CN112470003A - 评估黄斑变性的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了确定受试者是否有发展补体相关病症的风险的方法。还公开了用于治疗补体相关疾病的补体靶向治疗剂，特别是降低FHR‑4水平的药物。

Description

评估黄斑变性的方法
本申请要求2018年5月10日提交的GB1807611.7和2019年3月1日提交的GB1902790.3的优先权，出于所有目的，其内容和要素通过引用合并于此。
发明领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及评估发生补体驱动的疾病的风险的方法，以及治疗所述疾病的方法。
背景
补体系统是先天免疫系统的一部分，在消除微生物，炎症过程，清理细胞碎片和调节适应性免疫中起主要作用(Ricklin D.,Nat.Immunol.2010,11,785–797)。补体通过沉积在蛋白质C3b的表面而活化，蛋白质C3b是免疫系统蛋白质C3的促炎性分解产物。C3b与其他蛋白质结合形成转化酶复合物，以激活和放大补体应答，并启动补体级联的扩增环。最终导致细胞/组织破坏和局部炎症反应。因此，反常和缺陷，例如，补体系统的过度激活被认为是许多炎性、自身免疫、神经退行性和感染性疾病的关键驱动力(McGeer PL等人，NeurobiolAging.2017,52:12-22)。
黄斑变性，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)被认为部分是由于补体介导的眼组织攻击所致。AMD是发达国家失明的主要原因：目前占全球失明登记人数的8.7％，据估计，到2020年，将有1.96亿人受到影响，到2040年将增加到2.88亿(Wong等人，Lancet Glob Heal(2014)2:e106-16)。AMD表现为眼后部视网膜中央部位黄斑的逐渐破坏，导致中心视力丧失。疾病的早期阶段会看到黄斑的形态变化，包括首先脉络膜血管层的血管丢失(Whitmore等人，Prog Retin Eye Res(2015)45:1-29)；在脉络膜(高度血管化的层，为外部视网膜提供氧气和营养)中发现一层毛细血管。脉络膜血管层通过布鲁赫膜(BrM)(一种薄的(2-4μm)非细胞的，五层细胞外基质片)与代谢活跃的视网膜色素上皮(RPE)分隔开。BrM具有两个主要功能：RPE的底层和血管壁。BrM的结构和功能在例如，Curcio和Johnson，《布鲁赫膜的结构，功能和病理学》，作者：Ryan等人(2013)，《视网膜》，第1卷，第2部分：《基础科学和治疗转化》，第五版，伦敦：Elsevier，pp466-481中进行了综述，其通过引用的方式整体并入本文。
例如，Zipfel等人，第2章，在Lambris和Adamis(编辑)，《炎症和视网膜疾病：补体生物学和病理学，实验医学和生物学的进展》703，施普林格科学+商业媒体有限责任公司(2010)中综述了补体在AMD中的作用，其通过引用的方式整体并入本文。AMD的关键特征表明补体过度活跃，包括细胞/组织破坏和局部炎症反应。早期AMD的标志性病变，称为玻璃疣，在RPE层附近的BrM内发展(Bird等人，Surv Ophthalmol 1995,39(5):367-374)。玻璃疣是由脂质和细胞碎片的积聚形成的，包括大量补体激活产物(Anderson等人，Prog RetinEye Res 2009，29：95-112；Whitcup等人，Int J Inflam 2013，1-10)。BrM内玻璃疣的存在破坏了营养物质从脉络膜穿过细胞外基质流向RPE细胞，导致细胞功能障碍并最终死亡，从而导致视敏度丧失。
遗传改变/变异是AMD的主要危险因素。最近，在34个遗传基因位点中有45种常见的单核苷酸多态性(SNP)和7种罕见变体与这种情况相关，解释了高达34％的晚期AMD风险变异性(Fritsche等人，Nat Genet.2016；48(2)：134–143)。许多与AMD相关的遗传改变和变异都存在于编码补体级联成分的基因中和其周围，例如1q31.3号染色体上的补体激活调节子(RCA)基因座，其包含补体因子H(CFH)和补体因子H相关的1-5(CFHR1-5)基因(Schramm，EC等人，Mol Immunol 2014，61：118-125；McHarg，S等人，Mol Immunol 2015，67：43-50；通过引用的方式整体并入本)。
CFH/CFHR1-5基因编码的蛋白质发挥补体调节功能。CFH基因编码两种蛋白质；FH，是补体激活的主要血浆调节剂，和一个较小的剪接变体，称为FH样蛋白1(FHL-1)，其主要存在于脉络膜血管层的BrM和细胞外基质中(Clark等人，J Immunol.2014；193(10)：4962-70；McHarg等人，同上)。CFHR1-5基因编码一组主要由肝细胞合成的五个分泌的血浆蛋白(FHR-1至FHR-5)。FHR与FH的C3b结合结构域保持某些序列同源性，并被认为增强补体激活(Skerka等人，Mol Immunol.2013，56：170-180)。
“干性”AMD也称为地图样萎缩，约占晚期AMD病例的90％。在剩余的晚期病例的百分比中，玻璃疣的存在促进脉络膜新生血管形成(CNV)，其中RPE细胞合成的血管内皮生长因子(VEGF)的增加促进了脉络膜/脉络膜血管层中新的血管生长，并突破了BrM进入视网膜。这些新血管渗漏并最终形成疤痕组织；这就是所谓的“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD。“湿性”AMD仅占约10％的病例，是晚期AMD最致命的形式，其疾病特征与“干性”AMD不同。有用于湿性AMD的疗法，其中例如将抗VEGF剂注射入眼玻璃体内可减慢或逆转这些血管的生长，尽管其不能首先阻止其形成。地图样萎缩(“干性”AMD)仍然无法治愈。
鉴于以上考虑而设计了本发明。
发明概述
本发明提供了使用FHR-4水平作为生物标志物来确定受试者是否有发展补体相关疾病的风险的方法。
一方面，本发明提供了一种用于确定受试者是否有发展补体相关疾病的风险的方法，所述方法包括确定所述受试者的血液中的FHR-4的水平。
在一些实施方式中，所述方法包括确定受试者血液中FHR-4水平是否升高。在一些实施方式中，FHR-4水平升高表明发生补体相关病症的风险增加。
在一些实施方式中，所述方法包括确定受试者的血液中FHR-4的量。在各种实施方式中，所述方法包括测量所述受试者的血液中的FHR-4蛋白的浓度。在一些实施方式中，>15μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者患有所述疾病的高风险性。在其他实施方式中，5-15μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者患有所述疾病的中等风险性，和/或＜5μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者患有所述疾病的低风险性。
在一些实施方式中，在来自受试者的血液来源的样品中确定FHR-4的水平、量和/或浓度。在某些实施方式中，所述方法包括从受试者获得血液来源的样品或生物样品。
在各种实施方式中，FHR-4的水平、量和/或浓度在体外确定。
在一些实施方式中，所述方法包括确定所述受试者中编码FHR-4的基因的表达水平。
在另一方面，本发明提供了一种用于确定受试者是否有罹患补体相关疾病的风险的方法，所述方法包括确定所述受试者中编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，编码FHR-4的基因的表达水平增加表明所述受试者患有所述疾病的风险增加。在一些实施方式中，当与编码FHR-4的基因的参考表达水平相比时，编码FHR-4的基因的表达水平增加表明所述受试者患有所述疾病的风险增加。
在各种实施方式中，补体相关疾病选自黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)、早发性黄斑变性(EOMD)、黄斑营养不良、青光眼、糖尿病视网膜病变、溶血性尿毒症综合症(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、自身免疫性葡萄膜炎、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN II)、脓毒症、过敏性紫癜(HSP)、IgA肾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合症(SS)、类风湿性关节炎(RA)、C3肾炎因子肾小球肾炎(C3 NF GN)、遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、脑脊髓炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症(MS)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。在一些实施方式中，所述方法进一步包括确定受试者中是否存在与AMD和/或EOMD有关的一种或多种遗传因子。
在一些实施方式中，本文提供的任何方法可包括用于治疗或预防补体相关疾病的治疗步骤。在一些实施方式中，所述治疗步骤包括向受试者施用靶向补体的治疗剂和/或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂。
在另一方面，本发明提供了补体靶向治疗剂在治疗或预防受试者中的补体相关病症的方法中的用途，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高。还提供了一种用于治疗或预防受试者中的补体相关病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的靶向补体的治疗剂，其中待治疗的受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达水平升高。
在一些实施方式中，已经确定所述受试者具有增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4的基因的表达水平。
在另一方面，本发明提供了降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂在治疗或预防受试者中的补体相关疾病的方法中的用途，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因的表达水平升高。还提供了一种用于治疗或预防受试者中与补体相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达水平升高。
在一些实施方式中，已经确定所述受试者具有增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，FHR-4水平升高表明患有补体相关疾病的风险增加。
在一些实施方式中，所述方法包括任选地在体外确定受试者的血液中FHR-4的量。在各种实施方式中，所述方法包括任选地在体外测量所述受试者的血液中FHR-4蛋白的浓度。在一些实施方式中，>15μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者患有所述疾病的高风险性。在其他实施方式中，5-15μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者患有所述疾病的中等风险性，和/或＜5μg/ml的FHR-4浓度表示所述受试者患有所述疾病的低风险性。
在各种实施方式中，降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂具有以下一种或多种性质：抑制CFHR4基因的表达，降解FHR-4mRNA，结合至FHR-4蛋白，螯合FHR-4蛋白，螯合血液中的FHR-4蛋白，竞争结合FHR-4蛋白，阻断FHR-4蛋白的活性，降低血液中FHR-4的浓度，降低FHR-4蛋白离开血液的能力，降低FHR-4蛋白到达眼睛的能力，减少FHR-4在眼中的含量，降低FHR-4蛋白进入BrM的能力，抑制FHR-4介导的信号传导，调节涉及C3b的反应，调节涉及FHR-4和C3b的反应，降低FHR-4蛋白与C3b结合的能力，与FHR-4蛋白竞争结合C3b，促进FHR-4与C3b的分离，减少C3转化酶的活化，减少C3bBb的产生，增加C3的失活，增加iC3b的产生，降低补体激活和/或失活补体途径。
在一些实施方式中，所述药剂选自：反义核酸、适体、抗原结合分子、螯合剂和/或诱饵受体。
在各种实施方式中、补体相关疾病选自黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)、早发性黄斑变性(EOMD)、黄斑营养不良、青光眼、糖尿病视网膜病变、溶血性尿毒症综合症(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、自身免疫性葡萄膜炎、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN II)、脓毒症、过敏性紫癜(HSP)、IgA肾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合症(SS)、类风湿性关节炎(RA)、C3肾炎因子肾小球肾炎(C3 NF GN)、遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、脑脊髓炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症(MS)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
还提供了一种在受试者中诊断补体相关病症的发作风险，补体相关疾病的疾病进展风险和/或补体相关疾病存在的风险的方法，所述方法包括确定FHR-4水平和/或受试者血液中编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，所述方法额外包括如果受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高，则施用有效量的靶向补体的治疗剂或降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂。在一些实施方式中，所述方法包括从受试者获得血液样品并测量样品中FHR-4的水平/编码FHR-4的基因的表达水平。
在另一方面，本发明提供了一种选择受试者的方法，使用补体靶向治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达水平的药剂向该受试者治疗，所述方法包括确定受试者中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平，以及任选地，其中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平增加，选择用治疗剂或药剂治疗的受试者。
还提供了一种确定患有或疑似患有补体相关疾病的受试者是否可能对以补体靶向治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4表达水平的药物产生反应的方法，所述方法包括确定患者血液中FHR-4的水平和/或确定患者中编码FHR-4的基因的表达水平。
还提供了一种确定受试者是否对补体靶向的治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达水平的药剂的治疗处理有反应的方法，所述方法包括在给予治疗后确定受试者血液中FHR-4的水平。
在另一方面，本发明提供了降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂在治疗或预防受试者中年龄相关性黄斑变性(AMD)或早发性黄斑变性(EOMD)的方法中的应用。在一些实施方式中，AMD选自地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)。在一些实施方式中，所述降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂是FHR-4的螯合剂和/或诱饵受体。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这种组合。
发明详述
本发明涉及检测，诊断和治疗补体相关疾病。本文提供了确定由补体激活驱动的疾病的发作或进展的风险的方法，以及用于治疗或预防此类疾病的方法。在一些方面，提供了确定黄斑变性发展的风险的方法，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和早发性黄斑变性(EOMD)，以及治疗或预防AMD/EOMD的方法。
发明人已经确定FHR-4是补体激活的正调节剂。本文显示FHR-4可以防止FH介导的C3b分解，该分解将刺激C3转化酶的形成和补体扩增环的进程。组织中高水平的FHR-4可能会促进局部炎症反应和细胞溶解，从而导致与补体激活相关的疾病。
发明人已经确定，在受补体激活(例如AMD的眼睛中)影响的组织中FHR-4不是局部合成的。相反，FHR-4在肝脏中表达，然后在血液中在人体中运输。发明人发现，即使病理性补体激活的最终位点位于或将位于特定组织中，循环的FHR-4水平也可用作发生补体相关疾病的风险的指标。减少补体激活和/或降低FHR-4水平的治疗可降低发展或改善补体相关疾病的风险。
许多与补体相关的疾病的发展与患者的多种遗传改变和/或变异有关。许多基因及其周围的遗传变异可能与特定疾病有关。患有同一疾病的患者的遗传改变的数量和类型可能有很大的差异。例如，AMD风险与在超过34个遗传位点中的各种SNP相关(Fritsche等人，Nat Genet.2016；48(2)：134–143)。因此，可能难以用传统的“一刀切”方式治疗所有患有补体相关疾病的患者。
因此，本发明还涉及确定预期对用补体靶向剂或降低FHR-4水平的药剂治疗补体相关疾病的治疗有反应的患者亚组的确定。发明人已经确定，全身性FHR-4的高水平表明在AMD患者的特定亚组中的AMD风险增加。通过首先确定那些表现出高水平FHR-4的患者，可以使针对补体系统或FHR-4水平的治疗效果最大化。
C3b和FHR-4
蛋白质C3在补体系统中起重要作用，并有助于先天免疫。三种补体途径(经典途径，替代途径和凝集素)均导致C3裂解为C3a，一种有效的过敏毒素和C3b。如果C3b未被灭活，它可以与因子B结合并形成替代途径C3转化酶C3bBb。补体的C3b激活可能发生在非细胞结构上，例如BrM和脉络膜毛细血管层的毛细血管间隔。活性C3转化酶促进正反馈循环，称为扩增环。如果任其发展下去，这个循环将刺激补体末端途径的启动，从而导致炎症反应和细胞裂解。
细胞具有许多能够下调补体级联的细胞表面蛋白。C3b可以通过因子I(FI)和相关的可溶性辅助因子(例如因子H(FH)和因子H样蛋白1(FHL-1))灭活为iC3b。iC3b无法参与C3转化酶的组装，并且是调理素，能够介导白细胞募集和碎片清除。iC3b进一步分解为C3c和C3d，后者在增强B细胞反应中发挥作用。
已经提出了FHR蛋白充当补体激活的正调节剂，从而使得C3转化酶形成并驱动扩增环。
人补体因子H相关蛋白4(FHR-4或CFHR-4；Uniprot：Q92496，入门版145(2018年2月28日)，序列版3(2014年1月22日))属于血浆糖蛋白的H因子家族，包括短共有重复(SCR)结构域(也称为Sushi结构域或补体控制蛋白(CCP)结构域)。
FHR-4在人血浆中被检测为两种不同的糖蛋白：一种由9个SCR组成的578个氨基酸(86-kDa)长同种型，称为FHR-4A(Uniprot：Q92496-1；SEQ ID NO：1)和一种由5个SCR组成的331个氨基酸
Figure BDA0002892941500000091
的较短的同种型FHR-4B(Uniprot Q92496-3；SEQ ID NO：3)，对应于SCR 1和FHR-4A的6-9。FHR-4A的第二个同种型(SEQ ID NO：2)在20位具有一个缺失(Glu)。人FHR-4包含19个氨基酸的信号肽，该肽经切割可生成成熟的FHR-4蛋白(SEQ IDNO:5；SEQ ID NO：6)，FHR-4蛋白由CFHR4基因(NCBI基因ID：10877)编码。
如本文所用，术语“FHR-4”包括FHR-4A同种型1、FHR-4A同种型2或FHR-4B中的至少一种，并且优选包括FHR-4A同种型1和2以及FHR-4B。“FHR-4”是指来自任何物种的FHR-4，并且包括来自任何物种的FHR-4的同种型、片段、变体或同源物。在优选的实施方式中，“FHR-4”是指人FHR-4。
FHR-4同种型缺少与FH和FHR-1的N端补体抑制域SCR1-4同源的SCR。但是，FHR-4蛋白确实与包含C3b/C3d结合位点的C末端FH结构域SCR19-20具有同源性，并且FHR-4A和FHR-4B均已显示与C3b结合(Hellwage J.,FEBS Lett.1999,462,345–352和Hellwage J.,J.Immunol.2002,169,6935–6944；Hebecker和Józsi,J Biol Chem.2012,287(23):19528-36)。此外，据报道，FHR-4充当组装C3转化酶的平台(Hebecker和Józsi，J Biol Chem.2012,287(23):19528-36)。
评估补体相关疾病的方法
在一些方面，本发明提供了使用全身性FHR-4水平来评估补体相关病症的发作风险或进展风险的方法。
所述方法可以是补体相关病症的发作或进展的风险的诊断、预后和/或预测。诊断方法可用于确定疾病的诊断或严重程度，预后方法可帮助预测标准治疗条件下确定的临床人群中疾病的可能病程，预测方法可根据功效和/或安全性预测对治疗的可能反应，从而支持临床决策。
本发明的方法使用全身性FHR-4的水平作为生物标志物来确定受试者是否有发展补体相关病症的风险。术语“障碍”，“疾病”和“病症”可以互换使用，并且是指身体部位、器官或系统的病理学问题，其特征可以是可识别的一组体征或症状。术语“补体相关疾病”是指包含或由补体系统的缺陷或异常引起的障碍、疾病或病症。在一些实施方式中，补体相关疾病是由补体激活或补体过度激活驱动的疾病。
补体相关疾病可包括经典、替代和/或凝集素补体途径的破坏。在某些情况下，疾病可能与补体系统调节成分的缺乏有关。在一些实施方式中，所述疾病可以是与替代补体途径、替代补体途径的破坏相关和/或与替代补体途径的调节成分的缺乏相关的疾病。在某些情况下，该疾病与C3、C3b、FH、FHL-1、FI、CR1、CD46、CD55、C4BP、B因子(FB)、D因子(FD)、FHR-1、FHR-2、FHR-3、FHR-5、SPICE、VCP(或VICE)和/或MOPICE的一种或多种相关。在某些情况下，该疾病与C3、C3b、FH、FHL-1、FI、CR1、CD46、CD55、C4BP、B因子、D因子、FHR-1、FHR-2、FHR-3、FHR-5、SPICE、VCP(或VICE)和/或MOPICE的一种或多种活性缺陷或异常有关，或在病理上涉及其中一种或多种蛋白质。
在一些实施方式中，所述疾病可以是与C3或含C3的复合物、与C3或含C3的复合物有关的活性/反应、或与C3或含C3的复合物有关的活性/反应的产物有关的疾病。即，在一些实施方式中，所述疾病是在病理学上涉及C3、含有C3的复合物、与C3或含有C3的复合物有关的活性/反应、或所述活性/反应的产物的疾病。在一些实施方式中，与对照状态相比，所述疾病可以与C3或含C3的复合物的水平升高、与C3或含C3的复合物相关的活性/反应的水平升高、或与C3或C3的复合物相关的活性/反应产物的水平升高有关。
在一些实施方式中，所述疾病可以是与C3b或含C3b的复合物、与C3b或含C3b的复合物相关的活性/反应、或与C3b或含C3b的复合物相关的活性/反应的产物相关的疾病。也就是说，在一些实施方式中，所述疾病是其中病理上涉及C3b、含C3b的复合物、与C3b或含C3b的复合物相关的活性/反应、或所述活性/反应的产物的疾病。在一些实施方式中，与对照状态相比，所述疾病可能与C3b或含C3b的复合物水平升高、与C3b或含C3b的复合物相关的活性/反应水平升高、或与C3或C3的复合物相关的活性/反应产物的水平升高有关。
在一些实施方式中，所述疾病可以是与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46，与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46相关的活性/反应或与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46相关的活性/反应的产物相关的疾病。在一些实施方式中，所述疾病是其中在病理上涉及的FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46，与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46相关的活性/反应，或所述活性/反应的产物的疾病。在一些实施方案中，与对照状态相比，所述疾病可以与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46的水平降低，与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46，或与FH、FHL-1、FI、FB、FD、CR1和/或CD46相关的活性/反应的产物水平降低相关的疾病。
在一些实施方式中，与对照状态相比，所述疾病与C3、C3b、C3转化酶和/或C3bBb水平升高有关。在一些实施方式中，与对照状态相比，所述疾病与iC3b水平降低有关。
