CN111187774B

CN111187774B - 一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因及其应用

Info

Publication number: CN111187774B
Application number: CN202010184554.7A
Authority: CN
Inventors: 邓艳凤; 田忠玲
Original assignee: SUZHOU CITY INVASIVE PEST PREVENTION AND CONTROL TECHNOLOGY CENTER
Current assignee: SUZHOU CITY INVASIVE PEST PREVENTION AND CONTROL TECHNOLOGY CENTER
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2040-03-17
Also published as: CN111187774A

Abstract

本发明公开了一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因及其应用，属于生物技术领域。本发明为首次公开一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因MgCRT，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。通过实验证实该基因在拟禾本科根结线虫亚腹食道腺中表达，设计并合成该基因的dsRNA，将拟禾本科根结线虫幼虫浸在dsRNA溶液中，洗涤后接种水稻，发现采用此方法对拟禾本科根结线虫MgCRT基因沉默后，侵染水稻的线虫数量显著减少，表明基因拟禾本科根结线虫的MgCRT基因与其侵染寄主相关，也表明可以利用MgCRT基因作为靶标使用RNA干扰技术防治拟禾本科根结线虫侵染农作物。

Description

一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因及其应用。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类固着型内寄生植物病原线虫。根结线虫寄主范围广，适应性强，对农业生产危害严重，造成巨大经济损失。轮作、生物熏蒸、生物防治及化学农药是防治线虫的主要方法，但是存在防治效果差、污染环境等问题。存在特异性差、副作用大、防效有限等突出问题。

钙网蛋白在人类和多种动物寄生线虫中被发现并被证实与线虫寄生和人类疾病相关，特别是发现肠道寄生线虫在取食时会分泌钙网蛋白，因此推测其在线虫的侵染前后均扮演重要的角色。钙网蛋白的功能在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中已被大量研究，这些研究表明钙网蛋白有多种重要的生物学功能。在植物寄生线虫中，已报道在南方根结线虫(Meloidogyne incognita)上分离得到钙网蛋白基因Micrt，该基因是直接通过分离口针分泌物后测序获得的。Jaubert等在2005年进一步经原位杂交、蛋白荧光免疫组织定位并将南方根结线虫接种于拟南芥对该基因进行组织定位，证实Micrt不仅在南方根结线虫侵染型2龄幼虫的亚腹食道腺中表达，而且在取食位点和2龄幼虫在拟南芥组织中的迁移过程中也有该基因表达产物，暗示该基因与南方根结线虫侵染寄主相关。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

所述的拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因在阻止拟禾本科根结线虫侵染农作物中的应用。

所述的应用，是以拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因作为靶标，使用小分子RNA干扰其表达。

一种靶向所述的拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA，所述的dsRNA包括正义链和反义链，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA在阻止拟禾本科根结线虫侵染农作物中的应用。

所述靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA在阻止拟禾本科根结线虫侵染农作物中的应用的具体方法为：使拟禾本科根结线虫浸泡于所述靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA的溶液中。

所述的应用中，所述的农作物为水稻。

制备所述的靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA的引物：

MgCRT-p F：5′-ATTGACTGCGGTGGTGGTT-3′，

MgCRT-T7 R：

5′-TAATACGACTCACTATAGGGGTTCATCGTCCACTTTGTATTC-3′，

MgCRT-p R：5′-GTTCATCGTCCACTTTGTATTC-3′，

MgCRT-T7 F：

5′-TAATACGACTCACTATAGGGATTGACTGCGGTGGTGGTT-3′。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明首次获得拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)钙网蛋白基因MgCRT，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。通过实验证实该基因在拟禾本科根结线虫亚腹食道腺中表达。进一步设计并合成该基因的dsRNA(包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，将拟禾本科根结线虫幼虫浸在该dsRNA的溶液中，洗涤后接种水稻，发现采用此方法使拟禾本科根结线虫MgCRT基因沉默后，侵染水稻的线虫数量显著减少，表明拟禾本科根结线虫的MgCRT基因与其侵染寄主相关，也表明可以利用MgCRT基因作为靶标使用RNA干扰等技术防治拟禾本科根结线虫侵染农作物。

