ES2325465T3 - Proteina de superficie de neisseria meningitidis resistente a la proteinasa k. - Google Patents
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Abstract
UN ANTIGENO ALTAMENTE CONSERVADO, INMUNOLOGICAMENTE ACCESIBLE EN LA SUPERFICIE DE LOS ORGANISMOS NEISSERIA MENINGITIDIS. COMPOSICIONES Y METODOS INMUNOTERAPEUTICOS, PROFILACTICOS Y DIAGNOSTICOS UTILES EN EL TRATAMIENTO, PREVENCION Y DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR NEISSERIA MENINGITIDIS. UNA PROTEINA DE SUPERFICIE DE NEISSERIA MENINGITIDIS RESISTENTE A LA PROTEINASA K, QUE TIENE UN PESO MOLECULAR APARENTE DE 22 KDA, LAS CORRESPONDIENTES SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y DE AMINOACIDOS DERIVADAS (SEQ ID N0:1, NO:3, NO:5 Y NO:7; SEQ ID N0:2, NO:4, NO:6 Y NO:8), METODOS DE ADN RECOMBINANTE PARA LA PRODUCCION DE LA PROTEINA DE SUPERFICIE DE 22 KDA DE NEISSERIA MENINGITIDIS Y ANTICUERPOS QUE SE UNEN A LA PROTEINA DE SUPERFICIE DE 22 KDA DE NEISSERIA MENINGITIDIS.
Description
Proteína de superficie de Neisseria
meningitidis resistente a la proteinasa K.
La presente invención se refiere a un antígeno
altamente conservado e inmunológicamente accesible en la superficie
de organismos de Neisseria meningitidis, tal y como se define
en las reivindicaciones. Este antígeno único proporciona la base
para nuevos agentes profilácticos y diagnósticos útiles en el
tratamiento, prevención y diagnóstico de enfermedades producidas
por Neisseria meningitidis, tal y como se define en las
reivindicaciones. Más particularmente, esta invención se refiere a
una proteína de superficie de Neisseria meningitidis
resistente a la proteinasa K que tiene un peso molecular aparente de
22 kDa, las correspondientes secuencias nucleotídicas y de
aminoácidos derivadas (SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 26), métodos de ADN
recombinante para la producción de la proteína de superficie de 22
kDa de Neisseria meningitidis, anticuerpos que se unen a la
de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis y
procedimientos y composiciones para el diagnóstico, tratamiento y
prevención de enfermedades producidas por Neisseria
meningitidis, tal y como se define en las reivindicaciones.
Neisseria meningitidis es una causa
importante de muerte y morbididad en todo el mundo. Neisseria
meningitidis causa enfermedades tanto endémicas como
epidémicas, principalmente meningitis y meningococcemia [Gold,
Evolution of meningococcal disease, pág. 69, Vedros N.A., CRC Press
(1987); Schwartz y col., Clin. Microbiol. Rev., 2, p. S118 (1989)].
De hecho, este organismo es una de las causas más frecuentes,
después del Haemophilus influenzae tipo b, de meningitis
bacteriana en Estados Unidos, donde representa aproximadamente el
20% de todos los casos. Se ha documentado que la actividad
bactericida en suero es el principal mecanismo de defensa contra
Neisseria meningitidis y que la protección contra la invasión
por la bacteria se correlaciona con la presencia en el suero de
anticuerpos anti-meningococo [Goldschneider y col.,
J. Exp. Med. 129, pág. 1307 (1969); Goldschneider y col., J. Exp.
Med., 129, pág. 1327 (1969)].
Neisseria meningitidis está subdividida
en grupos serológicos de acuerdo con la presencia de antígenos
capsulares. En la actualidad se han reconocido 12 serogrupos, pero
los más frecuentes son los serogrupos A, B, C, Y y
W-135. Dentro de los serogrupos se pueden
identificar serotipos, subtipos e inmunotipos sobre las proteínas y
lipopolisacáridos de la membrana externa.
Las vacunas de polisacárido capsular disponibles
en la actualidad no son eficaces contra todos los aislamientos de
Neisseria meningitidis y no inducen de forma eficaz la
producción de anticuerpos protectores en lactantes pequeños
[Frasch, Clin. Microbiol. Rev. 2, pág. S134 (1989); Reingold y col.,
Lancet, pág. 114 (1985); Zollinger, en Woodrow y Levine, New
generation vaccines, pág. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)].
Actualmente, el polisacárido capsular de los serogrupos A, C, Y y
W-135 se usa en las vacunas contra este organismo.
Estas vacunas con polisacárido son eficaces a corto plazo, no
obstante, los sujetos vacunados no desarrollan una memoria
inmunológica por lo que han de ser revacunados en el plazo de un
periodo de tres años para mantener su nivel de resistencia.
Además, estas vacunas polisacáridas no inducen
suficientes niveles de anticuerpos bactericidas para obtener la
protección deseada en niños menores de dos años de edad, que son las
víctimas principales de esta enfermedad. En la actualidad no se
dispone de ninguna vacuna eficaz contra aislamientos del serogrupo
B, aunque estos organismos sean una de las principales causas de
las enfermedades meningocóccicas en los países desarrollados.
De hecho, el polisacárido del serogrupo B no es
un buen inmunógeno, ya que sólo induce una mala respuesta de IgM de
especificidad baja que no es protectora [Gotschlich y col., J. Exp.
Med., p. 129, 1349 (1969); Skevakis y col., J. Infect. Dis., 149,
pág. 387 (1984); Zollinger y col., J. Clin. Invest., 63, pág. 836
(1979)]. Además, la presencia de estructuras de reacción cruzada
estrechamente similares en las glicoproteínas del tejido cerebral
humano de neonatos [Finne y col., Lancet, pág. 355 (1983)] podría
desalentar los intentos de mejorar la inmunogenicicidad del
polisacárido del serogrupo B.
Para obtener una vacuna más eficaz se están
investigando otros antígenos de superficie de Neisseria
meningitidis tales como lipopolisacárido, proteínas de los
pelos y proteínas presentes en la membrana externa. Se ha demostrado
la presencia de una respuesta inmunitaria humana y de anticuerpos
bactericidas contra ciertos de estos antígenos de superficie
proteináceos en los sueros de voluntarios inmunizados y pacientes
convalecientes [Mandrell y Zollinger, Infect. Immun., 57, pág. 1590
(1989); Poolman y col., Infect. Immun., 40, pág. 398 (1983);
Rosenquist y col., J. Clin. Microbiol., 26, pág. 1543 (1988);
Wedege y Froholm, Infect. Immun. 51, pág. 571 (1986); Wedege y
Michaelsen, J. Clin. Microbiol., 25, pág. 1349 (1987)]. Además,
también se ha comunicado que los anticuerpos monoclonales dirigidos
contra proteínas de la membrana externa tales como de clase 2, 2/3 y
5 son bactericidas y protegen contra infecciones experimentales en
animales [Brodeur y col., Infec. Immun., 50, pág. 510 (1985);
Frasch y col, Clin. Invest. Med., 9, pág. 101 (1986); Saukkonen y
col. Microb. Pathogen., 3, pág. 261 (1987); Saukkonen y col.,
Vaccine, 7, pág. 325 (1989)].
Las preparaciones antigénicas basadas en las
proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis
han demostrado que poseen efectos inmunogénicos en animales y en
seres humanos, y algunos de ellos se han probado en ensayos
clínicos [Bjune y col., Lancet, pág. 1093 (1991); Costa y col., NIPH
Annals, 14, pág. 215 (1991); Frasch y col., Med. Trop., 43, pág.
177 (1982); Frasch y col., Eur. J. Clin. Microbiol., 4, pág. 533
(1985); Frasch y col. en Robbins, Bacterial Vaccines, pág. 262,
Praeger Publications, N.Y. (1987); Frasch y col., J. Infect. Dis.,
158, pág. 710 (1988); Moreno y col. Infec. Immun., 47, pág. 527
(1985); Rosenqvist y col., J. Clin. Microbiol., 26, pág. 1543
(1988); Sierra y col., NIPH Annals, 14, pág. 195 (1991); Wedege y
Froholm, Infec. Immun. 51, pág. 571 (1986); Wedege y Michaelsen, J.
Clin. Microbiol., 25, pág. 1349 (1987); Zollinger y col., J. Clin.
Invest., 63, pág. 836 (1979); Zollinger y col., NIPH Annals, 14,
pág. 211 (1991)]. No obstante, la existencia de una gran
variabilidad antigénica entre cepas en las proteínas de la membrana
externa puede limitar su uso en las vacunas [Frasch, Clin. Microb.,
Rev. 2, pág. S134 (1989)].De hecho, la mayoría de estas
preparaciones indujo anticuerpos bactericidas que estaban
restringidos al mismo serotipo o a uno relacionado a partir del
cual se extrajo el antígeno [Zollinger en Woodrow y Levine, New
Generation Vaccines, pág. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)].
Además, la protección conferida por estas vacunas en niños pequeños
todavía ha de establecerse con claridad. Las proteínas de la
membrana externa de Neisseria meningitidis altamente
conservadas tales como la clase 4 Munkley y col. Microb. Pathogen.,
11, pág. 447 (1991)] y la proteína lip (también denominada H.8)
[Woods y col., Infect. Immun., 55, p. 1927 (1987)] no son
candidatos a vacunas interesantes ya que no provocan la producción
de anticuerpos bactericidas. Para mejorar estas preparaciones
vacunales, existe una necesidad de proteínas altamente conservadas
que estarían presentes en la superficie de todas las cepas de
Neisseria meningitidis
y que serían capaces de producir anticuerpos bactericidas con el fin de desarrollar una vacuna de amplio espectro.
y que serían capaces de producir anticuerpos bactericidas con el fin de desarrollar una vacuna de amplio espectro.
El documento WO 94/05703 se refiere a un
anticuerpo monoclonal (AcMo) dirigido contra una proteína de la
superficie celular de Neisseria meningitidis.
El documento EP 0 273 116 desvela un polipéptido
capaz de imitar inmunológicamente a un sitio determinante
antigénico conservado de una proteína de opacidad gonocócica
(proteína II) y/o de la proteína meningocócica de clase 5.
K.S. BHAT Y COL., 1991, MOLECULAR MICROBIOLOGY
5(8): K.S. BHAT Y COL., 1992, MOLECULAR MICROBIOLOGY
6(8): 1073 1076 y EVA-MARIA KUPSCH Y COL.,
1993, EMBO JOURNAL 12(2): 641 650 describen variantes de
Neisseria gonorrhoeae MS11 que muestran morfologías distintas de
colonias por la expresión de una clase de componentes de superficie
denominada proteínas de opacidad (Opa, PII), una familia de
proteínas variantes de la membrana externa implicadas en la
patogenia.
El diagnóstico actual de laboratorio de
Neisseria meningitidis normalmente se realiza mediante
técnicas tales como tinción de Gram de las preparaciones en frotis,
aglutinación o co-aglutinación del látex y el
cultivo y aislamiento en medios enriquecidos y selectivos Morello y
col., en Balows, Manual of Clinical Microbiology, pág. 258,
American Society for Microbiology, Washington (1991)]. Normalmente,
las pruebas de degradación de hidratos de carbono se realizan para
confirmar la identificación de aislamientos de Neisseria
meningitidis. La mayoría de los procedimientos descritos son
procedimientos que requieren tiempo y personal preparado. Los kit
comerciales de aglutinación o co-aglutinación que
contienen sueros polivalentes dirigidos contra los antígenos
capsulares expresados por los serogrupos más prevalentes se usan
para la identificación rápida de Neisseria meningitidis. No
obstante, estos sueros polivalentes a menudo sufren reacción cruzada
no específica con otras especies bacterianas y, por esta razón,
siempre deberán usarse junto con la tinción de Gram y el cultivo.
En consecuencia, existe la necesidad de alternativas eficaces a
estos ensayos diagnósticos que mejorarán la rapidez y fiabilidad
del diagnóstico.
La presente invención resuelve los problemas a
los que se ha hecho referencia en lo que antecede proporcionando un
antígeno altamente conservado e inmunológicamente accesible en la
superficie de organismos de Neisseria meningitidis, tal y
como se define en las reivindicaciones. También se proporcionan
moléculas de ADN recombinante que codifican el antígeno anterior,
huéspedes unicelulares transformados con las moléculas de ADN y un
procedimiento para preparar un antígeno recombinante
sustancialmente puro tal y como se define en las reivindicaciones.
También se proporcionan anticuerpos específicos del antígeno de
Neisseria meningitidis anterior tal y como se define en las
reivindicaciones. El antígeno y los anticuerpos de esta invención
proporcionan la base de procedimientos únicos y composiciones
farmacéuticas para la detección, prevención y tratamiento de
enfermedades producidas por Neisseria meningitidis, tal y
como se define en las reivindicaciones.
El antígeno preferido es la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis, incluidos
fragmentos, tal y como se define en las reivindicaciones. También
se describen sus análogos y derivados. También se describen
anticuerpos tales como los anticuerpos monoclonales
Me-1 y Me-7 específicos de la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
Estos anticuerpos son altamente bacteriolíticos contra Neisseria
meningitidis y protegen de forma pasiva a los ratones frente a
la infección experimental.
La presente invención además proporciona
procedimientos para aislar nuevos antígenos de superficie de
Neisseria meningitidis y anticuerpos específicos de los
mismos, tal y como se define en las reivindicaciones.
La Figura 1 representa las secuencias de
nucleótidos y derivadas de aminoácidos de la proteína de superficie
de 22 kDa de la cepa de Neisseria meningitidis 608B (SEC ID
Nº 1; SEC ID Nº 2). Para los residuos de aminoácidos se usan
símbolos convencionales de tres letras. El marco de lectura abierto
se extiende desde el codón de iniciación en la base 143 hasta el
codón de terminación en la base 667. El recuadro indica el sitio de
unión al ribosoma putativo, mientras que la secuencia putativa del
promotor -10 está subrayada. Un péptido señal de 19 aminoácidos
también está subrayado.
La Figura 2 es una fotografía de un gel de
SDS-PAGE al 14% con tinción con azul de Coomassie
que muestra los digeridos de \alpha-quimotripsina
y tripsina de preparaciones de membrana externa de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2). La calle 1 contiene los
siguientes marcadores de peso molecular: fosforilasa b (97.400);
seroalbúmina bovina (66.200); ovoalbúmina (45.000); anhidrasa
carbónica (31.000); inhibidor de la tripsina de soja (21.500); y
lisozima (14.400). La calle 2 contiene preparación de membrana
externa control sin digerir. La calle 3 contiene una preparación
tratada con \alpha-quimotripsina (2 mg de enzima
por mg de proteína); la calle 4 contiene preparación tratada con
tripsina.
La Figura 3a es una fotografía de un gel de
SDS-PAGE al 14% con tinción con azul de Coomassie
que muestra digeridos de proteinasa K de preparaciones de membrana
externa de la cepa 608B de Neisseria meningitidis
(B:2a:P1.2). Las calles 1, 3, 5 y 7 contienen control sin digerir.
Las calles 2, 4, 6 y 8 contienen preparaciones de la membrana
externa digeridas con proteinasa K (2 UI por mg de proteína). Las
calles 1 a 4 contienen preparaciones tratadas a pH 7,2. Las calles
5 a 8 contienen preparaciones tratadas a pH 9,0. Las calles 1, 2, 5
y 6 contienen preparaciones tratadas sin SDS. Las calles 3, 4, 7 y
8 contienen preparaciones tratadas en presencia de SDS. Los
marcadores de peso molecular están indicados en la izquierda (en
kilodalton).
La Figura 3b es una fotografía de un gel de
SDS-PAGE al 14% con tinción de azul de Coomassie que
muestra perfiles de migración de la proteína recombinante de 22 kDa
purificada por afinidad. La calle 1 contiene marcadores de peso
molecular: fosforilasa b (97.400), seroalbúmina bovina (66.200),
ovoalbúmina (45.000), anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de la
tripsina de soja (21.500) y lisozima (14.400). La calle 2 contiene 5
\mug de proteína recombinante de 22 kDa control purificada por
afinidad. La calle 3 contiene 5 \mug de proteína recombinante de
22 kDa purificada por afinidad calentada a 100ºC durante 5 min. La
calle 4 contiene 5 \mug de proteína recombinante de 22 kDa
purificada por afinidad calentada a 100ºC durante 10 min. La calle 5
contiene 5 \mug de proteína recombinante de 22 kDa purificada por
afinidad calentada a 100ºC durante 15 min.
