KR20230019062A - 연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터 - Google Patents

연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터 Download PDF

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아드리안 티멀스
주디스 뉴마크
스티븐 페녹
락샤 무렐리
춘쥐안 송
리사 키스
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Abstract

본 발명은 망막의 원추 세포에 영향을 미치는 연령-관련 황반 변성 및 기타 유전 질환의 치료를 위한 단리된 프로모터, 트랜스진 발현 카세트, 벡터, 키트 및 방법을 제공한다.

Description

연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/924,338을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 2020년 10월 19일에 생성된 상기 ASCII 카피는 119561-01720_SL.txt로 명명되며, 그 크기는 48,600바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 대상체 또는 세포에서 단리된 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 AAV 벡터를 포함한 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구축물, 프로모터, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 표적 세포, 조직, 장기 또는 유기체에 외인성 DNA 서열을 전달하는 방법, 및 연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 유전자 발현 프로필에서의 이상에 의해 유발된 유전자 돌연변이 또는 후천성 질환으로 인해 고통받는 환자에 대한 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 요법은 장애, 질환, 악성 종양 등을 초래할 수 있는, 결함 있는 유전자 또는 비정상적인 조절 또는 발현, 예를 들어 과소발현 또는 과다발현으로 인한 의학적 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함 있는 유전자에 의해 야기되는 질환 또는 장애는 환자에게 교정된 유전 물질을 전달함으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있거나, 또는 결함 있는 유전자를 변경 또는 침묵시킴으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있으며, 예를 들어 환자에게 교정된 유전 물질을 전달함으로써 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 초래할 수 있다.
유전자 요법의 기본은 전사 카세트에 활성 유전자 산물 (때로는 트랜스진 또는 치료 핵산으로서 지칭됨)을 공급하여, 예를 들어, 긍정적인 기능 획득 효과, 부정적인 기능 상실 효과 또는 또 다른 결과를 초래할 수 있도록 하는 것이다. 이러한 결과는 치료 단백질, 예컨대 항체, 기능적 효소 또는 융합 단백질의 발현에 기인할 수 있다. 유전자 요법은 또한 다른 요인에 의해 야기되는 질환 또는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 인간 단일유전인자 장애는 정상 유전자를 표적 세포에 전달하고 발현함으로써 치료될 수 있다. 환자의 표적 세포에서 교정 유전자의 전달과 발현은 조작된 바이러스와 바이러스 유전자 전달 벡터의 사용을 포함한 많은 방법을 통해 수행될 수 있다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 파보비리다에(Parvoviridae) 과에 속하며, 보다 구체적으로 데펜도파보바이러스 속을 구성한다. AAV로부터 유래된 벡터 (즉, 재조합 AAV (rAAV) 또는 AAV 벡터)는 유전 물질을 전달하는 데 매력적인데, 이는 (i) 이들이 근세포와 뉴런을 포함한 매우 다양한 비-분열 세포와 분열 세포 유형을 감염 (형질도입)시킬 수 있으며; (ii) 바이러스 구조 유전자가 없으며, 이로써 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론 매개 반응이 감소되며; (iii) 야생형 바이러스는 인간에게서 비-병리적인 것으로 간주되며; (iv) 숙주 세포 게놈에 통합할 수 있는 야생형 AAV와 반대로, 복제 결핍성 AAV 벡터는 rep 유전자가 결여되고 일반적으로 에피솜으로서 지속되므로, 삽입 돌연변이 유발 또는 유전독성의 위험을 제한하며; (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 상대적으로 약한 면역원인 것으로 간주되므로, 유의미한 면역 반응을 촉발하지 않으므로 (ii 참조), 벡터 DNA의 지속성과 잠재적으로 치료 트랜스진의 장기적 발현을 확보하기 때문이다.
연령-관련 황반 변성 (AMD)은 선진국의 노인 인구에서 비가역적 실명의 주요 원인으로, 60세 이상의 노인 인구 중 대략 15%에 영향을 미친다. 대략 6억 명의 사람들이 이러한 연령대의 인구통계에 있다. AMD의 유병률은 연령에 따라 증가하며; 경증 또는 초기 형태는 75세 이상 인구의 거의 30%에서 발생하고 진행된 형태는 약 7%에서 발생한다 (Klein et al., Ophthalmol 1992; 99(6):933-943; Vingerling et al., Ophthalmol 1995 February; 102(2):205-210; Vingerling et al., Epidemiol Rev. 1995; 17(2):347-360). AMD는 황반의 망막 색소 상피 (RPE) 및 광수용기의 만발성, 만성 및 진행성 변성이다. 임상적으로, AMD는 신경 망막과 하부 조직의 특수 영역인 황반에서 발생하는 변성 변화로 인한 중심 시력의 점진적인 상실을 특징으로 한다. 초기 AMD는 RPE와 브루크 막 사이에 발생하는 AMD의 발병과 연관된 특징적인 안구 병변인 지질과 단백질을 함유한 침전물 (드루젠)을 특징으로 한다. 시각 기능은 통상적으로 이러한 단계에서 최소한으로 손상되지만 암순응에 있어서의 변화는 영향을 받는다.
최근 여러 연구는 보체 캐스케이드에서 AMD와 주요 단백질 간의 연관성을 보고하였다. 이러한 연구는 말단 경로 보체 성분 (C5, C6, C7, C8 및 C9) 및 말단 경로의 활성화-특이적 보체 단백질 단편 (C3b, iC3b, C3dg 및 C5b-9) 뿐만 아니라 드루젠 내의, 브루크 막 (RPE와 맥락막을 분리하는 엘라스틴과 콜라겐으로 구성된 세포외 층)을 따라, 및 드루젠을 덮고 있는 RPE 세포 내의 다양한 보체 경로 조절인자 및 억제인자 (인자 H, 인자 I, 인자 D, CD55 및 CD59 포함)를 밝혀내었다 (Johnson et al., Exp Eye Res. 2000; 70:441-449; Johnson et al., Exp. Eye Res. 2001; 73:887-896; Mullins et al. FASEB J. 2000; 14:835-846; Mullins et al., Eye 2001; 15:390-395). CFB, C2 및 C3를 포함한 보체 관련 유전자에서의 돌연변이는 AMD에 대한 위험 인자의 증가와 연관되었다. 그러나, CFH 유전자의 다형성은 AMD와 관련된 가장 큰 위험 인자를 초래한다. 예를 들어, 대체 경로 보체 캐스케이드 C3 전환효소의 주요 억제인자인 CFH 내의 위치 402에서 티로신이 히스티딘 아미노산으로 전이되면, 이러한 Y402H 다형성을 가진 개체가 AMD에 걸릴 위험이 거의 6배 증가한다.
인자 H (FH)는 보체 시스템의 핵심 조절인자로서 기능하는 다기능 단백질이다 (Zipfel, 2001. Semin Thromb Hemost. 27:191-9). 인자 H 단백질 활성은 (1) C-반응성 단백질 (CRP)과의 결합, (2) C3b와의 결합, (3) 헤파린과의 결합, (4) 시알산과의 결합; (5) 내피 세포 표면과의 결합, (6) 세포 인테그린 수용체와의 결합, (7) 미생물을 포함한 병원체와의 결합, 및 (8) C3b 보조 인자 활성을 포함한다. HF1, CFH 및 HF로서 공지된 인자 H 유전자는 인간 염색체 1의 위치 1q32에 존재한다. 1q32 특정한 로커스는 다수의 보체 경로-연관 유전자를 함유한다. 이러한 유전자의 한 군은 보체 활성화의 조절인자 (RCA) 유전자 클러스터로서 지칭되며, 인자 H를 코딩하는 유전자, 5개의 인자 H 관련 유전자 (각각 FHR-1, FHR-2, FHR-3, FHR-4 및 FHR-5 또는 CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4 및 CFHR5), 및 응고 인자 XIII의 베타 서브유닛을 코딩하는 유전자를 함유한다. 인자 H 및 인자 H 관련 유전자는 거의 전적으로 짧은 컨센서스 반복부 (SCR)로 구성된다. 인자 H-유사 단백질 1 (FHL1)로 지칭되는, CFH의 자연 발생 말단절단된 형태는 CFH 유전자의 대체 스플라이싱으로부터 발생한다 (Ripoche et al., Biochem J. 1988 Jan 15; 249(2):593-602). FHL1은 독특한 4개의 아미노산 C-말단으로 종결되기 전 첫 번째 7개의 보체 제어 단백질 (CCP) 도메인에 대해 CFH와 동일하다. FHL1은 기능에 필요한 모든 도메인을 유지하고 있으며 Y402H 다형성의 영향하에 있다. 이전 연구에서는 RPE 세포에 의한 FHL1 발현이 입증되었다 (Hageman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 17; 102(20):7227-32; Weinberger et al., Ophthalmic Res. 2014; 51(2):59-66). 인자 H, 및 CFH의 자연 발생 말단절단된 변이체 형태인 FHL1은 각각 SCR 1-20 및 1-7로 구성된다.
인자 H cDNA의 자연 발생 형태는 155 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 1231개 아미노산 길이의 폴리펩티드를 코딩한다. 인간 인자 H에 대한 cDNA 및 아미노산 서열 데이터는 EMBL/진뱅크 데이터 라이브러리의 수탁 번호 Y00716.1에서 찾을 수 있다. 인간 인자 H의 자연 발생 말단절단된 형태는 진뱅크 수탁 번호 X07523.1에서 찾을 수 있다.
현재, 건성 AMD에 대해 입증된 의학적 요법이 없으며 진행성 건성 AMD에 대한 치료법도 없다. 그의 기능 장애가 AMD의 병인과 관련이 있는 대체 보체 경로의 활성화 및 증폭에서 속도 제한 효소 (CFH 활성의 하류)인 보체 인자 D에 대항한 선택적 억제제인 람팔리주맙은 III상 임상 시험에서 1차 평가항목을 충족시키지 못하였다.
AAV는 파보바이러스 과의 구성원인 단일 가닥, 외피 미보유 DNA 바이러스이다. AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6 등을 포함한 AAV의 상이한 혈청형은 조직 분포의 상이한 프로필을 명확하게 보여준다. 이러한 AAV 캡시드 및 캡시드 변이체의 다양한 조직 지향성은 AAV 기반 벡터를 시험관내 및 생체내 둘 다에서 간, 골격근, 뇌, 망막, 심장 및 척수에 대한 광범위한 유전자 전달 적용에 사용할 수 있도록 한다 (Wu, Z., et al., (2006) Molecular Therapy, 14: 316-327). AAV 벡터는 망막에서 장기간의 유전자 발현을 매개할 수 있고 최소한의 면역 반응을 유도하므로 이러한 벡터를 눈으로의 유전자 전달을 위한 매력적인 선택으로 만든다. 그러나, AAV의 최적 패키지 용량은 4.9-kb이고, 20개의 보체-제어 단백질 모듈 (CCP)을 모두 함유하는 전장 CFH cDNA의 크기는 3.69 kb이다. 이는 필수 조절 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 (SV40 폴리 A) 신호 및 플랭킹 AAV 역위 말단 반복부 (ITR)를 위한 제한된 공간을 남긴다.
본 개시내용은 안구 질환 및 장애, 특히 연령-관련 황반 변성의 유효한 치료 또는 예방의 필요성에 역점을 두고 있고, 추가로 AAV 치료에서 CFH 유전자를 사용할 경우의 크기 제약의 문제를 해결해준다.
CFH는 필요한 모든 요소와 조합할 때 역사적으로 AAV 유전자 요법에 사용하기에 너무 큰 유전자이다. 본 개시내용은 이러한 문제를 극복하고 야생형 CFH의 생물학적 기능을 유지하면서 CFH 발현 카세트를 rAAV의 패키징 용량 (< 4.9 kb) 내에 맞추는 CFH cDNA의 조작된 변형을 설명한다. 본원에 기재된 기술은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터로부터 CFH의 발현에 의한 연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 말단절단된 보체 인자 H (CFH) 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하며, 여기서 말단절단된 CFH 단백질은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 포함한다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH1)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 1을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 1로 이루어진다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH1)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8로 이루어진다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH2)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3으로 이루어진다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH3)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4로 이루어진다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH4)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5로 이루어진다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산을 특징으로 한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6으로 이루어진다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 프로모터, 본원의 측면 및 실시양태 중 어느 하나의 핵산, 및 최소 조절 요소를 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 인간 핵산이다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열의 혈청형은 AAV2이다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열은 돌연변이체 캡시드 서열이다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 포유류 세포를 제공한다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 제조하는 방법으로서, 아데노-연관 바이러스 벡터 내로 프로모터 및 본원의 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 인간 핵산이다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열은 돌연변이체 캡시드 서열이다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 안구 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원의 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 투여하며, 이로써 상기 대상체에서 안구 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 보체 경로의 활성화와 연관된다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 망막 변성이다. 일부 실시양태에 따르면, 망막 변성은 연령 관련 황반 변성 (AMD)이다. 일부 실시양태에 따르면, AMD는 습성 AMD이다. 일부 실시양태에 따르면, AMD는 건성 AMD이다. 일부 실시양태에 따르면, 건성 AMD는 진행성 건성 AMD이다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 안구 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원의 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 투여하며, 이로써 상기 대상체에서 안구 질환 또는 장애를 예방하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 보체 경로의 활성화와 연관된다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 망막 변성이다. 일부 실시양태에 따르면, 망막 변성은 연령 관련 황반 변성 (AMD)이다. 일부 실시양태에 따르면, AMD는 습성 AMD이다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 지도형 위축 (GA)이다.
일부 실시양태에 따르면, 벡터는 안구 전달 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 망막으로 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 망막하로 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 맥락막상으로 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 유리체내로 투여된다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 및 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 개체의 눈에, 예를 들어, 그 개체의 망막하에 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 눈에 이종 핵산을 전달하는 방법을 제공한다
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 및 실시양태 중 어느 하나의 벡터와 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 키트는 벡터의 안구 전달을 위한 장치를 추가로 포함한다.
도 1a는 전장 인간 CFH (3696 bp)의 20개 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 나타낸 개략도이다. CCP 모듈은 타원형으로 표시된다. 일부 CCP는 표시된 바와 같이 다른 단백질에 대한 결합 부위를 확인하였다. 구축물 pTR-CBA-flCFH는 전장 인간 CFH를 포함한다. AMD에 대한 고위험 다형성 Y402H는 자연 발생 변이체 FHL-1에도 함유된 CCP 7에 위치해 있다.
도 1b는 다양한 CCP가 결실되도록 조작된 CFH 구축물을 나타낸 개략도이다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH1은 CCP 16-17이 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH2는 CCP 5-17이 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH3은 CCP 10-15가 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH4는 CCP 8-17이 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-CBA-FHL-1은 자연 발생 변이체 FHL-1을 포함한다. tCFH2와 tCFH4의 두 구축물은 보체 캐스케이드 활성에 중요한 것으로 공지된 CCP를 결실하도록 조작되었다.
도 2는 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 플라스미드 형질감염 후 CFH 변이체의 발현을 나타내는 그래프이다. HEK293 세포는 조작된 CFH 변이체를 함유하는 플라스미드 (도 1a에 나타난 바와 같은 pTR-CFH 변이체)로 형질감염되었다. 조건화된 배지 및 세포성 용해물은 형질감염 후 48시간에 채취되었고 검정될 때까지 -80℃에서 저장되었다. CFH 농도 (ng/ml)는 용해물에서 결정되었다.
도 3은 CFH 변이체에 의한 인간 보체 성분 C3b (C3b)의 절단을 검정하기 위한 항-C3/C3b 항체를 사용한 웨스턴 블롯의 결과를 보여준다. 도 2에 기재된 바와 같이 HEK293 세포는 형질감염되었고 세포성 용해물은 저장되었다. 도 3은 tCFH1 레인 (레인 6, 박스 내에 제시됨)에서 효율적인 절단이 관찰되었음을 보여준다. CFH 변이체 smCBA-tCFH2 및 smCBA-tCFH4에 의한 절단은 없거나 낮았다.
그 결과에 기초하여, AAV 생산을 위해 하기 CFH 변이체가 선택되었다:
1) pTR-smCBA-flCFH; 2) pTR-smCBA-tCFH1; 3) pTR-CBA-tCFH3; 4) pTR-CBA-FHL-1.
도 4는 HEK293 세포의 AAV 감염 후 CFH 변이체의 발현을 나타내는 그래프이다. HEK293 세포는 1 x 104의 감염 다중도 (MOI)로 감염되었다. 배지는 감염 후 72시간 후에 수집되었으며, 배지 중의 CFH 농도 (ng/ml)를 결정하였다. 그래프에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에 대한 AAV-CFH 감염 후 72시간에 조작된 CFH 구축물의 강력한 발현이 있었다.
