MX2008006719A - Polipeptidos quimericos, hibridos y en tandem de meningococos nmb1870 - Google Patents

Abstract

NMB1870 es una proteína de Neisseria meningitidis. Son conocidas tres familias de NM1870. para incrementar la habilidad de una proteína NM1870 para promover anticuerpos que son de reactividad cruzada entre las familias, NM1870 es manipulado por ingeniería genética. Las secuencias pueden ser sustituidas de una familia de NM1870 en la posición correspondiente en otra familia. Las proteínas de las secuencias de NM1870 provenientes de diferentes familias pueden ser unidas una a la otra.

Description

POLIPEPTIDOS QUIMÉRICOS, HÍBRIDOS Y EN TÁNDEM DE MENINGOCOCOS NMB1870 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se encuentra en el campo de la inmunización y, en particular, la inmunización contra enfermedades provocadas por bacterias patógenas del género Neisseria , tales como N. meningi tidis (meningococcus) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Neisseria meningi tidis es una bacteria encapsulada gram negativa que coloniza el tracto respiratorio superior de aproximadamente 10% de la población humana. Aunque las vacunas de polisacárido y de conjugado están disponibles contra los serogrupos A, C, 135 e Y, este procedimiento no puede ser aplicado al serogrupo B debido a que el polisacárido capsular es un polímero del ácido polisiálico, el cual es un autoantígeno en humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B, las proteínas expuestas en la superficie contenidas en las vesículas membranales externas (OMVs) han sido utilizadas. Estas vacunas promueven respuestas de anticuerpo bactericidas en suero, y protegen contra la enfermedad, pero fallan en inducir protección de cepa cruzada [1]. Algunos investigadores están enfocando por lo tanto a los antígenos meningocócicos específicos para el Ref..193575 uso en vacunas [2]. Un antígeno de este tipo es "NMB1870". Esta proteína fue originalmente descrita como proteína "741" de la cepa MC58 [SEQ IDs 2535 y 2536 en la referencia 3; SEQ ID 1 en la presente] , y también ha sido denominada como "GNA1870" [referencias 4-6, siguiente referencia 2] y como "ORF2086" [7-9]. Esta lipoproteína es expresada a través de todos los serogrupos meningocócicos y se ha encontrado en múltiples cepas de meningococos . Las secuencias de NMB1870 han sido agrupadas en tres familias (denominadas en la presente como familias I, II y III), y se ha encontrado que el suero producido contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, por ejemplo, existe protección cruzada intrafamiliar, pero no protección cruzada interfamiliar . Para lograr la protección de cepa cruzada utilizando NMB1870, por lo tanto, es utilizada más de una familia. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas, se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [10-12], incluyendo dos o tres de las familias en una cadena polipeptídica simple. Han sido probados varios híbridos y dan eficacia anti-meningocócica alentadora. Un objetivo de la invención es proporcionar procedimientos adicionales y mejorados para superar la especificidad de familia de la protección provocada por NMB1870, y para uso de estos procedimientos para proporcionar inmunidad contra la enfermedad y/o infección meningocócica, particularmente para el serogrupo B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENIÓN Complementando el trabajo descrito en la referencia 13, los inventores han sustituido las secuencias de una familia de NMB1870 en la posición correspondiente en otra familia, con el objetivo de producir una NMB1870 quimérica que no tenga la especificidad de familia de los polipéptidos de tipo silvestre. Como una alternativa a la manipulación por ingeniería de una NMB1870 simple tal que ésta tenga características de todas las tres familias, los inventores han producido también nuevos polipéptidos híbridos y en tándem que incluyen las secuencias de MB1870 provenientes de múltiples familias, con lo cual se complementa el trabajo descrito en las referencias 10 y 12. Mientras que cada familia de NMB1870 individual puede promover anticuerpos (por ejemplo, en ratones) éstos son efectivos únicamente contra cepas en la misma familia de NMB1870, los polipéptidos quiméricos, híbridos y en tándem de la invención pueden producir anticuerpos que reconocen los polipéptidos de NMB1870 de más de una familia. Los inventores han identificado también diversas formas polimórficas nuevas de NMB1870, incluyendo secuencias distintas de las tres familias previamente reportadas (familia IV) .

Susti tuciones de la familia NMB1870 La referencia 13 describe la sustitución de secuencias de una familia de NMB1870 en otra estructura de NMB1870 para dar polipéptidos de NMB1870 quiméricos. Los inventores han realizado trabajo adicional sobre las quimeras y han identificado un número de residuos clave para la sustitución en la secuencia de NMB1870 de la familia I. La sustitución de estos residuos puede mejorar la habilidad del polipéptido para promover los anticuerpos que reaccionan cruzadamente con los polipéptidos de la familia II. De este modo, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad a la SEQ ID No.: 57, y en donde uno o más de los siguientes residuos está ya sea sustituido con otro aminoácido o está suprimido: F14; T16; Q18; Q20; D21; S22; E23; H24; S25; G26; K27; K31; Q33; R35; 136; G37; 139; K48; E51; G52; R54; T56; A67; G68; K70; T72; A78; A79; N83; K85; D97; D102; P105; G107; R109; S114; S116; L118; N120; Q121; A122; K135; T147; V148; N149; G150; 1151; R152; H153. Se prefiere que al menos unos de los siguientes residuos esté sustituido: F14; T16; Q18; K31; Q33; R35; 136; G37; 139; T56; K70; T72; A78; A79; K85; D97; D102; S114; S116; L118; K135. Ninguno de estos residuos fue seleccionado para la sustitución en la referencia 13. Los aminoácidos preferidos para la sustitución o supresión son: F14; T16; Q18; Q20; D21; S22; E23; H24; S25; G26; K27; K31; Q33; R35; 136; G37; K48; E51; G52; R54; T72; A79; K85; P105; G107; R109; L118; N120; Q121; A122; T147; V148; N149; G150; 1151; R152; H153. La sustitución de los residuos es preferida, excepto para E51, donde es preferida la supresión. Los residuos son preferentemente sustituidos con el aminoácido correspondiente de NMB1870 en la familia II o en la familia III. Las sustituciones preferidas son de este modo: F14L; T161; Q18K; Q20N; D21N; S22P; E23D; H24K; S25I; S25T; G26D; K27S; K31Q; Q33S; R35L; I36V; G37S; I39L; K48Q; G52D; R54K; T56E; A67P; G68N; K70R; T72H; A78T; A79K; N83H; N83Y; K85R; D97E; D102E; P105A; G107E; R109S; S114L; S116D; L118R; N120G; Q121S; A122E; K135R; T147I; V148G; N149E; G150K; I151V; R152H; H153E. Únicamente los residuos 25 y 83 en esta lista tienen más de una sustitución preferida, ya que todos los otros tienen el mismo aminoácido en dos de las familias I, II y III.

La secuencia de aminoácidos tiene al menos 70% de identidad a la SEQ ID No.:57, por ejemplo >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99% o más. Esta secuencia puede estar presente como parte de un polipéptido más grande. El polipéptido puede tener la habilidad para inducir anticuerpos anti-meningococo, bactericidas, después de la administración a un animal hospedero, y en modalidades preferidas puede inducir anticuerpos que son bactericidas contra cepas en cada una de las tres familias de NMB1870 I a la III. La información adicional sobre las respuestas bactericidas se da en seguida. Una secuencia preferida de aminoácidos es la SEQ ID No.: 58 la cual, en comparación a la SEQ ID No.: 57, tiene sustituciones en: F14; T16; Q18; Q20; D21; S22; E23; H24 S25; G26; K27; K31; Q33; R35; 136; G37; K48; G52; R54; T72 A79; N83; K85; P105; G107; R109; L118; N120; Q121; A122 T147; V148; N149; G150; 1151; R152; H153. El residuo E51 fue suprimido . Otra secuencia sustituida es la SEQ ID No.: 59. Otra secuencia sustituida es la SEQ ID No.: 60.

Bucles superficiales para la susti tución Los bucles superficiales de la SEQ ID No.: 1 han sido identificados como: (1) los aminoácidos 164-168; (2) aminoácidos 179-182; (3) aminoácidos 188-196; (4) aminoácidos 203-208; (5) aminoácidos 216-224; (6) aminoácidos 233-237; (7) aminoácidos 247-251; y (8) aminoácidos 262-263: MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG IRHIGLAAKQ Mediante la alineación de la SEQ ID No.: 1 con cualquier otra secuencia de NMB1870, la persona experta puede identificar las posiciones de los bucles (1) al (8) en esa secuencia. Para facilidad de referencia, no obstante, las coordenadas del bucle son definidas en la presente como la sarta de aminoácidos en una secuencia de NMB1870 que, cuando se alinean a la SEQ ID No.: 1 utilizando un algoritmo de alineación por pares, comienza con el aminoácido alineado al primer residuo de aminoácido del bucle definido anteriormente en la SEQ ID No.: 1 y termina con el último aminoácido del bucle definido anteriormente en la SEQ ID No.: 1. La sustitución de las secuencias de bucle de una familia en la posición de bucle en otra familia, permite que sea producido el NMB1870 quimérico con antigenicidad multi-familia . De este modo, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia modificada de aminoácidos de una primera familia de NMB1870, en donde la secuencia modificada incluye al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7) secuencias de bucle superficial proveniente de una segunda familia de NMB1870 en lugar de una secuencia de bucle superficial de la primera familia. La invención también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de cadena principal o columna vertebral en nueve partes, con ocho inserciones de bucles, (una entre cada parte consecutiva de la secuencia de la cadena principal), donde al menos una de las secuencias de bucle es tomada de una secuencia de NMB1870 que es proveniente de una familia NMB1870 diferente proveniente de la secuencia de la cadena principal. Se prefiere utilizar bucles superficiales de más de una secuencia de NMB1870 diferente, y es posible insertar estos bucles en una secuencia simple de cadena principal. De este modo, la invención proporciona un polipéptido que proporciona una secuencia de aminoácidos: -B?-L?-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6- 6-B -L7-B8-L8-B9-en donde : (a) cada uno de Bi, B2, B3, B , B5, B6, B , B8 y B9 es: (i) un fragmento de la SEQ ID No.: M; o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% de identidad secuencial a dicho fragmento de (i) y/o que comprende un fragmento de al menos d aminoácidos contiguos provenientes del fragmento de (i) ; (b) cada uno de Li, L2, L3, L4, L5, L6, L7 y Le es: (i) un fragmento de las SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2 y/o de la SEQ ID No.: 3; o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% de identidad secuencial al fragmento de (i) y/o que comprende un fragmento de al menos e aminoácidos contiguos provenientes del fragmento de (i), con la condición de que al menos de Li, L2, L3, L , L5, Lß, L y L8 no sea un fragmento de la SEQ ID No.: M. La invención también proporciona un fragmento del polipéptido, con la condición de que el fragmento incluya al menos uno de Li, L2, L3, L , L5, L6, L7 y/o L8 y al menos un aminoácido proveniente de dos o más de Bi, B2, B3, B , B5, Be, B? , B8 y/o Bg. De este modo, en algunas modalidades el fragmento más pequeño incluye un bucle, un aminoácido para el extremo N de ese bucle y un aminoácido para el extremo C de ese bucle. El valor de M es seleccionado de 1, 2 ó 3, y las definiciones de Bi, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8 y B9 y de Li, L2, L3, L4, L5, Le, L7 y L8 puede variar sobre el valor de M. El significado de "(i) un fragmento de la SEQ ID No.: M" es como sigue: Similarmente, "(iii) un fragmento de la SEQ ID No. 1, SEQ ID No.: 2 y/o de la SEQ ID No.: 3" es definido como: Por ejemplo la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: -B?-L?-B2-L2-B3-L3-B -L -B5-L5-B6_L6-B7-L7-B8-L8-B9- en donde: Bi es los aminoácidos 1-163 de la SEQ ID No.: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% de identidad secuencial a los aminoácidos 1-163 y/o que comprende un fragmento de al menos d aminoácidos contiguos prevenientes de los aminoácidos 1-163; B2 es los aminoácidos 169-178 de la SEQ ID No.: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% de unidad secuencial a los aminoácidos 169-178 y/o que comprende un fragmento de al menos d aminoácidos contiguos provenientes de los aminoácidos 169-178 ... B9 es los aminoácidos 264-274 de la SEQ ID No.: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% de identidad secuencial a los aminoácidos 264-274 y/o que comprende un fragmento de al menos d aminoácidos contiguos provenientes de los aminoácidos 264-274; Li son los aminoácidos 164-168 de la SEQ ID No.: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% de identidad secuencial a los aminoácidos 164-168 y/o que comprende un fragmento de al menos e aminoácidos contiguos provenientes de los aminoácidos 164-168; L2 son los aminoácidos 179-182 de la SEQ ID No.: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% de identidad secuencial a los aminoácidos 179-182 y/o que comprende un fragmento de al menos e aminoácidos contiguos provenientes de los aminoácidos 179-182, ... L7 son los aminoácidos 269-270 de la SEQ ID No.: 3, o una secuencia de aminoácidos n% de identidad secuencial a los aminoácidos 269-270 y/o que comprende un fragmento de al menos e aminoácidos contiguos provenientes de los 269-270; etc . El valor de m se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de n se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de d se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 100 o más. El valor de e se selecciona de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. El valor de e es preferentemente menor de 20. La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia quimérica de aminoácidos: -B?-L?-B2-L -B3-L3-B4-L -B5-L5-B6-L6_B7-L7-B8-L8-B9-como se definió anteriormente, y que comprende además, ya sea N terminal a o C terminal a la secuencia quimérica, una secuencia de NMB1870, en donde la secuencia de NMB1870 está en la misma familia de NMB1870 que la SEQ ID No.: M. De este modo, el polipéptido comprende (i) una NMB1870 proveniente de una familia particular y (ii) también una NMB1870 proveniente de la misma familia, pero con al menos uno de sus bucles superficiales sustituidos por una familia de NMB1870 diferente . La invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad secuencial completa a la SEQ ID No.: Q de q%, en donde: el valor de q es al menos r; la identidad secuencial de la secuencia de aminoácidos a la SEQ ID No.: Q es mayor de q% en las regiones de cadena principal de la SEQ ID No.: Q; y la identidad secuencial de la secuencia de aminoácidos a la SEQ ID No. : Q es menos de q% en las regiones de bucle de la SEQ ID No.: Q. El valor de r se selecciona de 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, y 99.5. El valor de Q es 1, 2 ó 3, y los límites de las regiones de bucle y de las regiones de cadena principal son seleccionadas en consecuencia de las tablas anteriores (Li a L8 que son los bucles, y Bi a B9 que son la cadena principal o columna vertebral) . Donde Q es 1, la secuencia de aminoácidos en una región de bucle puede tener más de q% de identidad secuencial a la región de bucle correspondiente de la SEQ ID No.: 2 o de la SEQ ID No.: 3. Donde Q es 2, la secuencia de aminoácidos en una región de bucle puede tener más de q% de identidad secuencial a la región de bucle correspondiente de la SEQ ID No.: 1 o la SEQ ID No.: 3. Donde Q es 3, la secuencia de aminoácidos en una región de bucle puede tener más de q% de identidad secuencial a la región de bucle correspondiente de la SEQ ID No.: 1 ó SEQ ID No.: 2.

