CN110734474A

CN110734474A - 一种抗菌肽的筛选方法及其应用

Info

Publication number: CN110734474A
Application number: CN201911203158.8A
Authority: CN
Inventors: 瞿祥猛; 李至军; 张桂涛
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110734474B

Abstract

本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其涉及一种抗菌肽的筛选方法及其应用。本发明公开了一种抗菌肽的筛选方法，该筛选方法可以针对特定的致病菌快速筛选出具有特异抗性的抗菌肽。该筛选方法中选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的抗菌肽的分子量小，易于通过化学合成方法获得，降低了抗菌肽的生产成本。通过该筛选方法筛选的抗菌肽对致病菌具有较高的杀菌活性，且细胞毒性和溶血毒性低。

Description

一种抗菌肽的筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其涉及一种抗菌肽的筛选方法及其应用。

背景技术

自从1938年青霉素成功产业化后，抗生素的研究和开发进入了一段快速发展时期。抗生素治疗了无数细菌或真菌感染患者，为人类健康做出了巨大的贡献。但随着抗生素的不恰当使用和对抗生素管理的缺位，导致许多细菌对抗生素产生耐药性，从而使得抗生素治疗无效，细菌耐药性已经严重威胁人类健康。中国细菌耐药检测网数据显示2018年上半年国内细菌对抗菌药物的耐药形势仍比较严峻，特别是碳青霉烯类耐药的革兰阴性杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林的凝固酶阴性的葡萄球菌(MRCNS)。现阶段，在全球范围内每年由于耐药性细菌感染导致死亡的人数达到七十万，如果细菌耐药性问题未能得到有效控制，预计到2050年死亡总数将达到三千万人。因此在加速开发新型抗生素的同时，亟需开发具有与传统抗生素作用机制和作用靶点不同的抗菌剂，以期降低耐药性细菌引起严重感染的概率。

抗菌肽(antimicrobial peptide)是大多数生物体具有内源性免疫响应的一类活性生物分子，是一类具有抗菌、抗病毒或者抑制肿瘤等生物活性的多肽。1922年首次发现抗菌肽，但直到20世纪80年代才有较多研究。抗菌肽分子量相对较小，大部分带有正电荷并呈现两性性质。由于抗菌肽抑菌和杀菌的作用机制与抗生素不同，并且作为药物治疗时细菌产生耐药性的概率较低，同时具有广谱的抗菌效果，因此抗菌肽被认为有可能成为新一代的抗菌剂，能有效缓解细菌耐药性带来的威胁。

目前筛选抗菌肽的方法主要有分离天然抗菌肽、源于天然抗菌肽的突变设计、计算机虚拟设计以及随机肽库筛选。发明专利申请CN201310660578.5公开了分离一种天然抗菌肽QHA，由30个氨基酸残基组成，为直链多肽，分子量为3628.5Da，等电点12.61，对多种细菌具有抑菌作用。发明专利申请CN201910487182.2公开了一种人工合成抗菌肽及其设计方法与应用，以天然抗菌肽序列为基础，将天然抗菌体的肽骨架序列反转作为基本骨架序列，再对基本骨架序列和/或经所述基本骨架序列突变得到的多肽序列进行评估分析，筛选出具有抗菌性的人工合成抗菌肽序列。发明专利申请CN201410669038.8通过生物软件对猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列进行空间结构分析，将其39个氨基酸中的3处氨基酸进行突变，获得一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体，使其抗菌效力获得显著提高。

综上，目前抗菌肽的筛选方法存在着以下缺点：1)从自然界分离出的天然抗菌肽，生物活性不高；2)筛选得到的抗菌肽的肽链较长，化学合成的成本较高。

发明内容

本发明提供了一种抗菌肽的筛选方法及其应用，解决了现有的抗菌肽的筛选方法存在着筛选得到的抗菌肽肽链较长，合成成本高和从自然分离出的天然抗菌肽的生物活性不高的问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种抗菌肽的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1：将噬菌体展示随机肽库与致病菌混合，富集与所述致病菌特异性结合的噬菌体并扩增；

步骤2：挑取所述扩增得到的噬菌体中的阳性克隆后进行DNA测序，获得多肽的氨基酸序列后合成所述多肽；

步骤3：通过抗菌实验筛选得到抗菌肽；

所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量少于10个。

本发明提供的抗菌肽的筛选方法可以针对特定的致病菌快速筛选出具有特异抗性的抗菌肽。该筛选方法中选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的抗菌肽的分子量小，易于通过化学合成方法获得，降低了抗菌肽的生产成本。

