TW202128737A - Ａａｖ轉移盒 - Google Patents

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Abstract

本文闡述用於產生重組腺相關病毒(rAAV)載體之AAV轉移盒及質體。所揭示盒及質體包含一或多種轉殖基因，該一或多種轉殖基因具有改善、治療及/或預防一或多種疾病或病症、例如 C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick Disease) (NPC1) 之治療效能。

Description

AAV轉移盒
本揭示案係關於分子生物學及基因療法之領域。更特定而言，揭示案係關於用於產生重組病毒載體之組合物及方法。
C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick Disease) (NPC1)係特徵在於內溶酶體區室中之膽固醇累積之神經退化病症。其係由編碼NPC1之基因突變引起，NPC1係調介細胞內膽固醇輸送之內溶酶體蛋白。
NPC1可存在於嬰兒、兒童或成人中。新生兒可因肝浸潤而出現腹水及嚴重肝病，及/或因肺浸潤而出現呼吸衰竭。其他沒有肝病或肺病之嬰兒具有低張症及發育 遲緩。典型表現發生在兒童中晚期，伴有共濟失調、垂直核上性凝視麻痹(VSGP)及失智症之隱匿性發作。肌張力障礙及癲癇較為常見。發音困難及吞嚥困難最終變得無能，使得無法進行口服餵養；死亡通常發生在吸入性肺炎之第二個或第三個十年後期。成人更可能出現失智症或精神病學症狀。
已顯示在NPC1動物模型中2-羥丙基-β-環糊精(HPBCD)减少膽固醇及脂質累積且延長存活期。然而，目前尚無經美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准之NPC1療法。因此，迫切需要用於治療、治癒及/或預防NPC1之組合物及方法。
本文闡述AAV轉移盒、核酸及用於產生用於遞送核酸(例如包含轉殖基因之核酸)之重組腺相關病毒(rAAV)載體之質體。所揭示盒、核酸及質體包含可用於表現一或多種轉殖基因之序列，該一或多種轉殖基因具有改善、治療及/或預防一或多種疾病或病症(例如NPC1)之治療效能。
在一些實施例中，本揭示案提供腺相關病毒(AAV)轉移盒，其包含5’反向末端重複(ITR)、啟動子、轉殖基因、多聚腺苷酸化信號及3’ ITR，其中轉移盒包含內含子序列。在一些實施例中，內含子序列位於啟動子與轉殖基因之間。在一些實施例中，轉殖基因編碼NPC1蛋白。在一些實施例中，AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。
在一些實施例中，本揭示案提供重組AAV載體，其包含蛋白質衣殼及經蛋白質衣殼殼體化之核酸，其中核酸包含轉移盒，該轉移盒自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。在一些實施例中，轉移盒包含內含子序列，例如位於啟動子與轉殖基因之間之內含子序列。在一些實施例中，轉殖基因編碼NPC1蛋白。在一些實施例中，AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。
在一些實施例中，5’ ITR及3’ ITR中之至少一者之長度為約110至約160個核苷酸。在一些實施例中，5’ ITR之長度與3’ ITR相同。在一些實施例中，5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。5’ ITR及3’ ITR中之至少一者可自例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV之基因體分離或獲得。在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列，或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列，或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係誘導型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子可選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子、HSVTK啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β–肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、EF-1短啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及HSVTK啟動子。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 5-8中之任一者至少95%、至少96%、至少97%、至少98%至少99%或100%一致之序列。
在一些實施例中，內含子序列係嵌合序列或雜合序列。在一些實施例中，內含子序列包含自SV40分離或獲得之序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 10-11中之任一者之序列。
NPC1蛋白可為例如人類NPC1蛋白。在一些實施例中，NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%、至少95%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1之序列，或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 20之序列，或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白具有如UniProt登錄號O15118中所示之序列，其整體以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列，或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係選自猿猴病毒40 (SV40)、兔β球蛋白(rBG)、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之序列。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 12或13至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
在一些實施例中，AAV轉移盒進一步包含增強子。增強子可為例如CMV增強子。在一些實施例中，增強子包含SEQ ID NO: 9之序列，或與其至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
本文亦提供包含本揭示案之AAV轉移盒之核酸。本文亦提供包含本揭示案之AAV轉移盒之質體或桿狀病毒質體。
本文亦提供重組AAV載體，其包含蛋白質衣殼及經蛋白質衣殼殼體化之核酸，其中核酸包含本揭示案之AAV轉移盒。
亦提供包含本揭示案之AAV轉移盒之細胞。
亦提供產生重組AAV載體之方法，該方法包括使AAV產生細胞與本揭示案之AAV轉移盒或質體/桿狀病毒質體接觸。亦提供藉由此方法產生之重組AAV載體。重組AAV載體可具有選自以下之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV及牛AAV。重組AAV載體可包含含有衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼，其中衣殼蛋白次單元與野生型AAV之衣殼蛋白次單元相比包含一或多個突變。
亦提供組合物，其包含本揭示案之AAV轉移盒、核酸(例如質體或桿狀病毒質體)、細胞或重組AAV載體。
亦提供治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與治療有效量之本揭示案之AAV轉移盒、核酸(例如質體)、細胞或重組AAV載體。在一些實施例中，個體係人類個體。在一些實施例中，個體患有NPC1。
該等及其他實施例將在下文所述之詳細描述中更詳細地闡述。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2019年10月18日提出申請之美國臨時申請案第62/923,253號及於2019年10月17日提出申請之美國臨時申請案第62/916,749號之優先權，該等美國臨時申請案中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。序列表之說明
與本申請案相關之序列表係以文本格式提供以代替紙質副本，且特此以引用方式併入本說明書中。含有序列表之文本檔案之名稱係STRD_015_02WO_SeqList_ST25.txt。該檔案為約67.6 kb，創建於2020年10月14日，且以電子方式提交。
本文提供用於治療、預防及/或治愈NPC1之基因療法組合物及方法。更特定而言，本揭示案提供用於遞送核酸(例如轉殖基因)之腺相關病毒(AAV)載體及用於治療、預防及/或治愈NPC1之核酸(包括AAV轉移盒)。
AAV可用作基因遞送劑，且係人類基因療法之有力工具。使用AAV，可在活體內 及活體外 在多種細胞中達成高頻DNA遞送及穩定表現。與一些其他病毒載體系統不同，AAV不需要活性細胞分裂來穩定整合於靶細胞中。
在本說明書中引用之所有論文、出版物及專利皆以引用方式併入本文中，如同每一個別論文、出版物或專利具體且個別地指示為以引用方式併入且以引用方式併入本文中，以結合引用之出版物揭示並闡述方法及/或材料。
除非上下文另有指示，否則本文所述之各種特徵可明確意欲以任何組合使用。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習本揭示案所屬領域者通常理解之含義相同之含義。在本文之詳細描述中使用之術語僅出於闡述特定實施例之目的而非意欲進行限制。 定義
在本文之描述及所附申請專利範圍中使用以下術語：
除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該」亦欲包括複數形式。
此外，如本文所用之術語「約」在提及可量測之值(例如多核苷酸或多肽序列之長度、劑量、時間、溫度及諸如此類之量)時意欲涵蓋指定值之± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、± 0.5%或甚至± 0.1%之變化。
