MXPA03005327A - Anticuerpos anti-cd28 silenciados y el uso de estos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos anti- CD28 que son defectuosos en actividad mitogena (anticuerpos anti-CD28 silenciados), metodos para producir tales anticuerpos, composiciones que contienen anticuerpos y metodos de inmunosupresion, inducen tolerancia de celulas T y tratan rechazos de transplantes de organos y/o tejidos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD28 SILENCIADOS Y El USO DE ÉSTOS Campo de la Invención Esta invención se refiere a anticuerpos anti-CD28 defectuosos en cuanto a actividad mitógena y a los usos de éstos .

Antecedentes de la Invención Las reacciones de inmunidad, particularmente los rechazos en transplantes de órganos, se atribuyen principalmente a la activación de los linfocitos T. Esta activación de las células T es inducida mediante una señal de células que presentan antigeno (APC) . La señal de las APC comprende una primera señal por intermedio de un receptor de células T (TCR) y una segunda señal (señal co-estimulante) por intermedio de moléculas co-estimulantes . La primera señal es del complejo de mayor histocompatibilidad, (MHC) asociado con antigeno de péptidos donde las APC presentan el antigeno de péptidos al TCR. La segunda señal es mediada por varias moléculas co-estimulantes, los ejemplos de las cuales incluyen B7 (B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) son conocidos como ligandos en la APC lateral, y CD28, CTLA-4, etc., como receptores en la célula T lateral. El ligando B7 es una glicoproteina que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y es expresado en células B, etc., que pertenecen al grupo de células que presentan antigeno. Tanto CD28, y CTLA-4, que reconocen B7 como ligando común, son glicoproteinas transmembránicas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas . Asi la activación de células T esta regulada por la transducción concomitante de la primera señal por intermedio del TCR y la segunda señal de, por ejemplo, B7 y CD28/CTLA-4. De la señal de B7 a CD28 se sabe que promueve, mientras que la señal de B7 a CTLA-4 inhibe la activación de las células T [Waterhouse et al., Science, 270:985-988 (1995)]. Hasta ahora con el propósito de inducir inmunosupresión o tolerancia se han hecho intentos de bloquear la señal B7-CD28 por administración de CTLA-4Ig, anticuerpo anti*B7-l/anticuerpo anti-B7-2, anticuerpo anti-CD28 o similares. Por ejemplo, CTIA-4Ig se enlaza a B7, interfiriendo asi con la reacción entre B7 y CD28 y como consecuencia bloquea la señal de CD28 para presentar actividad inmunosupresora. Sin embargo, como la reacción entre B7 y CTLA-4 también es inhibida simultáneamente, la señal de CTLA-4 que actúa negativamente sobre la activación de las células T también es suprimida, de manera que la tolerancia deseada no es inducida (Kirk et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:8789-8794 (1997)]. También fue preparado un anticuerpo anti-B7 y se reporto que suprimió la activación de células T, pero igual que en el caso de CTLA-4Ig también suprimia la señal CTLA-4. De un anticuerpo anti-CD28 en un experimento in vitro se encontró que produce un efecto mitogénico en las células T y la combinación del estimulo con este anticuerpo y el anticuerpo anti-CD3 promovía el crecimiento y la activación de las células T y aumentaba la producción de citoquinas [WO 90/05541, Eur. J. Immunology, 16, 1289-1296 (1986), etc.]. Además el estimulo mitogénico del receptor de CD28 de las células T por un anticuerpo anti-CD28 in vivo dio por resultado la generación de una activación de células T similar a la segunda señal de B7 a CD28 [Yin et al., J. Immunology, 163: 4328-4334 (1999)]. Estas funciones activantes de células T sugirieron que un anticuerpo anti-CD28 podría ser utilizado como inmunopotenciador en la terapia del cáncer y del SIDA (WO 90/05541) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos anti-CD28, preparados mediante tecnologías convencionales ejercen una acción mitogénica sobre células T. Aunque las razones de esta actividad mitogénica no están completamente comprendidas, se cree que el enlace de la región Fe del anti-CD28 al receptor Fe de la célula que presenta antígeno sea la razón probable [Colé et al., J. Immunology, 36:159 (1997)]. Para ello, utilizando tecnología de ingeniería genética, hemos introducido mutaciones en el sitio de enlace del receptor Fe del anticuerpo anti-CD28 para modificar el anticuerpo, de manera que no tuviera más actividad mitogénica. Uno de tales anticuerpos que han generado los presentes inventores, es TN228 IgG2M3, en el cual IgG2M3 tiene dos sustituciones de aminoácidos en el gen IgG. Además hemos demostrado que el anticuerpo anti-CD28 silenciado resultante no tiene actividad mitogénica, lo que es muy útil para inducir la tolerancia de las células T. Para ello la presente invención provee anticuerpos anti-CD28 que no tienen actividad mitogénica (de aquí en adelante denominados anticuerpos anti-CD28 silenciados) y un método para suprimir reacciones de inmunidad, particularmente de rechazo en transplantes, y para inducir imnunotolerancia utilizando dichos anticuerpos. Un objeto de la presente invención es un anticuerpo anti-CD28 silenciado, donde el anticuerpo anti-CD28 puede ser un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. Las regiones variables de los anticuerpos anti-CD28 pueden incluir las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID Nos: 2, 4, 6 y 8 y polinucleótidos que codifican tales secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, tales polinucleótidos incluyen las SEQ ID Nos: 1, 3, 5 y 7. Otro objeto de la presente invención son vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-CD28. Otro objeto de la presente invención son métodos para producir el anticuerpo anti-CD28 silenciado, cultivando una célula huésped que comprende los polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-CD28 en condiciones que permiten la expresión de los polinucleótidos y recolectando los productos de gen producidos. Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende uno o más de los anticuerpos anti-CD28 silenciados, preferentemente mezclados con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables. Los anticuerpos anti-CD28 silenciados son útiles para inducir tolerancia de las células T, la ininunosupresión y como fármaco profiláctico/terapéutico en el rechazo en el transplante de órganos o tejidos. De acuerdo con esto, la presente invención provee métodos para inducir tolerancia de células T, ininunosupresión y provee una terapia de profilaxis o tratamiento en un rechazo en el transplante de un órgano o un tejido, por administración de uno o más anticuerpos anti-CD28 silenciados a un mamífero. Preferentemente tales anticuerpos anti-CD28 silenciados son administrados como composición farmacéutica, como se describe aquí y puede incluir fármacos/farmacéuticos adicionales donde sea apropiado.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. Constructos de plásmidos para la expresión del anticuerpo ChTN228. VL Y VH de TN228 de murinos fueron construidos como miniexones, flanqueados por sitios Xbal. La secuencia de VL fue incorporada en el vector de expresión pVk y la secuencia de VH fue incorporada en el vector de expresión pVg2M3. Figura 2. Secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos deducidas de la cadena liviana de C TN228 en los mini-exones. Las secuencias de péptidos de señal están en letra cursiva. Los CDR están subrayados. La cadena liviana completa comienza con un residuo de ácido aspártico (en negrilla) . Secuencias no trasladadas y secuencias de intrones están en letras minúsculas. Figura 3. Secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones variables de cadena pesada de ChTN228 en los mini-exones. Las secuencias de péptidos de señal están en letra cursiva. Los CDR están subrayados. La cadena pesada completa comienza con un residuo de glutamina (en negrilla) . Las secuencias no trasladadas y de intrones están en letras minúsculas. Figura 4. Experimento de competición. Se incuban células P815/CD28+ con 25 ng de MuTN228-FITC y diluciones al doble en serie de ChTN228 o MuTN228 como esta descrito en los ejemplos. También se incubaron células P815/CD28t con uTN228-FITC solo, sin competidor alguno. La fluorescencia del canal medio para cada muestra es representada en diagrama contra la concentración del competidor. Figura 5. Efecto inhibidor de TN228-IgG2m3 en MLR ( 1 ) humano primario. Se muestran en forma separada inhibiciones porcentuales de MLR primario de cuatro individuos. Figura 6. Efecto inhibidor de TN228-IgG2m3 de MLR (2) humano primario. Se muestran en forma separada inhibiciones porcentuales de MLR primario de cuatro individuos. Figura 7. El efecto de TN228-lgG2m3 en MLR secundario . Se muestran en forma separada los datos de dos voluntarios . La absorción de [ H] -timidina en MLR secundario es presentada como porcentaje de dpm de estimulo Ra i solo en MLR primario como 100. TN228~IgG2m3 : 0.1 µg/ml . Figura 8. Constructos de plásmidos para la expresión de anticuerpos HuTN228. Se construyeron VL Y VH de TN228 humanizado como mini-exones flanqueados por sitios Xbal. Se incorporo la secuencia de VL en el vector de expresión pVk y la secuencia de VH fue incorporada en el vector de expresión pVg2M3. Figura 9. Secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones variables de cadena pesada de HuTN228 en los mini-exones. Las secuencias de péptidos de señal están en letra cursiva. Los CDR están subrayados. La cadena pesada completa comienza con un residuo de glutamina (en negrilla). (SEC ID NOS: 5 y 6) Figura 10. Secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos deducidas de la región variable de cadena liviana de HuTN228 en los mini-exones . Las secuencias de péptidos de señal están en letra cursiva. Los CDR están subrayados. La cadena liviana completa comienza con un residuo de ácido aspártico (en negrilla) . (SEC ID NOS: 7 y 8) Figura 11. Ensayo de competición de FACS. El enlace de MuTN228 marcado con FITC, a células P815/CD28+ en presencia de varias cantidades de anticuerpo competidor MuTN228 o HuTN228 fue analizado en un experimento de competición de citometria de flujo, como esta descrito en los ejemplos. Figura 12. Ensayo de competición ELISA. Se analizo el enlace de MuTN228 biotinilado a sCD28-Fc en presencia de varias cantidades de anticuerpo competidor MuTN228 o HuTN228 en un experimento de competición ELISA, como esta descrito en los ej emplos . Figura 13. Ensayo de competición 1-125. Se analizo el enlace de MuTN228 marcado con 12 I, a células P815/CD28' en presencia de varias cantidades de anticuerpo competidor MuTN228 o HuTN228, en un experimento de competición de anticuerpos marcados con 12I, como esta descrito en los ejemplos. Figura 14. Constructos de plásmido para la expresión del anticuerpo PVl-IgG3. VLl y VH de PV1 fueron construidos en forma de mini-exones flanqueados por sitios Xbal. La secuencia de VL fue incorporada en el vector de expresión pMVk.rg.dE y la secuencia de VH en el vector de expresión pMVg3.D.Tt. Entonces los dos plásmidos fueron recombinados para generar un plásmido único que co-expresa las cadenas pesadas y livianas de PV1-IgG3. Figura 15A. Las secuencias de ADNc y secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones variables de cadena liviana y de cadena pesada en los mini-exones . Los CDR están subrayados. La cadena liviana completa comienza con un residuo de ácido aspártico (doblemente subrayado) en posición 20.(SEC ID NOS: 9 y 10) Figura 15B. Las secuencias de ADNc y secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones variables de PV1 en los mini-exones. Los CDR están subrayados. La cadena liviana completa comienza con un residuo de ácido aspártico (doblemente subrayado) en posición 20. (SEC ID NOS: 11 y 12) Figura 16. Análisis de PV-l-IgG3 mediante cromatografía de exclusión de tamaño, utilizando HPLC, como se describió en los Métodos. La proteina fue monitoreada por su absorbencia a 280 nm. Figura 17. Análisis SDS-PAGE del control de isotipo IgG3 de ratones (zona 1), PV1 (zona 2) y PVl-IgG3 (zona 3). Las proteínas en el panel A fueron corridas en condiciones no reductoras, y en el panel B en condiciones reductoras . MW representa marcadores de peso molecular. Los números son patrones de MW en kD. Figura 18. Se colorearon células EL4 con PVl (A), 37.51 (B) o PVl-IgG3 (C) , y se analizaron mediante citometría de flujo. Fueron anticuerpos secundarios utilizados: anti-hamster Armenio IgG (H+L) de asno, conjugado con FITC para PV1, anti-hamster Sirio IgG de asno, conjugado con FITC para 37.51 y anti-ratón kappa de cabra conjugado con FITC para PVl-IgG3. Los perfiles de linea entera representan células coloreadas sólo con anticuerpos secundarios. Los perfiles de linea interrumpida representan células coloreadas tanto con anticuerpos primarios, como también secundarios, como está descrito en los Métodos. El control de isotipo IgG3 de ratón no coloreó las células EL4 (no se muestran datos) . Figura 19. (A) Un exceso de PV1 o PVl-IgG3 compite con PV1 conjugado con R-PE para enlazarse con células EL4. La linea entera delgada (negra) en el histograma de la citometria de flujo representa células sin coloración alguna, una linea entera gruesa (azul oscuro) células coloreadas sólo con R-PE-PV1, una linea delgada interrumpida (color magenta) células coloreadas con R-PE-PV1 y exceso de PV1 no conjugado, y una linea delgada doblemente interrumpida (azul claro) células coloreadas con R-PE-PVl y un exceso de PVl-lgG3 no conjugado. Un exceso de control de isotipo IgG3 de ratón no produjo efecto en el enlace de R-PE-PVl con células EL4 (no se muestran los datos) . (B) . Un exceso de 145.2C11 ó 145.2Cll-IgG3 compite con 145.2C11 conjugado con R-PE para enlazarse con EL4. Una linea entera delgada (negra) representa células sin coloración alguna, una linea entera gruesa (azul oscuro) células coloreadas con R-PE-145.2C11 solo, una línea delgada interrumpida (color magenta) a células coloreadas con R-PE-145.2C11 y exceso de 145.2C11 no conjugado, y una línea delgada doblemente interrumpida (azul claro) células coloreadas con R-PE-145.2C11 y exceso de 1 5.2Cll-IgG3 no conjugado (C) . El exceso de PV1 compite con PVl-lgG3 para enlazarse con células EL . Las células EL4 fueron coloreadas con PVl-IgG3 con o sin exceso de PV1. Se lavaron las células y se colorearon con IgG3 específico de ratón, IgG (H+L) anti-ratón de asno, conjugado con FITC. Una línea delgada entera (negra) representa células coloreadas sólo con anticuerpos secundarios, una línea gruesa entera (azul oscuro) células coloreadas con PVl-IgG3 y anticuerpos secundarios y una línea delgada interrumpida (color magenta) células coloreadas con PVl-IgG3 y exceso de PV1 y anticuerpos secundarios. Figura 20. Se colorearon células esplénicas de ratón con PV1 -TgG3 y 145.2C11. Se colorearon las células con control de isotipo IgG3 de ratón (A) o PVl-IgG3 (B) , se contra-colorearon con IgG3 anti-ratón de cabra conjugado con R-PE y con 145.2C11 conjugado con FITC y se analizó por citometría de flujo de dos colores, como está descrito en los Materiales y Métodos. Sólo se analizaron células de la vía de los linfocitos. Las células PVl-IgG3-positivas están en los cuadrantes superiores y las células CD3-positivas están en los cuadrantes de la derecha. El número en cada cuadrante representa el porcentaje de células en ese cuadrante en particular .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el contexto de esta invención el término "anticuerpo anti-CD28 silenciado" significa cualquier anticuerpo anti-CD28 al que le falta la actividad mitógena. Más específicamente, es un anticuerpo que se enlaza específicamente al receptor del antigeno CD28 en la superficie de la célula T y no promueve el crecimiento o la activación de células T por estimulo combinado con un anticuerpo anti-CD3. Se puede construir un anticuerpo anti-CD28 silenciado sobre la base de un anticuerpo anti-CD28 o un hibridoma productor de anticuerpos anti-CD28 por mutación o modificación de un anticuerpo anti-CD28 agonista mediante una técnica de ingeniería genética o por modificación química. Tomando el uso de la tecnología de ingeniería genética como ejemplo, la afinidad de enlace del anticuerpo anti-CD28 por los receptores Fe puede ser reducida o eliminada introduciendo una mutación en la secuencia de aminoácidos del dominio de Fe del anticuerpo. Por ejemplo, se puede obtener un anticuerpo anti-CD28 silenciado aislando ADNc de células de hibridoma capaces de producir un anticuerpo monoclonal anti-CD28 e introduciendo un (s) mutación (es) en la región de la secuencia correspondiente al dominio Fe que desempeña un papel importante en el enlace al receptor de Fe (WO 88/07089) . El sitio de la mutación no está particularmente restringido, hasta donde el enlace a los receptores Fe pueda estar inhibido. Asi, en el caso de un anticuerpo de Clase IgG, por ejemplo, los residuos de aminoácido de cadena H 234, 235, 236, 237, 318, 320 y 322 son de preferencia y un anticuerpo anti-CD28 silenciado puede ser construido reemplazando por lo menos uno de estos aminoácidos por un aminoácido diferente. La fuente de tal anticuerpo anti-CD28 silenciado puede ser atinadamente seleccionada de acuerdo con el animal objeto, en el cual se utiliza el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales no humanos contienen secuencias de aminoácidos que presentan una antigenicidad en humanos a lo largo de un ámbito bastante amplio. Muchos estudios han mostrado que la respuesta inmune de un paciente a un anticuerpo extraño después de la inyección del anticuerpo es notablemente intensa y la misma administración del anticuerpo puede conducir al paciente a una condición peligrosa o despojar al anticuerpo de la utilidad terapéutica. Por ello es recomendable reemplazar la región Fe para asi hacer al anticuerpo relativamente más homólogo al animal objeto terapéutica, reemplazar las porciones de armazón de las regiones variables o usar el anticuerpo obtenido de un animal transgénico, en el cual el gen de anticuerpo del animal objeto ha sido introducido. Por ejemplo, cuando el anticuerpo debe ser administrado a un ser humano, se 1 utilizarla un anticuerpo quimérico (EP125023) , disponible por reemplazo de la región Fe, un anticuerpo humanizado con la porción del armazón reemplazada (EP0239400. EP045126) o un anticuerpo humano (EP546073, WO 97/07671) obtenido de un animal transgénico, en el cual fue introducido el gen de anticuerpo humano. Introduciendo mutaciones en estos anticuerpos mediante técnicas de ingeniería genética, tales como las descritas anteriormente o por modificación química, se puede reducir o eliminar la actividad mitogénica de los anticuerpos. Como ejemplos específicos de los anticuerpos anti- CD28 que tienen una región Fe silenciada se pueden mencionar no sólo los anticuerpos descritos más adelante en la sección de los ejemplos, sino también los anticuerpos preparados sintéticamente utilizando el gen de región constante del animal objeto terapéutico y los polinucleótidos de la región variable basados en la secuencia de aminoácidos de regiones variables mostrados en SEC. DE IDENT. NO: 2 y NO: 4 o SEC. DE IDENT. NO: 6 y NO: 8. Son ejemplos de tales polinucleótidos SEC. DE IDENT. NOS: 1, 3, 5 y 7. Son ejemplos más específicos de esta invención HuTN228 y MuTN228 y fragmentos de Fab de éstos, fragmentos F(ab)'2 de éstos, derivados de éstos, etc. Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, debido a la degradación de la tercera base casi cada aminoácido puede ser representado por más de un triplete de codón en una secuencia de nucleótidos codificante. Además un cambio menor de pares de bases puede tener por resultado variaciones (sustitución conservadora) en la secuencia de aminoácidos codificada, no esperándose que alteren sustancialmente la actividad biológica del producto del gen. Así, una secuenciación de ácido nucleico que codifica una proteina o un péptido revelados aquí, puede ser modificada levemente en la secuencia (por ejemplo, la sustitución de un nucleótido en un triplete de codón) y todavía codificar su producto génico respectivo de la misma secuencia de aminoácidos . El término "vector de expresión" se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido de la invención y provee las secuencias necesarias para su expresión en la célula huésped seleccionado. Los vectores de expresión generalmente incluirán un promotor de transcripción y un terminador de transcripción o proveerá la incorporación adyacente a un promotor endógeno. Los vectores de expresión usualmente serán plásmidos que además comprenden un origen de replicación y uno o más marcadores seleccionables . No obstante, los vectores de expresión alternativamente pueden ser recombinantes virales destinados a infectar el huésped o integrar vectores destinados a integrarse en un sitio preferido dentro del genoma del huésped. Están revelados ejemplos de vectores de expresión en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Sambrook, 6 Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989. Las células huésped apropiadas para la expresión del anticuerpo anti-CD28 silenciado incluyen procariotes, levaduras, archae y otras células eucarióticas . Son bien conocidos en la técnica los vectores de clonación y de expresión para usar con células huésped bacterianas, fúngicas, de levaduras y de mamíferos, por ejemplo, Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Pouwels et al., Elsevier, New York (1985) ] . Preferentemente las células son células de mamíferos. El vector puede ser un vector de plásmido, un vector de fago de cordón simple o doble o un vector viral de ARN o ADN de cordón simple o doble. Tales vectores pueden ser introducidos en células como polinucleótidos, preferentemente ADN, mediante técnicas bien conocidas de introducción de ADN o ARN en células. Los vectores, en el caso de vectores de fago y virales también pueden ser y preferentemente son introducidos dentro de células como virus empaquetados o encapsulados mediante técnicas bien conocidas de infección y transducción. Los vectores virales pueden ser competentes para replicación o deficientes para replicación. En el último caso la propagación de los virus generalmente ocurrirá únicamente en células huésped complementario. También se podrían emplear sistemas de translación exentos de células para producir las proteínas utilizando ARN derivados de los presentes construidos de ADN. 7 Los anticuerpos anti~CD28/proteínas pueden ser purificados mediante métodos de aislamiento/purificación para proteínas generalmente conocidas en el campo de la química de proteínas. Más particularmente se pueden mencionar, por ejemplo, extracción, recristalización, desalado con sulfato de amonio, sulfato de sodio, etc., centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía por adsorción, cromatografía por intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inversa, método de filtración por gel, cromatografía de permeación por gel, cromatografía de afinidad, electroforesis, distribución en contra-corriente, etc., y combinaciones de éstos. Conforme a la presente invención los anticuerpos purificados pueden ser producidos por los sistemas de expresión recombinantes descritos anteriormente. El método comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión gue comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína bajo condiciones suficientes para promover la expresión de la proteína. La proteína entonces es recolectada a partir de un medio de cultivo o extractos de células, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como es conocido por el técnico experto, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleado y si o no la proteína recombinante es segregada dentro del medio de cultivo.