附图说明

图1为CRT基因的进化树图；

图2为MgCRT基因在拟禾本科根结线虫中表达定位分析结果图；图中，a为正/反义探针电泳图；b为反义链探针杂交结果图；c为正义链探针杂交结果图；

图3为RNAi处理后的拟禾本科根结线虫侵染水稻结果图；图中dsRNA-crt为对MgCRT基因进行dsRNA沉默处理组，CK为对照组；knot表示拟禾本科线虫根结，J2表示拟禾本科根结线虫二龄幼虫。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

材料：拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)来自浙江金华水稻根部；

主要试剂：TRIZOL Reagent购自Invitrogen公司；PrimeScript^TM 1st StrandcDNA Synthesis Kit、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、3′-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase购自TAKARA公司；杂交试剂盒(DIGDNALabeling Kit)为ROCHE公司产品；T7 RNAi Transcription Kit为南京诺唯赞公司产品。

实施例1：拟禾本科根结线虫DNA提取

1、总RNA的提取

采用TRIZOL Reagent提取总RNA，步骤如下：

1)RNA提取过程中所用ddH₂O、离心管和枪头等用0.1％的DEPC处理。

2)将拟禾本科根结线虫收集于1.5mL离心管中，液氮速冻，加入200μL Trizol，用微量组织匀浆器充分研磨后，再加入800μL Trizol，充分混匀后室温静置5min；

3)加入200μL氯仿，充分振荡，室温放置3min，4℃12000rpm离心15min；

4)吸取上清至另一1.5mL离心管中，加入550μL异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min；

5)弃上清，每管中加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心5min；

6)弃上清，待管中酒精挥发后，加入20μL DEPC H₂O溶解RNA，RNA于-80℃冰箱保存。

2、反转录合成cDNA

第一链cDNA的合成使用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)试剂盒合成cDNA，步骤如下：

1)RNase Free的PCR管置于冰上，管中依次加入下面的反应物：

2μL总RNA，1μL dNTPs Mixture(10mM)，1μL引物Oligo(dt)，RNase Free dH₂O upto 10μL

2)65℃温浴混合液5min，冰上迅速冷却；

3)依次加入：4μL5×PrimerScript Buffer，0.5μLRNase inhibitor(40U/μL)，1μLPrimerScript RTase(200)，RNase Free dH₂O up to 20μL

4)混匀，短暂离心收集至管底；

5)50℃30min，85℃5min终止反应。反转录合成的c DNA可用于后续的PCR。

实施例2：拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因(MgCRT)的克隆

对拟禾本科根结线虫转录组数据进行拼接处理并一一比对，得到一段1712bp的序列与南方根结线虫CTR序列相似性很高，且该序列已包含CRT基因完整的5’端和ORF序列，3’序列不全，根据这段序列设计验证引物，见表1，用实施例1得到的cDNA进行PCR扩增。

表1引物序列

引物	序列
		Mgcrt-F-57	5′-ACGAAGATTAAGAATGGCCG-3′
Mgcrt-R-656	5′-CTTTCTGCCTTTTCGCCATC-3′
		Mgcrt-ORF-F	5′-TCTAAACATAAGAGCGACTACGG-3′
Mgcrt-ORF-R	5′-GTGCGGTATTTGGTAGGGAG-3′

PCR反应体系：1μLc DNA，1μL引物F(10μM)，1μL引物R(10μM)，2.5μL 10×Buffer，2μL dNTP(2.5mM)，0.2μL Taq，16.3μL dd H₂O。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。

配制1％琼脂糖凝胶，PCR产物经电泳验证片段大小后，用TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

PCR纯化产物可直接与pUCm-T载体(Takara)连接，采用10μL反应体系，依次加入：7μL PCR扩增产物，1μL pUCm-T，1μL10×连接缓冲液，1μL T4 DNA连接酶，10μL终体积。

12000rpm离心10秒，置4℃连接过夜或16℃连接4小时。

将连接后的载体转入大肠杆菌DH 5α感受态并通过菌落PCR和DNA测序确定阳性菌落，序列测定由上海生物工程有限公司完成。测序得到的序列与转录组拼接得到序列完全匹配，确定为拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的部分序列。

