CN115725687A - 猪源抗菌短肽的筛选法 - Google Patents
猪源抗菌短肽的筛选法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115725687A CN115725687A CN202211221211.9A CN202211221211A CN115725687A CN 115725687 A CN115725687 A CN 115725687A CN 202211221211 A CN202211221211 A CN 202211221211A CN 115725687 A CN115725687 A CN 115725687A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gsdmd
- porcine
- cmv
- xflag
- sumo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 101001026262 Homo sapiens Gasdermin-D Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 102100037388 Gasdermin-D Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 13
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 13
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 13
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 13
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100037387 Gasdermin-A Human genes 0.000 description 1
- 101001026276 Homo sapiens Gasdermin-A Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000056265 human GSDMD Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪源抗菌短肽的筛选及初步验证。本发明公开了一种猪源细菌性疾病的新型抗菌制剂——猪源GSDMD抗菌肽。通过构建以pET‑28a‑SUMO为载体的猪GSDMD‑FL、GSDMD‑N(p30)以及GSDMD截短片段的原核表达质粒，转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，验证猪GSDMD蛋白的杀菌效果并筛选具有抗菌作用的猪GSDMD片段。同时构建相应的以p3×Flag‑CMV‑14为载体的猪GSDMD截短片段真核表达质粒，转染至HEK293T细胞评估截短片段对细胞的毒性影响。最后，通过绘制纯化蛋白抑菌曲线进行其体外杀菌效果的验证。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪源抗菌短肽的筛选及初步验证。
背景技术
对于养猪业来说，细菌性疾病是制约其发展的重要因素，对养猪业造成了重大的经济损失。目前，防控细菌性疾病的主要手段是使用抗生素，但抗生素的长期使用造成了细菌耐药性增加等问题。自相应的全面禁抗措施实施以来，对于非抗生素抗菌药物的研发迫在眉睫。
Gasdermin D(GSDMD)是Gasdermin蛋白家族的成员之一，由N端和C端结构域构成，静止情况下呈自抑制状态。经炎性Caspase-1/4/5/11切割后，形成有较强细胞和细菌毒性的GSDMD-N蛋白。GSDMD-N能够特异性识别并结合磷脂酰肌醇和心磷脂，在生物膜上成孔而引起细胞焦亡，其中细胞焦亡是一种细胞程序性调控的裂解性死亡，是机体的非特异性防御机制之一，以细胞膜成孔、细胞肿胀破裂及细胞内容物外漏为特征。由于磷脂酰肌醇仅存在于真核细胞膜内层，而心磷脂为原核细胞细菌膜的组分之一，故GSDMD-N能够分别从真核细胞膜内和细菌膜外在生物膜上寡聚化形成孔道，从而引起生物膜的裂解和细胞的死亡，已有的试验证明，人源的GSDMD-N具有从胞外杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及李斯特菌等细菌的能力。但由于GSDMD-N的细胞毒性过高，无法获得纯化的GSDMD-N蛋白，故需要进一步筛选具有杀菌能力且对于真核细胞没有明显细胞毒性的GSDMD截短片段。已有研究表明，人源性的GSDMD截短片段在体外具有杀菌作用，但对于猪GSDMD蛋白的抗菌效果及其应用尚未进行发掘。
发明内容
本发明要解决的技术问题是筛选出猪源性的GSDMD抗菌短肽并初步验证其作用，为新型的高效、安全、无耐药性的抗菌制剂研发提供理论基础。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种猪源抗菌短肽的筛选法(猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法)：
构建猪GSDMD的原核表达质粒和猪GSDMD截短片段原核表达质粒；将上述质粒分别转化至BL21 pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD570和OD620测定及菌落平板计数检测获得具有杀菌作用的猪源抗菌短肽。
本发明的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，具体如下：
构建猪的原核表达质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-FL和pET-28a-SUMO-GSDMD-N以及猪的GSDMD截短片段原核表达质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90、；pET-28a-SUMO-GSDMD-70-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-80-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-185-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-205-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-225-245。