El anticuerpo anti-CD28 silenciado cuando se formula dentro de una composición farmacéutica puede ser utilizado (a) en rechazos de transplante que siguen la transplantación de órganos o tejidos, tales como corazón, ríñones, hígado, médula ósea, piel, córnea, pulmones, páncreas, intestino delgado, músculo, nervios, etc.; (b) en reacciones de injertos versus huésped en el transplante de médula ósea; (c) en enfermedades de autoinmunidad, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, diabetes de tipo I, etc.; y (d) en enfermedades de inmunidad, tales como asma, dermatitis atópica, etc. Pudiéndose esperar que el anticuerpo anti-CD28 silenciado por si mismo puede suprimir reacciones de inmunidad y rechazos de transplantes e inducir inmunotolerancia, también puede ser utilizado en combinación con otras drogas. Entre tales otras drogas que son útiles para la combinación con el anticuerpo anti-CD28 silenciado estén variados inmunosupresores , tales como rapamicina, desoxiespergulina, anticuerpo anti-CD40. anticuerpo anti-CD40L, prograf, ciclosporina A, anticuerpo anti-IL-2, anticuerpo anti-receptor de IL-2, anticuerpo anti-IL-12, anticuerpo anti-receptor de IL-12, y MMF. La rapamicina en particular inhibe la transducción de la señal relacionada con el crecimiento de células T entre señales de 1 receptor de IL-2, pero no inhibe la transducción de la señal relacionada con la apoptosis, de manera que se espera que su uso en combinación con un inhibidor especifico de la señal de CD28 sea útil. El anticuerpo anti-CD28 silenciado de esta invención puede ser administrado en forma oral o parenteral, preferentemente por la via intravenosa, intramuscular o subcutánea . El anticuerpo anti~CD28 silenciado de esta invención puede ser preparado en forma de una solución o un polvo liofilizado y, donde sea necesario, puede ser formulado con varios aditivos f rmacéuticamente aceptables, tales como un excipiente, diluyente, estabilizante, un agente isotonizante y un buffer. Los aditivos de preferencia incluyen un azúcar, tal como maltosa, un surfactante, tal como polisorbato, un aminoácido, tal como glicina, una proteína, tal como seroalbúmina humana y una sal, tal como cloruro de sodio. También se puede seleccionar de manera apropiada la forma farmacéutica, tal como preparaciones inyectables, (soluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos para disolver en el momento del uso, etc.), comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos, líquidos, inclusiones en liposomas, ungüentos, geles, polvos de uso externo, aerosoles, polvos para inhalar, gotas para los ojos, ungüentos oftálmicos, supositorios, pesarlos, y similares, dependiendo del método de administración y el péptido de la presente invención puede ser formulado de acuerdo con esto. La formulación en general está descrita en el capitulo 25.2 de Comprehensive Medicinal Chemistry, Volumen 5, Editor Hansch et al., Pergamon Press, 1990. La dosificación de la composición farmacéutica de esta invención depende de la composición especifica, el tipo de enfermedad que es el objeto de la terapia o la profilaxis, el método de administración, la edad y la condición del paciente y la duración del tratamiento, entre otras variables. De cualquier manera, en el caso de la administración intravenosa, intramuscular o subcutánea se puede administrar 0. Ol100 mg/Kg, preferentemente 0.1-10 mg/Kg por día a un adulto. Cuando se utiliza el anticuerpo anti-CD28 silenciado de esta invención para la supresión del rechazo de transplante o para la inducción de inmunotolerancia en un transplante de órgano o tejido, se puede administrar la composición en una dosis de alrededor de 1 mg/Kg/dia inmediatamente antes del transplante, inmediatamente después del transplante y 3, 7, 12, 18, 25, 35, 45 y 60 días después del transplante, por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea. La frecuencia de administración y la dosificación pueden ser juiciosamente incrementadas o disminuidas mientras se monitorea el curso de la reacción de rechazo después del transplante. Dependiendo del intervalo de administración del método de administración utilizado y de la condición del paciente, entre otros factores, es factible no sólo la administración continua, sino también la administración 1 intermitente. Asi, como el anticuerpo anti-CD28 silenciado de esta invención es un anticuerpo, provee un efecto sostenido, de manera que la dosificación intermitente puede ser premiada con la eficacia esperada. Una vez que en el periodo del tratamiento se establezca un estado de tolerancia, se puede mantener esta tolerancia aun si se descontinúa el uso del anticuerpo anti-CD28 silenciado. En este sentido este anticuerpo anti-CD28 silenciado sin duda es superior a otros inmunosupresores, cuyo efecto inmunosupresor declina después de la discontinuación.

