CN113801213A - 一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其防治病害的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其应用。MgBTF3是根结线虫上克隆到的首个转录因子类型的效应蛋白，其特异性的表达于线虫效应蛋白分泌器官头感器，在线虫侵染过程中分泌到寄主植物中。实验表明，降低MgBTF3在线虫侵染过程中的转录水平，会导致线虫侵染力显著下降。同时，MgBTF3在水稻上过表达，能够显著提高线虫的侵染力。敲除寄主水稻内源OsBTF3，线虫感染水稻能力的下降，而互补实验证明MgBTF3与水稻OsBTF3具有相似的功能。本发明MgBTF3的研究揭示了根结线虫效应蛋白抑制寄主免疫反应的一种新策略：通过模拟寄主的內源蛋白来调控寄主的免疫系统。所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及对应的水稻内源OsBTF3在拟禾本科根结线虫的防控方面具有重要的应用价值与前景。

Description

一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其防治病害的应用

技术领域

本发明属于植物病害防治技术领域。更具体地，涉及一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其防治病害的应用。

背景技术

根结线虫是一类重要的植物病原物，如拟禾本科根结线虫(Meloidogynegraminicola)是水稻根内的重要寄生线虫，对水稻造成严重的经济损失。

研究显示，根结线虫效应蛋白在线虫寄生过程能够被分泌到寄主组织中，从而调控寄主细胞的生理代谢和免疫系统来增强线虫致病力。如中国专利 CN108611352B发明公布了一种拟禾本科根结线虫翻译延长因子Mg-eEF1A，其能够被拟禾本科根结线虫分泌到体外，在植物寄生线虫侵染的过程中能够激活寄主的免疫系统，诱导水稻的基础免疫反应和对病原物的抗病性，激活水稻的PTI 免疫反应，比如病程相关基因的表达、胼胝质的积累、MAP激酶磷酸化，增强水稻对拟禾本科根结线虫和稻瘟菌的抗性，可应用于培育抗根结线虫植物方面，并为植物寄生线虫的防控开启一条具有巨大潜力的方向和策略。

在植物病原物中，研究人员已经发现许多病原物的效应蛋白能直接调控寄主细胞内基因的转录水平。在植物寄生线虫中，国内外的研究也大量报道线虫寄生植物过程中能够对寄主细胞进行转录调控，但是，在植物寄生线虫上转录因子类型的效应蛋白一直未被发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3，并探究其与线虫侵染过程的关联性。MgBTF3是根结线虫上首个报道的转录因子类型的效应蛋白，填补了植物寄生线虫效应蛋白在这一方面的研究空白。

本发明目的是提供一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3。

本发明另一目的是提供一种拟禾本科根结线虫转录因子编码基因Mgbtf3。

本发明再一目的是提供所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其编码基因在拟禾本科根结线虫防控方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从拟禾本科根结线虫中获得一个转录因子类型的效应蛋白MgBTF3，虫体原位杂交证明了MgBTF3特异性的表达于线虫效应蛋白分泌器官头感器。同时，通过荧光免疫组织方法证明了MgBTF3在线虫侵染过程中分泌到寄主植物中。采用植物介导的amiRNA技术降低MgBTF3在线虫侵染过程中的转录水平，导致线虫侵染力显著下降。同时，MgBTF3在水稻上的过表达，能够显著提高线虫的侵染力。进一步通过CRISPR-Cas9技术敲除技术寄主水稻内源OsBTF3，线虫感染水稻能力的下降，而互补实验证明MgBTF3与水稻OsBTF3具有相似的功能。最后，采用烟草瞬时表达系统，证明了MgBTF3能够有效抑制植物基础免疫反应。MgBTF3的研究揭示了根结线虫效应蛋白抑制寄主免疫反应的策略：通过模拟寄主的內源蛋白来调控寄主的免疫系统。