La Figura 4 es una fotografía de geles de
SDS-PAGE al 14% con tinción de azul de Coomassie y
sus correspondientes inmunotransferencias de tipo Western que
muestran la reactividad de los anticuerpos monoclonales específicos
de la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis. Preparación de membrana externa de la cepa 608B
de Neisseria meningitidis ((B:2a:P1.2) (A) sin tratar; (B)
proteinasa K tratada (2 UI por mg de proteína). La calle 1 contiene
marcadores de peso molecular y el perfil de migración característico
en gel de SDS-PAGE al 14% de preparaciones de
membrana externa. La calle 3 contiene Me-2; la calle
3 contiene Me-3; la calle 4 contiene
Me-5; la calle 5 contiene Me-7; y la
calle 6 contiene un anticuerpo monoclonal control no relacionado.
Los marcadores de peso molecular son fosforilasa b (97.400),
seroalbúmina bovina (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa
carbónica (31.000), inhibidor de la tripsina de soja (21.500) y
lisozima (14.400). Los resultados de la inmunotransferencia que se
muestran en la figura 4 para Me-2,
Me-3, Me-5, Me-6 y
Me-7 son consistentes con los resultados de la
inmunotransferencia obtenidos para Me-1.
La Figura 5 es una representación gráfica de la
actividad de unión de los anticuerpos monoclonales a células
bacterianas intactas. Los resultados para los anticuerpos
monoclonales representativos Me-5 y
Me-7 se presentan en cuentas por minuto
("CPM") en el eje vertical. Las diversas cepas bacterianas
usadas en el ensayo se muestran en el eje horizontal. Como control
negativo se usó un anticuerpo monoclonal específico de la porina de
Haemophilus influenzae. Se registraron cuentas de fondo
inferiores a 500 CPM y se restaron de los valores de unión.
La Figura 6 es una fotografía de geles de
SDS-PAGE al 14% teñidos y su correspondiente
inmunotransferencia de tipo Western, que demuestra la purificación
de la proteína de superficie recombinante de 22 kDa de Neisseria
meningitidis a partir de sobrenadante de cultivo concentrado de
la cepa BL21_(DE3) de Escherichia coli. La Figura
6(A) es una fotografía de gel de SDS-PAGE al
14% teñido con azul de Coomassie y plata. La calle 1 contiene los
siguientes marcadores de peso molecular: fosforilasa b (97.400),
seroalbúmina bovina (66.200), ovoalbúmina (45.000), anhidrasa
carbónica (31.000), inhibidor de la tripsina de soja (21.500) y
lisozima (14.400). La calle 2 contiene preparación de membrana
externa extraída de la cepa 608B de Neisseria meningitidis
(serotipo B: 2a:p1.2) (10 mg). La calle 3 contiene sobrenadante de
cultivo concentrado de Escherichia coli BL21(DE3) (10
mg). La calle 4 contiene proteína de superficie recombinante de 22
kDa de Neisseria meningitidis purificada por afinidad (1
mg). La Figura 6(B) una fotografía de un gel de
SDS-PAGE al 14% teñido con azul de Coomassie de
digeridos de \alpha-quimotripsina, tripsina y
proteinasa K de la proteína de superficie recombinante de 22 kDa de
Neisseria meningitidis purificada por afinidad. La calle 1
contiene los siguientes marcadores de peso molecular: fosforilasa b
(97.400), seroalbúmina bovina (66.200), ovoalbúmina (45.000),
anhidrasa carbónica (31.000), inhibidor de la tripsina de soja
(21.500) y lisozima (14.400). Las calles 2 a 5 contienen proteína
de superficie recombinante de 22 kDa de Neisseria
meningitidis purificada (2 mg). Las calles 7 a 10 contienen
seroalbúmina bovina (2 mg). Las calles 2 y 7 contienen proteína sin
digerir ("NT"). Las calles 3 y 8 contienen proteína tratada
con \alpha-quimotripsina ("C") (2 mg de
enzima por mg de proteína). Las calles 4 y 9 contienen proteína
tratada con tripsina ("T") (2 mg de enzima por mg de proteína).
Las calles 5 y 10 contienen proteína tratada con proteinasa K
("K") (2 UI por mg de proteína). La Figura 6(C) es una
fotografía de la inmunotransferencia de tipo western de un gel
duplicado usando el anticuerpo monoclonal Me-5.
La Figura 7 es una representación gráfica de la
actividad bactericida de los anticuerpos monoclonales
anti-proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis purificada con proteína A contra la
cepa 608B de Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2). El eje
vertical del gráfico muestra el porcentaje de supervivencia de la
bacteria Neisseria meningitidis tras la exposición a varias
concentraciones de anticuerpo monoclonal (mostrado en el eje
horizontal del gráfico).
La Figura 8 representa las secuencias de
nucleótidos y derivadas de aminoácidos de la proteína de superficie
de 22 kDa de la cepa de Neisseria meningitidis MCH88 (SEC ID
Nº 3; SEC ID Nº 4). Para los residuos de aminoácidos se usan
símbolos convencionales de tres letras. El marco de lectura abierto
se extiende desde el codón de iniciación en la base 116 al codón de
terminación en la base 643.
La Figura 9 representa las secuencias de
nucleótidos y derivadas de aminoácidos de la proteína de superficie
de 22 kDa de la cepa de Neisseria meningitidis Z4063 (SEC ID
Nº 5; SEC ID Nº 6). Para los residuos de aminoácidos se usan
símbolos convencionales de tres letras. El marco de lectura abierto
se extiende desde el codón de iniciación en la base 208 al codón de
terminación en la base 732.
La Figura 10 representa las secuencias de
nucleótidos y derivadas de aminoácidos de la proteína de superficie
de 22 kDa de la cepa de Neisseria gonorrhoeae b2 (SEC ID Nº
7; SEC ID Nº 8). Para los residuos de aminoácidos se usan símbolos
convencionales de tres letras. El marco de lectura abierto se
extiende desde el codón de iniciación en la base 241 al codón de
terminación en la base 765.
La Figura 11 representa la secuencia consenso
establecida a partir de las secuencias de ADN de las cuatro cepas
de Neisseria e indica las sustituciones o la inserción de
nucleótidos específicos de cada cepa.
La Figura 12 representa la secuencia consenso
establecida a partir de las secuencias de proteínas de las cuatro
cepas de Neisseria e indica las sustituciones o la inserción
de residuos de aminoácidos específicos de cada cepa.
La Figura 13 representa el curso de tiempo de la
respuesta inmunitaria a la proteína recombinante de 22 kDa en
conejos expresada como el título recíproco de ELISA. Se inyectó a
los conejos preparaciones de membrana externa de la cepa de E.
coli JM109 con plásmido N2202 o con plásmido control pWKS30. El
desarrollo de la respuesta humoral específica se analizó mediante
ELISA usando preparaciones de membrana externa obtenidas de la cepa
608B de Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2) como antígeno de
recubrimiento.
La Figura 14 representa el curso de tiempo de la
respuesta inmunitaria a la proteína recombinante de 22 kDa en monos
Macaca fascicularis (cinomolgos) expresada como el título
recíproco de ELISA. Los dos monos fueron inmunizados
respectivamente con 100 \mug (K28) y 200 \mug (I276) de proteína
de 22 kDa purificada por afinidad por inyección. El mono control
(K65) fue inmunizado con 150 \mug de proteína recombinante no
relacionada siguiendo el mismo procedimiento. El desarrollo de la
respuesta humoral específica se analizó mediante ELISA usando
preparaciones de membrana externa obtenidas de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2) como antígeno de
recubrimiento.
La Figura 15 es una representación gráfica de
los péptidos sintéticos de la invención, así como su respectiva
posición en la proteína completa de 22 kDa de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2).
La Figura 16 es un mapa del plásmido pNP2204 que
contiene el gen que codifica la proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis, el gen de la proteína de superficie
de 22 kDa de Neisseria meningitidis; una región codificadora
de resistencia a ampicilina, Ampi^{R}; origen de replicación
ColE1; un gen represor sensible a la temperatura cI857 del
bacteriofago \lambda; el promotor de la transcripción del
bacteriofago \lambda, IPL; un terminador de la transcripción. La
dirección de la transcripción está indicada por la flechas.
BglII y BamH1 son los sitios de restricción usados
para insertar el gen de 22 kDa en el plásmido p629.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el estudio de la ultraestructura de la
membrana externa de Neisseria meningitidis, los inventores
identificaron una nueva proteína de bajo peso molecular de 22
kilodalton que posee propiedades muy únicas. Esta proteína de
membrana externa es altamente resistente a tratamientos extensos con
enzimas proteolíticas, tales como proteinasa K, una serínproteasa
derivada del hongo Tritirachium album. Esto es muy
sorprendente dado que las proteínas resistentes a la proteinasa K
son muy raras en la naturaleza debido a la potencia, amplio ph
óptimo y a la baja especificidad del enlace peptídico de esta enzima
[Barrett, A.J. y N.D. Rawlings, Biochem. Soc. Transactions
(1991)19: 707-715]. Sólo unos pocos informes
han descrito proteínas de origen procariótico que son resistentes a
la degradación enzimática de la proteinasa K. Se han encontrado
proteínas resistentes a la proteinasa K en especies de
Leptospira [Nicholson, V.M. y J.F. Prescott, Veterinary
Microbiol. (1993) 36:123-138], especies de
Mycoplasma [Butler, G.H. y col. Infec. Immun. (1991)
59:1037-1042], Spiroplasma mirum [Bastian,
F.O. y col. J. Clin. Microbiol. (1987) 25:2430-2431]
y en virus y priones [Onodera, T. y col. Microbiol. Immunol. (1993)
37:311-316; Prusiner, S.B. y col. Proc. Nat. Acad.
Sci. USA (1993) 90:2793 2797]. En la presente memoria descriptiva,
los inventores describen el uso de esta proteína como medio para
mejorar la prevención, tratamiento y diagnóstico de las infecciones
producidas por Neisseria meningitidis.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la
invención, los inventores proporcionan una proteína de superficie
de Neisseria meningitidis altamente conservada e
inmunológicamente accesible y fragmentos de la misma, tal y como se
define en las reivindicaciones. También se describen sus análogos y
derivados. Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"proteína de superficie de Neisseria meningitidis"
significa cualquier proteína de superficie de Neisseria
meningitidis codificada por un gen natural de Neisseria
meningitidis. La proteína de Neisseria meningitidis de
acuerdo con la invención puede ser de origen natural o puede
obtenerse a través de la aplicación de biología molecular con el
objeto de producir una proteína recombinante, o un fragmento de la
misma.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"altamente conservado" significa que el gen de la proteína de
superficie de Neisseria meningitidis y la propia proteína
existen en más del 50% de las cepas conocidas de Neisseria
meningitidis. Preferentemente, el gen y su proteína existen en
más del 99% de las cepas conocidas de Neisseria
meningitidis. Los Ejemplos 2 y 4 indican procedimientos mediante
los cuales un experto en la técnica podría analizar una variedad de
diferentes proteínas de superficie de Neisseria meningitidis
para determinar si están "altamente conservadas".
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"inmunológicamente accesible" significa que la proteína de
superficie de Neisseria meningitidis está presente en la
superficie del organismo y es accesible a los anticuerpos. EL
Ejemplo 2 indica procedimientos mediante los cuales un experto en la
técnica podría analizar una variedad de diferentes proteínas de
superficie de Neisseria meningitidis para determinar si son
"inmunológicamente accesibles". La accesibilidad inmunológica
puede determinarse mediante otros procedimientos, incluido un ensayo
de aglutinación, un ELISA, un RIA, un ensayo de
inmunotransferencia, un ensayo de puntos-enzima, un
ensayo de accesibilidad en la superficie, microscopia electrónica o
una combinación de estos ensayos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"fragmentos" de la proteína de superficie de Neisseria
meningitidis incluyen polipéptidos que tienen la menos un
epítopo peptídico, o sus análogos y derivados. Se pueden obtener
péptidos de este tipo mediante la aplicación de biología molecular o
se pueden sintetizar usando técnicas convencionales de síntesis
peptídica de fase líquida o sólida.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"análogos" de la proteína de superficie de Neisseria
meningitidis incluyen las proteínas, o fragmentos de las
mismas, en las que uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia
natural son sustituidos por otro residuo de aminoácido, lo hace que
se conserven la funcionalidad global y las propiedades protectoras
de esta proteína. Dichos análogos se pueden producid sintéticamente,
o mediante tecnología de ADN recombinante, mediante, por ejemplo,
mutagénesis de una proteína de superficie natural de Neisseria
meningitidis. Dichos procedimientos son bien conocidos en la
técnica.
Por ejemplo, uno de dichos análogos se
selecciona de la proteína recombinante que se puede producir a
partir del gen de la proteína de 22 kDa de la cepa b2 de
Neisseria gonorrhoeae, como se representa en la Figura 10.
Otro análogo se puede obtener a partir del aislamiento del gen
correspondiente de Neisseria lactamica.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"derivado" de la proteína de superficie de Neisseria
meningitidis es una proteína o fragmento de la misma que ha
sido modificada covalentemente con, por ejemplo, dinitrofenol, con
el fin de convertirla en inmunogénica en seres humanos. Los
derivados de esta invención también incluyen derivados de los
análogos aminoacídicos de esta invención.
Debe entenderse que mediante los siguientes
ejemplos de esta invención, un experto en la técnica puede
determinar sin experimentación innecesaria si un fragmento, análogo
o derivado concreto sería útil en el diagnóstico, prevención o
tratamiento de enfermedades producidas por Neisseria
meningitidis.
La presente invención también incluyen formas
poliméricas de las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis, y fragmentos de las mismas, tal y como se define
en las reivindicaciones. También se contemplan sus análogos y
derivados. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más
polipéptidos que se han reticulado con reticuladores tal como
avidina/biotina, glutaraldehído o dimetilsuberimidato. Dichas formas
poliméricas también incluyen polipéptidos que contienen dos o más
secuencias de Neisseria meningitidis contiguas en tándem o
invertidas, producidas a partir de ARN multicistrónicos generados
mediante tecnología de ADN recombinante.
La presente invención proporciona proteínas de
superficie de Neisseria meningitidis sustancialmente puras.
Él término "sustancialmente puro" significa que la proteína de
superficie de Neisseria meningitidis de acuerdo con la
invención está libre de otras proteínas de origen de Neisseria
meningitidis. Se pueden obtener preparaciones de proteína de
superficie de Neisseria meningitidis sustancialmente puras
mediante una variedad de procedimientos convencionales, por ejemplo
el procedimiento descrito en los Ejemplos 3 y 11.
En otro aspecto, la invención proporciona
particularmente una proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura
1 (SEC ID Nº 2), o un fragmento de la misma, como se define en las
reivindicaciones. También se describe un análogo o derivado de la
misma.
En otro aspecto, la invención proporciona
particularmente una proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura
8 (SEC ID Nº 4), Figura 9 (SEC ID Nº 6) o un fragmento de la misma,
como se define en las reivindicaciones. También se describe un
análogo o derivado de la misma. Tal fragmento se puede seleccionar
de los péptidos enumerados en la Figura 15 (SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº
26).
En otro aspecto, la invención proporciona una
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria gonorrhoeae
que tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 10 (SEC ID Nº 8),
o un fragmento de la misma, como se define en las reivindicaciones.
También se describe un análogo o derivado de la misma. Como será
evidente a partir de lo que antecede, cualquier referencia a la
proteína de 22 kDa de Neisseria meningitidis también abarca
proteínas de 22 kDa aisladas de, o sintetizadas a partir de genes
aislados de otras especies de Neisseriacae tales como
Neisseria gonorrhoeae o Neisseria lactamica.
Una proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis de acuerdo con la invención puede
además caracterizarse por una o más de las características
siguientes:
(1) tiene un peso molecular aproximado de 22 kDa
según se evalúa en el gel SDS-PAGE;
(2) su movilidad electroforética en el gel
SDS-PAGE no se modifica con el tratamiento con
agentes reductores.
(3) tiene un punto isoeléctrico (pI) en un
intervalo de alrededor de pI 8 a pI 10;
(4) es altamente resistente a la degradación por
enzimas proteolíticas tales como
\alpha-quimotripsina, tripsina y proteinasa
K;
(5) la oxidación con peryodato no anula la unión
específica del anticuerpo dirigido contra la proteína de superficie
de 22 kDa de Neisseria meningitidis;
(6) es un antígeno altamente conservado;
(7) es accesible al anticuerpo en la superficie
de los organismos intactos de Neisseria meningitidis;
(8) puede inducir la producción de anticuerpos
bactericidas:
(9) puede inducir la producción de anticuerpos
que pueden proteger contra la infección experimental;
(10) puede inducir, cuando se inyecta en un
huésped animal, el desarrollo de una respuesta inmunológica que
puede proteger contra la infección producida por Neisseria
meningitidis.