Polipéptidos híbridos y en tándem Las referencias 10 a la 13 describen los polipéptidos híbridos en los cuáles una cadena polipeptídica simple incluye una secuencia de NMB1870 y una secuencia polipeptídica meningocócica diferente. Por ejemplo, los híbridos que contienen NMB1870 y NadA son descritos en la referencia 10. La referencia 12 describe un subgrupo específico de polipéptidos híbridos, denominados como polipéptidos en tándem, en los cuales una cadena polipeptídica simple incluye múltiples secuencias de NMB1870, por ejemplo, una de cada familia. La invención proporciona un número de nuevos polipéptidos híbridos y en tándem. En general, un polipéptido híbrido puede ser representado por la fórmula: -A-[-X-L-]n-B-en donde X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de Neisserial, L es una secuencia de aminoácidos ligadora, opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional, y n es un número entero mayor de 1. El valor de n puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, pero es preferentemente 2 ó 3. La secuencia -A- está preferentemente en el extremo N del polipéptido, y la secuencia -B- está preferentemente en el extremo C del polipéptido. De acuerdo a la invención, al menos una de las porciones -X- es una secuencia NMB1870. Las secuencias de NMB1870 preferidas para el uso como porciones -X- son truncadas hasta e incluyendo la secuencia de poliglicina encontrada cerca del extremo N maduro, por ejemplo, éstas son las secuencias ?G. Las versiones ?G de las SEQ ID NOs : 1 a 3 son las SEQ ID NOs: 22 a 24, respectivamente. Para las porciones X, particularmente aquellas diferentes de Xi, se prefiere que el péptido guía nativo deba ser omitido. En una modalidad, los péptidos guia serán suprimidos excepto por aquel de la porción -X- localizada en el extremo n del polipéptido híbrido, por ejemplo, el péptido guía de Xi será conservado, pero los péptidos guía de X2 ... Xn serán omitidos. Esto es equivalente a suprimir todos los péptidos guía y utilizar el péptido guía de Xx como la porción -A- . Para cada n casos de [-X-L-], la secuencia ligadora de aminoácidos -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2 el híbrido puede ser NH2-X?-L?-X2-L2-COOH, NH2-X?-X2-COOH, NH2-X?-L1-X2- COOH, NH2-X?-X2-L2-COOH, etc. La o las secuencias ligadoras de aminoácidos -L- serán típicamente cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, por ejemplo 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, los ligadores de poliglicina (por ejemplo, Glyn, donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y marcadores de histidina (por ejemplo, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 ó más) . Otras secuencias de aminoácidos ligadoras, adecuadas, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Un ligador útil es GSGGGG (SEQ ID No.: 15), con el dipéptido Gly-Ser formado a partir de un sitio de restricción BamHI ayudando de este modo a la clonación y a la manipulación, y el tetrapéptido Gly4 (SEQ ID No.: 16) es otro ligando de poliglicina típico. Otro ligador útil es la SEQ ID No.: 17, la cual puede ser opcionalmente precedida 'por un dipéptido Gly-Ser (SEQ ID No.: 18, de BamHl) o un dipéptido Gly-Lys (SEQ ID No.: 9, de HindIII). -A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será típicamente corto (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, por ejemplo, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias guías para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (por ejemplo, marcadores de histidina, por ejemplo, Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos N-terminal adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Si Xi carece de su propia metionina N-terminal, -A- puede proporcionar tal residuo de metionina en el polipéptido traducido (por ejemplo, -A- es un residuo de Met simple) . La Met puede estar hacia el extremo N de una secuencia ligadora tal como la SEQ ID No.: 17 (por ejemplo, SEQ ID: 21), o en el extremo N de una secuencia corta (por ejemplo, SEQ ID No.: 26) . Los ejemplos de secuencias -A- incluyen las SEQ ID Nos: 21, 26 y 43. -B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal, opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo, de 40 o menos aminoácidos, por ejemplo, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen las secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (por ejemplo, que comprenden marcadores de histidina, por ejemplo, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, ~por ejemplo, SEQ ID No.: 20), o las secuencias que aumentan la estabilidad del polipéptido. Otras secuencias de aminoácidos C-terminal adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Una porción -B- adecuada es la SEQ ID No.: 41, en la cual el Leu-Glu (SEQ ID No.: 44) corriente arriba (5') de la SEQ ID No.: 20 surge de un sitio de restricción Xhol. En los polipéptidos híbridos preferidos de la invención, una de las porciones X es una secuencia de "proteína 936". La proteína 936 fue originalmente descrita como la SEQ ID No.: 2884 en la referencia 3 (SEQ ID No.: 14 en la presente) y una versión truncada en la señal de esta secuencia es la SEQ ID No.: 25 en la presente. Las secuencias "936" para el uso con la invención incluyen las secuencias (i) que tienen al menos z% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 25, y/o (ii) que comprenden un fragmento de al menos f aminoácidos contiguos de la SEQ ID No.: 25. El valor de z se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de f se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 200 o más. Algunos polipéptidos híbridos incluyen una secuencia de 936 y dos secuencias de NMB1870. Las dos secuencias de NMB1870 serán provenientes de dos diferentes familias, por ejemplo, I y II, I y III, ó II y III. Los híbridos preferidos incluyen una secuencia 936, una secuencia NMB1870 de la familia I y una secuencia NMB1870 de la familia II. La 936 es preferentemente la más N-terminal de estas tres secuencias. Las SEQ ID Nos: 28, 29, 34 y 35 son ejemplos de polipéptidos híbridos que incluyen una secuencia 936 al extremo N de las secuencias de NMB1870 provenientes de dos familias diferentes. Por ejemplo, donde n = 2 entonces Xi puede ser una secuencia "936" y X2 puede ser una secuencia NMB1870. Similarmente, donde n = 3 entonces, Xi puede ser una secuencia "936" y X2 puede ser una secuencia NMB1870 proveniente de una primera familia, y X2 puede ser, una secuencia NMB1870 proveniente de una segunda familia. En los polipéptidos en tándem preferidos de la invención n es 2 ó 3.

Catorce polipéptidos y en tándem específicos de la invención son descritos en las SEQ ID Nos: 27 a 40 las cuales, por guía, son construidas a partir de las SEQ ID Nos . , como sigue: Los polipéptidos híbrido y en tándem preferidos, adicionales de la invención incluyen una secuencia de la familia IV. De este modo, al menos una porción X puede (i) tener al menos v% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 95, y/o (ii) comprender un fragmento de al menos vv 'aminoácidos contiguos de la SEQ ID No.: 95. El valor de v se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 ó más. El valor de vv se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 200 ó más. Mediante la inclusión de una secuencia de la familia IV, la actividad en suero contra las cepas 269 de cpx puede ser mejorada.