将上述8个质粒分别转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD570和OD620测定及菌落平板计数检测到猪GSDMD-N与猪GSDMD-60-90位氨基酸片段具有杀菌作用。
作为本发明的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法的改进：
原核表达质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，转化产物涂于含卡那霉素的平板过夜培养后挑取单菌落小摇进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取新鲜菌液加入含有卡那霉素的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD570＝0.4-0.6。取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜。菌液用于OD值测定、菌落平板计数和SDS-PAGE检测，结果显示，猪GSDMD-N与猪GSDMD-60-90位氨基酸片段具有杀菌作用。
作为本发明的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法的进一步改进：
构建对应的猪的真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL和C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N以及猪的GSDMD截短片段真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-70-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-80-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-185-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-205-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-225-245。
将上述8个质粒分别转染至HEK293T细胞，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h，通过测定培养上清LDH释放量及PI染色检测到猪GSDMD-N细胞毒性强而猪GSDMD-60-90位氨基酸片段细胞毒性小，故筛选到相较于猪GSDMD-N细胞毒性更小但仍具有杀菌作用的猪GSDMD-60-90位氨基酸片段。
作为本发明的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法的进一步改进：
猪的真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N和C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90转染至HEK293T细胞，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h后，细胞超声破碎产物上清经超滤管纯化得到真核细胞纯化蛋白。公司提取的细菌纯化蛋白与自提的真核细胞纯化蛋白分别倍比稀释为不同浓度梯度的纯化蛋白稀释液，以BHI培养基调节对数生长期BL21(DE3)pLysS细菌悬浮液并按照1：1加入纯化蛋白稀释液中，使细菌终浓度为1×106CFU/ml，以空白培养基作为阴性对照，以同倍比稀释的氨苄青霉素(AMP)作为阳性对照。37℃孵育，于不同时间点检测OD570或OD620并绘制抑菌曲线，结果证明，猪GSDMD-60-90位氨基酸片段具有胞外杀菌作用。
作为本发明的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法的进一步改进：
猪GSDMD-60-90位氨基酸碱基序列为：
5’-tccatctgggacatcctggagcccagtgccccggagccagctgtggagcgtggcggccccttctacttccatgacactatggacgggcagctg-3’；
猪GSDMD-60-90位氨基酸蛋白序列为：
5’-SIWDILEPSAPEPAVERGGPFYFHDTMDGQL-3’。
本发明的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，具体包括以下步骤：
1)质粒构建：以pET-28a-SUMO为原核表达载体，以C-p3×Flag-CMV-14为真核表达载体，构建猪GSDMD-FL、GSDMD-N和GSDMD截短片段的原核及真核表达质粒。
2)猪GSDMD-N杀菌作用的验证：猪GSDMD-FL和GSDMD-N真核表达质粒转染至HEK293T细胞中，检测LDH水平和PI染色情况以评估细胞焦亡水平。猪GSDMD-FL和GSDMD-N原核表达质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，于IPTG诱导下表达，测定OD570并进行平板菌落计数，评估GSDMD-FL及GSDMD-N的杀菌效果。
3)猪GSDMD 60-90位氨基酸片段杀菌作用的验证：猪GSDMD-60-90、GSDMD-70-90、GSDMD-80-90、GSDMD-185-245、GSDMD-205-245、GSDMD-225-245原核表达质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，于IPTG诱导下表达，测定OD570并进行平板菌落计数，评估各截短片段杀菌效力。猪GSDMD-60-90、GSDMD-70-90、GSDMD-80-90、GSDMD-185-245、GSDMD-205-245、GSDMD-225-245真核表达质粒转染至HEK293T细胞，通过LDH测定和PI染色检测细胞焦亡水平。
4)猪GSDMD 60-90位氨基酸片段胞外杀菌作用的验证：猪GSDMD 60-90真核表达质粒转染至HEK293T细胞，培养后超声破碎，上清经镍柱超滤管过滤得到真核表达纯化蛋白；原核表达纯化蛋白由公司纯化得到。纯化蛋白梯度稀释后与BL21(DE3)pLysS菌液共培养，测定不同时间点的OD570和OD620，绘制抑菌曲线。
进一步的具体步骤如下：
