CN101160412A - 治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与AMD危险提高或降低相关的因子H基因多态性和单元型。本发明提供了诊断和治疗AMD的方法和试剂。

Description

治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂

相关文献的交叉参考

本申请要求U.S.临时申请No.60/650,078(2005年2月14日提交)、60/717,861(2005年9月16日提交)、60/715,503(2005年9月9日提交)和60/735,697(2005年11月9日提交)的权益，所述文献均以其全部内容引入本文为参考。

联邦资助的研发中产生的发明的权利陈述

本申请所述工作部分由NIH眼科研究院基金EY1 1515资助。美国政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家中引起不可逆失明的最主要原因(综述参阅，Zarbin，1998，2004；Klein等，2004；Ambati等，2003；de Jong，2004；van Leeuwen等，2003)，影响约15％的60岁以上个体。估计有6亿个体在这一年龄统计范围内。AMD的患病数随年龄提高，在75岁及以上的群体中，轻度或早期形式在近30％的个体中发生，高级形式在约7％的个体中发生(Klein等，1992；Vingerling等，1995a，1995b)。在临床上，AMD的特征为由黄斑中发生的退化性变化引起的渐进性中央视觉丧失，黄斑是视网膜神经中的特化区域及其下层组织。在最严重或渗出性的疾病形式下，来自脉络膜脉管系统的新生血管叶突破了Bruch膜和视网膜色素上皮(RPE)，一般引起视网膜脱落和其后的变性。

AMD作为迟发性复合疾病，似乎由遗传和环境因素的组合引起和/或调节(Seddon和Chen，2004；Tuo等，2004；Klein和Francis，2003)。家族性聚集研究估计遗传组分主要参与了多达25％的疾病(Klaver等，1998a)。根据流行的假说，多数AMD病例不是多种单基因病症的集合，而是代表定量的表型、表示多种易患基因座的相互作用。所涉及的基因座数、所赋予的归因危险度和多个基因座之间的相互作用仍不清楚。

连锁和候选基因筛选分析已经对AMD的遗传学提供了有限的了解。已经报道了一个增加危险的基因，ABCA4(Allikmets等，1997)和一个降低危险的基因，ApoE4(Klaver等，1998b，Souied等，1998)对AMD的可靠关联。，此外，一些小组报道了全基因组连锁分析的结果(综述于Tuo等，2004；Weeks等，2004)。已经证明了一个有AMD表型的家族与特定染色体区域lq25-q31(ARMD1)的连锁(Klein等，1998)。已经提出HEMICENTIN-1基因为致病基因(Schultz等，2003)，尽管其作用还没有可靠地得到确认。若干研究(Weeks等，2001；Iyengar等，2003；Weeks等，2004)中染色体1q上重叠基因座的鉴定提示该基因座可能包含一个或多个AMD相关基因。

最近对玻璃疣(与AMD发病相关的特征性眼损伤)的研究已经指出了炎症和其他免疫介导过程(特别是补体活化)在AMD早期和晚期形式的病因学中的作用(Hageman等，1999，2001；Mullins等，2000，2001；Russell等，2000；Anderson等，2002，2004；Johnson等，2000，2001；Crabb等，2002；Ambati等，2003；Penfold等，2001；Espinosa-Heidman等，2003)。这些研究已经揭示了沿着bruch膜(由弹性蛋白质和胶原组成的分隔RPE和脉络膜的细胞外层)的玻璃疣中和RPE细胞上的玻璃疣中的末端途径补体组分(C5、C6、C7、C8和C9)和末端途径的活化特异性补体蛋白质片段(C3b、iC3b、C3dg和C5b-9)以及多种补体途径调节子和抑制子(包括因子H、因子I、因子D、CD55和CD59)(Johnson等，2000，2001；Mullins等2000，2001；Crabb等，2002)。许多这些玻璃疣相关分子先前认为是主要由肝合成的循环血浆蛋白质。有趣的是，许多这些玻璃疣相关分子似乎还由RPE和/或脉络膜细胞局部合成。

补体系统的活化在正常宿主的防御和损伤应答中发挥关键作用(Kinoshita，1991)。这一系统的不适当活化和/或控制(常由特异性补体相关基因的突变引起)可引起自身免疫后遗症和局部组织破坏(Holers，2003；Liszewski and Atkinson，1991；Morgan and Walport，1991；Shen andMeri，2003)，就像动脉粥样硬化(Torzewski等，1997；Niculescu等，1999)、阿尔茨海默病(Akiyama等，2000)和肾小球肾炎(Schwertz等，2001)中所显示的那样。

2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGN II)一种罕见疾病，与补体级联系统旁路途径的非受控系统性活化相关。该疾病的特征为肾小球基底膜中异常电子密度物质的沉积，最终导致肾衰竭，其中所述异常电子密度物质由补体旁路途径中涉及的蛋白质C3和C3c组成。有趣的是，许多MPGNII患者发生了斑状玻璃疣、RPE脱离和脉络膜新生血管膜，它们在临床上和组成上均与AMD中形成的有所不同，尽管它们常在十至二十岁中检测到(Mullins等，2001；O′Brien等，1993；Huang等，2003；Colville等，2003；Duvall-Young等，1989a，1989b；Raines等，1989；Leys等，1990；McAvoyand Silvestri，2004；Bennett等，1989；Orth and Ritz，1998；Habib等，1975)。

在多数MPGNII患者中，补体级联系统的调节失能是由针对C3bBb的自身抗体介导的。然而，其他MPGNII患者在因子H中存在突变(Ault等，1997；Dragon-Durey等，2004)，因子H是旁路补体途径的主要抑制子。因子H中的点突变(I1166R)在约克猪中引起MPGNII(Jansen等，1998)，因子H缺陷型小鼠发生严重肾小球肾炎(Pickering等，2002)。此外，一些患MPGNIII的扩大家族(相关疾病)的患病个体显示对染色体1q31-32的连锁(Neary等，2002)，1q31-32是与在AMD的全基因组连锁研究(见上文)中已经鉴定的基因座重叠的区域。这一特定基因座包含大量补体途径相关基因。这些基因的一个组称为补体活化调节子(RCA)基因簇，含有编码因子H、五种因子H相关基因(CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)和凝固因子XIII β亚基的基因。补体途径相关基因的第二个簇与1q25-31基因座毗邻，包括C4BPA、C4BPB、C4BPAL2、DAF(CD55)CRl、CR2、CRlL和MCP(CD46)。

发明概述

本发明涉及补体因子H基因的多态性和单元型，所述基因与年龄相关性黄斑变性(AMD)和2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGNII)的发生相关。本发明还涉及补体因子H相关5(CFHR5)基因的多态性和单元型，所述基因与AMD和MPGNII的发生相关。本发明提供诊断、监测和治疗这些以及其他疾病的方法。

在一方面中，本发明提供用于确定受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的倾向的诊断方法，所述方法包括检测因子H基因多个多态性位点中变异的存在与否。在一个实施方案中，本发明提供诊断对发生AMD的易感性增加的方法，包括检测个体中因子H基因多态性的存在与否。该方法可包括获得来自个体的DNA和分析来自该个体的DNA以确定该DNA是否在因子H基因中含有多态性。某些多态性指示，该个体与对照群体相比发生AMD的易感性增加。某些多态性指示该个体发生AMD的可能性降低。某些多态性指示该个体发生AMD的可能性既没有增加也没有降低。

在一个实施方案中，受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的倾向的诊断方法包括获得来自该受试者的DNA样品和检测该患者的DNA中是否存在与发生AMD相关的多态性，存在该多态性指示该受试者发生AMD的倾向提高，不存在该多态性指示该受试者发生AMD的倾向降低。

在相关的方面中，本发明提供诊断对发生AMD的易感性的方法，包括确定个体的因子H单元型。该方法包括获得来自个体的DNA和分析该个体的DNA以确定其因子H单元型。某些单元型(危险单元型)指示该个体对发生AMD的易感性提高。某些单元型(保护性单元型)指示该个体对发生AMD的易感性降低。某些单元型(中性单元型)指示该个体对发生AMD的可能性既不提高也不降低。

在相关的实施方案中，通过分析该基因编码的基因产物(如RNA或因子H蛋白质(如蛋白质同种型))来确定因子H基因的多态性位点中变异的存在与否。变体蛋白质的表达指示因子H基因的变异，并可指示提高或降低的发生AMD的倾向。可以使用免疫测定和其他方法检测蛋白质。

在另一相关的实施方案中，本发明提供通过检测个体生物样品中的变体因子H多肽来诊断发生AMD或其他疾病的易感性的方法。在一个实施方案中，使用基于抗体的测定诊断个体中的AMD或其他疾病，其中使该个体的生物样品(如血清样品)接触抗体并检测变体因子H多肽的存在与否。在实施方案中，该抗体与变体因子H多肽特异性表位(即在野生型因子H多肽中未发现)特异性相互作用。在实施方案中，使用基于分离的测定(如PAGE)诊断个体中的AMD或其他疾病，其中检测个体的生物样品(如血清样品)中变体因子H多肽的存在与否。

在一个方面中，本发明提供通过调节因子H的类型和/或全身和/或眼水平的量来治疗患AMD(如其中检测到指示发生症状AMD的危险提高的多态性或单元型的个体)或其他变体因子H基因相关疾病的个体的方法。该因子H多肽可以是野生型因子H多肽或变体因子H多肽。该因子H多肽可以是这样的因子H多肽，即其具有中性或保护性等位基因而不是危险单元型相关等位基因编码的序列。在一个实施方案中，该方法包括对个体施用有效量的因子H多肽，以降低疾病症状。在一个实施方案中，该方法包括对个体施用有效量的因子H多肽，以降低发生疾病症状的倾向并延缓疾病的发生和发展。在一个实施方案中，该方法包括施用包含因子H的血液。在一个实施方案中，该方法包括施用核酸(如转基因)，所述核酸包含编码因子H多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，该方法包括施用表达因子H多肽的细胞。

在一个方面中，本发明提供治疗患AMD(如其中检测到指示发生症状AMD的危险提高的多态性或单元型的个体)或其他变体因子H基因相关疾病的个体的方法。在一个实施方案中，该方法包括对患者施用有效量的降低变体因子H的量或编码因子H的基因表达的物质，以减少患者的疾病症状。在相关实施方案中，对个体施用治疗量的变体因子H多肽抑制剂(如灭活剂)。

在一个实施方案中，对个体施用抑制性核酸(如与变体因子H多肽的核苷酸序列至少部分互补的RNA)。在一个实施方案中，施用纯化的反义RNA，其与编码变体因子H多肽的RNA互补。

在另一实施方案中，对个体施用治疗量的抗CFH抗体，所述抗体足以部分灭活变体因子H多肽。

在另一实施方案中，治疗个体以从血中除去因子H的有害形式(如通过血浆去除术、抗体指导的血浆去除术或与因子H结合部分如肝素的复合)。

在一个方面中，本发明提供编码变体因子H多肽的纯化DNA、编码变体因子H多肽的纯化RNA，与编码变体因子H多肽的RNA互补的纯化反义RNA以及纯化的变体因子H多肽。在相关方面中，本发明提供用于表达野生型或变体因子H多肽或因子H生物活性片段的核酸。

在一个方面中，本发明提供包含编码因子H多肽的核酸的基因治疗载体。该载体可包括驱动因子H基因在多种细胞类型中表达的启动子。备选地，该载体可包括驱动因子H基因仅在特定细胞类型(如视网膜细胞或肾细胞)中表达的启动子。在一个方面中提供了含有编码因子H蛋白质的基因治疗载体和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含有病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，所编码的因子H多肽为保护性变体。

在一个方面中，本发明提供含有重组或纯化的因子H多肽的组合物，其中所述多肽为保护性多肽。

在相关方面中，本发明提供含有重组或纯化的因子H多肽和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含有病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，编码的因子H多肽具有野生型序列。在一个实施方案中，编码的因子H多肽为保护性变体。

在一个方面中，本发明提供抗体，所述抗体与变体因子H多肽而不是野生型因子H多肽特异性相互作用。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并可通过消减技术获得。这些抗体足以灭活变体因子H多肽。在相关方面中，本发明提供含有抗因子H抗体和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含有病原体，并适于对人类患者施用。

在一个方面中，本发明提供鉴定与发生AMD的危险提高或降低相关的变体因子H蛋白质的方法。在一个实施方案中，本发明提供鉴定保护性因子H蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有保护性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中保护性因子H蛋白质由具有保护性单元型的等位基因编码。在一个实施方案中，本发明提供鉴定中性因子H蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有中性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中中性因子H蛋白质由具有中性单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供鉴定与发生AMD的危险降低相关的因子H变体形式的方法，包括(a)鉴定具有与发生AMD的危险降低相关的单元型或二倍型(diplotype)的个体；(b)获得来自个体的基因组DNA或RNA；和(c)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中保护性因子H蛋白质由具有与发生AMD的危险降低相关的等位基因编码。在实施方案中，所述保护性或中性因子H蛋白质不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。

在相关方法中，鉴定与发生AMD的危险提高相关的因子H形式，是通过(a)鉴定具危险单元型的个体；和(b)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中危险因子H蛋白质由具危险单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供了鉴定与发生AMD的危险提高相关的因子H的变体形式的方法，包括(a)鉴定具有与发生AMD的危险提高相关的单元型或二倍型的个体；(b)获得来自该个体的基因组DNA或RNA；和(c)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中危险因子H蛋白质由具有与发生AMD的危险提高相关的单元型的等位基因编码。在实施方案中，所述危险因子H蛋白质不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。

在一个方面中，本发明提供诊断发生AMD或其他疾病的倾向或易感性的方法，所述方法通过检测患者的生物样品中全长因子H与截短因子H的比值。在一个实施方案中，诊断受试者中发生AMD的倾向或易感性的方法包括获得来自受试者的RNA样品和检测患者RNA中外显子10(即全长因子H)与外显子10A(即截短的因子H)表达的比值，比值提高指示该受试者发生AMD的倾向或易感性提高，比值降低指示该受试者发生AMD的倾向或易感性降低。在一个实施方案中，诊断受试者中发生AMD的倾向或易感性的方法包括获得来自受试者的蛋白质样品和检测患者蛋白质中全长因子H与截短的因子H的表达比值，比值提高指示该受试者发生AMD的倾向或易感性提高，比值降低指示该受试者发生AMD的倾向或易感性降低。

在一个方面中，本发明提供细胞，所述细胞含有编码因子H蛋白质或其片段的重组或纯化核酸，例如来自因子H基因的核酸。细胞可以为细菌或酵母或用于研究和药物开发的任何其他细胞。因此，本发明提供表达重组变体人因子H的分离宿主细胞或细胞系。在实施方案中，变体是危险变体且第第402位氨基酸具有组氨酸。在实施方案中，变体是保护性变体且第62位氨基酸为异亮氨酸。在实施方案中，变体为中性变体。在实施方案中，所述危险、保护性或中性变体因子H蛋白质不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。

在一个方面中，本发明提供转基因非人动物，其体细胞和生殖细胞含有编码人变体因子H多肽的转基因。本发明的转基因动物可用作AMD模型和用于筛选治疗AMD的有用物质。动物可以是小鼠、虫或用于研究和药物开发(如重组产生因子H)的任何其他动物。在实施方案中，该因子H为变体人因子H，其中所述变体的第62位氨基酸为异亮氨酸或第402位氨基酸为组氨酸。

在一个方面中，本发明提供筛选多态性位点的方法，所述多态性位点与表1A、1B和1C所述因子H基因中的多态性位点连锁。这些方法包括鉴定基因中与因子H基因多态性位点连锁的多态性位点，其中因子H基因中多态性位点的多态性形式与AMD相关；确定个体群中的单元型，以指示该连锁的多态性位点是否具有与因子H基因的多态性形式平衡-不平衡的多态性形式，其中因子H基因的多态性形式与AMD表型相关。

在一个方面中，本发明提供MPGNII的诊断、治疗和筛选方法，如上述对AMD进行。

在一个方面中，本发明提供用于确定受试者发生AMD或MPGNII的倾向的方法，包括检测CFHR5基因的一个或多个多态性位点中是否存在一个或多个变异。在一个实施方案中，本发明提供诊断对发生AMD或MPGNII的易感性提高的方法，包括检测个体CFHR5基因中是否存在多态性。该方法可包括获得自个体的DNA和分析来自该个体的DNA以确定该DNA是否在CFHR5基因中含有多态性。某些多态性指示个体对发生AMD或MPGNII的易感性提高。某些多态性指示个体发生AMD或MPGNII的可能性降低。某些多态性指示个体发生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。

在一个实施方案中，诊断受试者中发生AMD或MPGNII的倾向的方法包括从受试者获得DNA样品和检测该患者的DNA中是否存在与发生AMD或MPGNII相关的多态性，存在该多态性指示该受试者发生AMD或MPGNII的倾向提高，不存在该多态性指示该受试者发生AMD或MPGNII的倾向降低。

在相关的实施方案中，通过分析基因产物(如RNA或该基因编码的CFHR5蛋白质(如蛋白质同种型))确定CFHR5基因多态性位点处的变异存在与否。变体蛋白质的表达指示CFHR5基因中的变异，并可指示发生AMD或MPGNII的倾向提高或降低。可以使用免疫测定和其他方法检测蛋白质。

在相关方面中，本发明提供诊断对发生AMD或MPGNII的易感性的方法，包括确定个体的CFHR5单元型。该方法包括获得来自个体的DNA和分析该个体的DNA以确定其CFHR5单元型。某些单元型(危险单元型)指示个体具有比对照群提高的对发生AMD或MPGNII的易感性。某些单元型(保护性单元型)指示该个体具有降低的对发生AMD或MPGNII的易感性。某些单元型(中性单元型)指示该个体发生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。

在另一相关方面中，本发明提供通过检测个体的生物样品中变体CFHR5多肽来诊断对发生AMD或MPGNII或其他疾病的易感性的方法。在一个实施方案中，使用基于抗体的测定诊断个体中的AMD或MPGNII或其他疾病，其中通过使个体的生物样品(如血清样品)接触该抗体并检测是否存在该变体CFHR5多肽。在实施方案中，该抗体与变体CFHR5多肽特异性表位(即在野生型CFHR5多肽中未发现的)特异性相互作用。在实施方案中，使用基于分离的测定(如PAGE)诊断个体中的MPGNII或其他疾病，这是通过检测该个体的生物样品(如血清样品)中是否存在该变体CFHR5多肽。可以使用多种类型的免疫测定形式来测定样品中的CFH或CFHR5的多肽或蛋白质。包括夹层ELISA、放射性免疫测定、荧光免疫测定、免疫组织化学测定、点印迹、量杆(dip-stick)和Western印迹。

在一个方面中，本发明提供通过调节CFHR5的类型和/或全身性和/或肾水平的量来治疗个体的方法，所述个体患有AMD或MPGNII(如其中检测到指示发生AMD或MPGNII症状的危险提高的多态性或单元型的个体)或与变体CFHR5基因相关的其他疾病，或者有患病危险。CFHR5多肽可以是中性或保护性等位基因而不是与危险单元型相关的等位基因所编码的CFHR5多肽。在一个实施方案中，该方法包括以有效降低疾病症状的量对个体施用CFHR5多肽。在一个实施方案中，该方法包括以有效降低发生疾病症状的倾向和延缓疾病的发生或发展的量对个体施用CFHR5多肽。在一个实施方案中，该方法包括施用含有CFHR5的血。在一个实施方案中，该方法包括施用包含编码CFHR5多肽的核苷酸序列的核酸(如转基因)。

在一个方面中，本发明提供治疗个体的方法，所述个体患有AMD或MPGNII(如检测到指示发生AMD或MPGNII症状的危险提高的多态性或单元型的个体)或与变体CFHR5基因相关的其他疾病。在一个实施方案中，该方法包括以有效降低患者中疾病症状的量对患者施用物质，所述物质降低变体CFHR5的量或编码CFHR5的基因的表达。CFHR5多肽可以是野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽。

在一个实施方案中，对个体施用抑制性核酸(如与变体CFHR5多肽的核苷酸序列至少部分互补的RNA)。在一个实施方案中，施用与编码变体CFHR5多肽的RNA互补的纯化的反义RNA。

在另一实施方案中，对个体施用治疗量的抗CFHR5抗体，所述抗体足以使该变体CFHR5多肽部分失活。

在相关的实施方案中，对个体施用治疗量的变体CFHR5多肽抑制剂(如灭活剂)。

在另一实施方案中，治疗个体以从血中除去CFHR5的有害形式(如通过血浆去除术、抗体指导的血浆去除术或与CFHR5结合部分如肝素的复合)。

在一个方面中，本发明提供编码变体CFHR5多肽的纯化DNA、编码变体CFHR5多肽的纯化RNA、与编码变体CFHR5多肽的RNA互补的纯化的反义RNA以及纯化的变体CFHR5多肽。在相关方面中，本发明提供用于表达野生型或变体CFHR5多肽或CFHR5的生物活性片段的核酸。

在一个方面中，本发明提供包含编码CFHR5多肽的核酸的基因治疗载体。该载体可包括驱动CFHR5基因在多种细胞类型中表达的启动子。备选地，该载体可包括驱动CFHR5基因仅在特定细胞类型(例如视网膜细胞或肾细胞(如内皮细胞、肾系膜细胞、足细胞))中表达的启动子。在一个方面中，本发明提供含有编码CFHR5蛋白质的基因治疗载体和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，编码的CFHR5多肽为保护性变体。

在一个方面中，本发明提供含有重组或纯化的CFHR5多肽的组合物，其中该多肽为保护性变体。

在相关方面中，本发明提供含有重组或纯化的CFHR5多肽和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，编码的CFHR5多肽为野生型序列。在一个实施方案中，编码的CFHR5多肽为保护性变体。

在一个方面中，本发明提供与变体CFHR5多肽特异性相互作用而不与野生型CFHR5多肽相互作用的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并都可通过消减技术获得。这些抗体可以足以灭活变体CFHR5多肽。在相关方面中，本发明提供含有抗CFHR5抗体和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含病原体，并适于对人类患者施用。

在一个方面中，本发明提供鉴定与发生AMD或MPGNII的危险提高或降低相关的变体CFHR5蛋白质的方法。在一个实施方案中，本发明提供鉴定保护性CFHR5蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有保护性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中保护性CFHR5蛋白质由具有保护性单元型的等位基因编码。在一个实施方案中，本发明提供鉴定中性CFHR5蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有保护性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中中性CFHR5蛋白质由具有中性单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供鉴定与发生AMD或MPGNII的危险降低相关的CFHR5变体形式的方法，包括(a)鉴定具有与发生AMD或MPGNII的危险降低相关的单元型或二倍型的个体；(b)获得来自个体的基因组DNA或RNA；和(c)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中保护性CFHR5蛋白质由具有与发生AMD或MPGNII的危险降低的单元型的等位基因编码。在实施方案中，保护性或中性CFHR5蛋白质不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。

在相关方法中，鉴定了与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的CFHR5形式，所述鉴定通过(a)鉴定具危险单元型的个体和(b)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中危险CFHR5蛋白质由具危险单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供鉴定与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的CFHR5变体形式，包括(a)鉴定具有与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的单元型或二倍型的个体；(b)获得来自该个体的基因组DNA或RNA，和(c)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中危险CFHR5蛋白质由具有与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的单元型的等位基因编码。在实施方案中，危险CFHR5蛋白质不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。

在一个方面中，本发明提供含有重组或纯化的核酸的细胞，所述核酸来自CFHR5基因。该细胞可以为细菌或酵母，或用于研究和药物开发的任何其他细胞。因此，本发明提供表达重组变体人CFHR5的分离的宿主细胞或细胞系。在实施方案中，CFHR5变体为危险变体，并且第46位氨基酸为丝氨酸。在实施方案中，CFHR5变体为中性变体。在实施方案中，危险、保护性或中性变体CFHR5蛋白质不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。

在一个方面中，本发明提供转基因非人动物，其体细胞和生殖细胞含有编码人变体CFHR5多肽的转基因。本发明的转基因动物用作AMD或MPGNII的模型，并用于筛选用于治疗AMD或MPGNII的物质。所述动物可以为小鼠、虫或用于研究和药物开发(如重组产生CFHR5)的任何其他动物。在实施方案中，CFHR5为变体人CFHR5，其中所述CFHR5变体的第46位氨基酸为丝氨酸。

在一个方面中，本发明提供筛选与表14或表15中所述CFHR5基因多态性位点连锁的多态性位点的方法。这些方法包括鉴定与CFHR5基因多态性位点连锁的基因中的多态性位点，其中CFHR5基因中多态性位点的多态性形式与AMD或MPGNII相关；以及测定个体群中的单元型，以指示连锁的多态性位点是否具有与AMD或MPGNII表型相关CFHR5基因的多态性形式平衡-不平衡的多态性形式。

在一个方面中，本发明提供用于分析因子H单元型的试剂盒。该试剂盒可用于诊断患者的AMD。该试剂盒可包括一个或多个因子H、因子H等位基因特异性寡核苷酸(如等位基因特异性引物或探针)或特异性识别因子H多肽的抗体。该因子H等位基因特异性寡核苷酸可包括来自因子H基因编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。该因子H特异性抗体可识别正常或野生型H多肽或变体因子H多肽，其中在该因子H编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。该试剂盒可用于诊断AMD以及与因子H基因SNP相关的其他疾病，如MPGNII。作为替代或补充，该试剂盒可包括一个或多个因子H相关5(CFHR5)等位基因特异性寡核苷酸(如引物或探针)或特异性识别CFHR5多肽的抗体。CFHR5等位基因特异性引物和因子H相关5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自因子H相关5基因的编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。因子H相关5特异性抗体可识别正常或野生型H多肽或变体因子H相关5多肽，其中在该因子H相关5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。

在一个实施方案中，该试剂盒包含探针或引物，它们可以在表1A、表1B和/或表1C中列出的多态性位点处区分等位基因。在实施方案中，该探针为用于核酸扩增的引物，所述扩增为扩增跨越表1A、表1B和/或表1C中列出因子H基因多态性位点的区域。在实施方案中，该试剂盒具有探针或引物，它们在表1A、表1B和/或表1C中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因。在实施方案中，该试剂盒具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825；(b)rs800292；(c)rs3766404；(d)rs1061147；(e)rs1061170；(f)rs203674；(g)rs529825和rs800292中至少一个；(h)rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；(i)rs529825和rs800292中至少一个，以及rs3766404；以及rs1061147，rs1061170和rs203674中至少一个；或者j)rs529825，rs800292，rs3766404，rs1061170和rs203674中至少一个。

在相关实施方案中，试剂盒具有在一个以上多态性位点区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825；(b)rs800292；(c)内含子2(IVS2或insTT)(d)rs3766404；(e)rs1061147；(f)rs1061170；(g)外显子10A；(h)rs203674；(i)rs375046；j)rs529825和rs800292；(k)rs1061147、rs1061170和rs203674中至少两个或三个；(l)rs529825和rs800292中至少一个；和内含子2；和rs3766404；和rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；和外显子10A；和rs375046；(m)至少rs529825；rs800292；内含子2；rs3766404；rs1061170；外显子10A；rs203674；和rs375046；(n)rs529825、rs800292、内含子2；rs3766404、rs1061170、外显子10A、rs203674和rs375046中至少两个，或至少三个或至少四个；(o)外显子22(1210)；或(p)外显子22(1210)与任意前述变异或一组变异(a-o)组合。在实施方案中，试剂盒具有在rs460897和rs460184中一处或两处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该试剂盒具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点选自(a)rs3753394；(b)rs529825；(c)rs800292；(d)内含子2(IVS2或insTT)；(e)rs3766404；(f)rs1061147；(g)rs1061170；(h)rs2274700；(i)rs203674；(j)rs3753396；和(k)rs1065489。

在一个实施方案中，作为上述探针的替代或补充，试剂盒含有区分CFHR5基因中多态性位点的探针、引物、抗体等。在一个方面中，本发明提供基于CFHR5基因变异的诊断患者AMD或MPGNII的试剂盒。试剂盒可包括一种或多种CFHR5特异性探针或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸，或特异性识别CFHR5多肽的抗体。CFHR5特异性引物和CFHR5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自CFHR5基因编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。CFHR5特异性抗体可识别正常或野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽，其中在CFHR5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。该试剂盒可用于诊断AMD或MPGNII以及与CFHR5基因中SNP相关的其他疾病。

在一个实施方案中，试剂盒含有在表14或表15中列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多态性位点的区域。在实施方案中，该试剂盒具有在表14或表15中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该试剂盒包含在一个、两个或全部以下多态性位点处区分等位基因的探针或引物：rs9427661(-249T＞C)；rs9427662(-20T＞C)和rs12097550(P46S)。

在一个实施方案中，试剂盒含有在CFH基因中的多态性位点和CFHR基因(如CFHR5)的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。

在一个方面中，本发明提供用于确定受试者单元型的装置。该装置可用于例如诊断患者的AMD或其他疾病。在一个实施方案中，该装置含有在表1A、1B和/或1C中列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表1A、1B和/或1C中列出的因子H基因多态性位点的区域。在实施方案中，该装置具有在表1A、1B和/或1C中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825；(b)rs800292；(c)rs3766404；(d)rs1061147；(e)rs1061170；(f)rs203674；(g)rs529825和rs800292中至少一个；(h)rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；(i)rs529825和rs800292中至少一个；和rs3766404；以及rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；或者j)至少rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674。

上述试剂盒及其内含物还可用于为任何目的而鉴定发生MPGNII的倾向或确定因子H单元型。

在相关实施方案中，该装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825；(b)rs800292；(c)内含子2(IVS2或insTT)；(d)rs3766404；(e)rs1061147；(f)rs1061170；(g)外显子10A；(h)rs203674；(i)rs375046；(j)rs529825和rs800292；(k)rs1061147、rs1061170和rs203674中至少两个或三个；(l)rs529825和rs800292中至少一个；和内含子2；和rs3766404；和rs1061147，rs1061170和rs203674中至少一个；和外显子10A；和rs375046；(m)至少rs529825；rs800292；内含子2；rs3766404；rs1061170；外显子10A；rs203674；和rs375046；(n)rs529825、rs800292、内含子2、rs3766404、rs1061170、外显子10A、rs203674和rs375046中至少两个，或至少三个或至少四个；(o)外显子22(1210)；或(p)外显子22(1210)与任意前述变异或一组变异(a-o)组合。在实施方案中，装置具有在rs460897和rs460184中一个或两个处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点选自(a)rs3753394；(b)rs529825；(c)rs800292；(d)内含子2(IVS2或insTT)；(e)rs3766404；(f)rs1061147；(g)rs1061170；(h)rs2274700；(i)rs203674；(j)rs3753396和(k)rs1065489。在实施方案中，装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点选自(a)rs3753394；(b)rs529825；(c)rs800292；(d)内含子2(IVS2或insTT)；(e)rs3766404；(f)rs1061147；(g)rs1061170；(h)rs2274700；(i)rs203674；(j)rs3753396和(k)rs1065489。

在一个方面中，本发明提供用于诊断患者的AMD或MPGNII的装置。在一个实施方案中，该装置含有在表14和表15列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多态性位点的区域。在实施方案中，该装置具有在表14或表15中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。本发明的装置可含有区分因子H和CHFR5变体的探针或引物，包括上文及本文公开内容中其他处所述的位点的任何组合。

上文所述装置及其内含物还可用于为任何目的而鉴定发生MPGNII的倾向或确定因子H单元型。

在一个实施方案中，作为上述探针或引物的替代或补充，该装置含有区分CFHR5基因中多态性位点的探针、引物、抗体等。在一个方面中，本发明提供基于CFHR5基因变异诊断患者的AMD或MPGNII的装置。该装置可包括一种或多种CFHR5特异性探针或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸或特异性识别CFHR5多肽的抗体。CFHR5特异性引物和CFHR5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自CFHR5基因编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。该CFHR5特异性抗体可识别正常或野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽，其中在该CFHR5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。该装置可用于诊断AMD或MPGNII以及与CFHR5基因SNP相关的其他疾病。

在一个实施方案中，该装置含有在表14或表15中列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多态性位点的区域。在实施方案中，该装置具有在表14或表15中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该试剂盒具有在一个、两个或全部以下多态性位点处区分等位基因的探针或引物：rs9427661(-249T＞C)；rs9427662(-20T＞C)和rs12097550(P46S)。

在一个实施方案中，该装置含有在CFH基因中的多态性位点和CFHR基因(如CFHR5)的多态性位点区分等位基因的探针或引物。

在阅读全部公开内容后，本发明的其他方面将是显而易见的。

附图简述

图1A-1L显示人视网膜色素上皮中因子H(图1A-1H)和末端互补复合物(C5b-9)(图1I-1L)的免疫定位。缩写：(RPE)-脉络膜(Chor)复合物；Bruch膜(BM)；视网膜(Ret)；玻璃疣(Dr)。

图2显示使用来自人眼的RNA提取物对因子H基因表达(CFH和截短形式HFL1)的RT-PCR分析。

图3是人因子H基因的简图，显示本分析中使用的12个SNP、因子H基因的22个外显子、20个短共有重复序列(SCR)、病原体和其他底物的结合位点以及连锁不平衡(LD)节段的大概位置。显示CFH所有22个外显子(但无内含子)的简图未按比例拉伸。

图4是人因子H基因SNP的单元型网状图，显示危险(实心圆)、保护性(划线圆)、中性(空心圆)和始祖(标出)单元型的关系以及单元型的相对频率，以圆的大小和位置表示。

图5显示人因子H基因单元型和二倍型的相关分析。在AMD病例和对照中分析了8个信息化SNP的配对连锁不平衡。显示了在编码链上标出的多态性位点处的核苷酸，除了IYS1，显示了其非编码链上的核苷酸。

图6显示人因子H cDNA参照形式的3926碱基核苷酸序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID NO：1])。ATG起始密码子开始于第74位核苷酸，TAG终止密码子终止于第3769位核苷酸。

图7显示SEQ ID NO：1编码的多肽序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID NO：2])。1231个氨基酸的因子H多肽包括18个氨基酸的N端信号肽。

图8显示HFL1——人因子H截短形式的参照形式的1658碱基核苷酸序列(GenBank登录号X07523[SEQ ID NO：3])。ATG起始密码子开始于第74位核苷酸，TGA终止密码子终止于第1423位核苷酸。

图9显示SEQ ID NO：3编码的HFL1参照形式的多肽序列(GenBank登录号X07523[SEQ ID NO：4])。449个氨基酸的HFL1多肽包括18个氨基酸的N端信号肽。

图10显示示例性人因子H保护性变体的多肽序列[SEQ ID NO：5]。这种保护性变体因子H多肽的第62位氨基酸为异亮氨酸，第402位氨基酸为酪氨酸(以粗体标出)。

图11显示示例性HFL1保护性变体——人因子H的截短形式的多肽序列(SEQ ID NO：6)。这种保护性变体截短的因子H多肽的第62位氨基酸为异亮氨酸，第402位氨基酸为酪氨酸(以粗体标出)。

图12显示如(A)光学显微镜和(B)电子显微镜所见，具有密集膜内沉积的显著的肾小球细胞增多，其在MPGNII患者中引起毛细血管壁增厚。沉积可在肾小球基底膜(GBM)的致密板中形成分节的、间断或弥散模式。通过光学显微镜可见，它们是嗜酸性并为折射体，用过碘酸希夫明亮染色并为高渗的，这解释了其电子密度外观(A)。甚至通过电子显微镜可见，沉积缺乏亚结构，表现为非常暗的均匀斑点(B)。致密沉积的准确组成仍然未知(条带，5μm)。

图13是显示补体级联系统旁路途径的激活和调节的图，所述补体级联系统在AMD和MPGNII患者中系统性高水平激活。补体级联系统的旁路途径在MPGNII/DDD患者中系统性高水平激活。正常情况下，自发的水解(称为tick-over)过程低水平地持续激活C3。C3水解与图上部显示的大的蛋白质构象变化相关。该构象变化使C3(H2O)与C3b(C3的切割产物)类似。起始转化酶C3(H2O)Bb激活C3以形成C3b。尽管C3b具有短暂的半衰期，如果其与IgG、细胞或基底膜结合，则可被保护免于立即失活。(C3b)2-IgG复合物在流体相中形成，并与备解素(P)结合，这促进了因子B的结合和C3bBb的产生，C3bBb为旁路途径的转化酶，其在此处显示为Bb(C3b)2-IgG-备解素复合物。扩增环以箭头显示。C3NeF延长了C3转化酶的半衰期，在插图中显示。降解C3转化酶的一种机制是通过其与补体因子H(CFH)的相互作用，在底部右侧显示为fH。因子H的缺乏和突变与MPGN II/DDD相关。

图14为显示补体激活调节子(RCA)基因簇在染色体1q32上的组构以及已知为补体因子H(CFH)、因子H样1(CFHL1)和因子H相关1、2、3、4和5(CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)中短共有重复序列(SCR)的约60个氨基酸的结构域的排列的图。CFH具有20个SCR。已经确定了这些SCR中一些的相互作用配偶体，在右上方显示(CRP-C反应蛋白质；Hep，肝素)。补体因子H样1(CFHL1)是CFH的剪接异构体，而补体因子H相关蛋白质1-5(CFHR1-5)各由单独的基因编码(CFHR1-5)。CFHR1-5的SCR与CFH中的一些SCR相似，以椭圆中的数字显示。例如，CFHR5具有9个SCR，前两个与因子H的SCR6和7相似，因此具有CRP和肝素结合特性。CFHR5的SCR5-7在相应椭圆中具有数字12-14，因为这些SCR与因子H的SCR 12-14相似，并具有C3b和肝素结合特性。

图15显示连锁不平衡曲线，表明A307A和Y402H在因子H中连锁不平衡，-249T＞C和-20T＞C在CFHR5中连锁不平衡。

图16显示人CFHR5参照形式的2821个碱基的核苷酸序列(GenBank登录号AF295327[SEQ ID NO：7])。ATG起始密码子开始于第94位核苷酸，TGA终止密码子终止于第1803位核苷酸。