Fragmen tos y dominios de NMB1870 En vez de utilizar una secuencia de NMB1870 de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID No.: 1), la invención usará típicamente un fragmento. Por ejemplo, los aminoácidos con dirección 5' del extremo N maduro (Cys-20 en la SEQ ID No.: 1) serán en general omitidos. Preferentemente, una secuencia "?G" será utilizada, en la cual todos los aminoácidos hasta e incluyendo la secuencia de poliglicina de la NMB1870 serán suprimidos, por ejemplo, la supresión de los aminoácidos 1-26 en la SEQ ID No.: 1. En la SEQ ID Nos: 27 a 40, por ejemplo, la tabla anterior muestra que las formas ?G de NMB1870 (por ejemplo, SEQ ID Nos: 22 a 24) son utilizadas. Como se describe en la referencia 13, NMB1870 puede ser dividida en tres dominios, denominados como A, B y C. Tomando la secuencia de la familia I (SEQ ID No.: 1), en la cual el extremo N de la lipoproteína procesada madura es Cys-20, los tres dominios son (A) 1-119, (B) 120-183 y (C) 184-274: MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVA?DIG?GLAD? T?PLDHKDKGLQSLT DQSVRKNEKLK LAAQGA?KTYGNGDSLHTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ IQDSEHSGKMVAKRQ RIGDIAGEHTSFDKIIPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG IRHIGLAAKQ La forma madura del dominio "A", desde su cisteína C-terminal, es llamada "Amaduro". Para MC58, los dominios son: "A" = SEQ ID No. : 4; "B" = SEQ ID No. : 5; "C" = SEQ ID No. : 6; y "Amaduro" =F SEQ ID No. : 13. Múltiples secuencias de NMB1870 son conocidas [por ejemplo, ver las referencias 4, 8 y 10] y pueden ser fácilmente alineadas utilizando métodos estándares. Mediante tales alineamientos la persona experta puede identificar los dominios "A" (y "Ama uro") , "B" y "C" en cualquier secuencia de NMB1870 dada, por comparación a las coordenadas en la secuencia MC58. Para facilidad de referencia, no obstante, los dominios son definidos en seguida: Dominio "A" en una secuencia de NMB1870 dada es el fragmento de esa secuencia el cual, cuando se alinea a la SEQ ID No. : 1 utilizando un algoritmo de alineación por pares, comienza con el aminoácido alineado a Met-1 de la SEQ ID No.: 1 y termina con el aminoácido alineado a Lys-119 de la SEQ ID No.: 1. Dominio "Amadur0" en una secuencia de NMB1870 dada es el fragmento de esa secuencia el cual, cuando se alinea a la SEQ ID No.: 1 utilizando un algoritmo de alineación por pares, comienza con el aminoácido alineado a Cys-20 de la SEQ ID No.: 1 y termina con el aminoácido alineado a Lys-119 de la SEQ ID No. : 1. Dominio "B" en una secuencia de NMB1870 dada es el fragmento de esa secuencia el cual, cuando se alinea a la SEQ ID No.: 1 utilizando un algoritmo de alineación por pares, comienza con el aminoácido alineado a Gln-120 de la SEQ ID No.: 1 y termina con el aminoácido alineado a Gly-183 de la SEQ ID No. : 1. — Dominio "C" en una secuencia de NMB1870 dada es el fragmento de esa secuencia el cual, cuando se alinea a la SEQ ID No.: 1 utilizando un algoritmo de alineación por pares, comienza con el aminoácido alineado a Lys-184 de la SEQ ID No.: 1 y termina con el aminoácido alineado a Gln-274 de la SEQ ID No. : 1. El algoritmo de alineación por pares preferido, para definir los dominios, es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [14], utilizando los parámetros por omisión (por ejemplo, con penalidad de abertura de espacio vacio (Gap) = 10.0, y con penalidad por extensión de espacio vacío = 0.5, utilizando la matriz de calificación EBLOSUM62). Este algoritmo es convenientemente implementado en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [15]. Las secuencias de NMB1870 caen dentro de tres familias [4, 10] que son denominadas en la presente como familias I, II y III. Las secuencias prototípicas para las familias I-III son, respectivamente, las SEQ ID Nos.: 1-3. Los métodos filogenéticos y de dendrograma de la referencia 4 pueden ser seguidos con el fin de determinar fácilmente la familia para cualquier secuencia de NMB1870 dada, y una alineación por pares con cada una de las tres secuencias de NMB1870 prototípicas puede ser también utilizado para encontrar la concordancia de familia más parecida. Las secuencias caen distintamente en las tres familias, con la identidad secuencial que es de 74.1% entre las familias I y II, 62.8% entre las familias I y III y 84.7% entre las familias II y III, y con la variación secuencial dentro de cada familia que es baja (por ejemplo, un mínimo de 91.6% de identidad en la familia I, 93.4% en la familia II y 93.2% en la familia III). Como una manera rápida de determinar la familia de una secuencia sin requerir un análisis filogénetico, puede ser colocada una secuencia en la familia I y ésta tiene al menos 85% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 1, puede ser colocada en la familia II si ésta tiene al menos 85% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 2, y puede ser colocada en la familia III si ésta tiene al menos 85% de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 3. Con base en el alineamiento en la figura 6 de la referencia 4, los dominios ejemplares A, B y C para las tres familias prototípicas de NMB1870 (SEQ ID Nos.: 1 a 3) son como sigue: i Dominio de A B C familia? I SEQ ID No. : 4 SEQ ID No. : 5 SEQ ID No. : 6 II SEQ ID No. : 7 SEQ ID No. : 8 SEQ ID No. : 9 III SEQ ID No. : 10 SEQ ID No. : 11 SEQ ID No. : 12 Los dominios preferidos para el uso con la invención comprenden las secuencias de aminoácidos que (a) que tienen al menos x% de identidad secuencial a una o más de las SEQ ID Nos.: 4 a 12, y/o (a) comprenden un fragmento de al menos la secuencia de y aminoácidos consecutivos provenientes de una o más de las SEQ ID Nos.: 4 a 12. El valor de x se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de y se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50 o más. En los polipéptidos que comprenden secuencias de NMB1870 provenientes de diferentes familias, los valores de x e y para cada familia, pueden ser los mismos o diferentes. Una secuencia de dominio "A" está preferentemente entre ai y a2 (inclusive) aminoácidos de longitud, donde: ai se selecciona de 110, 115, 120, 125 y 130; y a2 se selecciona de 115, 120, 125, 130 y 135. Una secuencia de dominio "B" está preferentemente entre bi y b2 (inclusive) aminoácidos de longitud, donde: bi se selecciona de 55, 60, 65 y 70; y b2 se selecciona de 60, 65, 70 y 75. Una secuencia de dominio "C" está preferentemente entre ci y c2 (inclusive) aminoácidos de longitud, donde: ci se selecciona de 80, 85, 90, 95 y 100; y c2 se selecciona de 85, 90, 95, 100 y 105. Como se desee, cualquier forma de longitud completa de NMB1870 puede ser reemplazada por un dominio de NMB1870 simple (A, B ó C) o por dos dominios de NMB1870 (AB, AC ó BC) .

Formas polimórficas de NMB1870 Diversas formas polimórficas de NMB1870 han sido previamente reportadas. Han sido identificadas nuevas secuencias y así pues la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 y 94. La SEQ ID No.: 94 (ver también la SEQ ID No.: 140 de la referencia 12) es un ejemplo de una secuencia de la familia IV, la cual puede haber surgido por recombinación entre las familias I y III.

Polipéptidos La invención proporciona los polipéptidos diversos descritos anteriormente. Esta proporciona también un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56. Esta también proporciona los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos (a) que tiene identidad secuencial a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56 y/o (b) que comprende un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56. El grado de identidad secuencial es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) . El fragmento comprende preferentemente 7 o más aminoácidos consecutivos desde la secuencia inicial (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 70, 85, 90, 95, 100 o más) . NMB1870 es naturalmente una lipoproteína en N. meningi tidis . Se ha encontrado que ésta está lipidada cuando es expresada en E . col i . Los polipéptidos de la invención pueden tener un residuo de cisteína C-terminal, el cual puede ser lipidado, por ejemplo, comprendiendo un grupo palmitoilo. Una característica de los polipéptidos preferidos de la invención es la habilidad para inducir anticuerpos anti-meningococo, bactericidas, después de la administración a un animal hospedero. Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados mediante diversos medios, por ejemplo, mediante síntesis química (al menos en parte) , mediante digestión de los polipéptidos más largos utilizando proteasas, mediante traducción a partir del ARN, mediante purificación a partir del cultivo celular (por ejemplo, a partir de la expresión recombinante o del cultivo de N. meningi tidis) , etc. La expresión heteróloga en un hospedero de E. coli es una ruta de expresión preferida (por ejemplo, en DH5 , BL21 (DE3), BLR, etc. ) . Los polipéptidos de la invención pueden ser adheridos o inmovilizados a un soporte sólido.

Los polipéptidos de la invención pueden comprender un marcador detectable, por ejemplo, un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayo. Los polipéptidos pueden tomar varias formas (por ejemplo, nativos, fusiones, glucosilados, no glucosilados, lipidados, unidos por puentes disulfuro, etc.). Los polipéptidos son preferentemente preparados en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (por ejemplo, sustancialmente libre de otros polipéptidos neiseriales o de la célula hospedera) o en formas sustancialmente aislada. En general, los polipéptidos son proporcionados en un ambiente de origen no natural, por ejemplo, éstos son separados de su ambiente de origen natural. En ciertas modalidades, el polipéptido objetivo está presente en una composición que está enriquecida para el polipéptido en comparación a un control. Como tal, se proporciona un polipéptido purificado, con lo cual purificado se entiende que el polipéptido está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, entendiéndose por sustancialmente libre, que menos de 90%, usualmente menos de 60% y más usualmente menos de 50% de la composición está constituida de otros polipéptidos expresados. El término "polipéptido" se refiere a los polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, éste puede comprender aminoácidos modificados, éste puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcación. También incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la materia. Los polipéptidos pueden aparecer como cadenas simples o cadenas asociadas. Ácidos nucleicos La invención proporciona ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención como se definió anteriormente. La invención también proporciona el ácido nucleico que comprende: (a) un fragmento de al menos n nucleótidos consecutivos provenientes del ácido nucleico, en donde n es 10 o más (por ejemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o más); y/o (b) una secuencia que tiene al menos 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de identidad secuencial al ácido nucleico. Además, la invención proporciona el ácido nucleico que puede hibridarse al ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención, preferentemente bajo condiciones de "alta exigencia o severidad" (por ejemplo, 65°C en una solución de 0.1 x SSC, 0.5% de SDS). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser utilizados en reacciones de hibridación (por ejemplo, transferencias de Northern o Southern, o en microarreglos de ácido nucleico o "chips de genes") y reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.), y otras técnicas de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser preparados de muchas formas por ejemplo, mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforamidita del ADN), total o parcialmente, mediante digestión de ácidos nucleicos más largos utilizando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción) , mediante la unión de ácidos nucleicos más cortos o nucleótidos (por ejemplo, utilizando ligasas o polimerasas) , a partir de bibliotecas de cADN o de ADN genómico, etc. Los ácidos nucleicos de la invención pueden tomar varias formas, por ejemplo, de una sola hebra, de doble hebra, vectores, cebadores, sondas, marcados, no marcados, etc . Los ácidos nucleicos de la invención están preferentemente aislados o sustancialmente aislados. La invención incluye el ácido nucleico que comprende las secuencias complementarias a aquellas descritas anteriormente por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para el uso como cebadores. El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas, y también ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , etc. El ácido nucleico de acuerdo a la invención puede ser marcado, por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente. Esto es particularmente útil donde el ácido nucleico que va a ser utilizado en las técnicas de detección de ácido nucleico, por ejemplo, donde el ácido nucleico es un cebador o como una sonda para el uso en las técnicas tales como PCR, LCR, TMA, NASBA, etc. La invención también proporciona los vectores que comprenden las secuencias nucleotídicas de la invención (por ejemplo, los vectores de clonación o de expresión, tales como aquellos adecuados para la inmunización con ácido nucleico) y las células hospederas transformadas con tales vectores.