实施例3：RACE技术克隆MgCRT基因的全长序列

根据已获得拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的序列，设计3’端RACE所需的特异性引物Mgcrt-R3’(5′-ACATTTGCGGACCTGGAAC-3′)与3’端接头引物进行巢式PCR反应，扩增目的基因的3’端序列。按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase(TAKARA)操作说明，使用3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA；使用特异性引物和3’RACE Outer Primer进行PCR反应得到目的片段进行测序，得到序列与已知序列进行拼接，获得拟禾本科根结线虫钙网蛋白(MgCRT)cDNA全长序列。MgCRT基因cDNA全长1715bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含一个1248bp开放阅读框(ORF)。cDNA开放阅读框编码415个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例4：序列分析

DNAstar软件进行序列拼接和序列一致性比较，Primer 5.0软件进行引物设计，MEGA 5.0软件进行多重序列比对和构建Neighbor-joining系统进化树。

BLAST比对发现MgCRT与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)来源的CRT蛋白相似度分别为86.5％、87.7％。用MEGA 5.0软件用Neighbor-joining方法进行聚类分析，构建了CRT基因的进化树(图1)。结果显示拟禾本科根结线虫MgCRT基因与南方根结线虫、象耳豆根结线虫的紧密聚在一起。

实施例5：MgCRT基因表达定位分析

选用Roche的DIG DNA Labeling Kit杂交试剂盒，对MgCRT基因进行组织表达定位分析。根据MgCRT基因序列设计探针引物，如下表2所示；

表2引物序列

引物	序列
		MgCRT-lab-F	5′-GTGGGGAACTGGAAACTGAT-3′
MgCRT-lab-R-T7	5′-TAATACGACTCACTATAGGGTTGCTTCATCAATACTGTCCGTC-3′
		MgCRT-lab-F-T7	5′-TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGGAACTGGAAACTGAT-3′
MgCRT-lab-R	5′-TTGCTTCATCAATACTGTCCGTC-3′

以第一链cDNA为模板，按照Roche杂交试剂盒要求，进行不对称PCR合成杂交探针。探针PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.2％凝胶电泳检测后，-80℃储存，备用。

收集不同龄期新鲜的线虫，用2％的多聚甲醛溶液浸48℃泡16h，室温固定处理4h；用LysisBuffer、蛋白酶K、甲醛、丙酮等溶液，对线虫进行消化和通透处理；用杂交液重悬虫体，将预处理的线虫分别与标记好的正/反义链探针杂交，37℃黑暗处理16h，进行显色反应(显色抗体选用带FITC的抗体)，最后用0.01％吐温20停止染色；用LEICA DM5000显微镜观察、拍照。

所得结果如图2，反义链探针杂交处理的线虫，在亚腹食道腺附近显色，说明该基因在拟禾本科根结线虫亚腹食道腺中表达。

实施例6：MgCRT基因RNA干扰分析

采用南京诺唯赞的T7 RNAi Transcription Kit试剂盒进行dsRNA体外转录合成。根据MgCRT基因序列，设计引物：

MgCRT-p F(5′-ATTGACTGCGGTGGTGGTT-3′)和MgCRT-T7 R(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGTTCATCGTCCACTTTGTATTC-3′)，引物MgCRT-p R(5′-GTTCATCGTCCACTTTGTATTC-3′)和MgCRT-T7 F(5′-TAATACGACTCACTATAGGGATTGACTGCGGTGGTGGTT-3′)，根据试剂盒说明书，以cDNA为模板，分别进行正义链ssRNA及反义链ssRNA的PCR合成。随后，将上述ssRNA PCR产物按1∶1混合，94℃解链处理10min，冷却至25℃退火合成dsRNA。凝胶电泳检测合成的dsRNA质量。所合成dsRNA包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