EJEMPLOS Habiendo descrito esta invención en general, se puede lograr mayor comprensión por la referencia a ciertos ejemplos específicos que se proveen aquí sólo con el propósito de ilustración y no están destinados a limitar, salvo que se especifique de otra manera. Los ejemplos siguientes son llevados a cabo utilizando técnicas estándar que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto que esté descrito detalladamente de otra manera.

Ejemplo 1. Secuenciación de aminoácidos del anticuerpo anti-humano CD28 de ratón El hibridoma que producía el anticuerpo anti-humano CD28 (clon: TN228, IgGl kappa de ratón) fue generosamente provisto por el Dr. Yagita (Juntendo University School of Medicine, Japón). Se redujo aproximadamente 0.2 mg de anticuerpo anti-humano CD28 purificado (TN228) en guanidina-HCl 0.64 M, Tris-HCl 0.28 M, pH 8.5, DT7 0.055 M durante 90' a 60°C (en argón) , se carboximetiló por agregado de ácido yodoacético 0.13 M durante 45' a temperatura ambiente (en oscuridad), seguido del agregado de DTr 0.32 M (para terminar la reacción de carboximetilación) , e inmediatamente se cambió el buffer por fosfato de sodio 0.1 M, EDTA 0.002 M, pH 8.0 utilizando una columna PD-10 (catálogo # 17-0851-01, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala Suecia) . Se ajustó el eluato a DTT 0.005 M, glicerol 0.02% y se transfirió un tercio de la solución (aproximadamente 0.35 mi) a un tubo separado para el desagrupamiento N-terminal de la cadena pesada. Se digirió la muestra con 1800 µ? de piroglutamatoaminopeptidasa (catálogo # 7334, Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón) durante 24 horas a 45°C. Las secuencias N-terminales de las cadenas liviana y pesada de la muestra desagrupada fueron determinadas por degradación automatizada Edman a 20 ciclos y análisis PTH en un secuenciador de proteínas modelo 241 (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) . Los derivados de PTH fueron analizados en una columna Hypersil ODS C18. Se operó en el secuenciador y en HPLC de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando reactivos, solventes y columnas obtenidos de Hewlett Packard.

Tabla 1. Resultados de la secuenciación N-terminal para TN228 desagrupado con piroglutamatoaminopeptidasa : Ejemplo 2. Clonación de los ADNc de región variable Los ADNc de región V para las cadenas liviana y pesada de TN228 fueron clonados de las células de hibridoma mediante un método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) fijada, descrito por Co et al., (Co, M.S., N. M. Avadalovic, P.C. Coron, M. V. Avadalovic, D.A. Scheínberg, and C. Queen. 1992. Chimeric and humanizad antibodies with specificity for t e CD33 antigen. J. Immunol. 148:1149-1154, (1992)]. Se efectuó la amplificación en el ADNc utilizando cebadores 3' que se fijan respectivamente en las regiones de cadena C kappa y gamma de ratones y un cebador 5' que se fija a la cola G adicional del ADNc. Para la PCR de V el cebador 3' tiene la secuencia: 5' TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC 3' con los residuos 17-46 que se hibridizan con la región CK de ratón. Para la PCR de VH los cebadores 3, tienen las secuencias degradadas: A G T 5' TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC 3' T con los residuos 17-50 que se hibridizan con IgGCHI de ratón. Las secuencias que no se hibridizan en los dos juegos de cebadores contienen sitios de restricción utilizados para clonar. Los los ADNc de VL Y VH fueron subclonados en un vector TOPOII Blunt (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) para la determinación de secuencia. Se secuenciaron varios clones de cadena liviana y pesada por dos reacciones de PCR independientes. Para la cadena liviana se identificaron dos únicas secuencias homólogas a las regiones variables de cadena liviana de ratón. Una secuencia de VL era no funcional debido a una mutación de cambio del armazón y fue identificada como el alelo no productivo. La otra secuencia de VL fue típica para una región variable de cadena kappa funcional de ratón. Para la cadena pesada fue identificada una única secuencia homóloga a una típica región variable de cadena pesada de ratón. Sus secuencias de nucleótidos y sus secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones variables están descritas en la figura 2 y la figura 3.

Ejemplo 3. Construcción y expresión de TN228-IgG2M3 quimérico (Métodos) VL y VH de TN228 fueron convertidos mediante PCR en segmentos de mini-exones, flanqueados por sitios Xbal, como fue descrito por He et al., (He, X. Y., Z. XU, J. Melrose A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M.S. Co., y E. L. Berg. 1998. Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin. J. Immunol. 160: 1029-1035) fueron subclonados dentro de los plásitiidos de expresión de cadena liviana y cadena pesada (figura 1) . Cada mini-exon contiene una secuencia de péptidos de señal, una secuencia completa de región variable y una secuencia donadora de empalme derivada del gen de cadena J de ratón más homólogo. Tales secuencias donadoras de empalme se utilizan para empalmar el exon de la región V con la región constante del anticuerpo humano. Cada mini-exon fue secuenciado después de que fue clonado dentro del vector de expresión para asegurar de que se obtuvo la secuencia correcta y que no se generaron errores de PCR. Los exones de región constante de los plásmidos de expresión de cadena liviana y cadena pesada también fueron confirmados por secuenciación . En esta descripción ChTN228 se refiere a un anticuerpo quimérico que contiene las regiones variables VL y VH de TN228 de ratón, una región constante de IgG2M3 humano para la cadena pesada y una región constante kappa humano para la cadena liviana. La región constante de cadena pesada fue modificada como fue descrito {Col , M.S., C. Anasetti, and J.Y. Tso 1997. Human IgG2 variants of chimeric anti~CD3 are nonmitogenic to T cells J. Immunol . 159:3613-3621) a partir del fragmento genómico de la linea de células embrionarias humanas 2 y la cadena liviana fue derivada del fragmento genómico de la linea de células embrionarias humanas. Tanto los genes de cadena pesada como también los de cadena liviana son conducidos por el promotor mayor inmediato temprano y exaltador de citomegalovirus humano. Este gen de cadena pesada es seguido por el terminador de transcripción derivado del gen complementario humano C2 (Ashfield R . , P. Enriquez-Harris, and N.J. Prudfoot. 1991. transcriptional termination between the closely linked human complement genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO J. 104197-4207) . El gen gpt marcador de selección de cadena ligera (Mulligan, R.C. and P. Berg. 1981. Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltranferase . Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072-2076) y el gen dhfr marcador de selección de cadena pesada (Simonsen, C.C. and A.D. Levinson. 1983. Isolation and expresión of an altered mouse dihydrofoíate reductase ADNc Proc. Nati. Acad. Sci USA 80:2495-2499) ambos son conducidos por el promotor temprano SV40. Para la expresión de TN228 quimérica se realizó una transfección transitoria en células COS-7 (linea de células de riñón de mono) , utilizando lipofectamina (catálogo # 10964-013, GIBCO BRL) . Los medios utilizados por transfectantes transitorios fueron analizados para averiguar la producción de anticuerpo humano IgG2M3 mediante ELISA, utilizando la cadena gamma IgG anti-humano de cabra especifico como reactivo capturador y anticuerpo de cadena kappa antihumano de cabra conjugado con HRP como reactivo revelador. También se analizó el medio utilizado para averiguar la capacidad de ChTN228 para enlazarse a células P815/CD28*' (linea de células de mastocitoma de ratón P815 transfectada en forma estable con CD28) por coloración inmunofluorescente indirecta y se analizó por citometria de flujo. Para una producción estable de la linea de células se transfectaron los plásmidos quiméricos de expresión dentro de una línea de células de mieloma de murinos Sp2/0 mediante electroporación y los transfectantes fueron seleccionados para expresión de gpt . Los medios utilizados por los transfectantes estables fueron analizados mediante ELISA igual que para la transfección transitoria.

Resultados Los genes clonados VL y VH fueron convertidos en mini-exones mediante PCR (Figuras 2 y 3) y fueron subclonados en los vectores de expresión de cadena liviana y pesada, como está descrito anteriormente y se muestra en la figura 1.

Transfección transitoria de células COS-7: Los vectores quiméricos de expresión fueron transfectados transitoriamente en la linea de células de riñón de mono COS-7 para producir el anticuerpo quimérico TN228^. Se analizó el medio utilizado por las células transfectadas mediante ELISA para averiguar la producción de anticuerpos quiméricos IgG2M3 y mediante citometrla de flujo para averiguar el enlace a células P815/CD28+. El medio consumido en arabos ensayos fue positivo. El rendimiento de anticuerpo quimérico a partir de la transfección transitoria fue de -0.9 g/ml. El anticuerpo ChTN228 del sobrenadante transitorio se enlazaba a células ?815/0?28+ de una manera dependiente de la concentración (no se muestran los datos) . Transfección estable de las células Sp2/0: Los vectores quiméricos de expresión fueron transfectados en células Sp2/0 para la producción de una linea de células estable. Los medios utilizados de varios transfectantes fueron analizados para averiguar la producción de anticuerpo quimérico TN228 y para averiguar el enlace con células P815/CD284, igual que con los transfectantes transitorios. La mayoria de los transfectantes fueron positivos en ambos ensayos. Se eligió un transfectante por su productividad mayor de anticuerpos y se diluyó para crecer en 5L de media exento de suero. Se parificó ChTN228 a partir de 5L de medio utilizado por cromatografia de afinidad. El rendimiento de anticuerpo purificado era -25 mg.

Ejemplo 4. Purificación de proteínas del anticuerpo quimérico ChTN228 Se cultivó uno de los transfectantes altamente expresantes de ChTN228 de la transfección estable (Clon 7H) en 5 L medio de hibridoma GIBCO exento de suero (catálogo # 12045-076, GIBCO BRL) . El sobrenadante del cultivo utilizado fue recolectado cuando la viabilidad de las células alcanzó el 10% o menos, se concentró a 500 mi y se cargó en una columna de 5 mi de proteina-A Sefarosa utilizando una bomba Pharmacia Pl (2-3 ml/min) . Se lavó la columna con ??? antes de que el anticuerpo fuera eluido con glicina 0.1 M, NaCl 0.1 M, pH 2.7. Se dializó la proteina eluída contra 3 cambios de PBS 2L y entonces fue desalificada en una columna PD-10 equilibrada con PBS que contenia un adicional de NaCl 0.1 M. La solución de proteina desalificada fue filtrada a través de un filtro de 0.2 µp? antes de almacenar a 4°C.

Ejemplo 5. Determinación de la pureza mediante HPLC de exclusión de tamaño y SDS-PAGE Se efectuó una HPLC de exclusión de tamaño utilizando un sistema de HPLC Perkin Ehner consistente en un procesador avanzado de muestra de LC PE ISS 200 Advanced 1C Simple Processor, una bomba PE serie 410 Bio de LC, un detector PE 235 C Diode Array y un PE Nelson 600 serie LINK. Se utilizó un software Perkin Elmer Turbochrom Navigator Versión 4.1 para 0 controlar el automuestreador, la bomba y el detector, y para obtener, almacenar y procesar los datos. Se logró la separación utilizando dos columnas TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL de HPLC de exclusión de tamaño, 7.8 mm x 300 itim, tamaño de partículas 5 , tamaño de poro de 250 A (catálogo # 08541, TosoHaas, Montgomeryville, MD) , conectadas en serie. La fase móvil fue 200mM de fosfato de potasio/150 inM de cloruro de potasio a pH 6.9 y la tasa de flujo fue de 1.00 ml/minuto. El eluato de la columna fue monitoreado en forma espectrofotométrica a 220 mn y 280 nm. El volumen de inyección fue de 50 µ? (50 µg) de la muestra de ChTN228. Se efectuó el SDS-PAGE de acuerdo con procedimientos estándar en gel de gradiente 4-20% (catálogo # EC6025, Novex, San Diego, CA) .

Resultados Se analizó la pureza del ChTN228 aislado, mediante HPLC de exclusión de tamaño y SDS-PAGE. Basado en este análisis la proteina es de 96.5% de monómero y tiene la movilidad correspondiente a una proteina de peso molecular -160 kD. Un análisis SDS-PAGE de MuTN228, un control de isotipo MuFd79 (IgGl de ratón), ChTN228 y un control de isotipo HuEP5C7 (IgG2M3 humano) bajo condiciones no reductoras también indicó que los cuatro anticuerpos tenian un peso molecular de aproximadamente 150-160 kD. El análisis de las mismas cuatro proteínas en condiciones reductoras indicaba que los cuatro anticuerpos comprendían una cadena pesada con un peso molecular de alrededor de 50 kD y una cadena liviana con un peso molecular de alrededor de 25 kD.

Ejemplo 6. Experimento de competición: Métodos Se efectuó un experimento de titulación utilizando una serie de diluciones al doble de anticuerpo MuTN228-FITC, comenzando a 250 ng/ensayo. Se incubaron células P815/CD281 (5xl05 células/ensayo) con anticuerpo marcado con FITC durante 1 hora en hielo, se lavaron con PBS y se analizaron mediante citometría de flujo. Para los experimentos de competición se agregaron 25 ng de MuTN228-FITC y diluciones en serie al doble de anticuerpos competidores ChTN228 o MuTN228 comenzando a 800 ng/ensayo a células PS15/CD28+ (5?10;' células/ensayo) . Como control se incubaron células P815/CD28 (5xl0'; células/ensayo) con 25 ng de MuTN228-FITC solo (es decir, sin ningún competidor) . También se ensayaron anticuerpos control de isotipo HuEP5C7 y MuFd79 (800 ng/ensayo) como competidores. Se incubaron las células con la mezcla de anticuerpos en un volumen final de 150 µ? durante una hora en hielo (en la oscuridad) , luego se lavaron y se analizaron mediante citometría de flujo.

