ES2396422T3 - Dominios y epítopes de proteínas meningocócicas NMB 1870 - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, que comprende las etapasde: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB1870 con una segunda secuencia de aminoácidosNMB1870, en la que la primera y segunda secuencias son diferentes y provienen de familias diferentes deNMB1870, para proporcionar un par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una parte de la primera secuencia deaminoácidos, comenzando en el aminoácido a1 de dicha primera secuencia de aminoácidos y acabando en elaminoácido b1 de dicha primera secuencia de aminoácidos, en la que la parte es una secuencia de superficie enbucle; (c) seleccionar una parte de la segunda secuencia de aminoácidos, comenzando en el aminoácido a2 de dichasegunda secuencia de aminoácidos y acabando en el aminoácido b2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos,en la que la parte es una secuencia de superficie en bucle y en la que los restos a1 y a2 así como b1 y b2 estánalineados en el par de secuencias alineadas; y (d) reemplazar dicha parte de la primera secuencia de aminoácidospor dicha parte de la segunda secuencia de aminoácidos, proporcionando así la secuencia de aminoácidosNMB1870 quimérica, en la que la secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia estructural, en ochopartes y siete bucles de superficie, uno entre cada parte de la secuencia estructural.

Description

Dominios y epítopes de proteínas meningocócicas NMB 1870

Campo técnico

La presente invención se encuentra en el campo de la inmunización y, en particular, inmunización contra enfermedades producidas por bacterias patógenas del género Neisseria, tales como N. meningitidis (meningococo).

Técnica anterior

Neisseria meningitidis es una bacteria Gram-negativa encapsulada que coloniza el tracto respiratorio superior de aproximadamente el 10% de la población humana. Aunque se dispone de las vacunas de polisacáridos y conjugados contra los serogrupos A, C, W135 e Y, esta estrategia no puede aplicarse al serogrupo B porque el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico, que es un autoantígeno en seres humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B, se han usado proteínas expuestas en superficie contenidas en las vesículas de la membrana externa (VME). Estas vacunas provocan respuestas de anticuerpos bactericidas en suero y protegen contra la enfermedad, pero no inducen protección cruzada entre cepas[1]. Algunos investigadores, por tanto, se han centrado en antígenos meningocócicos específicos para su uso en vacunas.

Uno de estos antígenos es ‘NMB1870’. Esta proteína se denominó inicialmente proteína ‘741’ de la cepa MC58 [SEC ID Nº 2535 y 2536 en la ref. 2; SEC ID 1 en el presente documento], y también se ha denominado ‘GNA1870’ [ref. 3, después de la referencia 4] y ‘ORF2086’ [5,6]. Esta proteína se expresa en todos los serogrupos de meningococos y se ha encontrado en múltiples cepas de meningococos. Las secuencias de NMB1870 se han agrupado en tres familias, y se ha encontrado que el suero producido contra una familia determinada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, es decir, existe una protección cruzada dentro de la familiar pero no hay una protección cruzada entre familias.

Por tanto, para conseguir protección cruzada entre cepas usando NMB1870, se usa más de una familia. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas, se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [7], incluidas dos o tres de las tres familias en una sola cadena polipeptídica. Se han ensayado diversos híbridos y han proporcionado una alentadora eficacia anti-meningocócica.

Es un objeto de la invención proporcionar más y mejores estrategias para superar la especificidad de la familia de la protección proporcionada por NMB1870 y para usar estas estrategias para proporcionar inmunidad contra la enfermedad y/o infección menigocócicas, particularmente para el serogrupo B.

Descripción de la invención

Los inventores han descubierto que NMB1870 expone algunos de sus epítopos en bucles de superficie situados entre hélices alfa. La sustitución de epítopes bucle de una familia en la posición bucle de otra familia permite que se produzcan NMB1870 quiméricas con antigenicidad multifamiliar.

Por tanto la invención proporciona proteínas NMB1870 quiméricas que comprenden partes de NMB1870 de diferentes familias como se define en las reivindicaciones. Mientras que cada familia de NMB1870 puede provocar anticuerpos (por ejemplo en ratones) que son eficaces solo contra cepas en la misma familia NMB1870, los polipéptidos quiméricos de la invención pueden provocar anticuerpos que reconozcan proteínas NMB1870 de más de una familia.

Las respuestas de anticuerpos bactericidas se miden convenientemente en ratones y son un indicador patrón de la eficacia de la vacuna [por ejemplo véase la nota final 14 de la referencia 4]. Las proteínas quiméricas pueden provocar preferentemente una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra al menos una cepa de N. meningitidis de cada uno de al menos dos de los siguientes tres grupos de cepas:

(I)

MC58, gb185 (=M01-240185), m4030, m2197, m2937, iss1001, NZ394/98, 67/00, 93/114, bz198, m1390, nge28, lnp17592, 00-241341, f6124, 205900, m198/172, bz133, gb149 (=M01-240149), nm008, nm092, 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bz169, bz83, cu385, h44/76, m1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847.

(II)

961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013), e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, c11, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286.

(III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355), m3369, m3813, ngp165.

Por ejemplo, un polipéptido quimérico puede provocar una respuesta bactericida eficaz contra dos o más cepas de

N. meningitidis del serogrupo B, MC58, 961-5945 y M1239.

Preferentemente, el polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra al menos el 50% de las cepas meningocócicas del serogrupo B clínicamente importantes (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más). El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de N. meningitidis del serogrupo B y cepas de al menos uno (por ejemplo 1, 2, 3, 4) de los serogrupos A, C,

W135 e Y. El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de N. gonococcus y/o N. cinerea. El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas de al menos dos de las tres ramas principales del dendrograma mostrado en la Figura 5 de la referencia 3.

El polipéptido quimérico puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra las cepas de N. meningitidis en al menos 2 (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los linajes hipervirulentos ET-37, ET-5, grupo A4, linaje 3, subgrupo I, subgrupo III y subgrupo IV-1 [8,9]. Adicionalmente las quimeras pueden provocar respuestas de anticuerpos bactericidas contra uno o más de linajes hiperinvasivos.

Las quimeras pueden provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra las cepas de N. meningitidis al menos en 2 (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los siguientes tipos de secuencia multilocus: ST1, ST4, ST5, ST8, ST11, ST32 y ST41 [10]. La quimera también puede provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida contra cepas ST44.

La composición no tiene que inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de cepas de meningococo del serogrupo B, MenB, en los linajes especificados o MLST; sino que, para cualquier grupo determinado de cuatro o más cepas del meningococo del serogrupo B en un linaje hipervirulento particular o MLST, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra el menos el 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos de cepas preferidos incluirán cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. Preferentemente, el suero tiene un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, preferentemente al menos 214) es decir, el suero puede destruir al menos el 50% de las bacterias de ensayo de una cepa particular cuando está diluida al 1:1024, como se describe, por ejemplo, en la nota final 14 de la referencia 4. Los polipéptidos quiméricos preferidos pueden provocar una respuesta de anticuerpos en ratones que permanezca bactericida incluso cuando el suero se ha diluido al 1:4096 o más.

La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de longitud completa de NMB 1870 de la familia I de la cepa MC58 del serogrupo B:

Se destaca el extremo N de la lipoproteína madura procesada (Cys-20).

Las secuencias de NMB1870 se incluyen dentro de tres familias [3,7] que en el presente documento se denominan familias I, II y III. Las secuencias prototípicas para las familias I-III son, respectivamente, lasSEC ID Nos: 1-3. Los procedimientos filogenéticos y el dendrograma de la referencia 3 pueden seguirse para determinar fácilmente la familia para cualquier secuencia de NMB1870 determinada, y también puede usarse un alineamiento por pares con cada una de las tres secuencias de NMB1870 prototípicas para encontrar la coincidencia de familia más cercana. Las secuencias se incluyen claramente en las tres familias, siendo la identidad de secuencia del 74,1% entre las familias I y II, del 62,8% entre las familias I y III y del 84,7% entre las familias II y III y siendo la variación de secuencia dentro de cada familia baja (por ejemplo un mínimo de identidad del 91,6% en la familia I, del 93,4% en la familia II y del 93,2% en la familia III). Como un modo rápido de determinar la secuencia de una familia sin necesitar un análisis filogenético, puede introducirse una secuencia en la familia I si esta tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEC ID Nº: 1, puede introducirse en la familia II si tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEC ID Nº: 2 y puede introducirse en la familia III si tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEC ID Nº: 3.

Bucles de superficie de NMB1870

Los bucles de superficie de la SEC ID Nº: 1, que se sitúan entre las hélices alfa son: (1) los aminoácidos 134-141;

(2) los aminoácidos 162-168; (3) los aminoácidos 181-182; (4) el aminoácido 197; (5) los aminoácidos 219-223; (6) los aminoácidos 234-236; (7) aminoácidos 261-267:

Alineando la SEC ID Nº: 1 con cualquier otra secuencia de NMB1870, el experto en la materia puede identificar las posiciones de los bucles (1) a (7) en esa secuencia. Sin embargo, para simplificar referencias, en el presente documento las coordenadas de un bucle se definen como la serie de aminoácido (aminoácidos) en una secuencia de NMB 1870 que, cuando se alinea con la SEC ID Nº:1, usando un algoritmo de alineamiento por parejas,

5 comienza con el aminoácido alineado con el primer resto de aminoácido del bucle definido anteriormente en la SEC ID Nº: 1 y termina con el último aminoácido del bucle definido anteriormente en la SEC ID Nº: 1.

Construcción de secuencias de NMB1870 quiméricas

La invención proporciona un procedimiento para producir una secuencia de aminoácidos de NMB1870 quimérica, como se define en la reivindicación 1.

10 Las etapas (b) a (d) pueden realizarse más de una vez para el mismo alineamiento de la etapa (a), es decir, en la primera secuencia pueden realizarse sustituciones múltiples de la segunda secuencia. De manera similar, las etapas

(a) a (d) pueden realizarse más de una vez, usándose opcionalmente una “segunda secuencia de aminoácidos” diferente durante las etapas (a) posteriores, es decir, una primera secuencia puede alinearse con una segunda secuencia y someterse al procedimiento de sustitución y después puede alinearse con una segunda secuencia

15 diferente y someterse a una sustitución adicional, etc.

Por tanto la invención proporciona un procedimiento para producir una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, que comprende las etapas de: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB1870 con una segunda secuencia de aminoácidos NMB1870, para proporcionar un primer par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una parte de la primera secuencia de aminoácidos, que comienza en el aminoácido a1 de dicha primera 20 secuencia de aminoácidos y acaba en el aminoácido b1 de dicha primera secuencia de aminoácidos; (c) seleccionar una parte de la segunda secuencia de aminoácidos, que comienza en el aminoácido a2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos y acaba en el aminoácido b2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos, en la que los restos a1 y a2 y b1 y b2 se alinean en el primer par de secuencia alineadas; (d) reemplazar dicha parte de la primera secuencia de aminoácidos por dicha parte de la segunda secuencia de aminoácidos, proporcionando de esta manera una 25 secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica intermedia; (e) alinear la primera secuencia de aminoácidos NMB1870, o la secuencia quimérica intermedia, con una tercera secuencia de aminoácidos NMB1870, para proporcionar un segundo para de secuencias alineadas; (f) seleccionar una parte de la secuencia quimérica intermedia, que comienza en el aminoácido a3 de la secuencia quimérica intermedia y acaba en el aminoácido b3 de la secuencia quimérica intermedia; (g) seleccionar una parte de la tercera secuencia de aminoácidos, que comienza

30 en el aminoácido a4 de dicha tercera secuencia de aminoácidos y acaba en el aminoácido b4 de dicha tercera secuencia de aminoácidos, en la que los restos a3 y a4 y b3 y b4 se alinean en el segundo par de secuencias alineadas y (h) reemplazar dicha parte de la secuencia quimérica intermedia, por dicha parte de la tercera secuencia de aminoácidos, proporcionando de esta manera la secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica.

Las partes seleccionadas tienen preferentemente al menos una longitud de 3 aminoácidos.

35 La secuencia (o secuencias) sustituidas son secuencias bucle de superficie. La invención incluye situaciones que incluyen hasta 7 sustituciones.

La invención también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, en el que dicha secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica puede obtenerse mediante el procedimiento anterior.

40 El procedimiento de la invención puede continuarse por la etapa adicional de producir un polipéptido que comprenda dicha secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, por ejemplo, mediante expresión de proteínas recombinantes.

Sustitución de bucle

Los inventores han descubierto que NMB1870 expone algunos de sus epítopes en bucles de superficie situados entres hélices alfa. La sustitución de epítopes en bucles de una familia en la posición de bucle en otra familia permite

45 que se produzca la proteína NMB1870 quimérica con antigenicidad multifamiliar.

Por lo tanto la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos modificada de una primera familia de NMB1870, en el que la secuencia modificada incluye al menos una (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) secuencia en bucle de superficie de una segunda familia de NMB1870 en el lugar de una secuencia en bucle de superficie de la primera familia.

50 La invención también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos:

-

B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8

en la que: (a) cada uno de dichos B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 yB8 es: (i) un fragmento de la SEC ID Nº:1; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia m% con dicho fragmento de (i) y/o comprende un fragmento de al menos un aminoácido contiguo mm de dicho segmento de (i); (b) cada uno de dichos

L1, L2, L3, L4, L5, L6 yL7 es: (iii) un fragmento de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y/o SEC ID Nº: 3; siempre que al menos uno de dichos L1, L2, L3, L4, L5, L6 yL7 no sea un fragmento de la SEC ID Nº:1

Por tanto el polipéptido comprende una secuencia estructural básica, en ocho partes, y siete bucles, uno entre cada parte consecutiva de la secuencia estructural, pero al menos uno de las secuencias de bucle se extrae de una secuencia NMB1870 que es de una familia NMB1870 diferente de la secuencia estructural básica. Se prefiere el uso de bucles de superficie de más de una secuencia NMB1870 diferente, y es posible insertar estos bucles en una sola secuencia estructural.