图17显示SEQ ID NO：7编码的多肽序列(GenBank登录号AAK15619[SEQ ID NO：8])。569个氨基酸的CFHR5多肽包括18个氨基酸的N端信号肽。

图18显示CFH和因子H相关蛋白质的基因中的基因组复制。外显子以垂直线标出。以相同字母标出的区域(如A，A’和A″)具有基本相同的序列。

发明详述

I.引言

本发明提供由因子H基因中和因子H相关基因如因子H相关5基因中多种变异组成的多态性和单元型的集合。这些多态性和单元型与年龄相关性黄斑变性(AMD)和其他因子H相关病症相关。这些多态性和单元型中的某些导致变体因子H多肽。对这些和其他多态性和多态性组(如单元型)的检测可用于设计和进行AMD的诊断测定。可以通过核酸分析、通过因子H编码序列所编码的多肽(包括剪接变体编码的多肽)的分析或通过本领域已知的其他方法检测多态性和多态性组。分析这类多态性和单元型也可用于设计AMD的预防和治疗方案。

因子H是多功能蛋白质，发挥补体系统关键调节子的功能。参阅Zipfel，2001，″Factor H and disease：a complement regulator affects vital bodyfunctions″Semin Thromb Hemost.27：191-9。因子H蛋白质活性包括：(1)与C反应蛋白质(CRP)结合，(2)与C3b结合，(3)与肝素结合，(4)与唾液酸结合，(5)与内皮细胞表面结合，(6)与细胞整联蛋白质受体结合，(7)与病原体(包括微生物)结合(见图3)和(8)C3b辅因子活性。因子H基因称为HF1、CFH和HF，位于人染色体1，位置1q32。1q32特定基因座含有大量补体途径相关基因。这些基因中的一组称为补体激活调节子(RCA)基因簇，含有编码因子H、五种因子H-相关基因(分别为FHR-1、FHR-2、FHR-3、FHR-4和FHR-5或者CFHRl、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)的基因，以及编码凝结因子XIII β亚基的基因。因子H和因子H相关基因几乎完全由短共有重复序列(SCR)组成。因子H和FHL1分别由SCR 1-20和1-7组成。FHR-1、FHR-2、FHR-3、FHR-4和FHR-5分别由5、4、5、5和8个SCR组成(见图14)。基因的顺序从着丝粒到端粒为FH/FHL1、FHR-3、FHR-1、FHR-4、FHR-2和FHR-5。

因子H基因

已经确定了人因子H cDNA的参照形式(SEQ ID NO：1)  (参阅Ripoche等，1988，Biochem J249：593-602)和基因组序列。因子H cDNA编码表观分子量155 kDa的长度为1231个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)。存在称为FHL-1(也称为HFL1或CFHT)的因子H替代性剪接形式。FHL-1(SEQ ID NO：3)基本对应于因子H的外显子1至9(参阅Ripoche等，1988，Biochem J 249：593-602)。FHL1 cDNA编码表观分子量45-50kDA的长度为449个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：4)。FH1和FHL1的前445个氨基酸相同，FHL1具有独特的C端4个氨基酸(外显子10A)。替代外显子10A位于外显子9与外显子10之间的内含子中。人因子H和FHL1的cDNA和氨基酸序列数据分别以登录号Y00716和X07523见于EMBL/GenBank数据库。人因子H cDNA参照形式的3926碱基的核苷酸序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID NO：1])示于图6，SEQ ID NO：1编码的多肽序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID NO：2])示于图7。人因子H的截短形式——HFL1参照形式的1658个碱基的核苷酸序列(GenBank登录号X07523[SEQ ID NO：3])示于图8，SEQ ID NO：3编码的多肽序列(GenBank登录号X07523[SEQ ID NO：4])示于图9。因子H基因序列(长度为150626个碱基)以GenBank登录号AL049744可见。因子H启动子位于因子H基因编码区的5’。

FHR-1基因

FHR-1基因也称为CHFR1、CFHL1、CFHL、FHR1和HFL1。已经确定了人HFR-1cDNA的参照形式(参阅Estaller等，1991，J Immunol.146：3190-3196)和基因组序列。FHR-1 cDNA编码长度为330个氨基酸的多肽，预计分子量为39 kDa。人FHR-1的cDNA和氨基酸序列数据以登录号M65292见于EMBL/GenBank数据库。FHR-1基因序列以GenBank登录号AL049741可见。

FHR-2基因

FHR-2基因也称为CHFR2、CFHL2、FHR2和HFL3。已经确定了人HFR-2cDNA的参照形式(参阅Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci美国99：16899-16903)和基因组序列。FHR-2 cDNA编码长度为270个氨基酸的多肽，预计分子量为31kDa。人FHR-2的cDNA和氨基酸序列数据以登录号BC022283见于EMBL/GenBank数据库。FHR-2基因序列以GenBank登录号AL139418可见。

FHR-3基因

FHR-3基因也称为CHFR3、CFHL3、FHR3和HFL4。已经确定了人HFR-3cDNA的参照形式(参阅Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci美国99：16899-16903)和基因组序列。FHR-3 cDNA编码长度为330个氨基酸的多肽，预计分子量为38kDa。人FHR-3的cDNA和氨基酸序列数据以登录号BC058009见于EMBL/GenBank数据库。FHR-3基因序列以GenBank登录号AL049741可见。

FHR-4基因

FHR-4基因也称为CHFR4、CFHL4和FHR4。已经测定了人HFR-4cDNA的参照形式(参阅Skerka等，1991，J.Biol.Chem.272：5627-5634)和基因组序列。FHR-4 cDNA编码长度为331个氨基酸的多肽，预计分子量为38kDa。人FHR-4的cDNA和氨基酸序列数据以登录号X98337见于EMBL/GenBank数据库。FHR-4基因序列以GenBank登录号AF190816(5’末端)、AL139418(3’末端)和BX248415可见。

FHR-5基因

FHR-5基因也称为CHFR5、CFHL5和FHR5。已经确定了人CHFR-5cDNA的参照形式(SEQ ID NO：83)(参阅McRae等，2001，J.Biol.Chem.276：6747-6754)和基因组序列。CFHR5 cDNA编码长度为569个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：8)，表观分子量为65kDa。人CFHR5的cDNA和氨基酸序列数据以登录号AF295327见于EMBL/GenBank数据库。人CFHR5参照形式的2821碱基的核苷酸序列(GenBank登录号AF295327[SEQ ID NO：7])示于图16，SEQ ID NO：7编码的多肽序列(GenBank登录号AAK15619[SEQ ID NO：8])示于图17。CFHR-5基因序列以GenBank登录号AL139418(5’末端)、AL353809(3’末端)可见。FHR-5启动子位于CFHR5基因编码区的5’。

II.定义

提供以下定义以帮助理解本发明。除非另外指明，本文使用的所有技术术语、注释和其他科学或医学术语或命名法具有医学和分子生物学领域技术人员普遍理解的意义。在一些情况下，为了清楚和/或易于参考起见，本文定义了具有普遍理解意义的术语，不应假定本文中这些定义的内容代表与本领域一般理解相比存在的显著差异。

“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”是任何长度的核苷酸聚合形式，可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链。核酸可包括启动子或其他调节序列。寡核苷酸基本通过合成的手段制备。核酸包括跨越任一多态性位点或位于其侧翼的DNA节段或其互补序列，所示多态性位点示于表1A、表1B和/或1C，或者已知在因子H基因中。节段通常在5至100个连续碱基之间，范围经常从下限5、10、12、15、20或25个核苷酸至上限10、15、20、25、30、50或100个核苷酸(其中上限大于下限)。5-10、5-20、10-20、12-30、15-30、10-50、20-50或20-100之间的核酸是常见的。多态性位点可以在节段内的任何位置出现。提到双链核酸中的一条链的序列也定义了其互补链，除非本文中另外明确说明，提到核酸的一条链也指其互补物。对于某些应用，可以修饰核酸(如RNA)以提高胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不仅限于在分子骨架中使用硫代磷酸酯或2’-O-甲基而不是磷酸二酯酶键。修饰的核酸包括肽核酸(PNA)和具有内源性内切核酸酶不易识别的非常规碱基如肌苷、queosine和wybutosine以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫代-及类似修饰形式的核酸。

“杂交探针”是能以碱基特异性方式与核酸互补链结合的核酸。此类探针包括核酸和肽核酸(Nielsen等，1991)。可以在本领域已知的严格条件下进行杂交。例如，参阅如Berger和Kimmel(1987)Methods InEnzymology，152卷：Guide To Molecular Cloning Techniques，San Diego：Academic Press，Inc.；Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：Aaboratory Manual，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory；Sambook(2001)第3版；Rychlik，W.和Rhoads，R.E.，1989，Nucl.AcidsRes.17，8543；Mueller，P.R.等(1993)In Current Protocols in MolecularBiology 15.5，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley和Sons，New York；以及Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization inNucleic Acid Hybridization(1985))。本文使用的术语“探针”包括引物。探针和引物有时指“寡核苷酸”。

术语“引物”指能在适当条件下、在适当的缓冲液和适当的温度下作为模板指导的DNA合成的起始点的单链寡核苷酸。引物的适当长度取决于引物的预期用途，但范围一般从15至30个核苷酸。引物序列不需要与模板精确互补，但必须充分互补以与模板杂交。术语“引物位点”指靶DNA中与引物杂交的区域。术语“引物对”指一组引物，包括与待扩增DNA序列的5’末端杂交的5’上游引物以及与待扩增序列3’末端互补序列杂交的3’下游引物。

用于短探针和引物的示例性杂交条件为所计算的Tm下约5至12℃。计算Tm的公式是已知的，包括对于小于14个碱基的寡聚物并假定反应在50mM一价阳离子存在下进行时的Tm＝4℃×(引物中的G和C数)+2℃×(引物中的A和T数)。对于较长的寡聚物，可以使用以下公式：Tm＝64.9℃+41℃×(引物中的G和C数-16.4)/N，其中N为引物长度。另一普遍使用的公式考虑了反应的盐浓度(Rychlik，同上，Sambrook，同上，Mueller，同上)：Tm＝81.5℃+16.6℃×(log10[Na⁺]+[K⁺])+0.41℃×(％GC)-675/N，其中N为寡聚物中的核苷酸数。上述公式提供了某些应用的起点，然而，特定探针和引物的设计可以考虑其他或不同的因素。设计用于本发明方法的探针和引物的方法为本领域所熟知。

术语“危险”、“保护性”和“中性”用于描述变异、SNP、单元型、二倍型和特征为这些变异模式的基因所编码的群体中的蛋白质。危险单元型是基因(本文中为因子H或因子H相关基因)的等位基因形式，其包含至少一个与发生AMD的危险提高相关的变体多态性，优选一组变体多态性。涉及因子H或因子H相关基因使用时，术语“变体”指核苷酸序列，其中该序列与种群(本文中为美国欧裔血统的人)中最常见的序列不同。变体多态性可以在基因的编码或非编码部分中。危险因子H单元型的实例为编码氨基酸402处的组氨酸和/或氨基酸1210处的半胱氨酸的因子H基因等位基因。危险单元型可以是天然存在的，或者通过重组技术合成。保护性单元型是基因(本文中为因子H或因子H相关基因)的等位基因形式，其包含至少一个与发生AMD的危险降低相关的变体多态性，优选一组多态性。例如，一种保护性因子H单元型具有编码氨基酸62处为异亮氨酸的因子H基因。保护性单元型可以是天然存在的，或者通过重组技术合成。中性单元型是基因(本文中为因子H或因子H相关基因)的等位基因形式，其不包含种群或人种群中与发生AMD的危险提高或降低相关的变体多态性。从以下的讨论中显然可见，当施用于需要治疗或预防AMD或其他病症的患者时，“中性”单元型编码的蛋白质可以是保护性的。即施用于例如患AMD或有发生AMD的受试者时，CFH或CFHR5的“中性”和“保护性”形式可提供治疗益处，从而“保护”受试者免于疾病。

术语“野生型”指核酸或多肽，其中序列为种群(本文中为欧洲-美洲血统的人)中的普及形式(约40％普及，见图5)。就本文公开内容的目的而言，“野生型”因子H蛋白质具有SEQ ID NO：2的序列(图7)，只是第402位氨基酸为酪氨酸(Y；[SEQ ID NO：337])。就本文公开内容的目的而言，编码野生型因子H蛋白质的因子H基因具有SEQ ID NO：1的序列(图6)，只是开始于碱基1277的密码子(对应于第402位氨基酸)编码酪氨酸(TAT[SEQ ID NO：336])。

涉及因子H或因子H相关多肽时使用的术语“变体”指多肽，其中序列在改变所编码多肽的氨基酸序列的位置上不同于正常或野生型序列。例如，因子H基因核苷酸序列中的一些变异或取代改变密码子，从而编码不同的氨基酸(例如但不仅限于在一个或多个I62V、Y402H、D936E中的替代等位基因)，导致变体多肽。变体多肽可与危险相关(如第402位为组氨酸)、与保护相关(如第62位为异亮氨酸)，或者可以由中性单元型编码(如936位为天冬氨酸)。变体CFHR5多肽可与危险相关(如第46位为丝氨酸)、与保护相关，或者可以是中性的。

涉及因子H多肽时，术语“参照”指氨基酸序列与Ripoche等人，1988，Biochem J.249：593-602所述的全长(FH1，SEQ ID NO：2)或截短(FHL1，SEQ ID NO：4)人因子H序列相同的多肽。涉及CFHR5多肽时，术语“参照”指氨基酸序列与McRae等人，2001，J.Biol.Chem.276：6747-6754所述全长人CFHR5(SEQ ID NO：8)的序列相同的多肽。任意地将第一种鉴定的等位基因形式称为参照形式或等位基因；其他等位基因形式称为替代或变体等位基因。野生型和变体形式可以与参照形式具有实质的序列同一性(例如，野生型或变体形式可以在至少90％的野生型或变体中氨基酸位置上与参照形式相同，有时在至少95％的位置、有时至少98％或99％的位置上与参照形式相同)。变体可以由于移码突变或剪接变异而在某些蛋白质区域中与参照形式不同。

术语“多态性”指种群中存在两种或更多遗传确定的替代序列或等位基因。“多态性位点”是发生序列趋异的基因座。多态性位点具有至少两种等位基因。双等位基因多态性具有两种等位基因。三等位基因多态性具有三种等位基因。二倍体生物的等位基因形式可以是纯合或杂合的。多态性位点可以小至一个碱基对。多态性位点的实例包括：限制性片段长度多态性(RFLP)；可变数目串联重复(VNTR)；高变区；小卫星；双核苷酸重复；三核苷酸重复；四核苷酸重复和简单序列重复。本文使用的术语“多态性”可包括一组多态性(即单元型)。

“单核苷酸多态性(SNP)”在单核苷酸占据的多态性位点发生，所述位点是等位基因序列之间的变异位点。该序列之前和之后一般为高度保守的等位基因序列。SNP通常由于多态性位点处一个核苷酸取代另一个而产生。用一个嘌呤取代另一个嘌呤或者用一个嘧啶取代另一个嘧啶称为转换(transition)。用嘧啶取代嘌呤或相反称为颠换(transversion)。同义SNP指编码区中用一个核苷酸取代另一个而不改变所编码多肽氨基酸序列。非同义SNP指编码区中用一个核苷酸取代另一个而改变所编码多肽氨基酸序列。SNP还可以由相对于参照等位基因的核苷酸缺失或插入而产生。

一“组”多态性指多于一种多态性，如表1A、表1B和/或表1C中所示或已知在因子H基因或其他基因中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或多于6种多态性。

术语“单元型”指个体基因中一组多态性或多态性位点的等位基因的命名。例如，“112”因子H单元型指该因子H基因在前两个多态性位点处均包含等位基因1，在第三个多态性位点处包含等位基因2。“二倍型”为单元型对。

“分离的”核酸指是组合物中存在的优势种的核酸种类。分离的指核酸从至少一种与其天然相关的化合物分离。纯化的核酸包含(基于摩尔)至少约50％、80％或90％的所存在的所有大分子种类。

当两氨基酸序列至少约80％一致、优选至少约90％一致、更优选至少约95％、至少约98％一致或至少约99％一致时，认为其具有“实质的同一性”。一般通过确定两序列间的最佳比对和比较两序列来计算序列同一性百分比。可以通过观察，或使用Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法、使用Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、使用Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85：2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化的实施(例如Wisconsin Genetics软件包中，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)使用用于氨基酸比较的默认参数(例如用于缺口评分等)来进行序列的最适比对。有的时候需要描述两个序列之间关于具体长度或区域的序列同一性(例如两个序列可以被描述为在至少500碱基对的长度上具有至少95％的同一性)。通常所述长度可以是至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个氨基酸，或是参照蛋白质的全长。如果两个氨基酸序列有1、2或3个残基，或2-20个残基、2-10个残基、3-20个残基或3-10个残基不同，则也认为它们具有实质的同一性。

“连锁”描述了基因、等位基因、基因座或遗传标记由于其位于相同染色体上，所以被一起遗传的趋势。连锁可通过两个基因、等位基因、基因座或遗传标记之间的重组百分比测量。通常，以彼此间50厘摩(cM)以内的距离存在的基因座是连锁的。连锁的标记可存在于相同的基因或基因簇内。  “连锁不平衡”或“等位基因关联”是指具体的等位基因或遗传标记与位于邻近染色体位点上特定的等位基因或遗传标记，以比群体中对任何具体等位基因可能估计的频率更频繁地优先关联。连锁不平衡的标记特别适用于检测对疾病的易感性，即使标记本身不引起所述疾病。

术语“诊断”是指确定个体是否具有发生疾病的倾向(包括有无体征或症状)的能力。诊断发生疾病的倾向还可被称为“筛选”，在本文中使用时，术语诊断和筛选可交换使用。应当明白具有提高的或降低的发生病症的倾向是指相对于未患有所述病症的群体中的个体，发生所述病症的可能性。

III.表格

本文涉及到的某些表格在下文实施例之后提供。提供以下描述以帮助阅读者：

表1A-1C显示人因子H基因多态性及其与年龄相关性黄斑变性的关联。(1A)显示人因子H基因中dbSNP号、定位、跨越多态性的编码(顶部，5’到3’方向)和非编码(底部)链的序列、氨基酸改变、对照和AMD病例的等位基因频率，和1 SNP的χ²与P-值。(1B)显示人因子H基因中dbSNP号、被查询的序列、黑猩猩因子H基因中相应的核苷酸、定位、氨基酸改变以及引物与探针组。(1C)显示在dbSNP数据库中没有找到的人因子H基因中定位、跨越多态性的序列、氨基酸位置和14 SNP的氨基酸改变(如果有的话)。

表2显示一组AMD病例和对照中人因子H基因中八个SNP的单元型分析。

表3显示人因子H基因中六个SNP的单元型分析以及它们与AMD的关联。

表4显示11个人因子H基因SNP与年龄相关性黄斑变性的关联。

表5显示用于人因子H的SSCP、DHPLC和DNA测序分析的引物。

表6显示AMD患者和对照的基因分型数据。

表7显示多个人种群中危险单元型的频率。

表8显示若干种因子H的二倍型。指出了普遍危险和保护性二倍型。

表9显示用于扩增因子H编码序列的引物序列。

表10显示用于扩增CFHR5编码序列的引物序列。

表11显示22个MPGNII患者中因子H SNP分析。

表12显示22个MPGNII患者和AMD-阴性的、人种相匹配的对照中因子H SNP频率的比较。

表13列出与MPGNII相关联的因子H SNP及其相关的SCR。

表14显示22个MPGNII患者中CFHR5 SNP的分析。

表15显示22个MPGNII患者和AMD-阴性的、人种相匹配的对照中CFHR5 SNP频率的比较。

表16显示用于检测因子H基因中多态性的示例性的等位基因特异的探针(16A)和引物(16B)。

IV.补体因子H多态性

在一个方面，本发明提供与下述发现相关的新的诊断、治疗和药物筛选方法，所述发现为：补体因子H(HF1)基因中的多态位点与对AMD的易感性和AMD的发展有关。

与AMD相关的因子H多态性如实施例1所述被鉴定，其根据标准方案使用SSCP分析、DHPLC分析和直接测序法检查因子H(包括外显子10A，其被转录为因子H的同种型FHL1)的编码区和邻近内含子区域的变体。剩余的多态性通过5’核酸酶(Taqman，ABI)方法分型。如所述的进行Taqman基因分型和关联分析(Gold等，2004)。使用Mac Vector软件设计用于SSCP和DNA测序分析的引物，以扩增各外显子及其邻近的内含子区域。根据标准方案通过SSCP和DHPLC，针对序列变异筛选PCR得到的扩增子。通过SSCP和DHPLC检测到的所有改变根据标准方案通过双向测序证实。使用χ方(χ²)和Fisher′s精确检测(P值)进行统计学分析。

使用两组独立的AMD病例和年龄匹配的对照。所有参与的个体都是美国欧裔血统、大于60岁年龄并依照知情同意在IRB-批准的方案下招募。这些组由以下组成：来自The University of Iowa的352名患有临床上被证明的AMD的无关联的患者(平均年龄79.5±7.8岁)和113名无关联的对照患者(平均年龄78.4±7.4岁；通过年龄和人种匹配)，和来自ColumbiaUniversity的550名患有临床上被证明的AMD的无关联的患者(平均年龄71.32±8.9)和275名无关联的、通过年龄和人种匹配的对照(平均年龄68.84±8.6岁)。由视网膜研究员训练的眼科医师通过间接检眼镜检查法和裂隙灯显微镜检查法来检查患者。

Fundas照片根据标准化的、国际分类体系(Bird等，1995)分级。如果对照患者未显示任何可辨别的黄斑疾病体征或不具有已知的AMD家族史，则将他们选择并包括。AMD患者根据他们参与研究时最严重的眼分类被细分为表型类别：早期AMD(ARM)、地图样萎缩(GA)和渗出性(CNV)AMD。The University of Iowa的ARM和GA病例被进一步细分为不同的表型(单独的RPE改变、＞10的斑状硬玻璃疣、斑状软玻璃疣、BB(表皮)玻璃疣、PED、“Cherokee”萎缩、半岛状地图样萎缩(peninsulargeographic atrophy)和框式地图样萎缩(pattern geographic atrophy))。所有病例的最早的可被证明的表型也被记录并用于分析。

如表1A中所示，在两个独立组的检测中发现因子H基因多态位点与AMD的高度显著的关联，所述两个独立组一共包括约900个AMD病例和400个匹配的对照。表1A-1B中列出十六(16)个因子H基因中的多态性。其中有十二(12)个在SNP数据库(dbSNP)中发现，所述数据库可在国家生物技术信息中心(NCBI)找到。dbSNP是人因子H基因中SNP的集合，所述SNP分散于因子H基因的22个编码外显子中，分散于因子H基因的启动子、5’未翻译区、内含子和3’未翻译区中。以下列出在dbSNP数据库中找到的人因子H基因中379个SNP的登录号。这些SNP可用于实施本发明的方法。

表A

rs17575212rs17573867rs16840522

rs11582939rs11580821rs11579439

rs7551203rs7546015rs7540032

rs5014736rs5014735rs5014734

rs2019724rs1984894rs1928433

rs534479rs534399rs529825

rs395963rs395544rs395129

rs16840465rs16840462rs16840422rs16840419RS16840410rs16840401rs16840397rs16840394rs16840381rs16840379rs12756364rs12746361rs12740961rs12726401rs12566629rs12565418rs12406047rs12405238rs12402808rs12238983rs12144939rs12136675rs12134975rs12134598rs12127759rs12124794rs12116702rs12096637rs12085209rs12081550rs12069060rs12047565rs12047106rs12047103rs12045503rs12042805rs12041668rs12040718rs12039905rs12038674rs12038333rs12033127rs12032372rs12030500rs12029785rs12025861rs11809183rs11801630rs11799956rs11799595

rs11539862rs11398897rs11390840rs11340441rs11339120rs11318544rs11285593rs10922109rs10922108rs10922107rs10922106rs10922105rs10922104rs10922103rs10922102rs10922101rs10922100rs10922099rs10922098rs10922097rs10922096rs10922095rs10922094rs10922093rs10922092rs10801561rs10801560rs10801559rs10801558rs10801557rs10801556rs10801555rs10801554rs10801553rs10754200rs10754199rs10737680rs10737679rs10733086rs10688557rs10685027rs10664537rs10616982rs10545544rs10540668rs10536523rs10489456rs10465603rs10465586rs9970784

rs7539005rs7537967rs7535653rs7535263rs7529589rs7526622rs7524776rs7522681rs7519439rs7514261rs7513157rs7415913rs7413999rs7413137rs6695321rs6691749rs6690982rs6689826rs6689009rs6688272rs6685249rs6682138rs6680396rs6677604rs6677460rs6677089rs6675088rs6674960rs6673106rs6664877rs6664705rs6660100rs6428357rs6428356rs5779848rs5779847rs5779846rs5779845rs5779844rs5022901rs5022900rs5022899rs5022898rs5022897rs5016801rs5014740rs5014739rs5014738rs5014737rs5002879

rs5014733rs5003626rs5003625rs5003624rs5002880rs5002876rs5002875rs5002874rs4658046rs4657826rs4350148rs4044888rs4044884rs4044882rs3834020rs3766405rs3766404rs3766403rs3753397rs3753396rs3753395rs3753394rs3043115rs3043113rs3043112rs3043111rs2878649rs2878648rs2878647rs2860102rs2746965rs2336225rs2336224rs2336223rs2336222rs2336221rs2300430rs2300429rs2284664rs2284663rs2274700rs2268343rs2173383rs2143912rs2104714rs2064456rs2020130rs2019727rs1803696rs1587325

rs1928432rs1887973rs1831282rs1831281rs1831280rrs1410997rs1410996rs1329429rs1329428rs1329427rs1329424rs1329423rs1329422rs1329421rs1299282rs1292487rs1292477rs1292476rs1292475rs1292474rs1292473rs1292472rs1292471rs1292466rs1156679rs1156678rs1089031rs1065489rs1061171rs1061170rs1061l47rs1061111rs1060821rs1048663rs1040597rs800295rs800293rs800292rs800291rs800290rs800280rs800271rs800269rs766001rs765774rs742855rs731557rs572515rs570618rs569219

rs528298rs521605rs520992rs519839rs518957rs551397rs544889rs543879rs536564rs536539rs515299rs514756rs514591rs513699rs512900rs508505rs499807rs495968rs495222rs493367rs491480rs490864rs488738rs487114rs482934rs480266rs466287rs464798rs463726rs460897rs460787rs460184rs459598rs454652rs436337rs435628rs434536rs430173rs428060rs424535rs422851rs422404rs420922rs420921rs419137rs414539rs412852rs410232rs409953rs409319

rs393955rs386258rs385892rs385543rs383191rs405306rs403846rs402991rs402056rs399469rs398248rs381974rs380390rs380060rs379489rs375046rs374896rs374231rs371647rs368465rs364947rs203688rs203687rs203686rs203685rs203684rs203683rs203682rs203681rs203680rs203679rs203678rs203677rs203676rs203675rs203674rs203673rs203672rs203671rs203670rs203669rs70621rs70620rs15809rs14473rs3645

rs11799380rs11584505

rs9970075rs9427909

rs5002878rs5002877

rs1576340rs1474792

rs564657rs559350

rs409308rs407361

两个常见的非同义变体——外显子2中的I62V与外显子9中的Y420H，和一个较不常见的变体——外显子22中的R1210C显示与AMD最显著的关联。

表1A-1B中三个额外的多态性未在SNP数据库中找到：启动子中的多态性(表1A中的启动子1)、其中插入了两个T核苷酸的内含子2中的多态性和外显子10A中的多态性。

表1A中第一列列出因子H基因中多态性的dbSNP号。例如，rs800292是因子H基因中一个多态性的dbSNP名称。该多态性的描述以及dbSNP中其他因子H基因多态性可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝snp&cmd＝search&term＝)获得。第二列列出多态性的定位。例如，rs800292多态性定位于因子H基因的外显子2中。未通过数据库号鉴定的多态性可通过定位命名(例如“内含子2”)。第三列列出跨越多态性的DNA的编码(顶部，5’到3’方向)和非编码链(底部)的核酸序列。例如，显示多态性5’和3’的20个核苷酸位于rs800292多态性(编码链括号中指出的G或A)的侧翼。跨越外显子10A多态性的序列中的“N”指出变体等位基因中单个核苷酸的插入(A、C、G或T任一)。第四列列出序列的SEQ ID NO：。第五列列出与多态性相关的氨基酸改变(如果有的话)。例如，rs800292多态性导致因子H多肽的位置62处缬氨酸(V)到异亮氨酸(I)的氨基酸序列改变。第六列列出对照群体中多态性的等位基因频率。数1和2是指第三列中多态位点处分别对应于第一个和第二个核苷酸的等位基因。例如对rs800292多态性而言，G存在于78％的、A存在于22％的来自对照群体的所测序等位基因中。第七列列出AMD群体中多态性的等位基因频率。例如对rs800292多态性而言，G存在于91％的、A存在于9％的来自AMD群体的所测序等位基因中。第八列列出用于对照和AMD群体中多态性的等位基因频率之间比较的χ方检验和Fisher′s精确检验(分别为χ²和P值)。例如对rs800292多态性而言，χ²值是16.19，P值是5.74×10^-5，指示G等位基因与AMD关联。

表1B的第(1)、(2)、(3)部分的第一列列出因子H基因中多态性的dbSNP号。对于第(1)部分，第二列列出跨越多态性的核酸序列(查询序列)。对于rs529825(内含子1)、rs800292(外显子2)和rs203674(内含子10)多态性而言，显示人因子H基因的非编码链的序列。第三列列出序列的SEQ ID NO：。第四列列出存在于黑猩猩因子H基因中的等位基因。第五列列出SNP的定位。第六列列出与多态性关联的氨基酸改变(如果有的话)。对于第(2)部分，第二列和第四列列出用于扩增多态性的正向和反向引物或AOD号。第三列和第五列列出引物的SEQ ID NO：。对于第(3)部分，第二列和第四列列出用于检测多态性的探针。第三列和第五列列出探针的SEQ ID NO：。

应当理解未在表1A-1B中列出的因子H基因中的其他多态位点可以与AMD关联。因子H基因中的示范性多态位点已在上文列出，它们用于举例而非限制。表1C列出未在dbSNP数据库中找到的、可与AMD或其他疾病关联的因子H基因中其他的14个多态位点。第一列列出SNP定位。第二列列出跨越多态性的核酸序列。跨越外显子5多态性的序列中，“notG”指示变体等位基因中A、C或T核苷酸的存在，跨越外显子6多态性的序列中，“notC”指示变体等位基因中A、G或T核苷酸的存在。跨越外显子21多态性的序列中，“N”指示在变体等位基因中单个核苷酸(A、C、G或T之任一)的插入。第三列指出与多态性关联的氨基酸变化(如果有的话)。第四列指出序列的SEQ ID NO：。这些SNP也可用于实施本发明的方法。另外，应当理解这些CFH多态性适用于连锁和关联研究、对临床群体基因分型、将基因型信息与表型信息相关联、杂合子丢失分析和细胞样品来源鉴定。

表2显示AMD病例和对照中人因子H基因中八个SNP的单元型分析。危险单元型以点状框显示，确定SNP(Y402H和IVS10)的单元型以稠密点显示。保护性单元型以斜线框表示，确定SNP(IVS1、162V和IVS6)的单元型显示为不稠密的斜线。第一列列出启动子(Prom)中多态性的等位基因。第二列列出内含子1(IVS1)中多态性非编码链的等位基因。第三列列出外显子2(I62V)中多态性非编码链的等位基因。第四列列出内含子6(IVS6)中多态性的等位基因。第五列列出外显子9(Y402H)中多态性的等位基因。第六列列出内含子10(IVS10)中多态性的非编码链的等位基因。第七列列出外显子13(Q672Q)中多态性的等位基因。第八列列出外显子18(D936E)中多态性的等位基因。这八个SNP的dbSNP名称列在表1A-1B中。第九列列出单元型的让步比(Odds Ratio，OR)。第十列列出危险和两个保护性单元型的P值。第十一和十二列列出AMD病例和对照中单元型的频率。

表3显示患有AMD的六个因子H多态性的单元型分析。第一列列出启动子中多态性的某些等位基因(rs3753394)。第二列列出内含子1中多态性的等位基因(rs529825)。第三列列出内含子6中多态性的等位基因(rs3766404)。第四列列出内含子10中的多态性(rs203674)。第五列列出外显子13中多态性的等位基因(rs3753396)。第六列列出外显子18中多态性的等位基因(rs1065489)。第1到6列中数字1和2是指分别对应于各多肽位点(见表1A)第一和第二个核苷酸的等位基因。因此，第1到6列列出因子H基因中从5’到3’的多态性的等位基因。第七列列出基于第1到6列中所列多态性的因子H单元型。第八列列出对照群体中所指示的因子H单元型的频率。第九列列出AMD群体中所指示的因子H单元型的频率。如表3中所示，单元型分析提示多种变体有助于关联，并可赋予提高的或降低的AMD危险。

表8显示七个因子H多态性的二倍型分析。第一列指出该二倍型是否与提高的(危险二倍型)或降低的(保护性二倍型)发生AMD的危险相关。指出一般危险和保护性二倍型。第二列列出外显子2(I62V)中多态性的等位基因。第三列列出内含子2(IVS2-18)中多态性的等位基因。第四列列出外显子9(Y402H)中多态性的等位基因。第五列列出外显子18(D936E)中多态性的等位基因。第六列列出内含子20(IVS20)中多态性的等位基因。

危险相关的(“危险”)多态性和单元型

表1A和表2中显示包含与提高的AMD危险相关的多态性的位点。与提高的危险特别相关的多态性包括以下处的变体等位基因：rs1061170(402H；外显子9)、rs203674(内含子10)和残基1210(R1210C，外显子22)处的多态性。

表2和表6和图5中显示了某些与提高的AMD危险相关的单元型。如表2和图5中所示，一种普遍的危险单元型为H1单元型，其包括位置402处(编码组氨酸)的变体等位基因和在IVS10(内含子10，rs203674)处的变体等位基因，并在49％的AMD病例中发现，但是仅在26％的对照中发现。危险二倍型(H1/Hl)的纯合子明显处于危险中。其他危险单元型和二倍型如表2和表8所示。相似的数据呈现于表3中，其显示在48％的AMD病例中发现的、但是仅在28％对照中发现的危险单元型(111211)。

值得注意的是，百分之七十的MPGNII(II型膜性增生性肾小球肾炎)患者拥有该危险单元型(见表7)，这指示发生MPGNII的倾向可如本文所述用于AMD的方式检测和治疗。

这些多态性位点的显著相关性也在如实施例1中公开的多种AMD亚型中发现。

因子H基因外显子22中氨基酸位置1210处的非同义多态性与AMD强烈相关(见表1A)。编码半胱氨酸代替精氨酸的变体等位基因在5％的AMD病例中的杂合状态中发现，在对照中没有发现，所述对照属于由TheUniversity of Iowa确定的919个个体组成的小组。迄今为止未鉴定到第1210号纯合子。因此，因子H氨基酸位置1210处的半胱氨酸的存在提供了有力的提示：个体患有AMD或很可能发生AMD。值得注意的是，1210C指示发生AMD或其他补体介导的病症的倾向，甚至检测到保护性等位基因(例如Y402)时也是如此。已知CFH位置1210(R1210C)的变异引起非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)——一种伴随肾症状的补体相关疾病。由此扩展可得，其他已知引起aHUS的CFH变体或突变可与提高的发生AMD的危险相关。最常见的已确定的引起aHUS的变异包括，但不限于T956M、Q1076E、D1119G、W1183L、T1184R、L1189R、L1189F、S1191W、S1191L、V1197A和R1215G(Esparza-Gordillo等2005；Perez-Caballero等2001；Richards等2001；Sanchez-Corral等2002)；其他的引起aHUS的突变描述于Saunders(Saunders等2006)。在本发明的一个方面，在来自受试者的生物样品(例如蛋白质或核酸)中测定一种或多种aHUS相关的变异或突变的存在，所述aHUS相关的变异或突变的存在指示发生AMD的倾向。

应当理解没有在表1A-1C中列出的因子H基因中其他的多态性位点可进一步精炼该单元型分析。使用因子H基因中非同义多态性的单元型分析适用于鉴定变体因子H多肽。其他与危险相关的单元型可编码下述蛋白质，所述蛋白质与中性或保护性单元型所编码的蛋白质序列相同，但是在启动子或内含子中含有等位基因，例如改变因子H表达水平或位点的等位基因。还应理解因子H基因中或因子H相关基因中的多态性可与相邻基因的变异相关。相邻基因的变异可导致所编码的蛋白质表达或形式的改变，并在载体中具有有害的或保护性的作用。

保护性多态性和单元型

意外地，还发现了保护性多态性和单元型。例如如表2和图5中所示，包含IVS6(内含子6，rs3766404)中变体等位基因的保护性H2单元型存在于12％的对照中，但仅存在于6％的AMD病例中。保护性H4单元型包括IVS1(内含子1，rs529825)中的变体等位基因和变体等位基因(I62)(外显子2，rs800292)，并在18％的对照中发生，但是仅在12％的AMD病例中发生。相似的数据存在于表3中，其中单元型121111在21％对照中发生，但是仅在13％的AMD病例中发生，单元型112111在13％的对照中发生，但是仅在6％的AMD病例中发生。如图5所示，具有保护性单元型的纯合子明显保护。

在一些情况下，由表征为保护性单元型的基因编码的蛋白质与危险单元型蛋白质具有序列差异(例如由于非同义SNP的存在)。例如，因子H蛋白质的保护性形式通常在位置402上不含有组氨酸。在一些实施方案中，保护性形式在位置62具有异亮氨酸。其他的保护性形式可通过以下鉴定：(1)鉴定个体或具有保护性单元型的个体，和(2)确定来自个体的因子HcDNA或蛋白质的序列。其他保护性形式如下文在第VIII节所述鉴定。

