CN115175706A

CN115175706A - 用于治疗年龄相关性黄斑变性及其它眼部疾病和病症的腺伴随病毒(aav)载体

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Publication number: CN115175706A
Application number: CN202080089391.2A
Authority: CN
Inventors: M·希尔曼; A·蒂默斯; J·纽马克; S·彭诺克; R·穆雷利; C·宋; L·克耶斯
Original assignee: Applied Genetic Technologies Corp
Current assignee: Applied Genetic Technologies Corp
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2022-10-11
Also published as: AU2020371663A1; EP4048321A1; JP2022553309A; US20210123076A1; MX2022004770A; CA3158517A1; KR20230019062A; EP4048321A4; IL292379A; WO2021081203A1

Abstract

本发明提供了分离的启动子、转基因表达盒、载体、试剂盒和方法，其用于治疗年龄相关性黄斑生成和影响视网膜的视锥细胞的其它遗传疾病。

Description

用于治疗年龄相关性黄斑变性及其它眼部疾病和病症的腺伴随病毒(AAV)载体

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求于2019年10月22日提交的美国临时申请号62/924,338的利益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，所述序列已以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用以其整体并入。于2020年10月19日创建的所述ASCII副本命名为119561-01720_SL.txt，且大小为48,600字节。

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，包括用于在受试者或细胞中表达分离的多核苷酸的AAV载体。本公开内容还涉及核酸构建体、启动子、载体和包括多核苷酸的宿主细胞，以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物的方法，以及用于治疗或预防年龄相关性黄斑变性及其它眼部疾病和病症的方法。

背景技术

基因治疗旨在改善患者的临床后果，所述患者患有由基因表达谱中的异常引起的遗传突变或获得性疾病。基因治疗包括治疗或预防起因于缺陷基因或者异常调控或表达例如表达不足或过表达(其可以导致病症、疾病、恶性肿瘤等)的医学状况。例如，由缺陷基因引起的疾病或病症可以通过向患者递送校正性遗传材料进行治疗、预防或改善，或者可以通过例如用校正性遗传材料，使患者的缺陷基因改变或沉默进行治疗、预防或改善，导致遗传材料在患者内的治疗性表达。

基因疗法的基础是供应具有活性基因产物(有时称为转基因或治疗性核酸)的转录盒，例如，其可以导致正面的功能获得效应、负面的功能丧失效应或另一种后果。此类后果可以归于治疗性蛋白质例如抗体、功能性酶或融合蛋白的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性肿瘤。人单基因病症可以通过正常基因对靶细胞的递送和表达进行治疗。校正基因在患者的靶细胞中的递送和表达可以经由众多方法来进行，所述方法包括使用改造的病毒和病毒基因递送载体。

腺伴随病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)，且更具体而言构成依赖性细小病毒属。衍生自AAV的载体(即重组AAV (rAAV)或AAV载体)对于递送遗传材料是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)广泛多种非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减少对病毒感染的宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人中被视为非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组内的野生型AAV形成对比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因并且一般作为附加体持续存在，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其它载体系统相比，AAV载体一般被视为相对较弱的免疫原，并且因此并不触发显著的免疫应答(参见ii)，因此获得载体DNA的持久性和治疗性转基因的潜在地长期表达。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家的老年群体中的不可逆失明的主要原因，影响大约15%的60岁以上的个体。估计有6亿个体处于这个年龄人口中。AMD的患病率随着年龄而增加；轻度或早期形式在接近30%的75岁及以上的群体中出现，并且晚期形式在约7%中出现(Klein等人，Ophthalmol 1992；99(6):933-943；Vingerling等人，Ophthalmol 1995年2月；102(2):205-210；Vingerling等人，Epidemiol Rev. 1995；17(2):347-360)。AMD是在黄斑处的视网膜色素上皮(RPE)和光感受器的迟发性、慢性和进行性变性。临床上，AMD的特征在于中心视觉的进行性丧失，其可归于在黄斑(神经视网膜和下层组织的特殊区域)中出现的退行性变化。早期AMD的特征在于含有脂质和蛋白质的沉积物(玻璃疣)，与AMD发作相关的标志性眼部病变，其在RPE和玻璃膜之间出现。在这个阶段，除暗适应的变化以外，视觉功能通常受到最低程度的干扰。

最近的几项研究已报道了AMD与补体级联中的关键蛋白之间的相关。这些研究已揭示了在玻璃疣内，连同玻璃膜(由弹性蛋白和胶原组成的细胞外层，其将RPE和脉络膜分开)和上覆玻璃疣的RPE细胞内的终末途径补体组分(C5、C6、C7、C8和C9)和终末途径的激活特异性补体蛋白质片段(C3b、iC3b、C3dg和C5b-9)、以及各种补体途径调节剂和抑制剂(包括因子H、因子I、因子D、CD55和CD59) (Johnson等人，Exp Eye Res. 2000；70:441-449；Johnson等人，Exp. Eye Res. 2001；73:887-896；Mullins等人，FASEB J. 2000；14:835-846；Mullins等人，Eye 2001；15:390-395)。补体有关基因包括CFB、C2和C3中的突变已与AMD的风险因素增加相关。然而，CFH基因的多态性导致与AMD相联系的最大风险因素。例如，在CFH (替代途径补体级联C3转化酶的关键抑制剂)中的位置402处的酪氨酸至组氨酸的氨基酸转变，对于具有这种Y402H多态性的个体产生了AMD风险的接近六倍增加。

因子H (FH)是多功能蛋白质，其充当补体系统的关键调节剂(Zipfel，2001.Semin Thromb Hemost. 27:191-9)。因子H蛋白活性包括：(1)与C反应蛋白(CRP)结合，(2)与C3b结合，(3)与肝素结合，(4)与唾液酸结合；(5)与内皮细胞表面结合，(6)与细胞整联蛋白受体结合，(7)与病原体包括微生物结合，以及(8) C3b辅因子活性。因子H基因，称为HF1、CFH和HF，定位于人染色体1上的位置1q32处。1q32特定基因座含有许多补体途径相关基因。这些基因中的一组，称为补体激活调节剂(RCA)基因簇，含有编码因子H的基因、五种因子H有关基因(分别为FHR-1、FHR-2、FHR-3、FHR-4和FHR-5或CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)、以及编码凝血因子XIII的β亚基的基因。因子H和因子H有关基因几乎完全由短共有重复(SCR)组成。天然存在的截短形式的CFH，称为因子H样蛋白1 (FHL1)，起于CFH基因的可变剪接(Ripoche等人，Biochem J. 1988 Jan 15；249(2):593-602)。FHL1对于前七个补体控制蛋白(CCP)结构域与CFH相同，然后以独特的四氨基酸C末端终止。FHL1保留了所有必需的功能结构域，并且还经受Y402H多态性。先前的研究已证实了通过RPE细胞的FHL1表达((Hageman等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 17；102(20):7227-32；Weinberger等人，Ophthalmic Res. 2014；51 (2):59-66)。因子H和FHL1 (天然存在的截短变体形式的CFH)分别由SCR 1-20和1-7组成。

天然存在形式的因子H cDNA编码具有155 kDa的表观分子量，长度为1231个氨基酸的多肽。关于人因子H的cDNA和氨基酸序列数据在EMBL/GenBank数据库中的登录号Y00716.1下找到。天然存在的截短形式的人因子H在GenBank登录号X07523.1下找到。

目前，不存在用于干性AMD的证明的医学疗法，并且也没有可用于晚期干性AMD的治疗。兰帕珠单抗，针对补体因子D的选择性抑制剂，替代补体途径的激活和扩增中的限速酶(CFH活性的下游)，其功能障碍已与AMD的发病机制相联系，未能达到III期临床试验中的主要终点。

AAV是单链、无包膜的DNA病毒，其是细小病毒科的成员。AAV的不同血清型，包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6等，证实了不同的组织分布特征。这些AAV衣壳和衣壳变体的不同组织嗜性已致使基于AAV的载体能够广泛用于在体外和体内两者的广泛基因转移应用，用于肝、骨骼肌、脑、视网膜、心脏和脊髓(Wu，Z.等人(2006) Molecular Therapy，14: 316-327)。AAV载体可以介导视网膜中的长期基因表达并且引发最低限度的免疫应答，使得这些载体成为用于基因递送至眼的有吸引力的选择。然而，AAV的最佳包装容量为4.9-kb，而含有所有20种补体控制蛋白模块(CCP)的全长CFH cDNA的大小为3.69 kb。这对于基本调控序列如启动子、多聚腺苷酸化(SV40多聚A)信号和侧翼AAV反向末端重复(ITR)留下了有限的空间。

本公开内容解决了有效治疗或预防眼部疾病和病症，且特别是年龄相关性黄斑变性的需要，并且进一步解决了在AAV治疗中使用CFH基因的尺寸约束的挑战。

发明内容

CFH是大基因，当与所有必要元件组合时，其在历史上太大而无法用于AAV基因治疗中。本公开内容克服了这一挑战，并且描述了CFH cDNA的改造修饰，其保留了野生型CFH的生物学功能，同时将CFH表达盒装配在rAAV的包装容量(< 4.9 kb)内。本文所述的技术涉及通过来自重组腺伴随病毒(rAAV)载体的CFH表达，用于治疗或预防年龄相关性黄斑变性及其它眼部疾病和病症的方法和组合物。

在第一个方面，本公开内容提供了编码截短的补体因子H (CFH)蛋白的核酸，其中所述截短的CFH蛋白包含选自以下的5种或更多种补体控制蛋白模块(CCP)：CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。

根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQID NO: 1的核苷酸序列具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸编码CFH蛋白(tCFH1)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 1。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 1组成。

根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQID NO: 2的核苷酸序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性。根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 8的核苷酸序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性。根据一些实施方案，核酸编码CFH蛋白(tCFH1)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 2。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 2组成。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 8。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 8组成。

根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQID NO: 3的核苷酸序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性。根据一些实施方案，核酸编码CFH蛋白(tCFH2)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 3。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 3组成。

根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQID NO: 4的核苷酸序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性。根据一些实施方案，核酸编码CFH蛋白(tCFH3)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 4。根据一些实施方案，核酸由SEQID NO: 4组成。

根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQID NO: 5的核苷酸序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性。根据一些实施方案，核酸编码CFH蛋白(tCFH4)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 5。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 5组成。

根据一些方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列与SEQID NO: 6的核苷酸序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性。根据一些方面，本公开内容的特征在于由SEQ ID NO: 6的核苷酸序列组成的核酸。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 6组成。

根据一些方面，本公开内容提供了转基因表达盒，其包含启动子、本文任何一个方面和实施方案的核酸以及最小调控元件。根据一些实施方案，核酸是人核酸。根据一些实施方案，本公开内容提供了核酸载体，其包含本文任何方面或实施方案的表达盒。根据一些实施方案，载体是腺伴随病毒(AAV)载体。根据一些实施方案，所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据一些实施方案，衣壳序列的血清型是AAV2。根据一些实施方案，衣壳序列是突变型衣壳序列。

根据一些方面，本公开内容提供了哺乳动物细胞，其包含本文任何一个方面或实施方案的载体。

根据一些方面，本公开内容提供了制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，其包括将启动子和本文任何一个方面或实施方案的核酸插入腺伴随病毒载体内。根据一些实施方案，核酸是人核酸。根据一些实施方案，所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据一些实施方案，衣壳序列是突变型衣壳序列。

根据一些方面，本公开内容提供了治疗眼部疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文任何一个方面或实施方案的载体，从而治疗受试者中的眼部疾病或病症。根据一些实施方案，眼部疾病或病症与补体途径的激活相关。根据一些实施方案，眼部疾病或病症是视网膜变性。根据一些实施方案，视网膜变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)。根据一些实施方案，AMD是湿性AMD。根据一些实施方案，AMD是干性AMD。根据一些实施方案，干性AMD是晚期干性AMD。根据一些实施方案，本公开内容提供了预防眼部疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文任何一个方面或实施方案的载体，从而预防受试者中的眼部疾病或病症。根据一些实施方案，眼部疾病或病症与补体途径的激活相关。根据一些实施方案，眼部疾病或病症是视网膜变性。根据一些实施方案，视网膜变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)。根据一些实施方案，AMD是湿性AMD。根据一些实施方案，眼部疾病或病症是地图状萎缩(GA)。

根据一些实施方案，载体通过眼部递送途径进行施用。根据一些实施方案，载体是视网膜施用的。根据一些实施方案，载体是视网膜下施用的。根据一些实施方案，载体是脉络膜上施用的。根据一些实施方案，载体是玻璃体内施用的。

根据一些方面，本公开内容提供了用于将异源核酸递送至个体的眼的方法，其包括将本文任何一个方面和实施方案的载体施用于个体的眼，例如施用于个体的视网膜下。

根据一些方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含本文任何一个方面和实施方案的载体、以及使用说明书。根据一些实施方案，试剂盒进一步包括用于载体的眼部递送的装置。

附图说明

图1A是显示全长人CFH (3696bp)的20种补体控制蛋白模块(CCP)的示意图。CCP模块显示为椭圆形。如所示的，一些CCP具有关于其它蛋白质的鉴定的结合位点。构建体pTR-CBA-flCFH包含全长人CFH。关于AMD的高风险多态性Y402H定位于CCP 7中，其也包含在天然存在的变体FHL-1中。

图1B是显示CFH构建体的示意图，所述CFH构建体被改造为具有各种CCP缺失。构建体pTR-smCBA-tCFH1包含具有CCP 16-17缺失的全长人CFH。构建体pTR-smCBA-tCFH2包含具有CCP 5-17缺失的全长人CFH。构建体pTR-smCBA-tCFH3包含具有CCP 10-15缺失的全长人CFH。构建体pTR-smCBA-tCFH4包含具有CCP 8-17缺失的全长人CFH。构建体pTR-CBA-FHL-1包含天然存在的变体FHL-1。两种构建体tCFH2和tCFH4被改造为缺失已知对于补体级联活性重要的CCP。

图2是显示在人胚肾293 (HEK293)细胞的质粒转染之后，CFH变体的表达的图。HEK293细胞用含有改造的CFH变体(如图1A中所示的pTR-CFH变体)的质粒进行转染。条件培养基和细胞裂解物在转染之后48小时进行收集，并且贮存于-80℃下直至测定。确定裂解物中的CFH浓度(ng/ml)。

图3显示了用抗C3/C3b抗体测定人补体组分C3b (C3b)通过CFH变体的切割的蛋白质印迹结果。HEK293细胞被转染，并且细胞裂解物如图2中所述进行贮存。图3显示了在tCFH1泳道(泳道6，在方框中显示)中观察到有效切割。切割通过CFH变体smCBA-tCFH2和smCBA-tCFH4不存在或很低。