El significado de “(i) un fragmento de la SEC ID Nº: 1” es el siguiente:

Coordenadas de aminoácidos dentro de la SEC ID Nº:1

B1

B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8

1

1-133 142-161 169-180 183-196 198-218 224-233 237-260 268-274

De manera similar, “(iii) un fragmento de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y/o de la SEC ID Nº: 3” se define de la siguiente manera:

Coordenadas de aminoácidos dentro de la SEC ID Nº: 1, 2 o 3

SEC

L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7

1

134-141 162-168 181-182 197 219-223 234-236 261-267

2

134-141 162-167 180-181 196 218-222 233-235 260-266

3

142-149 170-175 188-189 204 226-230 241-243 268-274

Por ejemplo, a invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos:

-

B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8

en la que; B1 es los aminoácidos 1-133 de la SEC ID Nº: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 95% con dichos aminoácidos 1-133 y/o comprende un fragmento de al menos 6 aminoácidos contiguos de dichos aminoácidos 1-133; B2 es los aminoácidos 142-161 de la SEC ID Nº: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 95% con dichos aminoácidos 142-161 y/o comprende un fragmento de al menos 6 aminoácidos contiguos de dichos aminoácidos 142-161… B8 es los aminoácidos 268-274 de la SEC ID Nº: 1. L1 es los aminoácidos 134-141 de la SEC ID Nº: 2; L2 es los aminoácidos 162-167 de la SEC ID Nº: 2; L7 es los aminoácidos 268-274 de la SEC ID Nº: 3 etc.

La invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global del 80% con la SEC ID Nº: Q, en la que: el valor de q es al menos r; la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: Q es más del 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: Q; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: Q es menor del 80% en las regiones bucle de la SEC ID Nº: Q.

El valor de Q es 1, 2 o 3, y los límites de las regiones bucle y de las regiones estructurales se seleccionan por consiguiente de las tablas anteriores (siendo de L1 aL7 los bucles y de B1 aB8 la cadena estructural).

Polipéptidos

La invención proporciona los polipéptidos descritos anteriormente.

NMB1870 es una lipoproteína natural de en N.meningitidis. También se ha descubierto que está lipidada cuando se en E. coli. Los polipéptidos preferidos de la invención tienen un resto de cisteína en el extremo C, que puede estar lipidado, que comprenden, por ejemplo un grupo palmitoilo.

Una característica de los polipéptidos preferidos de la invención es la capacidad para inducir anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un animal huésped.

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse mediante diversos medios, por ejemplo, mediante síntesis química (al menos en parte), mediante digestión de los polipéptidos más largos usando proteasas, mediante traducción desde ARN, mediante purificación del cultivo celular (por ejemplo, de la expresión recombinante o del cultivo de N.meningitidis). etc. La expresión heteróloga de un huésped de E. coli es una vía de expresión preferida (por ejemplo, en DH5a, BL21 (DE3), BLR, etc.).

Los polipéptidos de la invención pueden estar fijados o inmovilizados en un soporte sólido.

Los polipéptidos de la invención pueden comprender un marcador detectable, por ejemplo, un marcador radioactivo, un marcador fluorescente o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayo.

Los polipéptidos pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, naturales, fusiones, glicosiladas, no glicosiladas, lipidadas, puentes de disulfuro, etc.).

Preferentemente, los polipéptidos se preparan en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos de Neisseria o de células huésped). En general, los polipéptidos se proporcionan en un ambiente no natural, por ejemplo se separan de su ambiente natural. En determinadas realizaciones, el polipéptido objeto está presente en una composición que está enriquecida para el polipéptido en comparación con un control. Como tal, se proporciona el polipéptido purificado, lo que significa que el polipéptido está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, de modo que sustancialmente libre quiere decir que menos del 90%, normalmente menos del 60% y, más normalmente, menos del 50% de la composición está constituido por otros polipéptidos expresados.

El término “polipéptido” se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también incluyen un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o mediante la invención; por ejemplo, formación de puentes disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la invención, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

Ácidos nucleicos

Como se ha definido anteriormente, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende: (a) un fragmento de al menos n nucleótidos consecutivos de dicho ácido nucleico, en el que n es 10 o más (por ejemplo 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o más); y/o (b) es una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) con dicho ácido nucleótido.

Adicionalmente, la invención proporciona un ácido nucleico que puede quimerizarse con ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención, preferentemente en condiciones de “alta rigurosidad” (por ejemplo, 65 °C en una solución de SDS al 0,5%, 0,1xSSC).

Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse en reacciones de hibridación (por ejemplo, transferencias de Northern o Southern, o en micromatrices de ácido nucleico o 'microplacas génicas') y en reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.) y en tras técnicas de ácido nucleico.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (por ejemplo, síntesis con fosforamidita de ADN) en todo o en parte, digiriendo los ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), uniendo los ácidos nucleicos más cortos o los nucleótidos (usando, por ejemplo, ligasas o polimerasas), a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden adoptar diversas formas, por ejemplo, pueden ser monocatenarios, bicatenarios, vectores, cebadores, sondas, pueden estar marcados, no marcados, etc.

Los ácidos nucleicos de la invención están, preferentemente, en forma aislada o sustancialmente aislada.

La invención incluye ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las descritas anteriormente, por ejemplo, para antisentido o exploración, o para usar como cebadores.

La expresión “ácido nucleico” incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen armazones modificados y también ácidos nucleicos peptídicos (ANP), etc.

El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede marcarse, por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico va a usarse en técnicas de detección de ácido nucleico, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es un cebador o una sonda para usar en técnica tales como PCR, LCR, TMA, NASBA, etc.

La invención también proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o expresión, tales como los adecuados para inmunización con ácido nucleico) y células huésped transformadas con dichos vectores.

Inmunización

Preferentemente, los polipéptidos de la invención se proporcionan como composiciones inmunogénicas, y la invención proporciona una composición inmunogénica de la invención para su uso como medicamento.

Las composiciones de la invención también pueden usarse en un procedimiento para suscitar una respuesta de anticuerpos en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una composición inmunogénica de la invención. La respuesta de anticuerpos es, preferentemente, una respuesta de anticuerpos protectora y/o bactericida.

Las composiciones de la invención también pueden usarse en un procedimiento para proteger a un mamífero contra una infección por Neisseria (por ejemplo, meningocócica), que comprende administrar al mamífero una composición inmunogénica de la invención.

La invención proporciona polipéptidos quiméricos de la invención para su uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o como vacunas)

El mamífero es, preferentemente, un ser humano. El ser humano puede ser un adulto o, preferentemente, un niño. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es, preferentemente, un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante); cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es, preferentemente, un adulto. Una vacuna para niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

Los usos y procedimientos son particularmente útiles para prevenir/tratar enfermedades que incluyen, pero sin limitación, meningitis (particularmente meningitis bacteriana) y bacteriemia.

La eficacia del tratamiento terapéutico puede ensayarse controlando la infección por Neisseria después de administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico puede ensayarse controlando las respuestas inmunitarias contra NMB1870 después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede determinarse mediante su administración a sujetos de ensayo (por ejemplo niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales [13]) y, después, determinando los parámetros patrón incluidos los anticuerpos bactericidas en suero (ABS) y los títulos de ELISA (GMT, media geométrica de los títulos). Estas respuestas inmunitarias generalmente se determinarán aproximadamente 4 meses después de la administración de la composición y se compararán con los valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un aumento de los ABS de al menos 4 u 8 veces. Cuando se administra más de una dosis de la composición, después de la administración puede realizarse más de una determinación.

Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que es superior al criterio para seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpos asociado superior a lo que en un huésped se considera seroconversión contra el antígeno son bien conocidos y dichos títulos son publicados por organizaciones tales como la OMS. Preferentemente más del 80% de una muestra estadísticamente significativa de sujetos está seroconvertido, más preferentemente más del 90%, aún más preferentemente más del 93% y más preferentemente del 96-100%.

En general, las composiciones de la invención se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede conseguirse por inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido) o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el músculo o el brazo. La inyección puede realizarse a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) pero, como alternativa, se puede usar la inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.

La invención puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa.

La posología del tratamiento puede ser un programa de dosis única o de dosis múltiples. Pueden usarse dosis múltiple en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. A un programa de dosis primaria le puede seguir un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis iniciales (por ejemplo entre 4-16 semanas) y entre la administración inicial y la de refuerzo puede determinarse rutinariamente.

La composición inmunogénica de la invención generalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier sustancia que , por sí misma, no induzca la producción de anticuerpos perjudiciales para el paciente que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Dichos vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. En dichos vehículos también puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tampón del pH y similares. Los liposomas son vehículos adecuados. En la referencia 14 puede encontrarse un análisis exhaustivo

de vehículos farmacéuticos.

Las infecciones por Neisseria afectan a diversas zonas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones de la invención pueden prepararse de varias maneras. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como suspensiones o soluciones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o 5 suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para administración oral por ejemplo, como un comprimido o cápsula o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para

10 administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, en forma de gotas.

La composición es, preferentemente, estéril. Preferentemente es apirógena. Preferentemente está tamponada a, por ejemplo, un pH entre 6 y 8, generalmente a un pH de aproximadamente 7. Cuando una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un tampón de histidina [15]. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.

15 Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno, así como de cualquier otro componente especificado, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz”, se quiere decir que la administración de dicha cantidad a un individuo, bien en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y estado físico del individuo que se va a tratar, la edad, grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no

20 humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, el criterio del médico tratante de la situación médica y otros factores importantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina. La posología del tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). La composición puede administrarse

25 junto con otros agentes inmunorreguladores.

Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales, adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención, incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como

30 hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 16] o mezclas de diferentes compuestos minerales, teniendo los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalina, amorfo, etc.) y prefiriéndose la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de una sal metálica [17].

Particularmente se prefieren fosfatos de aluminio, particularmente en composiciones que incluyen un antígeno

35 sacárido de H. influenzae y un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporción molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluida a 0,6 mg de Al3+/ml. La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio puede usarse, por ejemplo, entre 50 y 100 !g de Al3+ por conjugado por dosis. Cuando en una composición hay más de un conjugado, no todos los conjugados tienen que adsorberse.

B. Emulsiones en aceite

40 Las composiciones en emulsión en aceite, adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención, incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [capítulo 10 de la referencia 16; véase también la referencia 18] (escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5%, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). También puede usarse adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF).

45 C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 16]

Como adyuvantes en la invención también pueden usarse formulaciones de saponina. Las saponinas son un grupo heterólogo de glicósidos de esterol y glicósidos de triterpenoide que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia diversidad de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también puede obtenerse

50 comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (jabonera). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOM. El QS21 se comercializa como Stimulon™.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Usando estas técnicas, se han identificado fracciones específicas purificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18 QS21, QH-B y QH-C. Preferentemente,

55 la saponina es QS21. En la referencia 19 se divulga un procedimiento de producción de QS21. Las formulaciones con saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [20].

Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden usarse para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM [capítulo 23 de la referencia 16]. Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidil etanolamina o fosfatidilcolina. En los ISCOM puede usarse cualquier saponina. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen con mayor detalle en las referencias 20-22. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [23].

Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina puede encontrarse en las referencias 24 y 25.

D. Virosomas y partículas similares a virus

Los virosomas y las partículas similares a virus (VLP, Virus Like Particle) también pueden usarse como coadyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen uno o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Generalmente son no patógenas, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse de manera recombinante o aislarse a partir de virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para usar en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tal como HA o NA), el virus de la hepatitis B (tal como proteínas del o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la enfermedad pieboca, retrovirus, virus de Norwalk, el virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Q∀ (tal como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205, y Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón Ty). Adicionalmente, las VLP se tratan con mayor detalle en las referencias 26-31. Los virosomas se tratan con mayor detalle, por ejemplo, en la referencia 32.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos del lipopolisacárido (LPS) de enterobacterias, derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de los mismos.

Los derivados no tóxicos del LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3-O-desacilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma en “partícula pequeña” preferida de monofosforil lípido A 3-O-desacilado se desvela en la referencia 33. Tales “partículas pequeñas” de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas como para esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22 !m [33]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforil lípido A, tal como derivados de aminoalquilglucosaminida fosfato, por ejemplo, RC-529 [34,35].

Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli, tal como OM-174. El OM-174 se describe, por ejemplo, en las referencias 36 y 37.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada unida a una guanosina por un enlace fosfato). También se ha demostrado que los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimuladores.

Los CpG pueden incluir modificaciones / análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Las referencias 38, 39 y 40 describen posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, sustitución de guanosina con 2’-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto de adyuvante de los oligonucleótidos CpG se trata adicionalmente en las referencias 41-46.

La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [47]. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se tratan en las referencias 48-50. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5’ sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, pueden unirse dos secuencias oligonucleotídicas CpG en sus extremos 3’ para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, las referencias 47 y 51-53.

Como adyuvantes en la invención pueden usarse toxinas bacterianas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de las mismas. Preferentemente, la proteína deriva de E. coli (enterotoxina termolábil “TL” de E. coli), cólera (“CT”) o tosferina (“PT”). El uso de toxinas de ribosilación de ADP destoxificadas, tales como adyuvantes de mucosa se describe en la referencia 54 y como adyuvantes parenterales en la referencia 55. La toxina o toxoide está, preferentemente, en forma de holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante; preferentemente la subunidad B no ha mutado. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes, puede encontrarse en las referencias 56-63. Preferentemente, la referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas de ribosilación de ADP indicadas en la referencia 64, específicamente incorporadas en la presente memoria en su totalidad por referencia.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [65], etc.) [66], interferones (por ejemplo interferón-#), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.

