preparada como un supositorio o pesario. La composición puede ser preparada para administración nasal, aural u ocular por ejemplo como aspersiones, gotas, gel o polvo (por ejemplo, referencias 223 y 224) . El éxito con la administración nasal de sacáridos de neumococos (225, 226) , polipéptidos de neumococos (227) , sacáridos Hib (228) , sacáridos MenC (229) , y mezclas de conjugados de sacáridos Hib y MenC (230) han sido reportadas. General El término "que comprende" significa "que incluye" así como también "que consiste" por ejemplo una composición wque comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y. La palabra "substancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición la cual es "substancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "substancialmente" puede ser omitida a partir de la definición de la invención. El término "aproximadamente " en relación a un valor número x significa, por ejemplo x + 10%. Las expresiones tales como "< x% de los residuos de ácido siálico son O-acetilados en la posición 7", no significan que cada molécula de sacárido en una composición debe tener necesariamente el mismo grado de O-acetilación en la posición 7. Ni significa que cada molécula de sacárido en una composición debe necesariamente tener < x% de O-acetilación en la posición 7. Más aún, alguna puede tener >x% mientras que otras tienen < x%, pero el grado promedio de acetilación entre todas las posiciones 7 de todos los residuos de ácido siálico en la población total de los sacáridos es < x% . Lo mismo aplica para las expresiones como "> y% de los residuos de ácido siálico son O-acetilados en la posición 9 " y similares. Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en una forma abierta y cerrada y que, mientras las formas cerradas son mostradas en las fórmulas estructurales de la presente, las formas abiertas son también comprendidas por la invención. El ácido siálico es también conocido como ácido neuramínico . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 y 2 muestran espectros de MR anotados de MenW135 y MenY hidrolizados , respectivamente. Las Figuras 3 y 4 muestran el estado de 0-acetilación de los residuos de ácido siálico en las posiciones 7 y 9 durante la preparación de conjugados de MenW135-CRM197 y MenY-CRM197, respectivamente. Las Figuras 5 y 6 muestran títulos de IgG obtenidos en ratones contra antígenos de oligosacáridos usando MenW135 y MenY, respectivamente. Modos para llevar a cabo la Invención A. Producción. y purificación de polisacáridos de meningococos . Se describen polisacáridos capsulares a partir de MenW135 y MenY como se describe en la referencia 14. B. Preparación de conjugados de polisacáridos de serogrupos W135 y Y modificados Los polisacáridos purificados son hidrolizados en ácido acético amortiguador de acetato de sodio 50 mM, pH 4.7 por aproximadamente 3 horas en 80 °C. Esto resulta en oligosacáridos con un DP promedio de aproximadamente 15 a 20 como se determina por la proporción entre el ácido siálico (SA por sus siglas en inglés) y SA terminal reducido. Se ultrafiltra el hidrolizado a través de una membrana cortada de 30 kDa (12 a 20 volúmenes de diafiltración de amortiguador de acetato 5 mM/NaCl 15-30 mM pH 6.5) . El compuesto retenido, el cual contiene especies de alto peso molecular, se desecha mientras que el compuesto que permea es cargado en una columna Q-Sepharose Fast Flow equilibrada en amortiguador de acetato 5 mM/NaCl 15 mM pH 6.5 Se lava entonces la columna con amortiguador de equilibrio 10 CV, con el fin de eliminar oligosacáridos con DP <^ 3-4, y se eluye con amortiguador de acetato 5 mM 3CV/NaCl 500 mM pH 6.5 Se agrega el cloruro de amonio o acetato de amonio a la solución de oligosacárido dimensionada a una concentración final de 300 g/1, después se agrega el cianoborohidruro de sodio a 40 g/1 ó 73 g/1 de concentración final. Se incuba la mezcla en 50°C por 3 días para producir amino-oligosacáridos , los cuales son entonces purificados por ultrafiltración de flujo tangencial con una membrana corta de 1 kDa ó 3 kDa usando 13 volúmenes de diafiltración de Nací 0.5 mM seguido por 7 volúmenes de diafiltración de Nací 20 mM. Se secan entonces los oligosacáridos purificados con evaporador giratorio para eliminar el agua. Se solubilizan los amino-oligosacáridos secos en agua destilada en una concentración de grupo amino 40 M, después se agregan 9 volúmenes de DMSO seguido por trietil-amina en una concentración final de 200 mM. A la solución resultante, se agrega diéster de N-hidroxisuccinimido del ácido adípico para una concentración final de 480 mM. Se mantiene la reacción bajo agitación en temperatura ambiente por 2 horas, después se precipita el oligosacarido activado con acetona (80% v/v concentración final) . Se recolecta el precipitado por centrifugación y se lava varias veces