采用体外浸泡dsRNA法，对MgCRT基因进行RNAi沉默处理：将拟禾本科根结线虫幼虫用DEPC-H₂O清洗3次，离心后吸取10μL线虫悬浮液，浸泡至40μL的dsRNA溶液(终质量浓度为3μg/μL)中。用移液枪轻轻混匀后，置于25℃、200r/min条件下浸泡处理24h(室温黑暗条件下旋转培养24h)后，洗涤后接种水稻，每株水稻接种150条处理的二龄幼虫，重复4次，将同等数量的线虫浸泡至40μL ddH₂O中，作对照组。接种50h后，分别记录水稻根部二龄幼虫(J2)和根结(knot)个数，取平均值绘制图表。

所得结果如图3，图中dsRNA-crt为对MgCRT基因进行dsRNA沉默处理组，CK为对照组，knot表示拟禾本科根结线虫根结，J2为拟禾本科根结线虫二龄幼虫，可以发现，对MgCRT基因沉默后，侵染水稻的线虫的根结和幼虫数量均显著减少，表明MgCRT基因的表达蛋白在拟禾本科根结线虫侵染寄主过程中发挥重要作用。也表明使用RNA干扰技术沉默MgCRT基因作为防治拟禾本科根结线虫侵染水稻的方法是非常有效的。