优选地，所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量为7个。

优选地，所述致病菌为沙门氏菌、淋病奈瑟菌、奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、链球菌属、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的一种或多种。

本发明步骤1中，所述噬菌体展示随机肽库与致病菌混合优选在37度下，250rpm振荡培养至OD600为0.8；

所述将噬菌体展示随机肽库与致病菌混合后，还包括：离心去除未结合的噬菌体后采用洗脱液从致病菌上洗脱下噬菌体；所述洗脱液为酸性缓冲液；所述酸性缓冲液为Gly-HCl。

所述扩增具体为：将富集得到的噬菌体感染大肠杆菌进行培养；所述培养的条件优选为37℃、250rpm振荡培养5h。

本发明步骤2前，还包括：对所述扩增得到的噬菌体重复步骤1 3～5次，优选为5次。

本发明步骤2中，所述挑取所述扩增得到的噬菌体中的阳性克隆具体为：将步骤1噬菌体扩增后的大肠杆菌接种至平板培养基上进行培养，挑取蓝色噬菌斑，得到阳性克隆；

将所述阳性克隆进行DNA测序，从而获得多肽的氨基酸序列，利用化学合成法合成所述多肽，所述合成多肽为D型多肽和L型多肽，本发明实施例筛选的抗菌肽P2为L型。

本发明步骤3中，筛选抗菌肽优选还包括使用细胞毒性实验进行筛选。

优选地，本发明筛选得到的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该抗菌肽对铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌作用。

本发明还提供了上述抗菌肽的筛选方法所筛选的抗菌肽在制备抑制致病菌药物中的应用。

优选地，所述致病菌为金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和/或蜡状芽孢杆菌；

所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述致病菌的浓度为10⁵-10⁶cfu/ml时，所述抗菌肽在所述金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌中的最小抑菌浓度分别为16～32μg/ml、32～64μg/ml、32～64μg/ml、16～32μg/ml、16～32μg/ml，最小杀菌浓度分别为32～256μg/ml、64～256μg/ml、32～256μg/ml、32～256μg/ml。本发明实施例中，所述抗菌肽在所述金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌中的最小抑菌浓度分别为16μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、16μg/ml，最小杀菌浓度分别为32μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、32μg/ml。

本发明中，所述抗菌肽的杀菌时间为20min；

本发明中，所述抗菌肽对细胞具有较低的毒性，浓度不大于256μg/ml时细胞毒性和红细胞溶解活性均较低，安全性较好。

本发明还提供了一种致病菌抑制剂，包括上述抗菌肽的筛选方法所筛选抗菌肽；

所述致病菌为金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌中的一种或多种。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种抗菌肽的筛选方法，该筛选方法可以针对特定的致病菌快速筛选出具有特异抗性的抗菌肽。该筛选方法中选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的抗菌肽的分子量小，易于通过化学合成方法获得，降低了抗菌肽的生产成本。且通过该筛选方法筛选的抗菌肽对致病菌，特别是耐药性致病菌具有较高的杀菌活性，且细胞毒性和溶血毒性低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的筛选的多肽的流程示意图；

图2为本发明实施例1合成的多肽与不同菌株药敏测试结果图；

图3为本发明实施例1筛选得到的抗菌肽最小抑菌浓度和最低杀菌浓度测试结果图；

图4为本发明实施例1筛选得到的抗菌肽的时间-杀菌动力学测试结果图；

图5为本发明实施例1筛选得到的抗菌肽对细胞毒性测试结果图；

图6为本发明实施例1筛选得到的抗菌肽溶血毒性测试结果图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，随机7肽的噬菌体展示肽库购自New England BioLabs；金黄色葡萄球菌ATCC6538、粪肠球菌ATCC29212、铜绿假单胞菌ATCC9027、大肠杆菌CMCC 44102、蜡状芽孢杆菌CMCC63302均购自广东省微生物菌种保藏中心，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300购自上海鲁微科技有限公司；大肠杆菌E.coli ER2738来自New EnglandBioLabs；人胚胎肾细胞(HEK293)来自中国典型培养物保藏中心；噬菌体单链DNA抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；MH培养基购自广东省环凯微生物科技有限公司；LB培养基购自OXOID；氨苄青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，万古霉素购自Sigma。

