KR20020002389A - Ｂ7 분자에 반응성인 인간화된 면역글로불린 및 이를사용한 치료 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 이외의 기원의 가변 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 각각 포함하는 인간화된 항-B7-2 및 항-B7-1 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간화된 항-B7-2 및/또는 항-B7-1 항체를 투여함으로써 다양한 자가면역 질병, 이식편 거부반응, 염증성 질환 및 감염성 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
발명의 배경
항원 특이적 T-세포 활성화 및 면역 반응의 개시는 초기에는 항원 제공 세포 (APC)에 존재하는 펩티드/주요 조직 적합성 복합체 (MHC)와 T-세포 수용체 (TCR) 복합체의 상호작용에 좌우된다. B7 분자, B7-1 및 B7-2는 APC에 존재하는 분자이다. APC 상의 B7-1과 B7-2와 T-세포 상의 이들의 리간드 CD28과 CTLA4의 상호작용에 의해 제공되는 "보조자극(co-stimulatory)" 신호는 T-세포 활성화 및 면역 반응의 후속 조절을 완결하는 데에 필요하다. B7:CD28/CTLA4 경로로서 일컬어지는 B7-1 및 B7-2 경로를 조절할 필요가 있다. 또한, 이러한 경로에 의해 영향을 받는 질병에 대한 치료법을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 B7 분자에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 이외의 기원 (예를 들어, 설치류)의 항원 결합 영역과 인간 기원 (예를 들어, IgG 불변 영역 및/또는 인간 골격 영역과 같은 인간 불변 영역)의 일부 이상을 포함하는, B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 포함한다. 한 가지 양태에 있어서, 인간화된 항-B7-2 또는 인간화된 항-B7-1 면역글로불린의 인간 불변 영역은 인간화된 면역글로불린의 이펙터 기능을 약화시키는 돌연변이를 또한 함유할 수 있다. 본원에 기술된 인간화된 B7-2 면역글로불린은 B7-2에 결합하는 데에 있어서 뮤린 3D1과 경쟁할 수 있다. 유사하게는, 본원에 기술된 인간화된 B7-1 면역글로불린은 B7-1에 결합하는 데에 있어서 뮤린 1F1과 경쟁할 수 있다. 특정한 양태에 있어서, 인간화된 B7-2 면역글로불린의 항원 결합 영역은 3D1 모노클로날 항체로부터 유래되고, 인간화된 B7-1 면역글로불린의 항원 결합 영역은 1F1 모노클로날 항체로부터 유래된다.
본 발명의 인간화된 면역글로불린은 인간 기원의 불변 영역과 항원 결합 영역을 포함할 수 있으며, 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역은 B7-2에 결합하는 설치류 기원 (예를 들어, 3D1 모노클로날 항체로부터 유래됨)의 하나 이상의 상보성 결합 영역 (CDR) 또는 B7-1에 결합하는 설치류 기원 (예를 들어, 1F1 모노클로날 항체로부터 유래됨)의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 인간 기원의 면역글로불린의 일부는 인간 골격 영역 (FR)으로부터 유래된다.
인간화된 B7-2 항체의 항원 결합 영역은 경쇄와 중쇄를 추가로 포함할 수 있으며, 경쇄와 중쇄는 각각 3D1 항체로부터 유래된 3개의 CDR을 포함한다. 인간화된 B7-2 항체에 대한 경쇄의 FR은 예를 들어, 인간 H2F 항체의 경쇄로부터 유래될 수 있고, 중쇄는 예를 들어, 인간 I2R 항체의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 한 가지 특정한 양태에 있어서, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (A.T.C.C.)에 수탁번호 CRL-12524로 수탁된 세포주로부터 유래된, B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린이다.
인간화된 B7-1 항체의 항원 결합 영역은 경쇄와 중쇄를 포함할 수 있으며, 경쇄와 중쇄는 각각 1F1 항체로부터 유래된 3개의 CDR을 지닌다. 인간화된 B7-1 경쇄와 중쇄의 FR은 예를 들어, 인간 III-2R 항체의 경쇄와 중쇄로부터 유래될 수 있다. 한 가지 특정한 양태에 있어서, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (A.T.C.C.)에 수탁번호 PTA-263으로 수탁된 세포주로부터 유래된, B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린이다.
본 발명은 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, B7-1 또는 B7-2에 대한 결합 친화성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 또한 구현한다. 한 가지 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린은 B7-2에 대한 결합 친화성을 지니고, 경쇄는 B7-2와 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR (예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 기원 (예를 들어, H2F 항체)의 경쇄로부터 유래된 FR을 포함하고; 중쇄는 B7-2와 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR (예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 기원 (예를 들어, 인간 I2R 항체)의 중쇄로부터 유래된 FR 영역을 포함한다. 또 다른 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린은 B7-1에 대한 결합 친화성을 지니고, 경쇄 및/또는 중쇄는 B7-1과 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR (예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 기원 (예를 들어, III-2R)의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 FR을 포함한다. 면역글로불린은 본원에 나타나 있는 아미노산 서열을 지닌 경쇄 또는 중쇄에 대한 CDR1, CDR2 및 CDR3을 추가로 포함하거나 항체가 B7-2 또는 B7-1에 특이적으로 결합하도록 상기 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 인간화된 면역글로불린 경쇄 및 인간화된 면역글로불린 중쇄에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 인간화된 면역글로불린 (예를 들어, 단일 사슬 항체)을 코드화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이고, 본 발명은 또한 B7-2 또는 B7-1 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코드화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 양태는 뮤린 3D1 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 인간 경쇄 FR (예를 들어, H2F 항체)을 포함하는, B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린 경쇄이다. 유사하게는, 본 발명은 뮤린 1F1 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 인간 경쇄 FR (예를 들어, III-2R 항체)을 포함하는, B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 B7-1 면역글로불린 경쇄를 또한 포함한다. 또 다른 양태는 도 2b (SEQ ID NO:8)에 도시된 가변 영역 또는 도 7b (SEQ ID NO:28)에 도시된 가변 영역을 포함하는 인간화된 B7-2 또는 B7-1 면역글로불린 경쇄이다. 본 발명은 또한 도 2b (SEQ ID NO:7) 또는 도 7b (SEQ ID NO:27)에 각각 도시된 핵산 서열, 도 2b (SEQ ID NO:8) 또는 도 7b (SEQ ID NO:28)에 각각 도시된 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열, 또는 상기 서열의 상보서열인 핵산 서열을 포함하는, B7-2 또는 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 가변 경쇄를 코드화하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 B7-2에 대해 특이적이고 3D1 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 인간 중쇄 FR (예를 들어, I2R 항체)을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄이다. 유사하게는, 본 발명은 또한 B7-1에 대해 특이적이고 1F1 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 인간 중쇄 FR (예를 들어, III-2R 항체)을 포함하는 B7-1 인간화된 면역글로불린 중쇄에 관한 것이다. 본 발명은 도 2a (SEQ ID NO:6) 또는 도 7a (SEQ ID NO:26)에 도시된 가변 영역을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄에 관한 것이다. 본 발명은 또한 도 2a (SEQ ID NO;5)에 도시된 핵산 서열, 도 2a (SEQ ID NO:6)에 도시된 아미노산 서열을 코드화하는 단리된 핵산 서열, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열, 또는 상기 서열의 상보서열인 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 도 7a (SEQ ID NO:25)에 도시된 핵산 서열, 도 7a (SEQ ID NO:26)에 도시된 아미노산 서열을 코드화하는 단리된 핵산 서열, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 상기 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열, 또는 상기 서열의 상보서열인 핵산 서열을 포함하는, B7-1에 대해 특이적인 인간화된 가변 중쇄를 코드화하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 양태는 B7-2에 특이적으로 결합하며 마우스 3D1 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR과 인간 면역글로불린 경쇄로부터의 경쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 인간화된 경쇄 및 마우스 3D1 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR과 인간 면역글로불린 중쇄로부터의 중쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린이다. 마우스 3D1 항체는 도 1b (SEQ ID NO:4)에 도시된 성숙한 경쇄 가변 도메인과 같은 성숙한 경쇄 가변 도메인 및 도 1a (SEQ ID NO: 2)에 도시된 성숙한 중쇄 가변 영역과 같은 성숙한 중쇄 가변 도메인을 추가로지닐 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 B7-1에 특이적으로 결합하며 마우스 1F1 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR과 인간 면역글로불린 경쇄로부터의 경쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 인간화된 경쇄 및 마우스 1F1 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR과 인간 면역글로불린 중쇄로부터의 중쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린이다. 유사하게는, 마우스 1F1 항체는 도 6b (SEQ ID NO:24)에 도시된 성숙한 경쇄 가변 도메인과 같은 성숙한 경쇄 가변 도메인 및 도 6a (SEQ ID NO:22)에 도시된 성숙한 중쇄 가변 영역과 같은 성숙한 중쇄 가변 도메인을 추가로 지닐 수 있다.
본 발명은 인간화된 B7-1 및/또는 B7-2 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코드화하는 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 상기 유전자는 B7-2 및/또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간 이외의 기원의 항체 (예를 들어, 각각 뮤린 3D1 또는 1F1 항체)의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 CDR과 인간 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 FR을 코드화하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 하나 이상의 작제물을 포함하는, 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 인간화된 B7-2 면역글로불린 경쇄를 코드화하는 제 1 B7-2 재조합 핵산과 인간화된 B7-2 면역글로불린 중쇄를 코드화하는 제 2 B7-2 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 제 1 B7-2 핵산은 뮤린 3D1 항체의 경쇄로부터 유래된 하나 이상의 CDR과 인간 기원의 경쇄로부터 유래된 FR을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 제 2 B7-2 핵산은 뮤린 3D1 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR과 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 FR을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 인간화된 B7-1 면역글로불린 경쇄를 코드화하는 제 B7-1 재조합 핵산과 인간화된 B7-1 면역글로불린 중쇄를 코드화하는 제 2 B7-1 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 제 1 B7-1 핵산은 뮤린 1F1 항체의 경쇄로부터 유래된 하나 이상의 CDR과 인간 기원의 경쇄로부터 유래된 FR을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 제 2 B7-1 핵산은 뮤린 1F1 항체의 중쇄로부터 유래된 하나 이상의 CDR과 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 FR을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 인간화된 B7-1 및/또는 B7-2 면역글로불린을 코드화하는 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 B7-2 또는 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 코드화하는 숙주 세포를 인간화된 면역글로불린을 발현시키기에 적합한 조건하에서 유지시켜서 (하나 이상의) 인간화된 면역글로불린 사슬을 발현시키고 인간화된 면역글로불린을 생성시키는 것을 포함하여, 인간화된 면역글로불린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 인간화된 B7-1 또는 B7-2 면역글로불린을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 제 2 세포를, 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 인간화된 B7-2 면역글로불린과 접촉시키는 것을 포하하여, B7-2 수용체를 함유하는 제 1 세포와 B7-2를 함유하는 제 2 세포의 상호작용을 억제시키는 방법을 포함한다. 본 발명은또한 제 2 세포를 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 인간화된 B7-1 면역글로불린과 접촉시키는 것을 포함하여, B7-1 수용체를 함유하는 제 1 세포와 B7-1을 함유하는 제 2 세포의 상호작용을 억제시키는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 B7-1과 B7-2 수용체를 지닌 세포를 일정량의 인간화된 항-B7-1과 B7-2 면역글로불린과 접촉시키는 것을 포함하여, B7-1과 B7-2 수용체 둘 모두와 B7-1과 B7-2 리간드의 결합을 억제시키는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 다양한 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 캐리어 (예를 들어, 약제학적 캐리어)의 존재 또는 부재하에서 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 인간화된 B7-1 및/또는 B7-2 면역글로불린을 투여하여 면역 반응을 조절하는 것을 포함하여, 개체 (예를 들어, 환자)의 면역 반응을 조절하는 방법, 또는 장기, 조직, 세포 등이 이식된 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 예를 들어 연장된 기간 (예를 들어, 수 일, 수 개월 또는 수 년) 동안 급성 및/또는 만성 이식편 거부반응을 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체 (예를 들어, 환자)에게 캐리어의 존재 또는 부재하에서 본원에 기술된 바와 같은 유효량 (예를 들어, 치료적 유효량)의 B7-2 및/또는 B7-1 인간화된 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하여, B7-2 및/또는 B7-1 분자의 조절과 관련된 질병 (예를 들어, 자가면역 질병, 감염성 질병, 염증성 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병, 천식, 췌도염, 관절염, 염증성 장 질환, 염증성 피부염 및 다발성 경화증)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 B7-1 및/또는 B7-2 인간화된 면역글로불린을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 B7-2에 대해 특이적인 뮤린 항체로부터의 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 제조하는 방법 및/또는 B7-1에 대해 특이적인 뮤린 항체로부터의 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 제조하는 방법을 또한 구현한다. 이러한 방법은 B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 친화성을 지닌 인간 이외의 기원 (예를 들어, 뮤린 기원)의 항체의 CDR을 결정하거나 확인하고; CDR을 이식시키기에 적합한 골격 영역 아미노산 서열을 지닌 인간 항체를 수득하고, 인간 이외의 기원의 항체의 CDR을 인간 항체의 FR내로 이식시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 샘플 중의 B7-2 및/또는 B7-1의 존재 유무를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 시험하려는 샘플을 수득하고, B7-2 및/또는 B7-1과 항-B7-2 및/또는 항-B7-1 항체 사이에 각각 복합체가 형성되기에 충분할 정도로 샘플을 B7-2 및/또는 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 항체 또는 이의 단편과 접촉시키고, 복합체 형성의 존재 유무를 검출하는 것을 포함한다. 복합체의 존재는 샘플 중에 B7-2 및/또는 B7-1이 존재함을 나타낸다.
