CN110178793B

CN110178793B - 一种制备转人抑癌基因鸡的方法

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Publication number: CN110178793B
Application number: CN201910402086.3A
Authority: CN
Inventors: 雷雪芹; 徐廷生
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2039-05-15
Also published as: CN110178793A

Abstract

本发明涉及转基因技术领域，具体涉及一种转人抑癌基因鸡的制备方法，主要采用Trizol法从早期结肠癌病人的外周血中提取的总RNA，经RT‑PCR扩增人抗癌基因的编码区；从鸡的肝脏组织提取基因组DNA，经PCR扩增MAR调控序列；扩增产物经限制性内切酶消化，DNA连接酶的连接后，转化入感受态大肠杆菌，构建重组真核表达载体pEGFP‑N1‑人抑癌基因和pEGFP‑N1‑人抑癌基因/MAR；然后通过脂质体介导法体外转染人的HepG2肝癌细胞系，最后结合胚盘显微注射法，将脂质体介导的重组真核表达载体pEGFP‑N1‑人抑癌基因/MAR注射到入孵12‑24h的种蛋X期胚盘不同区域，结合蛋壳膜+蛋清封口后继续孵化，记录每组孵化率，进而通过基因检测、荧光检测及外源蛋白检测转人抑癌基因鸡的外源基因整合情况。

Description

一种制备转人抑癌基因鸡的方法

技术领域：

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种转人抑癌基因鸡以及制备转人抑癌基因鸡的方法。

背景技术：

一直以来，癌症始终是危害人类健康与生命的重大难题，在医学界对癌症的有效治疗方法仍是全球性的难题。传统采用放疗和化疗的治疗方法，带会给患者带来非常多的副作用，同时会出现很多并发症，例如：抑制骨髓功能、红细胞减少、白细胞减少和血小板减少等，每一项都有致命的危险。然而，采用常规的手术治疗却非常容易造成肿瘤细胞的扩散和转移。从治疗方面来看，抑制肿瘤的药物仍然是创新药研究最为活跃的领域，其中以研究肺癌、骨髓瘤、黑色素瘤以及乳腺癌等的肿瘤药物最为热门。随着科学技术的不断发展，对抑癌基因的研究，成为近几年来肿瘤的发生和预防领域的热点研究对象。大量学者都将矛头指向了转基因动物生物反应器的建立，尝试把人抑癌基因转入特定的动物器官，以期外源基因可以遗传表达，从而筛选培育转基因动物，可以从特异的转基因动物器官提取相应的抑癌药物用来治疗癌症和预防癌症。因此，制备转基因动物，提取抑癌物质，用于癌症病人的基因治疗和药物治疗，可大大减轻病人的痛苦，降低治疗成本，提高治愈率。

转基因是指通过基因工程技术把外源基因转入到特定的细胞内，使其与受体细胞染色体基因组结合，并能够稳定的遗传和表达。转基因动物是指将目的外源基因整合到受体基因组中的动物，进而产生新的整合外源目的基因的动物类群。转基因动物的研究中较为活跃的领域就是生产新的转基因产品，通常是通过外源目的基因在特定的器官或组织中的表达，该转基因动物生产系统被称为动物生物反应器。由于禽类具有生长周期短、繁殖能力强、禽蛋蛋白表达效率高、外源蛋白提纯程序简单、生产成本低等优点逐渐作为候选的动物生物反应器；而鸡蛋中的蛋白质结构单一几乎没有脂类等其他成分，蛋白成分单一化对于重组药用蛋白的分离纯化至关重要；SPF鸡品系可以作为转基因禽类的实验对象，因其容易满足制药业的需求，而且鸡蛋中的卵清蛋白的糖基化模式与人类蛋白质的糖基化模式具有很多相似之处。综合上述研究结果表明，与其他动物相比，鸡作为转基因禽类输卵管生物反应器的模式动物生产人类药用蛋白，更加符合实际需求。

但是一直以来制作转基因鸡的效率比较低，因为外源基因在宿主细胞内的整合是随机的，很难精确调控外源基因在宿主基因组中的行为，而且目前人抑癌基因在转基因动物水平的研究较少，并没有系统的制备转人抑癌基因鸡的方法，因此有必要加快对此研究的步伐。

发明内容：

针对目前转人抑癌基因鸡的研究中存在外源基因的整合效率低以及表达不稳定且没有系统的制备转人抑癌基因鸡的方法的缺陷和问题，本发明提供一种转人抑癌基因鸡以及制备转人抑癌基因鸡的方法。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种转人抑癌基因鸡，是将人抑癌基因经过RT-PCR扩增、酶切、连接、转化，采用脂质体包埋法转染含人抑癌基因及MAR调控序列的非病毒重组载体，并采用显微注射法将脂质体介导的重组载体注射到开口种蛋的胚盘中，将种蛋封口后继续孵化从而得到的含人抑癌基因的转基因鸡。

本发明还提供一种制备转人抑癌基因鸡的方法，具体包括以下步骤：

S1、人抑癌基因的克隆以及pEGFP-N1-人抑癌基因载体的构建

（1）采用Trizol法提取早期癌症病人的外周血白细胞总RNA，根据人抑癌基因的编码区设计上下游引物序列，RT-PCR扩增人抑癌基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；

（2）构建含人抑癌基因的扩增质粒：将人抑癌基因与克隆载体经连接酶连接得到连接产物，将连接产物加入感受态细胞进行转化、培养和鉴定，得到含人抑癌基因的重组质粒；

（3）将含人抑癌基因的重组质粒和载体pEGFP-N1分别同时进行双酶切，将双酶切回收后的人抑癌基因与线性化的真核载体pEGFP-N1按照比例连接得到连接产物pEGEP-N1-人抑癌基因；将连接产物pEGEP-N1-人抑癌基因转化感受态细胞，培养，根据上下游引物进行PCR检测、筛选，提取连接产物pEGEP-N1-人抑癌基因，再进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pEGEP-N1-人抑癌基因；

S2、MAR序列克隆及pEGFP-N1-人抑癌基因/MAR载体的构建

（1）从鸡体提取基因组DNA，根据鸡的MAR基因全序列设计扩增引物，经PCR扩增鸡核机制结合区MAR调控序列，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；

（2）将MAR序列与重组载体pEGFP-N1-人抑癌基因分别同时进行双酶切，将双酶切回收后的MAR序列与线性化的真核载体pEGFP-N1-p16按照比例连接得到连接产物，将连接产物转化入感受态细胞，培养，根据鸡的MAR上下游引物进行PCR检测，筛选，提取连接产物pEGEP-N1-人抑癌基因/MAR，再进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pEGEP-N1-人抑癌基因/MAR；