G. Bioadhesivos y mucoadhesivos

También pueden usarse bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado [67] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. En la invención, también pueden usarse como adyuvantes el quitosano y derivados del mismo [68]

H. Micropartículas

También pueden usarse micropartículas como adyuvantes en la invención. Se prefieren micropartículas (es decir una partícula de ∃100 nm a ∃150 !m de diámetro, más preferentemente de ∃200 nm a ∃30 !m de diámetro, y más preferentemente de ∃500 nm a ∃10 !m de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(%-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.) con poli(láctido-co-glicolido), opcionalmente tratadas para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, con un detergente catiónico tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia 16)

En las referencias 69-71 se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes.

J. Formulaciones de polioxietilenéter y polioxietilenéster

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen polioxietilenéteres y polioxietilenésteres [72]. Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de polioxietilen éster de sorbitán en combinación con un octoxinol [73] así como tensioactivos de polioxietilen éteres o ésteres de alquilo en combinación al menos con un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [74]. Los polioxietilen éteres preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauriléter (laureth 9), polioxietilen-9-esteoriléter, polioxiteilen-8-esteoriléter, polioxietilen-4-lauriléter, polioxietilen-35-lauriléter y polioxietilen-23-lauriléter.

K. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las referencias 75 y 76.

L. Muramil péptidos

Como ejemplos de muramil péptidos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención se incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP) y N-acetilmuramilL-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona

Como ejemplos de compuestos de imidazoquilonina adecuados para uso como adyuvantes en la invención se incluyen Imiquiamod y sus homólogos (por ejemplo “Resiquimod 3M”), descritos adicionalmente en las referencias 77 y 78.

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados con anterioridad. Por ejemplo, en la invención pueden usarse las siguientes composiciones adyuvantes: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [79]; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [80]; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [81]; (5) combinaciones de 3dMPL, por ejemplo, con QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [82]; (6) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80TM al 0,4%, polímero de bloque plurónico L121 al 5% y thr-MDP, bien microfluidizados en una emulsión en submicrones o sometidos a agitación vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) Sistema adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS, Cell Wall Skeleton), preferentemente MPL + CWS (DetoxTM) y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

En el capítulo 7 de la referencia 16 se desvelan otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes.

Para inmunización parenteral las sales de aluminio (fosfato de aluminio y, particularmente hidroxifosfatos y/o hidróxidos y, particularmente, oxihidróxido) y MF59 son adyuvantes preferidos. Los mutantes de toxina son adyuvante mucosos preferidos. El QS21 es otro adyuvante útil para NMB1870, que puede usarse solo o en

5 combinación con uno o más otros diversos adyuvantes, por ejemplo, con una sal de aluminio. Los muramil péptidos incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamin MTP-PE), etc.

Otros componentes antigénicos.

10 Las composiciones de la invención incluyen polipéptidos NMB1870 quiméricos. Particularmente se prefiere que la composición no incluya mezclas complejas o no definidas de antígenos, por ejemplo, se prefiere no incluir vesículas de la membrana externa en la composición. Los polipéptidos de la invención se expresan, preferentemente, de forma recombinante en un huésped heterólogo y después se purifican.

La composición de la invención incluye un polipéptido NMB 1870 quimérico. También puede incluir uno o más

15 antígenos de Neisseria adicionales, ya que una vacuna dirigida a más de un antígeno por bacteria disminuye la posibilidad de seleccionar mutantes de escape. Los antígenos de Neisseria para incluir en las composiciones incluyen proteínas que comprenden:

(a)

las 446 SEC ID pares (es decir, 2, 4, 6, ... , 890, 892) desveladas en la referencia 83.

(b)

las 45 SEC ID pares (es decir 2, 4, 6, ... , 88, 90) desveladas en la referencia 84;

20 (c) las 1674 SEC ID pares 2-3020, SEC ID pares 3040-3114 y todas las SEC ID 3115-3241, desveladas en la referencia 2;

(d)

las 2160 secuencias de aminoácidos de NMB0001 a NMB2160 de la referencia 4;

(e)

una proteína PorA meningocócica, de cualquier subtipo, preferentemente expresada de manera

recombinante; 25 (f) una variante, homólogo, ortólogo, parálogo, mutante etc. de (a) a (e); o

(g) una preparación de vesículas de la membrana externa de N. meningitidis [por ejemplo, véase la referencia 177].

Además de antígenos proteicos de Neisseria, la composición puede incluir antígenos para inmunizar contra otras enfermedades o infecciones. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos 30 adicionales:

-

un antígeno sacárido de N.meningitidis, serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido desvelado en la

referencia 85 del serogrupo C [véase también la ref. 86] o los oligosacáridos de la referencia 87. -un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo 88, 89, 90]. -un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivados [por ejemplo 91, 92].

35 -un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o del núcleo [por ejemplo 92, 93]. -un antígeno de difteria, tal como el toxoide de la difteria [por ejemplo capítulo 3 de la referencia 94] por ejemplo

el mutante CRM197 [por ejemplo 95]. -un antígeno del tétanos, tal como el toxoide del tétanos [por ejemplo capítulo 9 de la referencia 94]. -un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina de tos ferina (PT) y la hemaglutinina filamentosa

40 (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por

ejemplo referencias 93 y 97]. -un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo 86]. -un antígeno (o antígenos) de la polio [por ejemplo 98, 99] tal como IPV. -antígenos del sarampión, paperas y/o rubeola [por ejemplo capítulos 9, 10 y 11 de la referencia 94].

45 -un antígeno (o antígenos) de la gripe [por ejemplo capítulo 9 de la referencia 94], tal como las proteínas de

superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa. -un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo 100]. -un antígeno proteico de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [por ejemplo 101, 102]. -un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B).

50 -un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo A) [por ejemplo 102, 103, 104]. -un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo 105].

La composición puede comprender uno o más de estos otros antígenos.

Cuando sea necesario, los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse (por ejemplo, destoxificación de la toxina de la tosferina por medios químicos y/o genéticos [97]).

55 Cuando en la composición se incluye un antígeno de difteria, también se prefiere incluir antígenos del tétanos y de tosferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos, también se prefiere incluir antígenos de difteria y tosferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tosferina, también se prefiere incluir antígenos de difteria y del tétanos. Por tanto se prefieren las combinaciones de DTP.

Los antígenos sacáridos están, preferentemente, en forma de conjugados. Las proteínas transportadoras para los conjugados incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningitidis [106], péptidos sintéticos [107,108], proteínas de choque térmico [109,110], proteínas tosferínicas [111,112], proteínas D de H. influenzae [113], citocinas [114], linfocinas [114], proteínas estreptocócicas, hormonas [114], factores de crecimiento [114], toxina A o B de C. difficile [115], proteínas captadoras de hierro [116], etc. Una proteína transportadora preferida es el toxoide diftérico CRM197 [117].

Típicamente, los antígenos en la composición estarán presentes a una concentración de al menos 1 !g/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno proporcionado será suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden usarse terapéuticamente (es decir, para tratar una infección existente) o profilácticamente (es decir, para prevenir una infección futura).

Las composiciones de la invención pueden incluir uno, dos o tres de: (a) antígenos sacáridos de los serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococo; (b) un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae tipo B; y/o (c) un antígeno de Streptococcus pneumoniae.

Serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococo

Las vacunas de polisacáridos contra los serogrupos A, C, W135 e Y se han conocido durante muchos años.

Estas vacunas (MENCEVAX ACWYTM y MENOMUNETM) se basan en los polisacáridos capsulares de los organismos y, aunque son eficaces en adolescentes y en adultos, proporcionan una mala respuesta inmunitaria y una duración corta de protección y no pueden usarse en lactantes. A diferencia de los antígenos polisacáridos no conjugados en estas vacunas, las vacunas del serogrupo C recientemente aprobadas (MenjugateTM [118,85], MeningitecTM y NeisVac-CTM) incluyen sacáridos conjugados. MenjugateTM y MeningitecTM tienen antígenos oligosacáridos conjugados con un transportador CRM197, mientras que NeisVac-CTM usa el polisacárido completo (des-O-acetilado) conjugado con un transportador del toxoide tetánico. La vacuna MenactraTM contiene antígenos sacáridos capsulares conjugados de cada uno de los serogrupos Y, W135, C y A.

Las composiciones de la presente invención incluyen, preferentemente, antígenos sacáridos capsulares de uno o más de los grupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococos, en las que los antígenos están conjugados a una proteína (o proteínas) transportadora y/o son oligosacáridos. Por ejemplo, la composición puede incluir un antígeno sacárido capsular de: serogrupo C; serogrupos A y C; serogrupos A, C y W135; serogrupos A, C e Y; serogrupos C, W135 e Y o de los cuatro serogrupos A, C, W135 e Y.

Una cantidad típica de cada antígeno sacárido de meningococo por dosis está entre 1 !g y 20 !g, por ejemplo aproximadamente 1 !g, aproximadamente 2,5 !g, aproximadamente 4 !g, aproximadamente 5 !g o aproximadamente 10 !g (expresados en forma de sacárido).

Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de los grupos A y C, la proporción (p/p) del sacárido MenA: sacárido MenC puede ser superior a 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y y de uno o los dos serogrupos C y W135, la proporción (p/p) del sacárido MenY: sacárido MenW135 puede ser superior a 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior) y/o la proporción (p/p) del sacárido MenY: sacárido MenC puede ser inferior a 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 o menor). Las proporciones (p/p) preferidas para los sacáridos de los serogrupos A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1. Las proporciones (p/p) preferidas para los sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2: 1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Se prefiere el uso de una masa sustancialmente igual de cada sacárido.

Los sacáridos capsulares generalmente se usan en forma de oligosacáridos. Estos se forman convenientemente por fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo, por hidrólisis), que normalmente irá seguida de la purificación de los fragmentos del tamaño deseado.

La fragmentación de polisacáridos se realiza, preferentemente, para proporcionar una grado medio final de polimerización (GP) en el oligosacárido menor de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, preferentemente de aproximadamente 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferentemente de aproximadamente 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). El GP puede medirse convenientemente por cromatografía de intercambio iónico o por ensayos colorimétricos [119].

Si se realiza hidrólisis, generalmente, se medirá el tamaño del hidrolizado para eliminar los oligosacáridos de longitud corta [86]. Esto puede conseguirse de diversas maneras, tales como ultrafiltración seguida por cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización menor o igual a aproximadamente 6 se eliminan, preferentemente, para el serogrupo A y los inferiores a aproximadamente 4 se eliminan preferentemente para los serogrupos W135 e Y.

Los antígenos sacáridos MenC preferidos se desvelan en la referencia 118 y se usan en MenjugateTM.

El antígeno sacárido puede modificarse químicamente. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis para el serogrupo A [120; véase más adelante]. Puede realizarse la des-O-acetilación de los sacáridos meningocócicos. Para los oligosacáridos, la modificación puede producirse antes o después de la despolimerización.

Cuando una composición de la invención incluye un antígeno sacárido MenA, el antígeno es, preferentemente, un sacárido modificado en el que uno o más de los grupos hidroxilo en el sacárido nativo se ha sustituido por un grupo bloqueante [120]. Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis.

El número de unidades de monosacárido que tienen grupos bloqueantes puede variar. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las unidades de monosacáridos pueden tener grupos bloqueantes. Como alternativa, al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de las unidades de monosacáridos pueden tener grupos bloqueantes. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 unidades de monosacárido pueden tener grupos bloqueantes.

Del mismo modo, el número de grupos bloqueantes sobre una unidad de monosacárido puede variar. Por ejemplo, el número de grupos bloqueantes en una unidad de monosacárido puede ser 1 ó 2. El grupo bloqueante generalmente estará en la posición 4 y/o en la posición 3 de las unidades de monosacárido.

La unidad de monosacárido terminal puede tener o no un grupo bloqueante en lugar de su grupo hidroxilo nativo. Se prefiere conservar un grupo hidroxilo alomérico libre en una unidad de monosacárido terminal para proporcionar un soporte para reacciones adicionales (por ejemplo conjugación). Los grupos hidroxilo anoméricos pueden convertirse en grupos amino (-NH2 o NH-E, en el que E es un grupo protector de nitrógeno) por aminación reductora (usando, por ejemplo, NaBH3CN/NH4Cl) y posteriormente pueden regenerarse después de que otros grupos hidroxilo se hayan convertido en grupos bloqueantes.

Los grupos bloqueantes que remplazan grupos hidroxilo pueden estar directamente accesibles mediante una reacción de derivatización del grupo hidroxilo, es decir, reemplazando el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo con otro grupo. Los derivados adecuados de grupos hidroxilo que actúan como grupos bloqueantes son, por ejemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, ésteres, éteres (por ejemplo silil éteres o alquil éteres) y acetales. Algunos ejemplos específicos de dichos grupos bloqueantes son alilo, Aloc, bencilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. Otros grupos bloqueantes que no están directamente accesibles y que reemplazan completamente el grupo hidroxilo incluyen alquilo C1-12, alquilo C3-12, arilo C5-12, arilo C5-12 -alquilo C1-6, NR1R2 (R1 y R2 se definen en el siguiente párrafo), H, F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquilo-C1-6), CN, CF3, CCl3, etc. Los grupos bloqueantes preferidos son grupos aceptores de electrones.

Los grupos bloqueantes preferidos tienen la fórmula: -O-X-Y o -OR3 en la que: X es C(O), S(O) o SO2; Y es alquilo C1-12, alcoxi C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12 o arilo C5-12 -alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede opcionalmente sustituirse con 1, 2 ó 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3 o CCl3; o Y es NR1R2; R1 y R2 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12, arilo C5-12 -alquilo C1-6; o R1 y R2 pueden unirse para formar un grupo heterocíclico saturado C3-12; R3 es alquilo C1-12 o cicloalquilo C3-12 cada uno de los cuales puede opcionalmente sustituirse con 1, 2 ó 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl, Br, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3 o CCl3; o R3 es arilo C5-12 o arilo C5-12 -alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede sustituirse opcionalmente con 1, 2, 3, 4 ó 5 grupos seleccionados de F, Cl, Br, CO2H CO2(C1-6 alquilo), CN, CF3 o CCl3. Cuando R3 es alquilo C1-12 o cicloalquilo C3-12, éste se sustituye típicamente con 1, 2 ó 3 grupos como se define anteriormente. Cuando R1 y R2 están unidos para formar un grupo heterocíclico saturado C312, significa que R1 y R2 juntos con el átomo de nitrógeno forman un grupo heterocíclico saturado que contiene cualquier cantidad de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12). El grupo heterocíclico puede contener 1 ó 2 heteroátomos (tales como N, O, S) distintos del átomo de nitrógeno. Los ejemplos de grupos heterocíclicos saturados C3-12 son pirrolidinil, piperidinil, morfolinil, piperazinil, imidazolidinil, azetidinil y aziridinil.

