CN116284258A - 一种elbd靶向肽的突变体与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ELBD靶向肽的突变体与应用，所述ELBD靶向肽的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。本发明的ELBD靶向肽及其突变体可以应用于疾病诊断，治疗药物，定向递送，定向降解消除等各种场景，开发成靶向治疗药物，用于相关疾病的治疗。靶向肽引入到纳米抗体上，可以使得纳米抗体具有多靶向结合性，适用于更多的临床应用场景。靶向肽和dsRBD融合，可以将治疗用RNA分子定向递送到特定的靶细胞中，影响细胞的生物学功能，治疗各种疾病。靶向肽与IgG结合结构域偶联后，可以利用抗体特异性结合抗原分子的特性，将原本在胞外的靶标分子内吞拖入细胞内，通过胞内溶酶体的消化降解作用，实现与PROTAC技术类似的定向降解消除效果。

Description

一种ELBD靶向肽的突变体与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及ELBD靶向肽的突变体与应用。
背景技术
靶向肽是一种能够特异性地引导和运输与其偶合的被转运分子(通常为蛋白质、核酸、纳米颗粒等)到细胞特定区域的短肽。这些细胞的特定区域包括细胞膜的特定部位、细胞核、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体等。靶向肽在医学上经常被用于运输药物分子到特定靶部位(细胞、组织、器官)，使得药物分子在作用部位的浓度更集中，减少药物的不良反应，提高药物的药理作用效果。在肿瘤治疗过程中，应用靶向肽可以减少化疗药物的使用量，降低化疗药物在正常组织中的浓度，增加在肿瘤细胞中的浓度，从而降低药物引起的不良反应，改善肿瘤治疗的效果。靶向肽在与可被检测的识别标记物(荧光物质、同位素\放射性物质等)偶联后也用于肿瘤的诊断和作为手术治疗的辅助手段。
纳米抗体是一种从在羊驼外周血液中发现的分子量较小的抗原结合片段(～15kDa)，这种抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区。
纳米抗体具有体积小、溶解性好、稳定性好、可在深层组织中渗透，具有常规抗体所不具备的特性。由于这些特性，纳米抗体可以配制成保质期长的即用型溶液。纳米抗体单结构域的特点使得其可以通过噬菌体展示技术快速方便地筛选针对特定识别位点的纳米抗体。此外，纳米抗体相对容易在细菌、酵母或哺乳动物细胞中生产，能够以合理的成本进行大规模生产。纳米抗体可以用于在细胞中进行基因编码、标记和表达，用于靶蛋白的体内定位和功能研究。目前基于纳米抗体的治疗可采用三种不同的策略：①作为靶受体位点的拮抗剂/掩蔽剂，抑制阻断或影响受体的功能；②作为针对某一抗原的靶向结构域，携带偶联的药物/功能结构域专一性靶向递送；③作为纳米颗粒/脂质体表面的靶向分子，将纳米颗粒/脂质体导向靶部位。纳米抗体已成为一种很有前途的疾病诊断和治疗工具。同样，在纳米抗体上引入其它靶向肽序列，可以使得纳米抗体具有多靶向结合性，适用于更多的临床应用场景。
许多与高度结构化的RNA相互作用的蛋白质都包含双链RNA结合序列(dsRBD)，这些蛋白包括核酸酶RNase III、Dicer、蛋白激酶PKR、RNA脱氨酶(ADAR)和Staufen(一种负责mRNA定位的蛋白质)。双链RNA结合蛋白(DRBP)具有一个相同的进化保守序列，可与dsRNA发生相互作用。据报道，含有dsRNA结合域(dsRBD)的蛋白质可与低至11bp的dsRNA结合，而且这种结合大部分与具体的核苷酸序列无关。不过，确实有几种dsRBD显示出了高度的底物特异性，这可能具有重要的生物学意义。现已报道鉴定了20多个DRBP，这些蛋白参与无数细胞功能，从RNA干扰到抗病毒机制和其他类型的转录后基因调控，它们在细胞中发挥着多种至关重要的作用。
将靶向穿膜肽序列和dsRBD融合，可以将治疗用RNA分子定向递送到特定的靶细胞中，影响细胞的生物学功能，治疗各种疾病。
由链球菌或者金黄色葡萄球菌来源的可结合抗体分子的蛋白结构域早已被大量用于单克隆抗体的分离纯化和大规模商业化生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了ELBD靶向肽的突变体与应用，本发明的ELBD靶向肽及其突变体可以应用于疾病诊断，治疗药物，定向递送，定向降解消除等各种场景，开发成靶向治疗药物，用于相关疾病的治疗。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面公开了一种ELBD靶向肽的突变体，所述ELBD靶向肽的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
本发明中的ELBD序列为在美国专利申请15562722的分案申请中列出的ELBD序列(SEQ ID NO:24)：RCSHYTGIRCSHGIYTGIRCQH。
在这个序列中，仍然存在3个Cys残基，从Cys氧化形成二硫键的角度考虑，必将有一个Cys处于自由状态，可能会产生分子间的交联，造成重组蛋白的聚合。因此，对这个序列继续进行优化改造，优化的设想是：1.保留第一、第二个Cys，去除第三个Cys，使这一段序列能够通过氧化形成的二硫键成环；2.在尽可能保留重要保守氨基酸残基的前提下优化环的大小。
因此得到如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的三个突变体。