Resultados La especificidad de enlace de los anticuerpos MuTN228 y ChTN228 fue comparada en un experimento de competición por citometría de flujo, como fue descrito en los Métodos. Se mezclaron varias cantidades de MuTN228 o ChTN228 no marcados con 25 ng de anticuerpo MuTN228 marcado con FITC y se incubaron con células P815/CD28'. Tanto el MuTN228, como también el ChTN228 compitieron con MuTN228-FITC de una manera dependiente de la concentración, indicando que el enlace de ambos anticuerpos es específico para el antígeno CD28 (figura 4). Los anticuerpos control de isotipo MuFd79 y HuEP5C7 no compiten con MuTN228-FITC, indicando que los anticuerpos MuTN228 y C TN228 reconocen al antígeno CD28 a través de interacciones específicas de la región v.

Ejemplo 7. El anticuerpo quimérico anti-humano CD28 que tiene la afinidad reducida al F R humano inhibe la reacción de linfocitos primarios mezclados.

- Preparación de células Se prepararon células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) de voluntarias normales sanas por centrifugación con gradiente de densidad usando Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japón) . Se diluyó sangre humana con igual volumen de RPMI1640 y se superpuso a Ficoll-Paque Plus. Después de centrifugar durante 30 min a temperatura ambiente se recolectaron las PBMC y se lavaron con RPMI 1640. Después de esto se suspendieron las PBMC en el medio (RPMI1640 que contenia 2.5% de suero tipo AB humano, 2-mercaptoetanol y antibióticos) y se aplicaron a una columna de fibra de nylon (Wake junyaku, Osaka, Japón) . Después de 1 hora de incubación a 3 °C en 5% de C02 se eluyeron las células T con un medio caliente. Se utilizaron lineas celulares humanas B (Raji y JY) como células estimulantes en la reacción de linfocitos mezclados. Estas células fueron irradiadas con rayos X (2000R) antes del uso.

Reacción primaria de linfocitos mezclados (Ia MLR) Se sembraron células T humanas purificadas (1x10" células/pozo) y células Raji irradiadas (lxlO5 células/pozo) en microplacas de fondo plano de 96 pozos. Se agregaron anticuerpos al medio de cultivo y se incubaron las células durante 7 dias. Todos los cultivos fueron marcados por las 6 horas finales con 10 kBq/pozo de [?] timidina (Amersham Pharmacia Biotech) . Se recolectaron las células y se midió la radioactividad incorporada en un contador de centelleo en liquido . Los efectos de TN228-IgG2M3 (ChTN228) en MLR primaria estén mostrados en las figuras 5 y 6. El anticuerpo anti-humano CD28 original TN228 (MUTN228) no inhibió la MLR primaria, sin embargo, el anticuerpo quimérico TN228-IgG2M3 inhibió de una manera dependiente de la dosis. Por ello la conversión de la región Fe del anticuerpo anti-humano CD28 en uno con afinidad reducida al Fe R humano hace antagonista al anticuerpo a la proliferación de células T. El anticuerpo quimérico anti-humano CD28 que tenia afinidad reducida al Fe R humano redujo la baja sensibilidad de las células T en una reacción de linfocitos mezclados secundaria.

Reacción secundaria de linfocitos mezclados (2a MLR) Se sembraron células T humanas purificadas (1 x 10a células/pozo) y células Ra i irradiadas (1 x 101' células/pozo) en microplacas de fondo plano de 96 pozos. Se agregaron anticuerpos al medio de cultivo y se incubaron las células. Después de 5 días se recolectaron las células y se lavaron con un medio fresco. Se suspendieron las células con un medio fresco y se cultivaron durante 8 días. Se re-estimularon las células con células Raj i o JY irradiadas. Después de 7 dias adicionales de cultivo se incubaron las células con 10 kBq/pozo de [ ?] timidina durante 6 horas. Se recolectaron las células y se midió la radioactividad por un contador de centelleo en liquido . TN228-IgG2m3 inhibió la MLR primaria (figuras 5 y 6) .

Luego se analizó el efecto de este anticuerpo en la MLR secundaria. Se aplicó el anticuerpo al cultivo de la MLR primaria, luego se removió el anticuerpo del sobrenadante del cultivo. Después de cultivar en el medio sin anticuerpos se re-estimularon las células con las mismas células estimulantes (Raji) o estimulante de tercera parte (JY) . La proliferación de las células tratadas con TN228-IgG2m3 a través de la MLR primaria fue reducida en comparación con las células no tratadas. Sin embargo, ambas células proliferaron en casi la misma medida con el estimulante de tercera parte (JY) (Figura 7) . Este resultado indica que el anticuerpo anti-humano CD28 con afinidad reducida al Fe R humano puede inducir la energía de las células T a través del estimulo con alo-antigeno.

Ejemplo 8. Diseño de regiones variables de TN228 humanizado Las secuencias de región V de MuTN228 fueron analizadas mediante modelado por computadora. Basado en una investigación de homología de secuencia comparado con una base de datos de secuencia de anticuerpos Kabat ((8. Johnson, G . , and T.T. Wu.2000. Kabat datábase and its applications : 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res.28: 214-218), IC4 (Manheimmer-Lory, A., J.B. Katz, M. Pillinger, C. Ghossein, A. Smith, B. Diamond .1991. Molecular characteristics of antibodies bearing an anti-DNA-associated idiotype. J. Exp.

Med. 174: 1639-1652) fue seleccionado para proveer el armazón para las regiones variables de cadena pesada como también de cadena liviana del TN228 humanizado. El dominio variable de cadena pesada del TN228 humanizado tiene 65 residuos de 85 residuos de armazón que son idénticos a aquéllos de armazón de cadena pesada del TN228 de ratón o 76% de identidad de secuencia. El dominio variable de cadena liviana de TN228 humanizado tiene 56 residuos de 80 residuos de armazón que son idénticos a aquéllos del armazón de cadena liviana de TN228 de ratón, o 70% de identidad de secuencia. Se utilizaron los programas de computadora ABMOD y ENCAD (Levitt, . 1983. Molecular dynamics of native protein. 1. Computer simulations of trajectories . J. Mol. Biol.168: 595-620) para construir un modelo molecular del dominio variable de TN228, que fue utilizado para localizar los aminoácidos del armazón de TN228 de ratón que están lo suficientemente cerca de los CDR para interactuar potencialmente con ellos. Para diseñar las regiones variables de cadena pesada y liviana del TN228 humanizado, se injertaron los CDR de cadena pesada de TN228 de ratón en las regiones de armazón de la cadena pesada del IC4 humano y los CDR de cadena liviana del TN228 de ratón fueron injertados en las regiones de cadena liviana del armazón del IC4 humano. En posiciones del armazón donde el modelo de computadora sugería un contacto significativo con los CDR, los aminoácidos del anticuerpo de ratón fueron sustituidos por los aminoácidos originales del armazón humano. En el TN228 humanizado esto se efectuó en los residuos 27, 29, 30, 48, 67, 71 y 78 de la cadena pesada. Para la cadena liviana no se efectuaron sustituciones, debido a potenciales interacciones con los CDR (es decir, se efectuó un injerto recto de los CDR de MuTN228 dentro de la región del armazón de IC4; no obstante, ver más adelante dos excepciones) . Además, los residuos del armazón que sólo ocurrían raramente en sus posiciones en la base de datos de anticuerpos humanos, fueron reemplazados por aminoácidos de consenso humano en esas posiciones. En el TN228 humanizado esto fue efectuado en los residuos 23, 40, 73, 83 y 85 de la cadena pesada y en los residuos 69 y 77 de la cadena liviana. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y liviana del anticuerpo humanizado TN228 se muestran en las figuras 9 y 10.

Ejemplo 9. Construcción de vectores de expresión de TN228-IgG2M3 humanizado Métodos Una vez que las secuencias de regiones variables humanizadas hayan sido diseñadas como se describió anteriormente se construyeron genes para codificarlos, incluyendo péptidos de señal, señales donadoras de empalme y sitios apropiados de enzimas de restricción (figura 8). Los genes de región variable de cadena pesada y liviana fueron construidos y amplificados utilizando ocho oligonucleótidos sintéticos que se superponían, que tenían longitudes en el ámbito de aproximadamente 65 a 80 bases (He, X.Y, Z. Xu, J. elrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. lingbeil, M.S. Co, and E.L. Berg. 1998. Humanization and phamacokinetics of a monoclonal antibody wíth specificity for both E- and P-selectin. J. Immunol. 160: 1029-1035). Se fijaron los oligonucleótidos fueron templados en pares y se extendieron con el fragmento Klenow de ADN-polimerasa I, produciendo cuatro fragmentos de doble cordón. Los fragmentos resultantes fueron desnaturalizados, fijados de a pares y extendidos con Klenow, produciendo dos fragmentos- Los fragmentos resultantes fueron desnaturalizados, templados en pares y extendidos nuevamente, dando por resultado un gen de larga duración. El producto resultante fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , utilizando Taq-polimerasa purificada por gel, digerido con Xbal, purificado nuevamente por gel y subclonado dentro del sitio de Xbal de pVg2M3 para la expresión de la cadena pesada, y pVk para la expresión de la cadena liviana. El vector pVg2M3 para la expresión de la cadena pesada gamma 2 humano (Colé, M.S., C. Anasetti, and J.Y. Tso.1997. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 159: 3613-3621) y el vector pVk para la expresión de la cadena liviana kappa humano (CO, ?.?., N. . Avadalovic, P.C. Carón, M.V. Avadalovic, D.A. Scheinberg, and C. Queen.1992.

Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen. J. Immunol . 148:1149-1154) ha sido descrito anteriormente . Se verificaron las secuencias de los exones de las regiones V y regiones constantes de los plásmidos finales de cadena pesada y cadena liviana mediante secuenciación de nucleótidos. Se verificaron las estructuras brutas de los plásmidos finales por mapeo de restricción. Todas las manipulaciones de ADN fueron realizadas mediante métodos estándar. En esta especificación HuTN228 se refiere a anticuerpo humanizado que contiene las regiones variables VH y VL del TN228 humanizado, una región constante de IgG2M3 humano para la cadena pesada y una región constante kappa humano para la cadena liviana. La región constante de cadena pesada fue modificada (Colé, M.S., C. Anasetti, and J.Y. Tso. 1997. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol.159: 3613-3621) a partir del fragmento genómico de la linea de células embrionarias humanas 2 y la cadena liviana fue derivada del fragmento genómico de la linea de células embrionarias humanas . El promotor mayor inmediato temprano de citomegalovirus humano y el exhaltador ambos conducen los genes de cadena pesada y liviana. El gen de cadena pesada es seguido por el terminador de transcripción derivado del gen complementario humano C2 (Ashfield, R . , P. Enriquez-Harris, and N.J. Proudfoot.1991. Transcriptional termination bet een the closely linked human compiement genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO J. 10: 4197-4207) . El gen marcador de selección de cadena liviana gpt (Mulligan, R.C., and P. Berg. 1981. Selection for animal cells that express the Escherichia cold gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Proc . Nati. Acad. Sci . USA 78: 2072-2076) y el gen marcador de selección de cadena pesada dhfr (Simonsen, C.C., and A.D. Levinson 1983. Isolation and expression of an altered mouse dihydrofoíate reductase ADNc. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499) ambos son conducidos por el promotor temprano SV40. Para la expresión de HuTN228 se efectuó una transfección transitoria dentro de células COS-7 (linea de células de riñon de mono) utilizando Lipofectamine 2000 (catálogo # 11668-027, Life Technologies) . Los medios utilizados por los transfectantes transitivos fueron analizados para averiguar la producción de anticuerpo IgG2M3 humano, mediante ELISA, utilizando anticuerpo IgG anti-humano de cadena gamma de cabra especifico como reactivo capturador y anticuerpo anti-humano de cadena kappa de cabra conjugado con HRP como reactivo revelador. Los medios utilizados también fueron ensayados para averiguar la capacidad de HuTN228 de enlazarse con células P815/CD28+ por coloración inmunofluorescente indirecta y se analizaron por citometría de flujo (no se 4 muestran los datos) . Para la producción de lineas celular estable, los plásmidos de expresión humanizados fueron transíectados en una linea SP2/0 celular de mieloma de rtiurina por electroporación y los transíectantes fueron seleccionados por expresión gpt . Los medios utilizados a partir de transfectantes estables fueron analizados por ELISA con respecto de la transfección transciende.

Resultados : Basados en el diseño de secuencia de aminoácido de la región V humanizada, los genes V de cadena liviana (Figura 9 y 10) se construyeron como se describe en los Métodos. Los genes V de cadena liviana y pesada se clonaron en los vectores pVg2M3 y pVk, respectivamente, como se muestra en la Figura 8. Se analizaron diversos clones por secuencia de nucleótido y clones correctos de los vectores de expresión de cadena liviana y cadena pesada, se utilizaron para la transfección. Las regiones constantes de los vectores de expresión de cadena liviana y pesada, fueron también confirmados mediante secuenciación .