con acetona para eliminar el diéster de N-hidroxisuccinimido de ácido adípico y subproductos . Finalmente se seca el ol gosacarido activado bajo vacío. La cantidad de grupos éster activos introducida en la estructura de oligosacárido es determinada por un método colorimétrico como se describe en la referencia 231. C. Estado de O-acetilación de polisacáridos durante la conjugación Se mide el estado de O-acetilación de las posiciones C7 y C9 de los residuos de ácido siálico en la población de los sacáridos modificados derivados de MenW135 y MenY por análisis NMR. Los poli- y oligosacáridos intermediarios del proceso de conjugación (polisacárido nativo, después de la hidrólisis, antes a la aminación, después de la activación y después de la conjugación) son caracterizados usando experimentos NMR de protones ID y 2D. Se preparan las muestras """N NMR por disolver oligosacaridos liofilizados en 0.75 mi de 2¾0 deuterado al 99.9% (Aldrich™) para dar soluciones concentradas 10-15 mM. En todos los experimentos, se usan tubos NMR Wilmad de 5 mm. Se registran los espectros 2H NMR en un Espectrómetro NMR Bruker Avance DRX 600 MHz equipado con una unidad BGU y usando programas impulsados Bruker Estándar. Se usa una sonda de resonancia triple TBI de 5 mm con gradientes z auto cubiertos . Para procesar los datos se usa software Bruker XWINNMR 3.0. Las condiciones de adquisición espectral estándar de protones son para recolectar 32 k puntos de datos sobre una ventana espectral de 6000 Hz con 4 barridos. Los espectros 1H NMr son transformadas de Fourir después de aplicar una función de ampliación de línea de 0.1 Hz y se hacen referencia al agua monodeuterado (HDO) en 4.72 ppm. La evaluación de las resonancias y aquí la determinación de la estructura molecular son hechas en base a los datos de literatura (232,4) . Para mostrar la asignación de pico, se presentan los espectros de NMr anotados de enW135 hidrolizados y MenY hidrolizados en las Figuras 1 y 2 respectivamente. La siguiente tabla da la proporción de todas las posiciones C7 y C9 de ácido siálico (ácido N-acetil-neuraminico) en la población de sacáridos derivados de MenW315 que se encuentran para ser O-acetilados durante preparación de conjugado.
De esta forma, el porcentaje total de O-acetilación de ácido siálico en la posición 7 cae durante la preparación del conjugado, de aproximadamente 30% a aproximadamente 6%. Al mismo tiempo, el porcentaje de O-acetilación en la posición 9 se incrementa de aproximadamente 25% a aproximadamente 43% (Figura 3) . El cambio dramático visto en la posición 9 en la etapa final muestra que la conjugación preferentemente selecciona aquellos sacáridos que son 0-acetilados en la posición 9. Similármente, el estado de O-acetilación de los residuos de ácido siálico en la población de sacáridos modificados derivados de enY después de cada etapa del proceso de conjugación es dado en la siguiente tabla: De esta forma, el porcentaje de O-acetilación de ácido siálico en la posición 7 cae durante la preparación del conjugado de la presente invención de aproximadamente 10% a aproximadamente 2%, antes de finalmente enjuagar a aproximadamente 6% durante la reacción de conjugación. Al mismo tiempo, el porcentaje de O-acetilación en la posición 9 cae de aproximadamente 28% a aproximadamente 21%, antes de finalmente enjuagar a aproximadamente 45% durante la reacción de conjugación (Figura 4) . El cambio dramático observado en la posición 9 en la etapa final muestra que la conjugación selecciona preferentemente aquellos sacáridos que son O-acetilados en la posición 9. D. Inmunogenicidad de conjugados Los conjugados a granel congelados son descongelados. Cada uno se diluyen, bajo agitación, a una concentración final de 20 µg de sacárido/ml, fosfato 5 mM, 0 mg/ml de NaCl , fosfato de aluminio (para dar una concentración de Al3+ de 0.6 mg/ml), pH 7.2. Se mantienen entonces las mezclas, sin agitación, en 2-8°C durante la noche y se diluyen además con solución salina a 4 µg de sacárido/ml para inmunización de ratón. Un segundo grupo de vacunas se prepara para tanto los serogrupos en la misma forma, pero la adición de fosfato de aluminio se reemplaza con el mismo volumen de agua. Diez Balb/c ratones para cada grupo de inmunización son inyectados s.c, dos veces con 0.5 mi de vacuna en las semanas 0 y 4. Se realizan sangrados antes de la inmunización, el día antes del segundo día y 2 semanas después de la segunda dosis. Las inmunizaciones son realizadas con (a) la vacuna de conjugado con o sin alum, (b) control de solución salina y (c) control de polisacárido no conjugado . Se determinan los anticuerpos IgG antipolisacárido específicos en el suero de animales inmunizados esencialmente como se describe en la referencia 233. Cada suero de ratón individual es analizado por duplicado por una curva de titulación y