S3、重组真核表达载体的体外转染

（1）去内毒素质粒的提取：参照去内毒素质粒小提试剂盒说明书重新提取所用质粒得到去内毒素的线性化重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR；

（2）人肝癌细胞HepG2的体外培养；

（3）癌细胞的转染：采用脂质体法转染人肝癌细胞HepG2；

（4）转染细胞的Western Blot 检测：提取HepG2的总蛋白并测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳确定目的条带的位置，经过转膜、封闭、抗体孵育以及显色操作观察测定抑癌基因蛋白的蛋白印记；

S4、制备转基因鸡

（1）孵化箱的清洗消毒以及种蛋的灭菌和预孵化处理：对孵化器进行熏蒸消毒，对种蛋蛋壳进行灭菌消毒，将灭菌后的种蛋放入孵化箱内预孵化；

（2）种蛋的开窗：选取孵化12h的种蛋，在种蛋的赤道位置消毒，用砂轮在蛋壳赤道面处研磨，一边研磨一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口，观察鸡胚孵育情况；

（3）种蛋活体胚盘细胞的转染：制备转染液，取出显微注射器，针头灭菌后吸取2 μL的转染液，将转染液注射入种蛋的胚胎细胞中；

（4）种蛋的封口及孵化：将蛋壳膜在蛋清中润洗，然后在开口处覆盖第一层蛋壳膜，再在第一层蛋壳膜上交叉覆盖第二层蛋壳膜将种蛋封口，封口后放入孵化箱继续孵化；

（5）检测：对转基因鸡胚不同组织荧光检测、转基因鸡的外源人抑癌基因检测以及转基因鸡外源蛋白的Western Blot 检测。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，所述人抑癌基因为人抑癌基因p16，人抑癌基因p16的PCR反应总体系为：10×Trans TaqII 2 μL，2.5 mM dNTPs 1.6 μL，GCEnhancer 5 μL，HiFi 0.3 μL，上下游引物各0.7 μL，cDNA 1 μL，最后用dd H₂O补足20 μL。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，步骤S3中所述人肝癌细胞HepG2的体外培养方法为：

a、从液氮中取出HepG2细胞，立即放入37 ℃水浴锅中，30 s后待细胞冻存液完全融化，立即在室温条件下，800 rpm离心3 min，弃去细胞冻存液得到人肝癌细胞HepG2；

b、向人肝癌细胞HepG2中加入5 mL完全培养基，轻轻吹打混匀细胞沉淀并转移至细胞培养瓶中，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中进行培养；所述完全培养基的配制方法为：在89 mL 的DMEM培养基中加入10 mL胎牛血清，1mL双抗，充分混匀，封口膜封口，放于冰箱4℃保存；

c、两天更换一次培养液，待细胞长到整个细胞瓶的80～90%，弃去培养液，加入2～3 mL浓度为0.25%的胰酶消化1 min，轻轻吹打混匀，将混合液全部转移至灭菌15 mL离心管中，800 rpm离心3 min；

d、向细胞沉淀里加入12 ml完全培养基，吹打均匀，转移至12孔板中，每孔1 mL细胞悬液，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中进行细胞贴壁培养12 h，观察细胞形态及密度。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，步骤S3中癌细胞的转染方法为：

a、弃去人肝癌细胞HepG2的12孔板内的培养基，每孔加入1 mL 无血清培养基，放入培养箱继续培养数分钟；所述无血清培养基的配制方法为：在99 mL 的Opti-MEM培养基中加入1mL双抗，充分混匀，封口膜封口，放于冰箱4 ℃保存；

b、配制转染液：A：将1.5 μg的去内毒素质粒加入到100 μL的Opti-MEM培养基中；B：将3 μL的Lipofectamine^TM 2000加入到100 μL 的无菌Opti-MEM中；将A加入B中，轻轻吹打使两者混匀，在室温下放置15 min；

c、将12孔板的细胞分为四组，每组3个重复；分别为：空白对照组、pEGFP-N1质粒组、pEGFP-N1-p16质粒组以及pEGFP-N1-p16/MAR质粒组；

d、将新鲜配置的转染液分别滴加到每孔培养基内，轻轻混匀液体，于37 ℃含有5%CO₂培养箱中继续培养6 h；

e、吸取12孔板每孔内的培养基，每孔加入1 mL完全培养基，每12 h进行荧光显微镜拍照镜检转染效率，及各组细胞的形态变化。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，所述S4中步骤（3）中转染液的制备方法为：将等体积的Lipofectamine^TM2000加入到等体积的去内毒素的线性化重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR中轻轻混合均匀，室温条件下孵育25 min备用。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，所述步骤S4中种蛋的孵化条件为：37.8℃，预孵化12-24h，期间每隔2小时翻蛋一次，翻蛋角度±90°，相对湿度为55%-58%。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，所述步骤S2中鸡体的DNA提取自鸡肝脏组织。

上述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，所述显微注射部位为种蛋X时期胚盘的中心区和暗区。

本发明的有益效果：本发明是将人抑癌基因经过 RT-PCR扩增、酶切、连接、转化，并脂质体包埋法转染含人抑癌基因及MAR调控序列的非病毒载体，结合鸡胚显微注射法种蛋赤道开窗、蛋清和双层壳膜封口法，制备含人抑癌基因的转基因鸡，并摸索出制备转人抑癌基因鸡的方法，该方法适用于不同抑癌基因在鸡体内表达，为人类生产抑癌药用蛋白奠定了基石；在过程中为了提高转基因表达的水平同时降低每组不同转化细胞株之间的表达差异，为降低转入外源基因的沉默，从鸡的肝脏组织扩增处鸡的调控序列MAR，利用MAR序列的生物学特性，利用两端的MAR可以使外源基因独立的形成一个转录环，构建pEGFP-N1-人抑癌基因/MAR载体，将MAR序列连接在特定的外源基因编码区的两侧，使外源基因区域少受周围染色质的影响，使得外源基因能够进行高水平的转录表达。

附图说明：

图1为本发明pEGFP-N1-p16载体的构建流程图；

图2为本发明结肠癌患者外周血p16基因PCR电泳条带；图中泳道M为D2000Mark，泳道1为p16基因；

图3为本发明人抑癌基因p16基因测序结果序列对比图；

图4为扩增质粒pMD19-T-p16的菌液PCR电泳图；泳道M为D2000Mark，泳道1和2为扩增载体pMD19-T-P16的菌液PCR产物；

图5为本发明部分扩增质粒pMD19-T-p16的测序结果图；

图6为转化pEGFP-N1-p16质粒阳性菌液PCR电泳图，泳道M为D2000Mark，泳道1为阴性对照水，泳道2-5为阳性单克隆菌液，泳道 6为阴性单克隆菌液；