본 발명은 일정량 (예를 들어, 치료적 유효량)의 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 및/또는 일정량 (예를 들어, 치료적 유효량)의 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하여 질병에 걸린 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 질병으로는 예를 들어, 자가면역 질병, 감염성 질병, 천식, 염증성 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병, 췌도염, 관절염, 염증성 장 질환, 염증성 피부염 및 다발성 경화증이 있다. 이 방법은 또한 유효량의 B7-1에 결합하는 인간화된 면역글로불린 및/또는 B7-2에 결합하는 인간화된 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하여 장기, 조직, 세포 등이 이식된 개체의 면역 반응을 조절하는 것에 관한 것이다. 이 방법은 또한 장기, 조직, 세포 등이 이식된 개체의 면역 반응을 조절하는 데에 사용되는 약물을 투여하는 것을 포함한다. 약물로는 예를 들어, 메토트렉세이트, 라파마이신, 시클로스포린, 스테로이드, 항-CD40 경로 억제제 (예를 들어, 항-CD40 항체, 항-CD40 리간드 항체 및 CD40 경로의 소분자 억제제), 이식편 재이용 경로 억제제 (예를 들어, 미코페놀레이트 모페틸 (MMF)), IL-2 수용체 길항체 (예를 들어, Zeonpax(Hoffmann-la Roche Inc.) 및 시뮬렛(Simulet; Novartis, Inc.)) 및 이들의 유사체가 있을 수 있다. 이러한 약물은 인간화된 면역글로불린의 투여 전, 투여 도중 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 공여자로부터 세포 (예를 들어, 골수 또는 혈액 세포 또는 성분)를 수득하고, 세포를 B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린 및/또는 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린 및 수용 세포와 접촉시켜 혼합물을 수득하는 것을 포함하여, 세포 (예를 들어, 골수, 혈액 세포, 혈액 성분 및 기타 세포)를 이를 필요로 하는 개체에게 이식하는 방법에 관한 것이다. 면역글로불린 및 수용 세포는 내성을 유도시키기에 충분한 시간 동안 유지된다. 그 후, 혼합물 (골수 조성물 또는 혈액 세포 조성물로서 일컬어짐)이 개체내로 삽입된다. 수용 세포는 림프구 (예를 들어, 클래스 1 항원 (MHCI)을 발현시키는 림프구 또는 말초혈 림프구 (PBL))일 수 있다. 수용 세포를 사용하는 대신, 본 발명의 방법은 또한 MHC 클래스 I 항원, B7-1 및/또는 B7-2 분자를 발현시키는 조직, 장기 또는 세포를 이용하는 것을 포함한다. 세포는 수용 분자를 발현하도록 공학처리될 수 있다. 공여자로부터의 세포는 골수 세포이거나 혈액으로부터의 세포/성분 (예를 들어, 간세포(stem cell) 또는 미성숙 세포)일 수 있다. B7 면역글로불린은 내성을 유도시키기에 충분히 긴 시간 (예를 들어, 약 1 내지 96 시간, 바람직하게는 약 36 내지 48시간) 동안 공여자 골수 및 수용 세포와 접촉한다. 이러한 이식편을 필요로 하는 개체는 골수 이식이 이롭거나 이에 의해 치료될 수 있는 질병에 걸린 개체이다. 이러한 질병은 예를 들어 증식성 질병 (예를 들어, 백혈병, 림프종 및 암), 빈혈 (예를 들어, 겸상적혈구 빈혈, 탈라세미아 및 재생불량성 빈혈), 선천성 대사이상증, 선천성 면역결핍 질병, 및 골수 이형성 증후군 (MDS) 이다. 이러한 방법은 또한 면역 반응을 조절하는 데에 사용되는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트; 라파마이신; 시클로스포린; 스테로이드; 항-CD40 항체, 항-CD40 리간드 항체 및 CD40 경로의 소분자 억제제와 같은 항-CD40 경로 억제제; 미코페놀레이트 모페틸 (MMF)과 같은 이식편 재이용 경로 억제제, Zeonpax(Hoffmann-la Roche Inc.) 및 시뮬렛 (Novartis, Inc.)과 같은 IL-2 수용체 길항제; 또는 이들의 유사체)을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명은 공여자로부터 골수를 수득하고, 골수를 B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린 및/또는 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린 및 수용 세포 (예를 들어, 림프구)와 접촉시키는 것을 포함하여, 골수 이식편으로 치료되는 질병 (예를 들어, 백혈구, 림프종, 암과 같은 증식성 질병; 겸상적혈구 빈혈, 탈라세미아 및 재생불량성 빈혈과 같은 빈혈; 선천성 면역결핍 질병; 및 골수 이형성 증후군)에 걸린 개체에 이식하는 방법을 포함한다. 골수, 면역글로불린(들) 및 수용 세포는내성을 유도시키기에 충분한 시간 (예를 들어, 약 1 내지 96시간, 바람직하게는 약 36 내지 48시간) 동안 접촉한다. 그 후, 이러한 방법을 처리된 골수를 개체에게 재삽입시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 개체에게 면역 반응을 조절하는 데에 사용되는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트; 라파마이신; 시클로스포린; 스테로이드; 항-CD40 항체, 항-CD40 리간드 항체 및 CD40 경로의 소분자 억제제와 같은 항-CD40 경로 억제제; 미코페놀레이트 모페틸(MMF)와 같은 이식편 재이용 경로 억제제, Zeonpax(Hoffmann-la Roche Inc.) 및 시뮬렛 (Novartis, Inc.); 또는 이들의 유사체)을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 수용자에게 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린 및/또는 유효량의 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린을 투여함으로써 이식편 수용자를 치료하거나 이식편 수용자의 이식편 거부반응을 예방하는 방법을 포함한다. B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린은 약 1㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏의 양으로 투여되고, B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린은 약 1㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏의 양으로 투여된다. B7-1 및 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린은 수용자가 이식받은 당일에 투여될 수 있고 (예를 들어, 약 1㎎/㎏ 내지 약 25㎎/㎏의 양으로), 수용자가 이식받은 후에 주기적으로 (예를 들어, 매일, 매주 또는 매월) 또한 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 1㎎/㎏ 내지 약 5㎎/㎏의 양으로). 이러한 방법은 이식편 거부반응 치료에 사용되는 조성물, 예를 들어 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 시클로스포린 A 또는 FK506), 스테로이드 (예를 들어, 메틸 프레드니손 또는 프레드니손), 또는 면역 세포의 성장을 정지시키는 면역억제제 (예를 들어, 라파마이신), 항-CD40 경로억제제 (예를 들어, 항-CD40 항체, 항-CD40 리간드 항체 및 CD40 경로의 소분자 억제제), 이식편 재이용 경로 억제제 (예를 들어,미코페놀레이트 모페틸 (MMF)), IL-2 수용체 길항제 (예를 들어, Zeonpax(Hoffmann-la Roche Inc.) 및 시뮬렛 (Novartis, Inc.) 또는 이들의 유사체를 투여하는 것을 또한 포함한다. 또한, 본 발명은 세포, 조직 또는 장기를 이식하고; 상기 기술된 바와 같이, 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린과 유효량의 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린을 개체에게 투여함으로써, 세포, 조직 또는 장기를 이를 필요로 하는 개체에게 이식하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체에게 항원의 존재하에서 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 및/또는 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 투여함으로써 포유동물에게서 항원에 대한 항체 반응을 감소시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 또한 항원 (예를 들어, 파상풍 독소, 인자 VIII, 인자 IX, 인슐린, 성장 호르몬 또는 유전자 전달 벡터)을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 항원은 폴리펩티드 형태 또는 핵산 형태로 투여될 수 있다 (예를 들어, 아데노수반 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 네이키드(naked) DNA 벡터 등을 통한 전달을 이용하는 유전자 치료법).
본 발명의 잇점으로는 B7 보조자극 경로를 조절할 수 있는 능력이 있다. 인간화된 항-B7-2 및/또는 항-B7-1 항체를 이용한 이러한 보조자극 경로의 조작은 다양한 질병에 대한 치료 방법을 제공한다. 인간화된 항-B7-2 및 항-B7-1 항체는 상응하는 뮤린 항체와 거의 동일한 각각의 B7 분자에 대한 특이성을 유지하지만, 뮤린 대응물과 비교하여 인간에게서 감소된 면역원성과 증가된 반감기를 지닌다. 따라서, 본 발명은 면역 관련된 질병/질환, 또는 B7-2 및/또는 B7-1 분자가 중요한 역할을 하는 질병을 치료하는 데에 유리하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 자가면역 질병을 치료하는 방법 및 장기, 조직 또는 세포가 이식된 개체의 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 전술한 양태와 그 밖의 양태, 특징 및 잇점은 첨부된 도면을 참조로 하여 하기 본 발명의 바람직한 양태의 더욱 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 뮤린 3D1 항체의 중쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:1 및 2)의 서열 목록으로서, CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)의 아미노산 서열은 밑줄그어져 있고, 성숙한 중쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 1b는 뮤린 3D1 항체의 경쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:3 및 4)의 서열 목록으로서, CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)의 핵산 및 아미노산 서열은 밑줄그어져 있고, 성숙한 경쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 2a는 인간화된 3D1 항체의 중쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:5 및 6)의 서열 목록으로서, CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)의 핵산 및 아미노산 서열은 밑줄그어져 있고, 성숙한 중쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 2b는 인간화된 3D1 항체의 경쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:7 및 8)의 서열 목록으로서, CDR1, CDR2 및 CDR3의 핵산 및 아미노산 서열이다. 이러한 CDR은 밑줄그어져 있고, 성숙한 경쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 3은 경쟁 결합 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 이 그래프는 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-2 mAb 대 표면에서 rhB7-2 (CHO/hB7-2)를 발현하는 CHO 세포의 경쟁 결합 검정의 결과를 도시한다. 표지되지 않은 경쟁 항체를 농도를 증가시키면서 방사성표지된 트레이서 뮤린 항-인간 B7-2 mAb의 존재하에서 CHO/hB7-2와 인큐베이션시키고, 결합/유리 항체의 비를 결정하였다.
도 4는 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-2 mAb 대 CHO/hB7-2 세포의 직접적 결합 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 방사성표지된 항체를 농도를 증가시키면서 CHO 또는 CHO/hB7-2 세포와 인큐베이션시키고, CHO/hB7-2 세포에 결합된 특정 항체의 양을 결정하였다.
도 5는 T 세포 증식 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-2 mAb를 농도를 증가시키면서 PMA과 CHO/hB7-2 세포로 자극시킨 CD28+인간 T 세포에 첨가하고, 이러한 mAb에 의한 T 세포 증식의 억제를 결정하였다.
도 6a는 뮤린 1F1 항체의 중쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:21 및 22)의 서열 목록으로서, CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)의 아미노산 서열은밑줄그어져 있고, 성숙한 중쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 6b는 뮤린 1F1 항체의 경쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:23 및 24)의 서열 목록으로서, CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)의 핵산 및 아미노산 서열은 밑줄그어져 있고, 성숙한 경쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 7a는 인간화된 1F1 항체 (hu1F1)의 중쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:25 및 26)의 서열 목록으로서, CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)의 핵산 및 아미노산 서열은 밑줄그어져 있고, 성숙한 중쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 7b는 인간화된 1F1 (hu1F1) 항체의 경쇄 가변 영역 핵산 및 아미노산 서열 (각각 SEQ ID NO:27 및 28)의 서열 목록으로서, CDR1, CDR2 및 CDR3의 핵산 및 아미노산 서열이다. 이러한 CDR은 밑줄그어져 있고, 성숙한 경쇄의 첫 번째 아미노산은 두 번 밑줄그어져 있다.
도 8은 경쟁 결합 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 이 그래프는 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-1 mAb 대 rhB7-1 (CHO/hB7-1)로 트랜스펙션된 CHO의 경쟁 결합 검정의 결과를 도시한다. 표지되지 않은 경쟁 항체를 농도를 증가시키면서 방사성표지된 트레이서 인간화된 1F1의 존재하에서 CHO/hB7-1와 인큐베이션시키고, 결합/유리 항체의 비를 결정하였다.
도 9a는 마우스 1F1 항체 대 rhB7-1로 트랜스펙션된 CHO 세포의 결합의 스캐챠드 분석을 도시하는 그래프이다. 방사성표지된 마우스 1F1 항체를 rhB7-1로 트랜스펙션된 CHO 세포와 인큐베이션시키고, 결합/유리 방사능의 비를 결정하였다.
도 9b는 인간화된 1F1 항체 대 rhB7-1로 트랜스펙션된 CHO 세포의 결합의 스캐챠드 분석을 도시하는 그래프이다. 방사성표지된 인간화된 1F1 항체를 rhB7-1로 트랜스펙션된 CHO 세포와 인큐베이션시키고, 결합/유리 방사능의 비를 결정하였다.
도 10은 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-1 mAb 대 표면에서 rhB7-1를 발현하는 CHO (CHO/hB7-1)의 경쟁 결합 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 표지되지 않은 경쟁 항체를 농도를 증가시키면서 방사성표지된 트레이서 뮤린 항-인간 B7-1 mAb의 존재하에서 CHO/hB7-1과 인큐베이션시키고, 결합/유리 항체의 비를 결정하였다.
도 11은 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-1 mAb 대 CHO/hB7-1 세포의 직접 결합 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 방사성표지된 항체를 농도를 증가시키면서 CHO 또는 CHO/hB7-1 세포와 인큐베이션시키고, CHO/hB7-1 세포에 결합된 특정 항체의 양을 결정하였다.
도 12는 T 세포 증식 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-1 mAb를 농도를 증가시키면서 PMA와 CHO/hB7-1로 자극시킨 CD28+인간 T 세포에 첨가하고, 이러한 mAb에 의한 T 세포 증식의 억제를 결정하였다.