基于结果，选择下述CFH变体用于AAV生产：

1) pTR-smCBA-flCFH；2) pTR-smCBA-tCFH1；3) pTR-CBA-tCFH3；4) pTR-CBA-FHL-1。

图4是显示在HEK293细胞的AAV感染之后，CFH变体的表达的图。HEK293细胞以1 x10⁴的感染复数(MOI)进行感染。在感染后72小时收集培养基，并且确定培养基中的CFH浓度(ng/ml)。如图中所示的，在HEK293细胞的AAV-CFH感染之后72小时，存在改造的CFH构建体的稳固表达。

图5显示了如图4中所述的，如在AAV感染后72小时在细胞培养基中检测到的，用抗C3/C3b抗体测定C3b通过CFH变体的切割的蛋白质印迹结果。如图5中所示，C3b的切割在FHL-1的情况下是最有效的，随后为tCFH1和flCFH。值得注意的是，在泳道18 (FBS)中观察到背景水平的C3b切割伪影；该伪影不存在于泳道17 (DMEM/FBS)中。

图6是显示在视网膜下(SubR)注射后，在cfh-/-小鼠中的tCFH1或FHL-1表达的表。两种CFH变体FHL-1和tCFH1均在cfh-/-小鼠中的rAAV载体的视网膜下给药之后表达。如表中的结果显示的，观察到FHL-1表达的剂量应答。一些动物对于FHL-1或tCFH1的表达呈阴性，这可能是由于注射不成功。发现RPE/脉络膜中的tCFH1或FHL-1的表达水平高于神经视网膜中的水平。

图7A和图7B显示了在用tCFH1变体注射的cfh-/-小鼠中，确定因子B (FB)补体固定(FB的检测)的蛋白质印迹结果。图7A显示了在注射tCFH1的cfh-/-小鼠中的因子B固定。图7B显示了tCFH1和FHL-1的表达。图7A和图7B中所示的结果显示了由rAAV-tCFH1视网膜下注射诱导的tCFH1表达可以固定RPE/脉络膜中的因子B (FB)。CFH变体FHL-1并未显示FB固定。这些结果支持了由rAAV表达的tCFH1的生物学功能性，并且是首次AAV表达的CFH变体显示补体固定。

图8A和图8B显示了来自用媒介物注射的cfh-/-小鼠(图8A)、以及用tCFH1变体中剂量注射的cfh-/-小鼠(图8B)中的视网膜电图(ERG)测试结果。

图9显示了对于组1-6中的每一个，来自左(注射的)和右(未注射的)眼的眼部组织的体内横断面图像的光学相干断层扫描结果。

图10显示了对于组1-6中的每一个，在左(注射的)和右(未注射的)眼上的眼部组织的组织学检查结果。

图11显示了在用以低、中和高剂量的tCFH1变体注射的cfh-/-小鼠中，确定tCFH蛋白表达的蛋白质印迹结果。

图12显示了在用以各种剂量的tCFH1变体注射的cfh-/-小鼠中，确定因子B (FB)补体固定(FB的检测)的蛋白质印迹结果。

图13显示了来自评估rAAV-CFH变体的功能性的体外溶血实验的结果。

具体实施方式

I. 定义

本公开内容并不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、载体或试剂，因为它们可以改变。进一步地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期限制本公开内容的范围。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词都具有与本发明领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管本文描述了示例性方法、装置和材料，但与本文描述的相似或等价的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实践中。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有由本公开内容所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考为技术人员提供了本公开内容中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文使用的，下述术语具有下文归于其的含义，除非另有说明。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)冠词的语法对象。例如，“元件”意指一个元件或多于一个元件。

术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。

除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用。

术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”，并且可与短语“例如但不限于”互换使用。

如本文使用的，术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等等，是指用于致使治疗剂或药物组合物递送至所需的生物作用部位的方法。根据某些实施方案，这些方法包括对眼的视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。

如本文使用的，术语“载体”意欲包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。补充的活性成分也可以掺入组合物内。短语“药学上可接受的”指当施用于宿主时，不产生毒性、过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。

如本文使用的，术语“表达载体”、“载体”或“质粒”可以包括任何类型的遗传构建体，包括AAV或rAAV载体，其含有编码基因产物的核酸或多核苷酸，其中核酸编码序列的部分或全部能够被转录并适于基因治疗。转录物可以翻译成蛋白质。在一些情况下，它可能是部分翻译或不翻译的。在某些实施方案中，表达既包括基因转录又包括mRNA翻译成基因产物。在其它实施方案中，表达仅包括编码目的基因的核酸的转录。表达载体还可以包含与编码区可操作地连接的控制元件，以促进蛋白质在靶细胞中的表达。控制元件以及它们与之可操作地连接用于表达的一种或多种基因的组合有时可以被称为“表达盒”。

如本文使用的，术语“侧翼”指一个核酸序列关于另一个核酸序列的相对位置。一般地，在序列ABC中，B的侧翼为A和C。排列AxBxC也是如此。因此，侧翼序列在侧接序列之前或之后，但无需与侧接序列邻接或紧邻。

如本文使用的，术语“基因递送”意指通过其将外源DNA转移到宿主细胞用于基因疗法的应用的过程。

如本文使用的，术语“异源的”意指衍生自基因型不同于它与之进行比较或者引入或掺入其内的实体其余部分的实体。例如，通过遗传改造技术引入不同细胞类型内的多核苷酸是异源多核苷酸(并且在表达时，可以编码异源多肽)。类似地，掺入病毒载体内的细胞序列(例如基因或其一部分)是关于载体的异源核苷酸序列。

如本文使用的，术语“增加”、“增强”、“上升”(和类似术语)一般指相对于天然、预计或平均值，或者相对于对照条件，直接或间接地增加浓度、水平、功能、活动或行为的动作。

如本文使用的，术语“反向末端重复”或“ITR”序列是指在病毒基因组的末端处发现的相对短的序列，其处于相反取向。本领域众所周知的术语，“AAV反向末端重复(ITR)”序列是大约145个核苷酸的序列，其存在于天然单链AAV基因组的两个末端处。ITR最外面的145个核苷酸可以以两种替代取向中的任一种存在，导致在不同AAV基因组之间和单个AAV基因组的两端之间的异质性。最外面的145个核苷酸还含有几个较短的自身互补性区域(指定为A、A'、B、B'、C、C'和D区域)，允许在ITR的这一部分内发生链内碱基配对。

“野生型ITR”、“WT-ITR”或“ITR”指AAV或其它依赖病毒属(Dependovirus)中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与规范的天然存在的序列略微不同，并且因此对于在本文中使用所涵盖的WT-ITR序列包括由于在生产过程期间发生的天然存在的变化的WT-ITR序列 (例如，复制错误)。

如本文使用的，术语“末端重复”或“TR”包括任何病毒末端重复或合成序列，其包含至少一个最小所需复制起点和包含回文发夹结构的区域。Rep结合序列(“RBS”) (也称为RBE (Rep结合元件))和末端解离位点(“TRS”)一起构成“最小所需复制起点”，并且因此TR包含至少一种RBS和至少一种TRS。其在给定的多核苷酸序列段内是彼此的反向互补体的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和前病毒拯救。

术语“在体内”指在生物如多细胞动物中或其内发生的测定或过程。在本文所述的一些方面，当使用单细胞生物如细菌时，方法或用途可以被说成“在体内”发生。术语“离体”指使用具有完整膜的活细胞执行的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物的机体外部，例如外植体、培养的细胞包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系和提取的组织或细胞包括血细胞等。术语“在体外”指不要求具有完整膜的细胞存在的测定和方法，例如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统中引入可编程的合成生物回路，例如不包含细胞或细胞系统的培养基，例如细胞提取物。

如本文使用的，“分离的”分子(例如，核酸或蛋白质)或细胞意指它已从其天然环境的组分中鉴定且分离和/或回收。

如本文使用的，术语“最小调控元件”是指对于基因在靶细胞中的有效表达所必需的调控元件，并且因此应该包括在转基因表达盒中。此类序列可以包括例如启动子或增强子序列、促进DNA片段插入质粒载体内的多接头序列、以及负责mRNA转录物的内含子剪接和多聚腺苷酸化的序列。在用于色盲的基因疗法治疗的最近实例中，表达盒包括多聚腺苷酸化位点的最小调控元件、剪接信号序列和AAV反向末端重复。参见例如，Komaromy等人(HumMol Genet. 2010年7月1日；19(13): 2581–2593)。

如本文使用的，术语“降到最低”、“减少”、“降低”和/或“抑制”(和类似术语)一般指相对于天然、预计或平均值，或者相对于对照条件，直接或间接地减少浓度、水平、功能、活动或行为的动作。

如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指由单体核苷酸链组成的分子，例如DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)。核酸可以编码例如启动子、CFH基因或其一部分、或调控元件。核酸分子可以是单链或双链的。“CFH核酸”指包含CFH基因或其一部分、或者CFH基因的功能变体或其一部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变异的基因变体，所述微小变异例如如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变以及并不显著改变基因功能的其它突变或缺失。

DNA和RNA链的不对称端称为5' (五引物)和3' (三引物)端，其中5'端具有末端磷酸基，而3'端具有末端羟基。五引物(5')端具有在其末端处的脱氧核糖或核糖的糖环中第五个碳。核酸在体内以5'到3'方向合成，因为用于组装新链的聚合酶经由磷酸二酯键将每个新核苷酸附着到3'-羟基(-OH)基团。

如本文使用的，术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离，或者被修饰为含有以否则不存在于自然界中的形式的核酸区段，或者是合成的。当核酸构建体含有对于表达本公开内容的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

“编码”特定CFH蛋白(包括其片段和一部分)的DNA序列是转录成特定RNA和/或蛋白质的核酸序列。DNA多核苷酸可以编码翻译成蛋白质的RNA (mRNA)，或者DNA多核苷酸可以编码不翻译成蛋白质的RNA (例如tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或"ncRNA")。

如本文使用的，术语“可操作地连接的(operatively linked)”或“可操作地连接的(operably linked)”或“偶联的”可以指遗传元件的并列，其中元件处于允许其以预计方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动编码序列的转录，则启动子可以是与编码区可操作地连接的。在启动子和编码区之间可能存在间插残基，只要这种功能关系得到维持。

如本文使用的，关于参考多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”定义为在比对序列且在需要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性目的的比对可以以在本领域技术内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件程序，例如CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel等人，编辑1987)，Supp. 30，部分7.7.18，表7.7.1中描述的那些程序，并且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。比对程序的实例是ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，Pennsylvania)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。为了本文的目的，给定氨基酸序列A与、对于或针对给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下进行计算：100乘以分数X/Y，其中X是在该程序的A和B的比对中，通过序列比对程序中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应了解，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A与B的%氨基酸序列同一性将不等于B与A的%氨基酸序列同一性。为了本文的目的，给定核酸序列C与、对于或针对给定核酸序列D的%核酸序列同一性(其可以可替代地表述为与、对于或针对给定核酸序列D具有或包含一定%核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下进行计算：100乘以分数W/Z，其中W是在该程序的C和D的比对中，通过序列比对程序中评分为相同匹配的核苷酸数目，并且其中Z是D中核苷酸的总数。应了解，核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度，C与D的%核酸序列同一性将不等于D与C的%核酸序列同一性。

如本文使用的，术语“药物组合物”或“组合物”是指任选地与至少一种药学上可接受的化学组分混合的、本文所述的组合物或试剂(例如重组腺伴随(rAAV)表达载体)，所述化学组分例如(尽管并不限于)载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、赋形剂等等。

如本文使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物并且不限于最小长度。此类氨基酸残基聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽，寡肽，氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质及其片段两者均由该定义包含。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等等。此外，为了本公开内容的目的，“多肽”指包括对天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(性质上一般是保守的)的蛋白质，只要蛋白质维持所需活性。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增的错误。

如本文使用的，“启动子”是指促进特定基因转录的DNA区域。作为转录过程的部分，合成RNA的酶(称为RNA聚合酶)附着至基因附近的DNA。启动子含有特异性DNA序列和响应元件，其提供了关于RNA聚合酶和募集RNA聚合酶的转录因子的初始结合位点。“鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子”指衍生自鸡β-肌动蛋白基因(例如，由GenBank Entrez Gene ID 396526表示的原鸡(Gallus gallus) β肌动蛋白)的多核苷酸序列。“smCBA”启动子指杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本。

如本文使用的，术语“增强子”指顺式作用调控序列(例如，50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白质(例如，激活蛋白或转录因子)，以增加核酸序列的转录激活。增强子可以位于它们调控的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对。

启动子可以被说成驱动它调控的核酸序列的表达或转录。短语“可操作地连接(operably linked)”、“可操作地定位”、“可操作地连接(operatively linked)”、“处于控制下”和“处于转录控制下”，指示启动子相对于它调控的核酸序列处于正确的功能定位和/或取向上，以控制该序列的转录起始和/或表达。如本文使用的，“反向启动子”指其中核酸序列处于反向取向上的启动子，使得编码链现在是非编码链，且反之亦然。反向启动子序列可以用于各个实施方案中，以调控开关的状态。另外，在各个实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。

启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，如可以通过分离定位于给定基因或序列的编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。此类启动子可以被称为“内源的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与定位于该序列下游或上游的核酸序列天然相关的增强子。

在一些实施方案中，编码核酸区段置于“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，这两者均指通常不与它在其天然环境中与之可操作地连接的编码核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子指在其天然环境中通常不与给定核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子；从任何其它原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或通过本领域已知的遗传改造方法改变表达的突变。

如本文使用的，术语“重组体”可以指这样的生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然存在的环境中取出，(2)不与基因在自然界中在其中发现的多核苷酸的全部或一部分相关，(3)可操作地连接到它在自然界中不与之连接的多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可以用于提及克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mRNA。

如本文使用的，待通过本发明的方法治疗的“受试者”或“患者”或“个体”是指人或非人动物。“非人动物”包括任何脊椎动物或无脊椎动物生物。人受试者可以具有任何年龄、性别、种族或民族，例如高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施方案中，受试者已经在经历治疗。在一些实施方案中，受试者是新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。

如本文使用的，术语“疗效”指治疗的后果，所述治疗的结果被判断为期望和有益的。疗效可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。疗效还可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现的进展。

对于本文所述的任何治疗剂，治疗有效量可以最初根据初步体外研究和/或动物模型进行确定。治疗有效剂量也可以根据人数据进行确定。可以基于所施用化合物的相对生物利用度和效力来调整施加的剂量。基于上述方法及其它众所周知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。在下文概括了关于确定治疗有效性的一般原则，其可以在通过引用并入本文的Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第10版，McGraw-Hill (New York) (2001)的第1章中找到。

