KR20040020866A - 사일런스 항-ｃｄ28 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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힌톤파울
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히가시야수유키
세키노부오
우에다히로츠구
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후지사와 야꾸힝 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 유사분열 활성이 결여된 항-CD28 항체(사일런스 항-CD28 항체), 생산 방법, 항체를 포함하는 조성물 및 면역억제, T-세포 내성 유도 및 기관 및/또는 조직 이식 거부 치료 방법을 제공한다.

Description

사일런스 항-ＣＤ28 항체 및 그의 용도{Silenced anti-CD28 antibodies and use therof}
면역 반응, 특히 장기이식 거부는 주로 T 림프구의 활성화에 기인한다. 이 T 세포의 활성화는 항원전달 세포(APC)로부터의 시그날에 의해 유도된다. APC로부터의 시그날은 T-세포 수용체 (TCR)에 의한 제 1 시그날 및 동시자극성 분자에 의한 제 2 시그날(동시자극성 시그날)을 포함한다. 제 1 시그날은 APC가 TCR을 통해 T-세포 항원을 제시하는 펩티드 항원의 주요 조직적합성(histocompatibility) 항원 (MHC) 컴플렉스로부터이다. 제 2 시그날은 수개의 동시자극성 분자에 의해 매개되고, B7 (B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86))를 포함하는 것의 예는 APC 측 및 CD28, CTLA-4, 등상의 리간드로서, T-세포 측상의 수용체로서 공지되어 있다. 리간드 B7은 이뮤노글로블린 슈퍼 패밀리에 속하는 당단백질이고, 항원전달 세포 그룹에 속하는 B 세포 등에서 발현된다. 공통된 리간드로서 B7를 인식하는 CD28 및 CTLA-4는 이뮤노글로블린 슈퍼 패밀리에 속하는 당단백질이다. 따라서 T 세포의 활성화는 TCR에 의한 제 1 시그날 및 예를 들면, B7 및 CD28/CTLA-4로부터 제 2 시그날의 동시발생 트랜스덕션에 의해 조절된다. B7-로부터 CD28으로의 시그날은 T 세포의 활성화를 촉진시키는 반면 B7로부터 CTLA-4로부터의 시그날은 저해시키는 것으로 공지되어 있다[Waterhouse et al., Science, 270: 985-988 (1995)].
현재까지는 면역억제 또는 내성을 유도하기 위한 목적으로 CTLA-4Ig, 항-B7-1 항체/항-B7-2 항체, 항-CD28 항체 등을 투여하여 B7-CD28 시그날을 차단하는 것으로 시도되어 왔다. 예를 들면, CTIA-4Ig는 B7과 결합하여 B7 및 CD28과의 반응을 방해하고 결과적으로는 시그날을 CD28로부터 차단하여 면역억제적 활성을 나타낸다. 그러나 B7 및 CTLA-4 사이의 반응은 또한 동시에 저해되기 때문에 T 세포의 활성화에 대하여 반대로 작용하는 CTLA-4의 시그날 또한 억제되어 원하는 내성은 유도되지 않는다(Kirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8789-8794 (1997). 항-B7 항체를 제조하고 T 세포의 활성화를 억제한다고 보고되고 CTLA-4Ig의 경우에서와 같이, CTLA-4 시그날을 억제시켰다.
시험관내 시험에서 항-CD28 항체는 T 세포에 대하여 유사분열 효능을 발생시키고, 이 항체 및 항-CD3 항체를 사용한 결합 자극은 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키고 사이토카인의 생산을 증진시켰다[WO 90/05541, Eur. J. Immunology, 16,1289-1296 (1986), etc.]. 추가로, 항-CD28 항체에 의한 T 세포의 CD28 수용체의 유사분열 자극은 B7로부터 CD28로의 제 2 시그날과 유사한 T 세포 활성화 시그날이 생체내에서 생성되도록 자극하였다 [Yin et al., J. Immunology, 163: 4328-4334 (1999)]. 이 T-세포 활성화 작용이 항-CD28 항체가 암 및 AIDS의 치료에서 면역강화제로서 사용될 수 있다는 것을 제안하였다(WO 90/05541).
발명의 요약
통상의 과학 기술에 의해 제조된 항-CD28 항체은 T 세포상에서 유사분열 작용에 영향을 준다. 이러한 유사분열 활성에 대한 이유는 전체적으로 밝혀지지 않았지만, 항-CD28 Fc 부위의 항원-전달 세포의 Fc 수용체에 대한 결합이 가능한 이유로 판단되고 있다(Cole et al., J. Immunology, 36: 159 (1997). 따라서, 유전공학 기술을 사용하여, 본 발명자는 항-CD28 항체의 Fc 수용체 결합 부위내로 돌연변이를 도입하여 항체를 변형시킴으로써 더이상 유사분열 활성을 갖지 못하도록 하였다. 본 발명자들은 이러한 하나의 항체, TN228 IgG2M3을 생산하였고, 여기에서, IgG2M3은 IgG 유전자내 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 추가로, 본 발명자는 생성된 사일런스(silenced) 항-CD28 항체는 T 세포 내성을 유도함에 매우 유용한 유사분열 활성을 갖지 않는다는 것을 입증하였다.
따라서, 본 발명은 유사분열 활성을 갖지 않는 항-CD28 항체(이하, 사일런스 항-CD28 항체로서 언급함), 및 면역 반응, 특히 이식 거부를 억제하는 방법, 및 상기 항체를 사용하여 면역내성을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 키메라성 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있는 사일런스 항-CD28 항체이다. 항-CD28 항체의 가변 부위은 서열번호: 2,4,6 및 8에 나타낸 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1,3,5, 및 7을 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은 항-CD28 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포 숙주이다.
본 발명의 또다른 목적은 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 조건하에서 항-CD28 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 숙주를 배양하고 생성된 유전자 산물을 회수하여 사일런스 항-CD28 항체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 목적은 하나 이상의 사일런스 항-CD28 항체를 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 성분과 혼합하여 포함하는 약제학적 조성물이다.
사일런스 항-CD28 항체는 기관 또는 조직 이식 거부에 대한 예방약/치료제로서 및 T-세포 내성 유도, 면역억제에 유용한다. 따라서, 본 발명은 T-세포 내성 유도, 면역억제 방법을 제공하고, 포유동물에 하나 이상의 사일런스 항-CD28 항체를 투여하여 기관 또는 조직 거부시 예방 또는 치료법을 제공한다. 바람직하게, 상기 사일런스 항-CD28 항체를 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물로서 투여하고 적절하게 추가의 약물/약제를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1. ChTN228 항체 발현을 위한 플라스미드 작제물. 뮤린 TN228의 VL 및 VH 를 Xbal 사이트 측면에 위치하는 미니-엑손으로서 작제하였다. VL 서열을 발현 벡터 pVk에 도입하고 VH 서열을 발현 벡터 pVg2M3에 도입하였다.
도 2. 미니-엑손내 ChTN228의 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열. 시그날 펩티드 서열을 이탤릭체로 표기하였다. CDRs에 밑줄을 그었다. 성숙 경쇄는 아스파라긴산 잔기(굵은체)로 시작한다. 비해독 및 인트론은 소문자이다(서열 번호 : 1 및 2).
도 3. 미니-엑손내 ChTN228의 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열. 시그날 펩티드 서열을 이탤릭체로 표기하였다. CDRs에 밑줄을 그었다. 성숙 중쇄는 글루타민 잔기(굵은체)로 시작한다. 비해독 및 인트론은 소문자이다(서열 번호 : 3 및 4).
도 4. 경쟁 시험. P815/CD28+세포를 25ng의 MuTN228-FITC 및 상기 기술된 바와 같은 ChTN228 또는 MuTN228 2배 연속 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. P815/CD28+세포를 경쟁자없이 MuTN228-FITC와만 혼합하였다. 각 샘플에 대한 평균 채널 형광을 경쟁자 농도에 대하여 플랏팅하였다.
도 5. TN228-IgG2m3의 인간 1차 MLR에 대한 저해 효과(1). 4개의 각 개체로부터 1차 MLR의 저해율을 따로따로 나타내었다.
도 6. FN228-IgG2m3의 인간 1차 MLR에 대한 저해 효과(2). 4개의 각 개체로부터 1차 MLR의 저해율을 따로따로 나타내었다.
도 7. TN228-IgG2m3의 2차 MLR에 대한 효과.
두마리의 지원자로부터의 데이타를 따로따로 나타내었다
2차 MLR중 [3H]-티미딘 흡수를 100으로하여 1차 MLR에서 Raji 자극만을 퍼센트(dpm)로 나타내었다. TN228-IgG2m3: 0.1μg/mL
도 8. HuTN228 항체 발현을 위한 플라스미드 작제물. 뮤린 TN228의 VL 및 VH 를 Xbal 사이트 측면에 위치하는 미니-엑손으로서 작제하였다. VL 서열을 발현 벡터 pVk에 도입하고 VH 서열을 발현 벡터 pVg2M3에 도입하였다.
도 9. 미니-엑손내 HuTN228의 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열. 시그날 펩티드 서열을 이탤릭체로 표기하였다. CDRs에 밑줄을 그었다. 성숙 중쇄는 글루타민 잔기(굵은체)로 시작한다. 비해독 및 인트론은 소문자이다(서열 번호 : 5 및 6).
도 10. 미니-엑손내 HuTN228의 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열. 시그날 펩티드 서열을 이탤릭체로 표기하였다. CDRs에 밑줄을 그었다. 성숙 경쇄는 아스파라긴산 잔기(굵은체)로 시작한다. 비해독 및 인트론은 소문자이다(서열 번호 : 7 및 8)
도 11. FACS 경쟁 분석. 다양한 양의 경쟁자 MuTN228 또는 HuTN228 항체의 존재하에 FITC-표지된 MuTN228의 P815/CD28+세포 결합을 실시예에 기술되는 바와 같이 유식세포측정 경쟁 시험으로 분석하였다.
도 12. ELISA 경쟁 분석. 다양한 양의 경쟁자 MuTN228 또는 HuTN228 항체의 존재하에 바이오틴화된 MuTN228의 sCD28-Fc에 대한 결합을 실시예에 기술되는 바와 같이 ELISA 경쟁 분석 시험으로 분석하였다.
도 13. I-125 경쟁 분석. 다양한 양의 경쟁자 MuTN228 또는 HuTN228 항체의 존재하에l25I 표지된 MuTN228의 P815/CD28+세포에 대한 결합을 실시예에 기술되는 바와 같이l25I 표지된 항체 경쟁 시험으로 분석하였다.
도 14. PV1-IgG3 항체 발현을 위한 플라스미드 작제물. PV1의 VL및 VH를Xbal 사이트 측면에 위치하는 미니-엑손으로서 작제하였다. VL서열을 발현 벡터 pMVk. rg. dE에 도입하고 VH서열을 발현 벡터 pMVg3. D. Tt에 도입하였다. 두개의 플라스미드를 재조합하여 PV1-IgG3의 중쇄 및 경쇄를 공-발현하는 싱글 플라스미드를 생성하였다.
도 15A. 미니-엑손내 중쇄 및 경쇄의 cDNA 서열 및 추론된 아미노산 서열. CDRs에 밑줄을 그었다. 성숙 경쇄는 위치 20번에서 아스파라긴산 잔기(이중선)로 시작한다. 비해독 및 인트론은 소문자이다(서열 번호 : 9 및 10)
도 15B. 미니-엑손내 PV1의 가변 부위의 cDNA 서열 및 추론된 아미노산 서열. CDRs에 밑줄을 그었다. 성숙 중쇄는 위치 20번에서 글루타민 잔기(이중선)로 시작한다. 비해독 및 인트론은 소문자이다(서열 번호 : 11 및 12)
도 16. 방법에 기술된 바와 같이 HPLC를 사용한 크기배제 크로마토그래피에 의한 PV-1-IgG3 분석. 단백질을 280nM에서 흡광도에 의해 조사하였다.