GMT se calcula para cada grupo de inmunización. Se calculan los títulos en unidades de Elisa de ratón (MEU por sus siglas en inglés) usando un software de "Titerun" (FDA por sus siglas en inglés) . Se determina la especificidad del título de antipolisacárido por ELISA competitivo con el polisacárido relevante como competidor. Como se muestra en la Figura 5, el conjugado de MenW135 induce altos títulos de anticuerpos en animales. Como se espera, el polisacárido no conjugado no es inmunogénico . La formulación de conjugado con un fosfato de aluminio como adyuvante induce un nivel superior de anticuerpos comparado con el título obtenido por el conjugado solo. Se observan resultados similares para MenY (Figura 6) . Se prueban los sueros Post-II para actividad bactericida usando un ensayo in vitro para medir la lisis mediada por complemento de bacterias . Se inactivan los sueros Post-II por 30 minutos en 56°C antes de uso en el ensayo, complemento de conejo bebé al 25% se usa como una fuente de complemento. Se expresan los títulos bactericidas como la dilución de suero recíproco que producen 50% de muerte de bacterias contra las siguientes cepas: MenW135, 5554 (OAc+) ; MenY, 242975 (Oac+) . Un polisacárido capsular derivado de MenW135 no produce un valor GMT y da una actividad bactericida de solamente 4. En contraste, los conjugados des-O-acetilados de la invención dan valores GMT entre 14 y 565, con títulos bactericidas entre 64 y 2048. Un polisacárido capsular derivado de MenY no produce un valor GMT y da una actividad bactericida de solamente 256. En contraste, los conjugados des-O-acetilados de la invención dan valores GMT entre 253 y 1618, con títulos bactericidas entre 256 y 16384. Será entendido que la invención ha sido descrita por la forma de ejemplo solamente y pueden hacerse modificaciones mientras estén dentro del alcance y espíritu de la invención. En particular, modificaciones menores que no afectan la inmunogenicidad del sacárido capsular modificado de la presente invención son también comprendidas . Referencias : (1) Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,711,779. (2) Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,761,283. (3) Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,882,317. (4) Lemercimier et al. (1996) Corbohydr Res 296:83-96 (5) Jones & Lemercinier (2002) J Pharm Biomed Anal 30 :1233-47. (6) Claus et al. (2004) Molecular Microbiology 51:227-39. (7) Longoworth et al. (2002) 13th International Pathogenic Neisseria Conference. Resumen, página 272. (8) Longoworth et al. (2002) FEMS Immunol Med Microbiol 32 :119-23. (9) Pllard et al. (2003) Emerging Infections Diseases 9 :1503-4. (10) Glode M. P. Et al. (1979) J Infect Dis 139:52-56. (11) Solicitud WO94/05325; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,425,946. (12) Berry et al. (2002) Infect Immun 70:3707-13. 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Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguiente reivindicaciones : 1. Un sacárido capsular de meningococo del serogrupo W135 modificado, caracterizado porque (a) < 29% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) > 26% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 9.
  2. 2. Un sacárido capsular de meningococo del serogrupo Y modificado, caracterizado porque (a) < 9% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) =1 29% ó 27% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 9.
  3. 3. El sacárido capsular de meningococo modificado de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 2 , caracterizado porque > 0% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 7.
  4. 4. El sacárido capsular de meningococo modificado de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 2 , caracter zado porque >0% de los residuos de ácido siálico en el sacárido son O-acetilados en la posición 9.
  5. 5. Un sacárido capsular de meningococo modificado, caracterizado porque está opcionalmente conjugado a una proteína portadora, en donde el sacárido comprende n o • más unidades de repetición de la unidad de disacárido {[ácido siálico]-[hexosa]} donde la hexosa es ya sea galactosa o glucosa y n es un entero de 1 a 100, y en donde: (a) x% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 7; y/o (b) cuando la hexosa es galactosa > y% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 9, y cuando la hexosa es glucosa, >_ y% ó z% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 9. en donde: cuando la hexosa es galactosa, x es 29 y y es 26; y cuando la hexosa es glucosa, es 9 , y es 29 y z es 27.
  6. 6. El sacárido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la hexosa es galactosa, aproximadamente 6% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O- acetiladas en la posición 7, y aproximadamente 43% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 9.