因此，本发明提供了一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

以及所述拟禾本科根结线虫转录因子的编码基因Mgbtf3，其核苷酸序列如 SEQID NO.1所示。

SEQ ID NO.1(拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3编码基因)：

ATGAATCCTGAAAAAATTAAGAAGCTTCAACAAAATGCTGAGCATGT GCGTACCGGTGGCAAAGGAACAGCCCGACGGAAGAAGAAGGTAGTACAT AAAACAACAGCCTTGGATGACAAAAAGTTACAGAGTAACCTTAAGAAACT TTCTGTTACAAACATTCCTGGCATCGAAGAAGTTAATATGATCAAGGAGG ATGGTACTGTTATTCATTTCAATAACCCGAAAGTTCAAGCTTCTGTTCCAG CAAATACGTTCTCTATCACTGGGACTGCTGAGAATAAGCGTATAACTGAT ATGCTTCCGGGTATTTTAAATCAATTGGGAGCGGAATCTCTTGCTCACTTG AAGAAATTGGCCAACAACGTGACAACTCAATACAAACCATCAGATGATGA TGTTCCAGATTTGGTTGGCGATTTTGAGGAAGCGTCAAAGAATGAAACTA AAGAAGTTCAACCGCACCAGCAACGCATAGAGGGCGAGTTATAA

SEQ ID NO.2(拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3)：

MNPEKIKKLQQNAEHVRTGGKGTARRKKKVVHKTTALDDKKLQSNLK KLSVTNIPGIEEVNMIKEDGTVIHFNNPKVQASVPANTFSITGTAENKRITDML PGILNQLGAESLAHLKKLANNVTTQYKPSDDDVPDLVGDFEEASKNETKEVQ PHQQRIEGEL

基于上述研究结果，所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其编码基因与拟禾本科根结线虫侵染植物过程有密切的关系，可以用于开发培育抗拟禾本科根结线虫植物。

因此本发明还提供：

所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3或其编码基因Mgbtf3在防控拟禾本科根结线虫方面的应用。

所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3或其编码基因Mgbtf3在制备拟禾本科根结线虫防控药剂方面的应用。

能够降低或敲除所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂在防控拟禾本科根结线虫方面的应用。

能够降低或敲除所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂在制备拟禾本科根结线虫防控药剂方面的应用。

有研究显示，外源dsRNA(体表接触如浸泡、或线虫食用)可以实现对线虫內源基因的降低或沉默或敲除。因此，作为一种可选择的实施方案，能够降低或敲除所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂可为dsRNA。

另外，与所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3所对应的水稻内源 OsBTF3，研究显示，通过敲除寄主水稻内源OsBTF3，水稻抗线虫能力得到显著提升。

因此本发明还提供水稻內源基因OsBTF3在防控拟禾本科根结线虫方面的应用，或在培育抗拟禾本科根结线虫水稻方面的应用。应用方法可为降低或敲除水稻內源基因OsBTF3的表达。

基于上述内容，本发明可提供一种可用于防控水稻拟禾本科根结线虫病害的试剂盒，包括以下(1)和/或(2)的组分：

(1)能够降低或敲除所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂；

(2)能够降低或敲除水稻內源基因OsBTF3的表达的试剂。

基于此试剂盒，可以开发防控水稻拟禾本科根结线虫病害的方法，包括：利用能够降低或敲除水稻內源基因OsBTF3的表达的试剂构建抗拟禾本科根结线虫水稻。或利用能够降低或敲除所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂作为药物，进行施药。或两者配合。

上述降低或敲除基因表达水平/转录水平的技术可采用现有技术当中具有此作用的现有技术体系，比如植物介导的amiRNA技术、CRISPR-Cas9技术等等。

作为一种可选择的实施方案，所述能够降低或敲除拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3编码基因转录水平的试剂为含有MgBTF3220-240的amiRNA片段。