도 17. 마우스 IgG3 동형 대조군 (레인 1), PV1 (레인 2), 및 PV1-IgG3 (레인 3)의 SDS-PAGE 분석. 패널 A의 단백질은 비축소 조건하에서 이동하였고, 패널 B에서는 축소 조건하에서 이동하였다. MW는 분자량 마커를 나타낸다. 숫자는 MW 기준(kD)이다.
도 18. PV1 (A), 37.51 (B), 또는 PV1-IgG3 (C)으로 염색되고, 유식세포측정으로 분석되는 EL4 세포. 사용된 2차 항체는: PV1에 대하여 FITC-컨쥬게이트 당나귀 항-아르메니아 햄스터 IgG (H+L), 37.51에 대하여 FITC컨쥬게이트 당나귀 항-Syrian 햄스터 IgG, 및 PV1-IgG3에 대하여 FITC-컨쥬게이트 염소 항-마우스 카파. 짙은선 프로파일은 2차 항체로만 염색된 세포를 나타낸다. 점선 프로파일은 방법에 기술된 바와 같이 1차 및 2차 항체로 염색된 세포를 나타낸다. 마우스 IgG3 동형 대조군은 EL4 세포를 염색하지 않았다(자료는 나타내지 않음).
도 19. (A). 과량의 PV1, 또는 PVI-IgG3은 EL4 세포에 대한 결합에 대하여 R-PE-컨쥬게이트 PV1과 경쟁한다. 유식세포측정 막대 그래프에서 짙은선(흑색)은 염색하지 않은 세포, 굵은 짙은 선(암청색)은 R-PE-PV1 만으로 염색한 세포, 얇은 점선(자홍색)은 R-PE-PV1 및 과량의 비컨쥬게이트 PV1으로 염색된 세포, 및 얇은 이중 점선(옅은청색)은 R-PE-PV1 및 과량의 비컨쥬게이트 PV1-IgG3으로 염색된 세포를 나타낸다. 과량의 마우스 IgG3 동형 대조군은 R-PE-PV1의 EL4 세포에 대한 결합에 영향을 주지 않는다(자료는 나타내지 않음). (B). 과량의 145.2C11, 또는 145.2C11-IgG3은 EL4에 대한 결합에 대하여 R-PE-컨쥬게이트 145.2C11과 경쟁한다. 얇은 짙은선 (흑색)은 염색하지 않은 세포, 굵은 짙은선 (암청색)은 R-PE-145. 2C11으로만 염색한 세포, 얇은 점선 (자홍색) 세포는 R-PE-145. 2C11 및 과량의 비컨쥬게이트 145.2C11으로 염색된 세포, 및 얇은 이중 점선 (옅은 청색)은 R-PE-145.2C11 및 과량의 비컨쥬게이트 145.2C11-IgG3으로 염색된 세포를 나타낸다. (C). 과량의 PV1은 EL4 세포에 대한 결합에 대하여 PV1-IgG3과 경쟁한다. EL4 세포 를 PV1-IgG3으로 또는 과량의 PV1 없이 염색하였다. 세포를 세척하고 마우스 IgG3 특이, FITC-컨쥬게이트 당나귀 항-마우스 IgG (H+L)으로 염색하였다. 얇은 짙은선 (흑색)은 2차 항체만으로 염색한 세포, 굵은 짙은선 (암청색) 세포는 PV1-IgG3 및2차 항체로 염색한 세포, 얇은 점선 (자홍색) 세포는 PV1-IgG3 및 과량의 PV1, 및 2차 항체로 염색한 세포를 나타낸다.
도 20. PV1-IgG3 및 145.2C11로 염색된 마우스 지라 세포. 세포를 마우스 IgG3 동형 대조군 (A) 또는 PV1-IgG3 (B)로 염색, R-PE-컨쥬게이트 염소 항-마우스 IgG3 및 FITC-컨쥬게이트 145.2C11으로 역-염색(counter-stain)하고, 방법에 기술된 바와 같이 2-배 유식세포 측정에 의해 분석하였다. 림프구 게이트내 세포만을 분석하였다. PV1-IgG3-양성 세포를 상층 사분면에, CD3-양성 세포를 우측 사분면에 존재한다. 각 사분면에서 각 숫자는 특정 사분면에서 세포의 퍼센트를 나타낸다.
본 발명은 유사분열 활성이 결여된 항-CD28 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "사일런스 항-CD28 항체"는 유사분열 활성이 결여된 항-CD28 항체를 의미한다. 더욱 구체적으로, T 세포의 표면상의 항원 CD28 수용체에 특이적으로 결합하고 항-CD3 항체와의 결합(combined) 자극에 의해 T 세포의 성장 또는 활성화를 촉진시키지 않는 항체이다.
유전 공학 기술 또는 화학적 변형에 의해 작용성 항-CD28 항체를 돌연변이화 하거나 변형시켜 항-CD28 항체 또는 항 CD28 항체-생산 하이브리도마에 기초하여 사일런스 항-CD28 항체를 작제할 수 있다. 예로서 유전공학 기술을 이용하여, 항체의 Fc 영역의 아미노산 서열에 돌연변이를 도입시켜 Fc 수용체에 대한 항-CD28 항체의 결합능을 감소시키거나 제거할 수 있다. 예를 들면, 항 CD28 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포로부터 cDNA를 분리하고 Fc 수용체에 대한 결합에서 중요한 역할을 하는 Fc 영역에 상응하는 서열 부위에 돌연변이(들)를 도입하여 사일런스 항-CD28 항체를 수득할 수 있다(WO 88/07089). Fc 수용체의 결합을 저해할 수 있는 한 돌연변이 부위는 특별히 제한되지 않는다. IgG 항체 부류의 경우, 예를 들면, H-쇄 아미노산 잔기 234,235,236,237,318,320 및 322이 바람직하고 적어도 하나의 이들 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체하여 사일런스 항-CD28 항체를 작제할 수 있다.
사일런스 항-CD28 항체의 공급원은 항체를 사용하는 표적 동물에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 비인간형 모노클로날 항체는 상당히 광범위한 범위의 인간에 대하여 항원성을 보이는 아미노산 서열을 포함한다. 다수의 연구에서 외부 항체 주입후 상기 항체에 대한 환자의 면역 반응은 매우 강하게 나타났고 항체 투여가 환자에게 위험한 상태를 가져올 수 있거나 항체로부터 치료적 유용성을 빼앗을 수 있다고 나타났다. 따라서, 치료적 표적 동물에 상대적으로 더욱 상동성인 항체를 만들기 위해 Fc 부위를 대체하고, 가변 부위의 골격부를 대체하거나, 표적 동물의 항체 유전자가 도입되는 형질전환 동물로부터 수득된 항체를 사용하는 것을 권고할 수 있다. 예를 들면, 항체를 인간에게 투여하고자 하는 경우, Fc 영역의 대체시 이용가능한 키메라성 항체 (EP125023), 대체된 골격부를 포함하는 인간화 항체(EP0239400, EP045126) 또는 인간 항체 유전자가 도입된 형질전환 동물로부터 수득된 인간 항체(EP546073, WO 97/07671). 상기 기술된 바와 같은 유전공학 기술 또는 화학적 변형에 의해 이들 항체에서 돌연변이를 도입하여 항체의 유사분열 활성을 감소시키거나 제거할 수 있다.
사일런스 Fc 영역을 갖는 항-CD28 항체의 구체적인 예로서, 이하 실시예에서언급되는 항체 및 서열번호: 2 및 NO : 4 또는 서열번호 : 6 및 8에 나타낸 가변 부위의 아미노산 서열에 기초한 가변 부위 폴리뉴클레오티드 및 치료적 표적 동물의 불변영역 유전자를 사용하여 합성적으로 제조된 항체를 언급할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 예는 서열번호: 1,3,5, 및 7이다.
본 발명의 더욱 구체적인 예는 HuTN228 및 MuTN228 및 그의 Fab 단편, 그의 F (ab)'2 단편, 그의 유도체 등이다.
본 분야의 기술자에 인지되어 있는 바, 세번째 염기의 축퇴(degeneracy)에 의해 거의 모든 아미노산은 코딩 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 트리플릿 코돈에 의해 나타낼 수 있다. 추가로 최소한의 염기쌍 변형이 코딩되는 아미노산 서열에서 변이(보존적 치환)를 초래할 수 있고, 실질적으로는 유전자 산물의 생물학적 활성을 변화시킨다고 예측되지 않는다. 따라서, 본 명세서 기술되는 바와 같은 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열화는 서열에서 미세하게 변형될 수 있지만(예: 트리플릿 코돈에서 뉴클레오티드의 치환) 여전히 동일한 아미노산 서열의 각각의 유전자 산물을 코딩한다.
용어 "발현 벡터"는 본 발명의 펩티드를 코딩하고 선택된 숙주 세포에서 그의 발현을 위해 필수적인 서열을 제공하는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 발현 벡터는 통상 전사 프로모터 및 터미네이터를 포함하거나, 내인성 프로모터에 인접한 결합을 제공할 것이다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드, 추가로 복제 기점 및 하나 이상의 선택가능한 마커일 것이다. 그러나, 발현 벡터는 다르게는 숙주를 감염시키기 위해 고안된 바이러스 재조합체, 또는 숙주의 게놈내에서 바람직한 부위에 통합되도록 고안된 통합 벡터일 수 있다. 발현 벡터의 예는 [Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, Frisch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 기술되어 있다.
사일런스 항-CD28 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 원시세균, 및 다른 진핵 세포를 포함한다. 세균, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주를 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면, [Pouwels et al. Cloning vector: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)]과 같이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 바람직하게, 세포는 포유동물 세포이다. 벡터는 플라스미드 벡터, 싱글 또는 더블-스트랜드 파지 벡터, 또는 싱글 또는 더블-스트랜드 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 DNA 및 RNA를 세포내로 도입시키는 공지되 방법에 의해 폴리뉴클레오티드, 바람직하게 DNA로서 세포내로 도입될 수 있다. 또한 파지 및 바이러스 벡터인 경우 벡터는 감염 및 형질도입을 위해 잘 공지되어 있는 기술에 의해 패키지되거나 캡슐화된 바이러스로서 세포내로 도입될 수 있거나 바람직하게는 도입된다. 바이러스 벡터는 복제가능하거나 복제 불가능할 수 있다. 후자의 경우 바이러스 증식은 통상 보체 숙주 세포(completing host cells)에서 발생할 것이다. 본 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 단백질을 생산하기 위하여 무세포 해독 시스템을 사용할 수 있다.
단백질 화학 분야에서 통상 공지되어 있는 단백질용 분리/정제 방법에 의해 사일런스 항-CD28 항체/단백질을 정제할 수 있다. 더욱 특히, 예를 들면 추출, 재결정, 황산암모늄, 황산나트륨 등을 사용하는 염석법, 원심분리, 투석, 한외여과,흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정규상 (normal phase) 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과법, 겔 침투성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 역류 분포 등 및 이들의 조합을 언급할 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 기술한 바와 같은 재조합 발현 벡터에 의해 정제된 항체를 생산할 수 있다. 방법은 단백질 발현을 촉진시키기에 충분한 조건하에서 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이어서 사용된 발현 시스템에 따라 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 단백질을 회수한다. 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 재조합 단백질을 정제하는 방법은 사용되는 숙주 세포의 유형 및 재조합 단백질이 배양 배지로부터 분비되었는지 여부에 따라 달라질 것이다.
약제학적 조성물로 제형화되는 경우 사일런스 항-CD28 항체는 (a) 기관 또는 조직, 예로서 심장, 신장, 간, 골수, 피부, 각막, 폐, 췌장, 소장, 근육, 신경 등의 이식 후의 이식 거부; (b) 골수 이식에서 이식편대숙주반응; (c) 자가면역 질환 예로서 류마티스관절염, 전신성홍반성루프스, 다발경화증, 중증근육무력증, I형 당뇨병 등; 및 (d) 면역 질환 예로서 천식, 아토피성 피부염등에 사용될 수 있다.