同樣如本文所用之「及/或」係指並涵蓋一或多個相關之所列項目之任何及所有可能之組合，以及當在替代方案(「或」)中解釋時缺少組合。
「核酸」或「多核苷酸」係核苷酸鹼基之序列，例如RNA、DNA或DNA-RNA雜合序列(包括天然及非天然核苷酸二者)。在一些實施例中，本揭示案之核酸係單股或雙股DNA序列。核酸之長度可為1-1,000、1,000-10,000、10,000-100,000、100,000-1百萬或大於1百萬個核苷酸。核酸通常將含有磷酸二酯鍵，但在一些情形下包括可具有交替主鏈之核酸類似物，該等交替主鏈包含例如磷醯胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亞磷醯胺鍵聯以及肽核酸主鏈及鍵聯。其他類似核酸包括具有正性主鏈、非離子主鏈及非核糖主鏈之彼等核酸。含有一或多個碳環糖之核酸亦包括在核酸之定義中。核糖-磷酸主鏈之該等修飾可有助於添加標記，或增加該等分子在生理環境中之穩定性及半衰期。本揭示案之核酸可為線性，或可為環狀(例如質體)。
「AAV轉移盒」係可用於產生AAV載體之核酸。
如本文所用之術語「病毒載體」或「病毒性載體」係指用作核酸遞送媒劑且包含包裝在病毒粒子或病毒樣顆粒內之核酸(例如包含轉殖基因之核酸)之病毒顆粒。本揭示案之例示性病毒載體包括腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、慢病毒載體及反轉錄病毒載體。
「腺相關病毒載體」或「AAV載體」通常包含蛋白質衣殼及經蛋白質衣殼殼體化之核酸(例如包含轉殖基因之核酸)。「蛋白質衣殼」係近球形蛋白質外殼，其包含以T=1二十面體對稱締合及排列之個別「衣殼蛋白次單元」 (例如約60個衣殼蛋白次單元)。本文所述AAV載體之蛋白質衣殼包含複數個衣殼蛋白次單元。當AAV載體在本文中闡述為包含AAV衣殼蛋白次單元時，應理解AAV載體包含蛋白質衣殼，其中蛋白質衣殼包含一或多個AAV衣殼蛋白次單元。如本文所用之術語「衣殼蛋白」有時用於指衣殼蛋白次單元。術語「病毒樣顆粒(viral-like particle或virus-like particle)」係指不包含含有轉移盒或轉殖基因之任何載體基因體或核酸之蛋白質衣殼。
如本文所用之術語「腺相關病毒」 (AAV)包括(但不限於) 1型AAV、2型AAV、3型(包括3A型及3B型) AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、rh32.33型AAV、rh8型AAV、rh10型AAV、rh74型AAV、hu.68型AAV、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、蛇AAV、髭頰蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B及現在已知或後來發現之任何其他AAV。例如，參見表1。表 1
GenBank 登錄號    GenBank 登錄號    GenBank 登錄號
完整基因體 進化枝C Rh57 AY530569
腺相關病毒1 NC_002077, AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
腺相關病毒2 NC_001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
腺相關病毒3 NC_001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
腺相關病毒3B NC_001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
腺相關病毒4 NC_001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
腺相關病毒5 Y18065, AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
腺相關病毒6 NC_001862, AAB95450.1 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
禽類AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
禽類AAV株系DA-1 NC_006263, AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
牛AAV NC_005889, AY388617, AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339, AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 ABI16639, DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
進化枝A    Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077, AF063497 Hu3 AY530595 進化枝F   
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 MI332400.1
Hu 46 AY530609 進化枝D    HSC2 MI332401.1
進化枝B    Rh62 AY530573 HSC3 MI332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 MI332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 MI332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 MI332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 MI332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 MI332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 MI332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 MI332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 MI332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 MI332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 MI332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 MI332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 MI332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 MI332415.1
Hu57 AY530619 進化枝E    Hu68   
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 純系分離物   
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065, AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 其他   
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74   
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 髭頰蜥AAV   
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 蛇AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582      
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621      
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557      
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554      
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553      
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555      
重組AAV (rAAV)載體可使用病毒產生細胞株在培養物中產生。術語「病毒產生細胞(viral production cell)」、「病毒產生細胞株(viral production cell line)」或「病毒產生細胞(viral producer cell)」係指用於產生病毒載體之細胞。HEK293及239T細胞係常用的病毒產生細胞株。下表2列出多種病毒載體之例示性病毒產生細胞株。 rAAV之產生通常需要在細胞中存在三種元件：1)側接有AAV反向末端重複(ITR)序列之轉殖基因，2) AAV rep及cap基因，及3)輔助病毒蛋白序列。該三種元件可提供於一或多種質體上，且轉染或轉導至細胞中。表 2 ：例示性病毒產生細胞株
病毒載體 例示性病毒產生細胞株
腺病毒 HEK293、911、pTG6559、PER.C6、GH329、N52.E6、HeLa-E1、UR、VLI-293
腺相關病毒(AAV) HEK293、Sf9
反轉錄病毒 HEK293
慢病毒 293T
「HEK293」係指最初源自生長於組織培養物中之人類胚腎細胞之細胞株。HEK293細胞株易於生長於培養物中，且常用於病毒產生。如本文所用之「HEK293」亦可指一或多種變異體HEK293細胞株，即另外包含一或多個遺傳變化之源自原始HEK293細胞株之細胞株。已開發出許多變異體HEK293細胞株且經最佳化用於一或多種特定應用。舉例而言，293T細胞株含有SV40大T-抗原，其允許含有SV40複製起點之轉染質體之游離型複製，從而增加期望基因產物之表現。
「Sf9」係指昆蟲細胞株，其係源自親代草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞株IPLB-Sf-21-AE之純系分離物。Sf9細胞可在血清不存在下生長且可附著或懸浮培養。