도 5는 도 4에 기재된 바와 같이 AAV 감염 후 72시간에 세포 배지에서 검출된 바와 같이 CFH 변이체에 의한 C3b의 절단을 검정하기 위한 항-C3/C3b 항체를 사용한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, C3b의 절단은 FHL-1의 경우에 가장 효율적이었고, tCFH1 및 flCFH가 그 뒤를 이었다. 배경 수준 C3b 절단 인공물이 레인 18 (FBS)에서 관찰되었다는 점에 주목하며; 이러한 인공물은 레인 17 (DMEM/FBS)에서는 존재하지 않았다.
도 6은 망막하 (SubR) 주사 후 cfh-/- 마우스에서 tCFH1 또는 FHL-1의 발현을 나타내는 표이다. CFH 변이체 FHL-1 및 tCFH1 둘 다는 cfh-/- 마우스에서 rAAV 벡터의 망막하 투약 후에 발현된다. 표의 결과에 나타난 바와 같이, FHL-1 발현에서의 용량 반응이 관찰되었다. 일부 동물은 FHL-1 또는 tCFH1의 발현에 대해 음성이었으며, 이는 실패한 주사에 기인한 것일 수 있다. RPE/맥락막에서의 tCFH1 또는 FHL-1의 발현 수준은 신경 망막에서의 수준보다 더 높은 것으로 밝혀졌다.
도 7a 및 도 7b는 tCFH1 변이체가 주사된 cfh-/- 마우스에서 인자 B (FB) 보체 고정 (FB의 검출)을 결정하기 위한 웨스턴 블롯의 결과를 보여준다. 도 7a는 tCFH1 주사된 cfh-/- 마우스에서의 인자 B 고정을 나타낸다. 도 7b는 tCFH1 및 FHL-1 발현을 나타낸다. 도 7a 및 7b에 나타난 결과는 rAAV-tCFH1 망막하 주사에 의해 유도된 tCFH1 발현이 RPE/맥락막에서 인자 B (FB)를 고정시킬 수 있다는 것을 보여준다. CFH 변이체 FHL-1은 FB 고정을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 rAAV에 의해 발현되는 tCFH1의 생물학적 기능성을 뒷받침하며, AAV 발현된 CFH 변이체가 보체 고정을 보여주는 것은 처음이다.
도 8a 및 8b는 비히클이 주사된 cfh-/- 마우스 (도 8a) 및 tCFH1 변이체 중간 용량이 주사된 cfh-/- 마우스 (도 8b)로부터의 망막전위도 (ERG) 시험 결과를 보여준다.
도 9는 군 1-6 각각에 대해 왼쪽 눈 (주입됨) 및 오른쪽 눈 (비주입됨)으로부터의 안구 조직의 생체내 횡단면 영상의 광간섭 단층촬영의 결과를 보여준다.
도 10은 군 1-6 각각에 대해 왼쪽 눈 (주입됨) 및 오른쪽 눈 (비주입됨) 상의 안구 조직에 대한 조직학적 검사 결과를 보여준다.
도 11은 저용량, 중간 용량 및 고용량에서 tCFH1 변이체를 주사한 cfh-/- 마우스에서 tCFH 단백질 발현을 결정하기 위한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 12는 다양한 용량의 tCFH1 변이체가 주사된 cfh-/- 마우스에서 인자 B (FB) 보체 고정 (FB의 검출)을 결정하기 위한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 13은 rAAV-CFH 변이체의 기능성을 평가하기 위한 시험관내 용혈 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
I. 정의
본 개시내용은 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 벡터 또는 시약으로 제한되지 않는데, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 추가로, 본원에 사용된 전문 용어는 특정한 실시양태만을 설명하기 위한 것으로서, 본 개시내용의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명의 분야에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시의 실시에서는 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 또는 재료가 사용될 수 있으나, 예시적인 방법, 장치 및 재료가 본원에 기재되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 통상의 기술자에게 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에 제시된 의미를 가진다.
단수 형태는 지시 대상물의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소, 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "포함한"은 본원에서 "포함하나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 본원에 사용되며 이와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "예컨대"는 본원에서 "예컨대 ~이나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여하다", "투여하는 것", "투여" 등은 생물학적 작용의 원하는 부위에 치료제 또는 제약 조성물을 전달할 수 있게 하는 데 사용되는 방법을 지칭하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에 따르면, 이러한 방법은 눈에 대한 망막하 주사, 맥락막상 주사 또는 유리체내 주사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함하는 것을 의미한다. 제약상 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 문구 "제약상 허용되는"은 숙주에게 투여했을 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 일으키지 않는 분자적 실체 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 벡터", "벡터" 또는 "플라스미드"는 AAV 또는 rAAV 벡터를 포함한 임의의 유형의 유전적 구축물을 포함할 수 있으며, 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있고 유전자 요법을 위해 적응되는 유전자 산물을 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있다. 일부 경우에, 부분적으로 번역되거나 번역되지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA의 유전자 산물로의 변역 둘 다를 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현은 관심 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다. 발현 벡터는 또한 표적 세포에서의 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 코딩 영역에 작동적으로 연결된 제어 요소를 포함할 수 있다. 발현을 위해 작동가능하게 연결되는 제어 요소와 유전자 또는 유전자들의 조합은 때때로 "발현 카세트"로서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "플랭킹"은 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 지칭한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A와 C에 의해 플랭킹된다. 배열 AxBxC에 대해서도 마찬가지이다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞 또는 뒤에 위치하지만, 플랭킹된 서열과 연속되거나 이에 바로 인접할 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 전달"은 유전자 요법의 적용을 위해 외래 DNA가 숙주 세포로 전달되는 프로세스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이종"은 비교되거나 또는 도입 또는 혼입되는 실체의 나머지 부분과 유전자형으로 뚜렷이 구별되는 실체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 조작 기술에 의해 상이한 세포 유형 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다 (또한 발현될 때, 이종 폴리펩티드를 코딩할 수 있다). 유사하게, 바이러스 벡터 내로 혼입되는 세포 서열 (예를 들어, 유전자 또는 그의 일부분)은 벡터에 대한 이종 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증가", "증강", "상승" (및 유사 용어)은 일반적으로 자연적, 예상된 또는 평균과 비교하여, 또는 대조군 조건과 비교하여, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 행동을 직접 또는 간접적으로 증가시키는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "역위 말단 반복부" 또는 "ITR" 서열은 반대 배향에 있는 바이러스 게놈의 말단에서 발견되는 비교적 짧은 서열을 지칭하는 것을 의미한다. 관련 기술분야에 널리 공지된 용어 "AAV 역위 말단 반복부 (ITR)" 서열은 천연 단일 가닥 AAV 게놈의 양쪽 말단에 존재하는 대략 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽 145개의 뉴클레오티드는 2가지 대체 방향 중 하나로 존재할 수 있으며, 이는 상이한 AAV 게놈 간의 이질성과 단일 AAV 게놈의 두 말단 간에 이질성을 초래한다. 가장 바깥쪽 145개의 뉴클레오티드는 또한 자기-상보성의 몇 개의 더 짧은 영역 (A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 지정됨)을 함유하여, ITR의 이러한 부분 내에 가닥내 염기쌍 형성이 발생할 수 있게 한다.
"야생형 ITR", "WT-ITR" 또는 "ITR"은 AAV 또는 기타 데펜도바이러스에서 자연 발생 ITR 서열의 서열을 지칭하며, 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하고 있다. 임의의 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전 코딩의 축중성 또는 드리프트로 인해 정규 자연 발생 서열과 약간 다를 수 있으며, 따라서 본원에서 사용하기 위해 포괄된 WT-ITR 서열은 생산 프로세스 동안 일어나는 자연 발생 변화 (예를 들어, 복제 오류)의 결과로 생성된 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 적어도 하나의 적어도 요구된 복제 기점과 팔린드롬 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열 ("RBS") (RBE (Rep-결합 요소)로서 지칭되기도 함)과 말단 분해능 부위 ("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기점"을 구성하므로, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 주어진 연장물 내에서 서로 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역위 말단 반복부" 또는 "ITR"로서 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구제를 매개한다.
용어 "생체내"는 유기체, 예컨대 다세포 동물 내 또는 내부에서 발생하는 검정 또는 프로세스를 지칭한다. 본원에 기재된 측면 중 일부에서, 방법 또는 사용은 단세포 유기체, 예컨대 박테리움이 사용될 때 "생체내"에서 발생한다고 할 수 있다. 용어 "생체외"는 다세포 동물 또는 식물의 체 외부에 있는 무손상 막을 가진 살아있는 세포, 예를 들어, 체외 이식편, 1차 세포와 세포주를 포함한 배양 세포, 형질전환된 세포주, 및 특히 혈액 세포를 포함한 추출된 조직 또는 세포를 이용하여 수행되는 방법 및 사용을 지칭한다. 용어 "시험관내"는 무손상 막을 가진 세포, 예컨대 세포 추출물의 존재를 요구하지 않는 검정 및 방법을 지칭하며, 비-세포 시스템, 예컨대 세포 또는 세포 시스템, 예컨대 세포 추출물을 포함하지 않는 매질에서 프로그램가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "단리된" 분자 (예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 그의 자연 환경의 구성 요소로부터 확인 및 분리 및/또는 회수되었다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "최소 조절 요소"는 표적 세포에서 유전자의 효과적인 발현에 필요한 조절 요소를 지칭하므로, 트랜스진 발현 카세트에 포함되어야 한다. 이러한 서열은, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열, 플라스미드 벡터 내에 DNA 단편의 삽입을 용이하게 하는 폴리링커 서열, 및 mRNA 전사체의 인트론 스플라이싱 및 폴리아데닐화를 담당하는 서열을 포함할 수 있다. 완전색맹에 대한 유전자 요법 치료의 최근 예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 부위, 스플라이싱 신호 서열, 및 AAV 역위 말단 반복부의 최소 조절 요소를 포함하였다. 예를 들어, 문헌 [Komaromy et al. (Hum Mol Genet. 2010 Jul 1; 19(13): 2581-2593)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "최소화", "저하", "감소" 및/또는 "억제" (및 이와 유사한 용어)는 일반적으로 자연적, 예상된 또는 평균과 비교하여, 또는 대조군 조건과 비교하여 농도, 수준, 기능, 활성 또는 행동을 직접 또는 간접적으로 감소시키는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단량체 뉴클레오티드의 쇄로 구성된 분자, 예컨대 예를 들어, DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)를 지칭하는 것을 의미한다. 핵산은, 예를 들어 프로모터, CFH 유전자 또는 그의 일부분, 또는 조절 요소를 코딩할 수 있다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. "CFH 핵산"은 CFH 유전자 또는 그의 일부분, 또는 CFH 유전자 또는 그의 일부분의 기능적 변이체를 포함하는 핵산을 지칭한다. 유전자의 기능적 변이체는 사소한 변이, 예컨대 예를 들어, 침묵 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 미스센스 돌연변이, 및 유전자 기능을 유의미하게 변경시키지 않는 기타 돌연변이 또는 결실을 갖는 유전자의 변이체를 포함한다.
DNA와 RNA 가닥의 비대칭 말단은 5' (5 프라임) 및 3' (3 프라임) 말단으로 지칭되고, 5' 말단은 말단 포스페이트 기를 가지며, 3' 말단은 말단 히드록실 기를 가진다. 5 프라임 (5') 말단은 그의 말단에서 디옥시리보스 또는 리보스의 당-고리 내에 제5 탄소를 가지고 있다. 새로운 가닥을 어셈블리하는 데 사용되는 폴리머라제가 포스포디에스테르 결합을 통해 각각의 새로운 뉴클레오티드를 3'-히드록실 (-OH) 기에 부착시키기 때문에, 핵산은 생체 내에서 5'-방향에서 3'-방향으로 합성된다.
본원에 사용된 바와 같은, "핵산 구축물"은 자연 발생 유전자로부터 단리되거나 또는 자연에 달리 존재하지 않는 방식으로 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형되거나 또는 합성인 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 지칭한다. 용어 핵산 구축물은 이러한 핵산 구축물이 본 개시내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유할 때 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.
특정한 CFH 단백질 (그의 단편 및 일부분 포함)을 "코딩하는" DNA 서열은 특정한 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되는 RNA (mRNA)를 코딩할 수 있거나, 또는 DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되지 않는 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, 또는 DNA 표적화 RNA; "비-코딩" RNA 또는 "ncRNA"라고도 함)를 코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된" 또는 "커플링된"은 유전 요소의 병치를 지칭할 수 있으며, 여기서 요소는 예상되는 방식으로 작동할 수 있도록 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사를 시작하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것, 및 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 정렬 프로그램의 예는 ALIGN 플러스 [사이언티픽 앤드 에듀케이셔날 소프트웨어 (Scientific and Educational Software; 미국 펜실베이니아주)]이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교 중인 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대항한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (이는 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대항한 특정의 아미노산 서열 동일성 %을 가지거나 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배로, 여기서 X는 A와 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매칭물로서 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않는 것으로 인지될 것이다. 본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대항한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 % (이는 주어진 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대항한 특정의 핵산 서열 동일성 %을 가지거나 이를 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 대안적으로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: 분수 W/Z의 100배로, 여기서 W는 C와 D의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매칭물로서 점수가 매겨진 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서의 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않는 것으로 인지될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약 조성물" 또는 "조성물"은 예컨대 담체, 안정제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제 등이나 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 제약상 허용되는 화학 성분과 임의로 혼합된, 본원에 기재된 조성물 또는 작용제 (예를 들어, 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터)를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 적어도 길이로 제한되지는 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 자연 또는 비-자연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체 및 다량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 전장 단백질과 그의 단편 둘 다는 본 정의에 의해 포괄된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 더욱이, 본 개시의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 자연적으로 보존적임)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 지향 돌연변이 유발을 통한 의도적인 것일 수 있거나, 또는 PCR 증폭으로 인한 단백질 또는 오류를 생산하는 숙주의 돌연변이를 통한 우발적인 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "프로모터"는 특정한 유전자의 전사를 용이하게 하는 DNA 영역을 지칭하는 것을 의미한다. 전사 프로세스의 일부로서, RNA 폴리머라제로서 공지된, RNA를 합성하는 효소는 유전자 근처의 DNA에 부착된다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제를 동원하는 전사 인자에 대한 초기 결합 부위를 제공하는 반응 요소 및 특이적 DNA 서열을 함유한다. "닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터"는 닭 베타-액틴 유전자 (예를 들어, 진뱅크 엔트레즈 유전자 ID 396526으로써 나타낸 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 베타-액틴)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "smCBA" 프로모터는 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인핸서"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 활성인자 단백질 또는 전사 인자)과 결합하는 시스 작용성 조절 서열 (예를 들어, 50-1,500개 염기쌍)을 지칭한다. 인핸서는 그것이 조절하는 유전자 시작 부위의 상류 또는 유전자 시작 부위의 하류에서 최대 1,000,000개 염기쌍에 위치할 수 있다.
프로모터는 자신이 조절하는 핵산 서열의 발현을 구동하거나 또는 전사를 구동한다고 할 수 있다. 문구 "작동가능하게 연결된", "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어하에" 및 "전사 제어하에"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절되는 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 방향에 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, "역위 프로모터"는 핵산 서열이 역방향으로 있으므로, 코딩 가닥이었던 것이 이제 비-코딩 가닥이 되고, 그 반대도 마찬가지인 프로모터를 지칭한다. 역위 프로모터 서열은 스위치의 상태를 조절하기 위해 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 또한, 다양한 실시양태에서, 프로모터는 인핸서와 연계해서 사용될 수 있다.