사일런스 항-CD28 항체는 단독으로 면역 반응 및 이식 거부를 저해하고 면역내성을 유도할 것으로 예측할 수 있고, 또한 다른 약물과 배합되어 사용될 수 있다. 사일런스 항-CD28 항체와의 배합에 유용한 다른 약물은 다양한 면역억제제 예로서, 라파미이신, 데옥시스퍼가우린, 항-CD40 항체, 항-CD40L 항체, 프로그라프,사이클로스포린 A, 항-IL-2 항체, 항-IL-2 수용체 항체, 항-IL-12 항체, 항-IL12 수용체 항체 및 MMF이다. 특히, 라파미이신은 IL2 수용체로부터의 시그날중 T 세포의 성장과 관련되는 시그날의 형질도입을 저해하지만 세포고사-관련된 시그날의 형질도입은 저해하지 않기 때문에 CD28 시그날의 특정 저해제와의 배합물에서의 그의 용도는 유용할 것으로 기대된다.
본 발명의 사일런스 항-CD28 항체는 경구 또는 비경구적으로, 바람직하게 정맥내, 근육내 또는 피하 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 사일런스 항-CD28 항체는 액제 또는 냉동분말 형태로 제조될 수 있고, 필요한 경우 다양한 약제학적으로 허용가능한 첨가제 예로서 부형제, 희석제,안정화제, 등장화제 및 완충제와 함께 제형화될 수 있다. 바람직한 첨가제는 말토오스와 같은 당, 폴리소르베이트와 같은 계면활성제, 글리신과 같은 아미노산, 인간 혈청 알부민과 같은 단백질, 및 염화나트륨과 같은 염을 포함한다.
또한, 주사제와 같은 제형(액제, 현탁제, 유제, 사용시 용해시키는 고형제 등), 정제, 캅슐제, 과립제, 분말제, 액상제제, 리포좀 봉입체, 연고, 겔, 외형 분말제, 스프레이, 흡입용 분말제, 안과용 드롭제, 안과용 연고, 좌제, 질좌제 등이 투여 방법에 따라 적절하게 선택될 수 있고 본 발명의 펩티다는 그에 따라 제형화될 수 있다. 통상 제법은 [Chapter 25.2 of Comprehensive Medicinal Chemistry, Volume 5, Editor Hansch et al, Pergamon Press 1990]에 기술되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 용량은 다양한 변수중 특정 조성물, 치료 또는 예방의 표적으로서 질환의 유형, 투여 방법, 환자의 연령 및 상태, 치료 기간에 따른다. 그러나, 정맥, 근육내 또는 피하 투여시, 성인 1인당 1일에 0.01-100 mg/kg, 바람직하게 0.1-10 mg/kg을 투여할 수 있다.
본 발명의 사일런스 항-CD28 항체를 기관 또는 조직 이식에서 이식 거부의 억제 또는 면역내성의 유도를 위해 사용하는 경우, 조성물은 이식 직전, 이식 직후, 및 이식 후 3,7,12, 18, 25,35,45 및 60일째 약 1 mg/kg/일의 용량으로 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 이식후 거부 반응을 관찰하면서 투여 횟수 및 용량을 적절하게 증가 또는 감소시킬 수 있다.
투여 간격은 다양한 변수중 사용하는 투여 방법 및 환자의 상태에 따라 다르고, 연속적 투여 및 간헐적 투여가 가능하다. 따라서, 본 발명의 사일런스 항-CD28 항체는 항체이므로, 지속적인 효능을 제공하여 간헐적 투여는 예상되는 효능으로 보상받을 수 있다. 치료 기간과 관련하여, 일단 내성 상태에 도달하면 사일런스 항-CD28 항체의 사용이 중단되더라도 이 내성은 유지될 수 있다. 이와 관련하여, 이 사일런스 항-CD28 항체가 중단후 감소하는 면역억제 효능이 중단 후 감소하는 다른 면역억제제보다 우수하다는 것은 의심할 여지가 없다.
본 발명을 일반적으로 설명하면서, 단지 설명하기 위한 목적으로 본 명세서에서 제공되는 구체적인 특정 실시예를 참고로 하여 추가적으로 이해될 수 있고, 이는 달리 언급하지 않는 한 제한하고자 하는 것은 아니다. 이하 실시예은 상세히 설명되는 것을 제외하고 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있는 표준 기술을 사용하여 시행한다.
실시예 1. 마우스 항- CD28 항체의 아미노산 서열화
하이브리도마 생산 항-인간 CD28 항체 (클론: TN228, 마우스 IgGl 카파)는 일반적으로 Dr. Yagita (Juntendo University SchooL 의 Medicine, Japan)에 의해 제공받았다. 약 0.2 mg의 정제된 항-인간 CD28 항체 (TN228)를 0.64 M 구아니딘-HCl, 0.28 M Tris-HCl, pH 8.5, 0.055 M DT7에서 90'동안 60℃(아르곤하)에서 환원시키고, 실온에서(암실) 45'동안 요오도아세트산을 0.13M에 가하여 카복시메틸화시킨 후, DTr을 0.32 M에 가하고(카복시메틸화 반응을 종결시키기 위해), 즉시 PD10 칼럼(카달로그 #17-0851-01, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용하여 0.1 M 인산나트륨, 0.002 M EDTA, pH 8.0에서 완충-교환시켰다. 용출액을 0.005 M DTT, 0.02 % 글리세롤로 조절하고, 상기 용액의 1/3(약 0.35 ml)을 중쇄의 N-말단 탈차단(deblocking)을 위해 분리용 튜브에 이동시켰다. 24시간동안 45℃에서 샘플을 1800μU의 피로글루타메이트 아미노펩티다아제(카달로그 # 7334, Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 분해하였다. 탈차단된 샘플로부터의 경 및 중쇄의 N-말단 서열은 20회의 자동 Edman 분해 및 Model 241 단백질 서열기(Hewlett Packard, Palo Alto, CA)상의 PTH 분석에 의해 결정하였다. PTH 유도체를 Hypersil ODS C18 칼럼상에서 분석하였다. 서열기 및 HPLC는 제조사의 지시에 따라 작동시키고 시약, 용매, Hewlett Packard로부터 입수한 칼럼을 사용하였다.
피로글루타메이트 아미노펩티다아제를 사용하여 deblocked된 TN228에 대한 N-말단 서열화 결과는 하기와 같다:
실시예 2. 가변 부위 cDNA의 클로닝
TN228의 경쇄 및 중쇄에 대한 V 부위 cDNAs를 Co et al. (Co, M. S., N. M. Avadalovic, P. C. Caron, M. V. Avadalovic, D. A. Scheinberg, and C. Queen. 1992. 키메라성 and humanized 항체 with specificity for the CD33 antigen. J. Immunol. 148: 1149-1154.)에 의해 기술된 고정중합효소 연쇄반응(PCR) 반응에 의해 하이브리도마 세포로부터 클로닝하였다. 각각 마우스 카파 및 감마 쇄 C 영역에 어닐링하는 3' 프라이머, 및 cDNA의 첨가된 G-테일에 어닐링하는 5'프라이머를 사용하여 cDNA 상에서 증폭을 수행하였다. VL PCR을 위해 3' 프라이머는 마우스 Cκ 영역에 혼성화되는 잔기 17-46을 포함하는 서열(서열번호 13):
을 갖는다. VH PCR을 위해, 3' 프라이머는 마우스 IgG CH1에 혼성화되는 잔기 17-50을 포함하는 축퇴 서열 (서열번호: 14,15 및 16):
을 갖는다. 두개의 프라이머 세트중 비-혼성화 서열은 클로닝을 위해 사용되는 제한 영역을 포함한다. 서열 측정을 위해 VL 및 VH cDNAs를 TOPOII Blunt 벡터 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)내로 서브클로닝하였다.
수개의 경쇄 및 중쇄를 두개의 독립된 PCR 반응으로부터 서열화하였다. 경쇄에 대하여 마우스의 경쇄 가변 부위에 상동성인 두개의 독특한 서열을 동정하였다. 프레임쉬프트 돌연변이(frame shift mutation)에 기인하여 하나의 VL 서열은 비-기능성이고 비-생산성 대립유전자로서 동정되었다. 다른 하나의 VL 서열은 기능성 마우스 카파 쇄 가변 부위를 대표하였다. 중쇄에 대하여, 대표적인 마우스 중쇄 가변 부위에 상동성인 독특한 서열을 동정하였다. 가변 부위의 뉴클레오티드 서열 및 그의 추론된 아미노산 서열을 도 2 및 도 3에 나타낸다.
실시예 3. 키메라성 TN228-IgG2M3의 작제 및 발현
(방법)
He 등(He, X. Y., Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M. S. Co, and E. L. Berg. 1998. Humanization and pharmacokinetics of a MonoClonal 항체 with specificity for both E-and P-selectin. J. Immunol. 160: 1029-1035)에 의해 기술된 바와 같이 Xbal 사이트의 측면에 위치하는 미니-엑손 분절로 TN228 VL및 VH를 PCR에 의해 전환시키고 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드내로 서브클로닝하였다(도 1). 각 미니-엑손은 가장 상동성인 마우스 J 쇄 유전자로부터 유래된 시그날 펩티드 서열, 성숙 가변 부위 서열 및 스플라이싱 도너 서열을 포함한다. 스플라이싱 도너 서열을 사용하여 V 부위 엑손을 인간 항체 불변 부위로 스플라이싱하였다. 발현 벡터내로 클로닝한 후 각 미니-엑손을 서열화하여 정확한 서열이 수득되고 PCR 에러는 발생하지 않았다는 것을 확인하였다. 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드의 불변 부위 엑손 또한 서열화에 의해 확인하였다.
본 명세서에서, ChTN228은 마우스 TN228 VL 및 VH 가변 부위, 중쇄에 대한 인간 IgG2M3 불변 부위, 및 경쇄에 대한 인간 카파 불변 부위를 포함하는 키메라성 항체를 언급한다. 중쇄 불변 부위는 인간의 배 계열(germline) 2 게놈 단편으로부터 변형되고(Cole, M. S., C. Anasetti, and J. Y. Tso. 1997. Human IgG2 variants of 키메라성 항-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 159: 3613-3621), 경쇄는 배 계열 인간 K 게놈 단편으로부터 유래하였다. 중쇄 및 경쇄 유전자는 인간 거대세포바이러스 주요 조기(major immediate early) 프로모터 및 인핸서에 의해 작동한다. 중쇄 유전자뒤에 인간 보체 유전자 C2로부터 유래된 전사 터미네이터가 있다(Ashfield, R., P. Enriquez-Harris, and N. J. Proudfoot. 1991. Transcriptional termination between the closely linked Human complement gene C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc ? EMBO J. 10: 4197-4207). 경쇄 선별 마커 gpt 유전자 (Mulligan, R. C., and P. Berg. 1981. Selection for animal cell that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076) 및 중쇄 선별 마커 dizfr 유전자 (Simonsen, C. C., and A D. Levinson. 1983. Isolation and expression of an altered mous dihydrofolatereductase cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499)는 SV40 조기 프로모터에 의해 작동한다. 키메라성 TN228의 발현을 위해, COS-7 세포 (원숭이 신장 세포주)내로의 일시적 형질감염은 리포펙트아민 (카달로그 # 10964-013, GIBCO BRL)을 사용하여 수행되었다. 포획 시약(capturing agent)으로서 염소 항-인간 IgG 감마 쇄 특이성 항체 및 현상 시약으로서 HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 카파 쇄 항체를 사용하여 ELISA에 의해 인간 IgG2M3 항체 생산에 대하여 일시적 형질감염체로부터의 소모 배지(Spent media)를 분석하였다. 소모 배지를 간접적 면역형광 염색에 의해 P815/CD28+세포(P815 (mouse mastcytoma)내로 CD28으로 안정적으로 형질감염된 세포)에 결합하는 ChTN228의 능력을 시험하고 유식세포측정에 의해 분석하였다. 안정 세포주 생산을 위해, 전기천공에 의해 키메라성 발현 플라스미드를 뮤린 골수종 세포주 Sp2/0내로 형질감염시키고 형질감염체를 gpt 발현을 위해 선별하였다. 안정 형질감염체로부터 소모 배지를 일시적인 형질감염에 대한 것과 같이 분석하였다.