  7. 7. El sacárido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porgue la hexosa es glucosa, aproximadamente 6% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 7, y aproximadamente 45% de los residuos de ácido siálico en las n o más unidades de repetición son O-acetiladas en la posición 9.
  8. 8. Una composición caracterizada porque comprende a moléculas del sacárido capsular de meningococo del serogrupo W315, en donde el número promedio de residuos de ácido siálico por molécula de sacárido capsular es b, y en donde (a) <_ 29% de los a.b residuos de ácido siálico del serogrupo W135 en la composición son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) > 26% de los a.b residuos de ácido siálico del serogrupo W135 en la composición son O-acetilados en la posición 9. 9. Una composición caracterizada porque comprende a moléculas del sacárido capsular de meningococo del serogrupo- Y, en donde el número promedio de residuos de ácidos siálico por molécula de sacárido capsular es b, y en donde (a) <_ 9% de los a.b residuos de ácido siálico del serogrupo Y en la composición son O-acetilados en la posición 7; y/o (b) .> 29% o < 27% de los a.b residuos de ácido siálico del serogrupo W135 en la composición son O-acetilados en la posición
  9. 9.
  10. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 8 ó la reivindicación 9, caracterizada porque el sacarido capsular es conjugado a una proteína portadora.
  11. 11. Un sacárido caracterizado porgue comprende n o más unidades de repetición de la siguiente unidad de disacáridos en donde : n es un entero de 1 a 100, X y Y son grupos diferentes seleccionados de -H y -OH. R1 es seleccionado independientemente de -H y - C0CH3 y puede ser el mismo o diferente en cada unidad de disacárido, R2 es seleccionado independientemente de -H y - COCH3 y puede ser el mismo o diferente en cada unidad de disacárido, y - Cuando X es -OH y Y es -H, (a) <_ 29% de R1 son - COCH3 y/o (b) > 26% de R1 son -COCH3. - Cuando X es -H y Y es -OH, (a) < 9% de R1 son - COCH3 y/o (b) 29% ó 27% de R2 son -COCH3.
  12. 12. El sacárido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el sacárido tiene un grado promedio de polimerización de menos de 30.
  13. 13. El producto de conjugación de (i) un sacárido de conformidad con cualquiera reivindicación precedente, y (ii) una proteína portadora caracterizada porque se seleccionan del grupo que consiste de: toxoide de difteria, toxoide de tétanos, proteína D de H. Influenzae y CRMi97.
  14. 14. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende (a) un sacárido capsular modificado o conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, y (b) un portador aceptable farmacéuticamente.
  15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque está en forma acuosa.
  16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque está en forma liofilizada.
  17. 17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizada porque además comprende un antígeno de sacárido capsular a partir del serogrupo C de N. meningitidis.
  18. 18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada porque además comprende un antígeno de sacárido capsular a partir del serogrupo A de N. meningitidis .
  19. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque comprende un antígeno del serogrupo A
  20. 20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada porque además comprende un antígeno del serogrupo B de N. meningitidis.
  21. 21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, caracterizada porque además comprende un antígeno de sacárido a partir del tipo B de Haemophilus influenzae.
  22. 22. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, caracterizada porque además comprende un antígeno a partir de Streptococcus pneumoniae.
  23. 23. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, caracterizada porque además comprende uno o más de: antígeno a partir de virus de Hepatitis A; un antígeno a partir de virus de Hepatitis B; un antígeno de Bordetella pertussis; un toxoide de difteria; un toxoide de tétanos y/o un antígeno de poliovirus.
  24. 24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, caracterizada porque se usa como un medicamento.
  25. 25. Un método para incrementar la respuesta de anticuerpos en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 13 al mamífero .
  26. 26. El uso de un sac rido capsular de meningococo . del serogrupo W135 modificado y/o un sacárido capsular de meningococo del serogrupo Y modificado como se definen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la fabricación de un medicamento para protegerlo contra la meningitis de meningococos .
  27. 27. Un proceso para preparar un conjugado inmunogénico caracterizado porque comprende las etapas de: (1) proporcionar un sacárido capsular de meningococo de partida del serogrupo W135 ó serogrupo Y y una proteína portadora, ya sea o ambos que es/son opcionalmente modificado (s) para llevarlo/llevarlos a ser reactivos uno hacia el otro; (2) formar un enlace covalente entre el sacárido y la proteína portadora; y (3) purificar los glicoconjugados resultantes en donde, entre las etapas (1) y (3) se incrementa el grado de O-acetilación en la posición 9 de los residuos de ácido siálico en el sacárido de partida.
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