CN108611352A

CN108611352A - 一种拟禾本科根结线虫翻译延长因子Mg-eEF1A及其防治植物病害的应用

Info

Publication number: CN108611352A
Application number: CN201810360410.5A
Authority: CN
Inventors: 卓侃; 廖金铃; 陈建松; 林柏荣
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN108611352B

Abstract

本发明公开了一种拟禾本科根结线虫的翻译延长因子Mg‑eEF1A及其防治植物病害的应用。所述Mg‑eEF1A的基因组序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述Mg‑eEF1A是本发明首次发现，并证明其能够被拟禾本科根结线虫分泌到体外，在植物寄生线虫侵染的过程中能够激活寄主的免疫系统，诱导水稻的基础免疫反应和对病原物的抗病性，激活水稻的PTI免疫反应，比如病程相关基因的表达、胼胝质的积累、MAP激酶磷酸化，增强水稻对拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗性。而且，研究发现Mg‑eEF1A在线虫侵染过程能够诱导植物OsCERK1的表达，这一研究为植物寄生线虫的防控开启一条具有巨大潜力的方向和策略。

Description

一种拟禾本科根结线虫翻译延长因子Mg-eEF1A及其防治植物病害的应用

技术领域

本发明属于植物病害防治技术领域。更具体地，涉及一种拟禾本科根结线虫病原相关分子模式（PAMP）Mg-eEF1A及其防治植物病害的应用。

背景技术

禾本科为经济价值最高的一科，如稻、麦、玉米、粟（小米）、高梁等人类的主要粮食作物，甘蔗糖料作物以及牧草、竹类等均属本科。其它如造纸、纺织、铺建草皮、保提护岸、水土保持等方面，禾本科植物也占有相当重要的地位。水稻根结线虫病害与稻瘟病是禾本科常见的病害，造成大量的经济损失和危害。因此，其病害防治具有重要的意义和价值。

生物体通过进化的方式获得了多种方法来保护自身免受来自其他生物体或者非生物体的侵害。在动物中，研究最深入透彻的是B细胞、T细胞以及抗原特异性抗体组成的适应性免疫系统(Nürnberger et al., 2004)。但是，在植物中却不存在这方面的免疫系统。在过去的研究中，一些重要的植物先天免疫系统已经被发现和研究，这些先天免疫系统帮助植物抵御外界的各种侵害(Kumar et al., 2011)。植物的免疫系统能够通过细胞膜上一类模式识别受体蛋白（PRRs）来识别非自身存在的保守结构的分子，而这种保守结构的分子却是外源生物体所共有的，研究人员把它称之为病原(或者微生物)相关的分子模式（PAMPs/MAMPs）(Jones et al., 2006; Macho et al.,2014)。植物细胞表面存在大量的膜受体蛋白，能够识别非自身的保守分子来启动免疫反应。目前在植物病原物上的研究已经发现大量的这种病原相关的分子，但是在植物寄生线虫上的研究却很少。

在许多病原物中，已经发现了一些PAMPs/MAMPs的分子并鉴定出与之对应的植物细胞中的PRRs蛋白。第一个发现的植物寄生线虫上PAMP分子是信息素，它能够诱导植物产生免疫多种反应，比如，PTI相关抗病基因的表达、激活促分裂原激活蛋白激酶、触发水杨酸和茉莉酸介导的防卫通路以及提高拟南芥对病原物的抗性(Manosalva et al., 2015)。信息素是一种小分子化合物，是植物寄生线虫上发现的唯一一个线虫相关的分子模式，但是蛋白性质的线虫相关分子模式还未发现。并且，目前的研究还未发现植物与线虫PAMPs（或称之为NAMPs）直接作用的受体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有禾本科作物病害防治技术的缺陷和不足，首次通过酵母双杂的方法鉴定到一种植物寄生线虫蛋白性质的NAMP，即Mg-eEF1A，在植物寄生线虫侵染的过程中能够激活寄主的免疫系统。实验证明，Mg-eEF1A能够诱导水稻的基础免疫反应和对病原物的抗病性；并且，Mg-eEF1A能够与水稻膜蛋白受体OsCERK1相互作用，并且线虫侵染过程能够诱导OsCERK1的表达，

本发明的目的是提供一种拟禾本科根结线虫的翻译延长因子Mg-eEF1A。

本发明另一目的是提供所述Mg-eEF1A在诱导植物防卫反应、激活植物免疫反应、提高植物抗性或防治植物病害方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首次获得了一种拟禾本科根结线虫的翻译延长因子Mg-eEF1A，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明研究发现，Mg-eEF1A蛋白可诱导水稻防卫反应，能够有效提高植物对病原物拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗病性，为农业生产中的线虫防治提供一条新的策略。

因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

所述Mg-eEF1A或Mg-eEF1A蛋白在诱导植物防卫反应、激活植物免疫反应、提高植物抗性或防治植物病害方面的应用。

优选地，所述植物为禾本科植物。更优选为水稻。

优选地，所述病害为植物寄生线虫病害和/或稻瘟菌。

更优选地，所述植物寄生线虫病害为拟禾本科根结线虫病害。

另外，具体地，Mg-eEF1A蛋白可激活水稻的PTI免疫反应，激活病程相关基因的表达、诱导水稻根部防卫基因的上调、诱导胼胝质的积累、诱导MAP激酶磷酸化，增强水稻对拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗性。

因此，本发明还涉及一种诱导植物防卫反应、激活植物免疫反应、提高植物抗性或防治植物病害的方法，是利用所述Mg-eEF1A蛋白处理植物，或将所述Mg-eEF1A在植物中过表达。比如使用eEF1A蛋白液浸泡植物根部或喷施叶片。