(1)质粒构建：提取猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞的总RNA，再使用提取出的RNA进行cDNA的反转录合成。以前述cDNA为模板，PCR进行目的片段GSDMD-FL和GSDMD-N的扩增。原核表达载体pET-28a-SUMO和真核表达载体C-p3×Flag-CMV-14使用相应的限制性核酸内切酶BamHI/HindIII和EcoRI/XbaI切割以得到线性化载体。载体与片段纯化后，使用T4连接酶将片段连接至载体，连接产物转化感受态细胞后涂板，次日挑取单菌落摇菌并进行菌液PCR检验质粒构建情况，凝胶电泳得到目标条带的菌液送至公司测序。测序成功的菌液进行大摇扩增，提取质粒备用。猪GSDMD-60-90、GSDMD-70-90、GSDMD-80-90、GSDMD-185-245、GSDMD-205-245、GSDMD-225-245位氨基酸片段的原核及真核质粒的构建由公司完成。
(2)猪GSDMD-N杀菌作用的验证：真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL和C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N转染至HEK293T细胞，37℃、5％CO2条件下培养24h，经LDH检测和PI染色评估细胞焦亡水平。原核表达质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-FL和pET-28a-SUMO-GSDMD-N转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，转化产物涂于含卡那霉素的平板过夜培养，挑取单菌落小摇进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取新鲜菌液加入含有卡那霉素的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD570＝0.4-0.6。取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜。上述菌液用于OD570测定及菌落平板计数，以评估其杀菌能力；提取全菌蛋白，经SDS-PAGE分析，以证明蛋白诱导表达情况。
(3)猪GSDMD 60-90位氨基酸片段杀菌作用的验证：原核表达质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-70-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-80-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-185-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-205-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-225-245转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，转化产物涂于含卡那霉素的平板过夜培养，挑取单菌落小摇进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取新鲜菌液加入含有卡那霉素的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD570＝0.4-0.6。取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜。上述菌液用于OD570测定及菌落平板计数，以评估其杀菌能力；提取全菌蛋白，经SDS-PAGE分析，以证明蛋白诱导表达情况。真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-70-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-80-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-185-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-205-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-225-245转染至HEK293T细胞，37℃、5％CO2条件下培养24h，经LDH检测和PI染色评估细胞焦亡水平。
(4)猪GSDMD 60-90位氨基酸片段胞外杀菌作用的验证：原核表达蛋白由商业公司进行纯化。真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90转染至HEK293T细胞，37℃、5％CO2条件下培养24h，超声破碎细胞，上清使用镍柱超滤得到真核表达纯化蛋白。纯化蛋白梯度稀释为不同浓度，以BHI培养基调节对数生长期BL21(DE3)pLysS细菌悬浮液并按照1：1加入纯化蛋白稀释液中，使细菌终浓度为1×106CFU/ml，以空白培养基作为阴性对照，以同倍比稀释的氨苄青霉素(AMP)作为阳性对照。37℃孵育不同时间，检测OD570或OD620并绘制抑菌曲线。
本发明通过构建猪源性GSDMD-FL、GSDMD-N以及不同位点截短片段的原核及真核表达质粒，证明了猪源性GSDMD-N具有杀菌能力；同时筛选出了猪源性GSDMD 60-90位氨基酸截短片段，相对于猪GSDMD-N而言，在保留其杀菌能力的基础上降低了其细胞毒性，并采用体外试验对该猪源性抗菌短肽的功能进行了验证。此猪源性抗菌短肽的筛选及初步验证，为非耐药性抗菌制剂的研发提供了新的思路与可能性。
综上，本发明公开了一种猪源细菌性疾病的新型抗菌制剂——猪源GSDMD抗菌肽。通过构建以pET-28a-SUMO为载体的猪GSDMD-FL、GSDMD-N(p30)以及GSDMD截短片段的原核表达质粒，转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，验证猪GSDMD蛋白的杀菌效果并筛选具有抗菌作用的猪GSDMD片段。同时构建相应的以p3×Flag-CMV-14为载体的猪GSDMD截短片段真核表达质粒，转染至HEK293T细胞评估截短片段对细胞的毒性影响。最后，通过绘制纯化蛋白抑菌曲线进行其体外杀菌效果的验证。结果显示，猪GSDMD-N蛋白具有明显杀菌作用，但对细胞毒性较大；而猪GSDMD 60-90位氨基酸片段可以有效杀菌且对细胞无显著毒性，纯化后的猪GSDMD 60-90位氨基酸片段也具有一定的体外杀菌效果。猪源性抗菌短肽的筛选，为高效、安全、无耐药性的抗菌制剂研发提供了理论基础。即，本发明对于猪源抗菌短肽的筛选及初步验证能够为禁抗政策下的新型抗菌制剂研发提供思路。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为猪GSDMD-N对细胞焦亡的影响及其杀菌作用；