Ejemplo 10. Expresión de HuTN228 Transfección transitoria de las células COS-7: Los vectores de expresión fueron transíectados de manera transitoria en la linea de células de riñon de mono COS-7 para producir el anticuerpo HuTN228. El medio utilizado por las células transfectadas fue analizado mediante ELISA para averiguar la producción de anticuerpos IgG2M3 humanizados y por citometria de flujo para averiguar el enlace a células P815/CD28T (no se muestran los datos) . El medio utilizado fue positivo en ambos ensayos. El rendimiento de anticuerpo humanizado por transfección transitoria fue de -3.7 g/ml . El anticuerpo HuTN228 del sobrenadante transitorio se enlaza a células P815/CD28+ de una manera dependiente de la concentración (no se muestran datos) . Transfección estable de células Sp2/0: Los vectores de expresión humanizados fueron transfectados en células Sp2/0 para la producción de una linea de células estable. Los medios consumidos por varias transfectantes fueron ensayados para averiguar la producción de anticuerpo HuTN228 como con los transfectantes transitorios. Se eligió un transfectante (clon 4) se eligió por su productividad más alto de anticuerpos y se diluyó en un medio de hibridoma GIBCO exento de suero. Se purificó el anticuerpo HuTN228 a partir de 570 mi de medio utilizado, por cromatografía de afinidad. El rendimiento de anticuerpo purificado fue de ~7 mg.

Ejemplo 11. Purificación de proteínas de HuTN228 Uno de los transfectantes de alto expresión de HuTN228 de la transfección estable (Clon 4) fue cultivado en 570 mi de medio de hibridoma GIBCO exento de suero (catálogo # 12045-076, Life Technologies) . El sobrenadante del cultivo utilizado fue recolectado cuando la viabilidad de las células alcanzó el 10% o por debajo y se cargó en una columna de 2 mi de proteina A de sefarosa. Se lavó la columna con PBS antes de eluir el anticuerpo con glicina 0.1 M, NaCl 0.1 M, pH 2.5. La proteina eluida fue dializada contra 3 cambios de 2 L de PBS y luego fue desalificada en una columna PD-10 equilibrada con PBS que contenia un adicional de NaCl 0.1 M. Se filtró la solución de proteina desalificada a través de un filtro de 0.2 µ?? antes de almacenar a 40C.

Ejemplo 11. Determinación de la pureza mediante HPLC de exclusión de tamaño y SDS-PAGE Métodos Se efectuó la HPLC de exclusión de tamaño utilizando un sistema de HPLC Perkin Eliner consistente en un procesador de muestras de LC avanzado PE ISS 200. Una bomba PE serie 410 Bio LC, un detector PE 235 C Diode Array, y un PE Nelson 600 serie LIN . Se utilizó software Perkin Eliner Turbochroin Navigator versión 4.1 para controlar el automuestreador, la bomba y el detector y para adquirir, almacenar y procesar los datos. Se logró la separación utilizando dos columnas de HPLC de exclusión de tamaño TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL (7.8 mm x 300 mm, tamaño de partícula 5 m, tamaño de poros 250; catálogo #08541, TosoHaas, Montgomeryville, MD) , conectadas en serie. La fase móvil fue de fosfato de potasio 200mM/cloruro de potasio 150 mM a pH 6.9 y la tasa de flujo fue de 1.00 mi/minuto. El eluato de la columna fue monitoreado en forma espectrofotométrica a 220 nm y 280 mn. El volumen de inyección fue de 60 1 (60 g) de la muestra de HuTN228. Se efectuó un SDS-PAGE de acuerdo con procedimientos estándar en un gel de gradiente 4-20% (catálogo # EC6025, Novex, San Diego, CA) . Se confirmó el isotipo del anticuerpo purificado utilizando un equipo de subclase IgG humano Profile ELISA (catálogo # 99-1000. Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) , siguiendo las recomendaciones del fabricante . (Resultados) La pureza del anticuerpo aislado HuTN228 fue analizada por HPLC de exclusión de tamaño y SDS-PAGE. No se muestra el perfil de elusión de HPLC de HuTN228. En base a este análisis la proteina es - 98% de monómero y tiene la movilidad correspondiente a una proteina de peso molecular de - 160 kD. El análisis por SDS-PAGE de MuTN228, control de isotipo MuFd79 (IgGl de ratón), HuTN228 y control de isotipo HuEPSC7 (IgG2M3 humano) en condiciones no reductoras (no se muestran los datos) también indicaron que los cuatro anticuerpos tienen un peso molecular de aproximadamente 150-160 kD. El análisis de las mismas cuatro proteínas en condiciones reductoras (no se muestran los datos) indicaron que los cuatro anticuerpos comprendían una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y una cadena liviana con un peso molecular de aproximadamente 25 kD. El ensayo del isotipo indicaba que el isotipo del anticuerpo HuTN228 fue concordante con el isotipo IgG2 esperado (no de muestran los datos) .

Ejemplo 12. Experimento de competición FACS Métodos Se realizó un experimento de titulación utilizando series de diluciones al doble del anticuerpo MuTN228-FITC comenzando con 250 ng/ensayo. Se incubaron células P815/CD284 (3 x 105 células/ensayo) con anticuerpo marcado con FITC durante hora en hielo en 100 pl de buffer colorante FACS (FSB = PBS, 2% FBS, 3% de suero normal de ratón, 0.1% NaN3) , se lavó con 2 mi de FSB y se analizó mediante citometría de flujo (no se muestran los datos) . Para los experimentos de competición se combinó MuTN228-FITC (50 ng/ensayo) en 25 µ? de FSB con diluciones en serie al triple de anticuerpos competidores HuTN228 o MuTN228 (comenzando a 200 g/ml) en 25 1 de FSB y se agregó a células P815/CD28+ (3 x 105 células/ensayo) en 50 1 de FSB. Como control, las células P815/CD28+ fueron incubadas con MuTN228-FITC solo (50 ng/ensayo en 50 1 de FSB) . Los anticuerpos control de isotipo HuEP5C7 (IgG2M3 humano) y MuFd79 (IgGl de ratón) (200 g/ml en 25 1 de FSB) también fueron analizados como competidores no específicos. Las células fueron incubadas con la mezcla de anticuerpos en un volumen final de 100 1 durante una hora en hielo (en la oscuridad) , luego fueron lavadas con 2 mi de FSB y analizadas mediante citometria de flujo. Este experimento fue repetido tres veces .

Resultados La especificidad de enlace de los anticuerpos uTN228 y HuTN228 con moléculas CD28 en las células P815/CD28+ fue comparada en un experimento de competición por citometria de flujo, como el que fue descrito en los Métodos. Un resultado representativo se muestra en la Figura 5. Tanto MuTN228 como también HuTN228 compitieron con MuTN228-FITC de una manera dependiente de la concentración, indicando que el enlace de ambos anticuerpos es específico para el antígeno CD28. El enlace relativo de HuTN228 fue algunas veces mayor que el de MUTN228. Los anticuerpos control de isotipo MuFd79 y HuEP5C7 no compitieron con MUTN228-FITC, indicando que los anticuerpos MUTN228 y HuTN228 reconocen el antígeno CD28 a través de interacciones específicas de la región V.

Ejemplo 13. Experimento de competición por ELISA Métodos Se cubrió una placa ELISA de 96 pozos (Nunc-Immuno píate, catálc # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) con 100 1/pozo de sCD28-Fc (0.5 g/ml en PBS) (sCD28-Fc significa la proteina condensada, en la cual los dominios extracelulares de CD28 fueron combinados con los dominios CH2 y CH3 de IgGl) durante la noche a 4°C. Las placas fueron inactivadas durante 30 minutos con 300 1/pozo de Amortiguador Inactivador Superblock en TBS (catálogo # 37535, Pierce, Rocktord, IL) y se lavó con 300 1/pozo de Amortiguador Lavador ELISA (E B = PBS, 0.1% Tween 20). Se agregó por triplicado una mezcla de MuTN228-biotina (0.5 g/ml) en 100 1 de Amortiguador ELISA (EB = PBS, 1% BSA 0.1% Tween 20) y anticuerpos competidores HuTN228 o MuTN228 diluidos en serie al triple (comenzando a 100 g/ml) en 100 1 de EB en un volumen final de 200 1/pozo. También se analizaron anticuerpos control de isotipo HuEP5C7 y MuFD79 (100 g/ml) en 100 1 de EB como competidores no específicos. Como control de un "no competidor" se agregaron 100 1 de EB a 100 1 de MuTN228-biotina (0.5 g/ml). Como blanco se agregaron 200 1 de EB a los pozos restantes (que no contenían MuTN228-biotina) . Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 1.5 horas con agitación. Después de lavar 4 veces los pozos con 300 1/pozo de EWB, se agregaron 100 1/pozo de estreptavidina-HRP (1 g/ml, catálogo # 21124, Pierce) a todos los pozos. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Después de lavar los pozos como anteriormente, se agregaron 100 1/pozo de sustrato ???? (catálogo # 507602 & 506502, KPL, Gaithersburg, MD) a todos los pozos. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 5-7 minutos y se leyó la densidad óptica a 415 nm. Se repitió tres veces este experimento.

Resultados La especificidad de enlace de los anticuerpos HuTN228 y MuTN228 para sCD28-Fc fue comparada en un experimento de competición por ELISA, como se describió en los Métodos. Se muestra un resultado representativo en la figura 12, Tanto MuTN228 como también HUTN228 competían con MuTN228-biotina de una manera dependiente de la concentración. Los anticuerpos control de isotipo MuFd79 y HuEP5C7 no competían con MUTN228-biotina, indicando que los anticuerpos MuTN228 y HuTN228 reconocen el antigeno CD28 a través de interacciones específicas de la región V. Los valores IC50 de MuTN228 y HuTN228 para los tres experimentos se muestran en la tabla 2. El enlace relativo de HuTN228 en promedio fue 2,6 veces mayor que el de Mu N228.

Tabla 2. Resumen de la competición ELISA IC50 ^g ml) Competidor Experimento Experimento Experimento Promedio Desviación 1 2 3 estándar MuTN228 0,21 0,20 0,15 0,19 0,03 HuTN228 0,37 0,64 0,48 0,50 0,14 Ejemplo 14. Experimento de competición con anticuerpo marcado con 12'? ¦ Métodos Las afinidades de enlace relativas de anticuerpos MuTN228 y HuTN228 se determinaron siguiendo el método de Queen et al. (Queen, C, W.P. Schneider, H.E . Selick, P.W. Payne, N.F. Landolfi, J.F. Duncan, N.M. Avdalovic, M. Levitt, R.P. Junghans, T.A. Waldmann .1989. Un anticuerpo hunmanizado que enlaza al receptor interlucina 2. Proc. Nati. Acad. Sci.86:10029-10033) . En resumen, -10 ng de MuTN228 ,25I-marcado en 50 1 de Amortiguador (BB = PBS, 2¾ FBS, 1 g/ml ratón IgG, 0.1 % NaN;¾) se combinaron por triplicado con diluciones sereales tres veces de los anticuerpos MuTN228 o HuTN228 (iniciando en 400 g /mi) in 50 1 de BB, agregado a 100 1 de células P815/CD28* (2.5 x 10ü células/prueba) en tubos de incubación (Skatron Macro ell Tube Strips, catalog # 15773, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) , y se incubaron durante 90 minutos a 4 C con agitación moderada. Los anticuerpos de control de Isotipo HuEP5C7 y MuFd79 (400 g /ral) en 50 1 de BB también se probaron como competidores no específicos. Siguiendo la incubación, la mezcla de célula/anticuerpo se transformó en tubos de centrifuga (Sarstedt Micro Tubes, catalog # 72.702, Sarstedt, Newton, NC) que contiene ftalato de butilo al 0.1 mi 80¾-aceite de oliva al 20%, una vez que se lavaron los tubos de incubación con 50 1 de BB, y se separaron las cuentas libres y el enlace por centrifugación como se describe (Kuziel, W.A., S.J. Morgan, T.C. Dawson, S. Griffin, 0. Smithies, K. Ley, N. Maeda.1997. Reducción diversa en la adhesión de leucocito y la extravasación de leucocito de monolito en el ratón está deficiente en el receptor 2 de quimiocina CC. Proc. Nati. Acad. Sci. 94:12053- 12058). Este experimento se repitió tres veces.

Resultados La afinidad de enlace relativa de los anticuerpos MuTN228 y HuTN228 se compare en un experimento de competición del anticuerpo a la 12'I^marcado como se describió en el Método. Un resultado representativo se mostró en la Figura 13. Los MuTN228 y HuTN228 compitieron con el MuTN228 125I-marcada en una concentración de manera dependiente. El anticuerpo MuFd79 de control de isótopo mostró debilidad aunque competición repetible en altas concentraciones, pero el anticuerpo HuEPSC7 de control de isótopo no compitió con MuTN228 -marcado, indicando que el anticuerpo HuTN228 reconoce el antigéno CD28 a través de las interacciones específicas de la región V. Los valores IC50 de MuTN228 y HuTN228 para los tres experimentos se muestran en la Tabla 3. La afinidad de enlace aparente de HuTN228 fue aproximadamente 2.4 veces menos que el anticuerpo MuTN228.