La presente invención también proporciona, por
primera vez, una secuencia de ADN que codifica la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis (SEC ID Nº 1,
Nº 3, Nº 5 y Nº 7). Las secuencias de ADN preferidas de esta
invención se seleccionan del grupo compuesto por:
(a) la secuencia de ADN de la Figura 1 (SEC ID
Nº 1);
(B) la secuencia de ADN de la Figura 8 (SEC ID
Nº 3);
(c) la secuencia de ADN de la Figura 9 (SEC ID
Nº 5);
(d) la secuencia de ADN de la Figura 10 (SEC ID
Nº 7);
(e) análogos o derivados de las secuencias de
ADN anteriores;
(f) secuencias de ADN degeneradas de cualquiera
de las secuencias de ADN anteriores; y
(g) fragmentos de cualquiera de las secuencias
de ADN anteriores, en los que dichas secuencias codifican un
producto que muestra la actividad inmunológica de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
Preferentemente, dichos fragmentos son péptidos
tal y como se representan en la Figura 15 (SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº
26).
Preferentemente, esta invención también
proporciona, por primera vez, una secuencia de ADN que codifica la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
(SEC ID Nº 1). Secuencias de ADN más preferidas de esta invención
se seleccionan del grupo compuesto por:
(a) la secuencia de ADN de la Figura 1 (SEC ID
Nº 1);
(b) análogos o derivados de las secuencias de
ADN anteriores;
(c) secuencias de ADN degeneradas de cualquiera
de las secuencias de ADN anteriores; y
(d) fragmentos de cualquiera de las secuencias
de ADN anteriores, en los que dichas secuencias codifican un
producto que muestra la actividad inmunológica de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
Análogos y derivados del gen codificador de la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
hibridará con el gen codificador de la proteína de superficie de 22
kDa en las condiciones descritas en el Ejemplo 4.
Para los fines de la presente invención, los
fragmentos, análogos y derivados de la proteína de superficie de 22
kDa de Neisseria meningitidis tienen la "actividad
inmunológica" de la proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis si pueden inducir, cuando se inyectan
en un huésped animal, el desarrollo de una respuesta inmunológica
que puede proteger contra la infección producida por Neisseria
meningitidis. Un experto en la técnica puede determinar si una
secuencia concreta de ADN codifica un producto que muestra la
actividad inmunológica de la proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis siguiendo los procedimientos
indicados en la presente memoria descriptiva en el Ejemplo 6.
Las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis de esta invención se pueden aislar mediante un
procedimiento que comprende las etapas siguientes:
a) aislar un cultivo de la bacteria Neisseria
meningitidis,
b) aislar una porción de membrana externa del
cultivo de la bacteria; y
c) aislar dicho antígeno de la porción de
membrana externa.
En particular, la etapa anterior (c) puede
incluir las etapas adicionales de tratar los extractos de proteína
de membrana externa de Neisseria meningitidis con proteinasa
K, seguido por el fraccionamiento proteico usando técnicas de
separación convencionales tales como intercambio iónico y
cromatografía en gel y electroforesis.
Como alternativa y preferentemente, las
proteínas de superficie de Neisseria meningitidis de esta
invención pueden producirse mediante el uso de técnicas de biología
molecular, como se describen más concretamente en el Ejemplo 3 de
la presente memoria descriptiva. El uso de técnicas de biología
molecular es particularmente bien adecuado para la preparación de
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
recombinante sustancialmente pura.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la
invención, los inventores proporcionan un procedimiento para la
producción de proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis recombinante, incluidos fragmentos, análogos y
derivados de la misma, que comprende las etapas de (1) cultivar un
organismo huésped unicelular transformado con una molécula de ADN
recombinante que incluye una secuencia de ADN que codifica dicha
proteína, fragmento, análogo o derivado, y una o más secuencias de
control de la expresión unidas operativamente a la secuencia de
ADN, y (2) recuperar una proteína sustancialmente pura, fragmento,
análogo o derivado.
Como es bien conocido en la técnica, con le fin
de obtener niveles elevados de expresión de un gen transfeccionado
en un huésped, el gen debe estar operativamente unido a secuencias
de control de la expresión transcripcional y traduccional que son
funcionales en el huésped de expresión escogido.
Preferentemente, las secuencias de control de la
expresión, y el gen de interés, estarán contenidas en un vector de
expresión que además comprende un marcador de selección bacteriana y
un origen de replicación. Si el huésped de expresión es una célula
eucariótica, el vector de expresión deberá además comprender un
marcador de la expresión útil en el huésped de expresión.
En la expresión de las secuencias de ADN de esta
invención se pueden emplear una amplia variedad de combinaciones de
huésped/vector de expresión. Entre los vectores de expresión útiles
para huéspedes eucarióticos se incluyen, por ejemplo, vectores que
comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, del virus
del papiloma bovino, de adenovirus y de citomegalovirus. Entre los
vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos se
incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de
control de la plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos
de E. coli, incluidos col E1, pCR1, pBR322, pMB9 y sus
derivados, plásmidos con una gama de huéspedes más amplia, tales
como RP4, ADN de fago, por ejemplo los numerosos derivados del fago
lambda, por ejemplo NM989, y otros fagos de ADN, tales como el M3 y
los fagos de ADN monocatenario filamentosos.
Vectores de expresión útiles para células de
levadura incluyen el plásmido 2 mu y sus derivados. Vectores útiles
para células de insecto incluyen pVL 941.
Además, en estos vectores se puede usar una
amplia variedad de secuencias de control de la expresión para
expresar las secuencias de ADN de esta invención. Tales secuencias
de control de la expresión útiles incluyen las secuencias de
control de la expresión asociadas con genes estructurales de los
vectores de expresión anteriores. Ejemplos de secuencias de control
de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores
tempranos y tardíos de SV40 o de adenovirus, el sistema lac,
el sistema trp, el sistema TAC o TRC, las
principales regiones de operador y promotor del fago lambda, las
regiones control de la proteína de cubierta fd, el promotor para la
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo
Pho5, los promotores del sistema de acoplamiento alfa de levaduras y
otras secuencias de las que se sabe que controlan la expresión de
genes de células procarióticas y eucaróticas o sus virus, y varias
combinaciones de las mismas. La secuencia de control de la
expresión de la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis es particularmente útil en la expresión de la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
en E. coli (Ejemplo 3).
Las células huésped transformadas con los
vectores anteriores forman otro aspecto de esta invención. Una
amplia variedad de células huésped unicelulares son útiles en la
expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Estos
huéspedes pueden incluir huéspedes procarióticos y eucarióticos bien
conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus,
Streptomyces, hongos, levaduras, células de insecto tales como
Spodoptera frugiperda (SF9), células animales tales como
CHO y células de ratón, células de mono verde africano tales como
COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, y BMT 10, y células humanas y células
vegetales en cultivo tisular. Organismos huéspedes preferidos
incluyen bacterias tales como E. coli y Bacillus
subtilis y células de mamífero en cultivo tisular.
Por supuesto, debe entenderse que no todos los
vectores y secuencias de control de la expresión funcionarán
igualmente bien en la expresión de las secuencias de ADN de esta
invención. Tampoco funcionarán igualmente bien todos los huéspedes
con el mismo sistema de expresión. No obstante, un experto en la
técnica puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias
de control de la expresión y huéspedes sin experimentación indebida
y sin desviarse del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, al
seleccionar un vector, debe considerarse el huésped porque el
vector se ha de replicar en él. También se ha de considerar el
número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número
de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por
el vector, tal como marcadores de antibióticos.
Al seleccionar una secuencia de control de la
expresión también se ha de considerar una variedad de factores.
Estos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa de la secuencia, su
controlabilidad y su compatibilidad con las secuencias de ADN de
esta invención, particularmente en relación con las potenciales
estructuras secundarias. Los huéspedes unicelulares deben
seleccionarse considerando su compatibilidad con el vector escogido,
la toxicidad del producto codificado por las secuencias de ADN de
esta invención, sus características de secreción, su capacidad para
plegar la proteína correctamente, sus requisitos de fermentación o
cultivo y la facilidad para purificar en ellos los productos
codificados por las secuencias de ADN de esta invención.
Dentro de estos parámetros, un experto en la
técnica puede seleccionar varias combinaciones de huésped/secuencias
de control de la expresión/vector que expresarán las secuencias de
ADN de esta invención con fermentación o en cultivos animales a
gran escala.
Los polipéptidos codificados por las secuencias
de ADN de esta invención pueden aislarse de la fermentación o del
cultivo tisular y purificarse usando cualquiera de una variedad de
procedimientos convencionales. Un experto en la técnica puede
seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más adecuadas
sin desviarse del ámbito de esta invención.
Las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis de esta invención son útiles en las composiciones
profilácticas, terapéuticas y diagnósticas para prevenir, tratar y
diagnosticas enfermedades causadas por la infección producida por
Neisseria meningitidis.
Las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis de esta invención son útiles en las composiciones
profilácticas, terapéuticas y diagnósticas para prevenir, tratar y
diagnosticas enfermedades causadas por la infección producida por
Neisseria gonorrhoeae o Neisseria lactamica.
Las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis de acuerdo con esta invención son particularmente
adecuadas para la generación de anticuerpos y para el desarrollo de
una respuesta protectora contra enfermedades producidas por
Neisseria meningitidis.
Las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis de acuerdo con esta invención son particularmente
adecuadas para la generación de anticuerpos y para el desarrollo de
una respuesta protectora contra enfermedades producidas por
Neisseria gonorrhoeae o Neisseria lactamica.
En particular, los inventores proporcionan una
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
que tiene una secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID Nº 2)
o un fragmento de la misma para usar como inmunógeno y como vacuna,
como se define en las reivindicaciones. También se contempla un
análogo o derivado de tal proteína.
En particular, los inventores proporcionan una
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
que tiene una secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID Nº 2),
la Figura 8 (SEC ID Nº 4), la Figura 9 (SEC ID Nº 6) o la figura 10
(SEC ID Nº 8), o un fragmento de la misma para usar como inmunógeno
y como vacuna, como se define en las reivindicaciones. También se
contempla un análogo o derivado de tal proteína.
Con las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis se pueden emplear técnicas inmunológicas estándar
con el fin de usarlas como inmunógenos y como vacunas. En
particular, cualquier huésped adecuado se puede inyectar con una
cantidad farmacéuticamente eficaz de la proteína de superficie de 22
kDa de Neisseria meningitidis para generar anticuerpos
monoclonales o polivalentes anti-Neisseria meningitidis o
para inducir el desarrollo de una respuesta inmunológica protectora
contra enfermedades producidas por Neisseria meningitidis.
Antes de la inyección al huésped, las proteínas de superficie de
Neisseria meningitidis pueden formularse en un vehículo
adecuado y, por tanto, los inventores proporcionan una composición
farmacéutica que comprende uno o más antígenos de superficie de
Neisseria meningitidis o fragmentos de los mismos.
Preferentemente, el antígeno es la proteína de superficie de 22 kDa
de Neisseria meningitidis, o fragmentos de la misma, junto
con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. También se
contempla un análogo o derivado de tal proteína. Como se usa en la
presente memoria descriptiva, "cantidad farmacéuticamente
eficaz" se refiere a una cantidad de uno o más antígenos de
superficie de Neisseria meningitidis, o fragmentos de los
mismos, que provoca un título suficiente de anticuerpos
anti-Neisseria meningitidis para tratar o prevenir la
infección producida por Neisseria meningitidis.
Las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis de esta invención pueden también formar la base de
una prueba diagnóstica para la infección producida por Neisseria
meningitidis. Son posibles varios procedimientos diagnósticos.
Por ejemplo, esta invención proporciona un procedimiento para la
detección del antígeno de Neisseria meningitidis en una
muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene antígeno
de Neisseria meningitidis, que comprende:
a) aislar la muestra biológica de un
paciente;
b) incubar un anticuerpo frente a la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis o un fragmento
de la misma con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar anticuerpo específicamente unido o
fragmento unido en la mezcla que indique la presencia del antígeno
de Neisseria meningitidis.
Se contemplan los anticuerpos en el
procedimiento diagnóstico anterior tal como Me-1 y
Me-7.
Como alternativa, esta invención proporciona un
procedimiento para la detección de anticuerpos específicos del
antígeno de Neisseria meningitidis en una muestra biológica
que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo,
que comprende:
a) aislar la muestra biológica de un
paciente;
b) incubar una proteína de superficie de
Neisseria meningitidis de esta invención o un fragmento de la
misma con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar el antígeno específicamente unido o
fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo
específico del antígeno de Neisseria meningitidis. Un experto
en la técnica reconocerá que esta prueba diagnóstica puede tomar
varias formas, incluida una prueba inmunológica tal como un ensayo
de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o
un ensayo de aglutinación con látex, esencialmente para determinar
si hay anticuerpos específicos de la proteína presentes en un
organismo.
Las secuencias de ADN de esta invención también
se pueden usar para diseñar sondas de ADN para usar en la detección
de la presencia de bacterias Neisseria patogénicas en una
muestra biológica de la que se sospecha que contiene tal bacteria.
El procedimiento de detección de esta invención comprende las etapas
de:
a) aislar la muestra biológica de un
paciente;
b) incubar una sonda de ADN que tiene una
secuencia de ADN de esta invención con la muestra biológica para
formar una mezcla; y
c) detectar la sonda de ADN específicamente
unida en la mezcla, que indica la presencia de la bacteria
Neisseria.
Sondas de ADN preferidas tienen la secuencia de
pares de bases de la Figura 1 (SEC ID Nº 1), la Figura 8 (SEC ID Nº
3), la Figura 9 (SEC ID Nº 5) o la Figura 10 (SEC ID Nº 7) o la
secuencia consenso de la Figura 11 (SEC ID Nº 9).
Una sonda de ADN más preferida tiene la
secuencia de 525 pares de bases de la Figura 1 (SEC ID Nº 1).
Las sondas de ADN de esta invención también se
pueden usar para detectar ácidos nucleicos circulantes de
Neisseria meningitidis en una muestra, por ejemplo usando una
reacción en cadena de la polimerasa, como procedimiento diagnóstico
de infecciones producidas por Neisseria meningitidis. La
sonda se puede sintetizar usando técnicas convencionales y se puede
inmovilizar en una fase sólida, o puede marcarse con un marcador
detectable.
Una sonda de ADN preferida para esta aplicación
es un oligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos
aproximadamente 6 nucleótidos contiguos del gen de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis de la Figura
1 (SEC ID Nº 1), de la Figura 8 (SEC ID Nº 3), LA Figura 9 (SEC ID
Nº 5), de la Figura 10 (SEC ID Nº 7) o la secuencia consenso de la
Figura 11 (SEC ID Nº 9).
\newpage
Una sonda de ADN más preferida para esta
aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria a
al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos del gen de la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
de la Figura 1 (SEC ID Nº 1).
Otro procedimiento diagnóstico para la detección
de Neisseria meningitidis en un paciente comprende las
etapas de:
a) marcar un anticuerpo de esta invención o un
fragmento del mismo con un marcador detectable;
b) administrar al paciente el anticuerpo marcado
o el fragmento marcado; y
c) detectar anticuerpo marcado específicamente
unido o el fragmento marcado en el paciente que indique la
presencia de Neisseria meningitidis.
Para la purificación de todos los anticuerpos
anti proteína de superficie de Neisseria meningitidis se
puede usar la cromatografía de afinidad empleando una proteína de
superficie de Neisseria meningitidis inmovilizada como medio
de afinidad. Además, los inventores describen una proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis que tiene una
secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de la Figura 1
(SEC ID Nº 2), de la Figura 8 (SEC ID Nº 4), o de la Figura 10 (SEC
ID Nº 8), o una porción de la misma o un análogo de la misma,
covalentemente unida a un soporte insoluble.
Asimismo, los inventores describen una proteína
de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis que tiene
una secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de la Figura 1
(SEC ID Nº 2), o una porción de la misma o un análogo de la misma,
covalentemente unida a un soporte insoluble.
Otra característica de la invención es el uso de
las proteínas de superficie de Neisseria meningitidis de la
invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos
específicos para el diagnóstico y, en particular, el tratamiento de
la infección producida por Neisseria meningitidis. Los
anticuerpos adecuados se pueden determinar usando procedimientos de
detección selectiva adecuados mediante, por ejemplo, medición de la
capacidad de un anticuerpo concreto para proteger de forma pasiva
contra la infección producida por Neisseria meningitidis en
un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de
ratones descrito en los ejemplos de la presente memoria
descriptiva. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un
fragmento del mismo de unión al antígeno, y puede, en general,
pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o
fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen
mamífero, y, más específicamente, de origen murino, de rata o ser
humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo, o,
si se desea, un anticuerpo recombinante o un fragmento de
anticuerpo. El término anticuerpo recombinante o fragmento de
anticuerpo quiere decir anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se
ha producido usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o
los fragmentos de anticuerpo pueden ser de origen policlonal, o,
preferentemente, monoclonal. Puede ser específico para un número de
epítopos asociados con las proteínas de superficie de Neisseria
meningitidis, pero es, preferentemente, específico para uno.