Respuestas bactericidas Los polipéptidos preferidos de la invención pueden promover respuestas de anticuerpo que son bactericidas contra meningococos . Las respuestas de anticuerpo bactericidas son convenientemente medidas en ratones y son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna [por ejemplo, la nota final 14 de la referencia 2]. Los polipéptidos de la invención pueden promover preferentemente una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra al menos una cepa de N. meníngi tidis proveniente de cada uno de al menos de los siguientes tres grupos de cepas: (I) MC58, gbl85 (=M01-240185) , m4030, m2197, m2937, isslOOl, NZ394/98, 67/00, 93/114, bzl98, ml390, nge28, Inpl7592, 00-241341, f6124, 205900, ml98/172, bzl33, gbl49 (=M01-240149) , nm008, nm092, /00, 39/99, 72/00, 95330, bzl69, bz83, cu385, h44/76, ml590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847. (II) 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013) , e32, ml090, ni4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, cll, m986, m2671, 1000, ml096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286. (III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355) , m3369, m3813, ngpl65. Por ejemplo, un polipéptido quimérico puede promover una respuesta bactericida efectiva contra dos o más de las cepas de N. meningi tidis del serogrupo B, a saber, MC58, 961-5945 y M1239. El polipéptido puede promover preferentemente una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra al menos 50% de las cepas de meningococo del serogrupo B, clínicamente relevantes (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) . El polipéptido puede promover una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de N. meningi tidis serogrupo B y las cepas de al menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) de los serogrupos A, C, W135 e Y. El polipéptido puede promover una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de N. gonococcus y/o N. cinérea . El polipéptido puede promover una respuesta que es bactericida contra cepas provenientes de al menos dos de las tres principales ramas del dendograma mostrado en la figura 5 de la referencia 4. El polipéptido puede promover una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de N. meningi tidis en al menos 2 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) de las líneas hipervirulentas ET-37, ET-5, grupo A4, línea 3, subgrupo I, subgrupo III, y subgrupo IV-I [16, 17]. Los polipéptidos pueden inducir adicionalmente respuestas de anticuerpo bactericidas contra una o más líneas hiperinvasoras . Los polipéptidos pueden promover una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra las cepas de N. meningi tidis en al menos 2 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los siguientes tipos de secuencia multilocus: ST1, ST4, ST5, ST8, STI 1, ST32 y ST41 [18]. El polipéptido puede también promover una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de ST44. El polipéptido no necesita inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de las cepas MenB dentro de las líneas especificadas o MLST; más bien, para cualquier grupo dado de cuatro o más cepas de meningococos del serogrupo B dentro de una línea hipervirulenta particular o MLST, los anticuerpos inducidos por la composición son preferentemente bactericidas contra al menos 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas de al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. El suero preferentemente tiene un título bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o más alto, preferentemente al menos 214) , por ejemplo, en sueros capaz de matar al menos 50% de las bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1:1024, por ejemplo, como se describe en la nota final 14 de la referencia 2. Los polipéptidos quiméricos preferidos pueden promover una respuesta de anticuerpo en ratones, que permanece bactericida incluso cuando el suero es diluido 1:4096 o más.

Inmuniza ción Los polipéptidos de la invención son preferentemente proporcionados como composiciones inmunogénicas, y la invención proporciona una composición inmunogénica de la invención para el uso como un medicamento. La invención también proporciona un método para producir una respuesta de anticuerpo en un mamífero, que comprende administrar una composición inmunogénica de la invención al mamífero. La respuesta de anticuerpo es preferentemente una respuesta de anticuerpo protectora y/o bactericida . La invención también proporciona un método para proteger a un mamífero contra una infección por Neiseria (por ejemplo, meningocócica) , que comprende administrarle al mamífero una composición inmunogénica de la invención. La invención proporciona los polipéptidos quiméricos para el uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones inmunogéncias o como vacunas), o como reactivos de diagnóstico. Esta también proporciona el uso de ácido nucleico, el polipéptido o el anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir la infección Neiserial (por ejemplo, meningocósica) en un mamífero. El mamífero es preferentemente un humano. El humano puede ser un adulto, o preferentemente un niño. Donde la vacuna es para el uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un lactante o infante); donde la vacuna es para el uso terapéutico, el humano es preferentemente un adulto. Una vacuna destinada para niños puede también ser administrada a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc. Los usos y métodos son particularmente útiles para prevenir y/o tratar enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a, meningitis (particularmente meningitis bacteriana) y bacteremia. La eficacia del tratamiento terapéutico puede ser probada mediante el monitoreo de la infección Neiserial después de la administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico puede ser probada mediante el monitoreo de las respuestas inmunes contra NMB1870 después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede ser determinada al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo, de 12-16 meses de edad, o modelos animales [19]) y luego determinando los parámetros estándares que incluyen los anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y los títulos de ELISA (GMT) . Estas respuestas inmunes en general serán determinadas alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y comparadas a los valores determinados antes de la administración de la composición. Un incremento de SBA de al menos 4 veces u 8 veces es preferido. Donde más de una dosis de la composición es administrada, puede ser realizada más de una determinación post-administración. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente que es superior al criterio para la seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpo asociado por arriba del cual un hospedero es considerado como seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y tales títulos son publicados por organizaciones tales como la Organización Mundial de la Salud. Preferentemente, más del 80% de una muestra estadísticamente significativa de sujetos es seroconvertida, más preferentemente más del 90%, todavía más preferentemente más del 93% y lo más preferentemente 96-100%. Las composiciones de la invención serán administradas en general directamente a un paciente. La administración directa puede ser lograda mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, o al espacio intersticial de un tejido), o mediante la administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar o mucosal. La administración intramuscular al muslo o a la parte superior del brazo es preferida. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero la inyección libre de aguja puede ser alternativamente utilizada. Una dosis intramuscular típica es de aproximadamente 0.5 mi. La invención puede ser utilizada para promover inmunidad sistémica y/o mucosal. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples. Las dosis múltiples pueden ser utilizadas en un esquema de inmunización primaria y/o en un esquema de inmunización de refuerzo. Un esquema de dosis primario puede ser seguido por un esquema de dosis de refuerzo. La sincronización adecuada entre las dosis de aprestamiento (por ejemplo, entre 4-16 semanas), y entre el aprestamiento y el refuerzo, pueden ser rutinariamente determinadas. La composición inmunogénica de la invención incluirá en general un portador farmacéuticamente aceptable, el cual puede ser cualquier sustancia que por si misma no induzca la producción de anticuerpos peligrosos para el paciente que recibe la composición, y que puede ser administrada sin toxicidad indebida. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol, y etanol. Sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH y similares, pueden también estar presentes en tales vehículos. Una discusión completa de los portadores adecuados está disponible en la referencia 20. Las infecciones Neiseriales afectan diversas áreas del cuerpo y así pues las composiciones de la invención pueden ser preparadas en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como solución o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección pueden ser también preparadas. La composición puede ser preparada para la administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición puede ser preparada para la administración oral, por ejemplo, como una tableta o cápsula o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición puede ser preparada para la administración pulmonar por ejemplo, como un inhalador, utilizando un polvo fino o un rocío. La composición puede ser preparada como un supositorio o pesario. La composición puede ser preparada para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas . La composición es preferentemente estéril. Esta es preferentemente libre de pirógeno. Esta es preferentemente amortiguada, por ejemplo, a entre pH 6 y pH 8, en general alrededor de pH 7. Donde una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere utilizar un amortiguador de histidina [21]. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos. Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva del inmunógeno, así como cualquier otro de los componentes especificados, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie de dosis, es efectiva para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va ser tratado, la edad, el grupo taxonómico del individuo que va a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico que atiende respecto a la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiple (por ejemplo, incluyendo dosis reforazadoras) . La composición puede ser administrada en conjunto con otros agentes inmunorreguladores . Los adyuvantes que pueden ser utilizados en las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a: A. Composiciones que contienen minerales Las composiciones que contienen minerales, adecuadas para el uso como adyuvantes de la invención incluyen sales minerales, tales como las sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye las sales minerales tales como los hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc. [por ejemplo, ver los capítulos 8 y 9 de la referencia 22], o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.), y con la adsorción que es la preferida. Las composiciones que contienen minerales pueden ser también formuladas como una partícula de sal metálica [23]. Los fosfatos de aluminio son particularmente preferidos, particularmente en composiciones que incluyen un antígeno de sacárido de H. infl uenzae, y un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporción molar P04/A1 entre 0.84 y 0.92, incluida a 0.6 mg de Al3+/ml .

La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio puede ser utilizada, por ejemplo, entre 50 y 100 µg de Al3+ por conjugado por dosis. Donde existe más de un conjugado en una composición, no todos los conjugados necesitan ser adsorbidos.

B. Emulsiones en Aceite Las composiciones de emulsión en aceite adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de la referencia 22; ver también referencia 24] (5% de escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85, formulada en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador) . El adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) pueden ser también utilizados. Los adyuvantes de emulsiones aceite en agua son útiles con la invención .

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 22] Las formulaciones de saponina pueden ser también utilizadas como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoide que son encontrados en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies vegetales. La saponina proveniente de la corteza del árbol de Quillaia saponaria Molina ha sido ampliamente estudiada como adyuvante. La saponina puede también ser comercialmente obtenida de Smilax orna ta (sarsaparilla) , Gypsophilla pani cula ta (velo de novia), y Saponaria offi cianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOMs. QS21 es comercializado como StimulonMR. Las composiciones de saponina han sido purificadas utilizando cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-CLAR) . Las fracciones purificadas específicas utilizando estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 es descrito en la referencia 25. Las formulaciones de saponina pueden también comprender un esterol, tal como colesterol [26]. Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden ser utilizadas para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOMs) [capítulo 23 de la referencia 22]. Los ISCOMs también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Cualquier saponina conocida puede ser utilizada en los ISCOMs. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOMs son además descritos en las referencias 26-28. Opcionalmente, los ISCOMS pueden estar desprovistos de detergente adicional [29] . Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponina puede ser encontrada en las referencias 30 y 31.

D. Virosomas y partículas similares a virus Los virosomas y partículas similares a virus (VLPs) pueden ser también utilizados como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen en general una o más proteínas provenientes de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Éstos son en general no patógenos, no replicantes y en general no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden ser recombinantemente producidas o aisladas a partir de los virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para el uso en los virosomas o VLPs, incluyen proteínas derivadas del virus de la influenza (tales como HA o NA) , virus de la hepatitis B (tales como las proteínas de núcleo o de cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la enfermedad de pie y boca, retrovirus, virus Norwalk, virus del papiloma humano, HIV, fagos de ARN, fago Qß (tales como las proteínas de recubrimiento) , fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tales como la proteína pl del retrotransposon Ty) . Las VLPs son discutidas adicionalmente en las referencias 32-37. Los virosomas son discutidos además por ejemplo en la referencia 38.

E. Derivados bacterianos o microbianos Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados de Lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas de ribosilación del ADP, y derivados destoxificados de las mismas . Los derivados no tóxicos de LPS incluyen el monofosforil-lípido A (MPL) , y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla del monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado, con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferida del monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado es descrita en la referencia 39. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para ser esterilizadas por filtración a través de una membrana de 0.22 µm [39], Otros derivados de LPS no tóxico incluyen los miméticos del monofosforil-lípido A, tales como los derivados del fosfato de aminoalquil-glucosaminida, por ejemplo RC-529 [40, 41].

Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 es descrito por ejemplo en las referencias 42 y 43. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias nucleotídicas que contienen una porción CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARNs de doble hebra y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) han mostrado que también son inmunoestimuladoras . Los CpG ' s pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de una sola hebra. Las referencias 44, 45 y 46 describen las posibles sustituciones análogas, por ejemplo, el reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina . El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG es además discutido en las referencias 47-52. La secuencia CpG puede ser dirigida a TLR9, tal como la porción GTCGTT o TTCGTT [53] . La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de Thl, tal como CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B Odas son discutidos en las referencias 54-56.

Preferentemente, la CpG es un Cpg-A ODN. Preferentemente, el oligonucleótido CpG es construido de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias oligonucleotídicas de CpG pueden ser enlazadas en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" . Ver, por ejemplo, las referencias 53, 57-59. Las toxinas bacterianas de ribosilación del ADP y los derivados destoxificados de las mismas pueden ser utilizados como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína es derivada de E . coli (enterotoxina lábil al calor "LT" de E . coli ) , toxina del cólera ("CT"), o pertusis ("PT"). El uso de las toxinas destoxificadas de ribosilación del ADP como adyuvantes mucosales, se describe en la referencia 60 y como adyuvantes parenterales en la referencia 61. La toxina o toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación de destoxificación; preferentemente la subunidad B no es mutada. Preferentemente el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de las toxinas de ribosilación del ADP y los derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes, pueden ser encontradas en las referencias 62-69. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos está preferentemente basada en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas de ribosilación del ADP descritas en la referencia 70, específicamente incorporada por referencia en su totalidad aquí.