如本文使用的，术语“中央视网膜”指外黄斑和/或内黄斑和/或中央凹。如本文使用的，术语“中央视网膜细胞类型”指中央视网膜的细胞类型，例如如RPE和感光细胞。

如本文使用的，术语“黄斑”指灵长类动物中的中央视网膜区域，与周边视网膜相比，其含有更高相对浓度的感光细胞，特别是视杆和视锥。如本文使用的，术语“外黄斑”也可以被称为“外周黄斑”。如本文使用的，术语“内黄斑”也可以被称为“中央黄斑”。

如本文使用的，术语“中央凹”是指在灵长类动物的中央视网膜中的直径大约等于或小于1.5 mm的小区域，当与周边视网膜和黄斑相比较时，其含有更高相对浓度的感光细胞，特别是视锥。

如本文使用的，术语“视网膜下间隙”指在视网膜中的感光细胞和视网膜色素上皮细胞之间的定位。视网膜下间隙可以是潜在间隙，例如在任何视网膜下流体注射之前。视网膜下间隙还可以含有注射到潜在间隙内的流体。在这种情况下，液体“与视网膜下间隙接触”。“与视网膜下间隙接触”的细胞包括与视网膜下间隙交界的细胞，例如RPE和感光细胞。

如本文使用的，术语“转基因”是指引入细胞内并且能够转录成RNA并且任选地在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予它引入其内的细胞所需的性质，或以其它方式导致所需的治疗或诊断后果。

“转基因表达盒”或“表达盒”可互换使用，并且指包括转基因的线性核酸段，其与一个或多个启动子或足以指导转基因转录的其它调控序列可操作地连接，但不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区。表达盒可以另外包含一种或多种顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏物)、一种或多种内含子和一种或多种转录后调控元件。转基因表达盒包含核酸载体待递送至靶细胞的基因序列。这些序列包括目的基因(例如，CFH核酸或其变体)、一种或多种启动子和最小调控元件。

如本文使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病或病症(例如，AMD)是指疾病或病症的一种或多种体征或症状的减轻，疾病或病症程度的缩小，疾病或病症的稳定(例如，不恶化)状态，预防疾病或病症的传播，疾病或病症进展的延迟或减缓，疾病或病症状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以指与未接受治疗的预计存活相比延长存活。

如本文使用的，术语“载体”指包含待在体外或体内递送到宿主细胞内的核酸的重组质粒或病毒。

如本文使用的，术语“表达载体”指的是指导来自与载体上的转录调控序列连接的序列的RNA或多肽表达的载体。表达的序列经常(但不一定)对细胞是异源的。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两种复制系统，因此允许其在两种生物中维持，例如在人细胞中用于表达以及在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，适当时包括但不限于例如转录，转录物加工、翻译和蛋白质折叠，修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，以及通过从基因转录的mRNA翻译获得的多肽。术语“基因”意指当可操作地连接到适当的调控序列时，在体外或体内将(DNA)转录为RNA的核酸序列。基因可以包括或不包括在编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3’ UTR或“尾随”序列、以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文使用的，“重组病毒载体”指包含一种或多种异源序列(即，非病毒起源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况下，重组核酸的侧翼为至少一个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，重组核酸的侧翼为两个ITR。

如本文使用的，“重组AAV载体(rAAV载体)”指包含一种或多种异源序列(即，非AAV起源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼为至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已被合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)，并且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，此类rAAV载体可以被复制并包装到感染性病毒颗粒内。当rAAV载体掺入更大的多核苷酸内(例如，染色体或另一种载体例如用于克隆或转染的质粒中)，那么rAAV载体可以被称为“前载体(pro-vector)”，其可以在AAV包装功能和合适的辅助功能的存在下，通过复制和衣壳化得到“拯救”。rAAV载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、在脂质体内封装、以及在病毒颗粒例如AAV颗粒中衣壳化。rAAV载体可以包装到AAV病毒衣壳内，以生成“重组腺伴随病毒颗粒(rAAV颗粒)”。

如本文使用的，“rAAV病毒”或“rAAV病毒颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的rAAV载体基因组组成的病毒颗粒。

如本文使用的，“报道分子”指可以用于提供可检测读出的蛋白质。报道分子一般产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报道蛋白编码序列编码其在细胞或生物中的存在很容易观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白在用特定波长的光激发时促使细胞发荧光，萤光素酶促使细胞催化产生光的反应，而酶如β-半乳糖苷酶将底物转换为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报道多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)及其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶和本领域众所周知的其它。

转录调节剂指激活或阻遏目的基因转录的转录激活物和阻遏物，所述目的基因例如如本文所述的截短的CFH。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录激活物通常在转录启动子附近结合并募集RNA聚合酶以直接启动转录。阻遏物与转录启动子结合，并且在空间上阻碍通过RNA聚合酶的转录起始。取决于它们结合的位置以及细胞和环境条件，其它转录调节剂可以充当激活物或阻遏物。转录调节剂类别的非限制性实例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。

如本文使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调控序列元件结合，并且分别阻遏或激活与调控序列元件可操作地连接的序列转录的蛋白质。如本文所述的优选阻遏蛋白和诱导蛋白对至少一种输入试剂或环境输入的存在或不存在敏感。如本文所述的优选蛋白质在形式上是模块化的，包含例如可分离的DNA结合和输入试剂结合或响应元件或结构域。

如本文使用的，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于提及组合物、方法及其分别的组分，其对于方法或组合物是必需的，但对包括无论是否是必需的未指定元件开放。

如本文使用的，术语“基本上由……组成”指对于给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在实质上并不影响该实施方案的基本和新颖或功能特性的元件。“包含”的使用指示包括而不是限制。

术语“由……组成”指如本文所述的组合物、方法及其分别的组分，其排除在实施方案的描述中未叙述的任何元件。

如本文使用的，术语“基本上由……组成”指对于给定实施方案所需的那些元件。该术语允许存在实质上并不影响本发明的该实施方案的基本和新颖或功能特性的另外元件。

如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“方法”的提及包括本文所述类型和/或在阅读本公开内容后对于本领域技术人员将变得显而易见的一种或多种方法、和/或步骤等等。类似地，除非上下文另有明确说明，否则单词“或”预期包括“和”。尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文所述的相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中。缩写“例如”衍生自拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“如”同义。

本文公开的本发明的替代元件或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以个别地或者与组的其它成员或本文发现的其它元件以任何组合被提及且请求保护。为了方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以包括在组中或从组中缺失。当发生任何此类包括或缺失时，本说明书在本文中被视为含有如此修饰的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

在任何方面的一些实施方案中，本文所述的公开内容并不涉及用于克隆人类的方法、用于修饰人类的种系遗传同一性的方法、人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性的方法，所述方法很可能促使其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医疗益处，以及起因于此类方法的动物。

其它术语在本文中在本发明的各个方面的描述内进行定义。

在本申请自始至终引用的所有专利及其它出版物；包括参考文献、授权专利、公开专利申请和共同未决专利申请，明确地通过引用并入本文，用于描述且公开例如此类出版物中描述的可以与本文描述的技术结合使用的方法学的目的。提供这些出版物仅由于其公开内容在本申请的提交日期之前。在这点上不应解释为承认由于在先发明或出于任何其他原因，本发明人无权先于此类公开内容。关于日期的所有声明或关于这些文件内容的表达基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容正确性的任何承认。

本公开内容的实施方案的描述并不预期是穷举的或将本公开内容限制为所公开的精确形式。尽管本公开内容的具体实施方案和实施例在本文中为了说明性目的进行描述，但如相关领域的技术人员将认识到的，各种等价修改在本公开内容的范围内是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定次序呈现，但替代实施方案可以以不同次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开内容的教导可以适当地应用于其它程序或方法。可以组合本文描述的各个实施方案，以提供进一步的实施方案。需要时，可以修改本公开内容的各方面，以采用上述参考和申请的组合物、功能和概念，以提供本公开内容的再进一步的实施方案。此外，由于生物学功能等价性的考虑，可以在蛋白质结构中进行一些改变，而不影响在种类或量方面的生物学或化学作用。可以按照详细描述对本公开内容进行这些及其它改变。所有此类修改都预期包括在所附权利要求的范围内。

任何前述实施方案的特定元件可以组合或取代其它实施方案中的元件。此外，虽然已在这些实施方案的上下文中描述了与本公开内容的某些实施方案相关的优点，但其它实施方案也可以显示出此类优点，并且并非所有实施方案都必须显示出此类优点才能落入本公开内容的范围内。

本文描述的技术通过下述实施例进一步说明，所述实施例决不应被解释为进一步限制性的。应当理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期限制仅由权利要求限定的本发明的范围。

II. 核酸

本文提供了用于潜在治疗用途的核酸分子的表征和开发。本公开内容提供了可以用于治疗眼部疾病或病症(例如，年龄相关性黄斑变性)的启动子、表达盒、载体、试剂盒和方法。本公开内容的某些方面涉及将异源核酸递送至受试者的眼，其包括向受试者的眼施用重组腺伴随病毒(rAAV)载体。根据一些方面，本公开内容提供了治疗眼部疾病或病症(例如，年龄相关性黄斑变性)的方法，其包括将包含本文所述的rAAV载体的组合物递送至受试者，其中所述rAAV载体包含异源核酸(例如，编码CFH的核酸)，并且进一步包含两个AAV末端重复。根据一些实施方案，异源核酸可操作地连接至启动子。

几种遗传变体已与AMD相关。首先鉴定了补体因子H (CFH)基因中的常见编码变体Y402H。“CFH基因”是编码补体因子H (CFH)蛋白的基因。CFH是补体系统的155-kDa可溶性糖蛋白调节剂。它在血浆中是丰富的，并且可以经由聚阴离子如糖胺聚糖(GAG)和唾液酸的识别，与宿主细胞膜及其它自身表面结合(Meri和Pangburn，Proc Natl Acad Sci U S A.1990年5月；87(10):3982-6)。通过在替代途径C3和C5转化酶水平下的干预，它调节液相和表面相关的补体扩增两者。因子H以几种方式起作用(Pangburn等人，J Exp Med. 1977年7月1日；146(1):257-70)：它与因子B竞争结合C3b，从而妨碍替代途径C3转化酶(C3bBb)的形成；当双分子转化酶复合物的确成功组装时，CFH加速其后续解离(衰变)；CFH还加速替代途径C5转化酶(C3b2Bb)的衰变；并且CFH是因子I介导的C3b蛋白酶解切割为iC3b的辅因子。作为丝氨酸蛋白酶因子I的辅因子，CFH还调控已经沉积的C3b的蛋白酶解降解(Hocking等人，J. Biol. Chem. 283:9475-9487(2008)；Xue等人，Nat. Struct. Mol. Biol. 24:643-651(2017))。

成熟CFH (155 kDa) (Ripoche等人，Biochem J. 1988年1月15日；249(2):593-602)的1213个氨基酸残基由20个短共有重复(SCR)组成，所述短共有重复各自具有∼60个残基(Kristensen和Tack. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986年6月；83 (11):3963-7)。20个SCR的多重比对显示了在Cys(III)和Cys(IV)之间的四个不变的Cys残基和一个近乎不变的Trp残基(Schmidt等人，Clin Exp Immunol. 2008年1月；151 (1): 14–24)。在CFH内，三至八个残基的‘接头’位于一个SCR的Cys(IV) (最后一个残基)和下一个SCR的Cys(I) (第一个残基)之间。假定20个SCR各自(加上在任一端处的接头内的一个或两个残基)折叠成由Cys(I)–Cys(III)、Cys(II)–Cys(IV)二硫键合稳定的独特的三维(3D)结构，称为补体控制蛋白模块(CCP) [(Soares和Barlow. Structural biology of the complement system.Boca Raton: CRC Press，Taylor & Francis Group；2005. 第19–62页)。如图1A中所示，全长人CFH包含20种CCP (CCP 1-20)。一些CCP具有关于其它蛋白质的鉴定的结合位点，如图1A中所示。CCP和CCP结合蛋白在补体级联调控中起关键作用。关于AMD的高风险多态性Y402H定位于CCP 7中，其也包含在天然存在的变体FHL-1中。

“CFH核酸”指包含CFH基因或其一部分、或者CFH基因的功能变体或其一部分的核酸。基因的功能变体包括具有微小变异的基因变体，所述微小变异例如如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变以及并不显著改变基因功能的其它突变或缺失。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码包含补体控制蛋白模块(CCP) 1-20的CFH蛋白。根据一些实施方案，本发明的核酸编码由补体控制蛋白模块(CCP) 1-20组成的CFH蛋白。截短的CFH蛋白是缺少20种CCP中的至少一种或其中之一的一部分的CFH蛋白。

根据一些实施方案，表达的CFH蛋白对于眼部疾病或病症的治疗(例如，年龄相关性黄斑变性的治疗和/或预防)是有功能的。在一些实施方案中，表达的CFH蛋白并不引起免疫系统反应。

根据一些实施方案，全长CFH (包含补体控制蛋白模块(CCP) 1-20)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 1。

SEQ ID NO: 1

根据一些实施方案，CFH核酸包含SEQ ID NO: 1的核酸序列。根据一些实施方案，CFH核酸由SEQ ID NO: 1的核酸序列组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 1具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 1具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 1具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其包含选自以下的5种或更多种补体控制蛋白模块(CCP)：CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其包含选自以下的7种或更多种补体控制蛋白模块(CCP)：CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其包含选自以下的10种或更多种补体控制蛋白模块(CCP)：CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其包含选自以下的15种或更多种补体控制蛋白模块(CCP)：CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH1)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，截短的CFH (tCFH1)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 2。

SEQ ID NO: 2

根据一些实施方案，截短的CFH (tCFH1)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 8。

根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 2。根据一些实施方案，核酸包含SEQ IDNO: 8。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 2组成。根据一些实施方案，核酸由SEQ IDNO: 8组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少95%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ IDNO: 8具有至少95%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少96%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少96%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少97%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少97%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少99%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含下文显示的氨基酸序列SEQ IDNO: 9。

SEQ ID NO: 9

根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含下文显示的氨基酸序列SEQ IDNO: 10。

SEQ ID NO: 10

根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:10具有至少85%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10具有至少90%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10具有至少95%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10具有至少96%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ IDNO: 9或SEQ ID NO: 10具有至少97%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10具有至少98%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)包含与SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10具有至少99%同一性的氨基酸序列。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(tCFH1)由SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10组成。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH2)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为1353bp。根据一些实施方案，截短的CFH (tCFH2)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 3。

SEQ ID NO: 3

根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 3。根据一些实施方案，核酸由SEQ IDNO: 3组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH3)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为2610bp。根据一些实施方案，截短的CFH (tCFH3)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 4。

SEQ ID NO: 4

根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 4。根据一些实施方案，核酸由SEQ IDNO: 4组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH4)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为1893bp。根据一些实施方案，截短的CFH (tCFH4)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 5。