所述疾病可以是眼科疾病。在一些实施方式中，待治疗或预防的疾病或病症是补体相关性眼部疾病。在一些实施方式中，待治疗或预防的疾病或病症是黄斑变性。在一些实施方式中，所述疾病可以选自，即年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管形成(CNV)、黄斑营养不良和糖尿病性黄斑病变中的一种或多种。如本文所用，术语“AMD”包括早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)和“湿性”(即渗出性或新生血管性)AMD，如本文所述，每种疾病本身都可能是被检测、治疗和/或预防的疾病。在一些实施方式中，待治疗或预防的疾病或病症是上述疾病/病症的组合，例如，“干性”和“湿性”AMD。在一些实施方式中，待治疗或预防的疾病或病症不是“湿性”AMD或脉络膜新生血管。通常将AMD定义为在50岁及其以上的受试者中导致视力下降。在一些实施方式中，待治疗的受试者是50岁或以上，即至少50岁。
如本文所用，“早期AMD”是指AMD的一个阶段，其特征是在与RPE层相邻的布鲁赫膜内存在中等大小的玻璃疣，直径通常可达约200μm。早期AMD患者通常不会出现明显的视力丧失。如本文所用，“中期AMD”是指AMD的一个阶段，其特征在于视网膜中玻璃疣和/或色素的大量变化。中期AMD可能伴有一定视力下降。如本文所用，“晚期AMD”是指AMD的一个阶段，其特征在于存在玻璃疣和视力丧失，例如由于黄斑受损，导致严重的中心视力丧失。在AMD的所有阶段中，都可能存在“网状玻璃膜疣”(RPD)或“网状玻璃疣”(也称为视网膜下疣状沉积物(SDD))，这是指视网膜神经感觉层与RPE之间的视网膜下腔中细胞外物质的积累。“晚期AMD”包括“干性”和“湿性”AMD。在“干性”AMD(也称为地图样萎缩)中，黄斑中的光敏细胞逐渐分解，从而将视觉信息传递到大脑以及黄斑下方的支持组织。在“湿性”AMD(也称为脉络膜新生血管，新生血管性和渗出性AMD)中，异常血管在下面生长并进入视网膜。这些血管会渗漏液体和血液，从而导致黄斑肿胀和损伤以及随后的疤痕形成。损伤可能是快速而严重的。
在一些实施方式中，待治疗或预防的疾病或病症是早发性黄斑变性(EOMD)。如本文所用，“EOMD”是指表型严重的黄斑变性亚型，其表现出比经典AMD早得多的发病年龄并且导致更多年的实质性视力丧失。患者可能表现出早发型玻璃疣表型，包括均匀的，小的微微凸起的黄色视网膜下结节，随机散布在黄斑中，也称为“基底层玻璃膜疣”或“皮肤表皮疣”。EOMD也可称为“中发性黄斑变性”。EOMD子集在例如Boon CJ等人Am J Hum Genet 2008；82(2):516-23,van de Ven JP,等人Arch Ophthalmol 2012；130(8):1038-47,和Taylor RL等人Ophthalmology.2019 Mar 21.pii:S0161-6420(18):33171-3中所述，在此通过引用将其每一个的全部内容并入本文。与其他类型的黄斑变性一样，EOMD与补体调节异常和H因子活性破坏有关。在一些实施方式中，待治疗的受试者是49岁或更年轻。在一些实施方式中，待治疗的受试者为15至49岁，即15至49岁之间。在一些实施方式中，待治疗的疾病或病症是黄斑营养不良。黄斑营养不良是一种遗传病，通常由单个基因的突变引起，导致黄斑变性。
在一些实施方式中，所述疾病可以选自溶血性尿毒症综合征(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、自身免疫性葡萄膜炎、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN II)、败血症、过敏性紫癜(HSP)、IgA肾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、类风湿性关节炎(RA)、C3肾病因子肾小球肾炎(C3 NF GN)、遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、脑脊髓炎、动脉粥样硬化、多发性硬化(MS)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
在某些情况下，所述疾病是神经和/或神经退行性疾病。
一方面，本发明提供了一种用于确定受试者是否有患有补体相关病症的风险的方法，所述方法包括确定所述受试者的血液中FHR-4的水平。在某些情况下，所述方法包括确定所述受试者的血液中FHR-4水平的增加。在某些情况下，FHR-4水平的升高表明罹患该疾病的风险增加。所述方法可以用于确定受试者是否处于疾病发作的风险中，和/或是否处于疾病的进展、加重或恶化的风险中。
“FHR-4的水平”可以是FHR-4的水平、量或浓度。在一些实施方式中，本文提供的方法确定循环或全身FHR-4的水平。如本文所用，术语“生物标志物”是指一种或多种生物状态或状况的可测量指标。术语“发展”、“发展中”和“发展了”，例如，疾病的“发展”、“发展中”和“发展了”，如本文所用，既指疾病的发作，也指疾病状态的进展、加重或恶化。
在另一方面，本发明提供了一种用于确定受试者是否有发展黄斑变性(例如，EOMD和/或AMD)的风险的方法，所述方法包括确定所述受试者的血液中FHR-4的水平。在某些情况下，所述方法包括确定所述受试者的血液中FHR-4水平的增加。在某些情况下，FHR-4水平的升高表明罹患该疾病的风险增加。
所述方法可用于确定受试者是否有发生黄斑变性的风险，例如，EOMD和/或AMD，和/或有EOMD和/或AMD进展的风险。在某些情况下，所述疾病选自EOMD、AMD、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)和黄斑营养不良。
在其他方面，本发明提供了一种用于鉴定有患补体相关性疾病风险的受试者的方法，所述方法包括确定所述受试者的血液中FHR-4的水平。所述疾病可能是EOMD和/或AMD。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括确定受试者血液中FHR-4水平的增加，其中将FHR-4水平与参考值进行比较。在一些实施方式中，与参考值相比，受试者的血液中FHR-4水平的增加表明受试者罹患补体相关疾病的风险增加。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括确定受试者的血液中FHR-4的量的增加。例如，一种方法可以包括测量所述受试者的血液中的FHR-4的量。在一些实施方式中，血液中FHR-4的量增加表明所述受试者罹患疾病的风险增加。在某些情况下，与参考值相比，血液中FHR-4量的增加表明所述受试者罹患疾病的风险增加。
在一些实施方式中，FHR-4的增加量是5-10μg/ml，10-15μg/ml，15-20μg/ml或>20μg/ml的FHR-4浓度。即，5-10μg/ml，10-15μg/ml，15-20μg/ml或＞20μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者罹患疾病的风险增加。在优选的实施方式中，增加的FHR-4的量＞15μg/ml。在其他优选的实施方式中，增加的FHR-4的量＞20μg/ml。在一些实施方式中，>15μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者罹患疾病的高风险，5-15μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者罹患疾病的中度风险，和/或<5μg/ml的FHR-4浓度表明所述受试者罹患疾病的风险较低。
在某些情况下，FHR-4浓度为5μg/ml，6μg/ml，7μg/ml，8μg/ml，9μg/ml，10μg/ml，11μg/ml，12μg/ml，13μg/ml，14μg/ml，15μg/ml，16μg/ml，17μg/ml，18μg/ml，19μg/ml，20μg/ml，21μg/ml，22μg/ml，23μg/ml，24μg/ml，25μg/ml，26μg/ml，27μg/ml，28μg/ml，29μg/ml，30μg/ml或更高，表明受试者罹患所述疾病的风险增加。
本发明还提供了利用编码FHR-4的基因的表达水平作为生物标记物来确定受试者是否患有补体相关疾病的风险的方法。因此，在一些方面，提供了一种用于确定受试者是否患有补体相关疾病的风险的方法，所述方法包括确定所述受试者中编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，编码FHR-4的基因的表达水平增加表明所述受试者患有疾病的风险增加。在一些实施方式中，当与编码FHR-4的基因的参考表达水平相比时，编码FHR-4的基因的表达水平增加表明所述受试者患有疾病的风险增加。在某些情况下，所述方法包括测量编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，编码FHR-4的基因是CFHR4。在一些实施方式中，如上所述，所述方法包括确定/测量编码FHR-4的基因的表达水平并确定FHR-4的水平。
本文提供的任何方法可以包括确定来自受试者的样品中的FHR-4的水平或量和/或编码FHR-4的基因的表达水平。样品可以从任何组织或体液中获取。在优选的布置中，样品是从体液中采集的，更优选地是从人体循环的体液中采集。因此，样品可以是血液样品或淋巴样品。在特别优选的布置中，样品是血液样品或血液来源的样品。血液来源的样品可能是患者血液的选定的一部分，例如选定的含细胞部分或血浆或血清部分。选定的血清部分可包含去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的流体部分。或者，样品可以包括或可以来自所述个体的组织样品、活检或分离的细胞。
在一些实施方式中，样品包含来自肝脏的组织和/或肝细胞。在一些实施方式中，样品包含循环免疫细胞，例如分离的免疫细胞。在某些情况下，样品可以包含一个或多个单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和/或淋巴细胞，例如，NK细胞、T细胞和/或B细胞。
因此，在一些方面，本发明提供了一种用于确定受试者是否患有补体相关疾病的风险的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中确定FHR-4的水平或量和/或编码FHR-4的基因的表达水平。样品可以是相同的样品，或可以包含一个以上的样品，例如一个来自血液，一个来自组织。
在一些实施方式中，本文提供的任何方法包括从受试者获得血液来源的样品或生物样品的第一阶段。
在一些情况下，本文提供的方法包括确定FHR-4的水平或量以及确定编码FHR-4的基因的表达水平。这两个确定步骤可以在来自受试者的相同样品或不同样品上进行。在一些情况下，本文提供的任何方法可以包括定量FHR-4的量和/或编码FHR-4的基因的表达水平。
本发明所述的方法可以在人或动物体外进行。可以在体外，离体或体内进行本发明的方法，或产品可存在于体外，离体或体内。术语“体外”旨在涵盖在实验室条件下或在培养物中用材料、生物物质、细胞和/或组织进行的实验，而术语“体内”旨在涵盖用完整的多细胞生物进行的实验和步骤。“离体”是指在生物体外部存在或发生的某些事物，例如在人体或动物体外，可能在组织(例如整个器官)或从生物体获取的细胞上。在一些实施方式中，本文提供的方法的确定、检测、测量、定量和/或诊断步骤在体外进行。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于确定受试者是否患有补体相关疾病的风险的方法，其包括以下一个或多个步骤：(i)从受试者获得血液来源的样品；(ii)将样品与特异性结合FHR-4的抗体接触；和(iii)检测样品中存在的FHR-4的含量。在一些实施方式中，所述方法包括检测FHR-4与抗体之间的结合。在一些实施方式中，所述方法包括(i)提供来自受试者的血液来源的样品，(ii)将该样品与特异性结合FHR-4的抗体接触；以及(iii)检测样品中存在的FHR-4的量。所述方法可以包括如上所述的检测、测量或定量FHR-4的浓度。
所述抗体可以是本领域已知或可商购的任何合适的FHR-4抗体，例如：来自安迪生物(R&D Systems)的MAB5980、IC5980G、AF5980；和来自英杰公司的MA5-24288、PA5-41991；或来自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)的PA5-41991。FHR-4抗体也可以通过本文所述的或本领域已知的技术产生，参见，例如，Chiu和Gilliland,Curr Opin StructBiol.2016,38:163–173,Jakobovits A Curr Opin Biotechnol.1995Oct；6(5):561-6,和Brüggemann M等人，Arch Immunol Ther Exp(Warsz).2015；63(2):101–108。一种合适的技术是噬菌体展示技术，参见例如，Hammers和Stanley,J Invest Dermatol.2014,134(2):e17和Bazan J等人，Hum Vaccin Immunother.2012,8(12):1817–1828。抗原结合多肽链也可以通过诸如化学合成的技术产生(参见例如Chandrudu等人，分子(2013)，18：4373-4388)，重组表达如在Green和Sambrook，分子克隆：实验室手册(第4版)，冷泉港出版社，2012，以及《自然方法》(2008)；5(2)：135-146或无细胞蛋白合成(CFPS；参见例如Zemella等人Chembiochem(2015)16(17)：2420-2431)中提出的技术，所有这些文献均通过引用的方式整体并入本文。
使用抗体检测、测量或定量FHR-4的量的方法是本领域已知的，包括例如ELISA，参见例如Crowther JR，《分子生物学方法，ELISA指南》，第二版，Humana出版社，施普林格科学+商业媒体有限责任公司2009的一部分；Butler J.E.固定在固相上的抗原和抗体的行为，在：M.H.V.范·雷根莫特尔(Van Regenmortel)编辑的《抗原的结构》，Boca Raton，FL：CRC出版社，1992：209-259.第1卷,209；CRC出版社股份有限公司；Lequin RM.，临床化学51，12(2005)：2415-2418；以及Engvall和Perlmann，免疫化学8.9(1971)：871-874，其通过引用整体并入本文。其他方法可包括下文描述的和/或对本领域技术人员而言显而易见的质谱分析、蛋白质印迹、蛋白质免疫染色、免疫电泳和蛋白质免疫沉淀。
本文还提供了一种评估受试者患有补体相关疾病的倾向或易感性的方法，包括：
(a)提供该受试者的血液样本；
(b)评估样本中FHR-4的水平；
(c)使用(b)的结果来确定受试者患有补体相关疾病的可能性。
在某些情况下，FHR-4水平升高表明所述受试者患有疾病的风险增加。在某些情况下，与参考值相比，血液中FHR-4量的增加表明所述受试者患有疾病的风险增加。FHR-4的浓度和相关的风险等级如上所述。评估样品中FHR-4水平的方法如下所述。
如本文所用，术语“参考值”是指在分析期间用于比较的已知测量值。在某些情况下，参考值是从处于定义的健康状态的个人或群体获得的一个或一组测试值。在某些情况下，参考值是通过确定已知没有补体相关疾病的受试者的FHR-4水平而获得的。在某些情况下，参考值是通过确定先前来自同一受试者(例如，在疾病发展的早期)的FHR-4的水平或量来设置的。参考值可以是标准值，标准曲线或标准数据集。
本文提供的方法可包括确定受试者的基因组中是否存在以补体失调相关的多态性为特征的遗传图谱。多态性可以在诸如CCL28，FBN2，ADAM12，PTPRC，IGLC1，HS3ST4，PRELP，PPID，SPOCK，APOB，SLC2A2，COL4A1，MYOC，ADAM19，FGFR2，C8A，FCN1，IFNAR2，C1NH，C7和ITGA4等基因内或附近发现。与补体失调有关的遗传图谱可包括一个或多个，通常是多个单核苷酸多态性，例如，如在US 2010/0303832的表I和II中列出的，其通过引用整体并入本文。
遗传因子被认为在AMD和EOMD的发展中起作用。因此，本文描述的任何评估或治疗方法可以与评估AMD相关和/或EOMD相关和/或黄斑营养不良相关遗传变异的方法结合进行。
在一些情况下，本文提供的方法还包括确定受试者中是否存在与AMD相关的一种或多种遗传因子，例如一种或多种AMD相关的遗传变异。在一些情况下，所述方法包括(直接或间接)筛选一种或多种遗传因子的存在或不存在。在一些实施方式中，遗传因子是遗传风险因子。在一些实施方式中，已经确定受试者具有一种或多种这样的风险因子。在一些实施方式中，本发明的方法包括确定受试者是否具有一种或多种这样的风险因子。
在一些实施方式中，一种或多种遗传因子可以位于染色体1上的CFH/CFHR基因座。
所述一种或多种遗传因子可以位于以下的一种或多种中：CFH，例如选自Y402H(即rs1061170C)，rs1410996C，I62V(rs800292)，A473A(rs2274700)，R53C，D90G，D936E(rs1065489)，R1210C，IVS1(rs529825)，IVS2 insTT，IVS6(rs3766404)，A307A(rs1061147)，IVS10(rs203674)，rs3753396，R1210C，rs148553336，rs191281603，rs35292876，和rs800292；CFHR4，例如选自rs6685931和rs1409153；CFI，例如选自G119R和rs141853578；CFB，例如rs4151667，C2，例如rs9332739，C9，例如P167S；和/或C3，例如K155Q。在一些实施方式中，遗传因子是Y402H(即rs1061170C)。在一些实施方式中，遗传因子是rs3753396。在一些实施方式中，遗传因子是rs6685931和/或rs1409153。在一些实施方式中，遗传因子不是rs6685931。
在某些情况下，遗传因子位于CFHR4基因中。
合适的遗传风险因子和遗传变体在本领域中是已知的，并且可以在例如EdwardsAO等人，Science 2005,308(5720):421-4；Hageman GS等人，Proc Natl Acad Sci U SA.2005,102(20):7227–7232；Haines JL等人，Science 2005,308(5720):419-21,Klein RJ等人，Science 2005,308(5720):385–389；Fritsche等人,Nat Genet.2016,48(2):134-43；US 2010/0303832；或Clark等人,J Clin Med.2015,4(1):18-31中所述，每个通过引用整体并入本文。
在一些情况下，本文提供的方法还包括确定受试者中是否存在与EOMD有关的一种或多种遗传因子，例如，一种或多种与EOMD相关的遗传变体。在一些情况下，所述方法包括(直接或间接地)筛选是否存在一种或多种遗传因子。在一些实施方式中，遗传因子是遗传风险因子。在一些实施方式中，已经确定受试者具有一种或多种这样的风险因子。在一些实施方式中，本发明的方法包括确定受试者是否具有一种或多种这样的风险因子。在一些实施方式中，受试者可具有一种或多种早发性黄斑变性(EOMD)的风险因子。
EOMD被认为是由CFH基因的罕见变体的单基因遗传引起的(参见例如Boon CJ等人，Am J Hum Genet 2008；82(2)：516-23；van de Ven JP等人，Arch Ophthalmol 2012；130(8)：1038-47；Yu Y等人，Hum Mol Genet 2014；23(19)：5283-93；Duvvari MR等人，MolVis 2015；21：285-92；Hughes AE等人；Acta Ophthalmol 2016；94(3)：e247-8；Wagner等人Sci Rep 2016；6：31531；Taylor RL等人，Ophthalmology.2019 Mar 21.pii：S0161-6420(18)：33171-3)。在一些实施方式人中，受试者可具有一种或多种与EOMD相关的遗传变体。与EOMD相关的遗传变体描述于例如Servais A等人，Kidney Int,2012；82(4):454-64和Dragon-Durey MA,等人，J Am Soc Nephrol 2004；15(3):787-95；通过引用将其整体并入本文。在一些实施方式中，所述受试者可具有一种或多种以下与EOMD相关的遗传变异体：CFH c.1243del,p.(Ala415Profs*39)het；CFH c.350+1G>T het；CFH c.619+1G>A het；CFHc.380G>A,p.(Arg127His)；CFH c.694C>T,p.(Arg232Ter)；或CFH c.1291T>A,p.(Cys431Ser)。
在某些情况下，所述方法包括筛选与AMD风险或保护相关的RCA基因座(位于从CFH基因延伸到CD46(MCP)基因的第一个染色体上的DNA序列区域)内的缺失。
在一些情况下，本文提供了一种方法，所述方法包括确定与增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4的基因的表达相关的遗传因子是否存在。在一些情况下，一种方法包括确定与FHR-4水平增加的风险和/或编码FHR-4的基因表达增加的风险相关的遗传因子是否存在。
在一些情况下，在确定或已经确定受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达升高的情况下，本文提供的方法包括确定与所述升高相关的遗传因子是否存在。即，本发明的方法可以包括确定与FHR-4水平的增加和/或编码FHR-4的基因的表达水平的增加有关的遗传因子是否存在，以证实所述水平是遗传变异的结果或与遗传变异有关。
确定遗传因子存在与否的方法包括基因组DNA的限制性片段长度多态性鉴定(RFLPI)，基因组DNA的随机扩增多态性检测(RAPD)，扩增片段长度多态性检测(AFLPD)，多位点可变数量串联重复序列(VNTR)分析(MLVA)，SNP基因分型，多位点序列分型，PCR，DNA测序，例如Sanger测序或下一代测序，等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针，以及寡核苷酸微阵列或珠子。其他合适的方法描述于例如Edenberg HJ和Liu Y，冷泉港方案；2009；doi：10.1101/pdb.top62，和Tsuchihashi Z和Dracopoli NC，药物基因组学杂志，2002，2：103-110。
本文提供的用于评估补体相关疾病的罹患风险，即发作或进展风险的方法可以与本领域技术人员已知的其他诊断方法和/或针对此类疾病的测试结合进行。在某些情况下，评估补体相关疾病罹患风险的方法包括进一步的技术，这些技术选自通过溶血测定法测定CH50或AH50，测定MAC复合物(C789)生成过程中新抗原形成的测定，C3缺乏症筛查，甘露糖结合凝集素分析，定量单个补体成分的免疫化学分析，流式细胞仪评估细胞结合的调节蛋白(例如CD55，CD59和CD35)，肾功能测试以及确定血浆水平和/或补体调节蛋白水平和/或补体激活水平(例如C3，C4，CFH，CFI水平)，参见例如Shih AR和Murali MR,Am.J.Hematol.2015,90(12):1180-1186,Ogedegbe HO,实验室医学，2007,38(5):295–304，和Gowda S等人，N Am J Med Sci.2010,2(4):170–173，将其全部内容通过引用整体并入本文。
在某些情况下，本文提供的用于评估AMD和/或EOMD发展风险的方法包括进一步评估技术，其选自黑暗适应性测试，对比敏感度测试(例如佩利·罗布森(Pelli Robson))，使用例如斯内伦视力表和/或阿姆斯勒方格表的视觉敏锐度测试，法恩斯沃思-孟塞尔100色相测试和最大色彩对比度灵敏度测试(MCCS)用于评估色彩敏锐度和色彩对比敏感度，超锐度视野优先检查(PHP)，眼后的眼底摄影，眼底检查，眼底自发荧光，光学相干断层成像术，血管造影术(例如荧光素血管造影术，眼底荧光血管造影，吲哚青绿血管造影，光学相干断层扫描血管造影)，视网膜电图方法和/或测量组织学的变化(例如萎缩，视网膜色素变化，渗出性变化，例如眼睛出血，硬渗出物，视网膜下/RPE下/视网膜内液，和/或玻璃疣的存在)。
治疗和预防应用
本发明的方法提供了用于鉴定具有增加的FHR-4水平并且因此可能处于患有补体相关疾病的风险的患者的特定亚组的手段。选定的患者可能会因补体相关疾病而接受治疗。本文所述的方法还可用于选择用于治疗或预防性治疗的受试者，确定受试者是否对治疗性疗法有反应，和/或确定受试者是否可能对治疗或预防性疗法例如补体相关疾病的治疗有反应。
因此，在某些方面，具有发展成补体相关疾病的风险的受试者，患有补体相关疾病的受试者，已被确定有患补体相关疾病的风险和/或患有补体相关疾病的受试者，具有增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4的基因的表达的受试者，或已确定具有增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4的基因的表达的受试者，例如，用本文所述的方法，上述受试者可从补体相关疾病的治疗中受益。
本文提供的用于确定受试者是否有患有补体相关疾病的风险的任何方法可以另外包括治疗步骤，以治疗所述疾病。例如，本文提供的用于确定受试者是否有患有补体相关疾病的风险的方法可以包括治疗或预防所述疾病的治疗步骤，其中已经确定该受试者的FHR-4水平升高和/或增加了编码FHR-4的基因的表达。
在一个方面，本文提供了一种用于确定受试者是否有患有补体相关疾病的风险和治疗所述疾病的方法，所述方法包括确定所述受试者的血液中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平，并向所述受试者施用有效量的靶向补体的治疗剂，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高。测量FHR-4和风险等级的方法如本文所述。
治疗步骤可包括向受试者施用治疗或预防有效量的一种或多种靶向补体的治疗剂，例如一种或多种C1抑制剂，C5抑制剂，C5a抑制剂，C5aR拮抗剂，C3抑制剂，C3a抑制剂，C3b抑制剂，C3aR拮抗剂，经典通路抑制剂，替代通路抑制剂，FH补充疗法和/或MBL通路抑制剂。靶向补体的具体治疗剂包括但不限于一种或多种人C1酯酶抑制剂(C1-INH)，依库丽单抗(