Tabla 3. Resumen de la competición 125I IC50 (nM) Ejemplo 15 secuencia de aminoácidos del anticuerpo CD28 anti-murino de hámster Método Hibridoma y anticuerpos. El hibridoma PV1 de CD28 anti-murino de hámster Armenio se obtuvo del ATCC (ATCC HB-12352) .Se adquirieron PV1 y PV1 conjugado con R-ficoeritrina (R-PE) purificados de Southern Biotechnology (Birmingham, AL) . El anticuerpo anti-CD28 37.51 de hámster Sirio era de PharMingen (San Diego, CA) . Los anticuerpos secundarios con fluoresceina (FITC) , anti-hamster Sirio IgG (H+L) de asno, conjugado con FITC, anti-ratón IgG (H+L) de asno conjugado con FITC y anti-ratón IgG (H+L) de asno R-PE-F ( abf ) -¿ eran de Jackson immunoResearch (West Grove, PA) ; y anti-ratón kappa de cabra conjugado con FITC, Anti-ratón IgG3 de cabra conjugado con R-PE y anti-ratón kappa de cabra conjugado con peroxidasa de rábano rústico (HRP) eran de Southern Biotechnology. IgG3 anti-ratón de cabra y el control de isotipo IgG3 de ratón FLOPC 22 eran de Sigma Chemicals (St Louis, MO) . El anticuerpo CD3 anti-murino de hámster Armenio 145.2C11 y su versión quimérica hámster/ ratón 145.2Cll-IgG3 fueron generados en nuestro laboratorio. 145.2C11 conjugado con FITC era de Boehringer Mannheim. (Indianapolis, IN) .

Clonación de los ADNc de región variable los ADNc de región V para las cadenas liviana y pesada de PV1 fueron clonados de las células de hibridoma mediante un método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) fijada, descrito por Co et al., (Co, M.S., . M. Avadalovic, P.C. Carón, M. V. Avadalovic, D.A. Scheinberg, and C. Queen. 1992. J. Immunol . 148:1149-1154). Se efectuó la amplificación en el ADNc utilizando cebadores 3' que se fijan respectivamente en las regiones de cadena C kappa y gamma de ratones y un cebador 5' que se fija a la cola G adicional del ADNc. Para la PCR de V el cebador 3' tiene la secuencia: 5' TATAGAGCTCCACTTCCAGTGCCC (SEQ ID NO: 20 ), con los residuos 11-24 que se hibridizan con la región CK de hámster. Para la PCR de VH, los cebadores 3', tienen las secuencias degradadas de (SEC. DE IDENT. NOS: 17,18 y 19): A G T 5' TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC T con los residuos 19-50 que se hibridizan con IgGCHl de ratón. Las secuencias que no se hibridizan en los dos juegos de cebadores contienen sitios de restricción utilizados para clonar. Los ADNc de VL y VH fueron subclonados en un vector pUC19 para la determinación de secuencia. Para evitar errores generados en la PCR se secuenciaron cinco clones independientes para cada ADNc y sólo se eligieron los clones cuyas secuencias coincidían con la secuencia de consenso para expresar el PVl quimérico .

Resultados Clonación de los ADNc de la región PVl. El PVl de región V para las cadenas liviana y pesada de los ADNc fueron clonados de las células de hibridoma como de describe en los métodos. Para la PCR de VL sólo un cebador 3' correspondiente a la región Cy de hámster pudo rendir un producto de ADNc de VL a partir de PVl. Por el otro lado, un cebador 3' de la región Cy de hámster no rindió ningún producto de PCR. Estos resultados indicaron que el hibridoma PVl utiliza kappa para su cadena liviana. Varios clones de cadena liviana y pesada fueron secuenciados y se halló que contienen la misma VL y VH respectivamente. Datos de secuencia limitados de CH1 y Cy indicaron que las cadenas pesadas y livianas clonadas no son de origen de murinos .

Ejemplo 16. Construcción y expresión de PVl-IgG3 quimérico Método PVl VL y VH hechos por PCR fueron convertidos mediante PCR en segmentos de mini-exones, flanqueados por sitios Xbal, como fue descrito (He, X. Y., Z. Xu, J. Melrose A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M.S. Co., and E. L. Berg. 1998. J.Immunol 160: 1029-1035) fueron subclonados dentro de los plásmidos de expresión de cadena liviana y cadena pesada (figura 14) . Cada mini-exon contiene una secuencia de péptidos de señal, una secuencia completa de región variable y una secuencia 5' donadora de empalme derivada del gen de cadena J de ratón más homólogo. Tales secuencias donadoras de empalme se utilizan para empalmar el exon de la región V con la región constante del anticuerpo humano . Cada mini-exon fue secuenciado después de que fue clonado dentro del vector de expresión para asegurar de que se obtuvo la secuencia correcta y que no se generaron errores de PCR. Se construyó un vector para expresar tanto los genes de cadena pesada, como también de cadena liviana del PVl-IgG3 quimérico a partir de un plásmido simple. En esta descripción PVl-IgG3 se refiere a un anticuerpo quimérico que contiene las regiones variables PV1 VL y VH de IgG3 de ratón, una región constante de la cadena pesada y una región constante kappa humano para la cadena liviana. Se obtuvo el vector de expresión pVl.g3.rg.dE (figura 14) por un procedimiento de clonación en dos pasos, similar al descrito por Colé et al. (Colé, M.S., C. Anasetti, and J.Y. Tso 1997. J. Immunol . 159:3613-3612) . La región constante de cadena pesada fue derivada del fragmento genómico de ratón ?3 y la cadena liviana del fragmento ?. Tanto los genes de cadena pesada como también los de cadena liviana son conducidos por el promotor mayor inmediato temprano y exaltador de citomegalovirus humano, y se separaron por el terminador de transcripción derivado del gen complementario humano C2 (Ashfield R., P. Enriquez-Harris, and N.J. Prudfoot. 1991. EMBO J. 10:4197-4207) El gen marcador de selección gpt (Mulligan, R.C. and P. Berg. 1981. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072-2076) son conducidos por el promotor temprano SV40. Para la expresión de PVl-gG3 quimérico el vector deplásmido simple se transfecto en la linea celular NS0 de mieloma de murino y los transíectantes se seleccionaron para la expresión gpt. Los medios utilizados a partir de transfectantes se analizaron para la producción de anticuerpos IgG3 de ratón por ELISA, utilizando IgG3 de anti-ratón de cabra como reactivo capturador y cadena kappa anti-ratón de cabra conjugado con HRP como reactivo revelador. El ensayo se especifica por IgG3 de ratón; otros isotipos IgG3 de ratón son negativos en este análisis .

Resultados Expresión del PVl-IgG3 quimérico Se convirtieron las VL y VH clonadas en mini-exones (Figura 15) y se incorporaron dentro de un vector de expresión, como se describió en Métodos y Materiales y Fig. 15. El vector de expresión entonces fue transfectado en una línea de células de mieloma de murinos NSO para producir el PVl-IgG3 quimérico. Se ensayaron mediante ELISA los medios utilizados por varias transíectantes para averiguar la producción de anticuerpos IgG3 de ratón y mediante FACScan para averiguar el enlace a células EL4. La mayoría de los transfectantes fueron positivos en ambos ensayos. Se eligió un transfectante por su alta productividad de anticuerpos y se diluyó para su crecimiento en 1 L de medio exento de suero. Se purificó PVl-lgG3 a partir de 1 L de medio utilizado mediante cromatografía de afinidad. El rendimiento fue > 10 mg/L.

Ejemplo 17. Purificaci n de proteínas del anticuerpo quimérico PVI-IqG3 por HPLC y SDS-PAGE Métodos Se cultivó uno de los transfectantes altamente expresantes IgG3 (Clon #1) en 1 L medio de hibridoma Gibco. El sobrenadante del cultivo utilizado fue recolectado cuando la viabilidad de las células alcanzó el 30% o menos, se concentró a 200 mi y se cargó en una columna de 5 mi de proteína-A Sefarosa utilizando una bomba Pharmacia Pl (2-3 ml/min) . Se lavó la columna con PBS 0.1 M, NaCl (la concentración final del NaCl fue de 0.25 M) antes de eluir el anticuerpo con MgCl2, 3.5 M. Entonces la proteína eluida fue desalificada en una columna PD10 equilibrada con PBS que contenía un adicional de NaCl 0,1 M. La solución de proteína desalificada fue filtrada a través de un filtro de 0.2 µp? antes de almacenar a 4°C. Como todos los IgG3 de ratón, el PVl-IgG3 a altas concentraciones (> 1 mg/mL) precipita en el frió pero vuelve a disolverse cuando se calienta a 37°C. El anticuerpo permanece en solución a temperatura ambiente. Repetidos ciclos de precipitación por frió parecen no afectar la actividad enlazante al antigeno del anticuerpo .

Determinación de la pureza mediante HPLC de exclusión de tamaño y SDS-PAGE. Se efectuó una HPLC de exclusión de tamaño utilizando un sistema de HPLC Perkin Elmer consistente en un procesador avanzado de muestra de LC PE ISS 200. Una bomba PE serie 410 Bio de LC, un detector PE 235 C Diode Array y un PE Nelson 600 series LINK. Se utilizó un software Perkin Elmer Turbochrom Navigator Versión 4.1 para controlar el automuestreador, la bomba y el detector, y para obtener, almacenar y procesar los datos. Se logró la separación utilizando dos columnas TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL de HPLC de exclusión de tamaño, (TosoHaas, catalogo # 08541, 7.8 mm x 300 mm, tamaño de partícula de 5 µp? tamaño de poro a 250 Á) conectadas en serie. La fase móvil fue 200 mM de fosfato de potasio/150 mM de cloruro de potasio a pH 6.9 y la tasa de flujo fue de 1.00 mL/minuto. El eluato de la columna fue monitoreado en forma espectrofotométrica a 220 mn y 280 nm. El volumen de inyección fue de 50 ? (63.5 µg) de la muestra PV1-IgG3 no diluida. Se realiz{o SDS-PAGE de acuerdo a los procedimientos estándares.

Resultados La pureza del PVl -IgG3 aislado fue analizada por HPLC de exclusión de tamaño y por SDS-PAGE. El perfil de elusión por HPLC del PVl-IgG3 es mostrado en la figura 16. Basado en este análisis la proteina es al 99% rtionómero y tiene la movilidad correspondiente al peso molecular de 150 kD. Los análisis por SDS-PAGE de PVl, PVl-IgG3 y el control de isotipo en condiciones no reductoras también indicaron que los tres anticuerpos tienen el peso molecular de aproximadamente 150 kD (figura 17 A) . Las bandas menores que se ven en la figura 17A fueron debidas a la ebullición de las muestras en SDS sin reducción. Reflejaban el número de enlaces de disulfuro incompletos entre las cadenas en los anticuerpos. El análisis de las mismas tres proteínas en condiciones reductoras (Figura 17B) sin embargo, indicaba que PVl, pero no PVl-IgG3 o el control de isotipo, tiene una cadena pesada de peso molecular levemente mayor que el peso molecular de 50 kD vista usualmente en IgG. Por lo tanto, el anticuerpo PVl de hámster, ya sea, tiene una glicosilación pesada en Asn29i en CH3, o bien tiene un sitio extra de glicosilación en otro lado de la cadena pesada. Como se discute más adelante, este modelo inusual de glicosilación puede contribuir al enlace no específico de PVl a las células EL4, tal vez por interacción de lectina/carbohidratos .

Ejemplo 18. Métodos Citometrla de Flujo. Células EL4 de la linea de células T de murinos (2.5 x 10:J células/O.2 mi) fueron coloreadas con 1 µg/ml de PVl, 37.51 o PVl-IgG3 a 4°C durante 30 minutos, se lavaron con 2 mi de PBS frió y coloreadas con 20 µ? de anticuerpos secundarios específicos conjugados con fluorocromo (10 g/ml·) . Después de 20 minutos de incubación a 4°C en la oscuridad se lavaron las células con PBS y se analizaron por FACScan (Becton Dickinson, Milpitas, CA) . En el experimento de competición se colorearon células EL4 (2.5 x 105 células/0.2 mi) con 1 µg/ml de R-PE-PV1 y 25 µg ml de PVl, PVl-IgG3 o control de isotipo IgG3 a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad, se lavaron con PBS y se analizaron mediante FACScan. También se llevaron a cabo experimentos de competición similares utilizando variadas versiones de 145.2C11. En el experimento inverso de competición se colorearon células EL4 (2.5 x 105 células/0.2 mi) con 1 µg/ml de PVl-IgG3 y 25 µg/ml de PVl a 4°C durante 30 minutos, se lavaron 2 veces con PBS, se colorearon con anti-ratón IgG (H+L) de asno, conjugado con FITC, se lavaron y se analizaron mediante FACScan. Para controlar el enlace no específico de anticuerpos secundarios a PVl se colorearon células EL4 con exceso de PVl sin PVl-IgG3 y se analizaron. Para colorear células T de ratón se colorearon células esplénicas (2.5 x 10J células/0.2 mi) de ratones BALB/c con 1 g/pll de control de isotipo IgG3 de ratón (FLOPC 21) o PVI-IgG3 a 4°C durante 30 minutos, se lavaron con 2 mi de PBS frió y se colorearon con 20 µ? de 145.2C11 conjugado con FITC (10 µg/ml) y 20 µ? de IgG3 anti-ratón de cabra conjugado con R-PE (10 µ?/p??) . Después de 20 minutos de incubación a 4°C en la oscuridad, las células fueron lavadas con PBS y analizadas mediante FACScan.