도 13은 원 웨이 (one way) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 고정된 농도의 뮤린 또는 인간화된 항-인간 B7-2 (IgG2.M3 이소타입) 또는 인간 CTLA4Ig를 인간 반응제와 자극제 PBL의 혼합물에 첨가하고, 반응제 PBL의 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 결정하였다.
도 14는 반응제로서의 1차 MLR로부터의 PBL 및 자극제로서의 1차 MLR에서와 동일하거나 상이한 개체로부터의 PBL을 사용하는 원 웨이 2차 MLR 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 인간화된 항-인간 B7-1 mAb를 1차 MLR에만 첨가하였다. 2차 MLR에서의 반응제 PBL의 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 결정하였다.
도 15는 반응제로서의 1차 MLR로부터의 PBL 및 자극제로서의 1차 MLR에서와 동일하거나 상이한 개체로부터의 PBL을 사용하는 원 웨이 2차 MLR 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 인간화된 항-인간 B7-2 mAb (IgG2.M3 이소타입)를 1차 MLR에만 첨가하였다. 2차 MLR에서의 반응제 PBL의 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 결정하였다.
도 16은 반응제로서의 1차 MLR로부터의 PBL 및 자극제로서의 1차 MLR에서와 동일하거나 상이한 개체로부터의 PBL을 사용하는 원 웨이 2차 MLR 검정의 결과를 도시하는 그래프이다. 인간화된 항-인간 B7-1 및 B7-2 mAb (IgG2.M3 이소타입)를 1차 MLR에만 첨가하였다. 2차 MLR에서의 반응제 PBL의 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 결정하였다.
도 17은 반응제로서의 PBL 및 조사된(irradiated) "B" PBL 자극제를 사용하는 원 웨이 1차 MRL 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프이다. 반응제 및 자극제를 인간화된 항-B7-2 항체, 인간화된 항-B7-1 mAb, 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 mAb, 10㎍/㎖ CTLA4Ig, 20㎍/㎖ CTLA4Ig 또는 대조 Ig로 처리하였다. 배양물 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 측정하였다.
도 18은 반응제로서의 PBL 및 조사된 "C" PBL 자극제를 사용하는 원 웨이 1차 MRL 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프이다. 반응제 및 자극제를 인간화된 항-B7-2 항체, 인간화된 항-B7-1 mAb, 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 mAb, 10㎍/㎖ CTLA4Ig, 20㎍/㎖ CTLA4Ig 또는 대조 Ig로 처리하였다. 배양물 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 측정하였다.
도 19는 "B" 자극제 1차 MLR로부터의 반응제 (도 17 참조) 및 신선한 "B" 자극제를 사용한 원 웨이 2차 MRL 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프이다. 반응제 및 자극제를 단지 1차 MLR에서의 인간화된 항-B7-2 mAb, 인간화된 항-B7-1 mAb, 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 mAb, 10㎍/㎖ CTLA4Ig, 20㎍/㎖ CTLA4Ig 또는 대조 Ig로 처리하였다. 2차 MLR에 첨가물을 첨가하지 않았다. 배양물 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일 및 5일째에 측정하였다.
도 20은 "B" 자극제 1차 MLR로부터의 반응제 (도 17 참조) 및 신선한 "C" 자극제를 사용한 원 웨이 2차 MRL 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프이다. 반응제 및 자극제를 단지 1차 MLR에서의 인간화된 항-B7-2 mAb, 인간화된 항-B7-1 mAb, 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 mAb, 10㎍/㎖ CTLA4Ig, 20㎍/㎖ CTLA4Ig 또는 대조 Ig로 처리하였다. 2차 MLR에 첨가물을 첨가하지 않았다. 배양물 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일, 5일 및 6일째에 측정하였다.
도 21은 "B" 자극제 1차 MLR로부터의 반응제 (도 17 참조) 및 신선한 "B" 또는 "C" 자극제를 사용한 원 웨이 2차 MRL 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프이다. 반응제 및 자극제를 단지 1차 MLR에서의 인간화된 항-B7-2 mAb, 인간화된 항-B7-1 mAb, 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 mAb, 10㎍/㎖ CTLA4Ig, 20㎍/㎖ CTLA4Ig 또는 대조 Ig로 처리하였다. 2차 MLR에 첨가물을 첨가하지 않았다. 배양물 증식을 방사성표지된 티미딘을 첨가함으로써 3일, 4일, 5일 및 6일째에 측정하였다. 도 21은 도 19와 20을 편집한 도면이다.
도 22는 파상풍 독소로 면역된 인간 이외의 영장류의 항-파상풍 반응 (로그 역가)을 도시하는 그래프이다. 사이노몰구스 원숭이를 정제된 파상풍 독소로 면역시키고, 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 항체로 처리하였다. 혈청 항-파상풍 항체 역가 (IgM & IgG)를 26주에 걸쳐서 매주 측정하였다.
도 23은 파상풍 독소로 면역된 인간 이외의 영장류의 항-파상풍 반응 (로그 역가)을 도시하는 그래프이다. 사이노몰구스 원숭이를 0일째에 파상풍 독소로 면역시키고, 0일째에 1회 IV 용량의 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 항체 또는 비히클로 처리하였다. 14주째에, 동물을 추가의 인간화된 항-B7-1 또는 인간화된 항-B7-2 항체 처리없이 파상풍 독소로 2회째 면역시켰다. 혈청 항-파상풍 항체 역가 (IgM & IgG)를 18주에 걸쳐서 매주 측정하였다.
도 24는 파상풍 독소로 면역된 인간 이외의 영장류의 항-파상풍 반응 (로그 역가)을 도시하는 그래프이다. 사이노몰구스 원숭이를 0일째에 파상풍 독소로 면역시키고, 0일째에 1회 IV 용량의 인간화된 항-B7-1 항체 단독 또는 비히클로 처리하였다. 14주째에, 동물을 추가의 인간화된 항-B7-1 항체 처리없이 파상풍 독소로 2회째 면역시켰다. 혈청 항-파상풍 항체 역가 (IgM & IgG)를 18주에 걸쳐서 매주 측정하였다.
도 25는 파상풍 독소로 면역된 인간 이외의 영장류의 항-파상풍 반응 (로그 역가)을 도시하는 그래프이다. 사이노몰구스 원숭이를 0일째에 파상풍 독소로 면역시키고, 0일째에 1회 IV 용량의 인간화된 항-B7-2 항체 또는 비히클로 처리하였다. 14주째에, 동물을 추가의 인간화된 항-B7-2 항체 처리없이 파상풍 독소로 2회째 면역시켰다. 혈청 항-파상풍 항체 역가 (IgM & IgG)를 18주에 걸쳐서 매주 측정하였다.
도 26은 각각의 처리군 (군 지정: 군 1: 비히클 대조표준; 군 2 내지 4: 10, 1 또는 0.1 ㎎/㎏의 h1F1 단독; 군 5 내지 7: 10, 1 또는 0.1 ㎎/㎏의 h3D1 단독; 군 8 내지 11: 10, 1, 0.1 또는 0.01 ㎎/㎏의 조합된 h1F1과 h3D1)에 대한 항-파상풍 항체 역가 곡선 (로그 역가) 아래의 면적을 도시하는 막대 그래프이다. 사이노몰구스 원숭이를 0일째에 파상풍 독소로 면역시키고, 1회 IV 용량의 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 항체, 인간화된 항-B7-1 항체 또는 인간화된 항-B7-2 항체 단독, 또는 비히클로 처리하였다 (군 당 n=3). 곡선 아래의 면적 (AUC) 값을 0주에서 14주까지 계산하였다. 파상풍 역가 곡선의 AUC를 계산하기 전에 모든 파상풍 역가를 0의 기선에 정규화시켰다. 이러한 AUC 값을 검출가능한 항체 역가를 생성시키는 각각의 군 중의 동물의 수의 분율에 의해 칭량하여, 각각의 군 중의 반응성 동물의 수를 밝혀내었다.
도 27은 10 ㎎/㎏의 I.V. 용량을 투여한 후에 다양한 시점에서 항-B7-1 및 항-B7-2 (IgG2.M3 이소타입) mAb를 도시하는 그래프이다.
도 28은 신장 타가이식을 받은 붉은털 원숭이의 약 1년에 걸친 생존율을 도시하는 그래프이다. 이 원숭이를 조합된 인간화된 항-B7-1과 인간화된 항-B7-2 항체, 인간화된 항-B7-1 항체 또는 인간화된 항-B7-2 항체 단독, 또는 비히클로 처리하였다. 인간화된 항체를 20 ㎎/㎏의 초기 용량으로 투여한 후, 5 ㎎/㎏으로 투여하고, 그 후, 60일 내지 80일 동안 5 ㎎/㎏의 용량으로 매주 투여하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 포함하는, B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린에 관한 것이다. 바람직하게는, 인간화된 면역글로불린은 약 107M-1이상, 바람직하게는 108M-1이상, 더욱 바람직하게는 약 107M-1이상의 친화도를 지니면서 B7-2 또는 B7-1과 결합할 수 있다. 한 가지 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린은 B7-2 또는 B7-1과 결합하는 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 불변 영역으로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 인간 불변 영역은 골격 영역 (FR)에 인간 이외의 기원의 잔기를 지닐 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, B7-2 또는 B7-1과 결합하는 인간화된 면역글로불린은 (하나 이상의) 인간 이외의 기원의 상보성 결정 영역과 (하나 이상의) 인간 기원의 가변 골격 영역, 및 임의로, 인간 기원의 불변 영역을 포함한다. 임의로, 면역글로불린의 FR 영역은 인간 이외의 기원의잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서, 경쇄는 B7-2와 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역과 인간 기원의 경쇄로부터 유래된 골격 영역을 포함하고, 중쇄는 B7-2와 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역과 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 골격 영역을 포함한다. 또 다른 예에 있어서, 인간화된 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서, 경쇄는 B7-1과 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역과 인간 기원의 경쇄로부터 유래된 골격 영역을 포함하고, 중쇄는 B7-1과 결합하는 인간 이외의 깅원의 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역과 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 골격 영역을 포함한다. 또한, 본 발명은, 개별적 형태 또는 기능적으로 조합된 형태로, 경쇄, 중쇄, 가변 영역, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 구현한다.
본 발명은 인간화된 항체가 생성되는 뮤린 B7-2 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 지니지만 영장류 (예를 들어, 인간)에서 감소된 면역원성을 지니는 인간화된 B7-2 항체에 관한 것이다. 유사하게는, 본 발명은 또한 인간화된 항체가 생성되는 뮤린 B7-1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 지니지만 영장류 (예를 들어, 인간)에서 감소된 면역원성을 지니는 인간화된 B7-1 항체에 관한 것이다. 인간화된 B7-2 또는 B7-1 항체는 뮤린 대응물 보다 낮거나, 실질적으로 이와 동일하거나 이보다 높은 결합 친화도를 지닐 수 있다. (참조: 도 3, 4, 8, 9a 및 9b)
천연 면역글로불린은 두 개의 동일한 경쇄 (약 24kD)와 두 개의 동일한 중쇄 (약 55 또는 70kD)가 사량체를 형성하는 공통적인 코어 구조를 지닌다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 "항원 결합" 영역으로서 또한 일컬어지는 가변 (V) 영역으로서 알려져 있고, 각각의 사슬의 나머지의 더욱 보존되는 불변 (C) 영역과 구별될 수 있다. 경쇄의 가변 영역내에는 J 영역으로 알려진 C-말단 부분이 있다. 중쇄의 가변 영역내에는 J 영역 이외에 D 영역이 있다. 면역글로불린의 대부분의 아미노산 서열 변화는 항원 결합에 직접 관여하는 과가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 알려진 V 영역에 있는 3개의 별도의 위치에 한정된다. 가변 영역은 항원에 결합하는 항체의 일부이다. 불변 영역은 식세포, 태반세포, 비만세포 등의 세포 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 능력과 같은 다양한 기능을 가능하게 해준다. 경쇄 및 중쇄는 각각 가변 영역과 불변 영역을 지닌다. 따라서, 본 발명은 B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린에 관한 것이다. 인간화된 B7-1 또는 B7-2 면역글로불린은 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄가 사량체를 형성하도록 경쇄와 중쇄를 포함한다.
가변 영역은 또한 두 가지 타입의 영역, 즉, 골격 영역 (FR)과 상보성 결정 영역 (CDR)을 구성한다. CDR은 면역글로불린 강의 대부분의 아미노산 서열 변화를 함유하는 과가변 영역이다. 아미노-말단으로부터 출발하여, 이러한 영역은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3로 표시된다 (참조: 도 1a 내지 1b, 2a 내지 2b, 6a 내지 6b 및 7a 내지 7b). CDR은 더욱 보존되는 FR에 의해 연결되어 있다. 아미노-말단으로부터 출발하여, 이러한 영역은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 표시된다. CDR과 FR 영역의 위치 및 번호매김 시스템은 카바트(Kabat) 등에 의해 규정되었다 (Kabat, E.A.et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991); Kabat, E.A.Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, Second Edition, Holt, Rinehart and Winston, New York (1976); Kabat, E.A.Sequences of Immunoglobulin Chains:Tabulation and Analysis of Amino Acid Sequences of Precursors, V-regions, C-regions, J-Chain and β2-Microglobulins, U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service, (1979); Kabat, E.A.Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, Holt, Rinehart and Winston, New York (1968); Kabat, E.A.Experimental Immunochemistry, Second Edition, Springfield, Thomas (1967)). 면역글로불린을 인간화시키는 공정 동안, 인간 이외의 종으로부터의 B7-2 또는 B7-1에 대한 특이성을 지닌 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 인간 항체의 FR내로 이식된다. 또한, 특정한 인간 이외의 기원의 골격 치환체가 본원에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 생성된 인간화된 항체는 마우스와 같은 인간 이외의 종으로부터의 CDR과 인간 항체로부터의 FR을 지님으로써, 인간화된 항체는 B7-1 또는 B7-2에 대한 항원 특이성과 친화성을 유지한다.