Figure BDA0002892941500000211
亚力兄制药；靶向C5的人源化单克隆IgG2/4抗体)，APL-2(阿佩利斯)，mubodina(阿迪安制药和生物技术公司)，ergidina(阿迪安制药和生物技术公司)，利妥昔单抗(Biogen Idec，Genentech，霍夫曼-拉罗氏)，奥法木单抗(Genmab，GSK)，坎普他汀类似物，CD59，PMX53和PMX205的可溶和靶向形式(瑟法隆/Teva)，JPE-1375(Jerini)，CCX168(ChemoCentryx)，NGD-2000-1(前神经原)，辛吕泽(Cinryze，夏尔)，Berinert(CSL贝林)，欣特(Sanquin)，Ruconest/Conestat alfa(Pharming)，TNT009(真北)，OMS721(奥美罗斯)，CLG561(诺瓦蒂斯)，AMY-101(阿明达斯)，APL-1(阿佩利斯)，APL-2(阿佩利斯)，米考西普(MRC)，兰帕单抗(基因泰克)，ACH-4471(阿克琉斯)，ALXN1210(亚力兄制药)，斯多鲁单抗/LFG316(诺华/莫弗西斯)，Coversin(Akari)，RA101495(Ra制药)，Zimura(Ophthotech)，ALN-CC5(奥尼兰姆)，IFX-1(InflaRx)，ALXN1007(亚力兄制药)，阿伐可泮/CCX168(Chemocentryx)和/或一种或多种治疗剂，例如Ricklin等人,Mol Immunol.2017,89:10-21；Ricklin和Lambris,Adv Exp Med Biol.2013,734:1–22；Ricklin和Lambris,SeminImmunol.2016,28(3):208-22；Melis JPM等人,Mol Immunol.2015 67(2):117-130；Thurman JM,Nephrol Dial Transplant,2017 32:i57-i64,Cashman SM等人,PLoSOne.2011,6(4):e19078；Bora NS等人,J Biol Chem.2010,285(44):33826-33中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者中的补体相关疾病的方法，所述方法包括给予有效量的靶向补体的治疗剂，其中待治疗的受试者的FHR-4的水平升高和/或编码FHR-4的基因的水平升高。
在其他方面，本发明提供了补体靶向疗法在治疗或预防受试者中的补体相关疾病的方法中的用途，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因的水平升高。在其他方面，提供了补体靶向的治疗剂在制备用于治疗或预防受试者的补体相关疾病的药物中的用途，其中所述受试者的FHR-4的水平升高和/或编码FHR-4的基因的水平升高。
还提供了一种治疗或预防受试者的补体相关疾病的方法，或补体靶向治疗剂在治疗或预防受试者的补体相关疾病的方法中的用途，所述方法包括给予有效量的靶向补体的治疗剂，其中如果所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高，则选择所述受试者进行治疗。
本发明还提供了一种选择要用补体靶向治疗剂治疗的患者的方法，包括确定所述受试者的血液中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平。所述患者可能患有或已经确定患有补体相关疾病，例如通过本文提供的方法。
在本文提供的各个方面，待治疗的受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因的表达水平升高。在一些实施方式中，已经确定待治疗的受试者的FHR-4水平升高和/或已经确定编码FHR-4的基因的表达水平升高。如上所述，FHR-4的水平或编码FHR-4的基因的表达可以或已经使用本文提供的任何方法确定。在一些实施方式中，所述受试者具有如本文所述的患有补体相关疾病的高、中或低风险。所述方法可包括确定例如，如本文所述的在样品中FHR-4的量或浓度，确定与补体失调相关的遗传概貌的存在与否和/或评估患有补体相关疾病的风险的其他方法。在各个方面，受试者可能具有或已经确定具有增加的FHR-4水平。在其他实施方式中，受试者可能具有或已经确定具有增加的编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，受试者可能具有或已经确定具有增加的FHR-4水平和增加的编码FHR-4基因的表达水平。在一些实施方式中，所述基因是CFHR4。
根据本发明的某些方面，处于患补体相关疾病的风险中的受试者，患有补体相关疾病的受试者，已被确定具有患补体相关疾病的风险和/或患有补体相关疾病的受试者，具有FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达增加的受试者，或者已经确定具有FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达升高的受试者，例如通过本文所述的方法，上述受试者可从降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的治疗中受益。
因此，本文提供的用于确定受试者是否有患补体相关疾病的风险的任何方法可以另外包括治疗步骤，该步骤包括向受试者施用有效量的降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂。
在一些方面，本发明提供了一种用于确定受试者是否患有补体相关疾病的风险和治疗所述疾病的方法，所述方法包括在所述受试者的血液中确定FHR-4水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平，并向受试者施用有效量的靶向补体的治疗剂，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因的水平升高。本文描述了测量FHR-4和风险等级的方法。
本发明提供了一种在受试者中治疗或预防补体相关疾病的方法，其包括向受试者施用治疗或预防有效量的降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂。还提供了降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因的表达水平的药剂在治疗或预防受试者的补体相关疾病的方法中的用途。还提供了降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因的表达水平的药剂在制备用于治疗或预防补体相关疾病的药物中的用途。在某些情况下，将药剂施用于有需要的受试者。
在各个实施方案中，受试者已经患有或已经确定患有，例如，通过本文提供的方法，补体相关疾病和/或患有补体相关疾病的风险增加。在一些实施方式中，受试者具有如本文所述的患有补体相关疾病的高、中或低风险。在一些实施方式中，受试者已经具有或已经被确定具有，例如通过本文提供的方法，FHR-4水平增加和/或编码FHR-4的基因表达水平增加。
本发明提供了鉴定用于治疗补体相关疾病的受试者的方法。因此，本文提供了选择用于治疗或预防补体相关疾病的受试者的方法，所述治疗包括给予有效量的降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因表达水平的药剂，其中如果受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高，则选择该受试者进行治疗。所述受试者可能已经患有或已经确定患有例如通过本文提供的方法确定的补体相关疾病和/或具有水平升高的FHR-4和/或水平升高的编码FHR-4的基因表达。
还提供了降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因的表达水平的药剂在治疗或预防受试者的补体相关疾病的方法中的用途，其中如果受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高，则选择该受试者进行治疗。所述受试者可能已经患有或已经确定患有例如通过本文提供的方法确定的补体相关疾病，具有水平升高的FHR-4和/或水平升高的编码FHR-4的基因表达。所述方法可以包括向受试者施用有效量的药剂。
本发明还提供了一种选择用降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂治疗的患者的方法，包括确定所述受试者的血液中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平。所述患者可能患有或已经确定患有补体相关疾病，例如通过本文提供的方法。可以根据本文提供的任何方法选择患者进行治疗。
在本文提供的各个方面，待治疗的受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达水平升高。在一些实施方式中，已经确定待治疗的受试者的FHR-4水平升高和/或已经确定的编码FHR-4的基因表达水平升高。如上所述，可以使用本文提供的任何方法来确定FHR-4的水平或编码FHR-4的基因的表达水平。所述方法可包括确定如本文所述的例如，样品中FHR-4的量或浓度，确定与补体调节异常有关的遗传谱的存在与否，和/或评估患有补体相关疾病的风险的其他方法。在一些实施方式中，受试者具有如本文所述的患有补体相关疾病的高、中或低风险。在各个方面，受试者可能具有或已经确定具有增加的FHR-4水平。在其他实施方式中，受试者可能具有或已经确定具有增加的编码FHR-4的基因的表达水平。在一些实施方式中，受试者可能具有或已经确定具有增加的FHR-4水平和增加的编码FHR-4基因的表达水平。在一些实施方式中，所述基因是CFHR4。
适合于降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂如下文描述和/或本领域已知。
上文描述了本发明可以治疗或预防的补体相关疾病，包括与C3b、FH、FHL-1、FI、CR1、CD46、CD55、C4BP、B因子(FB)、D因子(FD)、FHR-1、FHR-2、FHR-3、FHR-5、SPICE、VCP(或VICE)和/或MOPICE中的一种或多种相关的疾病。
在某些情况下，本文所述的方法可用于治疗或预防下述疾病，或选择治疗或预防下述疾病的患者，所述疾病将从以下一种或多种中受益：降低C3bBb型C3转化酶、C3bBb3b型C5转化酶或C4b2a3b型C5转化酶的水平或活性；降低C3b、C5b或C5a的水平；或增加iC3b、C3f、C3dg或C3d的水平。
待治疗或预防的疾病可以选自黄斑变性、早发性黄斑变性(EOMD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)、黄斑营养不良、青光眼、糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑病变、溶血性尿毒症综合症(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、自身免疫性葡萄膜炎、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN II)、败血症、过敏性紫癜(HSP)、IgA肾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合症(SS)、类风湿性关节炎(RA)、C3肾炎因子肾小球肾炎(C3 NFGN)、遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、脑脊髓炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症(MS)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
在一些实施方式中，待治疗或预防的疾病选自黄斑变性、早发性黄斑变性(EOMD)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)、和黄斑营养不良。
如本文所用，“治疗”可以例如是疾病/病症的发展或进展的减少，疾病/病症的症状的减轻或疾病/病症的病理学的减轻。治疗或减轻疾病/病症可以有效地预防疾病/病症的进展，例如以防止病情恶化或减慢发展速度。在一些实施方式中，治疗或减轻可导致疾病/病症的改善，例如，疾病/病症的症状的改善或疾病/病症的严重性/活动性的某些其他相关性降低。防治/预防疾病/病症可以指预防病症的恶化或预防疾病/病症的发展，例如预防早期疾病/病症发展到晚期慢性阶段。
还提供了一种在受试者中诊断补体相关疾病的发作风险，补体相关疾病的疾病进展风险和/或补体相关疾病是否存在的方法，所述方法包括确定受试者血液中的FHR-4水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平。所述方法另外包括如果受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高，则给予有效量的靶向补体的治疗剂或降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂。在一些实施方式中，所述方法包括从受试者获得血液样品并测量样品中FHR-4的水平/编码FHR-4的基因的表达水平。在本文提供的本发明的任何方面，所述方法可以包括以下步骤：将FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达水平升高的存在与受试者发展补体相关疾病和/或患有补体相关疾病的风险增加相关联。本文描述了确定FHR-4水平的合适方法和技术。
在一些实施方式中，根据确定受试者具有一种或多种用于AMD和/或EOMD遗传因子的方法，例如一种或多种与AMD相关和/或与EOMD相关的遗传变体或黄斑营养不良，选择可降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因表达水平的药剂进行治疗或预防的受试者。在一些实施方式中，已经确定受试者具有一种或多种这样的遗传因子。在一些实施方式中，所述方法包括确定受试者是否具有一种或多种这样的遗传因子。在本文中描述了这样的方法和遗传因子。因此，本文提供了一种治疗或预防受试者补体相关疾病的方法，所述方法包括施用降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因表达水平的药剂，其中已确定受试者具有一种或多种AMD和/或EOMD的遗传因子。
在一些方面，本发明提供了采用FHR-4水平来确定受试者是否可能对治疗有反应,或受试者是否对治疗有反应的方法。此类方法应使患者能够针对其特定的病理需求接受最有效的治疗。
因此，提供了一种用于确定患有或疑似患有补体相关疾病的受试者是否可能对补体靶向治疗剂的治疗或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药物产生反应的方法，所述方法包括确定患者血液中FHR-4的水平和/或确定患者中编码FHR-4的基因的表达水平。在某些情况下，如果FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平增加，则患者可能对补体靶向治疗药的治疗或降低FHR-4和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂产生反应。在一些情况下，当FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平增加时，选择对象以用治疗剂或药剂治疗。确定FHR-4水平或编码FHR-4的基因的表达水平的方法可以如本文所述。
还提供了一种选择受试者的方法，所述受试者用补体靶向的治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂进行治疗，所述方法包括确定受试者血液中FHR-4的水平和/或确定编码FHR-4的基因的表达水平，以及任选地，其中当FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平增加时，选择用治疗剂或药剂治疗的对象。
在某些情况下，所述受试者患有或疑似患有补体相关疾病。在某些情况下，所述疾病是AMD。在某些情况下，所述疾病是EOMD。
还提供了确定受试者是否对补体靶向的治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达水平的药剂的治疗方法有反应的方法，所述方法包括在给予治疗后确定受试者血液中FHR-4的水平。在一些情况下，所述方法包括另外确定治疗前受试者的血液中FHR-4的水平，其中与治疗前FHR-4的水平相比，治疗后FHR-4的水平降低表明：受试者对上述治疗有反应/已经有反应。在一些情况下，与参考值相比，治疗后FHR-4水平的降低表明受试者对所述治疗有反应/已经有反应。
在本文描述的任何方法中，FHR-4的水平可以如本文描述的那样在生物样品中确定和/或测量。本文提供的任何方法可包括在体外确定FHR-4的水平。FHR-4量的增加可能是FHR-4浓度为5-10μg/ml，10-15μg/ml，15-20μg/ml或>20μg/ml。在一些实施方式中，本文提供的方法包括以下步骤：将增加量的FHR-4的存在与受试者发生AMD和/或EOMD的风险增加相关联。本文提供的任何方法可以包括定量FHR-4的量和/或CFHR4的表达水平。
术语“受试者”是指受试者，患者或个体，并且可以是任何动物或人类。所述受试者优选是哺乳动物，更优选是人类。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人类。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。治疗用途可用于人类或动物(兽医用途)。
用本文所述的治疗物质治疗的受试者可以是有需要的受试者。
本文所述的受试者可以属于患者亚群，即该受试者可以是人群的可识别的部分，特定的部分或细分的部分。人群和/或亚群可能患有或疑似患有补体相关疾病。与整个群相比，所述亚群可显示出增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4的基因表达水平。人群和/或亚群可能患有或怀疑患有AMD，EOMD或黄斑营养不良。
在一些方面，提供了一种在受试者中治疗或预防补体相关病症的方法，其中所述受试者的特征在于具有增加的FHR-4水平和/或增加的编码FHR-4基因的表达水平。
还提供了靶向补体的治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂在治疗或预防受试者中补体相关疾病的方法中的用途，其中所述受试者的特征在于FHR-4水平增加和/或编码FHR-4的基因表达水平增加。
靶向FHR-4/CFHR4的药物
具有FHR-4水平升高和/或编码FHR-4基因的表达水平升高的受试者可从所述降低的水平中获得治疗或预防益处。这可以通过施用降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的任何合适的药物来实现。
因此，在一些实施方式中，本文提供的方法包括施用降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达水平的药物。在一些实施方式中，所述药物能够降低FHR-4的水平和/或能够降低编码FHR-4的基因的表达水平。
在一些实施方式中，所述药物降低FHR-4的水平。在其他实施方式中，所述药物降低了编码FHR-4的基因的表达水平。在某些情况下，所述药物降低FHR-4的水平，以及编码FHR-4的基因的表达水平。在其他情况下，所述方法包括施用降低FHR-4水平的第一药物和降低编码FHR-4的基因表达水平的第二药物。或者，所述方法可以包括施用降低编码FHR-4的基因的表达水平的第一药物和降低FHR-4的水平的第二药物。术语“FHR-4的水平”包括例如FHR-4的量或浓度。FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平可以在受试者中降低，例如在受试者的血液中和/或受试者的肝脏中。
所述药物可能具有以下一种或多种性质：抑制CFHR4基因的表达，降解FHR-4mRNA，与FHR-4蛋白结合，螯合FHR-4蛋白，螯合血液中的FHR-4蛋白，竞争结合FHR-4蛋白，阻断FHR-4蛋白的活性，降低血液中FHR-4的浓度，降低FHR-4蛋白离开血液的能力，降低FHR-4蛋白到达眼睛的能力，减少眼睛中FHR-4的量，降低FHR-4蛋白进入BrM的能力，抑制FHR-4介导的信号传导，调节涉及C3b的反应，调节涉及FHR-4和C3b的反应，降低FHR-4蛋白与C3b结合的能力，与FHR-4蛋白竞争C3b结合，促进FHR-4与C3b的解离，降低C3转化酶激活，降低C3bBb的产生，增加C3失活，增加iC3b的产生，减少补体激活，和/或失活补体通路，例如替代补体通路。
在此，“抑制”、“抑制了”、“减少”或“减少了”是指相对于控制条件的减少，降低或减小。在此，“降低FHR-4的水平”是指相对于控制条件的减少或减小。FHR-4的水平可以通过确定受试者血液中相对于参考水平的FHR-4的水平、量或浓度来测量。FHR-4水平的降低和/或编码FHR-4的基因的表达水平的降低可以通过确定用药治疗后的受试中的FHR-4的水平/编码FHR-4的基因的表达水平来测量，并将其与治疗前受试者的水平进行比较。FHR-4水平的降低还可以指通过药物螯合或结合FHR-4，以使得FHR-4的循环水平/量/浓度降低。因此，在某些情况下，可将药物描述为降低循环FHR-4水平的药物。
在一些实施方式中，降低FHR-4的量或降低编码FHR-4的基因的表达的药物是反义核酸。如本文所指，“反义核酸”是与特定靶核酸(例如可翻译成蛋白质的mRNA)的至少一部分互补的核酸(例如DNA或RNA分子)并且能够减少目标核酸(例如来自DNA的mRNA)的转录或减少目标核酸(例如mRNA)的翻译或改变转录剪接(例如单链吗啉代寡核苷酸)。参见，例如，Weintraub，科学美国人，262：40(1990)。通常，合成的反义核酸(例如寡核苷酸)的长度通常在15至25个碱基之间。反义核酸能够与目标核酸(例如目标mRNA)杂交(例如选择性杂交)。在某些情况下，反义核酸在严格杂交条件下与目标核酸序列(例如mRNA)杂交。在某些情况下，反义核酸在中等严格的杂交条件下与目标核酸(例如mRNA)杂交。反义核酸可包含天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸，例如硫代磷酸，甲基膦酸酯和异头糖-磷酸骨架修饰的核苷酸。
在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子。反义核酸干扰mRNA的翻译，因为细胞不会翻译双链的mRNA。使用反义方法抑制基因的体外翻译是本领域众所周知的(参见例如Marcus-Sakura，Anal.Biochem.1988，172：289)。此外，可以使用与DNA直接结合的反义分子。反义核酸可以是单链或双链核酸。反义核酸的非限制性实例包括siRNA(包括其衍生物或前体，例如核苷酸类似物)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、saRNA(小活化RNA)和小核仁RNA(snoRNA)或其某些衍生物或前体。反义核酸分子可能会刺激RNA干扰(RNAi)。
因此，反义核酸可以干扰CFHR4的转录，干扰FHR-4mRNA的翻译和/或促进FHR-4mRNA的降解。在某些情况下，反义核酸能够诱导CFHR4基因表达的减少。
反义核酸可以靶向编码FHR-4的基因的任何区域。在某些情况下，该基因为CFHR4。在某些情况下，反义核酸可靶向SEQ ID NO：10、12、14、16、18或20中的一个或多个核苷酸序列。在某些情况下，反义核酸靶向SEQ ID NO：12和/或14中的核苷酸序列。这些反义核酸可以描述为siRNA分子。
如本文所提供的“siRNA”、“小干扰RNA”、“小RNA”或“RNAi”是指形成双链RNA的核酸，当双链RNA与基因或靶基因在同一细胞中表达时，其具有减少或抑制基因或靶基因表达的能力。杂交形成双链分子的核酸的互补部分通常具有基本或完全同一性。在一个实施方式中，siRNA或RNAi是与靶基因具有基本或完全同一性并形成双链siRNA的核酸。在实施方式中，siRNA通过与互补细胞mRNA相互作用而抑制基因表达，从而干扰互补mRNA的表达。通常，核酸的长度为至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度为15-50个核苷酸，而双链siRNA的长度为约15-50个碱基对)。在一些实施方式中，长度为20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25或约24-29个核苷酸，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
RNAi和siRNA描述于例如Dana等人，Int J Biomed Sci.2017；13(2):48–57，其通过引用整体并入本文。反义核酸分子可包含与目标核酸序列例如FHR-4互补的双链RNA(dsRNA)或部分双链RNA。通过在分子内的第一RNA部分和第二RNA部分之间的互补配对形成双链RNA分子。RNA序列(即第一部分)的长度通常小于30个核苷酸(例如29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸)。在一些实施方式中，RNA序列的长度是18至24个核苷酸的长度。在某些siRNA分子中，RNA分子的互补的第一部分和第二部分形成发夹结构的“茎”。这两个部分可以通过连接序列连接，这可以在发夹结构中形成“环”。连接序列的长度可以变化，并且可以是例如5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸的长度。合适的连接序列是本领域已知的。