Resultados Caracterización de PVl y PVl-lgG3 por citometria flujo Se utilizó PVl para colorear la linea de células T CD28-positivas EL4 y se analizaron mediante FACScan. El modelo de coloración indicó que PVl se enlaza a células EL4 en dos sitios diferentes (Figura 17A) . Además PVl, como también varias anticuerpos de células T anti-murino de h mster Armenio (145.2CU, anti-CD3; H57-597, anti-TCR; y UC10-4F10-11- anti-CTLA4) también se enlazan no especificamente a la linea de células de mieloma CD28-negativas NS0 (no se muestran datos) . Por el otro lado, el anticuerpo anti-CD28 de hámster Sirio 37.51 se enlaza especificamente a sólo un sitio en células EL4 (Figura 17B) . Se manifiesta que, además del enlace a CD28, PVl también se enlaza no específicamente a otros sitios, posiblemente a través de la interacción de tipo carbohidrato/lectina . Como se muestra en la figura 17C, el PVl -IgG3 quimérico no contiene esta actividad de enlace no específico. El anticuerpo se enlaza a las células EL4 en un modelo similar al de 37.51 y no se enlaza a células CD28-negativas NSO (no se muestran datos) . Por lo tanto la propiedad de enlace no específico de PVl reside en la región constante de cadena pesada de este anticuerpo en particular y es eliminada en la quimerización . Para demostrar que PVl-IgG3 contiene actividad de enlace específica para CD28, hemos utilizado el ensayo competitivo de FACScan. En estos experimentos se mezcló PVl conjugado con R-PE con un exceso (25 veces) de PVl no marcado, PVl-IgG3 o control de IgG3 de ratón y se utilizó la mezcla para colorear células EL4. Como se muestra en la figura 18 A, el PVl y PVl-IgG3, pero no el control de isotipo impidieron que el PVl conjugado con R-PE se enlazara con células EL4. La inhibición por PVl-IgG3 fue mayor que por PVl e interpretamos estos datos para indicar que PVl-IgG3 competía con PVl conjugado con R-PE para los sitios de CD28 pero no para los sitios no específicos. De manera similar tanto 145.2C11 (CD3 anti-murino de hámster Armenio), como también 145.2Cll-IgG3 quimérico impidieron que 145.2C11 conjugado con R-PE se enlazara a las células EL4 (Figura 18B) , pero el anticuerpo quimérico es menos eficiente, debido a su incapacidad de eliminar el enlace no especifico de R-PE-145.2C11 a las células. También hemos realizado el experimento de competición inversa utilizando un exceso (25 veces) de PV1 para competir con PVl-lgG3 en el enlace a las células EL4. Aunque PVl-IgG3 no estuvo marcado en este caso, fue reconocido específicamente por los anticuerpos anti-ratón de asno conjugados con FITC. Los resultados en la figura 18C mostraron que la inhibición del enlace de PVl-IgG3 a células EL4 por exceso de PV1 fue casi completa, demostrando que PV1 y PVl-IgG3 se enlazan al mismo epítope . Finalmente se utilizó PVl-IgG3 para colorear células esplénicas de ratón. Células esplénicas recubiertas por PV1-IgG3 fueron reconocidas específicamente por el anticuerpo secundario, IgG3 anti-ratón de cabra, conjugado con R-PE. Simultáneamente 145.2C11 conjugado con FITC también fue agregado a las células esplénicas para marcar células CD3-positivas. En el análisis por citometría de flujo de dos colores, PVl-IgG3 específicamente coloreaba células CD3-positivas, pero no células CD3-negativas (Figura 19B) . Por el otro lado, el control de isotipo IgG3 de ratón no coloreó las células CD3-positivas (Figura 19A) . Por lo tanto, el PVl-IgG3 quimérico reconoce un antigeno que es expresado en células T de murinos, una actividad de enlace de un antígeno que es consistente con un anticuerpo anti-CD28.

Ejemplo 19. Inducción de artritis inducida por colágeno Métodos Se inmunizaron ratones por vía intradérmica en la base del rabo con 125 µg de CII bovino (Collagen Gijutsu Kenkyukai, Japón) emulsionado con igual volumen de CFA (Wako, Japón) . Se reforzó el efecto en los ratones por inyección intradérmica de 125 µg de CU bovino en CFA en el día 21. Se trataron los ratones con anticuerpo anti-CD28 (PVl-IgG3) a la dosis de 1 mg/ g/día por infusión continua a través de una bomba osmótica durante 7 días después de la inmunización inicial. Se checo el desarrollo de artritis por inspección de cuatro garras en el dia 11 después de la segunda inmunización y la inflamación de cuatro garras estaba graduada de 0 a 3, como fue descrito previamente (Tada, Y., A. Ho, D.-R. Koh, T. W. Mak. 1996. J. Immunol. 156:4520,. Tadaf Y., A. Ho, T. Matsuyama, T. W. Mak. 1997. J. Exp. Med. 185 : 231) . Cada garra fue graduada y las cuatro marcas fueron agregadas, de manera que la marca máxima por ratón fue 12. El Índice de artritis fue calculado dividiendo la marca total de los ratones experimentales por el número total de ratones.

Resultados Se inmunizaron ratones con CII bovino y se observaron en cuanto el desarrollo de artritis. El día 11 después de la segunda inmunización el índice de artritis estaba significativamente reducido en ratones tratados con anticuerpo anti-CD28 (0.63 + 0.50) (P<0.01) versus el control (7.50 +0.66).

Ejemplo 20 Métodos Animales; Ratones Los ratones BALB/c hembra y los ratones C3H fueron obtenidos de Charles Ri er Japan Inc. (Yokohama, Japón) . Los animales todos fueron alojados en una instalación específica exenta de agentes patógenos en jaulas microaislantes con aire filtrado y libre acceso a la comida y al agua. Todos los ratones tenían una edad de 6-8 semanas cuando se iniciaron los experimentos .

Anticuerpos ; El CD28 (PVl-IgG3) anti-ratón silencioso tiene especificidad idéntica a la del clon PV-1 pero no tiene una fuerte actividad agonista in vitro (Fc->IgG3) . Se adquirió el CD154 anti-ratón (TRAP1, IgGl) de BD PharMingen (San Diego, CA) . Se adquirió CTLA4-Ig (CTLA-4/Fc Chimera) de Genzyme (Cambridge, MA) . Transplante de piel del rabo Se transplantaron injertos de piel de espesor completa (0.5 cm2) desde los rabos de ratones donadores (BALB/c: H-2d) en el tórax dorsal de los ratones receptores (C3H:H-2b) y se aseguraron con apósitos adhesivos durante 7 días. Entonces se controló diariamente la supervivencia de los injertos mediante inspección visual. Se definió como rechazo la pérdida de > 80% de tejido injertado epidérmico viable. Se efectuaron análisis estadísticos utilizando el ensayo Dunnett' s Múltiple Comparison. Se consideraron significativos valores de p< 0.05.

Protocolos de tratamiento; Se trataron los receptores de injertos de piel con . 50. 250 µg de CD28 anti-ratón silencioso, 250 g de CD154 anti-ratón y 100 µg de CTLA4-Ig administrados por vía intraperitoneal en el día del transplante (día 0) y en los días postoperatorios 3 y 6.

Resultados ; El bloqueo simultáneo de las vías co-estimulantes de células T CD40 y CD28 por administración de CD28 anti-ratón silencioso y CD154 anti-ratón efectivamente promueve la supervivencia de injertos de piel en ratones C3H. Los animales control rechazaron sus injertos después de 9 días. El anti-CD40L mAb solo prolongó modestamente la supervivencia del injerto (tiempo medio de supervivencia: 10 días), pero se vio un aumento drástico en la supervivencia cuando aquél fue combinado con CD28, extendiendo el tiempo medio de supervivencia (MST) hasta 33 dias. Esta estrategia es marcadamente menos eficaz que la administración de CTLA4-Ig y CD40L mAb anti-ratón, con un MST de 12 dias.

Ejemplo 21. Preparación de un fragmento Fab y F(ab')2 y del anticuerpo CD28 Preparación del fragmento Fab del anticuerpo anti- CD28. Se digirió el anticuerpo anti-humano CD28 (HuTN228) con ficina inmovilizada (Pierce, USA) . La ficina inmovilizada fue activada con amortiguador Tris-HCL 50mM pH 6.8 que contenia EDTA 5 mM y cisteina. HC1 11.5mM y cargada en una columna. Se agregó la solución de anticuerpo a la columna y se incubó a 37 °C durante 2 6 3 dias. Se lavó la columna con PBS y el digerido fue concentrado por ultrafiltración . El digerido concentrado fue aplicado a la columna de filtración por gel (TSKgel-3000SWX:l, Tosoh, Japón) y se recolectaron fracciones apropiadas y se concentraron por ultrafiltración . Se determinó la concentración de proteínas por absorbancia a 280 nm (Abs 280 = 1.4 para 1 mg/mL) y se confirmó el tamaño del fragmento mediante SDS-PAGE. Preparación del fragmento F(ab')2 del anticuerpo anti-CD28. Se preparó anticuerpo CD28 anti-humano por el mismo método que para el fragmento Fab, excepto la concentración de cisteina (1.15 mM) y el período de incubación (durante una noche) . Obviamente son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por ello se debe entender que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ser practicada de otra manera de lo que está específicamente descrito aquí. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí son incorporadas como referencia en su totalidad.

