KR20220083708A - Aav 전달 카세트 - Google Patents

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KR20220083708A
KR20220083708A KR1020227012835A KR20227012835A KR20220083708A KR 20220083708 A KR20220083708 A KR 20220083708A KR 1020227012835 A KR1020227012835 A KR 1020227012835A KR 20227012835 A KR20227012835 A KR 20227012835A KR 20220083708 A KR20220083708 A KR 20220083708A
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데이비드 디스뮤크
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스트라이드바이오 인코포레이티드
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Abstract

재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터의 생산에 사용되는 AAV 전달 카세트 및 플라스미드가 본 명세서에 기술되어 있다. 개시된 카세트 및 플라스미드는 니만-피크 질환, C1형(NPC1)과 같은 하나 이상의 질환 또는 장애의 개선, 치료 및/또는 예방에 치료 효능을 갖는 하나 이상의 이식유전자를 포함한다.

Description

AAV 전달 카세트
본 발명은 분자 생물학 및 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
니만-피크(Niemann-Pick) 질환, C1형(NPC1)은 엔도리소좀 구획에 콜레스테롤 축적을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애이다. 이는 세포 내 콜레스테롤 수송을 매개하는 엔도리소좀 단백질인 NPC1을 암호화하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다.
NPC1은 유아, 어린이 또는 성인에게 나타날 수 있다. 신생아는 간 침윤으로 인한 복수 및 중증 간 질환 및/또는 폐 침윤으로 인한 호흡 부전을 나타낼 수 있다. 간이나 폐 질환이 없는 다른 영아는 근육긴장저하와 발달 지연이 있다. 고전적인 표현은 운동 실조, 수직 핵상 주시 마비(VSGP) 및 치매의 교활한 발병과 함께 아동기 중후반에 발생한다. 근긴장이상과 발작이 흔하다. 구음 곤란과 연하 곤란은 결국 무력화되어, 경구 수유가 불가능하게 되며; 사망은 일반적으로 흡인성 폐렴으로 20 또는 30대 후반에 발생한다. 성인은 치매나 정신과적 증상을 보일 가능성이 더 크다.
2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(HPBCD)은 콜레스테롤과 지질 축적을 감소시키고 NPC1 동물 모델에서 생존을 연장하는 것으로 나타났다. 그러나, 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 NPC1에 대한 치료법은 없다. 따라서, NPC1을 치료, 경화 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법이 시급히 필요하다.
핵산(예를 들어, 이식유전자를 포함하는 핵산)의 전달을 위한 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터의 생산에 사용되는 AAV 전달 카세트, 핵산 및 플라스미드가 본 발명에 기술되어 있다. 개시된 카세트, 핵산 및 플라스미드는 NPC1과 같은 하나 이상의 질환 또는 장애의 개선, 치료 및/또는 예방에서 치료 효능을 갖는 하나 이상의 이식유전자를 발현하는데 사용될 수 있는 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 5' 역 말단 반복부(ITR), 프로모터, 이식유전자, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트를 제공하며, 여기서 전달 카세트는 인트론 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 프로모터와 이식유전자 사이에 위치한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 단백질 캡시드 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공하며, 여기서 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 전달 카세트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 프로모터와 이식유전자 사이에 위치한 인트론 서열과 같은 인트론 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 길이가 약 110 내지 약 160개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래될 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 프로모터는 구조성 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, HSVTK 프로모터, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, EF-1 짧은 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 HSVTK 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 5-8 중 어느 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 인트론 서열은 키메라 서열 또는 하이브리드 서열이다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 10-11 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
NPC1 단백질은, 예를 들어, 인간 NPC1 단백질일 수 있다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 20의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 그 전체가 본 발명에 참조로 포함되는 UniProt 수탁 번호 O15118에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), 토끼 베타 글로빈(rBG), α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 13과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 인핸서를 추가로 포함한다. 인핸서는, 예를 들어, CMV 인핸서일 수 있다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 SEQ ID NO: 9의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
또한 본 발명의 AAV 전달 카세트를 포함하는 핵산이 본 발명에서 제공된다. 또한 본 발명의 AAV 전달 카세트를 포함하는 플라스미드 또는 백미드가 본 발명에서 제공된다.
또한 단백질 캡시드 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터가 본 발명에 제공되며, 여기서 핵산은 본 발명의 AAV 전달 카세트를 포함한다.
또한, 본 발명의 AAV 전달 카세트를 포함하는 세포가 제공된다.
또한, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 AAV 생산자 세포를 본 발명의 AAV 전달 카세트 또는 플라스미드/백미드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한, 이 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터가 제공된다. 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택된 혈청형일 수 있다. 재조합 AAV 벡터는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함할 수 있고, 여기서 캡시드 단백질 서브유닛은 야생형 AAV의 캡시드 단백질 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
또한, 본 발명의 AAV 전달 카세트, 핵산(예를 들어, 플라스미드 또는 백미드), 세포, 또는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한 본 발명의 치료적 유효량의 AAV 전달 카세트, 핵산(예를 들어, 플라스미드), 세포 또는 재조합 AAV 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간 대상이다. 일부 실시태양에서, 대상은 NPC1을 갖는다.
이들 및 다른 실시태양은 아래에 설명된 상세한 설명에서 더 상세하게 다루어진다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a는 5 x 103 또는 10 x 103의 감염 다중도(MOI)에서 야생형 U2OS 세포, NPC1-결핍(NPC1-/-) U2OS 세포, 및 AAV2-hNPC로 형질도입된 NPC1-/- 세포에서 LysoTracker® 축적을 측정하여 결정된 리소좀 표현형을 보여주는 그래프이다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용하여 결정된다. 오차 막대는 평균(SEM)의 표준 오차를 나타낸다.
도 1b는 5 x 103 또는 10 x 103의 감염 다중도(MOI)에서 야생형 U2OS 세포, NPC1-결핍(NPC1-/-) U2OS 세포, 및 AAV2-hNPC로 형질도입된 NPC1-/- 세포에서 필리핀 염색을 사용하여 결정된 콜레스테롤 축적을 보여주는 그래프이다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용하여 결정된다. 오차 막대 SEM의 표준 오차를 나타낸다.
도 2는 식염수 또는 AAV9-hNPC1을 사용하는 안와후주사 후 NPC1-/- 마우스의 생존을 보여주는 카플란-마이어 생존 곡선이다. AAV9-hNPC1이 주입된 모든 동물은 실험 기간 동안 생존했으며 조직학적 분석을 위해 약 100일령에 희생되었다.
도 3은 야생형 마우스, 식염수 처리된 NPC1-/- 마우스, 또는 AAV9-hNPC1이 주사된 NPC1-/- 마우스의 약 10주(70일)령에서의 행동 표현형 점수를 나타낸다. 통계적 유의성은 짝지어지지 않은 T-검정을 사용하여 결정되었으며 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 4는 야생형 마우스, 식염수 처리된 NPC1-/- 마우스, 또는 AAV9-hNPC1로 처리된 NPC1-/- 마우스에서 약 8주(56일)령의 균형 대들보 보행 테스트에서 미끄러짐의 수를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
NPC1을 치료, 예방 및/또는 치료하기 위한 유전자 요법 조성물 및 방법이 본 발명에 제공된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 NPC1을 치료, 예방 및/또는 치료하기 위한 핵산, 예를 들어, 이식유전자 및 핵산(AAV 전달 카세트 포함)의 전달을 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 제공한다.
AAV는 유전자 전달제로 유용하며 인간 유전자 치료를 위한 강력한 도구이다. AAV를 사용하면 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 세포에서 고주파수 DNA 전달 및 안정적인 발현이 달성될 수 있다. 일부 다른 바이러스 벡터 시스템과 달리, AAV는 표적 세포에서 안정적인 통합을 위해 활성 세포 분열을 필요로 하지 않다.
본 명세서에 인용된 모든 논문, 간행물 및 특허는 각각의 개별 논문, 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되고 출판물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 참조로 포함된 것처럼 여기에 참조로 포함된다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 기술된 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서의 상세한 설명에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시태양을 기술하기 위해 사용된 것으로 한정하려는 의도가 아니다.
정의
다음 용어는 본 명세서의 기술과 첨부된 청구범위에서 사용된다:
단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된다.
또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 길이의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에 사용된 용어 "약"은 지정된 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
또한 본 명세서에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 선택적("또는")으로 해석될 때 조합의 결여 뿐만 아니라 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 의미하고 포함한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 염기의 서열, 예를 들어 RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열(자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오타이드 모두 포함)이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다. 핵산은 길이가 1-1,000, 1,000-10,000, 10,000-100,000, 100,000-100만 또는 100만 뉴클레오타이드 초과일 수 있다. 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 일부 경우에는 예를 들어 포스포라미드, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 연결, 및 펩타이드 핵산 골격 및 연결을 포함하는 대체 골격을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함될 수 있다. 다른 유사 핵산은 양성 백본, 비이온성 백본 및 비-리보스 백본이 있는 핵산을 포함한다. 하나 이상의 탄소고리 당을 함유하는 핵산도 핵산의 정의에 포함된다. 리보스-인산염 골격의 이러한 변형은 표지의 추가를 용이하게 하거나 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 핵산은 선형일 수 있거나 원형일 수 있다(예를 들어, 플라스미드).
"AAV 전달 카세트"는 AAV 벡터의 생성에 사용될 수 있는 핵산이다.
본 명세서에 사용된 용어 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"는 핵산 전달 비히클로서 기능하고 비리온 또는 바이러스 유사 입자 내에 포장된 핵산(예를 들어, 이식유전자를 포함하는 핵산)을 포함하는 바이러스 입자를 의미한다. 본 발명의 예시적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터(AAVs), 렌티바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
"아데노-연관 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터"는 일반적으로 단백질 캡시드, 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산(예를 들어, 이식유전자를 포함하는 핵산)을 포함한다. "단백질 캡시드"는 T=1 정이십면체 대칭으로 연관되고 배열된 개별 "캡시드 단백질 서브유닛"(예를 들어, 약 60개의 캡시드 단백질 서브유닛)을 포함하는 구형에 가까운 단백질 껍질이다. 본 명세서에 기술된 AAV 벡터의 단백질 캡시드는 복수의 캡시드 단백질 서브유닛을 포함한다. AAV 벡터가 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것으로 본 명세서에서 기술될 때, AAV 벡터는 단백질 캡시드를 포함하고, 여기서 단백질 캡시드는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용된 용어 "캡시드 단백질"은 때때로 캡시드 단백질 서브유닛을 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "바이러스성-유사 입자" 또는 "바이러스-유사 입자"는 전달 카세트 또는 이식유전자를 포함하는 임의의 벡터 게놈 또는 핵산을 포함하지 않는 단백질 캡시드를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAV 유형 rh32.33, AAV 유형 rh8, AAV 유형 rh10, AAV 유형 rh74, AAV 유형 hu.68, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 뱀 AAV, 비어드 드래곤 AAV, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B 및 현재 알려져 있거나 나중에 발견된 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 표 1 참조.
GenBank
기탁 번호 		GenBank
기탁 번호 		GenBank
기탁 번호
완전 게놈 단계통군 C Rh57 AY530569
아데노-연관 바이러스 1 NC_002077, AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
아데노-연관 바이러스 2 NC_001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
아데노-연관 바이러스 3 NC_001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
아데노-연관 바이러스 3B NC_001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
아데노-연관 바이러스 4 NC_001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
아데노-연관 바이러스 5 Y18065, AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
아데노-연관 바이러스 6 NC_001862, AAB95450.1 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
소 AAV NC_005889, AY388617, AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339, AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 ABI16639, DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
단계통군 A Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077, AF063497 Hu3 AY530595 단계통군 F
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 MI332400.1
Hu 46 AY530609 단계통군 D HSC2 MI332401.1
단계통군 B Rh62 AY530573 HSC3 MI332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 MI332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 MI332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 MI332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 MI332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 MI332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 MI332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 MI332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 MI332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 MI332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 MI332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 MI332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 MI332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 MI332415.1
Hu57 AY530619 단계통군 E Hu68
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 클론 분리물
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065, AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 기타
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 비어드 드레곤 AAV
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 뱀 AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555
재조합 AAV(rAAV) 벡터는 바이러스 생산 세포주를 사용하여 배양물에서 생산될 수 있다. "바이러스 생산 세포", "바이러스 생산 세포주" 또는 "바이러스 생산 세포"라는 용어는 바이러스 벡터를 생산하는 데 사용되는 세포를 의미한다. HEK293 및 239T 세포는 일반적인 바이러스 생산 세포주이다. 하기 표 2는 다양한 바이러스 벡터에 대한 예시적인 바이러스 생산 세포주를 나열한다. rAAV의 생산은 일반적으로 세포에 세 가지 요소의 존재를 필요로 한다: 1) AAV 역 말단 반복부(ITR) 서열이 플랭킹된 이식유전자, 2) AAV rep 및 cap 유전자, 및 3) 헬퍼 바이러스 단백질 서열. 이 세 가지 요소는 하나 이상의 플라스미드에 제공될 수 있으며 세포 내로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다.