中性多态性和单元型

某些单元型在群体中与发生AMD的提高的危险或降低的危险均不相关，并被称为“中性”。白种人群体中鉴定的中性单元型的实例显示在图5中(H3和H5)。其他的或不同的中性单元型可以在人种/种族不同的群体中鉴定。由表征为中性单元型的基因编码的蛋白质是“中性”因子H蛋白质。如上文所解释的，当给具危险单元型或诊断为患有AMD的患者施用“中性”因子H蛋白质时，其可提供治疗益处。例如由表征为中性单元型的基因编码的示范性蛋白质包括在位置402不具有组氨酸和/或位置62不具有异亮氨酸的蛋白质。位置402不具有组氨酸的蛋白质可在该位置具有酪氨酸，或具有除组氨酸或酪氨酸外的氨基酸。在位置62不具有异亮氨酸的蛋白质可在该位置具有缬氨酸，或可具有除缬氨酸或异亮氨酸之外的氨基酸。因子H蛋白质的中性形式通常在位置1210不具有半胱氨酸。

V.因子H相关5(CFHR5)基因多态性

在一个方面，本发明提供与下述发现相关的新的诊断、治疗和药物筛选方法，所述发现为因子H和CFHR5基因中的多态性位点与对MPGNII的易感性和MPGNII的发生相关。

与MPGNII相关的因子H和GFHR5多态性如实施例2中所述如下鉴定：通过使用PCR扩增在因子H或CFHR5的编码和邻近内含子区域检查变体，然后琼脂糖凝胶电泳并根据标准方案双向测序以验证PCR产物。对照群体中新的和经报道的SNP通过变性高效液相层析(DHPLC)分型。用于扩增因子H和CFHR5编码序列的引物分别显示在表9和表10中。

由患有经活检证实的MPGII的患者组成的测试组在肾病科查明，并依照IRB批准的方针招募在该研究中。对照组由种族匹配的但是年龄不匹配的、不相关的人组成，所述人已通过眼科检查排除了AMD。

如表11和表12所示，因子H基因中多态性位点与MPGNII之间的显著相关在对22个MPGNII病例和131个种族匹配的对照的检查中发现。因子H基因中十一(11)个多态性列于表11和表12中。其中，六(6)个在国家生物技术信息中心(NCBI)的SNP数据库(dbSNP)中发现。dbSNP是人基因组中SNP的集合。因子H基因中的SNP分散在因子H基因的22个编码外显子中，分布于因子H基因启动子、5’未翻译区、内含子和3’未翻译区中。在dbSNP数据库中发现的人因子H基因中379个SNP的登录号在上文列出。这些SNP可用于实施本发明的方法。

表11和表12中五个额外的多态性未在SNP数据库中找到：内含子2中的多态性，其中插入两个T核苷酸(IVS2-18insTT)；内含子7中的多态性(IVS7-53G＞T)；内含子15中的多态性(IVS15-30C＞A)；内含子18中的多态性(IVS18-89T＞C)；和外显子20中的多态性(N1050Y)。这些多态性适用于本发明的方法。另外，应当明白这些CFHR5多态性适用于连锁和关联研究、对临床群体基因分型、将基因型信息与表型信息相关联、杂合子丢失分析和细胞样品来源鉴定。

表11中第一行列出因子H基因中SNP的外显子或内含子位置。对外显子SNP而言，列出氨基酸位置和变化(如果有的话)。例如外显子2SNP位于因子H多肽的位置62，并有缬氨酸(V)到异亮氨酸(I)的改变。对于内含子SNP而言，指出SNP的性质。例如内含子2 SNP是两个核苷酸TT的插入。表11的第二行列出多态性的dbSNP号(如果有的话)。例如，rs800292是因子H基因中外显子2中多态性的dbSNP名称。该多态性以及dbSNP中其他因子H(CFH)基因的多态性的描述可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝snp&cmd＝search&term＝)获得。表11的第三行到第五行列出具体的二倍型存在于22个MPGNII患者中的次数。例如对于外显子2 SNP而言，GG存在于20个患者中，GA存在于2个患者中，AA在患者中不存在，所述患者患有MPGNII。表11的第六行和第七行列出具体的单元型存在于22个MPGNII患者中的频率。例如对于外显子2 SNP而言，G存在于95％的，A存在于5％的22个MPGNII患者的等位基因中。第八行列出22个MPGNII患者的因子H基因中一般单元型的核苷酸。例如，在22个MPGNII患者的因子H基因中，G是外显子2 SNP中更频繁的核苷酸，9T在内含子2 SNP中比11T更频繁地观察到。剩余的行列出22个MPGNII患者中每个的因子H基因中的11个SNP的二倍型。

应该理解，表11中未列出的因子H基因中的其他多态性位点可能与MPGNII相关。例如但非限制地，上文列出了因子H基因中的示例性多态性位点。

表12显示MPGNII患者与AMD阴性的人种匹配对照个体之间SNP频率的比较。表12的第一列列出了因子H基因中的SNP。表12的第二和第三列列出了特定单元型在22名MPGNII患者中出现的频率。表12的第四和第五列列出了特定单元型在131名对照个体中出现的频率。表12的第六列列出了对每个数据集计算的P值。

如表11和12所示，两种常见的非同义变体：外显子2中的I62V和外显子9中的Y420H；同义变体：外显子10中的A307A以及内含子2中的多态性显示与MPGNII显著相关。

如图14和15所示，在22个MPGNII病例和103个人种匹配的对照中进行的检查中发现，CHFR5基因的多态性位点与MPGNII显著相关。表14和15中列出了CFHR5基因中的五种(5)多态性；它们以dbSNP见于NCBI。CFHR5基因中的SNP分布在CFHR5基因的10个编码外显子中，并且分布在CFHR5基因的启动子、5’未翻译区、内含子和3’未翻译区中。下文列出的是见于dbSNP数据库的人CFHR5基因中82种SNP的登录号。这些SNP可用于实施本发明的方法。

表B

rs16840956rs16840946rs16840943rs12755054rs12750576rs12745733rs12736097rs12736087rs12735776rs12731848rs12731209rs12142971

rs12116643rs12097879rs12097550rs12092294rs12091602rs12064805rs12049041rs12039272rs11583363rs11306823rs10922153rs10922152

rs10922151rs10801584rs10801583rs10622350rs10614978rs10613146rs10588279rs9727516rs9427942rs9427941rs9427664rs9427663

rs9427662rs9427661rs9427660rs9427659rs7555407rs7555391rs7554757rs7550970rs7550735rs7550650rs7547265rs7537588

rs7535993rs7532441rs7532068rs7528757rs7527910rs7522952rs7522197rs7419075rs7366339rs6702632rs6702340rs6674853

rs6694672rs6692162rs6657256rs6657171rs5779855rs3748557rs2151137rs2151136rs1855116rs1759016rs1750311rs1412636

rs1332664rs1325926rs1170883rs1170882rs1170881rs1170880rs1170879rs1170878rs928440rs928439

表14的第一行列出了CFHR5基因中SNP的外显子、启动子或内含子位置。对于外显子SNP，列出了氨基酸位置和改变(如果有的话)。例如，外显子2SNP位于CFHR5多肽的第46位，由脯氨酸(P)改变成丝氨酸(S)。对于启动子和内含子SNP，标出了SNP的性质。例如，-249位的启动子SNP用C置换T。表14的第二行列出了多态性的dbSNP号(如果有的话)。例如，rs9427661是CFHR5基因启动子区中多态性的dbSNP名称。该多态性以及dbSNP中其他CFHR5基因多态性的描述在http://www.ncbi.nlm.nih.gov(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝snp&cmd＝search&term＝)提供。表14的第三到第五行列出了特定二倍型在22名MPGNII患者中的出现次数。例如，对于外显子2SNP，CC在19名MPGNII患者中出现，CT在3名MPGNII患者中出现，TT未在MPGNII患者中出现。表14的第六和第七行列出了特定单元型在22名MPGNII患者中的频率。例如，对于外显子2SNP，在22名MPGNII患者的等位基因中，C(编码脯氨酸)在93％中出现，T(编码丝氨酸)在7％中出现。第八行列出了22名MPGNII患者中CFHR5基因一般单元型的核苷酸。例如，在22名MPGNII患者中，在CFHR5基因的外显子2SNP中，C是更为常见的核苷酸。剩下的行列出了22名MPGNII患者中每一名的CFHR5基因中5SNP的二倍型。

应该理解，表14中未列出的CFHR5基因中其他多态性位点可能与MPGNII相关。例如但非限制地，上文列出了CFHR5基因中的示例性多态性位点。

表15显示MPGNII患者与AMD阴性人种匹配对照个体中SNP频率的比较。表15的第一列列出了CFHR5基因中的SNP。表15的第二和第三列列出了特定单元型在22名MPGNII患者中出现的频率。表15的第四和第五列列出了特定单元型在103名对照个体中出现的频率。表15的第六列列出了对每个数据集计算的P值。

如表14和15所示，一个非同义变体：外显子2中的P46S以及两个启动子多态性：-249T＞C和-2-T＞C显示与MPGNII显著相关。

MPGNII患者中鉴定的危险相关(“危险”)多态性和单元型

包含与MPGNII危险提高相关的因子H及CFHR5多态性的位点分别示于表11和12以及表14和15。因子H和CFHR5中与危险提高尤其相关的多态性分别包括rs1061170(外显子9中的Y420H)和rs12097550(外显子2中的P46S)处的变体等位基因。

与MPGNII危险提高相关的某些单元型示于表12和15。如表12所示，因子H基因中的一种危险单元型包括第402位的变体等位基因(编码组氨酸)，可见于64％的MPGNII病例中，但仅见于33％的对照。如表15所示，CFHR5基因中的一种危险单元型包括第46位的变体等位基因(编码丝氨酸)，可见于7％的MPGNII病例，但仅见于＜1％的对照。

应该理解，表11-12和14-15中未列出的因子H和CFHR5基因中其他多态性位点可能进一步精炼这些单元型分析。使用因子H或CFHR5基因中非同义多态性的单元型分析可用于鉴定变体因子H或CFHR5多肽。与危险相关的其他单元型可能编码与中性或保护性单元型所编码蛋白质序列相同的蛋白质，但在启动子或内含子中含有等位基因，例如改变因子H或CFHR5表达的水平或位置的等位基因。

保护性多态性和单元型

意外地，还发现了保护性多态性和单元型。例如，如表12所示，外显子2中具有变体等位基因(rs800292，I62V)的单元型在23％的对照中出现，但仅在＜3％的MPGNII病例中出现，IVS2(内含子2，-18insTT)中具有变体等位基因的单元型在26％的对照中出现，但仅在＜3％的MPGNII病例中出现。外显子10中具有变体等位基因(rs2274700，A473A)的单元型在对照中出现的频率比MPGNII病例出现的频率高。

在一些情况下，特征为保护性单元型的基因所编码的蛋白质具有与危险单元型蛋白质不同的序列。例如，因子H蛋白质的保护性形式通常第402位不是组氨酸。在一些实施方案中，保护性形式的第62位是异亮氨酸。可以通过以下方法鉴定其他保护性形式：(1)鉴定具有保护性单元型的一个或多个个体和(2)确定来自该个体的因子H cDNA或蛋白质序列。一些保护性形式比全长短。可以类似地鉴定CFHR5蛋白质的保护性形式。

中性多态性和单元型

某些单元型与发生MPGNII的危险提高或降低均不相关，称为“中性”。特征为中性单元型的基因所编码的蛋白质为“中性”因子H或CFHR5蛋白质。例如，特征为中性单元型的基因所编码的示例性蛋白质包括第402位不是组氨酸或第62位不是异亮氨酸的因子H蛋白质以及第46位不是丝氨酸的CFHR5蛋白质。

MPGNII患者中多态性的重要性

如实施例2所示，已经发现与发生AMD的倾向相关的相同CFH多态性也与发生2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGNII)相关。事实上，最初在AMD患者中发现的危险单元型(Y402H和IVS10)也可见于70％测试的患2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGNII)患者中，表明本发明的诊断方法可用于检测该病症。此外，CFHR5基因中的变异和单元型与患MPGNII的危险提高强烈相关。从这些数据中得出一个结论：MPGNII和AMD是同一遗传损伤的替代性表现。值得注意的是，MPGNII患者发生玻璃疣，它与AMD中形成的玻璃疣在临床上和组成上均无法区分。区别这两种基底表型的惟一特征是发病年龄——MPGNII中的玻璃疣发生较早，经常在10-20岁，而AMD中的玻璃疣发生年龄较晚。我们推断，在任一群体(AMD或MPGNII)中鉴定的因子H基因和CFHR5基因可以是对两种疾病易感性的预兆。可能有促成MPGNII和引起早期表型的其他因素。由于AMD很普遍而MPGNII很罕见，因此CFH和CFHR5基因的单元型分析以及本文所述的其他方法将可用于筛选和治疗患有AMD或发生AMD的可能性提高的患者。

功能缺失

因子H或CFHR5正常或野生型功能的缺失可能与AMD相关。显示与AMD相关性最强并导致变体因子H多肽或变体CFHR5多肽变异的因子H基因中的非同义多态性(如表1A、1B、1C、11、14和15所示)可能在AMD发挥原因作用。这样的作用可以通过产生转基因非人动物并确定该动物是否发生AMD来确认，所述动物表达带有这些非同义多态性的人因子H或CFHR5。因子H或CFHR5编码区中引入终止密码子的多态性可能通过减少或消除功能性因子H或CFHR5蛋白质而导致AMD。终止密码子还可能引起产生截短的因子H或CFHR5肽，其活性相对于全长蛋白质是异常的。调节区如启动子和内含子中的多态性可能通过降低因子H或CFHR5基因表达而导致AMD。内含子(如CFH的内含子2)中的多态性也可能通过改变基因剪接模式(导致因子H或CFHR5蛋白质的改变)而导致AMD。可以测定CFH RNA或蛋白质以检测剪接变体表达的变化，其中所述变化指示发生AMD的倾向。已经对因子H基因本身报道了选择性剪接模式。

可以通过若干手段确定因子H基因或CFHR5基因中多态性对AMD的影响。可以通过测量样品中的蛋白质水平来确定变体因子H或CFHR5多肽的表达水平的改变，所述样品来自患或未患AMD或多种AMD亚型的个体组。可以通过测定来自上述个体组的样品中因子H或CFHR5的体外活性(如与C3b或肝素结合)来检测变体因子H或CFHR5多肽生物活性的改变。

VI.基因组重复位点处的多态性

如图18所示，CFH基因和因子H相关(CFHR)1-5基因具有共享的高度保守区域，所述区域可能是由基因组重复产生的序列。可见于CFH或CFHR5的某些SNP和变异(如本文所述)预期也在CFHR1、CFHR2、CFHR3和CFHR4的相应序列中。例如，CFH外显子22的相应序列可见于CFH、CFHR1和CFHR2，可能在CFH外显子22中鉴定的多态性(如R1210C)也可见于CFHR1和/或CFHR2，并且这些改变可能与AMD、MPGNII和其他补体相关病症的发生倾向相关联。在CFH和CFHR5中鉴定的多态性位点侧翼序列的同源节段可以通过比对这些区域中的cDNA或基因组序列来鉴定。多态性位点侧翼的保守性序列通常包含至少10bp(在多态性位点的任一侧)，更常为至少20bp、或至少50bp或至少100bp，它们在核苷酸水平具有至少95％同一性，有时具有98％同一性、至少99％同一性或甚至100％同一性。同一性可通过观察或使用熟知的算法(Smith和Waterman，1981或Needleman和Wunsch，1970，均同上文)来测定。因此本发明提供确定受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)或其他病症的方法，所述方法是通过检测对应于CFH或CFHR5基因中同源多态性位点的因子H相关基因多态性位点处是否存在变异。

CFH和因子H相关基因的序列为本领域所公知(见本文中其他各处提供的序列和登录号)。还参阅Rodriquez de Cordoba，S.，等，2004，MolImmunol 41：355-67；Zipfel等，1999，Immunopharmocology 42：53-60；Zipfel等，Factor H family proteins：on complement，microbes and humandiseases，Biochem Soc Trans.2002年11月；30(Pt 6)：971-8；Diaz-GuillenMA，等，A radiation hybrid map of complement factor H and factorH-related genes，Immunogenetics，1999年6月；49(6)：549-52；Skerka C，等.，A novel short consensus repeat-containing molecule is related to humancomplement factor H，J Biol Chem.1993年2月5日；268(4)：2904-8；Skerka C，等，The human factor H-related gene 2(FHR2)：structure andlinkage to the coagulation factor XIIIb gene，Immunogenetics，1995；42(4)：268-74；Male DA，等，Complement factor H：sequence analysisof 221 kb of human genomic DNA containing the entire fH，fHR-1 andfHR-3 genes，Mol Immunol.2000年1-2月；37(1-2)：41-52；Hellwage J，等.，Biochemical and functional characterization of the factor-H-relatedprotein 4(FHR-4)，Immunopharmacology.1997年12月；38(l-2)：149-57；Skerka C，等.，The human factor H-related protein 4(FHR-4).A novelshort consensus repeat-containing protein is associated with humantriglyceride-rich lipoproteins，J Biol Chem.1997年2月28日；272(9)：5627-34；Hellwage J，等，Functional properties of complement factorH-related proteins FHR-3 and FHR-4：binding to the C3d region of C3band differential regulation by heparin，FEBS Lett.1999年12月3日；462(3)：345-52；Jozsi M，等，FHR-4A：a new factor H-related protein isencoded by the human FHR-4 gene，Eur J Hum Genet.2005年3月；13(3)：321-9；McRae JL，等，Location and structure of the human FHR-5gene，Genetica.2002年3月；114(2)：157-61；McRae JL，等.，Human factorH-related protein 5 has cofactor activity，inhibits C3 convertase activity，binds heparin and C-reactive protein，and associates with lipoprotein，JImmunol.2005年5月15日；174(10)：6250-6；Murphy B，等.，FactorH-related protein-5：a novel component of human glomerular immunedeposits，Am J Kidney Dis.2002年1月；39(l)：24-7。

VII.检测和分析与AMD相关的因子H多态性

因子H基因和CFHR5基因中的多态性位点和单元型与AMD(和MPGNII)相关这一发现具有多种特定应用，包括筛选个体以查明发生AMD的危险以及鉴定患有AMD或发生AMD的危险提高的个体的新的和最佳的治疗方法。不限于特定机制地，因子H基因中的多态性以多种方式影响个体的表型。因子H蛋白质编码区中出现的多态性可能通过影响蛋白质结构和/或功能来影响表型。因子H非编码区中出现的多态性可能通过其对复制、转录和/或翻译的影响而间接施加表型影响。因子H基因中的某些多态性可能使个体易感于特定突变，所述突变可与特定的AMD表型原因性相关。备选地，如上文所指出，CFH基因或CFHR5中的多态性可能与相邻基因(包括但不仅限于CFHR-1、2、3或4)的变异相关联。相邻基因的变异可能引起编码蛋白质表达或形式的变化，并对载体产生有害或保护性影响。

A.制备用于分析的样品

在分离自待评估个体的靶核酸中检测多态性。一般分析基因组DNA。对于基因组DNA的测定，事实上任何含有基因组DNA或RNA的生物样品(如有核细胞)都是合适的。例如，在实施例1所述试验中，从收集自病例和对照受试者的外周血白细胞获得基因组DNA(QIAamp DNA BloodMaxi kit，Qiagen，Valencia，CA)。其他合适的样品包括唾液、颊刮除物、视网膜活检、肾或肝或其他器官或组织；皮肤活检；羊水或CVS样品等。备选地，可以测定RNA或cDNA。备选地，如下文讨论地，所述测定可检测变体因子H蛋白质。用于纯化或部分纯化来自患者样品的核酸或蛋白质以用于诊断或其他测定的方法是熟知的。

B.检测靶核酸中的多态性

可以使用本领域熟知的任一方法在个体(如所分析的患者)中确定占据表1A、1B、1C、11、14和15中所述因子H基因和因子H相关5基因多态性位点以及位于因子H或CFHR5基因之中或附近的dbSNP组中其他多态性位点(见上文列表)中的碱基。实例包括：使用等位基因特异性探针；使用等位基因特异性引物；直接序列分析；变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析；单链构象多态性(SSCP)分析以及变性高效液相层析(DHPLC)分析。检测DNA多态性的其他熟知方法包括使用：分子信标技术(参阅如Piatek等，1998；Nat.Biotechnol.16：359-63；Tyagi和Kramer，1996，Nat.Biotechnology 14：303-308；和Tyagi等，1998，Nat.Biotechnol.16：49-53)、侵入物技术(参阅如Neri等，2000，Advances in Nucleic Acid andProtein Analysis 3826：117-125和美国专利号6,706,471)、基于核酸序列的扩增(Nasba)(Compton，1991)、蝎技术(Thelwell等，2000，Nuc.Acids Res，28：3752-3761和Solinas等，2001，″Duplex Scorpion primers in SNPanalysis and FRET applications″Nuc.Acids Res，29：20.)、限制性片段多态性(RFLP)分析等。其他方法对本领域技术人员而言是显而易见的。

例如，用于分析多态性的等位基因特异性探针的设计和使用描述于Saiki等，1986；Dattagupta，EP 235，726，Saiki，WO 89/11548。简言之，如果两种节段代表不同的多态性形式，则将等位基因特异性探针设计成与来自一个个体的靶DNA节段杂交，但不与来自另一个体的相应节段杂交。选择充分严格的杂交条件，以使给定的探针仅与两种等位基因之一显著杂交。一般将等位基因特异性探针设计成与靶DNA的节段杂交，以使多态性位点与探针的中心位置匹配。

用于分析因子H多态性的示例性等位基因特异性探针示于表16A。以使用多态性dbSNP No.rs 1061170为例，等位基因特异性探针的实例包括：5′-TTTCTTCCATAATTTTG-3′[SEQ ID NO：234](参照等位基因探针)和5′-TTTCTTCCATGATTTTG-3′[SEQ ID NO：235](变体等位基因探针)以及5′-TAATCAAAATTATGGAA-3′[SEQ ID NO：232](参照等位基因探针)和5′-TAATCAAAATCATGGAA-3′[SEQ ID NO：233](变体等位基因探针)。在该实例中，第一组等位基因特异性探针与跨越外显子9多态性的因子H基因非编码链杂交。第二组等位基因特异性探针与跨越外显子9多态性的因子H编码链杂交。这些探针长度为17个碱基。可以使用本领域已知方法便利地确定等位基因特异性探针的最佳长度。

等位基因特异性探针经常成对使用，将一对的一个成员设计成与靶序列的参照等位基因杂交，而另一成员设计成与变体等位基因杂交。可以在同一支持物上固定若干探针对，以同时分析同一靶基因序列内的多种多态性。

用于分析多态性的等位基因特异性引物的设计和使用描述于例如WO93/22456和Gibbs，1989。简言之，将等位基因特异性引物设计成与靶DNA上与多态性重叠的位点杂交，仅在引物与特定等位基因形式显示完全的互补性时才根据标准PCR操作引发DNA扩增。单碱基错配防止DNA扩增，不形成可检测的PCR产物。当多态性位点位于引物的3’最末端时该方法效果最好，因为该位置是从引物延长时最不稳定的。

用于分析因子H多态性的示例性等位基因特异性引物示于表16B。以dbSNP No.rs1061170为例，等位基因特异性引物的实例包括：5′-CAAACTTTCTTCCATA-3′[SEQ ID NO：294](参照等位基因引物)和5′-CAAACTTTCTTCCATG-3′[SEQ ID NO：295](变体等位基因引物)以及5′-GGATATAATCAAAATT-3′[SEQ ID NO：292](参照等位基因引物)和5′-GGATATAATCAAAATC-3′[SEQ ID NO：293](变体等位基因引物)。在该实例中，第一组等位基因特异性引物与外显子9中多态性紧邻的因子H基因非编码链杂交，与参照或变体多态性等位基因互补的最后一个核苷酸已标出。将这些引物与其他普通引物一起用于标准PCR操作，所述普通引物在多态性下游的特定位置与因子H基因编码链杂交。第二组等位基因特异性引物与外显子9中多态性位点直接相邻的因子H基因编码链杂交，与参照或变体多态性等位基因互补的最后一个核苷酸已标出。将这些引物与其他普通引物一起用于标准PCR操作，所述普通引物在多态性上游的特定位置与因子H基因非编码链杂交。选择普通引物以使产生的PCR产物的长度可从约100至约300个碱基内变化，或长度在约150至约250个碱基内变化，尽管更小(长度约50至约100个碱基)或更长(长度约300至约500个碱基)的PCR产物也是可能的。引物的长度可在约10至30个碱基内变化，或长度在约15至25个碱基内变化。可以通过观察因子H基因组序列来确定普通引物的序列，所述因子H基因组序列以GenBank登录号AL049744可见。

用于检测多态性的许多方法涉及扩增来自靶样品的DNA或RNA(如使用因子H特异性引物扩增个体因子H基因的节段)并分析扩增的基因。这可以通过标准聚合酶链式反应(PCR&RT-PCR)操作或本领域已知的其他方法实现。扩增可以引起因子H等位基因特异性寡核苷酸的产生，其跨越因子H基因中的单核苷酸多态性位点。因子H特异性引物序列和因子H等位基因特异性寡核苷酸可来自因子H基因的编码(外显子)或非编码(启动子、5’非翻译、内含子或3’非翻译)区。

可以通过使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析PCR产生的扩增产物。可以基于溶液中序列的依赖性熔解特性和电泳迁移来鉴定不同的等位基因。参阅Erlich编著，PCR Technology，Principles and Applications forDNA Amplification，第7章(W.H.Freeman和Co，New York，1992)。

可以使用单链构象多态性(SSCP)分析区分靶序列的等位基因。可以基于单链PCR产物的序列及结构依赖性电泳迁移来鉴定不同的等位基因(Orita等，1989)。可以按照标准操作产生扩增的PCR产物，并加热或另外变性以形成单链产物，所述单链产物可以重新折叠或形成部分取决于碱基序列的二级结构。

可以使用变性高效液相层析(DHPLC)分析区分靶序列的等位基因。可以通过单链PCR产物层析迁移的改变，基于碱基差异鉴定不同的等位基因(Frueh和Noyer-Weidner，2003)。可以按照标准操作产生扩增的PCR产物，并加热或另外变性以形成单链产物，所述单链产物可以重新折叠或形成部分取决于碱基序列的二级结构。

可以使用本领域熟知的DNA测序方案实现多态性的直接序列分析。参阅Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2版，CSHP，New York 1989)和Zyskind等，Recombinant DNA LaboratoryManual(Acad.Press，1988)。

多种用于检测生物样品中多态性的其他方法为本领域已知。参阅如Ullman等″Methods for single nucleotide polymorphism detection″美国专利号6,632,606；Shi，2002，″Technologies for individual genotyping：detection of genetic polymorphisms in drug targets and disease genes″AmJ Pharmacogenomics 2：197-205；Kwok等，2003，″Detection of singlenucleotide polymorphisms″Curr Issues Biol.5：43-60)。

通过本公开内容指导，对本领域技术人员而言显而易见的是，可以检测多种多态性和单元型以评估个体发生因子H相关病症的倾向。以下实施例和组合以及本文提供的其他实施例用于说明而非限制。在本发明的一个方面中，确定患者在一个或多个以下因子H基因多态性位点处的等位基因：rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170和rs203674。在一个实施方案中，确定患者在rs529825处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs3766404处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs 1061147处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs 1061170处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，确定rs529825和rs800292中至少一处。在一个实施方案中，确定rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一处。在一个实施方案中，确定rs529825和rs800292中至少一处，确定rs3766404并确定rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一处。在一个实施方案中确定rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674处的等位基因。本文提供上述多态性和多态性组合用于说明，而不是意在以任何方式限制本发明。即，用于实施本发明的其他多态性和单元型基于本公开是显而易见的。

在本发明的相关方面中，确定患者在一个或多个以下因子H基因多态性位点处的等位基因：rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、外显子10A、rs203674、rs375046和外显子22(1210)。在一个实施方案中，确定患者在rs529825处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在内含子2处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs3766404处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs1061147处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs 1061170处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在外显子10A处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs375046处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在外显子22(1210)处的等位基因。在一个实施方案中，确定rs529825和rs800292中至少一个；确定内含子2；确定rs3766404；确定rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；确定外显子10A；确定rs375046并确定外显子22(1210)。在一个实施方案中，确定rs529825、rs800292、内含子2、rs3766404、rs1061170、外显子10A、rs203674、rs375046和外显子22(1210)处的等位基因。在一个实施方案中，确定一个、两个、三个、四个、五个或五个以上下列因子H基因多态性位点：rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs2274700、外显子10A、rs203674、rs375046和外显子22(1210)。提供上述多态性和多态合用于说明，而不是意在以任何方式限制本发明。

如上文所讨论的，因子H基因外显子22中第1210位氨基酸的非同义多态性与AMD强烈相关，因此在因子H的氨基酸位置1210处存在半胱氨酸提供了对个体患AMD或可能发生AMD的强烈指示。值得注意的是，甚至在检测为另外有保护性的等位基因(如Y402)时，1210C仍指示发生AMD或其他补体介导病症的倾向。因此就发生AMD或其他因子H相关疾病的危险而言，患者在外显子22(1210)处的等位基因是非常有参考意义的。

在本发明的相关方面中，确定个体在一个或多个以下CFHR5基因多态性位点处的等位基因：rs9427661(-249T＞C)、rs9427662(-20T＞C)和rs12097550(P46S)。在一个实施方案中，确定患者在rs9427661处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs9427662处的等位基因。在一个实施方案中，确定患者在rs12097550处的等位基因。在一个实施方案中，确定rs9427661和rs9427662中至少一处。在一个实施方案中，确定rs9427661和rs9427662中至少一处，并确定rs12097550。在一个实施方案中，确定rs9427661、rs9427662和rs12097550。提供上述多态性和多态性组合用于说明，而不是意在以任何方式限制本发明。即，用于实施本发明的其他多态性和单元型基于本公开是显而易见的。

C.蛋白质变体的检测

在本发明的一个实施方案中，进行蛋白质测定以表征受试者CFH或CFHR5基因中的多态性。可适用于检测变体CFH、HFL1和CFHR5的方法是众所周知的。这些方法包括分析生物化学法如电泳(包括毛细管电泳和双向电泳)、层析法如高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析、质谱法以及多种免疫学方法如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、western印迹等。

例如，适用于实行本发明的大量已良好建立的免疫结合测定形式是已知的(参阅如Harlow，E.；Lane，D.Antibodies：a laboratory manual.ColdSpring Harbor，N.Y：Cold Spring Harbor Laboratory；1988和Ausubel等，(2004)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork NY。例如，所述测定可以是竞争性或非竞争性的。免疫结合测定(或免疫测定)一般使用“捕捉剂”与分析物特异性结合，并经常固定分析物。在一个实施方案中，捕捉剂为与变体CFH或CFHR5多肽或亚序列特异性结合的部分。可以使用如可检测标记的抗CFH/CFHR5抗体检测结合的蛋白质。在一个实施方案中，至少一种抗体对变体形式具有特异性(例如不与野生型CFH或CFHR5多肽结合)。在一个实施方案中，使用免疫印迹(Western印迹)形式检测变体多肽。

D.AMD患者筛选/诊断

与AMD或AMD特定亚型相关的因子H基因多态性(如表1A、表1B、表1C所示或如本文所述鉴定的)可用于诊断AMD或AMD特定亚型或对其的易感性。与AMD或AMD特定亚型相关的CFHR5基因多态性(如表14和15所示或如本文所述鉴定的)可用于诊断AMD或AMD特定亚型或对其的易感性。这些多态性还可用于筛选MPGNII和其他因子H相关疾病。

鉴定为具有发生AMD高危险的个体可以采取一些步骤降低危险，包括经常进行眼科检查和下文所述本领域已知或将在未来开发的治疗。

如实施例1所述，危险的CFH单元型与触发事件(如感染)的组合看来对于疾病表型是足够的。鉴定为AMD危险的患者可以在早期感染体征时接受进取性治疗(如使用抗生素、抗炎剂、用保护性形式的CFH/CFHR5进行治疗或使用其他CFH活性调节剂治疗)。

若干这些多态性形式(即特定位点存在或不存在多态性)的组合检测(例如表1A、表1B和/或表1C中列出的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或全部因子H基因多态性单独或与表1A-1C中未包括的其他因子H基因多态性组合)可提高准确诊断的可能性。类似地，若干CFHR5基因多态性形式的组合检测(例如表14和15中列出的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或全部CFHR5基因多态性单独或与表1A-1C中未包括的其他CFHR5基因多态性组合)可提高准确诊断的可能性。在一个实施方案中，筛选包括确定是否存在至少一种因子H基因多态性和至少一种CFHR5基因多态性。在一个实施方案中，筛选包括确定是否存在至少2、3或4种因子H基因多态性与至少2、3或4种CFHR5基因多态性的组合。

因子H和CFHR5基因的多态性可用于在AMD患者的家族成员中以及在一般群体中诊断AMD或AMD的特定亚型或其易感性。

在诊断方法中，可以将因子H多态性和/或CFHR5多态性的分析与其他AMD相关基因的多态性分析、AMD蛋白质标志物的检测(参阅如Hageman等，专利申请US20030017501；US20020102581；WO0184149和WO0106262)、其他AMD危险因素(如家族病史)的评估组合，与眼科检查或其他测定和方案组合。

E)鉴定用于药物治疗的患者

因子H基因和CFHR5基因的多态性还可用于鉴定合适的患者，所述患者用于进行AMD候选药物的临床试验。这些试验在治疗或对照群中进行，所述治疗和对照群在因子H基因和/或CFHR5基因多态性位点的指定集合具有相似或相同的多态性谱，或者具有相似或相同的因子H单元型和/或CFHR5单元型。使用在遗传上匹配的群体消除或降低了由于遗传因素造成的治疗结果，使得可以准确地评估潜在药物的效力。

F)筛选用于移植的供体组织

器官(如肝)和组织(如血、肝细胞)的移植日益广泛。在进行这些移植中，期望避免在受者中引入有害形式的因子H或因子H相关蛋白质而提高受者发生AMD的危险。因此，在本发明的一个方面中，测试供体组织以检测因子H或CFHR5基因多态性位点是否存在变异，从而鉴定带危险单元型或其他有害序列的宿主组织。作为补充或备选，可以测试器官和组织中因子H或CFHR蛋白质形式的表达，例如通过使用本文所述的免疫测定。在一个实施方案中，移植的组织为血或血浆(即在输血或血浆置换中给予)。对提供的血进行常规筛选以避免施用危险相关的蛋白质(如CFH的1210C)可避免使受者受害。

G)表型分类

可以基于与特定单元型的相关性鉴定对AMD特定亚型的易感性。因此，筛选可用于确定对具有不同AMD遗传亚型的患者组合适的疗法。

该方法可用于诊断AMD，AMD可细分成表型分类(例如，早期AMD(ARM)、地图样萎缩(GA)和渗出性AMD(CNV))。ARM和GA表型可进一步细分为不同的表型(例如单独的RPE改变、＞10的斑状硬玻璃疣、斑状软玻璃疣、BB(表皮)玻璃疣、色素上皮脱离(PED)、“Cherokee”萎缩、半岛状地图样萎缩和模式地图样萎缩)。这些表型的描述参阅如Bird等，1995，Surv Ophthalmol 39，367-74和Klaver等，2001，InvestOphthalmol Vis Sci 42，2237-41。

H)其他疾病

因子H和CFHR5基因的多态性(如表1A、1B、1C、11、14和15所示)还可测试与涉及旁路补体途径失调的其他疾病(如阿尔茨海默病、多发性硬化、狼疮和哮喘)和病症(如烧伤、移植和中风)的关联，所述途径具有已知但尚未作图的遗传组分。不限于任何特定作用机制地，本文提出变体因子H和/或CFHR5多肽的表达与备选补体途径的失调相关。因子H和/或CFHR5的变体形式可能是涉及备选补体途径缺陷的疾病的原因，或者因子H和/或CFHR5变体形式的存在可以表明备选补体途径中涉及的另一基因具有原因性作用。

因子H基因多态性还可用于疾病的作图和治疗，所述疾病位于染色体1q上，特别是在因子H基因位于的1q32处或附近。这一特定基因座含有大量补体途径相关基因。这些基因中的一个组称为补体活化调节子(RCA)基因簇，含有编码因子H、五种因子H相关基因和凝固因子XIII β亚基的基因。包括C4BPA、C4BPB、C4BPAL2、DAF(CD55)CR1、CR2、CR1L和MCP(CD46)的第二个补体相关基因簇紧邻1q25-31基因座。

VIII.AMD的预防和治疗

可以通过对患者施用变体因子H多肽和/或变体CHFR5多肽的拮抗剂来治疗具有因子H多态性的患者。拮抗剂可包括治疗量的与变体因子H多肽和/或变体CHFR5多肽或者与变体因子H多肽和/或变体CHFR5多肽特异性相互作用并中和其活性的抗体的核苷酸序列互补的RNA。备选地，与因子H多态性和/或CFHR5多态性相关的AMD可以通过对患者施用与危险提高无关的因子H和/或CHFR5形式(例如正常或野生型因子H蛋白质和/或正常或野生型CHFR5多肽)来治疗。在本发明的一种方法中，对患者施用因子H保护性变体形式和/或CHFR5保护性变体形式。

鉴定为具有AMD高危险的受试者中的治疗和预防方法包括但不限于(1)提高中性或保护性形式因子H和/或中性或保护性形式CHFR5的量或表达；(2)降低危险相关形式因子H和/或危险相关形式CHFR5的量或表达；和(3)降低补体旁路途径的活性。这些治疗和预防方法的实例包括(1)施用中性或保护性形式的因子H蛋白质，或治疗活性片段和/或中性，或保护性形式CHFR5或治疗活性片段；(2)另外提高中性和保护性形式因子H的表达；(3)干扰具危险单元型的个体所编码的变体因子H和/或变体CHFR5蛋白质的表达(例如通过施用反义RNA)；(4)降低有害变体形式的量或表达。