본 발명은 또한 B7-1 또는 B7-2 인간화된 면역글로불린 경쇄, 또는 B7-1 또는 B7-2 인간화된 면역글로불린 중쇄에 관한 것이다. 한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 인간 이외의 기원의 하나 이상의 경쇄 CDR (예를 들어, CDR1 (SEQ ID NO:16), CDR2 (SEQ ID NO:18) 및/또는 CDR3 (SEQ ID NO:20))과 인간 경쇄 골격 영역을 포함하는 인간화된 B7-2 경쇄에 관한 것이다 (도 2b 참조). 또 다른 양태에있어서, 본 발명은 또한 인간 이외의 기원의 하나 이상의 중쇄 CDR (예를 들어, CDR1 (SEQ ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:12) 및/또는 CDR3 (SEQ ID NO:14))과 인간 중쇄 골격 영역을 포함하는 인간화된 B7-2 면역글로불린 중쇄에 관한 것이다 (도 2a 참조). CDR은 B7-2에 대해 특이적인 3D1 항체의 뮤린 중쇄 (예를 들어, SEQ ID NO:1, 도 1a) 및 경쇄 (예를 들어, SEQ ID NO:3, 도 1b) 가변 영역과 같은 인간 이외의 기원의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 인간 이외의 기원의 하나 이상의 경쇄 CDR (예를 들어, CDR1 (SEQ ID NO:36), CDR2 (SEQ ID NO:38) 및/또는 CDR3 (SEQ ID NO:40))과 인간 경쇄 골격 영역을 포함하는 인간화된 B7-1 경쇄에 관한 것이다 (도 7b 참조). 본 발명은 또한 인간 이외의 기원의 하나 이상의 중쇄 CDR (예를 들어, CDR1 (SEQ ID NO:30), CDR2 (SEQ ID NO:32) 및/또는 CDR3 (SEQ ID NO:34))과 인간 중쇄 골격 영역을 포함하는 B7-1 인간화된 면역글로불린 중쇄에 관한 것이다. CDR은 B7-1에 대해 특이적인 1F1 항체의 뮤린 중쇄 (예를 들어, SEQ ID NO:21, 도 6a) 및 경쇄 (예를 들어, SEQ ID NO:23, 도 6b) 가변 영역과 같은 인간 이외의 기원의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 또한 1998년 5월 5일에 A.T.C.C. 제 CRL-12524호로 A.T.C.C. (10801 University Boulevard, Manassas, VA 02110-2209, USA)에 수탁된 세포주에 의해 발현된 항-B7-2 항체에 관한 것이다. A.T.C.C.에 수탁된 인간화된 항-B7-2 항체를 발현시키는 세포주는 IgG2.M3 이소타입의 인간화된 항-인간 B7-2 (CD86) 모노클로날 항체 (#HF2-3D1)을 발현시키는 재조합 CHO 세포주 (PA-CHO-DUKX-1538)로서 표시된다.
본 발명은 또한 1999년 6월 22일에 A.T.C.C. 제 PTA-263호로 A.T.C.C. (10801 University Boulevard, Manassas, VA 02110-2209, USA)에 수탁된 세포주에 의해 발현된 항-B7-1 항체에 관한 것이다. A.T.C.C.에 수탁된 인간화된 항-B7-1 항체를 발현시키는 세포주는 인간화된 항-인간 B7-1 (CD80) 모노클로날 항체 (#1F1)을 발현시키는 재조합 CHO 세포주 (PA-CHO-DUKX-1538)로서 표시된다.
인간 면역글로불린은 중쇄의 이소타입에 의존하여 클래스 및 서브클래스로 나뉘어질 수 있다. 클래스로는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE가 있으며, 여기서, 중쇄는 각각 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 타입을 지닌다. 서브클래스로는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2가 있으며, 여기서, 중쇄는 각각 γ1, γ2, γ3, γ4, α1 및 α2 타입을 지닌다. 선택된 클래스 또는 서브클래스의 인간 면역글로불린 분자는 카파(κ) 또는 람다(λ) 경쇄를 함유할 수 있다. (참조:Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W.B. Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A.,Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
"HF2.3D1" 및 "3D1"이란 용어는 B7-2에 대해 특이적인 뮤린 면역글로불린을 의미한다. "인간화된 HF2.3D1", "인간화된 3D1", "hu3D1", "h3D1", "B7-2 인간화된 면역글로불린" 또는 "인간화된 B7-2 면역글로불린"이란 용어는 인간 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 의미한다 (예를 들어, 마우스 항-인간 B7-2항체). "1F1" 또는 "마우스 1F1"이란 용어는 B7-1에 대해 특이적인 뮤린 면역글로불린을 의미한다. "인간화된 1F1", "hu1F1", "h1F1", "B7-1 인간화된 면역글로불린" 또는 "인간화된 B7-1 면역글로불린"이란 용어는 인간 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 의미한다 (예를 들어, 마우스 항-인간 B7-1 항체). "B7 분자"란 용어는 B7-1 및 B7-2 분자를 의미한다. "B7 항체"란 용어는 항-인간 B7-1 및 항-인간 B7-2 항체를 의미한다.
"면역글로불린" 또는 "항체"란 용어는 전체 항체 및 이의 생물학적으로 기능적인 단편을 포함한다. 이러한 생물학적으로 기능적인 단편은 적어도 상응하는 전장 항체의 항원 결합 기능을 보유하고, 바람직하게는, B7-2 또는 B7-1과 하나 이상의 이의 수용체 (예를 들어, CD28, CTLA4)의 상호작용을 억제할 수 있는 능력을 보유한다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 생물학적으로 기능적인 단편은 보조자극 경로의 조작을 위해 B7-2 및/또는 B7-1의 결합을 억제시킬 수 있다. 사용될 수 있는 생물학적으로 기능적인 항체의 예로는 B7-2 또는 B7-1에 결합할 수 있는 단편, 예를 들어 단일 사슬 항체, 즉, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2가 있다. 이러한 단편은 효소 절단 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 파파인 또는 펩신 절단을 사용하여 각각 Fab 또는 F(ab')2단편을 생성시킬 수 있다. 또한, 항체는 하나 이상의 정지 코돈이 천연 정지 부위의 업스트림에 삽입된 항체 유전자를 사용하여 다수의 트렁케이팅(truncating)된 형태로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2단편의 중쇄를 코드화하는 키메라 유전자는 중쇄의 CH1도메인과 힌지영역을 코드화하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 본 발명은 중쇄와 경쇄 두 부분을 모두 함유하는 단일 사슬 항체 (예를 들어, 단일 사슬 FV)를 포함한다.
본원에 사용된 "인간화된 면역글로불린"이란 용어는 상이한 기원의 면역글로불린의 부분을 포함하는 면역글로불린으로서, 하나 이상의 부분이 인간 기원이 면역글로불린을 의미한다. 예를 들어, 인간화된 항체는 마우스와 같은 필수적인 특이성을 지닌 인간 이외의 기원의 면역글로불린 및 인간 기원의 면역글로불린 서열로부터 유래된 부분을 포함할 수 있다 (예를 들어, 키메라 면역글로불린). 이러한 부분은 통상적인 기법 (예를 들어, 합성 기법)에 의해 화학적으로 함께 결합될 수 있거나, 유전 공학 기법을 사용하여 연속 폴리펩티드로서 제조될 수 있다 (예를 들어, 키메라 항체의 단백질 부분을 코드화하는 DNA를 발현시켜 연속 폴리펩티드 사슬을 생성시킬 수 있다). 본 발명의 인간화된 면역글로불린의 또 다른 예는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 CDR과 인간 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 골격 영역을 포함하는 하나 이상의 면역글로불린 사슬을 함유하는 면역글로불린이다 (예를 들어, 골격 변화가 있거나 없는 CDR 이식된 항체). 키메라 또는 CDR 이식된 단일 사슬 항체는 또한 인간화된 면역글로불린이란 용어에 포함된다. (참고 문헌: Cabillyet al., U.S. Patent No. 4,816,567; Cabillyet al., European Patent No. 0,125,023 B1; Bosset al., U.S. Patent No. 4,816,397; Bosset al., European Patent No. 0,120,694 B1; Neuberger, M.S.et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S.et al., European Patent No. 0,194,276 B1; Winter, U.S. PatentNo. 5,225,539; Winter, European Patent No. 0,194,276 B1; Padlan, E.A.et al., European Patent Application No. 0,519,596 A1) (단일 사슬 항체에 관한 참고 문헌: Ladneret al., U.S. Patent No. 4,946,778; Huston, U.S. Patent No. 5,476,786; 및 Bird, R.E.et al., Scienece, 242:423-426 (1998)).
본 발명의 예시된 항체에서 구현된 바와 같이, "인간화된 면역글로불린"이란 용어는 또한 인간 골격, 인간 이외의 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하며, 존재하는 임의의 불변 영역은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일한,예를 들어 약 60 내지 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 동일한 면역글로불린을 의미한다. 그러므로, 아마도 CDR을 제외한 인간화된 면역글로불린의 모든 부분은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 몇몇 경우, 인간 이외의 기원의 항체로부터의 CDR 이외의 인간화된 면역글로불린은 인간 골격 영역 중에 인간 이외의 기원의 잔기를 포함할 것이다.
인간화된 면역글로불린의 설계는 다음과 같이 수행될 수 있다. 아미노산이 하기 카테고리에 속하는 경우, 사용하려는 인간 면역글로불린 (억셉터 면역글로불린)의 골격 아미노산은 CDR을 제공하는 인간 이외의 기원의 면역글로불린 (공여자 면역글로불린)으로부터의 골격 아미노산으로 치환된다:
(a) 억셉터 글로불린의 인간 골격 영역 중의 아미노산이 이 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 드문 반면, 공여자 면역글로불린 중의 상응하는 아미노산이 이 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 전형적인 경우;
(b) 아미노산의 위치가 CDR 중의 하나에 바로 인접해 있는 경우; 또는
(c) 아미노산이 3차 구조 면역글로불린 모델에서 CDR과 상호작용할 수 있는 경우 (참조: Queenet al., op. cit., 및 Coet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)).
인간화된 면역글로불린의 제조에 관한 상세한 설명에 대해서는, 문헌 [Queen et al., op. cit. 및 Co et al, op. cit. 및 U.S. Patents 5,585,089; 5,693,762, 5,693,761 및 5,530,101]을 참조하라.
일반적으로, 인간화된 항체 중의 CDR 영역은 이들이 유래되는 마우스 항체 중의 상응하는 CDR 영역과 실질적으로 동일하고, 더욱 일반적으로는 이와 동일하다. 일반적으로 바람직한 것은 아니지만, 때때로 생성된 인간화된 면역글로불린의 결합 친화성에 현저한 영향을 미치지 않으면서 CDR 잔기의 하나 이상의 보존성 아미노산을 치환할 수 있다. 종종, CDR 영역의 치환은 결합 친화성을 향상시켜줄 수 있다.
상기 논의된 특정 아미노산 치환의 경우 이외에, 인간화된 면역글로불린의 골격 영역은 이들이 유래되는 인간 항체의 골격 영역과 일반적으로는 실질적으로 동일하고, 더욱 일반적으로는 이와 동일하다. 물론, 골격 영역 중의 많은 아미노산은 항체의 특이성 또는 친화성에 직접적인 기여를 거의 하지 않거나 전혀 하지 않는다. 따라서, 골격 잔기의 많은 개별적 보존성 치환은 생성된 인간화된 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 현저한 변화없이 허용될 수 있다.
인간화된 B7-2 면역글로불린의 항원 결합 영역 (인간 이외의 기원의 부분)은 B7-2 (예를 들어, 3D1 항체) 또는 B7-1 (예를 들어, 1F1 항체)에 대한 특이성을 지닌 공여자 면역글로불린으로서 일컬어지는 인간 이외의 기원의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 B7-2 항체에 대한 적합한 항원 결합 영역은 뮤린 항-인간 B7-2 항체인 HF2.3D1 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다 (참고문헌: 발명의 명칭이 "B7-2:CTLA4/CD 28 Counter Receptor"인, 1993년 7월 26일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/101,624호, 1993년 8월 19일에 출원된 제 08/109,393호 및 1993년 11월 3일에 출원 제 08/147,773호; 또한 1995년 2월 2일에 공개된 프리만(Freeman) 등의 WO 95/03408, "B7-2:CTLA4/CD 28 Counter Receptor"). 인간화된 B7-1 항체에 대한 적합한 항원 결합 영역은 뮤린 항-인간 B7-1 항체인 뮤린 1F1 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. 그 밖의 공급원으로는 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트), 토끼, 돼지, 염소 또는 인간 이외의 영장류 (예를 들어, 원숭이) 또는 낙타과 동물 (예를 들어, 낙타 및 라마)과 같은 인간 이외의 공급원으로부터 수득되는 B7-2 또는 B7-1 특이적 항체가 있다.