Preferentemente, el anticuerpo o los fragmentos del mismo serán
específicos de uno o más epítopos asociados con la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis. Asimismo, en
la presente memoria descriptiva se describen los anticuerpos
monoclonales Me-1 y Me-7.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de que la presente invención se
entienda mejor, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos
son con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como
limitantes del ámbito de la invención de ningún modo.
El Ejemplo 1 describe el tratamiento de la
preparación de membrana externa de Neisseria meningitidis con
enzimas proteolíticas y la posterior identificación de la proteína
de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
El Ejemplo 2 describe la preparación de
anticuerpos monoclonales específicos de la proteína de superficie
de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
El Ejemplo 3 describe la preparación de la
proteína de superficie recombinante de 22 kDa de Neisseria
meningitidis.
El Ejemplo 4 describe el uso de sondas de ADN
para la identificación de organismos que expresan la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
El Ejemplo 5 describe el uso de un anticuerpo
monoclonal anti-proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis para proteger a los ratones frente a
la infección producida por Neisseria meningitidis.
El Ejemplo 6 describe el uso de proteína de
superficie recombinante de 22 kDa purificada para inducir una
respuesta protectora contra la infección producida por Neisseria
meningitidis.
\newpage
El Ejemplo 7 describe la identificación de la
secuencia para la proteína de 22 kDa y el gen codificador de la
proteína para otras cepas de Neisseria meningitidis (MCH88 y
Z4063), y una cepa de Neisseria gonorrhoeae.
El Ejemplo 8 describe la respuesta inmunológica
de conejos y monos a la proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis.
El Ejemplo 9 describe el procedimiento usado
para mapear los diferentes epítopos inmunológicos de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
El Ejemplo 10 describe la inducción por calor de
un vector de expresión para la producción a gran escala de la
proteína de superficie de 22 kDa.
El Ejemplo 11 describe un procedimiento de
purificación para la proteína de superficie de 22 kDa cuando se
produce mediante tecnología recombinante.
El Ejemplo 12 describe el uso de la proteína de
superficie de 22 kDa como vacuna para seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron varias preparaciones antigénicas
derivadas de la célula entera, cloruro de litio o extractos de
sarcosilo para estudiar la ultraestructura de la membrana externa de
Neisseria meningitidis. La membrana externa de bacterias
gramnegativas actúa como una interfaz entre el medio ambiente y el
interior de la célula y contiene la mayoría de los antígenos que
están libremente expuestos a la defensa inmunitaria del huésped. El
objetivo principal del estudio era la identificación de antígenos
nuevos que puedan inducir una respuesta protectora contra
Neisseria meningitidis. Un enfoque usado por los inventores
para identificar tales antígenos era la alteración parcial de las
preparaciones antigénicas mencionadas en lo que antecede con enzimas
proteolíticas. Los determinantes antigénicos generados por los
tratamientos enzimáticos podrían identificarse mediante el análisis
posterior de las propiedades inmunológicas y protectoras de estas
preparaciones antigénicas tratadas. Para sorpresa de los
inventores, observaron, después de la resolución electroforética de
los extractos de membrana externa de cloruro de litio de
Neisseria meningitidis, que una banda de bajo peso molecular,
teñida con azul brillante de Coomassie R-250, no
quedaba destruida por los tratamientos con enzimas proteolíticas.
El azul de Coomassie se usa para teñir proteínas y péptidos y tiene
poca o ninguna afinidad por los polisacáridos o lípidos que también
son componentes clave de la membrana externa. El hecho de este
antígeno de bajo peso molecular se tiñó con azul de Coomassie
sugirió que la menos parte de él está formado por polipéptidos que
no son digeridos por enzimas proteolíticas o que están protegidos
contra la acción de las enzimas por otras estructuras de
superficie. Además, como se demuestra más adelante, la enzima muy
potente proteinasa K no digirió este antígeno de peso molecular
bajo, incluso después de tratamientos prolongados.
Se usó extracción con cloruro de litio para
obtener las preparaciones de membrana externa de diferentes cepas
de Neisseria meningitidis y se realizó del modo anteriormente
descrito por los inventores [Brodeur y col., Infect. Immun., 50,
pág. 510 (1985)]. El contenido proteico de estas preparaciones se
determinó mediante el método de Lowry adaptado a las fracciones de
membrana [Lowry y col., J. Biol. Chem. 193, pág. 265 (1951)]. Las
preparaciones de membrana externa derivadas de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2) se trataron durante 24
horas a 37ºC y agitación continua con
\alpha-quimotripsina de páncreas bovino (E.C.
3.4.21.1) (Sigma) o tripsina de tipo 1 de de páncreas bovino (E.C.
3.4.21.1) (Sigma). La concentración de enzima se ajustó a 2 mg por
mg de proteína a tratar. Las mismas preparaciones de membrana
externa también se trataron con diferentes concentraciones (0,5 a
24 mg por mg de proteína) de proteinasa L de Tritirachium
album limber (Sigma o Boehringer Mannheim, Laval, Canadá) (E.C.
3.4.21.14). Con el fin de estimular la digestión proteica por la
proteinasa K se usaron diferentes condiciones experimentales.
Las muestras se incubaron durante 1 hora, 2
horas, 24 horas o 48 horas a 37ºC o 56ºC con o sin agitación. El pH
de las muestras en mezcla se ajustó a un pH 7,2 o pH 9,0. También se
añadió a ciertas muestras un % (vol/vol) de dodecilsulfato sódico
(SDS). Inmediatamente después del tratamiento, las muestras se
resolvieron mediante electroforesis en gel de
SDS-PAGE usando el sistema MiniProteanII®
(Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canadá) en geles al
14% (p/vol) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las
proteínas se calentaron hasta 100ºC durante 5 minutos con
2-mercaptoetanol y SDS, se separaron en geles de SDS
al 14% y se tiñeron con azul brillante de Coomassie
R-250.
La Figura 2 presenta el perfil de migración en
gel de SDS-PAGE al 14% de las proteínas presentes en
las preparaciones de membrana externa derivadas de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis (B:2a:P1.2) tras el tratamiento a
37ºC durante 24 horas con \alpha-quimotripsina y
tripsina. Se puede observar una amplia digestión proteolítica de
las proteínas de alto peso molecular y de varias proteínas
principales de la membrana externa para las muestras tratadas
(Figura 2, calles 3 y 4) en comparación con el control sin tratar
(Figura 2, calle 2). Por el contrario, una banda proteica con un
peso molecular aparente de 22 kDa no se vio afectada incluso tras
24 horas de contacto con cualquier enzima proteolítica.
\newpage
Esta proteína única se estudió más usando un
tratamiento proteolítico más agresivo con proteinasa K (Figura 3).
La proteinasa k es una de las enzimas proteolíticas más potentes ya
que tiene una especificidad de enlace peptídico bajo y un pH amplio
óptimo. Sorprendentemente, la proteína de 22 kDa fue resistente a la
digestión con 2 unidades internacionales (UI) de proteinasa K
durante 24 horas a 56ºC (Figura 3, calle 2). Este tratamiento se
usa con frecuencia en el laboratorio de los inventores para producir
lipopolisacáridos o ADN casi libres de proteínas. De hecho, tras un
tratamiento proteolítico tan agresivo de la preparación de membrana
externa sólo se pueden observar polipéptidos pequeños. Además,
tratamientos más prolongados, de hasta 48 horas, o concentraciones
superiores de enzima (de hasta 24 UI) no alteraron la cantidad de la
proteína de 22 kDa. La cantidad y la migración en el gel de
SDS-PAGE de la proteína de 22 kDa no se vieron
afectados cuando se aumentó el pH de las mezclas de reacción a pH
9,0 o cuando se añadió 1,0% de SDS, un fuerte agente de
desnaturalización de proteínas (Figura 3, calles 4, 6 y 8). El uso
combinado de estas dos condiciones de desnaturalización normalmente
tendría como resultado la digestión completa de las proteínas
presentes en las preparaciones de membrana externa, dejando sólo
residuos de aminoácidos. A menudo se observaron polipéptidos de bajo
peso molecular en los digeridos y se supusieron que eran fragmentos
de proteína sensibles no digeridas con eficacia durante los
tratamientos enzimáticos. Estos fragmentos muy probablemente
estaban protegidos de degradaciones posteriores por los hidratos de
carbono y lípidos presentes en la membrana externa. Las bandas con
un peso molecular aparente de 28 kDa y 34 kDa que están presentes
en las muestras tratadas son, respectivamente, la enzima residual y
una proteína contaminante presente en todas las preparaciones
enzimáticas
analizadas.
analizadas.
Es de destacar el hecho de que este estudio
sobre la resistencia de la proteína de 22 kDa a las proteasas
indicó que otra banda de proteína con un peso molecular aparente de
18 kDa parece ser también resistente a la degradación enzimática
(Figura 3a). Se obtuvieron pistas sobre esta banda proteica de 18
kDa cuando se analizaron los perfiles de migración sobre los geles
de SDS-PAGE de la proteína de 22 kDa recombinante
purificada por afinidad (Figura 3b). La banda de 18 kDa sólo fue
evidente cuando la proteína de 22 kDa recombinante purificada por
afinidad se calentó durante un periodo prolongado de tiempo en
tampón de muestra que contenía el detergente SDS antes de aplicarse
al gel. El análisis del aminoácido en el extremo N con la
degradación de Edman (Ejemplo 3) estableció claramente que los
residuos aminoacídicos
(E-G-A-S-G-F-Y-V-Q)
identificados en la banda de 18 kDa correspondían a los aminoácidos
1-9 (SEC ID Nº 1). Estos resultados indican que las
bandas de 18 y 22 kDa tal y como se aprecian en el
SDS-PAGE de hecho derivan de la misma proteína. Este
último resultado también indica que la secuencia líder está
escindida de la proteína madura de 18 kDa. Se efectuarán más
estudios para identificar las modificaciones moleculares que
expliquen este cambio en el peso molecular aparente y evaluar su
impacto sobre las propiedades antigénicas y protectoras de la
proteína.
En conclusión, el descubrimiento de una proteína
de membrana externa de Neisseria meningitidis con la muy
rara propiedad de ser resistente a la digestión proteolítica demanda
un posterior estudio de sus características moleculares e
inmunológicas. La proteína de superficie de 22 kDa recombinante
purificada producida por Escherichia coli en el Ejemplo 3 es
también altamente resistente a la digestión por la proteinasa K.
Actualmente, los inventores están intentando entender el mecanismo
que confiere a la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis esta resistencia inusual a las enzimas
proteolíticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos monoclonales descritos en la
presente memoria descriptiva se obtuvieron de tres experimentos de
fusión independientes. Ratones Balb/c hembra (Charles River
Laboratories, St-Constant, Quebec, Canadá) se
inmunizaron con preparaciones de membrana externa obtenidas de las
cepas 604A, 608B y 2241C de Neisseria meningitidis de los
serogrupos respectivos A, B y C. La extracción con cloruro de litio
usada para obtener estas preparaciones de membrana externa se
realizó del modo descrito anteriormente por los inventores. [Brodeur
y col., Infect. Immun. 50, pág. 510 (1985)]. El contenido proteico
de estas preparaciones se determinó mediante el método de Lowry
adaptado a las fracciones de membrana [Lowry y col., J. Biol. Chem.
193, pág. 265 (1951)]. A grupos de ratones se les inyectó por vía
intraperitoneal o subcutánea a intervalos de tres semanas 10 mg de
diferentes combinaciones de las preparaciones de membrana externa
descritas en lo que antecede. Dependiendo del grupo de ratones,
los adyuvantes usados para las inmunizaciones fueron adyuvante
completo o incompleto de Freund (Gibco Laboratories, Grand Island,
N.Y.), o QuilA (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Canadá). Tres
días antes del procedimiento de fusión, los ratones inmunizados
recibieron una última inyección intravenosa de 10 mg de una de las
preparaciones de membrana externa descritas en lo que antecede. Los
inventores han descrito anteriormente el protocolo de fusión usado
para producir las líneas celulares de hibridoma secretoras del
anticuerpo monoclonal deseado [Hamel y col., J. Med. Microbiol., 25,
pág. 2434 (1987)]. La clase, subclase y tipo de cadena ligera de
los anticuerpos monoclonales Me-1,
Me-2, Me-3, Me-5,
Me-6 y Me-7 se determinaron
mediante ELISA tal como se ha comunicado previamente [Martin y col.,
J. Clin. Microbiol., 28, pág. 1720 (1990)] y se presentan en la
Tabla 1.
La especificidad de los anticuerpos monoclonales
se estableció usando Inmunotransferencia de tipo Western siguiendo
el procedimiento previamente descrito por los inventores [Martin y
col., Eur. J. Immunol. 18, pág. 601 (1988)] con las modificaciones
siguientes. Las preparaciones de membrana externa obtenidas de
diferentes cepas de Neisseria meningitidis se resolvieron en
geles de SDS-PAGE al 14%. Las proteínas se
transfirieron de los geles a las membranas de nitrocelulosa usando
un aparato semi-seco (Bio-Rad). Se
aplicó una corriente de 60 mA por gel (6 x 10 cm) durante 10
minutos en el tampón de electrotransferencia compuesto por
Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 20%
(vol/vol), pH 8,3. Los experimentos de Inmunotransferencia de tipo
Western indicaron claramente que los anticuerpos monoclonales
Me-1, Me-2, Me-3,
Me-5, Me-6 y Me-7
reconocían sus epítopos específicos sobre la proteína de 22 kDa de
Neisseria meningitidis (Figura 4A). El análisis de los geles
de SDS-PAGE y las correspondientes
inmunotransferencias de tipo Western también indicó que el peso
molecular aparente de esta proteína no varía de una cepa a otra. No
obstante, la cantidad de proteína presente en las preparaciones de
membrana externa varió de una cepa a otra y no estaba relacionada
con el serogrupo de la cepa. Además, estos anticuerpos monoclonales
todavía reconocían sus epítopos sobre la proteína de superficie de
22 kDa de Neisseria meningitidis tras el tratamiento de la
preparación de membrana externa con 2 UI de proteinasa K por mg de
proteína (tratamiento descrito en el Ejemplo 1, ant.) (Figura 4B).
Es interesante el hecho de que los epítopos permanecían intactos
tras la digestión enzimática, lo que confirma que incluso si son
accesibles en la preparación de membrana a los anticuerpos, no son
destruidos por el tratamiento enzimático. Este último resultado
sugirió que el mecanismo que explica la resistencia observada a la
proteinasa K muy probablemente no esté relacionado con las
estructuras de superficie que bloquean el acceso de la enzima a la
proteína o con la protección ofrecida por la membrana a las
proteínas que están embebidas profundamente. Aunque no se muestran
en la Figura 4, los resultados de las inmunotransferencias para
Me-1 eran consistentes con los resultados para los
otros cinco anticuerpos monoclonales.
Se realizaron una serie de experimentos para
caracterizar parcialmente la proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis y para diferenciarla de otras
proteínas de superficie meningocócicas. No se observó ningún cambio
en el peso molecular aparente en el gel SDS-PAGE de
la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis cuando las preparaciones de membrana externa se
calentaron a 100ºC durante 5 minutos o a 37ºC y 56ºC durante 30
minutos en tampón de muestra para electroforesis con o sin
2-mercaptoetanol. Esto indicó que la migración de
la proteína de superficie de 22 kDa, cuando está presente en la
membrana externa, no era modificable por calor o por
2-mercaptoetanol.
Se usó oxidación con peryodato sódico para
determinar si los anticuerpos monoclonales reaccionaban con los
epítopos de hidratos de carbono presentes en las preparaciones de
membrana externa extraídas de organismos de Neisseria
meningitidis. Anteriormente los inventores han descrito el
procedimiento usado para realizar este experimento. [Martin y col.,
Infect. Immun., 60, pág. 2718-2725 (1992)]. El
tratamiento de las preparaciones de membrana externa con 100 mM de
peryodato sódico durante 1 hora a temperatura ambiente no alteró la
reactividad de los anticuerpos monoclonales hacia la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis. Normalmente,
este tratamiento anula la unión de los anticuerpos específicos para
hidratos de carbono.