优选地，所述植物为禾本科植物。更优选为水稻。

优选地，所述病害为植物寄生线虫病害和/或稻瘟菌。

本发明还涉及一种防治水稻拟禾本科根结线虫病和/或稻瘟菌的方法，是将所述Mg-eEF1A在水稻中过表达，或利用所述Mg-eEF1A蛋白处理植物。

利用所述Mg-eEF1A蛋白处理植物的方法比如：使用Mg-eEF1A蛋白液浸泡水稻根部或喷施叶片。

另外，所述Mg-eEF1A在构建抗拟禾本科根结线虫病和/或稻瘟菌的转基因水稻方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

构建所述抗拟禾本科根结线虫病和/或稻瘟菌的转基因水稻的方法，是将所述Mg-eEF1A在水稻中过表达。

本研究用植物细胞膜上的受体OsCERK1在拟禾本科根结线虫的酵母双杂文库中筛选到互作蛋白Mg-eEF1A。通过酵母共转化实验分析，发现OsCERK1能够与Mg-eEF1A上的两个区域结合互作。进一步，通过免疫共沉淀的方法，确定了OsCERK1能够与Mg-eEF1A互作。通过western blot，研究证实Mg-eEF1A能够被线虫分泌到体外。同时，MgEF1A能够诱导水稻的防卫相关基因的表达、胼胝质的积累以及MAPK的磷酸化。最后，发现Mg-eEF1A的蛋白诱导的水稻防卫反应的确能够有效提高植物对病原物拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗病性。这是植物寄生线虫上第一次发现具有诱导植物免疫系统的蛋白性质的NAMP，同时，通过gus系统证明OsCERK1是拟禾本科根结线虫的识别受体。本实验证实植物能够通过识别微量的NAMP来帮助农作物获得更强的抗病能力，为植物的防治策略提供一条新的策略。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次通过酵母双杂的方法鉴定到一种植物寄生线虫蛋白性质的NAMP，即一个与水稻膜受体蛋白OsCERK1互作的拟禾本科根结线虫的翻译延长因子Mg-eEF1A，在植物寄生线虫侵染的过程中能够激活寄主的免疫系统。

实验证明，Mg-eEF1A能够被拟禾本科根结线虫分泌到体外，并诱导水稻的基础免疫反应和对病原物的抗病性，激活水稻的PTI免疫反应，比如病程相关基因的表达、胼胝质的积累、MAP激酶磷酸化以及增强水稻对拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗性。这些研究表明Mg-eEF1A是线虫上的一个蛋白类的NAMP，能够被水稻识别并诱导抗性产生。

另外，研究发现Mg-eEF1A能够与水稻膜蛋白受体OsCERK1相互作用，并且线虫侵染过程能够诱导OsCERK1的表达，说明Mg-eEF1A在植物中的识别受体为OsCERK1。这一研究为挖掘植物寄生线虫NAMP以及与其对应的受体提供了一条有效、可靠的途径，并为植物寄生线虫的防控开启一条具有巨大潜力的方向和策略。

附图说明

图1为eEF1A在线虫中的氨基酸序列比对。

图2为拟禾本科根结线虫Mg-eEF1A蛋白与水稻膜蛋白OsCERK1互作；图A：克隆全长不同区域的Mg-eEF1A结构域与水稻膜蛋白受体蛋白OsCERK1进行酵母共转化验证，p53+SV40，酵母双杂互作阳性对照； Lam C+SV40，酵母双杂阴性对照；图B：免疫共沉淀进一步验证Mg-eEF1A与OsCERK1的相互作用；IP，免疫共沉淀过程中使用的抗体；+，表示水稻原生质体瞬时表达包含此载体。

图3为Mg-eEF1A全长和部分蛋白Mg-eEF1A^313aa-417aa的表达及纯化。图A：pET28a-Mg-eEF1A蛋白的纯化，考马斯蓝染色的12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析MgGPP重组蛋白(红色框格)；1，结合缓冲液；2-6，漂洗缓冲液；7-9，洗脱缓冲液；M，蛋白标准marker。图B：pET32a-Mg-eEF1A^{313 aa-417 aa}重组蛋白的纯化；考马斯蓝染色的12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析MgGPP重组蛋白(红色框格)；10-12，洗脱缓冲液；13，洗脱缓冲液；M，蛋白标准分子量。

图4为Mg-eEF1A多克隆抗血清的特异性Western blot验证；左边的是免疫前空血清对照，右边是MgGPP抗血清实验组。

图5为Western blot检测Mg-eEF1A分泌特性；Nema-water：线虫浸泡后的水；Mg：拟禾本科根结线虫总蛋白。

图6为Mg-eEF1A对水稻防卫基因表达的影响。图A：Mg-eEF1A诱导的水稻根部防卫基因的上调；实验数据采用三个植株的平均值和标准偏差；*P < 0.05；**P < 0.01，Student’s t test。图B：用12 d的水稻根检测1 μM Mg-eEF1A2诱导胼胝质的积累；实验重复三次；比例尺，50 μm。

图7为Mg-eEF1A增强水稻的抗病性。A：Mg-eEF1A增强水稻对稻瘟菌的抗性；比例尺，1 cm。图B：Mg-eEF1A增强水稻对拟禾本科根结线虫的抗性；*P < 0.05；**P < 0.01，student’s t test。WT，未接稻瘟菌；Water，纯净水处理；Chitin，几丁质处理；Mg-eEF1A，Mg-eEF1A蛋白处理。