图1中：
(A)真核质粒转染HEK293T细胞后PI染色；(B)真核质粒转染HEK293T细胞后培养上清LDH释放量检测；(C)原核质粒诱导表达后菌液OD570值；(D，E)原核质粒诱导表达后平板菌落图及计数；(F)SDS-PAGE检测原核质粒诱导表达情况。
图2为猪GSDMD-60-90位氨基酸片段细胞焦亡的影响及其杀菌作用。
图2中：
(A、B)各原核质粒诱导表达后平板菌落及计数；(C)各原核质粒诱导表达后菌液OD570值；(D)诱导原核质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90表达后超声破碎细菌分析目的蛋白为可溶性(上清)或包涵体(沉淀)形式；(E)真核质粒转染HEK293T细胞后PI染色；(F)真核质粒转染HEK293T细胞后培养上清LDH释放量检测。
图3为猪GSDMD-60-90位氨基酸片段的体外杀菌作用。
图3中：
(A)SDS-PAGE检测GSDMD-60-90aa纯化蛋白；(B)原核表达纯化蛋白与AMP于570nm的抑菌曲线；(C)原核表达纯化蛋白与AMP于620nm的抑菌曲线；(D)真核表达纯化蛋白与AMP于570nm的抑菌曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：质粒构建
使用RNA提取试剂盒提取猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞的总RNA，再使用提取出的RNA按照反转录试剂盒说明于PCR仪上进行cDNA的反转录合成。搜索NCBI上猪GSDMD的基因序列，并通过SnapGene和CE Design软件于相应载体及位点进行GSDMD和GSDMD-N的引物设计，设计引物由生工生物工程股份有限公司合成。
所设计的引物具体如下：
pET-28a-SUMO-GSDMD-FL：
上游：5’-agagaacagattggtggatccATGGCATCAGCCTTTGAGAGG-3’
下游：5’-ctcgagtgcggccgcaagcttCTAGCAGAGCTGGCTGAGCC-3’
pET-28a-SUMO-GSDMD-N：
上游：5’-agagaacagattggtggatccATGGCATCAGCCTTTGAGAGG-3’
下游：5’-ctcgagtgcggccgcaagcttCTAGTCTGACTGGAACTTCAGGTGC-3’
C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL：
上游：5’-taagcttgcggccgcgaattcATGGCATCAGCCTTTGAGAGG-3’
下游：5’-gtcagcccgggatcctctagaGCAGAGCTGGCTGAGCCTC-3’
C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N：
上游：5’-taagcttgcggccgcgaattcATGGCATCAGCCTTTGAGAGG-3’
下游：5’-gtcagcccgggatcctctagaGTCTGACTGGAACTTCAGGTGCT-3’
以上述cDNA为模板，根据高保真PCR试剂盒说明进行目的片段扩增。原核表达载体pET-28a-SUMO和真核表达载体p3×Flag-CMV-14使用相应的限制性核酸内切酶BamHI/HindIII和EcoRI/XbaI酶切以得到线性化载体。
使用无缝克隆试剂盒将目的片段插入线性化载体。连接产物转化至
5α感受态细胞进行冰浴30min，42℃热激45s，再冰浴3min，37℃、180rpm摇菌1h、涂板(原核质粒用卡那浓度50μg/ml的平板，真核质粒用氨苄浓度100μg/ml的平板)一系列操作。次日挑取单菌落摇菌并进行菌液PCR检验质粒构建情况，凝胶电泳得到目标条带的菌液送至擎科生物科技有限公司测序(目的片段序列，5’-3’，详见序列表)。测序成功的菌液进行大摇扩增，使用质粒小提中量试剂盒提取质粒并保存。猪GSDMD-60-90、GSDMD-70-90、GSDMD-80-90、GSDMD-185-245、GSDMD-205-245、GSDMD-225-245位氨基酸片段的原核及真核质粒的构建送至生工生物工程股份有限公司完成。
实施例2：猪GSDMD-N杀菌作用的验证
使用VigoFect高效真核转染试剂将真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL和C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N转染至24孔板内生长密度40％-60％的HEK293T细胞，转染前1h更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基。转染后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，5h后更换为新鲜的含2％胎牛血清的DMEM培养液。24h后进行常规的LDH检测和PI染色，如图1的A、B，所得结果显示，转染C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N的细胞PI染色量显著多于转染C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL的细胞，并且转染C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N的细胞LDH释放量显著高于转染C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL的细胞。
因此根据上述结果得知：猪GSDMD-N能够引起细胞焦亡。
原核表达质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-FL和pET-28a-SUMO-GSDMD-N转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，转化产物涂于卡那霉素浓度为50μg/ml的平板，于37℃过夜培养，挑取单菌落小摇进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取新鲜菌液加入卡那霉素浓度为50μg/ml的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD570＝0.4-0.6。取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜。对上述菌液进行OD570测定及菌落平板计数，如图1的C、D、E，所得结果显示，转化pET-28a-SUMO-GSDMD-FL的细菌在IPTG诱导诱导表达后，其OD570值与菌落平板计数较未诱导组无显著变化，而转化pET-28a-SUMO-GSDMD-N的细菌在IPTG诱导诱导表达后，其OD570值与菌落平板计数较未诱导组有显著降低。