Los grupos bloqueantes -O-X-Y y -OR3 pueden prepararse a partir de grupos -OH mediante procedimientos de derivatización convencionales tales como reacción del grupo hidroxilo con un haluro de acilo, haluro de alquilo, haluro de sulfonilo, etc. Por tanto el átomo de oxígeno en -O-X-Y es preferentemente el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo mientras que el grupo -X-Y en -O-X-Y preferentemente sustituye el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo.

Como alternativa, los grupos bloqueantes pueden ser accesibles mediante una reacción de sustitución, tal como la sustitución de tipo Mitsonobu. Estos y otros procedimientos para preparar grupos bloqueantes a partir de grupos hidroxilo son bien conocidos.

Más preferentemente, el grupo bloqueante es -OC(O)CF3 [121] o un grupo carbamato -OC(O)NR1R2, en el que R1 y R2 se seleccionan independientemente de alquilo C1-6. Más preferentemente R1 y R2 son metilo, es decir, el grupo bloqueante es -OC(O)NMe2. Los grupos bloqueantes carbamato tienen un efecto estabilizante en el enlace glicosídico y pueden prepararse en condiciones suaves.

Los sacáridos MenA modificados preferidos contienen n unidades de monosacáridos, en las que al menos el h% de las unidades de monosacáridos no tienen grupos -OH en las posiciones 3 y 4. El valor de h es 24 o más (por ejemplo 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ó100) y es preferentemente 50 o más. Los grupos -OH ausentes son preferentemente grupos bloqueantes como se ha definido anteriormente.

Otros sacáridos MenA modificados preferidos comprenden unidades de monosacáridos, en el que al menos s de las unidades de monosacáridos no tienen -OH en la posición 3 y no tienen -OH en la posición 4. El valor de s es de al menos 1 (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90). Los grupos -OH ausentes son preferentemente grupos bloqueantes como se ha definido anteriormente.

Los sacáridos MenA modificados adecuados para su uso con la invención tienen la fórmula:

en la que

10 n es un número entero de 1 a 100 (preferentemente un número entero de 15 a 25); T es de la fórmula (A) o (B):

cada grupo Z se selecciona independientemente entre OH o un grupo bloqueante como se define anteriormente; y cada grupo Q se selecciona independientemente entre OH o un grupo bloqueante como se define anteriormente;

15 Y se selecciona entre OH o un grupo bloqueante como se define anteriormente; E es H o un grupo protector de nitrógeno; y en el que más de aproximadamente el 7% (por ejemplo, 8%, 9%, 10% o más) de los grupos Q son grupos bloqueantes.

Cada uno de los grupos n+2 Z pueden idénticos o diferentes entre sí. Del mismo modo, cada uno de los grupos n+2

20 Q pueden ser idénticos o diferentes entre sí. Todos los grupos Z pueden ser OH. Como alternativa, al menos el 10%, 20, 30%, 40%, 50% o 60% de los grupos Z pueden ser OAc. Preferentemente, aproximadamente el 70% de los grupos Z son OAc, siendo el resto de los grupos Z grupos OH o grupos bloqueantes como se ha definido anteriormente. Al menos aproximadamente el 7% de los grupos Q son grupos bloqueante. Preferentemente, al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso el 100% de los grupos Q son grupos

25 bloqueantes.

Los polisacáridos capsulares meningocócicos se preparan típicamente mediante un procedimiento que comprende las etapas de precipitación de polisacáridos (por ejemplo, usando un detergente catiónico), fraccionamiento en etanol, extracción en fenol frío (para eliminar la proteína) y ultracentrifugación (para eliminar el LPS) [por ejemplo, ref. 122]. Sin embargo, un procedimiento más preferido [87] implica la precipitación del polisacárido seguida por 30 solubilización del polisacárido precipitado usando un alcohol inferior. La precipitación puede conseguirse usando un detergente catiónico tal como sales de tetrabutilamonio y de cetiltrimetilamonio (por ejemplo, las sales de bromuro) o bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio. Se prefiere particularmente el bromuro de cetiltrimetilamonio (’CTAB’) [123]. La solubilización del material precipitado puede conseguirse usando un alcohol inferior tal como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metilpropan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, 35 dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar los complejos CTBA-polisacárido. El etanol se añade preferentemente al polisacárido precipitado para proporcionar una concentración final (sobre la base del

contenido total de etanol y agua) de entre 50% y 95%.

Después de la resolubilización, el polisacárido puede tratarse adicionalmente para eliminar contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones en las que ni siquiera es aceptable la menor contaminación (por ejemplo, para la producción vacunas humanas). Esto implicará típicamente una o más etapas de filtración, por ejemplo filtración en profundidad, puede usarse filtración a través de carbón activado, filtración por tamaño y/o ultrafiltración. Una vez filtrado para eliminar los contaminantes, el polisacárido puede precipitarse para tratamiento y/o procesamiento adicional. Esto puede conseguirse convenientemente intercambiando cationes (por ejemplo, mediante la adición de sales de calcio o de sodio).

Como alternativa a la purificación, los sacáridos capsulares pueden obtenerse por síntesis total o parcial, por ejemplo, la síntesis de Hib se desvela en la referencia 124 y síntesis de MenA en la referencia 125.

Las composiciones de la invención pueden comprender sacáridos capsulares de al menos dos serogrupos de N.meningitidis. Los sacáridos se preparan preferentemente por separado (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y después se mezclan para dar una composición de la invención.

Sin embargo, cuando la composición comprende sacárido capsular del serogrupo A se prefiere que el sacárido del serogrupo A no se combine con el otro sacárido (o sacáridos) hasta poco antes de usar, para minimizar el potencial de la hidrólisis. Esto puede conseguirse convenientemente teniendo el componente del serogrupo A (típicamente junto con los excipientes adecuados) en forma liofilizada y el otro componente (o componentes) del serogrupo en forma líquida (también con los excipientes adecuados), usándose los componentes líquidos para reconstituir el componente de MenA liofilizado cuando vaya a usarse. Cuando se usa una sal de aluminio como adyuvante, se prefiere incluir el adyuvante en el vial que contiene la vacuna líquida y liofilizar el componente MenA sin adyuvante.

Una composición de la invención puede por tanto prepararse a partir de un kit que comprende: (a) un sacárido capsular de N.meningitidis del serogrupo A, en forma liofilizada y (b) los otros antígenos de la composición en forma líquida. La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición de la invención, que comprende mezclar un sacárido capsular liofilizado de N.meningitidis del serogrupo A con los otros antígenos, en la que dichos antígenos adicionales están en forma líquida.

Las composiciones de la invención pueden usarse en un kit que comprende: (a) un primer envase que contiene sacáridos capsulares de dos o más serogrupos C, W135 e Y de N.meningitidis, todos en forma liofilizada; y (b) un segundo envase que contiene en forma líquida (i) una composición que, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos en ese sujeto, en el que la respuesta de anticuerpos es bactericida contra dos o más (por ejemplo, 2 ó 3) de los linajes hipervirulentos A4, ET-5 y linaje 3 del serogrupo B de N.meningitidis, (ii) sacáridos capsulares de ninguno o uno de los serogrupos C, W135 e Y de N.meningitidis y opcionalmente (iii) otros antígenos (véase más adelante) que no incluyen sacáridos capsulares meningocócicos, en el que la reconstitución del contenido del envase (a) mediante el contenido del envase (b) proporciona una composición de la invención.

En cada dosis, la cantidad de un antígeno sacárido individual será, generalmente, entre 1-50 !g (medidos en masa de sacárido), prefiriéndose aproximadamente 2,5 !g, 5 !g o 10 !g de cada uno. Por tanto, con proporciones en peso para A:C:W135:Y de 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1, la cantidad representada por el número 1 es, preferentemente, de aproximadamente 2,5 !g, 5 !g o 10 !g. Por tanto, para una proporción de la composición A:C:W:Y de 1:1:1:1 y 10 !g por sacárido, se administran 40 !g de sacárido por dosis. Las composiciones preferidas tienen aproximadamente los siguientes !g de sacárido por dosis:

A

10 0 0 0 10 5 2,5

C

10 10 5 2,5 5 5 2,5

W135

10 10 5 2,5 5 5 2,5

Y

10 10 5 2,5 5 5 2,5

Las composiciones de la invención pueden comprender menos de 50 !g de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones comprenden ≤ 40 !g de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤ 30 !g de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤ 25 !g de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤ 20 !g de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤ 10 !g de sacárido meningocócico por dosis pero, idealmente, las composiciones comprenden al menos 10 !g de sacárido meningocócico por dosis.

Los conjugados MenC Menjugate™ y NeisVac™ utilizan un adyuvante hidróxido, mientras que Meningitec™ utiliza un fosfato. En las composiciones de la invención es posible adsorber algunos antígenos sobre un hidróxido de aluminio, pero tener otros antígenos asociados con un fosfato de aluminio. Para combinaciones tetravalentes de serogrupos, por ejemplo, se dispone de las siguientes permutaciones:

Serogrupo

Sal de aluminio (H = un hidróxido; P = un fosfato)

A

P H P H H H P P P H H H P P P H

C

P H H P H H P H H P P H P H P P

W135

P H H H P H H P H H P P P P H P

Y

P H H H H P H H H P H P H P P P

Para combinaciones trivalentes de serogrupos de N.meningitidis se dispone de las siguientes permutaciones:

Serogrupo

Sal de aluminio (H = un hidróxido; P = un fosfato)

C

P H H H P P P H

W135

P H H P H P H P

Y

P H P H H H P P

Haemophilus influenzae de tipo B

5 Cuando la composición incluye un antígeno H.influenzae de tipo B, típicamente será un antígeno sacárido capsular Hib. Los antígenos sacáridos de H. influenzae b son bien conocidos.

Ventajosamente, el sacárido Hib se conjuga covalentemente a una proteína transportadora para potenciar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de conjugados de polisacáridos en general, y del polisacárido capsular de Hib en particular, está bien documentada [por ejemplo referencias 126 a 134 etc.]. La

10 invención puede usar cualquier conjugado Hib adecuado. Más adelante se describen proteínas transportadoras adecuadas y los transportadores preferidos para sacáridos Hib son CRM197 (“HbOC”), toxoide tetánico (PRP-T’) y el complejo de membrana externa de N.meningitidis. (PRP-OMP’).

El resto sacárido del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo, poliribosilribitol fosfato (PRP) de longitud completa ), pero se prefiere hidrolizar polisacáridos para formar oligosacáridos (por ejemplo, PM de ~ 1 a ~ 5 kDa).

15 Un conjugado preferido comprende un oligosacárido Hib unido covalentemente a CRM197 mediante un engarce de ácido adípico [135, 136]. El toxoide del tétanos también es un transportador preferido.

Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib.

Cuando una composición incluye un antígeno sacárido Hib, se prefiere que tampoco incluya un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio, entonces el antígeno Hib 20 puede absorberse en el adyuvante [137] o puede no adsorberse [138].

Los antígenos Hib pueden estar liofilizados, por ejemplo, junto con antígenos meningocócicos.

Streptococcus pneumoniae

Cuando la composición incluye un antígeno de S. pneumoniae, típicamente será un antígeno sacárido capsular que preferentemente está conjugado con una proteína transportadora [por ejemplo, referencias 88-90]. Se prefiere incluir 25 sacáridos de más de un serotipo de S. pneumoniae. Por ejemplo, mezclas de polisacáridos de 23 serotipos diferentes se usan ampliamente, ya que son vacunas conjugadas con polisacáridos de entre 5 y 11 serotipos diferentes [139]. Por ejemplo, PrevNar™ [140] contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) con cada sacárido conjugado individualmente con CRM197 por aminación reductora, con 2 !g de cada sacárido por dosis de 0,5 ml (4 !g de serotipo 6B) y con conjugados adsorbidos sobre adyuvante de fosfato de aluminio. Las

30 composiciones de la invención incluyen, preferentemente, al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden adsorberse sobre fosfato de aluminio.

Como alternativa al uso de antígenos sacáridos de neumococos, la composición puede incluir uno o más antígenos polipeptídicos. Se dispone de secuencias genómicas para diversas cepas de neumococos [141,142] y pueden someterse a vacunología inversa [143-146] para identificar antígenos polipeptídicos adecuados [147,148]. Por

35 ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128 y Sp130 como se define en la referencia 149.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir los antígenos sacárido y polipeptídico de neumococo. Éstos pueden usarse en mezcla simple, o el antígeno sacárido neumocócico puede conjugarse con una proteína neumocócica. Las proteínas transportadoras adecuadas para tales realizaciones incluyen los antígenos indicados en el párrafo anterior [149].

5 Los antígenos neumocócicos pueden estar liofilizados, por ejemplo, junto con antígenos meningocócicos y/o Hib.

Conjugación covalente

Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención normalmente estarán conjugados con una proteína (o proteínas) transportadora. En general, la conjugación potencia la inmunogenicidad de los sacáridos ya que los convierte de antígenos independientes de linfocitos T en antígenos dependientes de linfocitos T, lo que permite la

10 iniciación de la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisada en las referencias 150 y 126-134].