프로모터는 코딩 세그먼트의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열 및/또는 주어진 유전자 또는 서열의 엑손을 단리함으로써 수득될 수 있는 것과 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 인핸서는 핵산 서열의 하류 또는 상류에 위치한, 그 핵산 서열과 자연적으로 연합된 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 코딩 핵산 세그먼트는 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 위치하며, 둘 다 자연 환경에서 작동가능하게 연결된 코딩된 핵산 서열과 정상적으로 연합되지 않는 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 연합되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연적으로 발생하는" 것이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 관련 기술분야에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합"은 (1) 자연 발생 환경으로부터 제거되었거나, (2) 유전자가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 연합되지 않거나, (3) 자연적으로 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 생체 분자, 예를 들어 유전자 또는 단백질을 지칭할 수 있다. 용어 "재조합"은 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성되는 폴리뉴클레오티드 유사체 뿐만 아니라 그러한 핵산에 의해 코딩된 단백질 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 "대상체" 또는 "환자" 또는 "개체"는 인간 또는 비-인간 동물을 지칭하는 것을 의미한다. "비-인간 동물"은 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체를 포함한다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카서스계 (백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉, 중동인 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자 또는 임상 환경의 다른 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이미 치료를 받고 있다. 일부 실시양태에서 대상체는 신생아, 유아, 어린이, 청소년 또는 성인이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료 효과"는 그 결과가 바람직하고 유익하다고 판단되는 치료의 결과를 지칭한다. 치료 효과는 질환 징후를 직접 또는 간접적으로 저지, 감소 또는 제거하는 것을 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한 질환 징후의 진행을 직접 또는 간접적으로 저지, 감소 또는 제거하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제에 대한 치료상 유효량은 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델로부터 초기에 결정될 수 있다. 치료상 유효한 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용된 용량은 투여된 화합물의 상대적 생체 이용률과 효력에 근거하여 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 기타 널리 공지된 방법에 근거하여 최대의 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다. 치료 유효성을 결정하기 위한 일반적인 원칙은 문헌 [Chapter 1 of Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)] (본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있으며, 하기에 요약되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "중심 망막"은 외측 황반 및/또는 내측 황반 및/또는 망막중심오목을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "중심 망막 세포 유형"은 중심 망막의 세포 유형, 예컨대 예를 들어, RPE 및 광수용기 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "황반"은 말초 망막과 비교하여, 광수용기 세포, 특히 간상 및 원추 세포의 더 높은 상대적 농도를 함유하는 영장류의 중심 망막 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "외측 황반"은 "말초 황반"으로서 지칭될 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "내측 황반"은 "중심 황반"으로서 지칭될 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "망막중심오목"은 말초 망막 및 황반과 비교했을 때, 광수용기 세포, 특히 원추 세포의 더 높은 상대적 농도를 함유하는 직경 대략 1.5 mm 이하의 영장류의 중심 망막 내의 작은 영역을 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "망막하 공간"은 광수용기 세포와 망막 색소 상피 세포 사이의 망막 내 위치를 지칭한다. 망막하 공간은 유체의 임의의 망막하 주사 전과 같은 잠재적 공간일 수 있다. 망막하 공간은 또한 잠재적 공간 내로 주입되는 유체를 함유할 수 있다. 이러한 경우, 유체는 "망막하 공간과 접촉"한다. "망막하 공간과 접촉하는" 세포는 망막하 공간과 경계를 이루는 세포, 예컨대 RPE 및 광수용기 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "트랜스진"은 세포 내로 도입되고 RNA로 전사될 수 있으며, 적절한 조건하에 임의로 번역 및/또는 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것을 의미한다. 측면에서, 트랜스진은 그것이 도입된 세포에 원하는 특성을 부여하거나, 그렇지 않는 경우 원하는 치료 또는 진단 결과를 초래한다.
"트랜스진 발현 카세트" 또는 "발현 카세트"는 상호 교환적으로 사용되며, 트랜스진의 전사를 지시하기에 충분한 하나 이상의 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 핵산의 선형 연장물을 지칭하지만, 캡시드 코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역위 말단 반복 영역을 포함하지 않는다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스 작용성 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 억제인자), 하나 또는 이상의 인트론, 및 하나 또는 이상의 전사후 조절 요소를 부가적으로 포함할 수 있다. 트랜스진 발현 카세트는 핵산 벡터가 표적 세포에 전달해야 하는 유전자 서열을 포함한다. 이러한 서열은 관심 유전자 (예를 들어, CFH 핵산 또는 그의 변이체), 하나 이상의 프로모터 및 최소 조절 요소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 질환 또는 장애 (예컨대, 예를 들어 AMD)를 "치료" 또는 "치료하는 것"은 검출가능한지 검출가능하지 않든지 간에, 이러한 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상의 완화, 질환 또는 장애의 정도 감소, 질환 또는 장애의 안정화된 (예를 들어, 악화되지 않은) 상태, 질환 또는 장애의 확산 방지, 질환 또는 장애 진행의 지연 또는 둔화, 질환 또는 장애 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 관해 (부분적 또는 전체적)를 지칭하는 것을 의미한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교 시 생존을 연장하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포로 전달될 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포와 이종이지만, 반드시 그렇지는 않다. 발현 벡터는 부가의 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있으며, 따라서 두 유기체, 예를 들어 발현을 위한 인간 세포와 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지될 수 있다. 용어 "발현"은 RNA와 단백질, 및 적절한 분비 단백질을 생산하는 데 관여하는 세포성 프로세스를 지칭하며, 이는 적용가능한 경우, 예를 들어, 전사, 전사체 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결될 때 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA로 전사되는 (DNA) 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞과 뒤의 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 서열 (즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의 역위 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산은 2개의 ITR에 의해 플랭킹된다.
본원에 사용된 바와 같은, "재조합 AAV 벡터 (rAAV 벡터)"는 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 이종 서열 (즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는 적합한 헬퍼 바이러스에 감염되고 (또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고) AAV rep 및 cap 유전자 산물 (즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 염색체 또는 또 다른 벡터, 예컨대 클로닝 또는 형질감염을 위해 사용되는 플라스미드)에 혼입될 때, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재하에 복제 및 캡슐화에 의해 "구제"될 수 있는 "프로-벡터"로서 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과의 복합체 형성, 리포좀 내에서의 캡슐화, 및 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자 내에서의 캡슐화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 형태 중 임의의 것일 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드 내로 패키징되어 "재조합 아데노-연관 바이러스 입자 (rAAV 입자)"를 생성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "rAAV 바이러스" 또는 "rAAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질과 캡슐화된 rAAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "리포터"는 검출가능한 판독값을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 측정가능한 신호, 예컨대 형광, 색상 또는 발광을 생산한다. 리포터 단백질 코딩 서열은, 세포 또는 유기체에서의 그의 존재가 쉽게 관찰되는 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정한 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 내게 하고, 루시페라제는 세포가 빛을 생산하는 반응을 촉매하게 하며, 효소 예컨대 β-갈락토시다제는 기질을 유색 산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적으로 유용한 예시적인 리포터 폴리펩티드는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제 (AP), 티미딘 키나제 (TK), 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 기타 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시페라제, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
전사 조절인자는 본원에 기재된 바와 같은 관심 유전자, 예컨대 말단절단된 CFH의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성인자 및 억제인자를 지칭한다. 프로모터는 특정한 유전자의 전사를 시작하는 핵산의 영역이다. 전사 활성인자는 전형적으로 전사 프로모터와 근처에서 결합하고 RNA 폴리머라제를 동원하여 전사를 직접 시작한다. 억제인자는 전사 프로모터와 결합하고 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 결합 위치와 세포성 및 환경적 조건에 따라 활성인자 또는 억제인자로서 제공될 수 있다. 전사 조절인자 클래스의 비-제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 징크 핑거 단백질, 날개 달린 나선 (포크헤드) 단백질, 및 류신-지퍼 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "억제인자 단백질" 또는 "유도인자 단백질"은 조절 서열 요소와 결합하고 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화하는 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 억제인자 및 유도인자 단백질은 적어도 하나의 입력제 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 대해 감수성이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어 분리가능한 DNA-결합 및 입력제-결합 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 모듈 형태이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 방법 또는 조성물에 필수적이지만, 필수적이든 아니든 불특정 요소의 포함에 개방적인 조성물, 방법, 및 그의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "로 본질적으로 이루어지는"은 주어진 실시양태에 필요한 요소를 지칭한다. 이러한 용어는 그 실시양태의 기본적 및 신규 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.
용어 "로 이루어지는"은 실시양태의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 제외한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 그의 각각의 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "로 본질적으로 이루어지는"은 주어진 실시양태에 필요한 요소를 지칭한다. 이러한 용어는 본 발명의 그 실시양태의 기본적 및 신규 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가의 요소의 존재를 허용한다.
용어 "포함한"은 본원에서 "포함하나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "예컨대"는 본원에서 "예컨대 ~이나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재되고/되거나 본 개시내용의 판독 시 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것인 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 약어 "예를 들어"는 라틴어 예시어로부터 유래된 것이며, 본원에서 비-제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 실시양태의 군 분류는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 군 구성원은 개별적으로 또는 군의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 특정 군의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 인해 특정 군에 포함되거나 그로부터 결실될 수 있다. 이러한 임의의 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 변형된 바와 같은 군을 함유하는 것으로 간주되며, 따라서 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬 군의 서면 설명을 충족한다.
측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 프로세스, 인간의 생식 계통 유전적 정체성을 변형시키는 프로세스, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용 또는 인간 또는 동물에게 임의의 실질적인 의학적 혜택 없이 고통을 주는 것으로 예상되는 동물의 유전적 정체성을 변형시키는 프로세스, 및 그러한 프로세스로부터 비롯된 동물과 연관되지 않는다.
기타 용어는 본 발명의 다양한 측면에 대한 설명 내에서 본원에 정의된다.
참조 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류 중인 특허 출원을 포함한 모든 특허 및 기타 간행물; 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 것은, 예를 들어, 본원에 기재된 기술과 연계해서 사용될 수 있는 그러한 간행물에 기재된 방법론을 기재하고 개시할 목적으로 본원에 참조로 명시적으로 포함된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시를 위한 목적으로만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해서 또는 임의의 다른 이유로 인해 상기 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 본 출원인이 활용할 수 있는 정보에 기초하며, 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
본 개시내용의 실시양태에 대한 설명은 완전한 것으로 의도되지 않거나 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시내용의 구체적인 실시양태 및 예가 본원에서 예시의 목적으로 기재되어 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 등가 변형이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되지만, 대안적 실시양태는 상이한 순서로 기능을 수행하거나, 또는 기능이 실질적으로 공동으로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 다른 절차 또는 방법에도 적절히 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시양태을 조합하여 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 측면은 필요한 경우, 상기 참고문헌 및 적용의 조성, 기능 및 개념을 이용하도록 변형되어 본 개시내용의 또 다른 실시양태를 제공할 수 있다. 더욱이, 생물학적 기능적 동등성 고려사항 때문에, 종류 또는 양에 있어서 생물학적 또는 화학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조 내에서 일부 변화가 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 변화가 상세한 설명에 비추어 본 개시내용에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
전술한 실시양태 중 임의의 것의 구체적인 요소를 조합하거나 또는 이를 다른 실시양태에서의 요소로 대체할 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 특정 실시양태와 관련된 장점이 이들 실시양태들의 맥락에서 기재되었지만, 다른 실시양태가 또한 이러한 장점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시양태가 본 개시의 범위 내에 포함되기 위하여 이러한 장점을 반드시 나타내어야 하는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 본 발명이 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되는 것은 아니며, 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에 사용된 전문 용어는 특정한 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 이는 청구범위에 의해서만 규정된다.
II. 핵산
잠재적 치료적 사용을 위한 핵산 분자의 특징규명 및 개발이 본원에 제공된다. 본 개시내용은 안구 질환 또는 장애 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)가 있는 대상체의 치료에 사용될 수 있는 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 키트 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 특정 측면은 대상체의 눈에 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 눈에 이종 핵산을 전달하는 것에 관한 것이다. 일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 본원에 기재된 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 전달하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 이종 핵산 (예를 들어, CFH를 코딩하는 핵산)을 포함하며, 2개의 AAV 말단 반복부를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 이종 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
여러 유전적 변이체가 AMD와 연관된다. 보체 인자 H (CFH) 유전자 내의 공통 코딩 변이체 Y402H가 최초로 확인되었다. "CFH 유전자"는 보체 인자 H (CFH) 단백질을 코딩하는 유전자이다. CFH는 보체 시스템의 155-kDa 가용성 당단백질 조절인자이다. 그것은 혈장에 풍부하며 다가 음이온, 예컨대 글리코사미노글리칸 (GAG) 및 시알산의 인식을 통해 숙주 세포막 및 기타 자기-표면과 연합될 수 있다 (Meri and Pangburn, Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 May; 87(10):3982-6). 대체 경로 C3 및 C5 전환효소 수준에서의 개입을 통해, 유체 상과 표면-연관 보체 증폭 둘 다를 조정한다. 인자 H는 여러 가지 방식으로 작동한다 (문헌 [Pangburn et al. J Exp Med. 1977 Jul 1; 146(1):257-70]): 그것은 C3b와의 결합을 놓고 인자 B와 경쟁하므로, 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)의 형성을 방해하며; 이분자 전환효소 복합체가 어셈블링에 성공하면, CFH는 후속 해리 (붕괴)를 가속화하며; CFH는 또한 대체 경로 C5 전환효소 (C3b2Bb)의 붕괴를 가속화하며; CFH는 C3b에서 iC3b로의 인자 I 매개 단백질 분해적 절단에 대한 보조 인자이다. 세린 프로테아제 인자 I의 보조 인자로서, CFH는 또한 이미 축적된 C3b의 단백질 분해를 조절한다 (Hocking et al., J. Biol. Chem. 283:9475-9487(2008); Xue et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 24:643-651(2017)).
성숙한 CFH (155 kDa)의 1213개 아미노산 잔기 (문헌 [Ripoche et al., Biochem J. 1988 Jan 15; 249(2):593-602])은 각각 ~60개 잔기인 20개의 짧은 컨센서스 반복부 (SCR)로 이루어진다 (Kristensen and Tack. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Jun; 83(11):3963-7). 20개 SCR의 다중 정렬은 4개의 불변 Cys 잔기와 Cys(III)와 Cys(IV) 사이의 거의 불변 Trp 잔기를 보여준다 (Schmidt et al., Clin Exp Immunol. 2008 Jan; 151(1): 14-24). CFH 내에서, 하나의 SCR의 Cys(IV) (마지막 잔기)와 그 다음 SCR의 Cys(I) (첫 번째 잔기) 사이에 3개 내지 8개 잔기의 '링커'가 있다. 20개의 SCR (양쪽 끝에 있는 링커 내의 1개 또는 2개의 잔기 포함) 각각은 Cys(I)-Cys(III), Cys(II)-Cys(IV) 디술피드 연결에 의해 안정화된, 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)로 불리는 별개의 3차원 (3D) 구조로 폴딩되는 것으로 추정된다 [(Soares and Barlow. Structural biology of the complement system. Boca Raton: CRC Press, Taylor & Francis Group; 2005. pp. 19-62)]. 도 1a에 나타난 바와 같이, 전장 인간 CFH는 20개 CCP (CCP 1-20)를 포함한다. 일부 CCP는 도 1a에 표시된 바와 같이 다른 단백질에 대한 결합 부위를 확인하였다. CCP 및 CCP 결합 단백질은 보체 캐스케이드 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. AMD에 대한 고위험 다형성 Y402H는 자연 발생 변이체 FHL-1에도 함유된 CCP 7 내에 위치한다.
"CFH 핵산"은 CFH 유전자 또는 그의 일부분, 또는 CFH 유전자 또는 그의 일부분의 기능적 변이체를 포함하는 핵산을 지칭한다. 유전자의 기능적 변이체는 사소한 변이, 예컨대 예를 들어, 침묵 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 미스센스 돌연변이, 및 유전자 기능을 유의미하게 변경시키지 않는 기타 돌연변이 또는 결실을 갖는 유전자의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 보체 제어 단백질 모듈 (CCP) 1-20을 포함하는 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 보체 제어 단백질 모듈 (CCP) 1-20으로 이루어진 CFH 단백질을 코딩한다. 말단절단된 CFH 단백질은 20개의 CCP 중 적어도 하나, 또는 하나의 일부분이 누락된 CFH 단백질이다.
일부 실시양태에 따르면, 발현된 CFH 단백질은 안구 질환 또는 장애의 치료 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성의 치료 및/또는 예방)에 대해 기능적이다. 일부 실시양태에서, 발현된 CFH 단백질은 면역 체계 반응을 유발하지 않는다.
일부 실시양태에 따르면, 전장 CFH (보체 제어 단백질 모듈 (CCP) 1-20 포함)의 핵산 서열이 서열식별번호: 1로서 하기에 제시된다.
서열식별번호: 1
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 실시양태에 따르면, CFH 핵산은 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 핵산은 서열식별번호: 1의 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 1과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 1과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 1과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 군으로부터 선택된 7개 이상의 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 군으로부터 선택된 10개 이상의 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 군으로부터 선택된 15개 이상의 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH (tCFH1)의 핵산 서열이 서열식별번호: 2로서 하기에 제시된다.
서열식별번호: 2
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH (tCFH1)의 핵산 서열이 서열식별번호: 8로서 하기에 제시된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 96% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 96% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 97% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 97% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 99% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 하기에 제시된 아미노산 서열 서열식별번호: 9를 포함한다.
서열식별번호: 9
Figure pct00007
일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 하기에 제시된 아미노산 서열 서열식별번호: 10을 포함한다.
서열식별번호: 10
Figure pct00008
일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10으로 이루어진다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH2)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 1353 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH (tCFH2)의 핵산 서열이 서열식별번호: 3으로서 하기에 제시된다.