SEQ ID NO: 5

根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 5。根据一些实施方案，核酸由SEQ IDNO: 5组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(FHL-1)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6和CCP7。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6和CCP7组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为1357bp。根据一些实施方案，截短的CFH蛋白(FHL-1)的核酸序列在下文显示为SEQ ID NO: 6。

SEQ ID NO: 6

根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 6。根据一些实施方案，核酸由SEQ IDNO: 6组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码具有已知对于补体级联活性重要的CCP缺失的CFH蛋白。根据一些实施方案，tCFH2和tCFH4被改造为缺失已知对于补体级联活性重要的CCP。

根据某些实施方案，核酸是人核酸(即，衍生自人CFH基因的核酸)。在其它实施方案中，核酸是非人核酸(即，衍生自非人CFH基因的核酸)。

制备核酸

可以使用标准分子生物学技术来分离本发明的核酸分子(包括例如CFH核酸)。使用目的核酸序列的全部或一部分作为杂交探针，可以使用标准杂交和克隆技术(例如，如Sambrook，J.，Fritsh，E. F.和Maniatis，T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989中所述)来分离核酸分子。

用于本发明的方法中的核酸分子也可以通过聚合酶链反应(PCR)，使用基于目的核酸分子的序列设计的合成寡核苷酸引物进行分离。本发明的方法中使用的核酸分子可以根据标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或可替代地基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物进行扩增。

此外，对应于目的核苷酸序列的寡核苷酸也可以使用标准技术进行化学合成。化学合成聚脱氧核苷酸的众多方法是已知的，包括已在商购可得的DNA合成仪中自动化的固相合成(参见例如，通过引用并入本文的Itakura等人，美国专利号4,598,049；Caruthers等人，美国专利号4,458,066；以及Itakura美国专利号4,401,796和4,373,071)。用于设计合成寡核苷酸的自动化方法是可获得的。参见例如，Hoover，D.M. & Lubowski，2002. J.Nucleic Acids Research，30 (10): e43。

本发明的许多实施方案涉及CFH核酸。本发明的一些方面和实施方案涉及其它核酸，例如分离的启动子或调控元件。核酸可以是例如cDNA或化学合成的核酸。例如，可以通过使用聚合酶链反应(PCR)的扩增或通过筛选适当的cDNA文库来获得cDNA。可替代地，可以化学合成核酸。

III. 启动子、表达盒和载体

本公开内容的启动子、CFH核酸、调控元件和表达盒以及载体可以使用本领域已知的方法产生。下文描述的方法作为此类方法的非限制性实例提供。

启动子

可以使用如本文所述的一种或多种启动子在空间和时间两者上，实现来自AAV载体的如本文所述的CFH蛋白表达。

用于表达CFH蛋白的AAV载体的表达盒可以包括启动子，其可以影响总体表达水平。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子、猿猴病毒40 (SV40)启动子和CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；鸡β-肌动蛋白启动子，杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本(smCBA) (Pang等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.2008 Oct；49(10):4278-83)；与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子连接的巨细胞病毒增强子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等人，Gene，1991，108(2):193-9)和延伸因子1-α启动子(EF1-α)启动子(Kim等人，Gene，1990，91 (2):217-23和Guo等人，Gene Ther.，1996，3 (9):802-10)。在一些实施方案中，启动子包含鸡β-肌动蛋白启动子。根据一些实施方案，启动子包含杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本(smCBA)。启动子可以是组成型、诱导型或阻遏型启动子。在一些实施方案中，启动子能够在眼的细胞中表达异源核酸。在一些实施方案中，启动子能够在感光细胞或RPE中表达异源核酸。在一些实施方案中，启动子能够在许多视网膜细胞中表达异源核酸。

表达盒

在另一个方面，本发明提供了转基因表达盒，其包括(a)启动子；(b)核酸包含如本文所述的CFH核酸；以及(c)最小调控元件。本发明的启动子包括上文讨论的启动子。根据一些实施方案，启动子是CBA。根据一些实施方案，启动子是smCBA。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH1)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为3358bp。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 2。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 2组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQID NO: 2具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 2具有至少99%同一性。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 8。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 8组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ IDNO: 8具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 8具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH2)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为1353bp。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 3。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 3组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 3具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ IDNO: 3具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH3)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为2610bp。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 4。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 4组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 4具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ IDNO: 4具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(tCFH4)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为1893bp。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 5。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 5组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 5具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白(FHL-1)，其包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6和CCP7。根据一些实施方案，本发明的核酸编码截短的CFH蛋白，其由CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6和CCP7组成。根据一些实施方案，编码CFH蛋白的核酸的长度为1357bp。根据一些实施方案，核酸包含SEQ ID NO: 6。根据一些实施方案，核酸由SEQ ID NO: 6组成。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQID NO: 6具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 6具有至少99%同一性。

根据一些实施方案，重组核酸的侧翼为至少两个ITR。

根据一些实施方案，构建体包含全长人CFH、鸡β肌动蛋白启动子和反向末端重复(pTR-CBA-flCFH)。

根据一些实施方案，构建体包含具有CFH CCP 16-17缺失的全长人CFH、杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本和反向末端重复(pTR-smCBA-tCFH1)。

根据一些实施方案，构建体包含具有CFH CCP 5-17缺失的全长人CFH、杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本和反向末端重复(pTR-smCBA-tCFH2)。

根据一些实施方案，构建体包含具有CFH CCP 10-15缺失的全长人CFH、杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本和反向末端重复(pTR-smCBA-tCFH3)。

根据一些实施方案，构建体包含具有CFH CCP 8-17缺失的全长人CFH、杂合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的小版本和反向末端重复(pTR-smCBA-tCFH4)。

根据一些实施方案，构建体包括包含CCP 1-7的天然存在的CFH变体、鸡β-肌动蛋白启动子和反向末端重复(pTR-CBA-FHL-1)。根据一些实施方案，pTR-CBA-FHL-1包含SEQID NO: 7的核酸序列。根据一些实施方案，pTR-CBA-FHL-1由SEQ ID NO: 7的核酸序列组成。在一些实施方案中，核酸与SEQ ID NO: 7具有至少85%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 7具有至少90%同一性。根据一些实施方案，核酸是与SEQ ID NO: 7具有至少95%、96%、97%或98%同一性。根据一些实施方案，核酸与SEQ ID NO: 7具有至少99%同一性。

SEQ ID NO: 7

“最小调控元件”是对于基因在靶细胞中的有效表达所必需的调控元件。此类调控元件可以包括例如启动子或增强子序列、促进DNA片段插入质粒载体内的多接头序列、以及负责mRNA转录物的内含子剪接和多聚腺苷酸化的序列。在用于色盲的基因疗法治疗的最近实例中，表达盒包括多聚腺苷酸化位点的最小调控元件、剪接信号序列和AAV反向末端重复。参见例如，Komaromy等人。本发明的表达盒还可以任选地包括对于基因有效掺入靶细胞内并非必需的另外调控元件。

载体

本发明还提供了包括在先前部分中讨论的任何一种表达盒的载体。在一些实施方案中，载体是包含表达盒的序列的寡核苷酸。在具体实施方案中，寡核苷酸的递送可以通过以下完成：体内电穿孔(参见例如，Chalberg，TW等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，46，2140–2146 (2005) (下文Chalberg等人，2005))或电子雪崩转染(参见例如，Chalberg，TW等人， Investigative Ophthalmology &Visual Science，47，4083–4090 (2006) (下文Chalberg等人，2006))。在进一步的实施方案中，载体是DNA压缩肽(参见例如，Farjo，R等人，PLoS ONE，1，e38 (2006) (下文Farjo等人，2006)，其中CK30，含有与聚乙二醇偶联的半胱氨酸残基，随后为30个赖氨酸的肽，用于基因转移到光感受器)，具有细胞穿透性质的肽(关于肽递送至眼部细胞的实例，参见Johnson，LN等人，Cell-penetrating peptide for enhanced delivery of nucleic acids and drugs toocular tissues including retina and cornea. Molecular Therapy，16(1)，107–114(2007) (下文Johnson等人，2007)，Barnett，EM等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，47，2589–2595 (2006) (下文Barnett等人，2006)，Cashman，SM等人，Molecular Therapy，8，130–142(2003) (下文Cashman等人，2003)，Schorderet，DF等人，Clinical and Experimental Ophthalmology，33，628–635 (2005) (下文Schorderet等人，2005)，Kretz，A等人Molecular Therapy，7，659–669(2003) (下文Kretz等人，2003)，或者封装DNA的lipoplex、polyplex、脂质体或免疫脂质体(参见例如，Zhang，Y等人，Molecular Vision，9，465–472 (2003) (下文Zhang等人，2003)，Zhu，C等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，43，3075–3080 (2002) (下文Zhu等人，2002)，Zhu，C.等人，Journal of Gene Medicine，6，906–912. (2004) (下文Zhu等人，2004))。

在优选的实施方案中，载体是病毒载体，例如衍生自腺伴随病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(HSV))的载体。参见例如，Howarth，JL等人，Using viral vectors as gene transfer tools. Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)。在最优选的实施方案中，载体是腺伴随病毒(AAV)载体。

目前已鉴定了腺伴随病毒(AAV)的多种血清型，包括12种人血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12)和来自非人灵长类动物的多于100种血清型。Howarth JL等人，2010。在其中载体是AAV载体的本发明的实施方案中，AAV载体的反向末端重复(ITR)的血清型可以选自任何已知的人或非人AAV血清型。在优选的实施方案中，AAV载体的AAV ITR的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。此外，在其中载体是AAV载体的本发明的实施方案中，AAV载体的衣壳序列的血清型可以选自任何已知的人或动物AAV血清型。在一些实施方案中，AAV载体的衣壳序列的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在优选的实施方案中，衣壳序列的血清型是AAV2。在其中载体是AAV载体的一些实施方案中，采用假分型方法，其中将一种ITR血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳内。参见例如，Zolutuhkin S.等人，Methods 28 (2): 158-67 (2002)。在优选的实施方案中，AAV载体的AAV ITR的血清型和AAV载体的衣壳序列的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

在其中载体是rAAV载体的本发明的一些实施方案中，使用突变型衣壳序列。突变型衣壳序列以及其它技术，例如合理诱变、靶向肽的改造、嵌合颗粒的生成、文库和定向进化方法以及免疫逃避修饰，可以用于本发明中以优化AAV载体，用于例如实现免疫逃避和增强治疗输出的目的。参见例如，Mitchell A.M.等人，AAV’s anatomy: Roadmap foroptimizing vectors for translational success. Curr Gene Ther. 10 (5): 319-340。

AAV载体可以介导视网膜中的长期基因表达并且引发最低限度的免疫应答，使得这些载体成为用于基因递送至眼的有吸引力的选择。

IV.生产病毒载体的方法

本公开内容还提供了制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，其包括将本文所述的任何一种核酸插入腺伴随病毒载体内。根据一些实施方案，rAAV载体进一步包含一种或多种AAV反向末端重复(ITR)。

根据通过本公开内容提供的制备rAAV载体的方法，所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。因此，本公开内容包含使用假分型方法的载体，其中将一种ITR血清型的载体基因组包装到不同的血清型衣壳内。参见例如，Daya S.和Berns，K.I.，Genetherapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews，21 (4): 583-593 (2008) (下文Daya等人)。此外，在一些实施方案中，衣壳序列是突变型衣壳序列。

AAV载体

AAV载体衍生自腺伴随病毒，其之所以得名是因为它最初被描述为腺病毒制剂的污染物。AAV载体提供了超过其它载体类型的许多众所周知的优点：野生型菌株感染人和非人灵长类动物，而无疾病或不利效应的证据；AAV衣壳展示与高化学和物理稳定性组合的非常低的免疫原性，其允许严格的病毒纯化和浓缩方法；AAV载体转导导致在有丝分裂后的非分裂细胞中持续的转基因表达，并且提供长期的功能获得；并且AAV亚型和变体的多样性提供了靶向所选组织和细胞类型的可能性。Heilbronn R & Weger S，Viral Vectors forGene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics，于M. Schäfer-Korting (编辑)，Drug Delivery，Handbook of Experimental Pharmacology，197: 143-170 (2010)(下文Heilbronn)。AAV载体的主要限制在于对于含有单链DNA的常规载体，AAV仅提供有限的转基因容量(<4.9 kb)。

AAV是无包膜、小型、含有单链DNA的病毒，其由二十面体、20nm直径的衣壳衣壳化。人血清型AAV2用于大多数AAV的早期研究中。Heilbronn (2010)。它含有4.7 kb线性、单链DNA基因组，具有两个开放读码框rep和cap (“rep”用于复制，而“cap”用于衣壳)。Rep编码四种重叠的非结构蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep69是AAV生命周期的大多数步骤所需的，包括在发夹结构的反向末端重复(ITR)处的AAV DNA复制启动，其是AAV载体生产的必需步骤。cap基因编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。Rep和cap的侧翼为145 bpITR。ITR含有DNA复制起点和包装信号，并且它们作用于介导染色体整合。ITR一般是在AAV载体构建中维持的唯一AAV元件。

为了实现复制，AAV必须与辅助病毒一起共感染到靶细胞内。Grieger JC &Samulski RJ，Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vectordevelopment，production，and clinical applications. Adv Biochem Engin/ Biotechnol 99:119-145 (2005)。通常，辅助病毒是腺病毒(Ad)或单纯疱疹病毒(HSV)。在不存在辅助病毒的情况下，AAV可以通过整合到人染色体19上的位点内来建立潜伏感染。由AAV潜伏感染的细胞的Ad或HSV感染将拯救整合的基因组并且开始生产性感染。辅助功能所需的四种Ad蛋白是E1A、E1B、E4和E2A。另外，需要Ad病毒相关(VA) RNA的合成。疱疹病毒也可以充当辅助病毒用于生产性AAV复制。已发现编码解旋酶-引物复合物(UL5、UL8和UL52)和DNA结合蛋白(UL29)的基因足以调节HSV辅助效应。在采用rAAV载体的本发明的一些实施方案中，辅助病毒是腺病毒。在采用rAAV载体的其它实施方案中，辅助病毒是HSV。

制备重组AAV (rAAV)载体

本发明的rAAV载体的产生、纯化和表征可以使用本领域已知的许多方法中的任一种来进行。关于实验室规模生产方法的综述，参见例如，Clark RK，Kidney Int. 61s:9-15(2002)；Choi VW等人，Current Protocols in Molecular Biology 16.25.1-16.25.24(2007) (下文Choi等人)；Grieger JC & Samulski RJ，Adv Biochem Engin/Biotechnol99:119-145 (2005) (下文Grieger & Samulski)；Heilbronn R & Weger S，于M. Schäfer-Korting (编辑)，Drug Delivery，Handbook of Experimental Pharmacology，197:143-170 (2010) (下文Heilbronn)；Howarth JL等人，Cell Biol Toxicol 26:1-10(2010) (下文Howarth)。下文描述的生产方法预期作为非限制性实例。