결과
클론된 VL 및 VH 유전자를 PCR에 의해 미니-엑손으로 전환시키고(도 2 및 3) 상기 기술하고 도 1에 나타낸 바와 같이 경쇄 및 중쇄 발현 벡터내로 서브크로닝하였다.
COS-7 세포의 일시적 형질감염: 키메라성 발현 벡터를 원숭이 신장 세포주 COS-7로 일시적으로 형질감염시켜 키메라성 TN228+항체를 생산하였다. 형질감염된세포로부터의 소모 배지를 키메라성 IgG2M3 항체의 생산에 대하여 ELISA에 의해 시험하고 P815/CD28+세포의 결합에 대하여 유식세포측정에 의해 시험하였다. 소모 배지는 양 분석에서 양성이었다. 일시적 형질감염으로부터 키메라성 항체의 수율은 ~0.9μg/ml이었다. 일시적 상층액으로부터의 ChTN228 항체는 농도에 의존적인 방식으로 P815/CD28+세포에 결합하였다(데이타를 나타내지 않았다).
Sp2/0 세포의 안정적인 형질감염: 안정적인 세포주를 생산하기 위해 키메라성 발현 벡터를 Sp2/0 세포내로 형질감염시켰다. 수개의 형질감염체로부터의 소모 배지를 일시적 형질감염체를 사용한 경우와 같이 P815/CD28+세포에 대한 결합 및 키메라성 TN228 항체 생산에 대하여 시험하였다. 대부분의 형질감염체는 두개의 모든 분석에 대하여 양성이었다. 하나의 형질감염체를 그의 더욱 높은 항체 생산성에 대하여 선택하고 확장시켜 5 L의 무혈청 배지에서 배양하였다. ChTN228 를 친화성 크로마토그래피에 의해 5 L 의 소모 배지로부터 정제하였다. 정제된 항체의 수율은 ~25 mg이었다.
실시예 4 키메라성 항체 ChTN228의 단백질 정제
안정 형질감염 (클론 7H)으로부터의 높은 ChTN228 발현 형질감염체중 하나를 5ℓ의 GIBCO 하이브리도마 무혈청 배지(카달로그 # 12045-076, GIBCO BRL)에서 배양하였다. 세포 생육성이 10% 이하에 도달하였을 때 소모 배양 상층액을 수집하고, 500ml으로 농축시키고, Pharmacia PI 펌프 (2-3ml/분)를 사용하여 5 ml 단백질-A 세파로스 칼럼상에 적재하였다. 항체를 0.1 M 글리신, 0.1 M NaCl, pH 2.7로 용출시키기 앞서 칼럼을 PBS로 세척하였다. 용출된 단백질을 3회 교환된 2L PBS에 대하여 투석시킨 후 추가의 0.1 M NaCl을 포함하는 PBS로 평형화된 PD-10 칼럼상에서 탈염화하였다. 40℃에 저장하기 전에 탈염화된 단백질 용액을 0.2μm 필터로 여과하였다.
실시예 5 크기배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의한 순도 측정
PE ISS 200 Advanced LC Sample Processor, PE Series 410 Bio LC 펌프, PE 235C Diode Array Detector, 및 PE Nelson 600 Series LINK로 구성된 Perkin Ehner HPLC 시스템을 사용하여 크기배제 HPLC를 수행하였다. Perkin Ehmer Turbochrohn Navigator Version 4.1 소프트웨어를 사용하여 오토샘플러, 펌프, 및 검출기를 조정하고, 데이타를 얻고, 저장하고, 프로세싱하였다. 연속하여 연결된 두개의 TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL 크기배제 HPLC 칼럼(7.8 mm x 300 mm, 5μ m 입자 크기, 250Å 공극; 카달로그 # 08541, TosoHaas, Montgomeryville, MD)를 사용하여 분리하였다. 유동상은 200 mM 인산칼륨/150 mM 염화칼륨, pH 6.9이고, 유속은 1.00 mL분이었다. 칼럼 용출액을 220 nm 및 280 mn에서 분광광도적으로 관찰하였다. 주입 용량은 희석되지 않은 ChTN228 샘플 50㎕(50μg)이었다.
4-20% 구배 겔(카달로그 # EC6025, Novex, SanDiego, CA)상에서 표준 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다.
분리된 ChTN228의 순도를 크기배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 이 분석에 기초하여, 이 단백질은 96.5% 모노머이고 분자량이 ~160 kD인 단백질에 상응하는 유동성을 가졌다. 또한, 비축소 조건하에서의 MuTN228, 동형 대조군 MuFd79(마우스 IgGl), HuTN228, 및 동형 대조군 HuEP5C7 (인간 IgG2M3)의 SDS-PAGE 분석은 4개 항체 모두 약 150-160 kD의 분자량을 갖는다는 것을 나타낸다. 축소 조건하의 동일한 4개의 단백질의 분석은 4개 항체 모두 약 50 kD의 분자량을 갖는 중쇄 및 약 25 kD의 분자량을 갖는 경쇄로 구성된다는 것을 나타낸다.
실시예 6. 경쟁 시험:
방법
250 ng/est에서 시작하여 연속하여 2배로 희석된 MuTN228-FITC 항체 희석액을 사용하여 적정 시험을 수행하였다. P815/CD28+세포(5x105세포/시험)을 얼음상에서 1시간동안 FITC-표지된 항체와 인큐베이션시키고, PBS로 세척하고 유식세척측정에 의해 분석하였다. 경쟁 시험을 위해, 25 ng의 MuTN228-FITC 및 800 ng/시험에서 시작하는 경쟁 ChTN228 또는 MuTN228 항체의 일련의 2배 희석액을 P815/CD28+세포 (5x 105세포/시험)에 가하였다. 대조군으로서, P815/CD28+세포(5x105세포/시험)를 25 ng의 MuTN228-FITC과만 (즉, 경쟁자없이) 인큐베이션시켰다. HuEP5C7 및 MuFd79 동형 대조군 항체 (800ng/시험) 또한 경쟁자로서 시험하였다. 세포를 얼음상에서(암실에서) 1시간동안 최종 용량으로 150㎕의 항체 혼합물과 인큐베이션시킨 후 세척하고 유식세포측정에 의해 분석하였다.
결과
방법에 기술된 방법과 같이 유식세포측정 경쟁 시험에서 MuTN228 및 ChTN228 항체의 결합 특이성을 비교하였다. 다양항 용량의 표지되지 않은 MuTN228 또는ChTN228을 25 ng의 FITC-표지된 MuTN228 항체와 혼합하고 P815/CD28'세포와 함께 인큐베이션시켰다. MuTN228 및 ChTN228은 농도 의존적인 방식으로 MuTN228-FITC와 경쟁하고, 이는 양 항체 모두의 결합이 CD28 항원에 특이적임을 나타내었다(도 4). 동형 대조군 항체 MuFd79 및 HuEP5C7은 MuTN228-FITC와 경쟁하지 않았고, 이는 MuTN228 및 ChTN228 항체가 V-부위의 특이적 상호작용을 통해 CD28 항원을 인식한다는 것을 나타낸다.
실시예 7 인간 F R 에 대하여 감소된 친화성을 갖는 키메라성 항-인간 CD28 항체는 1차 혼합된 림프구 반응을 저해한다.
세포 표본
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque 플러스(Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 지원자로부터 표본화하였다. 인간 혈액을 동량의 RPMI1640으로 희석하고 Ficoll-Paque 플러스상에 오버레이하였다. 30분동안 실온에서 원심분리한 후, PBMC를 회수하고 RPM11640으로 세척하였다. 이후, PBMCs를 배지(2.5% 인간의 AB형 혈청, 2-머캅토에탄올, 및 항생제를 포함하는 RPMI1640)로 현탁시키고 나일론 피버 칼럼 (Wako junyaku, Osaka, Japan)에 사용하였다. 5% CO2에서 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시킨 후, T 세포를 가온된 배지로 용출시켰다.
인간 B 세포주(Raji and JY)를 혼합된 림프구 반응에서 자극제 세포로서 사용하였다. 이들 세포에 사용전 X-레이 조사하였다(2000R).
1차 혼합된 림프구 반응(1 st MUR)
정제된 인간 T 세포(1 x 105세포/웰) 및 조사된 Raji (1 x 105세포/웰)을 96웰 플랫 바닥 마이크로 플레이트에 플레이팅하였다. 항체를 배양 배지에 가하고 세포를 7일동안 인큐베이션시켰다. 모든 배지를 최종 6시간동안 10 kBq/웰 [3H] 티미딘 (Amersham Pharmacia biotech)로 표지화하였다. 세포를 회수하고 액체섬광계수기에 의해 통합된 방사능을 측정하였다.
1차 MLR에 대한 TN228-IgG2m3 (ChTN228)의 효능을 도 5 및 6에 나타내었다. 원(original) 항-인간 CD28 항체 TN228 (MuTN228)은 1차 MLR을 저해시키지 못했지만, 키메라성 항체 TN228-IgG2m3은 용량에 의존적인 방식으로 저해시켰다. 따라서, 항-인간 CD28 항체의 Fc 영역을 인간 Fc R에 대한 친화성인 감소된 것으로 전환시켜 항체를 T 세포 증식에 대하여 길항성으로 만든다.
인간 Fc R에 대한 친화성을 감소시킨 키메라성 항-인간 CD28 항체는 2차 혼합된 림프구 반응에서 T 세포 반응성을 저하시킨다.
2차 혼합된 림프구 반응 (2 nd MLR)
정제된 인간 T 세포(1 x 105세포/웰) 및 조사된 Raji 세포 (1 x 105세포/웰)을 96웰 플랫 바닥 마이크로 플레이트에 플레이팅하였다. 항체를 배양 배지에 가하고 세포를 인큐베이션시켰다. 5일 후, 세포를 회수하고 신선한 배지로 세척하였다. 세포를 신선한 배지로 현탁시키고 8일동안 배양하였다. 세포를 조사된 Raji또는 JY 세포로 다시 자극하였다. 추가의 7일동안 배양한 후, 6시간동안 세포를 10 kBq/웰 [3H] 티미딘과 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 회수하고 액체섬광계수기에 의해 통합된 방사능을 측정하였다.
TN228-IgG2m3은 1차 MLR을 저해하였다(도 5 및 6). 이후, 본 발명자는 2차 MLR에 대항 이 항체의 효능을 분석하였다. 항체를 1차 MLR 배지에 적용한 후, 항체를 배양 상층액으로부터 제거하였다. 항체가 없는 배지에서 배양한 후, 세포를 도일한 자극 (Raji) 또는 제 3의 자극원(JY)으로 다시 자극시켰다. 1차 MLR을 통해 TN228-IgG2m3으로 처리된 세포의 증식은 처리되지 않은 세포의 것과 비교하여 감소하였다. 그러나, 양 세포 모두는 제 3의 자극원(JY)을 사용한 것과 거의 동일한 정도로 증식하였다(도 7). 이 결과는 인간 Fc R에 대한 감소된 친화성을 갖는 항-인간 CD28 항체가 alo-항원 자극을 통해 T-세포 에너지를 유도할 수 있임을 나타낸다.