图7为重组质粒pEGFP-N1-p16的双酶切电泳图，泳道M为D5000Mark，泳道1为完整的环状pEGFP-N1-P16质粒；泳道2为经Hind III和Kpn I双酶切后的pEGFP-N1-P16质粒；

图8为重组pEGFP-N1-p16质粒中p16基因序列比对图；

图9为重组pEGFP-N1-p16质粒中p16氨基酸序列比对图；

图10为重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR的构建流程图；

图11为鸡肝脏基因组DNA的PCR扩增电泳图；泳道M D2000 Mark；泳道 1为MAR 基因；

图12为鸡肝脏基因组MAR序列测序图；

图13为重组载体pEGFP-N1-p16/MAR的菌液PCR电泳图；泳道M为D2000 Mark，泳道1为p16基因；

图14为重组真核表达载体电泳图；泳道1为完整的环状pEGFP-N1-p16质粒；泳道2为pEGFP-N1-p16/MAR质粒；泳道M为D5000 Mark。

图15为重组pEGFP-N1-p16/MAR载体的部分MAR序列测序图；

图16为空白对照组（阴性对照组）每12h的荧光显微照片，其中上部分为蓝色荧光下的照片，下部分为白光下的照片；

图17为转染质粒pEGFP-N1组（阳性对照组）每12h的荧光显微照片，其中上部分为蓝色荧光下的照片，下部分为白光下的照片；

图18为转染重组质粒pEGFP-N1-p16组每12h的荧光显微照片，其中上部分为蓝色荧光下的照片，下部分为白光下的照片；

图19为转染重组质粒pEGFP-N1-p16/MAR组每12h的荧光显微照片，其中上部分为蓝色荧光下的照片，下部分为白光下的照片；

图20为 HepG2细胞p16蛋白Western Blot结果图；

图21为不同转染组HepG2 细胞p16蛋白相对表达量；

图22为转基因鸡胚心脏组织涂片荧光显微照片，其中左侧为白光下的镜检照片，右侧为蓝色荧光下的镜检照片；

图23为转基因鸡胚肝脏组织涂片荧光显微照片，其中左侧为白光下的镜检照片，右侧为蓝色荧光下的镜检照片；

图24为部分转基因鸡基因组DNA外源p16基因PCR扩增电泳图；

图25为转基因鸡基因组DNA外源p16基因测序比对图；

图26为转基因鸡不同组织外源p16蛋白印迹图；

图27为转基因鸡外源p16蛋白相对表达量；

图28为转基因鸡小动物活体成像荧光检测。

具体实施方式：

研究发现在很多种肿瘤病变中都能检测到p16基因失活，没有抑制癌细胞活性的能力，故又将p16基因成为多肿瘤抑癌基因，而p16基因作为首个可以直接调控机体细胞的生长周期的抑癌基因，用p16制成的治疗药物具有专一性的靶子，较间接作用的p53对细胞周期具有更直接的影响，而且p16基因较p53基因短小，易于操作，便于进行基因治疗，因此本发明以人抑癌基因p16为研究对象来阐述制备转人抑癌基因基因鸡的方法；下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：抑癌基因p16的克隆及pEGFP-N1-p16载体的构建

试验材料：早期结肠癌患者的外周血，采集于洛阳东方医院，并在新鲜外周血内加有柠檬酸钠抗凝剂（ACD），液氮保存备用。

试验方法：pEGFP-N1-p16载体的构建流程图如图1所示。

1.1早期结肠癌患者外周血白细胞的分离

具体分离步骤如下：

1.首先将5 ml白细胞分离液加入无RNA酶的10 ml离心管中；

2.取3 ml新鲜抗凝血或室温解冻的抗凝血，缓慢均匀平铺在步骤1的分离液表面，3000 rpm离心30 min；

3.离心后出现五层，小心吸取淋巴细胞和粒细胞到10 ml无RNA酶的离心管中；

4.加入8 ml的细胞洗涤液于3000 rpm离心5 min，弃去上清液；

5.重复一次步骤4；

6.吸取1 ml细胞洗涤液，吹打均匀白细胞沉淀，转移至无RNA酶的1.5 ml离心管中，3000 rpm离心5 min，弃去上清液；

7.用移液枪吸取200 μL细胞洗涤液，吹打白细胞沉淀至悬液。

1.2人抑癌基因p16基因克隆引物设计与合成

参照GenBank人类抑癌基因p16的cds区域设计上下游引物， PCR扩增引物序列如表1所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 白细胞总RNA的提取：

采用TRIZOL法提取人外周血白细胞总RNA。

1.4 RT-PCR扩增

提取到的RNA立即进行cDNA的合成，反转录总体系为20 μL，在无RNA酶的EP管内加入Mix 4.0 μL，RNA 2.0 μL，最后加入DEPC水补足20 μL；

反转录的反应条件为：37 ℃，30 min；85 ℃，6 s，均为一个循环，反应结束后将cDNA存放于冰箱－20 ℃。

因p16基因序列cds区GC含量高达75%，固在PCR扩增的反应体系中是增加了GCEnhancer试剂，摸索合适的加入量，扩增出预期目的片段，送公司测序后，与NCBI数据库给出的人p16基因序列进行Blast同源性分析。

目的基因p16的PCR反应总体系为20 μL：10×Trans TaqII 2 μL，2.5 mM dNTPs1.6 μL，GC Enhancer 5 μL，HiFi 0.3 μL，上下游引物各0.7 μL，cDNA 1 μL，最后用dd H₂O补足20 μL。具体反应条件如表2所示。

结果：通过提取早期结肠癌患者外周血白细胞的总RNA，RT-PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统观察在421bp处出现一条单一条带（见图2），与预期目的条带大小一致；经该PCR产物的测序鉴定结果与NCBI上人p16基因序列比对，同源性99%（见图3）。这说明从早期结肠癌患者人外周血中成功扩增出人抑癌基因p16。

1.5感受态细胞的制备

大肠杆菌DH5α非感受态细胞，感受态细胞的制备及转化的具体方法参照感受态细胞制备试剂盒说明书并稍作改进。制备完成的大肠杆菌DH5α感受态细胞，于液氮中保存备用。在连接目的基因与T载体之前，先验证感受态细胞的转化效率。用1 μL pEGFP-N1质粒（实验室留存）转化100 μL新制备的DH5α感受态细胞，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴5min，1500 g离心1min，弃上清，剩余100 μL菌液轻轻混匀，均匀涂布于37 ℃预热的含有Kan的LB固体培养基，放入37 ℃恒温培养箱正置1 h，倒置过夜培养12～16 h，观察并计录单菌落数量，大致计算转化效率，确保自制的感受态细胞可以成功转化外源质粒。