Las proteínas transportadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como el toxoide de difteria o toxoide del tétanos. El toxoide de difteria mutante CRM197 [117,151,152] es particularmente preferido. Otras proteínas transportadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana externa de N.meningitidis [106], péptidos 15 sintéticos [107,108], proteínas de choque térmico [109,110], proteínas tosferínicas [111,112], citocinas [114], linfocinas [114], hormonas [114], factores de crecimiento [114], proteínas artificiales que comprenden epítopos múltiples de linfocitos T CD4+ humanos de diversos antígenos derivados de patógenos [153], la proteína D de H.influenzae [113,154], la proteína de superficie neumocócica PspA [155], proteínas de captación de hierro [116], la toxina A o B de C.difficile [115], etc. Los transportadores preferidos son el toxoide diftérico, el toxoide tetánico, la

20 proteína D de H.influenzae y CRM197.

Dentro de una composición de la invención, es posible el uso de más de una proteína transportadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión del transportador. Por tanto, pueden usarse diferentes proteínas transportadoras para diferentes serogrupos, por ejemplo los sacáridos del serogrupo A podrían conjugarse con CRM197 mientras que los sacáridos del serogrupo C podrían conjugarse con el toxoide tetánico. También es posible usar más de una

25 proteína transportadora para un antígeno sacárido concreto, por ejemplo los sacáridos de serogrupo A podrían estar en dos grupos, algunos conjugados con CRM197 y otros conjugados con el toxoide tetánico. Sin embargo, en general, se prefiere usar la misma proteína transportadora para todos los sacáridos.

Una sola proteína transportadora podría transportar más de un antígeno sacárido [156]. Por ejemplo, una sola proteína transportadora podría tener conjugados sacáridos de los serogrupos A y C. Para conseguir este objetivo,

30 los sacáridos pueden mezclarse antes de la reacción de conjugación. Sin embargo, en general, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo.

Se prefieren los conjugados con una proporción sacárido: proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir, exceso de proteína) y

5:1 (es decir, exceso de sacárido). Se prefieren las proporciones de 1:2 y 5:1, como son más preferidas las proporciones entre 1: 1,25 y 1: 2,5. Para MenA y MenC se prefiere un exceso de proteína transportadora.

35 Los conjugados pueden usarse junto con la proteína transportadora libre [157]. Cuando una proteína transportadora determinada está presente tanto en forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es, preferentemente, no superior al 5% de la cantidad total de la proteína transportadora en la composición en su conjunto y, más preferentemente, está presente a menos del 2% en peso.

Cuando sea necesario, puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier engarce 40 adecuado.

El sacárido típicamente se activará o funcionalizará antes en la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación, tales como CDAP (por ejemplo 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato [158.159, etc.]). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido pnitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; véase también la introducción a la referencia 132).

45 Pueden realizarse enlaces mediante un grupo engarzador usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 160 y 161. Un tipo de enlace implica la aminación reductora del polisacárido, acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo engarzador de ácido adípico y, después, acoplamiento de una proteína en el otro extremo del grupo engarzador de ácido adípico [130, 162, 163]. Otros engarces incluyen B-propionamido [164], nitrofenil-etilamina [165], haluros de haloacilo [166], enlaces

50 glicosídicos [167], ácido 6-aminocaproico [168], ADH [169], restos de C4 a C12 [170] etc. Como una alternativa al uso de un engarzador, puede usarse un enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido, seguido de aminación reductora con la proteína, como se describe, por ejemplo, en las referencias 171 y 172.

Se prefiere un procedimiento que implica la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, reemplazando

55 grupos = O terminales con -NH2) seguido por derivación con un diéster adípico (por ejemplo, N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico) y la reacción con la proteína transportadora. Otra reacción preferida utiliza activación con CDAP con una proteína D transportadora, por ejemplo, para MenA o MenC.

Después de la conjugación, los sacáridos conjugados y libres pueden separarse. Existen diversos procedimientos adecuados, incluidos cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [véanse también las referencias 173 y 174, etc.].

5 Cuando la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación de los oligosacáridos preceda a la conjugación.

Vesículas de la membrana externa

Se prefiere que las composiciones de la invención no incluyan mezclas complejas o no definidas de antígenos, que son características típicas de las VME. Sin embargo, una manera en que las VME pueden aplicarse la invención es 10 cuando estas van a administrarse en un régimen de dosis múltiple.

Cuando va a administrarse más de una dosis de VME, cada dosis puede complementarse (bien añadiendo la proteína purificada o bien por expresión de la proteína dentro de las bacterias de las que derivan las VME) mediante una de la primera proteína, segunda proteína o tercera proteína como se ha definido anteriormente. Preferentemente se complementan dosis diferentes con diferentes familias de NMB1870. En un programa de tres dosis de VME, por 15 ejemplo, cada dosis puede contener una primera proteína, segunda proteína y tercera proteína diferente de tal manera que después de recibir tres dosis de VME, se hayan recibido las tres familias. En un régimen de dos dosis de VME, puede usarse una familia por dosis de VME (omitiendo de esta manera una familia), o una o ambas dosis de VME pueden complementarse con más de una familia para proporcionar protección con las tres familias. En realizaciones preferidas, hay tres dosis de VME, y cada una de estas tres dosis de VME contiene tres poblaciones

20 de vesículas diferentes modificadas por ingeniería genética mostrando cada una tres subtipos, proporcionando así en total, nueve subtipos diferentes.

Esta estrategia puede usarse en general para mejorar preparaciones de microvesículas, 'VME nativas' [176], ampollas o vesículas de la membrana externa [por ejemplo referencias 177 a 182, etc.] de N. meningitidis del serogrupo B [175]. Estas pueden prepararse a partir de bacterias que se han manipulado por ingeniería genética 25 [183-186], por ejemplo, para aumentar la inmunogenicidad (por ejemplo hiperexpresar inmunógenos), para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacáridos capsulares, para regular por disminución la expresión de PorA, etc. Pueden prepararse a partir de cepas con hiperformación de ampollas [187-190]. Se pueden incluir vesículas de una Neisseria no patógena [191]. Las VME pueden prepararse sin el uso de detergentes [192,193]. Pueden expresar proteínas que no sean de Neisseria en su superficie [194]. Pueden no tener LPS. Pueden mezclarse con antígenos 30 recombinantes [177, 195]. Pueden usarse vesículas de bacterias con diferentes subtipos de proteínas de membrana externa de clase I, por ejemplo, seis subtipos diferentes [196,197] usando dos poblaciones de vesículas diferentes modificadas por ingeniería genética, mostrando cada una tres subtipos, o nueve subtipos diferentes usando tres poblaciones de vesículas diferentes modificadas por ingeniería genética, mostrando cada una tres subtipos, etc.. Los subtipos útiles incluyen: P1.7, 16; P1.5-1,2-2; P1.19, 15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2, 4; P1.22, 14; P41.7-1,1;

35 P1.18-1,3, 6.

También es posible, por supuesto, complementar preparaciones de vesículas con dos o tres familias diferentes.

Expresión de proteínas

En la técnica se conocen técnicas de expresión en bacterias. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unir la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3’) de una secuencia 40 codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que normalmente está proximal al extremo 5’ de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión para la ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado operador, que puede solaparse con un sitio de unión a la ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite regular 45 negativamente la transcripción (inducible), ya que una proteína represora génica puede unirse al operador y, de este modo, inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede producirse en ausencia de elementos reguladores negativos, tal como el operador. Además, la regulación positiva puede conseguirse con una secuencia de unión a una proteína activadora génica, que, si está presente, normalmente está proximal (5’) a la secuencia de unión de la ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora génica es la proteína activadora

50 de catabolitos (PAC), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Por tanto, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, de modo que potencia o reduce la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas del metabolismo del azúcar, tales como 55 galactosa, lactosa (lac) [Chang y col (1977) Nature 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel y col (1980) Nuc. Acids, Res. 8:4057; Yelverton y col., (1981) Nucl. Acid. Res. 9:731; Patente de Estados Unidos 4.738.921; documento EP-A0036776 y documento EP-A-0121775]. El sistema promotor de la ∀-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) “"The

cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (ed. I. Gresser)], los sistemas promotores del bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292:128] y T5 [Patente de Estados Unidos 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles. Otro promotor de interés es un promotor de arabinosa inducible (pBAD).

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago pueden unirse con secuencias operones de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, lo que crea un promotor híbrido sintético [Patente de Estados Unidos 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trplac híbrido compuesto por el promotor trp y las secuencias del operón lac, que está regulado por el represor lac [Amann y col (1983) Gene 25:167; de Boer y col (1983) Proc. Natl. Sci 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores naturales de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unir la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor natural de origen no bacteriano también puede acoplarse a una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema ARN polimerasa del bacteriófago T7/promotor es un ejemplo de un sistema promotor acoplado. [Studier y col., (1986) J. Mol Biol 189:113; Tabor y col., (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprender un promotor de bacteriófago y una región operador de E. coli (EPO-A-0 267 851).

Además de una secuencia promotora en funcionamiento, para la expresión de genes extraños en procariotas es también útil un sitio de unión eficaz al ribosoma. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 311 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio [Shine y col. (1975) Nature 254: 34]. Se piensa que la secuencia SD promueve la unión del ARNm al ribosoma mediante la formación de pares de bases entre la secuencia SD y el extremo 3’ y del ARNr 16S de E. coli [Steitz y col. (1979) “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”. In Biological Regulation and Development. Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión a ribosoma débil [Sambrook y col.,(1989) “Expression of cloned genes in Escherichia coli”. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una secuencia promotora puede estar unida directamente a la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N siempre será una metionina, codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede escindirse de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno o por incubación in vivo

o in vitro con una metionina N-terminal peptidasa bacteriana (documentoEP-A-0219237).

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas en 3’ del codón de terminación de la traducción y, por tanto, junto con el promotor que flanquea la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen con frecuencia secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tipo bucle en tallo que ayudan a terminar la transcripción. Son ejemplos que incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia señal (si se desea), la secuencia codificante de interés y la secuencia de la terminación de la transcripción, se introducen en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces del mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, de modo que le permite mantenerse en un huésped procariota para la expresión o para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido con un número alto o bajo de copias. Generalmente, un plásmido con un número alto de copias tendrá un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 y, normalmente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de número de copias alto contendrá, preferentemente, al menos aproximadamente 10 y, más preferentemente, al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector de número alto o bajo de copias dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña del huésped.

Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrase en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración normalmente contienen al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de varias cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (documento EP-A-0127328). Los vectores de integración también pueden estar compuestos del bacteriófagos o las secuencias del transposón.

Normalmente, las construcciones extracromosómicas y de expresión de integración pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los marcadores de selección pueden expresarse en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Los marcadores de selección también pueden incluir genes biosintéticos, tales como los que están en rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden introducirse en vectores de transformación. Los vectores de transformación normalmente comprenden un marcador de selección que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se han descrito anteriormente.

La vectores de expresión y de transformación, bien replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han

5 desarrollado para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake y col., (1981) Nature

292: 128; Amann y col., (1985) Gene 40: 183; Studier y col., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; documentos EP-A-0 036 776,EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:

10 655]; Streptococcus lividans [Powell y col., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [Patente de Estados Unidos 4.745.056].

Los procedimientos para inducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos son bien conocidos en la técnica y normalmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN también puede introducirse en las células bacterianas por electroporación. Los 15 procedimientos de transformación normalmente varían con la especie bacteriana que se va a transformar. Véase, por ejemplo, [Masson y col., (1989) FEMSMicrobiol. Lett. 60: 273; Palva y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang y col., (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen y col.. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci.

69: 2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) “An improved method for transformation

20 of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin y col., (1990) FEMS Microbial. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) “Transformation of Streptococcus

25 lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col., (1981) Infect. Immun.

32: 1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4 ª Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

General

La expresión “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste”, por ejemplo una composición que 30 comprende X puede consistir solo en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.

El término “aproximadamente” en relación a un valor numérico X significa, por ejemplo, X & 10%.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que es “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra sustancialmente puede omitirse de la definición de la invención.

35 La “identidad de secuencia” se determina, preferentemente, con el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de huecos afines con parámetros de penalización por apertura de hueco = 12 y penalización por extensión de hueco = 1.

Después del serogrupo, la clasificación de meningococos incluye el serotipo, el serosubtipo y, después, el inmunotipo y la nomenclatura convencional enumera serogrupo, serotipo, serosubtipo e inmunotipo, cada uno 40 separado por dos puntos, por ejemplo B:4:P1.15:L3,7,9. Dentro del serogrupo B, algunos linajes producen enfermedad a menudo (hiperinvasiva), algunos linajes producen más formas graves de la enfermedad que otros (hipervirulentos) y otros rara vez producen enfermedad. Se reconocen siete linajes hipervirulentos, en concreto los subgrupos I, III y IV-1, el complejo ET-5, el complejo ET-37, el grupo A4 y el linaje 3. Estos se han definido por electroforesis enzimática de multilocus (EEML), pero también se ha usado la tipificación de secuencias en multilocus

45 (TSML) para clasificar los meningococus [ref. 10]. Los cuatro grupos hipervirulentos principales son los complejos ST32, ST44, ST8 y ST11.

El término “alquilo” se refiere a grupos alquilo tanto en formas lineales como ramificadas. El grupo alquilo puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados de -O-, -NH-o -S-. El grupo alquilo también puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 enlaces dobles y/o triples. Sin embargo, el término "alquilo" normalmente se refiere a

50 grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroátomos o interrupciones de enlaces dobles o triples. Cuando se hace referencia a alquilo C1-12, significa que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12). De manera similar, cuando se hace referencia a alquilo C1-6 significa que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6).

55 El término “cicloalquilo” incluye grupos cicloalquilo, policicloalquilo y cicloalquenilo, así como combinaciones de estos con grupos alquilo, tales como grupos cicloalquilalquilo. El grupo cicloalquilo puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados de -O-, -NH-o -S-. Sin embargo, el término "cicloalquilo" normalmente se refiere a grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones de heteroátomo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen

grupos ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexilmetilo y adamantilo. Cuando se hace referencia a cicloalquilo C3-12, significa que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12).

El término “arilo” se refiere a un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo. Cuando se hace referencia a arilo C5-12, significa que el grupo arilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 5 y 12 (por ejemplo C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12).

La expresión “arilo C5-12 -alquilo C1-6” se refiere a grupos tales como bencilo, feniletilo y naftilmetilo.

Los grupos protectores de nitrógeno incluyen grupos sililo (tales como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acilo (tales como ftalimidas, trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z o Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2-(trimetilsilil)etoxi carbonilo, 2,2,2tricloroetoxicarbonilo (Troc)), derivados de sulfonilo (tales como ∀-trimetilsililetanesulfonil (SES)), derivados de sulfenilo, C1-12 alquilo, bencilo, bencidrilo, tritilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Un grupo protector de nitrógeno preferido es Fmoc.

En general, la invención no incluye las diversas secuencias de NMB1870 divulgadas especialmente en las referencias 3, 5, 6 y 7 aunque estas secuencias de NMB1870 pueden usarse de acuerdo con la invención, por ejemplo, para la construcción de secuencias quiméricas, etc.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 6 muestran modelos 3D de NMB1870. La Figura 7 muestra la transferencia de bucles de superficie para NMB1870.

La Figura 8 muestra el mapeo epitópico PepScan de 12 oligómeros de una proteína NMB1870 de la familia I. Los 3 paneles de arriba a abajo son los resultados utilizando antisuero generado contra las familias I, II y III de NMB1870. Los resultados son en unidades de tinción arbitrarias.

La Figura 9 muestra una transferencia de Western de fragmentos de NMB1870, teñidos usando suero policlonal.

La Figura 10 muestra análisis FACS usando antisuero generado contra diferentes fragmentos de NMB1870.

La Figura 11 muestra una transferencia de Western de cepas en la familia I, II o III de NMB1870, teñidas con anticuerpo monoclonal mAb502 (transferencia izquierda) o con un suero policlonal anti-NMB1870 (transferencia derecha).

La Figura 12 muestra una transferencia de Western de fragmentos de NMB1870, teñidos usando mAb502.

La Figura 13 muestra una transferencia puntual de fragmentos de NMB1870, teñidos usando mAb502. Los dominios A a C se ensayaron individualmente. También se ensayó un fragmento del dominio B-C, así como una mezcla de dominios B y C.

Las Figuras 14 y 15 muestran análisis FACS de bacterias. Las tres filas se tiñeron con diferentes anticuerpos: parte superior = mAb502; parte central = suero policlonal; parte inferior = anticuerpo monoclonal contra sacáridos capsulares (control positivo, SEAM3). Las tres columnas en la Figura 14 son todas las cepas de la familia I: MC58, M2934 y BZ83. Las tres columnas en la Figura 15 no expresan la genosupresión isogénica de la cepa MC58 de NMB1870: ∋NMB1870 de la familia I; la cepa 961-5945 de la familia II; la cepa M1239 de la familia III.

La Figura 16 muestra la hidrofilia y análisis de estructura secundaria de la secuencia NMB1870MC58 (SEC ID Nº: 1) de los restos 120 a 274.

Modos para realizar la invención

Mapeo epitópico

Para realizar el mapeo epitópico ’PepScan’ se usaron fragmentos de 12 y 10 oligómeros de NMB1870MC58. Los fragmentos se inmovilizaron en una membrana de celulosa y se hicieron reaccionar con antisueros generados contra una cepa de cada una de las tres familias de NMB1870: (I) MC58; (II) 2996; y (III) M1239. Los resultados del análisis de los 12 oligómeros se muestran en la Figura 8.

La región que incluye aproximadamente los primeros 110 aminoácidos de NMB1870 contiene epítopes lineales que son comunes a las tres familias. Los restos 120-183 incluyen epítopes específicos de familia. No se observaron péptidos positivos adicionalmente cadena abajo, lo que sugiere que estas secuencias están ocultas en la estructura tridimensional de la proteína y por tanto no podrían suscitar ningún anticuerpo en el suero, o que aquí los epítopes son discontinuos y no se observan en el análisis’PepScan’. Las siguientes alineaciones muestran las regiones de la secuencia NMB1870MC58 (SEC ID Nº: 1) que reaccionan con cada antisuero:

(1)

Anti-MC58 MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGL

(2)

Anti-2996 MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGL

(3)

Anti-M1239 MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGL

5 (1) Anti-MC58 QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQ

(2)

Anti-2996 QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQ

(3)

Anti-M1239 QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQ

(1)

Anti-MC58 IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI

(2)

Anti-2996 IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI 10 (3) Anti-M1239 IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI

(1)

Anti-MC58 GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI

(2)

Anti-2996 GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI

(3)

Anti-M1239 GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI

(1)

Anti-MC58 EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA 15 (2) Anti-2996 EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA

(3)

Anti-M1239 EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA

(1)

Anti-MC58 QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

(2)

Anti-2996 QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

(3)

Anti-M1239 QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

20 Los epítopos comunes de las tres familias son por tanto DKGLQSLTLDQSVR (SEC ID Nº: 21) y FDFIRQIEVDGQLI (SEC ID Nº: 22).

Basándose en los resultados del mapeo epitópico, la secuencia NMB1870 se escindió en tres dominios teóricos:

(A) Aminoácidos 1-119 (SEC ID Nº: 4)

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKL 25 KLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYK

(B) Aminoácidos 120-184 (SEC ID Nº: 5)

QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGG

(C) Aminoácidos 185-274 (SEC ID Nº: 6)

KLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGG KAQEVAG 30 SAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

Estos dominios se expresaron individualmente como proteínas que comprendían los dominios A, B o C (SEC ID Nos: 4 a 6) y en conjunto como proteínas que comprendían A-B (SEC ID Nº: 23) o B-C (SEC ID Nº: 24).

Durante la construcción de estas proteínas se usaron los siguientes cebadores oligonucleotídicos, y se introdujeron los sitios de restricción NdeI y XhoI:

Proteína

Cebador SEC ID Nos: (directo e inverso)

(A)

25 y 26

(B)

27 y 28

(C)

29 y 30

(A)(B)

31 y 32

(B)(C)

33 y 34

35 En la Figura 9 se muestra una transferencia de Western de los dominios A (truncados para comenzar con VAA…), B y C, usando anti-NMB1870MC58 policlonal como marcador. También se incluyen las fusiones AB y BC. El carril final de la transferencia contiene la proteína de longitud completa.

Los antisueros contra cada uno de los dominios A, B y C fueron capaces de unirse a células completas en análisis FACS (Figura 10). El cambio de fluorescencia fue más fuerte con los dominios A y C, lo que sugería que pueden ser más inmunoacesibles. Ningún antisuero pudo reconocer una cepa ∋NMB1870 genosuprimida.

Los sueros suscitados en ratones contra las proteínas (y contra las proteínas de control) usando, como adyuvante, CFA o un hidróxido de aluminio (HA), y los resultados de los ABS contra tres cepas meningocócicas diferentes fueron los siguientes:

Proteína

MC58FAMILIA I B:15:P1.7,16b (ET5) 961-5945FAMILIA II B:2b: P1.21,16 (A4) M1239 FAMILIA III B:14:P123,14 (lin.3)

CFA

HA CFA HA CFA HA

A

<4 16 <4 <4 <4 <4

B

<4 <4 <4 <4 <4 256

C

<4 512 <4 <4 <4 <4

AB

<4 <4 256 256 <4 <4

BC

32768 8192 <4 <4 <4 <4

SEC ID Nº 1

524288 16384 2048 <8 <4 <4

SEC ID Nº 2

<4 <4 16384 2048 <4 128

SEC ID Nº 3

<4 <4 2048 1024 16384 4096

5 Por tanto, dentro de la SEC ID Nº: 1 (MC58), los epítopes bactericidas más importantes requieren la presencia de los dominios B y C (dominio BC). Esto sugiere que la proteína puede incluir epítopes discontinuos constituidos por secuencias de estos dos dominios [ver ref. 237].

Además, los anticuerpos monoclonales Jar1, Jar3 y Jar4, que son capaces de proteger pasivamente a ratas contra infección meningocócica, reconocen el dominio BC pero no reconocen el dominio B o el dominio C en solitario . De 10 manera similar, Jar5 reconoce el dominio AB, pero no el dominio A o el dominio B en solitario.

En la referencia 238 pueden encontrarse detalles adicionales de este trabajo.

Anticuerpo monoclonal 502

Para seleccionar anticuerpos monoclonales anti-NMB1870 con actividad bactericida, ratones CD1 se inmunizaron con la familia I NMB1870MC58. Los sueros policlonales de los ratones individuales se evaluaron para detectar la unión 15 de anticuerpos por ELISA sobre la proteína purificada y en células MC58 completas, y para la actividad bactericida mediada por complemento contra MC58. En base a estos resultados se seleccionó el bazo de un ratón alto respondedor para la fusión con células de mieloma. Se aislaron diversas líneas celulares de hibridoma productoras de anticuerpos y se seleccionaron por ELISA positivo contra la proteína purificada o contra células bacterianas completas MC58. Para estudios posteriores se seleccionó el MAb502, un anticuerpo monoclonal del isotipo IgG2a

20 bactericida contra la cepa MC58. El anticuerpo reconoció la proteína purificada por ELISA y fue positivo en análisis FACS en la cepa MC58.

Un análisis de transferencia de Western contra NMB1870 de cada una de las tres variantes confirmó que el mAb502 reconocía un epítope presente sólo en las secuencias de la familia I. En cambio, el suero policlonal reconoció las tres variantes. Se usó el anticuerpo mAb502 monoclonal en análisis FACS contra diversas cepas de la familia l. En 25 cada caso el anticuerpo reconoció los antígenos de superficie celular (Figura 14, fila superior). El cambio de fluorescencia no fue tan fuerte como cuando se usaba un anti-NMB1870 policlonal (fila central) o cuando se usaba un SEAM3 monoclonal anti-cápsula (fila inferior), pero la unión fue específica. En cambio, el mAb502 no reconoció una cepa genosuprimida ΔNMB1870 (Figura 15, columna izquierda) y no reconoció las cepas de la familia II o familia III (columnas central y derecha). El control positivo anti-cápsula reconoció todas las cepas no reconocidas (Figura

30 15, fila inferior).

Comparación de inmunogenicidad de dominios

Los dominios A, B y C de la secuencia NMB1870-MC58ΔG (familia I) se prepararon individualmente y como fusiones de AB y BC, todos con marcadores de His en el extremo C. Estos se usaron para inmunizar ratones y los sueros se ensayaron para determinar la actividad bactericida contra una cepa de cada familia NMB1870. Por comparación, también se ensayaron los sueros suscitados en respuesta a las secuencias ΔG-NMB1870 de las tres familias. Como adyuvantes para las proteínas se usó hidróxido de aluminio o FCA. Los resultados fueron estos:

MC58 B:15:P1.7,16b ET5

961-5945 B:2b:P1.21,16 A4 M1239 B:14:P1.23,14 lin.3

Adyuvante

A

FCA <4 <4 <4

A

HA 16 <4 <4

B

FCA <4 <4 <4

B

HA <4 <4 256

C

FCA <4 <4 <4

C

HA 512 <4 <4

AB

FCA <4 256 <4

AB

HA <4 256 <4

BC

FCA 32768 <4 <4

BC

HA 8192 <4 <4

MC58

FCA 524288 2048 <4

MC58

HA 16384 <8 <4

2996

FCA <4 16384 <4

2996

HA <4 2048 128

M1239

FCA <4 2048 16384

M1239

HA <4 1024 4096

Por tanto, los dominios individuales no son inmunógenos particularmente eficaces, el dominio AB tampoco es particularmente eficaz, si bien, el dominio BC mostró buena actividad.

Modelo 3D del dominio BC

10 Se obtuvo una predicción de la estructura super-secundaría del dominio BC sometiendo la secuencia MC58 al servidor HMMSTR/Rosetta [240]. El resultado se muestra en la Figura 1.

La estructura 3D se sometió a exploración VAST [241] para encontrar similitud con estructuras de proteínas resueltas y para refinar los bucles. El resultado VAST (Figura 2) fue:

NMB1870 RHAVISGSVLYNQa--EKGSYS1g----iFGGKa QEVA 15 1K32_A 311 IAFVSRGQAFIQDvsgTYVI,KVpeplrirYVRRggdtkvAFIH 353

Usando el resultado VAST, el fragmento 229-259 (parte superior derecha de la Figura 2) se modeló adicionalmente y se modificó introduciendo giros en la estructura a lo largo de la línea de puntos de la Figura 2. El modelo resultante se refinó por minimización de energía, para proporcionar el modelo final de la Figura 3.

En la Figura 6 se muestra este modelo poniendo de relieve los bucles superficiales.

20 Mapeo epitópico de superficie

Un alineamiento de secuencia múltiple de los dominios de BC de las secuencias de NMB1870 a partir de cepas reconocidas por mAb502 en las transferencias de Western reveló diversa información de secuencia. Todas las cepas que estaban unidas por el anticuerpo incluían el resto Arg223, pero este resto era His en las cepas que no se reconocían en las transferencias. Aún así, no todas las secuencias con Arg223 produjeron sueros bactericidas y por eso el epítope bactericida total debe ser más amplio que este resto individual.

El alineamiento identificó otros restos que podrían estar implicados en la formación de un epítope bactericida específico: Phe128 (F), Ile133 (I), Asn197 (N), Gly2217 (G), Lys249 (K), Lys260 (K) y Val262 (V). Todos estos aminoácidos (fondo gris debajo) se conservan perfectamente entre las cepas ET-5 (tales como MC58), que son positivas a BCA, pero difieren en las cepas que son negativas a BCA:

Estudios similares basados en el alineamiento de secuencias de cepas que reaccionan con un suero policlonal bactericida identificaron los siguientes restos: Phe128, Ile133, Asn197 y Gly221. Los restos Lys249, Lys260 y

10 Va1262, identificados por el anticuerpo monoclonal, se descartaron en esta fase y estos tres restos se conservaron en la secuencia de NMB1870 de una cepa negativa a BCA (M2197).

A partir del modelo 3D de NMB1870, se observa que Phe134 e Ile139 se encuentran dentro de una supuesta hélice alfa, y por lo tanto no están bien accesibles para los anticuerpos. Por otro lado, tanto Asn197 como Gly221 están incluidos dentro de bucles de superficie y bien expuestos. Tanto Gly221 como Asn197 están espacialmente

15 próximos a Arg223, y por tanto pueden formar parte del mismo epítope. Considerando Gly221, cepas negativas a BCA a menudo tienen este pequeño y neutro aminoácido sustituido con un resto Glu o Lys, ambos voluminosos y con carga. Esta sustitución podría perjudicar al reconocimiento y unión correctos de anticuerpos a este epítope.

Este análisis por tanto revela cinco aminoácidos clave: Phe128, Ile133, Asn197, Gly221 y Arg223. Cuando se realiza un mapeo de estos restos con el modelo 3D (Figura 4), tres de ellos se agrupan en la superficie de la proteína

20 (Figura 5). El alineamiento con una predicción estructural secundaria (Figura 16) también muestra que Ile133, Asn197, Gly221 y Arg223 se localizan en regiones hidrófilas (es decir, en bucles de superficie).

Otros restos importantes podrían ser el dipéptido AD en posición 215-216, que está sustituido en la mayoría de las cepas negativas a BCA por AY y por S D en algunos respondedores débiles.

Los aminoácidos 197, 221 y 223 se mutaron de la siguiente manera:

Aminoácido (s) original

Asn-197 Gly-221 Arg-223 Asn-197 & Gly-221

Sustitución (s)

His Lys His His y Lys

La mutagénesis utilizó el sistema SDM de GeneTailor™ de Invitrogen. Se diseñaron cebadores internos que contenían cambios de codón de acuerdo con las especificaciones del manual de instrucciones y fueron los siguientes:

Cebadores

Secuencias (SEC ID Nº:) Mutación

741(1)-N197H dir 741(1)-N197H inv

GATTTCGCCGCCAAGCAGGGAcACGGCAAAATCGAA (SEC ID Nº: 66) TCCCTGCTTGGCGGCGAAATCTATGGTGTAGGT (SEC ID Nº: 67) AAC → cAC N → H

741(1)-G221K dir 741(1)-G221K inv

GCCGCCGATATCAAGCCGGATaaAAAACGCCATGCC(SEQ ID Nº: 68) ATCCGGCTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTCGAC(SEQ ID Nº: 69) GGA → aaA G → K

741(1)-R223H dir 741(1)-R223H inv

GATATCAAGCCGGATGGAAAACaCCATGCCGTCATCAGC (SEQ ID Nº: 70) TTTCCATCCGGCTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTC (SEQ ID Nº: 71) CGC → CaC R → H

Para generar cada mutante, se usaron, como molde, 100 ng de ADN del plásmido pET-ΔG741(1)-His en una reacción de metilación, después, como sustrato, se emplearon 12,5 ng de plásmido metilado en una reacción de mutagénesis, usando los siguientes pares de cebadores:

741(1)-N197H dir / 741(1)-N197H inv

741(1)-G221K dir / 741(1)-G221K inv

741(1)-R223H dir / 741(1)-R223H inv

Se realizó PCR de acuerdo con el manual de instrucciones del sistema de mutagénesis dirigida a sitio de GeneTailor™. Después de la reacción, se analizaron 10 !l del producto en un gel de agarosa al 1%, después 2 !l de mezcla de reacción de mutagénesis se transformaron en la cepa de E. coli DH5a™-T1R de acuerdo con las especificaciones del manual. Se analizaron colonias positivas por aislamiento de plásmidos (Kil QIAprep Spin Miniprep, QIAGEN™) y secuenciación. Para generar el doble mutante ΔG741(1)-His-N197H-G221K, se usó el ADN del mutante positivo ΔG741 (1)-His-G221K como sustrato para el siguiente con el par de cebadores correspondiente 741(1)-N197H dir/741(1)-N197H rev.

Para la expresión de la proteína recombinante como una fusión marcador-His-extremo C, se usaron 1,5 !l de cada construcción para transformar la cepa BL21-DE3 de E. coli. Se inocularon colonias recombinantes individuales en 4 ml de LB + Amp (100 !g/ml), se incubó a 37 °C durante una noche, después se diluyó a 1:30 en 20 ml de LB + Amp (100 !g/ml) en matraces de 125 ml, para proporcionar una DO600nm entre 0,1 y 0,2. Los matraces se incubaron a 37 °C en un agitador de baño de agua giratorio hasta crecimiento exponencial indicado a una DO600nm adecuado para la inducción de la expresión (DO 0,4-0,8). Se indujo la expresión de proteínas añadiendo IPTG 1,0 mM. Después de 3 horas de incubación a 37 °C se midió la DO600nm y se examinó la expresión. Se centrifugaron 1,0 ml de cada muestra en una microcentrifugadora, el sedimento se resuspendió en PBS y se analizó por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. Se expresaron todos los mutantes y no mutantes y se purificaron como formas solubles a 37 °C.

Sustitución de bucle

Basándose en el modelo 3D y en el trabajo de mapeo epitópico, los bucles de superficie de la familia II y III de NMB1870 se transfirieron a un armazón de la familia I.

Para el Bucle 1, la secuencia de aminoácidos está 100% conservada entre todas las cepas de la familia II y familia

III. En las tres familias, el Bucle 1 está flanqueado por dos hélices alfa (no conservadas en la secuencia) que posiblemente contribuyen a la exposición/plegamiento correcto del bucle. El resto Gly140 no se encuentra en la secuencia M6190 de la familia I, y aunque los anticuerpos Jar3 y Jar5 monoclonales se unen a las secuencias de la familia I no se unen a M6190, confirmando posteriormente la importancia epitópica de este bucle. La secuencia de la familia II se seleccionó para la inserción en el armazón de la familia I.

El Bucle 2 corresponde a un epítope bactericida. La única diferencia entre las familias II y III en esta posición es una sustitución Asp/Gly. Análisis de respuestas bactericidas entre las cepas de la familia II sugieren una función crítica para el resto Asp, de manera que se seleccionó la secuencia de la familia II.

El Bucle 3 es muy variable dentro de las familias II y III, pero se conserva en la familia I. En familia II, la mayor parte de las cepas tiene la secuencia PNG, pero en familia III la mayoría tiene la secuencia AGG. Aunque este bucle parece ser dispensable para la protección (las cepas con PNG son capaces de proteger contra las cepas con AGG de la familia III), para incluir ambas posibilidades la secuencia AG de la familia I se sustituyó con PN.

El resto Asn197 en el bucle 4 se identificó previamente como un resto importante para diferenciar entre cepas positivas a BCA y negativas a BCA de la familia I, y siempre se conservó en las cepas ET-5. El resto está sustituido por His en todas las cepas de la familia II y en un subgrupo de cepas de la familia III. Además, His también está presente en algunas cepas de la familia I. His se usó por tanto en este bucle, para incluir las familias II y III, además de cualquier secuencia de la familia I no incluida en la secuencia MC58.

El bucle 5, bucle 6 y bucle 7 son iguales en las familias II y III, pero diferentes de los de la familia I. Para estos tres bucles se usaron las secuencias de la familia II/III. El segundo resto en el bucle es Gly en lugar de Val porque las 5 cepas de la familia II que son susceptibles a suero suscitado contra la proteína de la cepa 2996 tienen este resto en esa posición.

Las sustituciones para cambiar la SEC ID Nº: 1 en la SEC ID Nº: 61, se muestran en la Figura 7. Los bucles 1, 2 y 4 recibieron secuencias de la familia II; el bucle 3 recibió la secuencia de la familia III; y los bucles 5, 6 y 7 recibieron una secuencia común a ambas familias II y III. Con 28 sustituciones de 274 (SEC ID Nº: 1) y 273 (SEC ID Nº: 61)

10 aminoácidos en total, la identidad global después del cambio de bucle superficial continuó siendo > 90%.

Los bucles se sustituyeron en serie. Se constituyeron siete proteínas en esta serie, sustituyendo cada bucle de la secuencia ΔGNMB1870MC58 en orden. Las siete proteínas sustituidas se denominaron LP1, LP2,..., LP7. El mutante LP7 es la SEC ID Nº: 61.

Para este trabajo se usó el sistema SDM de GeneTailor( (véase anteriormente), con los siguientes cebadores:

Cebadores

Secuencias SEC ID Nº

741 (1)-LP1 dir 741 (1)-LP1 inv

GCCTTTCAGACCGAGCAAATAaAcaAccCGGAcaAaatCGacAgcATGGTTGCGAAACGC TATTTGCTCGGTCTGAAAGGCGGTTAAGGCGGA 72 73

741 (1)-LP2 dir 741 (1)-LP2 inv

GGCGAACATACATCTTTTGACcAGCTTCCCGAcGGCaaaAGGGCGACATATCGC GTCAAAAGATGTATGTTCGCCCGCTATGTCGCC 74 75

741 (1)-LP3 dir 741 (1)-LP3 inv

ACGGCGTTCGGTTCAGACGATcCgaaCGGAAAACTGACCTAC ATCGTCTGAACCGAACGCCGTCCCGCGATATGTCGC 76 77

741 (1)-LP4 dir

GATTTCGCCGCCAAGCAGGGAcACGGCAAAATCGAA 78

741 (1)-LP4 inv

TCCCTGCTTGGCGGCGAAATCTATGGTGTAGGT 79

741 (1)-LP5 dir

CTGGCCGCCGCCGATATCAAGgCcGATGaAAAAaGCCATGCCGTCATC 80

741 (1)-LP5 inv

CTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTCGACATTGAG 81

(continuación)

Cebadores

Secuencias SEC ID Nº

741 (1)-LP6 dir

ATCAGCGGTTCCGTCCTTTACggCagcGaaGAGAAAGGCAGT 82

741 (1)-LP6 inv

GTAAAGGACGGAACCGCTGATGACGGCATGGCG 14

741 (1)-LP7 dir

GCCGGCAGCGCGGAAGTGAAAAtCGgcgAaaaggTACaCgAaATCGGCCTTGCCGCC 15

741 (1)-LP7 inv

TTTCACTTCCGCGCTGCCGGCAACTTCCTGGGCTTT 16

Todas las proteínas se expresaron así como la proteína de tipo silvestre y pudieron purificarse como productos solubles después del crecimiento a 37 °C. Se usaron las proteínas LP1, LP2,..., LP7 para inmunizar a los ratones, y los sueros resultantes se sometieron a ensayo contra diversas cepas diferentes de meningococo del serogrupo B, incluyendo al menos tres de cada familia de NMB1870. La proteína de partida (LP0) también se ensayó. Como adyuvante para las proteínas se usó hidróxido de aluminio (HA) o FCA (F). En la siguiente tabla, cada fila (excepto la fila inferior) muestra los ABS para un solo suero, ensayado contra nueve cepas ejemplares. La fila inferior muestra la actividad de un suero obtenido usando el antígeno de tipo silvestre a partir del homólogo de NMB1870 (es decir, ensayando con suero anti-NMB1870MC58 contra MC58, etc.):

10 Avanzando desde LP0 (sin sustituciones; NMB1870; familia I) a LP7 a través de LP1, LP2, etc., los sueros suscitados contra la proteína se vuelven más activos contra cepas cuya NMB1870 está en la familia II o familia III. Dado que las secuencias de la familia I se sustituyen con secuencias de la familia II/III entonces, a diferencia de expectativas anteriores, las respuestas bactericidas contra las cepas de la familia I muestran una tendencia ascendente.

15 Por tanto la SEC ID Nº 61 contiene epítopes de superficie de las familias II y III, para sustituir epítopes de la familia I. El polipéptido quimérico puede usarse para suscitar anticuerpos contra NMB1870 de las familias II y III y puede combinarse con una secuencia normal de la familia I para proporcionar antigenicidad multifamiliar. La combinación puede ser como una mezcla de dos polipéptidos individuales, o puede ser en forma de un híbrido [7] por ejemplo NH2-X1-SEC: 61-X2-SEC: 1-X3-COOH, NH2-X1-SEC: 1-X2-SEC: 61-X3-COOH, etc.

Nuevas secuencias de NMB1870

Se dispone de amplia información de secuencias para NMB1870 [por ejemplo, refs. 3, 5, 6 y 7]. Se han descubierto nuevas secuencias de NMB1870 adicionales.

5 La secuencia para la cepa 4243 se proporciona como SEC ID Nº: 62, comenzando en la cisteína N-terminal de la proteína madura. El péptido líder escindido es el mismo que el de una secuencia normal de la familia I.

En la cepa M.01.0240320 ('gb320'; SEC ID Nº: 63) y en la cepa S10026 (SEC ID Nº: 64) se ha observado una cuarta familia de NMB1870 . La secuencia de m3813 (SEC ID Nº: 21 de la ref. 7; SEC ID Nº: 65 en el presente documento) también puede clasificarse en la familia IV.