序列表

<110> 苏州市外来有害生物防控技术中心

<120> 一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因及其应用

<130> 100

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1715

<212> DNA

<213> Meloidogyne graminicola

<400> 1

ccctatttga gatattaaat aatattttaa ttcaaatttt tattgtttat ttttcaacga 60

agattaagaa tggccgaaag gttttctctt ctatcaacac tgcttattgc aggctttttg 120

accttcacgt acggggaagt tttcttcaag gaggaattca cagatgagtc atgggttgat 180

cgatgggttc aatctaaaca taagagcgac tacggaaaat ttgaactttc tcatgggaaa 240

ttttttgggg acaaggaacg cgatcaagga cttaaaactt ctcaagatgc tcgcttctac 300

agcatttctg ctaaattccc tgagaaattt agcaacaaag gaaaaacatt agtagtccaa 360

tttaccatta aacatgaaca ggatattgac tgcggtggtg gttatcttaa gctaatggcc 420

tcaactatta accaagaaga ctttcatgga gaaacccctt accatttaat gtttggcccg 480

gacatttgcg gacctggaac gaagaaggtt catgttatca tcaactacaa aggaaagaac 540

aatcttatta aaaaagacat tcgatgcaag gatgatgtgc ttacacacct ctatactctg 600

atcctcaacc cagacaatac ttatgaagtt caaattgatg gcgaaaaggc agaaagtggg 660

gaactggaaa ctgattggga gttgttgcct gaaaagaaaa ttaaagatcc tgatgccaaa 720

aagcctgacg attgggatga gaccgagtat atagacgatc ctgaggataa aaaaccagaa 780

gactgggact ccacacctga gacgattcct gatccagatg caaaaaagcc tgaggactgg 840

gatgacgaaa tggacggcga atgggaggca ccaaaaattg ataatccgaa ttataaagga 900

gaatttaaac caaagcagat caaaaatcca aattataaag gcaaatggat tcatcctgaa 960

attgacaatc cggaatacaa agtggacgat gaactctata tgcgtgatga ttggggtgct 1020

gttggtattg atatttggca ggttaaatcc ggttctatct ttgacaatat tatcgtgacg 1080

gacagtattg atgaagcaaa gtctcatgca aaagaaacat ttgaaccatt acgcgatgct 1140

gagaaaaaac agaaagaagc tgctgatgag gaggagagga agaagtttga agaggaagag 1200

aagaaacgta aggaggagga agaatcaaaa aagaaagacg aggataaaga agatgaggac 1260

gaagaggaaa aggaaggagg tgaaaagaag gaggaagatg agcatgatga gctttaagga 1320

aggtgtgtaa taaaaacgtt cacttttctt ctaataaaaa atatattatg gggactctgc 1380

cggcaccttt tctttgtttt ttgtgggttt tttctctttt ttaggtaatg atatttttta 1440

atcgtcattt aaatattaaa tttatttgtt ctctcctccc taccaaatac cgcacttttt 1500

gactataatt ggttttaaat tattttttgc ttaaaataat tgtgtcttca ttattttttg 1560

ttttgttttt ccttaattcg cgctatactt ttttctttta ttatcggctt ctttgtttct 1620

gaagctcata attaaagaaa aaaatggaat atttttgtct tttatttaaa ataaatttgt 1680

tatttcttca aaaaaaaaaa gaaaaaaaaa caaaa 1715

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> Meloidogyne graminicola

<400> 2

Met Ala Glu Arg Phe Ser Leu Leu Ser Thr Leu Leu Ile Ala Gly Phe

1 5 10 15

Leu Thr Phe Thr Tyr Gly Glu Val Phe Phe Lys Glu Glu Phe Thr Asp

20 25 30

Glu Ser Trp Val Asp Arg Trp Val Gln Ser Lys His Lys Ser Asp Tyr

35 40 45

Gly Lys Phe Glu Leu Ser His Gly Lys Phe Phe Gly Asp Lys Glu Arg

50 55 60

Asp Gln Gly Leu Lys Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ser Ile Ser

65 70 75 80

Ala Lys Phe Pro Glu Lys Phe Ser Asn Lys Gly Lys Thr Leu Val Val

85 90 95

Gln Phe Thr Ile Lys His Glu Gln Asp Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr

100 105 110

Leu Lys Leu Met Ala Ser Thr Ile Asn Gln Glu Asp Phe His Gly Glu

115 120 125

Thr Pro Tyr His Leu Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr

130 135 140

Lys Lys Val His Val Ile Ile Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Asn Leu Ile

145 150 155 160

Lys Lys Asp Ile Arg Cys Lys Asp Asp Val Leu Thr His Leu Tyr Thr

165 170 175

Leu Ile Leu Asn Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Gln Ile Asp Gly Glu

180 185 190

Lys Ala Glu Ser Gly Glu Leu Glu Thr Asp Trp Glu Leu Leu Pro Glu

195 200 205

Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Asp Asp Trp Asp Glu

210 215 220

Thr Glu Tyr Ile Asp Asp Pro Glu Asp Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp

225 230 235 240

Ser Thr Pro Glu Thr Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp

245 250 255

Trp Asp Asp Glu Met Asp Gly Glu Trp Glu Ala Pro Lys Ile Asp Asn

260 265 270

Pro Asn Tyr Lys Gly Glu Phe Lys Pro Lys Gln Ile Lys Asn Pro Asn

275 280 285

Tyr Lys Gly Lys Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Lys

290 295 300

Val Asp Asp Glu Leu Tyr Met Arg Asp Asp Trp Gly Ala Val Gly Ile

305 310 315 320

Asp Ile Trp Gln Val Lys Ser Gly Ser Ile Phe Asp Asn Ile Ile Val

325 330 335

Thr Asp Ser Ile Asp Glu Ala Lys Ser His Ala Lys Glu Thr Phe Glu

340 345 350

Pro Leu Arg Asp Ala Glu Lys Lys Gln Lys Glu Ala Ala Asp Glu Glu

355 360 365

Glu Arg Lys Lys Phe Glu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu

370 375 380

Glu Ser Lys Lys Lys Asp Glu Asp Lys Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu

385 390 395 400

Lys Glu Gly Gly Glu Lys Lys Glu Glu Asp Glu His Asp Glu Leu

405 410 415

<210> 3

<211> 610

<212> RNA

<213> ds RNA F(Artificial)

<400> 3

auugacugcg guggugguua ucuuaagcua auggccucaa cuauuaacca agaagacuuu 60

cauggagaaa ccccuuacca uuuaauguuu ggcccggaca uuugcggacc uggaacgaag 120

aagguucaug uuaucaucaa cuacaaagga aagaacaauc uuauuaaaaa agacauucga 180

ugcaaggaug augugcuuac acaccucuau acucugaucc ucaacccaga caauacuuau 240

gaaguucaaa uugauggcga aaaggcagaa aguggggaac uggaaacuga uugggaguug 300

uugccugaaa agaaaauuaa agauccugau gccaaaaagc cugacgauug ggaugagacc 360

gaguauauag acgauccuga ggauaaaaaa ccagaagacu gggacuccac accugagacg 420

auuccugauc cagaugcaaa aaagccugag gacugggaug acgaaaugga cggcgaaugg 480

gaggcaccaa aaauugauaa uccgaauuau aaaggagaau uuaaaccaaa gcagaucaaa 540

aauccaaauu auaaaggcaa auggauucau ccugaaauug acaauccgga auacaaagug 600

gacgaugaac 610

<210> 4

<211> 610

<212> RNA

<213> dsRNA R(Artificial)