실시예 8. 인간화 TN228 가변 부위의 설계
MuTN228의 V-영역 서열을 컴퓨터 모델링에 의해 분석하였다. Kabat 항체 서열 데이타베이스(8. Johnson, G., and T. T. Wu. 2000. Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res. 28: 214-218)에 대한 서열 상동성 서치에 기초하여, IC4 (Manheimmer-Lory, A., J. B. Katz, M. Pillinger, C. Ghossein, A. Smith, B. Diamond. 1991. Molecular characteristics of 항체 bearing an 항-DNA-associated idiotype. J. Exp. Med.174: 1639-1652)를 선택하여 골격에 인간화 TN228 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 제공하였다. 인간화 TN228 중쇄 가변 영역은 마우스 TN228 중쇄 골격의 것과 일치하거나, 76% 일치하는 85개의 골격 잔기중 65개의 잔기를 갖는다. 인간화 TN228 경쇄 가변 영역 마우스 TN228 경쇄 골격의 것과 일치하거나, 70% 일치하는 80개의 골격 잔기중 56개의 잔기를 갖는다.
컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD (Levitt, M. 1983. Molecular dynamics of native protein. I. Computer simulations of trajectories. J. Mol. Biol. 168: 595-620)를 사용하여 TN228 가변 영역의 분자 모델을 작제하고, 이를 사용하여 그들과 강력하게 상호작용하도록 CDRs에 충분히 가깝게 마우스 TN228 골격중 아미노산을 위치시켰다. 인간화 TN228 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 설계하기 위하여 마우스 TN228 중쇄로부터의 CDRs를 인간 IC4 중쇄의 골격 영역에 이식하고 마우스 TN228 경쇄로부터의 CDRs를 인간 IC4 경쇄의 골격 영역에 이식하였다. 컴퓨터 모델에 의해 CDRs와의 접촉에 중요한 것으로 제안되는 골격 위치에서, 마우스 항체로부터의 아미노산을 원 인간 골격 아미노산에 대하여 치환하였다. 인간화 TN228에 대하여, 중쇄의 잔기 27,29,30,48, 67,71 및 78에서 수행되었다. 경쇄에 대하여, 어떤 치환도 없었다(즉, MuTN228 CDRs을 IC4 골격 영역으로 직접 이식하였다). 추가로, 인간 항체 데이타베이스내 그 위치에서는 거의 드물게 발견되는 골격 잔기를 그 위치에서 인간 보존적 아미노산으로 대체하였다. 인간화 TN228에 대하여 중쇄의 잔기 23,40,73,83 및 85, 경쇄의 잔기 69 및 77에서 수행하였다. 인간화 TN228 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도 9 및 10에 나타낸다.
실시예 9. 인간화 TN228-IgG2M3의 작제 및 발현
방법
상기 기술한 바와 같이 인간화 가변 부위 아미노산 서열을 설계한 후, 시그날 펩티드, 스플라이스 도너 시그날 및 적절한 효소 사이트를 코딩하다록 유전자를 작제하였다(도 8). 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자를 작제하고 길이가 대략 65 내지 80개의 염기 범위인 8개의 오버랩핑 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켰다(He, X. Y, Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M. S. Co, and E. L. Berg. 1998. Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both EandP-selectin. J. Immunol. 160: 1029-1035). 올리고뉴클레오티드를 쌍으로 어닐링하고 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로 신장시켜, 더블-스트랜드 단편을 수득하였다. 생성된 단편을 변성시키고 쌍으로 어닐링하고 클레나우로 신장시켜 두개의 단편을 수득하였다. 이들 단편을 변성시키고 쌍으로 어닐링하고 다시 클레나우로 신장시켜 전장의 유전자를 수득하였다. 생성된 산물을 Taq 폴리머라제를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시키고, 겔-정제시키고, Xbal로 분해하고, 다시 겔-정제시키고, 중쇄의 발현을 위해 pVg2M3 및 경쇄의 발현을 위해 pVk의 XbaI 사이트내로 서브클로닝하였다. 인간 감마 2 중쇄 발현을 위한 pVg2M3 벡터(Cole, M. S., C. Anasetti, and J. Y. Tso. 1997. Human IgG2 variants of 키메라성 anti-CD3 are nonmitogenic to T cell. J. Immunol. 159: 3613-3621), 및 인간 카파 경쇄 발현을 위한 pVk 벡터(CO, M. S., N. M. Avadalovic, P. C. Caron, M. V.Avadalovic, D. A. Scheinberg, and C. Queen. 1992. chimeric and Humanized antibody with specificity for the CD33 antibody. J. Immunol. 148: 1149-1154)은 앞서 기술되었다.
중쇄 및 경쇄 최종 플라스미드의 V-부위 및 불변 부위 엑손의 서열을 뉴클레오티드 서열화에 의해 확인하였다. 최종 플라스미드의 전체 구조를 제한 지도화에 의해 확인하였다. 표준 방법에 의해 모든 DNA 조작을 수행하였다.
본 명세서에서, HuTN228은 인간화 TN228 VH 및 VL 가변 부위, 중쇄에 대한 인간 IgG2M3 불변 부위, 및 중쇄에 대한 인간 카파 불변 부위를 포함하는 인간화 항체를 언급한다. 중쇄 불변 부위는 배 계열 인간 2 게놈 단편으로부터 수정되었고 (Cole, M. S., C. Anasetti, and J. Y. Tso. 1997. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T 세포. J. Immunol. 159: 3613-3621) 경쇄는 배 계열 인간 K 게놈 단편으로부터 유래되었다. 인간 거대세포바이러스 주요 조기(major immediate early) 프로모터 및 인핸서가 중쇄 및 경쇄 유전자를 작동시킨다. 중쇄 유전자뒤에 인간 보체 유전자 C2로부터 유래된 전사 터미네이터 가 있다(Ashfield, R., P. Enriquez-Harris, and N. J. Proudfoot. 1991. Transcriptional termination between the closely linked Human 보체 genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO J. 10: 4197-4207). 경쇄 선별 마커 gpt 유전자 (Mulligan, R. C., and P. Berg. 1981. Selection for animal cell that express the Escherichia coli gene coding for xan얇은e-guanine phosphoribosyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :2072-2076) 및 중쇄 선별 마커 dhfr 유전자 (Simonsen, C. C., and A. D. Levinson. 1983. Isolation and expression of an altered mous dihydrofolate reductase cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499)는 SV40 조기 프로모터에 의해 작동된다.
HuTN228의 발현을 위해, 리포펙트아민 2000 (카달로그 # 11668-027, Life Technologies)를 사용하여 COS-7 세포 (원숭이 신장 세포주)내로 일시적인 형질감염을 수행하였다. 포획 시약(capturing agent)로서 염소 항-인간 IgG 감마 쇄 특이성 항체 및 현상 시약으로서 HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 카파 쇄 항체를 사용하여 ELISA에 의해 인간 IgG2M3 항체 생산에 대하여 일시적 형질감염체로부터의 소모 배지를 분석하였다. 또한 The 소모 배지를 간접적 면역형광 염색에 의해 P815/CD28 세포에 결합하는 HuTN228의 능력을 시험하고 유식세포측정(자료는 나타내지 않음)에 의해 분석하였다. 안정 세포주 생산을 위해, 전기천공에 의해 인간화 발현 플라스미드를 뮤린 골수종 세포주 Sp2/0내로 형질감염시키고 형질감염체를 gpt 발현을 위해 선별하였다. 안정 형질감염체로부터 소모 배지를 일시적인 형질감염에 대한 것과 같이 분석하였다.
결과
인간화 V-영역 아미노산 서열 디자인에 기초하여, 방법에 기술한 바와 같이 중쇄 및 경쇄 V-유전자 (도 9 및 10)를 작제하였다. 중쇄 및 경쇄 V-유전자를 도 8에 나타낸 바와 같이 각각 pVg2M3 및 pVk 벡터로 클로닝하였다. 수개의 클론을 뉴클레오티드 서열화에 의해 분석하고 두개 모두의 중쇄 및 경쇄 발현 벡터중 정확한클론을 형질감염을 위해 사용하였다. 두개 모두의 중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 불현 부위 또한 서열화에 의해 확인하였다.
실시예 10. HuTN228의 발현.
COS-7 세포의 일시적 형질감염: 발현 벡터를 일시적으로 원숭이 신장 세포주 COS-7내로 일시적으로 형질감염시켜 HuTN228 항체를 생산하였다. ELISA에 의해 형질감염된 세포로부터의 소모 배지를 인간화 gG2M3 항체의 생산에 대하여 시험하고 유식세포측정에 의해 P8l5/CD28+세포에 대한 결합을 분석하였다(자료는 나타내지 않음). 소모 배지는 양 분석에 대하여 양성이었다. 일시적 형질감염으로부터의 인간화 항체의 수율은 -3.7 g/ml이었다. 일시적 상층액으로부터의 HuTN228 항체는 농도에 의존한 방식으로 P815/CD28+세포에 결합하였다(자료는 나타내지 않음).
Sp2/0 세포의 안정 형질감염: 안정 세포주의 생산을 위해 인간화 발현 벡터를 Sp2/0 세포내로 형질감염시켰다. 수개의 형질감염체로부터의 소모 배지를 일시적 형질감염체를 사용한 것과 같이 HuTN228 항체 생산에 대하여 시험하였다. 하나의 형질감염체(클론 4)를 더욱 높은 생산성에 대하여 선택하고 GIBCO 하이브리도마 무혈청 배지에서 확장시켰다. 친화성 크로마토그래피에 의해 HuTN228 항체를 570㎖의 소모 배지로부터 정제하였다. 정제된 항체의 수율은 ~7 mg였다.
실시예 11. 단백질 정제
안정 형질감염 (클론 4)으로부터의 높은 HuTN228 발현 형질감염체중 하나를 570 mℓ의 GIBCO 하이브리도마 무혈청 배지 (카달로그 # 12045076, LifeTechnologies)에서 배양하였다. 세포 생육성이 10% 이하에 도달하였을 때 소모 배양 상층액을 수집하고 2 ml 단백질-A 세파로스 칼럼상에 적재하였다. 항체를 0.1 M 글리신, 0.1 M NaCl, pH 2.5로 용출시키기 앞서 칼럼을 PBS로 세척하였다. 용출된 단백질을 3회 교환된 2L PBS에 대하여 투석시킨 후 추가의 0.1 M NaCl을 포함하는 PBS로 평형화된 PD-10 칼럼상에서 탈염화하였다. 40℃에 저장하기 전에 탈염화된 단백질 용액을 0.2 m 필터로 여과하였다.
실시예 11. 크기배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의한 순도 측정
방법
PE ISS 200 Advanced LC Sample Processor, PE Series 410 Bio LC 펌프, PE 235C Diode Array Detector, 및 PE Nelson 600 Series LINK로 구성된 Perkin Ehner HPLC 시스템을 사용하여 크기배제 HPLC를 수행하였다. Perkin Ehmer Turbochrohn Navigator Version 4.1 소프트웨어를 사용하여 오토샘플러, 펌프, 및 검출기를 조정하고, 데이타를 얻고, 저장하고, 프로세싱하였다. 연속하여 연결된 두개의 TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL 크기배제 HPLC 칼럼(7.8 mm x 300 mm, 5 m 입자 크기, 250 공극; 카달로그 # 08541, TosoHaas, Montgomeryville, MD)를 사용하여 분리하였다. 유동상은 200 mM 인산칼륨/150 mM 염화칼륨, pH 6.9이고, 유속은 1.00 mL분이었다. 칼럼 용출액을 220 nm 및 280 mn에서 분광광도적으로 관찰하였다. 주입 용량은 HuTN228 샘플 60l(60 g)이었다.
4-20% 구배 겔(카달로그 # EC6025, Novex, SanDiego, CA)상에서 표준 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다.
제조사의 권고에 따라 인간 IgG Subclass Profile ELISA Kit (카달로그 # 99-1000, Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)를 사용하여 동형의 정제된 항체를 확인하였다.
(결과)
분리된 HuTN228 항체의 순도를 크기배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. HuTN228의 HPLC 용출 프로파일은 나타내지 않았다. 이 분석에 기초하여, 이 단백질은 -98% 모노머이고 분자량이 -160 kD인 단백질에 상응하는 유동성을 가졌다.