可以通过本领域已知的方案设计用于本发明的方法的合适的siRNA分子，参见例如Elbashire等人，自然,2001 411:494-8；Amarzguioui等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2004 316(4):1050-8；和Reynolds等人，Nat.Biotech.2004,22(3):326-30。siRNA分子的制造细节可在多家商业供应商的网站上找到，例如Ambion、Dharmacon、金斯瑞，英杰公司和OligoEngine。通常，可以使用BLAST比对程序检查任何潜在siRNA候选序列与其他核酸序列或核酸序列多态性的任何可能的匹配(请参阅美国国家医学图书馆互联网网站)。通常，产生并筛选许多siRNA以获得有效的候选药物，参见专利号为7,078,196的美国专利。siRNA可以从载体表达和/或化学或合成产生。合成RNAi可获自商业来源，例如英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。RNAi载体也可以从商业来源获得，例如英杰公司。
核酸分子可以是miRNA。术语“miRNA”按照其一般的含义使用，是指能够转录后调节基因表达的小的非编码RNA分子。在一个实施方式中，miRNA是与靶基因具有基本或完全同一性的核酸。在一些实施方式中，miRNA通过与互补细胞mRNA相互作用而抑制基因表达，从而干扰互补mRNA的表达。通常，miRNA的长度至少为约15-50个核苷酸(例如，miRNA的每个互补序列的长度为15-50个核苷酸，而miRNA的长度为约15-50个碱基对)。
核酸分子可以是适体。本文所用的术语“适体”是指与蛋白质、肽和小分子结合(例如以高亲和力和特异性)的寡核苷酸(例如短寡核苷酸或脱氧核糖核酸类)。适体由于其倾向于形成互补碱基对而通常具有限定的二级或三级结构，因此，通常能够折叠成多种复杂的分子结构。三维结构对于适体结合亲和力和特异性是必不可少的，并且特定的三维相互作用驱动适体-靶标复合物的形成。可以通过指数富集的配体的系统进化过程(SELEX，如Ellington AD，Szostak JW，自然1990，346：818-822；Tuerk C，Gold L.科学1990，249：505-510中所述)或通过开发SOMAmers(慢速修饰的适体)(Gold L等人(2010)基于适体的多重蛋白质组学技术用于生物标记物的发现.PLoS ONE 5(12)：e15004)从非常大的随机序列文库中体外选择适体。如本文所述适合使用的适体可以显示对FHR-4的特异性结合。适体可以抑制FHR-4的功能，例如阻断FHR-4与C3b的结合。
在一些实施方式中，降低FHR-4的量或降低编码FHR-4的基因的表达的药物是抗体或抗原结合分子(均在本文中称为“抗原结合分子”)，例如，抗FHR-4抗体。在某些情况下，抗原结合分子对FHR-4具有特异性。在某些情况下，抗原结合分子表现出与FHR-4的特异性结合。在某些情况下，抗原结合分子对C3b具有特异性。在某些情况下，抗原结合分子显示出与C3b的特异性结合。如本文所用，“特异性结合”是指对抗原具有选择性的结合，并且可以与对非靶标抗原的非特异性结合区分开。特异性结合靶分子的抗原结合分子优选以比其结合其他非靶分子更大的亲和力和/或更长的持续时间结合靶标。在一些情况下，抗原结合分子显示出高于FHR-1、FHR-2、FHR-3和/或FHR-5或FH和/或FHL-1的对FHR-4的特异性结合。抗原结合分子可以以1μM或更小，优选≤1μM，≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤100pM之一的KD结合人FHR-4。
抗FHR-4抗原结合分子可以是抑制或降低FHR-4的生物学活性的拮抗剂抗原结合分子。抗FHR-4抗原结合分子可以是中和FHR-4生物学作用的中和抗原结合分子，例如其通过C3b刺激C3转化酶产生的能力。
抗原结合分子可以结合FHR-4或C3b的特定目的区域。抗原结合分子的抗原结合区可以结合FHR-4或C3b的线性表位，其由氨基酸的连续序列(即氨基酸一级序列)组成。在一些实施方式中，抗原结合区分子可以结合由氨基酸序列的氨基酸的不连续序列组成的FHR-4或C3b的构象表位。
抗原结合分子可以是多特异性抗原结合分子。“多特异性”是指抗原结合分子显示出与一个以上靶标的特异性结合。在一些实施方式中，抗原结合分子是双特异性抗原结合分子。在一些实施方式中，抗原结合分子包含至少两个不同的抗原结合结构域(即，至少两个抗原结合结构域，例如包含不同的VH和VL)。可以以任何合适的形式提供多特异性抗原结合分子，例如在Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2)：182-212中描述的那些形式，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，抗原结合分子结合FHR-4和另一个靶标(例如，除FHR-4以外的抗原)，因此至少是双特异性的。术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。
可以根据本领域已知的方法通过分析来确定给定多肽与给定分子或另一给定肽/多肽特异性结合的能力，例如通过ELISA、表面等离振子共振(SPR；参见Hearty等人，Methods Mol Biol 2012，907：411-442)、生物膜层干涉技术(参见例如Lad等人，J BiomolScreen.2015，20(4)：498-507)、流式细胞术或通过放射性标记的抗原结合检测(RIA)酶联免疫吸附测定。通过这种分析，可以测量和定量与给定分子的结合。在一些实施方式中，结合可以是在给定测定中检测到的应答。结合亲和力可以以解离常数(KD)表示。
抗体结合的肽/多肽的区域可以由技术人员使用本领域熟知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体分析、肽扫描、诱变作图、通过质谱进行氢-氘交换分析、噬菌体展示、竞争性ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这样的方法例如在Gershoni等人，BioDrugs，2007，21(3)：145-156中描述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，抗原结合分子降低血液中FHR-4的浓度。在一些实施方式中，抗原结合分子减少循环FHR-4的量，例如在血液中。在一些实施方式中，抗原结合分子可以螯合FHR-4蛋白。在一些实施方式中，抗原结合分子结合FHR-4并降低FHR-4到达眼睛，进入BrM和/或进入脉络膜毛细血管层的毛细血管间隔的能力。在一些实施方式中，抗原结合分子减少FHR-4与C3b的结合。
抗原结合分子抑制两个结合伴侣之间相互作用的能力也可以通过分析这种相互作用的下游功能后果来确定。例如，抗原结合分子抑制FHR-4和C3b相互作用的能力可以通过在合适的测定法中分析C3bBb和/或iC3b的产生来确定，例如，通过使用ELISA、蛋白质印迹或电泳方法(例如本文所述的方法)，从反应中检测蛋白质的产生。
本领域技术人员将能够使用例如本文所述或本领域已知的技术产生合适的抗原结合分子，参见例如Chiu和Gilliland，Curr Opin Struct Biol.2016,38:163–173，Jakobovits A,Curr Opin Biotechnol.1995Oct；6(5):561-6，和Brüggemann M等人，ArchImmunol Ther Exp(Warsz).2015；63(2):101–108。一种合适的技术是噬菌体展示技术，参见例如，Hammers和Stanley，J Invest Dermatol.2014,134(2):e17和Bazan J等人，HumVaccin Immunother.2012,8(12):1817–1828。抗原结合多肽链也可以通过诸如化学合成的技术(参见例如Chandrudu等人，分子(2013)，18：4373-4388)，重组表达，如Green和Sambrook，分子克隆：实验室手册(第4版)，冷泉港出版社，2012年，以及在Nat Methods.(2008)；5(2):135-146中提出的技术，或无细胞蛋白合成(CFPS；参见例如，Zemella等人Chembiochem(2015)16(17):2420-2431)，所有这些文献均通过引用整体并入本文。抗原结合分子可以是单克隆的。
上文描述了已知的抗FHR-4抗体/抗原结合分子的实例。
降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂可以是螯合剂，例如，FHR-4的螯合剂。所述药剂可以是蛋白质分子。一个例子是抗原结合分子，例如，如本文所述，其将FHR-4隔离在血液中。
螯合剂或抗原结合分子可在FHR-4A的SCR 4/8/9或FHR-4B的SCR 4/5的区域内与FHR-4结合(参见例如，Hebecker和Józsi，J Biol Chem.2012，287(23)：19528-36)。例如，药剂或抗原结合分子可以结合至SEQ ID NO：1的456和578位之间，SEQ ID NO：2的455和577位之间和/或SEQ ID NO：3的209和331位之间的序列。
所述药剂可以是小分子。例如，所述小分子可以与FHR-4蛋白结合并阻止/降低FHR-4到达补体激活位点的能力和/或阻止/减少FHR-4与正常结合伴侣例如C3b之间的相互作用。所述小分子可能阻止/减少FHR-4蛋白的正确折叠。在某些情况下，所述小分子阻止/减少FHR-4与结合伴侣之间的结合。在某些情况下，所述小分子与FHR-4结合。
降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂可以是诱饵受体。在一些实施方式中，诱饵受体是指能够结合FHR-4的肽或多肽。所述受体可以是FHR-4的受体，包括其片段和衍生物。诱饵受体可能能够识别并结合特定的配体，但可能无法发出信号或激活后续反应。诱饵受体可以结合FHR-4形成复合物。诱饵受体可通过结合FHR-4并预防/降低FHR-4结合FHR-4受体的能力或可获得性来作为FHR-4抑制剂。因此，所述药剂可以是结合FHR-4的分子，使得FHR-4不可用于激活C3b。所述药剂可以基于C3b，例如受体可以是C3b的非活性形式。所述药剂可以基于SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：9。所述药剂可以基于C3c和/或C3d。
所述药剂可以被施用至血液/存在于血液中，或附着在组织上，例如在眼睛内或附近的组织上。所述受体可能能够抑制补体激活。所述受体可能能够抑制FHR-4和C3b之间的相互作用。所述受体可能能够抑制C3b的活化和/或抑制C3转化酶的形成。
在某些情况下，所述受体能够抑制FHR-4的活性。在某些情况下，诱饵受体可能是包含与C3b/C3d的FHR-4结合结构域相对应的区域的分子(参见例如Hellwage J.，FEBSLett.1999,462,345-352；Hellwage J.，J.Immunol.2002，169，6935–6944；Hebecker和Józsi，J Biol Chem.2012，287(23)：19528-36；和Nagar B等人，科学1998：1277-1281，其通过引用整体并入本文)。
诱饵受体可以是可溶的(不是膜结合的)，或者可以是膜结合的，例如，在细胞表面上表达。诱饵受体可以存在和/或施用在纳米载体的表面上，所述纳米载体例如是纳米颗粒、脂质体、珠子、聚合物、金属颗粒、树状物、纳米管或微型硅棒，例如参见Wilczewska AZ等人,Pharmacol Rep.2012,64(5):1020-1037。
本文描述了检测诱饵受体是否竞争FHR-4结合的方法。例如，SPR(参见例如Hearty等人，Methods Mol Biol 2012，907：411-442)，竞争ELISA测定或固相结合分析。其他合适的方法将是本领域已知的。
降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因表达的药物可能属于上述类别中的一种以上。例如，抗原结合分子或诱饵受体也可以是螯合剂。
本文所述的任何药物可以是任选地分离的和/或基本上纯化的。
施用降低FHR-4的水平和/或降低编码FHR-4基因的表达水平的药物，例如如本文所述，优选地，其为“治疗有效量”或“预防有效量”，其足以显示出对个体的益处。实际施用的量以及施用的速率和时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。治疗处方，例如决定剂量等，是全科医生和其他医生的责任之内的，并且通常要考虑待治疗的病症、个别患者的病症、递送部位、施用方法和从业人员已知的其他因素。上面提到的技术和方案的示例可以在雷明顿药物科学，第20版，2000年，利平科特，威廉姆斯和威尔金斯出版。可以以治疗有效量将药剂给予需要其的受试者。
可以将降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因的表达水平的药剂配制成用于临床的药物组合物或药物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。根据本发明，还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，这种生产方法可以包括一个或多个选自以下的步骤：分离药剂；和/或将药剂与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。可以将组合物配制成用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、玻璃体内、结膜内、视网膜下、脉络膜上腔、皮下、皮内、鞘内、口服或经皮给药途径，其可包括注射剂或输注或滴眼液给药(即眼内给药)。合适的制剂可以在无菌或等渗介质中包含该药剂。药物和药物组合物可以配制成包括凝胶在内的流体形式。可以配制流体制剂用于通过注射或输注(例如通过导管)施用于人体或动物体的选定器官或区域。本发明的另一方面涉及配制或生产在药物治疗方法中使用的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将降低本文所述FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因的表达水平的药剂与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。
在某些情况下，将药剂施用于肝脏，例如一个或多个肝细胞。在某些情况下，所述药剂被施用到血液中(即静脉内/动脉内施用)。在某些情况下，所述药剂是皮下给药的。
在某些情况下，所述方法包括靶向递送药剂，即其中相对于其他部位，所述药剂在受试者身体的某些部位的浓度增加了，和/或其中药剂是通过控释技术递送的。在某些情况下，所述方法包括静脉内、动脉内、肌内或皮下施用，并且其中所述药剂被配制在靶向药剂递送系统中。合适的靶向药剂递送系统包括例如纳米颗粒、脂质体、胶束、珠子、聚合物、金属颗粒、树状聚合物、抗体、适体、纳米管或微型硅棒。这样的系统可以包括磁性元件以将药剂引导到期望的器官或组织。合适的纳米载体和药剂递送系统对于本领域技术人员将是显而易见的。在某些情况下，所述药剂经配制用于靶向递送至特定器官或组织。在某些情况下，所述药剂被递送到肝脏。在某些情况下，所述方法包括静脉内、动脉内、肌内或皮下施用，并且其中所述药剂被配制用于靶向递送至肝脏。
在某些情况下，RNA，例如可以配制基于纳米颗粒的制剂用于肺部给药，以便随后递送至非肺组织，参见例如，US 2015/0157565 A1，将其全文并入本文。
可以根据需要降低FHR-4水平和/或降低CFHR4表达水平的位置来选择具体的给药方式和/或部位。在某些情况下，所述方法包括静脉内和/或动脉内给药。在某些情况下，所述方法包括向眼睛给药。如果需要降低CFHR4的表达，则可以将降低编码FHR-4的基因表达的药剂施用于肝脏。在某些情况下，所述药剂被递送到一个或多个肝细胞。
用于RNA递送的方法在本文中描述并且在本领域中是已知的，并且可以在例如Tatiparti K等人“siRNA递送策略：近期进展的全面综述。”，由Thomas Nann.编辑，Nanomaterials 7.4(2017):77，和Lehto T等人,Adv Drug Deliv Rev.2016,106(Pt A):172-182中找到，其通过引用整体并入本文。例如，RNA可以裸露递送，或通过使用纳米颗粒、聚合物、肽(例如细胞穿透肽)、或通过离体转染来递送RNA。纳米颗粒可以是有机的，例如胶束、脂质体、蛋白质、固体脂质颗粒、固体聚合物颗粒、树状聚合物和聚合物治疗剂。纳米颗粒可以是无机的，例如纳米管或金属颗粒，任选地添加有机分子。病毒提供了另一种纳米颗粒递送选择。可以对纳米颗粒进行优化，以提高其内吞率，避免肾脏清除和过滤，提高热稳定性，提高pH稳定性，防止毒性作用并提高RNA装载效率。其他的封装方法在例如US 2015/0157675 A1中所述。
给药可以单独或与其他治疗(例如其他治疗或预防性干预)组合，同时或顺序地取决于要治疗的病症。降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂和另一种治疗药物可以同时或顺序给药。在一些情况下，降低FHR-4的水平和/或降低编码FHR-4的基因表达水平的药剂与补体靶向的治疗剂同时或顺序施用，例如，如本文所述。
适用于本发明的其他治疗剂或技术可包括营养疗法、光动力疗法(PDT)、激光光凝术、抗VEGF(血管内皮生长因子)疗法和/或本领域已知的其他疗法，参见例如Al-Zamil WM和Yassin SA，Clin Interv Aging.2017 Aug 22；12:1313-1330)。抗VEGF疗法可包含诸如兰尼单抗(雷珠单抗，Genentech/诺华公司制造)、阿瓦斯汀(基因泰克)、贝伐单抗(无商标的阿瓦斯汀)和阿柏西普(来自再生元/拜耳的
Figure BDA0002892941500000381
/VEGF Trap-Eye)。适用于本发明的其他药剂或技术包括APL-2(阿佩利斯)、AdPEDF(GenVec)、封装细胞技术(ECT；神经科学)、角鲨胺乳酸盐(EVIZONTM，纳莱)、OT-551(抗氧化剂眼药水，Othera)、醋酸甲草胺(anecortave actate)(
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Alcon)、贝伐西尼(siRNA，敏锐制药)、哌加他尼钠
Figure BDA0002892941500000383
和AVCAGGSCD59(临床试验识别码：NCT03144999)。
同时施用是指一起施用降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因的表达水平的药剂和另一种治疗剂，例如作为包含两种药剂的药物组合物(联合制剂)，或紧接着彼此并任选地通过相同的给药途径，例如到同一组织、动脉、静脉或其他血管。顺序施用是指在通过单独施用其他药物的给定的时间间隔后施用多肽、核酸、载体、细胞或组合物或治疗剂中的一种。尽管在某些实施方式中是这种情况，但是不需要通过相同的途径来施用两种药剂。所述时间间隔可以是任何时间间隔。
可以提供降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达水平的药剂的多个剂量。一个或多个或每个剂量可以同时或顺序施用另一种治疗剂。
多个剂量可以通过预定时间间隔分开，所述预定时间间隔可以被选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天，或1、2、3、4、5或6个月中的一种。举例来说，药剂可以每7、14、21或28天(加上或减去3、2或1天)给予一次。
可以在持续释放递送系统中配制本文所述的药剂，以便以预定速率释放多肽、核酸、载体或组合物。缓释递送系统可以在指定的时间段内保持恒定的药物/治疗浓度。在一些实施方式中，本文所述的药剂被配制在脂质体、凝胶、植入物、装置或药物-聚合物缀合物，例如水凝胶中。
确定蛋白质/基因的表达水平
可以使用本领域公知的技术或如本文所述的方法来测定例如样品中的FHR-4的量。
例如，本文提供的任何方法可以采用FHR-4特异性ELISA(酶联免疫吸附实验)来测定FHR-4的量。FHR-4的量可以通过确定FHR-4的浓度来测定。进行ELISA的方法是本领域众所周知的，参见例如Crowther JR，分子生物学方法，ELISA指南.第二版.Humana出版社，施普林格科学+商业媒体有限责任公司2009的一部分；Butler J.E.固定在固相上的抗原和抗体的行为.在：M.H.V.范·雷根莫特尔(Van Regenmortel)编辑.抗原的结构.Boca Raton，FL：CRC出版社，1992：209-259.第1卷，209；CRC出版股份有限公司；Lequin RM.临床化学51.12(2005)：2415-2418；以及Engval l和Perlmann.免疫化学8.9(1971)：871-874，在此通过引用将其整体并入本文。在某些情况下，使用夹心ELISA(例如本文所述的)测定FHR-4的量。
其他检测蛋白质的合适方法包括：测量含蛋白质样品的吸光度、Bradford蛋白质检测(参见例如Bradford M，Anal Biochem.1976，72：248-254)、缩二脲试验衍生分析(例如比辛尼酸测定(BCA测定法；参见例如Smith PK等人，Anal.Biochem.1985，150：76-85)或劳里蛋白测定法(参见例如Lowry OH等人，J.Biol.Chem.1951，193：265–275；SargentM.Anal.Biochem.1987，163：476-481)、荧光胺技术(参见例如
Figure BDA0002892941500000391
等人，Arch.Biochem.Biophys.1973，155：213-220)、酰胺黑技术、胶体金技术(例如，参见Zeng S等人，Plasmonics.2011，6(3)：491-506；Tauran Y等人，World J Biol Chem.2013，4(3)：35-63)、高性能液相色谱法(HPLC；参见Thammana M，RRJPA 2016，5(2)：22-28；液相色谱-质谱法(LC/MS；参见例如Pitt JJ，Clin Biochem Rev.2009；30(1)：19–34)、蛋白质免疫沉淀(参见例如Burgess RR，Methods Enzymol.2009；463：331-42)、免疫电泳(参见例如Levinson，SS(2009).免疫电泳.在eLS，(编辑))、蛋白质印迹法(参见例如Mahmood和Yang，NAm J Med Sci.2012；4(9)：429-434)、蛋白质免疫染色(参见例如Ramos-Vara JA，兽医病理学，2005，42(4)：405-426)和质谱法(例如参见Bugni TS J.Nat.Prod.，2017，80(2)：574-575)。所有参考文献均通过引用整体并入本文。
CFHR4的表达水平可以使用本文描述的和/或本领域众所周知的技术来测量，例如，在Roth CM,Curr.Issues Mol.Biol.2002 4:93-100和Kukurba KR和Montgomery SB,冷泉港方案.2015,(11):951–969中所综述的，其全部内容通过引用并入本文。例如，可以使用定量PCR、实时PCT、测序技术(例如，RNA测序、下一代测序、微阵列、RNA印迹和核糖核酸酶保护分析(RPA))来测量基因表达。根据需要，本领域的技术人员将能够理解用于测量CFHR4表达的一种或多种合适的技术。在某些情况下，可以先从细胞样品中提取并分离总RNA或cDNA。
对于标准分子生物学技术，请参见Sambrook，J.，Russel，D.W.分子克隆，实验室手册.第3版.2001年，纽约冷泉港：冷泉港实验室出版社
试剂盒
在本发明的一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括具有补体靶向的治疗剂和/或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂的容器，以及用于确定一种或多种生物样品中FHR-4水平和/或编码FHR-4的基因表达水平的说明。
C3和补体调节蛋白
例如，在Foley等人J Thromb Haemostasis(2015)13:610-618中描述了C3的处理，其全部内容通过引用并入本文。人C3(UniProt：P01024；SEQ ID NO：7)包含1,663个氨基酸序列(包括N末端的22个氨基酸的信号肽)。氨基酸23至667编码C3β链(SEQ ID NO：8)，氨基酸749至1663编码C3α’链(SEQ ID NO：9)。C3β链和C3α’链通过链间二硫键(在C3β链的半胱氨酸559与C3α’链的半胱氨酸816之间形成)结合形成C3b。
将C3b加工成蛋白水解无活性形式的iC3b涉及在氨基酸1303和1320位处C3bα'链的蛋白水解切割，形成α'链片段1(对应于C3的672至748位的氨基酸)和α'链片段2(对应于C3的1321至1663位的氨基酸)。因此，iC3b包含C3β链，C3α'链片段1和C3α'链片段2(通过二硫键相连)。α’链的切割也释放出C3f，其对应于C3的1304至1320位的氨基酸。
C3b到iC3b的加工是通过补体因子I(在人体内由基因CFI编码)完成的。人补体因子I(UniProt：P05156)具有583个氨基酸序列(包括N末端18个氨基酸的信号肽)。前体多肽被弗林蛋白酶切割以产生成熟的补体因子I，其包含通过链间二硫键连接的重链(19至335的氨基酸)和轻链(340至583的氨基酸)。轻链的340至574的氨基酸编码补体因子I的蛋白水解域，该蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，包含负责裂解C3b以产生iC3b的催化三联体(Ekdahl等人，J Immunol(1990)144(11)：4269–74)。
补体因子I的辅助因子促进了补体因子I对C3b的蛋白水解切割，从而生成iC3b。能够作为补体因子I的辅助因子的分子包括补体因子H、补体受体1(CR1)、CD46、CD55和C4结合蛋白(C4BP)、SPICE、VCP(或VICE)和MOPICE。