治疗剂(如提高或降低野生型或变体因子H的水平或调节其活性的药物和/或提高或降低野生型或变体CFHR5的水平或调节其活性的药物)可以全身(如通过静脉注射或输注)施用或局部(如至眼睛RPE附近以治疗AMD)施用。将药物施用至眼睛的方法是医学领域所熟知的，并可用于施用本文所述的AMD治疗。示例性方法包括眼内注射(如眼球后、视网膜下、玻璃体内和绒毛膜内(intrachoridal))、离子电渗疗法、滴眼剂和眼内植入(如玻璃体内、Tenons下和结膜下)。例如，已经通过玻璃体内注射将抗VEGF抗体引入猕猴(参阅如Gaudreault等，2005，″Preclinicalpharmacokinetics of Ranibizumab(rhuFabV2)after a single intravitrealadministration″Invest Ophthalmol Vis Sci 46：726-33)，并且已经通过玻璃体内植入持续释放片剂在眼中表达生物活性VEGF和bFGF(Wong等，2001，″Intravitreal VEGF and bFGFproduce florid retinalneovascularization and hemorrhage in the rabbit″Curr Eye Res.22：140-7)。重要的是，已经发现因子H通过视网膜色素上皮局部合成(见实施例1)，表明局部施用药物具有治疗益处。

A.施用治疗性因子H多肽

对具有发生AMD(和/或具有早期疾病)的受试者施用中性或保护性形式因子H多肽和/或中性或保护性形式CFHR5多肽可用于改善疾病的进展。

在一种方法中，对患者施用重组因子H多肽。在一个实施方案中，重组因子H由中性单元型序列编码，所述序列可以是全长的(CFH/HF1)、截短的(FHL1)或选择性剪接的形式或其生物活性片段。在另一实施方案中，重组因子H具有全长或截短形式的保护性等位基因的序列或其保护性生物活性片段。用于产生治疗性重组蛋白质的方法是众所周知的，并包括下文所述的方法。治疗性多肽可以全身性(如静脉内或输注)或局部(如直接送至器官或组织，如眼或肝)施用。

因子H和CHFL1蛋白质的一些保护性形式比全长短。例如，可以施用中性或保护性形式因子H的片段，以治疗或预防AMD或MPGNII。在具体的实施方案中，施用在具有保护性表型个体中表达的CFH剪接变体所编码的多肽。可以通过在保护性或中性单元型纯合个体中筛选CFH相关RNA的表达来鉴定这些蛋白质。

在具体的实施方案中，保护性蛋白质具有对应于CFH基因序列中一个或多个外显子的序列。例如，保护性蛋白质可以具有全长或截短CFH蛋白质的序列，只是缺失了1、2、3或更多个外显子(可以是连续或不连续的)所编码的氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明的保护性因子H蛋白质具有与SEQ ID NO：2基本相同的氨基酸序列，只是第402位残基不是组氨酸，并且第1210位残基不是半胱氨酸。在一个实施方案中，第62位残基不是缬氨酸。优选地，第62位残基为异亮氨酸。优选地，第62位残基为异亮氨酸，第402位残基为酪氨酸，并且第1210位残基为精氨酸。优选地，保护性因子H蛋白质与SEQ ID NO：2或其片段具有95％的氨基酸同一性；有时与SEQ IDNO：2的参照因子H多肽具有至少95％的氨基酸同一性；有时为至少98％的氨基酸同一性，有时为至少99％的同一性。示例性人因子H保护性变体的多肽序列[SEQ ID NO：5]示于图10。该保护性变体因子H多肽第62位氨基酸为异亮氨酸，第402位氨基酸为酪氨酸(以粗体标出)。示例性HFL1(人因子H截短形式)保护性变体的多肽序列[SEQ ID NO：6]示于图11。该保护性变体截短的因子H多肽第62位氨基酸为异亮氨酸，第402位氨基酸为酪氨酸(以粗体标出)。

在一个实施方案中，本发明的保护性因子H蛋白质具有与SEQ ID NO：4(FHL1)基本相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，第62位残基不是缬氨酸。优选地，第62位残基为异亮氨酸。优选地，保护性因子H蛋白质与SEQ ID NO：4或其片段具有95％的氨基酸同一性；有时与SEQ IDNO：4的参照因子H多肽具有至少95％的氨基酸同一性；有时为至少98％的氨基酸同一性，有时为至少99％的同一性。

在一些实施方案中，保护性因子H蛋白质具有参照因子H多肽的一种或多种活性。在一个实施方案中，所述活性为与肝素结合。在一个实施方案中，所述活性为与CRP结合。在一个实施方案中，所述活性为与C3b结合。在一个实施方案中，所述活性为与内皮细胞表面结合。在一个实施方案中，所述活性为C3b辅因子活性。在一个实施方案中，保护性因子H蛋白质具有高于蛋白质SEQ ID NO：2的正常功能的活性。在一个实施方案中保护性因子H蛋白质具有高于蛋白质SEQ ID NO：4的正常功能的活性。

用于因子H活性的测定是众所周知的，并描述于科学文献中。为了说明而非限制，将简要描述测定实施例。

保护性蛋白质(CFH变体)与C3b或CRP结合

如上文所述，可以使用Biacore 3000系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)通过表面共振来分析C3b与CFH蛋白质的相互作用(Manuelian等，2003，Mutations in factor H reduce binding affinity to C3b and heparinand surface attachment to endothelial cells in hemolytic uremic syndrome.J Clin Invest 111，1181-90)。简言之，使用标准氨偶联将C3b(CalBiochem，Inc)与传感器芯片(Carboxylated Dextran Chip CM5，Biacore AB，Uppsala，Sweden)的流动细胞偶联。活化两个细胞并将C3b(50μg/ml，用10mM乙酸缓冲液，pH5.0透析)注射进一个流动细胞，直至达到4000共振单位的相应偶联水平。使用盐酸乙醇胺将未反应的基团失活。通过注射无C3b的偶联缓冲液将另一细胞制备为参照细胞。在每次结合测定前，通过两次注射10mM乙酸盐缓冲液中的2M NaCl，pH4.6和电泳缓冲液(PBS，pH7.4)，彻底洗涤流动细胞。在25℃下，以5μl/分钟的流动速率将因子H蛋白质注射进与C3b偶联的流动细胞或对照细胞。通过测量共振单位随时间的变化来定量因子H与C3b的结合，如Manuelian等，2003，同上所述。

可以在传感器芯片的流动细胞中用CRP替换C3b，以相同的方式通过表面共振分析CRP与CHF蛋白质之间的相互作用。

与内皮细胞表面的结合

通过HUVEC和FACS分析的免疫荧光染色来测定CHF蛋白质与内皮细胞表面的结合。在测定前，将HUVEC细胞保持在无血清的DMEM(BioWhittaker)中24小时。用DPBS/EDTA使细胞从表面脱离并用DPBS洗涤两次；将5×10⁵个细胞转移至塑料管，用1％BSA/DPBS封闭非特异性结合位点15分钟，之后与纯化的因子H等位基因变体(5μg)一起孵育。对照在无因子H同种型时进行。结合因子H之后，用DPBS彻底洗涤细胞。使用多克隆山羊抗人FH抗血清作为一抗(CalBiochem)(1∶100稀释)，在4℃孵育细胞15分钟。使用在封闭液中1∶100稀释的缀合Alexa-fluor488的山羊抗血清作为二抗。通过流式细胞术检查细胞(FACScalibur，Becton-Dickinson Immunocytometry，Mountain View，California，美国)。一般计数10000个事件。

流体相中的辅因子活性

就流体相辅因子测定而言，在30μl总体积中使用C3b生物素(100ng/反应)、因子I(200ng/反应)和100ng纯化的因子H。在还原条件下通过SDS-PAGE分离在加入因子I前后收集的样品，并通过Western印迹分析、通过Strepavidin-POD-缀合(1∶10000)检测并定量C3b降解产物。按照生产商的说明书，使用生物素标记试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)将C3b(40μg)(CalBiochem)生物素化。简言之，在25℃下，用D-生物素-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯标记30μgC3b(CalBiochem)2小时。使用以PBS平衡的PD10柱(Amersham Biosciences)，通过凝胶过滤除去过量的生物素。还参阅Sanchez-Corral等，2002，Am J.Hum.Genet.71：1285-95。

肝素结合测定

使用肝素亲和层析在高效液相层析(HPLC)系统中分析纯化的CFH蛋白质(CFH402Y和CFH402H)与肝素的结合。将10μgCFH蛋白质稀释在1/2×PBS中，并以0.5ml/分钟的流动速率应用于肝素-琼脂糖亲和柱(HiTrap，Amersham Biosciences)。用1/2×PBS充分洗柱，并用75至500mM NaCl范围的线性盐梯度，以10ml总体积和0.5ml/分钟的流动速率洗脱结合的CFH蛋白质。通过SDS-PAGE和Western印迹分析测定洗脱的级分。同种型在不同级分中洗脱表明CFH蛋白质中特定的氨基酸变异可调节该蛋白质与肝素的结合。还参阅如Pangburn等，1991，Localization of the heparin-binding site on complement Factor H，J BiolChem.266：16847-53。

施用CFHR5

在另一方法中，对患者施用重组CFHR5多肽。在一个实施方案中，重组CFHR5具有中性型序列或其生物活性片段。在另一实施方案中，重组CFHR5具有保护性等位基因或其保护性生物活性片段的序列。用于产生治疗性重组蛋白质的方法是众所周知的，并包括下文所述方法。治疗性多肽可以全身性(如静脉内或通过输注)或局部(如直接送至器官或组织，例如眼或肝)。

含有CFH或CFHR5多肽的治疗组合物

本发明提供因子H多肽的治疗性制品，所述多肽可以是野生型或变体(如中性或保护性变体)，并且可以是全长形式、截短形式或变体因子H多肽的生物活性片段。如本文所述，可以通过鉴定具有保护性单元型的个体并确定该个体基因组中编码的因子H氨基酸序列来鉴定保护性因子H蛋白质(及其编码基因)，其中保护性因子H蛋白质由具有保护性单元型的等位基因编码。生物活性片段可包括全长因子H多肽的任何部分，其赋予变体蛋白质生物功能。在一些情况下，保护性单元型将与短于全长形式的因子H(即除了FHL-1以外)的表达相关，所述表达例如是由于在基因中存在提前密码子。

还可以通过测试蛋白质在AMD生物标志表达上的作用来鉴定治疗活性片段。示例性AMD生物标志物包括补体途径组分(例如因子I、因子H、C1r、C3、C3a)、C反应蛋白质、触珠蛋白质、载脂蛋白质E、免疫球蛋白质重链或轻链、α1抗胰蛋白质酶、α2巨球蛋白质、运甲状腺素蛋白质、肌酸酐和名为″Biomarkers Associated With Age-Related MacularDegeneration″的共同未决临时申请No.60/715,503中所述的其他生物标志。

本发明提供CFHR5多肽的治疗性制品，所述多肽可以是野生型或变体(如中性或保护性变体)，并且可以是全长形式或变体CFHR5多肽的生物活性片段。如本文所述，可以通过鉴定具有保护性单元型的个体并确定该个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列来鉴定保护性CFHR5蛋白质(及其编码基因)，其中保护性CFHR5蛋白质由具有保护性单元型的等位基因编码。生物活性片段可包括全长CFHR5多肽的任何部分，其赋予变体蛋白质生物功能。治疗活性片段还可以通过测试蛋白质在上文所述因子H的AMD生物标志表达上的作用来鉴定。

因子H和CFHR5的一些形式可从基因分型的供体血中分离，从来自基因分型的眼供体的培养或转化的RPE细胞中分离或者从表达内源因子H的细胞系(如神经胶质细胞或肝细胞)中分离。备选地，治疗性蛋白质可以重组产生(如在培养的细菌或真核细胞中产生)并使用本领域熟知并描述于本文的方法进行纯化。如上文所指出，已经重组表达了因子H和CFHR5的一些形式用于研究目的。然而此类研究制品不适于治疗用途。本发明提供适于对患者施用的重组多肽，包括根据Good ManufacturingPractice(GMP)要求产生并测试的多肽。例如，送交FDA批准的重组多肽必须对效力和同一性进行测试、必须是无菌、不含外来物质，，并且产品中的所有成分(即防腐剂、稀释剂、佐剂等)必须符合纯度、质量标准并对患者无害。

本发明提供包含因子H多肽或CFHR5多肽以及可药用赋形剂或载体的组合物。术语“可药用赋形剂或载体”指用于制备所需化合物剂量形式的介质。可药用赋形剂或载体可包括一种或多种溶剂、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增厚或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington′s Pharmaceutical Sciences，15版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，PA，1975)和Handbook ofPharmaceutical Excipients，3版，A.H.Kibbe编著(AmericanPharmaceutical Assoc.2000)公开了药物组合物配制中使用的多种载体及其已知的制备技术。在一个实施方案中，可药用赋形剂在施用至眼(例如通过眼内注射)时对哺乳动物(如人类患者)无害。就眼内给药而言，例如但不仅限于，治疗剂可以在平衡盐溶液(BSS)或平衡盐溶液Plus(BSSPlus)(Alcon Laboratories，Fort Worth，Texas，美国)中施用。在相关方面中，本发明提供含有可治疗用因子H蛋白质(任选地为冻干制品)的无菌容器，如小瓶。治疗性因子H蛋白质或CFHR5多肽可以如上文所述重组制备。备选地，因子H蛋白质或CFHR5多肽可以从培养的RPE细胞(如原代培养物)或内源表达因子H或CFHR5的其他细胞中分离。

可以确定待施用于个体的中性或保护性形式的因子H或截短因子H或其生物活性片段或者中性或保护性形式的CFHR5或其生物活性片段的量。因子H的正常血浆浓度在116至562μg/ml之间变化，因子H在血浆中的半衰期约为6.5天(最近的综述参阅Esparza-Gordillo等，2004″Geneticand environmental factors influencing the human tactor H plasma levels″Immunogenetics 56：77-82)。在一个实施方案中，可以对个体施用外源因子H，所施用量要足以实现与健康个体中因子H血浆浓度相似的水平，即其量足以实现50至600mg/ml的血浆水平，例如100至560mg/ml。对个体(如160磅的受试者)施用的因子H的量可以为，例如但不仅限于，每次给药10毫克至5000毫克，每次给药50毫克至2000毫克，每次给药100毫克至1500毫克，每次给药200毫克至1000毫克或每次给药250毫克至750毫克。对个体施用因子H的频率可以为，例如但不仅限于，每天两次、每天一次、每周两次、每周一次、两周一次、每月一次、两月一次、六个月一次或每年一次。对个体施用因子H的量和频率可以通过监测疗程由医生方便地确定。

B)基因治疗方法

在另一方法中，因子H蛋白质或CFHR5多肽通过由外源多核苷酸编码的蛋白质的体内表达(即通过基因治疗)施用。在一个实例中，基因治疗涉及向细胞引入载体，所述载体表达因子H多肽或生物活性片段或CFHR5多肽或生物活性片段。

载体可以是病毒或非病毒。可获得大量来自动物病毒的载体，包括来自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、痘病毒、α病毒、弹状病毒和乳头瘤病毒。通常病毒被减毒至不再复制(参阅例如Kay等2001，NatureMedicine 7：33-40)

编码因子H多肽或CFHR5多肽的核酸一般与调节元件例如启动子和增强子连接，所述调节元件驱动DNA在个体靶细胞中的转录。启动子可驱动因子H基因或CFHR5基因在所有细胞类型中的表达。备选地，启动子可仅在特定细胞类型中驱动因子H基因或CFHR5基因的表达，例如在视网膜或肾细胞中。与编码因子H多肽或CFHR5多肽的核酸有效连接的调节元件通常被克隆进载体中。

如本领域技术人员应当知道的，基因治疗载体含有用于转录和翻译所插入的编码序列的必需元件(并可包括例如启动子、增强子、其他调节元件)。启动子可以是组成型或诱导型的。启动子可被选择为在靶组织中靶向优选的基因表达，例如RPE(近期综述参阅Sutanto等，2005，″Development and evaluation of the specificity of a cathepsin D proximalpromoter in the eye″Curr Eye Res.30：53-61；Zhang等，2004，″Concurrent enhancement of transcriptional activity and specificity of aretinal pigment epithelial cell-preferential promoter″Mol Vis.10：208-14；Esumi等，2004，″Analysis of the VMD2 promoter and implication of E-boxbinding factors in its regulation″J Biol Chem 279：19064-73；Camacho-Hubner等，2000，″The Fugu rubripes tyrosinase gene promotertargets transgene expression to pigment cells in the mouse″Genesis.28：99-105及其中的参考文献)。

合适的病毒载体包括DNA病毒载体(例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、慢病毒载体和痘苗病毒载体)和RNA病毒载体(如逆转录病毒载体)。在一个实施方案中，使用腺伴随病毒(AAV)载体。近期综述参阅Auricchio等，2005，″Adeno-associated viral vectors for retinal genetransfer and treatment of retinal diseases″Curr Gene Ther.5：339-48；Martin等，2004，Gene therapy for optic nerve disease，Eye 18：1049-55；Ali，2004，″Prospects for gene therapy″Novartis Found Symp.255：165-72；Hennig等，2004，″AAV-mediated intravitreal gene therapy reduceslysosomal storage in the retinal pigmented epithelium and improves retinalfunction in adult MPS VII mice″Mol Ther.10：106-16；Smith等，2003，″AAV-Mediated gene transfer slows photoreceptor loss in the RCS ratmodel of retinitis pigmentosa″Mol Ther.8：188-95；Broderick等，2005，″Local administration of an adeno-associated viral vector expressingIL-10 reduces monocyte infiltration and subsequent photoreceptor damageduring experimental autoimmune uveitis″Mol Ther.12：369-73；Cheng等，2005，″Efficient gene transfer to retinal pigment epithelium cells withlong-term expression.Retina 25：193-201；Rex等，″Adenovirus-mediateddelivery of catalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboringphotoreceptors from photo-oxidative stress.Hum Gene Ther.15：960-7；以及本文引用的参考文献)。

基因治疗载体必须根据Good Manufacturing Practice(GMP)的要求制造，使得产品适用于施用给患者。本发明提供适用于施用给患者的基因治疗载体，包括根据GMP要求制造和测试的基因治疗载体。进行FDA批准的基因治疗载体必须测试过效力和同一性、是无菌的、不含外来物质，并且产品中的所有成分(即防腐剂、稀释剂、佐剂等)必须符合纯度、质量标准，并对患者无害。例如，核酸制品要证明不含支原体。参阅例如Islam等，1997，An academic centre for gene therapy research and clinical grademanufacturing capability，Ann Med 29，579-583。

用于施用基因治疗载体的方法是已知的。在一个实施方案中，因子H或CFHR5表达载体全身性引入(例如静脉内或通过输注)，在一个实施方案中，因子H或CFHR5表达载体局部引入(即直接到具体的组织或器官，例如肝)。在一个优选的实施方案中，因子H或CFHR5表达载体直接引入眼(例如通过眼注射)。最近的综述参阅例如Dinculescu等，2005，″Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease″HumGene Ther.16：649-63；Rex等，2004，″Adenovirus-mediated delivery ofcatalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboringphotoreceptors from photo-oxidative stress″Hum Gene Ther.15：960-7；Bennett，2004，″Gene therapy for Leber congenital amaurosis″NovartisFound Symp.255：195-202；Hauswirth等，″Range of retinal diseasespotentially treatable by AAV-vectored gene therapy″Novartis FoundSymp.255：179-188，及其中所列参考文献)。

因此在一个方面，本发明提供包含基因治疗载体(其编码因子H蛋白质或CFHR5多肽)，任选地包含病毒载体的制品，其中基因治疗载体适用于施用给人受试者，并处于适用于施用给人受试者的赋形剂中(例如使用GLP技术产生的)。任选地，包含启动子的基因治疗载体在视网膜色素上皮细胞中优先的或特异地表达。

也可使用非病毒方法引入因子H或CFHR5序列，例如包被在生物可降解聚合物中(例如聚乳酸(plolyactic acid，PLA)；聚乙醇酸(polyglycolicacid，PGA)和共聚物(PLGA))中(最近综述参阅例如Bejjani等，2005，″Nanoparticles for gene delivery to retinal pigment epithelial cells″MolVis.11：124-32；Mannermaa等，2005，″Long-lasting secretion of transgeneproduct from differentiated and filter-grown retinal pigment epithelialcells after nonviral gene transfer″Curr Eye Res.2005 30：345-53，及其中引用的参考文献)。备选地，编码因子H多肽或CFHR5多肽的核酸可包装进脂质体内，或核酸可不使用载体不包装地递送给个体。

C)DNA修复

在另一方法中，处于发生AMD危险下(和/或患有早期疾病)的受试者可通过DNA修复将危险形式的因子H或CFHR5用中性或保护性形式的因子H或CFHR5替换。在一个实施方案中，可将形成三联体的寡核苷酸(其被设计用于特异性结合与危险单元型相关的因子H或CFHR5基因中的多态位点)通过病毒或非病毒方法施用给个体。形成三联体的寡核苷酸以序列特异性方式与双链DNA的大沟结合并引起DNA修复，导致基因组的靶向修饰(最近综述参阅Kuan等，2004，″Targeted gene modificationusing triplex-forming oligonucleotides″Methods Mol Biol.262：173-94)。结合跨越与危险单元型相关的多态性序列的形成三联体的寡核苷酸引起DNA修复，导致来自危险等位基因的序列成为中性或保护性等位基因，并可改善疾病的发生或进展。

D)引入表达中性或保护性形式的因子H蛋白质或CFHR5多肽的细胞、组织或器官

在另一方法中，对患者施用表达中性或保护性形式的因子H或因子H相关蛋白质(例如CFHR5)的细胞。在一个实施方案中，受者对危险单元型是杂合的，或更经常地是纯合的。例如，已经使用肝细胞移植作为对全器官移植的备选方案以支持许多形式的肝功能不全(参阅例如Ohashi等，Hepatocyte transplantation：clinical and experimental application，J MolMed.2001 79：617-30)。根据该方法，向需要治疗的患者施用(例如输注)肝细胞或其他表达CFH或CFHR5的细胞。这些细胞移动至肝或其他器官，并产生治疗性蛋白质。也参阅例如Alexandrova等，2005，″Large-scaleisolation of human hepatocytes for therapeutic application″CellTransplant.14(10)：845-53；Cheong等，2004，″Attempted treatment offactor H deficiency by liver transplantation″Pediatr Nephrol.19：454-8；Ohashi等，2001，″Hepatocyte transplantation：clinical and experimentalapplication″J Mol Med.79：617-30；Serralta等，2005，″Influence ofpreservation solution on the isolation and culture of human hepatocytesfrom liver grafts″Cell Transplant.14(10)：837-43；Yokoyama等，2006，″Invivo engineering of metabolically active hepatic tissues in aneovascularized subcutaneous cavity″Am.J.Transplant.6(l)：50-9；Dhawan等，2005，″Hepatocyte transplantation for metabolic disorders，experience at King′s College hospital and review of literature.″ActaGrastroenterol.Belg.68(4)：457-60；Bruns等，2005，″Injectable liver：anovel approach using fibrin gel as a matrix for culture and intrahepatictransplantation of hepatocytes″Tissue Eng.11(11-12)：1718-26。其他可使用的细胞类型包括(用于说明而非限制)肾和胰细胞。在一个实施方案中，将所施用的细胞改造为表达重组形式的蛋白质。

在另一相关方法中，使用治疗性的器官移植。大部分身体系统性因子H由肝产生，使得肝组织移植成为优选的方法。参阅Gerber等，2003，″Successful(？)therapy of hemolytic-uremic syndrome with factor Habnormality″Pediatr Nephrol.18：952-5。

在另一方法中，通过注射进眼(例如玻璃体内)或通过被囊细胞将保护性形式的CFH蛋白质递送至眼背部。作为实例的Neurotech′s被囊细胞技术(Neurotech′s Encapsulated Cell Technology(ECT))是允许将治疗性因子持续、长期地递送至眼背部的独特技术。参阅http://www.neurotech.fr。ECT移植物由被遗传修饰以产生特定治疗性蛋白质的细胞组成，所述细胞包被在半通透性空心纤维膜中。所述细胞持续产生治疗性蛋白质，所述治疗性蛋白质扩散出移植物并进入眼中(Bush等2004)。通过ECT装置递送至人眼的CNTF最近显示是完全成功的，并在I期临床试验所招募的10名患者中与最少的并发症相关(Sieving等2005)。也参阅Song等，2003；Tao2002.和Hammang等，美国专利号6,649,184。在本发明的一个实施方案中，在细胞中表达保护性形式的因子H(包括所谓的中性形式)并将其以被囊形式施用。在一个实施方案中，使用的细胞是可得自美国典型培养物保藏中心P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108的NTC-201人RPE系(ATCC#CRL-2302)。

E)降低因子H或CFHR5危险变体水平的治疗

因子H或CFHR5的正常或保护性功能的丧失可与AMD相关。显示与AMD最强烈相关并导致变体因子H多肽或CFHR5多肽的因子H和CFHR5基因中的非同义多态性(例如表1A、1B、1C、11、14和15中所示的那些)可能在AMD中具有原因性作用。例如，变体因子H或CFHR5可起到妨碍正常因子H或CFHR5功能的所谓的“显性失活”突变体的作用。

降低眼中或全身的危险形式因子H或CFHR5水平的任何方法可用于治疗，包括例如抑制因子H或CFHR5基因的转录、抑制因子H或CFHR5RNA的翻译、提高中性或保护性形式因子H，或截短的因子H或其生物活性片段的量或活性、提高中性或保护性形式CFHR5多肽或其生物活性片段的量或活性，或降低因子H蛋白质或CHFR5多肽的量或活性(例如通过血浆去除术、抗体指导的血浆去除术，或与因子H或CFHR5结合部分(例如肝素或变体特异性抗体)复合)。在一些实施方案中，相对于其他组织，优选在眼中(例如RPE)降低了因子H或CFHR5的水平。为了说明而非限制，下文概述了若干方法。

在一种方法中，施用肝素治疗鉴定为处于AMD危险下的受试者。肝素和肝素衍生物(包括类肝素)可具有用于治疗多种补体相关疾病的有希望的治疗性特征，所述疾病包括MPGNII(Floege等，1993；Girardi，2005；Diamond and Karnovsky，1986；Striker，1999；Rops等，2004)。考虑到本文公开的AMD和MPGNII之间的相关性，肝素和肝素衍生物(包括肝素类似物)可能对治疗AMD有效。在临床试验中，患有慢性增生性肾小球肾炎的患者在一年中接受每天皮下注射肝素，Cade和同事报告了改善的肌酸酐清除率和血管小球细胞过多的退化(Cade等，1971)。肝素和低分子量肝素(Enoxaparin)均显示通过阻断补体级联系统的旁路途径和经典途径预防小鼠中抗磷脂抗体综合征的进展(Girardi等，2004)。肝素的抗补体活性包括通过旁路途径阻断扩增转变酶C3bBb的生成；流体相肝素通过抑制C3b与因子B和因子D的相互作用阻止C3bBb的生成(Weiler等，1976)。

F)施用抑制性核酸

反义核酸——反义核酸如纯化的、与编码变体因子H多肽的RNA互补的反义RNA可用于抑制危险单元型相关因子H基因的表达。最近的综述参阅例如Gomes等，2005，″Intraocular delivery of oligonucleotides″Curr Pharm Biotechnol.6：7-15；和Henry等，2004，″Setting sights on thetreatment of ocular angiogenesis using antisense oligonucleotides″TrendsPharmacol Sci 25：523-7及其中引用的参考文献。

RNA干扰——双链RNA(dsRNA)抑制方法也可用于抑制HF1的表达。用于这类方法的RNA被设计为dsRNA的至少一个区与HF1基因的一个区基本相同；在一些实例中，所述区与HF1基因100％相同。就用在哺乳动物中而言，dsRNA长度一般约19-30个核苷酸(即使用短干扰RNA(siRNA或RNAi))，最常见长度为约21个核苷酸。适用于进行dsRNA和siRNA的方法和组合物讨论于例如PCT公开WO 98/53083；WO99/32619；WO 99/53050；WO 00/44914；WO 01/36646；WO 01/75164；WO02/44321和美国专利号6,107,094中。siRNA可在体外合成并施用给患者。备选地，RNAi策略可成功地与基于载体的方法组合，以实现在转染的细胞中从DNA模板合成小RNA(参阅例如Sui等，2002，″A DNAvector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammaliancells″Proc Natl Acad Sci美国99：5515-20；和Kasahara and Aoki，2005，″Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth musclecells and cardiomyocytes″Methods Mol Med.112：155-72及其中所引用的参考文献)。

核酶——核酶是能够催化RNA特异剪接的酶性RNA分子。核酶作用的机制涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后是核内切割。能够特异并有效地催化人因子H编码序列的内核分离的经改造的锤头状基序核酶分子属于本发明的范围内。任何可能的RNA靶标中特异的核酶切割位点通过在靶分子中扫描核酶切割位点被最初鉴定，所述切割位点包括例如GUA、GUU和GUC的序列。一旦被鉴定后，对应于含有切割位点的靶基因区的15和20个核糖核苷酸之间的短RNA序列可评价其二级结构特征，该特征可能使得寡核苷酸不能被切割。候选靶标的适合性也可通过使用核糖核酸酶保护测定法检测与互补的寡核苷酸杂交的程度来评价。核酶的性质为本领域公知；一般描述参阅Cech的专利(US6180399；US5869254；US6025167；US5854038；US5591610；US5667969；US5354855；US5093246；US5180818；US5116742；  US5037746和US4987071)。核酶和其他抑制性核酸可被设计为优先抑制具危险单元型相关序列的基因的表达。因此，识别跨越多态性的序列并在邻近GUA处切割的核酶识别危险形式，但是不识别中性或保护性形式，允许选择性的切割(Dawson等，2000，″Hammerhead ribozymes selectively suppress mutanttype I collagen mRNA in osteogenesis imperfecta fibroblasts″NucleicAcids Res.28：4013-20；Blalock等，2004″Hammerhead ribozyme targetingconnective tissue growth factor mRNA blocks transforming growthfactor-beta mediated cell proliferation″Exp Eye Res.78：1127-36)。

形成三联体的寡核苷酸——形成三联体的寡核苷酸以序列特异的方式与双链DNA的大沟结合并引起DNA修复，导致基因组的靶向修饰(最近的综述参阅Kuan等，2004，″Targeted gene modification usingtriplex-forming oligonucleotides″Methods Mol Biol.262：173-94)。寡核苷酸可被设计为与在危险单元型相关因子H基因中的多态性位点特异地结合。与跨越危险单元型相关多态性的序列结合的形成三联体的寡核苷酸引起DNA修复，导致将序列从危险等位基因修饰到中性或保护性等位基因。

如上所述的类似反义核酸、RNA干扰、核酶和形成三联体的寡核苷酸方法可用于降低眼中危险形式的CFHR5水平，或全身性地用于治疗AMD。

应当理解抑制性核酸可作为药物组合物或使用基因治疗方法而施用。

G)抗体治疗

在一个方面，将与变体因子H多肽特异性相互作用并中和其活性的抗HF1抗体施用给患有AMD或处于AMD危险下的个体。在一个实施方案中，抗体识别野生型和变体因子H蛋白质。在一个实施方案中，抗体识别变体因子H蛋白质，但不识别野生型因子H蛋白质。在另一个方面，将与变体CFHR5多肽特异性相互作用并中和其活性的抗CFHR5抗体施用给患有AMD或处于AMD危险下的个体。在一个实施方案中，抗体识别野生型和突变体CFHR5蛋白质。在一个实施方案中，抗体识别变体CFHR5蛋白质，但不识别野生型。抗体可全身或局部施用(参阅例如Gaudreault等，2005，″Preclinical pharmacokinetics of Ranibizumab(rhuFabV2)aftera single intravitreal administration″Invest Ophthalmol Vis Sci.46：726-33)。用于制备抗HF1和抗CFHR5抗体的方法为本领域已知，并包括下文所述方法。在相关的方面，将与变体因子H多肽和/或CFHR5多肽优先相互作用并降低其活性的药物施用给患有AMD或处于AMD危险下的个体。

H)旁路途径的调节物

在一个方面，本发明提供了治疗AMD的方法，所述方法通过将指导调节补体级联系统旁路途径(AP)的药物(例如天然蛋白质、重组蛋白质、抗体或小分子)局部施用至眼或以全身性水平施用。在一个实施方案中，治疗包括施用直接调节AP的药物。在一个实施方案中，治疗包括施用调节AP触发的药物(例如微生物)。在一个实施方案中，治疗包括施用调节AP下游途径的药物。调节AP的示范性药物为本领域已知，并包括但不仅限于DFP、PR226、BCX-1470、FUT-175、sMCP、PS-oligo、Compstatin、Fucan和GCRF(参阅例如Makrides，1998，″Therapeutic inhibition of thecomplement system″Pharmacol Rev.50：59-87；Holland等，2004，″Synthetic small molecule complement inhibitors″Curr Opin InvestigDrugs 5：1163-73；Holers等，2004，″The alternative pathway of complementin disease：opportunities for therapeutic targeting″Mol Immunol.41：147-52)。AP调节物可全身施用，或通过眼球内注射或其他已知方法将化合物递送至眼。

I)药物筛选/危险变体因子H或变体CFHR5的拮抗剂

本发明提供了筛选有效治疗AMD的药物的方法，所述方法通过将变体蛋白质、表达因子H或CFHR5变体的宿主细胞或转基因动物接触并监测变体的结合、表达、加工或活性。在一个实施方案中，因子H变体在氨基酸第62位具有缬氨酸和/或氨基酸第402位具有组氨酸和/或氨基酸第1210位具有半胱氨酸。在一个实施方案中，CFHR5变体在氨基酸第46位具有丝氨酸。

变体因子H多肽(例如与危险单元型相关的变体)的拮抗剂可用于治疗AMD。拮抗剂可抑制变体因子H的表达、抑制活性或降低RNA或蛋白质的稳定性。拮抗剂可通过产生并筛选巨大的组合文库获得，所述文库可以以多种类型化合物的分段的和高通量的模式制备。这类化合物包括肽、多肽、β转角拟态、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯二氮杂、寡聚N-取代的甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamate)等。化合物的巨大的组合文库可通过本领域已知方法构建。参阅例如WO 95/12608；WO 93/06121；WO 94/08051；WO 95/35503；WO 95/30642和WO 91/18980。最初从化合物文库中筛选对变体因子H多肽的特异性结合。具有体外结合活性的化合物也可测定它们干涉变体因子H多肽生物活性的能力，例如与C3b或肝素的结合。拮抗剂活性可在基于细胞的体系中或在转基因动物模型中测定，其中被表达外源变体因子H多肽。

变体CFHR5多肽的拮抗剂(例如与危险单元型相关的变体)可用于治疗AMD，并可如上文针对变体因子H拮抗剂的所述获得。

J)患者特异性治疗

可以基于因子H基因或CFHR5基因中某些多态性的存在对具有不同AMD遗传亚型的患者组设计专门的治疗，所述多态性在AMD中发挥原因性作用，并且已经解释了这些多态性对变体因子H多肽或CFHR5多肽的表达水平和/或生物活性的影响。例如，如果因子H或CFHR5中的多态性通过提高变体因子H多肽或CFHR5多肽的表达水平和/或生物活性而在动物模型中引起AMD，则与该因子H或CFHR5多态性相关的AMD可通过对患者施用该变体因子H多肽或变体CFHR5多肽的拮抗剂进行治疗。

K)使用AMD生物标志评估疗效

如上文指出的，还可以通过测试蛋白质对AMD生物标志表达的影响来确定CFH或CFHR蛋白质特定片段的疗效。示例性AMD生物标志包括上文所述的。这些AMD相关蛋白质(生物标志)以不同于健康个体的水平(提高或降低)存在于AMD个体中。本发明提供评估治疗AMD功效并监控AMD进展的方法，所述方法通过确定接受该疾病治疗的患AMD个体中生物标志的水平，并将该生物标志水平与生物标志先前确定的水平或参照水平进行比较。如共同未决的临时申请No.60/715,503所述，可以通过任何合适的方法确定生物标志的水平，例如本领域已知的常规技术，例如但不仅限于基于分离的方法(如凝胶电泳)、免疫测定法(如基于抗体的检测)和基于功能的方法(如酶或结合活性)。在一个实施方案中，评估个体中治疗AMD功效的方法包括获得来自该个体的样品以及通过以双向差异凝胶电泳(DIGE)分离蛋白质来确定生物标志水平。

VIII.因子H和CFHR5核酸

A)引物和探针

本发明提供毗邻或跨越多态性位点的核酸。所述核酸可作为探针或引物(包括侵入物、分子信标和其他荧光共振能量转移(FRET)型探针)用于检测因子H多态性。在一个实施方案中，探针或引物识别内含子2中的插入，但不识别野生型序列。示例性核酸包括跨越表1A、1B、1C、11、14和15列出的至少一个多态性位点的序列，其中多态性位置为该位置的备选碱基所占据。该位置中在对照群中更常见的碱基称为正常或野生型序列，而该位置中在对照群体中较不常见的备选碱基称为变体序列。该核酸还包含跨越因子H和CFHR5基因中其他已知多态性(例如上文表A和B中鉴定的多态性)的序列。

B)因子H和CFHR5多肽的表达载体以及重组产生

本发明提供包含编码因子H多肽的核酸的载体。因子H多肽可以是野生型或变体(如保护性变体)，并且可以是全长形式(如HF1)或截短形式。核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链的。

一些核酸编码全长的、变体形式的因子H多肽。变体因子H多肽可以在密码子编码的氨基酸上不同于正常或野生型因子H，所述密码子包括因子H基因中任一已知非同义多态性位置。在一个实施方案中，变体因子H多肽可以在密码子编码的氨基酸上不同于正常或野生型因子H，所述密码子包括表1A、表1B和/或表1C中所示非同义多态性位置中的一个，该位置由表1A、表1B和/或表1C中所示氨基酸占据。应该理解，可以产生这样的变体因子H基因：其编码变体因子H多肽，该多肽在因子H基因中多个多态性位点上具有备选氨基酸。