作为一种可选择的实施方案，所述能够降低或敲除水稻內源基因OsBTF3表达的试剂为CRISPR-Cas9技术所需试剂，包括gRNA(其序列为SEQ ID NO.3所示：CCAATTGAAGCTTGCACTTTAGG)。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其防治病害的应用：

1.在植物病原物中，已经发现许多病原物的效应蛋白能直接调控寄主细胞内基因的转录水平。在植物寄生线虫中，国内外的研究也大量报道线虫寄生植物过程中能够对寄主细胞进行转录调控，但是，在植物寄生线虫上转录因子类型的效应蛋白一直未被发现。MgBTF3是根结线虫上首个克隆到的转录因子类型的效应蛋白，填补了植物寄生线虫效应蛋白在这一方面的研究空白。

2.植物寄生线虫效应蛋白的功能研究中，研究人员发现其效应蛋白抑制寄主免疫系统的手段主要通过效应蛋白与寄主防卫系统通路关键蛋白互作，从而抑制免疫相关蛋白的活性和信号传导来增强其致病力。MgBTF3s的研究将初步揭示植物寄生线虫效应蛋白抑制寄主免疫反应新的策略：通过模拟寄主的內源转录因子类型蛋白调控寄主的免疫系统来增强其致病力。

3.MgBTF3是线虫中重要的毒力因子，RNAi沉默线虫的MgBTF3能够显著减少线虫的侵染。MgBTF3有望成为RNAi防治线虫的新靶标。同时，水稻中的 OsBTF3有利于线虫侵染，可能是一个线虫的感病相关基因。通过敲除OsBTF3 能够提高植物的抗线虫能力。

附图说明

图1 MgBTF3的序列分析；MgBTF3的cDNA序列.翻译起始密码子和终止密码子用黑色框格标记。推测的核定位信号用下划线标记。

图2 MgBTF3在拟禾本科根结线虫中的发育表达；A-C：拟禾本科根结线虫侵染前的2龄幼虫固定后分别与正义链探针(左)和反义链探针(右)进行原位杂交。比例尺，20μm。D：RT-qPCR分析MgBTF3在5个不同发育阶段(卵、pre-J2、 par-J2、-J3/J4和雌虫)的表达模式。数据结果采用2^-ΔΔCT来计算mRNA的相对表达水平，以卵的表达水平为基准。实验进行技术性重复和三次生物学重复计算的标准偏差。dpi，线虫侵染后的天数。

图3 MgBTF3重组蛋白和MgBTF3抗血清的特异性验证；A： pET32a-MgBTF3重组蛋白的纯化。考马斯蓝染色的12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析MgBTF3重组蛋白；1，诱导前；2，4度诱导16h；3，28度诱导4h。M，蛋白标准marker。B：在pre-J2s和健康的水稻根的总蛋白中，采用Western blot 分析MgBTF3抗血清的特异性。其中，Mg是侵染前的2龄幼虫的总蛋白，root 是健康的水稻根的总蛋白。

图4 MgBTF3在水稻根部组织切片中的免疫荧光定位；A-C：用MgBTF3特异性抗血清进行免疫荧光定位，结果显示荧光信号在线虫头部和细胞壁周围(箭头)。D-F：用免疫前的兔抗血清替代MgBTF3特异性抗血清进行免疫荧光定位，结果显示没有明显的荧光信号。

图5 MgBTF3在水稻根原生质体的亚细胞定位；A：在原生质体中分别表达 Ubi:MgBTF3:eGFP,Ubi:MgBTF3^Δ1-29:eGFP和Ubi:mCherry蛋白。Ubi: MgBTF3:eGFP和Ubi:mCherry的荧光信号都聚集在细胞质和细胞核中。B： western blotting用于分析Ubi:MgBTF3:eGFP和Ubi:MgBTF3Δ1-29:eGFP蛋白的表达情况。比例尺50μm。