또한, 비축소 조건하에서의 MuTN228, 동형 대조군 MuFd79 (마우스 IgGl), HuTN228, 및 동형 대조군 HuEP5C7 (인간 IgG2M3) SDS-PAGE 분석은 4개 항체 모두 약 150-160 kD의 분자량을 갖는다는 것을 나타낸다. 축소 조건하의 동일한 4개의 단백질의 분석은 4개 항체 모두 약 50 kD의 분자량을 갖는 중쇄 및 약 25 kD의 분자량을 갖는 경쇄로 구성된다는 것을 나타낸다.
동형 시험은 HuTN228 항체의 동형이 예상된 IgG2 동형과 일치한다는 것을 나타낸다(자료는 나타내지 않음).
실시예 12. FACS 경쟁 시험.
방법
250 ng/시험에서 시작하여 연속하여 2배로 희석된 MuTN228-FITC 항체 희석액을 사용하여 적정 시험을 수행하였다. P815/CD28+세포(3x105세포/시험)을 100ℓ의 FACS 염색 완충액(FSB = PBS, 2% FBS, 3% 정상 마우스 혈청, 0.1 % NaN3)중 얼음상에서 1시간동안 FITC-표지된 항체와 인큐베이션시키고, FBS로 세척하고 유식세척측정에 의해 분석하였다(자료를 나타내지 않음). 25ℓ의 FSB중 MuTN228-FITC (50 ng/시험)을 25ℓ의 FSB중 경쟁 HuTN228 또는 MuTN228 항체 (200 g/ml에서 시작)의 3개 일련의 희석액과 배합하고, 50ℓ의 FSB중 P815/CD28+세포 (3x105세포/시험)에 가하였다. 대조군으로서, P815/CD28+세포를 MuTN228-FITC(50ℓ의 FSB중 50ng/시험)과만 인큐베이션시켰다. 25ℓ의 FSB중 HuEP5C7(인간 IgG2M3) 및 MuFd79(마우스 IgGl) 동형 대조군 항체 (200g/㎖) 또한 비특이성 경쟁자로서 시험하였다. 세포를 얼음상에서(암실에서) 1시간동안 최종 용량으로 100ℓ의 항체 혼합물과 인큐베이션시킨 후 2㎖의 FSB로 세척하고 유식세포측정에 의해 분석하였다. 이 시험을 3회 반복하였다.
결과
방법에 기술된 방법과 같이 유식세포측정 경쟁 시험으로 MuTN228 및 HuTN228 항체의 P815/CD28+세포상의 CD28에 대한 결합 특이성을 비교하였다. 대표적인 결과는 도 5에 나타낸다. MuTN228 및 HuTN228 모두 농도 의존적인 방식으로 MuTN228-FITC와 경쟁하고, 이는 양 항체 모두의 결합이 CD28 항원에 특이적임을 나타낸다.상대적으로 HuTN228의 결합이 MuTN228의 것보다 몇배 덜하였다. 동형 대조군 항체 MuFd79 및 HuEP5C7은 MuTN228-FITC와 경쟁하지 않았고, 이는 MuTN228 및 HuTN228 항체가 V-부위의 특이적 상호작용을 통해 CD28 항원을 인식한다는 것을 나타낸다.
실시예 13. ELISA 경쟁 시험.
방법
96 웰 ELISA 플레이트 (Nunc-Immuno 플레이트, 카달로그 # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL)를 100ℓ/웰의 sCD28-Fc (PBS중 0.5 g/ml)(sCD28-Fc 는 융합된 단백질이고, 여기에서, CD28의 세포외 영역은 IgGI의 CH2 및 CH3 영역과 결합되었다)으로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 플레이트를 30분동안 TBS중 300ℓ/웰의 Superblock Blocking Buffer (카달로그 # 37535, Pierce, Rockford, IL)으로 차단하고 300ℓ/웰의 ELISA Wash Buffer (EWB = PBS, 0.1% Tween-20)으로 세척하였다. 100ℓ의 ELISA Buffer (EB = PBS, 1% BSA, 0.1% Tween-20)중 MuTN228-바이오틴 (0.5 g/ml) 혼합물 및 100ℓ의 EB중 3개 일련의 희석된 HuTN228 또는 MuTN228 경쟁자 항체 (100 g/ml에서 시작)를 3중으로 최종 용량 200ℓ/웰으로 가하였다. 100ℓ의 EB중 동형 대조군 항체 HuEP5C7 및 MuFd79 (100 g/ml) 또한 비특이성 경쟁자로서 시험하였다. '비 경쟁자' 대조군으로서, 100ℓ의 EB를 100ℓ의 MuTN228-바이오틴 (0.5 g/ml)에 가하였다. 블랭크로서, 200ℓ의 EB를 남은 웰(MuTN228-바이오틴을 포함하지 않음)에 가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 1.5시간동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 300 ℓ/웰의 EWB로 웰을 4회 세척한 후, 100ℓ/웰의 Streptavidin-HRP (1 g/ml, 카달로그 # 21124, Pierce)를 모든 웰에 가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 1시간동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 상기와 같이 웰을 세척한 후 100ℓ/웰의 ABTS 기질(카달로그 #507602 & 506502, KPL, Gaithersburg, MD)을 모든 웰에 가하였다. 플레이트를 5-7분동안 실온에서 인큐베이션시키고 415nm에서 흡광도를 판독하였다. 이 시험을 3회 반복하였다.
결과
sCD28-Fc에 대한 HuTN228 및 MuTN228 항체의 결합 특이성을 방법에 기술된 바와 같이 ELISA 경쟁 시험으로 비교하였다. 대표적인 결과를 도 12에 나타내었다. MuTN228 및 HuTN228은 MuTN228-바이오틴과 농도 의존적인 방식으로 경쟁하였다. 동형 대조군 항체 MuFd79 및 HuEP5C7은 MuTN228-바이오틴과 경쟁하지 않았고, 이는 MuTN228 및 HuTN228 항체가 V-영역 특이성 상호작용을 통해 CD28 항원을 인식한다는 것을 암시한다. 3개의 모든 시험에 대하여 MuTN228 및 HuTN228의 IC50값을 표 2에 나타낸다.상대적으로 HuTN228의 결합이 MuTN228의 것보다 평균 2.6배 낮았다.
표 2 : ELISA 경쟁 요약
실시예 14. 125 I-표지된 항체 경쟁 시험
방법
MuTN228 및 HuTN228 항체의 상대적인 결합능을 Queen 등의 방법(Queen, C., W. P. Schneider, H. E. Selick, P. W. Payne, N. F. Landolfi, J. F. Duncan, N. M. Avdalovic, M. Levitt, R. P. Junghans, T. A. Waldmann. 1989. Humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-10033)에 따라 측정하였다. 간단히, 50ℓ의 Binding Buffer (BB = PBS, 2%FBS, 1 g/ml mouse IgG, 0.1% NaN3)중 ~10 ng의125I-표지된 MuTN228를 50ℓ의 BB중 MuTN228 또는 HuTN228 경쟁자 항체 (400 g/ml에서 시작)의 3배 일련의 희석액과 3중으로 결합시키고 인큐베이션 튜브 (Skatron Macrowell Tube Strips, 카달로그 # 15773, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)중 100ℓ의 P815/CD28+세포 (2.5 x 105 세포/시험)에 가하고 서서히 진탕시키면서 90분동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 50ℓ의 BB중 동형 대조군 항체 HuEP5C7 및 MuFd79 (400 g/ml) 또한 비특이성 경쟁자로서 시험하였다. 인큐베이션 후, 세포-항체 혼합물을 0.1 ml 80% 디부틸 프탈레이트-20% 올리브유를 포함하는 원심분리 튜브 (Sarstedt Micro Tubes, 카달로그 # 72.702, Sarstedt, Newton, NC)로 옮기고, 인큐베이션 튜브를 50ℓ의 BB로 1회 세척하고 결합 및 유리 카운트를 (Kuziel, W. A., S. J. Morgan, T. C. Dawson, S. Griffin, 0. Smithies, K. Ley, N. Maeda. 1997. Severe reduction in leukocyte adhesion and monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 12053-12058)에 기술된 바와 같이 원심분리법에 의해 분리하였다. 이 시험을 3회 반복하였다.
결과
HuTN228 및 MuTN228 항체의 상대적인 결합능을 방법에 기술된 바와 같이125I-표지된 항체 경쟁 시험으로 비교하였다. 대표적인 결과를 도 13에 나타내었다. MuTN228 및 HuTN228은125I-표지된 MuTN228과 농도 의존적인 방식으로 경쟁하였다.동형 대조군 항체 MuFd79는 고농도에서 약하지만 반복가능한 경쟁을 나타내지만 동형 대조군 항체 HuEP5C7은125I-표지된 MuTN228과 경쟁하지 않았고, 이는 HuTN228 항체가 V-영역 특이성 상호작용을 통해 CD28 항원을 인식한다는 것을 암시한다. 3개의 모든 시험에 대하여 MuTN228 및 HuTN228의 IC50값을 표 3에 나타낸다.상대적으로 HuTN228의 결합이 MuTN228의 것보다 평균 2.4배 낮았다.
표 3. I-125 경쟁 요약
실시예 15. 햄스터 항-뮤린 CD28 항체의 아미노산 서열화
방법
하이브리도마 및 항체.아르메니아 햄스터 항-뮤린 CD28 하이브리도마 PV1을 ATCC (ATCC HB-12352)로부터 입수하였다. 정제된 PV1, R-피코에리트린 (R-PE)-컨쥬게이트 PV1을 Southern Biotechnology (Birmingham, AL)으로부터 구입하였다. Syrian 햄스터 항-CD28 항체 37.51을 PharMingen (San Diego, CA)으로부터 입수하였다. 2차 플루오레세인 (FITC)-컨쥬게이트 당나귀 항-아르메니아 햄스터 IgG (H+L), FITC-컨쥬게이트 당나귀 항-Syrian 햄스터 IgG (H+L), FITC-컨쥬게이트 당나귀 항마우스 IgG (H+L), R-PE-F (ab')2당나귀 항-마우스 IgG (H+L)을 Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA)으로부터 입수하고; FITC-컨쥬게이트 염소 항-마우스 카파, R-PE-컨쥬게이트 염소 항-마우스 IgG3, 및 홍당무과산화효소(HRP)-컨쥬게이트 염소 항-마우스 카파를 Southern Biotechnology으로부터 입수하였다. 염소 항마우스 IgG3, 및 마우스 IgG3 동형 대조군 FLOPC 22를 Sigma Chemicals (St. Louis, MO)으로부터 입수하였다. 아르메니아 햄스터 항-뮤린 CD3 항체 145.2C11 및 그의 햄스터/마우스 키메라성 버젼 145.2C11-IgG3은 본 실험실에서 생산하였다. FITC-컨쥬게이트 145.2C11을 Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN)으로부터 입수하였다.
가변 부위 cDNAs의 클로닝.PV1의 경쇄 및 중쇄에 대한 V 부위 cDNAs를 Co 등(Co, M. S., N. M. Avadalovic, P. C. Caron, M. V. Avadalovic, D. A. Scheinberg, and C. Queen. 1992. J. Immunol. 148: 1149-1154.)에 의해 기술된 부착된 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법에 의해 하이브리도마 세포로부터 클로닝하였다. 각각 햄스터 카파 및 감마 쇄 C 영역에 어닐링된 3' 프라이머, cDNA의 첨가된 G-테일에 어닐링된 5'프라이머를 사용하여 cDNA상에서 증폭을 수행하였다. VL PCR을 위해, 3'프라이머는 햄스터 Ck부위에 혼성화하는 잔기 11-24를 포함하는 서열 5'TATAGAGCTCCACTTCCAGTGCCC (서열번호 : 20)을 갖는다. VHPCR을 위해, 3'프라이머는 대부분의 설치류 IgG CH1에 혼성화하는 잔기 19-50을 포함하는 축퇴 서열(서열번호: 17,18 및 19):
을 갖는다. 두개의 프라이머 세트에서 비-혼성화 서열은 클로닝을 위해 사용되는 제한 사이트를 포함한다. VL및 VHcDNAs를 서열 결정을 위해 pUCl9 벡터내로 서브클로닝하였다. PCR-생성되는 에러를 막기 위해, 각 cDNAs에 대하여 독립적인 5개의 클론을 서열화하고 그의 서열이 보존적 서열과 일치하는 클론만을 선별하여 키메라성 PV1을 발현시켰다.