1.6 扩增质粒pMD19-T-p16的构建

将测序正确的p16基因PCR产物通过凝胶回收试剂盒纯化回收，利用超微量测定仪检侧回收产物浓度及OD值。

连接：参照T4连接试剂盒说明书配置连接体系。将质量合格的p16基因与克隆载体pMD19-T经T4连接酶16 ℃过夜连接，65 ℃灭活10 min，－20 ℃保存备用。

转化：取5 μL连接产物加入100 μL刚刚解冻的感受态细胞，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴5 min，1500 g离心1min，弃上清，剩余100 μL转化菌液轻轻混匀，将100 μL转化后的菌液均匀涂布含有AMP、X-GAL、IPTG的固体LB培养基，37 ℃过夜培养。用灭菌枪头挑取转化后形成的白色单菌落，于1 ml 含有Amp的液体LB培养基，37 ℃，120 rpm摇床震荡培养6 h，4 ℃保存备用。取1 μL该菌液为模板做菌液PCR鉴定阳性菌落，菌液PCR扩增体系与条件，同上p16基因扩增体系与条件。选取PCR阳性的菌液，用接种环挑取菌液，分区划线于新的含有AMP的固体LB培养基，37 ℃过夜培养12～16h。挑取单菌落于含有相应抗生素的4ml液体LB，37 ℃，120 rpm摇床培养12 h。经菌液PCR鉴定阳性的菌液，参照质粒小提试剂盒（北京全式金）说明书提取质粒，送公司测序鉴定。

保菌：检测阳性的菌液，重新在含AMP的LB固体培养基上过夜培养，挑取单个菌落，摇菌，加入终浓度50%的灭菌甘油，封口膜封口，于～80 ℃冰箱保存菌种，以备后用。

结果：经菌液PCR鉴定阳性菌落，通过2 %的琼脂糖凝胶电泳观察条带与预期条带大小一致，如图4所示：M泳道为D2000 Mark；1、2泳道为扩增载体pMD19-T-P16的菌液PCR产物电泳结果，与预期结果相符。

PCR阳性菌液的测序结果如下：

AAGCTTATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCCGCCACTCTCACCCGACCCGTGCACGACGCTGCCCGGGAGGGCTTCCTGGACACGCTGGTGGTGCTGCACCGGGCCGGGGCGCGGCTGGACGTGCGCGATGCCTGGGGCCGTCTGCCCGTGGACCTGGCTGGGTACC（SEQ ID NO.3）。下划线对应的序列分别是酶切位点Hind III、Kpn I，与NCBI上人p16基因序列（登录号：NM_{_}058195.3）比对同源性100%（见图5），并且包含了p16基因的全部cds区。

1.7重组质粒pEGFP-N1-p16的构建

酶切：将测序后经Blast比对结果正确的pMD19-T-p16载体与pEGFP-N1载体分别同时进行Hind III和Kpn I的双酶切，双酶切体系总共50 μL，如表3所示。于37 ℃水浴消化1h，80 ℃灭活20 min，－20 ℃保存备用。

连接：参照T4连接试剂盒说明书配置连接体系。将双酶切回收后的p16基因与线性化的真核载体pEGFP-N1按照浓度比3:1的比例，4 ℃过夜连接，65 ℃灭活10 min，－20 ℃保存备用。

转化：取5 μL上述连接产物加入100 μL刚刚解冻的感受态细胞，冰浴30 min，42℃热激90 s，冰浴5 min，1500 g离心1min，弃上清，剩余100 μL菌液轻轻混匀，将100 μL转化菌液涂布在含有KAN的固体LB培养基上，37℃过夜培养12～16h。用灭菌枪头挑取转化后形成的白色单菌落，于1 ml 含有KNA的液体LB培养基，37 ℃，120 rpm摇床震荡培养6 h，4℃保存备用。首先经菌液PCR鉴定阳性后，提取质粒再经Hind III和Kpn I双酶切鉴定，最后送公司测序鉴定。

保菌：经鉴定阳性的菌液，重新在含KNA的LB固体培养基上过夜培养，挑取单个菌落，摇菌，加入终浓度50%的灭菌甘油，封口膜封口，于－80 ℃冰箱保存菌种，以备后用。

结果：成功转化pEGFP-N1-P16载体的的单克隆菌液，进行PCR鉴定阳性，结果如图6所示：泳道1为阴性对照水，泳道2-5为阳性单克隆菌液，成功扩增出421bp目的条带，泳道6为阴性单克隆菌液，无目的条带；泳道M为D2000 Mark。

取阳性单克隆菌液纯化菌种后，提取质粒进行双酶切鉴定如图7所示：1泳道为完整的环状pEGFP-N1-P16质粒；2泳道为pEGFP-N1-P16质粒经Hind III和Kpn I双酶切后出现两条带，一条在4.7 Kb左右，另一条在410bp，与预期结果相符；M泳道为D5000 Mark。重组真核表达载体pEGFP-N1-P16的测序结果（见图8）与NCBI上公布的人p16基因序列（登录号：NM_{_}058195.3）比对，同源性100%，表达蛋白的同源性也是100%（见图9）。

实施例2：MAR序列克隆及pEGFP-N1-p16/MAR载体的构建

试验材料：河南科技大学牧场养殖的海蓝褐壳蛋鸡

试验方法：重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR的构建流程图如图10所示。

2.1 鸡肝脏组织中基因组DNA的提取

鸡肝脏组织中基因组DNA的提取按照上海生物工程动物基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

2.2 鸡核机制结合区MAR调控序列的克隆

使用Primer 5.0软件设计MAR序列的上下游引物，根据NCBI数据库上给出的已知鸡的MAR基因全序列（GeneBank：M58748.1 GI:211883）设计要扩增的PCR引物，设计好的引物序列由上海生物工程有限公司合成，引物序列如表4所示，扩增出来的预期目的条带大小为1044 bp。

MAR基因的PCR反应总体系为20 μL：10×Trans TaqII 2 μL，2.5 mM dNTPs 1.6 μL，HiFi 0.3 μL，上下游引物各0.7 μL，cDNA 1 μL，最后用ddH₂O补足20 μL。具体反应条件如表5所示。

2.3 MAR序列的纯化回收

将步骤2.2中的PCR 扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，将与目的DNA条带预期大小一致的条带切胶回收。DNA纯化回收的具体步骤参照按照索莱宝SanPrep柱式DNA回收试剂盒操作说明书。