本发明提供包含编码CFHR5多肽的核酸的载体。CFHR5多肽可以是野生型或变体(如保护性变体)。核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链的。

一些核酸编码全长的、变体形式CFHR5多肽。变体CFHR5多肽可以在密码子编码的氨基酸上不同于正常或野生型CFHR5，所述密码子包括CFHR5基因中任一已知非同义多态性位置。在一个实施方案中，变体CFHR5多肽可以在密码子编码的氨基酸上不同于正常或野生型CFHR5多肽，所述密码子包括表14和15中所示非同义多态性位置中的一个，该位置由表14和15中所示氨基酸占据。应该理解，可以产生这样的变体CFHR5基因：其编码变体CFHR5多肽，所述多肽在CFHR5基因中多个多态性位点上具有备选氨基酸。

用于产生重组蛋白质和多肽的表达载体是众所周知的(参阅Ausubel等，2004，Current Protocols In Molecular Biology，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。此类表达载体包括与调节元件(如启动子)连接的因子H多肽的编码核酸序列，所述调节元件驱动DNA转录并且适用于在原核(如大肠杆菌(E.coli))和真核(如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)宿主中表达。可以在表达载体中表达变体因子H或CFHR5多肽，在所述表达载体中变体因子H或CFHR5基因与启动子有效连接。启动子通常为用于哺乳动物细胞表达的真核启动子。转录调节序列通常包括异源启动子和任选的为宿主细胞所识别的增强子。可以使用市售的表达载体。表达载体可包括宿主识别的复制系统、可扩增基因、可选择标记、用于插入宿主基因组的宿主序列等。

合适的宿主细胞包括细菌如大肠杆菌、酵母、丝状真菌、昆虫细胞以及通常是永生化的哺乳动物细胞，包括小鼠、仓鼠、人和猴细胞系及其衍生物。宿主细胞能够加工变体因子H或CFHR5基因产物，以产生正确加工的成熟多肽。此类加工可包括糖基化、泛素化、二硫键形成等。

基于具体的构建和靶宿主，将含有变体因子H或CFHR5基因的表达构建体引入宿主细胞。合适的方法以及原核和真核宿主细胞是本领域熟知的。已经在Sf9昆虫细胞中表达了重组全长人因子H以用于研究目的(参阅Sharma和Pangburn，1994，Biologically active recombinant humancomplement factor H：synthesis and secretion by the baculovirus system，Gene 143：301-2)。已经在多种细胞类型中表达了人因子H的重组片段用于研究目的(参阅如Cheng等，2005，″Complement factor H as a markerfor detection of bladder cancer″Clin Chem.5：856-63；Vaziri-Sani等，2005，″Factor H binds to washed human platelets″J Thromb Haemost.3：154-62：Gordon等，1995，″Identification of complement regulatory domains inhuman factor H″J Immunol.155：348-56)。已经在Sf9昆虫细胞中表达了重组全长人CFHR5以用于研究目的(参阅McRae等，2001，Human FactorH-related Protein 5(FHR-5)，J.Biol.Chem.276：6747-6754)。

可以通过蛋白质生物化学和纯化的常规手段分离变体因子H或CFHR5多肽，以获得基本纯的产物。一般方法参阅Jacoby，Methods inEnzymology 104卷，Academic Press，New York(1984)；Scopes，ProteinPurification，Principles and Practice，2版Springer-Verlag，New York(1987)；和Deutscher(编著)Guide to Protein Purification，Methods inEnzymology，182卷(1990)。分泌蛋白质如因子H或CFHR5可以从培养宿主细胞的培养基中分离。如果不分泌变体因子H或CFHR5多肽，可以从细胞裂解液中分离。

在一个实施方案中，载体为用于产生变体因子H蛋白质的表达载体，所述蛋白质具有在图1A、1B和/或1C所示一个或多个多态性位点上为非野生型序列的序列。

在一个实施方案中，载体为用于产生变体因子H蛋白质的表达载体，所述蛋白质具有因子H保护性变体的序列。

在一个实施方案中，载体为用于产生变体CFHR5蛋白质的表达载体，所述蛋白质具有在图14和15所示一个或多个多态性位点上为非野生型序列的序列。

在一个实施方案中载体为用于产生变体CFHR5蛋白质的表达载体，所述蛋白质具有因子H保护性变体的序列。

C)基因治疗载体

表达用于基因治疗的因子H多肽或CFHR5多肽的方法是已知的，并描述于上文IV(A)一节。

XI.抗体

本发明提供因子H特异性抗体，所述抗体可识别正常或野生型因子H多肽或变体因子H多肽，其中在因子H编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施方案中，本发明提供特异性识别变体因子H多肽或其片段而不识别多态性位点处无变异的因子H多肽的抗体。

本发明还提供CFHR5特异性抗体，所述抗体可识别正常或野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽，其中在CFHR5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施方案中，本发明提供特异性识别变体CFHR5多肽或其片段而不识别多态性位点处无变异的CFHR5多肽的抗体。

抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，根据标准方法制备。可以通过用变体因子H或变体CFHR5多肽或其片段或其合成肽片段注射适当的动物来制备抗体。可以按照标准方法筛选单克隆抗体(Koehler和Milstein1975，Nature 256：495；Dower等，WO 91/17271；McCafferty等，WO92/01047；Vaughan等，1996，Nature Biotechnology，14：309；以及下文提供的参考文献)。在一个实施方案中，测定单克隆抗体分别对变体因子H或CFHR5多肽的特异性免疫活性，而对相应野生型因子H或CFHR5多肽无特异性免疫活性。鉴定特异性结合变体多肽而非相应野生型多肽的抗体的方法为本领域熟知。就方法(包括抗体筛选和消减法)而言，参阅Harlow& Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，New York(1988)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编著，1999，包括整个2005年的增刊)；Goding，Monoclonal Antibodies，Principles and Practice(2版)Academic Press，New York(1986)；Burioni等，1998，″A new subtraction technique for molecular cloning of rareantiviral antibody specificities from phage display libraries″Res Virol.149(5)：327-30；Ames等，1994，Isolation of neutralizing anti-C5amonoclonal antibodies from a filamentous phage monovalent Fab displaylibrary.J Immunol.152(9)：4572-81；Shinohara等，2002，Isolation ofmonoclonal antibodies recognizing rare and dominant epitopes in plantvascular cell walls by phage display subtraction.J Immunol Methods 264(1-2)：187-94。免疫或筛选可以针对全长变体蛋白质，或者备选地(经常更方便)针对包含已知在变体和野生型形式之间不同的表位的肽或多肽片段。具体的变体包括CFH和HFL1的Y402H或162V变体、CFH的R1210C变体、CFHR5的P46S变体和CFH的截短形式。在一个实施方案中，测量HF1。如上文所述，在一个实施方案中，测量HFL1与CHF的比例。对变体因子H或CFHR5多肽具有特异性的单克隆抗体(即不与野生型蛋白质结合或以低亲和力结合)可在诊断测定中用于检测因子H或CFHR5的变体形式，或者作为药物组合物中的活性成分。

本发明提供适于对患者施用的重组多肽，包括依照GoodManufacturing Pracctice(GMP)的要求产生和测试的抗体。例如，提交FDA批准的重组抗体必须测试其效力和同一性、是无菌的、不含外来物质，并且产品中的所有成分(如防腐剂、稀释剂、佐剂等)必须符合纯度、质量要求，并对患者无害。

本发明提供包含抗体和可药用赋形剂或载体的组合物，所述抗体特异性识别因子H或CFHR5多肽(如正常或野生型因子H多肽或变体因子H多肽，或者正常或野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽)。

在相关方面中，本发明提供含有可治疗用的因子H特异性或CFHR5特异性抗体的无菌容器，如小瓶。在一个实施方案中为冻干制品。

在相关方面中，本发明提供用于对患者施用的人或人源化抗因子H或抗CFHR5抗体的药物制品。人源化抗体具有基本来自人抗体(称为受体抗体)的可变区构架残基和基本来自小鼠抗体(称为供体免疫球蛋白质)的互补决定区。参阅Peterson，2005，Advances in monoclonal antibodytechnology：genetic engineering of mice，cells，and immunoglobulins，ILARJ.46：314-9，Kashmiri等，2005，SDR grafting-a new approach to antibodyhumanization，Methods 356：25-34，Queen等，Proc.Natl：Acad.Sci美国86：10029-10033(1989)，WO 90/07861，美国专利No.5,693,762，美国专利No.5,693,761，美国专利No.5,585,089，美国专利No.5,530,101，和Winter，美国专利No.5,225,539。恒定区(如果有)也基本或完全来自人免疫球蛋白质。人可变区通常选自人抗体，所述人抗体的构架序列显示与CDR来源小鼠可变区结构域的高度序列同一性。重链和轻链可变区构架残基可来自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体序列，或者可以是若干人抗体的共有序列。参阅Carter等，WO 92/22653。基于某些氨基酸对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，选择对来自人可变区构架残基的某些氨基酸进行取代。这些可能影响的研究是通过建模、检查特定位置氨基酸的特征或经验性地观察特定氨基酸的取代或诱变的效应。

例如，当小鼠可变区构架残基与选定的人可变区构架残基的氨基酸不同时，在可以合理预期该氨基酸具有以下性质时，一般应该用来自小鼠抗体的等价构架氨基酸取代人构架氨基酸：(1)与抗原直接非共价结合，(2)毗邻CDR区，(3)还与CDR区相互作用(即在CDR区约6A内)，或(4)参与VL-VH界面。

其他取代候选者为在人免疫球蛋白质该位置上不常见的受体人构架氨基酸。这些氨基酸可以用来自小鼠供体抗体等价位置或来自更典型人免疫球蛋白质等价位置的氨基酸取代。其他取代候选者为在人免疫球蛋白质该位置上不常见的受体人构架氨基酸。人源化免疫球蛋白质可变区构架一般表现出与人可变区构架序列或此类序列的共有序列至少85％的序列同一性。

IX.鉴定危险、保护性和中性变异和单元型

本发明提供筛选与表1A、1B、1C、11、14和15所述因子H基因和/或CFHR5基因多态性位点连锁的多态性位点的筛选方法。这些方法包括鉴定基因中与因子H基因或CFHR5基因多态性位点连锁的多态性位点，其中因子H基因或CFHR5基因多态性位点的多态性形式与AMD相关(如危险提高或降低)，以及确定个体群中的单元型，以指示连锁的多态性位点是否具有与因子H基因或CFHR5基因多态性形式平衡或不平衡的多态性形式，所述因子H基因或CFHR5基因多态性形式与AMD表型相关。

因子H基因或CFHR5基因多态性(如表1A、1B、1C、11、14和15所示)可用于在目的性状相关遗传基因座与多态性标志物之间建立物理连锁，所述多态性标志物与该性状无关，但在物理上与负责该性状的遗传基因座接近，并与其共分离。与目的性状相关的遗传基因座的作图有助于按照本领域熟知的方法克隆负责该性状的基因。

因子H基因或CFHR5基因多态性(如表1A、1B、1C、11、14和15所示)可用于家族连锁研究，以确定哪种多态性与表型性状共分离、确定需要治疗的个体和确定疗效。

通过计算LOD(优势对数)分数来分析连锁，LOD是当标志物与遗传基因座位于重组分数θ时，与二者不连锁(独立分离)的情况相比，对于二者获得所观察的分离数据的可能性的log₁₀。参阅Thompson &Thompson，Genetics in Medicine(第5版，W.B.Saunders Company，Philadelphia，1991)和Strachan，″Mapping the human genome″in TheHuman Genome (BIOS Scientific Publishers Ltd，Oxford)，第4章)。LOD分数为3表示表观观察到的连锁为交叉并发的几率为1000比1。+3或更高的LOD分数认为是两基因座连锁的确定证据，而-2或更低的LOD分数认为是非连锁的确定证据。

X.转基因非人动物

本发明提供能表达人变体因子H或CFHR5多肽的转基因非人动物。转基因非人动物可以具有失活的内源因子H或CFHR5基因的一个或两个等位基因。外源变体因子H或CFHR5基因的表达通常通过将基因与启动子和任选的增强子有效连接、接着按照标准操作将该构建体显微注射进合子中来实现。参阅Hogan等，″Manipulating the Mouse Embryo，ALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory。可以通过本领域已知的方法使内源因子H或CFHR5基因失活(Capecchi，1989)。因子H缺陷型小鼠可用于引入外源人变体因子H基因。表达人或非人变体因子H或CFHR5多肽的转基因动物提供了有用的药物筛选系统，并作为AMD和其他补体相关疾病的模型。转基因动物还可用于产生本发明的重组CFH和CFHR5蛋白质(参阅如美国专利No.6,066,725；6,013,857；5,994,616和5,959,171；Lillico等，2005；Houdebine，2000)。

XI.试剂盒

本发明提供检测因子H或CFHR5多态性和单元型的试剂、装置和试剂盒。尽管特别适用于筛选发生AMD的危险和/或鉴定预防或改善受试者AMD的适当治疗，但应该理解，在某些实施方案中，这些试剂、装置和试剂盒可出于任何目的(包括但不仅限于确定发生MPGNII或任何其他补体相关病症的危险)用于分析因子H和CFHR5多态性和单元型。

大量测定系统是本领域已知的，确定AMD相关变异的存在在本领域技术范围内可以实现的。在用于诊断或筛选之前，试剂盒试剂如多种引物、多种探针、引物组合或探针组合可以包含在分开的容器中。在实施方案中，试剂盒包括含有本文所述第一种CFH或CFHR5等位基因的探针、引物或引物对的第一个容器以及含有本文所述第二种CFH或CFHR5等位基因的探针、引物或引物对的第二个容器。

在一个实施方案中，本发明提供包含至少一种因子H或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸的试剂盒，所述寡核苷酸与因子H或CFHR5基因中的特定多态性杂交。该试剂盒可以含有与不同多态性形式杂交的一对或多对因子H或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸对。因子H或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自因子H或CFHR5基因编码区(外显子)或非编码区(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)的序列。可以提供固定在基质上的因子H或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸。所述基质可包含因子H或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸探针，所述探针用于检测表1A、1B、1C、11、14和15所示多态性和/或因子H或CFHR5基因的其他多态性(例如包括上文列出的可见于SNP数据库的多态性)中至少2、3、4、5或多于5(如至少6、7或8)种或全部。在一个实施方案中，该试剂盒用于诊断AMD。在相关实施方案中，该试剂盒用于筛选与因子H或CFHR5基因变异相关的其他疾病。

该试剂盒可包括至少一种因子H或CFHR5特异性引物，所述引物杂交跨越或毗邻因子H或CFHR5基因中特定多态性的区域。因子H或CFHR5特异性引物可包括来自因子H或CFHR5基因编码区(外显子)或非编码区(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)的序列。该试剂盒经常含有一对或多对因子H或CFHR5特异性引物对，所述引物与因子H或CFHR5基因中特定多态性附近核酸的相反链杂交。在适当的缓冲液和酶存在下，因子H或CFHR5特异性引物对可用于扩增因子H或CFHR5基因中的特定多态性。

通过本文的公开内容的指导，对本领域技术人员而言显而易见的是可以检测多种多态性和单元型以评估个体发生因子H相关病症的倾向。提供以下实施例和组合用于说明而非限制。在一些情况下，所述测定鉴定因子H或CFHR5基因中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个多态性位点处的等位基因。在一些情况下，所述测定鉴定了表1A、1B、1C、11、14和15中列出的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10处，或全部因子H或CFHR5基因多态性处的等位基因。在一个实施方案中，位点选自rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674，并任选地包括外显子22(R120C)。在一个实施方案中，位点选自rs3753394、rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs2274700、rs203674、rs3753396、rs1065489，并任选地包括外显子22(R120C)。在一个实施方案中，位点选自rs800292(I62V)、IVS 2(-18insTT)、rs1061170(Y402H)和rs2274700(A473A)。在一个实施方案中，位点选自rs9427661(-249T＞C)、rs9427662(-20T＞C)和rs12097550(P46S)。在优选的实施方案中，本发明的诊断/筛选测定鉴定因子H或CFHR5基因中至少两个多态性位点上的等位基因。在优选的实施方案中，本发明的诊断/筛选测定鉴定因子H或CFHR5基因中至少三个多态性位点上的等位基因。在优选的实施方案中，本发明的诊断/筛选测定鉴定因子H或CFHR5基因中至少四个多态性位点上的等位基因。

在一些情况下，该试剂盒包含引物或探针(“寡核苷酸”)，以鉴定表1A、1B、1C、11、14和15中列出的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10处，或全部因子H或CFHR5基因多态性处的等位基因。在一个实施方案中，试剂盒包括引物或探针，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674，并任选地包括外显子22(R120C)。在一个实施方案中，试剂盒包括引物或探针，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs529825、rs800292、内含子2 (IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、外显子10A、rs203674、rs375046，并任选地包括外显子22(R120C)。在一个实施方案中，试剂盒包括引物或探针，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs3753394、rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs2274700、rs203674、rs3753396、rs 1065489，并任选地包括外显子22(R120C)。在一个实施方案中，位点选自：rs800292(I62V)、IVS 2(-18insTT)、rs1061170(Y402H)和rs2274700(A473A)。在一个实施方案中，位点选自：rs9427661(-249T＞C)、rs9427662(-20T＞C)和rs 12097550(P46S)。

试剂盒可包括引物或探针，以确定两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个上述位点处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs3766404处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061170处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825和rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147、rs1061170和rs203674中至少两或三处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分以下多态性位点处的等位基因：rs529825和rs800292中至少一个；和rs3766404；和rs 1061147、rs 1061170和rs203674中至少一个。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825、rs800292、rs3766404、rs 1061170和rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)以及以下多态性位点处的等位基因：(a)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674、rs529825、rs800292；(b)rs1061147、rs1061170和rs203674中至少两个或三个；rs529825和rs800292、rs3766404，以及rs1061147，rs1061170和rs203674中至少两个或三个；或rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674。在一个实施方案中，引物或探针区分以下多态性位点处的等位基因：rs529825和rs800292中至少一个；以及rs3766404；以及rs 1061147、rs 1061170和rs203674中至少一个。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674处的等位基因。

试剂盒可以包括引物或探针，以测定两个上述位点或至少三个上述位点处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061170处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)和rs800292和/或外显子22和rs1061170和外显子22处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs800292、rs1061170和外显子22(R1210C)处的等位基因。

试剂盒可以包括引物或探针，以测定确定至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个上述位点处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分内含子2(IVS2或insTT)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs3766404处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs 1061170处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs2274700处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子10A处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs375046处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825和rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分以下位点的等位基因：rs529825和rs800292处、内含子2处、rs3766404处、rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处、rs2274700处、外显子10A处和rs375046处。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061170、rs2274700、外显子10A、rs203674和rs375046处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处以及rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs2274700、外显子10A、rs203674、rs375046、rs529825和rs 800292中一或多处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)及以下位点处的等位基因：(a)rs1061147、rs1061170和rs203674中任何两个或三个；(b)rs529825和rs800292；内含子2(IVS2或insTT)；rs3766404；rs1061147；rs1061170和rs203674中两个或三个；rs2274700；外显子10A和rs375046；或在rs529825；rs800292；内含子2(IVS2或insTT)；rs3766404；rs1061170；rs2274700；外显子10A；rs203674和rs375046。

在一个实施方案中，试剂盒含有用于检测因子H基因中至少一种变异的探针或引物以及用于检测CHFR-5基因中至少一种变异的探针或引物。在该实施方案中，该试剂盒任选地含有用于检测因子H基因和CHFR-5基因的一种或两种中一种以上变异的探针或引物，例如2种、3种或3种以上的变异。

多种用于确定单元型并可适用于本发明的测定方式是已知的。参阅如G_rgens等，2004，One-Step Analysis of Ten Functional HaplotypeCombinations of the Basic RET Promoter with a LightCycler Assay″Clinical Chemistry 50：1693-1695；Dawson，1989，″Carrier identification ofcystic fibrosis by recombinant DNA techniques.″Mayo Clin Proc64：325-34；Lee等，2005，″Gene SNPs and mutations in clinical genetictesting：haplotype-based testing and analysis.″Mutat Res.573：195-204。

在一个实施方案中，引物或探针区分以下位点的等位基因：(a)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170和rs203674中任何一个或多个；(b)内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A和rs375046中任何一个或多个；(c)rs529825和rs800292中一个或两个；(d)rs1061147、rs1061170和rs203674中一个或多个；(e)rs529825和rs800292中至少一个，以及rs3766404，和rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；(f)至少rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674；(g)外显子22(R1210C)；(h)外显子22(R1210C)和(a)-(g)任何一个；或者(i)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674、内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A、rs375046和外显子22(R1210C)中任何一个或多个以及rs9427661、rs9427662和rs12097550中任何一个或多个。在一个实施方案中，该试剂盒中包括在装置背景下足以区分下文列出的位点处等位基因任何组合的寡核苷酸。

试剂盒可包括特异性识别因子H或CFHR5多肽的抗体。因子H或CFHR5特异性抗体可识别正常的功能性因子H或CFHR5多肽，或变体因子H或CFHR5多肽，其中在因子H或CFHR5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。

XII.诊断装置

提供了用于诊断、预防、药物筛选和其他方法的装置和试剂。在一个方面中，提供了包含固定的引物或探针的装置，所述引物或探针对一个或多个因子H和/或CFHR5多态性位点具有特异性。在实施方案中，因子H和/或CFHR5多态性位点是本文所述与AMD相关的多态性位点。

在一个方面中，提供了包含固定的引物或探针的装置，所述引物或探针对一个或多个因子H和/或CFHR5基因产物(多核苷酸或蛋白质)具有特异性。该引物或探针能与多核苷酸(如基于与特定多态性位点的杂交)或多肽(如基于与变体多肽的特异性结合)结合。

在一个实施方案中，使用其中固定了多种(至少2种，一般为3种或更多)不同的引物或探针的阵列形式。术语“阵列”以其常用含义使用，指每一组多种引物或探针(通常固定在基质上)具有限定的位置(地址)，例如在基质上的位置。阵列上引物或探针的数目可以根据装置的性质和用途而有所不同。例如，量杆(dipstick)形式的阵列可具有少至2种不同的引物或探针，尽管通常多于2种引物或探针，并且经常为更多。将核酸附着在表面上的一种方法是通过制备高密度寡核苷酸阵列(参阅Fodor等，1991，Science 251：767-73；Lockhart等，1996，Nature Biotech 14：1675和美国专利No.5,578,832；5,556,752和5,510,270)。还考虑在一些实施方案中可使用包含单个固定探针的装置。

在一个实施方案中，使用其中固定了多种(至少2种，通常3种或更多)不同引物或探针的阵列形式。术语“阵列”以其常用含义使用，指每一组多种引物或探针(通常固定在基质上)具有限定的位置(地址)，例如在基质上的位置。阵列上引物或探针的数目可以根据装置的性质和用途而有所不同。

在一个实施方案中，固定的探针为抗体或其他因子H或CFHR5结合部分。

通过本文的公开内容指导，对本领域技术人员而言显而易见的是可以检测多种多态性和单元型以评估个体发生因子H相关病症的倾向。提供以下实例和组合用于说明而非限制。在一些情况下，阵列包括引物或探针以鉴定表1A、1B、1C、11、14和15中列出的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10处，或全部因子H或CFHR5基因多态性处的等位基因。在一个实施方案中，阵列包括探针或引物，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674，并任选地包括外显子22(R120C)。在一个实施方案中，阵列包括探针或引物，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、外显子10A、rs203674、rs375046，并任选地包括外显子22(R1210C)。在实施方案中，阵列包括探针或引物，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：(a)rs3753394；(b)rs529825；(c)rs800292；(d)内含子2(IVS2或insTT)；(e)rs3766404；(f)rs1061147；(g)rs1061170；(h)rs2274700；(i)rs203674；(j)rs3753396；(j)rs1065489，并任选地包括外显子22(R1210C)。在一个实施方案中，阵列包括探针或引物，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs800292(I62V)、IVS 2(-l8insTT)、rs1061170(Y402H)和rs2274700(A473A)。在一个实施方案中，阵列包括探针或引物，以确定至少一个以下多态性位点处的等位基因：rs9427661(-249T＞C)、rs9427662(-20T＞C)和rs12097550(P46S)。

阵列可以包括引物或探针，以确定两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个上述位点处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs3766404处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061170处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825和rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分以下位点的等位基因：rs529825和rs800292处，rs3766404处，rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处以及rs529825处、rs800292处、rs3766404处、rs1061147处、rs1061170处、rs203674处、rs529825和rs800292处、rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处，rs529825和rs800292处，rs3766404处，和rs1061147处、rs1061170和rs203674中两或三处，或rs529825和rs800292处，rs3766404处，rs1061170和rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分以下位点处的等位基因：(a)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170和rs203674中任何一处或多处；(b)内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A和rs375046中任何一处或多处；(c)rs529825和rs800292中一处或两处；(d)rs1061147、rs1061170和rs203674中一处或多处；(e)rs529825和rs800292中至少一处，以及rs3766404处，以及rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一处；(f)至少rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674处；(g)外显子22(R1210C)处；(h)外显子22(R1210C)处和(a)-(g)任何一处；或者(i)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674、内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A、rs375046和外显子22(R1210C)中任何一处或多处，以及rs9427661、rs9427662和rs12097550中任何一处或多处。

阵列可以包括引物或探针，以确定两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个上述位点处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分内含子2(IVS2或insTT)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs3766404处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs 1061170处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子10A处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs2274700处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs203674处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs375046处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825和rs800292处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分以下位点处的等位基因：rs529825和rs800292处，内含子2处，rs3766404处，rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处，外显子10A处，rs2274700处和rs375046处。在一个实施方案中，引物或探针区分rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061170、外显子10A、rs2274700、rs203674和rs375046处的等位基因。在一个实施方案中，引物或探针区分外显子22(R1210C)处以及rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs2274700、外显子10A、rs203674、rs375046、rs529825和rs 800292中任一处；rs1061147、rs1061170和rs203674中两或三处；rs529825和rs800292处，内含子2(IVS2或insTT)，rs3766404，rs1061147、rs1061170和rs203674中两个或三个，rs2274700，外显子10A和rs375046，或者rs529825、rs800292、内含子2(IVS2或insTT)、rs3766404、rs1061170、rs2274700、外显子10A、rs203674和rs375046处的等位基因。在一个实施方案中，该装置在试剂盒背景中区分上文中列出位点处等位基因的任何组合。

在一个实施方案中，基质包含少于约1000种不同引物或探针，经常少于约100种不同引物或探针，少于约50种不同引物或探针，或少于约10种不同引物或探针。如在此上下文中用到的，如果两种引物不与同一多核苷酸特异性结合(即例如不同基因的cDNA引物)，则引物与另一引物“不同”。如在此上下文中用到的，如果两种探针不与同一多肽或多核苷酸特异性结合(即例如不同基因的cDNA探针)，则探针与另一探针“不同”。如果引物或探针识别同一基因(即CFH或CFHR5)的不同等位基因，则也可以将其描述为不同。因此，在一个实施方案中，本发明的诊断装置仅检测CFH、仅检测CFHR5、仅检测CFH和CFHR5或者CFH、CFHR5和多至20种、优选多至10种或优选多至5种除CFH和/或CFHR5之外的基因的等位基因。即，该装置特别适用于筛选AMD和相关的补体相关疾病。在一个实施方案中，该装置包含仅识别CFH和/或CFHR1-5中一种或多种的引物或探针。在相关实施方案中，该装置包含用于多至20种、优选多至10种或优选多至5种除CFH或CFHR1-5之外其他基因的引物和探针。

在一个实施方案中，固定的引物为区分因子H或CHRF5基因多态性位点处的等位基因的等位基因特异性引物。鉴定因子H基因多态性位点处的等位基因的示例性等位基因特异性引物示于表16A。固定的等位基因特异性引物优先结合具有引物互补序列的核酸(RNA或DNA)。杂交可以通过多种方法检测，包括使用荧光检测的单碱基延伸、寡核苷酸连接测定等(参阅Shi，M.M.，2001，Enabling large-scale pharmacogenetic studies byhigh-throughput mutation detection and genotyping technologies″Clin.Chem.47(2)：164-172)。用于检测多态性位点的基于微阵列的装置是市售的，包括Affymetrix(Santa Calar，CA)、Protogene(Menlo Park，CA)、Genometrix(The Woodland，TX)、Motorola BioChip Systems(Northbrook，IL)和Perlegen Sciences(Mountain View，CA)。

在一个实施方案中，固定的探针为区分因子H或CHRF5基因多态性位点处的等位基因的等位基因特异性探针。鉴定因子H基因多态性位点处的等位基因的示例性等位基因特异性探针示于表16B。固定的等位基因特异性探针优先结合具有探针互补序列的核酸(RNA或DNA)。杂交可以通过多种方法检测，包括杂交的核苷酸的荧光(参阅Shi，M.M.，2001，Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughputmutation detection and genotyping technologies″Clin.Chem.47(2)：164-172)。用于检测多态性位点的基于微阵列的装置是市售的，包括Affymetrix(Santa Calar，CA)、Protogene(Menlo Park，CA)、Genometrix(The Woodland，TX)、Motorola BioChip Systems(Northbrook，IL)和Perlegen Sciences(Mountain View，CA)。

在某些实施方案中，从本发明的试剂盒或装置中排除对特定SNP和变异具有特异性的探针或引物。例如，在一些实施方案中，试剂盒或装置不包括一种或多种以下可以排除的SNP：(i)rs529825；(ii)rs900292；(iii)内含子2(IVS2或insTT)；(iv)rs3766404；(v)rs1061147；(vi)rs1061170；(vii)rs2274700；(viii)外显子10A；(ix)rs203674；(x)rs375046；(xi)rs3753396；(xii)rs1065489；或(xiii)外显子22(R1210C)。

XIII.实施例

实施例1

年龄相关性黄斑变性易感个体中因子H基因(HF1/CFH)的普遍单元型

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家老年人中不可逆失明的最常见原因，全世界每年有超过5千万人患病。我们先前的研究涉及眼玻璃疣(AMD的标志性损伤)的形成中旁路补体途径的活化。我们还显示AMD患者中的斑状玻璃疣与患有2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGNII)个体中早期形成的玻璃疣不可区分，MPGNII是特征为补体级联系统旁路途径的非受控活化的疾病。本文中我们显示旁路补体途径的主要抑制剂因子H蛋白质(HF1)在玻璃疣中累积，并由视网膜色素上皮局部合成。先前的连锁分析将含有因子H基因(HF1/CFH)的染色体1q25-32鉴定为主要的AMD易感性基因座。我们在由约900个AMD病例和400个匹配对照组成的两个独立群中分析了HF1的遗传变异。我们发现在这些群中8种普遍的HF1 SNP与AMD非常显著相关，两种普遍的错义变体显示非常显著的相关性(I62V；χ²＝36.1，ρ＝3.2×10^-7和Y402H；χ²＝54.4，ρ＝1.6×10^-13)。单元型分析提示多种HF1变体赋予提高或降低的AMD危险。一种常见的危险单元型在AMD病例中以49％的频率存在，在对照中为26％(OR＝2.67，95％CI[1.80-2.85])。该单元型的纯合子占病例的22.1％和对照的5.1％(OR＝5.26，95％CI[2.84-9.76])。还鉴定了若干保护性单元型(OR＝0.44-0.55)。危险单元型在70％MPGNII患者中存在这一发现进一步加强了这些数据。我们提出，与触发事件如感染组合时，补体系统调节子中遗传上预先确定的变异成为人群中一大部分AMD的基础。

引言

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家中引起不可逆失明的最主要原因(Klein等，2004；van Leeuwen等，2003)，影响约15％的60岁以上个体或估计有6亿个体。AMD的特征为由变性和新生血管变化引起的渐进性中央视觉丧失，所述变性和新血管变化发生在神经视网膜及其下层脉络膜之间的界面上。该位置上分布了光感受器、临近的视网膜色素上皮(RPE)、称为Bruch膜(BM)的基膜复合物以及脉络膜毛细血管网。

流行的观点是AMD是由多种遗传和环境危险因素的相互作用引起的复杂疾病(Klein等，2003；Tuo等，2004)。家族性聚集研究表明，遗传组分可以在多达25％的病例中鉴定到(Klaver等，1998a)。由此，AMD似乎是多种易感性基因座之间相互作用的产物，而不是单基因病症的集合。所涉及的基因座数、所赋予的归因危险度和多个基因座之间的相互作用仍不清楚。

连锁分析和候选基因筛选已经对AMD的遗传学提供了有限的了解。已经报道了一个基因与危险提高的可靠关联，ABCA4(Allikmets等，1997；Allikmets等，2000)和一个基因与危险降低的可靠关联，ApoE4(Klaver等，1998，Souied等，1998)。一些小组报道了全基因组连锁分析的结果(Tuo等，2004；Weeks等，2001)。迄今已经证明了一个AMD表型(ARMD1；MIM 603075)与特定染色体区域1q25-q31的连锁(Klein等，1998)。已经暂时将HEMICENTIN-1(也称为Fibl6)鉴定为致病基因(Schultz等，2003)，尽管它还不能解释显著的疾病负荷(Abecasis等，2004；Hayashi等，2004)。若干小组(Weeks等，2001；Iyengar等，2003)的染色体1q上重叠基因座的鉴定提示该基因座可能包含主要的AMD相关基因。

在AMD以及许多其他疾病如阿尔茨海默病(Akiyama等，2000)、动脉粥样硬化(Torzewski等，1997)和肾小球肾炎(Schwertz等，2001)中，特征性损伤和沉积物促成了疾病的发病和发展。尽管这些疾病的分子发病机制可能不同，但沉积物含有许多共同的分子组分，它们部分是由于局部炎症和补体级联系统(先天性免疫系统中宿主防御的关键元件)的活化。玻璃疣是与早期AMD相关的标志性沉积物，最近的研究也涉及在其形成中的局部炎症和补体级联系统的活化。(Hageman等，1999；Espinosa-Heidmann等，2003)。玻璃疣含有多种补体激活剂、抑制剂、激活特异性补体片段和末端途径组分，包括膜攻击复合物(MAC)——由于补体活化而形成的裂解复合物。MAC对宿主细胞和组织以及外源病原体而言可能是致死性的。

许多患II型膜性增生性肾小球肾炎(MPGNII)——特征为补体旁路活化途径的非受控全身性活化的罕见肾病——的个体也在黄斑中发生眼玻璃疣，其在组成和外观上与AMD的玻璃疣无法区分(Mullins等，2001；O’brien等，1993；McAvoy等，2004)。而且，一名诊断为MPGNII的患者在补体活化旁路途径的主要抑制子HF1(HF1)中带有突变(Zipfel，私人通信)。此外，一些患MPGNIII的扩大家族(相关疾病)的个体显示与定位在1q31-32的染色体区连锁(Neary等，2002)，1q31-32与在AMD的全基因组连锁研究中已经鉴定的基因座重叠。总之，这些发现提供了检查HF1是否与发生AMD和MPGNII相关的动因。

在该研究中，我们确定了AMD和MPGNII患者及匹配对照中HF1序列变体的频率，并分析了其与疾病表型的联系。我们还检查了来自正常和AMD供体的黄斑RPE-脉络膜复合物中的HF1转录和HF1蛋白质的分布。

方法

患者、表型和DNA——本研究使用AMD病例和年龄匹配对照的两个独立组。所有参与的个体均为美国欧裔血统，60岁以上，并在征得同意后在IRB批准的方案下加入。这些组由来自University of Iowa的404名临床记录为AMD的无关患者(平均年龄79.5±7.8)和131名无关对照个体(平均年龄78.4±7.4，年龄和种族匹配)，以及来自Columbia University大学的550名临床记录为AMD的无关患者(平均年龄71.32±8.9岁)和年龄和种族匹配的275名无关对照个体(平均年龄68.84±8.6岁)组成。由经视网膜研究员训练的眼科医师通过间接检眼镜检查和裂隙灯显微镜检查法来检查患者。

Caroline Klaver博士和其后Klaver博士训练的个体根据标准化国际分类系统(Bird等，1995)在两种体系下将眼底照片分级。如果对照患者未显示任何可辨别的黄斑疾病体征或不具有已知的AMD家族病史，则将其选择为对照并纳入。基于其参与研究时最严重的眼的分类，将AMD患者细分为表型分类——早期AMD(eAMD)、地图样萎缩(GA)和渗出性(CNV)AMD。将The University of Iowa的eAMD和GA病例进一步细分为不同表型(单独的RPE改变，＞10的斑状硬玻璃疣、斑状软玻璃疣、BB(表皮)玻璃疣、PED、“Cherokee”萎缩、半岛状地图样萎缩和框式地图样萎缩)。所有病例的最早的可被证明的表型也被记录并用于分析。

使用QIAamp DNA Blood Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从取自病例和对照受试者的外周血白细胞中制备基因组DNA。

Rrapanui——在Unidad de Bioetica，Ministerio de Salud(Santiago，Chile)批准的知情同意过程之后，对447名(66％女性，34％男性)EasterIsland居民提供完整的眼检查，包括放大眼底镜检查。采用医疗史、家族史和眼科病史，使用当地医师和社区领导的记录并协助划分受试者的种族。检查的患者中49％为纯种Rapanui人，9％为混合种(Rapanui与欧洲人、智利人、Mapuchi人和/或新近的波利尼西亚人的混合)，42％为大陆人(主要为智利欧洲人)。从201名老年个体中收集外周静脉血和血清，其中114名个体为纯种Rapanui人(108名＞50岁，89名＞60岁)。在该研究中使用来自65岁以上的60名纯种Rapanui居民和13名智利居民的DNA。