서열식별번호: 3
Figure pct00009
일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH3)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 2610 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH (tCFH3)의 핵산 서열이 서열식별번호: 4로서 하기에 제시된다.
서열식별번호: 4
Figure pct00010
Figure pct00011
일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH4)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 1893 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH (tCFH4)의 핵산 서열이 서열식별번호: 5로서 하기에 제시된다.
서열식별번호: 5
Figure pct00012
일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6 및 CCP7을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (FHL-1)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6 및 CCP7로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 1357 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 말단절단된 CFH 단백질 (FHL-1)의 핵산 서열이 서열식별번호: 6으로서 하기에 제시된다.
서열식별번호: 6
Figure pct00013
일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 보체 캐스케이드 활성에 중요한 것으로 공지된 CCP가 결실된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, tCFH2 및 tCFH4는 보체 캐스케이드 활성에 중요한 것으로 공지된 CCP가 결실되도록 조작되었다.
특정 실시양태에 따르면, 핵산은 인간 핵산 (즉, 인간 CFH 유전자로부터 유래되는 핵산)이다. 다른 실시양태에서, 핵산은 비-인간 핵산 (즉, 비-인간 CFH 유전자로부터 유래되는 핵산)이다.
핵산 제조
본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, CFH 핵산 포함)는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 단리될 수 있다. 핵산 분자는 관심 핵산 서열의 전부 또는 일부분을 혼성화 프로브로서 사용함으로써, 표준 혼성화 및 클로닝 기술을 사용하여 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기재된 바와 같음).
본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 분자는 또한 관심 핵산 분자의 서열에 기초하여 설계된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 단리될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자는 cDNA, mRNA, 또는 대안적으로 게놈 DNA를 템플릿으로서 사용하고 표준 PCR 증폭 기술에 따라 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
더욱이, 관심 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 또한 표준 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 DNA 합성기에서 자동화된 고체상 합성을 포함하여, 폴리데옥시뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 수많은 방법이 공지되어 있다 [예를 들어, Itakura et al. 미국 특허 번호 4,598,049; Caruthers et al. 미국 특허 번호 4,458,066; 및 Itakura 미국 특허 번호 4,401,796 및 4,373,071 참조 (본원에 참조로 포함됨)]. 합성 올리고뉴클레오티드를 설계하는 자동화된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hoover, D.M. & Lubowski, 2002. J. Nucleic Acids Research, 30(10): e43]을 참조한다.
본 발명의 많은 실시양태는 CFH 핵산을 포함한다. 본 발명의 일부 측면 및 실시양태는 다른 핵산, 예컨대 단리된 프로모터 또는 조절 요소를 포함한다. 핵산은, 예를 들어, cDNA 또는 화학적으로 합성된 핵산일 수 있다. cDNA는, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용한 증폭에 의해, 또는 적절한 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 화학적으로 합성될 수 있다.
III. 프로모터, 발현 카세트 및 벡터
본 개시내용의 프로모터, CFH 핵산, 조절 요소 및 발현 카세트, 및 벡터는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 하기에 기재된 방법은 이러한 방법의 비-제한적인 예로서 제공된다.
프로모터
AAV 벡터로부터 본원에 기재된 바와 같은 CFH 단백질의 발현은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 프로모터를 사용하여 공간적으로 및 시간적으로 모두 달성될 수 있다.
CFH 단백질의 발현을 위한 AAV 벡터의 발현 카세트는 전체 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 예시적인 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 즉시 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1 (PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터 (TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터 (TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터 (LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제 (hTERT) 프로모터; 닭 베타-액틴 프로모터, 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전 (smCBA) (문헌 [Pang et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 Oct; 49(10):4278-83]); 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터에 연결된 시토메갈로바이러스 인핸서; 시토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 베타-글로빈 프로모터 (CAG 프로모터; 문헌 [Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9]) 및 신장 인자 1-알파 프로모터 (EF1-알파) 프로모터 (문헌 [Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10])를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전 (smCBA)을 포함한다. 프로모터는 구성성, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 눈의 세포에서 이종 핵산을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용기 세포 또는 RPE에서 이종 핵산을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 다수의 망막 세포에서 이종 핵산을 발현할 수 있다.
발현 카세트
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 프로모터; (b) 본원에 기재된 바와 같은 CFH 핵산을 포함하는 핵산; 및 (c) 최소 조절 요소를 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 프로모터는 상기 논의된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 CBA이다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 smCBA이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH1)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 3358 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 2와 적어도 99% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH2)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 1353 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 3과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH3)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 2610 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 4와 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (tCFH4)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 1893 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6 및 CCP7을 포함하는 말단절단된 CFH 단백질 (FHL-1)을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6 및 CCP7로 이루어진 말단절단된 CFH 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, CFH 단백질을 코딩하는 핵산은 1357 bp 길이이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일하다.
일부 실시양태에 따르면, 재조합 핵산은 적어도 2개의 ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 실시양태에 따르면, 구축물은 전장 인간 CFH, 닭 베타 액틴 프로모터 및 역위 말단 반복부를 포함한다 (pTR-CBA-flCFH).
일부 실시양태에 따르면, 구축물은 CFH CCP 16-17이 결실된 전장 인간 CFH, 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전 및 역위 말단 반복부를 포함한다 (pTR-smCBA-tCFH1).
일부 실시양태에 따르면, 구축물은 CFH CCP 5-17이 결실된 전장 인간 CFH, 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전 및 역위 말단 반복부를 포함한다 (pTR-smCBA-tCFH2).
일부 실시양태에 따르면, 구축물은 CFH CCP 10-15가 결실된 전장 인간 CFH, 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전 및 역위 말단 반복부를 포함한다 (pTR-smCBA-tCFH3).
일부 실시양태에 따르면, 구축물은 CFH CCP 8-17이 결실된 전장 인간 CFH, 혼성체 CMV-닭 베타-액틴 프로모터의 작은 버전 및 역위 말단 반복부를 포함한다 (pTR-smCBA-tCFH4).
일부 실시양태에 따르면, 구축물은 CCP 1-7을 포함하는 자연 발생 CFH 변이체, 닭 베타-액틴 프로모터 및 역위 말단 반복부를 포함한다 (pTR-CBA-FHL-1). 일부 실시양태에 따르면, pTR-CBA-FHL-1은 서열식별번호: 7의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, pTR-CBA-FHL-1은 서열식별번호: 7의 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 85% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 90% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 99% 동일하다.
서열식별번호: 7
Figure pct00014
Figure pct00015
"최소 조절 요소"는 표적 세포에서 유전자의 효과적인 발현에 필요한 조절 요소이다. 이러한 조절 요소는, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열, 플라스미드 벡터 내에 DNA 단편의 삽입을 용이하게 하는 폴리링커 서열, 및 mRNA 전사체의 인트론 스플라이싱 및 폴리아데닐화를 담당하는 서열을 포함할 수 있다. 완전색맹에 대한 유전자 요법 치료의 최근 예에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 부위, 스플라이싱 신호 서열 및 AAV 역위 말단 반복부의 최소 조절 요소를 포함하였다. 예를 들어, 문헌 [Komaromy et al.] 참조. 본 발명의 발현 카세트는 또한 임의로, 표적 세포에 유전자를 효과적으로 혼입하는 데 필요하지 않는 부가의 조절 요소를 포함할 수 있다.
벡터
본 발명은 또한 이전 섹션에서 논의된 발현 카세트 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 발현 카세트의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 구체적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 전달은 생체내 전기천공법 (예를 들어, 문헌 [Chalberg, TW, et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 46, 2140-2146 (2005)] (이하 Chalberg et al., 2005) 참조) 또는 전자 사태 형질감염 (예를 들어, 문헌 [Chalberg, TW, et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 47, 4083-4090 (2006)] (이하 Chalberg et al., 2006) 참조)에 의해 달성될 수 있다. 추가 실시양태에서, 벡터는 DNA 압축 펩티드 (예를 들어, 문헌 [Farjo, R, et al. PLoS ONE, 1, e38 (2006)] (이하 Farjo et al., 2006) 참조) (여기서 폴리에틸렌 글리콜과 커플링된 시스테인 잔기에 이어 30개의 리신을 함유하는 펩티드인 CK30이 광수용기로의 유전자 전달을 위해 사용됨), 세포 침투 특성을 갖는 펩티드 (안구 세포로의 펩티드 전달의 예에 대해서는, 문헌 [Johnson, LN, et al., Cell-penetrating peptide for enhanced delivery of nucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea. Molecular Therapy, 16(1), 107-114 (2007) (이하 Johnson et al., 2007), Barnett, EM, et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 47, 2589-2595 (2006) (이하 Barnett et al., 2006), Cashman, SM, et al. Molecular Therapy, 8, 130-142 (2003) (이하 Cashman et al., 2003), Schorderet, DF, et al. Clinical and Experimental Ophthalmology, 33, 628-635 (2005) (이하 Schorderet et al., 2005), Kretz, A, et al., Molecular Therapy, 7, 659-669 (2003) (이하 Kretz et al. 2003)]을 참조함), 또는 DNA 캡슐화 리포플렉스, 폴리플렉스, 리포좀 또는 이뮤노리포좀 (예를 들어, 문헌 [Zhang, Y, et al. Molecular Vision, 9, 465-472 (2003) (이하 Zhang et al. 2003), Zhu, C, et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43, 3075-3080 (2002) (이하 Zhu et al. 2002), Zhu, C., et al. Journal of Gene Medicine, 6, 906-912. (2004) (이하 Zhu et al. 2004)] 참조)이다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아/폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV))로부터 유래된 벡터이다. 예를 들어, 문헌 [Howarth, JL et al., Using viral vectors as gene transfer tools. Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)]을 참조한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
12개의 인간 혈청형 (AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12) 및 비-인간 영장류로부터의 100개 초과의 혈청형을 포함한, 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 다수의 혈청형이 확인되었다 (Howarth JL et al., 2010). 벡터가 AAV 벡터인 본 발명의 실시양태에서, AAV 벡터의 역위 말단 반복부 (ITR)의 혈청형은 임의의 공지된 인간 또는 비-인간 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, AAV 벡터의 AAV ITR의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱이, 벡터가 AAV 벡터인 본 발명의 실시양태에서, AAV 벡터의 캡시드 서열의 혈청형은 임의의 공지된 인간 또는 동물 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터의 캡시드 서열의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 캡시드 서열의 혈청형은 AAV2이다. 벡터가 AAV 벡터인 일부 실시양태에서, 위형화 접근 방식이 이용되며, 여기서 하나의 ITR 혈청형의 게놈은 상이한 혈청형 캡시드로 패키징된다. 예를 들어, 문헌 [Zolutuhkin S. et al. Methods 28(2): 158-67 (2002)]을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, AAV 벡터의 AAV ITR의 혈청형 및 AAV 벡터의 캡시드 서열의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
벡터가 rAAV 벡터인 본 발명의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 캡시드 서열이 이용된다. 돌연변이체 캡시드 서열 뿐만 아니라 다른 기술, 예컨대 합리적인 돌연변이 유발, 표적화 펩티드의 조작, 키메라 입자의 생성, 라이브러리 및 유도 진화 접근 방식, 및 면역 회피 변형이 면역 회피 및 증진된 치료 결과를 달성하기 위하여 AAV 벡터를 최적화하기 위해 본 발명에 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mitchell A.M. et al. AAV's anatomy: Roadmap for optimizing vectors for translational success. Curr Gene Ther. 10(5): 319-340]을 참조한다.
AAV 벡터는 망막에서의 장기간 유전자 발현을 매개할 수 있고 최소한의 면역 반응을 이끌어낼 수 있어, 이들 벡터가 눈으로의 유전자 전달을 위한 매력적인 선택이 되게 한다.
IV. 바이러스 벡터를 생산하는 방법
본 개시내용은 또한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 제조하는 방법으로서, 아데노-연관 바이러스 벡터 내로 본원에 기재된 핵산 중 어느 하나를 삽입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공되는 rAAV 벡터를 제조하는 방법에 따르면, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 따라서, 본 개시내용은 하나의 ITR 혈청형의 벡터 게놈이 상이한 혈청형 캡시드로 패키징되는 위형화 접근 방식을 사용하는 벡터를 포괄한다. 예를 들어, 문헌 [Daya S. and Berns, K.I., Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews, 21(4): 583-593 (2008) (이하 Daya et al.)]을 참조한다. 더욱이, 일부 실시양태에서, 캡시드 서열은 돌연변이체 캡시드 서열이다.
AAV 벡터
AAV 벡터는 아데노바이러스 제제의 오염물질로서 원래 설명되었기 때문에 그의 명칭을 가진 아데노-연관 바이러스로부터 유래된다. AAV 벡터는 다른 유형의 벡터에 비해 널리 공지된 많은 이점을 제공한다: 야생형 균주는 질환 또는 부작용의 증거 없이 인간과 비-인간 영장류를 감염시키며; AAV 캡시드는 높은 화학적 및 물리적 안정성과 조합하여 매우 낮은 면역원성을 나타내며, 이는 바이러스 정제 및 농축의 엄격한 방법을 허용하고; AAV 벡터 형질도입은 유사분열 후 비-분열 세포에서 지속적인 트랜스진 발현을 유도하고 장기적인 기능 획득을 제공하며; 다양한 AAV 하위유형 및 변이체는 선택된 조직과 세포 유형을 표적화할 수 있는 가능성을 부여한다 [Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics, in M. Schaefer-Korting (ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010) (이하 Heilbronn)]. AAV 벡터의 주요한 한계는 AAV가 단일 가닥 DNA를 함유하는 기존 벡터에 대해 제한된 트랜스진 용량 (<4.9 kb)만 제공한다는 것이다.
AAV는 정이십면체, 직경 20 nm의 캡시드에 의해 캡슐화된, 작은 단일 가닥 DNA를 함유하는 외피 미보유 바이러스이다. 인간 혈청형 AAV2는 대부분의 AAV의 초기 연구에서 사용되었다 (Heilbronn (2010)). 이는 4.7 kb의 선형 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하며, 2개의 오픈 리딩 프레임 rep와 cap ("rep"은 복제를 나타내고 "cap"은 캡시드를 나타냄)를 갖는다. Rep는 4개의 중복되는 비구조 단백질: Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 코딩한다. Rep78 및 Rep69는 AAV 벡터 생산을 위한 필수 단계인 헤어핀 구조 역위 말단 반복부 (ITR)에서 AAV DNA 복제를 시작하는 것을 포함하여, AAV 수명 주기의 대부분의 단계에서 필요하다. cap 유전자는 3가지 캡시드 단백질, VP1, VP2, 및 VP3를 코딩한다. Rep 및 cap은 145 bp ITR에 의해 플랭킹된다. ITR은 DNA 복제 기점과 패키징 신호를 함유하고 있으며, 염색체 통합을 매개하는 역할을 한다. ITR은 일반적으로 AAV 벡터 구축에서 유지되는 유일한 AAV 요소이다.
복제를 달성하기 위해서는, AAV가 표적 세포에 헬퍼 바이러스와 공동감염되어야만 한다 (Grieger JC & Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production, and clinical applications. Adv Biochem Engin / Biotechnol 99:119-145 (2005)). 전형적으로, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 (Ad) 또는 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)이다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에, AAV는 인간 염색체 19번 부위에 통합함으로써 잠복 감염을 확립할 수 있다. AAV로 잠복 감염된 세포의 Ad 또는 HSV 감염은 통합된 게놈을 구제하고 증식성 감염을 시작할 것이다. 헬퍼 기능에 필요한 4가지 Ad 단백질은 E1A, E1B, E4, 및 E2A이다. 또한, Ad 바이러스-연관 (VA) RNA의 합성이 필요하다. 헤르페스바이러스 또한 증식성 AAV 복제를 위한 헬퍼 바이러스의 역할을 할 수 있다. 헬리카제-프리마제 복합체 (UL5, UL8, 및 UL52)와 DNA-결합 단백질 (UL29)을 코딩하는 유전자는 HSV 헬퍼 효과를 매개하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. rAAV 벡터를 이용하는 본 발명의 일부 실시양태에서, 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스이다. rAAV 벡터를 이용하는 다른 실시양태에서, 헬퍼 바이러스는 HSV이다.
재조합 AAV ( rAAV ) 벡터 제조
본 발명의 rAAV 벡터의 생산, 정제 및 특징규명은 관련 기술분야에 공지된 많은 방법 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 실험실 규모의 생산 방법에 대한 검토는, 예를 들어, 문헌 [Clark RK, Kidney Int. 61s:9-15 (2002); Choi VW et al., Current Protocols in Molecular Biology 16.25.1-16.25.24 (2007) (이하 Choi et al.); Grieger JC & Samulski RJ, Adv Biochem Engin / Biotechnol 99:119-145 (2005) (이하 Grieger & Samulski); Heilbronn R & Weger S, in M. Schaefer-Korting (ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010) (이하 Heilbronn); Howarth JL et al., Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010) (이하 Howarth)]을 참조한다. 하기에 기재되는 생산 방법은 비-제한적인 예로서 의도된 것이다.