<400> 4

guucaucguc cacuuuguau uccggauugu caauuucagg augaauccau uugccuuuau 60

aauuuggauu uuugaucugc uuugguuuaa auucuccuuu auaauucgga uuaucaauuu 120

uuggugccuc ccauucgccg uccauuucgu caucccaguc cucaggcuuu uuugcaucug 180

gaucaggaau cgucucaggu guggaguccc agucuucugg uuuuuuaucc ucaggaucgu 240

cuauauacuc ggucucaucc caaucgucag gcuuuuuggc aucaggaucu uuaauuuucu 300

uuucaggcaa caacucccaa ucaguuucca guuccccacu uucugccuuu ucgccaucaa 360

uuugaacuuc auaaguauug ucuggguuga ggaucagagu auagaggugu guaagcacau 420

cauccuugca ucgaaugucu uuuuuaauaa gauuguucuu uccuuuguag uugaugauaa 480

caugaaccuu cuucguucca gguccgcaaa uguccgggcc aaacauuaaa ugguaagggg 540

uuucuccaug aaagucuucu ugguuaauag uugaggccau uagcuuaaga uaaccaccac 600

cgcagucaau 610

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Mgcrt-F-57(Artificial)

<400> 5

acgaagatta agaatggccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Mgcrt-R-656(Artificial)

<400> 6

ctttctgcct tttcgccatc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Mgcrt-ORF-F(Artificial)

<400> 7

tctaaacata agagcgacta cgg 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Mgcrt-ORF-R(Artificial)

<400> 8

gtgcggtatt tggtagggag 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Mgcrt-R3'(Artificial)

<400> 9

acatttgcgg acctggaac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> MgCRT-lab-F(Artificial)

<400> 10

gtggggaact ggaaactgat 20

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> MgCRT-lab-R-T7(Artificial)

<400> 11

taatacgact cactataggg ttgcttcatc aatactgtcc gtc 43

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> MgCRT-lab-F-T7(Artificial)

<400> 12

taatacgact cactataggg gtggggaact ggaaactgat 40

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> MgCRT-lab-R(Artificial)

<400> 13

ttgcttcatc aatactgtcc gtc 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> MgCRT-p F(Artificial)

<400> 14

attgactgcg gtggtggtt 19

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> MgCRT-T7 R(Artificial)

<400> 15

taatacgact cactataggg gttcatcgtc cactttgtat tc 42

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> MgCRT-p R(Artificial)

<400> 16

gttcatcgtc cactttgtat tc 22

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> MgCRT-T7 F(Artificial)

<400> 17

taatacgact cactataggg attgactgcg gtggtggtt 39

Claims

1.一种拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.权利要求1所述的拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因在阻止拟禾本科根结线虫侵染水稻中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因作为靶标，使用小分子RNA干扰其表达。

5.一种靶向权利要求1所述的拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA，所述的dsRNA包括正义链和反义链，所述的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.权利要求5所述的所述靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA在阻止拟禾本科根结线虫侵染水稻中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法是使拟禾本科根结线虫浸泡于所述靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA的溶液中。

8.制备权利要求5所述的所述靶向拟禾本科根结线虫钙网蛋白基因的dsRNA引物：

MgCRT-p F：5′-ATTGACTGCGGTGGTGGTT-3′，

MgCRT-T7 R：

5′-TAATACGACTCACTATAGGGGTTCATCGTCCACTTTGTATTC-3′，

MgCRT-p R：5′–GTTCATCGTCCACTTTGTATTC-3′，

MgCRT-T7 F：

5′-TAATACGACTCACTATAGGGATTGACTGCGGTGGTGGTT-3′。