El anticuerpo monoclonal
2-1-CA2 (proporcionado por el Dr. A.
Bhattacharjee, Walter Reed Army Institute of Research, Washington,
D.C.) es específico de la proteína lip (también denominada H.8), un
antígeno de superficie común a todas las especies patogénicas de
Neisseria. La reactividad de este anticuerpo monoclonal con
preparaciones de membrana externa se comparó con la reactividad del
anticuerpo monoclonal Me-5, El anticuerpo
monoclonal específico de lip reaccionó con una banda proteica que
tiene un peso molecular aparente de 30 kDa, mientras que el
anticuerpo monoclonal Me-5 reaccionó con la banda
proteica de 22 kDa. Este resultado indica claramente que no hay
relación entre la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis y la proteína lip, otra proteína de membrana
externa altamente conservada.
Para verificar la exposición de la proteína de
22 kDa en la superficie de células bacterianas intactas de
Neisseria meningitidis, se realizó un radioinmunoensayo como
previamente han descrito los inventores [Proulx y col., Infec.
Immun., 59, pág. 963 (1991)]. Para este ensayo se usaron cultivos
bacterianos de seis y 18 horas. Los seis anticuerpos monoclonales
reaccionaron con 9 cepas de Neisseria meningitidis (el
serogrupo de la cepa está indicado entre paréntesis en la Figura
5), 2 cepas de Neisseria gonorrhoeae ("NG"), 2 cepas de
Moraxella catarrhalis ("MC") y 2 cepas de Neisseria
lactamica ("NL"). El radioinmunoensayo confirmó que los
epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales están
expuestos en la superficie de aislamientos intactos de Neisseria
meningitidis de diferentes serotipos y serogrupos y deberán
también ser accesibles a las enzimas proteolíticas (Figura 5). Los
anticuerpos monoclonales se unieron fuertemente a sus epítopos
diana sobre la superficie de todas las cepas de Neisseria
meningitidis analizadas. Los valores de unión registrados
(entre 3.000 a 35.000 CPM) variaron de una cepa a otra y con el
estado fisiológico de la bacteria. Como control negativo se usó un
anticuerpo monoclonal específico de la porina de Haemophilus
influenzae para cada cepa bacteriana. Se obtuvieron recuentos
inferiores a 500 CPM y después se restaron de cada valor de unión.
Con respecto a las cepas de Neisseria meningitidis analizadas
en este ensayo, los resultados mostrados en la Figura 5 para los
anticuerpos monoclonales Me-5 y Me-7
son representativos de los resultados obtenidos con los anticuerpos
monoclonales Me-1, Me-2,
Me-3 y Me-6. Con respecto a las
otras cepas bacterianas analizadas, las actividades de unión
mostradas para Me-7 son representativas de las
actividades de unión con otros anticuerpos monoclonales que
reconocían la misma cepa bacteriana.
También se evaluó la conservación antigénica de
los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales. Para la
detección selectiva rápida de los anticuerpos monoclonales contra un
gran número de cepas bacterianas se usó un inmunoensayo enzimático
de transferencia. Este ensayo se realizó como han descrito
previamente los inventores [Lussier y col., J. Immunoassay, 10,
pág. 373 (1989)]. En este estudio se usó una colección de 71 cepas
de Neisseria meningitidis. La muestra incluyó 19 aislamientos
del serogrupo A, 23 aislamientos del serogrupo B, 13 aislamientos
del serogrupo C, 1 aislamiento del serogrupo 29E, 6 aislamientos del
serogrupo W-135, 1 aislamiento del serogrupo X, 2
aislamientos del serogrupo Y, 2 aislamientos del serogrupo Z y 4
aislamientos de los que no se conocía el serogrupo ("NS").
Estos aislamientos se obtuvieron del Caribbean Epidemiology Centre,
Port of Spain, Trinidad; Children's Hospital of Eastern Ontario,
Ottawa, Canadá; Department of Saskatchewan Health, Regina, Canadá;
Laboratoire de Santé Publique du Québec, Montreal, Canadá;
Max-Planck Institut fur Molekulare Genetik, Berlín,
FRG; Montreal Children Hospital, Montreal, Canadá; Victoria General
Hospital, Halifax, Canadá; y nuestra propia colección de cepas.
También se analizaron las siguientes especies bacterianas: 16
Neisseria gonorrhoeae, 4 Neisseria cinerea, 5
Neisseria lactamica, 1 Neisseria flava, 1
Neisseria flavescens, 3 Neisseria mucosa, 4
Neisseria perflava/sicca, 4 Neisseria perflava, 1
Neisseria sicca, 1 Neisseria subflava y 5 Moraxella
catarrhalis, 1 Alcaligenes feacalis (ATCC 8750), 1
Citrobacter freundii (ATCC 2080), 1 Edwarsiella tarda
(ATCC 15947), 1 Enterobacter cloaca (ATCC 23355), 1
Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), 1 Escherichia
coli, 1 Flavobacterium odoratum, 1 Haemophilus
influenzae tipo b (cepa Eagan), 1 Klebsiella pneumoniae
(ATCC 13883), 1 Proteus rettgeri (ATCC 25932), 1 Proteus
vulgaris (ATCC 13315), 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC
9027), 1 Salmonella typhimurium (ATCC 14028), 1 Serrati
marcescens (ATCC 8100), 1 Shigella flexneri (ATCC
12022), 1 Shigella sonnei (ATCC 9290). Se obtuvieron de la
Colección Americana de cultivos Tipo o una colección conservada en
el Laboratory Centre for Disease Control, Ottawa, Canadá. Las
reactividades de los anticuerpos monoclonales con las cepas de
Neisseria más relevantes se presentan en la Tabla 1. Un
anticuerpo monoclonal, Me-7, reconocí su epítopo
específico en el 100% de las 71 cepas de Neisseria
meningitidis analizadas. Este anticuerpo monoclonal, así como
as Me-2, Me-3, Me-5
y Me-6, también reaccionó con ciertas cepas
pertenecientes a otras especies de Neisseria, lo que indica
que su epítopo específico también se expresa en otra
Neisseriaceae estrechamente relacionada. A excepción de una
leve reacción con una cepa de Neisseria lactamica, el
anticuerpo monoclonal Me-1 sólo reaccionó con
aislamientos de Neisseria meningitidis. Me-1
también se analizó con otra muestra de 177 aislamientos de
Neisseria meningitidis y pudo identificar correctamente más
del 99% del total de las cepas de Neisseria meningitidis
analizadas. Además de las cepas de Neisseria presentadas en
la Tabla 1, los anticuerpos monoclonales no reaccionaron con ninguna
de las otras especies bacterianas mencionadas en lo que
antecede.
En conclusión, los inventores generaron seis
anticuerpos monoclonales que reaccionaban específicamente con la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
Usando estos anticuerpos monoclonales, los inventores han
demostrado que sus epítopos específicos están 1) localizados en una
proteína de 22 kDa resistente a la proteinasa K presente en la
membrana externa de Neisseria meningitidis, 2) conservados
entre los aislamientos de Neisseria meningitidis, 3)
expuestos en la superficie de células intactas de Neisseria
meningitidis y accesibles a anticuerpos, y 4) la reactividad de
estos anticuerpos monoclonales con la proteína de superficie de 22
kDa de Neisseria meningitidis no se modifica con el
tratamiento con peryodato sódico, lo que sugiere que sus epítopos
específicos no se localizan en los hidratos de carbono.
Aunque los inventores han encontrado que la
migración de la proteína de 22 kDa de Neisseria meningitidis
se desplaza a un peso molecular aparente de aproximadamente 18 kDa
cuando se calienta en condiciones estrictas, los inventores han
observado que la migración no se modifica con el tratamiento con
2-mercaptoetanol.
Los inventores también han demostrado que la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
no tiene una similitud antigénica con la proteína lip, otra proteína
de peso molecular bajo y altamente conservada en la membrana
externa de Neisseria meningitidis.
Como se presentará en el ejemplo 3, estos
anticuerpos monoclonales también han reaccionado con la proteína de
superficie de 22 kDa recombinante purificada producidos tras la
transformación de la cepa BL21 de Escherichia coli (DE3) con
un vector plasmídico pNP2202 que contiene el gen codificador de la
proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se construyó una biblioteca de ADN genómico de
LambdaGEM-11 de la cepa 608B de Neisseria
meningitidis (B:2a:P1.2) de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante (Promega CO, Madison, WI). Brevemente, el ADN genómico
de la cepa 608B se digirió parcialmente con Sau 3AI y fragmentos que
varían entre 9 y 23 Kb se purificaron en gel de agarosa antes de
ligarse en los sitios Bam HI de las ramas de
LambdaGEM-11. Los fagos recombinantes resultantes
se usaron para infectar la cepa LE392 de Escherichia coli
(Promega) que después se sembró en placas de agar LB. Se
identificaron diecinueve placas positivas tras la
inmuno-detección selectiva de la biblioteca con los
anticuerpos monoclonales específicos de la proteína de superficie de
22 kDa de Neisseria meningitidis del Ejemplo 2 usando el
protocolo siguiente. Las placas se incubaron 15 minutos a -20ºC para
endurecer la parte superior del agar. Suavemente se aplicaron
filtros de nitrocelulosa sobre la superficie de las placas durante
30 minutos a 4ºC para absorber las proteínas producidas por los
clones víricos recombinantes. A continuación, los filtros se
lavaron el 0,02% de PBS-Tween (vol/col) y se realizó
inmunotransferencia tal y como se ha descrito previamente [Lussier
y col., J. Immunoassay, 10, pág. 373 (1989)]. Tras la amplificación
y purificación del ADN se seleccionó un clon vírico, Denominado clon
8, que tenía un inserto de 13 Kb, para los experimentos de
subclonación. Tras la digestión de este clon con Sac I se obtuvieron
dos fragmentos de 5 y 8 Kb. Estos fragmentos se purificaron en gel
de agarosa y se ligaron en el sitio de restricción Sac I del
plásmido de bajo número de copias pWKS30 [Wang y Kushner, Gene, 100,
pág. 195 (1991)]. Los plásmidos recombinantes se usaron para
transformar la cepa JM109 de Escherichia coli (Promega)
mediante electroporación (Bio-Rad, Mississauga,
Ont., Canadá) siguiendo las recomendaciones del fabricante y las
colonias resultantes se sometieron a detección selectiva con los
anticuerpos monoclonales específicos de la proteína de superficie de
22 kDa de Neisseria meningitidis del Ejemplo 2. Sólo se
observaron colonias positivas cuando las bacterias se transformaron
con el plásmido que portaba el inserto de 8 Kb.
El análisis de tipo western (la metodología se
describió en el Ejemplo 2) de los clones positivos mostró que la
proteína expresada por Escherichia coli estaba completa y
migraba en gel SDS-PAGE como la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis. Para reducir
más el tamaño del inserto se digirió un clon que contenía el
fragmento de 8 Kb con Cla I y, después, un fragmento de 2,75 Kb se
ligó en el sitio Cla I del plásmido pWKS30. El análisis de
transferencia de tipo western de los clones resultantes indicó
claramente de nuevo que la proteína expresada por Escherichia
coli estaba completa y migraba en gel SDS-PAGE
como la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis nativa.
Tras el análisis de restricción se mostró que
dos clones, denominados pNP2202 y pNP2203, portaban el inserto de
2,75 Kb en orientaciones opuestas y se seleccionaron para proceder
con la secuenciación del gen codificador de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis. El "Double
Stranded Nested Deletion Kit" de Pharmacia Biotech Inc.
(Piscataway, NJ) se usó de acuerdo con las instrucciones del
fabricante para generar una serie de deleciones en nido de ambos
clones. Los insertos truncados resultantes se secuenciaron desde el
cebador directo M13 presente en el vector pWKS30 con el "Taq Dye
Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit" usando un secuenciador
automático modelo 373A de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Después de secuenciar el inserto en ambas
direcciones, la secuencia de nucleótidos reveló un marco de lectura
abierto compuesto por 525 nucleótidos (incluido el codón de
terminación) que codifica una proteína compuesta por 174 residuos
de aminoácidos que tienen un peso molecular predicho de 18.000
dalton y un pI de 9,93. La secuencia de nucleótidos y la de
aminoácidos deducida se presenta en la Figura 1 (SEC ID Nº 1; SEC ID
Nº 2).
Para confirmar la expresión correcta del gen
clonado se determinó la secuencia de aminoácidos del extremo N de
la proteína de superficie nativa de 22 kDa derivada de la cepa 608B
de Neisseria meningitidis con el fin de compararla con la
secuencia de aminoácidos deducida a partir de los datos de la
secuenciación de nucleótidos. La preparación de membrana externa
derivada de la cepa 608B de Neisseria meningitidis se
resolvió mediante electroforesis en un gel de
SDS-PAGE al 14% y se transfirió a una membrana de
difluoruro de polivinilideno (Millipore Products, Bedford MA) de
acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente [Sambrook y
col., Molecular Cloning; a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)]. La banda de proteína de 22 kDa se
escindió del gel y después se sometió a degradación de Edman usando
el secuenciador automático de proteínas modelo 473A de Applied
Biosystems Inc. (Foster City, CA) siguiendo las recomendaciones del
fabricante. La secuencia de aminoácidos
E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A
correspondió a los aminoácidos 1-10 (SEC ID Nº 2)
del marco de lectura abierto, lo que indica que la proteína de
superficie de 22 kDa de la cepa 608B de Neisseria
meningitidis tiene una secuencia líder de 19 aminoácidos
(Residuos de aminoácidos -19 a -1 de la SEC ID Nº 2).
Una búsqueda en las bases de datos establecidas
confirmó que la proteína de superficie de 22 kDa de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis (SEC ID Nº 2) o su gen (SEC ID Nº 1)
no se habían descrito previamente.
El siguiente procedimiento se desarrolló con el
fin de maximizar la producción y purificación de la proteína de
superficie de 22 kDa recombinante de Neisseria meningitidis
expresada en Escherichia coli. Este procedimiento se basa en
la observación de que la proteína de superficie de 22 kDa
recombinante producida por la cepa BL21(DE3) de
Escherichia coli [Studier y Moffat, J. Mol. Biol., 189, pág.
113 (1986)] que porta el plásmido pNP2202 se puede encontrar en
grandes cantidades en la membrana externa, pero también se pueden
obtener a partir del sobrenadante del cultivo en el que la proteína
es más abundante. Por tanto, el sobrenadante del cultivo fue el
material usado para purificar la proteína de 22 kDa recombinante
usando cromatografía de afinidad (Figura 6A).
Para generar una matriz de cromatografía de
afinidad, los anticuerpos monoclonales Me-2,
Me-3 y Me-5 (descritos en el
Ejemplo 2) se inmovilizaron en sefarosa 4B
activada-CNBr (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway,
NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para preparar el sobrenadante del cultivo, un
cultivo durante la noche de la cepa BL21(DE3) de
Escherichia coli, que aloja el plásmido pNP2202, se inoculó
en caldo LB (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) que contiene
25 mg/ml de ampicilina (Sigma) y se incubó 4 horas a 37ºC con
agitación. Las células bacterianas se eliminaron del medio de
cultivo mediante dos centrifugaciones a 10.000 Xg durante 10 minutos
a 4ºC. El sobrenadante del cultivo se filtró en una membrana de
0,22 mm (Millipore, Bedfords, MA) y después se concentró
aproximadamente 100 veces usando una membrana de ultrafiltración
((Amicon Co., Beverly, MA) con un corte molecular de 10.000 dalton.
Para solubilizar completamente las vesículas de membrana, se añadió
Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, CA)) al sobrenadante de
cultivo concentrado hasta una concentración final de 1% (vol/vol).
La suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora, se
dializó durante la noche frente a varios litros de tampón
Tris-HCl 10 mM, pH 7,3 que contiene 0,05% de Empigen
BB_(vol/vol) y se centrifugó a 10.000 Xg durante 20 minutos
a 4ºC. La preparación antigénica se añadió a la matriz de afinidad y
se incubó durante la noche a 4ºC con agitación constante. La pasta
en gel se vertió en una columna de cromatografía y se lavó
extensamente con tampón Tris-HCl 10 mM, a ph 7,3 que
contiene 0,05% de Empigen BB (vol/vol). A continuación, la proteína
de 22 kDa recombinante se eluyó de la columna con LiCl 1M en tampón
Tris-HCl 10 mM a pH 7,3. La solución que contiene
la proteína eluida se dializó extensamente contra varios litros de
tampón Tris-HCl 10 mM a pH 7,3 que contiene 0,05%
de Empigen BB. Se usaron geles de SDS-PAGE teñidos
con azul de Coomassie y plata [Tsai y Frasch, Analytical Biochem.,
119, pág. 19 (1982)] para evaluar la pureza de la proteína de
superficie recombinante de 22 kDa en cada etapa del procedimiento
de purificación y los resultados representativos de presentan en la
Figura 6A. La tinción de plata de los geles claramente demostró que
el procedimiento de purificación generaba una proteína de 22 kDa
recombinante bastante pura con sólo una pequeña cantidad de
lipopolisacárido de Escherichia coli.