上述结果表明猪GSDMD-N能够导致细菌死亡。提取转化pET-28a-SUMO-GSDMD-FL和pET-28a-SUMO-GSDMD-N的细菌的全菌蛋白，经SDS-PAGE分析，如图1的F，转化pET-28a-SUMO-GSDMD-FL的IPTG诱导后的细菌蛋白于70kD左右出现猪GSDMD-FL蛋白条带，因此证明蛋白诱导表达有效，转化pET-28a-SUMO-GSDMD-N的IPTG诱导后的细菌由于GSDMD-N毒性太强经细胞焦亡而释放至上清中而导致其全菌蛋白中不能检到目的条带。
综上，实施例2已证明猪GSDMD-N有杀菌作用，但细胞毒性过强，故需要筛选同样具有杀菌作用但细胞毒性更低的猪GSDMD截短片段。
实施例3：猪GSDMD 60-90位氨基酸片段杀菌作用的验证
猪GSDMD-N的原核截短表达质粒pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-70-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-80-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-185-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-205-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-225-245转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞，转化产物涂于含卡那霉素50μg/ml的平板过夜培养，挑取单菌落小摇进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取新鲜菌液加入含有卡那霉素50μg/ml的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD570＝0.4-0.6。取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜，对上述菌液进行OD570测定及菌落平板计数，如图2的A、B、C，所得结果显示，转化pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90的IPTG诱导后的细菌相较于未诱导细菌其OD570值有显著降低，且菌落平板计数显著减少；
上述结果显示猪GSDMD-60-90位氨基酸片段在诱导表达后具有杀菌能力。提取转化pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90的细菌的全菌蛋白，经SDS-PAGE分析，如图2的D，结果显示转化pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90的细菌在IPTG诱导后GSDMD-60-90位氨基酸表达量显著升高，证明蛋白诱导表达有效，且诱导后的细菌进行超声破碎，GSDMD-60-90位氨基酸在上清中的大量表达保证了猪GSDMD-60-90位氨基酸片段的可溶性表达。
使用VigoFect高效真核转染试剂将真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-70-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-80-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-185-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-205-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-225-245转染至24孔板内生长密度40％-60％的HEK293T细胞，转染前1h更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基。转染后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，5h后更换为新鲜的含2％胎牛血清的DMEM培养液。24h后进行LDH检测和PI染色，如图2的E、F，转染C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90的细胞出现了PI染色阳性但LDH释放量相较于阴性对照组并没有显著升高；
结果表明，猪GSDMD-60-90位氨基酸片段对细胞毒性小但有一定穿孔作用。
综上，实施例3已筛选到具有杀菌作用但细胞毒性更低的GSDMD截短片段，后续进行胞外试验的验证。
实施例4：猪GSDMD 60-90位氨基酸片段胞外杀菌作用的验证
猪GSDMD-60-90位氨基酸原核表达蛋白由武汉天正源生物科技有限公司提取纯化，如图3的A。使用VigoFect高效真核转染试剂将真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90转染至24孔板内生长密度40％-60％的HEK293T细胞，转染前1h更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基。转染后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，5h后更换为新鲜的含2％胎牛血清的DMEM培养液，再于37℃、5％CO2条件下培养，24h后超声破碎细胞，上清使用镍柱超滤得到真核表达纯化蛋白。纯化蛋白以4为梯度稀释为不同浓度的蛋白稀释液，以BHI培养基调节对数生长期BL21(DE3)pLysS细菌悬浮液并按照1：1加入纯化蛋白稀释液中，使细菌终浓度为1×106CFU/ml，以空白培养基作为阴性对照，以同倍比稀释的氨苄青霉素(AMP)作为阳性对照。37℃孵育不同时间，检测OD570或OD620并绘制40、4-3、4-6、4-9四种浓度及阴性对照的抑菌曲线，如图3的B、C、D，猪GSDMD-60-90位氨基酸蛋白于高浓度时能够抑制OD值的升高，具有胞外杀菌作用。
结果表明，猪GSDMD-60-90位氨基酸片段纯化蛋白有一定的胞外杀菌作用。
最后还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.猪源抗菌短肽的筛选法，其特征是：