LISTA DE SECUENCIA <110> VASQUEZ, Maximiliano HINTON, Paul TAMURA, Kouichi HIGASHI , Yauyuki SE I , Nobuo UEDA, Hiroteugu TSO, J. Y n <120> ANTICUERPOS ANTI-CD28 SILENCIADOS Y El USO DE ÉSTOS <130> 200071USOPROV <150> US 60/255.155 <151> 2000-12-14 <160> 21 <11Q> Patentin versión 3.1 <210> 1 <211> 427 <212> DNA <213 híbrido <220> <221> CDS <222> (12) .. (404) <223> <400> tctagaccac c atg gag tca gac acn ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc Met Glu Ser Aep Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu 1 5 10 tgg gtt cea ggc tec act ggt gac att gtg ctc acc ca tct cea gct 98 Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Aep lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 15 20 25 tct ttg g t gtg tct ctg ggg cag aga gcc acc ate tec tgc aga gcc 146 Ser Leu Ala Val Ser Leu Oly Gln Arg Ala Thr lie Ser Cye Arg Ala 35 40 45 agt gaa agt gtt gaa tat tat gtc ac agt tta atg cag tgg tac caá 194 Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln 50 55 60 cag aaa cea gga cag c a ecc aaa ctc ctc ate tat gct gca tec aac 242 Gln Lya Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Aan 65 70 75 gta gat tct ggg gtc cct gcc agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg acá 290 Val Aep Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 80 85 90 6 cttaaaaatg aacactctgc aaactgatga cacagccata tattattgtg ccagagatcg 791 ggcgtatggt aactacctct atgccatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt 851 ctcctcaggt aagaatggcc tct aga 877 <210> 4 <211> 133 < 212> PRT <213 > híbrido <400> 4 Met Glu Ser Aap Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Aep lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr l ie Ser Cye Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser ??? Val Aep Ser 65 70 75 T0 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap Phe Ser 8S 90 95 Leu Aon lie His Pro Val Glu Glu Aep Aep lie Ala Met Tyr Phe CyB 100 105 110 Gln Gln Ser Arg Lye Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lye Leu 115 120 125 Glu lie Lys Arg Lya 130 <210> S <211> 6 <212> PRT < 213 > hitártelo <400> 5 <211> 877 <212> DNA <213> híbrido <220> <221> CDS <222> (12)..(431) <223> <400> 3 tctagaccac c atg gag tca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc 50 Met Gl Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu 1 5 10 tgg gtt cea ggc tec act ggt gac att gtg ctc acc ca tet cea gct 98 Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Aap lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 15 20 25 tet ttg gct gtg tet ctg ggg cag aga gee acc ate tec tgc aga gee 146 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly. Gln Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala 30 35 40 45 agt gaa agt gtt gaa tat tat gtc aca agt tta acg cag tgg tac caá 194 Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln 50 55 60 cag aaa cea gga cag cea ecc aaa ctc ctc ate tat gct gca tec aac 242 Gln Lye Pro Oly Gln Pro Pro Lye Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Aen 65 70 75 gta gat tet ggg gtc ect gee agg ttt agt ggc agt ggg tet ggg aca 290 Val Aep Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 80 85 90 gac ttc age ctc aac ate cat ect gtg gag gag gat gat att gca atg 338 Aep Phe Ser Leu Aen lie Hie Pro Val Glu Glu Asp Aop lie Ala Met 9S 100 105 tat ttc tgt cag caá agt agg aag gtt cea ttc acg ttc ggc teg ggg 386 Tyr Phe Cye Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 110 115 120 125 aca aag ttg gaa ata aaa cgt aag tag act ttt gct cta gat cta 431 Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Lys Thi- Phe Ala Leu Aep Leu 130 135 gaccaccatg gctgtcctgg tgctgttcct ctgcctggtt gcatttccaa gctgtgtcct 491 gtcccaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcgccctcac agagcctgtc 551 catcacttgc actgtctctg gattttcatt aaccagetat ggtgtacact gggttcgcca Gil gcctccagga aagggtctgg aatggctggg agtcatatgg cctggtggag gcacaaattt 671 taattcggct ctcatgtcca gactgagcat cagcgaagac aactccaaga gccaagtttt 731 gac ttc age etc aac ate cat ect gtg gag gag gat gat att gca atg 338 Asp Phe Ser Leu Aan lie Hia Pro Val Olu Glu Asp Asp lie Ala Met 9S 100 105 tat ttc tgt cag caa agt agg aag gtt cca ttc acg ttc ggc tcg ggg 3T6 Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 110 115 120 125 acá aag ttg gaa ata aaa cgtaagtaga cttttgctct aga 427 Thr Lys Leu Glu lie Lyo 130 <210> 2 <211> 131 <212> PFT <213> híbrido <400> 2 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp val Pro 1 S 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala, Thr lie Ser Cye Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lye Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Aan Val Aep Ser 65 70 75 BO Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser T5 90 95 Leu Aan lie His Pro Val Glu Glu Asp Asp lie Ala Met Tyr Phe Cys 100 105 110 Gln Gln Ser Arg Lye Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu lie Lys 130 <210> 3 Thr Phe Ala Leu Aap Leu 1 5 <210> 6 <211> 450 <212> DNA <213> híbrido 221> CDS 222> (12).. (431) 223> <400> 6 tctegaccac c atg gct gtc ctg gtg ctg ttc ctc tgc ctg gtt gca ttt 50 Met Ala Val Leu Val Leu Phe Leu Cya Leu Val Ala Phe 1 5 10 c a age tgt gtc ctg tec cag gtg cag ctg cag gag tea gga ect ggc 98 Pro Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly 15 20 25 ctg gtg aag ecc tea gag acc ctg tec ctc act tgc g t gtc tet gga 146 Leu Val Lye Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cye Ala Val Ser Qly 30 35 40 45 ttt tea tta acc age tat ggt gta cae tgg att cgc cag ect cea gga 194 Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly 50 55 60 aag ggt ctg gaa tgg ctg gga gtc ata tgg ect ggt gga ggc acá aat 242 Lye Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Pro Qly Gly Gly Thr Asn 65 70 75 ttt aat teg gct ctc atg tec aga ctg acc ate age gaa gac acc tec 290 Phe Aen Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr lie Ser Glu Asp Thr Ser 80 85 90 aag aac caá gtt tec tta aaa ttg age tet gtg acá gct gct gac acá 338 Lys Aen Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 95 1O0 105 gee gta tat tat tgt gee aga gat cgg gcg tat ggt aac tac ctc tat 3T6 Ala Val Ty*" 1Vr ^? Ala Ar9 AHP Ar9 Ala Tyr Qi A3n t?*" Leu Tvr 110 115 120 125 gcg atg gac tac tgg ggt caá gga acc tta gtc acc gtc tec tea 431 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 gg aagaatg geetetaga 450 <210> 7 <211> 140 <212> PRT <213» híbrido <400> 7 Met Ala val Leu Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys 1 S 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val LyB 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cye Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ser Tyr Gly Val His Tr lie Arg Gln Pro Pro Gly Lye Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly val He Trp Pro Gly Gly Gly Thr Aen Phe Aan Ser 65 70 75 80 Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr lie Ser Glu Asp Thr Ser Lys Aen Gln 85 90 95 val Ser Leu Lye Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cye Ala Arg Aep Arg Ala Tyr Gly Aen Tyr Leu Tyr Ala Met Aep 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 8 <211> 427 <212> OKA <213> híbrido <220> <221> CDS <222> (12) . <223> <400> 8 tctagaccac c atg gag tea gac acá etc ctg cta tgg gtg ctg ctg etc 50 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu 1 5 io tgg gtC cea ggc cc act ggt gac att cag atg acc caá tct cea tct 9B Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Aap He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 15 20 25 tct ctg tct gcg tct gtg ggg gac agg gtc acc ate aca tgc age ge 146 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Aep Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala 30 35 40 45 agt gaa agt gtt gaa tat tot gtc aca agt tta atg cag tgg cae caá 194 Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln 50 55 60 cag aaa cea gga aag gca ccc aaa etc etc ate tat gct gca tcc aac 242 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Aan 65 70 75 gta gat tct ggg gtc cct tcc agg ttt agt ggc agt ggg tct ggg aca 290 Val Aep Ser Qly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 80 T5 90 gac ttc acc etc acc ate tct tct ctg cag ceg gag gat att gca acg 338 Aep Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Aep lie Ala Thr 95 100 105 tat tac tgt cag caá agt agg aag gtt cea ttc acg ttc ggc ggg ggg 306 Tyr Tyr Cye Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Phe Thr Phe Gly Oly Qly 110 115 120 125 aca aag gtg gaa ata aaa cgtaagtaga cttttgctct aga 427 Thr Lye Val Glu lie Lya 130 <210> 9 <211> 131 <212> PRT <213> híbrido <400> 9 Met Glu Ser Aap Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Aep lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Oly Aep Arg Val Thr lie Thr Cyo Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Lye Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Val Asp Ser 65 70 75 T0 Qly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Thr 85 ¦ 90 95 Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Aep lie Ala Thr Tyr Tyr Cye 100 105 110 Gln Gln Ser Arg Lye val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Val 115 120 125 Glu lie Lys 130 <210> 10 <211> 445 <212> DNA <213> híbrido <220> <221> CDS <222> (21).. (419) <223> <400> 10 tctagacagt ggggaacaat atg gat tca cag atc cag gtc ctc atg tcc ctg 53 Met Asp Ser Qln lie Qln Val Leu Met Ser Leu 1 5 10 ctc ctc tgg atg tct ggt gcc tgt gga gat ett gtg atg acc cag tct 101 Leu Leu Trp Met Ser Gly Ala Cye Gly Asp lie Val Met Thr Gln Ser 15 20 25 cea tat tcc ctg gct gtg tca gca gga gag aag gtc acc atg agt tgc 149 Pro Tyr Ser Leu Ala Val Ser Ala Qly Glu Lye Val Thr Met Ser Cys 30 35 40 agg tcc agt cag age ctc tat tac agt gga atc aaa aag aac ctc ttg 197 Ar3 Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Ser Qly He Lys Lya Asn Leu Leu 45 50 55 gcc tgg tac cag cag aaa cea ggc cag tct c g aaa ctg ctg atc tac 245 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ly8 Leu Leu lie Tyr 60 65 70 75 ttt acá tct act cgg tta ect ggg gta ceg gat cgc ttc acá ggc agt 293 Phe Thr Ser Thr Arg Leu Pro Gly Val Pro Asp Arg phe Thr Qly Ser 80 85 90 gga tct ggg acá gat tac act ctc acc atc acc agt gtc cag gct gaa 341 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Thr Ser Val Gln Ala Glu 95 100 105 gac atg ggg cat tat ttc tgt cag cag ggt ata age act ccg ctc acg 389 Aep Met Gly Hia Tyr Phe Cye Gln Gln Gly lie Ser Thr Pro Leu Thr 110 115 120 ttc ggt gat ggc acc aag ctg gag ata aga cgtaagtaga at caaagtc 439 Phe Gly Aep Qly Thr Lya Leu Glu He Arg 125 130 tetaga 445 <210> 11 <=211> 133 «:212> PRT <213> híbrido <400> 11 Met Aop Ser Gln He Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Leu Trp Met Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cye Gly Asp He Val Met Thr Gln Ser Pro Tyr Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lye Val Thr Met Ser Cye Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Tyr Tyr Ser Qly He Lye Lye ?ß? Leu Leu Ala Trp Tyr Qln Gln 50 55 60 Lye Pro Gly Gln Ser Pro Lye Leu Leu He Tyr Phe Thr Ser Thr Arg 65 70 75 80 Leu Pro Gly Val Pro Aop Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap 85 90 95 Tyr Thr Leu Thr He Thr Ser Val Gln Ala Glu Aep Met Gly Hls Tyr 100 105 110 Phe Cyo Gln Gln Gly He Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Aep Gly Thr 115 120 125 Lye Leu Glu He Arg 130 <21D> 12 211> 167 <212> DNA <213> híbrido <220> <221> CDS 22> (16).. (444) <223> <400> 12 tctagagtct tcacc atg gta tgg ggc ttg ate ate atc ttc ctg gtc aca 51 Met Val Trp Gly Leu lie lie lie Phe Leu Val Thr 1 5 10 gca gct aca ggt gtc cae tec cag gtc cag ttg aag cag tet ggg gct 99 Ala Ala Thr Gly Val His Ser. Gln Val Gln Leu Lye Gln Ser Gly Ala 1S 20 25 gag ctt gtg aag cct gga gcc tea gtg aag ata tec tgc aaa act tca 147 Glu Leu Val Lye Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lyo Thr Ser 30 35 40 ggc tat acc ttc act gat ggc tac atg aac tgg gtt gag cag aag cct 195 Gly Tyr Thr Phe Thr Anp Gly Tyr Met Aen Trp Val Glu Gln Lye Pro 45 SO 55 60 ggg cag ggc ctt gag tgg att gga aga att gat cct gat agt ggt aat 243 Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg lie Aep Pro Asp Ser Gly Aen 65 70 75 act cgg tac aat cag aaa tt cag ggc aag gcc aca ctg act aga gac 291 Thr Arg Tyr Aen Gln Lyo Phe Gln Gly Lye Ale Thr Leu Thr Arg Asp T0 BS 90 aaa tec tec age aca gtc tac atg gac etc agg age ctg aca tet gag 339 Lyo Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu 95 100 105 gac tet gct gtc tat tac tgt gcg aga gat ggg acc tt tac ggt acc 387 Aop Ser Ala Val Tyr Tyr Cye Ala Arg Asp Gly Thr Phe Tyr Gly Thr 110 115 120 tac ggc tac tgg tac ttc gat ttc tgg ggc cag ggg acc cag gtc acc 435 Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Aep Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 125 130 135 140 gtc tec tca ggtgagtcct taaaa ctct aga 467 Val Ser Ser <210> 13 <211> 143 <212> P T <213> híbrido <400> 13 Met Val Trp Gly Leu He He He Phe Leu Val Thr Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Lya Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lye He Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Gly Tyr Met Aen Trp Val Glu Gln Lye Pro Qly Oln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp He Gly Arg He Aep Pro Aep Ser Gly Ann Thr Arg Tyr Aen 65 70 75 80 Gln Lya Phe Gln Gly Lya Ala Thr Leu Thr Arg Aap Lye Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Aep Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Aap Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cya Ala Arg Asp <31y Thr Phe Tyr Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp 115 120 125 Tyr Phe Aep Phe Trp Gly Oln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> ADN Sintético <400> 14 tatagagctc aagcttggat <210> 15 <211> 50 c212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223 ADN Sintético <400> 15 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc <210> 16 encia Artificial «223 > ADN Sintético <400> 16 tatagagctc aagcttccag tggatagaca gatgggggtg ttgttttggc <210> 17 <211> 50 •c212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> ADN Sintético <400> 17 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gttggggctg tcgttttggc <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> ADN Sintético <400 18 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc <210> 19 <211> 50 <212> DNA 213 > Secuencia Artificial <220> <223> ADN Sintético <40O> 19 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatgggggtg ttgttttggc <210> 20 <211> 50 <212a DNA <213> Secuencia Artificial 22Q> <223> ADN Sintético <40O> 20 tatagagctc aagcttceag tggatagtcc gatggggctg tcgttttggc <2io> 21 <211> 2< «;212> DNA < 213 > Secuencia Artificial <220> <223> ADN Sintético <400> 21 tatagagctc cacttccagt gccc

Claims (25)

1. RE VINDICACIONES 1. Anticuerpo anti-CD28 silenciado.
2. 2. Anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico.
3. 3. Anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado. 4. Anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una región variable que comprenden la secuencia de aminoácidos en SEC. IDEN NO: 2 o SEC. IDEN NO:
4. 4.
5. 5. Anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una región variable que comprenden la secuencia de aminoácidos en SEC. IDEN NO: 2 y SEC. DE IDENT. NO: 4.
6. 6. Anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos en SEC. IDEN NO: 6 y SEC. DE IDENT. NO: 8.
7. 7. Anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una región variables que comprende la secuencia de aminoácidos en SEC. IDEN NO: 6 y SEC. DE IDENT. NO: 8.
8. 8. Polinucleótido que codifica el anticuerpo en la reivindicación 1.
9. 9. Polinucleótido de la reivindicación 8 que comprende por lo menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEC. IDEN NO: 1, SEC. DE IDENT. NO: 2, SEC. IDEN NO: 3 y SEC. DE IDENT. NO: 4.
10. 10. Vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.
11. 11. Célula huésped comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.
12. 12. Célula huésped comprende el vector de expresión de la reivindicación 10.
13. 13. Método para producir un anticuerpo anti-CD28 silenciado que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 11, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y la recolección de un anticuerpo expresado a partir del cultivo.
14. 14. Método para producir un anticuerpo anti-CD28 silenciado que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 12, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y la recuperación de un anticuerpo expresado a partir del cultivo.
15. 15. Método para producir un anticuerpo anti-CD28 silenciado que comprende introducir un polinucleótido de la reivindicación 8, dentro de la célula huésped; cultivar la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo; y recuperar el anticuerpo expresado a partir del cultivo .
16. 16. Método de la reivindicación 15, en donde el polinucleótido comprende por lo menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEC. DE IDENT. 1, SEC. DE IDENT. NO: 2, SEC. DE IDENT. 3 y SEC. DE IDENT. NO: 4.
17. 17. Método para producir un anticuerpo anti-CD28 silenciado que comprende introducir un vector de expresión de la reivindicación 10, dentro de la célula huésped; cultivar la célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo; y recuperar el anticuerpo expresado a partir del cultivo .
18. 18. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-CD28 silenciado de la reivindicación ly un ingrediente f rmacéuticamente aceptable.
19. 19. Método para inducir tolerancia de las células T que comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo de la reivindicación 1, para inducir la tolerancia de las células T del paciente.
20. 20. Método de la reivindicación 19, en donde la administración además comprende administrar otro inmunosupresor .
21. 21. Método para proporcionar inmunosupresión en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva del anticuerpo de la reivindicación 1, para proporcionar inmunosupresión al paciente.
22. 22. Método de la reivindicación 21, en donde administrar además comprende administrar otro inmunosupresor.
23. 23. Método para tratar el rechazo de un trasplante de órgano o tejido en un paciente que comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo para tratar el rechazo de un trasplante de órgano o tejido en un paciente.
24. 24. Método de la reivindicación 23, en donde administra además comprende administrar otro inmunosupresor .
25. 25. Anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de HuTN228 y MuTN228 y fragmentos de Fab de los mismos, y fragmentos F(ab)'2 de los mismos.