结果：从新鲜鸡肝脏组织中提取基因组DNA，利用设计的MAR引物进行PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到特异性条带（见图11），与预期的目的条带大小一致1044 bp，经上海生物工程公司测序鉴定，与NCBI已公布的鸡的MAR序列（Gene Bank：M58748.1）进行DNA序列比对，同源性98%（见图12）。

2.4 重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR的构建

酶切：将测序后经Blast比对结果正确的MAR序列与重组pEGFP-N1-p16载体分别同时进行Not I和Xba I的双酶切，双酶切体系总共50 μL，如表6所示。于37 ℃水浴消化1 h30 min，65 ℃灭活20 min，－20 ℃保存备用。

连接：参照T4连接试剂盒说明书配置连接体系。将双酶切回收后的MAR序列与线性化的真核载体pEGFP-N1-p16按照浓度比3:2的比例，4 ℃过夜连接，65 ℃灭活10 min，－20℃保存备用。

转化：取5 μL上述连接产物加入100 μL刚刚解冻的Trans 110感受态细胞，冰浴30min，42 ℃热激90 s，冰浴5 min，1500 g离心1min，弃上清，剩余100 μL菌液轻轻混匀，将100 μL转化菌液涂布在含有KAN的固体LB培养基上，37℃过夜培养12～16h。用灭菌枪头挑取转化后形成的白色单菌落，于1 ml 含有KNA的液体LB培养基，37 ℃，120 rpm摇床震荡培养6 h，4 ℃保存备用。首先经菌液PCR鉴定阳性后，提取质粒后，送上海生工公司经通用引物测序鉴定。

成功转化pEGFP-N1-p16/MAR载体的的单克隆菌液，进行PCR阳性鉴定。以转化pEGFP-N1-p16/MAR质粒的单克隆菌液为模板，分别以p16引物、MAR引物扩增目的条带，阳性菌液扩增结果如图13所示：泳道1为p16基因，成功扩增出单一条带421bp；泳道2为MAR序列阳性条带1044 bp，与预期结果相符；泳道M为D2000 Mark。后经测序鉴定，与人p16基因（登录号：NM_{_}058195.3）同源性为100%，与鸡的MAR序列（Gene Bank：M58748.1）同源性为98%。

取阳性单克隆菌液纯化菌种后，提取质粒，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，如图14所示：泳道1为完整的环状pEGFP-N1-p16质粒；泳道2为pEGFP-N1-p16/MAR质粒；泳道M为D5000 Mark。

重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR的测序结果与NCBI上公布的人p16基因（登录号：NM_{_}058195.3）同源性为100%，与鸡的MAR序列（Gene Bank：M58748.1）同源性为98%（见图15）。经通用引物双向测序及拼接，得出连接在重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR上的全部MAR序列如下：

GCGGCCGCCACTGTAGCCCTTGCACCCTCACCACAGCACAGCACCTCACGTTCAGGCCCCAGCACGTCAAGATGGAGCCCTGTGCCCCCAGACAGCCAGCATGGAACCATCAAATCCTTAGAGTTGGAAGATGTCTGAATCCTTGTGCCCCCAATTCAGCCCGGCACCTCTCACACCCCACTCAACACTCCCTCTTCAGCCAAGAGCCTACAGCTCAACCCAGCACCTCACGCCACCCAGCAGCACTCCCGCCATCAGCCCAGTGCCCCCAGTCCGGATCGGTACCTCTCATGCCCATGCACAGTGCACCAGATCAGCCTGGCACCACTAGTTCATTCCAGCACCTCACGTGCCCACAGCCAACACACTCCAGCACCCCCGGTGCCCCTGGCACCTCACACCTCTCCGCTGCCTCAAGGTTCATTCCCCCCTCTTCCCACATCCCCTCACACCCCCTCATTATTTTCATGTCTCGCAATCTCCTTTGGTCACTTGGAGTCATTCAGTTATGACAACTCCAGAACTAGAAGCTGCTGGCCAGCAGCAAGTGCCACAAACTGTGTTCCCCTGGCAGCTCTTCTGGCTCATTTGTCTTATTGTGTGTCCAGCTGAGATCAGAAAGCTATCGGCAATTATGTCAGAGGATGGCCCAGGTTTTTCACATAGGTTTGTCTGTATTTGATAGCAATATTTAGATATTTGGATGCTCCGAGATATCCCCACTCTGGATTTTTCTCTGCAAGATTCTTCCCTTGGACTTCAGGCAGAGAAGGGGACTGAAAGGGAGATGAGCACCCGCAGTGAGGGCTTAATCTGCACGGCCATTCTCTGCCAGGCAGGTGATAACAACTGAAGCAAGAGAAGCTGTCATTGAGGGGAGAGAGTTGTTGGTGAGCGATTAAAGAGCAGTCACATTATCACAGCAGAGCATTCATCATGGCCCAGTGCTGGGCAGCTACGTTAGAATTGCCCAGTGTGTCTGCTTCCAAGCATAACTATGCATTCTTCAATTAAAAAACTGCAGGCATGTTTGCCATTTCCAGCTCTAGA（SEQ IDNO.6），（下划线分别表示酶切位点Not I和 Xba I）。

实施例3：重组真核表达载体的体外转染

试验材料：河南科技大学遗传与繁育实验室提供的人肝癌细胞系HepG2。

3.1 去内毒素质粒的提取

含有内毒素的质粒本身对细胞的生长就存在一定的毒性，所以在转染细胞之前，要先将所用的质粒做去内毒素处理。按照全式金去内毒素质粒小提试剂盒的说明书步骤重新提取所用质粒。

3.2 人肝癌细胞HepG2的体外培养

（1）配制完全培养基：在89 mL 的DMEM培养基中加入10 mL胎牛血清，1mL双抗，充分混匀，封口膜封口，放于冰箱4℃保存备用；

（2）从液氮中取出HepG2细胞，立即放入37 ℃水浴锅中，30 s后待细胞冻存液完全融化，立即室温800 rpm，离心3 min，弃去细胞冻存液；

（3）向HepG2细胞中加入5 mL完全培养基，轻轻吹打混匀细胞沉淀并转移至细胞培养瓶中，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中进行培养；

（4）两天更换一次培养液，待细胞长到整个细胞瓶的80～90%，弃去培养液，加入2～3 mL浓度为0.25%的胰酶消化1 min，轻轻吹打混匀，将混合液全部转移至灭菌15 mL离心管中，800 rpm，离心3 min；

（5）向细胞沉淀里加入12 ml完全培养基，吹打均匀，转移至12孔板中，每孔1 mL细胞悬液，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中进行细胞贴壁培养12 h，观察细胞形态及密度，可进行转染试验。