또한, 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1 항체와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항체와 같은 그 밖의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 제조될 수 있다 (참조: Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975); Harlow et al., 1998, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, NY): 및 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11 (1991)). 예를 들어, 항체는 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 낙타과 동물과 같은 적합한 포유동물에서 적합한 면역원에 대해 유도될 수 있다. B7-2 또는 B7-1을 함유하는 세포, B7-2 또는 B7-1의 B7-2 또는 B7-1 면역원 분획을 함유하는 막 분획, 및 적합한 캐리어에 컨쥬게이션된 B7-2 또는 B7-1 펩티드가 적합한 면역원의 예이다 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 면역원). 항체 생성 세포 (예를 들어, 림프구)는 예를 들어 면역된 동물의 림프절 또는 비장으로부터 단리될 수 있다. 그 후, 세포는 적합한 무한증식 세포 (예를 들어, 골수종 세포주)에 융합되어, 하이브리도마를 형성할 수 있다. 융합 세포는 선택 배양 기법을 사용하여 단리할 수 있다. 원하는 특이성을 지닌 항체를 생성시키는 세포는 ELISA와 같은 적합한 검정에 의해 선택될 수 있다. B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간 이외의 깅원의 면역글로불린은 인간 이외의 기원의 Fab 분자를 포함하는 파지 라이브러리와 같은 항체 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 인간화된 면역글로불린은 그 밖의 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
한 가지 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린의 항원 결합 영역은 인간 이외의 기원의 CDR을 포함한다. 이러한 양태에 있어서, B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린은 하나 이상의 인간 이외의 기원의 CDR을 포함한다. 예를 들어, CDR은 인간 이외의 기원의 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로부터 유래되어, 인간화된 B7-2 면역글로불린은 실질적으로 하나 이상의 인간 이외의 기원의 면역글로불린으로부터의 중쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:10), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:12) 및/또는 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:14) 아미노산 서열, 및/또는 경쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:16), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:18) 및/또는 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:20) 아미노산 서열을 포함하고, 생성된 인간화된 면역글로불린은 B7-2에 대한 결합 특이성을 지닐 수 있다. CDR은 B7-1에 대해 특이적인 인간 이외의 기원의 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로부터 또한 유래될 수 있다. 인간화된 B7-1 항체는 실질적으로 하나 이상의 인간 이외의 기원의 면역글로불린으로부터의 중쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:30), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:32) 및/또는 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:34) 아미노산 서열, 및/또는 경쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:36), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:38) 및/또는 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:40) 아미노산 서열을 포함하고, 생성된 인간화된 면역글로불린은 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닐 수 있다. 선택된 사슬의 모든 3개의 CDR은 공여자의 상응하는 사슬의 CDR과 실질적으로 동일할 수 있고, 바람직하게는, 경쇄 및 중쇄의 모든 3개의 CDR은 상응하는 공여자 사슬의 CDR과 실질적으로 동일하다. B7-2 중쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:9), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:11) 및 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:13) 및/또는 B7-2 경쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:15), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:17) 및 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:19)의 핵산 서열은 CDR을 인간 골격내로 이식하는 데에 또한 사용될 수 있다. 또한, B7-1 중쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:29), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:31) 및 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:33) 및/또는 B7-1 경쇄 CDR1 (예를 들어, SEQ ID NO:35), CDR2 (예를 들어, SEQ ID NO:37) 및/또는 CDR3 (예를 들어, SEQ ID NO:39)의 핵산 서열은 CDR을 인간 골격내로 이식하는 데에 또한 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 중쇄와 경쇄를 포함하는, B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린에 관한 것이다. 경쇄는 B7-2 또는 B7-1과 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 CDR과 인간 기원의 경쇄로부터 유래된 FR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄는 항체가 B7-2에 특이적으로 결합하도록 하기 나타난 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지니는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함할 수 있다: CDR1 KSSQSLLNSRTRENYLA (SEQ ID NO:16), CDR2 WASTRES (SEQ ID NO:18) 및 CDR3 TQSYNLYT (SEQ ID NO:20). 중쇄는 B7-2와 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 CDR과 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 FR을 포함할 수 있다. 예를 들어, B7-2 중쇄는 항체가 B7-2에 특이적으로 결합하도록 하기 나타난 아미노산 서열 또는 이외 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지니는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함할 수 있다: CDR1 DYAIQ (SEQ ID NO:10), CDR2 VINIYYDNTNYNQKFKG (SEQ ID NO:12), CDR3 AAWYMDY (SEQ ID NO:14).
B7-1에 대해 특이적인 경쇄는 항체가 B7-1에 특이적으로 결합하도록 하기 나타난 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지니는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함할 수 있다: CDR1 SVSSSISSSNLH (SEQ ID NO:30), CDR2 GTSNLAS (SEQ ID NO:32) 및 CDR3 QQWSSYPLT (SEQ ID NO:34). 중쇄는 B7-1과 결합하는 인간 이외의 기원의 항체로부터 유래된 CDR과 인간 기원의 중쇄로부터 유래된 FR을 포함할 수 있다. B7-1에 대해 특이적인 중쇄는 항체가 B7-1에 특이적으로 결합하도록 하기 나타난 아미노산 서열 또는 이와 동일한 아미노산 서열을 지니는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함할 수 있다: CDR1 DYYMH (SEQ ID NO:36), CDR2WIDPENGNTLYDPKFQG (SEQ ID NO:38) 및 CDR3 EGLFFAY (SEQ ID NO:40).
본 발명의 한 가지 양태는 B7-2에 특이적으로 결합하고 마우스 3D1 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR과 인간 면역글로불린 경쇄로부터의 경쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 인간화된 경쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린이다. 본 발명은 또한 마우스 3D1 항체로부터의3개의 중쇄 CDR과 인간 면역글로불린 중쇄로부터의 중쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 B7-2 인간화된 중쇄를 포함한다. 마우스 3D1 항체는 도 1b에 도시된 성숙한 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO;4)과 도 1a에 도시된 성숙한 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:2)를 추가로 지닐 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 B7-1에 특이적으로 결합하고 뮤린 1F1 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR과 인간 면역글로불린 경쇄로부터의 경쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 인간화된 경쇄를 포함하는 인간화된 면역글로불린이다. 본 발명은 또한 마우스 1F1 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR과 인간 면역글로불린 중쇄로부터의 중쇄 가변 영역 골격 서열을 포함하는 B7-1 인간화된 중쇄를 포함한다. 마우스 1F1 항체는 도 6b에 도시된 성숙한 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:24)과 도 6a에 도시된 성숙한 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO;22)를 지닐 수 있다.
인간 기원을 지니는 인간화된 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬의 부분 (인간 부분)은 임의의 적합한 인간 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 불변 영역 또는 이의 일부는, 존재하는 경우, 대립형질 변이체를 포함하여, 인간 항체의 κ 또는 λ 경쇄, 및/또는 γ (예를 들어, γ1,γ2,γ3,γ4), μ, α (예를 들어, α1,α2), δ 또는 ε 중쇄로부터 유래될수 있다. IgG2 또는 IgG4와 같은 특정 불변 영역, 이의 변이체 또는 일부는 이펙터 기능에 맞도록 선택될 수 있다. 예를 들어, "변이체"로도 일컬어지는 돌연변이된 불변 영역은 Fc 수용체에 결합하는 것을 최소화시키고/거나 상보체를 고정시킬 수 있는 능력을 최소화시키도록 융합 단백질에 혼입될 수 있다 (참조: Winter et al., U.S. Patent No. 5,648,260 및 5,624,821; GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994). 또한, 천연 Fc 영역과 비교하여 분열촉진 반응을 약화시키는 돌연변이된 IgG2 Fc 도메인이 생성될 수 있다 (참조: Tso et al., U.S. Patent No. 5,834,597; 이 특허는 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음). 인간화된 항-B7-2 항체에 대해 수행되는 돌연변이에 관해서는 실시예 3을 참조하고, 인간화된 항-B7-1 항체에 대해 수행되는 돌연변이에 관해서는 실시예 10을 참조하라.
존재하는 경우, 인간 FR은 바람직하게는 항원 결합 영역 공여자의 유사 영역 또는 동등한 영역에 대해 서열 유사성을 지닌 인간 항체 가변 영역으로부 유래된다. 인간화된 면역글로불린의 인간 기원의 부분에 대한 FR의 그 밖의 공급원으로는 인간 가변 컨센서스 서열이 있다 (참조: Kettleborough, C.A. et al.,Protein Engineering 4:773-783 (1991); Queen et al., U.S. patent Nos: 5,585,089, 5,693,762 및 5,693,761). 예를 들어, 인간 이외의 기원의 부분을 수득하기 위해 사용된 항체 또는 가변 영역의 서열은 카바트, 이.에이. (Kabat, E.A.) 등의 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office(1991)]에 기술된 인간 서열과 비교될 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린 사슬의 FR은 인간 이외의 공여자의 가변 영역 (예를 들어, 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1 항체)과 약 60% 이상의 전체 서열 동일성, 및 바람직하게는 약 80% 이상의 전체 서열 동일성을 지닌 인간 가변 영역으로부터 유래된다. 예를 들어, 마우스 HF2.3D1과 인간 H2F 경쇄 가변 골격 영역 사이의 전체 서열 동일성은 82.5% 이고, 마우스 HF2.3D1과 인간 I2R 중쇄 가변 골격 영역 사이의 전체 서열 동일성은 62.5% 이다. B7-1 항체의 경우, 뮤린 1F1과 인간화된 III-2R 경쇄 가변 골격 영역 사이의 전체 서열 동일성은 69% 이고, 뮤린 III-2R 중쇄 가변 골격 영역 사이의 전체 서열 동일성은 79% 이다.
두 개의 핵산 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 인간화된 면역글로불린을 코드화하는 DNA 또는 인간화된 면역글로불린의 아미노산 서열)와 관련된 "실질적으로 동일한"이란 문구는 하기 서열 비교 방법 및/또는 육안 검사에 의해 측정하여, 최대 대응을 위해 비교되고 정렬되는 경우, 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 90 내지 95% 이상의 누클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 지니는 두 개 이상의 서열 또는 서브시퀀스(subsequence)를 의미한다. 이러한 "실질적으로 동일한" 서열은 전형적으로 상동인 것으로 간주된다. 바람직하게는, "실질적 동일성"은 약 50개 이상의 잔기 길이인 서열의 영역, 더욱 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기의 영역에 걸쳐 존재하고, 가장 바람직하게는 서열이 약 150개 이상의 잔기 또는 비교하려는 두 서열의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일함을 의미한다. 하기 기술된 바와 같이, 임의의 두 개의 항체 서열은 카바트의 번호매김 방식을 사용하여 한 가지 방식으로만 정렬될 수 있다. 따라서, 항체의 경우, 동일성 비율은 특유하고 잘 정의된 의미를 지닌다.
면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터의 아미노산은 각각 Hx 및 Lx로 표시되고, 여기서, x는 카바트의 방식,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 및 1991)에 따른 아미노산의 위치를 나타내는 숫자이다. 카바트는 각각의 하위군(subgroup)에 대해 항체에 대한 다수의 아미노산 서열을 나열해주고, 이러한 하위군에서의 각가의 잔기 위치에 대해 가장 보편적으로 나타나는 아미노산을 나열해준다. 카바트는 나열된 서열에서 각각의 아미노산에 대해 잔기 번호를 할당하는 방법을 사용한다. 카바트의 방식은 당해 항체를 카바트 중의 컨센서스 서열의 하나와 정렬시킴으로써 요약에 포함되지 않은 그 밖의 항체에까지 확장될 수 있다. 카바트 번호매김 시스템을 사용하면 상이한 항체내의 동등한 위치에 있는 아미노산이 용이하게 확인된다. 예를 들어, 인간 항체의 L50 위치에 있는 아미노산은 마우스 항체의 아미노산 위치 L50에 대해 동등한 위치를 점유하고 있다.
기본적 항체 구조 유닛은 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25kDa)과 하나의 "중쇄" (약 50 내지 70kDa)를 지닌다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 두 개의 결합 부위를 지닌다.
경쇄는 카파 또는 람파로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 항체의 이소타입을 규정한다. 경쇄 및 중쇄내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되어 있고, 중쇄는 또한 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. (참조: Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 3rd ed. Raven Press, N.Y., 1993, Ch. 9)
N-말단에서 C-말단쪽으로, 경쇄와 중쇄 가변 영역은 둘 모두 골격과 (CDR)을 번갈아 포함한다 (FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4). 각각의 영역에 대한 아미노산의 할당은 상기 카바트 (1987 및 1991) 및/또는 초티아(Chothia) & 레스크(Lesk)의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
한 가지 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린은 인간 기원의 항체의 하나 이상의 사슬로부터 유래된 FR 중 하나 이상을 포함한다. 따라서, FR은 인간 기원의 하나 이상의 항체로부터 유래된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 선택된 인간화된 사슬의 인간 부분은 인간 기원 (예를 들어, 인간 면역글로불린 사슬, 인간 컨센서스 서열로부터 유래됨)의 가변 영역으로부터 유래된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4를 포함한다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, B7-2 경쇄 가변 영역에 대한 FR은 H2F 인간 항체로부터 유래되고, B7-2 중쇄 가변 영역에 대한 FR은 I2R 인간 항체로부터 유래된다. B7-1 중쇄 및 경쇄 가변 영역에대한 FR은 III-2R 항체로부터 유래된다.