人供体眼——人供体眼在死亡5小时内得自Iowa Lions眼库(IowaCity，IA)、Oregon Lions眼库(Portland，OR)和Central Florida Lions眼和组织库(Tampa，FL)。可获得时，阅读这些眼的总病理学特征以及眼底照片和血管造影片，并由视网膜专家分类。基底由至少两位个体根据修订版本的国际AMD分级系统(Bird等，1995)分类。

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)从来自眼的视网膜、RPE/脉络膜和RPE细胞中制备总RNA。使用QiaShredder(Qiagen，Valencia，CA)剪切基因组DNA并用DNAse(Promega)消化残余的基因组DNA。使用Agilent BioAnalyzer评估RNA完整性。

将来自38名临床记录为AMD的无关供体(平均年龄81.5±8.6)和19名无关对照供体(平均年龄80.5+8.8，年龄和种族匹配)的DNA用于SSCP分析，并评估潜在的基因型-表型关联。

免疫组织化学——固定后极部(包括锯齿缘和黄斑)并如上述处理(Hageman等，1999)。将一些后极部直接包埋进OCT中而不预先固定。在恒冷切片机上将组织切成6-8μm厚度的切片，如上述进行免疫标记(Hageman等，1999)。使用仅与二抗一起孵育的临近切片作为对照。制备一些经免疫标记的标本，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察，如上文所述(Anderson等，2002)。

聚合酶链式反应(PCR)——使用Superscript逆转录酶(Gibco BRL)和随机六聚体从总RNA中合成第一链cDNA。PCR反应使用以下引物组进行：FH1(外显子8至外显子10)5′-GAACATTTTGAGACTCCGTC-3′[SEQ ID NO：324]和5′-ACCATCCATCTTTCCCAC-3′[SEQ ID NO：325]；FH1(外显子9至外显子10)5′-TCCTGGCTACGCTCTTC-3′[SEQ IDNO：326]和5′-ACCATCCATCTTTCCCAC-3′[SEQ ID NO：325]；HFL1(外显子8至外显子10)5′-TCCGTCAGGAAGTTACTGG-3′[SEQ IDNO：327]和5′-AGTCACCATACTCAGGACCC-3′[SEQ ID NO.328]；HFL1(外显子9至外显子10)，5′-GGCTACGCTCTTCCAAAAG-3′[SEQID NO：329]和5′-AGTCACCATACTCAGGACCC-3′[SEQ ID NO：330]。使用MacVector软件(San Diego，CA)设计PCR引物(IDT，Coralville，IA)。反应参数为94℃3分钟的1个循环、94℃45秒、51.4℃(FH1)/55℃(FHL1)1分钟、72℃1分钟的40个循环和72℃3分钟的1个循环。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳并使用与Quantity One_软件(Bio-Rad，Hercules，CA)一起使用的Gel Doc 2000^TM记录系统进行记录。

微阵列分析：使用从在死亡5小时内收集的天然人RPE或RPE-脉络膜复合物中提取的总RNA(RNeasy minikit，Qiagen，Valencia，CA)进行DNA微阵列分析。使用三种不同平台：18,380种非冗余DNA的微阵列(Incyte Pharmaceuticals；St.Louis，MO)、Affymetrix基因芯片系统和完整人基因组或人1A V2寡聚物微阵列(AgilentInc.，Palo Alto，CA)。各自的操作按各生产商的说明书进行。对于Incyte分析，在随机引发反应中用33-P标记来自黄斑和视网膜赤道部区域6mm孔的cDNA，将其纯化并与含有18,380种非冗余cDNA的基于尼龙的阵列杂交。膜用射线影像(phosphoimage)检测，将信号标准化并使用Genome Discovery软件包分析数据。对于Affymetrix分析，使用标准化操作将RPE和RPE/脉络膜(来自6-8mm的黄斑和外缘孔)cRNA与Affymetrix基因芯片(HG-U133A直接杂交。这些方法在University of Iowa DNA核心实验室进行，其配备了流控站和GeneArray扫描仪。Agilent数据得自黄斑和视网膜赤道部的孔。使用Agilent Low Input RNA扩增试剂盒，用来自同一供体的黄斑和外缘RNA产生来自黄斑和外缘RPE/脉络膜的CY3和CY5标记的扩增cRNA。Agilent阵列数据使用VersArray扫描仪得自3名正常年轻供体、3名AMD供体和3名年龄匹配的非AMD对照，使用VersArray Analyzer软件(BioRad)定量数据。使用总体背景消减计算每个点的中间净强度，使用局部回归法使数据标准化。

突变筛选和分析——使用单链构象多态性(SSCP)分析、变性高效液相层析(DHPLC)和直接测序检查HF1编码区和毗邻的内含子区(包括转录产生截短的FHL1同种型的外显子10A)中的变体。剩余的SNP通过5’核酸酶(Taqman，ABI)法分型。如所述进行Taqman基因分型和关联性分析(Gold等，2004)。使用Mac Vector软件(San Diego，CA)设计用于SSCP、DHPLC和DNA测序分析的引物(表5)，以扩增每个外显子及其毗邻的内含子区。如前述通过SSCP和DHPLC在PCR产生的扩增子中筛选序列变异(Allikmets等，1997；Hayashi等，2004)。按照标准操作通过双向测序确认SSCP和DHPLC检测到的所有变化。统计学分析使用卡方检验和Fisher精确检验进行。

结果

RPE-脉络膜界面处的因子H

在得自6名具有早期AMD病史的供体和3名无AMD或玻璃疣的年龄相近供体的眼中评估因子H蛋白质在来自黄斑和黄斑外的RPE/脉络膜复合物中的分布(图1A-1L)。在AMD供体中，在玻璃疣中、RPE下(即亚RPE空间)和脉络膜毛细血管周围存在强烈的HF1免疫反应性(IR)(图1A-1D、1E、1G)。在不存在一抗时，RPE/脉络膜中无标记(图1F)。五哦有因子H抗体以均一方式在一定程度上标记黄斑(图1C和1E)。一种抗体还标记了黄斑内的亚结构元件(图1A和1B)。这些结构也可使用针对与HF1结合的活化补体组分C3b/iC3b的抗体标记(Anderson等，2004；Johnson等，2001)。与年龄匹配的对照相比，因子H免疫反应性在AMD供体中更强，在AMD供体的黄斑中也比外缘更显著(图1G和1H)。黄斑中的抗HF1模式(图1G)与抗C5b-9的模式(图1I和1K)高度近似，在两种情况下，标记一般都包括脉络膜毛细血管。黄斑外的位置显示低得多的抗C5b-9免疫反应性(图1J)。在无AMD的50岁以下供体的RPE-脉络膜中观察到没有或几乎没有C5b-9免疫反应性(图1L)。

图1的描述

(A-B)来自诊断为萎缩性AMD的84岁老年男性供体的高倍放大共聚焦免疫荧光图像。在Cy2/荧光素通道上使玻璃疣和亚RPE空间中亚结构元件(白色箭头)的抗HF1(Advanced Research Technologies)标记成像。亚RPE空间是基底RPE表面与Bruch膜内胶原层之间的细胞外区室。这些元件也可以使用针对C3片段(iC3b、C3d、C3dg)的单克隆抗体显示免疫反应性(IR)，所述C3片段与补体激活表面共价结合(Johnson等，2001；2003)。在该供体的脉络膜毛细血管腔(星号)中强烈的抗因子H标记最有可能反映血流中HF1的高循环水平。RPE胞质中自身荧光脂褐质颗粒在Cy3/Texas红通道上标记。放大率标记：A)5μm；B)3μm.

(C-D)使用不同的HF1多克隆抗体(Quidel)在83岁AMD老年男性的玻璃疣和亚RPE空间中进行HF1的共聚焦免疫荧光定位(Cy2/萤光素通道；绿色)。C)在该供体眼中，玻璃疣(Dr)标记模式是均一的。D)RPE-脉络膜的低倍放大图像。抗HF1 IR在整个脉络膜和亚RPE空间(箭头)、解剖区室中存在，其中玻璃疣和其他沉积物与年龄和AMD形式相关。脂褐素自发荧光(Cy3通道；红色)。放大率标记C)10μm；D)20μm。

(E-F)玻璃疣中HF1的免疫组织化学定位。E)紫色碱性磷酸酶反应产物表示的抗HF1单克隆抗体(Quidel)标记在玻璃疣中、沿着Bruch膜以及在脉络膜毛细血管壁(箭头)上很明显。F)来自同一眼的对照切片。不存在一抗时，未发生标记。RPE胞质和脉络膜中的褐色色素为黑色素。放大率标记＝10μm。

(G-H)黄斑中的HF1免疫定位。G)AMD供体中沿着BM、脉络膜毛细血管壁和毛细血管间支柱(箭头)存在广泛的标记。H)来自无AMD供体黄斑的对照切片，在相同结构中标记明显较低。放大率标记＝20μm。

(I-J)来自同一AMD供体眼的黄斑下(图1I)和黄斑外(图1J)的RPE-脉络膜中补体膜攻击复合物(C5b-9)的免疫组织化学定位。在黄斑中，强烈的抗C5b-9标记与玻璃疣、Bruch膜和脉络膜毛细血管内皮相关。黄斑外的抗C5b-9标记局限在Bruch膜附近的窄带中。RPE胞质和脉络膜中的褐色色素代表黑色素色素形成。放大率标记＝20μm。

(K-L)来自AMD供体(图1K)和来自无AMD的另一供体(图1L)的黄斑中C5b-9的免疫组织化学定位。RPE胞质和脉络膜中的褐色色素形成代表黑色素。抗C5b-9标记主要与脉络膜毛细血管壁(黑色箭头)和毛细血管间支柱(白色箭头)相关。标记在AMD眼中强得多。注意与图G所示来自同一供体的黄斑中抗HF1标记模式的强相似性。放大率标记K＝15μm；L＝20μm。

视网膜色素上皮是因子H的局部来源

通过RT-PCR和DNA微阵列分析评估HF1和FHL1在RPE、RPE/脉络膜和视网膜中的表达。在来自患和未患AMD的供体的人眼中，两种基因产物的适当大小的PCR产物在新分离的RPE和RPE/脉络膜复合物中存在，但在神经视网膜中不存在(图2)。在HF1编码序列的外显子8、9、10A(用于产生截短的同种型FHL1的外显子)和10中选择引物。PCR反应使用从RNA制备的cDNA进行，所述RNA提取自来自临床记录AMD病史的供体的人感觉神经视网膜(泳道2)、RPE和脉络膜(泳道3)和新分离的RPE细胞(泳道4)。将基因组DNA作为模板用于扩增(泳道5)，泳道6描述的混合物中未加入模板。泳道1含有100bp的序列梯。跨越HF1的外显子8至外显子10(左图)、外显子9至外显子10(右图)以及FHL1的外显子8至外显子10A(左图)和外显子8至外显子10A(右图)的扩增引物为预计的大小(分别为376、210、424和248bp)。通过RT-PCR在RPE或RPE/脉络膜中未检测到FHR 1-5的转录物，但在神经视网膜中检测到FHR 1-4(数据未显示)。

来自三种平台的基因表达阵列数据确认，RPE和脉络膜细胞局部表达HF1和FHL1转录物，但HF1相关蛋白质转录物(FHR1可能是例外)则很少(如果有的话)。使用来自9名AMD供体和3名年龄匹配对照的RPE/脉络膜cDNA作为探针探测的Incyte阵列得到的数据显示，在AMD供体中HF1 mRNA平均水平提高2-3倍。与黄斑外区域相比，在黄斑区中也存在水平稍高的趋势，尽管该差异不具有统计学显著性。使用Affymetrix阵列进行的分离RPE和毗邻的RPE/脉络膜制品的检查所产生的数据证实在这些组织中存在HF1转录物，并显示HF1信息中的显著部分存在于RPE层中(数据未显示)，所述制品来自两名AMD供体和两名年龄匹配的对照供体。

HF1中的变异与AMD和MPGN II相关

为了测试HF1基因的等位基因变体是否与AMD相关，在University ofIowa在404名AMD患者和131名匹配对照的群体中筛选了全部22个编码外显子和50-100bp的侧翼内含子序列。检测到总计26种序列变体、编码区中的17种SNP(cSNP)(包括5种同义和12种非同义取代)以及9种内含子SNP9(一些变体示于图3)。图3显示分析中使用的11种SNP、20种短共有重复序列(SCR)和连锁不平衡(LD)节段的大致定位，并且基于先前公开的数据，病原体和其他底物的大致结合位点示于下图(Zipfel等，2002；Rodriguez de Cordoba等，2004)。cSNP包括先前描述的普遍的非同义变体，如外显子2中的I62V、外显子9中的Y402H和外显子18中的D936E(图3)。可能具有功能效应的常见内含子SNP的实例为IVS2-18intTT变体。还在AMD患者和对照中都检测到了五种罕见(＜0.5％)变体，排除了疾病表型由罕见HF1等位基因(即疾病导致的突变)引起的可能性。在404名患者和131名对照中的一些或全部中获得了6种SNP的详细基因型数据(表4和6A-6C)，使用病例-对照研究设计进行相关性分析。在若干个体变体中发现了十分显著的相关性，包括I62V(χ²＝15.0，p＝1.1×10^-4)和Y402H(χ²＝49.4，p＝2.1×10^-12)。在这个群体中，外显子10中的同义A473A变体观察到与AMD的最强相关性，得到的让步比(OR)为3.42(95％置信区间(CI)[2.27-5.15])。

这些结果在Columbia University，New York获得的AMD患者(n＝550)和匹配对照(n＝275)独立群体中得到了证实(表4)。在第二个群体中，相同的两种非同义SNP也与AMD高度相关(I62V；χ²＝36.1，p＝3.2×10^-7和Y402H；χ²＝54.4，p＝1.6×10^-13)。此外，基于商业测定的频率和可用性选择了若干其他内含子SNP(总计11种SNP)。在该群体中观察到与内含子10中的SNP rs203674的最强相关性(χ²＝66.1，p＝4.29×10^-16)。该变体显示与AMD的OR为2.44(95％CI＝1.97-3.03)。尽管OR中等，但该变体十分普遍，30.5％的病例是等位基因B纯合的，但在对照中仅为12.9％。外显子13和18中的Q672Q和D936E等位基因未显示统计学显著的相关性，提示HF1的N端一半(包括病原体和底物分子识别的结构域，(图3，也见下文))中的变异与AMD相关。两组数据十分相似，其中，这两个群体中不仅基因分型的SNP以十分显著的方式与AMD相关，而且相关性的频率和程度也非常相似(表4和6)。

将整个AMD患者群体与对照相比时，相关性非常显著(表4)。对AMD的主要亚表型(如早期AMD(eAMD，特征为斑状玻璃疣和/或色素异常)、CNV(新生血管膜和/或盘状疤)和GA(地图样萎缩))分别进行分析时，相关性在eAMD和CNV病例中尤为突出。在一些病例中，GA组显示与总体趋势存在偏差，特别是就外显子13(Q672Q)和18(D936E)等位基因定义的单元型而言(数据未显示)。尽管这一偏差就病因学变化而言是显著的，但其未达到统计学显著，很可能是由于GA患者数相对较小。

连锁不平衡(LD)分析显示在整个HF1基因上存在广泛的LD(表2和图3)。外显子2-3区中的三种SNP实质上如同外显子7和9中的A307A和Y402H变体，以及外显子13和18中的Q672Q和D936E变体，为完全LD(表6和图5)。在病例和对照中进行的单元型估计在49％的病例中鉴定到最常见的危险单元型，而在对照中仅为26％(OR＝2.93 95％CI[2.29-3.74])。该单元型的纯合子存在于22.1％的Columbia病例和5.1％的对照中(OR＝5.26，95％CI[2.84-9.76])。两种普遍的保护性单元型可见于30％的对照和18％的病例中(OR＝0.476 95％CI[0.349-0.650]和OR＝0.472，95％CI[0.320-0.698])。这些单元型仅在外显子2-3基因座SNP和内含子10 SNP中存在差异。如图4和表2所示，这些保护性单元型彼此密切相关，并距危险单元型都至少有5步距离。有趣的是，先前显示与HUS相关的3种SNP(启动子-257C＞T、A473 A和D936E)都在一种AMD危险为中性的相对普遍的单元型(12％)上(见下文的讨论)。对于每种SNP，我们鉴定共有的黑猩猩基因组中存在的碱基。产生的单元型代表可能遗传的人单元型，并与保护性单元型密切相关(数据未显示)。

还在20名无关MPGNII患者、52名Rapanui本地人和一小群美国西班牙裔、美国非裔和美国欧裔中对SNP IVS2-18insTT和Y402H进行基因分型(表7)。在不同群体的样品中由Y402H变体和/或IVS10基因座的基因型估计危险单元型的频率。他们包括65岁以上的Rapanui本地人(AMD在Easter Island种群中极为罕见，很可能不存在)、来自ColumbiaUniversity的对照(年龄＞65岁)、西班牙人一般种群、来自University ofIowa的对照(年龄＞65岁)、美国非裔一般种群、来自Columbia University的AMD病例、美国欧裔一般种群、患有MPGNII的来自University of Iowa的AMD病例。N＝个体数。在MPGNII群体中，危险单元型的频率约为70％。此外，危险单元型似乎在AMD发病率较低的美国西班牙裔和美国非裔中频率较低(35-45％)。然而，这些种群中分型的样品数很小。EasterIsland上的RapaNui种群具有显著的低AMD水平。从52名65岁以上无AMD的Rapanui本地人的分析中，我们估计危险单元型的频率仅为19％。

讨论

因子H多态性和AMD

本文展示的数据将两个独立群体中的大部分AMD病例与补体调节子基因，因子H(HF1/CFH)的特定多态性联系起来(Zipfel，2001；Rodriguezde Cordoba等，2004)。单元型分析显示最常见的危险单元型在近一半的AMD个体中存在，相比之下对照中仅为约25％。在两个群体中SNP相关性的频率和程度非常相似，并且在每个群体中基因分型的SNP均显示与AMD具有十分显著的相关性。相关性在早期AMD或脉络膜新生血管化的病例中尤为突出，在地图样萎缩中则较低。与先前与AMD相关的遗传异常相比，观察到的特定HF1单元型与AMD的相关性程度是惊人的。

对特定HF1单元型赋予提高的AMD疾病表型危险这一结论的其他支持通过在20名患有MPGNII无关患者和52名Rapanui本地人中对SNPIVS2-18insTT和Y402H进行基因分型而获得，MPGNII是与HF1突变相关的肾病，其中患者发生早发性斑状玻璃疣，Rapanui人是AMD发生率非常低(如果有的话)的人种。在该研究中发现约70％的MPGN II患者和19％的Rapanui人带有HF1危险单元型。需要通过更大的样本集分析来证实这些结果，但该数据确实提示HF1与AMD的相关性不仅限于欧洲人来源的种群。还鉴定了保护性单元型，进一步提示了HF1在AMD发病机制中的功能。

因子H多态性的功能提示

人中因子H缺陷与MPGN II和非典型性溶血性尿毒症综合征(aHUS)(Zipfel等，2001)相关。由突变引起的HF1缺陷引起蛋白质截短或氨基酸取代，导致内质网中的蛋白质滞留。血浆HF1水平的降低继而引起旁路补体途径的非受控活化，伴随C3和其他补体组分的消耗。相反，引起aHUS的HF1突变一般是限制FH1在细胞表面的补体抑制功能的错义突变。最近的研究已经显示了具有或不具有FH1突变的个体中三种普遍SNP与aHUS之间的相关性(Caprioli等，2003)。此外，已经证明损伤(如感染)触发aHUS的表现。

多数基因分型的HF1 SNP位于所编码蛋白质中重要的功能结构域中(图3)，其由20个有60个氨基酸短共有重复序列(SCR)组成。SCR含有C3b(SCR1-4，SCR12-14和SCR19-20)、肝素、唾液酸(SCR7，SCR1 3和SCR1 9-20)和C-反应蛋白质(CRP)(SCR7)的结合位点。因此，位于该功能结构域中的SNP尽管普遍，但仍推测其通过表达水平、结合效率和其他分子特性的变化来影响蛋白质功能。例如，外显子2 I62V变体位于SCR2中，SCR2包含在第一个C3b结合位点中，外显子9 Y402H变体在SCR7结构域中，SCR7与肝素和CRP都结合。内含子SNP如IVS2-18insTT变体可影响剪接。例如，TT插入的影响分析(http://splice.cmh.edu/server)提示在天然受体位点上游6bp处产生新的隐蔽剪接受体(数据未显示)。研究的某些SNP还有可能影响HF1同种型的表达。例如I62V存在于预计的外显子剪接增强子中(Wang等，2004)(数据未显示)。

常见SNP的功能性后果可能是适度的，因为它们涉及迟发性表型，并且不受(严格的)进化限制。具有更多显著效果(即致病突变)的HF1变体涉及早发性、重度(退行性)疾病，例如HF1缺陷和aHUS(Zipfel等，2002；Rodriguez de Cordoba等，2004；Caprioli等，2003；Zipfel，2001)。有意思的是这样的事实，即在完全筛选HF1基因后，仅在约25％至35％的HUS患者(主要是在无致病突变的人)中鉴定到了真实的致病突变(Caprioli等，2003)。同时，已经在HUS患者中鉴定了变体-257C＞T(启动子)、A473A(外显子13)和D936E(外显子18)定义的疾病相关单元型(Caprioli等，2003)。此外，相同的研究还鉴定了若干家族，其中患病渊源者遗传了来自一个亲本的的突变等位基因和来自另一亲本的易感性等位基因。相反，患病渊源者的健康同胞(致病突变的携带者)遗传了保护性等位基因。在来自这些家族的患病个体中，疾病触发效应(在＞60％的病例中为细菌或病毒感染)在＞80％的所有病例和＞90％无明显疾病相关突变的病例中鉴定到(Caprioli等，2003)。

总之，这些数据强烈提示危险HF1单元型与感染触发事件的结合足以使疾病表现出来。有意思的是，HUS中的危险HF1单元型(主要在C端)不与AMD和/或MPGNII中的危险HF1单元型重叠(表2)，提示HUS中有与MPGNII和AMD不同的触发器。对MPGNII中早发性玻璃疣和AMD中组成相同但HUS中不同的那些玻璃疣的观察支持了这些疾病不同的病因。

HF1中的致病突变在MPGN II中很罕见，在AMD中尚未报道，在本研究中我们在广泛筛选后也未发现它们。然而，我们观察到了相同的危险单元型，其频率为70％的MPGN II患者和约50％的AMD患者。这些数据与被传染物触发时危险HF1显著提高对疾病的易感性一致。这些因素的组合效应决定了得到的单元型的严重性，范围从AMD至MPGNII。

HF1单元型的进化分析表明，危险单元型已经由黑猩猩中发现的始祖单元型发生了显著的进化。图4展示了HF1 SNP单元型网状图，其显示了单元型之间的关系，圆圈的大小与单元型的频率成比例。大实心圆代表主要的危险单元型，竖线圆是两种显著的保护性单元型，大空心圆是包含三种非典型性溶血性尿毒症综合征(HUS)相关SNP中的单元型，它们对于AMD危险而言是中性的。还标出了推定的始祖单元型。有可能出现不同的HF1基因形式，以应答活化旁路补体途径的病原体。作用很弱的HF1单元型可提供降低的补体抑制和针对细菌感染的更强保护。然而，这些弱等位基因可能因为补体系统功能障碍的结果而导致易感性个体。有意思的是，AMD危险单元型在产生全长HF1和FHL1蛋白质的基因5’末端存在显著差异。相反，基因3’部分的HUS突变簇仅在HF1中发现。因此，确定这两种蛋白质形式在疾病中的作用将是很重要的。

AMD中因子H功能障碍的生物学模型

补体系统的一种主要功能是提供针对这些传染物的防御。其介导微生物的调理作用和裂解、外源颗粒的移除、炎性细胞的募集、抗体产生的调节和清除免疫复合物(Morgan等，1991；Kinoshita，1991)。该系统的活化触发连续的放大性蛋白质水解级联系统(其引起活化表面的修饰)以释放刺激炎性细胞的可溶性过敏毒素，最终形成膜攻击复合物(MAC)——通过形成跨膜孔促进细胞裂解的大分子复合物。补体的非受控活化可引起宿主细胞和组织的旁观者损伤。结果HF1以及其他循环和膜相关蛋白质已经发生了进化，以调节该系统(Morgan，1999)。

已经在玻璃疣中(和/或在其旁侧或覆盖其上的RPE细胞)、沿Bruch膜和/或在脉络膜内皮细胞膜上鉴定了补体组分谱(Hageman等，2001；Mullins等，2000；Mullins等，2001；Anderson等，2002；Johnson，等，2000；Johnson等，2001；Crabb等，2002；Johnson等，2002；Mullins等，1997)。它们包括末端途径补体组分、末端途径的活化特异性片段以及多种补体调节子。有证据表明细胞介导的事件也可能促进这一过程(Penfold等，2001；Seddon等，2004；Miller等，2004)。

我们现在显示HF1也是有先前AMD病史的人供体中玻璃疣的成分，其次，我们显示HF1与玻璃疣内含有淀粉状蛋白质的亚结构元件中的其配体C3b共定位，进一步提示这些结构是候选补体活化剂(Anderson等，2004；Johnson等，2002)。如C5b-9免疫反应性所示，我们还证明HF1和MAC在RPE脉络膜界面共分布，并且这些沉积物在具有先前AMD病史的供体的眼中更为活跃。最后，与同一眼中更外围的位置相比，黄斑中HF1和C5b-9免疫反应性更强。所有这些发现均与AMD病理学主要表现在黄斑中这一事实，以及Bruch膜水平的补体活化是玻璃疣形成过程中的关键要素和AMD发病机制的原因因素这一结论一致(Hageman等，2001；Anderson等，2002)。

HF1在RPE-脉络膜界面的分布与C5b-9十分相似，暗示在RPE-脉络膜界面产生并沉积了显著量的MAC。这提示与一个或多个危险HF1单元型相关的蛋白质可能经历了其弱化补体活化的正常功能的降低。因此，与AMD相关的HF1变体可能使RPE和脉络膜细胞处于旁路途径介导的补体攻击、玻璃疣形成和与后期新生血管AMD相关的Bruch膜完整性破坏的持续危险中。由于黄斑中的Bruch膜显著地薄于任何其他地方(Chong等，2005)，因此它可能更易感于其后的新生血管侵袭。由于黄斑中的Bruch膜显著地薄于外周中的Bruch膜，因此它更可能被降解到对新生血管侵袭易感的程度。

总之，本研究的结果提供了HF1常见单元型使个体易患AMD的强大证据。我们提出，调节补体级联系统旁路途径的基因中的改变与活化该系统的事件结合成为人种群中AMD的主要部分的基础。

实施例2

补体调节基因因子H(CFH)和因子H相关5(CFHR5)中的变异与II型膜性增生性肾小球肾炎(致密沉积物性肾小球肾炎)相关

引言

膜性增生性肾小球肾炎是变化很多、病因常不清楚的疾病，分别占儿童和成人肾病综合征原发性肾病因的4％和7％(Orth等，1998)。基于肾免疫病理学和超微结构研究识别了三种亚型。I型和III型膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)是免疫复合物介导疾病的变体，相反，MPGNII与免疫复合物没有已知的相关性(Appel等，2005)。

MPGNII占儿童MPGN病例中的20％以下，在成人病例中不到1％(Orth等，1998；Habib等，1975；Habib等，1987)。两种性别患病情况相等，诊断通常在存在非特异性发现如血尿、蛋白质尿、急性肾炎综合征或肾病综合征的5-15岁之间的儿童中作出(Appel等，2005)。80％以上的MPGNII患者血清C3肾炎因子(C3NeF)也为阳性，C3NeF是针对补体级联系统旁路途径转化酶C3bBb的自身抗体(Schwertz等，2001)。C3NeF可见于多至一半的I型和III型MPGN病人中，也可见于健康个体中，使肾小球基底膜(GBM)中致密沉积物的电子显微镜证明为MPGN II的确定诊断所必需(Appel等，2005)。这种形态学标志为MPGN II的特征，以致于该疾病更准确地称为致密沉积物性肾小球肾炎(MPGNII/DDD)(图12)。

MPGNII/DDD的自发性缓解并不普遍(Habib等，1975；Habib等，1987；Cameron等，1983；Barbiano di Belgiojoso等，1977)。更普遍的结果是肾功能的慢性衰退，在诊断后10年内在约一半患者中导致终末期肾脏病(ESRD)(Barbiano di Belgiojoso等，1977；Swainson等，1983)。在一些患者中，蛋白质尿的迅速波动在明显的触发事件不存在下与急性肾衰退的发作一起发生，在其他患者中，尽管有持续性的蛋白质尿，但疾病可稳定数年。

在50％以上的MPGNII/DDD患者中，C3NeF在疾病全程中持续(Schwertz等，2001)。其存在一般与补体活化的证据相关，如CH50降低、C3降低、C3dg/C3d提高和补体级联系统旁路途径的持续高水平活化。血清中最丰富(～1.2mg/ml)的补体蛋白质C3通常在称为tick-over的过程中通过其硫代酸酯的水解而经历低水平的持续自体活化。C3水解诱导大的蛋白质构象变化，使C3(H₂O)与C3的切割产物C3b相似。C3(H₂O)与因子B结合以形成C3(H₂O)Bb，其在消耗C3并产生C3bBb²的扩增环中将C3切割成C3b(图13)。

在MPGNII/DDD中，C3NeF与C3bBb(或与已装配的转化酶)结合以延长该酶的半衰期，导致持续的C3消耗，压倒了控制C3bBb水平和补体活化的正常调节机制(Appel等，2005)。正常控制包括至少7种蛋白质，其中4种存在于血清中(补体因子H(CFH)、补体因子H样蛋白质1(CFHL1)、补体因子I(CFI)和C4结合蛋白质(C4BP))，3种与细胞膜结合(膜辅因子蛋白质(MCP，CD46)、衰变加速因子(DAF，CD55)和补体受体1(CR1，CD35)(Appel等，2005；Meri等，1994；Pascual等，1994)。

与MPGNII/DDD特别相关的是因子H-因子H家族中7种蛋白质之一。在猪和小鼠中，其的缺陷与肾病的发生相关，在光学和电子显微镜水平与MPGNII/DDD类似；在人中，已在MPGNII/DDD患者中报道了其缺陷以及因子H基因的突变(Meri等，1994；Dragen-Durey等，2004；Zipfel等，2005)(图14)。

因子H家族的其他6个成员包括FHL1(因子H的剪接同种型)和不同基因编码的五种CFH相关蛋白质(CFHR1-5)。对后五种蛋白质的了解很少，尽管它们确实显示与因子H不同程度的结构相似性(Appel等，2005)。这个组中对MPGNII/DDD最有意义的是CFHR5，因为其显示与因子H最高的相似性，并且已在其他类型肾小球肾炎患者的肾活组织检查中得到证明(Appel等，2005；Murphy等，2002)。体外研究也显示V存在于接触补体攻击的表面上，提示其在补体级联系统中可能发挥作用(Murphy等，2002)。

MPGNII/DDD患者发生称为玻璃疣的眼部表型这一观察进一步强化了因子H/CFHR5与MPGNII/DDD之间可能的关系。玻璃疣由于视网膜色素上皮下，眼Bruch膜内的视网膜中异常细胞外沉积物的沉积而形成。MPGNII/DDD的玻璃疣与年龄相关性黄斑变性(AMD)中形成的玻璃疣在临床上和组成上均无法区分(Mullins等，2001；Anderson等，2002)，AMD是老年人中最常见的视觉损伤形式(Klein等，2004；van Leeuwen等，2003)。区分这两种玻璃疣类型的惟一特征是发病年龄——MPGNII/DDD的玻璃疣发生较早，经常在十至二十岁之间，而AMD的玻璃疣在老年人中发现。

四个最近的研究已经将因子的特定等位基因变体与AMD相联系，提示因子H介导的补体旁路途径调节中的细微差异可能在很大一部分AMD病例中发挥作用(Hageman等，2005；Edwards等，2005；Haines等，2005；Klein等，2005)。这些研究之一还显示MPGNII/DDD和AMD患者分离若干相同的因子H危险等位基因(Hageman等，2005)。在本研究中，我们寻求精炼因子H和CFHR5等位基因变异与MPGNII/DDD的相关性。

材料和方法

患者和对照。将活组织检查证明为MPGNII/DDD的患者在肾脏病学划分中确认，并在IRB批准的指导下纳入本研究。对照组在人种匹配但年龄不匹配的无关人中确认，其中已通过眼科检查排除了AMD。

突变筛选和分析。通过PCR扩增因子H和CFHR5的编码区和毗邻的内含子区，所述PCR为35个循环，每个循环为94℃变性、61℃退火和70℃延伸各30秒。用于扩增因子H和CFHR5编码序列的引物序列分别示于表10和11。通过琼脂糖凝胶电泳证实产物的产生，接着在MPGNII/DDD患者中对扩增子进行双向测序。通过变性高效液相层析(DHPLC)在对照群中分型在数据采掘(Ensemble数据库，dbSNP，Applied Biosystems)中鉴定的所有新的和已报道的SNP(表9和10)。简言之，在三个不同温度下进行每种扩增子的DHPLC分析。使用Wavemaker软件分析扩增子，以估计最佳温度、运行时间和乙腈梯度。以+/-2℃内的预计温度优化灵敏度并使检测到新突变的可能性尽可能大(Prasad等，2004)。

单元型分析。使用Haploview完成单元型分布的块结构构建，Haploview是Whitehead Institute开发的公用软件程序(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)(参阅Barrett等)。将两个数据库录入Excel文件，一个由每个对照的性别和基因型组成，另一个描述标志信息，包括SNP身份和染色体定位，将它们上传到Haploview程序。输出由连锁不平衡(LD)曲线和带有交换百分比的相应种群频率组成。

统计学分析。使用独立性卡方检验检测MPGNII/DDD患者与对照之间SNP频率的差异。P值≤0.05认为是显著的。使用对照群产生因子H和CFHR5的LD曲线。

结果

患者和对照。活组织检查证明为MPGNII/DDD的22名患者和无AMD的131个人参与了本研究。对照组的平均年龄为78.4岁，反映了我们排除AMD的确定标准。

因子H、CFHR5和MPGNII/DDD。在MPGNII/DDD患者组和对照群中基因分型的7种因子H SNP中的4种的等位基因频率显示与MPGNII/DDD疾病表型显著相关，p＜0.05。这些SNP包括外显子2 I62V、IVS 2-18insTT、外显子9 Y402H和外显子10 A473A。外显子7 A307A、外显子13 Q672Q和外显子18 D936E的等位基因频率在组间无显著差异(表11至13)。

在MPGNII/DDD患者组和对照群中基因分型了5种CFHR5 SNP，包括一种非同义SNP(外显子2 P46S)、两种启动子SNP(-249T＞C、-20T＞C)和两种内含子SNP(IVS1+75T＞A、IVS2+58C＞T)。三种SNP(外显子2P46S、-249T＞C和-20T＞C)的等位基因频率在组间存在显著差异，p＜0.05(表14和15)。

单元型模块(Haploblock)。单元型模块显示A307A和Y402H在因子H中连锁不平衡，而-249T＞C和-20T＞C在CFHR5中连锁不平衡(表15)。

讨论

补体旁路途径代表针对病原体保护人的精妙系统。其主要心组分C3以高浓度在血浆中循环，并遍布在体液中(Walport，2001)。其活化产生损伤外源表面并导致微生物清除的毒性局部环境。为了防止无限制的补体活化，宿主细胞和组织表面使用表面附着及膜结合的补体调节子下调扩增环。一些宿主细胞以高拷贝数表达单个膜结合调节子，而其他细胞表达若干膜结合调节子并且附着可溶性流体相调节子。少数组织缺少膜结合调节子，仅依赖可溶性调节子的附着(Appel等，2005)。

在肾中，内皮和系膜细胞表达两种膜结合补体调节子MCP和DAF(van den Dobbelsteen等，1994；Timmerman等，1996)。足细胞表达四种：MCP、DAF、CF1和CD59。系膜细胞和足细胞还分泌可溶性调节子，因子H，其在膜性肾病中应答于补体活化和炎症而上调(Angaku等，1998；Bao等，2002)。因子H通过与分泌系膜细胞和足细胞直接结合而以自分泌方式发挥作用。

相反，GBM是独特的。其缺乏内源性膜结合调节子以保护其免受补体介导的损伤，然而，其高度负电性表面结合并吸附因子H(Zipfel等，2005)。GBM对局部补体控制中因子H的依赖性与较少数MPGNII/DDD病人中发现因子H病理性突变一致(Ault等，1997；Dragen-Durey等，2004)。

我们鉴定因子H和CFHR5的若干等位基因变体与MPGNII/DDD相关的数据与补体控制在该疾病的发病机制中发挥作用这一假说一致。我们的数据与已报道AMD数据的比较提供了额外的支持，因为我们观察到的因子H中每种已鉴定的危险SNP的等位基因频率在MPGNII/DDD患者组中都高于AMD患者组，有力的证据将因子H与AMD相联系(Hageman等，2005；Edwards等，2005；Haines等，2005；Klein等，2005)。尽管还不知道因子H中外显子2和9的氨基酸变化是否影响功能，但这些变化可见于与C3b和肝素相互作用的结构域中，并且C3b/C3d及肝素结合的差异已经用因子H中的若干氨基酸的变化证明，所述因子H与另一种肾病，非典型性溶血性尿毒症综合征相关(Manuelian等，2003)(表12和13)。

除了因子H以外，因子H相关家族中其他成员的功能多数未知，其表达模式也未探索过，然而CFHR5的研究已经显示其具有与因子H相似的特性，包括与肝素、CRP和C3b结合(Murphy等，2002)(图14)。这种相似性提示与因子H一样，CFHR5可能在MPGNII/DDD中发挥作用。与此一致的是我们发现CFHR5在来自两名MPGNII/DDD患者的肾活组织检查中的表达(数据未显示)。

我们的基因分型数据显示一些CFHR5等位基因变体与MPGNII/DDD疾病表型优先关联。包括了可以影响转录的CFHR5启动子区中的两种SNP，所述影响一种是通过移除C/EBPβ结合位点，另一种通过加入GATA-1结合位点。另一显著的相关性将外显子2中的脯氨酸改变为丝氨酸。由于CFHR5的外显子1和2编码与因子H短共有重复序列6(SCR6)同源的结构域，所述结构域在肝素和CRP结合之内，因此这种改变可能影响补体活化和控制。

实施例3

产生保护性形式的因子H蛋白质

基于单元型H2制备人补体因子H(CFH)的示例性保护性形式(图5)。简言之，从四名供体的眼组织(RPE/脉络膜复合物)中分离RNA。使用以下引物通过逆转录-聚合酶链式反应扩增RNA：

5’-GAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAG-3’[SEQ ID NO：331]

5’-AAGTTCTGAATAAAGGTGTGC-3’[SEQ ID NO：332].