AAV 벡터 생산은 패키징 플라스미드의 공동 형질감염에 의해 수행될 수 있다 (Heilbronn). 세포주는 결실된 AAV 유전자 rep 및 cap 및 필요한 헬퍼바이러스 기능을 제공한다. 아데노바이러스 헬퍼 유전자, VA-RNA, E2A 및 E4는 2개의 별도의 플라스미드 상에 또는 단일 헬퍼 구축물 상에, AAV rep 및 cap 유전자와 함께 형질감염된다. AAV 캡시드 유전자가 ITR로 분류된 트랜스진 발현 카세트 (관심 유전자, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CFH 핵산; 프로모터; 및 최소 조절 요소를 포함함)로 대체되는 재조합 AAV 벡터 플라스미드가 또한 형질감염된다. 이러한 패키징 플라스미드는 부착 또는 현탁 세포주로 형질감염될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 이러한 패키징 플라스미드는 전형적으로, 나머지 필요한 Ad 헬퍼 유전자인 E1A 및 E1B를 구성적으로 발현하는 인간 세포주인 HEK 293 또는 HEK293T 세포로 형질감염된다. 이는 관심 유전자를 운반하는 AAV 벡터의 증폭 및 패키징으로 이어진다.
현재 12개의 인간 혈청형 및 100개 초과의 비-인간 영장류 혈청형을 포함한 AAV의 다수의 혈청형이 확인되었다 (Howarth et al.). 본 발명의 AAV 벡터는 임의의 공지된 혈청형의 AAV로부터 유래된 캡시드 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "공지된 혈청형"은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있는 캡시드 돌연변이체를 포괄한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 바이러스 캡시드 서열의 유전자 조작, 상이한 혈청형의 캡시드 영역의 노출된 표면의 도메인 교환, 및 마커 구제와 같은 기술을 사용한 AAV 키메라의 생성을 포함한다. 문헌 [Bowles et al. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)] 뿐만 아니라 그 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다. 더욱이, 본 발명의 AAV 벡터는 임의의 공지된 혈청형의 AAV로부터 유래된 ITR을 포함할 수 있다. 우선적으로, ITR은 인간 혈청형 AAV1-AAV12 중 하나로부터 유래된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 하나의 ITR 혈청형의 게놈이 상이한 혈청형 캡시드로 패키징되는 위형화 접근 방식이 이용된다.
우선적으로, 본 발명에 이용된 캡시드 서열은 인간 혈청형 AAV1-AAV12 중 하나로부터 유래된다. AAV5 혈청형 캡시드 서열을 함유하는 재조합 AAV 벡터는 생체내 망막 세포를 표적화하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌 [Komaromy et al.]을 참조한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, AAV 벡터의 캡시드 서열의 혈청형은 AAV2이다. 다른 실시양태에서, AAV 벡터의 캡시드 서열의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12이다. 캡시드 서열의 혈청형이 자연적으로 망막 세포를 표적화하지 않는 경우에도, 특이적 조직을 표적화하는 다른 방법이 이용될 수 있다 (문헌 [Howarth et al.] 참조).
재조합 AAV (rAAV) 벡터의 생산, 정제 및 특징규명을 위한 가능한 한 가지 프로토콜은 문헌 [Choi et al.]에 제공된다. 일반적으로, 하기 단계가 포함된다: 트랜스진 발현 카세트의 설계, 특이적 수용체를 표적화하기 위한 캡시드 서열의 설계, 아데노바이러스가 없는 rAAV 벡터의 생성, 정제 및 역가. 이들 단계는 하기에 요약되어 있으며 문헌 [Choi et al.]에 자세히 기재되어 있다.
트랜스진 발현 카세트는 단일 가닥 AAV (ssAAV) 벡터 또는 유사 이중 가닥 트랜스진으로서 패키징되는 "이량체" 또는 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터일 수 있다 (Choi et al.; Heilbronn; Howarth). 전통적인 ssAAV 벡터를 사용하면, 일반적으로 단일 가닥 AAV DNA를 이중 가닥 DNA로 전환시켜야 하기 때문에 유전자 발현이 느리게 시작된다 (트랜스진 발현의 안정기에 도달할 때까지 수일 내지 수주가 소요된다). 대조적으로, scAAV 벡터는 수시간 이내에 유전자 발현의 시작을 보여주며, 이는 정지 세포의 형질도입 후 수일 이내에 안정기에 도달한다 (Heilbronn). 그러나, scAAV 벡터의 패키징 용량은 전통적인 ssAAV 벡터의 대략 절반이다 (Choi et al.). 대안적으로, 트랜스진 발현 카세트는 두 AAV 벡터 사이에서 절단되어, 더 긴 구축물의 전달을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Dyka et al. Hum Gene Ther. 2019 Sep 30]을 참조한다. ssAAV 벡터는 제한 엔도뉴클레아제로 적절한 플라스미드 (예컨대 예를 들어, CFH 유전자를 함유하는 플라스미드)를 소화하여 rep 및 cap 단편을 제거하고, AAVwt-ITR을 함유하는 플라스미드 백본을 겔 정제함으로써 구축될 수 있다 (Choi et al.). 연속해서, 원하는 트랜스진 발현 카세트를 적절한 제한 부위 사이에 삽입하여 단일 가닥 rAAV 벡터 플라스미드를 구축할 수 있다. scAAV 벡터는 문헌 [Choi et al.]에 기재된 바와 같이 구축될 수 있다.
이어서, rAAV 벡터와 적합한 AAV 헬퍼 플라스미드 및 pXX6 Ad 헬퍼 플라스미드의 대규모 플라스미드 제제 (적어도 1 mg)가 정제될 수 있다 (Choi et al.). 적합한 AAV 헬퍼 플라스미드는 각각 AAV2 ITR 게놈을 AAV 혈청형 1 내지 12 및 그의 변이체의 캡시드로 교차 패키징할 수 있는 pXR 시리즈, pXR1-pXR5로부터 선택될 수 있다. 적절한 캡시드는 관심 세포에 대한 캡시드의 표적화의 효율성에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, rAAV 벡터의 캡시드 서열의 혈청형은 AAV2인데, 이는 이러한 유형의 캡시드가 망막 세포를 효과적으로 표적화하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 특이적 세포 유형 (예를 들어, 망막 원추 세포)으로의 유전자 전달 및/또는 발현을 개선시키기 위해, 게놈 (즉, 트랜스진 발현 카세트) 길이와 AAV 캡시드를 변화시키는 공지된 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Yang GS, Journal of Virology, 76(15): 7651-7660]을 참조한다.
그 다음, HEK293 또는 HEK293T 세포를 pXX6 헬퍼 플라스미드, rAAV 벡터 플라스미드, 및 AAV 헬퍼 플라스미드로 형질감염시킨다 (Choi et al.). 연속해서, 분별된 세포성 용해물은 rAAV 정제의 다단계 프로세스를 거친 다음, CsCl 구배 정제 또는 헤파린 세파로스 컬럼 정제 프로세스를 거친다. rAAV 비리온의 생산 및 정량화는 도트-블롯 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 세포 배양에서 rAAV의 시험관내 형질도입은 바이러스의 감염성과 발현 카세트의 기능성을 검증하는 데 사용될 수 있다.
문헌 [Choi et al.]에 기재된 방법에 더하여, AAV의 생산을 위한 다양한 다른 형질감염 & 정제 방법이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 침전 또는 PEI 프로토콜에 의존하는 방법을 포함한 일시적 형질감염 방법이 이용가능하다. 다양한 정제 방법은 아이오딕사놀 구배 정제, 친화성 및/또는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함한다.
rAAV 벡터를 생산하기 위한 실험실 규모의 방법에 더하여, 본 발명은 AAV 벡터의 생물반응기 규모의 제조를 위해, 예를 들어 문헌 [Heilbronn; Clement, N. et al. Human Gene Therapy, 20: 796-606]을 포함한 관련 기술분야에 공지된 기술을 활용할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, rAAV 벡터를 생산하는 방법은 문헌 [Chulay et al. (Hum Gene Ther. 2011 Feb;22(2):155-65)] (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행된다.
V. 치료 방법
본 개시내용은 AAV1-12, 또는 그의 일부분 또는 변이체를 포함하는 rAAV 입자가 대상체의 망막으로 전달되는, 안구 장애에 대한 유전자 요법의 방법을 제공한다. 한 측면에 따르면, 본 개시내용은 안구 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은, CFH를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 투여하며, 이로써 상기 대상체에서 안구 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 발현 벡터는 2개의 AAV 말단 반복부를 추가로 포함한다. 한 측면에 따르면, 본 개시내용은 안구 질환 또는 장애의 진행의 예방 또는 정지를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은, CFH를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 투여하며, 이로써 상기 대상체에서 안구 질환 또는 장애의 진행을 예방 또는 정지시키는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애의 진행을 예방 또는 정지시키는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에 따르면, 본 개시내용은 안구 질환 또는 장애의 진행의 역전을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은, CFH를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 투여하며, 이로써 상기 대상체에서 안구 질환 또는 장애의 진행을 역전시키는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애의 진행을 역전시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 발현 벡터는 적어도 2개의 AAV 말단 반복부를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 보체 경로의 활성화와 연관된다. 일부 실시양태에 따르면, 안구 질환 또는 장애는 망막 변성이다. 일부 실시양태에 따르면, 망막 변성은 연령 관련 황반 변성 (AMD)이다. 일부 실시양태에 따르면, 치료받는 대상체는 안구 장애의 한 가지 이상의 징후 또는 증상을 나타냈다.
AMD는 전 세계적으로 노인의 법적 시각상실 및 시력 상실의 주요 원인인 복잡하고 진행성인 안구 질환이다 (Pennington et al., Eye Vis. 2016, 3, 34). AMD는 실제 병인이 불분명함에도 불구하고 환경적 요인과 유전적 요인 둘 다로부터 기인한다. AMD의 영향을 받는 개인의 수는 약 1억 9600만명이며 2040년에는 2억 8800만명으로 증가할 것으로 예상된다 (Wong et al., Lancet Health 2014, 2, e106-e116). AMD의 주요 임상 증상은 중심 시력의 손상이며, 이는 결국 완전한 시력 상실을 초래할 수 있다. 고령은 정의상 AMD의 주요 위험 요소이다. 연대순으로, AMD는 초기와 말기로 분류할 수 있다. 초기 AMD는 브루크 막과 RPE 사이에 세포외 파편 침착물의 존재 및 증가로 대표된다. 이러한 파편들은 드루젠이라고 불리며, AMD의 진행과 함께 나타난다 (Joachim et al., Ophthalmology 2014, 121, 917-925). 말기 AMD는 위축성 (건성) 및 신생혈관성 (습성)의 두 가지 형태로 나타날 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, AMD는 건성 AMD이다. 일부 실시양태에 따르면, 건성 AMD는 진행성 건성 AMD이다. 건성 형태의 AMD는 보다 통상적인 형태의 AMD로, 모든 연령-관련 황반 변성 증례의 85 내지 90퍼센트를 차지한다. 이는 망막 아래에 드루젠이라는 황색 침착물이 축적되고 시력 상실이 시간이 지남에 따라 서서히 악화되는 것이 특징이다. 이러한 병태는 전형적으로 양쪽 눈의 시력에 영향을 미치지만, 시력 상실은 종종 한쪽 눈에 먼저 일어난다. 일부 실시양태에 따르면, AMD는 습성 AMD이다. 습성 형태의 연령-관련 황반 변성은 급격히 악화될 수 있는 심각한 시력 상실과 연관된다. 이러한 형태의 병태는 황반 아래에 비정상적이고 연약한 혈관이 자라는 것이 특징이다. 이들 혈관은 혈액과 체액을 누출시켜, 황반을 손상시키고 중심 시력을 흐릿하고 왜곡되게 보이게 만든다. 현재 습성 AMD 약물 치료는 혈관 생산을 자극하는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 억제하는 데 초점을 맞추고 있다. 그러나, VEGF 치료의 장기적인 효과의 가능성은 남아 있다. 마우스 모델에서, 항-VEGF 요법을 통한 장기 치료는 망막 내에서 광수용기 및 그의 지원 세포의 사멸 증가와 상관관계가 있다 (Ford et al., 2012. Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 53, 7520-7527; Saint-Genie et al., 2008. PLoS ONE 3, e3554).
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본 발명의 벡터 중 임의의 것을 안구 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하며, 이로써 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애 (예를 들어, AMD)를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
치료 방법 중 임의의 것에서, 벡터는 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대 네이키드 DNA 플라스미드, 올리고뉴클레오티드 (예컨대 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 RNA (siRNA), 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드)이다. 올리고뉴클레오티드 벡터를 포함하는 구체적 실시양태에서, 전달은 생체내 전기천공 (예를 들어, 문헌 [Chalberg et al., 2005] 참조) 또는 전자 사태 형질감염 (예를 들어, 문헌 [Chalberg et al. 2006] 참조)에 의해 달성될 수 있다. 추가 실시양태에서, 벡터는 수용성 중합체에서 임의로 캡슐화될 수 있는 덴드리머/DNA 복합체, DNA 압축 펩티드 (예를 들어, 문헌 [Farjo et al., 2006] 참조) (여기서 폴리에틸렌 글리콜과 커플링된 시스테인 잔기에 이어 30개의 리신을 함유하는 펩티드인 CK30이 광수용기로의 유전자 전달을 위해 사용됨), 세포 침투 특성을 갖는 펩티드 (안구 세포로의 펩티드 전달의 예에 대해서는, 문헌 [Johnson et al., 2007; Barnett et al., 2006; Cashman et al., 2003; Schorder et al., 2005; Kretz et al. 2003]을 참조함), 또는 DNA 캡슐화 리포플렉스, 폴리플렉스, 리포좀 또는 이뮤노리포좀 (예를 들어, 문헌 [Zhang et al. 2003; Zhu et al. 2002; Zhu et al. 2004] 참조)이다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아/폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV))로부터 유래된 벡터이다. 예를 들어, 문헌 [Howarth]을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원에 기재된 rAAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애 (예를 들어, AMD)를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 CFH를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 핵산 서열은 세포 내로 직접 도입되며, 여기서 핵산 서열은 그 결과로 생성되는 재조합 세포의 생체내 투여 전에, 코딩된 산물을 생산하도록 발현한다. 이것은 관련 기술분야에 공지된 수많은 방법 중 임의의 것, 예를 들어 전기천공, 리포펙션, 인산칼슘 매개 형질감염과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.
제약 조성물
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 임의로 제약상 허용되는 부형제 중의, 본원에 기재된 벡터 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 제약상 허용되는 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질이며, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 에멀션으로서, 또는 사용 전에 액체에서 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로서 공급될 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 제공하거나 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정제, 습윤 및 유화제, 다양한 삼투압을 위한 염, 캡슐화제, pH 완충 물질, 및 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 눈으로의 직접 전달에 적합한 임의의 의약품을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 소르비톨, 다양한 TWEEN 화합물 중 임의의 것, 및 액상물, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 그 내부에, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대 염산염, 브로민화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제에 대한 철저한 논의는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
일반적으로, 이러한 조성물은 안구 주사에 의한 투여를 위해 제형화된다. 따라서, 이러한 조성물은 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 식염수, 링거의 평형 염 용액 (pH 7.4) 등과 조합될 수 있다. 필수는 아니지만, 조성물은 임의로 정확한 양의 투여에 적합한 단위 투여 형태로 공급될 수 있다.
투여 방법
본 발명의 치료 방법에 따르면, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조성물의 투여는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 치료 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 전장 또는 말단절단된 CFH 단백질 (예를 들어, tCFH1)을 코딩하는 핵산)은 단독으로 (즉, 전달을 위한 벡터 없이) 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 투여는 안구 주사에 의한 것이다. 일부 실시양태에 따르면, 투여는 망막하 주사에 의한 것이다. 망막하 전달 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 WO 2009/105690을 참조한다. 일부 실시양태에 따르면, 조성물은 중심 망막 외부의 망막하 공간으로 직접 주사된다. 다른 실시양태에서, 투여는 안구내 주사, 유리체내 주사, 맥락막상 또는 정맥내 주사를 통해 이루어진다. 망막에 대한 벡터의 투여는 편측 또는 양측일 수 있으며, 전신 마취를 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다.