构建猪GSDMD的原核表达质粒和猪GSDMD截短片段原核表达质粒；将上述质粒分别转化至BL21 pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD570和OD620测定及菌落平板计数检测获得具有杀菌作用的猪源抗菌短肽。
2.根据权利要求1所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：
所述猪GSDMD的原核表达质粒为：pET-28a-SUMO-GSDMD-FL、pET-28a-SUMO-GSDMD-N；
所述猪GSDMD截短片段原核表达质粒为：pET-28a-SUMO-GSDMD-60-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-70-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-80-90、pET-28a-SUMO-GSDMD-185-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-205-245、pET-28a-SUMO-GSDMD-225-245；
将上述8个质粒分别转化至BL21 pLysS感受态细胞，在IPTG诱导下表达，通过OD570和OD620测定及菌落平板计数检测到猪GSDMD-N与猪GSDMD-60-90位氨基酸片段具有杀菌作用。
3.根据权利要求1或2所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：
原核表达质粒转化至BL21 pLysS感受态细胞中，转化产物涂于含卡那霉素的平板过夜培养后挑取单菌落摇菌进行甘油保菌，同时按照1：100的比例取菌液加入含有卡那霉素的BHI培养基中，37℃、180rpm培养至OD570＝0.4-0.6；取其中2ml菌液作为未诱导对比，向剩余菌液中加入终浓度0.5mM的IPTG，15℃、140rpm诱导过夜；菌液用于OD值测定、菌落平板计数和SDS-PAGE检测，结果显示，猪GSDMD-N与猪GSDMD-60-90位氨基酸片段具有杀菌作用。
4.根据权利要求3所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：
构建对应的猪的真核表达质粒和猪GSDMD截短片段真核表达质粒；
所述猪的真核表达质粒为：C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-FL和C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-N；
猪GSDMD截短片段真核表达质粒为：C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-70-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-80-90、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-185-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-205-245、C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-225-245；
将上述8个质粒分别转染至HEK293T细胞，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h，通过测定培养上清LDH释放量及PI染色检测到猪GSDMD-N细胞毒性强而猪GSDMD-60-90位氨基酸片段细胞毒性小，故筛选到相较于猪GSDMD-N细胞毒性更小但仍具有杀菌作用的猪GSDMD-60-90位氨基酸片段。
5.根据权利要求1～4任一所述的猪源抗菌短肽的筛选及初步验证方法，其特征是：
猪的真核表达质粒C-p3×Flag-CMV-14-GSDMD-60-90转染至HEK293T细胞，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h后，细胞超声破碎产物上清经超滤管纯化得到真核细胞纯化蛋白；真核表达纯化后蛋白与纯化的原核表达蛋白分别进行了验证；将纯化的蛋白同倍比稀释为不同浓度梯度的纯化蛋白稀释液，以BHI培养基调节对数生长期BL21 pLysS细菌悬浮液并按照1：1加入纯化蛋白稀释液中，使细菌终浓度为1×106CFU/ml，以空白培养基作为阴性对照，以同倍比稀释的氨苄青霉素作为阳性对照；37℃孵育，于不同时间点检测OD570或OD620并绘制抑菌曲线，结果证明，猪GSDMD-60-90位氨基酸片段具有胞外杀菌作用。
6.利用如权利要求1～5任一方法所得的猪源抗菌短肽，其特征是：
猪GSDMD-60-90位氨基酸碱基序列为：
5’-tccatctgggacatcctggagcccagtgccccggagccagctgtggagcgtggcggccccttctacttccatgacactatggacgggcagctg-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211221211.9A CN115725687B (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 猪源抗菌短肽的筛选法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211221211.9A CN115725687B (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 猪源抗菌短肽的筛选法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115725687A true CN115725687A (zh) | 2023-03-03 |
| CN115725687B CN115725687B (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=85293417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211221211.9A Active CN115725687B (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 猪源抗菌短肽的筛选法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115725687B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117904161A (zh) * | 2024-01-24 | 2024-04-19 | 浙江大学 | 基于根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin构建的细胞表面展示系统及其应用 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000073433A1 (en) * | 1999-05-31 | 2000-12-07 | Novozymes A/S | Screening method for peptides |