图8为Mg-eEF1A激发植物MAPK信号途径。

图9为OsCERK1在线虫侵染位点表达上调。图A：X-gluc染色液对野生型的日本晴水稻根进行染色，在水稻的根部没有观察到根部GUS的染色。图B：X-gluc染色液对接种拟禾本科根结线虫3 d后的野生型的日本晴水稻进行染色，在侵染点处没有观察到GUS的染色。图C：OsCERK1pro:GUS转基因水稻用X-gluc染色液染色，发现在整个根部都出现GUS的染色。图D：OsCERK1pro:GUS转基因水稻接种拟禾本科根结线虫3 d后用X-gluc染色液染色，发现在整个根部都出现GUS的染色，并且在线虫侵染点位置颜色更深。红色箭头：侵染位点；比例尺：500 μm。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用到的试剂：phosphor-p44/42 MAPK(Cat No.# Antibody 9101，Cell Signaling Technology)，购自聚研生物科技有限公司；flg22多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Chitin 来源于虾壳，EZview Red Anti-HA Affinity Gel，均购自Sigma。稻瘟菌培养基：浓缩果汁40mL，酵母提取物10g，乳糖5g。

实施例1 Mg-eEF1A克隆

根据拟禾本科根结线虫转录组数据，拼接出Mg-eEF1A基因的全长的cDNA序列。随后，设计覆盖全长序列的引物Mg-eEF1A-gDNA-F/Mg-eEF1A-gDNA-R,扩增出基因组序列。

SEQ ID NO.4（引物Mg-eEF1A-gDNA-F）

ATGGGAAAAGAAAAGATTC

SEQ ID NO.5（引物Mg-eEF1A-gDNA-R）

TTATTTCTTCTTTCCAGCAG

扩增出的Mg-eEF1A基因全长1650 bp（SEQ ID NO.1所示），包含6个短片段的内含子，编码465个氨基酸（SEQ ID NO.2所示）。

通过同源比对，发现Mg-eEF1A在线虫中非常保守（图1）。

实施例2 酵母双杂

1、实验方法

（1）收集拟禾本科根结线虫侵染前的2龄幼虫，使用Trizol regent提取线虫的总RNA，用DNase 1去除残留的DNA，具体操作过程如下：

收集拟禾本科根结线虫于1.5 ml的离心管中，用适合的研磨棒在液氮的环境下粉碎虫体，并加入1 ml的Trizol regent混匀。在室温下静止5 min，以使核蛋白体完全解离。向上述裂解液中加入200 μl的氯仿，剧烈震荡15秒，重复3次，室温静置2 min。12000 rpm，4℃离心15 min，小心吸取上层液体到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置30 min。12000 rpm，4℃ 离心15 min，去掉上清，沉淀用75%的酒精洗涤2次。室温放置数分钟晾干，加入30μl RNase free water（DEPC水），待完全溶解后，取少量检测，其余在-80℃保存。

（2）使用Make Your Own Mate & Plate Library System（clontech）文库构建试剂盒进行拟禾本科根结线虫侵染前2龄幼虫的文库构建，实验步骤严格按照说明书的操作进行。通过PCR得到不含有信号肽的区域OsCERK1Δsp，并克隆到酵母载体pGBKT7中，得到诱饵载体pGBKT7:OsCERK1Δsp。使用酵母转化试剂盒Yeastmaker Yeast TransformationSystem 2 kit 把诱饵载体转化到酵母菌Y2H，具体实验操作参照说明书进行。通过酵母双杂试剂盒Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System，使用诱饵载体pGBKT7:OsCERK1Δsp在线虫的文库中于4缺培养基SD/-Ade/-His/-Leu//-Trp上进行互作蛋白的筛选。随后挑取4缺培养基上的克隆到含有SD/-Ade/-His/-Leu//-Trp/x-α-gal的4缺培养基中，观察菌落的颜色变化。2 d后，选取颜色变蓝的菌落，通过引物5’ PCR Primer和3’ PCR Primer进行菌落PCR。

SEQ ID NO.6（引物5’ PCR Primer）

TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG

SEQ ID NO.7（引物3’ PCR Primer）

GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA

将PCR验证合格的菌落进行酵母质粒的提取，并把这些质粒转化到大肠杆菌DH5α中，最后在艾基生物有限公司进行测序。分析测序结果，通过扩增得到假定互作蛋白的全长，克隆到载体pGADT7中。把含有假定载体的PGADT7与诱饵载体pGBKT7:OsCERK1Δsp共同转化到酵母菌Y2H中，并在4缺培养基SD/-Ade/-His/-Leu//-Trp/x-α-gal上进行共转化验证。

2、实验结果

Mg-eEF1A蛋白与水稻膜蛋白OsCERK1结合

（1）构建拟禾本科根结线虫侵染前的2龄幼虫的酵母双杂cDNA文库。用水稻上的膜蛋白OsCERK1作为诱饵蛋白，筛选到18个菌落克隆。通过测序验证，得到一批假定的互作蛋白（表1）。

表1 水稻膜蛋白OsCERK1酵母双杂假定蛋白

在进行酵母共转的验证过程中，发现Mg-eEF1A能够与OsCERK1相互作用。进一步研究这两个蛋白的互作区域，把Mg-eEF1A按结构域分为3段，分别与OsCERK1共转酵母。结果表明，Mg-eEF1A（200aa-350aa）和Mg-eEF1A（300aa-464aa）能够相互作用（图2 A）。进一步把这两个相互作用的重复部分扩增（250aa-350aa）出来，但是却发现Mg-eEF1A（300aa-350aa）部分不能够与OsCERK1互作。这个结果说明，OsCERK1能够与Mg-eEF1A上两个不同位置的结构区域互作。