「轉染試劑」意指增強核酸轉移至細胞中之組合物。此項技術中常用之一些轉染試劑包括一或多種結合至核酸及細胞表面之脂質(例如LipofectamineTM )。
如本文所用之術語「感染複數」或「MOI」係指與細胞接觸之病毒粒子數。舉例而言，經培養細胞可以介於1 × 102 至1 × 105 個病毒粒子/細胞範圍內之MOI與AAV接觸。
如本文所用之「有效量」係可有效地治療或預防個體之疾病或病症或改善其體征或症狀之AAV載體、核酸或本文所提供之其他劑之量。「有效量」可端視例如疾病及/或疾病之症狀、疾病及/或疾病或病症之症狀之嚴重程度、欲治療患者之年齡、體重及/或健康狀況以及開處方醫師之判斷而變化。在任何給定情況下，合適之量可由熟習此項技術者確定，或可能夠藉由常規實驗來確定。
此項技術中已知測定兩個或更多個胺基酸序列之間之序列相似性或一致性之方法。序列相似性或一致性可針對整個核酸長度或所指示核酸部分來測定。序列相似性或一致性可使用此項技術中已知之標準技術(包括但不限於Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)之局部序列一致性演算法)、藉由Needleman及Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)之序列一致性比對演算法、藉由 Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444 (1988)之相似性搜索方法、藉由該等演算法(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)之計算實施、Devereux等人，Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)所述之最佳擬合序列程式或藉由檢查來測定。
另一適宜演算法係Altschul等人，J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)及Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)中所述之BLAST演算法。尤其有用之BLAST程式係自Altschul等人，Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); h t t p: / / blast.wustl/edu/blast/ README.html獲得之WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2利用若干搜索參數，該等搜索參數視情況地設定為預設值。該等參數係動態值且由程式本身端視特定序列之組成及正在搜索感興趣序列之特定資料庫之組成來建立；然而，可調整該等值以增加靈敏度。
此外，另一有用之演算法係如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402報導之空位化BLAST。
出於本揭示案之目的，除非另有指示，否則一致性%係使用可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上在線獲得之基本局部比對搜索工具(BLAST)來計算。熟習此項技術者將了解，可視需要取代其他演算法。 反向末端重複
反向末端重複或ITR序列係調介AAV前病毒整合且用於將AAV DNA包裝至病毒粒子中之序列。ITR參與AAV生命週期中之多種活動。舉例而言，可形成髮夾結構之ITR序列在轉染後自質體切除、載體基因體之複製以及自宿主細胞基因體整合及拯救中起作用。
本揭示案之AAV轉移盒可包含5’ ITR及3’ ITR。ITR序列之長度可為約110至約160個核苷酸，例如長度為110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160個核苷酸。在一些實施例中，ITR序列之長度可為約141個核苷酸。在一些實施例中，5’ ITR之長度與3’ ITR相同。在一些實施例中，5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。在一些實施例中，5’ ITR長於3’ ITR，且在其他實施例中，3’ ITR長於5’ ITR。
ITR可自任一AAV (例如表1中所列出之AAV)之基因體分離或獲得。在一些實施例中，5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV之基因體分離或獲得。在一些實施例中，5’ ITR及3’ITR中之至少一者可為自除AAV外之另一小病毒物種之成員分離或獲得之野生型或突變ITR。舉例而言，在一些實施例中，ITR可為自博卡病毒(bocavirus)或小病毒B19分離或獲得之野生型或突變體ITR。
在一些實施例中，ITR包含促進scAAV產生之修飾。在一些實施例中，促進scAAV產生之修飾係自ITR缺失末端解析序列(TRS)。在一些實施例中，5’ ITR係野生型ITR，且3’ ITR係缺少末端解析序列之突變ITR。在一些實施例中，3’ ITR係野生型ITR，且5’ ITR係缺少末端解析序列之突變ITR。在一些實施例中，末端解析序列不存在於5’ ITR及3’ITR二者中。在其他實施例中，促進scAAV產生之修飾係用不同的髮夾形成序列(例如shRNA形成序列)替代ITR。
在一些實施例中，5’ ITR可包含SEQ ID NO: 3之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，3’ ITR可包含SEQ ID NO: 4之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列，且3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含一或多個“代用” ITR，即與ITR具有相同功能之非ITR序列。例如，參見 Xie, J.等人，Mol. Ther., 25(6): 1363-1374 (2017)。在一些實施例中，AAV轉移盒中之ITR經代用ITR替代。在一些實施例中，代用ITR包含髮夾形成序列。在一些實施例中，代用ITR係短髮夾(sh)RNA形成序列。 啟動子、增強子、抑制子及其他調控序列
基因表現可由側接給定蛋白質之編碼區之核苷酸序列(稱為啟動子及增強子)來控制。
如本文所用之術語「啟動子」係指一或多個引導可操作連接之核酸之轉錄之核酸控制序列。啟動子可包括轉錄起始位點附近之核酸序列，例如TATA元件。啟動子亦可包括可由轉錄因子結合之順式作用多核苷酸序列。
「組成型」啟動子係在大多數環境及發育條件下有活性之啟動子。「誘導型」啟動子係在環境及發育調控下有活性之啟動子。術語「可操作連接」係指核酸表現控制序列(例如啟動子或轉錄因子結合位點之陣列)與第二核酸序列之間之功能鍵聯，其中表現控制序列引導對應於第二序列之核酸之轉錄。
基因表現亦可由一或多種遠端「增強子」或「抑制子」元件來控制，該等元件可位於距轉錄起始位點多達數千個鹼基對處。增強子或抑制子元件以類似於轉錄起始位點附近之順式作用元件之方式調控轉錄，只是增強子元件可在離轉錄起始位點一定距離之處起作用。
在一些實施例中，本文所述之AAV轉移盒包含啟動子。啟動子可為例如組成型啟動子或誘導型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。
可用於本文所述之AAV轉移盒中之例示性啟動子包括CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β–肌動蛋白(CBA)啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：雞β–肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子及EF-1α短啟動子。在一些實施例中，啟動子包含選自SEQ ID NO: 5-8中之任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，本文所述之AAV轉移盒包含增強子。增強子可為例如CMV增強子。在一些實施例中，增強子包含SEQ ID NO: 9之序列或與其至少95%一致之序列。
可用於本文所述之AAV轉移盒中之例示性組織特異性啟動子及增強子之非限制性清單包括：HMG-COA還原酶啟動子；固醇調控元件1 (SRE-1)；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)啟動子；人類C-反應蛋白(CRP)啟動子；人類葡萄糖激酶啟動子；膽固醇7-α羥化酶(CYP-7)啟動子；β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸轉移酶啟動子；胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP-1)啟動子；醛醇縮酶B啟動子；人類運鐵蛋白啟動子；I型膠原啟動子； 前列腺酸磷酸酶(PAP)啟動子；前列腺分泌蛋白94 (PSP 94)啟動子；前列腺特異性抗原複合物啟動子；人類腺激肽釋放酶基因啟動子(hgt-1)；肌細胞特異性增強子結合因子MEF-2；肌肉肌酸激酶啟動子；胰臟炎相關之蛋白質啟動子(PAP)；彈性蛋白酶1轉錄增強子；胰臟特異性澱粉酶及彈性蛋白酶增強子啟動子；胰臟膽固醇酯酶基因啟動子；子宮球蛋白啟動子；膽固醇側鏈裂解(SCC)啟動子；γ-γ烯醇酶(神經元特異性烯醇酶，NSE)啟動子；神經纖絲重鏈(NF-H)啟動子；人類CGL-1/顆粒酶B啟動子；末端去氧轉移酶(TdT)、λ5、VpreB及lck (淋巴球特異性酪胺酸蛋白激酶p561ck)啟動子；人類CD2啟動子及其3'轉錄增強子；人類NK及T細胞特異性活化(NKG5)啟動子；pp60c-src酪胺酸激酶啟動子；器官特異性新抗原(OSN) mw 40 kDa (p40)啟動子；結腸特異性抗原-P啟動子；人類α-乳清蛋白啟動子；磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)啟動子、HER2/neu啟動子、酪蛋白啟動子、IgG啟動子、絨毛膜胚胎抗原啟動子、彈性蛋白酶啟動子、膽色素原去胺酶啟動子、胰島素啟動子、生長激素因子啟動子、酪胺酸羥化酶啟動子、白蛋白啟動子、甲胎蛋白啟動子、乙醯基-膽鹼受體啟動子、醇去氫酶啟動子、α或β球蛋白啟動子、T細胞受體啟動子、骨鈣化素啟動子、IL-2啟動子、IL-2受體啟動子、乳清(wap)啟動子及II類MHC啟動子。 轉殖基因
本文所述之AAV轉移盒包含用於在靶細胞中表現之轉殖基因。