AAV载体生产可以通过包装质粒的共转染来完成。Heilbronn。细胞系供应缺失的AAV基因rep和cap以及所需的辅助病毒功能。腺病毒辅助基因VA-RNA、E2A和E4连同AAV rep和cap基因一起转染到两种分开的质粒或单一辅助构建体上。还转染了重组AAV载体质粒，其中AAV衣壳基因替换为被ITR包围(bracketed)的转基因表达盒(包含目的基因，例如如本文所述的CFH核酸；启动子；和最小调控元件)。这些包装质粒可以转染到贴壁或悬浮细胞系内。根据一些实施方案，这些包装质粒通常转染到HEK 293或HEK293T细胞内，所述HEK 293或HEK293T细胞是组成型表达剩余所需的Ad辅助基因E1A和E1B的人细胞系。这导致携带目的基因的AAV载体的扩增和包装。

目前已鉴定了AAV的多种血清型，包括12种人血清型和来自非人灵长类动物的多于100种血清型。Howarth等人。本发明的AAV载体可以包含衍生自任何已知血清型的AAV的衣壳序列。如本文使用的，“已知血清型”包含可以使用本领域已知方法产生的衣壳突变体。此类方法包括例如病毒衣壳序列的遗传操纵，不同血清型的衣壳区域的暴露表面的结构域交换，以及使用技术如标记物拯救的AAV嵌合体生成。参见Bowles等人，Journal ofVirology，77(1): 423-432 (2003)，以及其中引用的参考文献。此外，本发明的AAV载体可以包含衍生自任何已知血清型的AAV的ITR。优选地，ITR衍生自人血清型AAV1-AAV12之一。在本发明的一些实施方案中，采用假分型方法，其中将一种ITR血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳内。

优选地，本发明中采用的衣壳序列衍生自人血清型AAV1-AAV12之一。含有AAV5血清型衣壳序列的重组AAV载体已证实在体内靶向视网膜细胞。参见例如，Komaromy等人。因此，在本发明的优选实施方案中，AAV载体的衣壳序列的血清型是AAV2。在其它实施方案中，AAV载体的衣壳序列的血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。即使当衣壳序列的血清型并非天然地靶向视网膜细胞时，也可以采用特异性组织靶向的其它方法。参见Howarth等人。

Choi等人中提供了用于产生、纯化和表征重组AAV (rAAV)载体的一种可能方案。一般地，涉及下述步骤：设计转基因表达盒，设计用于靶向特异性受体的衣壳序列，生成无腺病毒的rAAV载体，纯化且滴定。这些步骤在下文概括并且在Choi等人中详细描述。

转基因表达盒可以是单链AAV (ssAAV)载体或者包装为假双链转基因的“二聚体”或自互补AAV (scAAV)载体。Choi等人；Heilbronn；Howarth。由于单链AAV DNA成为双链DNA的所需转换，使用传统的ssAAV载体一般导致基因表达的缓慢开始(从数天到数周，直到达到转基因表达的平台)。相比之下，scAAV载体显示在静止细胞的转导后数小时内开始的基因表达，其在数天内达到平台。Heilbronn。然而，scAAV载体的包装容量是传统ssAAV载体的大约一半。Choi等人。可替代地，转基因表达盒可以在两种AAV载体之间拆分，其允许递送更长的构建体。参见例如，Dyka等人，Hum Gene Ther. 2019年9月30日。可以通过用限制性核酸内切酶消化适当的质粒(例如，含有CFH基因的质粒)，以去除rep和cap片段，并且使含有AAVwt-ITR的质粒主链凝胶纯化，来构建ssAAV载体。Choi等人。随后，所需的转基因表达盒可以在适当的限制位点之间插入，以构建单链rAAV载体质粒。可以如Choi等人中所述构建scAAV载体。

然后，可以纯化rAAV载体以及合适的AAV辅助质粒和pXX6 Ad辅助质粒的大规模质粒制剂(至少1 mg) (Choi等人)。合适的AAV辅助质粒可以选自pXR系列pXR1-pXR5，其分别允许AAV2 ITR基因组交叉包装到AAV血清型1至12及其变体的衣壳内。可以基于衣壳的目的细胞靶向的效率来选择适当的衣壳。例如，在本发明的一个优选实施方案中，rAAV载体的衣壳序列的血清型是AAV2，因为已知这种类型的衣壳有效地靶向视网膜细胞。可以采用改变基因组(即转基因表达盒)长度和AAV衣壳的已知方法，以改善表达和/或基因转移到特定细胞类型(例如视网膜视锥细胞)。参见例如，Yang GS，Journal of Virology，76(15): 7651-7660。

接下来，用pXX6辅助质粒、rAAV载体质粒和AAV辅助质粒转染HEK293或HEK293T细胞。Choi等人。随后，使分级的细胞裂解物经受rAAV纯化的多步骤过程，随后为CsCl梯度纯化或肝素琼脂糖凝胶柱纯化。rAAV病毒粒子的产生和定量可以使用斑点印迹测定进行确定。rAAV在细胞培养物中的体外转导可以用于验证病毒的感染性和表达盒的功能性。

除Choi等人中描述的方法之外，用于生产AAV的各种其它转染和纯化方法可以用于本发明的上下文中。例如，瞬时转染方法是可获得的，包括依赖磷酸钙沉淀或PEI方案的方法。各种纯化方法包括碘克沙醇梯度纯化、亲和和/或离子交换柱层析。

除用于产生rAAV载体的实验室规模的方法之外，本发明可以利用本领域已知的用于AAV载体的生物反应器规模制造的技术，包括例如Heilbronn；Clement，N.等人， HumanGene Therapy，20: 796-606。根据一些实施方案，用于产生rAAV载体的方法如Chulay等人(Hum Gene Ther. 2011年2月；22(2):155-65)中所述进行，所述参考文献通过引用随同以其整体并入。

V. 治疗方法

本公开内容提供了用于眼部病症的基因治疗方法，其中将包含AAV1-12或者其一部分或变体的rAAV颗粒递送至受试者的视网膜。根据一个方面，本公开内容提供了治疗眼部疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用如本文所述的表达载体，其中所述表达载体包含编码CFH的核酸，从而治疗受试者中的眼部疾病或病症。根据一些实施方案，表达载体进一步包含两个AAV末端重复。根据一个方面，本公开内容提供了预防或阻止眼部疾病或病症的进展的方法，其包括向有此需要的受试者施用如本文所述的表达载体，其中所述表达载体包含编码CFH的核酸，从而预防或阻止受试者中的眼部疾病或病症的进展。根据另一个方面，本公开内容提供了逆转眼部疾病或病症的进展的方法，其包括向有此需要的受试者施用如本文所述的表达载体，其中所述表达载体包含编码CFH的核酸，从而逆转受试者中的眼部疾病或病症的进展。根据一些实施方案，表达载体进一步包含至少两个AAV末端重复。根据一些实施方案，眼部疾病或病症与补体途径的激活相关。根据一些实施方案，眼部疾病或病症是视网膜变性。根据一些实施方案，视网膜变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)。根据一些实施方案，待治疗的受试者已表现出眼部疾病的一种或多种体征或症状。

AMD是复杂的进行性眼病，其是全世界老年人中的法定失明和视力丧失的主要原因(Pennington等人，Eye Vis. 2016，3，34)。AMD起因于环境和遗传因素两者，尽管其实际病因仍不清楚。受AMD影响的个体数目为约1.96亿，并且预计在2040年增加到2.88亿(Wong等人，Lancet Health 2014，2，e106–e116)。AMD的主要临床症状是中心视力受损，其最终可能导致完全视力丧失。老年按定义是主要的AMD风险因素。按时间顺序，AMD可以分类为早期和晚期。早期AMD的典型特征在于在玻璃膜和RPE之间的细胞外碎片的沉积物的存在和增加。这些碎片被称为玻璃疣，并且其存在随着AMD进展而出现(Joachim等人，Ophthalmology2014，121，917–925)。晚期AMD可能表现为两种形式，萎缩性(干性)和新生血管性(湿性)。根据一些实施方案，AMD是干性AMD。根据一些实施方案，干性AMD是晚期干性AMD。干性形式的AMD是更常见的AMD形式，占年龄相关性黄斑变性的所有病例的85至90百分比。它的特征在于在视网膜下方的称为玻璃疣的微黄色沉积物积聚，以及随着时间过去缓慢恶化的视力丧失。该状况通常影响双眼的视力，尽管视力丧失经常在一只眼中先于另一只眼发生。根据一些实施方案，AMD是湿性AMD。湿性形式的年龄相关性黄斑变性与可以快速恶化的严重视力丧失相关。这种形式的状况的特征在于在黄斑下异常脆弱的血管生长。这些血管渗漏血液和流体，其损害黄斑并且使中心视力显得模糊和扭曲。目前的湿性AMD药物治疗集中于抑制血管内皮生长因子(VEGF)，其刺激血管产生。然而，仍然存在VEGF治疗的长期效应的可能性。在小鼠模型中，用抗VEGF疗法的延长治疗与视网膜内的光感受器及其支持细胞的增加死亡相关联(Ford等人，2012. Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 53，7520-7527；Saint-Genie等人，2008. PLoS ONE 3，e3554)。

根据一些实施方案，本公开内容进一步提供了用于治疗眼部疾病或病症(例如AMD)的方法，其包括将本发明的任何载体施用于需要此类治疗的受试者，从而治疗该受试者。

在任何治疗方法中，载体可以是本领域已知的任何类型的载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体，例如裸露DNA质粒、寡核苷酸(例如如反义寡核苷酸、小分子RNA(siRNA)、双链寡脱氧核苷酸或单链DNA寡核苷酸)。在涉及寡核苷酸载体的具体实施方案中，递送可以通过体内电穿孔(参见例如，Chalberg等人，2005)或电子雪崩转染(参见例如，Chalberg等人，2006)来完成。在进一步的实施方案中，载体是可以任选地封装在水溶性聚合物中的树枝状聚合物/DNA复合物，DNA压缩肽(参见例如，Farjo等人2006，其中CK30，含有与聚乙二醇偶联的半胱氨酸残基，随后为30个赖氨酸的肽，用于基因转移到光感受器)，具有细胞穿透性质的肽(关于肽递送至眼部细胞的实例，参见Johnson等人，2007；Barnett等人，2006；Cashman等人，2003；Schorder等人，2005；Kretz等人，2003)，或者封装DNA的lipoplex、polyplex、脂质体或免疫脂质体(参见例如，Zhang等人，2003；Zhu等人，2002；Zhu等人，2004)。根据一些实施方案，载体是病毒载体，例如衍生自腺伴随病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(HSV))的载体。参见例如，Howarth。在优选的实施方案中，载体是腺伴随病毒(AAV)载体。

根据一些实施方案，本公开内容提供了用于治疗眼部疾病或病症(例如AMD)的方法，其包括施用本文所述的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含编码CFH的核酸序列。

根据一些实施方案，在所得到的重组细胞的体内施用之前，将本文所述的核酸序列直接引入细胞内，核酸序列在所述细胞中表达以产生编码的产物。这可以通过本领域已知的众多方法中的任一种，例如通过此类方法如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染来实现。

药物组合物

根据一些方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含任选地在药学上可接受的赋形剂中的本文所述的任何载体。

如本领域众所周知的，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其促进药理学有效物质的施用，并且可以作为液体溶液或悬浮液、作为乳状液、或者作为适合于在使用之前溶解或悬浮于液体中的固体形式供应。例如，赋形剂可以给予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、封装剂、pH缓冲物质和缓冲剂。此类赋形剂包括适合于直接递送至眼的任何药物试剂，其可以进行施用而无过度毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，各种TWEEN化合物中的任一种，以及液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包括在其中，例如矿物酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。药学上可接受的赋形剂的详尽讨论在REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES (Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可获得。

一般地，这些组合物配制用于通过眼部注射的施用。相应地，这些组合物可以与药学上可接受的媒介物例如盐水、林格氏平衡盐溶液(pH 7.4)等等组合。尽管不是必需的，但组合物可以任选地以适合于施用精确量的单位剂型供应。

施用方法

根据本发明的治疗方法，包含本文所述载体的组合物的施用可以通过本领域已知的任何手段来完成。根据一些实施方案，治疗组合物(例如，编码如本文所述的全长或截短的CFH蛋白(例如，tCFH1)的核酸)是单独施用的(即，不含用于递送的载体)。根据一些实施方案，施用是通过眼部注射。根据一些实施方案，施用是通过视网膜下注射。视网膜下递送的方法是本领域已知的。例如，参见通过引用以其整体并入本文的WO 2009/105690。根据一些实施方案，组合物直接注射到中央视网膜外部的视网膜下间隙内。在其它实施方案中，施用是通过眼内注射、玻璃体内注射、脉络膜上或静脉内注射。载体对视网膜的施用可以是单侧或双侧的，并且可以伴随或不伴随全身麻醉的使用而完成。

通过用包含本文所述载体的组合物安全且有效地转导眼部细胞(例如，RPE)，其中所述载体包含编码CFH的核酸，本发明的方法可以用于治疗个体；例如，患有眼部病症(例如，AMD)的人，其中所述转导的细胞产生以足以治疗眼部疾病的量的CFH。

根据一些实施方案，组合物可以通过或者在相同程序期间或者间隔开数天、数周、数月或数年的一次或多次视网膜下注射进行施用。根据一些实施方案，包含本文所述载体的组合物的多次注射相隔不多于一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、九小时、十二小时或24小时。根据一些实施方案，包含本文所述载体的组合物的多次注射相隔约一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月或更长时间。根据一些实施方案，包含本文所述载体的组合物的多次注射相隔一年、两年、三年、四年、五年或更多年。根据一些实施方案，多种载体可以用于治疗受试者。

根据本发明的治疗方法，可以基于接受治疗的受试者的特性，例如受试者的年龄和载体将递送至其的区域的体积，来确定所递送的载体的体积。已知眼的大小和视网膜下或眼部间隙的体积在个体中不同，并且可能随着受试者的年龄而变。根据一些实施方案，注射到视网膜的视网膜下间隙的组合物的体积多于约1 µl、2 µl、3 µl、4 µl、5 µl、6 µl、7 µl、8 µl、9 µl、10 µl、15 µl、20 µl、25 µl、50 µl、75 µl、100 µl、200 µl、300 µl、400 µl、500 µl、600 µl、700 µl、800 µl、900 µl或1 mL中的任何一个或两者之间的任何量。根据其中在视网膜下施用载体的实施方案，可以选择载体体积，目的是覆盖全部或一定百分比的视网膜下或眼部间隙、或者使得递送特定数目的载体基因组。