实施例3 免疫共沉淀

1、实验方法

通过PCR得到不含有信号肽区域的OsCERK1Δsp和Mg-eEF1A，并克隆到水稻原生质体瞬时表达载体pUbi上，得到pUbi:OsCERK1Δsp:HA和pUbi: Mg-eEF1A:EGFP。同时，构建一个植物表达载体pUbi:EGFP作为阴性对照。把pUbi:OsCERK1Δsp:HA分别与pUbi: Mg-eEF1A:EGFP和pUbi:EGFP在水稻原生质体中共同表达。48h后，收集原生质体细胞并提取总蛋白，总蛋白的提取方法参照2.3.7进行。免疫共沉淀的方法参照EZview Red Anti-HA AffinityGel（sigma）的说明书进行，过程如下：首先，在总蛋白中加入EZview Red Anti-HAAffinity Gel，4℃孵育过夜；然后，用提取蛋白的提取液洗涤4～5次，收集沉淀；在沉淀中加入50 μL ddH₂O和6 μl 的10×Protein loading buffer，沸水中5～10 min使其变性，作为样品。最后，分别用相对应的anti-myc和anti-GFP检测样品作为IP，而提取的总蛋白分别用anti-myc、anti-HA和anti-GFP抗体检测作为input。实验重复三次。

Western blot 步骤如下：取 20 μl检测蛋白在12% SDS-PAGE胶中进行分离，并通过湿转法把蛋白转印到PVDF(PALL，Washington，NY，USA)膜上。把PVDF用5%(w/v)的脱脂奶粉4℃过夜封闭，之后加入检测抗体（anti-GFP、anti-myc、anti-HA）1:3000稀释，孵育2 h。用PBST漂洗3次，每次10 min。加入anti-mouse horseradish peroxidase-conjugatedsecondary antibody二抗，使用1:5000稀释，室温孵育2 h。蛋白显色采用ImmobilonWestern Chemiluminescent system with Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂盒，在暗室中进行胶片曝光。

2、实验结果

为进一步验证蛋白互作的准确性，在水稻原生质体上共同表达OsCERK1:HA和Mg-eEF1A:eGFP，进行免疫共沉淀。实验结果表明，用eGFP抗体沉淀中，能够检测到OsCERK1:HA大小的条带，反过来，用HA抗体检测沉淀，也能得到到Mg-eEF1A:eGFP大小的替代（图2 B）。免疫共沉淀结果结果表明，OsCERK1和Mg-eEF1A确实结合互作。

实施例4 Mg-eEF1A抗体制备和验证

1、实验方法

为验证Mg-eEF1A蛋白的功能，采用原核表达、蛋白纯化以及蛋白浓缩的方法来得到Mg-eEF1A全长蛋白。分别克隆全长的Mg-eEF1A和EGFP到pET-32a原核表达载体中，得到pET-32a:Mg-eEF1A和pET-32a:EGFP，并进一步转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，原核表达的诱导和蛋白纯化。并选择Mg-eEF1A的313aa-417aa区域作为免疫源制备抗体。

所得抗原免疫新西兰大白兔后，先进行抗血清的ELISA 检测，然后进行westernblot分析。

2、实验结果

通过诱导和纯化，得到了纯度较高的可溶性Mg-eEF1A蛋白（图3 A）。由于eEF1A蛋白是个高度保守的蛋白序列，选取Mg-eEF1A上的一段相对特异的氨基酸片段来作为免疫源制备Mg-eEF1A多克隆抗血清（图3 B）。

进一步在侵染后的拟禾本科根结线虫和健康的水稻根的总蛋白中，通过westernblot的方法验证Mg-eEF1A多克隆抗血清的特异性。在pre-J2s、侵染后根结线虫以及健康的水稻根的总蛋白中，发现Mg-eEF1A能特异识别拟禾本科根结线虫总蛋白中的Mg-eEF1A（图4）。

实施例5 Mg-eEF1A分泌分析

1、方法

收集200 μL的拟禾本科根结线虫侵染前的2龄幼虫，通过仔细的清洗和消毒后置于1.5mL的离心管中，加入500 μL的dd H₂O（加入蛋白酶抑制剂）悬浮线虫。在室温下放置24 h，取上清，用0.2 μm的细菌过滤器去除杂质。再通过millipore的30 kDa的过滤柱超滤浓缩线虫浸泡液，最后得到80 μL的线虫分泌溶液。使用Mg-eEF1A的抗血清，通过western blot的方法检测线虫分泌溶液，通过Mg-eEF1A抗血清检测线虫浸泡后的水中蛋白成分和拟禾本科根结线虫的总蛋白。

2、结果

结果显示，在在拟禾本科根结线虫总蛋白和线虫浸泡后水中都有一条Mg-eEF1A蛋白50kDa大小的特异性条带（图5），说明Mg-eEF1A能够被线虫分泌到体外。

实施例6 Mg-eEF1A诱导水稻基础免疫反应

1、收集培育5 d的日本晴水稻的根，置于12孔细胞培养板中，加入无菌水浸泡过夜。分别加入Mg-eEF1A(1 μM)、EGFP(1 μM)、chitin(100 nM)，对照组加入等量无菌水（dd H₂O）。1h后，使用RNA prepmicro kit(Tiangen Biotech，Beijing，China)分别提取各个处理的总RNA。反转录使用全式金生物科技（北京）有限公司的TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒得到cDNA。RT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂盒(Takara，Tokyo，Japan)在 Thermal Cycler Dice Real TimeSystem(Takara，Tokyo，Japan)上进行。OsUBQ-F/OsUBQ-R作为内参。