10 Breve descripción del listado de secuencias

SEC ID Nº:

Descripción

1

NMB 1870 de la cepa MC58 – familia I

2

NMB 1870 de las cepas 961-5945 y 2996 -familia II

3

NMB 1870 de la cepa M1239 – familia III

SEC ID Nº:

Descripción

4-6

Dominios A a C de la SEC ID Nº: 1

7-9

Dominios A a C de la SEC ID Nº: 2

10-12

Dominios A a C de la SEC ID Nº: 3

13

Dominio A maduro de SEC ID Nº: 4

14-16

Cebadores de SDM

17-20

Engarces y secuencias de expresión

21-22

Epítopes comunes

23

AB

24

BC

25-42

Cebadores

43

BM1239CMC58 M1239MC58

44

BC2996BCM1239 2996M1239

45

Engarce

46-51

Cebadores

52

BCMC58-BCM1239-BC2996 MC58 M1239 2996

53

NMB1870MC58-NMB1870M1239-NMB18702996

54

Secuencia para la expresión

55-60

Cebadores

61

Sustitución de bucle superficial

62-65

Secuencias de NMB1870

66-82

Cebadores de SDM

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Listado de secuencias

SEC ID Nº: 1 -cepa MC58 -familia I

45 SEC ID Nº: 2 -cepas 961-5945 y 2996 -familia II

SEC ID Nº: 3 -cepa M1239 -familia III

SEC ID Nº: 4 -dominio A de la SEC ID Nº: 1

SEC ID Nº: 5 -dominio B de la SEC ID Nº: 1

QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGG

SEC ID Nº: 6 -dominio C de la SEC ID Nº: 1

KLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEV KTVNGIRHIGLAAKQ

SEC ID Nº: 7 -dominio A de la SEC ID Nº: 2

SEC ID Nº: 8 -dominio B de la SEC ID Nº: 2

10 QDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGG

SEC ID Nº: 9 -dominio C de la SEC ID Nº: 2

KLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLA-LFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

SEC ID Nº: 10 -dominio A de la SEC ID Nº: 3

SEC ID Nº: 11 -dominio B de la SEC ID Nº: 3

QNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNG

SEC ID Nº: 12 -dominio C de la SEC ID Nº: 3

RLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLA20 LFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

SEC ID Nº: 13 -dominio A maduro de la SEC ID Nº: 4

SEC ID Nº: 14 -Cebador SDM

GTAAAGGACGGAACCGCTGATGACGGCATGGCG

25 SEC ID Nº: 15 -cebador SDM GCCGGCAGCGCGGAAGTGAAAATCGGCGAAAAGGTACACGAAATCGGCCTTGCCGCC

SEC ID Nº: 16 -Cebador SDM

TTTCACTTCCGCGCTGCCGGCAACTTCCTGGGCTTT

SEC ID Nº: 17

30 GSGGGG

SEC ID Nº: 18

GGGG

SEC ID Nº: 19 -Secuencia para la expresión

GSGPDSDRLQQRR

35 SEC ID Nº: 20 -Secuencia para la expresión GPDSDRLQQRR

SEC ID Nº: 21 -epítope común

DKGLQSLTLDQSVR

SEC ID Nº: 22 -epítope común

40 FDFIRQIEVDGQLI

SEC ID Nº: 23 -AB SEC ID Nº: 24 -BC

SEC ID Nº: 25 -cebador oligonucleotídico

5 CGCGGATCCCATATGGTCGCCGCCGACATCG

SEC ID Nº: 26 -cebador oligonucleotídico

CCCGCTCGAGTTGTTTGTATACTTGGAACTCTCCAC

SEC ID Nº: 27 -cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCCATATGCAAAGCCATTCCGCCTTAA

10 SEC ID Nº: 28 -cebador oligonucleotídico CCCGCTCGAGTCCGCCGGCATCGTCTG

SEC ID Nº: 29 -cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCCATATGGGAAAACTGACCTACACCA

SEC ID Nº: 30 -cebador oligonucleotídico

15 CCCGCTCGAGTTGCTTGGCGGCAAGGC

SEC ID Nº: 31 -cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCCATATGGTCGCCGCCGACATCG

SEC ID Nº: 32 -cebador oligonucleotídico

CCCGCTCGAGTCCGCCGGCATCGTCTG

20 SEC ID Nº: 33 -cebador oligonucleotídico CGCGGATCCCATATGCAAAGCCATTCCGCCTTAA

SEC ID Nº: 34 -cebador oligonucleotídico

CCCGCTCGAGTTGCTTGGCGGCAAGGC

SEC ID Nº: 35 -cebador oligonucleotídico

25 CGCGGATCCCATATGCAGAACCACTCCGCCGT

SEC ID Nº: 36 -cebador oligonucleotídico

GCCCAAGCTTGCCATTCGGGTCGTCGG

SEC ID Nº: 37-cebador oligonucleotídico

GCCCAAGCTTAAACTGACCTACACCATAGA

30 SEC ID Nº: 38 -cebador oligonucleotídico CCCGCTCGAGTTGCTTGGCGGCAAGGC

SEC ID Nº: 39 -cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCCATATGCAGGACCACTCCGCCG

SEC ID Nº: 40 -cebador oligonucleotídico

35 CGCGGATCCCTGTTTGCCGGCGATGCC

SEC ID Nº: 41-cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCGGGGGGGGGGGGCAGAACCACTCCGCCGT

SEC ID Nº: 42 -cebador oligonucleotídico

CCCAAGCTTCTGTTTGCCGGCGATGCC 40 SEC ID Nº: 43 -BM1239CMC58

SEC ID Nº: 44 -BC2996BCM1239

SEC ID Nº: 45

GKGGGG

5 SEC ID Nº: 46 -Cebador CGCGGATCCCATATGCAAAGCCATTCCGCCTTAA

SEC ID Nº: 47 -Cebador

CGCGGATCCTTGCTTGGCGGCAAGGC

SEC ID Nº: 48 -Cebador

10 CGCGGATCCGGGGGGGGGGGGCAGAACCACTCCGCCGT

SEC ID Nº: 49 -Cebador

CCCAAGCTTCTGTTTGCCGGCGATGCC

SEC ID Nº: 50 -Cebador

CGCGGATCCGGGGGGGGGGGGCAGGACCACTCCGCCG

15 SEC ID Nº: 51 -Cebador CCCGCTCGAGCTGTTTGCCGGCGATGCC

SEC ID Nº: 52

SEC ID Nº: 53

SEC ID Nº: 54 -Secuencia para expresión

GKGPDSDRLQQRR

SEC ID Nº: 55 -Cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCCATATGGTCGCCGCCGACATCG

25 SEC ID Nº: 56 -Cebador oligonucleotídico CGCGGATCCTTGCTTGGCGGCAAGGC

SEC ID Nº: 57 -Cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCGGCCCTGATTCTGACCG

SEC ID Nº: 58 -Cebador oligonucleotídico

30 CCCAAGCTTCTGTTTGCCGGCGATGCC

SEC ID Nº: 59 -Cebador oligonucleotídico

CGCGGATCCGGCCCTGATTCTGACCG

SEC ID Nº: 60 -Cebador oligonucleotídico

CCCGCTCGAGCTGTTTGCCGGCGATGCC

SEC ID Nº: 61 -Sustitución de bucle en superficie

SEC ID Nº: 62 -cepa 4243

SEC ID Nº: 63 -cepa gb320

10 SEC ID Nº: 64-cepa S10026

SEC ID Nº: 65 -cepa m3813

SEC ID Nº: 66 -Cebador SDM

15 GATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAA

SEC ID Nº: 67 -Cebador SDM

TCCCTGCTTGGCGGCGAAATCTATGGTGTAGGT

SEC ID Nº: 68 -Cebador SDM

GCCGCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCC

20 SEC ID Nº: 69 -Cebador SDM ATCCGGCTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTCGAC

SEC ID Nº: 70 -Cebador SDM

GATATCAAGCCGGATGGAAAACACCATGCCGTCATCAGC

SEC ID Nº: 71 -Cebador SDM

25 TTTTCCATCCGGCTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTC

SEC ID Nº: 72 -Cebador SDM

GCCTTTCAGACCGAGCAAATAAACAACCCGGACAAAATCGACAGCATGGTTGCGAAACGC

SEC ID Nº: 73 -Cebador SDM

TATTTGCTCGGTCTGAAAGGCGGTTAAGGCGGA

30 SEC ID Nº: 74 -Cebador SDM GGCGAACATACATCTTTTGACCAGCTTCCCGACGGCAAAAGGGCGACATATCGC

SEC ID Nº: 75 -Cebador SDM

GTCAAAAGATGTATGTTCGCCCGCTATGTCGCC

SEC ID Nº: 76 -Cebador SDM

ACGGCGTTCGGTTCAGACGATCCGAACGGAAAACTGACCTAC

SEC ID Nº: 77-Cebador SDM

ATCGTCTGAACCGAACGCCGTCCCGCGATATGTCGC

5 SEC ID Nº: 78 -Cebador SDM GATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAA

SEC ID Nº: 79 -Cebador SDM

TCCCTGCTTGGCGGCGAAATCTATGGTGTAGGT

SEC ID Nº: 80 -Cebador SDM

10 CTGGCCGCCGCCGATATCAAGGCCGATGAAAAAAGCCATGCCGTCATC

SEC ID Nº: 81 -Cebador SDM

CTTGATATCGGCGGCGGCCAGGTCGACATTGAG

SEC ID Nº: 82 -Cebador SDM

ATCAGCGGTTCCGTCCTTTACGGCAGCGAAGAGAAAGGCAGT

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, que comprende las etapas de: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB1870 con una segunda secuencia de aminoácidos NMB1870, en la que la primera y segunda secuencias son diferentes y provienen de familias diferentes de 5 NMB1870, para proporcionar un par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una parte de la primera secuencia de aminoácidos, comenzando en el aminoácido a1 de dicha primera secuencia de aminoácidos y acabando en el aminoácido b1 de dicha primera secuencia de aminoácidos, en la que la parte es una secuencia de superficie en bucle; (c) seleccionar una parte de la segunda secuencia de aminoácidos, comenzando en el aminoácido a2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos y acabando en el aminoácido b2 de dicha segunda secuencia de aminoácidos,

   10 en la que la parte es una secuencia de superficie en bucle y en la que los restos a1 y a2 así como b1 y b2 están alineados en el par de secuencias alineadas; y (d) reemplazar dicha parte de la primera secuencia de aminoácidos por dicha parte de la segunda secuencia de aminoácidos, proporcionando así la secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, en la que la secuencias de aminoácidos comprenden una secuencia estructural, en ocho partes y siete bucles de superficie, uno entre cada parte de la secuencia estructural.

   15 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia es una secuencia NMB1870 de la familia 1.

2. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la primera secuencia es la SEC ID Nº: 1.

3. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los bucles de superficie en la SEC ID Nº: 1 son: (1) los aminoácidos 134 a 141; (2) los aminoácidos 162 a 168; (3) los aminoácidos 181 a 182; (4) el aminoácido 197; (5) los aminoácidos 219 a 223; (6) los aminoácidos 234 a 236; (7) los aminoácidos 261 a 267.

   20 5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la segunda secuencia es la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 3.

4. 6.

   El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que las partes seleccionadas tienen una longitud de al menos 3 aminoácidos.

5. 7.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (1).

   25 8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (2).

6. 9.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la parte comprende el bucle de superficie (3).

7. 10.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la parte comprende el bucle de superficie (4).

8. 11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie 30 (5).

9. 12.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (6).

10. 13.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la parte comprende el bucle de superficie (7).

    35 14. Un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos NMB1870 quimérica, que puede obtenerse por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11. 15. Un polipéptido que comprende secuencia de aminoácidos:

    -

    B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8

    en la que:

    40 (a) cada uno de dichos B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 y B8 es: (i) un fragmento de la SEC ID Nº: 1; y/o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con dicho fragmento de

    (i)

    y/o que comprende un fragmento de al menos 6 aminoácidos contiguos de dicho fragmento de (i);

    (b)

    cada uno de dichos L1, L2, L3, L4, L5, L6 y L7 es: (iii) un fragmento de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y/o

    SEC ID Nº: 3, a condición de que al menos uno de dichos L1, L2, L3, L4, L5, L6 y L7 no sea un fragmento de 45 la SEC ID Nº: 1,

    y en la que de B1 a B8 se definen de la siguiente manera:

    Coordenadas de aminoácidos dentro de la SEC ID Nº: 1

    B1

    B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8

    1-133

    142-161 169-180 183-196 198-218 224-233 237-260 268-274

    y en la que de L1 a L7 se definen de la siguiente manera:

    Coordenadas de aminoácidos dentro de la SEC ID Nº: 1, 2 o 3

    SEC

    L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7

    1

    134-141 162-168 181-182 197 219-223 234-236 261-267

    2

    134-141 162-167 180-181 196 218-222 233-235 260-266

    3

    142-149 170-175 188-189 204 226-230 241-243 268-274

12. 16. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global con la SEC ID Nº: 1 de al menos 80%, en la que: la identidad de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 1 es

    5 superior al 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: 1; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 1 es inferior al 80% en las regiones en bucle de la SEC ID Nº: 1, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una estructura, en ocho regiones estructurales, y siete regiones en bucle, una entre cada parte de la secuencia estructural.
13. 17. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global con

    10 la SEC ID Nº: 2 de al menos 80%, en la que: la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 es superior al 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: 2; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 es inferior al 80% en las regiones en bucle de la SEC ID Nº: 2, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una estructura, en ocho regiones estructurales, y siete regiones en bucle, una entre cada parte de la secuencia estructural.

    15 18. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global con la SEC ID Nº: 3 de al menos 80%, en la que: la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 3 es superior al 80% en las regiones estructurales de la SEC ID Nº: 3; y la identidad de secuencia de dicha secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº: 3 es inferior al 80% en las regiones en bucle de la SEC ID Nº: 3, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una estructura, en ocho regiones estructurales, y siete regiones

    20 en bucle, una entre cada parte de la secuencia estructural.

14. 19.

    Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

15. 20.

    Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

16. 21.

    La composición de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente un adyuvante de sal de aluminio.

17. 22. La composición de la reivindicación 20 o reivindicación 21, que adicionalmente comprende una proteína PorA 25 meningocócica.

18. 23.

    La composición de la reivindicación 20 o la reivindicación 21, que adicionalmente comprende una preparación de vesícula de la membrana externa de N. meningitidis.

19. 24.

    El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, para su uso como medicamento.