轉殖基因可為任何相關異源核酸序列。該等核酸可包括編碼多肽之核酸，該等多肽包括治療性(例如用於醫學或獸醫用途)或免疫原性(例如用於疫苗)多肽或RNA。替代地，核酸可編碼反義核酸、核酶、影響剪接體介導之/反式剪接(ram-splicing)之RNA、調介基因沈默之干擾RNA (RNAi，包括siRNA、shRNA或miRNA)以及其他非轉譯RNA。在一些實施例中，核酸序列可指導基因編輯。舉例而言，核酸可編碼基因編輯分子，例如嚮導RNA或核酸酶。在一些實施例中，核酸可編碼鋅指核酸酶、歸巢核酸內切酶、TALEN (轉錄活化子樣效應物核酸酶)、NgAgo (agronaute核酸內切酶)、SGN (結構導向核酸內切酶)或RGN (RNA導向核酸酶，例如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)。在一些實施例中，核酸可與宿主染色體上之基因座共用同源性並重組。此方法可用於例如校正宿主細胞中之遺傳缺陷。
本揭示案之病毒載體提供將轉殖基因遞送至寬範圍之細胞(包括分裂細胞及非分裂細胞)中之手段。病毒載體可用於將轉殖基因遞送至活體外 細胞，例如 ，以產生活體外 多肽或用於離體 基因療法。病毒載體另外可用於將轉殖基因遞送至有需要之個體，例如 以表現免疫原性或治療性多肽或功能性RNA之方法中。以此方式，多肽或功能性RNA可在個體之活體內 產生。個體可能需要多肽之原因在於，個體缺乏該多肽。此外，該方法可實踐之原因在於，個體中多肽或功能性RNA之產生可賦予一些有益之效應。如本文所用之術語「功能性RNA」係指在細胞中具有一或多種功能之任何非編碼RNA序列，例如前段中所述之彼等非編碼RNA序列。
病毒載體亦可用於遞送核酸，以在經培養細胞或個體中產生感興趣之多肽或功能性RNA (例如，將個體用作生物反應器來產生多肽或觀察功能性RNA對個體之效應，例如與篩選方法結合進行)。
一般而言，本揭示案之病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之轉殖基因，以治療及/或預防遞送治療性多肽或功能性RNA係有益之任何疾病狀態。
在一些實施例中，轉殖基因可用於治療NPC1。在一些實施例中，轉殖基因編碼NPC1蛋白。NPC1蛋白可為例如人類NPC1蛋白。在一些實施例中，NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含表3中所列出之一或多個單胺基酸變化(基於SEQ ID NO: 1編號)。在一些實施例中，NPC1蛋白包含表3中所列出之一或多個胺基酸變化(基於SEQ ID NO: 20編號)。在一些實施例中，NPC1蛋白係人類NPC1蛋白之截短形式。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1之序列，或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 20之序列，或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1或20之序列，相對於其具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多個胺基酸變化。在一些實施例中，NPC1蛋白包含具有表3中所列出之一或多個胺基酸變化之SEQ ID NO: 1之或20序列。在一些實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在一些實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列，或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列，或相對於其具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多個核酸變化之序列。表 3 ： NPC1 變異體序列
位置編號基於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 20。
位置 突變 位置 突變 位置 突變
63 C→R 691 P→L 1012 G→D
74 C→Y 695 L→V 1015 G→V
92 Q→R 700 D→N 1016 H→R
113 C→R 703 F→S 1023 V→G
137 T→M 724 L→P 1034 G→R
151 S→G 727 V→F 1035 A→V
166 P→S 734 S→I 1036 T→K
177 C→G 742 E→K 1036 T→M
177 C→Y 745 A→E 1049 A→V
215 H→R 754 M→K 1054 A→T
222 N→S 757 V→A 1059 R→Q
231 V→G 763 F→L 1061 I→T
237 P→S 767 A→V 1062 A→V
242 D→H 775 Q→P 1066 T→N
242 D→N 789 R→C 1087 F→L
247 C→Y 789 R→G 1088 Y→C
248 G→V 825 Y→C 1089 E→K
272 M→R 849 S→I 1094 I→T
333 G→D 858 I→V 1097 D→N
372 R→W 862 Q→L 1137 N→I
378 V→A 865 S→L 1140 G→V
380 L→F 871 Y→C 1142 M→T
381 W→C 873 V→A 1150 N→K
388 A→P 874 D→V 1156 N→I
389 R→C 888 P→S 1156 N→S
401 P→T 889 V→M 1165 V→M
404 R→P 890 Y→C 1167 F→L
404 R→Q 899 Y→D 1168 C→Y
404 R→W 910 G→S 1174 A→V
433 P→L 917 D→Y 1186 R→H
434 P→L 926 A→T 1189 E→G
434 P→S 927 A→V 1205 T→K
451 E→K 928 Q→P 1205 T→R
472 L→P 929 L→P 1212 V→L
473 S→P 934 R→Q 1213 L→F
474 P→L 940 S→L 1213 L→V
479 C→Y 942 W→C 1216 A→V
509 Y→S 943 I→M 1220 I→T
510 H→P 944 D→N 1224 F→L
511 T→M 945 D→N 1236 G→E
512 H→R 948 D→H 1240 G→R
518 R→Q 948 D→N 1249 S→G
518 R→W 948 D→Y 1266 R→Q
521 A→S 950 V→M      
537 F→L 954 S→L      
543 P→L 956 C→Y      
574 T→K 958 R→L      
576 K→R 958 R→Q      
605 A→V 959 V→E      
612 E→D 961-966 NITDQF→S      
615 R→C 961 N→S      
615 R→L 968 N→S      
631 M→R 971 V→G      
640 G→R 976 C→R      
642 M→I 978 R→C      
652 S→W 986 G→S      
660 G→S 992 G→A      
664 V→M 992 G→R      
666 S→N 992 G→W      
670 C→W 996 M→R      
673 G→V 1004 S→L      
684 L→F 1007 P→A      
多聚腺苷酸化(聚A)信號
多聚腺苷酸化信號係在幾乎所有的哺乳動物基因中發現之核苷酸序列且控制一串約200個腺苷殘基(聚(A)尾)添加至基因轉錄物之3′端。聚(A)尾有助於mRNA穩定性，且缺少聚(A)尾之mRNA會迅速降解。亦有證據表明，聚(A)尾之存在藉由影響轉譯之起始而對mRNA之可轉譯性有積極之貢獻。
在一些實施例中，本揭示案之AAV轉移盒包含多聚腺苷酸化信號。多聚腺苷酸化信號可選自猿猴病毒40 (SV40)、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)之多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之序列。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。 填充序列
AAV載體通常接受具有確定大小範圍、通常在約4 kb至約5.2 kb範圍內或稍大一些之DNA插入。因此，對於較短之轉殖基因序列，可能需要包括額外核酸以達成AAV載體可接受之所需長度。因此，在一些實施例中，本揭示案之AAV轉移盒可包含填充序列。填充序列可為例如長度介於1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500至4,500-5,000個核苷酸之間之序列。填充序列可位於盒中任何期望之位置，使得其不妨礙載體之功能或活性。 內含子序列
在一些實施例中，本揭示案之AAV轉移盒可包含內含子序列。與不含內含子序列之表現相比，內含子序列之納入可增強表現。在一些中，內含子序列可增加基因表現而不用作轉錄因子之結合位點。舉例而言，內含子序列可藉由影響轉錄速率、核輸出及轉錄物穩定性來增加轉錄物水準。在一些實施例中，內含子序列增加mRNA轉譯之效率。
在一些實施例中，內含子序列係雜合或嵌合序列。在一些實施例中，內含子序列係自SV40、β-球蛋白、雞β-肌動蛋白、小鼠微小病毒(MVM)、IX因子及/或人類IgG (重鏈或輕鏈)中之一或多者之內含子序列分離或獲得。在一些實施例中，內含子序列係自SV40分離或獲得。在一些實施例中，內含子序列係嵌合的。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11之序列，或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
內含子序列可位於轉移盒中不干擾AAV載體產生之任何地方。舉例而言，在一些實施例中，內含子序列可位於啟動子與轉殖基因之間。 AAV轉移盒