예시적인 바이러스 생산 세포주
바이러스 벡터 예시적인 바이러스 생산 세포주(들)
아데노바이러스 HEK293, 911, pTG6559, PER.C6, GH329, N52.E6, HeLa-E1, UR, VLI-293
아데노-연관 바이러스(AAV) HEK293, Sf9
레트로바이러스 HEK293
렌트바이러스 293T
"HEK293"은 원래 조직 배양에서 성장한 인간 배아 신장 세포에서 유래한 세포주를 의미한다. HEK293 세포주는 배양에서 쉽게 자라며 일반적으로 바이러스 생산에 사용된다. 본 발명에 사용된 "HEK293"은 또한 하나 이상의 변이체 HEK293 세포주, 즉, 하나 이상의 유전적 변경을 추가로 포함하는 원래의 HEK293 세포주로부터 유래된 세포주를 의미할 수 있다. 많은 변형 HEK293 라인이 하나 이상의 특정 응용분야를 위해 개발 및 최적화되었다. 예를 들어, 293T 세포주는 SV40 복제 기점을 함유하는 형질감염된 플라스미드의 에피솜 복제를 허용하는 SV40 큰 T-항원을 포함하여, 원하는 유전자 산물의 발현을 증가시킨다.
"Sf9"는 모 담배거세미나방종(Spodoptera frugiperda) 세포주 IPLB-Sf-21-AE로부터 유래된 클론 분리물인 곤충 세포주를 의미한다. Sf9 세포는 혈청이 없는 상태에서 성장될 수 있으며 부착되거나 현탁액에서 배양될 수 있다.
"형질감염 시약"은 핵산의 세포 내로의 전달을 향상시키는 조성물을 의미한다. 당업계에서 일반적으로 사용되는 일부 형질감염 시약은 핵산 및 세포 표면에 결합하는 하나 이상의 지질(예를 들어, 리포펙타민TM)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "감염 다중도" 또는 "MOI"는 세포와 접촉된 비리온의 수를 의미한다. 예를 들어, 배양된 세포는 세포당 1 x 102 내지 1 x 105 비리온 범위의 MOI에서 AAV와 접촉될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "유효량"은 대상의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하거나 이의 징후 또는 증상을 개선하는데 효과적인 본 명세서에 제공된 AAV 벡터, 핵산, 또는 기타 작용제의 양이다. "유효량"은, 예를 들어, 질환 및/또는 질환의 증상, 질환의 중증도 및/또는 질환 또는 장애의 증상, 치료될 환자의 연령, 체중 및/또는 건강 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다. 임의의 주어진 경우에 적절한 양은 당업자에 의해 확인될 수 있거나 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
2개 이상의 아미노산 서열 사이의 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 유사성 또는 동일성은 핵산의 전체 길이 또는 핵산의 지시된 부분에 대해 결정될 수 있다. 서열 유사성 또는 동일성은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)의 국소 서열 동일성, Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444 (1988)의 유사한 방법에 대한 연구, 이러한 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)의 컴퓨터화 구현, Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)에 의해 기술된 베스트 핏 시퀀스 프로그램 또는 검색을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
다른 적합한 알고리즘은 Altschul et al., J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) and Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)에 기술된 BLAST 프로그램이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480(1996); http:// blast.wustl/edu/blast/README.html로부터 얻은 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 선택적으로 기본 값으로 설정되는 여러 검색 매개변수를 사용한다. 매개변수는 동적 값이며 특정 시퀀스의 구성과 관심 시퀀스가 검색되는 특정 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 자체에 의해 설정된다; 그러나 값은 감도를 높이기 위해 조정될 수 있다.
또한, 추가로 유용한 알고리즘은 Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402에 의해 보고된 갭이 있는 BLAST이다.
본 발명의 목적을 위해, 달리 명시되지 않는 한, 퍼센트 동일성은 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 온라인으로 이용 가능한 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool(BLAST))를 사용하여 계산된다. 당업자는 다른 알고리즘이 적절하게 대체될 수 있음을 이해할 것이다.
역 말단 반복부
역 말단 반복부 또는 ITR 서열은 AAV 프로바이러스 통합을 매개하고 AAV DNA를 비리온으로 패키징하기 위한 서열이다. ITR은 AAV 수명 주기의 다양한 활동에 관여한다. 예를 들어, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 ITR 서열은 형질감염 후 플라스미드로부터의 절제, 벡터 게놈의 복제, 숙주 세포 게놈으로부터의 통합 및 구조에 역할을 한다.
본 발명의 AAV 전달 카세트는 5' ITR 및 3' ITR을 포함할 수 있다. ITR 서열은 길이가 약 110개 내지 약 160개 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이가 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 125, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시태양에서, ITR 서열은 길이가 약 141개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 3' ITR보다 더 길고, 다른 실시태양에서, 3' ITR은 5' ITR보다 더 길다.
ITR은 임의의 AAV, 예를 들어 표 1에 나열된 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래될 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV 이외의 다른 파보바이러스 종의 구성원으로부터 분리된 야생형 또는 돌연변이된 ITR일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, ITR은 보카바이러스 또는 파보바이러스 B19로부터 분리되거나 유래된 야생형 또는 돌연변이 ITR일 수 있다.
일부 실시태양에서, ITR은 scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형을 포함한다. 일부 실시태양에서, scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형은 ITR로부터 말단 분해 서열(TRS)의 결실이다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 야생형 ITR이고, 3' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 야생형 ITR이고, 5' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 실시태양에서, 말단 분해 서열은 5' ITR 및 3' ITR 둘 다에 존재하지 않는다. 다른 실시태양에서, scAAV의 생산을 촉진하기 위한 변형은 ITR을 shRNA-형성 서열과 같은 상이한 헤어핀-형성 서열로 대체하는 것이다.
일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하고, 3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 하나 이상의 "대리" ITR, 즉 ITR과 동일한 기능을 하는 비-ITR 서열을 포함한다. 예를 들어, Xie, J. et al., Mol. Ther., 25(6): 1363-1374(2017) 참조. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트의 ITR은 대리 ITR로 대체된다. 일부 실시태양에서, 대리 ITR은 헤어핀 형성 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대리 ITR은 짧은 헤어핀(sh)RNA-형성 서열이다.
프로모터, 인핸서, 리프레서 및 기타 조절 서열
유전자 발현은 주어진 단백질에 대한 코딩 영역에 플랭킹하는 프로모터 및 인핸서라고 하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 제어될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 하나 이상의 핵산 조절 서열을 의미한다. 프로모터는 TATA 요소와 같은 전사 시작 부위 근처의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 시스-작용 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
"구조성" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 조절하에서 활성인 프로모터이다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제 2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 여기서 발현 제어 서열은 제 2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 지시한다.
유전자 발현은 또한 전사 시작 부위로부터 수천 염기쌍만큼 위치할 수 있는 하나 이상의 말단 "인핸서" 또는 "리프레서" 요소에 의해 제어될 수 있다. 인핸서 또는 리프레서 요소는 인핸서 요소가 전사 시작 위치에서 멀리 떨어져서 작용할 수 있다는 점을 제외하고는, 전사 시작 위치 근처의 시스 작용 요소와 유사한 방식으로 전사를 조절한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터는, 예를 들어, 구조성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다.
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 및 EF-1 알파 짧은 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 5-8 중 어느 하나로부터 선택된 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 인핸서를 포함한다. 인핸서는, 예를 들어, CMV 인핸서일 수 있다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 SEQ ID NO: 9의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 조직-특이적 프로모터 및 인핸서의 비제한적 목록은 HMG-COA 환원효소 프로모터; 스테롤 조절 요소 1(SRE-1); 포스포에놀 피루베이트 카복시 키나아제(PEPCK) 프로모터; 인간 C-반응성 단백질(CRP) 프로모터; 인간 글루코키나제 프로모터; 콜레스테롤 7-알파 하이드로일라제(CYP-7) 프로모터; 베타-갈락토시다제 알파-2,6 시알릴트랜스퍼라제 프로모터; 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP-1) 프로모터; 알돌라제 B 프로모터; 인간 트랜스페린 프로모터; 콜라겐 유형 I 프로모터; 전립선산 포스파타제(PAP) 프로모터; 94(PSP 94) 프로모터의 전립선 분비 단백질; 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터; 인간 선 칼리크레인 유전자 프로모터(hgt-1); 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2; 근육 크레아틴 키나아제 프로모터; 췌장염-연관 단백질 프로모터(PAP); 엘라스타제 1 전사 인핸서; 췌장 특이적 아밀라아제 및 엘라스타아제 인핸서 프로모터; 췌장 콜레스테롤 에스테라제 유전자 프로모터; 자궁글로빈 프로모터; 콜레스테롤 측쇄 절단(SCC) 프로모터; 감마-감마 에놀라제(뉴런-특이적 에놀라제, NSE) 프로모터; 신경섬유 중쇄(NF-H) 프로모터; 인간 CGL-1/그랜자임 B 프로모터; 말단 데옥시 트랜스퍼라제(TdT), 람다 5, VpreB 및 lck(림프구 특이적 티로신 단백질 키나아제 p561ck) 프로모터; 인간 CD2 프로모터 및 이의 3' 전사 인핸서; 인간 NK 및 T 세포 특이적 활성화(NKG5) 프로모터; pp60c-src 티로신 키나아제 프로모터; 기관-특이적 신생항원(OSN), mw 40kDa(p40) 프로모터; 결장 특이적 항원-P 프로모터; 인간 알파-락트알부민 프로모터; 포스포에홀피루베이트 카복시키나아제(PEPCK) 프로모터, HER2/neu 프로모터, 카제인 프로모터, IgG 프로모터, 융모막 배아 항원 프로모터, 엘라스타제 프로모터, 포르포빌리노겐 데아미나제 프로모터, 인슐린 프로모터, 성장 호르몬 인자 프로모터, 티로신 하이드록실라제 프로모터, 알부민 프로모터, 알파태아단백질 프로모터, 아세틸-콜린 수용체 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 알파 또는 베타 글로빈 프로모터, T-세포 수용체 프로모터, 오스테오칼신 프로모터, IL-2 프로모터, IL-2 수용체 프로모터, 유청(wap) 프로모터 및 MHC 클래스 II 프로모터를 포함한다.
이식유전자
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 표적 세포에서의 발현을 위한 이식유전자를 포함한다.
이식유전자는 관심 있는 임의의 이종 핵산 서열(들)일 수 있다. 이러한 핵산은 치료(예를 들어, 의료 또는 수의학적 용도) 또는 면역원성(예를 들어, 백신) 폴리펩타이드 또는 RNA를 포함하는 폴리펩타이드 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 안티센스 핵산, 리보자임, 스플라이세오솜-매개/램-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA, 유전자 침묵을 매개하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함하는 간섭 RNA(RNAi), 및 기타 번역되지 않은 RNA를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산 서열은 유전자 편집을 지시할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 가이드 RNA 또는 뉴클레아제와 같은 유전자 편집 분자를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산은 아연-핑거 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, TALEN(전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제), NgAgo(아그로노트 엔도뉴클레아제), SGN(구조 유도 엔도뉴클레아제), 또는 RGN( RNA-가이드 뉴클레아제), 예를 들어 Cas9 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제를 암호화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 핵산은 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 이와 재조합할 수 있다. 이 접근법은, 예를 들어, 숙주 세포의 유전적 결함을 교정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 분할 및 비분할 세포를 포함하는 광범위한 세포 내로 이식유전자를 전달하기 위한 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 시험관내에서 세포에 이식유전자를 전달하기 위해, 예를 들어 시험관내에서 또는 생체외 유전자 요법을 위해 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어, 면역원성 또는 치료적 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 발현하기 위해 이를 필요로 하는 대상에게 이식유전자를 전달하는 방법에 추가로 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA는 대상에서 생체내에서 생산될 수 있다. 대상은 폴리펩타이드가 결핍되어 있기 때문에 대상에게 폴리펩타이드가 필요할 수 있다. 또한, 대상에서 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA의 생산이 일부 유익한 효과를 줄 수 있기 때문에 방법이 실행될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "기능적 RNA"는 이전 단락에 기술된 것과 같은 세포에서 하나 이상의 기능을 갖는 임의의 비-암호화 RNA 서열을 의미한다.