결과
PV1 V 부위 cDNAs의 클로닝. PVI 경쇄 및 중쇄 V 부위 cDNAs를 방법에 기술된 바와 같이 하이브리도마 세포로부터 클로닝하였다. VLPCR을 위해, 햄스터 Cγ부위에 일치하는 3'프라이머만 PV1으로부터 VLcDNA 산물을 얻을 수 있었다. 한편, 햄스터 Cγ영역으로부터의 3'프라이머는 어느 PCR 산물도 얻을 수 없었다. 이 결과는 하이브리도마 PV1이 그의 경쇄를 위해 카파를 사용한다는 것을 나타내었다. 수개의 경쇄 및 중쇄 클론을 서열화하고 이는 각각 동일한 VL및 VH를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 제한된 CH1 및 Cγ서열 데이타는 클로닝된 중쇄 및 경쇄는 뮤린으로부터 유래된 것이 아님을 나타낸다.
실시예 16. 키메라성 PV1-IgG3의 작제 및 발현.
방법
PV1 VL및 VH을 (He, X. Y., Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M. S. Co, and E. L. Berg. 1998. J. Immu1eol. 160: 1029-1035.)에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 Xbal 사이트의 측면에위치하는 미니-엑손 분절로 만들고 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드로 따로따로 도입하였다(도 14). 각 미니-엑손은 시그날 펩티드 서열, 성숙 가변 부위 서열 및 가장 상동성인 마우스 J 쇄 유전자로부터 유래된 5'스플라이싱 도너 서열을 포함한다. 스플라이싱 도너 서열을 사용하여 V 부위 엑손을 마우스 항체 불변 부위로 스플라이싱하였다. 발현 벡터내로 클로닝한 후 각 미니-엑손을 서열화하여 정확한 스플라이싱 시그날이 도입되었음을 확인하고, PCR 에러는 발생하지 않았다.
벡터를 작제하여 싱글 플라스미드로부터 키메라성 PV1-IgG3의 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시켰다. 이 보고에서, PV1-IgG3은 햄스터 PV1 VL및 VH가변 부위, 중쇄에 대한 마우스 IgG3 불변 부위, 경쇄에 대한 마우스 카파 불변 부위를 포함하는 키메라성 항체를 언급한다. 발현 벡터 pV1. g3. rg. dE (도 14)를 Cole 등(Cole, M. S., C. Anasetti, and J. Y. Tso. 1997. J. Immunol. 159: 36133621.)에 기술된 것과 유사한 2단계 클로닝 방법에 의해 수득하였다. 중쇄 불변 부위는 마우스 γ3 게놈 단편으로부터 유래되고, 경쇄는 κ 단편으로부터 유래되었다. 중쇄 및 경쇄 유전자는 인간 거대세포바이러스 주요 조기 프로모터 및 인핸서에 의해 작동하고, 이는 인간 보체 유전자 C2로부터 유래된 전사 터미네이터에 의해 분리된다(Ashfield, R., P. Enriquez-Harris, and N. J. Proudfoot. 1991. EMBO.J. 10: 41974207.). 선별 마커 gpt 유전자(Mulligan, R. C., and P. Berg. 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 20722076)는 변현된 SV40 조기 프로모터에 의해 작동한다. 키메라성 PV1-IgG3의 발현을 위해, 싱글 플라스미드 벡터를 뮤린 골수종세포주 NSO내로 형질감염시키고, 형질감염체를 gpt 발현을 위해 선별하였다. 포획 시약으로서 염소 항-마우스 IgG3 및 현상 시약으로서 HRP-컨쥬게이트 염소 항-마우스 카파 쇄를 사용하여 ELISA에 의해 마우스 IgG3 항체 생산에 대하여 형질감염체로부터의 소모 배지를 분석하였다. 이 분석은 마우스 IgG3에 대하여 특이적이고; 이 분석에서 다른 마우스 IgG 동형은 음성이었다.
결과
키메라성 PV1-IgG3의 발현. 클로닝된 VL및 VH을 미니-엑손으로 만들고(도 15) 재료 및 방법 및 도 15에 기술된 바와 같이 도입하였다. 이어서 발현 벡터를 뮤린 골수종 세포주 NSO내로 형질감염시켜 키메라성 PV1-IgG3을 생산하였다. 수개의 형질감염체로부터의 소모 배지를 마우스 IgG3 항체의 생산에 대하여 ELISA에 의해, EL4 세포에 대한 결합에 대해 FACScan에 의해 분석하였다. 대부분의 형질감염체는 양 분석에 대하여 양성이었다. 하나의 형질감염체를 그의 높은 항체 생산성에 대하여 선택하고 확장시켜 1 L의 무혈청 배지에서 배양하였다. PV1-IgG3을 친화성 크로마토그래피에 의해 1L의 소모 배지로부터 정제하였다. 수율은 > 10 mg/L이었다.
실시예 17 HPLC 및 SDS-PAGE에 의한 정제된 키메라성 PVI-IgG3의 특징화
방법
단백질 정제. 높은 IgG3-발현 형질감염체 (클론 #1)중 하나를 1 L 의 Gibco 무혈청 하이브리도마 배지에서 배양하였다. 세포 생육성이 30% 이하에 도달하였을때 소모 배양 상층액을 수집하고 200mL로 농축시키고 Pharmacia P1 펌프 (2-3 ml/분)를 사용하여 5 ml 단백질-A 세파로스 칼럼상에 적재하였다. 항체를 3.5 M MgCl2로 용출시키기 앞서 칼럼을 추가의 0.1 M NaCl(NaCl의 최종 농도는 0.25 M)을 포함하는 PBS로 세척하였다. 용출된 단백질을 추가의 0.1 M NaCl을 포함하는 PBS로 평형화된 PD-10 칼럼상에서 탈염화하였다. 4℃에 저장하기 전에 탈염화된 단백질 용액을 0.2μ m 필터로 여과하였다. 모든 마우스 IgG3과 같이, 고농도( > 1 mg/mL)의 PV1-IgG3은 냉각상태에서는 침전하고 37℃으로 가온시켜 용액으로 되돌아왔다. 실온에서 항체는 용액 상태로 존재한다. 냉각 침전의 반복적 사이클은 항체의 항원 결합 활성에 영향을 주는 것처럼 보이지는 않는다.
크기배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 순도 측정.PE ISS 200 Advanced LC Sample Processor, PE Series 410 Bio LC 펌프, PE 235C Diode Array Detector, 및 PE Nelson 600 Series LINK로 구성된 Perkin Ehner HPLC 시스템을 사용하여 크기배제 HPLC를 수행하였다. Perkin Ehmer Turbochrohn Navigator Version 4.1 소프트웨어를 사용하여 오토샘플러, 펌프, 및 검출기를 조정하고, 데이타를 얻고, 저장하고, 프로세싱하였다. 연속하여 연결된 두개의 TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL 크기배제 HPLC 칼럼(7.8 mm x 300 mm, 5μ m 입자 크기, 250Å 공극; 카달로그 # 08541, TosoHaas, Montgomeryville, MD)를 사용하여 분리하였다. 유동상은 200 mM 인산칼륨/150 mM 염화칼륨, pH 6.9이고, 유속은 1.00 mL분이었다. 칼럼 용출액을 220 nm 및 280 mn에서 분광광도적으로 관찰하였다. 주입 용량은 희석되지 않은 PV1-IgG3샘플 50㎕(63.5μg)이었다. 표준 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다.
결과.
분리된 PVI-IgG3의 순도를 크기배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. PVI-IgG3의 HPLC 용출 프로파일을 도 16에 나타낸다. 이 분석에 기초하여, 이 단백질은 99% 모노머이고 분자량이 150 kD인 단백질에 상응하는 유동성을 가졌다. 또한, 비축소 조건하에서의 PV1, PV1-IgG3 및 동형 대조군의 SDS-PAGE 분석은 3개 모두 약 150 kD의 분자량을 갖는다는 것을 나타낸다(도 17A). 도 17A에 나타난 최소 밴드는 축소시키지 않은 SDS에서 샘플의 비등에 의한 인공 산물이었다. 이는 항체에서 불완전한 쇄 사이의 디설파이드 결합의 수를 반영한다. 그러나, 축소 조건하의 동일한 3개의 단백질의 분석(도 17B)은 PV1-IgG3 또는 동형 대조군을 제외한 PV1은 통상 IgG에 나타난 50 kD의 분자량보다 미세하게 높은 분자량을 갖는 중쇄를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서, 햄스터 항체 PV1은 CH3중 Asn297에 중쇄 당화를 갖거나 중쇄 어느 부분에서 추가의 당화를 갖는다. 이하 논의되는 바, 이 특별한 당화 패턴이 렉틴/탄수화물 상호작용에 의해 EL4 세포에 대한 PV1의 비특이성 결합의 원인이 될 수 있다.
실시예 18
방법
유식세포측정. 뮤린 T 세포주 EL4 세포 (2.5 x 105세포/0.2 ml)를 30분동안 4℃에서 1μg/mℓ의 PV1, 37.51 또는 PVI-IgG3으로 염색하고, 2mL의 냉 PBS로 세척하고, 20㎕의 특이적 플루오로크롬 컨쥬게이트 2차 항체 (10μg/mℓ)으로 염색하였다. 암실에서 4℃에서 20분동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 PBS로 세척하고 FACScan (Becton Dickenson, Milpitas, CA)에 의해 분석하였다.
경쟁 시험에서, EL4 세포 (2.5 x 105세포/0.2 ml)를 1μg/mℓ의 R-PE-PV1 및 25μg/mℓ의 PV1, PV1-IgG3, 또는 IgG3 동형 대조군으로 암실에서 30분동안 4℃에서 염색하고 PBS로 세척하고 FACScan로 분석하였다. 유사한 경쟁 시험 또한 다양항 버젼의 145.2C11을 사용하여 수행하였다. 역 경쟁 시험에서, EL4 세포 (2.5 x 105세포/0. 2 ml)를 1μg/mℓ의 PV1-IgG3 및 25μg/mℓ의 PV1으로 30분동안 4℃에서 염색하고 PBS로 2회 세척하고 FITC-컨쥬게이트 당나귀 항-마우스 IgG (H+L)으로 염색하고 세척하고 FACScan로 분석하였다. 2차 항체의 PV1에 대한 비특이성 결합에 대한 대조군으로, EL4 세포를 PV1-IgG3 없이 과량의 PV1으로 염색하고 분석하였다.
마우스 T 세포 염색을 위해, BALB/c 마우스 지라 세포 (2.5 x 105세포/0.2 ml)를 1 μg/mℓ의 마우스 IgG3 동형 대조군 (FLOPC 21) 또는 PVI-IgG3로 4℃에서 30분동안 염색하고 2 mℓ의 냉 PBS로 세척하고 20㎕의 FITC-컨쥬게이트 145.2C11 (10μg/mℓ) 및 20㎕의 R-PE-컨쥬게이트 염소 항-마우스 IgG3 (10μg/mℓ)으로 염색하였다. 암실에서 20분동안 4℃에서 인큐베이션시킨 후, 세포를 PBS로 세척하고 FACScan로 분석하였다.