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)轉移盒包含5’反向末端重複(ITR)、啟動子、轉殖基因、多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，轉移盒包含內含子序列，例如位於啟動子與轉殖基因之間之內含子序列。在一些實施例中，轉殖基因編碼NPC1蛋白。在一些實施例中，AAV轉移盒包含增強子。在一些實施例中，AAV轉移盒包含內含子序列。在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列且3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，增強子包含SEQ ID NO: 9之序列。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 5-8中任一者之序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 10或11之序列。在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，聚A信號包含SEQ ID NO: 12或13之序列。在一些實施例中，AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。在一些實施例中，AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14之序列。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、CBA啟動子、SV40內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、SV40多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB240啟動子、嵌合內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、rBG多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB379啟動子、SV40內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、rBG多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB240啟動子、嵌合內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、SV40多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB240啟動子、SV40內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、SV40多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、CMV增強子、HSVTK啟動子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、rBG多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 5之序列之CBA啟動子、含有SEQ ID NO: 10之序列之SV40內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 1)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 12之SV40多聚腺苷酸化信號以及含有SEQ ID NO: 4之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 6之序列之GUSB240啟動子、含有SEQ ID NO: 11之嵌合內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 1)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 13之rBG多聚腺苷酸化信號以及含有SEQ ID NO: 4之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 6之GUSB379啟動子、含有SEQ ID NO: 10之序列之SV40內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 1)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 13之rBG多聚腺苷酸化信號以及含有SEQ ID NO: 4之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 7之GUSB240啟動子、含有SEQ ID NO: 11之序列之嵌合內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 1)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 12之SV40多聚腺苷酸化信號以及含有SEQ ID NO: 4之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 6之GUSB240啟動子、含有SEQ ID NO: 10之序列之SV40內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 1)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 12之SV40多聚腺苷酸化信號以及含有SEQ ID NO: 4之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3之序列之5’ ITR、CMV增強子、含有SEQ ID NO: 8之HSVTK啟動子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 1)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 13之rBG多聚腺苷酸化信號以及含有SEQ ID NO: 4之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，核酸包含AAV轉移盒。在一些實施例中，核酸包含轉殖基因，其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸包含轉殖基因，其中轉殖基因編碼胺基酸SEQ ID NO: 20之序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:20之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；內含子序列；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:20之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；雞β-肌動蛋白啟動子；內含子序列；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:20之胺基酸序列。
本文所述之AAV轉移盒可使用標準分子生物學技術納入質體或桿狀病毒質體中。質體或桿狀病毒質體可進一步包含一或多種在AAV產生期間使用之遺傳元件，包括例如AAV rep及cap基因以及輔助病毒蛋白序列。 AAV產生方法
可使用AAV轉移盒及包含本文所述AAV轉移盒之核酸(例如質體)來產生重組AAV載體。
在一些實施例中，產生重組AAV載體之方法包括使AAV產生細胞(例如HEK293細胞)與本揭示案之AAV轉移盒或核酸(例如質體)接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括使AAV產生細胞與編碼例如AAV rep及cap基因以及輔助病毒蛋白序列之一或多種額外質體接觸。
在一些實施例中，產生重組AAV載體之方法包括使AAV產生細胞(例如昆蟲細胞，例如Sf9細胞)與至少一種包含本揭示案之AAV轉移盒之昆蟲細胞相容性核酸接觸。「昆蟲細胞相容性」核酸係可轉型或轉染至昆蟲細胞中且可由細胞之轉錄及/或轉譯機制識別之任何核酸。在一些實施例中，昆蟲細胞相容性核酸係桿狀病毒核酸。在一些實施例中，該方法進一步包括將昆蟲細胞維持在使得產生AAV之條件下。
所產生之重組AAV載體可具有任一血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV及牛AAV。在一些實施例中，所產生之重組AAV載體可包含含有衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼，其中衣殼蛋白次單元與天然AAV衣殼蛋白次單元相比包含一或多個胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)。舉例而言，重組AAV載體可為源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV及牛AAV之經修飾之AAV載體。
重組AAV載體可用於用轉殖基因轉導靶細胞，例如藉由使重組AAV載體與靶細胞接觸進行。 組合物
亦提供組合物，其包含本揭示案之AAV轉移盒、質體、細胞或重組AAV載體。在一些實施例中，組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 治療方法
可使用本揭示案之AAV載體來治療或預防有需要之個體之疾病、病症或其他疾患。個體可為例如人類或動物。人類可為兒科個體、青少年個體、成年個體或老年個體。
因此，本揭示案之另一態樣係向個體投與本揭示案之病毒載體、病毒顆粒及/或病毒樣顆粒之方法。
本揭示案亦提供將核酸遞送至個體之方法，其包括向個體投與本揭示案之病毒載體及/或組合物。向有需要之個體投與本揭示案之病毒載體及/或組合物可藉由此項技術中已知之任何方法來實施。視情況地，病毒載體及/或組合物係以有效劑量(例如治療有效劑量)於醫藥學上可接受之載劑中遞送。在較佳實施例中，遞送有效量之病毒載體及/或組合物。
欲投與個體之病毒載體及/或病毒樣顆粒之劑量端視投與模式、欲治療及/或預防之疾病或疾患、個別個體之狀況、特定病毒載體或顆粒及欲遞送之核酸及諸如此類而定，且可以常規方式確定。在一些實施例中，重組AAV之劑量係有效劑量。例示性有效劑量可為例如至少約105 、約106 、約107 、約108 、約109 、約1010 、約1011 、約1012 、約1013 、約1014 、約1015 個轉導單位、視情況選用之約108 至約1013 個轉導單位之劑量。在一些實施例中，重組AAV之有效劑量係介於每公斤個體體重約1 × 1011 至約1 × 1015 個載體基因體之劑量。舉例而言，有效劑量可為每公斤個體體重約1× 1011 、約5 × 1011 、約1 × 1012 、約5 × 1012 、約1 × 1013 、約5 × 1013 、約1 × 1014 、約5 × 1014 或約1 × 1015 個載體基因體。