F. Inmunomoduladores humanos Los inmunomoduladores humanos, adecuados para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen citocinas, tales como interieucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [71], etc.) [72], interferones (por ejemplo interferón ?) , factor estimulador de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y mucoadhesivos pueden ser también utilizados como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico especificado [73] o mucoadhesivos tales como los derivados reticulados del poli (ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y derivados del mismo pueden ser también utilizados como adyuvantes en la invención [ 74 ] .

H. Micropartículas Las micropartículas pueden también ser utilizadas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (por ejemplo una partícula de aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 150 µm de diámetro, más preferentemente aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 30 µm de diámetro, y lo más preferentemente aproximadamente 500 nm hasta aproximadamente 10 µm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (a-hidroxiácido) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con el poli (láctido-co-glicólido) son preferidos, opcionalmente tratados para tener una superficie negativamente cargadas (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

I. Liposomas (Capítulos 13 & 14 de la referencia 22) Los ejemplos de formulaciones de liposomas, adecuadas para el uso como adyuvantes se describen en las referencias 75-77.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y esteres de polioxietileno [78]. Tales formulaciones incluyen además surfactantes de éster de polioxietilen-sorbitan en combinación con un octoxinol [79] así como surfactantes de éteres o esteres alquílicos de polioxietileno en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional tal como un octoxinol [80]. Los éteres de polioxietileno preferidos son seleccionados del siguiente grupo: éter polioxietilen-9-laurílico (lauret 9), éter polioxietilen-9-esteorílico, éter polioxietilen-8-esteorílico, éter polioxietilen-4-laurílico, éter polioxietilen-35-laurílico, y éter polioxietilen-23-laurílico.

K. Polifosfaceno (PCPP) Las formulaciones de PCPP son descritas, por ejemplo, en las referencias 81 y 82.

L. Péptidos de muramilo Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para el uso como adyuvantes de la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no MDP) , y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) .

M. Compuestos de Imidazoquinolina Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolina adecuados para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M"), descrito además en las referencias 83 y 84. La invención puede también comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes anteriormente identificados. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes pueden ser utilizadas en la invención: (1) una saponina y una emulsión aceite en agua [85]; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [86]; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [87]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [88]; (6) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80MR, 5% de polímero en bloque de pluronic L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitado en torbellino para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) el sistema adyuvante RibiMR (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de la pared de células bacterianas provenientes del grupo que consiste de monofosforil-lípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (DetoxMR); y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores se describen en el Capítulo 7 de la referencia 22. Las sales de aluminio (fosfatos de aluminio y particularmente los hidroxifosfatos y/o hidróxidos y particularmente oxihidróxido) y MF59, son adyuvantes preferidos para la inmunización parenteral. Los mutantes de toxina son adyuvantes mucosales preferidos. QS21 es otro adyuvante útil para NMB1870, que puede ser utilizado solo o en combinación con uno más de estos adyuvantes, por ejemplo con una sal de aluminio. Los péptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil- L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) , etc.

Componentes antigénicos adicionales Las composiciones de la invención incluyen secuencias de NMB1870. Se prefiere particularmente que la composición no deba incluir mezclas complejas o no definidas de antígenos, por ejemplo se prefiere no incluir vesículas de la membrana externa en la composición. Los polipéptidos de la invención son preferentemente expresados recombinantemente en un hospedero heterólogo y luego purificados. Así como se incluye una secuencia de NMB1870, una composición de la invención puede también incluir uno o más antígenos neiseriales adicionales, como una vacuna que se dirige a más de un antígeno por bacteria, disminuye la posibilidad de seleccionar mutantes de escape. Los antígenos neiseriales para la inclusión en las composiciones incluyen polipéptidos que comprenden uno o más de: (a) las 446 SEQ IDs pares (por ejemplo, 2, 4, 6,..., 890, 892) descritas en la referencia 89. (b) las 45 SEQ IDs pares (por ejemplo, 2, 4, 6,..., 88, 90) descritas en la referencia 90; (c) las 1674 SEQ IDs pares 2-3020, las SEQ IDs pares 3040- 3114, y todas las SEQ IDs 3115-3241, descritas en la referencia 3; (d) las 2160 secuencias de aminoácidos NMB0001 a NMB2160 de la referencia 2; (e) una proteína PorA de meningococo, de cualquier subtipo, preferentemente recombinantemente expresada; (f) una variante, homólogo, ortólogo, parálogo, mutante, etc. de (a) a (e) ; o (g) una preparación de vesícula de membrana externa de N. meningi tidi s [por ejemplo ver referencia 182].

Además de los antígenos polipeptídicos neiseriales, la composición puede incluir antígenos para inmunizar contra otras enfermedades o infecciones. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos adicionales: un antígeno sacárido proveniente de N. meningi tidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido descrito en la referencia 91 del serogrupo C [ver también referencia 92] o los oligosacáridos de la referencia 93. un antígeno sacárido proveniente de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo 94, 95, 96]. un antígeno proveniente del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo 97, 98]. - un antígeno proveniente del virus de la hepatitis B, tales como los antigenos de superficie y/o núcleo [por ejemplo 98, 99] . un antígeno de la difteria, tal como un toxoide de la difteria [por ejemplo Capítulo 3 de la referencia 100] por ejemplo el mutante CR 197 [por ejemplo 101] . un antígeno tetánico, tal como el toxoide tetánico [por ejemplo Capítulo 4 de la referencia 100] . un antigeno de Bordetella pertusis, tal como la holotoxina de pertusis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertusis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo referencias 102 y 103]. un antígeno sacárido proveniente de Haemophil us influenzae B [por ejemplo 92] . - uno o varios antígenos de la polio [por ejemplo 104, 105] tal como IPV. antígenos del sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo Capítulos 9, 10 y 11 de la referencia 100]. uno o varios antígenos de la influenza [por ejemplo Capítulo 19 de la referencia 100], tales como las proteínas superficiales hemaglutinina y/o neuraminidasa . un antígeno de Moraxella ca tarrhalis [por ejemplo 106]. un antígeno proteico de Streptococcus agala ctiae (streptococcus del grupo B) [por ejemplo 107, 108]. - un antígeno sacárido de Streptococcus agala ctiae (streptococcus del grupo B) . un antígeno de Streptococcus pyogenes (streptococcus del grupo A) [por ejemplo 108, 109, 110]. un antígeno de Staphylococcus a ureus [por ejemplo 111] . La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Los antígenos proteicos tóxicos pueden ser destoxificados donde sea necesario (por ejemplo la destoxificación de la toxina de pertusis por medios químicos y/o genéticos [103]).

Donde es incluido un antígeno de la difteria en la composición, se prefiere también incluir el antígeno del tétanos y los antígenos de pertusis. Similarmente, donde un antígeno del tétanos es incluido se prefiere también incluir antígenos de la difteria y de pertusis. Similarmente, donde es incluido un antígeno de pertusis, se prefiere también incluir antígeno de la difteria y del tétanos. Son de este modo preferidas las combinaciones de DTP. Los antígenos sacáridos están preferentemente en la forma de conjugados. Las proteínas portadoras para los conjugados son discutidas con más detalle más adelante. Los antígenos en la composición estarán típicamente presentes a una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno.

En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para promover una respuesta inmune contra ese antígeno . Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser utilizadas terapéuticamente (por ejemplo para tratar una infección existente) o profilácticamente (por ejemplo para prevenir la infección futura) . Como una alternativa al uso de los antígenos proteicos en las composiciones inmunogénicas de la invención, puede ser utilizado el ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica para el antigeno.

Las composiciones particularmente preferidas de la invención incluyen uno, dos o tres de: (a) antígenos sacáridos provenientes de los serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococcus; (b) un antígeno sacárido de Haemophil us infl uenzae tipo B; y/o (c) un antígeno de Streptococcus pneumoniae.

Serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococcus Las vacunas polisacáridas contra los serogrupos A, C, 135 e Y han sido conocidos por muchos años. Estas vacunas (MENCEVAX ACWYMR y MENOMUNEMR) están basadas en los polisacáridos capsulares de los organismos y, aunque éstas son efectivas en adolescentes y adultos, éstas dan una respuesta inmune pobre, y una corta reducción de protección, y no pueden ser utilizadas en infantes. En contraste a los antígenos polisacáridos no conjugados en estas vacunas, las vacunas del serogrupo C recientemente aprobadas (MenjugateMR [112,91], MeningitecMR y NeisVac-CMR) incluyen sacáridos conjugados. MenjugateMR y MeningitecMR tienen antígenos oligosacáridos conjugados a un portador CRM197, mientras que NeisVac-CMR utiliza el polisacárido completo (des-O-acetilado) conjugado a un portador de toxoide tetánico. La vacuna MenactraMR contiene antígenos sacáridos capsulares conjugados, provenientes de cada uno de los serogrupos Y, W135, C y A.