결과
유식세포측정에 의한 PV1 및 PV1-IgG3의 특징화.PV1을 사용하여 CD28-양성T 세포주 EL4를 염색하고 FACScan로 분석하였다. 염색 패턴이 PV1은 두개의 상이한 위치에서 EL4 세포에 결합한다는 것을 암시한다(도 17A). 추가로, PV1 및 수개의 아르메니아 햄스터 항-뮤린 T 세포 항체 (145.2C11, 항-CD3; H57-597, 항-TCR ; 및 UC10-4F10-11, 항-CTLA4)은 또한 비특이적으로 CD28-음성 골수종 세포주 NSO에 결합한다(자료는 나타내지 않음). 한편 Syrian 햄스터 항-CD28 항체 37.51는 특이적으로 EL4 세포상의 한 위치에만 결합한다(도 17B). CD28 결합외에도, PV1은 또한 가능하게는 탄수화물/렉틴 형 상호작용을 통해 다른 위치에 비특이적으로 결합하는 것으로 보인다. 도 17C에 나타내는 바, 키메라성 PV1-IgG3은 이 비특이성 결합 활성을 포함한다. 항체는 37.51의 것에 유사한 패턴으로 EL4 세포에 결합하고, CD28-음성 NSO 세포에 결합하지 않는다(자료는 나타내지 않음). 따라서, PV1의 비특이적 결합 특성은 이 특정 항체의 중쇄 불변 부위에 의존하고 이는 키메라화시 소거된다.
PV1-IgG3이 CD28-특이적 결합 활성을 포함한다는 것을 입증하기 위하여 본 발명자는 FACScan 경쟁 분석을 사용하였다. 이 시험에서, R-PE-컨쥬게이트 PV1을 과량의 (25-배) 표지되지 않은 PV1, PV1-IgG3 또는 마우스 IgG3 대조군과 혼합하고 혼합물을 사용하여 EL4 세포를 염색하였다. 도 18A에 나타낸 바, 동형 대조군을 제외한 PV1 및 PV1-IgG3은 R-PE-컨쥬게이트 PV1이 EL4 세포에 결합하지 못하도록 하였다. PVI-IgG3에 의한 저해가 PV1에 의한 것보다 적었고, 본 발명자는 이들 데이타에 의해 PV1-IgG3은 비특이성 부위가 아닌 CD28 부위에 대하여 R-PE컨쥬게이트 PV1과 경쟁한다고 해석하였다. 유사하게, 145.2C11(아르메니아 햄스터 항-뮤린CD3) 및 키메라성 145. 2C11-IgG3은 R-PE-컨쥬게이트 145.2C11이 EL4 세포에 결합하지 못하도록 하였지만(도 18B), 키메라성 항체는 세포에 대한 R-PE145.2C11의 비특이적 결합을 소거시키는 그의 무능에 의해 키메라성 항체는 효능이 덜 하였다.
본 발명자는 또한 EL4 세포에 대한 결합에 대하여 PV1-IgG3과 경쟁하는 과량의 (25-배) PV1을 사용하여 역경쟁 시험을 시행하였다. 이 경우 PV-l-IgG3을 표지화하지 않았지만, 이는 특이적으로 FITC-컨쥬게이트 당나귀 항-마우스 항체에 의해 인식되었다. 도 18C의 결과는 과량의 PV1에 의한 EL4 세포에 대한 PV1-IgG3의 결합 저해는 거의 완벽하였고, 이는 PV1 및 PV1-IgG3은 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다.
최종적으로, PV1-IgG3을 사용하여 마우스 지라 세포를 염색하였다. PV1-IgG3-코팅된 지라 세포는 특이적으로 2차 항체 R-PE-컨쥬게이트 염소 항-마우스 IgG3에 의해 인식되었다. 동시에, FITC컨쥬게이트 145.2C11 또한 지라 세포에 가하여 CD3-양성 세포를 표지화하였다. 2-색 유식세포 측정 분석에서 PV1-IgG3은 특이적으로 CD3-양성 세포을 염색하였지만, CD3-음성 세포를 염색시키지 않았다(도 19B). 한편, 마우스 IgG3 동형 대조군은 CD3-양성 세포를 염색시키지 않았다(도 19A). 따라서, 키메라성 PV1-IgG3은 뮤린 T 세포상에서 발현되는 항원 및 항-CD28 항체와 일치하는 항원 결합 활성을 인식한다.
실시예 19 콜라겐 유도 관절염의 유도
방법
마우스를 동량의 CFA (Wako, Japan)으로 유화된 125μg의 송아지 CII(Collagen Gijutsu Kenkyukai, Japan)으로 꼬리의 기저부에서 진피적으로 면역화하였다. 마우스를 21일째 CFA중 125μg의 송아지 CII을 진피 주사하여 추가접종하였다. 초기 면역화후 7일동안 1mg/kg/일의 투여량으로 항-CD28 항체 (PV1-IgG3)를 삼투압 펌프를 통해 연속 주입하여 마우스를 처리하였다. 2차 면역화후 11일째 발 4개를 관찰하여 관절염 발생을 체크하고, (Tada, Y., A. Ho, D.-R. Koh, T. W. Mak. 1996. J. Immunol. 156: 4520,. Tada, Y., A. Ho, T. Matsuyama, T. W. Mak. 1997. J. Exp. Med. 185: 231)에 앞서 기술된 바와 같이 발 4개의 염증화를 1 내지 3으로 등급화하였다. 각 발을 등급화하고 4개의 점수를 합하여 마우스 1마리당 최대 점수를 12로 하였다. 시험 마수의 총 점수를 마우스 전체 마릿수로 나누어 관절염 인덱스를 산출하였다.
결과
마우스를 송아지 CII로 면역화시키고 관절염 발생을 관찰하였다. 2차 면역화후 11일째 관절염 인덱스는 대조군 (7.50±0. 66)에 대하여 항-CD28 항체 (0.63 ±0. 50) (P < 0. 01) 를 처리한 마우스에서 현저하게 감소하였다.
실시예 20
방법
마우스; 동물
암컷 BALB/c 및 C3H 마우스를 Charles River Japan, Inc. (Yokohama, Japan)로부터 입수하였다. 동물 모두를 여과된 대기를 포함하고 음식물 및 식수에 접근이 자유로운 미세분리 우리(microisolator cages)내 특정 무균 설비에서 하우징하였다. 시험을 시작할 때 모든 마우스의 연령은 6-8주령이었다.
항체;
항-마우스 사일런스 CD28 (PV1-IgG3)은 PV-1 클론의 것과 동일한 특이성을 갖지만 시험관내에서는 강한 작용성을 갖지 않는다(Fc→IgG3). 항-마우스 CD 154 (TRAP 1, IgG1)을 BD PharMingen (San Diego, CA)로부터 구입하였다. CTLA4-Ig (CTLA-4/Fc Chimera)를 Genzyme (Cambridge, MA)로부터 구입하였다.
꼬리-피부 이식;
기증자 마우스 (BALB/c: H-2d)의 꼬리로부터의 전 두께의 피부 이식편(0.5 cm2)을 수령자 마우스(C3H : H-2b)의 등쪽 흉곽상에 이식시키고 7일동안 밴드-보조기로 고정시켰다. 이후 이식 생존을 매일 눈으로 관찰하였다. 거부는 생육 가능한 표피 이식편 조직이 > 80% 손실된 것으로서 정의되었다. 통계학적 분석은 Dunnett's Multiple Comparison 테스트를 통해 시행하였다. p < 0.05의 값은 유의적인 것으로 판단하였다.
처리 프로토콜;
이식한 날(0일째) 및 수술 후 3일, 6일째 i.p로 10,50,250μg의 항-마우스 사일런스 CD28, 250μg의 항-마우스 CD154 및 100μg의 CTLA4-Ig를 피부 이식편 수령자에 투여하여 처리하였다.
결과;
항-마우스 사일런스 CD28 및 항-마우스 CD 154 의 투여에 의해 CD40 및 CD28T 세포 공동자극 경로를 동시에 차단하여 C3H 마우스에서 피부 동종이식 생존이 효과적으로 촉진되었다. 대조군 동물은 9일째 그의 이식편을 거부하였다. 항-CD40L mAb는 단독으로 동종이식 생존을 완만하게(modestly) 연장시켰지만(MST 10일), CD28과 배합하였을 때는 중앙 생존 시간-(MST-)을 33일 이상으로 연장시키면서 생존을 현저하게 개선시키는 것으로 나타났다. 이러한 방법은 CTLA4-Ig 및 항-마우스 CD40L mAb의 투여에서는 MST가 12일로서 현저히 덜 효능이 있다.
실시예 21 Fab 및 F (ab') 2 단편 및 항-CD28 항체의 제조
항-CD28 항체의 Fab 단편의 제조
항-인간 CD28 항체 (HuTN228)를 고정된-피신 (Pierce, USA)으로 분해하였다. 고정된 피신을 5mM EDTA and 11. 5mM 시스테인 ·HCl을 포함하는 50mM Tris-HCL pH 6.8 완충액으로 활성화시키고 칼럼으로 패킹하였다. 항체 용액을 칼럼에 가하고, 2 또는 3일동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 칼럼을 PBS로 세척하고 분해물을 한외여과에 의해 농축시켰다. 농축된 분해물을 겔-여과 칼럼 (TSKgel-3000SWxl, Tosoh, Japan)에 적용하고 적절한 분획을 회수하고 한외여과에 의해 농축시켰다. 단백질 농도를 흡광도 280nm (1mg/mL에 대하여 Abs280 = 1. 4)에서 측정하고 단편 크기를 SDS-PAGE로 확인하였다.
항-CD28 항체 F (ab')2 단편의 제조
항-인간 CD28 항체를 시스테인의 농도(1.15mM) 및 인큐베이션 기간(하루밤동안)을 제외하고 Fab 단편의 것과 동일한 방법으로 제조하였다.
확실하게, 상기 교시와 관련하여 본 발명의 다수의 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 첨부된 청구 범위의 범위내에서 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 기술된 것 외로 시행될 수 있다.
모든 문헌, 특허출원, 특허, 및 본 명세서에서 언급된 다른 문헌은 전체적으로 참고문헌으로서 인용된다.

Claims (25)

  1. 사일런스(silenced) 항-CD28 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 키메라성 항체인 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  4. 제 1항에 있어서, 서열 번호:2 또는 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위를 갖는 항체.
  5. 제 1항에 있어서, 서열 번호:2 및 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위를 갖는 항체.
  6. 제 1항에 있어서, 서열 번호:6 또는 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위를 갖는 항체.
  7. 제 1항에 있어서, 서열 번호:6 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 부위를 갖는 항체.
  8. 제 1항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 및 서열 번호:4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  11. 제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제 10항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 항체 발현에 적절한 조건하에서 제 11항의 숙주 세포를 배양하고 상기 배양물로부터 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는, 사일런스 항-CD28 항체를 생산하는 방법.
  14. 항체 발현에 적절한 조건하에서 제 12항의 숙주 세포를 배양하고 상기 배양물로부터 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는, 사일런스 항-CD28 항체를 생산하는 방법.
  15. 제 8항의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 도입하고;
    항체 발현에 적절한 조건하에서 숙주 세포를 배양하고;
    상기 배양물로부터 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는, 사일런스 항-CD28 항체를 생산하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 서열 번호:1, 서열 번호:2, 서열 번호:3, 및 서열 번호:4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  17. 제 10항의 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하고;
    항체 발현에 적절한 조건하에서 숙주 세포를 배양하고;
    상기 배양물로부터 발현된 항체를 회수하는 것을 포함하는 사일런스 항-CD28 항체를 생산하는 방법.
  18. 제 1항의 사일런스 항-CD28 항체 및 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 유효량의 제 1항의 항체를 환자에 투여하여 T-세포 내성을 유도하는 것을 포함하는, 환자에서 T-세포 내성을 유도하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 추가로 또다른 면역억제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  21. 유효량의 제 1항의 항체를 환자에 투여하여 면역억제를 제공하는 것을 포함하는, 환자에서 면역억제를 제공하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 추가로 또다른 면역억제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  23. 유효량의 항체를 환자에게 투여하여 기관 또는 조직 이식 거부를 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 기관 또는 조직 이식 거부를 치료하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 추가로 또다른 면역억제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  25. HuTN228 및 MuTN228 및 그의 Fab 단편 및 그의 F (ab)'2 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 항체.
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