在特定實施例中，可採用一次以上之投與(例如兩次、三次、四次或更多次投與)以在不同之時間間隔(例如每天、每週、每月、每年等)內達成期望之基因表現水準。
例示性投與模式包括口服、直腸、經黏膜、鼻內、吸入(例如經由氣溶膠)、經頰(例如舌下)、陰道、鞘內、眼內、經皮、子宮內(或卵內)、非經腸(例如靜脈內、皮下、真皮內、肌內[包括投與骨骼肌、膈肌及/或心肌]、真皮內、胸膜內、腦內及關節內)、局部(例如投與皮膚及黏膜表面，包括氣道表面及經皮投與)、淋巴內及諸如此類以及直接組織或器官注射(例如投與肝、骨骼肌、心肌、橫膈膜或腦)。亦可投與腫瘤(例如在腫瘤或引流淋巴結中或附近)。在任何給定之情形下，最合適之途徑將端視所治療及/或預防之疾患之性質及嚴重程度以及所用特定AAV載體之性質而定。
向靶組織之遞送亦可藉由遞送包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之貯庫來達成。如本文所述，「貯庫」之遞送係指投與允許病毒緩慢釋放及/或逐漸傳播之持續作用調配物，以使得病毒可比標準注射可能持續之時間作用更長之時間。在代表性實施例中，將包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之貯庫植入骨骼肌、心肌及/或膈肌組織中，或可使組織與包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之膜或其它基質接觸。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包括向個體投與有效量(例如治療有效量)之本揭示案之AAV轉移盒、質體、細胞或重組AAV。在一些實施例中，個體係人類個體。在一些實施例中，個體患有NPC1。實例
本文包括之以下實例僅用於說明目的並不欲進行限制。實例 1 ：在哺乳動物細胞中製備重組 AAV 載體
提供三種質體。第一種質體包含轉移盒，該轉移盒包含側接有兩個ITR (SEQ ID NO: 3及4)之編碼NPC1之轉殖基因(SEQ ID NO: 2)。第一種質體包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。第二種質體包含編碼Rep及Cap蛋白之序列。第三種質體包含AAV產生所需之各種「輔助」因子(E4、E2a及VA)。
使用適當轉染試劑(例如LipofectamineTM )將三種質體轉染至病毒產生細胞(例如HEK293)中。在37℃下培育預定時間段後，自培養基收集AAV顆粒或溶解細胞以釋放AAV顆粒。然後根據標準方法，使用定量PCR (qPCR)或微滴式數位PCR (ddPCR)對AAV顆粒進行純化及滴定。可將AAV顆粒儲存在-80℃下以備後用。實例 2 ：在昆蟲細胞中製備重組 AAV 載體
提供第一種重組桿狀病毒載體。第一種重組桿狀病毒載體包含核酸，該核酸包含含有編碼NPC1之轉殖基因(SEQ ID NO: 2)之轉移盒，其中轉殖基因側接有兩個ITR (SEQ ID NO: 3及4)。轉移盒包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。
將昆蟲細胞(例如Sf9)在懸浮培養物中與第一種重組桿狀病毒載體及至少一種額外重組桿狀病毒載體共感染，該至少一種額外重組桿狀病毒載體包含編碼AAV Rep及Cap蛋白之核酸。在28℃下培育預定時間段後，自培養基收集AAV顆粒或溶解細胞以釋放AAV顆粒。然後根據標準方法，使用定量PCR (qPCR)或微滴式數位PCR (ddPCR)對AAV顆粒進行純化及滴定。可將AAV顆粒儲存在-80℃下以備後用。實例 3 ：活體外 功效分析
為確定本文所述之AAV轉移盒是否能夠拯救經培養細胞中之NPC1溶酶體表型，使用三重轉染方案在HEK293細胞中製備包裝hNPC1轉移盒(SEQ ID NO: 14)之重組AAV2載體(例如，參見 實例1)。然後使用AAV2-hNPC1載體活體外轉導野生型U2OS細胞(骨肉瘤)及不表現NPC1 (NPC-/- )之U2OS細胞，感染 複數(MOI)為5 × 103 (5K)或10 × 103 (10K)。然後在37℃下在5% CO2 氣氛中培育細胞。
NPC1細胞在溶酶體中展現特征性膽固醇累積，其可藉由觀察細胞中溶酶體之大小及數量來監測。在此分析中，藉由量測細胞中螢光細胞器染料LysoTracker® (ThermoFisher Scientific® )之累積來監測溶酶體表型。用AAV2-hNPC1載體轉導72小時後，將50 mM LysoTracker® 添加至細胞中。2小時後，固定細胞並量測LysoTracker® 螢光。
結果顯示於圖 1A 中。如預期，野生型U2OS細胞未顯示在溶酶體中有顯著之LysoTracker® 螢光累積，而NPC1-/- 細胞顯示出顯著之螢光累積。用AAV2-hNPC1以5K或10K之MOI轉導之細胞在溶酶體中具有顯著減少之LysoTracker® 螢光累積。
在單獨分析中，將用hNPC1轉導之細胞固定並使用非律平(filipin)染色，非律平係膽固醇之組織化學染色劑。源自絲狀鏈黴菌 (Streptomyces filipinensis) 之非律平染色劑購自Polysciences，且以50 µg/mL之最終濃度使用。使用Pico自動化細胞成像系統(ImageXpress® )使細胞可視化，並對非律平染色劑進行定量。結果顯示於圖 1B 中。如預期，野生型U2OS細胞未顯示顯著之膽固醇累積，而NPC1-/- 細胞顯示出顯著之膽固醇累積。用AAV2-hNPC1以5K或10K之MOI轉導之細胞具有顯著降低之膽固醇累積。
綜上所述，該等資料表明，使用AAV2-hNPC之細胞轉導成功地拯救了NPC1缺陷型U2OS細胞之溶酶體表型。實例 4 ：活體內 功效分析
為確定本文所述之AAV轉移盒是否能夠拯救活體內 NPC1表型，在HEK293細胞中使用三重轉染方案製備包裝hNPC1轉移盒(SEQ ID NO: 14)之重組AAV9載體(例如，參見 實例1)。藉由眶後注射向約24-28天齡之NPC1缺陷型小鼠(即NPC1-/- 小鼠)靜脈內注射劑量為3.0 × 1014 個載體基因體/公斤(vg/kg)之鹽水或AAV9-hNPC1載體。結果顯示於圖 2 中。所有用鹽水處理之小鼠截至約80天齡時皆死亡。然而，所有注射AAV9-hNPC1之動物在整個實驗持續時間內皆存活。將注射AAV9-hNPC1之小鼠在約100天齡時處死用於分析。
小鼠亦在平衡木行走測試中受到挑戰，其中當小鼠走過平衡木時量測滑倒次數。測試係在約8週(56天)齡時實施。如圖 4 中所示，野生型小鼠沒有自平衡木上滑落。儘管用AAV9-hNPC1處理之NPC1-/- 小鼠與用鹽水處理之NPC1-/- 小鼠之間之滑倒次數沒有統計學上顯著之差異，但在AAV9-hNPC1組中觀察到之平均滑倒次數較少。
亦在約10週(70天)齡時評價小鼠之行為表型評分。行為表型評分係量測各種疾病症狀、包括理毛、步態、駝背、壁架測試、後肢勾環及震顫之綜合評分。(參見 Alam 等人，Sci Transl Med, 2016；Guyenet等人，J Vis Exp, 2010)。如圖 3 中所示，用AAV9-hNPC1處理之NPC1-/- 小鼠與用鹽水處理之NPC1-/- 小鼠相比具有顯著減小之評分。
綜上所述，該等資料表明，AAV9-hNPC1可至少部分地拯救NPC1缺陷型小鼠之疾病表型。
前述內容係對本發明之說明，且不應理解為限制本發明。本發明係由所附申請專利範圍限定，其中包括申請專利範圍之等效內容。經編號之實施例
儘管附有申請專利範圍，但以下經編號之實施例亦形成本揭示案之一部分。
1. 一種腺相關病毒(AAV)轉移盒，其自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼NPC1蛋白。
2. 如實施例1之AAV轉移盒，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者之長度為約110至約160個核苷酸。
3. 如實施例1或2之AAV轉移盒，其中5’ ITR之長度與3’ ITR相同。
4. 如實施例1或2之AAV轉移盒，其中5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。
5. 如實施例1-4中任一者之AAV轉移盒，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV之基因體分離或獲得。
6. 如實施例1之AAV轉移盒，其中5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列。
7. 如實施例1之AAV轉移盒，其中3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列。
8. 如實施例1-7中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係組成型啟動子。
9. 如實施例1-7中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係誘導型啟動子。
10. 如實施例1-9中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係組織特異性啟動子。
11. 如實施例1-7中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子、HSVTK啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
12. 如實施例11之AAV轉移盒，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及HSVTK啟動子。
13. 如實施例1-7中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子包含與SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8中之任一者至少95%或100%一致之序列。
14. 如實施例1-13中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。
15. 如實施例1-13中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致之序列。