根据本公开内容的治疗方法，所施用的载体的浓度可以取决于生产方法而不同，并且可以基于确定为对于特定施用途径治疗上有效的浓度进行选择或优化。根据一些实施方案，以载体基因组/毫升(vg/ml)的浓度选自约10⁸ vg/ml、约10⁹ vg/ml、约10¹⁰ vg/ml、约10¹¹ vg/ml、约10¹² vg/ml、约10¹³ vg/ml和约10¹⁴ vg/ml或两者之间的任何量。在优选的实施方案中，浓度在通过视网膜下注射或玻璃体内注射以约0.05 mL、约0.1 mL、约0.2 mL、约0.4 mL、约0.6 mL、约0.8 mL和约1.0 mL的体积递送的10¹⁰ vg/ml - 10¹³ vg/ml的范围内。

根据一些实施方案，可以将一种或多种另外的治疗剂施用于受试者。例如，可以将抗血管生成剂(例如，核酸或多肽)施用于受试者。

本文所述的组合物的有效性可以通过几个标准来监测。例如，在受试者中使用本公开内容的方法的治疗后，可以通过一种或多种临床参数包括本文所述的那些临床参数，就例如疾病状态的一种或多种体征或症状的进展中的改善和/或稳定化和/或延迟来评价受试者。此类测试的实例是本领域已知的，并且包括客观以及主观(例如，受试者报告的)测量。例如，为了测量治疗对受试者的视觉功能的有效性，可以评估下述中的一种或多种：受试者的主观视力质量、受试者的暗适应、受试者的改善的中心视力功能(例如，受试者流畅地阅读且识别人脸的能力的改善)、受试者的视觉流动性(例如，导航迷宫所需的时间的减少)、受试者的视敏度(例如，受试者的Log MAR评分的改善)、微视野检查法(例如，受试者的dB评分的改善)、暗适应视野检查法(例如，受试者的dB评分的改善)、精细矩阵映射(例如，受试者的dB评分的改善)、Goldmann视野检查法(例如，暗点区域(即失明区域)的大小减少和分辨较小靶的能力的改善)、闪烁灵敏度(例如赫兹的改善)、自发荧光和电生理学测量(例如ERG的改善)。根据一些实施方案，视觉功能通过受试者的暗适应进行测量。暗适应测试是用于确定视杆光感受器在黑暗中增加其灵敏度的能力的测试。该测试是在其下视杆和视锥系统在暴露于明亮光源之后恢复在黑暗中的灵敏度的速率的测量。根据一些实施方案，视觉功能通过受试者的视觉移动性进行测量。根据一些实施方案，视觉功能通过受试者的视敏度进行测量。根据一些实施方案，视觉功能通过微视野检查法进行测量。根据一些实施方案，视觉功能通过暗适应视野检查法进行测量。根据一些实施方案，视觉功能通过ERG进行测量。根据一些实施方案，视觉功能通过受试者的主观视觉质量进行测量。

AMD的体外和体内模型

人胎儿RPE (hfRPE)的原代培养物已显示为AMD研究中的有用工具，因为它们模拟了天然RPE的功能和代谢活性(Ablonczy等人，2011. Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 52，8614-8620)。AMD研究中使用的其它RPE细胞类型包括衍生自干细胞的RPE和永生化的ARPE-19细胞系(Dunn等人，1996，Exp. Eye Res. 62，155-170).

Cfh−/−小鼠模型是可以用于研究AMD的体内模型。

补体因子H (CFH)通过防止C3b与因子B的结合并阻断C3转化酶的形成，在替代途径中发挥重要的调控作用(Pickering和Cook，2008. Clin Exp Immunol. 2008 Feb；151(2):210-30)。CFH功能的缺乏导致替代途径的失调，导致C3的低全身水平，C3在肾小球基底膜中的沉积，以及最终地II型膜性增生性肾小球肾炎(MPGN) (Pickering和Cook，2008)。遗传改造为缺乏补体因子H的小鼠也发展MPGN和暗示AMD的视网膜异常(Coffey等人，2007.Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Oct 16；104(42):16651-6；Pickering等人，2002. NatGenet. 2002 Aug；31 (4):424-8)。在2岁时，这些动物证实如通过水迷宫测量的视敏度降低、视杆驱动视网膜电图(ERG) a波和b波应答的减少、增加的视网膜下自发荧光、视网膜中的补体沉积和光感受器外段的解体。

转基因CFHY402H小鼠模型是可以用于研究AMD的体内模型。为了进一步阐明CFH突变通过其促成AMD的机制，构建了在人ApoE启动子的控制下表达Y402H多态性的转基因小鼠系(Ufret-Vincenty等人，2010. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Nov；51 (11):5878-87)。这种小鼠模型中的AMD样症状发展也需要高脂肪饮食。ApoE基因编码载脂蛋白E，其在形成用于脂质转运的脂蛋白方面是重要的。在1岁时，这些动物证实比野生型小鼠或Cfh−/−小鼠中可见的更大数目的玻璃疣样沉积物。免疫组织化学揭示了视网膜下间隙中的小胶质细胞和巨噬细胞的数目增加，并且电子显微镜检查显示了玻璃膜的增厚和C3d的基底膜沉积。

VI.试剂盒

如本文所述的rAAV组合物可以包含在设计用于如本文所述的本公开内容的方法之一的试剂盒中。根据一些实施方案，本公开内容的试剂盒包含(a)本公开内容的任何一种载体、以及(b)其使用说明书。根据一些实施方案，本公开内容的载体可以是本领域已知的任何类型的载体，包括如上所述的非病毒或病毒载体。根据一些实施方案，载体是病毒载体，例如衍生自腺伴随病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒(HSV))的载体。根据优选的实施方案，载体是腺伴随病毒(AAV)载体。

根据一些实施方案，试剂盒可以进一步包含使用说明书。根据一些实施方案，试剂盒进一步包含用于眼部递送(例如，眼内注射、玻璃体内注射、脉络膜上或静脉内注射)本文所述的rAAV载体的组合物的装置。根据一些实施方案，使用说明书包括根据本文所述方法之一的说明书。由试剂盒提供的说明书可以描述可以如何施用载体用于治疗目的，例如，用于治疗眼部疾病或病症(例如，AMD)。根据其中试剂盒待用于治疗目的的一些实施方案，说明书包括关于推荐剂量和施用途径的细节。

根据一些实施方案，试剂盒进一步含有缓冲剂和/或药学上可接受的赋形剂。也可以使用另外的成分，例如防腐剂、缓冲剂、张度剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子润湿剂或澄清剂、增粘剂等等。本文所述的试剂盒可以以单一单位剂量或多剂量形式进行包装。试剂盒的内容物一般配制为无菌且基本上等渗的溶液。

本文提到的所有专利和出版物通过引用并入本文至由法律允许的范围，用于描述且公开其中报道的可能与本公开内容一起使用的蛋白质、酶、载体、宿主细胞和方法学的目的。然而，本文中的任何内容均不应解释为承认本公开内容无权凭借在先公开内容而早于此类公开内容。

本公开内容通过下述实施例进行进一步说明，所述实施例不应被解释为进一步的限制。所有附图以及本申请自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图都明确地通过引用以其整体并入本文。

实施例

实施例1. 构建体设计和克隆

CFH由20种CCP组成，所述CCP充当关于其它蛋白质的结合位点。已知前7种CCP对于补体调控是重要的，如通过天然发生的截短的CFH “FHL-1”证明的。这种截短形式的CFH(显示为SEQ ID NO: 7)由前7种CCP组成，并且保留了作为补体调节剂的一些功能。因此，我们旨在通过去除没有已知功能的CCP或具有冗余结合位点的CCP来截短CFH。生成了两种另外的截短构建体用于“概念验证”，其中缺失已知对于功能重要的CCP，以充当功能丧失的对照。

CBA启动子是广泛使用的强大启动子，其能够驱动跨越多种细胞类型的GOI表达。CBA启动子的缺点在于其大尺寸。在本文的工作中，测试CBA启动子的截短版本，并且用于节省AAV载体构建体中的空间。

CBA启动子由CMV ie增强子、核心鸡β-肌动蛋白启动子、短外显子和长内含子组成。CMV ie增强子和内含子是完整启动子的最大区段，并且对于启动子功能并非关键的，而是充当增强子元件。因此，目的是通过缺失CMV ie增强子和内含子的一部分来截短启动子。另外，评估先前生成的小型CBA启动子(smCBA)，并且包括在构建体中。

pTR-CBA-flCFH：为了生成pTR-CBA-flCFH构建体，通过NotI消化从pUC57-flCFH中切除flCFH片段，并且随后生成pTR-CBA-flCFH

pTR-CBA-FHL-1：与用于pTR-CB-flCFH构建相同的克隆策略用于pTR-CB-FHL-1质粒克隆。合成FHL-1 cDNA序列(NCBI CCDS ID: 53452.1)加上在两端处适当的克隆位点(NotI)，以产生pTR-CBA_FHL-1

pTR-smCBA-flCFH：pTR-smCBA-flCFH通过用smCBA启动子替换pTR-CBA-flCFH中的完整CBA启动子进行构建。全长CBA和smCBA两者均可以从其亲本质粒中切除。

pTR-smCBA-tCFH1：截短的CFH基因“tCFH1”经由PCR扩增生成，并且随后克隆到pTR-smCBA主链内。生成了侧翼为用于连接的特定限制位点的两个PCR片段(一个含有CCP 1至15，而另一个含有CCP 18至20)，用XhoI/KpnI或KpnI/NotI消化，然后连接到pTR-smCBA主链内。SEQ ID NO: 2显示了tCFH1的核酸序列。

pTR-smCBA-tCFH2：截短的CFH基因“tCFH2”经由PCR扩增生成，并且随后克隆到pTR-smCBA主链内。生成了两个PCR片段(一个含有CCP 1至4，而另一个含有CCP 18至20)，用XhoI/KpnI或KpnI/NotI消化，然后通过3片连接(3-piece ligation)而连接到pTR-smCBA主链内。SEQ ID NO: 3显示了tCFH2的核酸序列。

pTR-smCBA-tCFH3：截短的CFH基因“tCFH3”经由PCR扩增生成，并且随后克隆到pTR-smCBA主链内。生成了两个PCR片段(一个含有CCP 1至9，而另一个含有CCP 16至20)，用XhoI/KpnI或KpnI/NotI消化，然后通过3片连接而连接到pTR-smCBA主链内。SEQ ID NO: 4显示了tCFH3的核酸序列。

pTR-smCBA-tCFH4：截短的CFH基因“tCFH4”经由PCR扩增生成，并且随后克隆到pTR-smCBA主链内。生成了两个PCR片段(一个含有CCP 1至7，而另一个含有CCP 18至20)，用XhoI/KpnI或KpnI/NotI消化，然后通过3片连接而连接到pTR-smCBA主链内。SEQ ID NO: 5显示了tCFH4的核酸序列。

实施例2. rAAV生产

如先前所述的(Xiao等人(1998) J. Virol. 72:2224-2232)，通过人胚肾癌293细胞(HEK-293)的转染来产生重组AAV载体。转基因处于鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或CBA启动子的短版本(SmCBA)的控制下。在转染后68-76小时收集病毒，并且使用碘克沙醇(IOD)梯度超速离心纯化两次。在纯化后，然后使用分子量截止过滤器，将病毒浓缩并在BSST (具有0.014% Tween 20的Alcon平衡盐溶液)中配制。

实施例3. 体外研究

首先，用由CFH变体转染的HEK293细胞进行实验。执行ELISA测定以确定培养基中的CFH浓度(ng/ml)。图2是显示在人胚肾293 (HEK293)细胞的质粒转染之后，CFH变体的表达的图。HEK293细胞用含有改造的CFH变体(如图1A中所示的pTR-CFH变体)的质粒进行转染。细胞裂解物在转染之后48小时进行收集，并且贮存于-80℃下直至测定。确定裂解物中的CFH浓度(ng/ml)。

用细胞裂解物执行切割测定，以确定人补体组分C3b (C3b)通过CFH变体的切割。图3显示了用抗C3/C3b抗体(Abcam，目录# 129945)测定人C3b通过CFH变体的切割的蛋白质印迹结果。HEK293细胞用质粒进行转染，并且收集的样品如图2中所述进行贮存。图3显示了在smCBA-tCFH1泳道(泳道6，在方框中显示)中观察到有效切割。切割通过CFH变体smCBA-tCFH2和smCBA-tCFH4不存在或很低。可以用细胞上清液进行相同的程序，具有类似的预计结果。

基于这些结果，选择下述CFH变体用于AAV生产：1) pTR-smCBA-flCFH；2) pTR-smCBA-tCFH1；3) pTR-CBA-tCFH3；4) pTR-CBA-FHL-1。

接下来，执行HEK293细胞的rAAV-CFH感染。ELISA测定用于测量培养基中的CFH浓度(ng/ml)。图4是显示在HEK293细胞用1 x 10⁴ vg的感染复数(MOI)的rAAV感染之后，CFH变体的表达的图。在感染后72小时收集样品，并且确定培养基中的CFH浓度(ng/ml)。如图中所示的，在HEK293细胞的rAAV-CFH感染之后72小时，存在改造的CFH构建体的稳固表达。

用细胞裂解物执行测定，以确定人补体组分C3b (C3b)通过rAAV表达的CFH变体的切割。结果显示于图5中。如图5中所示， C3b的切割通过FHL-1是最有效的，随后为tCFH1和flCFH。

实施例4. 溶血实验

这项研究的目的是通过评估每种构建体诱导兔红细胞中的裂解/抑制绵羊红细胞的裂解的能力，在体外评估rAAV-CFH变体的功能性。

补体因子H (CFH)蛋白由20种补体控制蛋白(CCP)组成，所述补体控制蛋白各自在替代补体途径激活中发挥关键功能。CCP 1-4对于液相中的C3b结合(C3b切割为iC3b)是重要的，而除结合C3b之外，CCP 19-20还结合自身表面上发现的糖胺聚糖(GAG)和唾液酸(SA)(Kerr等人，J. Biol. Chem. 2017；292(32):13345-13360)。尽管所有CCP都以协作的方式工作，以实现在外来表面上的补体激活以及在自身表面上的补体抑制，但关键CCP的缺乏可以阻碍CFH蛋白在生物环境中的主要功能。

因为CFH变体涉及从野生型CFH中缺失CCP (如图1A中所示)，所以在溶血测定中测试其帮助确定对于关键功能(例如CFH的液相活性和膜结合活性)重要的CCP。

CFH在血清中的替代补体途径的体外激活中发挥关键作用。红细胞(RBC)对这种补体激活是敏感的，促使其裂解并释放血红蛋白。因此，RBCs的裂解将实验稀释剂变成红色，并且等价于所释放的血红蛋白量的红色强度可以在415nm处进行光度测量。

替代补体调节蛋白如CFH负责识别自身与非自身。并不表达人调节蛋白的外来病原体被替代途径(AP)识别且破坏。因子B、因子D和备解素蛋白是替代补体系统所独有的。AP途径能够经由自发地发生的C3的“缓慢运转(tickover)”自动激活，生成蛋白质中的构象变化。这种修饰的C3能够结合因子B，导致其构象变化。修饰的因子B被活性血清蛋白酶因子D切割，生成Ba和Bb。Bb蛋白保持与复合物结合，所述复合物然后可以切割另外的C3分子，生成C3b。C3b与因子B结合，以生成更多的C3转化酶(C3bBb)。上述步骤通过血清蛋白备解素得到增强，所述血清蛋白备解素负责稳定蛋白质：蛋白质相互作用。因此，当C3b结合因子B时，AP可以作为扩增环启动(Thurman等人，J Immunol 2006；176(3):1305-1310)。因此，游离因子B的不存在指示补体途径的持续激活。

由于AP途径可以自发地激活，因此需要系统的持续控制。CFH是活性AP抑制剂，并且通过结合C3b并将其转换为无活性的C3b或iC3b而发挥功能，从而防止AP环的扩增。因此，并未形成C3bBb转化酶，在血清中留下游离的因子B。

向RBC中添加血清引起C3的激活和AP环的扩增，当血清缺乏控制蛋白如CFH时，其无需调控而进展。兔RBC膜有效地结合C3b并且显示对调控蛋白的失活是抗性的，因为它们缺乏在膜上的唾液酸残基(Fearon等人，J Exp Med 1977；146(1): 22-33)。在CFH耗尽的血清中，C3的自发液相激活无需通过CFH的调控而发生，用尽了所有的游离因子B。由于游离因子B的不存在，AP环并不持续扩增，并且因此不形成C3b。已显示了，耗尽CFH的人血清并未显示C3调理作用。将CFH耗尽的血清重构至生理水平导致C3调理作用。(van der maten等人，JID 2016；213:1820-1827)。当CFH耗尽的血清连同CFH一起加入兔RBC中时，AP活化导致RBC膜上的C3b沉积，并且AP进展导致膜攻击复合物(MAC)形成，引起RBC的裂解。在415nm光度测量通过增加浓度的CFH诱导的裂解。当血清中的CFH恢复到生理水平时，观察到100%的裂解。

正常人血清含有生理水平的CFH。因此，C3激活在CFH的调控下进行。当将正常人血清加入抗体致敏的绵羊红细胞中时，C3b结合并激活绵羊RBC膜上的AP。绵羊RBC具有富含唾液酸的表面，其可以结合CFH的C末端(Yoshida等人，PLoS One 2015；10 (5): 1-21)。因此，当将CFH加入反应中时，它结合绵羊RBC膜，有效地阻断C3扩增环。结果，绵羊RBC的溶血受到抑制。

绵羊和兔RBC帮助评估CFH的不同功能。绵羊RBC的溶血揭示了由CCP 19-20调节的CFH的膜结合活性。兔RBC的溶血揭示了主要受CCP 1-4调节的CFH的液相活性。本文所述的CFH变体对绵羊和兔RBC两者进行测试，以评估其功能性。

测定条件如下：

条件	规格	目的
			MgEGTA	3mM浓度	在RBC表面上的AP途径的选择性扩增
红血细胞(绵羊/兔)	2E6个细胞/反应	测试CFH的膜结合活性(主要由CCP 19-20赋予)
			血清(正常人血清/CFH 耗尽的血清)	20%反应体积	供应对于RBC上的补体激活所必需的组分
因子H (CFH)	纯化的CFH蛋白，来自转染的分泌的CFH (3-5ug/反应)	测试CFH对RBC的保护/裂解促进活性
			光密度(OD)	在415 nm处的吸光度读数	吸光度用于测量由于AP激活，通过破裂的RBC分泌的血红蛋白水平

反应通过将RBC与含有MgEGTA、血清和CFH蛋白(纯化的、转染或感染上清液)的缓冲液混合进行制备，并且在37℃下温育30分钟。MgEGTA对于选择性和增强的AP激活是关键的(des Prez等人，Infection and Immunity 1975；11 (6):1235-1243)。将RBC离心并且对于反应各自测量上清液在415nm处的光密度。反应一式两份执行。

用CFH质粒变体转染HEK293T细胞，并且在转染后72小时收获上清液。在溶血测定之前测量上清液中的CFH水平。

用rAAV-CFH变体感染HEK293T细胞，并且在感染后72小时收获上清液。在溶血测定之前测量上清液中的CFH水平。

结果显示于图13中。如图13中所示，rAAV-CFH变体对兔RBC具有裂解促进功能。在图的顶部上的条指示了通过CFH对兔RBC诱导的裂解水平。测量裂解水平并在图中绘制。野生型CFH的功能性与具有和不具有HA标签的tCFH1可比较。这指示了截短的tCFH1由对于分泌功能关键的所有CCP区域组成。HA标签并不干扰tCFH1功能性。当与切割测定相比较时，FHL1和tCFH3功能性相对较低，所述切割测定测量CFH构建体的相同分泌功能。切割测定在反应中使用<1ng的C3b，并且不模拟血清中的AP途径的复杂性。因此，我们在这两种体外测定中观察到FHL1和tCFH3的活性中的不一致。还如图13中显示的，rAAV-CFH变体对绵羊RBC具有CFH的保护功能。在图的底部上的条指示了通过CFH对绵羊RBC发挥的保护功能水平。对照血清具有固有的CFH水平，其并未显示不受裂解的高度保护。然而，反应中供应的CFH构建体可以结合绵羊红细胞并阻断AP途径，因此抑制RBC的破裂，反映为减少的OD415nm读数。通过FHL1降低的裂解活性显示了CCP 19-20对于膜结合活性是关键的。这使得FHL-1成为良好的概念验证对照。野生型CFH的功能性与具有和不具有HA标签的tCFH1可比较。这指示了截短的tCFH1由对于分泌以及膜结合功能性关键的所有CCP区域组成。HA标签并不干扰tCFH1功能性。CCP 10-15也已显示了在CFH的C3b结合活性中发挥作用。这种功能性也促成CFH的溶血活性。这解释了tCFH3在保护绵羊RBC免于裂解方面的功能性减少。

实施例5. FHL-1和tCFH1构建体在cfh -/-小鼠中的体内测试

在CFH缺陷(cfh-/-)小鼠中测量AAV-FHL-1载体和AAV-tCFH1的活性。小鼠用1.0¹²、1.0¹¹和1.0¹⁰ vg/mL的AAV-FHL-1或1.0¹² vg/mL的AAV-tCFH1视网膜下给药到一只眼内。在8周后，终结小鼠并分析眼的CFH表达。除了用1.0¹⁰ vg/mL给药的眼之外，大多数眼对于CFH表达呈阳性(检测到剂量应答)。大多数用AAV-tCFH1给药的眼揭示了除表达水平之外的FB固定，而对于FHL-1呈阳性的眼则没有。

图7A和图7B显示了确定通过tCFH1变体的补体固定(因子B (FB)的检测)的蛋白质印迹结果。图7A显示了在注射tCFH1的cfh-/-小鼠中的因子B固定。图7B显示了tCFH1和FHL-1的表达。图7A和图7B中所示的结果显示了由rAAV-tCFH1视网膜下注射诱导的tCFH1表达可以固定RPE/脉络膜中的因子B (FB)。CFH变体FHL-1并未显示FB固定。这些结果支持了由rAAV表达的tCFH1的生物学功能性，并且是首次AAV表达的CFH变体显示补体固定。

实施例6. cfh -/-小鼠中的tCFH1构建体剂量范围发现研究

在CFH缺陷(cfh-/-)小鼠中测量以高、中和低剂量的AAV-tCFH1的活性。下表显示了研究的细节：

视网膜电图(ERG)是测量视网膜响应光刺激的电活性的诊断测试。ERG的b波被广泛认为反映双极细胞的激活。在终结之前，测量了关于媒介物和中剂量rAAV2tYF-smCBA-tCFH1小鼠的暗视b波ERG。BMAX1是暗视ERG的视杆占优势组分，而BMAX2是暗视ERG的视锥占优势组分。图8A显示了用媒介物给药的小鼠中的结果。图8B显示了用tCFH1中剂量给药的小鼠的结果。可见所有注射的眼中ERG的一些减少，并且归于手术程序。中和低剂量组的最低限度减少显示了载体安全性。在高剂量组中可见更广泛的减少，其指示了在高剂量下的一些载体毒性。

在终结之前，光学相干断层扫描(OCT)用于生成来自左(注射的)和右(未注射的)眼的眼部组织的体内横截面图像。关于组1-6各自的结果显示于图9中。如图9中所示，在与手术程序有关的所有注射的眼中观察到少许外核层(ONL)变薄。在高剂量组中观察到超出注射区域更广泛的ONL变薄，其指示了在高剂量下的一些载体毒性。在未注射的眼中没有观察到ONL的变化。在终结后对眼执行组织学检查，并且对于组1-6中的每一个，来自左眼(注射的)和右眼(未注射的)上的眼部组织的代表性组织学图像显示于图10中。可见所有注射的眼中的少许光感受器层变薄和免疫细胞浸润，并且与手术程序有关。然而，如图10中所示，在高剂量组中可见更广泛的光感受器层变薄和免疫细胞浸润，其指示了在高剂量下的一些载体毒性。在未注射的眼中没有观察到变化。

闭锁小带-1 (ZO-1)是细胞间连接的主要结构蛋白。接下来，执行ZO-1染色，以评价视网膜色素上皮(RPE)畸形，其将指示组1-6各自中的RPE应激。未注射的眼用作对照。从每组和对照中获得的RPE片层的平面固定(Flatmounts)就ZO-1和Hoechst (核)进行染色，并且用共聚焦显微镜检查进行成像。在所有注射的眼中观察到一些细胞解体和免疫细胞，其与手术过程有关(未显示)。在未注射的眼中，RPE形态类似在视网膜各处具有均匀大小的规则六边形细胞阵列。然而，在高剂量组中观察到更广泛的细胞解体和免疫细胞，因此指示了在高剂量下的一些载体毒性(未显示)。

通过蛋白质印迹确认了在用以低、中和高剂量的tCFH1变体注射的cfh-/-小鼠中的tCFH蛋白表达。如图11中所示，在tCFH蛋白表达中可见剂量应答，而用高和中剂量观察到显著水平的tCFH1表达。用低剂量观察到最低限度的tCFH1表达。来自正常C57Bl6小鼠和表达正常人CFH的转基因小鼠的视网膜提取物用作阳性对照。ELISA也用于确认tCFH1表达。从ELISA实验获得的结果确认了来自蛋白质印迹的结果，其中在tCFH蛋白表达中可见剂量应答，而用高和中剂量观察到显著水平的tCFH1表达。用低剂量观察到最低限度的tCFH1表达。下表显示了如通过ELISA确定的tCFH1蛋白表达。

补体系统在内源性条件下在视网膜、RPE和脉络膜中是活性的。因子B (FB)组分已在正常视网膜中检测到，并且几种人补体组分和调节因子例如因子B中的遗传变异都已与AMD的发生相关联(Gold B等人，Nat Genet. 2006；38:458–62)。图12显示了在用以不同剂量的tCFH1变体注射的cfh-/-小鼠中，确定因子B (FB)补体固定(FB的检测)的蛋白质印迹结果。如图中12所示，观察到剂量应答，具有在较高剂量下的tCFH1表达与FB固定之间的更好关联。高剂量和中剂量显示FB恢复，而在低剂量下未观察到FB恢复。

实施例7. rAAV-CFH载体在CFH H402小鼠中的体内测试

这项研究的目的是评估rAAV-CFH载体在CFH H402小鼠(CFH-HH:cfh-/-)中的功效。

补体因子H (CFH)单核苷酸多态性(SNP)已报道为年龄相关性黄斑变性(AMD)发病机制的重要遗传风险因素。已发现Y402H多态性是AMD易感性的最高风险因素。在cfh-/-小鼠背景(CFH-HH:cfh-/-)中表达全长人CFH H402的转基因小鼠模型用于测试rAAV-CFH载体的效应。小鼠年龄达到90周，并且饲喂高脂肪、富含胆固醇(HFC)的饮食。观察到AMD样表型，包括视力丧失、增加的视网膜色素上皮(RPE)损伤和增加的亚RPE沉积物形成。

rAAV-hCFH载体将在这种CFH-HH:cfh-/-鼠模型中进行测试，并且评估拯救ERG、停止或减少RPE畸形发生且停止或减少亚RPE沉积物累积的功效。

研究设计

rAAV-tCFH1将在视网膜下施用于H402小鼠模型(以HFC饮食的>90周龄的CFH-HH:cfh -/-小鼠)，以评估其关于抑制AMD样病理表型的功效，所述AMD样病理表型包括视力丧失、视网膜色素上皮(RPE)损伤和亚RPE沉积物形成。仅注射一只眼。