对补体因子H的结构和功能进行了综述，例如Wu等人，Nat Immunol(2009)10(7)：728-733，其通过引用整体并入本文。人补体因子H(UniProt：P08603)具有1,233个氨基酸序列(包括N末端，18个氨基酸的信号肽)，并包含20个约60个氨基酸的补体控制蛋白(CCP)结构域。
对补体受体1(CR1)的结构和功能进行了综述，例如在Khera和Das中，Mol Immunol(2009)46(5)：761-772和Jacquet等人，J Immunol(2013)190(7)：3721-3731中，这两个文献均通过引用整体并入本文。人CR1(UniProt：P17927)具有2,039个氨基酸序列(包括N末端，41个氨基酸的信号肽)，并包含30个补体控制蛋白(CCP)结构域。
CD46(也称为膜辅因子蛋白(MCP))的结构和功能描述于例如Liszewski和Atkinson，Human Genomics(2015)9：7和Liszewski等人，J Biol Chem(2000)275：37692-37701中，两者均通过引用整体并入本文。人CD46(UniProt：P15529)具有392个氨基酸序列(包括N末端，34个氨基酸的信号肽)，并包含309个氨基酸的细胞外结构域(UniProt：P15529，35至343位)，23个氨基酸的跨膜结构域(UniProt：P15529，344至366位)和26个氨基酸的胞质结构域(UniProt：P15529，367至392位)。
CD55(也称为促衰变因子(DAF))的结构和功能描述于例如Brodbeck等人，Immunology(2000)101(1)：104-111中，其通过引用整体并入本文。人CD55(UniProt：P08174)具有381个氨基酸序列(包括N末端，34个氨基酸的信号肽)，并包含四个CCP结构域。
C4结合蛋白(C4BP)的结构和功能描述于Blom等人，J Biol Chem(2001)276(29)：27136-27144和Fukui等人，J Biochem(2002)132(5)：719-728中，两者均通过引用整体并入本文。人C4BP(UniProt：P04003)具有597个氨基酸序列(包括N末端，48个氨基酸的信号肽)，并包含8个CCP结构域。
序列
Figure BDA0002892941500000421
Figure BDA0002892941500000431
Figure BDA0002892941500000441
Figure BDA0002892941500000451
***
适当地以其特定形式或根据用于执行所公开的功能的装置，或者用于获得所公开的结果的方法或过程来表达在前面的说明书，或以下权利要求书或附图中公开的特征。适当地，可以单独地，或者以这些特征的任意组合来利用本发明的各种形式来实现本发明。
尽管已经结合上述示例性实施方式描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，以上阐述的本发明的示例性实施方式被认为是说明性的而不是限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方式进行各种改变。
为了避免任何疑问，提供本文提供的任何理论解释是为了提高读者的理解。发明人不希望受到任何这些理论解释的束缚。
本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应解释为限制所描述的主题。
在整个说明书中，包括所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和“包含”以及诸如“含有”，“具有”和“包含的”的变体应当理解为暗示包含所述整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。
必须注意的是，如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。范围可以在本文中表示为从“大约”一个特定值和/或到“大约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一实施方式。相对于数值的术语“约”是可选的，并且是指例如+/-10％。
现在将参考附图讨论本发明的方面和实施方式。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施方式将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
附图概述
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验。
图1A和1B.该图显示了CFHR4的基因表达分析。(A)来自AMD和非AMD受试者的眼组织中CFHR4和CFH的基因表达分析。针对归一化表达水平测量基因表达。(B)CFHR4在27个人体组织中的基因表达分析。
图2A和2B.通过免疫组织化学检测眼组织中FHR-4蛋白的图像。比例尺等于20μm。(A)显示FHR-4在脉络膜毛细血管层和BrM的毛细血管间隔中定位的图像。(B)图像显示在晶簇中FHR-4的定位。
图3.FHR-4与固定的C3b结合的表面等离振子共振(SPR)传感图。
图4.该图显示了固相结合测定，其中FHR-4增加的浓度能够胜过C3b和FH/FHL-1之间的结合。
图5.图表说明了FHR-4对作为FI辅助因子对FHL-1活性的影响，通过C3b分解来测量。
图6.示意图显示了FHR-4在C3转化酶形成中的作用。
图7A至7C.该图显示了AMD和非AMD受试者中FHR-4的水平。(A)187名患有晚期AMD或无AMD的受试者的血浆FHR-4浓度(“检测组”)。(B)分析来自检测组的血浆FHR-4浓度的百分比分布。(C)来自518名患有AMD或未患有AMD的受试者(“全部的组”)的血浆FHR-4浓度的百分比分布的分析。
图8A和8B.该图显示了siRNA敲低后在HuH肝细胞中CFHR4的表达。(A)用单个或合并的siRNA 1-6，或同等的siRNA阴性对照(零乱siRNA)转染后CFHR4的表达。CFHR4的表达相对于GAPDH表达已归一化。(B)相对于siRNA阴性对照(零乱siRNA)，用单独或合并的siRNA1-6转染后CFHR4的百分比表达。
实施例
实施例1
CFHR4基因的表达
分析取自AMD和非AMD受试者的眼组织的FHR-4编码基因(CFHR4)的表达。
发明人使用Whitmore SS等人，在干性年龄相关的黄斑变性中基因表达的改变提示脉络膜内皮细胞的早期丧失，Mol Vis 2013；19：2274-97中产生的可公开获得的数据分析了CFHR4的表达。简而言之，Whitmore等人解剖供体眼睛并将黄斑RPE和脉络膜与视网膜分离。从RPE和脉络膜中提取RNA，并使用基于外显子的微阵列(美国昂飞公司)测量了10000多个基因的表达。
发明人的分析结果如图1A所示。发现CFHR4在来自AMD或非AMD受试者的供体眼睛的视网膜或脉络膜中均未表达。相反，发现CFH(编码FH蛋白)在两个组中均表达。
接下来，分析了多种人体组织的CFHR4基因表达。
发明人使用作为基因型组织表达(GTEx)项目的一部分而产生的公开可用数据来分析组织特异性CFHR4表达，参见GTEx Consortium(2015)人类基因组，基因型组织表达(GTEx)初步分析：人类的多组织基因调控，科学，348，648-660。
发明人对27个组织中CFHR4基因表达的分析如图1B所示。仅在肝组织中检测到显著的CFHR4基因表达。
FHR-4蛋白的定位
通过免疫组织化学分析FHR-4蛋白在眼组织中的定位。
使用先前描述的方法(Clark SJ等人，J Immunol.2014，193：4962-4970)对组织切片(10μm)进行染色，以检查是否存在内源性FHR-4，胶原蛋白IV或C3/C3b。简而言之，将组织切片与冷却的(-20℃)组织学级丙酮(西格玛奥德里奇)和甲醇(1：1混合)孵育20秒，然后用PBS彻底清洗。在室温下，用0.1％(w/v)BSA，1％(v/v)山羊血清和0.1％(v/v)Triton X-100的PBS封闭组织切片1h。用PBS洗涤后，将组织切片与10μg/ml的抗FHR-4(见下文)与1μg/ml的胶原IV兔多克隆抗体混合的抗体组合在4℃孵育16小时。洗涤切片，并将在PBS中以1：250稀释的生物素化抗小鼠IgG(目录号BA_9200，Vector Laboratories，Inc)施加1小时以扩增FHR-4信号。随后洗涤载玻片，在室温下加入在PBS中以1：250稀释的
Figure BDA0002892941500000471
链霉亲和素(产品目录号：S32357，英杰公司)和在PBS中以1：500稀释的
Figure BDA0002892941500000472
偶联山羊抗兔Ab(美国英杰公司)2小时。洗涤后，在用培养基(Vectashield；H-1400，载体实验室，英国彼得伯勒)固定并盖上盖玻片之前，将DAPI用作核复染剂(在0.3mM下持续5分钟)。
在空白对照切片的情况下，遵循完全相同的方案，但是PBS代替了第一抗体。为了在免疫组织化学中测试抗体特异性，进行了预吸附实验，其中在施加到组织切片之前，将10倍摩尔过量的纯重组FHR-4与抗FHR-4Ab预混合。在所有情况下，图像都是在ZeissAxioimager.D2直立显微镜上使用40x/0.5 EC Plan-nefluar和100x/0.5 EC Plan-nefluar物镜收集的，并使用Coolsnap HQ2相机(Photometrics)通过Micromanager软件v1.4.23捕获。DAPI、FITC和Cy5的特定带通滤波器组用于防止从一个通道流到下一个通道。然后使用斐济ImageJ(http://imagej.net/Fiji/Downloads)处理和分析图像。为了防止颜色从一个通道流到下一个通道，对DAPI、FITC和Cy-5使用了特定的带通滤波器组。所有图像均使用ImageJ64(1.40g版；http：//rsb.info.nih.gov/ij)处理。
结果示于图2A和2B。图2A显示FHR-4位于毛细血管间隔，并且在BrM中也观察到弱标记。图2B显示了位于晶簇中的FHR-4。比例尺等于20μm。
因此，FHR-4在肝脏中合成，然后积累在眼睛附近的组织中。
实施例2
FHR-4抗体的产生
使用本领域已知的标准方案，用弗氏完全佐剂中的重组FHR-4免疫小鼠。通过在捕获ELISA中筛选单个小鼠的血清来评估抗FHR-4抗体的效价。使用标准方案，收获脾细胞并与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。选择杂交瘤，使其生长，然后筛选抗体产生。扩增阳性细胞并纯化抗体。
实施例3
FHR-4与C3b结合
使用表面等离子体共振(SPR)分析了FHR-4与固定的C3b结合的能力。
使用Biacore 3000(GE保健公司)进行SPR。通过使用标准胺偶联剂将人C3b固定在Biacore系列S羧甲基化葡聚糖(CM5)传感器芯片(GE保健公司)的流通池上来制备传感器表面，并且包括没有C3b蛋白的空白流通池。在含0.05％表面活性剂P20的PBS中，在25℃和15μl/min的流速下进行实验。FHR-4以1至100μg/ml的浓度范围进行注射，重复三次。注射样品150秒，再解离200秒，在两次注射之间用1M NaCl使芯片再生1分钟，然后在下一次注射之前将芯片在含0.05％表面活性剂P20的PBS中重新平衡。从空白池中减去每个响应值后，通过全局数据分析确定缔合和解离速率常数。所有曲线均使用1：1Langmuir缔合/解离模型(BIAevaluation 4.1；GE保健公司)拟合。
结果显示在图3中，其中FHR-4被证明以1.1×10-6M的KD与固定的C3b结合。
FHR-4与FH/FHL-1竞争结合C3b
固相结合测定法用于评估FHR-4是否能胜过FH和FHL-1与C3b的结合。
将纯化的C3b在100μl/孔PBS中以1μg/孔的浓度吸附到微量滴定板的孔中(NuncMaxisorb，Kastrup，Denmark)，在室温下放置16h。将板在37℃下用测定缓冲液(20mMHEPES，130mM NaCl，0.05％(v/v)Tween-20，pH 7.3)中的300μl/孔的1％(w/v)BSA封闭90分钟。该标准测定缓冲液(SAB)用于所有随后的孵育、稀释和洗涤，所有步骤均在室温下进行。SAB中FH或FHL-1的恒定浓度为100nM，增加的FHR-4浓度用作竞争剂，最高为500nM。将FH/FHR-4和FHL-1/FHR-4混合物与固定的C3b孵育4小时。洗涤后，通过加入100μl/孔的0.5μg/ml OX23抗体检测结合的FH或FHL-1蛋白，并孵育30分钟，然后洗涤，并在100μl的1：1000稀释的AP偶联抗小鼠IgG(西格玛奥德里奇)中稀释30分钟。使用100μl/孔的1mg/ml对硝基苯酚磷酸盐二钠溶液(西格玛奥德里奇)在0.05M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.3中显影。在室温下显影10分钟后确定405nm处的吸光度值，并针对空白孔(即没有固定C3b的孔)进行校正。
结果显示在图4中。增加FHR-4的浓度可以逐渐超过FH和FHL-1与固定化C3b的结合。
FHR-4抑制C3b的分解
评估了FHR-4抑制C3b分解为iC3b的能力。
通过将纯化的FHL-1，C3b和FI一起在总体积为20μl的PBS中于37℃孵育15分钟来测量FHL-1的液相辅因子活性。对于每个反应，使用2μg C3b和0.04μg FI(因子I)，每个反应中FHL-1的浓度范围为0.015μg至1μg。加入5μl 5×SDS还原样品缓冲液终止试验，并在100℃煮沸10分钟。样品在4-12％NuPAGE Bis Tris凝胶上200V电泳60分钟，以最大程度地分离C3b分解产物带。使用的分子量标记是Novex Sharp预先染色的蛋白质标准品(3.5-260kDa，目录号LC5800，美国生命技术公司，佩斯利，英国)。使用ImageJ64(版本1.40g；rsb.info.nih.gov/ij)测量68kDa iC3b产物带的密度，并用于追踪FHL-1蛋白的C3b分解效率。对于FHR-4抑制测定，将反应中使用的FHL-1的量固定为1μg，并添加增加量的FHR-4，以使FHR-4的摩尔比FHL-1高5倍。否则，反应在与之前相同的条件下进行。在所有情况下，均使用三个独立实验的平均数据。
结果如图5所示。FHR-4浓度的增加可以逐步抑制FI和FHL-1将C3b分解为iC3b。
FHR-4的作用示意图如图6所示。FHR-4阻止FHL-1充当因子I的辅助因子，从而导致C3b失活失败(C3b不会转化为iC3b)。这促进了C3转化酶的形成和补体激活。因此，FHR-4促进补体失调。
实施例4
FHR-4水平与AMD风险之间的关联
在来自有或没有AMD患者的血浆中测量FHR-4水平，以评估FHR-4水平是否与AMD风险相关。
分析了两个单独的AMD组的FHR-4水平：来自晚期AMD患者的187个血浆样本(“检测组”)与没有AMD的匹配对照组(106个AMD vs 81个非AMD)，以及一个包含518个样本(304个AMD vs 214个非AMD)的“全部的组”进行比较。
样本取自“剑桥”AMD研究，该研究是AMD的一项病例对照研究，参与者来自2001年至2007年之间在伦敦、英格兰东南部和英格兰西北部的眼科诊所(Yates等人，N Engl JMed.2007，357：553-561)。所有患者至少有一只眼睛受脉络膜新生血管性疾病(CNV)和/或地图样萎缩(GA)的影响。如果患者的近视屈光不正大于6屈光度或患有其他炎症或视网膜血管疾病(例如视网膜血管阻塞，糖尿病性视网膜病或脉络膜视网膜炎)的证据可能会导致黄斑病的发展或混淆，则将患者排除在外。对照是指示病人的配偶，伴侣或朋友。所有参与者在一份招募卷中都将他们的种族/族裔描述为白人。参加者由眼科医生检查并进行了黄斑区域的彩色立体眼底照相。使用年龄相关性黄斑病变和黄斑变性的国际分类在伦敦Moorfields眼科医院的阅读中心对图像进行分级(Bird等人，国际ARM流行病学研究小组.Surv Ophthalmol.1995，39：367-374)。接受采访时采集血样，然后将储存在–80℃的锂-肝素血浆样品用于FHR-4测量。
使用优化的内部夹心ELISA分析法测量FHR-4浓度。在Nunc-ImmunoTM MaxiSorpTM96孔板上涂50μl/孔的单克隆抗FHR-4抗体4E9，浓度为5μg/ml(在0.1M碳酸盐缓冲液,pH9.6中)。用PBS+0.1％Tween-20(PBST)中的2％BSA封闭后，将板在PBST中洗涤，并将稀释在0.1％PBST中的纯化FHR-4蛋白质稀释系列添加到孔中，重复两次实验，以生成标准曲线。将测试样品以1:40的稀释度(50μl/孔)重复两次实验添加到其余的孔中，并将板在37℃下孵育1.5小时。将板在PBST中洗涤，加入50μl/孔的1μg/ml HRP标记的抗FHR-4单克隆抗体，并将板在室温下孵育1小时。洗涤后，加入50μl/孔的邻苯二胺(SIGMAFASTTM OPD，西格玛奥德里奇，英国)以显色板，并在5分钟后通过加入等体积的10％的硫酸使反应停止。在酶标仪中于492nm处测量吸光度，并使用GraphPadPrism5绘制的标准曲线内插蛋白质浓度。
结果显示在图7A至7C中。(7A)检测组中血浆样品的FHR-4测量显示，患有晚期AMD的受试者的平均FHR-4水平升高(7.8±0.7μg/ml与5.7±0.5μg/ml，P＝0.0208)。(7B)当分析来自检测组的FHR-4测量值中FHR-4浓度的百分比分布时，约12％的AMD受试者的血浆FHR-4水平大于15μg/ml。此外，5.8％的AMD受试者的血浆FHR-4水平大于20μg/ml，而非AMD受试者的血浆FHR-4含量为0％。(7C)在较大全部的组中进行的重复实验显示了相似的结果，其中5％的AMD受试者的血浆FHR-4水平大于20μg/ml。
实施例5
siRNA敲低CFHR4的表达
测试靶向CFHR4不同区域的siRNA分子对肝细胞中CFHR4表达的影响。
将人类肝癌细胞系的HuH细胞在添加10％胎牛血清(FBS，西格玛，目录号F9665)和1％青霉素链霉素(Pen/Strep，西格玛P0781)的含有低葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，西格玛，目录号D6046)中，在5％CO2培养箱中于370C培养。六个siRNA靶序列(siRNA1-6；SEQ ID NO：10、12、14、16、18和20)和六个阴性对照siRNA序列(零乱siRNA；SEQID NO：11、13、15、17、19和21)由Ambion(生命科学技术有限公司)内部设计。
将人肝癌细胞接种到24孔板(50,000细胞/孔)中并进行培养。24小时后，用1μlLipofectamine RNAimax(英杰公司，目录号13778-075)将10nM siRNA1-6或合并在一起的所有6种siRNA或其相应的零乱siRNA对照转染细胞24小时。所有反应均重复进行两次实验。
转染后24小时后，使用分离RNA Mini试剂盒(Bioline，目录号BIO-52072)提取RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，目录号4368814)合成cDNA。
按照制造商的说明，使用预先设计的FAM标记的TaqMan探针(赛默飞世尔科技，生命技术公司)进行定量PCR反应。简而言之，将10ng cDNA重悬于反应混合物中，其中包括0.5ul CFHR4 TaqMan探针(HS00198577_m1)或GAPDH TaqMan探针(Hs02758991_g1)，5ul 2x反应预混液(mastermix)(4440040)，最终反应体积为10ul。使用ABI第1步热循环仪(Applied Biosystems)使用以下热循环条件运行样品，重复两次实验：42℃持续5分钟，95℃持续10秒，以及95℃持续5秒和60℃持续34秒的40个循环。将CFHR4基因表达相对GAPDH表达归一化，并通过ΔΔCt方法确定相对表达。
结果显示在图8A和8B中。qPCR数据表明siRNA 1-3、5和6(SEQ ID NO：10、12、14、18、20)均显著降低了CFHR4表达(8A；每种siRNA的数据均显示在其等效的零乱siRNA阴性对照旁边)。siRNA 2和3(SEQ ID NO：12、14)和合并的siRNA具有最大的CFHR4敲低效应。图8B显示，零乱的siRNA对CFHR4表达没有影响。
序列表
<110> 曼彻斯特大学
<120> 评估和治疗补体相关疾病的方法
<130> 007450349
<150> GB 1807611.7
<151> 2018-05-10
<150> GB 1902790.3
<151> 2019-03-01
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 578
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) FHR-4A (同种型 1) Uniprot: Q92496-1 输入版本 145(2018年2月28日), 序列版本 3 (2014年1月22日)
<400> 1
Met Leu Leu Leu Ile Asn Val Ile Leu Thr Leu Trp Val Ser Cys Ala
1 5 10 15
Asn Gly Gln Glu Val Lys Pro Cys Asp Phe Pro Glu Ile Gln His Gly
20 25 30
Gly Leu Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Pro Ala Ala Ala
35 40 45
Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Val Thr Pro Ser
50 55 60
Gly Ser Tyr Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro
65 70 75 80
Thr Val Pro Cys Leu Arg Thr Cys Ser Lys Ser Asp Val Glu Ile Glu
85 90 95
Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile Tyr Ile Leu Asn Glu Glu
100 105 110
Thr Gln Tyr Asn Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Gly Asn Ser
115 120 125
Ser Gly Ser Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly Trp Ser Thr Gln Pro Ile
130 135 140
Cys Ile Lys Phe Cys Asp Met Pro Val Phe Glu Asn Ser Arg Ala Lys
145 150 155 160
Ser Asn Gly Met Trp Phe Lys Leu His Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys
165 170 175
Tyr Asp Gly Tyr Glu Ser Ser Tyr Gly Asn Thr Thr Asp Ser Ile Val
180 185 190
Cys Gly Glu Asp Gly Trp Ser His Leu Pro Thr Cys Tyr Asn Ser Ser
195 200 205
Glu Asn Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser Asn Gly Asp Thr Thr Ser
210 215 220
Phe Pro Gln Lys Val Tyr Leu Pro Trp Ser Arg Val Glu Tyr Gln Cys
225 230 235 240
Gln Ser Tyr Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Lys Tyr Val Thr Cys Ser Asn
245 250 255
Gly Asp Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile Ser Met Lys Pro Cys Glu
260 265 270
Phe Pro Glu Ile Gln His Gly His Leu Tyr Tyr Glu Asn Thr Arg Arg
275 280 285
Pro Tyr Phe Pro Val Ala Thr Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp
290 295 300
Gln Asn Phe Val Thr Pro Ser Gly Ser Tyr Trp Asp Tyr Ile His Cys
305 310 315 320
Thr Gln Asp Gly Trp Leu Pro Thr Val Pro Cys Leu Arg Thr Cys Ser
325 330 335
Lys Ser Asp Ile Glu Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Ser Ser
340 345 350
Ile Tyr Ile Leu Asn Lys Glu Ile Gln Tyr Lys Cys Lys Pro Gly Tyr
355 360 365
Ala Thr Ala Asp Gly Asn Ser Ser Gly Ser Ile Thr Cys Leu Gln Asn
370 375 380
Gly Trp Ser Ala Gln Pro Ile Cys Ile Lys Phe Cys Asp Met Pro Val
385 390 395 400