바이러스 벡터는 또한 배양된 세포 또는 대상에서 관심 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA의 생산을 위한 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 대상을 생물반응기로 사용하여 폴리펩타이드를 생산하거나 예를 들어, 스크리닝 방법과 관련하여 대상에 대한 기능적 RNA의 효과를 관찰할 수 있다).
일반적으로, 본 발명의 바이러스 벡터는 치료용 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 전달하는 것이 유익한 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 암호화하는 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1을 치료하는 데 유용하다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화한다. NPC1 단백질은, 예를 들어, 인간 NPC1 단백질일 수 있다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 또는 적어도 98% 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 표 3에 나열된 단일 아미노산 변화 중 하나 이상을 포함한다(SEQ ID NO: 1에 기초한 넘버링). 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 표 3에 나열된 아미노산 변화 중 하나 이상을 포함한다(SEQ ID NO: 20에 기초한 넘버링). 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 절단된 형태이다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 20의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 20의 서열을 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 아미노산 변화와 함께 포함한다. 일부 실시태양에서, NPC1 단백질은 표 3에 나열된 아미노산 변화 중 하나 이상과 함께 SEQ ID NO: 1 또는 20의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 암호화한다 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 암호화한다.
일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열 또는 이에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 핵산 변화를 포함한다.
NPC1 변이체 서열 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 20을 기초로 한 위치 넘버링
위치 돌연변이 위치 돌연변이 위치 돌연변이
63 C→R 691 P→L 1012 G→D
74 C→Y 695 L→V 1015 G→V
92 Q→R 700 D→N 1016 H→R
113 C→R 703 F→S 1023 V→G
137 T→M 724 L→P 1034 G→R
151 S→G 727 V→F 1035 A→V
166 P→S 734 S→L 1036 T→K
177 C→G 742 E→K 1036 T→M
177 C→Y 745 A→E 1049 A→V
215 H→R 754 M→K 1054 A→T
222 N→S 757 V→A 1059 R→Q
231 V→G 763 F→L 1061 I→T
237 P→S 767 A→V 1062 A→V
242 D→H 775 Q→P 1066 T→N
242 D→N 789 R→C 1087 F→L
247 C→Y 789 R→G 1088 Y→C
248 G→V 825 Y→C 1089 E→K
272 M→R 849 S→I 1094 I→T
333 G→D 858 I→V 1097 D→N
372 R→W 862 Q→L 1137 N→I
378 V→A 865 S→L 1140 G→V
380 L→F 871 Y→C 1142 M→T
381 W→C 873 V→A 1150 N→K
388 A→P 874 D→V 1156 N→I
389 R→C 888 P→S 1156 N→S
401 P→T 889 V→M 1165 V→M
404 R→P 890 Y→C 1167 F→L
404 R→Q 899 Y→D 1168 C→Y
404 R→W 910 G→S 1174 A→V
433 P→L 917 D→Y 1186 R→H
434 P→L 926 A→T 1189 E→G
434 P→S 927 A→V 1205 T→K
451 E→K 928 Q→P 1205 T→R
472 L→P 929 L→P 1212 V→L
473 S→P 934 R→Q 1213 L→F
474 P→L 940 S→L 1213 L→V
479 C→Y 942 W→C 1216 A→V
509 Y→S 943 I→M 1220 I→T
510 H→P 944 D→N 1224 F→L
511 T→M 945 D→N 1236 G→E
512 H→R 948 D→H 1240 G→R
518 R→Q 948 D→N 1249 S→G
518 R→W 948 D→Y 1266 R→Q
521 A→S 950 V→M
537 F→L 954 S→L
543 P→L 956 C→Y
574 T→K 958 R→L
576 K→R 958 R→Q
605 A→V 959 V→E
612 E→D 961-966 NITDQF→S
615 R→C 961 N→S
615 R→L 968 N→S
631 M→R 971 V→G
640 G→R 976 C→R
642 M→I 978 R→C
652 S→W 986 G→S
660 G→S 992 G→A
664 V→M 992 G→R
666 S→N 992 G→W
670 C→W 996 M→R
673 G→V 1004 S→L
684 L→F 1007 P→A
폴리아데닐화(PolyA) 신호
폴리아데닐화 신호는 거의 모든 포유동물 유전자에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열이며 유전자 전사체의 3' 말단에 일련의 약 200개의 아데노신 잔기(폴리(A) 꼬리)의 추가를 제어한다. 폴리(A) 꼬리는 mRNA의 안정성에 기여하며 폴리(A) 꼬리가 없는 mRNA는 빠르게 분해된다. 폴리(A) 꼬리의 존재가 번역 개시에 영향을 주어 mRNA의 번역성에 긍정적으로 기여한다는 증거도 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 전달 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)의 폴리아데닐화 신호로부터 선택될 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 13의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
스터퍼 서열
AAV 벡터는 일반적으로 정의된 크기 범위, 일반적으로 약 4kb 내지 약 5.2kb 또는 약간 더 많은 범위의 DNA 삽입물을 허용한다. 따라서, 더 짧은 이식유전자 서열의 경우, AAV 벡터에 허용 가능한 필요한 길이를 달성하기 위해 추가 핵산을 포함하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 전달 카세트는 스터퍼 서열을 포함할 수 있다. 스터퍼 서열은 예를 들어 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500- 3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500 내지 4,500-5,000개 뉴클레오타이드 길이 사이의 서열일 수 있다. 스터퍼 서열은 임의의 원하는 위치의 카세트에 위치될 수 있어서 벡터의 기능 또는 활성을 방해하지 않는다.
인트론 서열
일부 실시태양에서, 본 발명의 AAV 전달 카세트는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 인트론 서열의 포함은 인트론 서열 부재하에서의 발현과 비교하여 발현을 향상시킬 수 있다. 일부 인트론 서열은 전사 인자의 결합 부위로 기능하지 않고 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 인트론 서열은 전사 속도, 핵 외이송 및 전사 안정성에 영향을 주어 전사 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 mRNA 번역의 효율을 증가시킨다.
일부 실시태양에서, 인트론 서열은 하이브리드 또는 키메라 서열이다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SV40, β-글로빈, 닭 베타-액틴, 마우스 미세 바이러스(MVM), 인자 IX, 및/또는 인간 IgG(중쇄 또는 경쇄)의 하나 이상의 인트론 서열로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 키메라이다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11의 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
인트론 서열은 AAV 벡터의 생성을 방해하지 않는 전달 카세트의 아무 곳에나 위치될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 프로모터와 이식유전자 사이에 위치될 수 있다.
AAV 전달 카세트
일부 실시태양에서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 전달 카세트는 5' 역 말단 반복부(ITR), 프로모터, 이식유전자, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 전달 카세트는 프로모터와 이식유전자 사이의 인트론 서열과 같은 인트론 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 인핸서를 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 인트론 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하고 3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인핸서는 SEQ ID NO: 9의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 5-8 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 인트론 서열은 SEQ ID NO: 10 또는 11의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 폴리A 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 13의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, CBA 프로모터, SV40 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, SV40 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB240 프로모터, 키메라 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, rBG 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB379 프로모터, SV40 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, rBG 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB240 프로모터, 키메라 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, SV40 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, GUSB240 프로모터, SV40 인트론, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, SV40 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다. 일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 5' ITR, CMV 인핸서, HSVTK 프로모터, NPC1 단백질을 암호화하는 이식유전자, rBG 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 CBA 프로모터, SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 SV40 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 1)을 암호화하는 이식유전자, SEQ ID NO: 12를 포함하는 SV40 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 6의 서열을 포함하는 GUSB240 프로모터, SEQ ID NO: 11을 포함하는 키메라 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 13을 포함하는 rBG 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 6을 포함하는 GUSB379 프로모터, SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 SV40 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 13을 포함하는 rBG 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 7을 포함하는 GUSB240 프로모터, SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 키메라 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 12를 포함하는 SV40 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 5' ITR, SEQ ID NO: 6을 포함하는 GUSB240 프로모터, SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 SV40 인트론, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 12를 포함하는 SV40 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 5' ITR, CMV 인핸서, SEQ ID NO: 8을 포함하는 HSVTK 프로모터, NPC1 단백질(SEQ ID NO: 1)을 암호화하는 이식유전자, SEQ ID NO: 13을 포함하는 rBG 폴리아데닐화 신호, 및 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 3' ITR을 포함한다.
일부 실시태양에서, 핵산은 AAV 전달 카세트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 이식유전자를 포함하고, 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 이식유전자를 포함하고, 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 인트론 서열; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시태양에서, 핵산은 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 닭 베타-액틴 프로모터; 인트론 서열; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하며; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 암호화한다.
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 플라스미드 또는 백미드에 포함될 수 있다. 플라스미드 또는 백미드는, 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 포함하는 AAV의 생산 동안 사용되는 하나 이상의 유전적 요소를 추가로 포함할 수 있다.
AAV 생산 방법
AAV 전달 카세트, 및 본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트를 포함하는 핵산(예를 들어, 플라스미드)은 재조합 AAV 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법은 AAV 생산자 세포(예를 들어, HEK293 세포)를 본 발명의 AAV 전달 카세트 또는 핵산(예를 들어, 플라스미드)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 이 방법은 AAV 생산자 세포를 예를 들어 AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 암호화하는 하나 이상의 추가 플라스미드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법은 AAV 생산자 세포(예를 들어, Sf9 세포와 같은 곤충 세포)를 본 발명의 AAV 전달 카세트를 포함하는 적어도 하나의 곤충 세포-적합성 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. "곤충 세포-적합성" 핵산은 곤충 세포로 형질전환되거나 형질감염될 수 있고 세포의 전사 및/또는 번역 기구에 의해 인식될 수 있는 임의의 핵산이다. 일부 실시태양에서, 곤충 세포-적합성 핵산은 배큘로바이러스 핵산이다. 일부 실시태양에서, 이 방법은 AAV가 생성되도록 하는 조건하에서 곤충 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다.
생산된 재조합 AAV 벡터는 임의의 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV일 수 있다. 일부 실시태양에서, 생산된 재조합 AAV 벡터는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질 캡시드를 포함할 수 있고, 여기서 캡시드 단백질 서브유닛은 천연 AAV 캡시드 단백질 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환 및/또는 결실)을 포함한다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 유래된 변형된 AAV 벡터일 수 있다.
재조합 AAV 벡터는, 예를 들어, 재조합 AAV 벡터를 표적 세포와 접촉시킴으로써 표적 세포를 이식유전자로 형질도입하는데 사용될 수 있다.
조성물
또한, 본 발명의 AAV 전달 카세트, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시태양에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
치료 방법
본 발명의 AAV 벡터는 필요로 하는 대상의 질환, 장애, 또는 다른 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 대상은, 예를 들어, 인간 또는 동물일 수 있다. 인간은 소아 대상, 청소년 대상, 성인 대상 또는 노인 대상일 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 양태는 본 발명의 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 바이러스-유사 입자를 대상에게 투여하는 방법이다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이러스 벡터 및/또는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에게 핵산을 전달하는 방법을 제공한다. 필요로 하는 대상에 대한 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 및/또는 조성물의 투여는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 선택적으로, 바이러스 벡터 및/또는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체에 유효 용량(예를 들어, 치료적 유효 용량)으로 전달된다. 바람직한 실시태양에서, 유효량의 바이러스 벡터 및/또는 조성물이 전달된다.
대상에게 투여될 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자의 용량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방될 질환 또는 상태, 개별 대상의 상태, 특정 바이러스 벡터 또는 입자, 및 전달될 핵산 등에 따라 달라질 것이고, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 재조합 AAV의 용량은 유효 용량이다. 예시적인 유효 용량은 예를 들어 적어도 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015 형질도입 단위, 선택적으로 약 108 내지 약 1013 형질도입 단위의 용량일 수 있다. 일부 실시태양에서, 재조합 AAV의 유효 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1015 벡터 게놈 범위의 용량이다. 예를 들어, 유효 용량은 대상의 체중 킬로그램당 약 1 x 1011, 약 5 x 1011, 약 1 x 1012, 약 5 x 1012, 약 1 x 1013, 약 5 x 1013, 약 1 x 1014, 약 5 x 1014, 또는 약 1 x 1015 벡터 게놈일 수 있다.
특정 실시태양에서, 다양한 간격, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등의 기간에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)가 사용될 수 있다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안내, 경피, 자궁내(또는 난소), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 대한 투여 포함], 피내, 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 피부 및 기도 표면을 포함하는 점막 표면 모두에, 및 경피 투여), 림프내 등 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사(예를 들어, 간, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌)를 포함한다. 투여는 또한 종양(예를 들어, 종양 또는 배액 림프절 내부 또는 근처)에 대한 것일 수 있다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료 및/또는 예방될 상태의 특성 및 중증도 및 사용 중인 특정 AAV 벡터의 특성에 따라 달라질 것이다.
표적 조직으로의 전달은 또한 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 저장소(depot)를 전달함으로써 달성될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, "저장소"의 전달은 바이러스의 느린 방출 및/또는 점진적인 전파를 허용하여 바이러스가 표준 주사로 가능한 것보다 더 긴 기간 동안 작용할 수 있도록 하는 지속 작용 제제의 투여를 의미한다. 대표적인 실시태양에서, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 저장소는 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육 조직에 이식되거나 조직은 바이러스 벡터 및/또는 바이러스-유사 입자를 포함하는 필름 또는 기타 매트릭스와 접촉될 수 있다.
일부 실시태양에서, 필요로 하는 대상을 치료하는 방법은 유효량(예를 들어, 치료 유효량)의 AAV 전달 카세트, 플라스미드, 세포, 또는 본 발명의 재조합 AAV를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간 대상이다. 일부 실시태양에서, 대상은 NPC1을 갖는다.
실시예
예시 목적으로만 본 명세서에 포함된 다음 실시예는 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 포유동물 세포에서 재조합 AAV 벡터의 제조
3개의 플라스미드가 제공된다. 제 1 플라스미드는 2개의 ITR(SEQ ID NO: 3 및 4)이 플랭킹된 NPC1을 암호화하는 이식유전자(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 전달 카세트를 포함한다. 제 1 플라스미드는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함한다. 제 2 플라스미드는 Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 제 3 플라스미드는 AAV 생산에 필요한 다양한 "헬퍼(helper)" 인자(E4, E2a 및 VA)를 포함한다.
3개의 플라스미드는 적절한 형질감염 시약(예를 들어, 리포펙타민TM)을 사용하여 바이러스 생산 세포(예를 들어, HEK293)로 형질감염된다. 소정의 시간 동안 37℃에서 배양한 후, AAV 입자를 배지로부터 수집하거나 세포를 용해시켜 AAV 입자를 방출한다. 그런 다음 AAV 입자를 정제하고 표준 방법에 따라 정량적 PCR(qPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 적정한다. AAV 입자는 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 보관될 수 있다.
실시예 2: 곤충 세포에서 재조합 AAV 벡터의 제조
제 1 재조합 바큘로바이러스 벡터가 제공된다. 제 1 재조합 배큘로바이러스 벡터는 NPC1을 암호화하는 이식유전자(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 전달 카세트를 포함하는 핵산을 포함하고, 여기서 이식입유전자는 2개의 ITR(SEQ ID NO: 3 및 4)에 의해 플랭킹된다. 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
곤충 세포(예를 들어, Sf9)는 AAV Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 재조합 배큘로바이러스 벡터 및 적어도 하나의 추가 재조합 배큘로바이러스 벡터와 함께 현탁 배양에서 동시 감염된다. 소정의 시간 동안 28℃에서 배양한 후, AAV 입자를 배지로부터 수집하거나 세포를 용해시켜 AAV 입자를 방출한다. 그런 다음 AAV 입자를 정제하고 표준 방법에 따라 정량적 PCR(qPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 적정한다. AAV 입자는 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 보관될 수 있다.
실시예 3: 시험관내 효능 분석
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트가 배양된 세포에서 NPC1 리소좀 표현형을 구제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, hNPC1 전달 카세트(SEQ ID NO: 14)를 패키징하는 재조합 AAV2 벡터를 삼중-형질감염 프로토콜을 사용하여 HEK293 세포에서 제조하였다(예를 들어, 실시예 1 참조). 그런 다음 AAV2-hNPC1 벡터를 사용하여 야생형 U2OS 세포(골육종) 및 5 x 103(5K) 또는 10 x 103(10K)의 감염 다중도(MOI)에서 시험관 내에서 NPC1을 발현하지 않는 U2OS 세포(NPC-/-)를 형질도입하는데 사용하였다. 그런 다음 세포를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 배양하였다.
NPC1 세포는 리소좀에서 콜레스테롤의 특징적인 축적을 나타내며, 이는 세포 내 리소좀의 크기와 수를 관찰하여 모니터하였다. 이 분석법에서, 리소좀 표현형은 세포에서 형광성 소기관 염료 LysoTracker®(ThermoFisher Scientific®)의 축적을 측정하여 모니터하였다. AAV2-hNPC1 벡터로 형질도입한 지 72시간 후, 50mM의 LysoTracker®를 세포에 첨가하였다. 2시간 후, 세포를 고정하고 LysoTracker® 형광을 측정하였다.
결과를 도 1a에 나타내었다. 예상대로, 야생형 U2OS 세포는 리소좀에서 LysoTracker® 형광의 상당한 축적을 나타내지 않은 반면 NPC1-/- 세포는 축적을 보였다. 5K 또는 10K의 MOI에서 AAV2-hNPC1으로 형질도입된 세포는 리소좀에서 LysoTracker® 형광 축적이 상당히 감소하였다.
별도의 분석에서, hNPC1으로 형질도입된 세포를 고정하고 콜레스테롤에 대한 조직화학적 염색인 필리핀(filipin)을 사용하여 염색하였다. 스트렙토마이세스 필리피넨시스(Streptomyces filipinensis)에서 유래한 필리핀 균주는 폴리사이언스에서 구입하여 50μg/mL의 최종 농도로 사용하였다. Pico Automated Cell Imaging System(ImageXpress®)을 사용하여 세포를 시각화하고 필리핀 염색을 정량화하였다. 결과를 도 1b에 나타내었다. 예상대로, 야생형 U2OS 세포는 유의미한 콜레스테롤 축적을 나타내지 않은 반면 NPC1-/- 세포는 콜레스테롤 축적을 보였다. 5K 또는 10K의 MOI에서 AAV2-hNPC1으로 형질도입된 세포는 콜레스테롤 축적을 상당히 감소시켰다.
종합하면, 이러한 데이터는 AAV2-hNPC를 사용하는 세포의 형질도입이 NPC1-결핍 U2OS 세포에서 리소좀 표현형을 성공적으로 구조했음을 보여준다.
실시예 4: 생체내 효능 분석
본 명세서에 기술된 AAV 전달 카세트가 생체내에서 NPC1 표현형을 구조할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, hNPC1 전달 카세트(SEQ ID NO: 14)를 패키징하는 재조합 AAV9 벡터를 삼중-형질감염 프로토콜을 사용하여 HEK293 세포에서 제조하였다(예를 들어, 실시예 1 참조). 24-28일령의 NPC1이 결핍된 마우스(즉, NPC1-/- 마우스)는 식염수 또는 AAV9-hNPC1 벡터와 함께 안와후주사에 의해 킬로그램당 3.0 x 1014 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 정맥내 주사되었다. 결과를 도 2에 나타내었다. 모든 식염수 처리된 마우스는 약 80일령에 사망하였다. 그러나, 모든 AAV9-hNPC1 주사 동물은 실험 기간 동안 생존하였다. AAV9-hNPC1 주사 마우스는 분석을 위해 약 100일령에 희생되었다.
마우스는 또한 균형 대들보를 가로질러 걸을 때 미끄러짐의 수를 측정하는 균형 대들보 보행 테스트에 도전하였다. 테스트는 생후 약 8주령(56일)에 실시하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 야생형 마우스는 균형 대들보에서 미끄러지지 않았다. AAV9-hNPC1로 처리한 NPC1-/- 마우스와 식염수-처리된 NPC1-/- 마우스 사이에 미끄러짐 수에 통계적으로 유의한 차이가 없었지만, AAV9-hNPC1 그룹에서 관찰된 미끄러짐의 평균 수는 더 적었다.
마우스의 행동 표현형 점수는 또한 약 10주령(70일)에 평가하였다. 행동 표현형 점수는 몸단장, 보행, 척추 후만증, 렛지 테스트, 뒷다리 잡기 및 떨림을 포함하는 다양한 질환 증상을 측정하는 종합 점수이다. (Alam et al, Sci Transl Med, 2016; Guyenet et al, J Vis Exp, 2010 참조). 도 3에 도시된 바와 같이, AAV9-hNPC1로 처리된 NPC1-/- 마우스는 식염수 처리된 NPC1-/- 마우스와 비교하여 유의하게 감소된 점수를 가졌다.
종합하면, 이러한 데이터는 AAV9-hNPC1이 NPC1 결핍 마우스의 질환 표현형을 적어도 부분적으로 구조할 수 있음을 입증한다.
전술한 내용은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 다음의 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 등가물이 그 안에 포함된다.
번호를 매긴 실시태양
첨부된 청구항에도 불구하고, 다음의 번호가 매겨진 실시태양은 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
1. 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트로서, 이식 유전자는 NPC1 단백질을 암호화하는 것인 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트.
2. 실시태양 1에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 길이가 약 110 내지 약 160개 뉴클레오타이드인 AAV 전달 카세트.
3. 실시태양 1 또는 2에 있어서,
5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이인 AAV 전달 카세트.
4. 실시태양 1 또는 2에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
5. 실시태양 1-4 중 어느 하나에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래되는 것인 AAV 전달 카세트.
6. 실시태양 1에 있어서,
5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
7. 실시태양 1에 있어서,
3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
8. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 구조성 프로모터인 AAV 전달 카세트.
9. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 유도성 프로모터인 AAV 전달 카세트.
10. 실시태양 1-9 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 조직-특이적 프로모터인 AAV 전달 카세트.
11. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, HSVTK 프로모터, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 AAV 전달 카세트.
12. 실시태양 11에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 HSVTK 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 AAV 전달 카세트.
13. 실시태양 1-7 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나와 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
14. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 전달 카세트.
15. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
16. 실시태양 15에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
17. 실시태양 16에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 갖는 것인 AAV 전달 카세트.
18. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
19. 실시태양 1-13 중 어느 하나에 있어서,
이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
20. 실시태양 1-18 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), 토끼 베타 글로빈(rBG), α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택되는 것인 AAV 전달 카세트.
21. 실시태양 2O에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 전달 카세트.
22. 실시태양 2O에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호인 AAV 전달 카세트.
23. 실시태양 1-19 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 13과 적어도 95% 또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
24. 실시태양 1-23 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인핸서를 추가로 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
25. 실시태양 24에 있어서,
인핸서는 CMV 인핸서인 AAV 전달 카세트.
26. 실시태양 24에 있어서,
인핸서는 SEQ ID NO: 9의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
27. 실시태양 1-26 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
28. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 키메라 서열인 AAV 전달 카세트.
29. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 하이브리드 서열인 AAV 전달 카세트.
30. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
31. 실시태양 27에 있어서,
인트론 서열은 SEQ ID NO: 10-11 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
32. 실시태양 1에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
33. 실시태양 1-31 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트를 포함하는 플라스미드.
34. 실시태양 1-32 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트 또는 실시태양 33의 플라스미드를 포함하는 세포.
35. 단백질 캡시드 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서: 여기서 핵산은 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하는 전달 카세트를 포함하며; 여기서 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화하는 것인 재조합 AAV 벡터.
36. 실시태양 35에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 길이가 약 110 내지 약 160개 뉴클레오타이드인 재조합 AAV 벡터.
37. 실시태양 35 또는 36에 있어서,
5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이인 재조합 AAV 벡터.
38. 실시태양 35 또는 36에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는 것인 재조합 AAV 벡터.
39. 실시태양 35-38 중 어느 하나에 있어서,
5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 분리되거나 유래되는 것인 재조합 AAV 벡터.
40. 실시태양 35에 있어서,
5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
41. 실시태양 35에 있어서,
3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
42. 실시태양 35-41 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 구조성 프로모터인 재조합 AAV 벡터.
43. 실시태양 35-41 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 유도성 프로모터인 재조합 AAV 벡터.
44. 실시태양 35-41 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 조직-특이적 프로모터인 재조합 AAV 벡터.
45. 실시태양 35-41 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, HSVTK 프로모터, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 다면체 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 AAV 벡터.
46. 실시태양 45에 있어서,
프로모터는 CBA 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 HSVTK 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 재조합 AAV 벡터.
47. 실시태양 35-41 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나와 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
48. 실시태양 35-47 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 재조합 AAV 벡터.
49. 실시태양 35-48 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 것인 재조합 AAV 벡터.
50. 실시태양 49에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 것인 재조합 AAV 벡터.
51. 실시태양 50에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질의 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 갖는 것인 재조합 AAV 벡터.
52. 실시태양 35-48 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
53. 실시태양 35-48 중 어느 하나에 있어서,
이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
54. 실시태양 35-53 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 원숭이 바이러스 40(SV40), rBG, α-글로빈, β-글로빈, 인간 콜라겐, 인간 성장 호르몬(hGH), 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬(hGH) 및 소 성장 호르몬(bGH)으로부터 선택되는 것인 재조합 AAV 벡터.
55. 실시태양 54에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 재조합 AAV 벡터.