3.3 癌细胞的转染

（1）配制无血清培养基：在99 mL 的Opti-MEM培养基中加入1mL双抗，充分混匀，封口膜封口，放于冰箱4 ℃保存备用；

（2）弃去步骤3.2中12孔板内的培养基，每孔加入1 mL 无血清培养基，放入培养箱继续培养数分钟；

（3）配制转染液：A：将1.5 μg的去内毒素质粒加入到100 μL的Opti-MEM培养基中；B：将3 μL的Lipofectamine^TM 2000加入到100 μL 的无菌Opti-MEM中；将A加入B中，轻轻吹打使两者混匀，在室温下放置15 min；

（4）将12孔板的细胞分为四组，每组3个重复；分别为：空白对照组、pEGFP-N1质粒组、pEGFP-N1-p16质粒组以及pEGFP-N1-p16/MAR质粒组；

（5）将新鲜配置的转染液分别滴加到每孔培养基内，轻轻混匀液体，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中继续培养6 h；

（6）吸取孔内所以培养基，每孔加入1 mL完全培养基，每12 h进行荧光显微镜拍照镜检转染效率，及各组细胞的形态变化。

荧光镜检照片显示，在相同转染时间下，转染重组质粒pEGFP-N1-p16试验组结果（见图18）和转染重组质粒pEGFP-N1-p16/MAR组图（见图19），均在绿色荧光显微镜下检测到绿色荧光；与空白对照组（阴性对照组）结果（见图16）和转染质粒pEGFP-N1组（阳性对照组）结果（见图17）相比，表明重组表达载体pEGFP-N1-p16和pEGFP-N1-p16/MAR可以在真核细胞成功表达绿色荧光。

3.4 转染细胞的Western Blot检测

3.4.1总蛋白的提取：用12孔板培养HepG2细胞，分为4组，每组3个重复；4组细胞分别为空白对照组、转染pEGFP-N1质粒组、转染pEGFP-N1-p16质粒组以及转染pEGFP-N1-p16/MAR质粒组。具体步骤如下：

（1）将上述细胞培养48h后，弃去细胞培养液，用冰浴并灭菌的PBS缓冲液缓慢冲洗细胞2～3次，将12孔板倒置，弃尽液体；

（2）在12孔板每孔加入100 μL含有1 μL PMSF的强PIPA裂解液，用细胞刷充分刮取细胞，震荡裂解30 min此操作需在低温环境中进行或于冰上裂解；

（3）在显微镜下观察细胞裂解完全后，吸取全部液体与1.5 mL的灭菌离心管中，放于4℃离心机，12000 g离心15 min；

（4）吸取上清液，存放于-80℃冰箱备用，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定蛋白浓度；

制备SDS-PAGE凝胶，根据每组蛋白的浓度来确定上样量，上样前与蛋白电泳上样液等比例混合，沸水煮10 min，待蛋白样品冷却至室温，于3000 rpm离心1 min，取上清液放于冰箱-20℃保存备用。将处理过的蛋白样品加入凝固的SDS-PAGE凝胶加样孔，并加入相应的蛋白Mark，以确定目的条带的位置。最初以80 V电压，跑40 min左右，换至120 V电压，电泳至蛋白Mark中与目的条带大小的带能清晰与其他条带分开，结束电泳。

3.4.2 转膜：将PVDF膜用甲醛浸泡，并裁剪成合适的大小；去除多余的凝胶，裁剪六层相同大小的滤纸，于转膜缓冲液中浸泡；采用湿转法，于120V恒压，转膜90 min。转膜过程中除尽三明治结构中的每一层的气泡，同时是滤纸的大小稍大于膜，膜的大小稍大于胶，防止烧坏电极。

3.4.3 封闭：将转膜后的PVDF膜用蒸馏水冲洗干净，立即转入5%的脱脂牛奶中进行封闭，室温摇床回旋震荡12h。

3.4.4 抗体孵育：用TBST清洗封闭后PVDF膜，每次5 min，清洗3次；随后放入稀释2500倍的兔抗人p16-INK4a抗体，于4℃过夜孵育；再次用TBST清洗一抗孵育后的PVDF膜，5～6次，每次6 min；用稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔做为二抗，4℃孵育2h。

3.4.5 显色：经二抗孵育后的PVDF 膜，根据超敏型辣根过氧化氢酶DAB显色试剂盒的说明书进行显色操作，并依据实际情况稍作改进，具体操作步骤如下：

（1）工作液的配置：在5 mL反应液中分别加入100 μL的溶液A、500 μL的溶液B和10μL的溶液C，避光保存，充分混匀；

（2）将PVDF膜转移至暗盒，平铺上述工作液到该PVDF膜上，于室温反应5 min左右，肉眼可观察显色条带；

（3）吸去上述工作液，用超纯水对显色后的PVDF膜清进行反复冲洗，通过凝胶成像系统拍照记录显色结果，进行灰度分析；通过SPSS 20.0软件进行统计分析。

结合凝胶成像系统拍摄结果（见图20），以及不同转染组HepG2 细胞p16蛋白相对表达量（见图21）（其中p16蛋白相对表达量：蛋白条带灰度值与向应内参条带灰度值的比值，经SPAA软件单因素方差分析，绘制不同转染组HepG2 细胞p16蛋白相对表达量统计图）；结果表明：转染pEGFP-N1-p16质粒组和pEGFP-N1-p16/MAR质粒组的HepG2细胞p16蛋白相对表达量显著高于空白对照组和pEGFP-N1质粒组（P＜0.05）；其中空白对照组和pEGFP-N1质粒组细胞p16蛋白相对表达量差异不显著；转染pEGFP-N1-p16质粒组与转染pEGFP-N1-p16/MAR质粒组的HepG2细胞相比p16蛋白相对表达量差异不显著。

实施例4：转基因鸡的制备

试验材料：新鲜海兰白受精种蛋，购自于洛阳公华禽业公司。

4.1 孵化环境的预处理

种蛋在进入孵化箱孵化之前，要对孵化箱进行清洗和熏蒸消毒。首先用清水将孵化箱里外都清洗一遍，晾干，再用75%的酒精由内而外擦拭一遍，然后打开孵化箱的开关，调试温度、湿度以及风机是否正常运转。等一切程序都正常运转后，关闭电源和通风口，按照每立方米7 g高锰酸钾固体粉末，加入14 mL福尔马林溶液的比例加入到已初步清洁过的孵化箱内。期间一定要带好口罩和手套，加入福尔马林后会产生大量刺鼻浓烟，立即关闭孵化箱，过夜消毒。消毒时的孵化器温度要求在22～32 ℃，保持湿度在75%以上。