SEQ ID NO.8（引物OsUBQ-F）

CCAGTAAGTCCTCAGCCATGGAG

SEQ ID NO.9（引物OsUBQ-R）

GGACACAATGATTAGGGATC

通过qRT-PCR的方法观察一些与OsCERK1相关的防卫基因的表达（OsKS4，Os04g10060；Os-WRKY13，Os01g0750100； Beta-Glu，Os05g0495900；MLO，Os03g0129100； PAL，Os02g0627100）。

结果显示，用Mg-eEF1A的蛋白浸泡水稻根后，浸泡Mg-eEF1A的蛋白的水稻根比用清水和EGFP对照的防卫基因表达量显著升高（图6 A）。

2、为进一步验证Mg-eEF1A对植物免疫的诱导，同样用Mg-eEF1A蛋白浸泡水稻的根：日本晴水稻在MS培养基上生长，12 d后取水稻的嫩根用1μM 的Mg-eEF1A、water、Chitin以及eGFP蛋白浸泡过夜。

通过苯胺蓝染色的方法，在荧光显微镜下观察根部胼胝质积累的情况。结果显示，经过Mg-eEF1A蛋白浸泡过的水稻根比对照根的胼胝质积累明显增多（图6 B）。这说明，Mg-eEF1A蛋白能够有效诱导植物胼胝质的积累，转基因水稻Mg-eEF1A能够有效诱导水稻根的胼胝质的积累。

以上实验结果表明，拟禾本科根结线虫Mg-eEF1A蛋白能够激发植物防卫反应。

实施例7 Mg-eEF1A诱导水稻抗病性

1、实验方法

诱导稻瘟菌抗性：日本晴水稻种子消毒后，播种到育苗盘中，放置在28℃，16 h光照，8h黑暗的培养箱中培养。用5叶期的水稻苗接种稻瘟菌。稻瘟菌培养在专用培养基上（成分：乳糖、酵母提取物、浓缩果汁），在28℃黑暗中培养3 d，之后转到28℃，16 h光照，8 h黑暗培养箱中进行孢子的生长。在养7 d后，在培养皿中加入无菌水，用毛刷收集稻瘟菌的孢子。用血球计数板计数，使孢子的浓度达到1×10⁵个/ml。在接种前24 h，对水稻喷施不同的成分诱导剂：无菌水、chitin(100 nM)、eGFP蛋白(1 μM)以及Mg-eEF1A(1 μM)。水稻接种稻瘟菌采用Chen等(2003)进行叶片浸泡和喷施的方法。在稻瘟菌孢子液中加入终浓度为1%的Tween-20表面活性剂，用喷壶均匀的喷到每个处理的水稻叶片上，同时把水稻叶片浸入孢子液中。每个处理稻瘟菌接种30棵水稻。接种10 d后，观察水稻的叶片发病情况，并记录拍照。

诱导拟禾本科根结线虫抗性：日本晴水稻经过6 d的育苗，移栽到沙土培养杯中，然后继续在培养杯中培养6 d。接着，用Mg-eEF1A蛋白(1 μM)、eGFP蛋白(1 μM)、chitin(100nM)以及无菌水对日本晴水稻的叶片进行喷洒，并对根部进行灌溉。1 d后，把处理过的水稻苗用清水冲洗，移到新的培养杯中，每个日本晴水稻接种200拟禾本科根结线虫，每个处理接种15棵水稻，12 d后用品红染色统计雌虫数。

2、实验结果

用Mg-eEF1A蛋白对日本晴水稻的4叶期叶片用Mg-eEF1A蛋白进行喷洒，并对根部用Mg-eEF1A蛋白进行灌溉；并分别用纯净水、几丁质为对照。1 d后接种稻瘟菌。9 d后观察发病情况。结果表明，Mg-eEF1A蛋白能够诱导水稻对稻瘟病的抗性（图7 A）。

接着，用Mg-eEF1A蛋白对日本晴水稻的叶片进行喷洒，并用Mg-eEF1A蛋白对其根部进行灌溉；并分别用纯净水、几丁质为对照。1 d后，每个日本晴水稻接种200条拟禾本科根结线虫，12 d后用品红染色统计雌虫数。结果显示，Mg-eEF1A蛋白处理的水稻雌虫数比对照组中的数量显著减少，表明Mg-eEF1A蛋白能够诱导水稻对拟禾本科根结线虫的抗性（图7B）。

以上结果表明，本发明拟禾本科根结线虫Mg-eEF1A可诱导水稻的抗病性。

实施例8 Mg-eEF1A诱导激发植物MAPK信号途径

1、实验方法

用Mg-eEF1A、flg22以及ddH₂O处理拟南芥和水稻的根部0 min，15 min和30 min。收集处理的样品，用液氮研磨，并加入蛋白提取液提取总蛋白。得到的样品在12% SDS-PAGE中电泳。