La resistencia a la escisión proteolítica de la
proteína de superficie recombinante purificada de 22 kDa también se
verificó y los resultados se presentan en la Figura 6B. La proteína
de superficie recombinante purificada de 22 kDa se trató como se ha
descrito en el Ejemplo 1 con \alpha-quimotripsina
y tripsina a 2 mg por mg de proteína y con 2 UI de proteinasa K por
mg de proteína durante 1 hora a 37ºC con agitación constante. No se
observó reducción en la cantidad de proteína después de cualquiera
de estos tratamientos.
En comparación, se observó digestión parcial o
completa en función de la enzima seleccionada para la proteína
control que, en este caso fue seroalbúmina bovina (BSA, Sigma).
Además, periodos más prolongados de tratamiento no tuvieron como
resultado ninguna modificación de la proteína. Estos últimos
resultados demostraron que las células transformadas de
Escherichia coli pueden expresar la proteína de superficie
de 22 kDa recombinante competa y que esta proteína también es
altamente resistente a la acción de estas tres enzimas
proteolíticas como lo era la proteína nativa encontrada en
Neisseria meningitidis. Además, la proteína de superficie de
22 kDa recombinante purificada que no está embebida en la membrana
externa de Escherichia coli todavía es altamente resistente
a la acción de las enzimas proteolíticas.
Los inventores también han verificado el efecto
de los tratamientos enzimáticos sobre las propiedades antigénicas
de la proteína recombinante de 22 kDa. Como se determina mediante
ELISA e Inmunotransferencia de tipo western, los anticuerpos
monoclonales descritos en el Ejemplo 2 reconocieron con facilidad la
proteína de superficie de 22 kDa recombinante que se purificó de
acuerdo con el procedimiento descrito en lo que antecede (Figura
6C). Además, la reactividad del anticuerpo monoclonal
Me-5, así como la reactividad de otros anticuerpos
monoclonales específicos de la proteína de 22 kDa, con la proteína
de superficie de 22 kDa recombinante purificada no se alteró con
ninguno de os tratamientos enzimáticos, lo que confirma que las
propiedades antigénicas de la proteína de 22 kDa recombinante
parecen similares a las descritas para la proteína nativa.
En el ejemplo 3 se presentaron datos importantes
y se pueden resumir del siguiente modo:
1) Se obtuvieron las secuencias de nucleótidos y
de aminoácidos de la proteína de superficie de 22 kDa de la cepa de
Neisseria meningitidis 608B (SEC ID Nº 1; SEC ID Nº 2).
2) La secuenciación del extremo N de la proteína
nativa confirmó que el gen de 22 kDa de Neisseria
meningitidis sí se había clonado;
3) esta proteína no se había descrito
previamente;
4) es posible transformar un huésped como
Escherichia coli y obtener la expresión de la proteína de
superficie de 22 kDa recombinante de Neisseria meningitidis
con alto rendimiento;
5) es posible obtener la proteína recombinante
libre de otras moléculas de Neisseria meningitidis y casi
libre de los componentes producidos por Escherichia coli;
6) la proteína de superficie de 22 kDa
recombinante purificada permanece altamente resistente a la acción
de enzimas proteolíticas tales como
\alpha-quimotripsina, tripsina y proteinasa K,
y
7) las propiedades antigénicas de la proteína de
22 kDa recombinante se comparan con las descritas para la proteína
de superficie de 22 kDa nativa de Neisseria meningitidis.
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Para verificar la conservación molecular entre
los aislamientos de Neisseria de la codificación génica para
la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis
se usó un ensayo de hibridación de transferencia en puntos de ADN
para analizar las diferentes especies de Neisseria y otras
especies bacterianas. En primer lugar, la secuencia de codificación
génica de 525 pares de bases para la proteína de superficie de 22
kDa de Neisseria meningitidis se amplificó mediante PCR, se
purificó en gel de agarosa y se marcó mediante cebado aleatorio con
el sistema de detección y marcaje de ADN DIG no radiactivo
((Boehringer Mannheim, Laval, Canadá) siguiendo las instrucciones
del fabricante.
El ensayo de transferencia de puntos de ADN se
realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer
Mannheim). Brevemente, las cepas bacterianas que se van a analizar
se transfirieron en forma de puntos a una membrana de nylon de
carga positiva (Boehringer Mannheim), se secaron y después se
trataron tal y como se describe en la guía de usuario del sistema
DIG para levantamiento de colonias. Se efectuaron
pre-hibridaciones e hibridaciones a 42ºC con
soluciones que contenían formamida al 50% (Sigma). La solución
pre-hibridación también contenía 100 mg/ml de ADN
de esperma de arenque (Boehringer Mannheim) como agente bloqueante
adicional para prevenir la hibridación inespecífica de la sonda de
ADN. Las etapas estrictas de lavados y detección usando el sustrato
PPD lumigen quimioluminiscente también se realizaron tal y como se
describe en la guía del usuario del sistema DIG.
Para las 71 cepas de Neisseria
meningitidis analizadas, los resultados obtenidos con el
anticuerpo monoclonal Me-7 y la sonda de ADN de 525
pares de bases coincidían perfectamente. De acuerdo con los
resultados, todas las cepas de Neisseria meningitidis
analizadas tienen el gen de la proteína de superficie de 22 kDa de
Neisseria meningitidis y expresan la proteína, dado que todas
fueron reconocidas por el anticuerpo monoclonal por lo que se
confirma que esta proteína está altamente conservada entre los
aislamientos de Neisseria meningitidis (Tabla 2).
La sonda de ADN también detectó el gen
codificador de la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria
meningitidis en todas las cepas de Neisseria gonorrhoeae
analizadas.
Por el contrario, el anticuerpo monoclonal
Me-7 sólo reaccionó con 2 de las 16 cepas de
Neisseria gonorrhoeae analizadas, lo que indica que el
epítopo específico está de alguna manera ausente, inaccesible o
modificado en las cepas de Neisseria gonorrhoeae o que la
mayoría de las cepas de Neisseria gonorrhoeae no expresan la
proteína aunque tengan la secuencia codificadora en su genoma (Tabla
2).
También se observó una buena correlación entre
los dos procedimientos de detección para Neisseria lactamica,
dado que sólo se encontró una cepa de Neisseria lactamica
con el gen y que no expresaba la proteína (Tabla 2). Este resultado
también se pudo explicar con las mismas razones presentadas en el
último párrafo.
Esto puede indicar que, aunque no se expresa la
proteína de 22 kDa, o no está accesible sobre la superficie de las
cepas de Neisseria gonorrhoeae, el gen codificador de la
proteína de 22 kDa de las cepas de Neisseria gonorrhoeae y
Neisseria lactamica se puede usar para la construcción de
plásmidos recombinantes usados para la producción de la proteína de
superficie de 22 kDa o de análogos. Todas estas proteínas o análogos
pueden usarse para la prevención, detección o diagnóstico de
infecciones causadas por Neisseria. Más particularmente,
tales infecciones pueden seleccionarse de infecciones producidas por
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria
lactamica Por tanto, la proteína de superficie de 22 kDa o sus
análogos se puede usar para la fabricación de una vacuna contra
dichas infecciones. Además, la proteína de 22 kDa o sus análogos
puede usarse para la fabricación de un kit para la detección o el
diagnóstico de dichas infecciones.
Los resultados obtenidos con cepas de
Moraxella catharralis mostraron que de las 5 cepas
analizadas, 3 reaccionaron con el anticuerpo monoclonal
Me-7, pero ninguna de ellas reaccionó con la sonda
de ADN, lo que indica que el gen codificador de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis está ausente
del genoma de estas cepas (Tabla 2).
Se analizaron varias otras especies de
Neisseria así como otras especies bacterianas (véase la nota
al pie de la Tabla 2) y se encontró que ninguna de ellas era
positiva con cualquiera de las dos pruebas. Este último resultado
parece indicar que el gen de la proteína de superficie de 22 kDa
sólo se comparte entre las especies estrechamente relacionadas de
Neisseriacae.
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En conclusión, el ensayo de hibridación con ADN
indicó claramente que el gen codificador de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis está altamente
conservada entre las Neisseria patogénicas. Además, los
resultados obtenidos mostraron claramente que esta sonda de ADN
podría convertirse en una valiosa herramienta para la detección
rápida u directa de bacterias Neisseria patogénicas en
muestras clínicas. Esta sonda podría incluso perfeccionarse más
para discriminar entre Neisseria meningitidis y Neisseria
gonorrhoeae.
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La actividad bacteriolítica de los anticuerpos
monoclonales específicos de la proteína de superficie purificada de
22 kDa de Neisseria meningitidis se evaluó in vitro de
acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente [Brodeur y
col., Infect. Immun., 50, pág. 510 (1985); Martin y col., Infect.
Immun., 60, pág. 2718 (1992)]. En presencia de un complemento de
suero de cobaya, los anticuerpos monoclonales purificados
Me-1 y Me-7 mataron con eficiencia
a la cepa 608B de Neisseria meningitidis. Concentraciones
relativamente bajas de cada uno de estos anticuerpos monoclonales
redujeron en más de un 50% el número de bacterias viables. La
utilización de concentraciones superiores de anticuerpos
monoclonales purificados Me-1 y Me-7
tuvo como resultado una aguda disminución (hasta un 99%) del número
de unidades formadoras de colonias bacterianas. Es importante el
hecho de que la actividad bacteriolítica de estos anticuerpos
monoclonales dependen de del complemento, ya que la inactivación
por calor del suero de cobaya durante 30 minutos a 56ºC anuló
completamente la actividad de muerte. Los otros anticuerpos
monoclonales no exhibieron una actividad bacteriolítica
significativa contra la misma cepa. Los resultados combinados
representativos de varios experimentos se presentan en la Figura 7,
en la que los resultados mostrados para Me-7 son
representativos y consistentes con los resultados obtenidos para
Me-1. Los resultados mostrados para
Me-2 son representativos y consistentes con los
resultados obtenidos para los demás anticuerpos monoclonales
Me-3, Me-5 y
Me-6.
Para evaluar la actividad protectora de cada
anticuerpo monoclonal se usó un modelo de ratón de infección, que
había descrito previamente uno de los inventores [Brodeur y col,
Infect. Immun., 50, pág. 510 (1985); Brodeur y col., Can. J.
Microbiol., 32, pág. 33 (1986)]. Brevemente, se inyectó a los
ratones Balb/c por vía intraperitoneal 600 ml de fluido ascítico
que contiene anticuerpos monoclonales 18 hors antes de la exposición
a la bacteria. A continuación, los ratones fueron expuestos a un ml
de una suspensión que contenía 1000 unidades formadoras de colonias
de la cepa 608B de Neisseria meningitidis, 4% de mucina
(Sigma) y 1,6% de hemoglobina (Sigma). Los resultados combinados de
varios experimentos se presentan en la Tabla 3. Es importante
destacar que sólo los anticuerpos monoclonales bacteriolíticos
Me-1 y Me-7 protegieron a los
ratones contra la infección experimental producida por Neisseria
meningitidis. De hecho, la inyección de fluido ascítico que
contenía estos dos anticuerpos monoclonales antes de la exposición
a la bacteria incrementó de forma significativa el índice de
supervivencia de los ratones Balb/c hasta un 70% o más en
comparación con el 9% observado en los grupos control que
recibieron 600 ml de fluido ascítico inducido con Sp2/0 o 600 ml de
fluido ascítico que contiene anticuerpos monoclonales no
relacionados. Los resultados también han indicado que el 80% de los
ratones sobrevivió a la infección si previamente se les había
inyectado 400 \mug de Me-7 purificado con
proteína A 18 horas antes de la exposición a la bacteria.
Actualmente se están realizando más experimentos para determinar la
concentración mínima necesaria para proteger al 50% de los ratones.
Se observaron menores índices de supervivencia del 20 al 40% para
los demás anticuerpos monoclonales específicos de la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis.
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En conclusión, los resultados indicaron
claramente que un anticuerpo específico para la proteína de
superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis puede
proteger con eficacia a los ratones contra una exposición letal
experimental. La inducción de anticuerpos protectores por un
antígeno es uno de los criterios más importantes para justificar la
realización de más investigaciones sobre un potencial candidato a
vacuna.
La proteína de superficie recombinante
purificada de 22 kDa se preparó de acuerdo con el protocolo
presentado en el Ejemplo 3 y se usó para inmunizar ratones Balb/c
para determinar su efecto protector contra la exposición con una
dosis letal de la cepa 608B de Neisseria meningitidis
(B:2a:P1.2). Se decidió usar la proteína recombinante
purificada en lugar de la proteína meningocócica nativa con el fin
de asegurarse de que no había otro antígeno meningocócico en la
preparación vacunal usada durante estos experimentos. El modelo de
ratón de infección usado en estos experimentos había sido descrito
previamente por uno de los inventores [Brodeur y col, Infect.
Immun., 50, pág. 510 (1985); Brodeur y col., Can. J. Microbiol., 32,
pág. 33 (1986)].. A cada ratón se le inyectó por vía subcutánea
tres veces a intervalos de tres semanas 100 ml de la preparación
antigénica que contenía 10 ó 20 \mug por ratón de la proteína de
superficie recombinante purificada de 22 kDa. Para estos
experimentos se usó el adyuvante QuilA a una concentración de 25
\mug por inyección. Los ratones en los grupos control fueron
inyectados siguiendo el mismo procedimiento con 10 ó 20 \mug de
BSA, 20 \mug de sobrenadante de cultivo concentrado de la cepa
BL21 (DE3) de Escherichia coli portadora del plásmido pWKS30
sin el inserto del gen para la proteína meningocócica preparada tal
y como se describe en el Ejemplo 3, o solución salina tamponada con
fosfato. Las muestras de suero de cada ratón se obtuvieron antes de
cada inyección con el fin de analizar el desarrollo de la respuesta
inmunitaria contra la proteína recombinante. Dos semanas después de
la tercera inmunización, se inyectó a los ratones de todos los
grupos por vía intraperitoneal 1 ml de una suspensión que contenía
1000 unidades formadoras de colonias de la cepa 608B de Neisseria
meningitidis en 4% de mucina (Sigma) y 1,6% de hemoglobina
(Sigma).
Los resultados de estos experimentos se
presentan en la Tabla 4. El ochenta por ciento (80%) de los ratones
inmunizados con la proteína de superficie recombinante purificada de
22 kDa sobrevivió a la exposición a la bacteria en comparación con
el 0-42% en los grupos control. Es importante el
hecho de que los ratones del grupo control a los que se inyectó
sobrenadante de cultivo concentrado de Escherichia coli no
estaban protegidos frente a la exposición a la bacteria. Este
último resultado indicó claramente que los componentes presentes en
el medio de cultivo y los antígenos de Escherichia coli que
podrían estar presentes en pequeñas cantidades tras la purificación
no contribuyen a la protección observada frente a Neisseria
meningitidis.
\vskip1.000000\baselineskip
La inyección de proteína de superficie
recombinante purificada de 22 kDa protegió considerablemente a los
ratones inmunizados contra el desarrollo de una infección letal por
Neisseria meningitidis.
Ejemplos de anticuerpos se encuentran en líneas
celulares de hibridoma murino productoras de los anticuerpos
monoclonales Me-1 y Me-7 depositadas
en la Colección Americana de Cultivos Tipo en Rockville, Maryland,
EE.UU. el 21 de julio de 1995. A los depósitos se les asignaron
números de registro HB 11959 (Me-1) y HB 11958
(Me-7).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN de 2,75 kb digerido con clal
que contenía el gen codificador de la proteína de superficie de 22
kDa se aisló del ADN genómico de las diferentes cepas de
Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae tal y
como se describe en el ejemplo 3.
a) cepa MCH88: La secuencia de nucleótidos de la
cepa MCH88 (aislamiento clínico) se presenta en la Figura 8 (SEC ID
Nº 3). De las pruebas experimentales obtenidas de la cepa 608B
(Ejemplo 3) se dedujo una secuencia líder putativa correspondiente
a los aminoácidos -19 a -1
(M-K-K-A-L-A-A-L-I
A-L-A-L-P-A-A-A-L-A).