实施例1噬菌体展示筛选

本实施例利用随机7肽的噬菌体展示肽库，针对金黄色葡萄球菌进行噬菌体展示筛选实验，筛选实验原理见图1，具体操作如下：

(1)取50μl金黄色葡萄球菌甘油菌接种至50ml LB培养基中，于恒温摇床37℃、250转/分钟振荡培养至OD600为0.8左右；

(2)取1支1.5ml离心管，加入1ml含5％BSA的PBS缓冲液，室温下封闭30min，弃去溶液；

(3)取200μl细菌液至1.5ml离心管中，5000rpm离心2min，弃去培养基，细菌沉淀用200μl PBS溶液重悬，取100μl至封闭的离心管中；

(4)取10μl随机7肽噬菌体(2×10¹¹pfu)加入到上述细菌悬液中，室温下振荡混匀30min，使噬菌体与金黄色葡萄球菌充分结合；

(5)噬菌体和细菌混合液8000rpm离心1min，弃去上清未结合的噬菌体；

(6)细菌沉淀用200μl PBS-T溶液洗涤，8000rpm离心1min，弃去上清；

(7)重复步骤6，一共10次，充分洗涤去除与细菌结合较弱的噬菌体，细菌沉淀用100μl Gly-HCl缓冲液重悬洗脱噬菌体，室温下振荡5min，8000rpm离心1min，将上清转移至新的离心管中，加入18μl Tris溶液调节pH至中性；

(8)取100μl步骤7的洗脱液加入至OD600为0.8的大肠杆菌ER2738培养液中，37℃、250rpm培养5h；

(9)将培养液转移至50ml离心管中，9000rpm离心5min，取16ml上清转移至新的50ml离心管，加入4ml 20％PEG/NaCl溶液，充分混匀，冰浴30min，12000rpm离心10min；

(10)弃去上清，沉淀用1ml PBS缓冲液溶解，12000rpm离心5min；

(11)将上清转移至新的1.5ml离心管，加入200μl 20％PEG/NaCl，充分混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min；

(12)弃去上清，沉淀用200μl PBS缓冲液溶解，用紫外分光光度计检测在波长268nm的吸收值，计算噬菌体滴度(1OD＝5×10¹¹pfu/ml)，完成第一轮噬菌体筛选；

(13)重复步骤1-12，总共完成5轮的噬菌体筛选得到与金黄色葡萄球菌特异性结合的噬菌体。

实施例2噬菌体单克隆扩增、提取及测序

为获得经过筛选后噬菌体的氨基酸序列，需要挑取噬菌体单克隆进行扩增并提取单链DNA，然后进行DNA测序，具体步骤如下：

(1)接种E.coli ER2738至20ml LB培养基中，于恒温培养箱中37℃、250rpm培养至OD600约为0.8，分别取1ml菌液至无菌离心管中；

(2)从第五轮筛选后的计数平板上挑取10个分离清楚的蓝色噬菌斑，分别接种到上述离心管中，编号为P1-P10，于恒温培养摇床37℃、250rpm培养5h；

(3)按照噬菌体单链DNA抽提试剂盒说明中操作方法，提取P1-P10的单链DNA；

(4)将提取后的单链DNA用1％的琼脂凝胶进行电泳检测，电泳条件为120V，25min，电泳完成后于凝胶成像仪中成像；

(5)分别将10个单链DNA测序，测序引物为GCCCTCATAGTTAGCGTAACG(5’→3’)；

(6)将测序所得的碱基序列用软件Chromas读取并转换为氨基酸序列，获得10个多肽的氨基酸序列，同时使用软件DNAMAN对10个序列进行比对。

测序结果见表1。

表1测序后碱基序列翻译为氨基序列结果

实施例3多肽合成

筛选到的多肽采用Fmoc固相化学合成方法，合成的多肽粗品用高效液相色谱纯化并用质谱分析分子量以及电荷，同时用去离子水和0.1mol/L PBS缓冲液测试多肽溶解度。纯化后多肽样品分装后通过冷冻干燥制备成粉末，每管2mg，于-20℃保存备用。

实施例4抑菌实验

采用纸片扩散法初步测定多肽的抑菌效果，具体操作如下：

(1)分别划线接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌于LB琼脂平板中，在恒温培养箱中37℃培养16-18h，分别挑取单菌落接种至10ml LB液体培养中，37℃、250rpm培养至OD600约为0.5；