MAP激酶的磷酸化检测使用抗体phosphor-p44/42 MAPK(Cat的抗体1:1000)，其中抗体液用5%的BSA稀释。

2、实验结果

MAP激酶级联是早期植物PTI的信号通路，通过激活MPK3 和MPK6等磷酸化来调控信号的传递。本研究中。通过Mg-eEF1A浸泡水稻根来证明Mg-eEF1A能够激活MAP激酶级联信号通路。通过不同浸泡时间，收集水稻根的总蛋白用MAPK磷酸化蛋白进行western blot检测。实验结果证明，Mg-eEF1A浸泡水稻根能够诱导MAPKs中MPK3 和MPK6磷酸化加强，表明Mg-eEF1A能够激发水稻的MAPKs信号通路（图8）。

实施例9 GUS系统检测OsCERK1转录表达

1、实验方法

通过生物信息学分析，得到OsCERK1基因的起始密码子位置前2000 bp的序列。通过PCR的方法得到OsCERK1的2000 bp大小启动子包含片段OsCERK1^pro （SEQ ID NO.3所示）。克隆OsCERK1的启动子到pCAMBIA1305.1中，替换GUS基因前的35s启动子，得到pCAMBIA1305.1:OsCERK1pro:GUS的GUS表达载体。

通过水稻转基因的方式，把pCAMBIA1305.1:OsCERK1pro:GUS转到日本晴水稻中。收集拟禾本科根结线虫，侵染pCAMBIA1305.1:OsCERK1pro:GUS的转基因水稻，3 d后收集水稻的根部，用x-gluc染色液进行GUS染色，通过显微镜观察结果。

2、实验结果

Mg-eEF1A能够与植物的膜受体OsCERK1结合，通过实验证明 OsCERK1在植物寄生线虫过程中具有调控作用。把OsCERK1的启动子区域（翻译起始子前面2000bp）克隆到GUS表达载体中，得到pCERK1-promotor:GUS，并转化到日本晴水稻中对其进行拟禾本科根结线虫的接种。然后通过GUS染色法，观察水稻根部情况。

实验结果表明，CERK1是一个根部泛表达的基因，但在拟禾本科根结线虫的侵染部位的GUS颜色更深（图9）。这说明线虫侵染水稻过程中，能够诱导OsCERK1的转录表达。

综上研究显示，本发明得到一个拟禾本科根结线虫的Mg-eEF1A蛋白，其能够与水稻表面受体激酶OsCERK1相结合，并触发植物的免疫反应。eEF1A是真核生物中保守的蛋白，对细胞的正常代谢过程具有重要的作用。通过生物信息学分析，eEF1A蛋白不含有典型的分泌信号肽。本发明为证明Mg-eEF1A能够被线虫分泌到虫体外，制备了Mg-eEF1A特异性的抗血清，并通过western blot在拟禾本科根结线虫浸泡液中检测到了Mg-eEF1A的蛋白底物。这一研究表明，尽管Mg-eEF1A不具有典型的分泌信号肽，但是Mg-eEF1A通过非经典的分泌途径到达细胞外被植物所识别，它在拟禾本科根结线虫2龄幼虫阶段就被分泌到虫体外。

进一步地，本研究发现Mg-eEF1A能够增强植物对病原物的抗性。经过Mg-eEF1A蛋白处理的水稻对拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗病能力都显著增强。为探究植物对线虫和其它病原物的抗病性的增强机理，通过实验证明Mg-eEF1A能够诱导水稻的免疫反应。本研究选取报道的OsCERK1相关途径的防卫基因来研究Mg-eEF1A的诱导情况，实验结果说明Mg-eEF1A能够诱导水稻根部防卫基因的上调。进一步的研究发现，Mg-eEF1A还能够诱导植物根部的胼胝质的积累，胼胝质的增加是植物抵御病原物最重要的手段之一。本实验使用Mg-eEF1A浸泡水稻的根部，同样也能诱导MAP激酶的磷酸化，说明Mg-eEF1A能够激活MAP激酶级联途径的信号通路。综合这些研究说明，拟禾本科根结线虫Mg-eEF1A能够作为植物线虫上的NAMP分子激活植物的免疫反应，从而增强植物的抗病性。

另外，研究发现在水稻的根部或者叶片部使用Mg-eEF1A都能够诱导水稻的抗性，这说明Mg-eEF1A的受体在整个水稻植株上都能够表达。OsCERK1是水稻中的受体激酶，其胞外LysM结构能够识别多种PAMPs分子来诱导下游的免疫反应，比如几丁质，结瘤因子以及肽聚糖。在本研究中，通过酵母双杂交和免疫共沉淀，已经证明Mg-eEF1A能够与水稻膜蛋白受体OsCERK1相互作用。进一步通过转化OsCERK1启动子到gus表达系统中，结果发现OsCERK1在拟禾本科根结线虫侵染点表达增强。这说明在植物寄生线虫寄生过程中，植物细胞膜蛋白OsCERK1能够识别病原物，而且 OsCERK1是Mg-eEF1A的细胞膜识别受体。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种拟禾本科根结线虫翻译延长因子Mg-eEF1A及其防治植物病害的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> Mg-eEF1A基因组序列(Mg-eEF1A genome sequence)