CFH를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조성물로 안구 세포 (예를 들어, RPE)를 안전하고 효과적으로 형질도입함으로써, 본 발명의 방법은 안구 장애 (예를 들어, AMD)가 있는 개체, 예를 들어 인간을 치료하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 형질도입된 세포는 안구 장애를 치료하기에 충분한 양으로 CFH를 생산한다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물은 동일한 절차 동안 또는 수일, 수주, 수개월 또는 수년 간격으로 한번 이상의 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조성물의 다수의 주사는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간 또는 24시간 이하의 간격이다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조성물의 다수의 주사는 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월 또는 그 초과의 간격이다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조성물의 다수의 주사는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 그 초과의 간격이다. 일부 실시양태에 따르면, 대상체를 치료하기 위해 다수의 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명의 치료 방법에 따르면, 전달된 벡터의 용적은 치료를 받는 대상체의 특징, 예컨대 대상체의 연령, 및 벡터가 전달될 부위의 용적에 근거하여 결정될 수 있다. 눈의 크기와 망막하 또는 안구 공간의 용적은 개인마다 상이하며 대상체의 연령에 따라 변할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 일부 실시양태에 따르면, 망막의 망막하 공간에 주사되는 조성물의 용적은 약 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, 5 μl, 6 μl, 7 μl, 8 μl, 9 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 50 μl, 75 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 600 μl, 700 μl, 800 μl, 900 μl, 또는 1 mL 중 어느 하나 초과, 또는 이들 사이의 임의의 양이다. 벡터가 망막하로 투여되는 실시양태에 따르면, 망막하 또는 안구 공간의 전체 또는 특정 백분율을 포괄하는 것을 목적으로, 또는 특정한 수의 벡터 게놈이 전달되도록 벡터 용적이 선택될 수 있다.
본 개시내용의 치료 방법에 따르면, 투여되는 벡터의 농도는 생산 방법에 따라 달라질 수 있으며, 특정한 투여 경로에 대해 치료상 유효한 것으로 결정된 농도에 근거하여 선택 또는 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 밀리리터당 벡터 게놈의 농도 (vg/ml)는 약 108 vg/ml, 약 109 vg/ml, 약 1010 vg/ml, 약 1011 vg/ml, 약 1012 vg/ml, 약 1013 vg/ml, 및 약 1014 vg/ml로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 그 사이의 임의의 양이다. 바람직한 실시양태에서, 농도는 약 0.05 mL, 약 0.1 mL, 약 0.2 mL, 약 0.4 mL, 약 0.6 mL, 약 0.8 mL, 및 약 1.0 mL의 용적 중의 망막하 주사 또는 유리체내 주사에 의해 전달되는 1010 vg/ml 내지 1013 vg/ml의 범위이다.
일부 실시양태에 따르면, 하나 이상의 부가의 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항혈관신생제 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)가 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 조성물의 유효성은 몇 가지 기준에 의해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법을 사용한 대상체의 치료 후, 본원에 기재된 것을 포함한 하나 이상의 임상적 파라미터에 의한 평가, 예를 들어 질환 상태의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선 및/또는 안정화 및/또는 진행 지연에 대한 평가가 대상체에 대해 이루어질 수 있다. 그러한 시험의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 주관적 (예를 들어, 보고된 대상) 측정 뿐만 아니라 객관적 측정도 포함한다. 예를 들어, 대상체의 시각 기능에 대한 치료의 유효성을 측정하기 위해, 하기 중 하나 이상이 평가될 수 있다: 대상체의 주관적인 시력 질, 대상체의 암순응, 대상체의 개선된 중심 시력 기능 (예를 들어, 유창하게 읽고 얼굴을 인식할 수 있는 대상체의 능력 개선), 대상체의 시각적 이동성 (예를 들어, 미로를 탐색하는 데 필요한 시간의 감소), 대상체의 시각적 예민성 (예를 들어, 대상체의 Log MAR 점수 개선), 미세시야계검사 (예를 들어, 대상체의 dB 점수 개선), 암순응 시야측정 (예를 들어, 대상체의 dB 점수 개선), 미세 매트릭스 매핑 (예를 들어, 대상체의 dB 점수 개선), 골드만 시야측정 (예를 들어, 암점 영역 (즉, 시력상실 영역)의 크기 감소 및 더 작은 표적을 해결할 수 있는 능력 개선), 깜박임 민감도 (예를 들어, 헤르츠의 개선), 자가형광 및 전기생리학 측정 (예를 들어, ERG 개선). 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 대상체의 암순응에 의해 측정된다. 암순응 시험은 간상 광수용기가 어둠 속에서 감도를 증가시킬 수 있는 능력을 결정하는 데 사용되는 시험이다. 이러한 시험은 간상 및 원추 시스템이 밝은 광원에 노출된 후 어두운 곳에서 감도를 회복하는 속도를 측정하는 것이다. 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 대상체의 시각적 이동성에 의해 측정된다. 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 대상체의 시력에 의해 측정된다. 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 미세시야계검사에 의해 측정된다. 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 암순응 시야측정에 의해 측정된다. 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 ERG에 의해 측정된다. 일부 실시양태에 따르면, 시각 기능은 대상체의 주관적인 시각 질에 의해 측정된다.
AMD의 시험관내 및 생체내 모델
인간 태아 RPE (hfRPE)의 1차 배양물은 천연 RPE의 기능과 대사 활성을 모델링하기 때문에 AMD 연구에서 유용한 도구인 것으로 나타났다 (Ablonczy et al., 2011. Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 52, 8614-8620). AMD 연구에 사용되는 다른 RPE 세포 유형은 줄기 세포로부터 유래된 RPE 및 불멸화 ARPE-19 세포주를 포함한다 (Dunn et al., 1996, Exp. Eye Res. 62, 155-170).
Cfh-/- 마우스 모델은 AMD를 연구하는 데 사용될 수 있는 생체내 모델이다. 보체 인자 H (CFH)는 C3b와 인자 B의 결합을 방지하고 C3 전환효소의 형성을 차단함으로써 대체 경로에서 중요한 조절 역할을 한다 (Pickering and Cook, 2008. Clin Exp Immunol. 2008 Feb; 151(2):210-30). CFH 기능의 결여는 대체 경로의 조절 장애로 이어져 C3의 낮은 전신 수준, 사구체 기저막에서의 C3의 침전, 및 궁극적으로는 막증식 사구체신염 (MPGN) 유형 II를 초래한다 (Pickering and Cook, 2008). 보체 인자 H가 결여되도록 유전적으로 조작된 마우스는 또한 AMD를 연상시키는 망막 이상 및 MPGN을 발생시킨다 (Coffey et al., 2007. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Oct 16; 104(42):16651-6; Pickering et al., 2002. Nat Genet. 2002 Aug; 31(4):424-8). 2세 때, 이들 동물은 수중 미로를 통해 측정된 바와 같은 시력 감소, 간상 구동 망막전위도 (ERG) a-파 및 b-파 반응의 감소, 망막하 자가형광 증가, 망막 내의 보체 침착, 및 광수용기 외부 세그먼트의 붕괴를 명확하게 보여주었다.
트랜스제닉 CFH Y402H 마우스 모델은 AMD를 연구하는 데 사용될 수 있는 생체내 모델이다. CFH 돌연변이가 AMD에 기여하는 메커니즘을 추가로 설명하기 위해, 인간 ApoE 프로모터의 제어 하에 Y402H 다형성을 발현하는 트랜스제닉 마우스 계통이 구축되었다 (Ufret-Vincenty et al., 2010. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Nov; 51(11):5878-87). 이러한 마우스 모델에서 AMD-유사 증상이 발생하려면 또한 고지방 식단을 필요로 한다. ApoE 유전자는 지질 수송을 위한 지단백질 형성에 중요한 아포지단백질 E를 코딩한다. 1세 때, 이들 동물은 야생형 마우스 또는 Cfh-/- 마우스에서 볼 수 있는 것보다 더 많은 수의 드루젠-유사 침착물을 명확하게 보여주었다. 면역조직화학은 망막하 공간에서 미세아교세포와 대식세포의 수의 증가를 밝혀내었고, 전자 현미경 검사는 브루크 막의 두꺼워짐과 C3d의 기저막 침착을 보여주었다.
VI. 키트
본원에 기재된 바와 같은 rAAV 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 방법 중 하나에 사용하기 위해 설계된 키트 내에 함유될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 키트는 (a) 본 개시내용의 벡터 중 어느 하나, 및 (b) 그의 사용 지침을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 벡터는 상기 기재된 바와 같은 비-바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아/폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV))로부터 유래된 벡터이다. 바람직한 실시양태에 따르면, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
일부 실시양태에 따르면, 키트는 사용 지침을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 키트는 본원에 기재된 rAAV 벡터의 조성물의 안구 전달 (예를 들어, 안구내 주사, 유리체내 주사, 맥락막상, 또는 정맥내 주사)을 위한 장치를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 사용 지침은 본원에 기재된 방법 중 하나에 따른 지침을 포함한다. 키트와 함께 제공된 지침은, 예를 들어 안구 질환 또는 장애 (예를 들어, AMD)를 치료하기 위해 치료 목적으로 벡터를 투여할 수 있는 방법을 설명할 수 있다. 키트가 치료 목적으로 사용되어야 하는 일부 실시양태에 따르면, 지침은 권장 투여량 및 투여 경로에 관한 세부사항을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 키트는 완충제 및/또는 제약상 허용되는 부형제를 추가로 함유한다. 부가의 성분, 예를 들어 보존제, 완충제, 강장제, 항산화제 및 안정제, 비이온성 습윤제 또는 정화제, 점도 증가제 등이 또한 사용될 수 있다. 본원에 기재된 키트는 단일 단위 용량 또는 다중 용량 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 내용물은 일반적으로 멸균 및 실질적으로 등장성 용액으로서 제형화된다.
본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 본원에 보고된 단백질, 효소, 벡터, 숙주 세포 및 방법론을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 법률에 의해 허용된 범위를 참조하여 본원에 포함된다. 그러나, 본원의 어떠한 것도, 본 개시내용이 선행 개시내용에 의해서 상기 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 도면 뿐만 아니라 본 출원 전체에서 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 그 전체가 본원에 명시적으로 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. 구축물 설계 및 클로닝
CFH는 다른 단백질에 대한 결합 부위로서 제공되는 20개의 CCP로 구성된다. 자연 발생 말단절단된 CFH "FHL-1"에 의해 입증된 바와 같이, 처음 7개의 CCP는 보체 조절에 중요한 것으로 공지되어 있다. 이러한 말단절단된 형태의 CFH (서열식별번호: 7로서 표시됨)는 처음 7개의 CCP로 구성되며, 보체 조절인자로서의 일부 기능을 유지한다. 따라서, 본 발명자들은 공지된 기능이 없는 CCP 또는 중복 결합 부위가 있는 CCP를 제거함으로써 CFH를 말단절단하는 것을 목표로 하였다. 기능에 중요한 것으로 공지된 CCP가 기능 제어의 손실로서 작용하도록 결실되는 "개념 증명"을 위해 2개의 부가의 말단절단된 구축물이 생성되었다.
CBA 프로모터는 다수의 세포 유형에 걸쳐 GOI 발현을 구동할 수 있는 널리 사용되는 강력한 프로모터이다. CBA 프로모터의 단점은 크기가 크다는 것이다. 본 연구에서는, AAV 벡터 구축물의 공간을 절약하기 위해 CBA 프로모터의 말단절단된 버전을 시험하고 사용하였다.
CBA 프로모터는 CMV ie 인핸서, 코어 닭 β-액틴 프로모터, 짧은 엑손 및 긴 인트론으로 이루어진다. CMV ie 인핸서 및 인트론은 전체 프로모터의 가장 큰 세그먼트이며 프로모터 기능에 중요하지 않으며, 대신 인핸서 요소로서 작용한다. 따라서, 목표는 CMV ie 인핸서 및 인트론의 일부분을 결실시킴으로써 프로모터를 말단절단하는 것이었다. 또한, 이전에 생성된 작은 CBA 프로모터 (smCBA)를 평가하고 구축물에 포함시켰다.
pTR - CBA - flCFH : pTR-CBA-flCFH 구축물을 생성하기 위해, flCFH 단편을 NotI 소화에 의해 pUC57-flCFH로부터 절제한 후 pTR-CBA-flCFH를 생성하였다.
pTR - CBA - FHL -1: pTR-CB-flCFH 구축에 대한 것과 동일한 클로닝 전략이 pTR-CB-FHL-1 플라스미드 클로닝에 사용되었다. FHL-1 cDNA 서열 (NCBI CCDS ID: 53452.1) 플러스 양 말단에서의 적절한 클로닝 부위 (NotI)를 합성하여 pTR-CBA_FHL-1을 생성하였다.
pTR - smCBA - flCFH : pTR-CBA-flCFH 내의 전체 CBA 프로모터를 smCBA 프로모터로 대체함으로써 pTR-smCBA-flCFH를 구축하였다. 전장 CBA 및 smCBA 둘 다는 모 플라스미드로부터 절제될 수 있다.
pTR - smCBA - tCFH1 : 말단절단된 CFH 유전자 "tCFH1"은 PCR 증폭을 통해 생성되고, 이후 pTR-smCBA 백본으로 클로닝된다. 라이게이션을 위한 특이적 제한 부위에 의해 플랭킹된 2개의 PCR 단편 (하나는 CCP 1 내지 15를 함유하고, 다른 하나는 CCP 18 내지 20을 함유함)이 생성되며, 이를 XhoI/KpnI 또는 KpnI/NotI로 소화시킨 다음, pTR-smCBA 백본에 연결하였다. 서열식별번호: 2는 tCFH1의 핵산 서열을 나타낸다.
pTR - smCBA - tCFH2 : 말단절단된 CFH 유전자 "tCFH2"는 PCR 증폭을 통해 생성되었고, 이후 pTR-smCBA 백본으로 클로닝되었다. 2개의 PCR 단편 (하나는 CCP 1 내지 4를 함유하고, 다른 하나는 CCP 18 내지 20을 함유함)이 생성되고, 이를 XhoI/KpnI 또는 KpnI/NotI로 소화시킨 다음, 3-조각 라이게이션을 통해 pTR-smCBA 백본에 연결되었다. 서열식별번호: 3은 tCFH2의 핵산 서열을 나타낸다.
pTR - smCBA - tCFH3 : 말단절단된 CFH 유전자 "tCFH3"는 PCR 증폭을 통해 생성되었고, 이후 pTR-smCBA 백본으로 클로닝되었다. 2개의 PCR 단편 (하나는 CCP 1 내지 9를 함유하고, 다른 하나는 CCP 16 내지 20을 함유함)이 생성되고, 이를 XhoI/KpnI 또는 KpnI/NotI로 소화시킨 다음, 3-조각 라이게이션을 통해 pTR-smCBA 백본에 연결되었다. 서열식별번호: 4는 tCFH3의 핵산 서열을 나타낸다.
pTR - smCBA - tCFH4 : 말단절단된 CFH 유전자 "tCFH4"는 PCR 증폭을 통해 생성되었고, 이후 pTR-smCBA 백본으로 클로닝되었다. 2개의 PCR 단편 (하나는 CCP 1 내지 7을 함유하고, 다른 하나는 CCP 18 내지 20을 함유함)이 생성되고, 이를 XhoI/KpnI 또는 KpnI/NotI로 소화시킨 다음, 3-조각 라이게이션을 통해 pTR-smCBA 백본에 연결되었다. 서열식별번호: 5는 tCFH4의 핵산 서열을 나타낸다.
도 1a는 전장 인간 CFH (3696 bp)의 20개 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 나타낸 개략도이다. CCP 모듈은 타원형으로 표시된다. 일부 CCP는 표시된 바와 같이 다른 단백질에 대한 결합 부위를 확인하였다. 구축물 pTR-CBA-flCFH는 전장 인간 CFH를 포함한다. AMD에 대한 고위험 다형성 Y402H는 자연 발생 변이체 FHL-1에도 함유된 CCP 7에 위치해 있다.
도 1b는 다양한 CCP가 결실되도록 조작된 CFH 구축물을 나타낸 개략도이다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH1은 CCP 16-17이 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH2는 CCP 5-17이 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH3은 CCP 10-15가 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-smCBA-tCFH4는 CCP 8-17이 결실된 전장 인간 CFH를 포함한다. 구축물 pTR-CBA-FHL-1은 자연 발생 변이체 FHL-1을 포함한다. tCFH2와 tCFH4의 두 구축물은 보체 캐스케이드 활성에 중요한 것으로 공지된 CCP를 결실하도록 조작되었다.