| CN1539965A (zh) * | 2002-09-29 | 2004-10-27 | 武汉大学 | 重组昆虫杆状病毒和制备方法及其作为杀虫剂的应用 |
| WO2008084566A1 (ja) * | 2007-01-11 | 2008-07-17 | Research Organization Of Information And Systems | モデルマウス、その製造方法およびその用途 |
| CN101307100A (zh) * | 2007-05-16 | 2008-11-19 | 上海医药工业研究院 | 一种抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和应用 |
| JP2011032236A (ja) * | 2009-08-04 | 2011-02-17 | Dainippon Sumitomo Pharma Co Ltd | 腫瘍血管新生阻害剤 |
| CN102220255A (zh) * | 2010-04-14 | 2011-10-19 | 深圳市圣西马生物技术有限公司 | 一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用 |
| US20120009625A1 (en) * | 2008-07-22 | 2012-01-12 | Peking Sinagri Yin Thai Bio-Technology Co., Ltd. | Secretion expression of antibiotic peptide cad in bacillus subtilis and expression system of recombination bacillus subtilis |
| CN107312080A (zh) * | 2017-07-23 | 2017-11-03 | 复旦大学 | 一种来源于gsdmd蛋白的抗菌肽及其应用 |
| CN109136265A (zh) * | 2018-09-25 | 2019-01-04 | 吉林大学 | Gsdmd-n基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用 |
| CN110283245A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-09-27 | 东北农业大学 | 猪髓源pmap-23衍生抗菌肽及制备方法和应用 |
| CN110734474A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-01-31 | 中山大学 | 一种抗菌肽的筛选方法及其应用 |
| CN111485000A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-04 | 浙江大学 | 猪gsdmd蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法 |
-
2022
- 2022-10-08 CN CN202211221211.9A patent/CN115725687B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000073433A1 (en) * | 1999-05-31 | 2000-12-07 | Novozymes A/S | Screening method for peptides |
| CN1539965A (zh) * | 2002-09-29 | 2004-10-27 | 武汉大学 | 重组昆虫杆状病毒和制备方法及其作为杀虫剂的应用 |
| WO2008084566A1 (ja) * | 2007-01-11 | 2008-07-17 | Research Organization Of Information And Systems | モデルマウス、その製造方法およびその用途 |
| CN101307100A (zh) * | 2007-05-16 | 2008-11-19 | 上海医药工业研究院 | 一种抗菌肽的多肽片段及其核苷酸序列和应用 |
| US20120009625A1 (en) * | 2008-07-22 | 2012-01-12 | Peking Sinagri Yin Thai Bio-Technology Co., Ltd. | Secretion expression of antibiotic peptide cad in bacillus subtilis and expression system of recombination bacillus subtilis |
| JP2011032236A (ja) * | 2009-08-04 | 2011-02-17 | Dainippon Sumitomo Pharma Co Ltd | 腫瘍血管新生阻害剤 |
| CN102220255A (zh) * | 2010-04-14 | 2011-10-19 | 深圳市圣西马生物技术有限公司 | 一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用 |
| CN107312080A (zh) * | 2017-07-23 | 2017-11-03 | 复旦大学 | 一种来源于gsdmd蛋白的抗菌肽及其应用 |
| CN109136265A (zh) * | 2018-09-25 | 2019-01-04 | 吉林大学 | Gsdmd-n基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用 |
| CN110283245A (zh) * | 2019-07-12 | 2019-09-27 | 东北农业大学 | 猪髓源pmap-23衍生抗菌肽及制备方法和应用 |