图6 MgBTF3促进拟禾本科根结线虫的寄生；A,MgBTF3过表达水稻的表型分析。MgBTF3过表达水稻的根长，株高和根重与野生型水稻没有显著差异。 B,qRT-PCR检测MgBTF3 mRNA在转基因水稻株系中的表达水平。线虫侵染实验表明，过表达MgBTF3的水稻雌虫数量显著多于野生型植株。实验数据采用 10棵的水稻统计的标准偏差，实验重复三次。*P<0.05；**P<0.01，Student’s t test。OE_11和OE_20，两个水稻转基因株系；WT，野生型株系。C,MgBTF3 RNAi 转基因水稻的表型分析。MgBTF3 RNAi转基因水稻的根长，株高和根重与野生型水稻没有显著差异。D,qRT-PCR检测MgBTF3 RNAi转基因水稻株系中的表达水平。线虫侵染实验表明，MgBTF3 RNAi转基因水稻株系中雌虫数量显著少于野生型植株。实验数据采用10棵的水稻统计的标准偏差，实验重复三次。*P< 0.05；**P<0.01，Student’s ttest。RNAi_22和RNAi_29，两个水稻RNAi转基因株系；WT，野生型株系。E：qRT-PCR分析MgBTF3在侵染RNAi植株、和野生型植株的拟禾本科根结线虫上的转录水平。同时用两个非靶标基因MgMO237 和Mg16593来检测RNAi植株的基因沉默特异性。实验数据使用每个株系的10 棵水稻得到平均值和标准偏差。*P<0.05；**P<0.01，Student’s t test。RNAi_22和RNAi_29，两个水稻RNAi转基因株系；WT，野生型株系。

图7 MgBTF3抑制植物的基础免疫；MgBTF3抑制flg22诱导的烟草ROS产生。携带有MgBTF3，Flag tag载体(EV)的GV3101的农杆菌注射4周的烟草叶片。注射48h后，取注射位点附件的叶盘，使用flg22诱导ROS产生。实验数据采用9个叶盘的平均值和标准偏差。实验重复三次，得到三次相似的结果。

图8 OsBTF3与MgBTF3促进拟禾本科根结线虫的寄生；A,qRT-PCR检测OsBTF3突变以及MgBTF3互补水稻植株中OsBTF3和MgBTF3的表达水平。 B,OsBTF3突变以及MgBTF3互补水稻植株的表型分析。C,线虫侵染实验表明， OsBTF3突变水稻植株中的雌虫数显著低于野生型。同时，MgBTF3互补水稻植株中的雌虫数量与野生型没有显著差别。实验数据采用10棵的水稻统计的标准偏差，实验重复三次。*P<0.05；**P<0.01，Student’s t test。M_12和M_12，两个水稻OsBTF3突变株系；MO_23和MO_28，两个水稻MgBTF3互补突变株系；WT，野生型株系。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 MgBTF3基因的克隆和序列分析

基于南方根结线虫分泌蛋白组和拟禾本科根结线虫基因组，通过同源克隆技术，从拟禾本科根结线虫中扩增得到MgBTF3全长cDNA基因序列(图1)。 MgBTF3全长cDNA序列含有一个492bp的开放阅读框，编码163aa，大小为 18kDa。使用SignalP，发现MgBTF3蛋白在N端不含有典型的分泌信号肽。进一步通过非经典分泌蛋白预测SecretomeP 2.0软件，结果显示，BTF3可能是一个非典型信号肽分泌蛋白。同时，TMHMM 2.0在线预测跨膜结构域显示，MgBTF3不具有跨膜结构域。

实施例2 MgBTF3基因特异性的在线虫的头感器表达，同时在取食位点形成阶段表达最高

本研究采用原位杂交技术确定MgBTF3基因在拟禾本科根结线虫中的表达位置。结果显示，MgBTF3正义链探针在虫体上没有观察到明显的信号出现(图 2A)。相反，反义链探针在2龄幼虫的头感器部位有明显的杂交信号(图2B-2C)，说明MgBTF3在拟禾本科根结线虫的头感器部位特异性的表达。