如生产商(Invitrogen，Carlsbad，CA)所述，用Platinum Taq使用Superscript III One-Step High Fidelity进行RT-PCR反应。从琼脂糖凝胶上切下大小正确的产物(3769bp)并使用离心柱分离。

如生产商(Invitrogen)的推荐，在载体pCR2.1-TOPO中使用TOPO-TA克隆系统克隆PCR产物。通过直接测序确定来自四名患者中每一名的克隆的完整遗传序列。相对于示例性保护性参照序列(H2)，来自一名患者(患者#498-01)的DNA中核苷酸多态性的数目最少，尽管该DNA编码第402位氨基酸处的危险序列(组氨酸)，并编码第62位氨基酸处的缬氨酸。为了制备编码CFH保护性形式的基因，我们使用QuikChange诱变系统(Stratagene，La Jolla，CA)改变编码氨基酸62的碱基以使其编码异亮氨酸，改变第402位的碱基以使其编码酪氨酸，产生SEQ ID NO：335。该蛋白质的第1210位氨基酸为精氨酸。使用的寡核苷酸如下(加上正确的反义形式)：

62：5’-TATAGATCTCTTGGAAATATAATAATGGTATGCAGG-3’[SEQ ID NO：333]

402：5’-ATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTAC-3’[SEQ ID NO：334]

通过直接测序完整基因来确认所引入突变的保真性。将得到的保护性基因克隆进在巨细胞病毒启动子控制下的真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。使用Exgen 500转染试剂(Fermentas，Hanover，MD)将这种表达载体转染进人肺癌细胞系A549(ATCC，Manassas，VA)。转染后，在无血清培养基(Hybridoma-SFM，Invitrogen)中培养细胞。

在转染后48小时收集上清液，并进行Western印迹分析。使用针对人CFH的单克隆抗体和多克隆抗体(Quidel，SanDiego，CA)确认大小正确(约150kDa)的产物的存在。

患者#498-01(62I，402Y)CFH基因[SEQ IDNO：335]

表5

SSCP、DHPLC和测序引物

外显子	区域	正向引物(5′-3′)	SEQ IDNO：	反向引物(5′-3′)	SEQ IDNo：
						1	5′上游-int1	GCAAAAGTTTCTGATAGGC	64	AATCTTACCTTCTGCTACAC	65
2	int-int2	TTAGATAGACCTGTGACTG	66	TCAGGCATAATTGCTAC	67
						3	int2-int3	ACTTGTTCCCCCACTC	68	CCTCTTTTCGTATGGACTAC	69
	int2-ex3	TTGTTCCCCCACTCCTAC	70	ACACATTTTCCTCCTGTAAGG	71
							ex3-int3	CCCTGTGGACATCCTGG	72	AACCTCTTTTCGTATGGACTAC	73
4	int3-ex4	ATGCTGTTCATTTTCC	74	CCATCCATCTGTGTCAC	75
							ex4-int4	ATTACCGTGAATGTGAC	76	TTGTATGAGAAAAAAAAAC	77
5	int4-int5	TCCAATCTTATCCTGAGG	78	TCTTACCCACACACTTTG	79
						6	int5-ex6	GTCCTGGTCACAGTCC	80	GCATACAGCATCTCCTC	81
	ex6-int6	GCACTGAATCTGGATG	82	ATGAACCTTGAACACAG	83
						7	int6-ex7	CGGATACTTATTTCTGC	84	CGTGATTCATCTCCAG	85
	ex7-int7	AGAACTGGAGATGAAATC	86	TGAATGGAACTTACAGG	87
						8	int7-ex8	GTGAAACCTTGTGATTATC	88	TCCCAGTAACTTCCTG	89
	ex8-int8	CTGTGATGAACATTTTGAG	90	TGCTCTCCTTTCTTCG	91
						9	int8-int9	CATTGTTATGGTCCTTAGG	92	ACATGCTAGGATTTCAGAG	93
10	int9-ex9	CTTTTTCTTATTCTCTTCCC	94	TCACCATCTGCTGTTAC	95
							ex9-int10	TGTAACAGCAGATGGTG	96	CCCACAAAAAGACTAAAG	97
11	int10-ex11	GGGAAATACTCAGATTG	98	ATGGCATTCATAGTCC	99
							ex11-ex11	CCAGAACTAAAAATGACTTC	100	GGTAAATCAGACCAACC	101
	ex11-int11	ATAGTGTGTGGTTACAATG	102	GTTTATGTCAAATCAGGAG	103
						12	int11-int12	CAAGAAAGAGAATGCGAAC	104	AGATTACAGGCAATGGG	105
13	int12-ex13	TTGATTGTTTAGGATGC	106	TTGAGGAGTTCAGGAGGTGG	107
							ex13-int13	CTGAACTCCTCAATGG	108	ATTACCAATACACACTGG	109
14	int13-int14	TTACATAGTGGAGGAGAG	110	TGGAAATGTTGAGGC	111
						15	int14-int15	AGTTGGTTTGATTCCTATC	112	TTGAGCAGTTCACTTCTG	113
16	int15-ex16	TTATGCCCACCTCCAC	114	ATACACTACTGACCAACAC	115
							ex16-int16	GTCTATGAGAATACAAGCC	116	GAATCTGAGGTGGAGG	117
17	int16-ex17	CCCTTTGATTTTCATTC	118	AGAACTCCATTTTCCC	119
							ex17-int17	CACAACCACCTCAGATAG	120	GCCTAACCTTCACACTG	121
18	int17-ex18	GTCATAGTAGCTCCTGTATTG	122	ACGTAACTTCTTCTCCATAC	123
							ex18-int18	CTTCCTTGTAAATCTCCAC	124	CAATGCACCATACTTATGC	125
19	int18-ex19	TAAAGATTTGCGGAAC	126	GGCTCCATCCATTTTG	127
							ex19-int19	TTACAAAATGGATGGAG	128	AAGTGCTGGGATTACAGGCG	129
20	int19-ex20	CTACTCAAAATGAACACTAGG	130	TTTAACCCTGCTATACTCC	131
							ex20-int20	TAAATGGAAACTGGACG	132	ACCCTATTACTTGTGTTCTG	133
21	int20-int21	GTGTTTGCGTTTGCC	134	GAGATTTTTCCAGCCAC	135
						22	int21-ex22	TCTCACACATTGCGAAC	136	ACCGTTAGTTTTCCAGG	137
	ex22-3′下游	GGTTTGGATAGTGTTTTGAG	138	ATGTTGTTCGCAATGTG	139

表8

因子H二倍型

G、A、T、C是指在指示的多态性上的核苷酸。S、L是指内含子2多态性的短和长(插入2个T核苷酸)等位基因。

表9

用来扩增因子H编码序列的引物

表10

用来扩增CFHR5编码序列的引物

表12

相对于对照22名MPGNII患者中因子H的SNP频率比较

(作为fl和f2给出的等位基因频率)

SNP	f1MPGNII	f2MPGNII	f1对照	f2对照	P-值
						外显子2I62V	42(G)	2(A)	202(G)	60(A)	0.0051
IVS2-18insTT	42(short)	2(long)	194(short)	68(long)	0.0018
						外显子7A307A	16(C)	28(A)	88(A)	174(C)	0.72
外显子9Y402H	28(H)	16(Y)	88(H)	174(Y)	0.00014
						外显子10A473A	40(G)	4(A)	74(G)	62(A)	0.000013
外显子13Q672Q	35(A)	9(G)	217(A)	41(G)	0.45
						外显子18D936E	35(D)	9(E)	115(D)	19(E)	0.32

表13

与MPGNII相关的编码SNP和因子H相关的短共有重复序列

SNP	SCR	SCR功能
			外显子2I62V	1	与C3b相互作用
外显子9Y402H	7	结合肝素与C反应蛋白质相互作用
			外显子10A473A	8	与C反应蛋白质相互作用

表15

相对于对照22名MPGNII患者中CFHR5的SNP频率比较

(作为f1和f2给出的等位基因频率)

SNP	f1MPGNII	f2MPGNII	f1对照	f2对照	P-值
						启动子-249T＞C	43(T)	1(C)	178(G)	28(A)	0.033
启动子-20T＞C	43(T)	1(C)	178(G)	28(A)	0.033
						IVS1+75T＞A	37(T)	7(A)	161(A)	41(C)	0.38
外显子2P46S	41(P)	3(S)	205(P)	1(S)	0.00023
						IVS2+58C＞T	37(C)	7(T)	158(C)	28(T)	0.28

XV参考文献

就上述作者和数据引用的参考文献在下文中提供完整引用。

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尽管本发明已经参考具体实施方案进行了详细描述，本领域技术人员应该认识到，改良和改善在如下文权利要求所阐述的本发明范围和精神之内。本文引用的所有出版物和专利文献均引入本文为参考，如同每一篇出版物或文献均特别且单独指出引入本文为参考。引用出版物和专利文献(专利、公开的专利申请和未公开的专利申请)并不意在承认任一这些文献是适当的现有技术，也不构成对其内容或数据的承认。本发明现已以书面说明的方式描述，本领域技术人员将会认识到，本发明可以以多种实施方案实行，上述描述用于说明目的，而非限制以下权利要求。

序列表

<110>爱荷华大学研究基金会

<120>治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂

<130>020618-001220CN

<140>CN 0000000

<141>2006-02-14

<150>WO PCT/US2006/005313

<151>2006-02-14

<150>US 60/650,078

<151>2005-02-14

<150>US 60/717,861

<151>2005-09-09

<150>US 60/735,697

<151>2005-11-09

<160>337

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>3926

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

aattcttgga agaggagaac tggacgttgt gaacagagtt agctggtaaa tgtcctctta    60

aaagatccaa aaaatgagac ttctagcaaa gattatttgc cttatgttat gggctatttg    120

tgtagcagaa gattgcaatg aacttcctcc aagaagaaat acagaaattc tgacaggttc    180

ctggtctgac caaacatatc cagaaggcac ccaggctatc tataaatgcc gccctggata    240

tagatctctt ggaaatgtaa taatggtatg caggaaggga gaatgggttg ctcttaatcc    300

attaaggaaa tgtcagaaaa ggccctgtgg acatcctgga gatactcctt ttggtacttt    360

tacccttaca ggaggaaatg tgtttgaata tggtgtaaaa gctgtgtata catgtaatga    420

ggggtatcaa ttgctaggtg agattaatta ccgtgaatgt gacacagatg gatggaccaa    480

tgatattcct atatgtgaag ttgtgaagtg tttaccagtg acagcaccag agaatggaaa    540

aattgtcagt agtgcaatgg aaccagatcg ggaataccat tttggacaag cagtacggtt    600

tgtatgtaac tcaggctaca agattgaagg agatgaagaa atgcattgtt cagacgatgg    660

tttttggagt aaagagaaac caaagtgtgt ggaaatttca tgcaaatccc cagatgttat    720

aaatggatct cctatatctc agaagattat ttataaggag aatgaacgat ttcaatataa    780

atgtaacatg ggttatgaat acagtgaaag aggagatgct gtatgcactg aatctggatg    840

gcgtccgttg ccttcatgtg aagaaaaatc atgtgataat ccttatattc caaatggtga    900

ctactcacct ttaaggatta aacacagaac tggagatgaa atcacgtacc agtgtagaaa    960

tggtttttat cctgcaaccc ggggaaatac agccaaatgc acaagtactg gctggatacc    1020

tgctccgaga tgtaccttga aaccttgtga ttatccagac attaaacatg gaggtctata    1080

tcatgagaat atgcgtagac catactttcc agtagctgta ggaaaatatt actcctatta    1140

ctgtgatgaa cattttgaga ctccgtcagg aagttactgg gatcacattc attgcacaca    1200

agatggatgg tcgccagcag taccatgcct cagaaaatgt tattttcctt atttggaaaa    1260

tggatataat caaaatcatg gaagaaagtt tgtacagggt aaatctatag acgttgcctg    1320

ccatcctggc tacgctcttc caaaagcgca gaccacagtt acatgtatgg agaatggctg    1380

gtctcctact cccagatgca tccgtgtcaa aacatgttcc aaatcaagta tagatattga    1440

gaatgggttt atttctgaat ctcagtatac atatgcctta aaagaaaaag cgaaatatca    1500

atgcaaacta ggatatgtaa cagcagatgg tgaaacatca ggatcaatta gatgtgggaa    1560

agatggatgg tcagctcaac ccacgtgcat taaatcttgt gatatcccag tatttatgaa    1620

tgccagaact aaaaatgact tcacatggtt taagctgaat gacacattgg actatgaatg    1680

ccatgatggt tatgaaagca atactggaag caccactggt tccatagtgt gtggttacaa    1740

tggttggtct gatttaccca tatgttatga aagagaatgc gaacttccta aaatagatgt    1800

acacttagtt cctgatcgca agaaagacca gtataaagtt ggagaggtgt tgaaattctc    1860

ctgcaaacca ggatttacaa tagttggacc taattccgtt cagtgctacc actttggatt    1920

gtctcctgac ctcccaatat gtaaagagca agtacaatca tgtggtccac ctcctgaact    1980

cctcaatggg aatgttaagg aaaaaacgaa agaagaatat ggacacagtg aagtggtgga    2040

atattattgc aatcctagat ttctaatgaa gggacctaat aaaattcaat gtgttgatgg    2100

agagtggaca actttaccag tgtgtattgt ggaggagagt acctgtggag atatacctga    2160

acttgaacat ggctgggccc agctttcttc ccctccttat tactatggag attcagtgga    2220

attcaattgc tcagaatcat ttacaatgat tggacacaga tcaattacgt gtattcatgg    2280

agtatggacc caacttcccc agtgtgtggc aatagataaa cttaagaagt gcaaatcatc    2340

aaatttaatt atacttgagg aacatttaaa aaacaagaag gaattcgatc ataattctaa    2400

cataaggtac agatgtagag gaaaagaagg atggatacac acagtctgca taaatggaag    2460

atgggatcca gaagtgaact gctcaatggc acaaatacaa ttatgcccac ctccacctca    2520

gattcccaat tctcacaata tgacaaccac actgaattat cgggatggag aaaaagtatc    2580

tgttctttgc caagaaaatt atctaattca ggaaggagaa gaaattacat gcaaagatgg    2640

aagatggcag tcaataccac tctgtgttga aaaaattcca tgttcacaac cacctcagat    2700

agaacacgga accattaatt catccaggtc ttcacaagaa agttatgcac atgggactaa    2760

attgagttat acttgtgagg gtggtttcag gatatctgaa gaaaatgaaa caacatgcta    2820

catgggaaaa tggagttctc cacctcagtg tgaaggcctt ccttgtaaat ctccacctga    2880

gatttctcat ggtgttgtag ctcacatgtc agacagttat cagtatggag aagaagttac    2940

gtacaaatgt tttgaaggtt ttggaattga tgggcctgca attgcaaaat gcttaggaga    3000

aaaatggtct caccctccat catgcataaa aacagattgt ctcagtttac ctagctttga    3060

aaatgccata cccatgggag agaagaagga tgtgtataag gcgggtgagc aagtgactta    3120

cacttgtgca acatattaca aaatggatgg agccagtaat gtaacatgca ttaatagcag    3180

atggacagga aggccaacat gcagagacac ctcctgtgtg aatccgccca cagtacaaaa    3240

tgcttatata gtgtcgagac agatgagtaa atatccatct ggtgagagag tacgttatca    3300

atgtaggagc ccttatgaaa tgtttgggga tgaagaagtg atgtgtttaa atggaaactg    3360

gacggaacca cctcaatgca aagattctac aggaaaatgt gggccccctc cacctattga    3420

caatggggac attacttcat tcccgttgtc agtatatgct ccagcttcat cagttgagta    3480

ccaatgccag aacttgtatc aacttgaggg taacaagcga ataacatgta gaaatggaca    3540

atggtcagaa ccaccaaaat gcttacatcc gtgtgtaata tcccgagaaa ttatggaaaa    3600

ttataacata gcattaaggt ggacagccaa acagaagctt tattcgagaa caggtgaatc    3660

agttgaattt gtgtgtaaac ggggatatcg tctttcatca cgttctcaca cattgcgaac    3720

aacatgttgg gatgggaaac tggagtatcc aacttgtgca aaaagataga atcaatcata    3780

aagtgcacac ctttattcag aactttagta ttaaatcagt tctcaatttc attttttatg    3840

tattgtttta ctccttttta ttcatacgta aaattttgga ttaatttgtg aaaatgtaat    3900

tataagctga gaccggtggc tctctt                                         3926

<210>2

<211>1231

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

             20                  25                  30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

         35                  40                  45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met

    50                  55                  60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65                  70                  75                  80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

            100                 105                 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

        115                 120                 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

    130                 135                 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

                165                 170                 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

            180                 185                 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

        195                 200                 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

    210                 215                 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225                 230                 235                 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

                245                 250                 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

            260                 265                 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

        275                 280                 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

    290                 295                 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

                325                 330                 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

            340                 345                 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

        355                 360                 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

    370                 375                 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385                 390                 395                 400

Asn His Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

                405                 410                 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

            420                 425                 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

        435                 440                 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

    450                 455                 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465                 470                 475                 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Arg Cys Gly Lys

                485                 490                 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

            500                 505                 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

        515                 520                 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

    530                 535                 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545                 550                 555                 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

                565                 570                 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

            580                 585                 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

        595                 600                 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

    610                 615                 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625                 630                 635                 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

                645                 650                 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

            660                 665                 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

        675                 680                 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

    690                 695                 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705                 710                 715                 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

                725                 730                 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

            740                 745                 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

        755                 760                 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

    770                 775                 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785                 790                 795                 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

                805                 810                 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

            820                 825                 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

        835                 840                 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

    850                 855                 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865                 870                 875                 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

                885                 890                 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

            900                 905                 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

        915                 920                 925

Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His

    930                 935                 940

Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe

945                 950                 955                 960

Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu

                965                 970                 975

Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu

            980                 985                 990

Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro  Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr

        995                 1000                 1005

Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys

    1010                1015                1020

Met Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr

    1025                1030                1035

Gly Arg Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr

    1040                1045                1050

Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro

    1055                1060                1065

Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met

    1070                1075                1080

Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu

    1085                1090                1095

Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro

    1100                1105                1110

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr

    1115                1120                1125

Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln

    1130                1135                1140

Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln Trp Ser

    1145                1150                1155

Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile

    1160                1165                1170

Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys

    1175                1180                1185

Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg

    1190                1195                1200

Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys

    1205                1210                1215

Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg

    1220                1225                1230

<210>3

<211>1658

<212>DNA

<213>人

<400>3

aattcttgga agaggagaac tggacgttgt gaacagagtt agctggtaaa tgtcctctta    60

aaagatccaa aaaatgagac ttctagcaaa gattatttgc cttatgttat gggctatttg    120

tgtagcagaa gattgcaatg aacttcctcc aagaagaaat acagaaattc tgacaggttc    180

ctggtctgac caaacatatc cagaaggcac ccaggctatc tataaatgcc gccctggata    240

tagatctctt ggaaatgtaa taatggtatg caggaaggga gaatgggttg ctcttaatcc    300

attaaggaaa tgtcagaaaa ggccctgtgg acatcctgga gatactcctt ttggtacttt    360

tacccttaca ggaggaaatg tgtttgaata tggtgtaaaa gctgtgtata catgtaatga    420

ggggtatcaa ttgctaggtg agattaatta ccgtgaatgt gacacagatg gatggaccaa    480

tgatattcct atatgtgaag ttgtgaagtg tttaccagtg acagcaccag agaatggaaa    540

aattgtcagt agtgcaatgg aaccagatcg ggaataccat tttggacaag cagtacggtt    600

tgtatgtaac tcaggctaca agattgaagg agatgaagaa atgcattgtt cagacgatgg    660

tttttggagt aaagagaaac caaagtgtgt ggaaatttca tgcaaatccc cagatgttat    720

aaatggatct cctatatctc agaagattat ttataaggag aatgaacgat  ttcaatataa   780

atgtaacatg ggttatgaat acagtgaaag aggagatgct gtatgcactg aatctggatg    840

gcgtccgttg ccttcatgtg aagaaaaatc atgtgataat ccttatattc caaatggtga    900

ctactcacct ttaaggatta aacacagaac tggagatgaa atcacgtacc agtgtagaaa    960

tggtttttat cctgcaaccc ggggaaatac agccaaatgc acaagtactg gctggatacc    1020

tgctccgaga tgtaccttga aaccttgtga ttatccagac attaaacatg gaggtctata    1080

tcatgagaat atgcgtagac catactttcc agtagctgta ggaaaatatt actcctatta    1140

ctgtgatgaa cattttgaga ctccgtcagg aagttactgg gatcacattc attgcacaca    1200

agatggatgg tcgccagcag taccatgcct cagaaaatgt tattttcctt atttggaaaa    1260

tggatataat caaaattatg gaagaaagtt tgtacagggt aaatctatag acgttgcctg    1320

ccatcctggc tacgctcttc caaaagcgca gaccacagtt acatgtatgg agaatggctg    1380

gtctcctact cccagatgca tccgtgtcag ctttaccctc tgaacttctg atcgaaggtc    1440

atccctctcc agcttgagtg gatcaaagat gacaagggcc aatggaacca agtttgagtc    1500

ttgccaggtc aatacttggg tcctgagtat ggtgactagt atctgttttg ttatgtgtgt    1560

attattccag ccagaatggg aaatgctaat tcagctcctc caggcagcca atggggctgg    1620

tggctttgag attattaaac tcttctggat cctctacg                            1658

<210>4

<211>449

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

            20                  25                  30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

        35                  40                  45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met

    50                  55                  60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65                  70                  75                  80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

            100                 105                 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

        115                 120                 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

    130                 135                 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

    165                 170                 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

            180                 185                 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

        195                 200                 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

    210                 215                 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225                 230                 235                 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

                245                 250                 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

            260                 265                 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

        275                 280                 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

    290                 295                 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

                325                 330                 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

            340                 345                 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

        355                 360                 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

    370                 375                 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385                 390                 395                 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

                405                 410                 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

            420                 425                 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Ser Phe Thr

        435                 440                 445

Leu

<210>5

<211>1231

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的因子H变体

<400>5

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

                20                  25                  30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

            35                  40                  45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met

        50                  55                  60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65                  70                  75                  80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

            100                 105                 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

        115                 120                 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

    130                 135                 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

                165                 170                 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

            180                 185                 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

        195                 200                 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

    210                 215                 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225                 230                 235                 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

                245                 250                 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

            260                 265                 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

        275                 280                 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

    290                 295                 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

                325                 330                 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

            340                 345                 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

        355                 360                 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

    370                 375                 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385                 390                 395                 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

                405                 410                 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

            420                 425                 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

        435                 440                 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

    450                 455                 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465                 470                 475                 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Arg Cys Gly Lys

                485                 490                 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

            500                 505                 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

        515                 520                 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

    530                 535                 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545                 550                 555                 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

                565                 570                 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

            580                 585                 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

        595                 600                 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

    610                 615                 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625                 630                 635                 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

                645                 650                 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

            660                 665                 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

        675                 680                 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

    690                 695                 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705                 710                 715                 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

                725                 730                 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

            740                 745                 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

        755                 760                 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

    770                 775                 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785                 790                 795                 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

                805                 810                 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

            820                 825                 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

        835                 840                 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

    850                 855                 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865                 870                 875                 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

                885                 890                 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

            900                 905                 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

        915                 920                 925

Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His

    930                 935                 940

Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe

945                 950                 955                 960

Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu

                965                 970                 975

Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu

            980                 985                 990

Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr

        995                 1000                1005

Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys

    1010                1015                1020

Met Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr

    1025                1030                1035

Gly Arg Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr

    1040                1045                1050

Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro

    1055                1060                1065

Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met

    1070                1075                1080

Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu

    1085                1090                1095

Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro

    1100                1105                1110

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr

    1115                1120                1125

Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln

    1130                1135                1140

Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Ash Gly Gln Trp Ser

    1145                1150                1155

Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile

    1160                1165                1170

Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys

    1175                1180                1185

Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg

    1190                1195                1200

Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys

    1205                1210                1215

Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg

    1220                1225                1230

<210>6

<211>449

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的截短因子H变体

<400>6

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

            20                  25                  30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

        35                  40                  45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met

    50                  55                  60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65                  70                  75                  80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

            100                 105                 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

        115                 120                 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

    130                 135                 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

                165                 170                 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

            180                 185                 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

        195                 200                 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

    210                 215                 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225                 230                 235                 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

                245                 250                 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

            260                 265                 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

        275                 280                 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

    290                 295                 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

                325                 330                 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

            340                 345                 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

        355                 360                 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

    370                 375                 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385                 390                 395                 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

                405                 410                 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

            420                 425                 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Ser Phe Thr

        435                 440                 445

Leu

<210>7

<211>2823

<212>DNA

<213>人

<400>7

ggcaggtgct tgttactgtt aatgaaagca gatttaaagc aacaccacca tcactggagt    60

atttttagtt atatacgatt gagactacca agcatgttgc tcttattcag tgtaatccta    120

atctcatggg tatccactgt tgggggagaa ggaacacttt gtgattttcc aaaaatacac    180

catggatttc tgtatgatga agaagattat aacccttttt cccaagttcc tacaggggaa    240

gttttctatt actcctgtga atataatttt gtgtctcctt caaaatcctt ttggactcgc    300

ataacatgca cagaagaagg atggtcacca acaccgaagt gtctcagaat gtgttccttt    360

ccttttgtga aaaatggtca ttctgaatct tcaggactaa tacatctgga aggtgatact    420

gtacaaatta tttgcaacac aggatacagc cttcaaaaca atgagaaaaa catttcgtgt    480

gtagaacggg gctggtccac tcctcccata tgcagcttca ctaaaggaga atgtcatgtt    540

ccaattttag aagccaatgt agatgctcag ccaaaaaaag aaagctacaa agttggagac    600

gtgttgaaat tctcctgcag aaaaaatctt ataagagttg gatcagactc agttcaatgt    660

taccaatttg ggtggtcacc taactttcca acatgcaaag gacaagtacg atcatgtggt    720

ccacctcctc aactctccaa tggtgaagtt aaggagataa gaaaagagga atatggacac    780

aatgaagtag tggaatatga ttgcaatcct aattttataa taaacgggcc taagaaaata    840

caatgtgtgg atggagaatg gacaacttta cccacttgtg ttgaacaagt gaaaacatgt    900

ggatacatac ctgaactcga gtacggttat gttcagccgt ctgtccctcc ctatcaacat    960

ggagtttcag tcgaggtgaa ttgcagaaat gaatatgcaa tgattggaaa taacatgatt    1020

acctgtatta atggaatatg gacagagctt cctatgtgtg ttgcaacaca ccaacttaag    1080

aggtgcaaaa tagcaggagt taatataaaa acattactca agctatctgg gaaagaattt    1140

aatcataatt ctagaatacg ttacagatgt tcagacatct tcagatacag gcactcagtc    1200

tgtataaacg ggaaatggaa tcctgaagta gactgcacag aaaaaaggga acaattctgc    1260

ccaccgccac ctcagatacc taatgctcag aatatgacaa ccacagtgaa ttatcaggat    1320

ggagaaaaag tagctgttct ctgtaaagaa aactatctac ttccagaagc aaaagaaatt    1380

gtatgtaaag atggacgatg gcaatcatta ccacgctgtg ttgagtctac tgcatattgt    1440

gggccccctc catctattaa caatggagat accacctcat tcccattatc agtatatcct    1500

ccagggtcaa cagtgacgta ccgttgccag tccttctata aactccaggg ctctgtaact    1560

gtaacatgca gaaataaaca gtggtcagaa ccaccaagat gcctagatcc atgtgtggta    1620

tctgaagaaa acatgaacaa aaataacata cagttaaaat ggagaaacga tggaaaactc    1680

tatgcaaaaa caggggatgc tgttgaattc cagtgtaaat tcccacataa agcgatgata    1740

tcatcaccac catttcgagc aatctgtcag gaagggaaat ttgaatatcc tatatgtgaa    1800

tgaagcaagc ataattttcc tgaatatatt cttcaaacat ccatctacgc taaaagtagc    1860

cattatgtag ccaattctgt agttacttct tttattcttt caggtgttgt ttaactcagt    1920

tttatttaga actctggatt tttagagctt tagaaatttg taagctgaga gaacaatgtt    1980

tcacttaata ggagggtgtc ttagtccata ttacattgtt ataacagagt atcacagact    2040

ggataacttc taaccaatag tttatttgtt tcataaatct aaaagctgag aagtccaaga    2100

tggtggggct gcctctggtg agggtcttct cgaagcatca taatatgctg gaaggcatca    2160

caacatggtg gaagggatca cgtggcaaaa gagcatgtac atgggagtga gagaaaaaga    2220

gagagagaga cagagtggcg ggggccgggg aggagcgcaa actcatcctt tataaagaca    2280

ccactcctga gataacaatc caatcccatg ataatgacat taatccattc aagaagatag    2340

agctctcgtg acttaatcac cttctaaaga tctcacctga caacactgtt gcattggcag    2400

ttaagtttcc acgtaaactt tcggggacac attcaaacca caggagaaac tcaaattgtt    2460

cctgggcaaa tcacaacatg gggaatttta ttcataaatg tccacagaaa cagtaaatgt    2520

tctcgcttca gaacttaatt catctaatcc ctcctgtttg tctcaaatta taggataact    2580

ttgaaacttt ctgaattaac gttatttaaa aggaaatgta gatgttattt tagtctctat    2640

cttcaggtta ttatcactta aaaacctgcg aaagctgtca acttttgtgg ttgtagcaag    2700

tattaataaa tatttataaa tcctctaatg taagtctagc tacctatcca atactaaata    2760

ccccttaaag tattaaatgc actatctgct gtaaacggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    2820

aaa                                                                  2823

<210>8

<211>569

<212>PRT

<213>人

<400>8

Met Leu Leu Leu Phe Ser Val Ile Leu Ile Ser Trp Val Ser Thr Val

1               5                   10                  15

Gly Gly Glu Gly Thr Leu Cys Asp Phe Pro Lys Ile His His Gly Phe

            20                  25                  30

Leu Tyr Asp Glu Glu Asp Tyr Asn Pro Phe Ser Gln Val Pro Thr Gly

        35                  40                  45

Glu Val Phe Tyr Tyr Ser Cys Glu Tyr Asn Phe Val Ser Pro Ser Lys

    50                  55                  60

Ser Phe Trp Thr Arg Ile Thr Cys Thr Glu Glu Gly Trp Ser Pro Thr

65                  70                  75                  80

Pro Lys Cys Leu Arg Met Cys Ser Phe Pro Phe Val Lys Asn Gly His

                85                  90                  95

Ser Glu Ser Ser Gly Leu Ile His Leu Glu Gly Asp Thr Val Gln Ile

            100                 105                 110

Ile Cys Asn Thr Gly Tyr Ser Leu Gln Asn Asn Glu Lys Asn Ile Ser

        115                 120                 125

Cys Val Glu Arg Gly Trp Ser Thr Pro Pro Ile Cys Ser Phe Thr Lys

    130                 135                 140

Gly Glu Cys His Val Pro Ile Leu Glu Ala Asn Val Asp Ala Gln Pro

145                 150                 155                 160

Lys Lys Glu Ser Tyr Lys Val Gly Asp Val Leu Lys Phe Ser Cys Arg

                165                 170                 175

Lys Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Asp Ser Val Gln Cys Tyr Gln Phe

            180                 185                 190

Gly Trp Ser Pro Asn Phe Pro Thr Cys Lys Gly Gln Val Arg Ser Cys

        195                 200                 205

Gly Pro Pro Pro Gln Leu Ser Asn Gly Glu Val Lys Glu Ile Arg Lys

    210                 215                 220

Glu Glu Tyr Gly His Asn Glu Val Val Glu Tyr Asp Cys Asn Pro Asn

225                 230                 235                 240

Phe Ile Ile Asn Gly Pro Lys Lys Ile Gln Cys Val Asp Gly Glu Trp

                245                 250                 255

Thr Thr Leu Pro Thr Cys Val Glu Gln Val Lys Thr Cys Gly Tyr Ile

            260                 265                 270

Pro Glu Leu Glu Tyr Gly Tyr Val Gln Pro Ser Val Pro Pro Tyr Gln

        275                 280                 285

His Gly Val Ser Val Glu Val Asn Cys Arg Asn Glu Tyr Ala Met Ile

    290                 295                 300

Gly Asn Asn Met Ile Thr Cys Ile Asn Gly Ile Trp Thr Glu Leu Pro

305                 310                 315                 320

Met Cys Val Ala Thr His Gln Leu Lys Arg Cys Lys Ile Ala Gly Val

                325                 330                 335

Asn Ile Lys Thr Leu Leu Lys Leu Ser Gly Lys Glu Phe Asn His Asn

            340                 345                 350

Ser Arg Ile Arg Tyr Arg Cys Ser Asp Ile Phe Arg Tyr Arg His Ser

        355                 360                 365

Val Cys Ile Asn Gly Lys Trp Asn Pro Glu Val Asp Cys Thr Glu Lys

    370                 375                 380

Arg Glu Gln Phe Cys Pro Pro Pro Pro Gln Ile Pro Asn Ala Gln Asn

385                 390                 395                 400

Met Thr Thr Thr Val Asn Tyr Gln Asp Gly Glu Lys Val Ala Val Leu

                405                 410                 415

Cys Lys Glu Asn Tyr Leu Leu Pro Glu Ala Lys Glu Ile Val Cys Lys

            420                 425                 430

Asp Gly Arg Trp Gln Ser Leu Pro Arg Cys Val Glu Ser Thr Ala Tyr

        435                 440                 445

Cys Gly Pro Pro Pro Ser Ile Asn Asn Gly Asp Thr Thr Ser Phe Pro

    450                 455                 460

Leu Ser Val Tyr Pro Pro Gly Ser Thr Val Thr Tyr Arg Cys Gln Ser

465                 470                 475                 480

Phe Tyr Lys Leu Gln Gly Ser Val Thr Val Thr Cys Arg Asn Lys Gln

                485                 490                 495

Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys Leu Asp Pro Cys Val Val Ser Glu Glu

            500                 505                 510

Asn Met Asn Lys Asn Asn Ile Gln Leu Lys Trp Arg Asn Asp Gly Lys

        515                 520                 525

Leu Tyr Ala Lys Thr Gly Asp Ala Val Glu Phe Gln Cys Lys Phe Pro

    530                 535                 540

His Lys Ala Met Ile Ser Ser Pro Pro Phe Arg Ala Ile Cys Gln Glu

545                 550                 555                 560

Gly Lys Phe Glu Tyr Pro Ile Cys Glu

                565

<210>9

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>9

ggggttttct gggatgtaat ratgttcagt gttttgacct t                         41

<210>10

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>10

ttatgaaatc cagaggatat yaccagctgc tgatttgcac a                         41

<210>11

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>11

agtccaagtt tacacagtac ratagactta cccattgcca a                         41

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>12

gatatagatc tcttggaaat rtaataatgg tatgcaggaa g                         41

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(22)

<223>残基21-22可以缺失

<400>13

taattcataa cttttttttt ttcgttttag aaaggccctg tg                        42

<210>14

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>14

aaaggaatac atttaggact yatttgaagt tagtgtcaac a                         41

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>15

caacccgggg aaatacagcm aaatgcacaa gtactggctg                           40

<210>16

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>16

aaaatggata taatcaaaat yatggaagaa agtttgtaca g                         41

<210>17

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>17

tatgccttaa aagaaaaagc raaatatcaa tgcaaactag g    41

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>残基21任选缺失

<400>18

cagcttgagt ggatcaaaga ntgacaaggg ccaatggaac c    41

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>19

acggtaccta tttattagta katctaatca ataaagcttt t    41

<210>20

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>20

aagggaccta ataaaattca rtgtgttgat ggagagtgga c    41

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>21

ttttttattt tttattataa mattaattat atttttaata t                        41

<210>22

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>22

ccttgtaaat ctccacctga katttctcat ggtgttgtag c                        41

<210>23

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>23

ggggatatcg tctttcatca ygttctcaca cattgcgaac a                        41

<210>24

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>24

aaatccagag gatatyacca gctgctgatt t                                   31

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>25

aatggtaag tctatygtac tgtgtaaact t                                    31

<210>26

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>26

tgcataccat tattayattt ccaagagatc t                                   31

<210>27

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(19)

<223>残基18-19任选可以缺失

<400>27

acatactaat tcataacttt ttttttttcg ttttag                              36

<210>28

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>28

aatacattta ggactyattt gaagttagtg t                                   31

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>29

ccggggaaat acagcmaaat gcacaagtac t                                   31

<210>30

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>30

ggatataatc aaaatyatgg aagaaagttt g    31

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>31

cttaaaagaa aaagcraaat atcaatgcaa a    31

<210>32

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>32

ctttattgat tagatmtact aataaatagg t    31

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>33

acctaataaa attcartgtg ttgatggaga g    31

<210>34

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>因子H基因多态性

<400>34

taaatctcca cctgakattt ctcatggtgt t    31

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

acttgttccc ccactcctac                             20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

cctcttttcg tatggactac                             20

<210>37

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

tgaaatcacg taccagtgta gaaatgg                     27

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

caggtatcca gccagtactt gt                          22

<210>39

<211>45

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>39

ctttatttat ttatcattgt tatggtcctt aggaaaatgt tattt                    45

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>40

ggcaggcaac gtctatagat ttacc                                          25

<210>41

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

tcaccatctg ctgttacata tcctagt                                        27

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

tgggtttatt tctgaatctc agtatacata tgc                                 33

<210>43

<211>15

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>43

aatacagcaa aatgc                                                     15

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>44

tttcttccat gattttg                                                 17

<210>45

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>45

aagaaaaagc gaaatat                                                 17

<210>46

<211>14

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>46

atacagccaa atgc                                                    14

<210>47

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>47

ttcttccata attttg                                                  16

<210>48

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>48

aagaaaaagc aaaatat                                                 17

<210>49

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>49

ccaggctatc tataaatgcc rccctggata tagatctctt g                        41

<210>50

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>50

ttggtacttt tacccttaca kgaggaaatg tgtttgaata t                        41

<210>51

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>残基21是G或H

<400>51

acgatggttt ttggagtaaa nagaaaccaa agtgtgtggg t                        41

<210>52

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>残基是C或D

<400>52

ttatttataa ggagaatgaa ngatttcaat ataaatgtaa c                     41

<210>53

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>残基是C或D

<400>53

cactgaatct ggatggcgtc ngttgccttc atgtgaag                         38

<210>54

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>残基21任选缺失

<400>54

aagatggatg gtcgccagca staccatgcc tca                              33

<210>55

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>55

acaattatgc ccacctccac stcagattcc caattctcac a                     41

<210>56

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>56

caaccacctc agatagaaca yggaaccatt aattcatcca g                41

<210>57

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>57

gtcttcacaa gaaagttatg yacatgggac taaattgagt t                41

<210>58

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>58

cacatgtcag acagttatca ktatggagaa gaagttacgt a                41

<210>59

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>59

tcagtatgga gaagaagtta ygtacaaatg ttttgaaggt t                41

<210>60

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>60

gtatggkgca ttgaatttta ttatatg                                27

<210>61

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>61

acacctcctg tgtgwatccg cccacagtac aaaat                  35

<210>62

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>残基21任选可以缺失

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>残基23任选可以缺失

<400>62

cttgtatcaa cttgagggta nancaagcga ataacatgta gaaa        44

<210>63

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>多态性

<400>63

aaaagcttta ttgattagat mtactaataa ataggtaccg t           41

<210>64

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>64

gcaaaagttt ctgataggc                               19

<210>65

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>65

aatcttacct tctgctacac                              20

<210>66

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>66

ttagatagac ctgtgactg                               19

<210>67

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>67

tcaggcataa ttgctac                                 17

<210>68

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>68

acttgttccc ccactc                                  16

<210>69

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>69

cctcttttcg tatggactac                    20

<210>70

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>70

ttgttccccc actcctac                      18

<210>71

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>71

acacatttcc tcctgtaagg                    20

<210>72

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>72

ccctgtggac atcctgg                       17

<210>73

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>73

aacctctttt cgtatggact ac                 22

<210>74

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>74

atgctgttca ttttcc                    16

<210>75

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>75

ccatccatct gtgtcac                   17

<210>76

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>76

attaccgtga atgtgac                   17

<210>77

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>77

ttgtatgaga aaaaaaaac                 19

<210>78

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>78

tccaatctta tcctgagg                 18

<210>79

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>79

tcttacccac acactttg                 18

<210>80

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>80

gtcctggtca cagtcc                   16

<210>81

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<210>180

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>180

ctgtgtttgc gtttgcctta                              20

<210>181

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<212>DNA

<213>人工的

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<223>引物

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<213>人工的

<220>

<223>引物

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<213>人工的

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<212>DNA

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<223>引物

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<212>DNA

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<223>引物

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aattatttga atttccagac acctt                      25

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<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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cttaaatgca atttcactat tctatga                    27

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<220>

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<220>

<223>探针

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<211>17

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<400>205

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

<223>探针

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<220>

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<211>17

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<220>

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<220>

<223>探针

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<220>

<223>探针

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<220>

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<211>17

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<220>

<223>探针

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<220>

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<210>220

<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>220

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<210>221

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>221

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<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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<210>223

<211>17

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<213>人工的

<220>

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<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>224

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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tttaggactt atttgaa                           17

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<211>17

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<220>

<223>探针

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<211>17

<212>DNA

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<220>

<223>探针

<400>227

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<220>

<223>探针

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<211>17

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<220>

<223>探针

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<220>

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>231

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<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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<211>17

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<220>

<223>探针

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

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<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

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<220>

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<220>

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<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>n是a，c，g或t

<400>241

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<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>n是a，c，g或t

<400>243

gcccttgtca ntctttg                       17

<210>244

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>244

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<210>245

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>245

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<210>246

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>246

ttgattagat ctactaa                        17

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>247

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>248

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>249

ataaaattca gtgtgtt                         17

<210>250

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>250

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<210>251

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>251

ccatcaacac actgaat                         17

<210>252

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>252

tttattataa cattaat                         17

<210>253

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>254

tataattaat gttataa                        17

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>255

tataattaat tttataa                        17

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>256

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<210>257

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>257

ctccacctga tatttct                        17

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>258

catgagaaat ctcaggt                        17

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<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>259

catgagaaat atcaggt                        17

<210>260

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>260

tctttcatca cgttctc                        17

<210>261

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

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tctttcatca tgttctc                        17

<210>262

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

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<210>263

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>探针

<400>263

gtgtgagaac atgatga                        17

<210>264

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>264

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<210>265

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>265

tttctgggat gtaatg                         16

<210>266

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<210>270

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<210>271

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>271

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<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<210>273

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<210>274

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>274

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<210>275

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>275

aatgggtaag tctatt                        16

<210>276

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>276

agatctcttg gaaatg                        16

<210>277

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<400>277

agatctcttg gaaata                        16

<210>278

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>278

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<211>16

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<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>279

tgcataccat tattat                        16

<210>280

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>280

tcataacttt tttttt                        16

<210>281

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<211>16

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<223>引物

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<220>

<223>引物

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<220>

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<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>n是a，c，g或t

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<211>15

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<211>16

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<213>人工的

<220>

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<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>n是a，c，g，或t

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cattggccct tgtcan                        16

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<220>

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<211>16

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213>人工的

<220>

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<213>人工的

<220>

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

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<220>

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<220>

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aagttctgaa taaaggtgtg c                     21

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<213>人工的

<220>

<223>引物

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tatagatctc ttggaaatat aataatggta tgcagg     36

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<211>36

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<213>人工的

<220>

<223>引物

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atggatataa tcaaaattat ggaagaaagt ttgtac    36

<210>335

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的人CFH变体

<400>335

agttagctgg taaatgtcct cttaaaagat ccaaaaaatg agacttctag caaagattat    60

ttgccttatg ttatgggcta tttgtgtagc agaagattgc aatgaacttc ctccaagaag    120

aaatacagaa attctgacag gttcctggtc tgaccaaaca tatccagaag gcacccaggc    180

tatctataaa tgccgccctg gatatagatc tcttggaaat ataataatgg tatgcaggaa    240

gggagaatgg gttgctctta atccattaag gaaatgtcag aaaaggccct gtggacatcc    300

tggagatact ccttttggta cttttaccct tacaggagga aatgtgtttg aatatggtgt    360

aaaagctgtg tatacatgta atgaggggta tcaattgcta ggtgagatta attaccgtga    420

atgtgacaca gatggatgga ccaatgatat tcctatatgt gaagttgtga agtgtttacc    480

agtgacagca ccagagaatg gaaaaattgt cagtagtgca atggaaccag atcgggaata    540

ccattttgga caagcagtac ggtttgtatg taactcaggc tacaagattg aaggagatga    600

agaaatgcat tgttcagacg atggtttttg gagtaaagag aaaccaaagt gtgtggaaat    660

ttcatgcaaa tccccagatg ttataaatgg atctcctata tctcagaaga ttatttataa    720

ggagaatgaa cgatttcaat ataaatgtaa catgggttat gaatacagtg aaagaggaga    780

tgctgtatgc actgaatctg gatggcgtcc gttgccttca tgtgaagaaa aatcatgtga    840

taatccttat attccaaatg gtgactactc acctttaagg attaaacaca gaactggaga    900

tgaaatcacg taccagtgta gaaatggttt ttatcctgca acccggggaa atacagcaaa    960

atgcacaagt actggctgga tacctgctcc gagatgtacc ttgaaacctt gtgattatcc    1020

agacattaaa catggaggtc tatatcatga gaatatgcgt agaccatact ttccagtagc    1080

tgtaggaaaa tattactcct attactgtga tgaacatttt gagactccgt caggaagtta    1140

ctgggatcac attcattgca cacaagatgg atggtcgcca gcagtaccat gcctcagaaa    1200

atgttatttt ccttatttgg aaaatggata taatcaaaat tatggaagaa agtttgtaca    1260

gggtaaatct atagacgttg cctgccatcc tggctacgct cttccaaaag cgcagaccac    1320

agttacatgt atggagaatg gctggtctcc tactcccaga tgcatccgtg tcaaaacatg    1380

ttccaaatca agtatagata ttgagaatgg gtttatttct gaatctcagt atacatatgc    1440

cttaaaagaa aaagcgaaat atcaatgcaa actaggatat gtaacagcag atggtgaaac    1500

atcaggatca attacatgtg ggaaagatgg atggtcagct caacccacgt gcattaaatc    1560

ttgtgatatc ccagtattta tgaatgccag aactaaaaat gacttcacat ggtttaagct    1620

gaatgacaca ttggactatg aatgccatga tggttatgaa agcaatactg gaagcaccac    1680

tggttccata gtgtgtggtt acaatggttg gtctgattta cccatatgtt atgaaagaga    1740

atgcgaactt cctaaaatag atgtacactt agttcctgat cgcaagaaag accagtataa    1800

agttggagag gtgttgaaat tctcctgcaa accaggattt acaatagttg gacctaattc    1860

cgttcagtgc taccactttg gattgtctcc tgacctccca atatgtaaag agcaagtaca    1920

atcatgtggt ccacctcctg aactcctcaa tgggaatgtt aaggaaaaaa cgaaagaaga    1980

atatggacac agtgaagtgg tggaatatta ttgcaatcct agatttctaa tgaagggacc    2040

taataaaatt caatgtgttg atggagagtg gacaacttta ccagtgtgta ttgtggagga    2100

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ttattactat ggagattcag tggaattcaa ttgctcagaa tcatttacaa tgattggaca    2220

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acacacagtc tgcataaatg gaagatggga tccagaagtg aactgctcaa tggcacaaat    2460

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agaagaaatt acatgcaaag atggaagatg gcagtcaata ccactctgtg ttgaaaaaat    2640

tccatgttca caaccacctc agatagaaca cggaaccatt aattcatcca ggtcttcaca    2700

agaaagttat gcacatggga ctaaattgag ttatacttgt gagggtggtt tcaggatatc    2760

tgaagaaaat gaaacaacat gctacatggg aaaatggagt tctccacctc agtgtgaagg    2820

ccttccttgt aaatctccac ctgagatttc tcatggtgtt gtagctcaca tgtcagacag    2880

ttatcagtat ggagaagaag ttacgtacaa atgttttgaa ggttttggaa ttgatgggcc    2940

tgcaattgca aaatgcttag gagaaaaatg gtctcaccct ccatcatgca taaaaacaga    3000

ttgtctcagt ttacctagct ttgaaaatgc catacccatg ggagagaaga aggatgtgta    3060

taaggcgggt gagcaagtga cttacacttg tgcaacatat tacaaaatgg atggagccag    3120

taatgtaaca tgcattaata gcagatggac aggaaggcca acatgcagag acacctcctg    3180

tgtgaatccg cccacagtac aaaatgctta tatagtgtcg agacagatga gtaaatatcc    3240

atctggtgag agagtacgtt atcaatgtag gagcccttat gaaatgtttg gggatgaaga    3300

agtgatgtgt ttaaatggaa actggacgga accacctcaa tgcaaagatt ctacaggaaa    3360

atgtgggccc cctccaccta ttgacaatgg ggacattact tcattcccgt tgtcagtata    3420

tgctccagct tcatcagttg agtatcaatg ccagaacttg tatcaacttg agggtaacaa    3480

gcgaataaca tgtagaaatg gacaatggtc agaaccacca aaatgcttac atccgtgtgt    3540

aatatcccga gaaattatgg aaaattataa catagcatta aggtggacag ccaaacagaa    3600

gctttattcg agaacaggtg aatcagttga atttgtgtgt aaacggggat atcgtctttc    3660

atcacgttct cacacattgc gaacaacatg ttgggatggg aaactggagt atccaacttg    3720

tgcaaaaaga tagaatcaat cataaagtgc acacctttat tcagaactt                3769

<210>336

<211>3926

<212>DNA

<213>人

<400>336

aattcttgga agaggagaac tggacgttgt gaacagagtt agctggtaaa tgtcctctta    60

aaagatccaa aaaatgagac ttctagcaaa gattatttgc cttatgttat gggctatttg    120

tgtagcagaa gattgcaatg aacttcctcc aagaagaaat acagaaattc tgacaggttc    180

ctggtctgac caaacatatc cagaaggcac ccaggctatc tataaatgcc gccctggata    240

tagatctctt ggaaatgtaa taatggtatg caggaaggga gaatgggttg ctcttaatcc    300

attaaggaaa tgtcagaaaa ggccctgtgg acatcctgga gatactcctt ttggtacttt    360

tacccttaca ggaggaaatg tgtttgaata tggtgtaaaa gctgtgtata catgtaatga    420

ggggtatcaa ttgctaggtg agattaatta ccgtgaatgt gacacagatg gatggaccaa    480

tgatattcct atatgtgaag ttgtgaagtg tttaccagtg acagcaccag agaatggaaa    540

aattgtcagt agtgcaatgg aaccagatcg ggaataccat tttggacaag cagtacggtt    600

tgtatgtaac tcaggctaca agattgaagg agatgaagaa atgcattgtt cagacgatgg    660

tttttggagt aaagagaaac caaagtgtgt ggaaatttca tgcaaatccc cagatgttat    720

aaatggatct cctatatctc agaagattat ttataaggag aatgaacgat ttcaatataa    780

atgtaacatg ggttatgaat acagtgaaag aggagatgct gtatgcactg aatctggatg    840

gcgtccgttg ccttcatgtg aagaaaaatc atgtgataat ccttatattc caaatggtga    900

ctactcacct ttaaggatta aacacagaac tggagatgaa atcacgtacc agtgtagaaa    960

tggtttttat cctgcaaccc ggggaaatac agccaaatgc acaagtactg gctggatacc    1020

tgctccgaga tgtaccttga aaccttgtga ttatccagac attaaacatg gaggtctata    1080

tcatgagaat atgcgtagac catactttcc agtagctgta ggaaaatatt actcctatta    1140

ctgtgatgaa cattttgaga ctccgtcagg aagttactgg gatcacattc attgcacaca    1200

agatggatgg tcgccagcag taccatgcct cagaaaatgt tattttcctt atttggaaaa    1260

tggatataat caaaattatg gaagaaagtt tgtacagggt aaatctatag acgttgcctg    1320

ccatcctggc tacgctcttc caaaagcgca gaccacagtt acatgtatgg agaatggctg    1380

gtctcctact cccagatgca tccgtgtcaa aacatgttcc aaatcaagta tagatattga    1440

gaatgggttt atttctgaat ctcagtatac atatgcctta aaagaaaaag cgaaatatca    1500

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agatggatgg tcagctcaac ccacgtgcat taaatcttgt gatatcccag tatttatgaa    1620

tgccagaact aaaaatgact tcacatggtt taagctgaat gacacattgg actatgaatg    1680

ccatgatggt tatgaaagca atactggaag caccactggt tccatagtgt gtggttacaa    1740

tggttggtct gatttaccca tatgttatga aagagaatgc gaacttccta aaatagatgt    1800

acacttagtt cctgatcgca agaaagacca gtataaagtt ggagaggtgt tgaaattctc    1860

ctgcaaacca ggatttacaa tagttggacc taattccgtt cagtgctacc actttggatt    1920

gtctcctgac ctcccaatat gtaaagagca agtacaatca tgtggtccac ctcctgaact    1980

cctcaatggg aatgttaagg aaaaaacgaa agaagaatat ggacacagtg aagtggtgga    2040

atattattgc aatcctagat ttctaatgaa gggacctaat aaaattcaat gtgttgatgg    2100

agagtggaca actttaccag tgtgtattgt ggaggagagt acctgtggag atatacctga    2160

acttgaacat ggctgggccc agctttcttc ccctccttat tactatggag attcagtgga    2220

attcaattgc tcagaatcat ttacaatgat tggacacaga tcaattacgt gtattcatgg    2280

agtatggacc caacttcccc agtgtgtggc aatagataaa cttaagaagt gcaaatcatc    2340

aaatttaatt atacttgagg aacatttaaa aaacaagaag gaattcgatc ataattctaa    2400

cataaggtac agatgtagag gaaaagaagg atggatacac acagtctgca taaatggaag    2460

atgggatcca gaagtgaact gctcaatggc acaaatacaa ttatgcccac ctccacctca    2520

gattcccaat tctcacaata tgacaaccac actgaattat cgggatggag aaaaagtatc    2580

tgttctttgc caagaaaatt atctaattca ggaaggagaa gaaattacat gcaaagatgg    2640

aagatggcag tcaataccac tctgtgttga aaaaattcca tgttcacaac cacctcagat    2700

agaacacgga accattaatt catccaggtc ttcacaagaa agttatgcac atgggactaa    2760

attgagttat acttgtgagg gtggtttcag gatatctgaa gaaaatgaaa caacatgcta    2820

catgggaaaa tggagttctc cacctcagtg tgaaggcctt ccttgtaaat ctccacctga    2880

gatttctcat ggtgttgtag ctcacatgtc agacagttat cagtatggag aagaagttac    2940

gtacaaatgt tttgaaggtt ttggaattga tgggcctgca attgcaaaat gcttaggaga    3000

aaaatggtct caccctccat catgcataaa aacagattgt ctcagtttac ctagctttga    3060

aaatgccata cccatgggag agaagaagga tgtgtataag gcgggtgagc aagtgactta    3120

cacttgtgca acatattaca aaatggatgg agccagtaat gtaacatgca ttaatagcag    3180

atggacagga aggccaacat gcagagacac ctcctgtgtg aatccgccca cagtacaaaa    3240

tgcttatata gtgtcgagac agatgagtaa atatccatct ggtgagagag tacgttatca    3300

atgtaggagc ccttatgaaa tgtttgggga tgaagaagtg atgtgtttaa atggaaactg    3360

gacggaacca cctcaatgca aagattctac aggaaaatgt gggccccctc cacctattga    3420

caatggggac attacttcat tcccgttgtc agtatatgct ccagcttcat cagttgagta    3480

ccaatgccag aacttgtatc aacttgaggg taacaagcga ataacatgta gaaatggaca    3540

atggtcagaa ccaccaaaat gcttacatcc gtgtgtaata tcccgagaaa ttatggaaaa    3600

ttataacata gcattaaggt ggacagccaa acagaagctt tattcgagaa caggtgaatc    3660

agttgaattt gtgtgtaaac ggggatatcg tctttcatca cgttctcaca cattgcgaac    3720

aacatgttgg gatgggaaac tggagtatcc aacttgtgca aaaagataga atcaatcata    3780

aagtgcacac ctttattcag aactttagta ttaaatcagt tctcaatttc attttttatg    3840

tattgtttta ctccttttta ttcatacgta aaattttgga ttaatttgtg aaaatgtaat    3900

tataagctga gaccggtggc tctctt                                         3926

<210>337

<211>1231

<212>PRT

<213>人

<400>337

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

            20                  25                  30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

        35                  40                  45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met

    50                  55                  60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65                  70                  75                  80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

            100                 105                110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

        115                 120                 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

    130                 135                 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

                165                 170                 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

            180                 185                 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

        195                 200                 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

    210                 215                 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225                 230                 235                 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

                245                 250                 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

            260                 265                 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

        275                 280                 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

    290                 295                 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

                325                 330                 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

            340                 345                 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

        355                 360                 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

    370                 375                 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385                 390                 395                 400

Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

                405                 410                 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

            420                 425                 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

        435                 440                 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

    450                 455                 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465                 470                 475                 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Arg Cys Gly Lys

                485                 490                 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

            500                 505                 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

        515                 520                 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys Hi s Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

    530                 535                 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545                 550                 555                 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

               565                 570                 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

            580                 585                 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

        595                 600                 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

    610                 615                 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625                 630                 635                 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

                645                 650                 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

            660                 665                 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

        675                 680                 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

    690                 695                 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705                 710                 715                 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

                725                 730                 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

            740                 745                 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

        755                 760                 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

    770                 775                 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785                 790                 795                 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

                805                 810                 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

            820                 825                 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

        835                 840                 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

    850                 855                 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865                 870                 875                 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

                885                 890                 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

            900                 905                 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

        915                 920                 925

Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His

    930                 935                 940

Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe

945                 950                 955                 960

Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu

                965                 970                 975

Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu

            980                 985                 990

Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr

        995                 1000                1005

Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys

    1010                1015                1020

Met Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr

    1025                1030                1035

Gly Arg Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr

    1040                1045                1050

Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro

    1055                1060                1065

Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met

    1070                1075                1080

Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu

    1085                1090                1095

Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro

    1100                1105                1110

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr

    1115                1120                1125

Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln

    1130                1135                1140

Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln Trp Ser

    1145                1150                1155

Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile

    1160                1165                1170

Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys

    1175                1180                1185

Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg

    1190                1195                1200

Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys

    1205                1210                1215

Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg

    1220                1225                1230

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1. 确定受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的倾向的诊断方法，其包括检测编码补体调节子(RCA)的基因多态性位点处是否存在变异。

2. 权利要求1的方法，其中所述基因为因子H或CFHR5。

3. 权利要求2的方法，其中所述多态性位点为因子H基因中的双等位基因单核苷酸多态性。

4. 权利要求3的方法，其包括获得来自患者的核酸样品和检测所述患者DNA中因子H基因多态性位点处是否存在变异。

5. 权利要求4的方法，其中存在变异指示患者发生AMD的倾向提高。

6. 权利要求4的方法，其中存在变异指示患者发生AMD的倾向降低。

7. 权利要求2的方法，其中所述多态性位点为表A列出的因子H基因中的单核苷酸多态性。

8. 权利要求7的方法，其中所述多态性为rs800292(I62V)。

9. 权利要求7的方法，其中所述多态性为rs1061170(Y402H)。

10. 权利要求2的方法，其中所述多态性在外显子22(R1210C)中。

11. 权利要求4的方法，其中检测步骤包括(i)将来自受试者的核酸样品与一种或多种能与因子H基因等位基因选择性杂交的多核苷酸探针在反应中组合，和(ii)监测反应以确定样品中因子H基因等位基因的存在。

12. 根据权利要求11的方法，其中所述探针为在聚合酶链式反应中引发多核苷酸合成的寡核苷酸。

13. 权利要求2的方法，其中检测变体因子H蛋白质。

14. 权利要求13的方法，其中所述变体第62位氨基酸为异亮氨酸。

15. 权利要求13的方法，其中所述变体第402位氨基酸为组氨酸。

16. 权利要求13的方法，其中所述变体第1210位氨基酸为半胱氨酸。

17. 权利要求13的方法，其中监测步骤包括(i)在免疫测定中将来自受试者的血或血清样品与对变体蛋白质等位基因具有特异性的抗体试剂混合，和(ii)监测所述测定以确定抗体试剂与蛋白质样品之间的特异性结合。

18. 权利要求2的方法，其中所述多态性位点为CHFR5基因中选自如下的单核苷酸多态性：rs9427661(-249T＞C)、rs9427662(-20T＞C)和rs120977550(P64S)。

19. 权利要求18的方法，其中所述多态性为rs120977550(P64S)。

20. 权利要求2的方法，其中检测变体CFHR5多肽。

21. 权利要求20的方法，其中所述变体CFHR5多肽

22. 诊断受试者对年龄相关性黄斑变性(AMD)的易感性的方法，其包括筛选单元型，其中所述单元型为：

a)因子H或CFHR5基因中的危险单元型，其在诊断为AMD的个体中的存在比健康个体中更为常见，或

b)因子H或CFHR5基因中的保护性单元型，其在健康个体中的存在比诊断为AMD的个体中更为常见，或

c)因子H或CFHR5基因中的中性单元型。

23. 权利要求22的方法，其中所述单元型在因子H基因中。

24. 权利要求23的方法，其中所述筛选包括检测在rs1061170、rs800292、rs1061147、内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、rs1061170、外显子10A和外显子22(R1210C)中任何一处或多处是否存在变体序列。

25. 权利要求22的方法，其中所述单元型在CFHR5基因中。

26. 权利要求25的方法，其中所述单元型为CFHR5基因中的危险单元型，所述CFHR5基因包括在rs9427661、rs9427662和rs12097550中至少一处的变体序列。

27. 因子H多肽在制备预防或治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的药物中的用途。

28. 权利要求27的用途，其中所述药物给予具有与AMD危险相关的因子H单元型的患者。

29. 根据权利要求27的用途，其中所述因子H多肽包含第62位的异亮氨酸。

30. 多核苷酸在制备预防或治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的药物中的用途，所述多核苷酸包含编码因子H多肽的序列，所述序列与启动子有效连接。

31. 权利要求30的用途，其中所述启动子对RPE具有特异性。

32. 权利要求27的用途，其中所述因子H多肽用于对眼施用。

33. 权利要求32的用途，其中所述因子H多肽用于通过眼内注射施用。

34. 物质在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性(AMD)的药物中的用途，所述物质降低因子H变体的表达，所述因子H变体与发生AMD的危险提高相关。

35. 权利要求34的用途，其中所述物质为RNA，其与变体因子H多肽的至少一部分核苷酸序列互补。

36. 权利要求35的用途，其中所述RNA为反义RNA。

37. 权利要求35的用途，其中所述RNA为核酶。

38. 权利要求35的用途，其中所述RNA为短干扰RNA(siRNA)。

39. 药物组合物，其包含编码因子H多肽的基因治疗载体和可药用赋形剂。

40. 包含重组因子H多肽的组合物，其中重组因子H多肽包含第62位的异亮氨酸。

41. 包含重组因子H多肽和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含病原体，并且适于对人类患者施用。

42. 权利要求41的药物组合物，其中所述重组因子H多肽包含第62位的异亮氨酸。

43. 包含抗体的药物组合物，所述抗体与第402位为组氨酸的变体因子H蛋白质结合，但不与具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：337序列的因子H蛋白质结合。

44. 表达编码变体人因子H的转基因的转基因非人动物，其中所述变体的第62位氨基酸由缬氨酸替换异亮氨酸(I62V)、所述变体的第402位氨基酸由组氨酸替换酪氨酸(Y402H)，或所述变体的第1210位氨基酸由半胱氨酸替换精氨酸(R1210C)。

45. 表达重组变体人因子H的分离的宿主细胞，其中所述变体的第402位氨基酸由组氨酸替换酪氨酸(Y402H)，或所述变体的第1210位氨基酸由半胱氨酸替换精氨酸(R1210C)。

46. 表达重组变体人因子H的分离的宿主细胞，其中所述变体包含第62位的异亮氨酸。

47. 筛选能治疗AMD的物质的方法，其包括：使权利要求47的宿主细胞接触所述物质；以及监测Y402H或R1210C变体的表达或加工。

48. 鉴定保护性因子H蛋白质的方法，其包括：

a)鉴定具有保护性单元型的个体；和

b)确定所述个体基因组中编码的因子H的序列。

49. 鉴定与发生AMD危险降低相关的因子H的变体形式的方法，其包括：

i)鉴定具有与发生AMD危险降低相关的单元型或二倍型的个体；

ii)获得来自所述个体的基因组DNA或RNA；和

iii)确定所述个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列。

50. 用于诊断受试者对AMD易感性的装置或试剂盒，其包括在表A中列出的至少一个因子H基因多态性位点处区分等位基因的寡核苷酸。

51. 权利要求50的装置或试剂盒，其中所述寡核苷酸为引物，用于跨越表A中列出的因子H基因多态性位点的区域的核酸扩增。

52. 权利要求50的装置或试剂盒，其中所述寡核苷酸为探针，用于跨越表A中列出的因子H基因多态性位点的区域的核酸杂交。

53. 权利要求52的装置或试剂盒，其具有在表A中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的寡核苷酸。

54. 权利要求53的装置或试剂盒，其中所述多态性位点包括rs1061170、rs800292、rs1061147、内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、rs1061170、外显子10A和外显子22(R1210C)中的任一个或多个。

55. 用于诊断受试者对AMD的易感性的装置或试剂盒，其包含在表14列出的至少一个CFHR5基因多态性位点处区分等位基因的寡核苷酸。

56. 用于确定受试者发生II型膜性增生性肾小球肾炎(致密沉积物性肾小球肾炎)(MPGNII)的倾向的诊断方法，其包括检测在因子H基因和/或补体因子H相关5(CFHR5)基因多态性位点处是否存在变异。

57. 权利要求59的方法，其中存在变异指示患者发生MPGNII的倾向提高。

Claims (60)

1.确定受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的倾向的诊断方法，其包括检测编码补体调节子(RCA)的基因中多态性位点处是否存在变异。

2.权利要求1的方法，其中所述基因为因子H或CFHR5。

3.权利要求2的方法，其中所述多态性位点为因子H基因中的双等位基因单核苷酸多态性。

4.权利要求3的方法，其包括获得来自患者的核酸样品和检测来自该患者DNA中因子H基因多态性位点处是否存在变异。

5.权利要求4的方法，其中存在变异指示患者发生AMD的倾向提高。

6.权利要求4的方法，其中存在变异指示患者发生AMD的倾向降低。

7.权利要求2的方法，其中所述多态性位点为表1A-1C中列出的因子H基因中的单核苷酸多态性。

8.权利要求7的方法，其中所述多态性为rs800292(I62V)。

9.权利要求7的方法，其中所述多态性为rs1061170(Y402H)。

10.权利要求7的方法，其中所述多态性在外显子22(R1210C)中。

11.权利要求4的方法，其中检测步骤包括(i)将来自受试者的核酸样品与一种或多种能与因子H基因等位基因选择性杂交的单核苷酸探针在反应中组合，和(ii)监测反应以确定样品中因子H基因等位基因的存在。

12.根据权利要求11的方法，其中所述探针为能在聚合酶链式反应中引发多核苷酸合成的寡核苷酸。

13.权利要求2的方法，其中检测变体因子H蛋白质。

14.权利要求13的方法，其中所述变体第62位氨基酸为异亮氨酸。

15.权利要求13的方法，其中所述变体第402位氨基酸为组氨酸。

16.权利要求13的方法，其中所述变体第1210位氨基酸为半胱氨酸。

17.权利要求13的方法，其中监测步骤包括(i)在免疫测定中将来自受试者的血或血清样品与对变体蛋白质等位基因具有特异性的抗体试剂混合，和(ii)监测所述测定以确定抗体试剂与蛋白质样品之间的特异性结合。

18.权利要求2的方法，其中所述多态性位点为CHFR5基因中选自如下的单核苷酸多态性：rs9427661(-249T＞C)、rs9427662(-20T＞C)和rs120977550(P64S)。

19.权利要求18的方法，其中所述多态性为rs120977550(P64S)。

20.权利要求2的方法，其中检测变体CFHR5多肽。

21.权利要求20的方法，其中所述变体CFHR5多肽第第46位氨基酸由丝氨酸替换脯氨酸。

22.诊断受试者对年龄相关性黄斑变性(AMD)的易感性的方法，包括筛选单元型，其中所述单元型为：

a)因子H或CFHR5基因中的危险单元型，其在诊断为AMD的个体中的存在比健康个体中更为常见，或

b)因子H或CFHR5基因中的保护性单元型，其在健康个体中的存在比诊断为AMD的个体中更为常见，或

c)因子H或CFHR5基因中的中性单元型。

23.权利要求22的方法，其中所述单元型在因子H基因中。

24.权利要求23的方法，其中所述单元型包含rs1061170和rs203674中至少一处的变体序列。

25.权利要求23的方法，其中所述单元型为保护性单元型，其包含rs529825、rs800292和rs3766404中至少一处的变体序列。

26.权利要求23的方法，其中所述筛选包括确定以下位置的变异：

a)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170和rs203674中任何一处或多处；

b)内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A和rs375046中任何一处或多处；

c)rs529825和rs800292中一处或两处；

d)rs1061147、rs1061170和rs203674中一处或多处；

e)rs529825和rs800292中至少一处；和rs3766404；和rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一处；

f)至少rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674；

g)外显子22(R1210C)；或

h)外显子22(R1210C)和(a)-(g)中任一项。

27.权利要求22的方法，其中所述单元型在CFHR5基因中。

28.权利要求27的方法，其中所述单元型为CFHR5基因中的危险单元型，其包括rs9427661、rs9427662和rs12097550中至少一处的变体序列。

29.治疗患者的方法，所述患者诊断为患有或具有发生年龄相关性黄斑变性(AMD)危险，所述方法包括对患者施用因子H多肽。

30.根据权利要求29的方法，其中所述患者具有与AMD危险相关的因子H单元型。

31.根据权利要求29的方法，其中所述因子H多肽由因子H保护性单元型编码。

32.根据权利要求29的方法，其中所述施用包括施用含有编码因子H多肽的序列的多核苷酸或施用表达因子H多肽的细胞，所述序列与启动子有效连接。

33.权利要求32的方法，其中所述启动子对RPE具有特异性。

34.权利要求29的方法，其中对眼施用因子H多肽。

35.权利要求34的方法，其中通过眼内注射施用因子H多肽。

36.治疗患者的方法，所述患者具有与AMD危险相关的因子H单元型，其包括施用物质以降低基因产物的表达，所述基因产物由编码变体因子H多肽的因子H基因编码。

37.权利要求36的方法，其中所述物质为RNA，其与变体因子H多肽的至少一部分核苷酸序列互补。

38.权利要求37的方法，其中所述RNA为反义RNA。

39.权利要求37的方法，其中所述RNA为核酶。

40.权利要求37的方法，其中所述RNA为短干扰RNA(siRNA)。

41.药物组合物，其包含编码因子H多肽的基因治疗载体和可药用赋形剂。

42.包含重组因子H多肽的组合物，其中所述重组因子H多肽由保护性单元型编码，并且第62位为异亮氨酸。

43.包含重组因子H多肽和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含病原体，并且适于对人类患者施用。

44.权利要求43的药物组合物，其中所述重组因子H多肽由保护性单元型编码。

45.包含抗体的药物组合物，所述抗体与变体因子H蛋白质结合，但不与具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：337序列的因子H蛋白质结合。

46.表达编码变体人因子H的转基因的转基因非人动物，其中所述变体氨基酸的第62位由缬氨酸替换异亮氨酸(I62V)、所述变体氨基酸的第402位由组氨酸替换酪氨酸(Y402H)，或所述变体氨基酸的第1210位由半胱氨酸替换精氨酸(R1210C)。

47.表达重组变体人因子H的分离的宿主细胞，其中所述变体氨基酸的第402位由组氨酸替换酪氨酸(Y402H)，或所述变体氨基酸的第1210位由半胱氨酸替换精氨酸(R1210C)。

48.表达重组变体人因子H的分离的宿主细胞，其中所述变体由保护性单元型编码。

49.筛选能治疗AMD的物质的方法，其包括：使权利要求47的宿主细胞接触所述物质；以及监测Y402H或R1210C变体的表达或加工。

50.鉴定保护性因子H蛋白质的方法，其包括：

a)鉴定具有保护性单元型的个体；和

b)确定所述个体基因组中编码的因子H的序列。

51.鉴定与发生AMD危险降低相关的因子H的变体形式的方法，其包括：

i)鉴定具有与发生AMD危险降低相关的单元型或二倍型的个体；

ii)获得来自该个体的基因组DNA或RNA；和

iii)确定该个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列。

52.用于诊断受试者对AMD易感性的装置或试剂盒，其包括在表1A-1C中列出的至少一个因子H基因多态性位点处区分等位基因的寡核苷酸。

53.权利要求52的装置或试剂盒，其中所述寡核苷酸为引物，其用于跨越表1A-1C中列出的因子H基因多态性位点的区域的核酸扩增。

54.权利要求52的装置或试剂盒，其中所述寡核苷酸为探针，其用于跨越表1A-1C中列出的因子H基因多态性位点的区域的核酸杂交。

55.权利要求52的装置或试剂盒，其具有在表1A-1C中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的寡核苷酸。

56.权利要求55的装置或试剂盒，其中所述多态性位点包括：

a)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170和rs203674中任何一个或多个；

b)内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A和rs375046中任何一个或多个；

c)rs529825和rs800292中一个或两个；

d)rs1061147、rs1061170和rs203674中一个或多个；

e)rs529825和rs800292中至少一个；和rs3766404；和rs1061147、rs1061170和rs203674中至少一个；

f)至少rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061170和rs203674；

g)外显子22(R1210C)；或

h)外显子22(R1210C)和(a)-(g)中任一项。

57.权利要求55的装置或试剂盒，其中所述多态性位点包括：

a)rs529825、rs800292、rs3766404、rs1061147、rs1061170、rs203674、内含子2(IVS2或insTT)、rs2274700、外显子10A、rs375046和外显子22(R1210C)中任何一个或多个；和

b)rs9427661、rs9427662和rs12097550中任何一个或多个。

58.用于诊断受试者对AMD的易感性的装置或试剂盒，其包含在表14列出的至少一个CFHR5基因多态性位点处区分等位基因的寡核苷酸。

59.用于确定受试者发生II型膜性增生性肾小球肾炎(致密沉积物性肾小球肾炎)(MPGNII)的倾向的诊断方法，其包括检测在因子H基因和/或补体因子H相关5(CFHR5)基因多态性位点处是否存在变异。

60.权利要求59的方法，其中存在变异指示患者发生MPGNII的倾向提高。

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