<400> 1

atgggaaaag aaaagattca tatcaacatt gtagttattg gtcacgtcga ttctggtaaa 60

tctacaacga ctggacattt aatttacaaa tgtggtggaa tcgacaaaag gactatcgag 120

aagttcgaga aggaagctca ggaaatggga aagggatcgt tcaaatatgc ctgggtaatt 180

catttttatt aatacacttc ttatttgttc taattaaggt gttggacaag ttgaaggcag 240

aacgtgaacg tggtattact attgacattg ctctttggaa gttcgagact gctaagtact 300

atgtcacgat tattgatgct cctggacatc gagactttat caagaacatg attactggtt 360

tcttatgaga ttattggttc ttttaacttt tatttaggta cttcccaagc tgattgtgct 420

gttttggtag ttgcttgtgg aactggtgaa ttcgaagcag gaatttctaa gaatggtcag 480

actcgtgaac acgcacttct tgctcagact ttgggagtca agcaacttat tgttgcctgt 540

aacaaggttt ttgatctgtt tgctttcttt cttactcaat ttagatggac acaactgagc 600

cacctttctc tgaagctcgt tttgaagaag tcaagaatga agtttctagc tttatcaaga 660

agattggata caaccctgca accgttgctt ttgtccctat ctctggtttc aacggtgaca 720

acatgctcga gccctctgac aggatgccat ggttcaaggg atggaacatt gagaggaagg 780

aaggaaatgc tagtggaaag acattgttgg aggctctcga tgccatcctt cctccaagta 840

ggcctaccga taagccactt cgactccctc ttcaagacgt ttacaaaatt ggaggtttac 900

ttttgatttt accttgaaga aatttaaaat ctttttaggt attggaactg ttcctgttgg 960

acgtgttgag actggtattc tcaaacctgg aatggttgtt acctttgctc ctcaaggaat 1020

ttctactgaa gttaaatctg ttgaaatgca ccacgaatca cttcctgaag ctgttcctgg 1080

tgacaatgtt ggttttaacg tgaagaacat ttctgtcaag gatattcgtc gtggatcagt 1140

tacatctgat tctaagaatg atcctgcaaa ggagacaaag caattcactg ctcaaggtta 1200

atttttgttt gaacagagca gctaatttgt gacattttag ttattatcat gaaccaccct 1260

ggacagattg ctgctggtta tactcctgtt ttggattgcc atacagccca cattgcttgt 1320

aagttcaatg aacttaagga gaaggttgat cgtcgaactg gtaaaaaagt tgaagacaat 1380

ccaaaggcct tgaagactgg agatgctggt ttgctttaaa gcctattctc tttctaaaat 1440

tcattttaag gtatcgtcga cttaattcct accaagccaa tgtgcgttga ggctttcact 1500

gactatgctc ctcttggacg ttttgctgtt cgtgacatgc gtcagactgt ggctgttggt 1560

gtaatcaagg ctgttgagaa ggttgaggct ggtggaaagg tcacaaagtc cgctcagaag 1620

gctggagctg ctgctggaaa gaagaaataa 1650

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> Mg-eEF1A氨基酸序列(Mg-eEF1A amino acid sequence)

<400> 2

Met Gly Lys Glu Lys Ile His Ile Asn Ile Val Val Ile Gly His Val

1 5 10 15

Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Cys Gly

20 25 30

Gly Ile Asp Lys Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Gln Glu

35 40 45

Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys

50 55 60

Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe

65 70 75 80

Glu Thr Ala Lys Tyr Tyr Val Thr Ile Ile Asp Ala Pro Gly His Arg

85 90 95

Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Cys Ala

100 105 110

Val Leu Val Val Ala Cys Gly Thr Gly Glu Phe Glu Ala Gly Ile Ser

115 120 125

Lys Asn Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Gln Thr Leu Gly

130 135 140

Val Lys Gln Leu Ile Val Ala Cys Asn Lys Met Asp Thr Thr Glu Pro

145 150 155 160

Pro Phe Ser Glu Ala Arg Phe Glu Glu Val Lys Asn Glu Val Ser Ser

165 170 175

Phe Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asn Pro Ala Thr Val Ala Phe Val Pro

180 185 190

Ile Ser Gly Phe Asn Gly Asp Asn Met Leu Glu Pro Ser Asp Arg Met

195 200 205

Pro Trp Phe Lys Gly Trp Asn Ile Glu Arg Lys Glu Gly Asn Ala Ser

210 215 220

Gly Lys Thr Leu Leu Glu Ala Leu Asp Ala Ile Leu Pro Pro Ser Arg

225 230 235 240

Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys Ile

245 250 255

Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Ile Leu

260 265 270

Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Gln Gly Ile Ser Thr Glu

275 280 285

Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ser Leu Pro Glu Ala Val Pro

290 295 300

Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Ile Ser Val Lys Asp Ile

305 310 315 320

Arg Arg Gly Ser Val Thr Ser Asp Ser Lys Asn Asp Pro Ala Lys Glu

325 330 335

Thr Lys Gln Phe Thr Ala Gln Val Ile Ile Met Asn His Pro Gly Gln

340 345 350

Ile Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ala His Ile

355 360 365

Ala Cys Lys Phe Asn Glu Leu Lys Glu Lys Val Asp Arg Arg Thr Gly

370 375 380

Lys Lys Val Glu Asp Asn Pro Lys Ala Leu Lys Thr Gly Asp Ala Gly

385 390 395 400

Ile Val Asp Leu Ile Pro Thr Lys Pro Met Cys Val Glu Ala Phe Thr

405 410 415

Asp Tyr Ala Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr

420 425 430

Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ala Val Glu Lys Val Glu Ala Gly Gly

435 440 445

Lys Val Thr Lys Ser Ala Gln Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys

450 455 460

Lys

465

<210> 3

<211> 2100

<212> DNA

<213> 启动子序列(Promoter sequence)