研究设计的表显示于下文。

等价方案

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。此类等价方案预期由下述权利要求包含。

<110> APPLIED GENETIC TECHNOLOGIES CORPORATION

<120> 用于治疗年龄相关性黄斑变性及其它眼部疾病和病症的腺伴随病毒(AAV)载体

<130> 119561-01720

<140>

<141>

<150> 62/924,338

<151> 2019-10-22

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3696

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60

tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120

acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180

aatattataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240

cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300

ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360

ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420

tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480

gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540

ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600

gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660

atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720

tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780

tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840

aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900

gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960

accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1020

cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1080

tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 1140

ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1200

aattatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1260

gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 1320

agatgcatcc gtgtcaaaac atgttccaaa tcaagtatag atattgagaa tgggtttatt 1380

tctgaatctc agtatacata tgccttaaaa gaaaaagcga aatatcaatg caaactagga 1440

tatgtaacag cagatggtga aacatcagga tcaattagat gtgggaaaga tggatggtca 1500

gctcaaccca cgtgcattaa atcttgtgat atcccagtat ttatgaatgc cagaactaaa 1560

aatgacttca catggtttaa gctgaatgac acattggact atgaatgcca tgatggttat 1620

gaaagcaata ctggaagcac cactggttcc atagtgtgtg gttacaatgg ttggtctgat 1680

ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1740

gatcgcaaga aagaccagta taaagttgga gaggtgttga aattctcctg caaaccagga 1800

tttacaatag ttggacctaa ttccgttcag tgctaccact ttggattgtc tcctgacctc 1860

ccaatatgta aagagcaagt acaatcatgt ggtccacctc ctgaactcct caatgggaat 1920

gttaaggaaa aaacgaaaga agaatatgga cacagtgaag tggtggaata ttattgcaat 1980

cctagatttc taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2040

ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2100

tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2160

gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2220

cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2280

cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2340

tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2400

gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2460

cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2520

gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2580

ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2640

attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700

tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 2760

agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 2820

gttgtagctc acatgtcaga cagttatcag tatggagaag aagttacgta caaatgtttt 2880

gaaggttttg gaattgatgg gcctgcaatt gcaaaatgct taggagaaaa atggtctcac 2940

cctccatcat gcataaaaac agattgtctc agtttaccta gctttgaaaa tgccataccc 3000

atgggagaga agaaggatgt gtataaggcg ggtgagcaag tgacttacac ttgtgcaaca 3060

tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 3120

ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 3180

tcgagacaga tgagtaaata tccatctggt gagagagtac gttatcaatg taggagccct 3240

tatgaaatgt ttggggatga agaagtgatg tgtttaaatg gaaactggac ggaaccacct 3300

caatgcaaag attctacagg aaaatgtggg ccccctccac ctattgacaa tggggacatt 3360

acttcattcc cgttgtcagt atatgctcca gcttcatcag ttgagtacca atgccagaac 3420

ttgtatcaac ttgagggtaa caagcgaata acatgtagaa atggacaatg gtcagaacca 3480

ccaaaatgct tacatccgtg tgtaatatcc cgagaaatta tggaaaatta taacatagca 3540

ttaaggtgga cagccaaaca gaagctttat tcgagaacag gtgaatcagt tgaatttgtg 3600

tgtaaacggg gatatcgtct ttcatcacgt tctcacacat tgcgaacaac atgttgggat 3660

gggaaactgg agtatccaac ttgtgcaaaa agatag 3696

<210> 2

<211> 3351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 2

atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60

tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120

acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180

aatattataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240

cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300

ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360

ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420

tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480

gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540

ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600

gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660

atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720

tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780

tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840

aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900

gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960

accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1020

cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1080

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ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1200

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ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1740

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attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700

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acaacatgtt gggatgggaa actggagtat ccaacttgtg caaaaagata g 3351

<210> 3

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 3

atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60

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<210> 4

<211> 2616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

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atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720

tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780

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tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 2040

ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 2100

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<210> 5

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

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aattatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1260

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<211> 1350

<212> DNA

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 6

atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60

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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

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tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 2040

acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 2100

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ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 2280

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gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 2580

atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 2640

tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 2700

tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 2760

aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 2820

gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 2880

accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 2940

cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 3000

tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 3060

ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 3120

aattatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 3180

gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 3240

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agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 3360

atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 3420

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gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggcca 3656

<210> 8

<211> 3372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 8

atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60

tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120

acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180

aatcgccctg gatatagatc tcttggaaat atcataatgg tatgcaggaa gggagaatgg 240

gttgctctta atccattaag gaaatgtcag aaaaggccct gtggacatcc tggagatact 300

ccttttggta cttttaccct tacaggagga aatgtgtttg aatatggtgt aaaagctgtg 360

tatacatgta atgaggggta tcaattgcta ggtgagatta attaccgtga atgtgacaca 420

gatggatgga ccaatgatat tcctatatgt gaagttgtga agtgtttacc agtgacagca 480

ccagagaatg gaaaaattgt cagtagtgca atggaaccag atcgggaata ccattttgga 540

caagcagtac ggtttgtatg taactcaggc tacaagattg aaggagatga agaaatgcat 600

tgttcagacg atggtttttg gagtaaagag aaaccaaagt gtgtggaaat ttcatgcaaa 660

tccccagatg ttataaatgg atctcctata tctcagaaga ttatttataa ggagaatgaa 720

cgatttcaat ataaatgtaa catgggttat gaatacagtg aaagaggaga tgctgtatgc 780

actgaatctg gatggcgtcc gttgccttca tgtgaagaaa aatcatgtga taatccttat 840

attccaaatg gtgactactc acctttaagg attaaacaca gaactggaga tgaaatcacg 900

taccagtgta gaaatggttt ttatcctgca acccggggaa atacagcaaa atgcacaagt 960

actggctgga tacctgctcc gagatgtacc ttgaaacctt gtgattatcc agacattaaa 1020

catggaggtc tatatcatga gaatatgcgt agaccatact ttccagtagc tgtaggaaaa 1080

tattactcct attactgtga tgaacatttt gagactccgt caggaagtta ctgggatcac 1140

attcattgca cacaagatgg atggtcgcca gcagtaccat gcctcagaaa atgttatttt 1200

ccttatttgg aaaatggata taatcaaaat tacggaagaa agtttgtaca gggtaaatct 1260

atagacgttg cctgccatcc tggctacgct cttccaaaag cgcagaccac agttacatgt 1320

atggagaatg gctggtctcc tactcccaga tgcatccgtg tcaaaacatg ttccaaatca 1380

agtatagata ttgagaatgg gtttatttct gaatctcagt atacatatgc cttaaaagaa 1440

aaagcgaaat atcaatgcaa actaggatat gtaacagcag atggtgaaac atcaggatca 1500

attacatgtg ggaaagatgg atggtcagct caacccacgt gcattaaatc ttgtgatatc 1560

ccagtattta tgaatgccag aactaaaaat gacttcacat ggtttaagct gaatgacaca 1620

ttggactatg aatgccatga tggttatgaa agcaatactg gaagcaccac tggttccata 1680

gtgtgtggtt acaatggttg gtctgattta cccatatgtt atgaaagaga atgcgaactt 1740

cctaaaatag atgtacactt agttcctgat cgcaagaaag accagtataa agttggagag 1800

gtgttgaaat tctcctgcaa accaggattt acaatagttg gacctaattc cgttcagtgc 1860

taccactttg gattgtctcc tgacctccca atatgtaaag agcaagtaca atcatgtggt 1920

ccacctcctg aactcctcaa tgggaatgtt aaggaaaaaa cgaaagaaga atatggacac 1980

agtgaagtgg tggaatatta ttgcaatcct agatttctaa tgaagggacc taataaaatt 2040

caatgtgttg atggagagtg gacaacttta ccagtgtgta ttgtggagga gagtacctgt 2100

ggagatatac ctgaacttga acatggctgg gcccagcttt cttcccctcc ttattactat 2160

ggagattcag tggaattcaa ttgctcagaa tcatttacaa tgattggaca cagatcaatt 2220

acgtgtattc atggagtatg gacccaactt ccccagtgtg tggcaataga taaacttaag 2280

aagtgcaaat catcaaattt aattatactt gaggaacatt taaaaaacaa gaaggaattc 2340

gatcataatt ctaacataag gtacagatgt agaggaaaag aaggatggat acacacagtc 2400

tgcataaatg gaagatggga tccagaagtg aactgctcaa tggcacaaat acaattatgc 2460

ccacctccac ctcagattcc caattctcac aatatgacaa ccacactgaa ttatcgggat 2520

ggagaaaaag tatctgttct ttgccaagaa aattatctaa ttcaggaagg agaagaaatt 2580

acatgcaaag atggaagatg gcagtcaata ccactctgtg ttgaaaaaat tccatgttca 2640

caaccacctc agatagaaca cggaaccatt aattcatcca ggtcttcaca agaaagttat 2700

gcacatggga ctaaattgag ttatacttgt gagggtggtt tcaggatatc tgaagaaaat 2760

gaaacaacat gctacatggg aaaatggagt tctccacctc agtgtgaagg cacctcctgt 2820

gtgaatccgc ccacagtaca aaatgcttat atagtgtcga gacagatgag taaatatcca 2880

tctggtgaga gagtacgtta tcaatgtagg agcccttatg aaatgtttgg ggatgaagaa 2940

gtgatgtgtt taaatggaaa ctggacggaa ccacctcaat gcaaagattc tacaggaaaa 3000

tgtgggcccc ctccacctat tgacaatggg gacattactt cattcccgtt gtcagtatat 3060

gctccagctt catcagttga gtaccaatgc cagaacttgt atcaacttga gggtaacaag 3120

cgaataacat gtagaaatgg acaatggtca gaaccaccaa aatgcttaca tccgtgtgta 3180

atatcccgag aaattatgga aaattataac atagcattaa ggtggacagc caaacagaag 3240

ctttattcga gaacaggtga atcagttgaa tttgtgtgta aacggggata tcgtctttca 3300

tcacgttctc acacattgcg aacaacatgt tgggatggga aactggagta tccaacttgt 3360

gcaaaaagat ag 3372

<210> 9

<211> 1116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 9

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1 5 10 15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

20 25 30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met

50 55 60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65 70 75 80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

100 105 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

115 120 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

130 135 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145 150 155 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

165 170 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

180 185 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

195 200 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

210 215 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225 230 235 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

245 250 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

260 265 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

275 280 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

290 295 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305 310 315 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

325 330 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

340 345 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

355 360 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

370 375 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385 390 395 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

405 410 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

420 425 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

435 440 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

450 455 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465 470 475 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Arg Cys Gly Lys

485 490 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

500 505 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

515 520 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

530 535 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

565 570 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

580 585 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

595 600 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

610 615 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625 630 635 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

645 650 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

660 665 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

675 680 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

690 695 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705 710 715 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

725 730 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

740 745 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

755 760 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

770 775 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785 790 795 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

805 810 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

820 825 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

835 840 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

850 855 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865 870 875 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

885 890 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

900 905 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

915 920 925

Leu Gly Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala Tyr Ile

930 935 940

Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr

945 950 955 960

Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys

965 970 975

Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly

980 985 990

Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe

995 1000 1005

Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys

1010 1015 1020

Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg

1025 1030 1035

Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val

1040 1045 1050

Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp

1055 1060 1065

Thr Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu

1070 1075 1080

Phe Val Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr

1085 1090 1095

Leu Arg Thr Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys

1100 1105 1110

Ala Lys Arg

1115

<210> 10

<211> 1114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 10

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1 5 10 15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

20 25 30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met

50 55 60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65 70 75 80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

100 105 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

115 120 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

130 135 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145 150 155 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

165 170 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

180 185 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

195 200 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

210 215 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225 230 235 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

245 250 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

260 265 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

275 280 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

290 295 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305 310 315 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

325 330 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

340 345 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

355 360 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

370 375 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385 390 395 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

405 410 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

420 425 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

435 440 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

450 455 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465 470 475 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys

485 490 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

500 505 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

515 520 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

530 535 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

565 570 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

580 585 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

595 600 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

610 615 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625 630 635 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

645 650 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

660 665 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

675 680 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

690 695 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705 710 715 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

725 730 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

740 745 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

755 760 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

770 775 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785 790 795 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

805 810 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

820 825 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

835 840 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

850 855 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865 870 875 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

885 890 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

900 905 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

915 920 925

Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser

930 935 940

Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys

945 950 955 960

Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn

965 970 975

Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys

980 985 990

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu

995 1000 1005

Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn

1010 1015 1020

Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly

1025 1030 1035

Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser

1040 1045 1050

Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala

1055 1060 1065

Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val

1070 1075 1080

Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg

1085 1090 1095

Thr Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys

1100 1105 1110

Arg

Claims

1. 一种编码截短的补体因子H (CFH)蛋白的核酸，其中截短的CFH蛋白包含选自以下的5种或更多种补体控制蛋白模块(CCP)：CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20。

2.权利要求1的核酸，其中所述核酸编码包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP10、CCP11、CCP12、CCP13、CCP14、CCP15、CCP18、CCP19和CCP20的CFH蛋白(tCFH1)。

3. 权利要求2的核酸，其包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8。

4. 一种核酸，其包含与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的核苷酸序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。

5.权利要求1的核酸，其中所述核酸编码包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP18、CCP19和CCP20的CFH蛋白(tCFH2)。

6. 权利要求5的核酸，其包含SEQ ID NO: 3。

7. 一种核酸，其包含与SEQ ID NO: 3的核苷酸序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。

8.权利要求1的核酸，其中所述核酸编码包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP8、CCP9、CCP16、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20的CFH蛋白(tCFH3)。

9. 权利要求8的核酸，其包含SEQ ID NO: 4。

10. 一种核酸，其包含与SEQ ID NO: 4的核苷酸序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。

11.权利要求1的核酸，其中所述核酸编码包含CCP1、CCP2、CCP3、CCP4、CCP5、CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20的CFH蛋白(tCFH4)。

12. 权利要求11的核酸，其包含SEQ ID NO: 5。

13. 一种核酸，其包含与SEQ ID NO: 5的核苷酸序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。

14.一种转基因表达盒，其包含

启动子；

权利要求1-13中任一项的核酸；和

最小调控元件。

15.权利要求14的表达盒，其中所述核酸是人核酸。

16.一种核酸载体，其包含权利要求14或15的表达盒。

17.权利要求16的载体，其中所述载体是腺伴随病毒(AAV)载体。

18.权利要求17的载体，其中所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

19.权利要求18的载体，其中所述衣壳序列的血清型是AAV2。

20.权利要求18的载体，其中所述衣壳序列是突变型衣壳序列。

21.一种哺乳动物细胞，其包含权利要求16-20中任一项的载体。

22.一种制备重组腺伴随病毒(rAAV)载体的方法，其包括将启动子和权利要求1-13中任一项的核酸插入腺伴随病毒载体内。

23.权利要求22的方法，其中所述核酸是人核酸。

24.权利要求22或23的方法，其中所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

25.权利要求24的方法，其中所述衣壳序列是突变型衣壳序列。

26.一种治疗眼部疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用权利要求16-20中任一项的载体，从而治疗所述受试者中的眼部疾病或病症。

27.权利要求26的方法，其中所述眼部疾病或病症与补体途径的激活相关。

28.权利要求26的方法，其中所述眼部疾病或病症是视网膜变性。

29.权利要求28的方法，其中所述视网膜变性是年龄相关性黄斑变性(AMD)。

30.权利要求29的方法，其中所述AMD是湿性AMD。

31.权利要求29的方法，其中所述AMD是干性AMD。

32.权利要求31的方法，其中所述干性AMD是早期至晚期干性AMD。

33.权利要求26的方法，其中所述眼部疾病或病症是地图状萎缩(GA)。

34.权利要求26-33中任一项的方法，其中所述载体是视网膜施用的。

35.一种用于将异源核酸递送至个体的眼的方法，其包括将权利要求16-20中任一项的载体施用于个体的视网膜。

36.一种试剂盒，其包含权利要求16-20中任一项的载体和使用说明书。

37.权利要求36的试剂盒，其进一步包括用于载体的视网膜递送的装置。