使用实时荧光定量qRT-PCR对MgBTF3基因的发育表达情况进行分析。本实验选取拟禾本科根结线虫生活史的5个阶段：卵、侵染前的2龄幼虫(pre-J2s)、寄生阶段的2龄虫体(par-J2s)、3和4龄虫体(par-J3s/J4s)以及成熟的雌虫 (female)。实验结果的数据分析以卵阶段转录水平作为基准，采用2-ΔΔCT的方法。结果表明，在线虫侵染后5到10天的par-J3s阶段的MgBTF3转录水平最高 (图2D)。在线虫侵染10天后，MgGPP转录水平急剧下降，在雌虫阶段最低(图 2D)。

综合以上实验结果，说明MgBTF3可能是一个与线虫寄生相关基因，在线虫取食位点形成阶段起到重要的作用。

实施例3 MgBTF3抗血清的获得及特异性检测

本研究通过原核表达方法，得到符合制备多克隆抗血清的MgBTF3免疫原蛋白(图3A)。采用免疫新西兰大白兔的方法，得到MgBTF3的多克隆抗血清。提取pre-J2s和健康水稻根的总蛋白，通过western blot验证MgBTF3抗血清的特异性。Western blot结果表明，MgBTF3抗血清在pre-J2s的总蛋白中有一条特异的大约28kDa的杂交条带，比预期的MgBTF3蛋白的分子量(18kDa)大10kDa。相反，MgBTF3抗血清在健康水稻根的总蛋白中没有杂交信号出现。综合结果表明，MgBTF3多克隆抗血清能特异性的识别线虫中的MgBTF3蛋白，与水稻根部的总蛋白没有非特异性信号。推测MgBTF3可能在线虫中发生蛋白修饰，导致蛋白的分子量增大。

用上述获得的MgBTF3抗血清进行拟禾本科根结线虫侵染部位病理切片的荧光免疫组化来研究MgBTF3在植物组织中的分泌特性。选取线虫侵染早期阶段的水稻根结部位，经过包埋、切片、脱蜡和抗体孵育等步骤后在荧光显微镜下观察。在一些切片中，则观察到在线虫的头部以及头部周围观察到明显的荧光信号(图4A-C)。作为实验对照，用免疫前的兔抗血清替代MgBTF3抗血清，所有处理的切片中都没有荧光信号的出现(图4D-F)。这些结果表明，在线虫寄生的过程中，MgBTF3可能被线虫分泌到植物组织中。

实施例4 MgBTF3蛋白在水稻细胞中的定位分析

本研究通过水稻原生质体的瞬时表达系统，研究MgBTF3蛋白在寄主水稻细胞内的定位情况。构建MgBTF3和MgBTF3^Δ1-29编码序列与加强型的GFP荧光蛋白(eGFP)融合载体MgBTF3:eGFP转化水稻原生质体(图5)。通过PEG 的转化方法，把这些融合蛋白载体分别与mCherry质粒分别转化到水稻原生质体中。结果发现在水稻细胞的细胞质和细胞核都有明显的荧光信号。这个结果与 mCherry单独定位的情况一致(图5)。进一步确认原生质体细胞质蛋白表达情况，提取细胞的总蛋白，用western blot进行验证。结果发现在Ubi:MgBTF3:eGFP, Ubi:MgBTF3Δ1-29:eGFP的表达细胞蛋白中有一条特异的55kDa和52kDa大小条带(图5)。同样，融合蛋白与预期的蛋白分子量大了10kDa。推测MgBTF3:eGFP 和MgBTF3^Δ1-29:eGFP融合蛋白在水稻细胞内也发生修饰作用。