本发明另一方面公开了上述的ELBD靶向肽的突变体的应用，所述ELBD靶向肽的突变体在制备靶向治疗药物中的用途。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体的靶向递送的表达载体为与纳米抗体结合的表达载体。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体的靶向递送的表达载体为与RNA结合的表达载体。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体的靶向递送的表达载体为与抗体结合序列的表达载体。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体的系列表达载体构建方法为：以EGFP-ELBD-H2-pET28a表达质粒出发，同时将原有的EGFP-ELBD-H2-pET28a表达载体用Eco RI与Sal I双酶切，并与合成的片段利用T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化E.coliDH5α菌株，培养，回收重组质粒DNA，测序验证，即构建完成系列EGFP-ELBD-H2-pET28a表达载体，包括EGFP-ELBD-N1-pET28a，EGFP-ELBD-N2-H2-pET28a，EGFP-ELBD-N3-H2-pET28a。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体与纳米抗体结合的表达载体的构建为：以DNA人工固相合成方法合成GFP纳米抗体的DNA序列，再以合成好的DNA序列为模版，根据GFPnanobody的基因序列，设计引物1与引物2进行PCR扩增，引物1与引物2分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点；PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min；
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nde I和Bam HI双酶切，回收片段；同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段；并用T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA；
引物1的序列如SEQ ID NO:4所示，引物2的序列如SEQ ID NO:5所示。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体与RNA结合的表达载体的构建为：以DNA人工固相合成方法合成双链RNA结合蛋白RBD的DNA序列；再以合成好的序列为模版，根据RBD的基因序列，设计引物3与引物4进行PCR扩增，引物3与引物4分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点；
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min；
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nde I和Bam HI双酶切，回收片段；同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段；并用T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA；
引物3的序列如SEQ ID NO:6所示，引物4的序列如SEQ ID NO:7所示。
作为本发明的一种优选方案，ELBD靶向肽的突变体与抗体结合序列的表达载体的构建为：以DNA人工固相合成方法合成IgG结合蛋白IgGBD的DNA序列；再以合成好的序列为模版，根据IgGBD的基因序列，设计引物5与引物6进行PCR扩增，引物5与引物6分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点；
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min；
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nco I和Bam HI双酶切，回收片段；同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段；并用T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA；
引物5的序列如SEQ ID NO:8所示，引物6的序列如SEQ ID NO:9所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明的ELBD靶向肽及其突变体可以应用于疾病诊断，治疗药物，定向递送，定向降解消除等各种场景，开发成靶向治疗药物，用于相关疾病的治疗。
2)本发明提供的ELBD靶向肽的突变体，引入到纳米抗体上，可以使得纳米抗体具有多靶向结合性，适用于更多的临床应用场景。
3)本发明提供的ELBD靶向肽的突变体，和dsRBD融合，可以将治疗用RNA分子定向递送到特定的靶细胞中，影响细胞的生物学功能，治疗各种疾病。
4)本发明提供的ELBD靶向肽的突变体，与IgG结合结构域偶联后，可以利用抗体特异性结合抗原分子的特性，将原本在胞外的靶标分子内吞拖入细胞内，通过胞内溶酶体的消化降解作用，实现与PROTAC技术类似的定向降解消除效果。
附图说明
图1是实施例1的重组蛋白对细胞的选择性示意图。
图2是实施例2递送纳米抗体的效率观察示意图。
图3是实施例3递送抗体IgG的效率观察示意图。
图4是实施例4递送siRNA的效率观察示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，ELBD序列(SEQ ID NO:24)：RCSHYTGIRCSHGIYTGIRCQH为美国专利申请15562722的分案申请中列出的。
在这个序列中，仍然存在3个Cys残基，从Cys氧化形成二硫键的角度考虑，必将有一个Cys处于自由状态，可能会产生分子间的交联，造成重组蛋白的聚合。因此，对这个序列继续进行优化改造，优化的设想是：1.保留第一、第二个Cys，去除第三个Cys，使这一段序列能够通过氧化形成的二硫键成环；2.在尽可能保留重要保守氨基酸残基的前提下优化环的大小。在这些优化突变体中，列举以下3个突变体序列进行说明。
其中，以ELBD-N1与H2(即来源于HB-EGF的CPP，见PCT/CN2017/076656中的SEQ IDNO:12)融合组成的靶向穿膜肽的穿膜效果更好，表达的融合蛋白可以更多以可溶性形式存在，纯化的融合蛋白更稳定，不易产生聚集沉淀。
EGFP-ELBD-H2系列表达载体构建
以DNA人工固相合成方法合成两端带Eco RI和Sal I酶切位点的系列S3模拟肽样结构的突变核苷酸序列，AA序列见表1。
以EGFP-ELBD-H2-pET28a表达质粒出发，同时将原有的EGFP-ELBD-H2-pET28a表达载体用Eco RI与Sal I双酶切，并与合成的片段利用T4 DNA连接酶连接。
将上述连接产物转化E.coli DH5α菌株，培养，回收重组质粒DNA，测序验证，即构建完成系列EGFP-ELBD-H2-pET28a表达载体，
包括EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a，EGFP-ELBD-N2-H2-pET28a，EGFP-ELBD-N3-H2-pET28a。
表1.AA序列
简称 AA序列 氨基酸序列编号
Optimized ELBD RCSHYTGIRCSHGIYTGIRCQH
ELBD-N1 RCSHYTGIVCHSYVGA SEQ ID NO:1
ELBD-N2 RCSHYTGIICHPYHGE SEQ ID NO:2
ELBD-N3 VCHSYVGAVCHSYVGA SEQ ID NO:3
GFP纳米抗体-ELBD-N1-H2表达载体构建
以DNA人工固相合成方法合成GFP纳米抗体(GFPnanobody)的DNA序列。再以合成好的DNA序列为模版，根据GFPnanobdy的基因序列，设计如下引物进行PCR扩增，正反向引物分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点。
SEQ ID NO:4，引物1：5’-CGCCATATGGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGG-3’；
SEQ ID NO:5，引物2：5’-CGCGGATCCTTTGCTACTAACGGTAACCTGGGTGC-3’。
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min。
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nde I和Bam HI双酶切，回收片段。同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段。并用T4DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。
双链RNA结合蛋白(dsRBD)-ELBD-N1-H2表达载体构建
以DNA人工固相合成方法合成双链RNA结合蛋白(dsRBD)的DNA序列。再以合成好的序列为模版，根据dsRBD的基因序列，设计如下引物进行PCR扩增，正反向引物分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点。
SEQ ID NO:6，引物3：5’-CGCCATATGGAACGTGCGATTCAGGGCAA-3’；
SEQ ID NO:7，引物4：5’-CGCGGATCCTTCGCTTTCCTTCTTAAAGGTTTCAATACCTTCC-3’。
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min。
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nde I和Bam HI双酶切，回收片段。同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段。并用T4DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。
IgG结合蛋白(IgGBD)-ELBD-N1-H2表达载体构建
以DNA人工固相合成方法合成IgG结合蛋白(IgGBD)的DNA序列。再以合成好的序列为模版，根据IgGBD的基因序列，设计如下引物进行PCR扩增，正反向引物分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点。
SEQ ID NO:8，引物5：
5’-CGCCATATGGTTGATAACAAATTTAACAAAGAACAGCAGAACGCAT-3’；
SEQ ID NO:9，引物6：5’-CGCGGATCCTTTTGGTGCCTGTGCATCATTCAGC-3’。
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min。
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nco I和Bam HI双酶切，回收片段。同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段。并用T4DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。
ELBD-N1系列重组蛋白表达纯化
(一)EGFP-ELBD-H2系列重组蛋白表达纯化
1)从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。
2)取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。
3)将培养温度调整到15℃到20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10MM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，500-1000rpm低速离心收集菌体。
4)收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温(4-10℃)条件下，高速离心(8000-13400rpm)收集含有目标蛋白的上清液。
5)收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。
6)收集的蛋白在pH7.2的Tris-HCl缓冲液中透析6h。
(二)GFP纳米抗体-ELBD-N1-H2重组蛋白表达纯化
1)从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。
2)取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。
3)将培养温度调整到15℃到20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10MM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，500-1000rpm低速离心收集菌体。
4)收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温(4-10℃)条件下，高速离心(8000-13400rpm)收集含有目标蛋白的上清液。
5)收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。
6)收集的蛋白在pH7.2的Tris-HCl缓冲液中透析6h。
(三)IgG结合蛋白(IgGBD)-ELBD-N1-H2重组蛋白表达纯化
1)从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。
2)取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。
3)将培养温度调整到15℃到20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10MM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，500-1000rpm低速离心收集菌体。
4)收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温(4-10℃)条件下，高速离心(8000-13400rpm)收集含有目标蛋白的上清液。
5)收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。
6)收集的蛋白在pH7.2的Tris-HCl缓冲液中透析6h。
(四)双链RNA结合蛋白(dsRBD)-ELBD-N1-H2重组蛋白表达纯化
1)从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。
2)取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。
3)将培养温度调整到15℃到20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10MM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，500-1000rpm低速离心收集菌体。
4)收集的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)重新悬浮，以一定功率(10-100w)进行超声破碎。在低温(4-10℃)条件下，高速离心(8000-13400rpm)收集含有目标蛋白的上清液。
5)收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。
6)收集的蛋白在pH7.2的Tris-HCl缓冲液中透析6h。
实施例1
EGFP-ELBD-N1重组蛋白对细胞的选择性
选用11种细胞来研究EGFP-ELBD-N1-H2重组蛋白的肿瘤靶向性特征。其中包括7种人体肿瘤细胞：HeLa(人宫颈癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)，H460(人肺癌细胞)，22RV1(人前列腺癌细胞)，SMMC-7721(人肝癌细胞)，Lovo(人肝癌细胞)，MBA-MD-231(人三阴性乳腺癌细胞)，SKBR-3(人乳腺癌细胞)，以及1种正常人体细胞：MRC-5(人胚肺成纤维细胞)。
采用0.25μM，0.5μM，1μM，2μM的重组蛋白样品浓度，将样品与体外培养的肿瘤细胞共孵育12h，以倒置荧光显微镜比较观察各种EGFP-ELBD-H2重组蛋白对上述细胞的穿膜作用效果。
参见图1，结果发现，EGFP-ELBD-N1-H2蛋白对HeLa，22RV1，A549，MCF-7，Lovo，SKBR-3以及MBA-MD-231细胞的穿膜作用显著高于SMMC-7721，H460以及正常细胞MRC-5。这种现象的产生与不同癌细胞表面的特异性受体表达量不同有关。
实施例2
GFPnanobody-ELBD-N1-H2递送纳米抗体的效率观察
选用HeLa细胞，将终浓度为的1μM EGFP蛋白与0.5μM，1μM，2μM的GFPnanobody-ELBD-N1-H2蛋白一起与体外培养的细胞共孵育12h，经过PBS洗涤，台盼蓝洗涤后以倒置荧光显微镜观察纳米抗体是否可以被ELBD-N1-H2靶向穿膜肽携带进入细胞。
参见图2，结果可以看出，EGFP自身无法进入细胞，在细胞内没有荧光信号。
而GFPnanobody-ELBD-N1-H2存在条件下，胞内有明显的荧光信号，且随着GFPnanobody-ELBD-N1-H2蛋白浓度的升高，荧光信号明显增加。
表明GFPnanobody-ELBD-N1-H2可以将胞外的EGFP蛋白一起携带进入细胞，也证明了ELBD-N1可以将纳米抗体递送进入细胞。该实验结果同时也验证了ELBD-N1可以通过非共价相互作用的方式，将外源蛋白分子递送进入细胞。
实施例3
IgGBD-ELBD-N1-H2递送抗体IgG的效率观察
选用HeLa细胞，将终浓度为100nM Alexa Fluor 488荧光标记的抗体IgG与0.25μM，0.5μM，1μM的IgGBD-ELBD-N1-H2蛋白一起在室温条件孵育半小时，随后将混合物与体外培养的细胞共孵育12h，经过PBS洗涤，台盼蓝洗涤后以倒置荧光显微镜观察抗体IgG是否可以被ELBD-N1靶向穿膜肽携带进入细胞。参见图3，结果可以看出，Alexa Fluor 488荧光标记的抗体IgG自身无法高效地进入细胞，在细胞内没有显著的荧光信号；而IgGBD-ELBD-N1-H2存在条件下，胞内有明显的荧光信号，表明IgGBD-ELBD-N1-H2可以将胞外的抗体IgG高效递送进入细胞。
实施例4
RBD-ELBD-N1-H2递送siRNA的效率观察
选用HeLa细胞，将终浓度为50nM Cy3荧光标记的siRNA与0.5μM，1μM，2μM的RBD-ELBD-N1-H2蛋白一起在室温条件孵育半小时，随后将混合物与体外培养的细胞共孵育12h，经过PBS洗涤，台盼蓝洗涤后以倒置荧光显微镜观察siRNA是否可以被ELBD-N1靶向穿膜肽携带进入细胞。参见图4，结果可以看出，Cy3标记的siRNA在细胞内存在一些微弱的红色荧光信号，可能是细胞对双链核酸的非特异性摄取导致；RBD-ELBD-N1-H2蛋白可以显著增强胞内的红色荧光信号，表明RBD-ELBD-N1-H2蛋白可以作为siRNA的高效递送载体使用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种ELBD靶向肽的突变体，其特征在于，所述ELBD靶向肽的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
2.一种如权利要求1所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，所述ELBD靶向肽的突变体在制备靶向治疗药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体的靶向递送的表达载体为与纳米抗体结合的表达载体。
4.根据权利要求2所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体的靶向递送的表达载体为与RNA结合的表达载体。
5.根据权利要求2所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体的靶向递送的表达载体为与抗体结合序列的表达载体。
6.根据权利要求3或4或5所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体的系列表达载体构建方法为：以EGFP-ELBD-H2-pET28a表达质粒出发，同时将原有的EGFP-ELBD-H2-pET28a表达载体用Eco RI与Sal I双酶切，并与合成的片段利用T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化E.coli DH5α菌株，培养，回收重组质粒DNA，测序验证，即构建完成系列EGFP-ELBD-H2-pET28a表达载体，包括EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a，EGFP-ELBD-N2-H2-pET28a，EGFP-ELBD-N3-H2-pET28a。
7.根据权利要求6所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体与纳米抗体结合的表达载体的构建为：以DNA人工固相合成方法合成GFP纳米抗体的DNA序列，再以合成好的DNA序列为模版，根据GFPnanobody的基因序列，设计引物1与引物2进行PCR扩增，引物1与引物2分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点；PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min；
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nde I和Bam HI双酶切，回收片段；同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段；并用T4 DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA；
引物1的序列如SEQ ID NO:4所示，引物2的序列如SEQ ID NO:5所示。
8.根据权利要求6所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体与RNA结合的表达载体的构建为：以DNA人工固相合成方法合成双链RNA结合蛋白RBD的DNA序列；再以合成好的序列为模版，根据RBD的基因序列，设计引物3与引物4进行PCR扩增，引物3与引物4分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点；
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min；
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nde I和Bam HI双酶切，回收片段；同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段；并用T4 DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA；
引物3的序列如SEQ ID NO:6所示，引物4的序列如SEQ ID NO:7所示。
9.根据权利要求6所述的ELBD靶向肽的突变体的应用，其特征在于，ELBD靶向肽的突变体与抗体结合序列的表达载体的构建为：以DNA人工固相合成方法合成IgG结合蛋白IgGBD的DNA序列；再以合成好的序列为模版，根据IgGBD的基因序列，设计引物5与引物6进行PCR扩增，引物5与引物6分别引入了Nde I和Bam HI酶切位点；
PCR扩增反应条件：PCR扩增的反应条件为：先95℃，变性5min，然后95℃，变性45s，60℃复性30s，72℃延伸60s，循环33次，最后72℃，10min；
将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Nco I和Bam HI双酶切，回收片段；同时以Nde I和Bam HI双酶切EGFP-ELBD-N1-H2-pET28a载体质粒，回收载体片段；并用T4 DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA；
引物5的序列如SEQ ID NO:8所示，引物6的序列如SEQ ID NO:9所示。
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