실시예 2. rAAV 생산
재조합 AAV 벡터는 앞서 기재된 바와 같이 인간 배아 신장 암종 293 세포 (HEK-293)의 형질감염에 의해 생산되었다 (Xiao et al. (1998) J. Virol. 72:2224-2232). 트랜스진은 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 CBA 프로모터의 짧은 버전 (SmCBA)의 제어 하에 있었다. 바이러스는 형질감염 후 68 내지 76시간에 수집되었으며 아이오딕사놀 (IOD) 구배 초원심분리를 사용하여 2회 정제되었다. 정제 후, 바이러스는 분자량 컷 오프 필터를 사용하여 BSST (0.014% 트윈 20을 포함하는 알콘 균형 염 용액)에서 농축 및 제형화되었다.
실시예 3. 시험관내 연구
먼저, CFH 변이체로 형질감염된 HEK293 세포를 사용하여 실험을 수행하였다. ELISA 검정을 수행하여 배지 중의 CFH 농도 (ng/ml)를 결정하였다. 도 2는 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 플라스미드 형질감염 후 CFH 변이체의 발현을 나타내는 그래프이다. HEK293 세포는 조작된 CFH 변이체를 함유하는 플라스미드 (도 1a에 나타난 바와 같은 pTR-CFH 변이체)로 형질감염되었다. 세포성 용해물은 형질감염 후 48시간에 채취되었고 검정될 때까지 -80℃에서 저장되었다. CFH 농도 (ng/ml)는 용해물에서 결정되었다.
CFH 변이체에 의한 인간 보체 성분 C3b (C3b)의 절단을 결정하기 위해 세포 용해물을 사용하여 절단 검정을 수행하였다. 도 3은 CFH 변이체에 의한 인간 C3b의 절단을 검정하기 위한 항-C3/C3b 항체 [압캠(Abcam), cat# 129945]를 사용한 웨스턴 블롯의 결과를 보여준다. 도 2에 기재된 바와 같이 HEK293 세포는 플라스미드로 형질감염되었고 수집된 샘플은 저장되었다. 도 3은 smCBA-tCFH1 레인 (레인 6, 박스 내에 제시됨)에서 효율적인 절단이 관찰되었음을 보여준다. CFH 변이체 smCBA-tCFH2 및 smCBA-tCFH4에 의한 절단은 없거나 낮았다. 세포 상청액에도 동일한 절차를 수행할 수 있으며, 유사한 예상 결과를 얻을 수 있다.
이들 결과에 기초하여, AAV 생산을 위해 하기 CFH 변이체가 선택되었다: 1) pTR-smCBA-flCFH; 2) pTR-smCBA-tCFH1; 3) pTR-CBA-tCFH3; 4) pTR-CBA-FHL-1.
다음으로, HEK293 세포의 rAAV-CFH 감염이 수행되었다. ELISA 검정을 사용하여 배지 중의 CFH 농도 (ng/ml)를 측정하였다. 도 4는 1 x 104 vg의 감염 다중도 (MOI)로 HEK293 세포의 rAAV 감염 후 CFH 변이체의 발현을 나타내는 그래프이다. 샘플은 감염 후 72시간 후에 수집되었으며, 배지 중의 CFH 농도 (ng/ml)를 결정하였다. 그래프에 나타난 바와 같이, HEK293 세포의 rAAV-CFH 감염 후 72시간에 조작된 CFH 구축물의 강력한 발현이 있었다.
rAAV 발현된 CFH 변이체에 의한 인간 보체 성분 C3b (C3b)의 절단을 결정하기 위해 세포 용해물로 검정을 수행하였다. 그 결과가 도 5에 나타나 있다. 도 5에 나타난 바와 같이, C3b의 절단은 FHL-1에 의해 가장 효율적이었으며, tCFH1 및 flCFH가 그 뒤를 이었다.
실시예 4. 용혈 실험
본 연구의 목적은 토끼 적혈구에서 용해를 유도할 수 있고 양 적혈구에서 용해를 억제할 수 있는 각각의 구축물의 능력을 평가함으로써 시험관 내에서 rAAV-CFH 변이체의 기능성을 평가하는 것이었다.
보체 인자 H (CFH) 단백질은 20개의 보체 제어 단백질 (CCP)로 구성되어 있으며, 각각은 대체 보체 경로 활성화에서 중요한 기능을 수행한다. CCP 1-4는 유체상에서의 C3b 결합 (C3b에서 iC3b로의 절단)에 중요한 반면, CCP 19-20은 C3b과 결합하는 것 외에도 자기-표면에서 발견되는 글리코사미노글리칸 (GAG) 및 시알산 (SA)과 결합한다 (Kerr et al., J. Biol. Chem. 2017; 292(32):13345-13360). 모든 CCP가 외래 표면에서 보체 활성화를 달성하고 자기-표면에서 보체 억제를 달성하기 위해 협력 방식으로 작동하지만, 중요한 CCP의 부재는 생물학적 환경에서 CFH 단백질의 주요 기능을 억제할 수 있다.
CFH 변이체는 야생형 CFH로부터 CCP (도 1a에 나타낸 바와 같음)의 결실을 수반하기 때문에, 용혈 검정에서 이를 시험하는 것은 CFH의 유체상 활성 및 막 결합 활성과 같은 주요 기능에 중요한 CCP를 결정하는 데 도움이 된다.
CFH는 혈청 내 대체 보체 경로의 시험관내 활성화에 중요한 역할을 한다. 적혈구 (RBC)는 이러한 보체 활성화에 민감하여 헤모글로빈을 용해하고 방출하게 한다. 따라서, RBC의 용해는 실험용 희석제를 적색으로 변하게 하고, 방출되는 헤모글로빈의 양에 상응하는 적색의 강도는 415 nm에서 광도측정법으로 측정할 수 있다.
대체 보체 조절 단백질, 예컨대 CFH는 비-자기로부터 자기를 인식하는 역할을 한다. 인간 조절 단백질을 발현하지 않는 외래 병원체는 대체 경로 (AP)에 의해 인식되고 파괴된다. 인자 B, 인자 D 및 프로페르딘 단백질은 대체 보체 시스템에 독특하다. AP 경로는 단백질에서의 입체형태적 변화를 자발적으로 생성하는 C3의 "공회전"을 통해 자가 활성화가 가능하다. 이러한 변형된 C3는 인자 B와 결합하여 그의 입체형태 변화를 유도할 수 있다. 변형된 인자 B는 활성 혈청 프로테아제 인자 D에 의해 절단되어 Ba 및 Bb를 생성한다. Bb 단백질은 부가의 C3 분자를 절단하여 C3b를 생성할 수 있는 복합체와 연합되어 있다. C3b는 인자 B와 연합하여 더 많은 C3-전환효소 (C3bBb)를 생성한다. 전술한 단계는 단백질: 단백질 상호 작용을 안정화시키는 역할을 하는, 혈청 단백질 프로페르딘에 의해 증진된다. 따라서, AP는 C3b가 인자 B와 결합할 때 증폭 루프로서 개시될 수 있다 (Thurman et al., J Immunol 2006; 176(3):1305-1310). 따라서, 유리 인자 B의 부재는 보체 경로의 지속적인 활성화를 나타낸다.
AP 경로는 자발적으로 활성화될 수 있으므로, 시스템의 지속적인 제어가 필요하다. CFH는 활성 AP 억제제이며 C3b에 결합하여 이를 불활성 C3b 또는 iC3b로 전환시켜 AP 루프의 증폭을 방지함으로써 기능한다. 따라서, C3bBb 전환효소는 형성되지 않고 혈청에 유리 인자 B를 남긴다.
혈청을 RBC에 부가하면 C3의 활성화와 AP 루프의 증폭이 일어나며, 이는 혈청에 제어 단백질, 예컨대 CFH가 결여될 때 조절 없이 진행된다. 토끼 RBC 막은 C3b와 효율적으로 결합하며, 막에 시알산 잔기가 결여되기 때문에 조절 단백질의 불활성화에 저항하는 것으로 나타났다 (Fearon et al., J Exp Med 1977; 146(1): 22-33). C3의 자발적 유체 상 활성화는 유리 인자 B를 전부 사용하여 CFH-고갈된 혈청에서 CFH에 의한 조절 없이 발생한다. 유리 인자 B의 부재로 인해, AP 루프가 지속적으로 증폭되지 않으므로 C3b가 형성되지 않는다. CFH에 대해 고갈된 인간의 혈청은 C3 옵소닌화를 보이지 않는 것으로 나타났다. CFH-고갈된 혈청을 생리적 수준으로 재구성한 결과, C3 옵소닌화가 나타났다 (van der maten et al., JID 2016; 213:1820-1827). CFH-고갈된 혈청이 CFH와 함께 토끼 RBC에 부가되면, AP 활성화는 RBC 막에 C3b 침착을 유도하고 AP 진행은 RBC의 용해를 유발하는 막 공격 복합체 (MAC) 형성을 야기한다. CFH의 농도를 증가시킴으로써 용해를 유도하는 것은 415 nm에서 광도측정법으로 측정된다. 혈청 내 CFH가 생리학적 수준으로 회복되면 100% 용해가 관찰된다.
정상적인 인간 혈청은 생리학적 수준의 CFH를 함유한다. 따라서, C3 활성화는 CFH의 조절 하에 진행된다. 항체 감작된 양 적혈구에 정상 인간 혈청이 부가되면, C3b는 양 RBC 막의 AP와 결합하고 이를 활성화시킨다. 양 RBC는 CFH의 C-말단과 결합할 수 있는 시알산이 풍부한 표면을 가지고 있다 (Yoshida et al., PLoS One 2015; 10(5): 1-21). 따라서, CFH가 반응에 부가되면, 이는 양 RBC 막과 결합하여 C3 증폭 루프를 효율적으로 차단한다. 그 결과, 양 RBC의 용혈이 억제된다.
양 및 토끼 RBC는 CFH의 상이한 기능을 평가하는 데 도움이 된다. 양 RBC의 용혈은 CCP 19-20에 의해 조정되는 CFH의 막 결합 활성에 빛을 비춰준다. 토끼 RBC의 용혈은 주로 CCP 1-4에 의해 조정되는 CFH의 유동 상 활성에 빛을 비춰준다. 본원에 기재된 CFH 변이체는 기능성을 평가하기 위해 양 및 토끼 RBC 모두에서 시험되었다.
검정 조건은 하기와 같다:
Figure pct00016
MgEGTA, 혈청 및 CFH 단백질 (정제된, 형질감염 또는 감염 상청액)을 함유하는 완충액과 RBC를 혼합함으로써 반응물을 준비하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. MgEGTA는 선택적 및 증진된 AP 활성화에 중요하다 (des Prez et al., Infection and Immunity 1975; 11(6):1235-1243). RBC를 원심분리하고 각각의 반응물에 대해 상청액 415 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다. 반응은 이중으로 수행되었다.
HEK293T 세포를 CFH 플라스미드 변이체로 형질감염시키고 상청액을 형질감염 후 72시간에 채취하였다. CFH 수준은 용혈 검정 전에 상청액에서 측정되었다.
HEK293T 세포를 rAAV-CFH 변이체로 감염시키고 상청액을 감염 후 72시간에 채취하였다. CFH 수준은 용혈 검정 전에 상청액에서 측정되었다.
그 결과가 도 13에 나타나 있다. 도 13에 나타난 바와 같이, rAAV-CFH 변이체는 토끼 RBCs에 대한 용해 촉진 기능을 가지고 있었다. 그래프의 최상단의 막대는 토끼 RBC에서 CFH에 의해 유도된 용해 수준을 나타낸다. 용해 수준이 측정되고 그래프에 플롯되었다. 야생형 CFH의 기능성은 HA 태그가 있는 경우 및 없는 경우의 tCFH1과 거의 동등한 수준이다. 이는 말단절단된 tCFH1이 분비 기능에 중요한 모든 CCP 영역으로 이루어지고 있음을 나타낸다. HA 태그는 tCFH1 기능성을 교란시키지 않는다. FHL1 및 tCFH3 기능성은 CFH 구축물의 동일한 분비 기능을 측정하는 절단 검정과 비교할 때 상대적으로 낮다. 절단 검정은 반응에서 < 1 ng의 C3b를 사용하며 혈청 내 AP 경로의 복잡성을 모방하지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 이들 두 시험관내 검정에서 FHL1 및 tCFH3의 활성의 불일치를 관찰한다. 또한 도 13에 나타난 바와 같이, rAAV-CFH 변이체는 양 RBC에서 CFH의 보호 기능을 가지고 있다. 그래프 최하단의 막대는 양 RBC에서 CFH에 의해 발휘되는 보호 기능의 수준을 나타낸다. 대조군 혈청은 용해에 대항하여 높은 정도의 보호를 나타내지 않는 고유한 CFH 수준을 가지고 있다. 그러나, 반응에 공급된 CFH 구축물은 양 적혈구와 결합하고 AP 경로를 차단할 수 있으므로, 감소된 OD415 nm 판독값으로서 반영되는 RBC의 파열을 억제할 수 있다. FHL1에 의한 용해 활성의 감소는 CCP 19-20이 막 결합 활성에 중요하다는 것을 보여준다. 이는 FHL-1을 개념 제어의 좋은 증거로 만든다. 야생형 CFH의 기능성은 HA 태그가 있는 경우 및 없는 경우 tCFH1과 거의 동등한 수준이다. 이는 말단절단된 tCFH1이 막 결합 기능성 뿐만 아니라 분비 기능성에 중요한 모든 CCP 영역으로 이루어진다는 것을 나타낸다. HA 태그는 tCFH1 기능성을 교란시키지 않는다. CCP 10-15는 또한 CFH의 C3b 결합 활성에 있어서 일정 역할을 하는 것으로 나타났다. 이러한 기능성은 또한 CFH의 용혈 활성에 기여한다. 이것은 양 RBC를 용해로부터 보호하는 데 있어 tCFH3의 기능성이 감소했다는 것을 설명해 준다.
실시예 5. cfh -/- 마우스에서 FHL -1 및 tCFH1 구축물에 대한 생체내 시험
AAV-FHL-1 벡터 및 AAV-tCFH1의 활성을 CFH 결핍 (cfh-/-) 마우스에서 측정하였다. 마우스의 한쪽 눈에 1.012, 1.011 및 1.010 vg/mL의 AAV-FHL-1 또는 1.012 vg/mL의 AAV-tCFH1을 망막하로 투여하였다. 8주 후, 마우스는 제거되었고 눈은 CFH 발현을 위해 분석되었다. 1.010 vg/mL을 투여한 눈을 제외한 대부분의 눈은 CFH 발현에 대해 양성이었다 (용량 반응이 검출되었음). AAV-tCFH1을 투여한 대부분의 눈은 발현 수준에 더하여 FB 고정을 나타냈으나, FHL-1에 대해 양성인 눈은 그렇지 않았다.
도 6은 망막하 (SubR) 주사 후 cfh-/- 마우스에서 tCFH1 또는 FHL-1의 발현을 나타내는 표이다. CFH 변이체 FHL-1 및 tCFH1 둘 다는 cfh-/- 마우스에서 rAAV 벡터의 망막하 투약 후에 발현된다. 표의 결과에 나타난 바와 같이, FHL-1 발현에서의 용량 반응이 관찰되었다. 일부 동물은 FHL-1 또는 tCFH1의 발현에 대해 음성이었으며, 이는 실패한 주사에 기인한 것일 수 있다. RPE/맥락막에서의 tCFH1 또는 FHL-1의 발현 수준은 신경 망막에서의 수준보다 더 높은 것으로 밝혀졌다.
도 7a 및 도 7b는 tCFH1 변이체에 의한 보체 고정 (인자 B (FB)의 검출)을 결정하기 위한 웨스턴 블롯의 결과를 보여준다. 도 7a는 tCFH1 주사된 cfh-/- 마우스에서의 인자 B 고정을 나타낸다. 도 7b는 tCFH1 및 FHL-1 발현을 나타낸다. 도 7a 및 7b에 나타난 결과는 rAAV-tCFH1 망막하 주사에 의해 유도된 tCFH1 발현이 RPE/맥락막에서 인자 B (FB)를 고정시킬 수 있다는 것을 보여준다. CFH 변이체 FHL-1은 FB 고정을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 rAAV에 의해 발현되는 tCFH1의 생물학적 기능성을 뒷받침하며, AAV 발현된 CFH 변이체가 보체 고정을 보여주는 것은 처음이다.