(2)分别将菌液按1:1000稀释，此时菌液的菌落数在10⁵-10⁶cfu/ml范围，取稀释菌液100μl加入至LB琼脂平板中并涂布均匀；

(3)待菌液完全干燥后，在平板上放置6个纸片(直径为6mm)，分别加入阴性对照(无菌去离子水)、阳性对照(氨苄青霉素或万古霉素)以及4条多肽，多肽浓度均为1mg/ml，体积为10μl；

(4)将平板放置恒温培养箱中37℃培养，18h后测定抑菌圈大小，初步确定多肽的抑菌活性。每组重复三次实验，取平均值。

检测结果如图2所示，其中多肽P6溶解性较差多肽P1、P5、P9对所有菌株均无明显的抑菌圈，多肽P2对大肠杆菌和粪肠球菌也没有明显的抑制作用，对铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑菌圈，具有明显的抗菌效果。

实施例5多肽最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定

采用肉汤二倍稀释法测定最小抑菌浓度和最低杀菌浓度，具体操作如下：

(1)分别划线接种金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌于LB琼脂平板中，在恒温培养箱中37℃培养16-18h，分别挑取单菌落接种至10ml MH液体培养中，37℃、250rpm培养至OD600约为0.5；

(2)分别将菌液按1:1000稀释，此时菌液的菌落数在10⁵-10⁶cfu/ml范围，分别取50μl加至96孔板，每种菌接种10个孔，并在第11号孔加入100μl的MH培养基作为空白对照；

(3)将多肽稀释至浓度为0.512mg/ml，然后两倍梯度稀释8次，总共9个不同浓度的多肽，分别50μl的不同浓度的多肽加入加有菌液的96孔板中，在第10号孔加入50μl MH培养基作为阴性对照，每个样品3个复孔，轻轻振荡混匀，放置恒温培养箱37℃培养16h；

(4)观察每个孔中细菌生长情况，以无菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度；

(5)分别用无菌接种环沾取每个孔中的液体，印迹在LB琼脂平板上，等待液体完全吸收后放置37℃培养箱培养16h，观察细菌形成情况；

(6)96孔板中剩余菌液涂布在LB琼脂平板上，等待液体完全吸收后放置37℃培养箱培养16h，计数每个平板上的菌落，计算最低杀菌浓度(菌落数降低3个log值为最低杀菌浓度)。

结果如图3所示，P2对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌的最小抑菌浓度均为16μg/ml，最低杀菌浓度均为32μg/ml，对MRSA的最小抑菌浓度均为32μg/ml，最低杀菌浓度均为64μg/ml。因此，利用噬菌体展示筛选的方法可以筛选到针对特定细菌具有抗菌效果的多肽，同时该多肽对其他细菌也具有抗菌效果。

实施例6多肽的时间-杀菌动力学(time-kill kinetics)实验

多肽对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌均有抑制作用，本实验通过不同时间考察多肽对上述细菌生长的影响情况，具体操作如下：

(1)分别划线接种金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌于LB琼脂平板中，在恒温培养箱中37℃培养16-18h，分别挑取单菌落接种至10ml MH液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600约为0.5；

(2)分别将菌液按1:1000稀释，此时菌液的菌落数在105-106cfu/ml范围，分别取100μl加至96孔板；

(3)将多肽用MH培养基稀释至浓度为2×MBC，分别取100μl加入至加有细菌的96孔板中，同时设置阳性对照(氨苄青霉素或万古霉素)、空白对照(加入100μl PBS)，每个样品三个复孔，将96孔板放置37℃恒温摇床培养500rpm培养；

(4)分别在0、10、20、30、60min取样10μl，梯度稀释后涂布平板，将平板放置37℃恒温培养箱培养16h，菌落计数并计算菌液中细菌密度，比较不同处理方式下细菌的密度。

实验结果如图4所示，阴性对照PBS与细菌混合后在60min内持续生长，多肽与金黄色葡萄球菌、MRSA、蜡状芽孢杆菌细菌混合10min后，细菌的活率明显下降，并在20min后基本全部死亡，与铜绿假单胞菌混合10min后细菌基本全部死亡，而阳性对照如氨苄青霉素和万古霉素与细菌混合60min后，细菌增长受到抑制并有部分死亡，但死亡细菌数量较少。因此，所筛选出的多肽P2具有快速杀菌的效果，与作用于细胞膜的阳离子抗菌肽的特性一致。

实施例7细胞毒性实验

使用人胚胎肾细胞(HEK293)检测多肽的体外细胞毒性，具体检测步骤如下：

(1)复苏HEK293细胞，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，于恒温培养箱37℃、5％CO₂条件下培养；

(2)细胞传代培养两次后，将处于生长对数期的细胞从方瓶消化后并用10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，混匀后细胞计数；

(3)将细胞液密度调整至5×104个/ml，并接种至96孔板，每孔体积为100μl；

(4)将多肽用DMEM/F12培养基稀释至浓度为0.512mg/ml，然后两倍梯度稀释7次，总共8个不同浓度的多肽；

(5)将不同浓度的多肽加入至加有细胞的96孔板中，每孔100μl，每个样品三个复孔，同时设定调零孔(未加细胞，只加200μl培养基)、空白对照(加入100μl PBS)和阳性对照(加入100μl DMSO)，将96孔板放置培养箱培养24h；

(6)每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)，继续在恒温培养箱培养4h；

(7)取出96孔板，小心吸去孔内的培养基，每孔加入150μl DMSO，于微量振荡器上300rpm振荡10min，使结晶物充分溶解；

(8)将96孔板放入多功能酶标仪，在波长490nm处检测每个孔的吸光值，计算多肽对细胞的毒性；

结果如图5所示，阳性对照DMSO组对细胞具有明显的毒性，基本检测不到活细胞，多肽P2在浓度不大于256μg/ml时，细胞数量与阴性对照没有明显的差异，即对细胞没有明显的抑制作用，当浓度为512μg/ml时，细胞数量约为阴性对照的75％，即对细胞存在一定的抑制作用。

实施例8溶血毒性实验

抗菌肽能够存在杀死细菌，同时也有可能结合真核细胞膜并造成细胞毒性，本实验评估多肽是否引起对鸡红细胞的溶血效应，具体步骤如下：

(1)将鸡红细胞用PBS溶液洗涤三次后制备成浓度为1％(体积比)的细胞悬液，分别取100μl的红细胞悬液加入到96孔板中；

(2)多肽用PBS稀释至浓度为0.512mg/ml，然后两倍梯度稀释7次，总共8个不同浓度的多肽；

(3)分别将不同浓度的多肽加入至加有红细胞的96孔板中，同时设置阴性对照(PBS溶液)和阳性对照(0.1％Triton-X 100)，每个样品三复孔；

(4)将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养2h，于96孔板离心机中2500rpm离心10min，将每个孔的上清分别转移至新的96孔板，用多功能酶标仪检测每个孔在波长540nm处的吸收值；

(5)计算多肽的溶血率，计算公式为溶血率(％)＝(样品吸收值-阴性对照吸光值)/(阳性对照吸收值-阴性对照吸光值)×100％。

结果如图6所示，多肽P2在浓度4-512μg/ml的范围内，对血红细胞均无明显的毒性。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种抗菌肽的筛选方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Trp Leu Arg Arg Lys Trp

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val His Thr Arg Tyr Ile Asn

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met His Met His His Gly Leu

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Leu Ser Gly Thr Trp Tyr Ile

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Leu Tyr Thr Ser Trp Pro

1 5

Claims

1.一种抗菌肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将噬菌体展示随机肽库与致病菌混合，富集与所述致病菌特异性结合的噬菌体并进行扩增；

步骤3：通过抑菌实验筛选得到抗菌肽；

所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量少于10个。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量为7个。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述致病菌为沙门氏菌、淋病奈瑟菌、奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、链球菌属、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2中合成的所述多肽为D型多肽和L型多肽。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2前，还包括：对所述扩增得到的噬菌体重复步骤1 3～5次。

7.权利要求1至6任意一项所述的抗菌肽的筛选方法所筛选的抗菌肽在制备抑制致病菌药物中的应用。

8.根据权利要求7中的应用，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述致病菌的浓度为10⁵-10⁶cfu/ml时，所述抗菌肽在所述金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林、铜绿假单胞菌和蜡状芽孢杆菌中的最小抑菌浓度分别为16～32μg/ml、32～64μg/ml、32～64μg/ml、16～32μg/ml、16～32μg/ml，最小杀菌浓度分别为32～256μg/ml、64～256μg/ml、32～256μg/ml、32～256μg/ml。

10.一种致病菌抑制剂，其特征在于，包括权利要求1至6任意一项所述的抗菌肽的筛选方法所筛选的抗菌肽。