Una búsqueda en las bases de datos establecidas confirmó que la
proteína de superficie de 22 kDa de la cepa MCH 188 de Neisseria
meningitidis (SEC ID Nº 4) o su gen (SEC ID Nº 3) no se habían
descrito previamente.
b) cepa Z4063: La secuencia de nucleótidos de la
cepa Z4063 (Wang J.-F. y col. Infect. Immun., 60, pág. 5267 (1992))
se presenta en la Figura 9 (SEC ID Nº 5). De las pruebas
experimentales obtenidas de la cepa 608B (Ejemplo 3) se dedujo una
secuencia líder putativa correspondiente a los aminoácidos -19 a -1
(M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A).
Una búsqueda en las bases de datos establecidas confirmó que la
proteína de superficie de 22 kDa de la cepa Z4063 de Neisseria
meningitidis (SEC ID Nº 6) o su gen (SEC ID Nº 5) no se habían
descrito previamente.
c) cepa b2 de Neisseria gonorrhoeae: La
secuencia de nucleótidos de la cepa b2 de Neisseria
gonorrhoeae (serotipo 1 Nat.Ref. Center for Neisseria, LCDC,
Ottawa, Canadá) se describe en la Figura 10 (SEC ID Nº 7). De las
pruebas experimentales obtenidas de la cepa 608B (Ejemplo 3) se
dedujo una secuencia líder putativa correspondiente a los
aminoácidos -19 a -1
(M-K-K-A
L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A).
Una búsqueda en las bases de datos establecidas confirmó que la
proteína de superficie de 22 kDa de la cepa b2 de Neisseria
gonorrhoeae (SEC ID Nº 8) o su gen (SEC ID Nº 7) no se habían
descrito previamente.
La figura 11 muestra la secuencia consenso
establecida a partir de la secuencia de ADN de las cuatro cepas
analizadas. La cepa MCH88 mostró una inserción de un codón (TCA) en
el nucleótido 217, pero, en general, las cuatro cepas mostraron una
sorprendente homología.
La Figura 12 representa la homología entre la
secuencia de aminoácidos deducida obtenida de las cuatro cepas.
Entre las cuatro cepas hay una identidad superior al 90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Conejos y monos fueron inmunizados con la
proteína recombinante de 22 kDa para evaluar la respuesta de
anticuerpos en especies distintas a los ratones.
Conejos macho New Zealand fueron inmunizados con
preparaciones de membrana externa obtenidas de la cepa JM109 de
E. coli con el plásmido pN2202 o con el plásmido control
pWKS30 (la cepa y los plásmidos se describen en el Ejemplo 3). La
extracción con cloruro de litio usada para obtener estas
preparaciones de membrana externa se realizó del modo previamente
descrito por los inventores [Brodeur y col, Infect. Immun. 50, 510
(1985)]. El contenido proteico de estas preparaciones se determinó
mediante el método de Lowry adaptado a las fracciones de membrana
[Lowry y col., J. Biol. Chem. 193, pág. 265 (1951)]. Se inyectó a
los conejos por vía subcutánea e intramuscular en varios sitios dos
veces a intervalos de tres semanas 150 \mug de una de las
preparaciones de la membrana externa descritas en lo que antecede.
El adyuvante usado para estas inmunizaciones fue QuilA, a una
concentración final del 20% (vol./vol.) (CedarLane Laboratories,
Hornby, Ont., Canadá). El desarrollo de la respuesta humoral
específica se analizó mediante ELISA usando preparaciones de
membrana externa extraídas de la cepa 608B de Neisseria
meningitidis B:2a:P1.2) como antígeno de recubrimiento y
mediante inmunotransferencia de tipo western siguiendo los
procedimientos ya descritos por los inventores [Brodeur y col.,
Infect. Immun. 50, 510 (1985); Martin y col., Eur. J. Immunol. 18,
601 (1988)]. Para estos ensayos se usaron inmunoglobulinas de burro
anti-conejo marcadas con fosfatasa alcalina o con
peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove,
PA).
La inyección de preparación de membrana externa
de E. coli que contenía la proteína recombinante de 22 kDa
en combinación con el adyuvante QuilA indujo en el conejo una fuerte
respuesta humoral específica de 1/32.000 determinada mediante ELISA
(Figura 13). Los anticuerpos inducidos tras la inyección de la
proteína recombinante de 22 kDa reaccionaron con la proteína
recombinante purificada de 22 kDa, pero es más importante el hecho
de que también reconocieron la proteína nativa expresada, plegada y
embebida en la membrana externa de Neisseria meningitidis.
Los experimentos de inmunotransferencia de tipo western indicaron
claramente que los anticuerpos presentes tras la segunda inyección
reconocían sobre la membrana de nitrocelulosa la misma banda
proteica que la relevada por el AcMo Me-2 (descrito
en el Ejemplo 2), que es específica de la proteína de 22 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos monos Macaca fascicularis
(cinomolgos) fueron inmunizados respectivamente con dos inyecciones
de 100 \mug (K28) y 200 \mug (I276) de proteína recombinante
purificada por afinidad de 22 kDa por inyección. Los procedimientos
usados para producir y purificar la proteína de la cepa BL21De3 de
E. coli se han descrito en el Ejemplo 3. El adyuvante usado
para esas inmunizaciones fue Alhidrogel a una concentración final
del 20% (vol./vol.) (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Canadá).
Los monos recibieron dos inyecciones intramusculares a intervalos
de tres semanas. Un mono control (K65) fue inmunizado con una
preparación de proteína recombinante no relacionada siguiendo los
mismos procedimientos. Los sueros se analizaron tal y como se ha
descrito en lo que antecede. Para estos ensayos se usaron
inmunoglobulinas de burro anti-conejo marcadas con
fosfatasa alcalina o con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch
Laboratories, West Grove, PA).
La respuesta de anticuerpos específica del mono
K28 inmunizado con 100 \mug de la proteína purificada por
inyección apareció más rápido y fue más fuerte que la observada para
el mono I276, al que se le inyectaron 200 \mug de proteína
(Figura 14). Los anticuerpos específicos para la proteína de 22 kDa
nativa detectados mediante inmunotransferencia de tipo western ya
estaban presentes en el suero de los monos inmunizados veintiún
días después de la primera inyección, pero estaban ausentes en el
suero del mono control tras dos inyecciones del antígeno
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados en los Ejemplos 2 y 5
mostraron claramente que la inyección de la proteína recombinante
de 22 kDa puede inducir una respuesta humoral protectora en ratones
que está dirigida contra las cepas de Neisseria
meningitidis. Es más importante el hecho de que los resultados
presentados en este ejemplo demuestran que esta respuesta
inmunológica no está restringida a únicamente una especie, sino que
esta proteína de superficie recombinante también puede estimular el
sistema inmunitario de otras especies como los conejos o los
monos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mapeó el epítopo de la proteína de superficie
de 22 kDa de Neisseria meningitidis usando un procedimiento
descrito por uno de los inventores [Martin y col. Infect. Immun
(1991): 59:1457-1464]. La identificación de los
epítopos lineales se consiguió usando 18 péptidos sintéticos
solapantes que cubren toda la secuencia de la proteína de 22 kDa de
Neisseria meningitidis derivada de la cepa 608B (Figura 15) y
el suero hiperinmune obtenido tras la inmunización con esta
proteína. La identificación de las porciones inmunodominantes en la
proteína de 22 kDa puede ser útil en el diseño de nuevas vacunas
eficaces. Además, la localización de estos epítopos de las células
B también proporciona información valiosa sobre la configuración
estructural de la proteína en la membrana externa de Neisseria
meningitidis. Todos los péptidos fueron sintetizados por BioChem
Immunosystems Inc. (Montreal, Canadá) con el sintetizador peptídico
automático de Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Los péptidos
sintéticos se purificaron mediante cromatografía de líquidos a alta
presión de fase inversa. Los péptidos CS-845,
CS-847, CS-848,
CS-851, CS-852 y
CS-856 (Figura 15) se solubilizaron en un volumen
pequeño de guanidina-HCl 6M (J.T. Baker, Ontario,
Canadá) o dimetilsulfóxido (J.T. Baker). A continuación se ajustó
estos péptidos a 1 mg/ml con agua destilada. Todos los demás
péptidos estaban libremente solubles en agua destilada y también se
ajustaron a 1 mg/ml.
Se realizaron ensayos de inmunosorción ligada a
enzimas (ELISA) con los péptido mediante el recubrimiento de
péptidos sintéticos en placas de microtitulación (Immulon 4,
Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) a una concentración de
50 \mug/ml en tampón carbonato 50 mM, a pH 9,6. Tras la incubación
durante la noche a temperatura ambiente, las placas se lavaron con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,05%
(p/vol) de Tween 20 (Sigma Chemical Co., St.-Louis, Mo.) y se
bloquearon con PBS que contenía 0,5% (p/vol) de seroalbúmina bovina
(Sigma). Los sueros obtenidos de ratones y monos inmunizados con la
proteína de superficie recombinante purificada pro afinidad de 22
kDa se diluyeron y a las placas de ELISA se añadieron 100 \mul
por pocillo de cada dilución y se incubaron durante 1 hora a 37ºC.
Las placas se lavaron tres veces y se añadieron 100 \mul de
inmunoglobulinas de cabra anti-ratón o
anti-humanas conjugadas con fosfatas alcalina
Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) diluidas de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Tras la incubación
durante 1 hora a 37ºC, las placas se lavaron y se añadieron 100
\mul de dietanolamina (10% (vol/vol), pH 9,8) que contiene
p-nitro-fenilfosfato (Sigma) a 1
mg/ml. Tras 60 minutos, la reacción (\lambda= 410 nm) se leyó
espectrofotométricamente con un lector de microplacas.
Antisueros de ratón y mono obtenidos tras la
inmunización con proteína recombinante purificada por afinidad de
22 kDa (Ejemplo 8) se usaron con éxito en combinación con dieciocho
péptidos sintéticos solapantes para localizar los epítopos de las
células B en la proteína. Estos epítopos se agrupan dentro de tres
dominios antigénicos sobre la proteína.
La primera región se localiza entre los residuos
de aminoácidos y 86. Los análisis por ordenador usando diferentes
algoritmos sugirieron que esta región tiene la mayor probabilidad de
ser inmunológicamente importante porque es hidrófila y está
expuesta en la superficie. Además, la comparación de las cuatro
secuencias proteicas que se presenta en la Figura 12 indica que una
de las principales variaciones, que es la inserción de un residuo
de aminoácido en la posición 73, también está localizada en esta
región.
Los antisueros identificaron un segundo dominio
antigénico localizado entre los residuos de aminoácidos 110 y 140.
Es interesante el hecho de que el análisis de la secuencia reveló
que siete de los catorce residuos de aminoácidos que no están
conservados entre las cuatro secuencias proteicas están agrupados
dentro de esta región de la proteína.
Un tercer dominio antigénico localizado en una
porción altamente conservada de la proteína, entre los residuos de
aminoácidos 31 y 55, sólo fue reconocido por los sueros de
monos.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen codificador de la proteína de superficie
de 22 kDa de Neisseria meningitidis se inserto en el plásmido
p629 [George y col. Bio/technology 5: 600-603
(1987)]. Un casete del gen represor sensible a la temperatura c1857
del bacteriofago \lambda, del que se ha eliminado el promotor
funcional Pr, es transportado por el plásmido p629 que usa el
promotor PL para controlar la síntesis de la proteína de superficie
de 22 kDa. La inactivación del represor c1857 por un cambio de
temperatura de 30ºC a temperaturas superiores a 38ºC tiene como
resultado la producción de la proteína codificada por el plásmido.
La inducción de la expresión génica en células de E. coli
por un cambio de temperatura es ventajoso para la fermentación a
gran escala y que se puede conseguir con facilidad con los
fermentadores modernos. Otros vectores de expresión inducible
normalmente requieren la adición de moléculas específicas como
lactosa o
isopropiltio-\beta-D-galatosidasa
(IPTG) en el medio de cultivo con el fin de inducir la expresión
del gen deseado.
Un fragmento de 540 nucleótidos se amplificó
mediante PCR a partir del ADN genómico de la cepa 608B de
Neisseria meningitidis usando los siguientes dos cebadores
oligonucleotídicos (OCRR8 5'-_TAATAGATCTAT
GAAAAAAGCACTTGCCAC-3' y OCRR9: 3'-CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5'). Estos cebadores
corresponden a las secuencias nucleotídicas encontradas en ambos extremos del gen de 22 kDa. Para simplificar la clonación del producto de la PCR se incorporó un sitio de restricción Bgl II (AGATCT) en la secuencia nucleotídica de estos cebadores. El producto de la PCR se purificó en gel de agarosa antes de su digestión con Bgl II. Este fragmento de BgI II de aproximadamente 525 pares de bases se insertó después en los sitios Bgl II y Bam HI del plásmido p629. El plásmido que contiene el inserto producto de la PCR denominado pNP2204 se usó para transformar la cepa DH5aF'IQ de E. coli. En la Figura 16 se presenta un mapa parcial del plásmido pNP2204. Las colonias resultantes se sometieron a detección selectiva con anticuerpos monoclonales específicos de la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis que se describen en el Ejemplo 2. El análisis de transferencia de tipo western de los clones resultantes indicó claramente que la proteína sintetizada por E. coli estaba completa y migraba en el gel de SDS-PAGE como la proteína de superficie nativa de 22 kDa de Neisseria meningitidis. El ADN del plásmido se purificó del clon seleccionado y después se secuenció. La secuencia nucleotídica del inserto presente en el plásmido coincidía perfectamente con la secuencia nucleotídica del gen codificador de la proteína de 22 kDa de Neisseria meningitidis que se presenta en la Figura 1.
GAAAAAAGCACTTGCCAC-3' y OCRR9: 3'-CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5'). Estos cebadores
corresponden a las secuencias nucleotídicas encontradas en ambos extremos del gen de 22 kDa. Para simplificar la clonación del producto de la PCR se incorporó un sitio de restricción Bgl II (AGATCT) en la secuencia nucleotídica de estos cebadores. El producto de la PCR se purificó en gel de agarosa antes de su digestión con Bgl II. Este fragmento de BgI II de aproximadamente 525 pares de bases se insertó después en los sitios Bgl II y Bam HI del plásmido p629. El plásmido que contiene el inserto producto de la PCR denominado pNP2204 se usó para transformar la cepa DH5aF'IQ de E. coli. En la Figura 16 se presenta un mapa parcial del plásmido pNP2204. Las colonias resultantes se sometieron a detección selectiva con anticuerpos monoclonales específicos de la proteína de superficie de 22 kDa de Neisseria meningitidis que se describen en el Ejemplo 2. El análisis de transferencia de tipo western de los clones resultantes indicó claramente que la proteína sintetizada por E. coli estaba completa y migraba en el gel de SDS-PAGE como la proteína de superficie nativa de 22 kDa de Neisseria meningitidis. El ADN del plásmido se purificó del clon seleccionado y después se secuenció. La secuencia nucleotídica del inserto presente en el plásmido coincidía perfectamente con la secuencia nucleotídica del gen codificador de la proteína de 22 kDa de Neisseria meningitidis que se presenta en la Figura 1.
Para estudiar el nivel de síntesis de la
proteína de superficie de 22 kDa se usó el plásmido inducible por
temperatura pNP2204 para transformar las siguientes cepas de E.
coli: W3110, JM105, BL21, TOPP1, TOPP2 y TOPP3. El nivel de
síntesis de la proteína de superficie de 22 kDa y la localización de
la proteína en las diferentes fracciones celulares se determinaron
para cada cepa. Los cultivos en matraz de agitación en caldo LB
(Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) indicaron que un
cambio de temperatura de 30ºC a 39ºC inducía de forma eficaz la
expresión del gen. La evaluación en el curso del tiempo del nivel de
síntesis indicó que la proteína aparecía, según se determina en el
gel de SDS-PAGE, tan pronto como 30 minutos después
de la inducción y que la cantidad de proteína aumentaba de forma
constante durante el periodo de inducción. Se determinaron los
niveles de expresión entre 8 y 10 mg de proteína de 22 kDa por litro
para las cepas W3110 y TOPP1 de E. coli. Para ambas cepas,
la mayoría de la proteína de 22 kDa se incorpora en la membrana
externa bacteriana.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que la gran mayoría de la proteína de 22
kDa está embebida en la membrana externa de las cepas de E.
coli, el protocolo de purificación presentado en este ejemplo es
diferente del ya descrito en el ejemplo 3 en el que una gran
cantidad de proteína se liberó en el sobrenadante del cultivo. Un
cultivo durante la noche incubado a 30ºC de la cepa de E.
coli W3110 o TOPP1 que aloja el plásmido pNP2204 se inoculó en
caldo LB que contiene 50 \mug/ml de ampicilina (Sigma) y se
cultivó a 30ºC con agitación (250 rpm) hasta que se alcanzó una
densidad celular de 0,6 (\lambda= 600 nm), punto en el cual la
temperatura de incubación se cambió a 39ºC durante de tres a cinco
horas para inducir la producción de la proteína. Las células
bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 8.000 xg
durante 15 minutos a 4ºC y se lavaron dos veces en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,3. Las células bacterianas se
rompieron con ultrasonidos (también se pueden usar desintegración
balística o desintegración mecánica con una prensa francesa). Las
células no fragmentadas se eliminaron mediante centrifugación a
5.000 xg durante 5 minutos y se desecharon. Las membranas externas
se separaron de los componentes del citoplasma mediante
centrifugación a 100.000 xg durante 1 hora a 10ºC. Los sedimentos
que contienen la membrana se resuspendieron en un volumen pequeño de
PBS a pH 7,3. Para solubilizar la proteína de superficie de 22 kDa
de las membranas se usaron detergentes tales como Empigen BB
(Calbiochem Co., LaJolla, CA), Zwittergent-3,14
(Calbiochem Co.), o \beta-octilglucósido (Sigma).