16. 如實施例15之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少95%一致之序列。
17. 如實施例16之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少98%一致之序列。
18. 如實施例1-13中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1之序列。
19. 如實施例1-13中任一者之AAV轉移盒，其中轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列。
20. 如實施例1-18中任一者之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係選自猿猴病毒40 (SV40)、rBG、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)。
21. 如實施例20之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。
22. 如實施例20之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。
23. 如實施例1-19中任一者之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 13至少95%或100%一致之序列。
24. 如實施例1-23中任一者之AAV轉移盒，其中盒進一步包含增強子。
25. 如實施例24之AAV轉移盒，其中增強子係CMV增強子。
26. 如實施例24之AAV轉移盒，其中增強子包含SEQ ID NO: 9之序列或與其至少95%一致之序列。
27. 如實施例1-26中任一者之AAV轉移盒，其中盒進一步包含內含子序列。
28. 如實施例27之AAV轉移盒，其中內含子序列係嵌合序列。
29. 如實施例27之AAV轉移盒，其中內含子序列係雜合序列。
30. 如實施例27之AAV轉移盒，其中內含子序列包含自SV40分離或獲得之序列。
31. 如實施例27之AAV轉移盒，其中內含子序列包含SEQ ID NO: 10-11中任一者之序列。
32. 如實施例1之AAV轉移盒，其中AAV轉移盒 包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。
33. 一種質體，其包含如實施例1-31中任一者之AAV轉移盒。
34. 一種細胞，其包含如實施例1-32中任一者之AAV轉移盒或如實施例33之質體。
35. 一種重組AAV載體，其包含蛋白質衣殼及經蛋白質衣殼殼體化之核酸：其中核酸包含轉移盒，該轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼NPC1蛋白。
36. 如實施例35之重組AAV載體，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者之長度為約110至約160個核苷酸。
37. 如實施例36或36之重組AAV載體，其中5’ ITR之長度與3’ ITR相同。
38. 如實施例35或36之重組AAV載體，其中5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。
39. 如實施例35-38中任一者之重組AAV載體，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV之基因體分離或獲得。
40. 如實施例35之重組AAV載體，其中5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列。
41. 如實施例35之重組AAV載體，其中3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列。
42. 如實施例35-41中任一者之重組AAV載體，其中啟動子係組成型啟動子。
43. 如實施例35-41中任一者之重組AAV載體，其中啟動子係誘導型啟動子。
44. 如實施例35-41中任一者之重組AAV載體，其中啟動子係組織特異性啟動子。
45. 如實施例35-41中任一者之重組AAV載體，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子、HSVTK啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β–肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
46. 如實施例45之重組AAV載體，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及HSVTK啟動子。
47. 如實施例35-41中任一者之重組AAV載體，其中啟動子包含與SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8中之任一者至少95%或100%一致之序列。
48. 如實施例35-47中任一者之重組AAV載體，其中NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。
49. 如實施例35-48中任一者之重組AAV載體，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致之序列。
50. 如實施例49之重組AAV載體，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少95%一致之序列。
51. 如實施例50之重組AAV載體，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少98%一致之序列。
52. 如實施例35-48中任一者之重組AAV載體，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1之序列。
53. 如實施例35-48中任一者之重組AAV載體，其中轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列。
54. 如實施例35-53中任一者之重組AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係選自猿猴病毒40 (SV40)、rBG、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)。
55. 如實施例54之重組AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。
56. 如實施例54之重組AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。
57. 如實施例35-53中任一者之重組AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 13至少95%或100%一致之序列。
58. 如實施例35-57中任一者之重組AAV載體，其中盒進一步包含增強子。
59. 如實施例58之重組AAV載體，其中增強子係CMV增強子。
60. 如實施例58之重組AAV載體，其中增強子包含SEQ ID NO: 9之序列或與其至少95%一致之序列。
61. 如實施例35-60中任一者之重組AAV載體，其中盒進一步包含內含子序列。
62. 如實施例61之重組AAV載體，其中內含子序列係嵌合序列。
63. 如實施例61之重組AAV載體，其中內含子序列係雜合序列。
64. 如實施例61之重組AAV載體，其中內含子序列包含自SV40分離或獲得之序列。
65. 如實施例61之重組AAV載體，其中內含子序列包含SEQ ID NO: 10-11中任一者之序列。
66. 如實施例35之重組AAV載體，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14-19中任一者之序列。
67. 如實施例35之重組AAV載體，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14之序列。
68. 如實施例35-67中任一者之重組AAV載體，其中蛋白質衣殼包含來自以下血清型中之任一者之AAV之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV。
69. 如實施例35-67中任一者之重組AAV載體，其中蛋白質衣殼包含相對於以下AAV血清型中之任一者之衣殼蛋白次單元具有一或多個胺基酸突變之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV。
70. 一種產生重組AAV載體之方法，該方法包括使AAV產生細胞與如實施例1-32中任一者之AAV轉移盒或如實施例33之質體接觸。
71. 一種藉由如實施例35之方法產生之重組AAV載體。
72. 如實施例71之重組AAV載體，其中載體具有選自以下之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV及牛AAV。
73. 一種組合物，其包含如實施例1-32中任一者之AAV轉移盒、如實施例33之質體、如實施例34之細胞或如實施例35-69、71或72中任一者之重組AAV載體。
74. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與有效量之如實施例1-32中任一者之AAV轉移盒、如實施例33之質體、如實施例34之細胞或如實施例35-68、70或71中任一者之重組AAV載體。
75. 如實施例74之方法，其中個體患有NPC1。
76. 如實施例74或75之方法，其中個體係人類個體。
77. 一種核酸編碼，其自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:20之胺基酸序列。
78. 一種腺相關病毒(AAV)轉移盒，其自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；雞β-肌動蛋白啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉移盒包含內含子序列；其中轉殖基因編碼NPC1蛋白。
79. 如實施例78之AAV轉移盒，其中內含子序列位於啟動子與轉殖基因之間。
80. 如實施例78或79之AAV轉移盒，其中5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列。