Las composiciones de la presente invención incluyen preferentemente los antígenos sacáridos capsulares provenientes de uno o más de los serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococcus, en donde los antígenos son conjugados a una o varias proteínas portadoras y/o son oligosacáridos. Por ejemplo, la composición puede incluir un antígeno sacárido capsular del: serogrupo C; serogrupos A y C; serogrupos A, C y W135; serogrupos A, C e Y; serogrupos C, W135 e Y; o de los cuatro serogrupos a saber, A, C, 135 e Y. Una cantidad típica de cada antígeno sacárido meningocócico por dosis está entre 1 µg y 20 µg, por ejemplo aproximadamente 1 µg, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µg, aproximadamente 5 µg o aproximadamente 10 µg (expresado como sacárido) . Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares provenientes de los serogrupos A y C, la proporción (peso/peso) del sacárido MenA: sacárido MenC puede ser mayor de (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y, y uno o ambos de los serogrupos C y W135, la proporción (p/p) de sacárido MenY : sacárido Men 135 puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o que la proporción (p/p) de sacárido MenY: sacárido MenC puede ser menor de 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o menor). Las proporciones preferidas (p/p) para los sacáridos provenientes de los serogrupos A:C: 135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1. Las proporciones preferidas (p/p) para los sacáridos provenientes de los serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Se prefiere utilizar una masa sustancialmente igual de cada sacárido. Los sacáridos capsulares serán en general utilizados en la forma de oligosacáridos. Éstos son convenientemente formados mediante fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo mediante hidrólisis), que usualmente será seguido por purificación de los fragmentos del tamaño deseado. La fragmentación de los polisacáridos es preferentemente realizada para dar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacárido de menos de 30 (por ejemplo entre 10 y 20, preferentemente alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferentemente alrededor de 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). DP puede ser convenientemente medido mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante ensayos colorimétricos [113]. Si la hidrólisis es realizada, el hidrolizado será en general ajustado el tamaño con el fin de eliminar los oligosacáridos de longitud corta [92]. Esto puede ser logrado de diversas formas, tales como ultrafiltración seguida por cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización de menos de o igual a aproximadamente 6 son preferentemente removidos para el serogrupo A, y aquellos de menos de alrededor 4 son preferentemente removidos para los serogrupos W135 e Y. Los antígenos sacáridos MenC preferidos son descritos en la referencia 112, como se utiliza en MenjugateMR. El antígeno sacárido puede ser químicamente modificado. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis para el serogrupo A [114; ver más adelante]. La des-O-acetilación de los sacáridos meningocócicos puede ser realizada. Para los oligosacáridos, la modificación puede tener lugar antes o después de la despolimerización. Donde una composición de la invención incluye un antígeno sacárido MenA, el antígeno es preferentemente un sacárido modificado en el cual uno o más de los grupos hidroxilo sobre el sacárido nativo han sido reemplazados por un grupo bloqueador [114]. Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis. Los polisacáridos capsulares meningocócidos son típicamente preparados mediante un proceso que comprende los pasos de precipitación de polisacárido (por ejemplo utilizando un detergente catiónico) , fraccionamiento con etanol, extracción con fenol frío (para eliminar la proteína) y ultracentrifugación (para retirar LPS) [por ejemplo referencia 115]. Un proceso más preferido [93], no obstante, involucra la precipitación del polisacárido, seguido por la solubílización del polisacárido precipitado utilizando un alcohol inferior. La precipitación puede ser lograda utilizando un detergente catiónico tal como las sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo las sales de bromuro) , o el bromuro de hexadimetrina y las sales de miristiltrimetilamonio . El bromuro de cetiltrimetilamonio ( ' CTAB ' ) es particularmente preferido [116]. La solubilización del material precipitado puede ser lograda utilizando un alcohol inferior tal como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar los complejos de CTAB-polisacárido . El etanol es preferentemente agregado al polisacárido precipitado para dar una concentración final (basada en el contenido total del etanol y el agua) de entre 50% y 95%. Después de la re-solubilización, el polisacárido puede ser además tratado para eliminar los componentes. Esto es particularmente importante en situaciones donde incluso la contaminación menor no es aceptable (por ejemplo para la producción de vacuna humana) . Esto involucrará típicamente uno o más pasos de filtración por ejemplo filtración en profundidad, puede ser utilizada filtración a través de carbón activado, filtración por tamaño y/o ultrafiltración . Una vez filtrado para eliminar los contaminantes, el polisacárido puede ser precipitado para el tratamiento y/o procesamiento posteriores. Esto puede ser convenientemente logrado mediante el intercambio de cationes (por ejemplo mediante la adición de sales de calcio o de sodio) . Como una alternativa a la purificación, los sacáridos capsulares pueden ser obtenidos mediante síntesis total o parcial, por ejemplo, la síntesis Hib es descrita en la referencia 117, y la síntesis MenA en la referencia 118. Las composiciones de la invención comprenden sacáridos capsulares provenientes de al menos dos serogrupos de N. meningi tidis . Los sacáridos son preferentemente preparados separadamente (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y luego mezclados para dar una composición de la invención. Donde la composición comprende sacárido capsular del serogrupo A, no obstante, se prefiere que el sacárido del serogrupo A no sea combinado con el o los otros sacáridos hasta poco antes del uso, con el fin de reducir al mínimo el potencial para la hidrólisis. Esto puede ser convenientemente logrado al tener el componente del serogrupo A (típicamente junto con los excipientes apropiados) en forma liofilizada y el otro u otros componentes del serogrupo en forma líquida (también con excipientes apropiados) con los componentes líquidos que son utilizados para reconstituir el componente MenA liofilizado cuando está listo para utilizarse. Donde se utiliza un adyuvante de sal de aluminio, se prefiere incluir el adyuvante en el frasco que contiene la vacuna líquida, y liofilizar el componente MenA sin el adyuvante. Una composición de la invención puede ser de este modo preparada a partir de un kit que comprende: (a) un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis serogrupo A, en forma liofilizada; y (b) los antígenos adicionales provenientes de la composición, en forma líquida. La invención también proporciona un método para preparar una composición de la invención, que comprende mezclar un sacárido capsular liofilizado de N. meningi tidis serogrupo A con los antígenos adicionales, en donde los antígenos adicionales están en forma líquida. La invención también proporciona un kit que comprende: (a) un primer recipiente que contiene sacáridos capsulares provenientes de dos o más de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningi tidis, todos en forma liofilizada; y (b) un segundo recipiente que contiene en forma líquida (i) una composición la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o más (por ejemplo, 2 ó 3) de las líneas hipervirulentas A4 , ET-5 y la línea 3 de N. meningi tidis serogrupo B, (ii) sacáridos capsulares provenientes de ninguno o uno de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningi tidis, y opcionalmente (iii) antígenos adicionales (ver más adelante) que no incluyen sacáridos capsulares de meningococo, en donde la reconstitución de los contenidos del recipiente (a) por los contenidos del recipiente (b) proporciona una composición de la invención. Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno sacárido individual estará en general entre 1-50 µg (medida como la masa de sacárido), con aproximadamente 2.5 µg, 5 µg o 10 µg de cada uno, que es preferida. Con las proporciones en peso A:C:W135:Y de 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1, por lo tanto, la cantidad representada por el número 1 es preferentemente aproximadamente 2.5 µg, 5 µg o 10 µg. Para una composición A:C:W:Y con proporción de 1:1:1:1 y 10 µg por sacárido, por lo tanto, son administrados 40 µg de sacárido por dosis. Las composiciones preferidas tienen aproximadamente los siguientes µg de sacárido por dosis: Las composiciones preferidas de la invención comprenden menos de 50 µg del sacárido del meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <40 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <30 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <25 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <20 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <10 µg de sacárido de meningococo por dosis pero, idealmente, las composiciones de la invención comprenden al menos 10 µg de sacárido de meningococo por dosis. Los conjugados MenjugateMR y NeisVacMR MenC utilizan un adyuvante de hidróxido, mientras que MeningitecMR utiliza un fosfato. Es posible, en las composiciones de la invención, adsorber algunos antígenos a un hidróxido de aluminio pero tener otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. Para las combinaciones de serogrupo tetravalente, por ejemplo, son disponibles las siguientes permutaciones: Para las combinaciones trivalentes del serogrupo de N. meningi tidis, son disponibles las siguientes permutaciones : Haemophil us infl uenzae tipo B Donde la composición incluye un antígeno de H. influenzae tipo b, éste será típicamente un antígeno sacárido capsular Hib. Los antígenos sacáridos provenientes de H. infl uenzae b son' bien conocidos. Ventajosamente, el sacárido Hib está covalentemente conjugado a una proteína portadora, con el fin de aumentar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de los conjugados polisacáridos en general, y del polisacárido capsular Hib en particular, está bien documentada [por ejemplo las referencias 119 a 127, etc.]. La invención puede utilizar cualquier conjugado de Hib adecuado. Las proteínas portadoras adecuadas son descritas más adelante, y los portadores preferidos para los sacáridos de Hib son CRM19-7 (?bOC), toxoide tetánico ( ' PRP-T ' ) y el complejo de la membrana externa de N. meningi tidis ('PRP-OMP'). La porción sacárida del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo fosfato de polirribosilribitol (PRP), de longitud completa) pero se prefiere hidrolizar los polisacáridos para formar oligosacáridos (por ejemplo modalidad preferida de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 kDa) . Un conjugado preferido comprende un oligosacárido Hib covalentemente enlazado a CRM?97 vía un enlazador de ácido adípico [128, 129]. El toxoide tetánico es también un portador preferido. Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib. Donde una composición incluye un antígeno sacárido Hib, se prefiere que ésta no incluya tampoco un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio, entonces el antígeno Hib puede ser adsorbido al adyuvante [130] o éste puede ser no adsorbido [131].

Los antígenos Hib pueden ser liofilizados, por ejemplo, junto con antígenos meningocócicos .

Streptococcus pneumoniae Donde la composición incluye un antígeno de S. pneumoniae, éste será típicamente un antígeno sacárido capsular, el cual está preferentemente conjugado a una proteína portadora [por ejemplo referencias 94-96]. Se prefiere incluir sacáridos provenientes de más de un serotipo de S . pneumoniae . Por ejemplo, mezclas de polisacáridos de los 23 serotipos diferentes son ampliamente utilizadas, como lo son las vacunas conjugadas con polisacáridos provenientes de entre 5 y 11 serotipos diferentes [132]. Por ejemplo, PrevNarMR [133] contiene antígenos provenientes de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F) con cada sacárido individualmente conjugado a CRM?97 mediante aminación reductiva, con 2 µg de cada sacárido o dosis de 0.5 mi (4 µg del serotipo 6B) , y con los conjugados adsorbidos sobre un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen preferentemente al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden ser adsorbidos sobre un fosfato de aluminio. Como una alternativa al uso de los antígenos sacáridos provenientes de pneumococcus, la composición puede incluir uno o más antígenos polipeptídicos . Las secuencias genómicas para varias cepas de pneumococcus son disponibles [134, 135] y pueden ser sometidas a vacunología inversa [136-139] para identificar los antígenos polipeptídicos adecuados [140, 141]. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SpIOl, Spl28 y Spl30, como se define en la referencia 142. En algunas modalidades, la composición puede incluir antígenos sacáridos y polipeptídicos provenientes de pneumococcus. Éstos pueden ser utilizados en mezcla simple, o el antígeno sacárido neumocócico puede ser conjugado a una proteína de neumococo. Las proteínas portadoras adecuadas para tales modalidades incluyen los antígenos listados en el párrafo previo [142]. Los antígenos de neumococos pueden ser liofilizados, por ejemplo, junto con antígenos de meningococos y/o de Híb.

Conjugación covalente Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención usualmente serán conjugados a una o varias proteínas portadoras. En general, la conjugación aumenta la inmunogenicidad de los sacáridos ya que ésta los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo el aprestamiento para la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisada en las referencias 143 y 119-127]. Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como el toxoide de la difteria o el toxoide del tétanos. La toxina de la difteria mutante CRM197 [144, 145, 146] es particularmente preferida. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningi tidis [147], péptidos sintéticos [148, 149], proteínas de choque térmico [150, 151], proteínas de pertusis [152, 153], proteína D de H. infl uenzae [154, 155], citocinas [156], linfocinas [156], proteínas artificiales que comprenden epitopos de células T CD4+, humanas, múltiples, provenientes de diversos antígenos, derivados de patógenos [157], proteínas de streptococcus, hormonas [156], factores de crecimiento [156], proteína PspA de la superficie del neumococo [158], toxina A o B de C. difficile [159], proteínas de captación de hierro [160], etc. Una proteína portadora preferida es CRM197. Dentro de una composición de la invención, es posible utilizar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de supresión del portador. De este modo, diferentes proteínas portadoras pueden ser utilizadas para diferentes serogrupos, por ejemplo los sacáridos del serogrupo A pueden ser conjugados a CRM197, mientras que los sacáridos del serogrupo C pueden ser conjugados al toxoide tetánico. Es también posible utilizar más de una proteína portadora para un antígeno sacárido particular por ejemplo los sacáridos del serogrupo A pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM197 y otros conjugados al toxoide tetánico. En general, no obstante, se prefiere utilizar la misma proteína portadora para todos los sacáridos. Una proteína portadora simple puede llevar más de un antígeno sacárido [161]. Por ejemplo, una proteína portadora simple puede tener conjugados a ésta, los sacáridos provenientes de los serogrupos A y C. Para lograr esta meta, los sacáridos pueden ser mezclados antes de la reacción de conjugación. En general, no obstante, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo. Los conjugados con una proporción sacárido : proteína (p/p) de entre 1:5 (por ejemplo proteína en exceso) y 5:1 (por ejemplo sacárido en exceso) son preferidos. Son preferidas las proporciones entre 1:2 y 5: 1, como lo son las proporciones entre 1:1.25 y 1:2.5 que son más preferidas. La proteína portadora en exceso es preferida para MenA y MenC. Los conjugados pueden ser utilizados en conjunto con la proteína portadora libre [162]. Cuando una proteína portadora dada está presente en forma libre y conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferentemente no mayor de 5% de la cantidad total de la proteína portadora en la composición, como un todo, y más preferentemente al menos de 2% en peso. Puede ser utilizada cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado, donde sea necesario. El sacárido será activado típicamente o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridinio [163, 164, etc.]). Otras técnicas adecuadas utilizan carbodiimidas, hidrazidas, esteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver también la introducción a la referencia 125. Los enlaces via un grupo ligador pueden ser realizados utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 165 y 166. Un tipo de enlace involucra la aminación reductiva del polisacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador de ácido adípico, y luego el acoplamiento de una proteína al otro extremo del grupo ligador de ácido adípico [123, 167, 168]. Otros ligadores incluyen B-propionamido [169] nitrofenil-etilamina [170], haluros de haloacilo [171], enlaces glucosídicos [172], ácido 6-aminocaproico [173], ADH [174], las porciones de 4 a 12 átomos de carbono [175] etc. Como una alternativa al uso de un ligador, puede ser utilizado un enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender la oxidación del polisacárido, seguido por la aminación reductiva con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 176 y 177. Un proceso que involucra la introducción de grupos amino dentro del sacárido (por ejemplo mediante el reemplazo de los grupos =0 terminales con -NH2) seguido por derivatización con un diéster adípico (por ejemplo el diéster de N-hidroxisuccinimido del ácido adípico) y la reacción con la proteína portadora, es preferido. Otra reacción preferida utiliza la activación con CDAP con una proteína D portadora, por ejemplo para MenA o MenC. Después de la conjugación, los sacáridos libres y conjugados pueden ser separados. Existen muchos métodos adecuados que incluyen la cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [ver también las referencias 178 y 179, etc.]. Donde la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación del oligosacárido preceda la conjugación.