56. 실시태양 54에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 rBG 폴리아데닐화 신호인 재조합 AAV 벡터.
57. 실시태양 35-53 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12 또는 13과 적어도 95% 또는 적어도 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
58. 실시태양 35-57 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인핸서를 추가로 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
59. 실시태양 58에 있어서,
인핸서는 CMV 인핸서인 재조합 AAV 벡터.
60. 실시태양 58에 있어서,
인핸서는 SEQ ID NO: 9의 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
61. 실시태양 35-60 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
62. 실시태양 61에 있어서,
인트론 서열은 키메라 서열인 재조합 AAV 벡터.
63. 실시태양 61에 있어서,
인트론 서열은 하이브리드 서열인 재조합 AAV 벡터.
64. 실시태양 61에 있어서,
인트론 서열은 SV40으로부터 분리되거나 유래된 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
65. 실시태양 61에 있어서,
인트론 서열은 SEQ ID NO: 10-11 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
66. 실시태양 35에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14-19 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
67. 실시태양 35에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14 의 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
68. 실시태양 35-67 중 어느 하나에 있어서,
단백질 캡시드는 하기 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV 중 어느 하나의 AAV로부터의 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
69. 실시태양 35-67 중 어느 하나에 있어서,
단백질 캡시드는 하기 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV 중 어느 하나의 캡시드 단백질 서브유닛에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
70. AAV 생산자 세포를 실시태양 1-32 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트 또는 실시태양 33의 플라스미드와 접촉시키는 단계를 포함하여 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법.
71. 실시태양 35의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터.
72. 실시태양 71에 있어서,
벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 선택된 혈청형인 재조합 AAV 벡터.
73. 실시태양 1-32 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 33의 플라스미드, 실시태양 34의 세포, 또는 실시태양 35-69, 71, 또는 72 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
74. 실시태양 1-32 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 33의 플라스미드, 실시태양 34의 세포, 또는 실시태양 35-68, 70, 또는 71 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
75. 실시태양 74에 있어서,
대상은 NPC1을 갖는 것인 방법.
76. 실시태양 74 또는 75에 있어서,
대상은 인간 대상인 방법.
77. 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하는 핵산으로서; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 암호화하는 것인 핵산.
78. 5'에서 3'로: 5' 역 말단 반복부(ITR); 닭 베타-액틴 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트로서; 여기서 전달 카세트는 인트론 서열을 포함하고; 여기서 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화하는 것인 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트.
79. 실시태양 78에 있어서,
인트론 서열은 프로모터와 이식유전자 사이에 위치하는 것인 AAV 전달 카세트.
80. 실시태양 78 또는 79에 있어서,
5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
81. 실시태양 78-80 중 어느 하나에 있어서,
3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 AAV 전달 카세트.
82. 실시태양 78-81 중 어느 하나에 있어서,
프로모터는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 AAV 전달 카세트.
83. 실시태양 78-82 중 어느 하나에 있어서,
인트론 서열은 SV40 인트론인 AAV 전달 카세트.
84. 실시태양 78-82 중 어느 하나에 있어서,
인트론 서열은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
85. 실시태양 78-84 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 전달 카세트.
86. 실시태양 78-84 중 어느 하나에 있어서,
NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
87. 실시태양 78-84 중 어느 하나에 있어서,
이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
88. 실시태양 78-87 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 전달 카세트.
89. 실시태양 78-87 중 어느 하나에 있어서,
폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
90. 실시태양 78-89 중 어느 하나에 있어서,
카세트는 인핸서를 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
91. 실시태양 78에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
92. 실시태양 78에 있어서,
AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 15-19 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
93. 실시태양 78-92 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트를 포함하는 플라스미드.
94. 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하는 핵산으로서; 여기서 핵산은 인트론 서열을 포함하고; 여기서 이식유전자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 암호화하는 것인 핵산.
95. 실시태양 94에 있어서,
인트론 서열은 프로모터와 이식유전자 사이에 위치하는 것인 핵산.
96. 실시태양 78-92 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 93의 플라스미드, 또는 실시태양 94 또는 95의 핵산을 포함하는 세포.
97. 단백질 캡시드 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서: 여기서 핵산은 실시태양 78-92 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트를 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
98. 제 97 실시태양에 있어서,
단백질 캡시드는 다음 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV 중 어느 하나의 AAV로부터의 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
99. 실시태양 97에 있어서,
단백질 캡시드는 다음 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV 중 어느 하나의 캡시드 단백질 서브유닛에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
100. AAV 생산자 세포를 실시태양 78-92 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 93의 플라스미드, 또는 실시태양 93의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하여 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법.
101. 실시태양 100의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터.
102. 실시태양 78-92 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 93의 플라스미드, 실시태양 94 또는 95의 핵산, 실시태양 96의 세포, 또는 실시태양 97-99 또는 101 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
103. 대상에게 유효량의 실시태양 78-92 중 어느 하나의 AAV 전달 카세트, 실시태양 93의 플라스미드, 실시태양 94 또는 95의 핵산, 실시태양 96의 세포 또는 실시태양 97-99 또는 101 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
104. 실시태양 103에 있어서,
대상은 NPC1을 갖는 것인 방법.
105. 실시태양 103 또는 104에 있어서,
대상은 인간 대상인 방법.
SEQUENCE LISTING <110> StrideBio Inc. <120> AAV TRANSFER CASSETTE <130> STRD-015/02WO 331843-2151 <150> US 62/923,253 <151> 2019-10-18 <150> US 62/916,749 <151> 2019-10-17 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1278 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Arg Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Pro Ala Gln Val Phe Ser Gln Ser Cys Val Trp Tyr Gly Glu Cys Gly 20 25 30 Ile Ala Tyr Gly Asp Lys Arg Tyr Asn Cys Glu Tyr Ser Gly Pro Pro 35 40 45 Lys Pro Leu Pro Lys Asp Gly Tyr Asp Leu Val Gln Glu Leu Cys Pro 50 55 60 Gly Phe Phe Phe Gly Asn Val Ser Leu Cys Cys Asp Val Arg Gln Leu 65 70 75 80 Gln Thr Leu Lys Asp Asn Leu Gln Leu Pro Leu Gln Phe Leu Ser Arg 85 90 95 Cys Pro Ser Cys Phe Tyr Asn Leu Leu Asn Leu Phe Cys Glu Leu Thr 100 105 110 Cys Ser Pro Arg Gln Ser Gln Phe Leu Asn Val Thr Ala Thr Glu Asp 115 120 125 Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Thr Lys Thr Asn Val Lys Glu Leu 130 135 140 Gln Tyr Tyr Val Gly Gln Ser Phe Ala Asn Ala Met Tyr Asn Ala Cys 145 150 155 160 Arg Asp Val Glu Ala Pro Ser Ser Asn Asp Lys Ala Leu Gly Leu Leu 165 170 175 Cys Gly Lys Asp Ala Asp Ala Cys Asn Ala Thr Asn Trp Ile Glu Tyr 180 185 190 Met Phe Asn Lys Asp Asn Gly Gln Ala Pro Phe Thr Ile Thr Pro Val 195 200 205 Phe Ser Asp Phe Pro Val His Gly Met Glu Pro Met Asn Asn Ala Thr 210 215 220 Lys Gly Cys Asp Glu Ser Val Asp Glu Val Thr Ala Pro Cys Ser Cys 225 230 235 240 Gln Asp Cys Ser Ile Val Cys Gly Pro Lys Pro Gln Pro Pro Pro Pro 245 250 255 Pro Ala Pro Trp Thr Ile Leu Gly Leu Asp Ala Met Tyr Val Ile Met 260 265 270 Trp Ile Thr Tyr Met Ala Phe Leu Leu Val Phe Phe Gly Ala Phe Phe 275 280 285 Ala Val Trp Cys Tyr Arg Lys Arg Tyr Phe Val Ser Glu Tyr Thr Pro 290 295 300 Ile Asp Ser Asn Ile Ala Phe Ser Val Asn Ala Ser Asp Lys Gly Glu 305 310 315 320 Ala Ser Cys Cys Asp Pro Val Ser Ala Ala Phe Glu Gly Cys Leu Arg 325 330 335 Arg Leu Phe Thr Arg Trp Gly Ser Phe Cys Val Arg Asn Pro Gly Cys 340 345 350 Val Ile Phe Phe Ser Leu Val Phe Ile Thr Ala Cys Ser Ser Gly Leu 355 360 365 Val Phe Val Arg Val Thr Thr Asn Pro Val Asp Leu Trp Ser Ala Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ala Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Phe Asp Gln His Phe Gly 385 390 395 400 Pro Phe Phe Arg Thr Glu Gln Leu Ile Ile Arg Ala Pro Leu Thr Asp 405 410 415 Lys His Ile Tyr Gln Pro Tyr Pro Ser Gly Ala Asp Val Pro Phe Gly 420 425 430 Pro Pro Leu Asp Ile Gln Ile Leu His Gln Val Leu Asp Leu Gln Ile 435 440 445 Ala Ile Glu Asn Ile Thr Ala Ser Tyr Asp Asn Glu Thr Val Thr Leu 450 455 460 Gln Asp Ile Cys Leu Ala Pro Leu Ser Pro Tyr Asn Thr Asn Cys Thr 465 470 475 480 Ile Leu Ser Val Leu Asn Tyr Phe Gln Asn Ser His Ser Val Leu Asp 485 490 495 His Lys Lys Gly Asp Asp Phe Phe Val Tyr Ala Asp Tyr His Thr His 500 505 510 Phe Leu Tyr Cys Val Arg Ala Pro Ala Ser Leu Asn Asp Thr Ser Leu 515 520 525 Leu His Asp Pro Cys Leu Gly Thr Phe Gly Gly Pro Val Phe Pro Trp 530 535 540 Leu Val Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Gln Asn Tyr Asn Asn Ala Thr Ala 545 550 555 560 Leu Val Ile Thr Phe Pro Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Thr Glu Lys 565 570 575 Leu Gln Arg Ala Gln Ala Trp Glu Lys Glu Phe Ile Asn Phe Val Lys 580 585 590 Asn Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Thr Ile Ser Phe Thr Ala Glu Arg Ser 595 600 605 Ile Glu Asp Glu Leu Asn Arg Glu Ser Asp Ser Asp Val Phe Thr Val 610 615 620 Val Ile Ser Tyr Ala Ile Met Phe Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Leu Gly 625 630 635 640 His Ile Lys Ser Cys Arg Arg Leu Leu Val Asp Ser Lys Val Ser Leu 645 650 655 Gly Ile Ala Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Ser Val Ala Cys Ser Leu 660 665 670 Gly Val Phe Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile Glu 675 680 685 Val Ile Pro Phe Leu Val Leu Ala Val Gly Val Asp Asn Ile Phe Ile 690 695 700 Leu Val Gln Ala Tyr Gln Arg Asp Glu Arg Leu Gln Gly Glu Thr Leu 705 710 715 720 Asp Gln Gln Leu Gly Arg Val Leu Gly Glu Val Ala Pro Ser Met Phe 725 730 735 Leu Ser Ser Phe Ser Glu Thr Val Ala Phe Phe Leu Gly Ala Leu Ser 740 745 750 Val Met Pro Ala Val His Thr Phe Ser Leu Phe Ala Gly Leu Ala Val 755 760 765 Phe Ile Asp Phe Leu Leu Gln Ile Thr Cys Phe Val Ser Leu Leu Gly 770 775 780 Leu Asp Ile Lys Arg Gln Glu Lys Asn Arg Leu Asp Ile Phe Cys Cys 785 790 795 800 Val Arg Gly Ala Glu Asp Gly Thr Ser Val Gln Ala Ser Glu Ser Cys 805 810 815 Leu Phe Arg Phe Phe Lys Asn Ser Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Lys Asp 820 825 830 Trp Met Arg Pro Ile Val Ile