<400> 3

gtaaataaat gaggaaatat aaggacatca ggttttacat gagatatagt ttctacacaa 60

tatttaagac atcatgttaa ataaatagca taaaatttaa gtatggaaaa atggtgtttg 120

cattgaaaga atagtgtcta gtattgtaga ctggtgaggg cgagttagag caaataatcc 180

aatacttctt gggcgtcacc ttggattgca cgttctcaag tcccaaccaa gaacgtcttt 240

gggatttgtg tatccacaat tctactgccg tcttgagaga ctaacatatc agctttcatt 300

ttgtagtcta cctccacatg tctcaacttg gcccctccat ccgccttgac atcatatcca 360

actcacttgc tatggcagct tgcttggtga tgtatctagg cctcttccta ggaattgcaa 420

tgctatacca acagtgagat gagcatacga agctctgata ccatattgtt agcaaactaa 480

tttactaagg ccctgtttaa attccctggt aaaattttac accctgttac atcgaatgtt 540

catacacatg catcgaatgt ttagacacat gcatgaagta ttaaatgtaa acgaaaaaat 600

aactaattat acagattgcg tgtaaattgc gagacgaatc ttttaagcct aattgcgcca 660

tgatttgaca atgttgtgct atagtaaaca tctgctaatg atggattaat taggcttaat 720

aaattcgtct cgcagtttac agtcggaatc tgtaatttgt tttgttatta gtttacgttt 780

aatactttaa atgtgtgccc gtatatccaa tatgacacgc taaaactttt cacccctgga 840

tctaaacaca gtctaagtga atagctgtag tagtctagat aaaactcaaa actcaaggtt 900

ggtgttgata agaagctaga tgaagaagga gatctacagt caaagcttgg ctccagatag 960

ccgccaccct cactgttgct tgtctccttt tgtgcaattt gcatttcttc cagccggatg 1020

gtccaagtga aaacccaaac acaggtcatc aaagccgatg tcttaactgt tgcatactac 1080

acacaccaat taactggcac attaacacac actacaactt atgaaaaaaa aagttccttt 1140

ttaattgcac atgaattata ttagatgttg caaccttcat aatttgtttt agctataatc 1200

caatggacag acagtgacaa cagagctcac aatctttttc gaaaaaaaaa aagacaacag 1260

agctcacaag catacagtga tgcagacggc catgcgtgac ataccagtcc tgaacagagg 1320

acataagttc taagaattgc gtgcgtcagc aatgccaatg aggaaaccga caactcagca 1380

tctaccatac gatatgctct tgtgcgttct ctaatccgca tgcaaatatc taatagaagt 1440

gtctggagag gagtcgtgga gcggtataaa ccagctccat atatctagtt tattctatga 1500

tagcgtttta tctagctctg ctcttatttt aagtgggcta aaactatttg gttagactct 1560

agcttttgga gtggagctat gccaaacaga cctcaaatat agaatactta aggagtcaag 1620

gttagtggct aagcacacga ttatcctctt gttcttcaag caacacatta ttcctggctg 1680

attgagacac caacccgtgc taattaagca gttcaatcat ttaaccaaaa aaaactaatt 1740

aagctaagca tccgtaagca aagaacacag agtgagctgt aatgatctgt agtactacgc 1800

tttaattgct ttgaccacgg ccgccgccat tgttgtgctc ttcttctccc tttcttcccc 1860

ggcgccgacc tccctgccac gcgtcgtgcc ctgattagct cactcccccc tgcccccacc 1920

tgtcagcctt acacgttgcg ctgtagtagg tggggcccac ttgaggaagc gggggtcaaa 1980

cttcccccgc gttttggtcg tcgtcgtcgt cgtcttcttc cttctcctcc tccgcctcga 2040

atggctccac gcttcagccg cggctagggt ttcgtcgcga gcgacctccc gccgcccgcc 2100

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物Mg-eEF1A-gDNA-F(primer Mg-eEF1A-gDNA-F)

<400> 4

atgggaaaag aaaagattc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物Mg-eEF1A-gDNA-R(primer Mg-eEF1A-gDNA-R)

<400> 5

ttatttcttc tttccagcag 20

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物5' PCR Primer(5' PCR Primer)

<400> 6

ttccacccaa gcagtggtat caacgcagag tgg 33

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物3' PCR Primer(3' PCR Primer)

<400> 7

gtatcgatgc ccaccctcta gaggccgagg cggccgaca 39

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物OsUBQ-F(primer OsUBQ-F)

<400> 8

ccagtaagtc ctcagccatg gag 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物OsUBQ-R(primer OsUBQ-R)

<400> 9

ggacacaatg attagggatc 20

Claims

1.一种拟禾本科根结线虫的翻译延长因子Mg-eEF1A，其特征在于，其基因组序列如SEQID NO.1所示。

2. 一种拟禾本科根结线虫的翻译延长因子Mg-eEF1A蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述Mg-eEF1A或权利要求2所述Mg-eEF1A蛋白在诱导植物防卫反应、激活植物免疫反应、提高植物抗性或防治植物病害方面的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述植物为禾本科植物。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述禾本科植物为水稻。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述病害为植物寄生线虫病害和/或稻瘟菌。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述植物寄生线虫病害为拟禾本科根结线虫病害。

8.一种诱导植物防卫反应、激活植物免疫反应、提高植物抗性或防治植物病害的方法，其特征在于，利用所述Mg-eEF1A蛋白处理植物，或将所述Mg-eEF1A在植物中过表达。

9.一种防治水稻拟禾本科根结线虫病和/或稻瘟菌的方法，其特征在于，利用权利要求2所述Mg-eEF1A蛋白处理植物，或将权利要求1所述Mg-eEF1A在水稻中过表达。

10.权利要求1所述Mg-eEF1A在构建抗拟禾本科根结线虫病和/或稻瘟菌的转基因水稻方面的应用。