Phe Glu Asn Ser Arg Ala Lys Ser Asn Gly Met Arg Phe Lys Leu His
405 410 415
Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys Tyr Asp Gly Tyr Glu Ile Ser Tyr Gly
420 425 430
Asn Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Glu Asp Gly Trp Ser His Phe
435 440 445
Pro Thr Cys Tyr Asn Ser Ser Glu Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile
450 455 460
Ser Asn Gly Asp Thr Thr Ser Phe Leu Leu Lys Val Tyr Val Pro Gln
465 470 475 480
Ser Arg Val Glu Tyr Gln Cys Gln Ser Tyr Tyr Glu Leu Gln Gly Ser
485 490 495
Asn Tyr Val Thr Cys Ser Asn Gly Glu Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys
500 505 510
Ile His Pro Cys Ile Ile Thr Glu Glu Asn Met Asn Lys Asn Asn Ile
515 520 525
Gln Leu Lys Gly Lys Ser Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Lys Thr Gly Asp
530 535 540
Thr Ile Glu Phe Met Cys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Asn Thr Ser Val
545 550 555 560
Leu Ser Phe Gln Ala Val Cys Arg Glu Gly Ile Val Glu Tyr Pro Arg
565 570 575
Cys Glu
<210> 2
<211> 577
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) FHR-4A (同种型2) Uniprot: Q92496-2 在20位缺失 输入版本 145 (2018年2月28日), 序列版本 3 (2014年1月22日)
<400> 2
Met Leu Leu Leu Ile Asn Val Ile Leu Thr Leu Trp Val Ser Cys Ala
1 5 10 15
Asn Gly Gln Val Lys Pro Cys Asp Phe Pro Glu Ile Gln His Gly Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Pro Ala Ala Ala Gly
35 40 45
Gln Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Val Thr Pro Ser Gly
50 55 60
Ser Tyr Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Thr
65 70 75 80
Val Pro Cys Leu Arg Thr Cys Ser Lys Ser Asp Val Glu Ile Glu Asn
85 90 95
Gly Phe Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile Tyr Ile Leu Asn Glu Glu Thr
100 105 110
Gln Tyr Asn Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Gly Asn Ser Ser
115 120 125
Gly Ser Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly Trp Ser Thr Gln Pro Ile Cys
130 135 140
Ile Lys Phe Cys Asp Met Pro Val Phe Glu Asn Ser Arg Ala Lys Ser
145 150 155 160
Asn Gly Met Trp Phe Lys Leu His Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys Tyr
165 170 175
Asp Gly Tyr Glu Ser Ser Tyr Gly Asn Thr Thr Asp Ser Ile Val Cys
180 185 190
Gly Glu Asp Gly Trp Ser His Leu Pro Thr Cys Tyr Asn Ser Ser Glu
195 200 205
Asn Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser Asn Gly Asp Thr Thr Ser Phe
210 215 220
Pro Gln Lys Val Tyr Leu Pro Trp Ser Arg Val Glu Tyr Gln Cys Gln
225 230 235 240
Ser Tyr Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Lys Tyr Val Thr Cys Ser Asn Gly
245 250 255
Asp Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile Ser Met Lys Pro Cys Glu Phe
260 265 270
Pro Glu Ile Gln His Gly His Leu Tyr Tyr Glu Asn Thr Arg Arg Pro
275 280 285
Tyr Phe Pro Val Ala Thr Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln
290 295 300
Asn Phe Val Thr Pro Ser Gly Ser Tyr Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr
305 310 315 320
Gln Asp Gly Trp Leu Pro Thr Val Pro Cys Leu Arg Thr Cys Ser Lys
325 330 335
Ser Asp Ile Glu Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile
340 345 350
Tyr Ile Leu Asn Lys Glu Ile Gln Tyr Lys Cys Lys Pro Gly Tyr Ala
355 360 365
Thr Ala Asp Gly Asn Ser Ser Gly Ser Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly
370 375 380
Trp Ser Ala Gln Pro Ile Cys Ile Lys Phe Cys Asp Met Pro Val Phe
385 390 395 400
Glu Asn Ser Arg Ala Lys Ser Asn Gly Met Arg Phe Lys Leu His Asp
405 410 415
Thr Leu Asp Tyr Glu Cys Tyr Asp Gly Tyr Glu Ile Ser Tyr Gly Asn
420 425 430
Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Glu Asp Gly Trp Ser His Phe Pro
435 440 445
Thr Cys Tyr Asn Ser Ser Glu Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser
450 455 460
Asn Gly Asp Thr Thr Ser Phe Leu Leu Lys Val Tyr Val Pro Gln Ser
465 470 475 480
Arg Val Glu Tyr Gln Cys Gln Ser Tyr Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Asn
485 490 495
Tyr Val Thr Cys Ser Asn Gly Glu Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile
500 505 510
His Pro Cys Ile Ile Thr Glu Glu Asn Met Asn Lys Asn Asn Ile Gln
515 520 525
Leu Lys Gly Lys Ser Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Lys Thr Gly Asp Thr
530 535 540
Ile Glu Phe Met Cys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Asn Thr Ser Val Leu
545 550 555 560
Ser Phe Gln Ala Val Cys Arg Glu Gly Ile Val Glu Tyr Pro Arg Cys
565 570 575
Glu
<210> 3
<211> 331
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens) FHR-4B Uniprot: Q92496-3 在FHR-4A的80-326位缺失输入版本145 (2018年2月28日), 序列版本 3 (2014年1月22日)
<400> 3
Met Leu Leu Leu Ile Asn Val Ile Leu Thr Leu Trp Val Ser Cys Ala
1 5 10 15
Asn Gly Gln Glu Val Lys Pro Cys Asp Phe Pro Glu Ile Gln His Gly
20 25 30
Gly Leu Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Pro Ala Ala Ala
35 40 45
Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Val Thr Pro Ser
50 55 60
Gly Ser Tyr Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro
65 70 75 80
Thr Val Pro Cys Leu Arg Thr Cys Ser Lys Ser Asp Ile Glu Ile Glu
85 90 95
Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile Tyr Ile Leu Asn Lys Glu
100 105 110
Ile Gln Tyr Lys Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Thr Ala Asp Gly Asn Ser
115 120 125
Ser Gly Ser Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly Trp Ser Ala Gln Pro Ile
130 135 140
Cys Ile Lys Phe Cys Asp Met Pro Val Phe Glu Asn Ser Arg Ala Lys
145 150 155 160
Ser Asn Gly Met Arg Phe Lys Leu His Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys
165 170 175
Tyr Asp Gly Tyr Glu Ile Ser Tyr Gly Asn Thr Thr Gly Ser Ile Val
180 185 190
Cys Gly Glu Asp Gly Trp Ser His Phe Pro Thr Cys Tyr Asn Ser Ser
195 200 205
Glu Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser Asn Gly Asp Thr Thr Ser
210 215 220
Phe Leu Leu Lys Val Tyr Val Pro Gln Ser Arg Val Glu Tyr Gln Cys
225 230 235 240
Gln Ser Tyr Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Asn Tyr Val Thr Cys Ser Asn
245 250 255
Gly Glu Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile His Pro Cys Ile Ile Thr
260 265 270
Glu Glu Asn Met Asn Lys Asn Asn Ile Gln Leu Lys Gly Lys Ser Asp
275 280 285
Ile Lys Tyr Tyr Ala Lys Thr Gly Asp Thr Ile Glu Phe Met Cys Lys
290 295 300
Leu Gly Tyr Asn Ala Asn Thr Ser Val Leu Ser Phe Gln Ala Val Cys
305 310 315 320
Arg Glu Gly Ile Val Glu Tyr Pro Arg Cys Glu
325 330
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) FHR-4信号肽位置1-19 Uniprot: Q92496-1
<400> 4
Met Leu Leu Leu Ile Asn Val Ile Leu Thr Leu Trp Val Ser Cys Ala
1 5 10 15
Asn Gly Gln
<210> 5
<211> 558
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) FHR-4A成熟蛋白位置20-578 Uniprot: Q92496-1 输入版本145 (2018年2月28日), 序列版本3 (2014年1月22日)
<400> 5
Glu Val Lys Pro Cys Asp Phe Pro Glu Ile Gln His Gly Gly Leu Tyr
1 5 10 15
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ser
20 25 30
Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Val Thr Pro Ser Gly Ser Tyr
35 40 45
Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Thr Val Pro
50 55 60
Cys Leu Arg Thr Cys Ser Lys Ser Asp Val Glu Ile Glu Asn Gly Phe
65 70 75 80
Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile Tyr Ile Leu Asn Glu Glu Thr Gln Tyr
85 90 95
Asn Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Gly Asn Ser Ser Gly Ser
100 105 110
Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly Trp Ser Thr Gln Pro Ile Cys Ile Lys
115 120 125
Phe Cys Asp Met Pro Val Phe Glu Asn Ser Arg Ala Lys Ser Asn Gly
130 135 140
Met Trp Phe Lys Leu His Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Tyr Glu Ser Ser Tyr Gly Asn Thr Thr Asp Ser Ile Val Cys Gly Glu
165 170 175
Asp Gly Trp Ser His Leu Pro Thr Cys Tyr Asn Ser Ser Glu Asn Cys
180 185 190
Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser Asn Gly Asp Thr Thr Ser Phe Pro Gln
195 200 205
Lys Val Tyr Leu Pro Trp Ser Arg Val Glu Tyr Gln Cys Gln Ser Tyr
210 215 220
Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Lys Tyr Val Thr Cys Ser Asn Gly Asp Trp
225 230 235 240
Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile Ser Met Lys Pro Cys Glu Phe Pro Glu
245 250 255
Ile Gln His Gly His Leu Tyr Tyr Glu Asn Thr Arg Arg Pro Tyr Phe
260 265 270
Pro Val Ala Thr Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe
275 280 285
Val Thr Pro Ser Gly Ser Tyr Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr Gln Asp
290 295 300
Gly Trp Leu Pro Thr Val Pro Cys Leu Arg Thr Ser Lys Ser Asp Ile
305 310 315 320
Glu Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile Tyr Ile Leu
325 330 335
Asn Lys Glu Ile Gln Tyr Lys Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Thr Ala Asp
340 345 350
Gly Asn Ser Ser Gly Ser Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly Trp Ser Ala
355 360 365
Gln Pro Ile Cys Ile Lys Phe Cys Asp Met Pro Val Phe Glu Asn Ser
370 375 380
Arg Ala Lys Ser Asn Gly Met Arg Phe Lys Leu His Asp Thr Leu Asp
385 390 395 400
Tyr Glu Cys Tyr Asp Gly Tyr Glu Ile Ser Tyr Gly Asn Thr Thr Gly
405 410 415
Ser Ile Val Cys Gly Glu Asp Gly Trp Ser His Phe Pro Thr Cys Tyr
420 425 430
Asn Ser Ser Glu Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser Asn Gly Asp
435 440 445
Thr Thr Ser Phe Leu Leu Lys Val Tyr Val Pro Gln Ser Arg Val Glu
450 455 460
Tyr Gln Cys Gln Ser Tyr Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Asn Tyr Val Thr
465 470 475 480
Cys Ser Asn Gly Glu Trp Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile His Pro Cys
485 490 495
Ile Ile Thr Glu Glu Asn Met Asn Lys Asn Asn Ile Gln Leu Lys Gly
500 505 510
Lys Ser Asp Ile Lys Tyr Tyr Ala Lys Thr Gly Asp Thr Ile Glu Phe
515 520 525
Met Cys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Asn Thr Ser Val Leu Ser Phe Gln
530 535 540
Ala Val Cys Arg Glu Gly Ile Val Glu Tyr Pro Arg Cys Glu
545 550 555
<210> 6
<211> 312
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) FHR-4B成熟蛋白位置20-331 Uniprot: Q92496-3
<400> 6
Glu Val Lys Pro Cys Asp Phe Pro Glu Ile Gln His Gly Gly Leu Tyr
1 5 10 15
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Leu Tyr Phe Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ser
20 25 30
Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Gln Asn Phe Val Thr Pro Ser Gly Ser Tyr
35 40 45
Trp Asp Tyr Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Thr Val Pro
50 55 60
Cys Leu Arg Thr Cys Ser Lys Ser Asp Ile Glu Ile Glu Asn Gly Phe
65 70 75 80
Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ile Tyr Ile Leu Asn Lys Glu Ile Gln Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Thr Ala Asp Gly Asn Ser Ser Gly Ser
100 105 110
Ile Thr Cys Leu Gln Asn Gly Trp Ser Ala Gln Pro Ile Cys Ile Lys
115 120 125
Phe Cys Asp Met Pro Val Phe Glu Asn Ser Arg Ala Lys Ser Asn Gly
130 135 140
Met Arg Phe Lys Leu His Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Tyr Glu Ile Ser Tyr Gly Asn Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Glu
165 170 175
Asp Gly Trp Ser His Phe Pro Thr Cys Tyr Asn Ser Ser Glu Lys Cys
180 185 190
Gly Pro Pro Pro Pro Ile Ser Asn Gly Asp Thr Thr Ser Phe Leu Leu
195 200 205
Lys Val Tyr Val Pro Gln Ser Arg Val Glu Tyr Gln Cys Gln Ser Tyr
210 215 220
Tyr Glu Leu Gln Gly Ser Asn Tyr Val Thr Cys Ser Asn Gly Glu Trp
225 230 235 240
Ser Glu Pro Pro Arg Cys Ile His Pro Cys Ile Ile Thr Glu Glu Asn
245 250 255
Met Asn Lys Asn Asn Ile Gln Leu Lys Gly Lys Ser Asp Ile Lys Tyr
260 265 270
Tyr Ala Lys Thr Gly Asp Thr Ile Glu Phe Met Cys Lys Leu Gly Tyr
275 280 285
Asn Ala Asn Thr Ser Val Leu Ser Phe Gln Ala Val Cys Arg Glu Gly
290 295 300
Ile Val Glu Tyr Pro Arg Cys Glu
305 310
<210> 7
<211> 1663
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) C3 (UniProt: P01024; 输入版本221 (2017年12月20日); 序列版本2 (2006年12月12日))包括信号肽