본 발명에 사용되는 인간 이외의 기원 및 인간 기원의 면역글로불린 부분은 이들이 유래되는 면역글로불린 또는 면역글로불린 부분과 동일한 서열, 또는 이들의 변이체를 지닌다. 이러한 변이체로는 하나 이상의 잔기의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 달라지는 돌연변이체가 있다. 상기 언급된 바와 같이, 인간 이외의 기원을 지닌 CDR은 인간 이외의 공여자와 실질적으로 동일하고, 바람직하게는 인간 이외의 공여자의 CDR과 동일하다. 본원에 기술된 바와 같이, 인간 기원의 FR의 하나의 잔기를 공여자의 상응하는 위치로부터의 잔기로 치환시키는 변화와 같은 FR에서의 변화가 이루어질 수 있다. 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 및 치환을 포함하는 FR에서의 하나 이상의 돌연변이가 이루어질 수 있다. 몇몇 이러한 치환은 실시예 2에서는 인간화된 HF2.3D1 항체의 설계에서 및 실시예 9에서는 인간화된 1F1에 대해 설명되어 있다. 선택된 인간화된 항체 또는 사슬에 대해, 골격 돌연변이가 본원에 기술된 바와 같이 설계될 수 있다. 바람직하게는, B7-2 및 B7-1 인간화된 면역글로불린은, 인간 이외의 공여자의 친화도와 유사하거나 이보다 우수한 친화도를 지니면서, B7-2 및 B7-1과 각각 결합할 수 있다. 변이체는 인간 이외의 공여자 또는 억셉터 인간 사슬의 돌연변이유발을 포함하는 다수의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 인간화된 면역글로불린은 인간 B7-2 또는 B7-1에 대해 결합 특이성을 지니며, B7-2 또는 B7-1의 결정기와 결합할 수 있는 인간화된 면역글로불린 (단편을 포함함)을 포함한다. 한 가지 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 인간화된 면역글로불린은 결합 기능 (예를 들어, B7-2 또는 B7-1에 대한 특이성, 동일하거나 유사한 에피토프 특이성을 지님) 및/또는 억제 기능 (예를 들어, CD28 또는 CTLA4를 함유하는 세포가 B7-2 또는 B7-1 리간드에 결합하는 것을 억제시킬 수 있는 능력)과 같은 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 지닌다. 따라서, 바람직한 인간화된 면역글로불린은 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1 항체의 결합 특이성, 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1 항체의 에피토프 특이성 (예를 들어, B7-2 또는 B7-1에 결합하는 데에 있어서 각각 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1, 키메라 HF2.3D1 또는 1F1 항체, 또는 인간화된 HF2.3D1 또는 1F1와 경쟁할 수 있음)을 지닐 수 있다.
B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린의 결합 기능은 예를 들어, 인간화된 면역글로불린과 B7-2 또는 B7-1 (예를 들어, B7-2 또는 B7-1을 포함하는 막 분획, 또는 B7-2 또는 B7-1을 발현시키는 핵산을 포함하는 인간 림프구 세포주 또는 재조합 숙주 세포) 사이의 복합체의 형성을 모니터링하는 검정을 사용하여 표준 면역학적 방법에 의해 검출될 수 있다.
결합 및/또는 유착 검정 또는 그 밖의 적합한 방법이 또한 필요한 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 (라이브러리로부터) 확인하고/하거나 단리하는 과정에 사용될 수 있다 (예를 들어, B7-2 또는 B7-1 수용체를 함유하는 세포와 B7 분자 사이의 유착을 모니터링하는 검정, 또는 그 밖의 적합한 방법).
본 발명에 사용되는 인간 이외의 기원 및 인간 기원의 면역글로불린 부분은 경쇄, 중쇄 및 경쇄와 중쇄의 일부를 포함한다. 이러한 면역글로불린 부분은 면역글로불린으로부터 수득되거나 유래될 수 있거나 (예를 들어, 부분의 새로운 합성에의해), 원하는 특성 (예를 들어, B7-2 또는 B7-1과 결합하는 특성, 서열 유사성)을 지닌 면역글로불린 또는 이의 사슬을 코드화하는 핵산이 제조되고 발현될 수 있다. 인간 기원 및 인간 이외의 기원의 원하는 부분 (예를 들어, 항원 결합 영역, CDR, FR, C 영역)을 포함하는 인간화된 면역글로불린은 원하는 인간화된 사슬을 코드화하는 유전자 (예를 들어, DNA)를 제조하기 위한 합성 및/또는 재조합 핵산을 사용하여 생성될 수 있다. 사슬의 일부를 제조하기 위해, 하나 이상의 정지 코돈이 원하는 위치에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 새롭게 설계된 인간화된 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 기존의 DNA 서열을 변화시키는 PCR 돌연변이유발 방법을 사용하여 작제될 수 있다 (참조: Kamman, M.,et al.,Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)). 새로운 CDR을 코딩하는 PCR 프라이머는 동일하거나 매우 유사한 인간 가변 영역을 기초로 하는 미리 인간화시킨 가변 영역의 DNA 주형에 하이브리드화될 수 있다 (Sato, K.,et al.,Cancer Research53:851-856 (1993)). 유사한 DNA 서열이 주형으로서 사용될 수 없는 경우, 가변 영역 서열을 코드화하는 서열을 포함하는 핵산이 합성 올리고누클레오티드로부터 작제될 수있다 (참조: Kolbinger, F.,Protein Engineering8:971-980 (1993)). 신호 펩티드를 코드화하는 서열은 또한 핵산내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 합성시에, 벡터내로 삽입시에). 천연 신호 펩티드 서열을 이용할 수 없는 경우, 또 다른 항체로부터의 신호 펩티드 서열이 사용될 수 있다 (참조: Kettleborough, C.A.,Protein Engineering 4:773-783 (1991)). 이러한 방법, 본원에 기술된 방법 또는 그 밖의 적합한 방법을 사용하여, 변이체를 용이하게 생성시킬 수 있다. 한 가지 양태에 있어서, 클로닝된 가변영역은 돌연변이유발될 수 있고, 원하는 특이성을 지닌 변이체를 코드화하는 서열이 선택될 수 있다 (예를 들어, 파지 라이브러리로부터; 참조: Krebber et al., U.S. 5,514,548; Hoogengoom et al., WO 93/06213, published April 1, 1993).
핵산 및 이를 포함하는 작제물:
본 발명은 또한 본 발명의 인간화된 B7-1 또는 B7-2 면역글로불린, 또는 인간화된 B7-1 또는 B7-2 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코드화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 및/또는 재조합 핵산 (예를 들어, 본질적으로 순수한 핵산을 포함함)에 관한 것이다.
본원에 "단리된 (isolated)"으로서 일컬어지는 핵산은 이들의 기원의 게놈 DNA 또는 세포 RNA의 핵산 (예를 들어, 세포내에 존재하거나 라이브러리와 같은 핵산의 혼합물의 형태로 존재함)으로부터 분리된 핵산으로서, 본질적으로 순수한 핵산을 포함하는 본원에 기술된 방법 또는 그 밖의 적합한 방법에 의해 수득된 핵산, 화학적 방법, 생물학적 방법과 화학적 방법이 조합된 방법에 의해 수득된 핵산, 및 단리된 재조합 핵산을 포함한다 (참조: Daugherty, B.L.et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. 및 J.S. Crowe,Gene, 101: 297-302 (1991)).
본원에 "재조합"으로서 일컬어지는 핵산은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및/또는 제한 효소를 사용한 벡터 (예를 들어, 플라스미드)내로의 클로닝과 같은 인공 재조합 방법에 의존하는 과정에 의해 생성된 핵산을 포함하는, 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 핵산이다. "재조합" 핵산은 세포의 천연 메카니즘을 통해 발생하는재조합 사건으로부터 생성된 핵산이지만, 원하는 재조합 사건을 일으킬 수 있도록 설계된 핵산을 세포에 도입시킨 후에 선택된다.
본 발명은 또한 더욱 상세하게는 각각 "인간화된 3D1" 또는 "인간화된 1F1"으로도 일컬어지는 인간화된 HF2.3D1 또는 1F1 면역글로불린 (예를 들어, 인간 이외의 기원의 부분이 뮤린 HF2.3D1 또는 1F1 모노클로날 항체로부터 유래되는 본 발명의 인간화된 면역글로불린) 또는 이의 사슬을 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다. 한 가지 양태에 있어서, 경쇄는 HF2.3D1 또는 1F1 항체의 경쇄로부터 유래된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하고, 중쇄는 HF2.3D1 또는 1F1 항체의 중쇄로부터 유래된 3개의 상보성 결정 영역을 포함한다. 이러한 핵산은 예를 들어, (a) 인간화된 HF2.3D1 또는 1F1 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, SEQ ID NO:5 (도 2a 참조) 또는 SEQ ID NO:25 (도 7a 참조)), (b) 인간화된 HF2.3D1 또는 1F1 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, SEQ ID NO:7 (도 2b 참조) 또는 SEQ ID NO:27 (도 7b 참조)), (c) 인간화된 HF2.3D1 또는 1F1 면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 적어도 기능적인 부분을 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, 사슬을 포함하는, 인간화된 면역글로불린이 항원에 결합하기에 충분한 부분)을 포함한다. 유전 코드의 축중으로 인해, 선택된 폴리펩티드를 코드화하는 다양한 핵산이 만들어질 수 있다. 한 가지 양태에 있어서, 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 폴리누클레오티드를 포함하는,도 2a 및/또는 도 2b, 또는 도 7a 및/또는 도 7b에 나타나 있거나 이와 실질적으로 동일한 가변 영역의 누클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 기준을 충족시키는 단리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은, 상기 논의된 바와 같이, 인간화된 HF2.3D1 또는 인간화된 1F1 항체 또는 이들의 변이체의 서열과 동일한 서열을 코드화하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간화된 면역글로불린을 코드화하는 핵산 (예를 들어, DNA)은 서열을 추가 조작하거나 적합한 숙주 세포에서 코드화된 폴리펩티드를 생성시키기 위해 적합한 작제물 (예를 들어, 벡터)내로 혼입될 수 있다.
B7-2 및/또는 B7-1에 대한 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 생성시키는 방법:
본 발명의 또 다른 일면은 B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 인간화된 면역글로불린은 예를 들어, B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 코드화하는 하나 이상의 재조합 핵산을 적합한 숙주 세포에서 발현시킴으로써 수득될 수 있다.
B7-2 및/또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 발현시키기에 적합한 작제물 또는 발현 벡터가 또한 제공된다. 작제물은 적합한 숙주 세포내로 삽입될 수 있고, 본 발명의 인간화된 면역글로불린을 발현시키는 세포는 생성되고 배양물 중에 유지될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 대장균, 바실루스 서브틸리스 (B. subtilis) 및 그 밖의 적합한 세균과 같은 세균 세포를 포함하는 원핵 세포, 또는 진균 또는 효모 세포 (예를 들어,Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, Neurospora crassa), 또는 그 밖의 하등 진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포 (예를 들어, Sf9 곤충 세포 (WO 94/26087, O'Connor, published November 24, 1994))와 같은 진핵 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 또한 식물, 유전자이식 동물, 또는 포유동물로부터 유래할 수 있다 (예를 들어, COS 세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), HuT 78 세포, 293 세포) (참조: Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)).
B7-2 및/또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 생성시키는 숙주 세포는 다음과 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 원하는 인간화된 면역글로불린에 대한 코딩 서열의 일부 또는 전부를 코드화하는 핵산을 핵산 벡터, 예를 들어 플라스미드와 같은 DNA 벡터, 바이러스 또는 그 밖의 적합한 발현 유닛내로 삽입시킬 수 있다. 하나의 복사체 또는 다수의 복사체로 유지되거나 숙주 세포 염색체내로 삽입되는 다수의 벡터를 이용할 수 있다.
적합한 발현 벡터는 다음 성분 중의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 성분을 함유할 수 있다: 전사 조절 엘리먼트 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 터미네이터)와 같은 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트, 및/또는 하나 이상의 번역 신호; 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열. 작제물에 있어서, 신호 서열은 벡터 또는 그 밖의 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린의 전사 및/또는 변역 신호는 발현을 유도시키기 위해 사용될 수 있다.
프로모터는 적합한 숙주 세포에서 발현시키기 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 인간화된 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬을 코드화하는 핵산에 작동적으로 결합되어, 코드화된 폴리펩티드의 발현을 유도시켜줄 수 있다. 원핵숙주 (예를 들어, 대장균에 대한 lac, tac, T3, 및 T7 프로모터) 및 진핵숙주 (예를 들어, 효모 알코올 탈수소효소 (ADH) 및 SV40, CMV)에 대한 다수의 적합한 프로모터를 이용할 수 있다.
또한, 발현 벡터는 전형적으로 벡터를 함유하는 숙주 세포을 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터인 경우, 복제 기원을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여해주는 생성물을 코드화하는 유전자가 보편적인 선택성 마커이고, 원핵세포 (예를 들어, β-락타마아제 유전자 (암피실린 내성) 및Tet유전자 (테트라사이클린 내성)) 및 진핵세포 (예를 들어, 네오마이신 (G418 또는 제네티신), gpt (미코페놀산), 암피실린, 및 히그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트에 의해 선택될 수 있게 해준다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 코드화하는 유전자 (예를 들어,LEU2, URA3및HIS3)는 효모에서 선택성 마커로서 종종 사용된다. 바이러스 (예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있는 벡터를 사용하는 것이 또한 고려된다. 본 발명은 또한 이러한 발현 벡터를 함유하는 세포에 관한 것이다.
예를 들어, B7-2 또는 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린의 중쇄와 경쇄를 코드화하는 핵산 (예를 들어, 하나 이상의 핵산), 또는 이러한 핵산(들)을 포함하는 작제물 (예를 들어, 하나 이상의 작제물)은, 핵산(들)이 (예를 들어, 숙주 세포 게놈내로 삽입되는, 벡터, 세포에서의 프로세스에 의해 생성된 작제물에 존재하는) 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트에 작동적으로 결합되도록, 선택된 숙주 세포에 대해 적합한 방법 (예를 들어, 형질전환, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 감염)에 의해 적합한 숙주 세포내로 삽입될 수 있다. 숙주 세포는 발현에 적합한 조건하에서 (예를 들어, 유도물질, 적합한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충물 등이 보충된 적합한 배지의 존재하에서) 유지되어, 코드화된 폴리펩티드(들)을 생성시킬 수 있다. 바람직한 경우, 코드화된 단백질 (예를 들어, 인간화된 HF2.3D1 또는 1F1 항체)은 예를 들어, 숙주 세포, 배지 또는 밀크(milk)로부터 단리될 수 있다. 이러한 공정은 유전자이식 동물의 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함한다 (참조: WO 92/03918, GenPharm International, published March 19, 1992).