81. 如實施例78-80中任一者之AAV轉移盒，其中3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列。
82. 如實施例78-81中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子包含SEQ ID NO: 5之序列。
83. 如實施例78-82中任一者之AAV轉移盒，其中內含子序列係SV40內含子。
84. 如實施例78-82中任一者之AAV轉移盒，其中內含子序列包含SEQ ID NO: 10之序列。
85. 如實施例78-84中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。
86. 如實施例78-84中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1之序列。
87. 如實施例78-84中任一者之AAV轉移盒，其中轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列。
88. 如實施例78-87中任一者之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。
89. 如實施例78-87中任一者之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 12之序列。
90. 如實施例78-89中任一者之AAV轉移盒，其中盒包含增強子。
91. 如實施例78之AAV轉移盒，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14之序列
92. 如實施例78之AAV轉移盒，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 15-19中任一者之序列。
93. 一種質體，其包含如實施例78-92中任一者之AAV轉移盒。
94. 一種核酸，其自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中核酸包含內含子序列；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
95. 如實施例94之核酸，其中內含子序列位於啟動子與轉殖基因之間。
96. 一種細胞，其包含如實施例78-92中任一者之AAV轉移盒、如實施例93之質體或如實施例94或95之核酸。
97. 一種重組AAV載體，其包含蛋白質衣殼及 經蛋白質衣殼殼體化之核酸：其中核酸包含如實施例78-92中任一者之AAV轉移盒。
98. 如實施例97之重組AAV載體，其中蛋白質衣殼包含來自以下血清型中之任一者之AAV之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV。
99. 如實施例97之重組AAV載體，其中蛋白質衣殼包含相對於以下AAV血清型中之任一者之衣殼蛋白次單元具有一或多個胺基酸突變之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV。
100. 一種產生重組AAV載體之方法，該方法包括使AAV產生細胞與如實施例78-92中任一者之AAV轉移盒、如實施例93之質體或如實施例93之核酸接觸。
101. 一種藉由如實施例100之方法產生之重組AAV載體。
102. 一種組合物，其包含如實施例78-92中任一者之AAV轉移盒、如實施例93之質體、如實施例94或95之核酸、如實施例96之細胞或如實施例97-99或101中任一者之重組AAV載體。
103. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與有效量之如實施例78-92中任一者之AAV轉移盒、如實施例93之質體、如實施例94或95之核酸、如實施例96之細胞或如實施例97-99或101中任一者之重組AAV載體。
104. 如實施例103之方法，其中個體患有NPC1。
105. 如實施例103或104之方法，其中個體係人類個體。
圖 1A 係顯示如藉由量測野生型U2OS細胞、NPC1缺陷性(NPC1-/- ) U2OS細胞及用AAV2-hNPC以5 × 103 或10 × 103 之感染複數(MOI)轉導之NPC1-/- 細胞中之LysoTracker® 累積所確定之溶酶體表型的圖。使用單因子ANOVA確定統計學顯著性。誤差槓代表平均值之標準誤差(SEM)。圖 1B 係顯示如使用非律平(filipin)染色確定之野生型U2OS細胞、NPC1缺陷性(NPC1-/- ) U2OS細胞及用AAV2-hNPC以5 × 103 或10 × 103 之感染複數(MOI)轉導之NPC1-/- 細胞中之膽固醇累積的圖。使用單因子ANOVA確定統計學顯著性。誤差槓代表SEM。圖 2 係卡普蘭-邁耶存活率曲線(Kaplan-Meier survival curve)，其顯示眶後注射鹽水或AAV9-hNPC1後NPC1-/- 小鼠之存活率。所有注射AAV9-hNPC1之動物在整個實驗之持續時間內存活，且在約100天齡時處死用於組織學分析。圖 3 顯示野生型小鼠、鹽水處理之NPC1-/- 小鼠或注射AAV9-hNPC1之NPC1-/- 小鼠在約10週(70天)齡時之行為表型評分。使用未配對T-測試來確定統計學顯著性，且誤差槓代表SEM。圖 4 顯示野生型小鼠、鹽水處理之NPC1-/- 小鼠或經AAV9-hNPC1處理之NPC1-/- 小鼠在約8週(56天)齡時在平衡木行走測試中之滑倒次數。誤差槓代表標準偏差。
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Claims (26)

  1. 一種腺相關病毒(AAV)轉移盒，其自5’至3’包含： 5’反向末端重複(ITR)； 雞β-肌動蛋白啟動子； 轉殖基因； 多聚腺苷酸化信號；及 3’ ITR； 其中該轉移盒包含內含子序列；且 其中該轉殖基因編碼該NPC1蛋白。
  2. 如請求項1之AAV轉移盒，其中該5’ ITR包含SEQ ID NO: 3之序列。
  3. 如請求項1或2之AAV轉移盒，其中該3’ ITR包含SEQ ID NO: 4之序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之AAV轉移盒，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 5之序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之AAV轉移盒，其中該內含子序列係SV40內含子。
  6. 如請求項1至4中任一項之AAV轉移盒，其中該內含子序列包含SEQ ID NO: 10之序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之AAV轉移盒，其中該NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。
  8. 如請求項1至6中任一項之AAV轉移盒，其中該NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 1之序列。
  9. 如請求項1至6中任一項之AAV轉移盒，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 2之序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之AAV轉移盒，其中該多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。
  11. 如請求項1至9中任一項之AAV轉移盒，其中該多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 12之序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之AAV轉移盒，其中該盒包含增強子。
  13. 如請求項1之AAV轉移盒，其中該AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 14之序列。
  14. 如請求項1之AAV轉移盒，其中該AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 15-19中任一者之序列。
  15. 一種質體，其包含如請求項1至14中任一項之AAV轉移盒。
  16. 一種核酸，其自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中該核酸包含內含子序列；其中該轉殖基因編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
  17. 一種細胞，其包含如請求項1至14中任一項之AAV轉移盒、如請求項15之質體或如請求項16之核酸。
  18. 一種重組AAV載體，其包含蛋白質衣殼及經該蛋白質衣殼殼體化之核酸： 其中該核酸包含如請求項1至14中任一項之AAV轉移盒。
  19. 如請求項18之重組AAV載體，其中該蛋白質衣殼包含來自以下血清型中之任一者之AAV之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV。
  20. 如請求項18之重組AAV載體，其中該蛋白質衣殼包含相對於以下AAV血清型中之任一者之衣殼蛋白次單元具有一或多個胺基酸突變之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽類AAV或牛AAV。
  21. 一種產生重組AAV載體之方法，該方法包括使AAV產生細胞與如請求項1至14中任一項之AAV轉移盒、如請求項15之質體或如請求項16之核酸接觸。
  22. 一種藉由如請求項21之方法產生之重組AAV載體。
  23. 一種組合物，其包含如請求項1至14中任一項之AAV轉移盒、如請求項15之質體、如請求項16之核酸、如請求項17之細胞或如請求項18至20或22中任一項之重組AAV載體。
  24. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如請求項1至14中任一項之AAV轉移盒、如請求項15之質體、如請求項16之核酸、如請求項17之細胞或如請求項18至20或22中任一項之重組AAV載體。
  25. 如請求項24之方法，其中該個體患有NPC1。
  26. 如請求項24或25之方法，其中該個體係人類個體。
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