4.2 种蛋的灭菌

刚购买来的新鲜受精种蛋表面一般都会残留有鸡粪及大量微生物，所以在入孵前要先对种蛋进行消毒。取1000 ml的灭菌双蒸水，水温控制在37 ℃左右，加入10 ml新洁尔灭溶液。首先将新鲜种蛋表面的粪污用清水清洗干净，再将种蛋放入配置的新洁尔灭水溶液中浸泡3～5 min，拿出晾干后放入消过毒并预热的孵化箱内进行孵化。孵化条件为：37.8℃，每隔2小时翻蛋一次，翻蛋角度±90°，相对湿度为55%左右。

4.3 种蛋的开窗与封口

在使用无菌操作台之前，首先对其进行75%的酒精消毒和紫外灯照射杀菌，所用器具在使用之前也要用酒精擦拭及紫外灭菌灭菌。在无菌操作台内点起酒精灯，选取孵化12h的种蛋，先用75%酒精擦拭将要开口的蛋壳部位进行消毒，开口方式为种蛋赤道面开口，使用特制的蛋壳开口器，打开大小为直径约0.5 cm的圆形窗口，小心撕开蛋壳膜，水平放置2min，等待鸡胚上浮。全程一定保持严格无菌状态。注射后的开口种蛋，轻轻平放，用酒精棉球慢慢擦拭种蛋开口周围，用两层新鲜的蛋壳膜加蛋清封闭窗口，晾干，重新放入孵化箱孵化至出壳。

4.4种蛋活体胚盘细胞的转染

配制转染液：将等体积 Lipofectamine^TM2000加入到等体积的去内毒素的线性化重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR中轻轻混合均匀，室温条件下孵育25 min备用，具体所需转染液体积根据试验需求配置。

取出显微注射器，针头在酒精灯火焰上灭菌，放置室温后，吸取2 μL的上述转染液，对准开口种蛋的胚胎，针头倾斜45 ℃，轻轻插入并注射2 μL的转染液于胚胎细胞，随后封闭开口种蛋，重新入孵。

4.5 种蛋的孵化

三组种蛋孵化条件一致，每隔2小时翻蛋一次，每次翻蛋角度±90°，前18天的基础孵化温度为37.8 ℃，相对湿度控制在55%左右；孵化18 d后落盘，孵化温度37.5 ℃，相对湿度70%，记录各组的孵化率。孵化过程中定时记录鸡胚的死亡个数与死亡天数。将共120枚新鲜受精种蛋，平均分成三组，每组40枚。对照组种蛋只开窗封口不注射；暗区组的种蛋开窗后将转染液显微注射鸡胚盘的暗区；中心组的种蛋是将转染液显微注射鸡胚盘的中心区；孵化结果如表7所示；

由表7可知，对照组的孵化率（87.5%）显著高于暗区组和中心组孵化率（P<0.05）；暗区组种蛋的孵化率（47.5%）显著高于中心组的孵化率（15.0%）（P<0.05）。

4.6 转基因鸡胚不同组织荧光检测

由于种蛋开口注射会对种蛋的孵化造成一定的影响，孵化过程的死亡率会高于正常孵化种蛋。在转基因种蛋的孵化期间要定时照蛋，观察鸡胚孵化情况并及时取出死胚蛋。取出发育不同阶段的鸡胚各组织，制作组织涂片，在荧光显微镜下检测死亡鸡胚各组织是否表达绿色荧光蛋白，保存图片；结果发现：转基因鸡胚心脏组织涂片（见图22）和肝脏组织涂片（见图23）有不同程度的绿色荧光的表达，其中左侧图为白光下的镜检照片，右侧为蓝色荧光下的镜检结果。

4.7 转基因鸡的外源p16基因检测

提取转基因鸡组织基因组DNA，利用PCR扩增技术检测转基因鸡基因组DNA是否整合了人抑癌基因p16。为了排除鸡自身p16基因序列对外源p16基因检测的影响，在人抑癌基因p16序列与鸡p16基因序列的非同源区重新设计一对p16引物p16-0，引物序列见表8，用以扩增特异性的人p16基因片段。

非同源区p16基因PCR反应总体系为20 μL：10×Trans TaqII 2 μL，2.5 mM dNTPs1.6 μL，HiFi 0.3 μL，GC Enhancer 5μL；上下游引物各0.7 μL，cDNA 1 μL，最后用dd H₂O补足20 μL。具体反应条件如表9所示。

选取孵化天数大于或等于7 d的死胚组织和成功孵化出壳的小鸡鸡冠组织，提取其基因组DNA，利用非同源区p16-0引物扩增目的基因，检测转基因鸡是否整合外源p16基因。部分转基因鸡基因组DNA基因检测结果见图24，由图可知，与非转基因鸡（Normal）相比其中G049、G055、G061、G092号转基因鸡扩增出大小157 bp的特异性条带，该条带与阳性质粒pEGFP-N1-p16/MAR扩增出的目的条带大小一致，与预期结果相符。纯化回收以转基因鸡DNA为模板扩增出的157 bp的条带，送上海生工测序鉴定，结果见图25，结果显示与人的p16基因同源性为99%。

4.8 转基因鸡外源蛋白的Western Blot检测

解剖发育至14d死亡转基因鸡胚，分别提取转基因雏鸡的肌肉组织、心脏组织及肝脏组织的总蛋白，选择的内参基因为β-actin，经SDS-PAGE电泳、转膜、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色后，在凝胶成像系统拍照，蛋白印记检测结果如图26所示，不同部位外源p16蛋白相对表达量结果如图27所示。

由图可知：分别在肌肉、心脏和肝脏组织中都检测到外源p16蛋白的表达。其中心脏和肝脏的表达量高于肌肉的表达量；外源p16蛋白的检出部位与转基因鸡胚涂片的荧光检测部位相符，心脏和肝脏。

4.9 转基因鸡活体成像检测以及转基因鸡胚外源基因检测

成功孵化的雏鸡，转基因鸡与非转基因鸡需分开饲养，保持饲养环境的清洁。取5日龄小鸡于小动物活体成像系统检测其活体表达荧光情况。首先经Xenogen IVIS活体成像系统对每只鸡分别进行荧光信号的采集，最后扣除对照组非转基因鸡的自身荧光，对比试验组转基因鸡自身发出的荧光，结果见图28，图中A为非转基因鸡，B、C、D为转人抑癌基因p16基因鸡。由图28可以看出三只转基因鸡均在胸部有较强的荧光发出，与外源p16蛋白的检出部位相同，均为心脏和肝脏。