인간화된 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬이 N-말단 위치, C-말단 위치 또는 융합 단백질 내부에서 면역글로불린 이외의 잔기 (예를 들어, 천연적으로 발현되는 면역글로불린에는 없는 잔기)에 결합되어 있는 융합 단백질이 생성될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태는 면역글로불린 서열을 코드화하는 핵산을 pET 벡터 (예를 들어, pET-15b, Novagen), 파지 벡터 (예를 들어, pCANTAB 5 E, Pharmacia), 또는 그 밖의 벡터 (예를 들어, pRIT2T 단백질 A 융합 벡터, Pharmacia)와 같은 적합한 발현 벡터내로 삽입시킴으로써 생성될 수 있다. 생성된 작제물은 발현을 위해 적합한 숙주 세포내로 삽입될 수 있다. 발현된 경우, 몇몇 융합 단백질은 적합한 친화성 매트릭스에 의해 세포 용해질로부터 단리되거나 정제될 수 있다 (참조: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)).
치료 방법 및 조성물:
헬퍼 T 세포와 세포독성 T 세포의 두 가지 타입의 T-세포가 존재한다. 헬퍼 T 세포는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 커플링되는 항원을 인식할 수 있다. 항원 제공 세포는 항원을 내재화하여, 항원을 MHC 분자와 함께 다시 제공한다. 항원이 인식되면, 시토카인의 분비가 일어난다. 시토카인 분비는 B-림프구, 세포독성 T 세포, 식세포 및 그 밖의 세포를 활성화시켜준다. 그러나, 시토카인 분비 및 세포 증식은 항원 인식 이외의 것을 필요로 한다. 완전한 T-세포 활성화는 "보조자극 신호"로서 일컬어지는 제 2 신호를 필요로 한다. 이러한 보조자극 신호는 활성화 캐스케이드를 개시시키고, 유지시키고, 조절하는 기능을 한다. 중요한 보조자극 경로는 B7:CD28/CTLA4 경로라고 일컬어진다.
B7:CD28/CTLA4 경로는 두 개의 보조자극 리간드, 즉, B7-1 (CD80)과 B7-2 (CD86)를 포함한다. 항원 제공 세포상에 존재하는 B7-1 및 B7-2 리간드는 각각CD28 및 CTLA4라 일컬어지는 T-세포 상의 두 개의 수용체에 결합한다.
B7 폴리펩티드, B7-1 (CD80) 및 B7-2 (CD86)의 발현은 엄격하게 조절된다 (Linsley, PS et al., Immunity 1:793-801 (1994)). 자극되지 않은 항원 제공 세포는 수상 세포의 경우를 제외하고는 일반적으로 B7-1 및 B7-2를 발현하지 않는다. 활성화된 후, 수상 세포, 표피 랑게르한스 세포, B 세포 및 대식세포는 B7-2 및 B7-1의 발현을 상향조절한다. 또한, B7-2는 과립구 및 T-세포 분자 상에서 발현될 수 있고, B7-1은 섬유아세포 및 T-세포 분자 내에서 발현된다 (Reiser,et al., New England J. of Med., 335:18, 1369-1377, 1371 (1996)).
대부분의 면역 반응에 있어서, B7-2는 B7-2 보다 먼저 유도되고, 고수준으로 상승한다. B7-2는 또한 인터루킨-4 (IL-4)의 생성 및 타입 2 헬퍼 세포의 생성에 영향을 미친다. B7 분자 (B7-1 및 B7-2)는 또한 흑색종에 대한 백신을 생성시키는 데에 유용할 수 있는 CD4 T 세포의 부재하에서 CD8 T 세포를 보조자극하는 역할을 한다. B7 분자는 천연 킬러 세포 및 γ/δ T 세포를 보조자극할 수 있다. 그러므로, B7 분자의 조절은 항-종양 및 항-미생물 면역에 있어서 유용하다.
B7:CD28/CTLA4 경로는 감염성 질환, 천식, 자가면역 질환, 염증성 장애, 이식된 기관에 대한 거부반응 및 이식편대숙주질환의 병인론을 포함하는 다양한 질환에 관여한다. 또한 상기 경로는 면역계를 자극하는 예방 및 메카니즘에 관여한다. B7과 같은 공동자극제를 엔코딩하는 유전자를 사용하는 트랜스펙션은 항종양 및 항바이러스 백신을 위해 적용될 수 있다. 또한, B7 분자는 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병, 천식, 췌도염, 관절염, 염증성 장질환, 염증성 피부염(심상성 건선 및 아토피성 피부염) 및 다발성 경화증[참조: Reiser,et al., New England J. of Med., 335 (18):1369(1996)]. 따라서, 본 발명은 본원에 기술하는 바와 같이, B7-1 및/또는 B7-2에 결합하는 면역글로불린(들)을 투여하는 것을 포함하여, 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 면역글로불린은 치료학적 유효량으로, 임의적으로는, 캐리어내에서 투여되어야 한다.
질환에 걸린 개체를 치료한다는 것은 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 최소화시키거나 완화시키는 것을 말한다. 이식 거부반응을 하는 개체를 치료한다는 것은 이식 거부반응과 관련된 하나 이상의 증상(예컨대, 발열, 신장 기능의 상실, 팽창된 신장, 거부반응에 대한 T-세포/APC 세포 공격)을 최소화시키거나 완화시키는 것을 의미한다. 개체에게서 질환을 예방한다는 것은 질환의 하나 이상의 증상의 발생을 예방하는 것을 말한다. 이식 거부반응을 예방한다는 것은 이러한 이식 거부반응과 관련된 하나 이상의 면역 반응을 감소시키는 것을 의미한다.
그러므로, B7 분자 역할을 조절하거나 이에 영향을 미치는 것은 본원에서 기술하는 질환에 걸린 개체를 치료하는 데 유용할 수 있다. 또한 B7 분자는 면역-관련 질환 또는 자가면역 질환 및 B7-2 및/또는 B7-1이 관여하는 질환에 걸린 개체를 치료하는 데 유용하다. 또한 B7-2 또는 B7-1의 조절은 IL-4 및/또는 타입 2 헬퍼 세포와 관련되거나 이에 의해 영향을 받는 질환에 대해 사용될 수 있다. 이들 질환/질병은 B7-2 및/또는 B7-1에 특이적인 항체를 사용하여 치료될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 B7-2 또는 B7-1에 특이적인 인간화된 항체이다. 이들 질환의 치료는 항-B7-2 항체, 항-B7-1 항체(이들의 키메라 버전 및 인간화된 버전을 포함함) 및/또는 상응하는 수용체인 CD28 및 CTLA4에 대한 항체를 동시-투여함으로써 촉진될 수 있다.
본원에서 기술하는 질환에 추가적으로, B7-1 및/또는 B7-2에 결합하는 면역글로불린이 조직, 기관 또는 세포가 이식된 인간에게 투여될 수 있다. B7 경로를 억제시키는 것은 이식된 조직, 기관 또는 세포의 거부반응을 예방하거나 감소시킨다. 본 발명은 장기간(예컨대, 수일, 수개월, 수년) 동안 급성 및/또는 만성 이식 거부반응을 치료하는 것에 관한 것이다. 급성 이식 거부반응은 일반적으로 이식한 지 처음 몇 주 이내에 발생하지만, 만성 거부반응은 처음 몇 주 후에 발생한다. 투여되는 항-B7-1 및 항-B7-2 항체의 양을 본원에 기술하였다.
특히, 본 발명은 이식편 수용자를 치료하거나 이식 거부반응을 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 인간화된 항-B7-1 및 인간화된 항-B7-2 항체를 이식편에 대한 거부반응을 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것과 관련이 있다. 이식편은 세포, 조직 또는 기관일 수 있다. 항체는 이식되기 전 및/또는 후에, 또는 이식하는 순간에 투여될 수 있다. 항체는 투여량(예컨대, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg)으로 투여된다. 상세하게는, 항체는 이식 당일에는 더 높은 투여량(예컨대, 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg)으로 투여된 다음 이식 후 주기적으로 더 낮은 투여량(예컨대, 매주 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 투여량)으로 투여된다. 주목할만하게, 상기 투여는 이식 거부반응에 대한 직접적인 면역 반응을 현저히 감소시키고 완전히 예방하기까지 하였다. 실시예 22 및 실시예 23 참조.
또한 치료 방법은 인간화된 항-B7-2 항체 및/또는 인간화된 항-B7-1 항체와그 밖의 공지된 표준 보호 약물(예컨대, 기관, 조직, 세포 등이 이식된 개체의 면역 반응을 조절하기 위해 사용되는 약물)의 동시-투여와 관련되어 있다. 이러한 약물에는 예컨대, 메토트렉세이트, 면역 세포의 성장을 정지시키거나 세포 주기 과정을 억제시키는 면역억제제(예컨대, 라파마이신), 스테로이드(예컨대, 프레드니손 또는 이의 유도체), 칼시뉴린 억제제(예컨대, 사이클로스포린 또는 FK506), 항-CD40 경로 억제제(예컨대, 항-CD40 항체, 항-CD40 리간드 항체 및 CD40 경오르이 저분자 억제제), 이식 샐비지(salvage) 경로 억제제(예컨대, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF)), IL-2 수용체 길항제[예컨대, 호프만-라 로취 인코포레이티드(Hoffmann-la Roche Inc.)로부터의 Zeonpax및 노바티스, 인코포레이티드(Novartis, Inc)로부터의 Simulet] 및 이들의 유사체, 또는 미래에 개발될 이식 거부반응 약물이 포함된다. 본원에 기술한 데이터는 사이클로스포린 A, 프레드니손 및 라파마이신이 이들 화합물 중 어느 하나가 인간화된 항-B7-1 및 인간화된 항-B7-2와 함께 투여되는 경우 이식 거부반응을 예방하는 데 있어서 특히 잘 작용함을 보여주었다. 이들 화합물들의 투여되는 양은 다양하다. 투여되는 양은 개체내의 이들의 혈청 농도에 의존한다. 높은 혈청 농도는 낮은 투여량을 보증하고, 낮은 혈청 농도는 높은 투여량을 보증한다. 예를 들어, 인간화된 항-B7-1 및 인간화된 항-B7-2 항체와 함께 투여되는 경우 사이클로스포린 A는 약 150 ng/ml 내지 약 100 mg/ml(예컨대, 200 내지 300 ng/ml)의 양으로 투여될 수 있고, 프레드니손은 약 0.2 mg/kg 내지 약 2.0 mg/ml의 양으로 투여될 수 있고, 메틸프레드니손은 약 0.2 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg의 양으로 투여될 수 있고, 라파마이신은 약 0.5mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명은 세포 이식을 필요로 하는 개체에게 세포(예컨대, 혈구 또는 혈액 성분, 또는 골수)를 이식하기 위한 생체외 방법을 포함한다. 이를 필요로 하는 개체는 예컨대, 이러한 이식편을 사용하여 치료되는 질환(예컨대, 백혈병, 림프종, 암과 같은 증식성 질환; 겸상 적혈구성 빈혈, 지중해빈혈 및 재생불량성 빈혈과 같은 빈혈; 선천성 대사 이상; 선천성 면역결핍 질환; 및 골수 이형성증)에 걸린 개체이다. 이 방법은 공여자로부터 세포를 수득하는 것을 포함한다. 일반적으로, 공여 골수는 미성숙 및 성숙 림프구 둘 모두를 포함하고 있다. 공여자로부터의 혈구는 골수 세포 뿐만 아니라 줄기 세포 또는 미성숙 혈구가 될 수 있다. 공여자의 세포는 바람직하게는 환자/수용자와 유사한 특징을 가진 인간으로부터 기원하지만 이에 제한되지 않는다(예컨대, 공여자의 골수는 환자의 골수와 대등하다). 공여자가 환자와 대등한지 결정하기 위해 분석된 특징은 MHC 클래스 1 및 2(예컨대, HLA-A, HLA-B 및/또는 HLA-DR)이다. 이 방법은 세포(예컨대, 골수 또는 그 밖의 혈액 성분)를 B7-1에 특이적인 면역글로불린 및/또는 B7-2에 특이적인 면역글로불린 및 수용 세포(예컨대, 환자로부터의 림프구)와 접촉시켜 "치료된 세포"로서 일컬어지는 혼합물을 수득하는 것과 관련이 있다. 사용된 항체의 양은 존재하는 세포의 수에 의존한다. 세포의 양이 많을 수록 많은 항체를 필요로 하고, 세포의 양이 적을 수록 적은 항체를 필요로 한다. 본원에 기술한 실험들은 각 항체 10 mg/ml을 사용했으며 이는 10 내지 100 배를 초과하는 것이다. 본 구체예에 사용된 항-B7-1 및/또는 항-B7-2 항체의 양은 아네르기(예컨대, 약 0.01 내지 약 10 mg/ml)를 유도하기에 충분해야 한다. 공여 세포, 면역글로불린(들) 및 수용 세포는 내성을 유도하기에 충분한 시간(예컨대, 약 1 내지 96시간, 바람직하게는 36 내지 48시간) 동안 접촉된다. 내성 유도(예컨대, 아네르기)란 B7-1 및/또는 B7-2 항체를 사용한 치료에 의해 유도된 항원에 대한 반응성의 결핍을 말하며, T-세포는 더 이상 상기 항원에 대해 적절하게 또는 완전하게 반응할 수 없다. 실시예 18 참조. 수용 세포(예컨대, 말초혈 림프구(PBL), 또는 클래스 I 항원(MHC-I)을 발현시키는 림프구)를 세포가 분열하는 것을 방지하기 위해 조사하였다. 수용 세포의 대용물은 MHC 클래스 I 항원, 및 B7-1 및/또는 B7-2 분자를 발현시키는 조직, 기관 또는 조작된 세포일 수 있다. 그런 다음, 이 방법은 혼합물(예컨대, 치료된 세포) 또는 치료된 골수를 환자에게 도입시키는 것을 포함한다. 상기 치료 방법은 이식편대숙주질환을 예방하는데 도움이 된다. 예를 들어, 치료된 골수내의 세포는 수용성 동종항원에 대해 내성이 됨으로써 이식편대숙주질환을 감소시키거나 제거시키며, 공여 골수(예컨대, 줄기 세포)의 인그래프먼트(engraphment)를 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 이식편대숙주질환의 치료, 예방 또는 조력을 포함한다. 항-B7-1 및 항-B7-2 항체는 수용자의 공여 골수 또는 공여 세포에 의해 거부반응을 감소시킨다. 그러나, 이 방법은 다른 외래 세포 및 항원에 대한 면역 반응을 검출하고 발생시키는 환자의 능력을 현저하게 손상시킴없이 거부반응을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 이식이 수용성 특이적이 되도록 해주며, 이식편을 손상시키지 않고 외래 항원에 대한 거부반응이 가능하도록 해준다. 실시예 단락 참조.