<400> 7
Met Gly Pro Thr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr His
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn
20 25 30
Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp
35 40 45
Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly
50 55 60
Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr
65 70 75 80
Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe
85 90 95
Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe
100 105 110
Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly
115 120 125
Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr
130 135 140
Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly
145 150 155 160
Arg Thr Val Met Val Asn Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys
165 170 175
Gln Asp Ser Leu Ser Ser Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser
180 185 190
Trp Asp Ile Pro Glu Leu Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala
195 200 205
Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val
210 215 220
Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu
225 230 235 240
Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile
260 265 270
Phe Gly Ile Gln Asp Gly Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu
275 280 285
Lys Arg Ile Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg
290 295 300
Lys Val Leu Leu Asp Gly Val Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val
305 310 315 320
Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Met Val Gln Ala Glu Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro
340 345 350
Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met
355 360 365
Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala
370 375 380
Tyr Arg Val Pro Val Ala Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu
385 390 395 400
Thr Gln Gly Asp Gly Val Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser
405 410 415
Gln Lys Pro Leu Ser Ile Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser
420 425 430
Glu Ala Glu Gln Ala Thr Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr
435 440 445
Val Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu
450 455 460
Leu Arg Pro Gly Glu Thr Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp
465 470 475 480
Arg Ala His Glu Ala Lys Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn
485 490 495
Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln
500 505 510
Asp Leu Val Val Leu Pro Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser
515 520 525
Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg
530 535 540
Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val
545 550 555 560
Gly Ser Leu Val Val Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val
565 570 575
Pro Gly Gln Gln Met Thr Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg
580 585 590
Val Val Leu Val Ala Val Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys
595 600 605
Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp
610 615 620
Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser
625 630 635 640
Asp Ala Gly Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln
645 650 655
Arg Ala Glu Leu Gln Cys Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser
660 665 670
Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys
675 680 685
Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg
690 695 700
Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys
705 710 715 720
Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg
725 730 735
Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp
740 745 750
Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro
755 760 765
Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn
770 775 780
Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr
785 790 795 800
Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys
805 810 815
Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp
820 825 830
Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg
835 840 845
Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val
850 855 860
Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg
865 870 875 880
Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val
885 890 895
Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val
900 905 910
Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser
915 920 925
Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val
930 935 940
Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu
945 950 955 960
Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser
965 970 975
Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu
980 985 990
Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser
995 1000 1005
Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile
1010 1015 1020
Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly
1025 1030 1035
Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr
1040 1045 1050
Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala
1055 1060 1065
Phe Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val
1070 1075 1080
Lys Val Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln
1085 1090 1095
Val Leu Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys
1100 1105 1110
Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu
1115 1120 1125
Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu
1130 1135 1140
Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys
1145 1150 1155
Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly
1160 1165 1170
Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr
1175 1180 1185
Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly Arg Leu Lys
1190 1195 1200
Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn
1205 1210 1215
Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr
1220 1225 1230
Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe
1235 1240 1245
Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala
1265 1270 1275
Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn
1280 1285 1290
Leu Asp Val Ser Leu Gln Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr
1295 1300 1305
His Arg Ile His Trp Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu
1310 1315 1320
Thr Lys Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly
1325 1330 1335
Gln Gly Thr Leu Ser Val Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys
1340 1345 1350
Asp Gln Leu Thr Cys Asn Lys Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys
1355 1360 1365
Pro Ala Pro Glu Thr Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr
1370 1375 1380
Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala
1385 1390 1395
Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro
1400 1405 1410
Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr
1415 1420 1425
Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Ala Phe Ser Asp Arg Asn Thr
1430 1435 1440
Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser His Ser Glu Asp Asp Cys
1445 1450 1455
Leu Ala Phe Lys Val His Gln Tyr Phe Asn Val Glu Leu Ile Gln
1460 1465 1470
Pro Gly Ala Val Lys Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser
1475 1480 1485
Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu Lys Glu Asp Gly Lys Leu Asn
1490 1495 1500
Lys Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu Asn Cys
1505 1510 1515
Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu
1520 1525 1530
Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg
1535 1540 1545
Leu Val Lys Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met
1550 1555 1560
Ala Ile Glu Gln Thr Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val
1565 1570 1575
Gly Gln Gln Arg Thr Phe Ile Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala
1580 1585 1590
Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser
1595 1600 1605
Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly
1610 1615 1620
Lys Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro Glu Glu Asp Glu Cys Gln
1625 1630 1635
Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr
1640 1645 1650
Glu Ser Met Val Val Phe Gly Cys Pro Asn
1655 1660
<210> 8
<211> 645
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) C3 β链 (UniProt: P01024; 输入版本221 (2017年12月20日);残基 23-667)
<400> 8
Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser
1 5 10 15
Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro
20 25 30
Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser
35 40 45
Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val
50 55 60
Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg
65 70 75 80
Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu
85 90 95
Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr
100 105 110
Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg Ile Phe
115 120 125
Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly Arg Thr Val Met Val Asn
130 135 140
Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys Gln Asp Ser Leu Ser Ser
145 150 155 160
Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser Trp Asp Ile Pro Glu Leu
165 170 175
Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro
180 185 190
Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro
195 200 205
Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr
210 215 220
Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Ile Gln Asp Gly
245 250 255
Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ile Pro Ile Glu
260 265 270
Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Leu Asp Gly
275 280 285
Val Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val
290 295 300
Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Gln Ala Glu
305 310 315 320
Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr
325 330 335
Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met Pro Phe Asp Leu Met Val
340 345 350
Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg Val Pro Val Ala
355 360 365
Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu Thr Gln Gly Asp Gly Val
370 375 380
Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser Gln Lys Pro Leu Ser Ile
385 390 395 400
Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser Glu Ala Glu Gln Ala Thr
405 410 415
Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr Val Gly Asn Ser Asn Asn
420 425 430
Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu Leu Arg Pro Gly Glu Thr
435 440 445
Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp Arg Ala His Glu Ala Lys
450 455 460
Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn Lys Gly Arg Leu Leu Lys
465 470 475 480
Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Pro
485 490 495
Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr
500 505 510
Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser
515 520 525
Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Ser Leu Val Val Lys
530 535 540
Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val Pro Gly Gln Gln Met Thr
545 550 555 560
Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg Val Val Leu Val Ala Val
565 570 575
Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser
580 585 590
Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly
595 600 605
Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser Asp Ala Gly Leu Thr Phe
610 615 620
Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln Arg Ala Glu Leu Gln Cys
625 630 635 640
Pro Gln Pro Ala Ala
645
<210> 9
<211> 915
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) C3 α'链(UniProt: P01024; 输入版本 221 (2017年12月20日);序列版本 2 (2006年12月12日); 残基749-1663)