El detergente se añadió a la fracción de membrana a una
concentración final del 3% y la mezcla se incubó durante 1 hora a
20ºC. El material no soluble se eliminó mediante centrifugación a
100.000 xg durante 1 hora a 10ºC.
La proteína de 22 kDa se solubilizó de forma
eficaz mediante tres de los detergentes, no obstante el
\beta-octilglucósido presentaba la ventaja de
eliminar con facilidad varias proteínas de membrana no deseadas
debido a que no se solubilizaron y se pudo separarlas del
sobrenadante mediante centrifugación. Para eliminar el detergente,
el sobrenadante que contenía la proteína de 22 kDa se dializó
extensamente frente a varios cambios de tampón PBS. El tratamiento
con proteinasa K (como en el Ejemplo 1) se puede usar para eliminar
más proteínas no deseadas de la preparación de proteína de
superficie de 22 kDa. La precipitación diferencial con sulfato
amónico o disolventes orgánicos y la ultrafiltración son dos etapas
adicionales que se pueden usar para eliminar ácido nucleico y
contaminantes polisacáridos no deseados de las proteínas antes de
que la permeación en gel y la cromatografía de intercambio iónico
se puedan usar con eficacia para obtener la proteína de 22 kDa
purificada. También se puede usar cromatografía de afinidad, como
se describe en el ejemplo 3, para purificar la proteína de 22
kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para formular una vacuna para uso humano se
pueden seleccionar antígenos de proteína de superficie de 22 kDa de
los polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva. Por
ejemplo, un experto en la técnica podría diseñar una vacuna
alrededor del polipéptido de 22 kDa o fragmentos del mismo que
contienen un epítopo inmunogénico. El uso de técnicas de biología
molecular es particularmente adecuado para la preparación de
antígenos recombinantes sustancialmente puros.
La composición vacuna puede tomar una variedad
de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación
sólida, semisólida y líquida, tales como polvos, soluciones líquidas
o suspensiones, y liposomas. Según la creencia de los inventores de
que los antígenos de la proteína de superficie de 22 kDa de esta
invención pueden provocar una respuesta inmunitaria protectora
cuando se administran a un ser humano, las composiciones de esta
invención serán similares a las usadas para inmunizar seres humanos
con otras proteínas y polipéptidos, por ejemplo tétanos y difteria.
Por tanto, las composiciones de esta invención comprenderán,
preferentemente, un adyuvante farmacéuticamente aceptable tal como
adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de alúmina, un péptido de
muramilo, una emulsión de agua en aceite, un liposoma, un ISCOM o
CTB, o una subunidad B no tóxica de la toxina del cólera. Más
preferentemente, las composiciones incluirán una emulsión de agua en
aceite o hidróxido de aluminio como adyuvante.
La composición se administraría al paciente en
cualquiera de una serie de formas farmacéuticamente aceptables,
incluidas las vías intramuscular, intradérmica, subcutánea o tópica.
Preferentemente, la vacuna se administrará por vía
intramuscular.
Generalmente, la forma de dosificación
consistirá en una inyección inicial, más probablemente con
adyuvante, de aproximadamente 0,01 a 10 mg, y preferentemente de
0,1 a 1,0 mg de antígeno de la proteína de superficie de 22 kDa por
paciente, seguida muy probablemente por una o más inyecciones de
refuerzo. Preferentemente, los refuerzos se administrarán
aproximadamente 1 y 6 meses después de la inyección inicial.
Una consideración en relación con el desarrollo
de la vacuna es la cuestión de la inmunidad mucosa. La vacuna
mucosa ideal se tomará de un modo seguro por vía oral o intranasal
como una o algunas dosis y producirá anticuerpos protectores en las
superficies adecuadas a lo largo de la inmunidad sistémica. La
composición vacunal mucosa puede incluir adyuvantes, portadores de
partículas inertes o vectores recombinantes vivos.
Los anticuerpos de la proteína de superficie de
22 kDa de esta invención son útiles para inmunoterapia pasiva e
inmunoprofilaxis de seres humanos infectados con Neisseria
meningitidis o bacterias relacionadas, tales como Neisseria
gonorrhoeae o Neisseria lactamica. Las formas y regímenes de
dosificación para tal inmunización pasiva serían similares a los de
otras inmunoterapias pasivas.
Un ejemplo de anticuerpo es un hibridoma
productor de AcMo Me-1 o Me-7
depositado en la Colección Americana de cultivos Tipo en Rockville,
Maryland, EE.UU. el 21 de julio de 1995, y se identifica como líneas
celulares de hibridoma murino, Me-1 y
Me-7 respectivamente. A estos depósitos se les
asignó los números de registro HB 11959 (Me-1) y HB
11958 (Me-7).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Brodeur, Bernard R
\hskip3,9cm Martin, Denis
\hskip3,9cm Hamel, Josee
\hskip3,9cm Rioux, Clement
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA DE SUPERFICIE DE NEISSERIA MENINGITIDIS RESISTENTE A LA PROTEINASA K
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Goudreau Gage Dubuc y Martineau Walter
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 800 Place victoria, Suite 3400, tour de la Bourse
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Montreal
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Québec
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Canadá
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: H4Z 1E9
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Emisión de patente 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLITID:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLITID: US 08/406.362
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 17 DE MARZO DE 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLITID: USO (PROVIS) 60/001.983
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 4 DE AGOSTO DE 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Leclerc/Dubuc/Prince, Alain/Jean/Gaetan
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: EIOVAC-1 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 514-397-7400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 514-397-4382
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 830 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 143..199
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-mat
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 200..667
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 710 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: MCH88
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 116..643
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 116..172
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-mat
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 173..643
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 175 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 850 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Z4063
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 208..732
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 208..264
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-mat
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 265..732
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 810 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CEPA: b2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 241..765
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido-señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 241..297
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Neisseria meningitidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 608B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (38)
1. Una molécula de ADN aislada que hibrida a
42ºC en presencia de 50% de formamida con un gen codificador de una
proteína de superficie de Neisseria que tiene un peso molecular
aparente de 22 kDa, en la que dicho gen es una molécula de ADN tal
y como se define en las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5 o SEC
ID Nº 7, y en la que dicha molécula de ADN aislada codifica una
proteína de superficie de Neisseria que es capaz de inducir un
anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido compuesto por
la secuencia de aminoácidos que se indica en las SEC ID Nº 2, 4, 6
u 8.
2. La molécula de ADN aislada de la
reivindicación 1, en la que la proteína de superficie de Neisseria
es una proteína de superficie de Neisseria meningitidis.
3. La molécula de ADN aislada de la
reivindicación 1, en la que la molécula de ADN tal como se define en
las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 7 es una
molécula de ADN bicatenaria.
4. La molécula de ADN aislada de la
reivindicación 1, compuesta por una secuencia de ADN que se
selecciona de la base 143 a la base 664 de la SEC ID Nº 1, la base
200 a la base 664 de la SEC ID Nº 1, la base 116 a la base 640 de
la SEC ID Nº 3, la base 173 a la base 640 de la SEC ID Nº 3, la base
208 a la base 729 de la SEC ID Nº 5, la base 265 a la base 729 de
la SEC ID Nº 5, la base 241 a la base 762 de la SEC ID Nº 7, la base
298 a la base 762 de la SEC ID Nº 7 y las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3,
SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 7.
5. La molécula de ADN aislada de la
reivindicación 1, que codifica uno cualquiera de los péptidos
seleccionados de las SEC ID Nº 9, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC
ID Nº 13, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 15, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17,
SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 21, SEC ID Nº
22, SEC ID Nº 23, SEC ID Nº 24, SEC ID Nº 25, y SEC ID Nº 26 o uno
cualquiera de los polipéptidos seleccionados de las SEC ID Nº 2, SEC
ID Nº 4, SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 8, o uno cualquiera de los
polipéptidos seleccionados desde el aminoácido 1 al aminoácido 155
de la SEC ID Nº 2, el aminoácido 1 al aminoácido 156 de la SEC ID Nº
4, el aminoácido 1 al aminoácido 155 de la SEC ID Nº 6 y el
aminoácido 1 al aminoácido 155 de la SEC ID Nº 8.
6. Una molécula de ADN recombinante que
comprende
- (i)
- la molécula de ADN aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y
- (ii)
- una secuencia control de la expresión unida operativamente a dicha molécula de AND.
7. La molécula de ADN recombinante de la
reivindicación 6, en la que dicha secuencia de control de la
expresión es inducible, en la que dicha secuencia de control de la
expresión es inducible por un estímulo escogido de temperatura,
lactosa e IPTG.
8. La molécula de ADN recombinante de la
reivindicación 7, en la que la secuencia de control de la expresión
es un promotor seleccionado de los promotores \lambda PL,
\lambda PR, TAC, T7, T3, LAC y TRP.
9. Un huésped unicelular transformado con la
molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las
reivindicaciones 6-8, en el que dicho huésped se
escoge de las cepas JM109 de E. coli, BL21 (DE3) de E.
coli, DH5aF'IQ de E. coli, W3110 de E. coli,
JM105 de E. coli, BL21 de E. coli, TOPP1 de E.
coli, TOPP2 de E. coli y TOPP3 de E. coli.
10. Un procedimiento para producir la molécula
de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones
1-5, que comprende las etapas de cultivar el
huésped unicelular de la reivindicación 9 y aislar dicha molécula de
ADN.
11. Un polipéptido aislado codificado por la
molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones
1-5, en el que el polipéptido aislado es capaz de
inducir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido
compuesto por la secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID Nº
2, 4, 6 u 8.
12. El polipéptido aislado de la reivindicación
11, en el que el polipéptido aislado está libre de otras proteínas
de origen de Neisseria meningitidis.
13. El polipéptido aislado de la reivindicación
11, en el que dicho polipéptido aislado puede inducir, cuando se
inyecta en un huésped animal, el desarrollo de una respuesta
inmunológica que puede proteger contra la infección producida por
Neisseria meningitidis.
14. El polipéptido aislado de una cualquiera de
las reivindicaciones 11-13, tal y como se define
mediante las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 6 o SEC ID Nº 8, y fragmentos
del mismo tal y como se define mediante las SEC ID Nº 9, SEC ID Nº
10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 14, SEC ID
Nº 15, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19, SEC
ID Nº 20, SEC ID Nº 21, SEC ID Nº 22, SEC ID Nº 23, SEC ID Nº 24,
SEC ID Nº 25 o SEC ID Nº 26.
\newpage
15. Un procedimiento para producir el
polipéptido aislado de la reivindicación 11, que comprende las
etapas de cultivar el huésped unicelular de la reivindicación 9 y
recuperar el polipéptido de la reivindicación 11.
16. Un procedimiento para aislar el polipéptido
aislado de cualquiera de las reivindicaciones 11-14,
que comprende:
- (a)
- aislar un cultivo de la bacteria Neisseria meningitidis;
- (b)
- aislar una porción de membrana externa en dicho cultivo; y
- (c)
- aislar dicho polipéptido de dicha porción de membrana externa.
\vskip1.000000\baselineskip
17. El procedimiento de la reivindicación 16,
que además comprende tratar dicha porción de membrana externa con
proteinasa K.
18. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones
11-14, en la que la composición es una vacuna.
19. La composición farmacéutica de la
reivindicación 18, que además comprende un excipiente
farmacéutico.
20. Un procedimiento para fabricar una vacuna
para la prevención de infecciones producidas por Neisseria
meningitidis y/o Neisseria gonorrhoeae en seres humanos,
que comprende mezclar el polipéptido aislado de cualquiera de las
reivindicaciones 11-14 con un excipiente o adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
21. Una cantidad eficaz del polipéptido aislado
de cualquiera de las reivindicaciones 11-14 para
usar en la prevención de infecciones producidas por Neisseria
meningitidis y/o Neisseria gonorrhoeae en seres
humanos.
22. Uso del polipéptido aislado de cualquiera de
las reivindicaciones 11-14 para la fabricación de
una vacuna para la prevención de infecciones producidas por
Neisseria meningitidis y/o Neisseria gonorrhoeae en
seres humanos.
23. Un anticuerpo o un fragmento del mismo de
unión a antígeno que se une específicamente a un polipéptido
compuesto por la secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID Nº
2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 6 o SEC ID Nº 8.
24. El anticuerpo de la reivindicación 23, que
es un anticuerpo monoclonal.
25. El anticuerpo de la reivindicación 23 o la
reivindicación 24, en el que el anticuerpo es de origen murino.
26. El anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 23-25, en el que el anticuerpo es
un isotipo de IgG.
27. Un procedimiento para aislar el anticuerpo
de la reivindicación 23, que comprende:
- a)
- introducir el polipéptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 11-14 en un mamífero; y
- b)
- aislar suero del mamífero que contiene dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Un procedimiento para aislar el anticuerpo
monoclonal de la reivindicación 24, que comprende,
- a)
- introducir el polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14 en un mamífero;
- b)
- fusionar las células productoras de anticuerpos del mamífero con células de mieloma para formar células de hibridoma; y
- c)
- aislar dicho anticuerpo monoclonal de dichas células de hibridoma.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Una composición farmacéutica que comprende
el anticuerpo o un fragmento del mismo, de unión a antígeno de una
cualquiera de las reivindicaciones 23-26 y un
excipiente farmacéutico.
30. Un procedimiento para fabricar una
composición farmacéutica para la prevención de infecciones
producidas por Neisseria meningitidis y/o Neisseria
gonorrhoeae en seres humanos, que comprende mezclar el
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones
11-14 con un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
31. Uso de una cantidad farmacéuticamente eficaz
del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones
23-26 para la fabricación de un medicamento para la
prevención de infecciones producidas por Neisseria
meningitidis en seres humanos.
32. Un procedimiento para la detección de un
antígeno de Neisseria meningitidis en una muestra biológica
aislada de un paciente, que comprende:
- a)
- incubar el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 23-26 con dicha muestra biológica para formar una mezcla; y
- b)
- detectar en la mezcla el anticuerpo específicamente unido al antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
33. Un procedimiento para la detección de un
anticuerpo específico de un antígeno de Neisseria
meningitidis en una muestra biológica aislada de un paciente,
que comprende:
- a)
- incubar el polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14 con dicha muestra biológica para formar una mezcla; y
- b)
- detectar en la mezcla el polipéptido específicamente unido al anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Un anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 23-26 para usar en el tratamiento
médico del cuerpo humano y/o animal.
35. Uso del polipéptido aislado de cualquiera de
las reivindicaciones 11-14 para fabricar un kit para
la detección diagnóstico de la infección producida por Neisseria
meningitidis en seres humanos.
36. Un procedimiento para la detección de
bacteria Neisseria meningitidis patogénica en una muestra
biológica aislada de un paciente, que comprende
- a)
- poner en contacto dicha muestra con una sonda de ADN que tiene una secuencia de ADN de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para formar una mezcla; y
- b)
- detectar la hibridación mediante dicha sonda de ADN con un polinucleótido en la mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
37. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, en el que dicha sonda de ADN es un oligómero que
tiene una secuencia complementaria a al menos 6 nucleótidos
contiguos de una cualquiera de los polinucleótidos de las SEC ID Nº
1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 7.
38. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 37, que además comprende una etapa de amplificar un
ADN diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa con un
conjunto de oligómeros que tienen una secuencia (i) complementaria
a al menos 6 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3,
SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 7, y (ii) que flanquean dicho ADN
diana.
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|---|---|---|---|
| US19833 | 1987-02-27 | ||
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