실시예 6. cfh -/- 마우스에서의 tCFH1 구축물 용량 범위 발견 연구
고용량, 중간 용량 및 저용량에서 AAV-tCFH1의 활성이 CFH 결핍 (cfh-/-) 마우스에서 측정되었다. 하기 표는 연구의 세부사항을 나타낸다:
Figure pct00017
망막전위도 (ERG)는 빛 자극에 대한 반응으로 망막의 전기적 활성을 측정하는 진단 검사이다. ERG의 b 파장은 양극상 세포의 활성화를 반영하는 것으로 널리 여겨지고 있다. 종료에 앞서, 비히클 및 중간 용량 rAAV2tYF-smCBA-tCFH1 마우스에 대한 암순응 b-파장 ERG를 측정하였다. BMAX1은 암순응 ERG의 간상체 우성 성분이며 BMAX2는 암순응 ERG의 원추형 우성 성분이다. 도 8a는 비히클을 투여한 마우스에서의 결과를 나타낸다. 도 8b는 tCFH1 중간 용량을 투여한 마우스의 결과를 나타낸다. 주입된 모든 눈에서 ERG의 일부 감소가 관찰되었으며, 이는 수술 절차에 기인한다. 중간 용량 및 저용량 군에서의 최소 감소는 벡터 안전성을 보여준다. 고용량 군에서 보다 광범위한 감소가 나타났으며, 이는 고용량에서의 일부 벡터 독성을 나타낸다.
광간섭 단층촬영 (OCT)을 사용하여 종료 전에 왼쪽 눈 (주입됨) 및 오른쪽 눈 (비주입됨)으로부터의 안구 조직의 생체내 횡단면 영상을 생성하였다. 군 1-6 각각에 대한 결과가 도 9에 나타나 있다. 도 9에 나타난 바와 같이, 수술 절차와 관련된 모든 주입된 눈에서 일부 외부 핵층 (ONL)의 얇아짐이 관찰되었다. 주입된 영역을 벗어난 더 광범위한 ONL 얇아짐이 고용량 군에서 관찰되었으며, 이는 고용량에서의 일부 벡터 독성을 나타낸다. 비주입된 눈에서는 ONL에서의 변화가 관찰되지 않았다. 종료 후 눈에 대한 조직학적 검사를 수행하였으며, 군 1-6 각각에 대한 왼쪽 눈 (주입됨) 및 오른쪽 눈 (비주입됨) 상의 안구 조직으로부터의 대표적인 조직학적 영상이 도 10에 나타나 있다. 주입된 모든 눈에서 일부 광수용기 층의 얇아짐 및 면역 세포의 침윤을 볼 수 있었으며, 이는 수술 절차와 관련이 있었다. 그러나, 도 10에 나타난 바와 같이, 고용량 군에서 보다 광범위한 광수용기 층 얇아짐 및 면역 세포 침윤이 관찰되었으며, 이는 고용량에서의 일부 벡터 독성을 나타낸다. 비주입된 눈에서는 아무런 변화도 관찰되지 않았다.
폐쇄띠-1 (ZO-1)은 세포간 접합의 주요 구조 단백질이다. 다음으로, ZO-1 염색을 수행하여 망막 색소 상피 (RPE) 이형증을 평가했으며, 이는 군 1-6 각각에서의 RPE 스트레스를 나타낸다. 비주입된 눈이 대조군으로서 사용되었다. 각각의 군 및 대조군으로부터 수득된 RPE 시트의 플랫마운트를 ZO-1 및 훽스트(Hoechst) (핵)에 대해 염색하고 공초점 현미경으로 영상을 촬영하였다. 일부 세포 분열 및 면역 세포가 주입된 모든 눈에서 관찰되었으며, 이는 수술 절차와 관련이 있었다 (도시되지 않음). 비주입된 눈에서는, RPE 형태가 망막 전체에 걸쳐 균일한 크기의 세포의 정육각형 어레이와 유사하였다. 그러나, 고용량 군에서는 더 광범위한 세포 분열 및 면역 세포가 관찰되었고, 따라서 이는 고용량에서의 일부 벡터 독성을 나타낸다 (도시되지 않음).
저용량, 중간 용량 및 고용량의 tCFH1 변이체를 주사한 cfh-/- 마우스에서의 tCFH 단백질 발현이 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 도 11에 나타난 바와 같이, tCFH 단백질 발현에서 용량 반응이 관찰되었으며, 고용량 및 중간 용량에서 상당한 수준의 tCFH1 발현이 관찰되었다. 저용량에서는 최소한의 tCFH1 발현이 관찰되었다. 정상 C57Bl6 마우스 및 정상 인간 CFH를 발현하는 트랜스제닉 마우스로부터의 망막 추출물이 양성 대조군으로서 사용되었다. ELISA는 또한 tCFH1 발현을 확인하는 데 사용되었다. ELISA 실험으로부터 수득된 결과는 tCFH 단백질 발현에서 용량 반응이 관찰된 웨스턴 블롯으로부터의 결과를 확인했으며, 고용량 및 중간 용량에서 상당한 수준의 tCFH1 발현이 관찰되었다. 저용량에서는 최소한의 tCFH1 발현이 관찰되었다. 하기 표는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 tCFH1 단백질 발현을 나타낸다.
Figure pct00018
보체 시스템은 내인성 조건하에 망막, RPE, 및 맥락막에서 활성이다. 인자 B (FB) 성분은 정상 망막에서 검출되었으며, 인자 B와 같은 여러 인간 보체 성분 및 조절인자에서의 유전적 변이는 모두 AMD의 발생과 상관관계가 있었다 (Gold B, et al. Nat Genet. 2006;38:458-62). 도 12는 다양한 용량의 tCFH1 변이체가 주사된 cfh-/- 마우스에서 인자 B (FB) 보체 고정 (FB의 검출)을 결정하기 위한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 도 12에 나타난 바와 같이, 용량 반응이 관찰되었으며, 더 높은 용량에서 tCFH1 발현과 FB 고정 간의 더 나은 상관관계가 있었다. 고용량 및 중간 용량에서는 FB 회복이 나타난 반면, 저용량에서는 FB 회복이 관찰되지 않았다.
실시예 7. CFH H402 마우스에서의 rAAV - CFH 벡터의 생체내 시험
본 연구의 목적은 CFH H402 마우스 (CFH-HH:cfh-/-)에서 rAAV-CFH 벡터의 효능을 평가하는 것이다.
보체 인자 H (CFH) 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)은 연령-관련 황반 변성 (AMD) 병인의 중요한 유전적 위험 인자로서 보고되었다. Y402H 다형성이 AMD 감수성에 대한 가장 높은 위험 인자인 것으로 밝혀졌다. cfh-/- 마우스 배경 (CFH-HH:cfh-/-)에서 전장 인간 CFH H402를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 rAAV-CFH 벡터의 효과를 시험한다. 마우스는 90주령이 되었고 고지방, 콜레스테롤이 풍부한 (HFC) 식단을 먹였다. 시력 상실, 망막 색소 상피 (RPE) 손상 증가 및 RPE-하 침착물 형성 증가를 포함한, AMD-유사 표현형이 관찰되었다.
rAAV-hCFH 벡터는 이러한 CFH-HH:cfh-/- 뮤린 모델에서 시험되며; ERG를 구제하고, RPE 이상형태증형성을 중지 또는 감소시키며, RPE-하 침착물 축적을 중지 또는 감소시키는 효능에 대해 평가된다.
연구 설계
rAAV-tCFH1은 시력 상실, 망막 색소 상피 (RPE) 손상 및 RPE-하 침착물 형성을 포함한 AMD-유사 병리학적 표현형의 억제에 대한 효능을 평가하기 위해 H402 마우스 모델 (HFC 식단이 제공되는 >90주령 CFH-HH:cfh-/- 마우스)에게 망막하 투여될 것이다. 한쪽 눈에만 주입될 것이다.
연구 설계의 표가 하기에 제시된다.
Figure pct00019
*면역조직화학
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태의 다수의 등가물을 일상적인 실험만을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> APPLIED GENETIC TECHNOLOGIES CORPORATION <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)VECTORS FOR THE TREATMENT OF AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION AND OTHER OCULAR DISEASES AND DISORDERS <130> 119561-01720 <140> <141> <150> 62/924,338 <151> 2019-10-22 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3696 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60 tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120 acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180 aatattataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240 cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300 ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360 ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420 tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480 gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540 ggctacaaga 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tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 2700 tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 2760 aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 2820 gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 2880 accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 2940 cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 3000 tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 3060 ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 3120 aattatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 3180 gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 3240 agatgcatcc gtgtcagctt taccctctga cctgcagggc atgcgcggcc gcgcggatcc 3300 agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 3360 atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 3420 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 3480 ggaggttttt tagtcgactg gggagagatc 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agaaatgcat 600 tgttcagacg atggtttttg gagtaaagag aaaccaaagt gtgtggaaat ttcatgcaaa 660 tccccagatg ttataaatgg atctcctata tctcagaaga ttatttataa ggagaatgaa 720 cgatttcaat ataaatgtaa catgggttat gaatacagtg aaagaggaga tgctgtatgc 780 actgaatctg gatggcgtcc gttgccttca tgtgaagaaa aatcatgtga taatccttat 840 attccaaatg gtgactactc acctttaagg attaaacaca gaactggaga tgaaatcacg 900 taccagtgta gaaatggttt ttatcctgca acccggggaa atacagcaaa atgcacaagt 960 actggctgga tacctgctcc gagatgtacc ttgaaacctt gtgattatcc agacattaaa 1020 catggaggtc tatatcatga gaatatgcgt agaccatact ttccagtagc tgtaggaaaa 1080 tattactcct attactgtga tgaacatttt gagactccgt caggaagtta ctgggatcac 1140 attcattgca cacaagatgg atggtcgcca gcagtaccat gcctcagaaa atgttatttt 1200 ccttatttgg aaaatggata taatcaaaat tacggaagaa agtttgtaca gggtaaatct 1260 atagacgttg cctgccatcc tggctacgct cttccaaaag cgcagaccac agttacatgt 1320 atggagaatg gctggtctcc tactcccaga tgcatccgtg tcaaaacatg ttccaaatca 1380 agtatagata ttgagaatgg gtttatttct gaatctcagt atacatatgc cttaaaagaa 1440 aaagcgaaat atcaatgcaa actaggatat gtaacagcag atggtgaaac atcaggatca 1500 attacatgtg ggaaagatgg atggtcagct caacccacgt gcattaaatc ttgtgatatc 1560 ccagtattta tgaatgccag aactaaaaat gacttcacat ggtttaagct gaatgacaca 1620 ttggactatg aatgccatga tggttatgaa agcaatactg gaagcaccac tggttccata 1680 gtgtgtggtt acaatggttg gtctgattta cccatatgtt atgaaagaga atgcgaactt 1740 cctaaaatag atgtacactt agttcctgat cgcaagaaag accagtataa agttggagag 1800 gtgttgaaat tctcctgcaa accaggattt acaatagttg gacctaattc cgttcagtgc 1860 taccactttg gattgtctcc tgacctccca atatgtaaag agcaagtaca atcatgtggt 1920 ccacctcctg aactcctcaa tgggaatgtt aaggaaaaaa cgaaagaaga atatggacac 1980 agtgaagtgg tggaatatta ttgcaatcct agatttctaa tgaagggacc taataaaatt 2040 caatgtgttg atggagagtg gacaacttta ccagtgtgta ttgtggagga gagtacctgt 2100 ggagatatac ctgaacttga acatggctgg gcccagcttt cttcccctcc ttattactat 2160 ggagattcag tggaattcaa ttgctcagaa tcatttacaa tgattggaca cagatcaatt 2220 acgtgtattc atggagtatg gacccaactt ccccagtgtg tggcaataga taaacttaag 2280 aagtgcaaat catcaaattt aattatactt gaggaacatt taaaaaacaa gaaggaattc 2340 gatcataatt ctaacataag gtacagatgt agaggaaaag aaggatggat acacacagtc 2400 tgcataaatg gaagatggga tccagaagtg aactgctcaa tggcacaaat acaattatgc 2460 ccacctccac ctcagattcc caattctcac aatatgacaa ccacactgaa ttatcgggat 2520 ggagaaaaag tatctgttct ttgccaagaa aattatctaa ttcaggaagg agaagaaatt 2580 acatgcaaag atggaagatg gcagtcaata ccactctgtg ttgaaaaaat tccatgttca 2640 caaccacctc agatagaaca cggaaccatt aattcatcca ggtcttcaca agaaagttat 2700 gcacatggga ctaaattgag ttatacttgt gagggtggtt tcaggatatc tgaagaaaat 2760 gaaacaacat gctacatggg aaaatggagt tctccacctc agtgtgaagg cacctcctgt 2820 gtgaatccgc ccacagtaca aaatgcttat atagtgtcga gacagatgag taaatatcca 2880 tctggtgaga gagtacgtta tcaatgtagg agcccttatg aaatgtttgg ggatgaagaa 2940 gtgatgtgtt taaatggaaa ctggacggaa ccacctcaat gcaaagattc tacaggaaaa 3000 tgtgggcccc ctccacctat tgacaatggg gacattactt cattcccgtt gtcagtatat 3060 gctccagctt catcagttga gtaccaatgc cagaacttgt atcaacttga gggtaacaag 3120 cgaataacat gtagaaatgg acaatggtca gaaccaccaa aatgcttaca tccgtgtgta 3180 atatcccgag aaattatgga aaattataac atagcattaa ggtggacagc caaacagaag 3240 ctttattcga gaacaggtga atcagttgaa tttgtgtgta aacggggata tcgtctttca 3300 tcacgttctc acacattgcg aacaacatgt tgggatggga aactggagta tccaacttgt 3360 gcaaaaagat ag 3372 <210> 9 <211> 1116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Arg Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Leu Gly Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala Tyr Ile 930 935 940 Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr 945 950 955 960 Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys 965 970 975 Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly 980 985 990 Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe 995 1000 1005 Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys 1010 1015 1020 Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg 1025 1030 1035 Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val 1040 1045 1050 Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp 1055 1060 1065 Thr Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu 1070 1075 1080 Phe Val Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr 1085 1090 1095 Leu Arg Thr Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys 1100 1105 1110 Ala Lys Arg 1115 <210> 10 <211> 1114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser 930 935 940 Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys 945 950 955 960 Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn 965 970 975 Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys 980 985 990 Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu 995 1000 1005 Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn 1010 1015 1020 Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly 1025 1030 1035 Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser 1040 1045 1050 Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala 1055 1060 1065 Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val 1070 1075 1080 Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg 1085 1090 1095 Thr Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys 1100 1105 1110 Arg

Claims (37)

  1. 말단절단된 보체 인자 H (CFH) 단백질을 코딩하는 핵산으로서, 여기서 말단절단된 CFH 단백질은 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20으로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 보체 제어 단백질 모듈 (CCP)을 포함하는 것인 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 핵산이 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP10, CCP11, CCP12, CCP13, CCP14, CCP15, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH1)을 코딩하는 것인 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 핵산.
  4. 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 핵산이 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH2)을 코딩하는 것인 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 서열식별번호: 3을 포함하는 핵산.
  7. 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 핵산이 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP8, CCP9, CCP16, CCP17, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH3)을 코딩하는 것인 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 서열식별번호: 4를 포함하는 핵산.
  10. 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  11. 제1항에 있어서, 핵산이 CCP1, CCP2, CCP3, CCP4, CCP5, CCP6, CCP7, CCP18, CCP19 및 CCP20을 포함하는 CFH 단백질 (tCFH4)을 코딩하는 것인 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 서열식별번호: 5를 포함하는 핵산.
  13. 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  14. 하기를 포함하는 트랜스진 발현 카세트:
    프로모터;
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산; 및
    최소 조절 요소.
  15. 제14항에 있어서, 핵산이 인간 핵산인 발현 카세트.
  16. 제14항 또는 제15항의 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 캡시드 서열의 혈청형이 AAV2인 벡터.
  20. 제18항에 있어서, 캡시드 서열이 돌연변이체 캡시드 서열인 벡터.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 포유류 세포.
  22. 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 제조하는 방법으로서, 아데노-연관 바이러스 벡터 내로 프로모터 및 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 핵산이 인간 핵산인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 캡시드 서열이 돌연변이체 캡시드 서열인 방법.
  26. 안구 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터를 투여하며, 이로써 상기 대상체에서 안구 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 안구 질환 또는 장애가 보체 경로의 활성화와 연관된 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 안구 질환 또는 장애가 망막 변성인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 망막 변성이 연령 관련 황반 변성 (AMD)인 방법.
  30. 제29항에 있어서, AMD가 습성 AMD인 방법.
  31. 제29항에 있어서, AMD가 건성 AMD인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 건성 AMD가 초기 내지 진행성 건성 AMD인 방법.
  33. 제26항에 있어서, 안구 질환 또는 장애가 지도형 위축 (GA)인 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 망막으로 투여되는 방법.
  35. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터를 개체의 망막에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 눈에 이종 핵산을 전달하는 방법.
  36. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터 및 사용 지침을 포함하는 키트.
  37. 제36항에 있어서, 벡터의 망막 전달을 위한 장치를 추가로 포함하는 키트.
KR1020227017063A 2019-10-22 2020-10-22 연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터 KR20230019062A (ko)

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