结合表7可知，在除去对照组之外的80枚转基因种蛋中，孵化过程中死胚总共55只，孵化出壳25只；经检测发现，在55只死胚组织中检测出外源p16基因的有15只，外源基因检出率27.27%；其中有2只在心脏和肝脏组织检测到绿色荧光的表达；分别在2只发育14 d的转基因鸡胚的肌肉、心脏及肝脏组织经检测到有外源p16蛋白的表达；在孵化出壳的25只转基因小鸡中有3只在胸部有较强荧光的表达。

综合上述研究结果总结得出：（1）重组真核表达载体pEGFP-N1-p16和pEGFP-N1-p16/MAR可以表达有活性的p16蛋白；（2）通过对比分析孵化率，得出显微注射鸡胚盘X期不同部位存在统计学差异；（3）利用脂质体转染重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR，采用胚盘显微注射法，可以制备能够表达外源p16蛋白的转基因鸡，为转基因鸡输卵管生物反应器的建立奠定基础。

序列表

<110> 河南科技大学

<120> 一种转人抑癌基因鸡以及制备转人抑癌基因鸡的方法

<141> 2019-05-15

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 9

gccggaagct tatggtgcgc aggttcttgg t 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 10

ctaatggtac ccagccaggt ccacgggcag a 31

<210> 11

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 11

aagcttatgg tgcgcaggtt cttggtgacc ctccggattc ggcgcgcgtg cggcccgccg 60

cgagtgaggg ttttcgtggt tcacatcccg cggctcacgg gggagtgggc agcgccaggg 120

gcgcccgccg ctgtggccct cgtgctgatg ctactgagga gccagcgtct agggcagcag 180

ccgcttccta gaagaccagg tcatgatgat gggcagcgcc cgagtggcgg agctgctgct 240

gctccacggc gcggagccca actgcgccga ccccgccact ctcacccgac ccgtgcacga 300

cgctgcccgg gagggcttcc tggacacgct ggtggtgctg caccgggccg gggcgcggct 360

ggacgtgcgc gatgcctggg gccgtctgcc cgtggacctg gctgggtacc 410

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 12

tttagcggcc gccactgtag ccctta 26

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 13

catcttctag agctggaaat ggcaaac 27

<210> 14

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 14

gcggccgcca ctgtagccct tgcaccctca ccacagcaca gcacctcacg ttcaggcccc 60

agcacgtcaa gatggagccc tgtgccccca gacagccagc atggaaccat caaatcctta 120

gagttggaag atgtctgaat ccttgtgccc ccaattcagc ccggcacctc tcacacccca 180

ctcaacactc cctcttcagc caagagccta cagctcaacc cagcacctca cgccacccag 240

cagcactccc gccatcagcc cagtgccccc agtccggatc ggtacctctc atgcccatgc 300

acagtgcacc agatcagcct ggcaccacta gttcattcca gcacctcacg tgcccacagc 360

caacacactc cagcaccccc ggtgcccctg gcacctcaca cctctccgct gcctcaaggt 420

tcattccccc ctcttcccac atcccctcac accccctcat tattttcatg tctcgcaatc 480

tcctttggtc acttggagtc attcagttat gacaactcca gaactagaag ctgctggcca 540

gcagcaagtg ccacaaactg tgttcccctg gcagctcttc tggctcattt gtcttattgt 600

gtgtccagct gagatcagaa agctatcggc aattatgtca gaggatggcc caggtttttc 660

acataggttt gtctgtattt gatagcaata tttagatatt tggatgctcc gagatatccc 720

cactctggat ttttctctgc aagattcttc ccttggactt caggcagaga aggggactga 780

aagggagatg agcacccgca gtgagggctt aatctgcacg gccattctct gccaggcagg 840

tgataacaac tgaagcaaga gaagctgtca ttgaggggag agagttgttg gtgagcgatt 900

aaagagcagt cacattatca cagcagagca ttcatcatgg cccagtgctg ggcagctacg 960

ttagaattgc ccagtgtgtc tgcttccaag cataactatg cattcttcaa ttaaaaaact 1020

gcaggcatgt ttgccatttc cagctctaga 1050

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 15

ggttcttggt gaccctccg 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificially synthesized)

<400> 16

cctagacgct ggctcctca 19

Claims

1.一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S1、人抑癌基因的克隆以及pEGFP-N1-人抑癌基因载体的构建

S2、MAR序列克隆及pEGFP-N1-人抑癌基因/MAR载体的构建

S3、重组真核表达载体的体外转染

（2）人肝癌细胞HepG2的体外培养；

（3）癌细胞的转染：采用脂质体法转染人肝癌细胞HepG2；

S4、制备转基因鸡

2.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：所述人抑癌基因为人抑癌基因p16，人抑癌基因p16的PCR反应总体系为：10×Trans TaqII 2 μL，2.5 mMdNTPs 1.6 μL，GC Enhancer 5 μL，HiFi 0.3 μL，上下游引物各0.7 μL，cDNA 1 μL，最后用dd H₂O补足20 μL。

3.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：步骤S3中所述人肝癌细胞HepG2的体外培养方法为：

b、向人肝癌细胞HepG2中加入5 mL完全培养基，轻轻吹打混匀细胞沉淀并转移至细胞培养瓶中，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中进行培养；所述完全培养基的配制方法为：在89 mL的DMEM培养基中加入10 mL胎牛血清，1mL双抗，充分混匀，封口膜封口，放于冰箱4℃保存；

4.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：步骤S3中癌细胞的转染方法为：

b、配制转染液：A：将1.5 μg的去内毒素质粒加入到100 μL的Opti-MEM培养基中；B：将3μL的Lipofectamine^TM 2000加入到100 μL 的无菌Opti-MEM中；将A加入B中，轻轻吹打使两者混匀，在室温下放置15 min；

d、将新鲜配制的转染液分别滴加到每孔培养基内，轻轻混匀液体，于37 ℃含有5% CO₂培养箱中继续培养6 h；

5.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：所述S4中步骤（3）中转染液的制备方法为：将等体积的Lipofectamine^TM2000加入到等体积的去内毒素的线性化重组真核表达载体pEGFP-N1-p16/MAR中轻轻混合均匀，室温条件下孵育25 min备用。

6.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：所述步骤S4中种蛋的孵化条件为：37.8 ℃，预孵化12-24h，期间每隔2小时翻蛋一次，翻蛋角度±90°，相对湿度为55%-58%。

7.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：所述步骤S2中鸡体的DNA提取自鸡肝脏组织。

8.根据权利要求1所述的一种制备转人抑癌基因鸡的方法，其特征在于：所述显微注射部位为种蛋X时期胚盘的中心区和暗区。