Ala Ile Phe Val Gly Val Leu Ser Phe 835 840 845 Ser Ile Ala Val Leu Asn Lys Val Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Leu 850 855 860 Ser Met Pro Asp Asp Ser Tyr Met Val Asp Tyr Phe Lys Ser Ile Ser 865 870 875 880 Gln Tyr Leu His Ala Gly Pro Pro Val Tyr Phe Val Leu Glu Glu Gly 885 890 895 His Asp Tyr Thr Ser Ser Lys Gly Gln Asn Met Val Cys Gly Gly Met 900 905 910 Gly Cys Asn Asn Asp Ser Leu Val Gln Gln Ile Phe Asn Ala Ala Gln 915 920 925 Leu Asp Asn Tyr Thr Arg Ile Gly Phe Ala Pro Ser Ser Trp Ile Asp 930 935 940 Asp Tyr Phe Asp Trp Val Lys Pro Gln Ser Ser Cys Cys Arg Val Asp 945 950 955 960 Asn Ile Thr Asp Gln Phe Cys Asn Ala Ser Val Val Asp Pro Ala Cys 965 970 975 Val Arg Cys Arg Pro Leu Thr Pro Glu Gly Lys Gln Arg Pro Gln Gly 980 985 990 Gly Asp Phe Met Arg Phe Leu Pro Met Phe Leu Ser Asp Asn Pro Asn 995 1000 1005 Pro Lys Cys Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Tyr Ser Ser Ala Val 1010 1015 1020 Asn Ile Leu Leu Gly His Gly Thr Arg Val Gly Ala Thr Tyr Phe 1025 1030 1035 Met Thr Tyr His Thr Val Leu Gln Thr Ser Ala Asp Phe Ile Asp 1040 1045 1050 Ala Leu Lys Lys Ala Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Thr Glu Thr 1055 1060 1065 Met Gly Ile Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Ser Val 1070 1075 1080 Phe Tyr Val Phe Tyr Glu Gln Tyr Leu Thr Ile Ile Asp Asp Thr 1085 1090 1095 Ile Phe Asn Leu Gly Val Ser Leu Gly Ala Ile Phe Leu Val Thr 1100 1105 1110 Met Val Leu Leu Gly Cys Glu Leu Trp Ser Ala Val Ile Met Cys 1115 1120 1125 Ala Thr Ile Ala Met Val Leu Val Asn Met Phe Gly Val Met Trp 1130 1135 1140 Leu Trp Gly Ile Ser Leu Asn Ala Val Ser Leu Val Asn Leu Val 1145 1150 1155 Met Ser Cys Gly Ile Ser Val Glu Phe Cys Ser His Ile Thr Arg 1160 1165 1170 Ala Phe Thr Val Ser Met Lys Gly Ser Arg Val Glu Arg Ala Glu 1175 1180 1185 Glu Ala Leu Ala His Met Gly Ser Ser Val Phe Ser Gly Ile Thr 1190 1195 1200 Leu Thr Lys Phe Gly Gly Ile Val Val Leu Ala Phe Ala Lys Ser 1205 1210 1215 Gln Ile Phe Gln Ile Phe Tyr Phe Arg Met Tyr Leu Ala Met Val 1220 1225 1230 Leu Leu Gly Ala Thr His Gly Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu 1235 1240 1245 Ser Tyr Ile Gly Pro Ser Val Asn Lys Ala Lys Ser Cys Ala Thr 1250 1255 1260 Glu Glu Arg Tyr Lys Gly Thr Glu Arg Glu Arg Leu Leu Asn Phe 1265 1270 1275 <210> 2 <211> 3834 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPC1 cDNA <400> 2 atgaccgctc gcggcctggc ccttggcctc ctcctgctgc tactgtgtcc agcgcaggtg 60 ttttcacagt cctgtgtttg gtatggagag tgtggaattg catatgggga caagaggtac 120 aattgcgaat attctggccc accaaaacca ttgccaaagg atggatatga cttagtgcag 180 gaactctgtc caggattctt ctttggcaat gtcagtctct gttgtgatgt tcggcagctt 240 cagacactaa aagacaacct gcagctgcct ctacagtttc tgtccagatg tccatcctgt 300 ttttataacc tactgaacct gttttgtgag ctgacatgta gccctcgaca gagtcagttt 360 ttgaatgtta cagctactga agattatgtt gatcctgtta caaaccagac 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cagccatacc cttcgggagc tgatgtaccc tttggacctc cgcttgacat acagatactg 1320 caccaggttc ttgacttaca aatagccatc gaaaacatta ctgcctctta tgacaatgag 1380 actgtgacac ttcaagacat ctgcttggcc cctctttcac cgtataacac gaactgcacc 1440 attttgagtg tgttaaatta cttccagaac agccattccg tgctggacca caagaaaggg 1500 gacgacttct ttgtgtatgc cgattaccac acgcactttc tgtactgcgt acgggctcct 1560 gcctctctga atgatacaag tttgctccat gacccttgtc tgggtacgtt tggtggacca 1620 gtgttcccgt ggcttgtgtt gggaggctat gatgatcaaa actacaataa cgccactgcc 1680 cttgtgatta ccttccctgt caataattac tataatgata cagagaagct ccagagggcc 1740 caggcctggg aaaaagagtt tattaatttt gtgaaaaact acaagaatcc caatctgacc 1800 atttccttca ctgctgaacg aagtattgaa gatgaactaa atcgtgaaag tgacagtgat 1860 gtcttcaccg ttgtaattag ctatgccatc atgtttctat atatttccct agccttgggg 1920 cacatcaaaa gctgtcgcag gcttctggtg gattcgaagg tctcactagg catcgcgggc 1980 atcttgatcg tgctgagctc ggtggcttgc tccttgggtg tcttcagcta cattgggttg 2040 cccttgaccc tcattgtgat tgaagtcatc ccgttcctgg tgctggctgt tggagtggac 2100 aacatcttca ttctggtgca ggcctaccag agagatgaac gtcttcaagg ggaaaccctg 2160 gatcagcagc tgggcagggt cctaggagaa gtggctccca gtatgttcct gtcatccttt 2220 tctgagactg tagcattttt cttaggagca ttgtccgtga tgccagccgt gcacaccttc 2280 tctctctttg cgggattggc agtcttcatt gactttcttc tgcagattac ctgtttcgtg 2340 agtctcttgg ggttagacat taaacgtcaa gagaaaaatc ggctagacat cttttgctgt 2400 gtcagaggtg ctgaagatgg aacaagcgtc caggcctcag agagctgttt gtttcgcttc 2460 ttcaaaaact cctattctcc acttctgcta aaggactgga tgagaccaat tgtgatagca 2520 atatttgtgg gtgttctgtc attcagcatc gcagtcctga acaaagtaga tattggattg 2580 gatcagtctc tttcgatgcc agatgactcc tacatggtgg attatttcaa atccatcagt 2640 cagtacctgc atgcgggtcc gcctgtgtac tttgtcctgg aggaagggca cgactacact 2700 tcttccaagg ggcagaacat ggtgtgcggc ggcatgggct gcaacaatga ttccctggtg 2760 cagcagatat ttaacgcggc gcagctggac aactataccc gaataggctt cgccccctcg 2820 tcctggatcg acgattattt cgactgggtg aagccacagt cgtcttgctg tcgagtggac 2880 aatatcactg accagttctg caatgcttca gtggttgacc ctgcctgcgt tcgctgcagg 2940 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tgtgccactg aagagcgata caaaggaaca gagcgcgaac ggcttctaaa tttc 3834 <210> 3 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 prime Inverted Terminal Repeat <400> 3 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 4 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 prime Inverted Terminal Repeat <400> 4 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 5 <211> 278 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 5 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278 <210> 6 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSB240 Promoter <400> 6 cggctggggc tgagggtgag ggtcccgttt ccccaaaggc ctagcctggg gttccagcca 60 caagccctac cgggcagcgc ccggccccgc ccctccaggc ctggcactcg tcctcaacca 120 agatggcgcg gatggcttca ggcgcatcac gacaccggcg cgtcacgcga cccgccctac 180 gggcacctcc cgcgcttttc ttagcgccgc agacggtggc cgagcggggg accgggaagc 240 <210> 7 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSB379 Promoter <400> 7 attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 60 ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag 120 cagacctcgc ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag 180 cctggggttc cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg 240 cactcgtcct caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc 300 acgcgacccg ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggtcgag 360 cgggggaccg ggaagctta 379 <210> 8 <211> 146 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Herpes simplex virus <400> 8 atgacacaaa ccccgcccag cgtcttgtca ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg 60 gggcggcgcg gtcccaggtc cacttcgcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc 120 gagcgaccct gcagcgaccc gcttaa 146 <210> 9 <211> 301 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cytomegalovirus sp. <400> 9 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 60 gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 120 ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 180 tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 240 gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 300 g 301 <210> 10 <211> 97 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> simian virus 40 <400> 10 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 11 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Intron <400> 11 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 12 <211> 122 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> simian virus 40 <400> 12 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 tt 122 <210> 13 <211> 56 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 13 aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56 <210> 14 <211> 4685 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV transfer cassette 1 <400> 14 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc 180 tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt 240 gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg 300 aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc 360 gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc 420 ggcgggcgat gcatgtaagt ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg 480 gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta gcaccggtcg 540 ccaccatgac cgctcgcggc ctggcccttg gcctcctcct gctgctactg tgtccagcgc 600 aggtgttttc acagtcctgt gtttggtatg gagagtgtgg aattgcatat ggggacaaga 660 ggtacaattg cgaatattct ggcccaccaa aaccattgcc aaaggatgga tatgacttag 720 tgcaggaact ctgtccagga ttcttctttg gcaatgtcag tctctgttgt gatgttcggc 780 agcttcagac actaaaagac aacctgcagc tgcctctaca gtttctgtcc agatgtccat 840 cctgttttta taacctactg aacctgtttt gtgagctgac atgtagccct cgacagagtc 900 agtttttgaa tgttacagct actgaagatt atgttgatcc tgttacaaac cagacgaaaa 960 caaatgtgaa agagttacaa tactacgtcg gacagagttt tgccaatgca atgtacaatg 1020 cctgccggga tgtggaggcc ccctcaagta atgacaaggc cctgggactc ctgtgtggga 1080 aggacgctga cgcctgtaat gccaccaact ggattgaata catgttcaat aaggacaatg 1140 gacaggcacc ttttaccatc actcctgtgt tttcagattt tccagtccat gggatggagc 1200 ccatgaacaa tgccaccaaa ggctgtgacg agtctgtgga tgaggtcaca gcaccatgta 1260 gctgccaaga 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<211> 4663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV Transfer Casette 5 <400> 18 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac cggctggggc tgagggtgag ggtcccgttt 180 ccccaaaggc ctagcctggg gttccagcca caagccctac cgggcagcgc ccggccccgc 240 ccctccaggc ctggcactcg tcctcaacca agatggcgcg gatggcttca ggcgcatcac 300 gacaccggcg cgtcacgcga cccgccctac gggcacctcc cgcgcttttc ttagcgccgc 360 agacggtggc cgagcggggg accgggaagc atgcatgtaa gtttagtctt tttgtctttt 420 atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg 480 cctttacttc tagcaccggt cgccaccatg accgctcgcg gcctggccct tatgaccgct 540 cgcggccggc ctcctcctgc tgctactgtg tccagcgcag gtgttttcac agtcctgtgt 600 ttggtatgga gagtgtggaa ttgcatatgg ggacaagagg tacaattgcg aatattctgg 660 cccaccaaaa ccattgccaa aggatggata tgacttagtg caggaactct gtccaggatt 720 cttctttggc aatgtcagtc tctgttgtga tgttcggcag cttcagacac taaaagacaa 780 