实施例5 MgBTF3提高拟禾本科根结线虫致病力

为了确定拟禾本科根结线虫效应蛋白MgBTF3在线虫寄生过程中的作用，本研究通过基因转化技术在水稻中过表达MgBTF3。通过qRT-PCR的方法筛选出2个高表达的转基因株系(OE-11和OE-20)。表型分析显示，过表达MgBTF3 株系与野生型对照植株WT没有明显的差异(图6A)。过表达MgBTF3水稻接种拟禾本科根结线虫15天后，植株中的雌虫数量显著多于野生型转基因植株，平均增加了30.9％和43.0％的雌虫数(图6B)。该结果表明拟禾本科根结线虫效应蛋白MgBTF3能够增强线虫对寄主的敏感性。

采用in planta RNAi的方法研究MgBTF3基因沉默后，线虫的寄生能力是否发生影响。通过转基因技术把含有MgBTF3220-240的amiRNA片段在水稻中进行转录，从而通过线虫取食进入线虫体内沉默MgBTF3的转录水平。经过 qRT-PCR的筛选，获得2个高表达的的株系(RNAi_22和RNAi_29)。表型观察表明转基因株系与野生型对照株系WT没有明显差异(图6C)。拟禾本科根结线虫侵染高表达的MgBTF3^220-240amiRNA植株的实验结果显示，相比于野生型植株，RNAi转基因株系中的雌虫数量明显减少，每个株系平均减少38.0％-23.1％ (图6D)。为进一步验证RNAi转基因水稻线虫侵染数量的下降与MgBTF3的表达相关，本研究收集了侵染7天后的线虫，用两个发育表达水平与MgBTF3相似的非靶标基因MgMO237和Mg16593作为RNAi特异性检测。实验结果表明，相比于野生型植株，RNAi株系中的线虫MgBTF3表达水平急剧下降，而对照基因没有显著变化(图6E)。这些结果表明，拟禾本科根结线虫效应蛋白MgBTF3 在线虫的寄生过程具有重要的作用。

实施例6 MgBTF3抑制寄主基础免疫

植物寄生线虫效应蛋白能够与寄主防卫相关因子互作，从而抑制寄主的免疫系统促进寄生。这促使我们进一步研究MgBTF3是否能够抑制寄主的免疫系统。植物的免疫反应具有多种途径，其中活性氧的产生是这些防卫反应中的基础。本实验使用细菌鞭毛蛋白flg22作为激发子来诱导植物的PTI反应。通过在烟草上瞬时表达了35S:MgBTF3:Flag融合蛋白，2天后取注射点附近的叶盘，用flg22 处理来诱导活性氧的产生。实验结果表明，表达MgBTF3:Flag的叶片能够显著抑制flg22激发的活性氧(图7)。这些实验结果表明，拟禾本科根结线虫的效应蛋白MgBTF3能够抑制植物的基础免疫。

实施例7 MgBTF3与水稻同源基因OsBTF3在线虫寄生过程具有相同的功能

为研究水稻同源基因OsBTF3在线虫侵染过程中是否与MgBTF3具有相同功能，我们通过基因编辑技术(CRISPR-Cas9技术，所用gRNA为 CCAATTGAAGCTTGCACTTTAGG，敲除了水稻中的OsBTF3基因，从中得到两个OsBTF3突变株系(M_12和M_15)。并且通过互补实验，在OsBTF3缺失的水稻株系中进行MgBTF3的过表达，得到两个互补植株(MO_23和MO_28)。 qRT-PCR的结果表明，OsBTF3突变和互补的水稻中的OsBTF3 mRNA转录水平显著下降，而在互补植株中的能够检测到表达MgBTF3的表达(图8A)。表型分析显示，OsBTF3突变和互补的水稻在植株的根长，株高以及根重方面都显著小于对照野生型植株(图8B)。线虫侵染实验发现，在线虫接种15天后，OsBTF3 突变的水稻雌虫数量显著少于野生型植株，但是，互补植株的雌虫数量与野生型没有显著差异(图8C)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院水稻研究所

<120> 一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3及其防治病害的应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 492