<400> 9
Ser Asn Leu Asp Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
Ser Glu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu
20 25 30
Pro Pro Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys
35 40 45
Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys
50 55 60
Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp
65 70 75 80
Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln
85 90 95
Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu
100 105 110
Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala
115 120 125
Thr Thr Lys Arg Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln
145 150 155 160
Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly
165 170 175
Val Arg Lys Ser Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys
180 185 190
Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly
195 200 205
Val Gln Lys Glu Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro
210 215 220
Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala
225 230 235 240
Gln Met Thr Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile
245 250 255
Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro
260 265 270
Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys
275 280 285
Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly
290 295 300
Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala
305 310 315 320
Phe Val Lys Arg Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys
325 330 335
Val Phe Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu
340 345 350
Cys Gly Ala Val Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly
355 360 365
Val Phe Gln Glu Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly
370 375 380
Leu Arg Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu
385 390 395 400
Ile Ser Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser
405 410 415
Leu Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr
420 425 430
Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu
435 440 445
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450 455 460
Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr
465 470 475 480
Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu
530 535 540
Asn Leu Asp Val Ser Leu Gln Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr
545 550 555 560
His Arg Ile His Trp Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr
565 570 575
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580 585 590
Thr Leu Ser Val Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu
595 600 605
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610 615 620
Thr Glu Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile
625 630 635 640
Cys Thr Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp
645 650 655
Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln
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Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys
675 680 685
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Lys Leu Asn Lys Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu
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Asn Cys Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg
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Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg
785 790 795 800
Leu Val Lys Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala
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Glu Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp
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Gly Glu Lys Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly Lys Asp Thr Trp Val
865 870 875 880
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885 890 895
Gln Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met Val Val Phe Gly
900 905 910
Cys Pro Asn
915
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建FHR4＃1 位置：46 siRNA靶标
<400> 10
gaatcacact tggtaactaa t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建FHR4＃1 位置：46 零乱siRNA
<400> 11
gccaagaatg tacctattat a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建FHR4＃2 位置：835 siRNA靶标
<400> 12
ggtcaagagt cgagtaccag t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建FHR4＃2 位置：835 零乱siRNA（阴性对照）
<400> 13
gggtgaatcc cgcatggtaa a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #3 位置: 1401 siRNA 靶标
<400> 14
gaatgctacg atggatatga a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #3 位置: 1401 零乱siRNA (阴性对照)
<400> 15
gataaggtga gccattagat a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #4 位置: 1658 siRNA 靶标
<400> 16
ggaaccacca agatgcatac a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #4 位置: 1658 零乱siRNA（阴性对照）
<400> 17
gcactcaaga agacgatacc a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #5 位置: 1794 siRNA靶标
<400> 18
ggatataatg cgaatacatc a 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #5 位置: 1794 零乱siRNA (阴性对照)
<400> 19
gcataagaat atacgttcag a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #6 位置: 2154 siRNA靶标
<400> 20
gcatattgta cagtatacct a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 构建 FHR4 #6 位置: 2154 零乱siRNA(阴性对照）
<400> 21
gttgctatcg tctataaaca a 21

Claims (22)

1.一种确定受试者是否有罹患补体相关疾病风险的方法，所述方法包括确定所述受试者血液中FHR-4的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，包括确定所述受试者的血液中FHR-4水平的增加。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中FHR-4水平升高表明罹患补体相关疾病的风险增加。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法包括测量所述受试者的血液中的FHR-4蛋白的浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其中FHR-4浓度＞15μg/ml表明所述受试者罹患所述疾病的高风险。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在来自受试者的血液来源的样品中确定FHR-4的水平和/或浓度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中FHR-4的水平和/或浓度在体外确定。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述疾病选自黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)、早发性黄斑变性(EOMD)、黄斑营养不良、青光眼、糖尿病视网膜病变、溶血性尿毒症综合症(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、自身免疫性葡萄膜炎、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGNII)、脓毒症、过敏性紫癜(HSP)、IgA肾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合症(SS)、类风湿性关节炎(RA)、C3肾炎因子肾小球肾炎(C3NF GN)、遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、脑脊髓炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症(MS)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括确定所述受试者中是否存在与AMD和/或EOMD和/或黄斑营养不良有关的一种或多种遗传因子。
10.补体靶向治疗剂在治疗或预防在受试者中补体相关疾病的方法中的用途，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因水平升高。
11.一种用于治疗或预防受试者的补体相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的靶向补体的治疗剂，其中所述待治疗的受试者的FHR-4水平和/或编码FHR-4的基因表达水平升高。
12.根据权利要求10所述的靶向补体的治疗剂的用途或根据权利要求11所述的方法，其中已确定所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR的基因表达水平升高。
13.一种降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4基因的表达的药剂在治疗或预防受试者中的补体相关疾病的方法中的用途，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达水平升高。
14.一种治疗或预防受试者的补体相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂，其中所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码FHR-4的基因表达水平升高。
15.根据权利要求13所述的药剂的用途，或根据权利要求14所述的方法，其中，已经确定所述受试者的FHR-4水平升高和/或编码的FHR-4基因表达水平升高。
16.根据权利要求13或15所述的药剂的用途，或根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述药剂具有以下一种或多种性质：抑制CFHR4基因的表达，降解FHR-4mRNA，与FHR-4蛋白结合，隔离FHR-4蛋白，隔离FHR-4蛋白，竞争FHR-4蛋白的结合，阻断FHR-4蛋白的活性，降低血液中FHR-4的浓度，降低FHR-4蛋白离开血液的能力，降低FHR-4蛋白到达眼睛的能力，减少FHR-4在眼中的含量，降低FHR-4蛋白进入BrM的能力，抑制FHR-4介导的信号传导，调节涉及C3b的反应，调节涉及FHR-4和C3b的反应，降低FHR-4蛋白质与C3b结合的能力，与FHR-4蛋白质竞争C3b结合，促进FHR的解离-3来自C3b，减少C3转化酶激活，减少C3bBb的产生，增加C3失活，增加iC3b的产生，减少补体激活和/或失活补体途径。
17.根据权利要求13、15或16中任一项所述的药剂的用途，或根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂选自：反义核酸、适体、抗原结合分子、螯合剂和/或诱饵受体。
18.根据权利要求10、12、13或15至17中任一项所述的药剂的用途，或根据权利要求11、12、或14至17中任一项所述的方法，其中所述补体相关疾病选自黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、地图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、脉络膜新生血管形成(CNV)、早发性黄斑变性(EOMD)、黄斑营养不良、青光眼、糖尿病视网膜病变、溶血性尿毒症综合症(HUS)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、自身免疫性葡萄膜炎、II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN II)、脓毒症、过敏性紫癜(HSP)、IgA肾病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合症(SS)、类风湿性关节炎(RA)、C3肾炎因子肾小球肾炎(C3 NFGN)、遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、脑脊髓炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症(MS)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。
19.一种选择受试者的方法，所述受试者用补体靶向的治疗剂或降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂对所述受试者进行治疗，所述方法包括确定受试者中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平，以及任选地，其中FHR-4的水平和/或编码FHR-4的基因的表达水平增加，则选择用治疗剂或药剂治疗的对象。
20.降低FHR-4水平和/或降低编码FHR-4的基因表达的药剂在治疗或预防受试者的年龄相关性黄斑变性(AMD)或早发性黄斑变性(EOMD)或黄斑营养不良的方法中的用途。
21.根据权利要求20所述的药剂的用途，其中所述AMD选自图样萎缩(“干性”(即非渗出性)AMD)、早期AMD、中期AMD、后期/晚期AMD、“湿性”(新生血管性或渗出性)AMD、和脉络膜新生血管形成(CNV)。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的药剂的用途，其中降低FHR-4的量和/或降低编码FHR-4的基因的表达的药剂是螯合剂和/或FHR-4的诱饵受体。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202006789D0 (en) 2020-05-07 2020-06-24 Univ Manchester Detection of complement proteins
EP4214515A1 (en) 2020-09-16 2023-07-26 Complement Therapeutics Limited Complementome assay
GB202107586D0 (en) 2021-05-27 2021-07-14 Complement Therapeutics Ltd Inhibitory nucleic acids for Factor H family proteins
GB202203627D0 (en) * 2022-03-16 2022-04-27 Univ Manchester Agents for treating complement-related disorders
WO2023212293A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof
WO2023212298A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101160412A (zh) * 2005-02-14 2008-04-09 爱荷华大学研究基金会 治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂
US20080152659A1 (en) * 2006-07-13 2008-06-26 University Of Iowa Research Foundation Methods and reagents for treatment and diagnosis of vascular disorders and age-related macular degeneration
CN101563363A (zh) * 2006-06-21 2009-10-21 南卡罗来纳医疗大学研究发展基金会 用于治疗疾病的靶向补体因子h
CN103920142A (zh) * 2005-02-14 2014-07-16 爱荷华大学研究基金会 治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂
US20150361183A1 (en) * 2013-01-30 2015-12-17 Imperial Innovations Limited Inhibition of the complement system

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002044321A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
BRPI0619657A2 (pt) 2005-11-04 2011-11-08 Genentech Inc métodos de prevenção ou melhoria de doença ocular, uso de um inibidor de complemento, uso de um sirna especìfico para uma proteìna do sistema complemento e uso de um ácido nucleico que codifica um inibidor do sistema complemento
US20100330097A1 (en) 2007-11-01 2010-12-30 Hageman Gregory S Predicting amd with snps within or near c2, factor b, plekha1, htra1, prelp, or loc387715
CN101544476A (zh) 2008-03-28 2009-09-30 皮尔金顿集团有限公司 超疏水性透明涂层及其制备方法
US20150157675A1 (en) 2012-04-02 2015-06-11 Sung Kyun Biotech Co., Ltd. Composition comprising eupatorium spp. extract as active ingredient for preventing and treating obesity and metabolic bone disease
WO2013185069A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101160412A (zh) * 2005-02-14 2008-04-09 爱荷华大学研究基金会 治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂
CN103920142A (zh) * 2005-02-14 2014-07-16 爱荷华大学研究基金会 治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂
CN101563363A (zh) * 2006-06-21 2009-10-21 南卡罗来纳医疗大学研究发展基金会 用于治疗疾病的靶向补体因子h
US20080152659A1 (en) * 2006-07-13 2008-06-26 University Of Iowa Research Foundation Methods and reagents for treatment and diagnosis of vascular disorders and age-related macular degeneration
US20150361183A1 (en) * 2013-01-30 2015-12-17 Imperial Innovations Limited Inhibition of the complement system

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