| CN110734474A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-01-31 | 中山大学 | 一种抗菌肽的筛选方法及其应用 |
| CN111485000A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-04 | 浙江大学 | 猪gsdmd蛋白介导的细胞焦亡模型建立方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SIYUN KUANG等: "Structure insight of GSDMD reveals the basis of GSDMD autoinhibition in cell pyroptosis", PNAS, vol. 114, no. 40, pages 10642 - 10647 * |
| SONG Y 等: "Porcine Gasdermin D Is a Substrate of Caspase-1 and an Executioner of Pyroptosi", FRONT IMMUNOL, pages 1 - 13 * |
| 廖文艳;马得莹;韩宗玺;刘胜旺;: "重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定", 中国预防兽医学报, no. 10, pages 23 - 27 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117904161A (zh) * | 2024-01-24 | 2024-04-19 | 浙江大学 | 基于根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin构建的细胞表面展示系统及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115725687B (zh) | 2023-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113307855B (zh) | 拟穴青蟹抗菌多肽Spampcin56-86及其应用 | |
| CN111172114B (zh) | 一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用 | |
| Meseguer et al. | Mycoplasma pneumoniae: a reduced-genome intracellular bacterial pathogen | |
| CN115725687A (zh) | 猪源抗菌短肽的筛选法 | |
| Li et al. | Mycoplasma hyopneumoniae Mhp597 is a cytotoxicity, inflammation and immunosuppression associated nuclease | |
| CN113583103A (zh) | 一种抗菌肽HeHampⅠ(67-92)及其应用 | |
| CN113088522A (zh) | 一种日本鳗鲡转录因子c-Rel基因启动子及其应用 | |
| Petrova et al. | Inhibition of infection and transmission of HIV-1 and lack of significant impact on the vaginal commensal lactobacilli by carbohydrate-binding agents | |
| Xin-Qin et al. | Expression of IFN-λ1 from Congjiang pigs and its effect on anti-PRRSV proliferation | |
| US20230304023A1 (en) | Bile salts bactosensor and use thereof for diagnostic and therapeutic purposes | |
| Yan et al. | Helicobacter pylori-induced REDD1 modulates Th17 cell responses that contribute to gastritis | |
| Liu et al. | Yersinia ruckeri strain SC09 restrains innate immunity to promote infection process in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) via the type IV secretion system (T4SS) | |
| CN113698464A (zh) | 一种抗菌肽HeHampⅡ-4(63-88)及其应用 | |
| CN112472821B (zh) | 一种蛋白质纳米颗粒用于制备抗vsv病毒产品的用途 | |
| CN108546285B (zh) | 一种抗癌生物活性肽CB1a及其应用 | |
| WO2020082220A1 (zh) | 一种头孢抗性且高表达去乙酰化酶2样蛋白的粪肠球菌及应用 | |
| CN114369158B (zh) | 一种抗新冠病毒的信息菌素及其应用 | |
| Lin et al. | The influence of gene Rv3671c in Mycobacterium bovis to its replication and acid resistance | |
| CN112941088B (zh) | 与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用 | |
| CN117487009B (zh) | 抗鸡pml单克隆抗体及其应用 | |
| CN113957026B (zh) | 一种用于生产重组人IL-1ra的工程菌株及制备方法和应用 | |
| US20240116991A1 (en) | Bile salts bactosensor and use thereof for diagnositc and therapeutic purposes | |
| WO2024051748A1 (zh) | 用于治疗骨关节炎的mRNA及其制备方法与应用 | |
| CN108728417B (zh) | 用于筛选饲料抗生素替代品的方法及其产品 | |
| CN112546239A (zh) | 一种蛋白质纳米颗粒用于制备抗病毒产品的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |