WO2018048192A1 - 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법 - Google Patents

종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2018048192A1
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WO
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stent
vorinostat
block copolymer
coated
tumor
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PCT/KR2017/009762
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강대환
정영일
곽태원
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부산대학교병원
부산대학교 산학협력단
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    • A61F2/82—Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials

Definitions

  • the present invention relates to a tumor-specific enzyme-responsive nanofiber-coated vorinostat-releasing gut stent and a method for preparing the same, and more particularly, inhibits histone deacetylase that is specifically expressed in tumor tissue or cancer cells.
  • This is a stent loaded with vorinostat, which is effective to prevent digestive cancer, especially by supporting vorinostat on nanofibers, which have improved drug release control ability, and coating nanofiber films on stents for digestive organs.
  • the present invention relates to a vorinostat-releasing gut stent coated with a tumor specific enzyme-responsive nanofiber, and a method of manufacturing the same.
  • gastrointestinal cancers such as stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, liver cancer, etc. among Korean cancer incidences is increasing rapidly, which is included among the top 10 cancers every year.
  • treatments for gastrointestinal cancer such as surgery, chemotherapy, immunotherapy, and radiation therapy, but most of the treatments have a poor prognosis except for early detection and surgery.
  • Advanced gastrointestinal cancers block the digestive tract, such as the gastrointestinal tract, esophagus or bile duct, causing symptoms such as dysphagia, vomiting and jaundice. Therefore, in order to survive or improve the quality of life, the clogged tube should be opened.
  • Endoscopic or radiation-mediated stent implantation is recognized as a primary treatment rather than the past treatment using bypass surgery.
  • the digestive stent is a medical device that is inserted and mounted in the narrowed digestive tract to expand the stenosis back to its original size.
  • the stent used for digestive cancer is stainless steel, nickel titanium, nitinol, and cobalt. It is made of a metal such as chromium (cobalt chromium) and inserted into the body through a thin diameter release tool.
  • the stent inserted in the constricted position is called a self-expandable bare metal stent, which is used for non-blood system such as bile duct, airway, and gastrointestinal tract.
  • the metal stent does not have a direct cancer cell killing effect, there is a disadvantage in that restenosis of the stent occurs due to growth of cancer cells after a certain period of time after insertion of the stent. Therefore, drug eluting stents have a concept of local drug delivery that prevents cancer cell growth by delivering an anticancer drug to the stent where the drug is gradually released by coating a drug such as an anticancer drug on the existing stent.
  • DES is urgently needed to overcome digestive cancer.
  • nanofibers by electrospinning which are being actively researched, since proteins or drugs can be simultaneously supported in nano-sized fibers without damage in an environment of normal temperature and pressure, such as metal stents, A method of attaching a polymer nanofiber containing drug to a support by coating it directly on the support or by post treatment has been devised.
  • the nanofibers produced by the electrospinning technique can easily control the diameter, thickness, drug loading, etc. of the fibers, and have a fibrous structure, which can be applied to various fields such as drug-release stents.
  • Non-vascular stents are commonly used in the trachea and bronchus, as well as the digestive tract, such as esophagus and bile ducts.
  • the first is internal hyperplasia, which narrows the lumen due to benign hyperplasia of the tissue due to foreign body reaction to the inserted stent.
  • the main goal of the drug-release stent for the digestive system is to prevent obstruction of the digestive tract due to tumor overgrowth.
  • the gut stent is divided into a bare metal stent or a covered stent coated with a non-degradable polymer, and the drug-release stent is coated with a polymer that has an anticancer effect on the surface of the stent so that the drug is controlled. To be released. Coating the drug on the digestive stent can be classified into three types.
  • the polymer can use both non-degradable and biodegradable polymer, and when the drug is dissolved in the non-degradable polymer, the drug is released by diffusion.
  • the drug release tendency is controlled by the thickness of the coated polymer, and the drug release stent for blood vessels is used. CYPHER TM , TAXUS TM, and the like are applicable.
  • the polymer is a medium that carries a drug such as polyurethane (PU), polyethylene, Teflon, polytetrafluoroethylene (PTFE), polycarprolactone (PCL), poly (lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA), polyvinylalcohol (PVA), etc. It can be used to coat a large amount of drug on the stent.
  • PU polyurethane
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PCL polycarprolactone
  • PLGA poly (lactic acid-co-glycolic acid)
  • PVA polyvinylalcohol
  • the prior art according to such a stent is the 'Korea Patent Registration No. 10-1049871 vascular stent yarn and the vascular stent using this thread', in the case of the prior art to produce nanofibers using a biodegradable polymer material
  • the polymer material mainly consists of a chain form, and because it is not selectively biodegradable to digestive cancer, it can not be expected to have a special effect on cancer treatment.
  • the development of coating technology is needed.
  • an object of the present invention is to prepare a nanofiber carrying a bolinostat having a histone deacetylase inhibitory effect and coating it on a stent for bile ducts, which is more effective in biliary tract cancers generated in the bile ducts, one of the human digestive organs.
  • the biodegradable polymer is a peptide that is decomposed by cathepsin B and covalently bonded with other polymers to prepare a block copolymer, and using this, a tumor-specific enzyme immobilized on the biliary stent by making a nanofiber loaded with vorinostat.
  • the present invention provides a responsive nanofiber coated vorinostat releasing gut stent and a method of manufacturing the same.
  • the above object is to synthesize a biodegradable polymer block copolymer using a glycine-phenylalanine-leucine-glycine (GFLG) peptide that is specifically degraded to cathepsin B.
  • GFLG glycine-phenylalanine-leucine-glycine
  • Tumor specific enzyme-responsive nanofibers comprising the step of dissolving the biodegradable polymer block copolymer and vorinostat in an organic solvent to form a spinning solution, and spinning the spinning solution onto a stent body. Is achieved by the method of producing a coated vorinostat releasing gut stent.
  • the biodegradable polymer block copolymer is preferably a polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer formed by linking polycaprolactone (PCL) and polyethylene glycol (PEG) through the GFLG peptide.
  • PCL polycaprolactone
  • PEG polyethylene glycol
  • the biodegradable polymer block copolymer is formed by covalently bonding the carboxylic acid of the GFLG peptide and the amine group of 4-arm polyethylene glycol, and is PCL-GFLG- (PEG) n -[(PEG) n -NH- GFLG-PCL] 3 is preferable, and the biodegradable polymer block copolymer preferably has a molecular weight of 20,000 to 200,000 g / mol.
  • the step of synthesizing the biodegradable polymer block copolymer the step of preparing the GFLG peptide to 0.01 to 30% by weight of the solvent; Mixing and reacting dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) with the GFLG peptide to 0.01 to 30% by weight; Adding 4-arm polyethylene glycol to 0.01 to 30% by weight in the solvent to react to form a first mixture; Lyophilizing the first mixture to obtain polyethylene glycol to which a peptide is covalently bonded; Polycaprolactone, dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride, and N-hydroxysuccinimide are dissolved in an organic solvent so as to be 0.01 to 30% by weight, and the peptide is co-bonded with polyethylene glycol to react with a second solvent. Forming a mixture; It is preferable to include the step of lyophil
  • the spinning solution the content of the vorinostat is mixed 0.01 to 20% by weight based on 100% by weight of the biodegradable polymer block polymer, the spinning solution is the biodegradable polymer block polymer in 100% by weight of the total spinning solution And it is preferable that the total verninostat is contained 3 to 60% by weight.
  • the above object is also the stent main body; Biodegradable polymer block copolymer formed using Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG) peptide that is specifically degraded to cathepsin B, and vorinostat It is also achieved by a tumor-specific enzyme-responsive nanofiber-coated vorinostat releasing digestive tract stent, comprising nanofibers coated on the surface of the stent body through radiation.
  • GFLG Gly-Phe-Leu-Gly
  • the biodegradable polymer block copolymer is preferably a polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer formed by linking polycaprolactone (PCL) and polyethylene glycol (PEG) through the GFLG peptide.
  • PCL polycaprolactone
  • PEG polyethylene glycol
  • the biodegradable polymer block copolymer is formed by covalently bonding the carboxylic acid of the GFLG peptide and the amine group of 4-arm polyethylene glycol, and is PCL-GFLG- (PEG) n -[(PEG) n -NH- GFLG-PCL] 3 is preferable, and the biodegradable polymer block copolymer preferably has a molecular weight of 20,000 to 200,000 g / mol.
  • biodegradable polymer is a peptide that is decomposed by cathepsin B covalently bonded with other polymers to prepare a block copolymer, using this can be fixed to the biliary stent made of nanofibers loaded with vorinostat.
  • FIG. 1 is a flow chart of a method for producing a digestive tract stent according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a flow chart illustrating a synthetic method of covalently binding cathepsin B peptide to 4-cancer polyethylene ethylene glycol according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating a method of synthesizing a block copolymer by covalently binding 4-hep polyethylene ethylene glycol and polycaprolactone covalently bonded to a cathepsin B peptide according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4 is an electron micrograph of a nanofiber coated stent according to the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the release rate of the vorinostat in the nanofiber coated stent prepared in Figure 4 according to the present invention
  • Figure 6 is a graph showing the molecular weight change of the block copolymer in the nanofiber coated stent prepared in Figure 5 according to the present invention.
  • Figure 7 is a photograph showing the protein expression by Western blot anti-cancer performance of the vorinostat released in Figure 5 according to the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph and a graph comparing anticancer activity in rats with biliary tract cancer cell line (HuCC-T1) according to the present invention as a tumor model.
  • the shape of the polymer carrier is possible in two ways. First, a film or nanofiber web (nonwoven fabric) is produced by attaching to the outer surface of the stent is used. Second, it is possible to prepare a polymer carrier supporting the drug as a spinning solution and to spin it directly on the outer surface of the stent so that the nanofibers are directly coated.
  • the main feature of the present invention is that the vorinostat forms a polymer nanofiber carrier, and thus, it is possible to make the above-described film form, nanofiber web (nonwoven fabric) formation, or nanofiber direct coating. Among them, to prepare a film for the control experiment will be described as an example.
  • PCL polycaprolactone
  • the present invention is specifically coated with a vorinostat-releasing nanofiber coated with anti-cancer effects by specifically inhibiting histone deacetylase expressed in biliary cancer cells, which is a type of gastrointestinal cancer.
  • biliary cancer cells which is a type of gastrointestinal cancer.
  • nanofibers containing biodegradable polymer block copolymers that are effectively degraded by enzymes secreted by the biliary tract cancer cells are coated on the stent to selectively react to the biliary tract cancer, minimizing side effects such as necrosis of surrounding tissues due to biodegradation and treatment.
  • the purpose is to produce a vorinostat-release digestive tract stent that can be.
  • the vorinostat releasing gut stent of the present invention uses a stent body and glycine-phenylalanine-leucine-glycine (Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) peptide that is specifically degraded to cathepsin B.
  • Biodegradable polymer block copolymer formed by, and the vorinostat (vorinostat) comprises a nanofiber coated on the surface of the stent through the electrospinning.
  • a glycine-phenylalanine-leucine-glycine (Gly-Phe-Leu-Gly) peptide is used. Synthesizing polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer; The polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer and borinostat are dissolved in an organic solvent and electrospun onto the stent body.
  • Peptides corresponding to the peptide structure specifically degraded to cathepsin B, one of the enzymes secreted by biliary tract cancer cells are glycine-phenylalanine-leucine-glycine (Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) peptides. There are two peptides that connect two different polymers to each other to synthesize a biodegradable polymer block copolymer.
  • the polymer block copolymer is most preferably a polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer, which is a biodegradable polycaprolactone-polyethylene glycol block by connecting polyethylene glycol (PEG) and polycaprolactone (PCL) through a peptide.
  • PEG polyethylene glycol
  • PCL polycaprolactone
  • Polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer is formed by covalently bonding carboxylic acid of GFLG peptide and amine group of 4-arm polyethylene glycol, and is PCL-GFLG- (PEG) n -[(PEG) n -NH- GFLG-PCL] 3 structure.
  • the polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer preferably has a molecular weight of 20,000 to 200,000 g / mol. If the molecular weight is less than 20,000 g / mol, it is difficult to form nanofibers. It is difficult to melt.
  • the molecular weight is smaller than the present invention, it is difficult to coat the nanofibers on the surface of the stent body because the nanofibers are not formed well, and the small molecular weight means that the arm is less so that biodegradation is sufficiently achieved. You may not lose.
  • the 4-ca polycarprolactone-polyethylene glycol block copolymer made of the present invention is used, the amount of GFLG peptide that is decomposed by reacting with cathepsin B increases, which is an excellent stent for treating cancer.
  • the first step comprises preparing the glycine-phenylalanine-leucine-glycine peptide to 0.01 to 30% by weight of the solvent; Dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) to 0.01 to 30% by weight Mixing with the peptide solution and reacting for 12 hours; Mixing 4-arm polyethylene glycol to 0.01 to 30% by weight and reacting for 24 hours; Dialysis to purify the reaction mixture, and lyophilized to obtain polyethylene glycol covalently bonded peptide; Polycaprolactone, dimethylamino propyl-ethylcarbodiimide hydrochloride (N- (3-Dimethylaminopropyl) -
  • the polymer block copolymer may be polylactide-co-glycolide, polylactide-co-caprolactone, polylactide-polyethylene glycol block copolymer, poly Caprolactone-Polyethylene Glycol Block Copolymer, Poly (lactide), PLA, Poly (glycolide, PGA), Polyethylene Glycol, Polypropylene Glycol propylene glycol), poly (vinyl alcohol), PVA, polyvinylpyrrolidone (poly (vinylpirrolidone), PVP), dextran, hyaluronic acid, pullulan, Cellulose (chitosan), chitosan (chitosan), cellulose (cellulose), beta-glucan (fucoidan) can be used alone or in combination (blend), but not limited to the above materials, using a peptide Block There is no particular limitation as long as the material can synthesize the coalescence.
  • the polymer block copolymer and borinostat are dissolved in an organic solvent and electrospun onto the stent body (S2).
  • the polymer block copolymer and the borinostat are dissolved in a glass solvent, mixed with each other, and then electrospun onto the stent body to produce the boronstat-release stent.
  • nanofibers loaded with vorinostat using polymer block copolymers are manufactured by electrospinning and coated on the biliary stent body so that the nanofibers fixed on the stent body are closely adhered to the biliary cancer tissue.
  • the spinning block is prepared by dissolving the polymer block copolymer and the vorinostat in a spinnable concentration using the same solvent.
  • the content of the vorinostat is in the range of 0.01 to 20% by weight based on 100% by weight of the entire polymer block copolymer. If the ratio of vorinostat is less than 0.01% by weight, the content of the final product may not be exhibited due to the low content of vorinostat, and if it is more than 20% by weight, the final product may have too much content of vorinostat.
  • the concentration of the spinning solution (mixed solution in which the polymer block copolymer and the borinostat) are prepared is 3 to 60% by weight to form a morphology of the fiber ( It is desirable to control morphology.
  • the concentration of the spinning solution is less than 3% by weight, it is difficult to form a fibrous shape, and when it exceeds 60% by weight, the viscosity rises, making it difficult to spin.
  • the spinning solution prepared at a concentration of 3 to 60% by weight is transferred to a spinning nozzle using a metering pump, and electrospinning is performed by applying a voltage to the spinning nozzle using a high voltage regulator.
  • the voltage is used as a voltage capable of radiation in the range of 0.5 to 100kV
  • the current collector may be grounded or charged to the (-) pole.
  • a collector plate is comprised from an electrically conductive metal, a peeling paper, etc.
  • the amount of discharge during spinning is discharged at a discharge rate of 0.01 to 5cc / hole ⁇ min per hole using a metering pump, and is preferably radiated in an environment with a relative humidity of 10 to 90% in a chamber that can control temperature and humidity during spinning.
  • the spinning method includes electrospinning, electro-spray, electro-brown spinning, centrifugal electro-spinning, and flash electrospinning.
  • Various methods of radiation such as electrospinning, bubble electrospinning, and magnetic electrospinning can be adopted.
  • FIG. 2 shows a method of covalently binding amine groups of 4-carboxylic acid polyethylene glycol and carboxylic acid of glycine-phenylalanine-leucine-glycine (Gly-Phe-Leu-Gly) peptide.
  • chlorine e6 was converted to dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)).
  • EDC dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • EDC dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • EDC dimethylaminopropyl-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • Figure 3 is a view showing a method for obtaining a block copolymer by combining polycaprolactone to peptide-bound polyethylene glycol. More specifically, 1200 mg of polyethylene glycol bound peptide was dissolved in 50 ml of DMSO, 77 mg of N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxy 46 mg of succinimide was added and stirred for about 12 hours, and then 4000 mg of polycaprolactone (molecular weight 10,000 g / mol) was added and stirred for 24 hours to react.
  • EDC N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • reaction product was precipitated in diethyl ether to obtain a precipitate, which was placed in a desiccator at room temperature and dried in vacuum for about 3 days to obtain a polycaprolactone-polyethylene glycol block copolymer as a white powder.
  • the spinning solution consisting of a polymer and a vorinostat is to be a solution of about 15% by weight.
  • the nanofiber web was obtained by electrospinning at an applied voltage of 25 kV, a distance of 20 cm between the spinning nozzle and the current collector, and a discharge amount of 0.05 cc / g / hole per minute at 30 ° C. and a relative humidity of 60%.
  • the spinning solution was directly radiated to the stent main body fixed to the rotating body to form a nanofiber carrying borinostat and at the same time, coating the stent main body to obtain a borinostat-releasing stent coated with nanofibers.
  • the scanning electron micrograph of the web is shown in FIG. The distribution of the fiber diameter was about 200-600 nm, and the average fiber diameter was about 300 nm.
  • the release rate of vorinostat from the nanofibers prepared in Example 3 was performed in phosphate buffered saline (PBS) solution, 0.01M, pH7.4, and the amount of vorinostat released was determined by HPLC. Measured.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 5 shows the effect of cathepsin B secreted from cancer cells on the release rate of vorinostat released from nanofibers.
  • the release rate of chlorine e6 was slow on the phosphate buffer solution, and less than 30% was released in about 3 days, but more than 60% was released in 3 days when cathepsin B was present.
  • the release of vorinostet from the nanofibers can be seen that the drug is released in response to cancer cell-specific enzyme cathepsin B can be effectively delivered to cancer tissues.
  • Figure 6 is a graph confirming the molecular weight of the biodegradable polymer block polymer according to cathepsin B, the block polymer is not in contact with the cathepsin B is maintained in the molecular weight while the block polymer is in contact with the cathepsin B is reduced in molecular weight It can be seen that the block polymer is biodegraded by cathepsin B.
  • FIG. 7 shows the anticancer effect of the vorinostat released from the nanofibers.
  • the vorinostat released from the nanofibers was found to express Ac-Histone H4 in the same manner as the existing drugs, and also inhibited the expression of HDAC1, HDAC2, and HDAC3.
  • HDAC histone deacetylase
  • the vorinostat released from nanofibers can effectively inhibit the expression of histone deacetylase (HDAC), which is specifically expressed in cancer cells, and can acetylate (Ac-Histone) to Histone. there was.
  • HDAC histone deacetylase
  • the nanofibers carrying the vorinostat prepared in Example 3 were tested for anticancer performance against HuCC-T1 cells, a human biliary cancer cell line.
  • Figure 8 is an experiment on the anti-cancer performance of HuCC-T1 cells, human biliary cancer cell line is nanofibers loaded with vorinostat. About two to three weeks after planting tumors in nude mice, when the tumors grew, they planted nanofibers at the bottom of the tumors to measure anticancer performance. As shown in the figure, when the nanofibers carrying the vorinostat were placed in comparison with the comparison group, the tumor size was found to be reduced by almost half.
  • the nanofibers loaded with vorinostats effective on cancer cells can also be prepared with vorinostat-targeted nanoparticle stents. This stent manufacturing process will be briefly described.
  • the solution may be dropped into an aqueous solution such as distilled water to make a nanoparticle solution, and then dialyzed using a dialysis membrane to remove the organic solvent, and then spun directly onto the stent body, so that the nanoparticles may be coated on the surface of the stent body.
  • an aqueous solution such as distilled water
  • dialyzed using a dialysis membrane to remove the organic solvent
  • spun directly onto the stent body so that the nanoparticles may be coated on the surface of the stent body.
  • a separate current collector plate may be prepared to prepare a nanofiber web (nonwoven form) first, and the nanoparticle solution may be re-spun on the nanofiber web to be attached onto the nanofiber.
  • the nanoparticles may be used to prepare a film in a film form. It is also possible to prepare a drug-release controlled therapeutic stent by preparing such a film-type film and adhering to the outer surface of the stent body.

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Abstract

본 발명은, 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법에 있어서, 카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드를 이용하여 생분해성 고분자 블록공중합체를 합성하는 단계와; 상기 생분해성 고분자 블록공중합체와 보리노스탯(vorinostat)을 유기용매에 녹여 방사용액을 형성하고, 상기 방사용액을 스텐트본체에 방사 하는 단계를 포함하는 것을 기술적 요지로 한다. 이에 의해 히스톤 디아세틸라아제 억제 효과가 있는 보리노스탯을 담지한 나노섬유를 제조하여 담관용 스텐트에 코팅하는 것으로, 인체 내 소화기관 중 하나인 담관 내에서 발생한 담도암에 보다 활용도가 높은 효과를 얻을 수 있다. 또한, 생분해성 고분자를 카텝신 B에 의해 분해되는 펩타이드로 다른 고분자와 공유결합하여 블록공중합체로 제조하고, 이를 이용하여 보리노스탯이 담지된 나노섬유로 만들어 담도용 스텐트에 고정할 수 있다.

Description

종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법
본 발명은 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종양 조직 또는 암세포에 특이적으로 발현하는 히스톤 디아세틸라아제를 저해하는 효과가 있는 보리노스탯을 담지한 스텐트로, 특히 보리노스탯의 약물방출조절 능력이 보다 향상된 나노섬유에 보리노스탯을 담지하고 나노섬유 필름을 소화기용 스텐트에 코팅하여 소화기암을 효과적으로 억제할 수 있는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법에 관한 것이다.
인간의 식생활 및 생활패턴의 변화로 국내의 암 발병률 중 특히 위암, 식도암, 대장암, 담도암, 췌장암, 간암 등과 같은 소화기암의 발병률이 급증하고 있으며, 이는 매년 상위 10대 암 중에 포함되고 있다. 소화기암의 치료법은 수술, 화학 치료법, 면역요법, 방사선 치료법 등 다양한 치료법이 있지만, 조기 발견되어 외과적 수술이 가능한 경우를 제외하고는 대부분의 치료법이 예후가 나쁜 편이다. 또한 상당히 많은 예에서 이미 진행된 상태로 발견되며 수술이 불가능한 경우가 상당수이다. 진행된 소화기암은 위장관, 식도 또는 담관과 같이 소화기관을 막아 연하곤란, 구토, 황달과 같은 증상을 일으킨다. 따라서 환자생존이나 삶의 질 향상을 위해서 막힌 관을 개통시켜야 하는데, 과거의 바이패스(bypass) 수술을 이용한 치료법보다는 내시경 또는 방사선중재 스텐트 삽입술이 1차 치료법으로 인정받고 있다.
소화기용 스텐트는 협착된 소화관 내에 삽입 및 장착되어 협착부위를 원래의 크기로 다시 확장시키는 의료장치이며, 소화기암에 사용되는 스텐트는 스테인레스스틸(stainless steel), 니켈티타늄(nickel titanium, nitinol), 코발트크로뮴(cobalt chromium) 등의 금속으로 제조되어 얇은 직경의 방출도구를 통해 체내에 삽입된다. 이와 같이 협착된 자리에 삽입된 스텐트가 스스로 팽창하는 경우를 자가 팽창형 금속 스텐트(self-expandable bare metal stent)라고 하며, 이는 담관계나 기도, 위장관 등의 비혈관계에 사용되고 있다. 이러한 금속 스텐트는 직접적인 암세포 사멸 효과가 없기 때문에 스텐트 삽입 후 일정 기간이 흐른 뒤 암세포의 성장으로 인한 스텐트의 재협착이 발생하는 단점이 있다. 따라서 기존의 스텐트에 항암제와 같은 약물을 코팅하여 약물이 서서히 방출되게 함으로써 스텐트가 삽입된 곳에 항암제를 전달하여 암세포 성장을 억제하는 국소약물전달(local drug delivery) 개념을 가진 약물방출 스텐트(drug eluting stent, DES)의 개발이 소화기암의 극복을 위해 시급한 상황이다.
한편 최근 연구가 활발하게 진행되고 있는 전기방사에 의한 나노섬유(nanofiber)의 경우, 상온, 상압의 환경에서 단백질이나 약물을 손상 없이 나노크기의 섬유 내에 방사와 동시에 담지할 수 있으므로, 금속 스텐트와 같은 지지체에 직접 방사하여 코팅하거나 후처리를 통하여 약물이 함유된 고분자 나노섬유를 지지체에 부착시킬 수 있는 방법이 고안되고 있다. 이러한 전기방사 기법에 의해 제조된 나노섬유는 섬유의 직경, 두께, 약물 담지량 등을 손쉽게 조절가능하며, 섬유상 구조를 하고 있어 약물방출형 스텐트와 같은 다양한 분야에 적용이 가능한 장점을 가지고 있다.
비혈관 스텐트는 식도, 담관계 등 소화관 이외에도 기관과 기관지 등에서도 흔하게 사용되고 있으며, 공통적으로 두 가지 문제를 예방해야 한다. 첫째는 삽입된 스텐트에 대한 이물반응으로 조직의 양성 과형성이 발생하여 내강을 좁게 하는 내증식이다. 둘째는 암에 의한 체내 통로의 폐쇄를 치료하기 위해 삽입된 스텐트에서 악성 과증식이 일어나는 것이다. 소화기용 약물방출 스텐트의 주요 목표는 종양의 과증식으로 인한 소화관의 폐쇄를 예방하는 것이다. 소화관 스텐트는 베어메탈 스텐트(bare metal stent) 혹은 비분해성 고분자가 코팅된 커버드 스텐트(covered stent)로 나뉘고, 약물방출 스텐트는 이러한 스텐트 표면에 항암효과가 있는 약물을 고분자와 함께 코팅하여 약물이 제어방출되도록 한 것이다. 약물을 소화기용 스텐트에 코팅하는 방법은 크게 세 가지로 구분할 수 있다.
1) 고분자와 약물을 금속스텐트 메쉬 위에 동시에 직접 코팅하는 방법, 2) 고분자 없이 약물을 다공성의 금속 스텐트의 다공에 약물을 부착하는 방법, 3) 마지막으로 약물을 담지한 고분자를 필름 형태로 제조하고 스텐트에 고정하는 방법이 있다. 이때 고분자는 비분해성과 생분해성 고분자를 모두 사용할 수 있으며 약물이 비분해성 고분자에 녹아 있는 경우 확산에 의해 약물이 방출되는데, 코팅된 고분자의 두께에 의해 약물방출 경향이 제어되며, 혈관용 약물방출 스텐트인 CYPHERTM이나 TAXUSTM등이 해당된다. 생분해성 고분자를 사용할 경우, 약물이 담지된 고분자의 생분해가 시간이 지남에 따라 발생하며 이에 따라 약물이 용출되게 된다. 여기서 고분자는, Polyurethane(PU), polyethylene, Teflon, polytetrafluoroethylene(PTFE), polycarprolactone(PCL), poly(lactic acid-co-glycolic acid)(PLGA), polyvinylalcohol(PVA) 등과 같은 고분자를 약물을 담지하는 매체로 사용하며, 이는 많은 양의 약물을 스텐트에 코팅할 수 있다.
그러나 지금까지 사용된 대부분의 항암제는 소화기암에 효과가 없는 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin) 등 일반 항암제를 담지한 경우가 대부분이였으며, 이러한 항암제를 단순한 비다공성/다공성 고분자 필름에 담지하여 스텐트에 코팅하였다. 이는 약물의 조절 방출이 어렵고, 단순 고분자 필름은 표면적이 작아서 소화관 내에 발생한 종양에 충분히 밀착시키기가 어려웠던 것이 사실이다. 반면에 나노섬유는 일반 필름에 비하면 표면적이 수천 배 넓기 때문에 종양에 대한 약물 방출 효과가 훨씬 더 클 것으로 기대할 수 있다.
이와 같은 스텐트에 따른 종래기술은 '대한민국특허청 등록특허 제10-1049871호 맥관 스텐트용 실 및 이 실을 이용한 맥관용 스텐트'가 있는데, 종래기술의 경우에는 생분해성 고분자 소재를 사용하여 나노섬유를 제작하고 있으나 고분자 소재가 주로 사슬 형태로 이루어져 있기 때문에 빠른 생분해가 힘들며, 소화기암에 선택적으로 생분해되는 것이 아니기 때문에 암 치료에 특별한 효과를 기대할 수 없다.
이러한 상황들을 고려해 볼 때, 항암제 등의 약물의 항암활성을 그대로 유지하면서 소화기관에서 약물이 일정하게 방출되고, 종양조직에 충분히 밀착하여 약물을 방출할 수 있도록 약물이 담지된 나노섬유를 소화기용 스텐트에 코팅하는 기술의 개발이 필요하다.
따라서 본 발명의 목적은, 히스톤 디아세틸라아제 억제 효과가 있는 보리노스탯을 담지한 나노섬유를 제조하여 담관용 스텐트에 코팅하는 것으로, 인체 내 소화기관 중 하나인 담관 내에서 발생한 담도암에 보다 활용도가 높은 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 생분해성 고분자를 카텝신 B에 의해 분해되는 펩타이드로 다른 고분자와 공유결합하여 블록공중합체로 제조하고, 이를 이용하여 보리노스탯이 담지된 나노섬유로 만들어 담도용 스텐트에 고정한 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적은, 카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드를 이용하여 생분해성 고분자 블록공중합체를 합성하는 단계와; 상기 생분해성 고분자 블록공중합체와 보리노스탯(vorinostat)을 유기용매에 녹여 방사용액을 형성하고, 상기 방사용액을 스텐트본체에 방사 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드를 통해 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 연결하여 형성되는 폴리카프로로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록공중합체인 것이 바람직하다.
상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드의 카르복실산과 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜의 아민기를 공유결합시켜 형성되며, PCL-GFLG-(PEG)n-[(PEG)n-NH-GFLG-PCL]3 구조로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 분자량이 20,000 내지 200,000g/mol로 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 생분해성 고분자 블록공중합체를 합성하는 단계는, 상기 GFLG 펩타이드를 용매의 0.01 내지 30중량%가 되도록 준비하는 단계; 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 0.01 내지 30중량%가 되도록 상기 GFLG 펩타이드와 혼합하여 반응시키는 단계; 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜을 0.01 내지 30중량%가 되도록 상기 용매 내에 첨가하여 반응하여 제1혼합물을 형성하는 단계; 상기 제1혼합물을 동결건조하여 펩타이드가 공유결합된 폴리에틸렌글리콜을 얻는 단계; 폴리카프로락톤, 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드를 0.01 내지 30중량%가 되도록 유기용매에 녹이고, 상기 펩타이드가 공유결합된 폴리에틸렌글리콜을 첨가 및 반응하여 제2혼합물을 형성하는 단계; 상기 제2혼합물을 동결건조하여 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 블록공중합체를 형성하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 방사용액은, 상기 생분해성 고분자 블록중합체 100중량% 기준으로 상기 보리노스탯의 함량이 0.01 내지 20중량% 혼합되며, 상기 방사용액은, 상기 방사용액 전체 100중량% 중 상기 생분해성 고분자 블록중합체 및 상기 보리노스탯이 총 3 내지 60중량% 포함된 것이 바람직하다.
상기한 목적은 또한, 스텐트본체와; 카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드를 이용하여 형성된 생분해성 고분자 블록공중합체와, 보리노스탯(vorinostat)을 방사를 통해 상기 스텐트본체의 표면에 코팅되는 나노섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트에 의해서도 달성된다.
여기서, 상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드를 통해 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 연결하여 형성되는 폴리카프로로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록공중합체인 것이 바람직하다.
상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드의 카르복실산과 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜의 아민기를 공유결합시켜 형성되며, PCL-GFLG-(PEG)n-[(PEG)n-NH-GFLG-PCL]3 구조로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 분자량이 20,000 내지 200,000g/mol로 이루어지는 것이 바람직하다.
상술한 본 발명의 구성에 따르면, 히스톤 디아세틸라아제 억제 효과가 있는 보리노스탯을 담지한 나노섬유를 제조하여 담관용 스텐트에 코팅하는 것으로, 인체 내 소화기관 중 하나인 담관 내에서 발생한 담도암에 보다 활용도가 높은 효과를 얻을 수 있다.
또한, 생분해성 고분자를 카텝신 B에 의해 분해되는 펩타이드로 다른 고분자와 공유결합하여 블록공중합체로 제조하고, 이를 이용하여 보리노스탯이 담지된 나노섬유로 만들어 담도용 스텐트에 고정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 소화관 스텐트 제조방법의 순서도이고,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 4-암 폴린에틸렌 글리콜에 cathepsin B 펩타이드를 공유결합시킨 합성방법을 나타낸 순서도이고,
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 cathepsin B 펩타이드가 공유결합된 4-암 폴린에틸렌 글리콜과 폴리카프롤락톤을 공유결합시켜 블록공중합체를 합성한 방법을 나타낸 순서도이고,
도 4는 본 발명에 의한 나노섬유가 코팅된 스텐트의 전자 현미경 사진이고,
도 5는 본 발명에 의한 도 4에서 제조된 나노섬유가 코팅된 스텐트에서 보리노스탯의 방출속도를 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명에 의한 도 5에서 제조된 나노섬유가 코팅된 스텐트에서 블록공중합체의 분자량 변화를 나타낸 그래프이고,
도 7는 본 발명에 의한 도 5에서 방출된 보리노스탯의 항암 성능을 웨스턴 블롯 방식에 의해 단백질 발현을 나타낸 사진이고,
도 8은 본 발명에 의한 담도암 세포주(HuCC-T1)를 종양 모델로 한 쥐에서 항암성능을 비교한 사진 및 그래프이다.
이하 본 발명의 실시예에 따른 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법을 도면을 통해 상세히 설명한다.
스텐트(stent)에 결합되는 고분자 담지체를 통해 약물방출형 치료용 스텐트를 제작하기 위해서 고분자 담지체의 형상은 두 가지가 가능하다. 첫째, 필름형상이나 나노섬유웹(부직포)형상으로 제작하여 스텐트의 외면에 부착시켜 사용하는 방법이다. 둘째는, 약물이 담지된 고분자 담지체를 방사용액으로 준비하고 이를 직접 스텐트 외면에 방사하여 나노섬유가 직접코팅 되도록 하는 방법이 가능하다. 본 발명의 특징은 보리노스탯이 고분자 나노섬유 담지체를 형성하는 것이 주안점이므로 위에서 열거한 필름형상, 나노섬유웹(부직포)형성 또는 나노섬유 직접코팅 어느 것으로 만드는 것이 가능하다. 그 중 대조 실험을 위하여 필름형상으로 제조하는 것을 실시예로서 설명하기로 한다. 이는 기존 사용되는 스텐트 중 내증식을 억제하기 위하여 약물이 담지되지 않은 폴리카프로락톤(PCL)필름이 스텐트 외면에 부착되어 사용되므로 이와 비교 결과를 나타내기 위하여 동일한 필름형상으로 제작하는 것이다. 이하에서는 필름의 형태로 모든 실시예가 이루어져 있으나, 나노섬유웹 또는 나노섬유 직접코팅도 본 발명의 범주에 속하는 것이다.
기본적으로 본 발명은 소화기암의 일종인 담도암 세포에서 발현되는 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylase)를 특이적으로 억제하여 항암 효과를 발휘할 수 있는 보리노스탯(vorinostat) 방출형 나노섬유가 코팅된 비혈관 스텐트를 개발하는 것이다. 또한 담도암 세포가 분비하는 효소에 의해 효과적으로 분해되는 생분해성 고분자 블록 공중합체를 포함하는 나노섬유를 스텐트에 코팅하여 담도암에 선택적으로 반응하여, 생분해 및 치료에 따른 주변 조직의 괴사 등 부작용이 최소화될 수 있는 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트를 제조하는 것이 목적이다.
본 발명의 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트는, 스텐트본체와, 카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드를 이용하여 형성된 생분해성 고분자 블록공중합체와, 보리노스탯(vorinostat)을 전기 방사를 통해 상기 스텐트의 표면에 코팅되는 나노섬유를 포함한다.
이러한 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트의 제조방법으로는, 보리노스탯이 담지된 나노섬유를 스텐트본체에 코팅하는 방법에 있어서, 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly) 펩타이드를 이용하여 폴리카프로로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록공중합체를 합성하는 단계; 폴리카프로로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록공중합체와 보리노스탯을 유기용매에 녹여 스텐트본체 위에 전기 방사 하는 단계로 나뉜다.
이러한 단계를 상세히 설명하면 도 1에 도시된 바와 같이 먼저, 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신 펩타이드를 이용하여 고분자 블록공중합체를 합성한다(S1).
담도암 세포가 분비하는 효소 중 하나인 카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 펩타이드 구조에 해당하는 펩타이드로는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드가 있는데, 이러한 펩타이드로 각각 다른 두 개의 고분자를 연결하여 생분해성 고분자인 고분자 블록공중합체를 합성한다. 여기서 고분자 블록공중합체는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체가 가장 바람직한데, 이는 펩타이드를 통해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 폴리카프로락톤(PCL)을 연결하여 생분해성 고분자인 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체를 형성한다. S1 단계는 카텝신 B에 의해 폴리에틸렌 글리콜과 폴리카프로로락톤이 분해되면서 약물이 방출되도록 하는데 주안점을 두었다.
폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체는 GFLG 펩타이드의 카르복실산과 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜의 아민기를 공유결합시켜 형성되며, PCL-GFLG-(PEG)n-[(PEG)n-NH-GFLG-PCL]3 구조로 이루어지게 된다. 이러한 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체는 분자량이 20,000 내지 200,000g/mol로 이루어지는 것이 바람직한데, 분자량이 20,000g/mol 미만일 경우 나노섬유를 형성하기 어려우며, 200,000g/mol를 초과할 경우 용매에 녹이기 어렵다는 단점이 있다. 특히 분자량이 본 발명보다 작으면 나노섬유가 형성이 잘 되지 않기 때문에 스텐트본체의 표면에 나노섬유를 코팅하기 어려우며, 분자량이 작은 것은 그 만큼 암(arm) 이 적다는 것을 의미하기 때문에 생분해가 충분히 이루어지지 않을 수 있다. 본 발명과 같이 4-암으로 이루어진 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체를 사용할 경우 카텝신 B와 반응하여 분해되는 GFLG 펩타이드의 양이 많아져 암 치료에 우수한 스텐트가 된다.
폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체를 합성하는 단계는 다음과 같이 이루어진다. 첫 번째 단계는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신 펩타이드를 용매의 0.01 내지 30 중량%가 되도록 준비하는 단계; 디메틸아미노 프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)와 N-하드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 0.01 내지 30 중량%가 되도록 펩타이드 용액과 혼합하여 12시간 동안 반응시키는 단계; 4-암(arm) 폴리에틸렌 글리콜을 0.01 내지 30 중량 %가 되도록 혼합하여 24시간 동안 반응하는 단계; 반응한 혼합물을 투석하여 정제하고 동결건조하여 펩타이드가 공유결합된 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 단계; 폴리카프로락톤과 디메틸아미노 프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)와 N-하드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 0.01 내지 30 중량%가 되도록 유기용매에 녹이고, 동일한 몰농도의 펩타이드가 공유결합된 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 24시간 동안 반응하는 단계; 반응한 혼합물을 투석하여 정제하고 동결건조하여 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 블록공중합체를 얻는 단계;로 이루어진다.
경우에 따라서 고분자 블록공중합체는 폴리카프로락톤 이외에, 폴리락타이드글리콜라이드(Polylactide-co-glycolide), 폴리락타이드카프로락톤(Polylactide-co-caprolactone), 폴리락타이드-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체, 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체, 폴리락티드(Poly(lactide), PLA), 폴리클로코라이드(Poly(glycolide), PGA), 폴리에틸렌 글리콜(Poly(ethylene glycol)), 폴리프로필렌 글리콜(Poly(propylene glycol)), 폴리비닐알코올(poly(vinyl alcohol), PVA), 폴리비닐피롤리돈(poly(vinylpirrolidone), PVP), 덱스트란(dextran), 히아루론산(hyaluronic acid), 풀루란(Pullulan), 셀룰로오스(cellulose), 키토산 (chitosan), 셀룰로오스(cellulose), 베타글루칸(beta-glucan), 후코이단 (Fucoidan)을 단독 또는 복합화(blend)하여 사용할 수 있으나 상기 물질에 한정하는 것은 아니며, 펩타이드를 이용하여 블록공중합체를 합성할 수 있는 물질이면 특별한 제한이 없다.
고분자 블록공중합체와 보리노스탯을 유기용매에 녹여 스텐트본체 위에 전기 방사한다(S2).
고분자 블록공중합체와 보리노스탯을 유리용매에 녹여 서로 혼합시킨 다음, 이를 스텐트본체 위에 전기방사하여 보리노스탯이 방출형 스텐트를 제조한다. 즉 고분자 블록공중합체를 이용하여 보리노스탯을 담지한 나노섬유를 전기 방사를 통해 제조하여 담도용 스텐트본체에 코팅함으로써 스텐트본체에 고정된 나노섬유가 담도암 조직에 최대한 밀착되도록 하고, 보리노스탯이 방출시에 암세포의 생리적인 작용에 반응하여 방출이 조절되도록 함으로써 주변 정상 조직에는 부작용을 최소화하고 항암성능은 최대화 할 수 있는 치료용 스텐트를 개발 할 수 있게 된다.
전기 방사를 통한 나노섬유 제조를 위해서는 고분자 블록공중합체와 보리노스탯을 동일 용매를 사용하여 방사 가능한 농도로 용해하여 방사용액을 준비한다. 방사용액을 이루는 고분자 블록공중합체와 보리노스탯의 함량비에 관하여는 고분자 블록공중합체 전체를 100중량% 기준으로 보리노스탯의 함량이 0.01 내지 20중량%의 범위가 적당하다. 보리노스탯의 비율이 0.01중량% 미만의 경우 보리노스탯의 함량이 낮아 최종 제품의 약효가 발휘하지 못하는 경우가 발생할 수 있으며, 20중량% 초과인 경우에는 보리노스탯의 함량이 너무 많아 최종제품의 가격이나 약효 등의 역효과를 발생할 가능성이 있는 경우가 있다. 또한, 본 발명의 나노섬유의 제조시에는 섬유상 구조를 형성하기 위해 방사용액(고분자 블록공중합체와 보리노스탯이 담지된 혼합용액)의 농도를 3 내지 60중량%로 제조하여 섬유의 모폴러지(morphology)를 제어하는 것이 바람직하다. 이때 방사용액의 농도는 3중량% 미만의 경우 섬유상의 형성이 곤란하며, 60중량% 초과할 경우 점도가 상승하여 방사가 곤란하다.
3 내지 60중량%의 농도로 제조된 방사용액을 정량펌프(metering pump)를 사용하여 방사노즐로 이송하고, 고전압 조절장치를 사용하여 방사노즐에 전압을 인가하여 전기 방사를 실시한다. 이때 사용되는 전압은 0.5 내지 100kV의 범위에서 방사가 가능한 전압으로 실시하며, 집전판은 접지를 하거나 (-)극으로 대전하여 사용할 수 있다. 집전판은 전기전도성 금속이나 박리지 등으로 구성되는 것이 바람직하다. 집전판의 경우 방사시 섬유의 집속을 원활하게 하기 위해 포집장치(suction collector)를 부착하여 사용하는 것이 바람직하며, 방사노즐과 집전 판까지의 거리는 5 내지 50㎝로 조절하여 사용하는 것이 바람직하다. 방사시 토출량은 정량펌프를 사용하여 홀당 0.01 내지 5cc/hole×min으로 토출하여 방사하고, 방사시 온도 및 습도를 조절할 수 있는 챔버 내에서 상대습도 10 내지 90%의 환경에서 방사하는 것이 바람직하다.
회전체에 스텐트본체를 고정할 수 있는 지지층에 스텐트본체를 끼운 후 약물함유 나노섬유를 직접 방사하여 스텐트본체 상에 방사 코팅한다. 이때 나노섬유의 균일성을 확보하기 위해 방사노즐의 간격이 일정하도록 하고, 좌우 반복이동이 가능하며, 회전체의 속도는 나노섬유가 부착하기 용이한 속도로 회전시켜 방사하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 방사방법으로는 전기방사(electro-spinning), 전기분사(electro-spray), 전기분사방사(electro-brown spinning), 원심 전기방사(centrifugal electro-spinning), 플래쉬 전기방사(flash-electrospinning), 버블전기방사(bubble electrospinning), 자장전기방사(magnetic electrospinning) 등의 다양한 방식의 방사법을 적절히 채택하여 사용할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 아래의 실시예들은 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니며, 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 변경될 수 있다.
<실시예 1> 펩타이드와 폴리에틸렌 글리콜의 합성
도 2는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly) 펩타이드의 카르복실산(carboxylic acid)과 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 아민기를 공유결합시킨 방법을 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이 클로린 e6을 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)와 N-하드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 활성화시켜 펩타이드-NHS 결합물을 얻고 폴리에틸렌 글리콜의 아민기에 결합하는 과정을 거쳤다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 펩타이드 200mg을 디메칠술폭사이드 (Dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹이고 여기에 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC) 77mg, N-하드록시숙신이미드 46mg을 첨가하고 약 12시간 동안 교반한 다음, 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm poly(ethylene glycol) 1000mg을 넣고 추가로 24시간 동안 교반한 뒤 증류수에 대하여 2일 동안 투석하고 동결건조하여 분말을 수득하여 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌 글리콜을 얻었다.
<실시예 2> 폴리카프롤락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체 합성
도 3은 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌 글리콜에 폴리카프로락톤을 결합하여 블록공중합체를 얻는 방법을 나타낸 도이다. 좀 더 상세히 설명하면 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌 글리콜 1200mg을 DMSO 50ml에 녹이고 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC) 77mg, N-하드록시숙신이미드 46mg을 첨가하고 약 12시간 동안 교반한 다음, 폴리카프롤락톤(분자량 10,000g/mol) 4000mg을 첨가하고 24시간 동안 교반하여 반응하였다. 반응물을 디에틸에테르에 침전하여 침전물을 얻은 뒤, 실온에서 데시게이터에 넣고 진공 상태에서 약 3일간 건조하여 백색의 분말 상태로 폴리카프롤락톤-폴리에틸렌글리콜 블록공중합체를 얻었다.
<실시예 3> 보리노스탯이 담지된 나노섬유를 스텐트본체에 코팅
고분자 100중량%에 대하여 보리노스탯을 2 내지 10중량%가 되게 한 후 아세톤에 녹여 방사용액을 제조하였다. 이때 고분자와 보리노스탯으로 이루어진 방사용액은 약 15중량%의 용액이 되도록 한다. 방사용액을 사용하여 인가전압 25kV, 방사노즐과 집전체와의 거리 20㎝, 토출량 분당 0.05cc/g/hole이 되도록 30℃, 상대습도 60%에서 전기방사를 실시하여 나노섬유 웹을 얻었다. 이때 방사 용액은 회전체에 고정된 스텐트본체에 직접 방사하여 보리노스탯이 담지된 나노섬유가 형성됨과 동시에 스텐트본체에 코팅을 하여 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 스텐트를 얻었으며, 나노섬유 웹의 주사전자 현미경 사진을 도 4에 나타냈다. 섬유경의 분포는 약 200-600㎚이었고, 평균 섬유경은 약 300㎚인 것이 제조되었다.
<실시예 4> 보리노스탯의 방출실험
실시예 3으로 제조된 나노섬유로부터 보리노스탯의 방출 속도는 인산완충용액(phosphate buffered saline(PBS) solution, 0.01M, pH7.4)에서 실시하였으며, 방출된 보리노스탯의 양은 HPLC를 이용하여 측정하였다.
도 5는 암세포에서 분비되는 카텝신 B가 나노섬유로부터 방출되는 보리노스탯의 방출속도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이 인산완충용액 상에서는 클로린 e6의 방출속도가 느렸으며, 약 3일 동안 30% 미만이 방출되었으나 카텝신B가 있을 경우 3일 동안 60% 이상 방출되었음을 알 수 있었다. 이 결과에서 보는 바와 같이 나노섬유로부터 보리노스텟의 방출은 암세포 특이적인 효소인 카텝신 B에 반응하여 약물이 방출되어 암조직에 효과적으로 전달 시킬 수 있음을 알 수 있다.
도 6은 카텝신 B에 따른 생분해성 고분자 블록중합체의 분자량을 확인한 그래프로, 카텝신 B와 접촉이 이루어지지 않은 블록중합체는 분자량이 유지된 반면 카텝신 B와 접촉이 이루어진 블록중합체는 분자량이 감소하는 것으로 보아 카텝신 B에 의해 블록중합체가 생분해되는 것을 알 수 있다.
도 7은 나노섬유로부터 방출된 보리노스탯의 항암효과를 나타낸 것이다. 나노섬유로부터 방출된 보리노스탯은 기존의 약물과 동일하게 Ac-Histone H4를 발현시키는 것을 알 수 있었고, 또한 동일하게 HDAC1, HDAC2, HDAC3의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이 결과에서 보는 바와 같이 나노섬유에서 방출된 보리노스탯이 효과적으로 암세포에서 특이적으로 발현하는 히스톤 디아세틸라아제(HDAC)의 발현을 억제하고 Histone에 acetylation(Ac-Histone) 시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5> 담도암 세포에 대한 나노섬유 스텐트의 항암성능 측정
실시예 3으로 제조된 보리노스탯이 담지된 나노섬유를 인간 담도암 세포주인 HuCC-T1세포에 대하여 항암 성능을 검증하였다.
도 8은 보리노스탯이 담지된 나노섬유가 인간 담도암 세포주인 HuCC-T1세포에 대한 항암 성능을 실험한 것이다. 누드 쥐에 종양을 심고 약 2-3주 후 종양이 성장하면 종양의 하단에 나노섬유를 심어서 항암 성능을 측정한 것이다. 도에서 보는 바와 같이 비교군에 비하여 보리노스탯을 담지한 나노섬유를 식립한 경우 종양의 크기가 절반 가까이 줄어든 것을 알 수 있었다.
<실시예 6> 보리노스탯이 담지된 나노섬유의 활용
상기와 같이 암세포에 효과가 있는 보리노스탯이 담지된 나노섬유는 보리노스탯 표적형 나노입자형 스텐트 제작도 가능하다. 이러한 스텐트 제작과정을 간략히 설명하기로 한다.
먼저, 본 발명에 의래 제조된 블록공중합체와 보리노스탯을 나노입자 형성이 가능한 농도로 물(H2O), 에탄올, DMAc(dimethyl acetamide), DMF(N,N-dimethylformamide), NMP(N-methyl-2-pyrrolidinone), DMSO(dimethyl sulfoxide), acetone, THF(tetrahydrofuran), chloroform, Methyl chloride 등과 같은 적당한 용매에 용해한다. 이 용액은 제조시에는 나노입자상 구조를 형성하기 위해 용액(고분자와 약물이 담지된 혼합용액)의 농도를 0.1~60중량%로 제조하여 나노입자의 모폴러지(morphology)를 제어하는 것이 바람직하다. 이 용액을 증류수와 같은 수용액에 떨어뜨려 나노입자 용액을 만들고 투석막을 이용하여 투석하여 유기용매를 제거한 다음 스텐트본체 상에 직접 방사하여 스텐트본체의 표면에 나노입자가 코팅되도록 하는것이 가능할 것이다.
또는, 별도의 집전판을 구비하여 나노섬유 웹(부직포 형태)을 먼저 제조하고, 상기 나노섬유 웹 상에 나노입자 용액을 재 방사하여 나노섬유 위에 부착되도록제조할 수 있다. 상기와 달리 나노입자를 이용하여 필름형태의 막으로 제조할 수도 있을 것이다. 이러한 필름형태의 막을 제조하여 스텐트본체의 외면에 접착시킴으로써 약물방출조절형 치료용 스텐트의 제작도 가능할 것이다.
그리고, " 본 연구는 보건복지부 보건의료연구개발사업의 지원에 의하여 이루어진 것임을 밝힙니다. (과제 고유번호 : HI14C2220) "

Claims (11)

  1. 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법에 있어서,
    카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드를 이용하여 생분해성 고분자 블록공중합체를 합성하는 단계와;
    상기 생분해성 고분자 블록공중합체와 보리노스탯(vorinostat)을 유기용매에 녹여 방사용액을 형성하고, 상기 방사용액을 스텐트본체에 방사 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드를 통해 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 연결하여 형성되는 폴리카프로로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록공중합체인 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드의 카르복실산과 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜의 아민기를 공유결합시켜 형성되며,
    PCL-GFLG-(PEG)n-[(PEG)n-NH-GFLG-PCL]3 구조로 이루어지는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 분자량이 20,000 내지 200,000g/mol로 이루어지는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록공중합체를 합성하는 단계는,
    상기 GFLG 펩타이드를 용매의 0.01 내지 30중량%가 되도록 준비하는 단계;
    디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 0.01 내지 30중량%가 되도록 상기 GFLG 펩타이드와 혼합하여 반응시키는 단계;
    4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜을 0.01 내지 30중량%가 되도록 상기 용매 내에 첨가하여 반응하여 제1혼합물을 형성하는 단계;
    상기 제1혼합물을 동결건조하여 펩타이드가 공유결합된 폴리에틸렌글리콜을 얻는 단계;
    폴리카프로락톤, 디메틸아미노프로필-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드를 0.01 내지 30중량%가 되도록 유기용매에 녹이고, 상기 펩타이드가 공유결합된 폴리에틸렌글리콜을 첨가 및 반응하여 제2혼합물을 형성하는 단계;
    상기 제2혼합물을 동결건조하여 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 블록공중합체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 방사용액은, 상기 생분해성 고분자 블록중합체 100중량% 기준으로 상기 보리노스탯의 함량이 0.01 내지 20중량% 혼합된 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 방사용액은, 상기 방사용액 전체 100중량% 중 상기 생분해성 고분자 블록중합체 및 상기 보리노스탯이 총 3 내지 60중량% 포함된 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트 제조방법.
  8. 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트에 있어서,
    스텐트본체와;
    카텝신 B(cathepsin B)에 특이적으로 분해되는 글라이신-페닐알라닌-류신-글라이신(Gly-Phe-Leu-Gly, GFLG) 펩타이드를 이용하여 형성된 생분해성 고분자 블록공중합체와, 보리노스탯(vorinostat)을 방사를 통해 상기 스텐트본체의 표면에 코팅되는 나노섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드를 통해 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 연결하여 형성되는 폴리카프로로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록공중합체인 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 상기 GFLG 펩타이드의 카르복실산과 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜의 아민기를 공유결합시켜 형성되며,
    PCL-GFLG-(PEG)n-[(PEG)n-NH-GFLG-PCL]3 구조로 이루어지는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자 블록 공중합체는, 분자량이 20,000 내지 200,000g/mol로 이루어지는 것을 특징으로 하는 종양 특이적 효소 응답형 나노섬유가 코팅된 보리노스탯 방출형 소화관 스텐트.
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