<212> DNA

<213> 拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3编码基因

<400> 1

atgaatcctg aaaaaattaa gaagcttcaa caaaatgctg agcatgtgcg taccggtggc 60

aaaggaacag cccgacggaa gaagaaggta gtacataaaa caacagcctt ggatgacaaa 120

aagttacaga gtaaccttaa gaaactttct gttacaaaca ttcctggcat cgaagaagtt 180

aatatgatca aggaggatgg tactgttatt catttcaata acccgaaagt tcaagcttct 240

gttccagcaa atacgttctc tatcactggg actgctgaga ataagcgtat aactgatatg 300

cttccgggta ttttaaatca attgggagcg gaatctcttg ctcacttgaa gaaattggcc 360

aacaacgtga caactcaata caaaccatca gatgatgatg ttccagattt ggttggcgat 420

tttgaggaag cgtcaaagaa tgaaactaaa gaagttcaac cgcaccagca acgcatagag 480

ggcgagttat aa 492

<210> 2

<211> 163

<212> PRT

<213> 拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3

<400> 2

Met Asn Pro Glu Lys Ile Lys Lys Leu Gln Gln Asn Ala Glu His Val

1 5 10 15

Arg Thr Gly Gly Lys Gly Thr Ala Arg Arg Lys Lys Lys Val Val His

20 25 30

Lys Thr Thr Ala Leu Asp Asp Lys Lys Leu Gln Ser Asn Leu Lys Lys

35 40 45

Leu Ser Val Thr Asn Ile Pro Gly Ile Glu Glu Val Asn Met Ile Lys

50 55 60

Glu Asp Gly Thr Val Ile His Phe Asn Asn Pro Lys Val Gln Ala Ser

65 70 75 80

Val Pro Ala Asn Thr Phe Ser Ile Thr Gly Thr Ala Glu Asn Lys Arg

85 90 95

Ile Thr Asp Met Leu Pro Gly Ile Leu Asn Gln Leu Gly Ala Glu Ser

100 105 110

Leu Ala His Leu Lys Lys Leu Ala Asn Asn Val Thr Thr Gln Tyr Lys

115 120 125

Pro Ser Asp Asp Asp Val Pro Asp Leu Val Gly Asp Phe Glu Glu Ala

130 135 140

Ser Lys Asn Glu Thr Lys Glu Val Gln Pro His Gln Gln Arg Ile Glu

145 150 155 160

Gly Glu Leu

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> gRNA

<400> 3

ccaattgaag cttgcacttt agg 23

Claims (10)

1.一种拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述拟禾本科根结线虫转录因子的编码基因Mgbtf3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3或权利要求2所述编码基因Mgbtf3在防控拟禾本科根结线虫方面的应用。

4.权利要求1所述拟禾本科根结线虫转录因子MgBTF3或权利要求2所述编码基因Mgbtf3在制备拟禾本科根结线虫防控药剂方面的应用。

5.能够降低或敲除权利要求2所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂在防控拟禾本科根结线虫方面的应用。

6.能够降低或敲除权利要求2所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂在制备拟禾本科根结线虫防控药剂方面的应用。

7.水稻內源基因OsBTF3在防控拟禾本科根结线虫方面的应用，或在培育抗拟禾本科根结线虫水稻方面的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，应用方法为降低或敲除水稻內源基因OsBTF3的表达。

9.一种可用于防控水稻拟禾本科根结线虫病害的试剂盒，其特征在于，包括以下(1)和/或(2)的组分：

(1)能够降低或敲除权利要求2所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂；

(2)能够降低或敲除水稻內源基因OsBTF3的表达的试剂。

10.一种防控水稻拟禾本科根结线虫病害的方法，其特征在于，包括以下(1)和/或(2)的步骤：

(1)利用能够降低或敲除权利要求2所述编码基因Mgbtf3转录水平的试剂作为药物，进行施药；

(2)利用能够降低或敲除水稻內源基因OsBTF3的表达的试剂构建抗拟禾本科根结线虫水稻。

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