Vesículas membranales externas Se prefiere que las composiciones de la invención no deben incluir mezclas complejas o no definidas de los antígenos, que son características típicas de los OMVs . No obstante, la invención puede ser utilizada en conjunto con OMVs, ya que se ha encontrado que NMB1870 aumenta su eficacia [6], en particular por la sobre-expresión de los polipéptidos de la invención en las cepas utilizadas para la preparación de OMV. Este procedimiento puede ser utilizado en general para mejorar las preparaciones de microvesículas de N. meningi tidis serogrupo B [180], OMVs nativos' [181], burbujas o vesículas de membrana externa [por ejemplo referencias 182 a 187, etc.]. Éstas pueden ser preparadas a partir de bacterias que han sido genéticamente manipuladas [188-191] por ejemplo para incrementar la inmunogenicidad (por ejemplo hiper-expresar inmunógenos) , para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacáridos capsulares, para subregular la expresión de PorA, etc. Éstos pueden ser preparados a partir de las cepas hiperformadoras de vesículas o burbujas [192-195]. Las vesículas provenientes de una Neisseria no patógena pueden ser incluidas [196]. Los OMVs pueden ser preparados sin el uso de detergentes [197, 198]. Éstas pueden expresar proteínas no Neisseriales sobre su superficie [199]. Éstas pueden estar agotadas en LPS. Éstas pueden ser mezcladas con antígenos recombinantes [182, 200]. Las vesículas provenientes de bacterias con diferentes subtipos de proteína membranal externa de la clase I, pueden ser utilizadas, por ejemplo seis subtipos diferentes [201, 202] utilizando dos diferentes poblaciones de vesículas manipuladas por ingeniería, cada una mostrando tres subtipos, o nueve subtipos diferentes utilizando tres diferentes poblaciones de vesículas manipuladas por ingeniería genética, cada una mostrando tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen: Pl.7,16; Pl.5-1, 2-2; Pl.19, 15-1; Pl.5-2,10; Pl.12-1, 13; Pl.7-2,4; Pl.22,14; Pl.7-1,1; Pl.18-1, 3, 6.

Expresión de proteínas Las técnicas de expresión bacteriana son conocidas en la materia. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazarse a la ARN-polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción corriente abajo (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo el gen estructural) en mARN . Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que está usualmente colocado próximo al extremo 5 ' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de la transcripción incluye usualmente un sitio de enlace a la ARN-polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener "un segundo dominio llamado un operador, el cual puede traslaparse a un sitio de enlace a la ARN-polimerasa, adyacente, en el cual comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada negativa (inducible) , ya que una proteína represora de genes puede enlazarse al operador y con esto inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede ser lograda por una secuencia de enlace a la proteína activadora de genes, la cual, si está presente es usualmente (5') proximal a la secuencia de enlace al ARN-polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolitos (CAP) , la cual ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escheri chia coli (E. coli ) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet . 18: 173]. La expresión regulada puede ser por lo tanto positiva o negativa, con lo cual se aumenta o se reduce la transcripción. Las secuencias que codifican para las enzimas de la vía metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de azúcar, tales como galactosa, lactosa . ( lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofano ( trp) [Goeddel et al. (1980) Ntic. Acids Res. 5: 4057; Yelverton et al. (1981) Nml .

Acids Res. 9: 731; Patente de los Estados Unidos No. 4,738,921; Patentes Europeas EP-A-0036776 y EP-A-0121775] . El sistema promotor de ß-lactamasa (bla ) [Weissmann (1981) "The cloning of inferieron and other mistakes." In Inferieron 3 (ed. I. Gresser)], el bacteriófagoe lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128] y T5 [Patente de los Estados Unidos No. 4,689,406] como sistemas promotores también proporcionan secuencias promotoras útiles. Otro promotor de interés es un promotor de arabinosa inducibles (pBAD) . Además, los promotores sintéticos que no aparecen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden ser unidas con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [Patente de los Estados Unidos No. 4,551,433]. Por ejemplo, el promotor ta c es un promotor trp-la c híbrido comprendido del promotor trp y de las secuencias del operón la c que es regulado por el represor lac [A ann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. 80: 21], Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural, de origen no bacteriano que tienen la habilidad para enlazarse a la ARN-polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano puede ser también acoplado con una ARN-polimerasa compatible, para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotes. El sistema de polimerasa/promotor de ARN del bacteriófago T7, es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc Nati Acad. Sci. 52: 1074]. Además, un promotor híbrido puede también estar comprendido de un promotor bacteriófago y una región operadora de E . coli (EPO-A-0 267 851) . Además de una secuencia promotora del funcionamiento, un sitio de enlace al ribosoma, eficiente es también útil para la expresión de los genes extraños en procariotes. En E. coli , el sitio de enlace al ribosoma es llamado la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3 a 9 nucleótidos en longitud localizada de 3 a 11 nucleótidos con dirección 5' del codón de inicio. Se piensa que la secuencia SD promueve el enlace de ARN al ribosoma por el apareamiento de las bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del rARN 16S de E . coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger) ] . Para expresar los genes eucarióticos y los genes procarióticos con sitio de enlace al ribosoma, débil [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una secuencia promotora puede estar directamente enlazada con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N será siempre una metionina, que es codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N puede ser escindida de la proteína mediante incubación in vi tro con bromuro de cianógeno y ya sea mediante incubación in vivo o in vi tro con una peptidasa N-terminal de metionina, bacteriana (EP-A-0219237 ) . Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias, son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de detención de la traducción, y de este modo conjuntamente con el promotor flanquean las secuencias de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mARN que puede ser traducido en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción frecuentemente incluyen secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos, capaces de formar estructuras de bucle de tallo que ayudan a la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli , así como otros genes biosintéticos . Usualmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, la secuencia de señal (si se desea), la secuencia de codificación de interés, y la secuencia de terminación de la transcripción, son colocados juntos dentro de las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión son a menudo mantenidas en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaces de realizar el mantenimiento estable en un hospedero, tales como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiéndole de este modo ser mantenido en un hospedero procariótico ya sea para la expresión o para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de alto o bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias tendrá en general un número de copias en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y usualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedero que contiene un plásmido de alto número de copias contendrá preferentemente al menos 10, y más preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Un vector de alto o de bajo número de copias puede ser seleccionado, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña en el hospedero. Alternativamente, las construcciones de expresión pueden ser integradas dentro del genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen usualmente al menos una secuencia homologa al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con el ADN proveniente de diversas cepas de Bacilus, se integran dentro del cromosoma de Bacillus (EP-A-0127328 ) . Los vectores de integración pueden estar también comprendidos de secuencias de bacteriófagos o de transposones. Usualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas. Los marcadores seleccionables pueden ser expresados en el hospedero bacteriano y pueden incluir genes que hacen resistente a la bacteria contra los fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Los marcadores seleccionables pueden también incluir genes biosintéticos, tales como aquellos en las vías biosintéticas de la histidina, triptofano y leucina. Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden ser colocados juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están usualmente comprendidos de un marcador seleccionable que es ya sea mantenido en un replicón o desarrollado en un vector de integración, como se describió anteriormente. Los vectores de expresión y de transformación, ya sea replicones extracromosómicos o vectores de integración, han sido desarrollados para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, los vectores de expresión han sido desarrollados para, entre otras las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 79: 5582; EP-A-0, 036, 259 y EP-A-0, 063, 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. 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General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo x+10%. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. "Identidad secuencial" es preferentemente determinada por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como es implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , utilizando una búsqueda de espacio vacío afín, con los parámetros de pena lidad por abertura de espa cio va cio = 12 y penalidad por extensión de espa cio va cío = 1 . Después del serogrupo, la clasificación del meningococo incluye el serotipo, el serosubtipo y luego el inmunotipo, y la nomenclatura estándar lista el serogrupo, serotipo, serosubtipo e inmunotipo, cada uno separado por el signo de puntuación dos puntos (:) por ejemplo B: 4 : Pl .15 : L3, 7 , 9. Dentro del serogrupo B, algunas líneas provocan enfermedad frecuentemente (hiperinvasoras) , algunas líneas provocan formas más severas de la enfermedad que otras (hipervirulentas) y otras raramente provocan enfermedad del todo. Siete líneas hipervirulentas son reconocidas, a saber los grupos I, III y IV-1, el complejo ET-5, el complejo ET- 37, el grupo A4 y la línea 3. Éstas han sido definidas por electroporesis enzimática multilocus (MLEE) , pero la tipificación de secuencia multilocus (MLST) ha sido también utilizada para clasificar los eningococos [referencia 18] . Los cuatro grupos hipervirulentos principales son los complejos ST32, ST44, ST8 y STll. En general, la invención no abarca las diversas secuencias de NMB1870 específicamente descritas en las referencias 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 203, aunque éstas secuencias de MB1870 pueden ser utilizadas de acuerdo a la invención, por ejemplo para la construcción de secuencias quiméricas, etc.