cctgcagctg cctctacagt ttctgtccag atgtccatcc tgtttttata acctactgaa 840 cctgttttgt gagctgacat gtagccctcg acagagtcag tttttgaatg ttacagctac 900 tgaagattat gttgatcctg ttacaaacca gacgaaaaca aatgtgaaag agttacaata 960 ctacgtcgga cagagttttg ccaatgcaat gtacaatgcc tgccgggatg tggaggcccc 1020 ctcaagtaat gacaaggccc tgggactcct gtgtgggaag gacgctgacg cctgtaatgc 1080 caccaactgg attgaataca tgttcaataa ggacaatgga caggcacctt ttaccatcac 1140 tcctgtgttt tcagattttc cagtccatgg gatggagccc atgaacaatg ccaccaaagg 1200 ctgtgacgag tctgtggatg aggtcacagc accatgtagc tgccaagact gctctattgt 1260 ctgtggcccc aagccccagc ccccacctcc tcctgctccc tggacgatcc ttggcttgga 1320 cgccatgtat gtcatcatgt ggatcaccta catggcgttt ttgcttgtgt tttttggagc 1380 attttttgca gtgtggtgct acagaaaacg gtattttgtc tccgagtaca ctcccatcga 1440 tagcaatata gctttttctg ttaatgcaag tgacaaagga gaggcgtcct gctgtgaccc 1500 tgtcagcgca gcatttgagg gctgcttgag gcggctgttc acacgctggg ggtctttctg 1560 cgtccgaaac cctggctgtg tcattttctt ctcgctggtc ttcattactg cgtgttcgtc 1620 aggcctggtg tttgtccggg tcacaaccaa tccagttgac ctctggtcag cccccagcag 1680 ccaggctcgc ctggaaaaag agtactttga ccagcacttt gggcctttct tccggacgga 1740 gcagctcatc atccgggccc ctctcactga caaacacatt taccagccat acccttcggg 1800 agctgatgta ccctttggac ctccgcttga catacagata ctgcaccagg ttcttgactt 1860 acaaatagcc atcgaaaaca ttactgcctc ttatgacaat gagactgtga cacttcaaga 1920 catctgcttg gcccctcttt caccgtataa cacgaactgc accattttga gtgtgttaaa 1980 ttacttccag aacagccatt ccgtgctgga ccacaagaaa ggggacgact tctttgtgta 2040 tgccgattac cacacgcact ttctgtactg cgtacgggct cctgcctctc tgaatgatac 2100 aagtttgctc catgaccctt gtctgggtac gtttggtgga ccagtgttcc cgtggcttgt 2160 gttgggaggc tatgatgatc aaaactacaa taacgccact gcccttgtga ttaccttccc 2220 tgtcaataat tactataatg atacagagaa gctccagagg gcccaggcct gggaaaaaga 2280 gtttattaat tttgtgaaaa actacaagaa tcccaatctg accatttcct tcactgctga 2340 acgaagtatt gaagatgaac taaatcgtga aagtgacagt gatgtcttca ccgttgtaat 2400 tagctatgcc atcatgtttc tatatatttc cctagccttg gggcacatca aaagctgtcg 2460 caggcttctg gtggattcga aggtctcact aggcatcgcg ggcatcttga tcgtgctgag 2520 ctcggtggct tgctccttgg gtgtcttcag ctacattggg ttgcccttga ccctcattgt 2580 gattgaagtc atcccgttcc tggtgctggc tgttggagtg gacaacatct tcattctggt 2640 gcaggcctac cagagagatg aacgtcttca aggggaaacc ctggatcagc agctgggcag 2700 ggtcctagga gaagtggctc ccagtatgtt cctgtcatcc ttttctgaga ctgtagcatt 2760 tttcttagga gcattgtccg tgatgccagc cgtgcacacc ttctctctct ttgcgggatt 2820 ggcagtcttc attgactttc ttctgcagat tacctgtttc gtgagtctct tggggttaga 2880 cattaaacgt caagagaaaa atcggctaga catcttttgc tgtgtcagag gtgctgaaga 2940 tggaacaagc gtccaggcct cagagagctg tttgtttcgc ttcttcaaaa actcctattc 3000 tccacttctg ctaaaggact ggatgagacc aattgtgata gcaatatttg tgggtgttct 3060 gtcattcagc atcgcagtcc tgaacaaagt agatattgga ttggatcagt ctctttcgat 3120 gccagatgac tcctacatgg tggattattt caaatccatc agtcagtacc tgcatgcggg 3180 tccgcctgtg tactttgtcc tggaggaagg gcacgactac acttcttcca aggggcagaa 3240 catggtgtgc ggcggcatgg gctgcaacaa tgattccctg gtgcagcaga tatttaacgc 3300 ggcgcagctg gacaactata cccgaatagg cttcgccccc tcgtcctgga tcgacgatta 3360 tttcgactgg gtgaagccac agtcgtcttg ctgtcgagtg gacaatatca ctgaccagtt 3420 ctgcaatgct tcagtggttg accctgcctg cgttcgctgc aggcctctga ctccggaagg 3480 caaacagagg cctcaggggg gagacttcat gagattcctg cccatgttcc tttcggataa 3540 ccctaacccc aagtgtggca aagggggaca tgctgcctat agttctgcag ttaacatcct 3600 ccttggccat ggcaccaggg tcggagccac gtacttcatg acctaccaca ccgtgctgca 3660 gacctctgct gactttattg acgctctgaa gaaagcccga cttatagcca gtaatgtcac 3720 cgaaaccatg ggcattaacg gcagtgccta ccgagtattt ccttacagtg tgttttatgt 3780 cttctacgaa cagtacctga ccatcattga cgacactatc ttcaacctcg gtgtgtccct 3840 gggcgcgata tttctggtga ccatggtcct cctgggctgt gagctctggt ctgcagtcat 3900 catgtgtgcc accatcgcca tggtcttggt caacatgttt ggagttatgt ggctctgggg 3960 catcagtctg aacgctgtat ccttggtcaa cctggtgatg agctgtggca tctccgtgga 4020 gttctgcagc cacataacca gagcgttcac ggtgagcatg aaaggcagcc gcgtggagcg 4080 cgcggaagag gcacttgccc acatgggcag ctccgtgttc agtggaatca cacttacaaa 4140 atttggaggg attgtggtgt tggcttttgc caaatctcaa attttccaga tattctactt 4200 caggatgtat ttggccatgg tcttactggg agccactcac ggattaatat ttctccctgt 4260 cttactcagt tacatagggc catcagtaaa taaagccaaa agttgtgcca ctgaagagcg 4320 atacaaagga acagagcgcg aacggcttct aaatttctag gtttaaacaa gctttaagat 4380 acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 4440 aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttctcg 4500 agccatgggc gcgccatcga tgaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4560 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4620 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 4663 <210> 19 <211> 4691 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV Transfer Casette 6 <400> 19 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgcgtcgac tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 180 ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 240 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 300 ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 360 atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 420 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggatgacaca aaccccgccc agcgtcttgt 480 cattggcgaa ttcgaacacg cagatgcagt cggggcggcg cggtcccagg tccacttcgc 540 atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac ccgcttaaat 600 gcataccggt cgccaccatg accgctcgcg gcctggccct tggcctcctc ctgctgctac 660 tgtgtccagc gcaggtgttt tcacagtcct gtgtttggta tggagagtgt ggaattgcat 720 atggggacaa gaggtacaat tgcgaatatt ctggcccacc aaaaccattg ccaaaggatg 780 gatatgactt agtgcaggaa ctctgtccag gattcttctt tggcaatgtc agtctctgtt 840 gtgatgttcg gcagcttcag acactaaaag acaacctgca gctgcctcta cagtttctgt 900 ccagatgtcc atcctgtttt tataacctac tgaacctgtt ttgtgagctg acatgtagcc 960 ctcgacagag tcagtttttg aatgttacag ctactgaaga ttatgttgat cctgttacaa 1020 accagacgaa aacaaatgtg aaagagttac aatactacgt cggacagagt tttgccaatg 1080 caatgtacaa tgcctgccgg gatgtggagg ccccctcaag taatgacaag gccctgggac 1140 tcctgtgtgg gaaggacgct gacgcctgta atgccaccaa ctggattgaa tacatgttca 1200 ataaggacaa tggacaggca ccttttacca tcactcctgt gttttcagat tttccagtcc 1260 atgggatgga gcccatgaac aatgccacca aaggctgtga cgagtctgtg gatgaggtca 1320 cagcaccatg tagctgccaa gactgctcta ttgtctgtgg ccccaagccc cagcccccac 1380 ctcctcctgc tccctggacg atccttggct tggacgccat gtatgtcatc atgtggatca 1440 cctacatggc gtttttgctt gtgttttttg gagcattttt tgcagtgtgg tgctacagaa 1500 aacggtattt tgtctccgag tacactccca tcgatagcaa tatagctttt tctgttaatg 1560 caagtgacaa aggagaggcg tcctgctgtg accctgtcag cgcagcattt gagggctgct 1620 tgaggcggct gttcacacgc tgggggtctt tctgcgtccg aaaccctggc tgtgtcattt 1680 tcttctcgct ggtcttcatt actgcgtgtt cgtcaggcct ggtgtttgtc cgggtcacaa 1740 ccaatccagt tgacctctgg tcagccccca gcagccaggc tcgcctggaa aaagagtact 1800 ttgaccagca ctttgggcct ttcttccgga cggagcagct catcatccgg gcccctctca 1860 ctgacaaaca catttaccag ccataccctt cgggagctga tgtacccttt ggacctccgc 1920 ttgacataca gatactgcac caggttcttg acttacaaat agccatcgaa aacattactg 1980 cctcttatga caatgagact gtgacacttc aagacatctg cttggcccct ctttcaccgt 2040 ataacacgaa ctgcaccatt ttgagtgtgt taaattactt ccagaacagc cattccgtgc 2100 tggaccacaa gaaaggggac gacttctttg tgtatgccga ttaccacacg cactttctgt 2160 actgcgtacg ggctcctgcc tctctgaatg atacaagttt gctccatgac ccttgtctgg 2220 gtacgtttgg tggaccagtg ttcccgtggc ttgtgttggg aggctatgat gatcaaaact 2280 acaataacgc cactgccctt gtgattacct tccctgtcaa taattactat aatgatacag 2340 agaagctcca gagggcccag gcctgggaaa aagagtttat taattttgtg aaaaactaca 2400 agaatcccaa tctgaccatt tccttcactg ctgaacgaag tattgaagat gaactaaatc 2460 gtgaaagtga cagtgatgtc ttcaccgttg taattagcta tgccatcatg tttctatata 2520 tttccctagc cttggggcac atcaaaagct gtcgcaggct tctggtggat tcgaaggtct 2580 cactaggcat cgcgggcatc ttgatcgtgc tgagctcggt ggcttgctcc ttgggtgtct 2640 tcagctacat tgggttgccc ttgaccctca ttgtgattga agtcatcccg ttcctggtgc 2700 tggctgttgg agtggacaac atcttcattc tggtgcaggc ctaccagaga gatgaacgtc 2760 ttcaagggga aaccctggat cagcagctgg gcagggtcct aggagaagtg gctcccagta 2820 tgttcctgtc atccttttct gagactgtag catttttctt aggagcattg tccgtgatgc 2880 cagccgtgca caccttctct ctctttgcgg gattggcagt cttcattgac tttcttctgc 2940 agattacctg tttcgtgagt ctcttggggt tagacattaa acgtcaagag aaaaatcggc 3000 tagacatctt ttgctgtgtc agaggtgctg aagatggaac aagcgtccag gcctcagaga 3060 gctgtttgtt tcgcttcttc aaaaactcct attctccact tctgctaaag gactggatga 3120 gaccaattgt gatagcaata tttgtgggtg ttctgtcatt cagcatcgca gtcctgaaca 3180 aagtagatat tggattggat cagtctcttt cgatgccaga tgactcctac atggtggatt 3240 atttcaaatc catcagtcag tacctgcatg cgggtccgcc tgtgtacttt gtcctggagg 3300 aagggcacga ctacacttct tccaaggggc agaacatggt gtgcggcggc atgggctgca 3360 acaatgattc cctggtgcag cagatattta acgcggcgca gctggacaac tatacccgaa 3420 taggcttcgc cccctcgtcc tggatcgacg attatttcga ctgggtgaag ccacagtcgt 3480 cttgctgtcg agtggacaat atcactgacc agttctgcaa tgcttcagtg gttgaccctg 3540 cctgcgttcg ctgcaggcct ctgactccgg aaggcaaaca gaggcctcag gggggagact 3600 tcatgagatt cctgcccatg ttcctttcgg ataaccctaa ccccaagtgt ggcaaagggg 3660 gacatgctgc ctatagttct gcagttaaca tcctccttgg ccatggcacc agggtcggag 3720 ccacgtactt catgacctac cacaccgtgc tgcagacctc tgctgacttt attgacgctc 3780 tgaagaaagc ccgacttata gccagtaatg tcaccgaaac catgggcatt aacggcagtg 3840 cctaccgagt atttccttac agtgtgtttt atgtcttcta cgaacagtac ctgaccatca 3900 ttgacgacac tatcttcaac ctcggtgtgt ccctgggcgc gatatttctg gtgaccatgg 3960 tcctcctggg ctgtgagctc tggtctgcag tcatcatgtg tgccaccatc gccatggtct 4020 tggtcaacat gtttggagtt atgtggctct ggggcatcag tctgaacgct gtatccttgg 4080 tcaacctggt gatgagctgt ggcatctccg tggagttctg cagccacata accagagcgt 4140 tcacggtgag catgaaaggc agccgcgtgg agcgcgcgga agaggcactt gcccacatgg 4200 gcagctccgt gttcagtgga atcacactta caaaatttgg agggattgtg gtgttggctt 4260 ttgccaaatc tcaaattttc cagatattct acttcaggat gtatttggcc atggtcttac 4320 tgggagccac tcacggatta atatttctcc ctgtcttact cagttacata gggccatcag 4380 taaataaagc caaaagttgt gccactgaag agcgatacaa aggaacagag cgcgaacggc 4440 ttctaaattt ctaggtttaa acaagcttaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 4500 tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgag ccatgggcgc gccatcgatg aggaacccct 4560 agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 4620 aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 4680 ctgcctgcag g 4691 <210> 20 <211> 1278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant NPC1 protein <400> 20 Met Thr Ala Arg Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Pro Ala Gln Val Phe Ser Gln Ser Cys Val Trp Tyr Gly Glu Cys Gly 20 25 30 Ile Ala Tyr Gly Asp Lys Arg Tyr Asn Cys Glu Tyr Ser Gly Pro Pro 35 40 45 Lys Pro Leu Pro Lys Asp Gly Tyr Asp Leu Val Gln Glu Leu Cys Pro 50 55 60 Gly Phe Phe Phe Gly Asn Val Ser Leu Cys Cys Asp Val Arg Gln Leu 65 70 75 80 Gln Thr Leu Lys Asp Asn Leu Gln Leu Pro Leu Gln Phe Leu Ser Arg 85 90 95 Cys Pro Ser Cys Phe Tyr Asn Leu Leu Asn Leu Phe Cys Glu Leu Thr 100 105 110 Cys Ser Pro Arg Gln Ser Gln Phe Leu Asn Val Thr Ala Thr Glu Asp 115 120 125 Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Thr Lys Thr Asn Val Lys Glu Leu 130 135 140 Gln Tyr Tyr Val Gly Gln Ser Phe Ala Asn Ala Met Tyr Asn Ala Cys 145 150 155 160 Arg Asp Val Glu Ala Pro Ser Ser Asn Asp Lys Ala Leu Gly Leu Leu 165 170 175 Cys Gly Lys Asp Ala Asp Ala Cys Asn Ala Thr Asn Trp Ile Glu Tyr 180 185 190 Met Phe Asn Lys Asp Asn Gly Gln Ala Pro Phe Thr Ile Thr Pro Val 195 200 205 Phe Ser Asp Phe Pro Val His Gly Met Glu Pro Met Asn Asn Ala Thr 210 215 220 Lys Gly Cys Asp Glu Ser Val Asp Glu Val Thr Ala Pro Cys Ser Cys 225 230 235 240 Gln Asp Cys Ser Ile Val Cys Gly Pro Lys Pro Gln Pro Pro Pro Pro 245 250 255 Pro Ala Pro Trp Thr Ile Leu Gly Leu Asp Ala Met Tyr Val Ile Met 260 265 270 Trp Ile Thr Tyr Met Ala Phe Leu Leu Val Phe Phe Gly Ala Phe Phe 275 280 285 Ala Val Trp Cys Tyr Arg Lys Arg Tyr Phe Val Ser Glu Tyr Thr Pro 290 295 300 Ile Asp Ser Asn Ile Ala Phe Ser Val Asn Ala Ser Asp Lys Gly Glu 305 310 315 320 Ala Ser Cys Cys Asp Pro Val Ser Ala Ala Phe Glu Gly Cys Leu Arg 325 330 335 Arg Leu Phe Thr Arg Trp Gly Ser Phe Cys Val Arg Asn Pro Gly Cys 340 345 350 Val Ile Phe Phe Ser Leu Val Phe Ile Thr Ala Cys Ser Ser Gly Leu 355 360 365 Val Phe Val Arg Val Thr Thr Asn Pro Val Asp Leu Trp Ser Ala Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ala Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Phe Asp Gln His Phe Gly 385 390 395 400 Pro Phe Phe Arg Thr Glu Gln Leu Ile Ile Arg Ala Pro Leu Thr Asp 405 410 415 Lys His Ile Tyr Gln Pro Tyr Pro Ser Gly Ala Asp Val Pro Phe Gly 420 425 430 Pro Pro Leu Asp Ile Gln Ile Leu His Gln Val Leu Asp Leu Gln Ile 435 440 445 Ala Ile Glu Asn Ile Thr Ala Ser Tyr Asp Asn Glu Thr Val Thr Leu 450 455 460 Gln Asp Ile Cys Leu Ala Pro Leu Ser Pro Tyr Asn Thr Asn Cys Thr 465 470 475 480 Ile Leu Ser Val Leu Asn Tyr Phe Gln Asn Ser His Ser Val Leu Asp 485 490 495 His Lys Lys Gly Asp Asp Phe Phe Val Tyr Ala Asp Tyr His Thr His 500 505 510 Phe Leu Tyr Cys Val Arg Ala Pro Ala Ser Leu Asn Asp Thr Ser Leu 515 520 525 Leu His Asp Pro Cys Leu Gly Thr Phe Gly Gly Pro Val Phe Pro Trp 530 535 540 Leu Val Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Gln Asn Tyr Asn Asn Ala Thr Ala 545 550 555 560 Leu Val Ile Thr Phe Pro Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Thr Glu Lys 565 570 575 Leu Gln Arg Ala Gln Ala Trp Glu Lys Glu Phe Ile Asn Phe Val Lys 580 585 590 Asn Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Thr Ile Ser Phe Thr Ala Glu Arg Ser 595 600 605 Ile Glu Asp Glu Leu Asn Arg Glu Ser Asp Ser Asp Val Phe Thr Val 610 615 620 Val Ile Ser Tyr Ala Ile Met Phe Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Leu Gly 625 630 635 640 His Met Lys Ser Cys Arg Arg Leu Leu Val Asp Ser Lys Val Ser Leu 645 650 655 Gly Ile Ala Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Ser Val Ala Cys Ser Leu 660 665 670 Gly Val Phe Ser Tyr Ile Gly Leu Pro Leu Thr Leu Ile Val Ile Glu 675 680 685 Val Ile Pro Phe Leu Val Leu Ala Val Gly Val Asp Asn Ile Phe Ile 690 695 700 Leu Val Gln Ala Tyr Gln Arg Asp Glu Arg Leu Gln Gly Glu Thr Leu 705 710 715 720 Asp Gln Gln Leu Gly Arg Val Leu Gly Glu Val Ala Pro Ser Met Phe 725 730 735 Leu Ser Ser Phe Ser Glu Thr Val Ala Phe Phe Leu Gly Ala Leu Ser 740 745 750 Val Met Pro Ala Val His Thr Phe Ser Leu Phe Ala Gly Leu Ala Val 755 760 765 Phe Ile Asp Phe Leu Leu Gln Ile Thr Cys Phe Val Ser Leu Leu Gly 770 775 780 Leu Asp Ile Lys Arg Gln Glu Lys Asn Arg Leu Asp Ile Phe Cys Cys 785 790 795 800 Val Arg Gly Ala Glu Asp Gly Thr Ser Val Gln Ala Ser Glu Ser Cys 805 810 815 Leu Phe Arg Phe Phe Lys Asn Ser Tyr Ser Pro Leu Leu Leu Lys Asp 820 825 830 Trp Met Arg Pro Ile Val Ile Ala Ile Phe Val Gly Val Leu Ser Phe 835 840 845 Ser Ile Ala Val Leu Asn Lys Val Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Leu 850 855 860 Ser Met Pro Asp Asp Ser Tyr Met Val Asp Tyr Phe Lys Ser Ile Ser 865 870 875 880 Gln Tyr Leu His Ala Gly Pro Pro Val Tyr Phe Val Leu Glu Glu Gly 885 890 895 His Asp Tyr Thr Ser Ser Lys Gly Gln Asn Met Val Cys Gly Gly Met 900 905 910 Gly Cys Asn Asn Asp Ser Leu Val Gln Gln Ile Phe Asn Ala Ala Gln 915 920 925 Leu Asp Asn Tyr Thr Arg Ile Gly Phe Ala Pro Ser Ser Trp Ile Asp 930 935 940 Asp Tyr Phe Asp Trp Val Lys Pro Gln Ser Ser Cys Cys Arg Val Asp 945 950 955 960 Asn Ile Thr Asp Gln Phe Cys Asn Ala Ser Val Val Asp Pro Ala Cys 965 970 975 Val Arg Cys Arg Pro Leu Thr Pro Glu Gly Lys Gln Arg Pro Gln Gly 980 985 990 Gly Asp Phe Met Arg Phe Leu Pro Met Phe Leu Ser Asp Asn Pro Asn 995 1000 1005 Pro Lys Cys Gly Lys Gly Gly His Ala Ala Tyr Ser Ser Ala Val 1010 1015 1020 Asn Ile Leu Leu Gly His Gly Thr Arg Val Gly Ala Thr Tyr Phe 1025 1030 1035 Met Thr Tyr His Thr Val Leu Gln Thr Ser Ala Asp Phe Ile Asp 1040 1045 1050 Ala Leu Lys Lys Ala Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Thr Glu Thr 1055 1060 1065 Met Gly Ile Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Val Phe Pro Tyr Ser Val 1070 1075 1080 Phe Tyr Val Phe Tyr Glu Gln Tyr Leu Thr Ile Ile Asp Asp Thr 1085 1090 1095 Ile Phe Asn Leu Gly Val Ser Leu Gly Ala Ile Phe Leu Val Thr 1100 1105 1110 Met Val Leu Leu Gly Cys Glu Leu Trp Ser Ala Val Ile Met Cys 1115 1120 1125 Ala Thr Ile Ala Met Val Leu Val Asn Met Phe Gly Val Met Trp 1130 1135 1140 Leu Trp Gly Ile Ser Leu Asn Ala Val Ser Leu Val Asn Leu Val 1145 1150 1155 Met Ser Cys Gly Ile Ser Val Glu Phe Cys Ser His Ile Thr Arg 1160 1165 1170 Ala Phe Thr Val Ser Met Lys Gly Ser Arg Val Glu Arg Ala Glu 1175 1180 1185 Glu Ala Leu Ala His Met Gly Ser Ser Val Phe Ser Gly Ile Thr 1190 1195 1200 Leu Thr Lys Phe Gly Gly Ile Val Val Leu Ala Phe Ala Lys Ser 1205 1210 1215 Gln Ile Phe Gln Ile Phe Tyr Phe Arg Met Tyr Leu Ala Met Val 1220 1225 1230 Leu Leu Gly Ala Thr His Gly Leu Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu 1235 1240 1245 Ser Tyr Ile Gly Pro Ser Val Asn Lys Ala Lys Ser Cys Ala Thr 1250 1255 1260 Glu Glu Arg Tyr Lys Gly Thr Glu Arg Glu Arg Leu Leu Asn Phe 1265 1270 1275

Claims (26)

  1. 5'에서 3'로:
    5' 역 말단 반복부(ITR);
    닭 베타-액틴 프로모터;
    이식유전자;
    폴리아데닐화 신호; 및
    3' ITR를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트로서;
    여기서 전달 카세트는 인트론 서열을 포함하고;
    여기서 이식유전자는 NPC1 단백질을 암호화하는 것인 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 카세트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    5' ITR은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    3' ITR은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    프로모터 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    인트론 서열은 SV40 인트론인 AAV 전달 카세트.
  6. 제 1 항에 있어서,
    인트론 서열은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  7. 제 1 항에 있어서,
    NPC1 단백질은 인간 NPC1 단백질인 AAV 전달 카세트.
  8. 제 1 항에 있어서,
    NPC1 단백질은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  9. 제 1 항에 있어서,
    이식유전자는 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  10. 제 1 항에 있어서,
    폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호인 AAV 전달 카세트.
  11. 제 1 항에 있어서,
    폴리아데닐화 신호는 SEQ ID NO: 12의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  12. 제 1 항에 있어서,
    카세트는 인핸서를 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  13. 제 1 항에 있어서,
    AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  14. 제 1 항에 있어서,
    AAV 전달 카세트는 SEQ ID NO: 15-19 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 AAV 전달 카세트.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 AAV 전달 카세트를 포함하는 플라스미드.
  16. 5'에서 3'로, 5' 역 말단 반복부(ITR); 프로모터; 이식유전자; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하는 핵산으로서; 여기서 핵산은 인트론 서열을 포함하며; 이식유전자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 암호화하는 것인 핵산.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 AAV 전달 카세트, 제 15 항의 플라스미드, 또는 제 16 항의 핵산을 포함하는 세포.
  18. 단백질 캡시드 및 단백질 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서:
    여기서 핵산은 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 AAV 전달 카세트를 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
  19. 제 18 항에 있어서,
    단백질 캡시드는 다음 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV 중 어느 하나의 AAV로부터의 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
  20. 제 18 항에 있어서,
    단백질 캡시드는 다음 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV 중 어느 하나의 캡시드 단백질 서브유닛에 비해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 AAV 벡터.
  21. AAV 생산자 세포를 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 AAV 전달 카세트, 제 15 항의 플라스미드, 또는 제 16 항의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하여 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법.
  22. 제 21 항의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터.
  23. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 AAV 전달 카세트, 제 15 항의 플라스미드, 제 16 항의 핵산, 제 17 항의 세포 또는 제 18 항 내지 제 20 항 및 제 22 항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
  24. 대상에게 유효량의 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 AAV 전달 카세트, 제 15 항의 플라스미드, 제 16 항의 핵산, 제 17 항의 세포 또는 제 18 항 내지 제 20 항 및 제 22 항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하여 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    대상은 NPC1을 갖는 것인 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    대상은 인간 대상인 방법.
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