MODALIDADES DE LA INVENCIÓN Sustituciones La SEQ ID NO: 59 es descrita en la referencia 13 como una quimera de NMB1870 proveniente de las familias I, II y III. Este polipéptido es derivado por sustituciones en siete regiones de la SEQ ID NO: 1, identificadas enseguida: MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG 1RHIGLAAKQ(SEQIDN0:1) Aunque esta quimera produjo anticuerpos que fueron bactericidas contra meningococos de cada familia de NMB1870, las respuestas contra las cepas de la familia II y la familia III no fueron consistentemente altas. Al combinar diversos procedimientos, incluyendo una estructura tridimensional derivada por resonancia magnética nuclear del dominio BC de un polipéptido de la familia I, los inventores encontraron que los residuos 162-168 (segunda región subrayada) están rodeados por un parche de aminoácidos que están conservados entre meningococos MC58 (familia I) y 2996 (familia II) . De este modo, la sustitución creó un área extensa similar a 2996 sobre la superficie del polipéptido MC58, lo cual podría explicar porqué las quimeras que incluyen esta sustitución podrían promover una respuesta bactericida contra las cepas de la familia II. La sustitución en la tercera región subrayada (ProAsn en vez de AlaGly) probablemente alteró la conformación de la cadena principal local, introduciendo un alto grado de rigidez que alteró el plegamiento del polipéptido y redujo la actividad bactericida. Con base en una comparación de (i) los alineamientos de secuencia dentro de la familia II, y (ii) la reactividad cruzada sérica intra-familias, fueron identificados un número de residuos de aminoácidos que podrían mejorar la habilidad de una quimera para promover una buena respuesta anti-II. Estos residuos son: (a) expuestos superficialmente, basados en la estructura de RMN, y así pues son inmunoaccesibles; (b) conservados dentro de las cepas de la familia II que no fueron muertas por los sueros anti-2996; y (c) no en la bolsa hidrofóbica de proteína. Numerados de acuerdo a la SEQ ID NO: 2, estos residuos fueron: D121; D165; A180; G181; K183; T185; T187; A191; A192; H196; K198; A213; S234; y G261. Excepto para D121 y D165, cada uno de estos residuos fueron conservados en tres cepas que fueron resistentes a los antisueros producidos contra la secuencia 2996. D121 es N en una de las tres cepas, y D165 es S en dos de las tres cepas. De este modo, la SEQ ID NO: 57 fue alterada para dar la SEQ ID NO: 60, la cual estuvo presente como parte de una secuencia NMB1870 de longitud completa. La secuencia de 7-mer KLPEGGR (SEQ ID NO: 61) en la SEQ ID NO: 57, fue reemplazada con 6-mer de QLPDGK (SEQ ID NO: 62) . De este modo, un aminoácido está suprimido. Dependiendo de cómo estén alineadas estas dos secuencias, entonces el residuo suprimido puede ser identificado como E51, G52, G53 o R54. El resultado final no depende de cuál residuo esté nominalmente suprimido sino que, con base en el alineamiento en la referencia 4, el residuo suprimido es mejor descrito como E51. Polipéptidos en tándem Como se describe en la referencia 12, un triple tándem de las tres familias NMB1870 fue preparado con las tres familias ordenadas I-III-II, desde el extremo N hasta el extremo C. Con o sin un marcador de histidina C-terminal, este polipéptido produjo respuestas inmunes que fueron excelentes contra meningococos que tenían un NMB1870 en las familias I y III (títulos bactericidas séricos >1:128 fueron típicamente observados contra 100% de las cepas probadas), pero las respuestas fueron más débiles contra las cepas en la familia II de NMB1870 (títulos >1:128 típicamente observados contra 60% de las cepas probadas) . En particular, las respuestas fueron más bajas cuando se utiliza el polipéptido en tándem que cuando se utiliza una mezcla de las tres proteínas separadas. En contraste, un tándem II-III dio buenos resultados, de modo que la secuencia de la familia II no es inherentemente incompatible con el procedimiento de expresión en tándem. Las respuestas contra las familias I y II son importantes, pero las cepas de la familia III son relativamente raras. Para mejorar la eficacia contra las cepas de la familia II, tres procedimientos han sido utilizados ahora: (a) el orden de las familias fue alterado, para ser I-II-III, II-III-I o II-I-III; (b) la secuencia de la familia III fue omitida, y las familias I y II fueron expresadas ya sea como I-II o como II-I; o (c) las familias I y II fueron expresadas con dirección 3' en una 'secuencia de proteína 936', ya sea como 936-I-II o como 936-II-I. Estos polipéptidos fueron expresados con varios ligadores, guías, etc., y con/sin un marcador poli-His C-terminal. Las modalidades de estos tres procedimientos se dan en las SEQ ID NOs: 27 a 38: Estas proteínas fueron utilizadas para inmunizar ratones. Fueron probados diferentes adyuvantes, incluyendo adyuvante completo de Freund, un adyuvante de hidróxido de aluminio, emulsión aceite en agua de MF59, y una mezcla de MF590 y un oligonucleótido inmunoestimulador . Los sueros de ratones fueron probados en ensayos bactericidas. En general, las SEQ ID NOs: 28 y 29 fueron igualmente efectivas. La SEQ ID NO: 34 algunas veces mostró mejor actividad que la SEQ ID NO: 28. Para las proteínas que incluyen las tres familias, los mejores resultados fueron en general observados con la SEQ ID NO: 37.

Secuencias de la familia II 5 diferentes cepas en la familia II de NMB1870 fueron seleccionadas: M3153, M00-0243143; 1000, NGH38 y M0579. Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar los fragmentos para insertarse dentro de los sitios Ndel/Xhol de un vector de expresión pET de E . coli . Las secuencias fueron amplificadas como secuencias ?G; en las secuencias "chim?G", el cebador agregó la SEQ ID NO: 66 al extremo N. Los cebadores delanteros proporcionaron un sitio Ndel; los cebadores inversos proporcionaron un sitio Xhol.

Nuevas secuencias de NMB1870 La extensa información de secuencias para NMB1870 está disponible [por ejemplo referencias 4, 7, 8 y 10] . Han sido encontradas nuevas secuencias de NMB1870 adicionales. Estas secuencias son las SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 63, 64, 65, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 y 94. Los sueros producidos contra diferentes proteínas de NMB1870 fueron probados contra la cepa MN117. La actividad bactericida fue menor para los sueros producidos contra proteínas en las familias I, II o III que para el suero homólogo. Similarmente, los sueros producidos contra la secuencia NM117 tuvieron una actividad de SBA relativamente baja contra las cepas en las familias I, II o III de NMB1870. Se entenderá que la invención es descrita anteriormente mencionada a manera de ejemplo únicamente, y pueden ser realizadas modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención. REFERENCIAS (los contenidos de las cuales se incorporan por referencia totalmente en la presente) [1] Jodar et al. (2002) Lancet 359 ( 9316) : 1499-1508. [2] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820. [4] Masignani et al (2003) J Exp Med 197:789-799. [5] Welsch et al. (2004) J Immunol 172:5605-15. [6] Yion et al. (2005) J Infect Dis 192(4) :580-90. [7] WO03/063766. [8] Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100. [9] Zhu et al. (2005) Infect Immun 73 ( 10 ): 6838-45. [10] WOO 1/64920. [11] WO03/020756. [12] WO2004/048404. [13] WO2006/024954. [14] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48, 443-453. [15] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277. [16] Achtman (1995) Global epidemiology of meningococcal disease . Pages 159-175 of Meningococcal disease (ed.

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Patente de los Estados Unidos 4,761,283

[177] Patente de los Estados Unidos 4,356, 170 [178] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264. [179] WO00/38711; Patente de los Estados Unidos 6,146,902.

[180] WO02/09643. [181] Katial et al. (2002) Infect Immun 70:702-707. [182] WO01/52885. [183] Patente Europea 0301992. ' [184] Bjune et al (1991) Lancet 338 (8775) : 1093-1096. [185] Fukasawa et al. (1999) Va ccine 17:2951-2958. [186] WO02/09746. [187] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol . Stand. 92:323-333

[188] WO01/09350. [189] Patente Europea 0449958. [190] EP-A-0996712. [191] EP-A-0680512. [192] WO02/062378. [193] W099/59625. [194] Patente de los Estados Unidos 6,180, 111. [195] WO01/34642. [196] WO03/051379. [197] Patente de los Estados Unidos 6,558,677. [198] WO2004/019977. [199] WO02/062380. [200] WO00/25811. [201] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015.

[202] Vermont etal. (2003) Infecí Immun 71:1650-1655. [203] WO2004/094596 BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad a la SEQ ID No.: 57, y caracterizado porque uno o más de los siguientes residuos está ya sea sustituido con otro aminoácido o está suprimido: F14; T16; Q18; Q20; D21; S22; E23; H24; S25; G26; K27; K31; Q33; R35; 136; G37; 139; K48; E51; G52; R54; T56; A67; G68; K70; T72; A78; A79; N83; K85; D97; D102; P105; G107; R109; S114; S116; L118; N120; Q121; A122; K135; T147; V148; N149; G150; 1151; R152; H153.
2. 2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de los siguientes residuos está sustituido o suprimido: F14; T16; Q18; Q20; D21; S22; E23; H24; S25; G26; K27; K31; Q33; R35; 136; G37; K48; E51; G52; R54; T72; A79; K85; P105; G107; R109; L118; N120; Q121; A122; T147; V148; N149; G150; 1151; R152; H153.
3. 3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque E51 está suprimido.
4. 4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de los siguientes residuos está sustituido: F14; T16; Q18; K31; Q33; R35; 136; G37; 139; T56; K70; T72; A78; A79; K85; D97;-D102; S114; S116; L118; K135.0
5. 5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2 o 4, caracterizado porque comprende una sustitución seleccionada de: F14L; T161; Q18K; Q20N; D21N; S22P; E23D; H24K; S25I; S25T; G26D; K27S; K31Q; Q33S; R35L; I36V; G37S; I39L; K48Q; G52D; R54K; T56E; A67P; G68N; K70R; T72H; A78T; A79K; N83H; N83Y; K85R; D97E; D102E; P105A; G107E; R109S; S114L; S116D; L118R; N120G; Q121S; A122E; K135R; T147I; V148G; N149E; G150K; I151V; R152H; H153E.
6. 6. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos tiene al menos 80% de identidad a la SEQ ID NO: 57.
7. 7. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos tiene al menos 90% de identidad a la SEQ ID NO: 57.
8. 8. El polipéptido de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 60.
9. 9. Un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia modificada de aminoácidos de una primera familia de NMB1870, en donde la secuencia modificada incluye al menos una (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7) secuencias de bucle superficial provenientes de una segunda familia de NMB1870, en lugar de una secuencia de bucle superficial proveniente de la primera familia.
10. 10. Un polipéptido que proporciona una secuencia de aminoácidos: -B?-L?-B2-L2-B3-L3-B -L4-B5-L5-B6-L6-B -L7-B8-L8-B9-caracterízado porque: (a) cada uno de Bi, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8 y B9 es: (i) un fragmento de la SEQ ID No.: M; o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad secuencial al fragmento de (i) y/o que comprende un fragmento de al menos diez aminoácidos contiguos provenientes del fragmento de (i) ; (b) cada uno de Li, L2, L3, L4, L5, L6, L7 y L8 es: (i) un fragmento de las SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2 y/o de la SEQ ID No.:- 3; o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad secuencial al fragmento de (i) y/o que comprende un fragmento de al menos diez aminoácidos contiguos provenientes del fragmento de (i), con la condición de que al menos de Li, L2, L3, L4, L5, L6, L7 y L8 no sea un fragmento de la SEQ ID No. : M. en donde M es 1, 2 ó 3, y Bi, B2, B3, B4, B5, B6, B7, Be, B9, Li, L2, L3, L4, L5, e, L7, L8 son seleccionados como sigue, dependiendo de M:
11. 11. Un fragmento del polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el fragmento incluye al menos uno de Lx, L2, L3, L4, L5, L6, L7 y/o L8 y al menos un aminoácido proveniente de dos o más de Bi, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8 y/o B9.
12. 12. Un polipéptido, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos quimérica: -B?-L?-B2-L2-B3-L3-B4 L-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9- de conformidad con la reivindicación 10 u 11, y que comprende además, ya sea N-terminal a o C-terminal a la secuencia quimérica, una secuencia NMB1870, en donde la secuencia NMB1870 está en la misma familia NMB1870 que la SEQ ID NO: M.
13. 13. Un polipéptido híbrido de la fórmula: -A-[-X-L-]n-B- caracterizado porque: X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia Neisserial, L es una secuencia de aminoácidos ligadora, opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal, opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal, opcional, y n es 2 o más, en donde al menos una de las porciones -X- es una secuencia NMB1870.
14. 14. El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40.
15. 15. El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque al menos una de las porciones -X- tiene al menos 90% de identidad secuencial a la SEQ ID NO: 95.
16. 16. Un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 y 94.