또한 본 발명은 인간화된 항-B7-1 및/또는 인간화된 항-B7-2 항체를 개체에게 투여함으로써 개체내의 항원에 대한 항체 반응을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이 항체는 항원의 존재하에서 투여될 수 있다. 이 항원은 성장 인자, 응고 인자, 사이토카인, 케모카인, 유전자 치료 비히클 또는 호르몬일 수 있다. 특히, 이 항원은 예컨대, 파상풍톡소이드, 인자 VIII, 인자 IX, 인슐린, 성장 호르몬 또는 유전자 전달 벡터일 수 있다. 이 항원은 폴리펩티드 형태 또는 핵산 형태(예컨대, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 네이키드 DNA 벡터 등을 통한 유전자 전달)로 투여될 수 있다. 이들 항원에 대한 항체 반응의 서프레션은 투여된 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 항체 반응을 발생시키는 혈우병환자에서와 같은 수많은 질환의 치료에 도움을 줌으로써, 혈액 응고 문제를 야기시킨다. 본원에 기술한 데이터는 모델 항원, 파상풍톡소이드와 함께 유효량의 인간화된 항-B7-1 및/또는 인간화된 항-B7-2 항체를 투여하는 것이 파상풍톡소이드에 대한 항체 반응을 억제시킴을 보여준다. 이들 항체는 항체와 함께 투여되거나, 시간내에(예컨대, 이전 또는 이후에 짧게) 충분히 접근시킴으로써 요망되는 효과, 예컨대, 항체 반응의 서프레션을 제공할 수 있다. 인간화된 항-B7-1 및 인간화된 항-B7-2 항체는 예컨대, 항원을 투여하기 약 14일 전 내지 투여한지 약 2일 후 사이에 상기 항체에 대해 약 3주(항체의 반감기)이내에 투여된다. 인간화된 항-B7-1 및 인간화된 항-B7-2 항체는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg로 투여된다.
본 발명은 캐리어가 존재 또는 부재하는 인간화된 항-B7-1 및/또는 인간화된 항-B7-2 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예는 B7-1 및/또는 B7-2 면역글로불린을 주입가능한 형태 또는 캡슐 형태로 투여하는 것이다. 특히, 주입가능한 형태는 정맥내 또는 피하적 주입일 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는 캐리어" 또는 "캐리어"란 비교적 불활성이고 비독성인 임의의 일반적으로 허용되는 부형제 또는 약물 전달 조성물을 말한다. 예시적인 캐리어에는 탄산칼슘, 수크로오스, 덱스트로오스, 만노오스, 알부민, 전분, 셀룰로오스, 실리카 겔, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 건조탈지유, 쌀가루, 마그네슘 스테아레이트 등이 포함된다. 적절한 제형 및 추가적인 캐리어들은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA)]에 기술되어 있다.
또한 적절한 캐리어(예컨대, 약제학적 캐리어)에는 멸균수, 식염수(링거액과 같은), 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스 또는 전분과 같은 탄수화물, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규소산, 점성 파라핀, 지방사 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 제조물들은 멸균될 수 있으며, 필요한 경우, 보조제, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정제, 가습제, 에멀션화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충액, 염료, 및/또는 면역글로불린과 해롭게 반응하지 않는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 또한 이들은 요망되는 경우 다른 활성 물질, 예컨대, 효소 억제제와 조합되어 물질대사의 쇠퇴를 감소시킬 수 있다. 캐리어(예컨대, 약제학적으로 허용되는 캐리어)가 바람직하지만, 면역글로불린을 투여하기 위해 필수적인 것은 아니다.
비경구 적용에 있어서, 주입가능한 멸균용액, 바람직하게는 오일계 용액 또는 수용액 뿐만 아니라 현탁액, 에멀전, 또는 좌약을 포함하는 이식편이 특히 적합하다. 특히, 비경구 투여를 위한 캐리어에는 텍스트로오스, 염수, 정제수, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 땅콩 오일, 참깨 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 폴리머 등의 수용액이 포함된다. 앰플, 바이알 및 주사기는 편리한 단위 투여량이다.
본 발명의 면역글로불린은 정맥내적으로, 비경구적으로, 근육내적으로, 피하적으로, 경구적으로, 코로, 흡입에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해 또는 좌약에 의해 투여될 수 있다. 이 조성물은 요망되는 효과를 제공하기 위해 단일 투여량 또는 일정 기간에 걸친 1회 이상의 투여량으로 투여될 수 있다.
실제 유효량의 면역글로불린은 예컨대, 사용되는 특정 면역글로불린, 제형된 특정 조성물, 투여 모드, 및 환자의 연령, 체중, 상태, 및 질환 또는 질병의 경중도에 따라 다를 수 있다. 본원에 사용하는 바와 같이, 유효량의 B7-2 및/또는 B7-2 면역글로불린은 B7/CD28/CTLA4 경로를 조절하거나 억제시키는 양이다. 특정 환자를 위한 투여량을 본원에 기술하였고 이는 통상적인 고려(예컨대, 적절하고 통상적인 약리학적 프로토콜에 의해)를 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
인간화된 B7-1 항체, 인간화된 B7-2 항체 및/또는 그 밖의 약물의 투여는 시간상 동시에 또는 연속적으로 일어날 수 있다. 이들 화합물 또는 조성물은 이전, 이후 또는 같은 시간에 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용하는 용어 "동시-투여"란 본원에 기술한 질환을 치료하거나 내성화를 유도시키기 위해 인간화된 B7-1 및/또는 B7-2 항체 및/또는 그 밖의 조성물을 때때로 투여하는 것을 의미한다(예컨대, 메토트렉세이트; 라파마이신; 사이클로스포린; 스테로이드; CD40 경로의 항-CD40 항체, 항-CD40 리간드 항체 및 저분자 억제제와 같은 항-CD40 경로 억제제; 마이코페놀레이트 모페틸(MMF)와 같은 이식 샐비지 경로 억제제; 호프만-라 로취 인코포레이트로부터의 Zeonpax및 노바티스 인코포레이티드로부터의 Simulet 및 이들의 유사체와 같은 IL-2 수용체 길항제). 본 발명의 방법은 항체 또는 조성물이 요망되는 효과를 생성시키기에 충분히 근접한 시간에 투여되는한, 이들이 투여되는 순서에는 제한이 없다.
또한 본 발명은 인간화된 항-B7-2 또는 B7-1 항체를 각각 사용하여 B7-2 또는 B7-1의 존재여부 또는 레벨을 결정하는 방법에 관한 것이다. B7-2 또는 B7-1의 존재여부는 검정(예컨대, ELISA, 방사성면역검정(RIA), FACS 또는 면역조직화학)에서 검출될 수 있다. 이 검정은 직접적이거나 간접적인 검출(예컨대, 경쟁 검정)일 수 있다.
예를 들어, 적절한 샘플내에서 ELISA 검정을 사용하여 B7-2 또는 B7-1의 존재여부를 결정하는 방법은 적절한 샘플을 검출기로서 인간화된 또는 뮤린 항-B7-2 또는 B7-1 항체(예컨대, 바이오티닐화된 항-B7-2 또는 B7-1 mAb 및 HRP-스트렙타비딘, 또는 HRP-컨쥬게이션된 항-B7-2 또는 B7-1 mAb)를 포함하는 조성물 및 고형 지지물(예컨대, 미세역가 플레이트)와 결합시키는 것을 포함하며, 이것은 이에 (직접적으로 또는 간접적으로) 결합된 항-B7-2 또는 B7-1 캡쳐 항체를 가지고 있다. 검출기 항체는 각각 항-B7-2 또는 B7-1 항체 및 B7-2 또는 B7-1사이에 복합체가 형성되도록 해주는 조건하에서, 캡쳐 항체에 의해 인식되는 상이한 B7-2 또는 B7-1 에피토프에 결합할 수 있다. 이 방법은 상기 샘플내의 복합체의 형성을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
또한 B7-2 또는 B7-1의 존재는 방사성면역검정 또는 형광성 검정으로 결정될 수 있다. 예를 들어, B7-2 또는 B7-1의 존재는 샘플을 수득하고, 표지된 복합체의 형성이 적합한 조건하에서, 바람직하게는 B7-2 또는 B7-1에 결합하는데 필요한 양을 초과하는 양으로 항-B7-2 또는 B7-1 항체(예컨대, 방사성 또는 형광성 표지물을 포함하는 인간화된 또는 뮤린 항-B7-2 또는 B7-1 항체; 또는 방사성 또는 형광성 표지물을 포함하는 제 2의 항체를 위한 결합 부위를 포함하는 인간화된 또는 뮤린 항-B7-2 또는 B7-1 항체)를 포함하는 조성물을 사용하여 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 면역결합 검정에 의해 평가될 수 있다. 이 방법은 샘플내의 복합체의 형성을 결정(검출 또는 측정)하는 것을 추가로 포함한다. 유사하게는, B7-1 또는 B7-2의 존재여부 또는 레벨을 본 발명의 인간화된 항-B7-1 또는 B7-2 항체를 사용하는 형광-활성화된 세포 소팅(FACS) 분석 또는 조직의 조직화학적 분석을 사용하여 결정할 수 있다.
실시예
본 발명은 이제부터 하기 실시예로 설명되어질 것이며, 본 발명은 어떠한 식으로든 이들 실시예로 한정되어서는 않된다.
실시예 1 : 마우스 3D1 가변 영역 cDNA의 클로닝 및 서열화 :
마우스 3D1(HF2.3D1으로 불리우기도 함) 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 앵커링된 PCR을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 단리된 mRNA로부터 클로닝시켰다[참고문헌: Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]. 사용된 5' 프라이머를 cDNA에 첨가된 폴리-dG 테일에 아닐링시키고 3' 프라이머를 불변 영역에 아닐링시켰다. 그런 다음, 증폭된 유전자 단편을 플라스미드 pUC18에 삽입시켰다. 누클레오티드 서열을 VL및 VHcDNA 둘 모두에 대한 수개의 독립적인 클론으로부터 결정하였다. 중쇄의 경우에, 마우스 중쇄 가변 영역에 전형적인 단일의 독특한 서열을 동정하였다. 경쇄의 경우에, 뮤린 경쇄 가변 영역 서열과 상동인 2개의 독특한 서열을 동정하였다. 그러나, 하나의 서열은 V-J 접합부에서 프레임 이동을 유발시킨 결손 누클레오티드로 인해 기능적이지 못했으며, 비생산적인 대립유전자로서 동정되었다. 그 밖의 다른 서열은 기능적인 마우스 카파 사슬 가변 영역에 나타냈다. 중쇄 및 기능적 경쇄의 가변 영역 cDNA 서열 및 번역된 아미노산 서열은 도 1a 및 1b에 도시되어 있다. 마우스 VL서열은 카뱃(Kabat)의 바우스 카파 사슬 서브그룹 I에 속한다. 마우스 VH는 카뱃의 중쇄 서브그룹 II(A)에 속한다.
실시예 2 : 인간화된(humanized) 3D1 가변 영역의 디자인 :
인간화된 항체에서의 마우스 항체의 결합 친화성을 유지시키기 위해, 퀸(Queen) 등의 일반 방법을 따랐다[참고문헌: Queenet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 10029(1989), U.S. 특허 제 5,585,089호 및 제 5,693,762호; 이들 모두 본원에 참고문헌으로 인용됨]. 골격 잔기의 선택은 높은 결합 친화성을 보유하는데 중요할 수 있다. 원칙적으로, 인간 항체로부터의 골격 서열은 CDR 그라프팅에 대한 주형으로서 사용될 수 있지만; 그러한 골격 내로의 곧은 CDR의 교체로인해 항원에 대한 결합 친화성이 상당히 손실될 수 있음이 증되었다[참고문헌: Tempestet al., Biotechnology9 : 266 (1992); Shalabyet al., J. Exp. Med.17 : 217 (1992)]. 인간 항체가 본래의 뮤린 항체에 대하여 보다 상동적이면, 인간 골격은 친화성을 감소시킬 수 있는 마우스 CDR 내로 만곡부를 덜 도입시킬 것으로 여겨진다. 서열 상동성에 기초하여, I2R은 인간화된 3D1 중쇄를 위해 골격을 제공하고 인간화된 3D1 경쇄 가변 영역을 위해 H2F를 제공하는 쪽으로 선택된다. [참고문헌 : Manheimer-Lory, A.et al., J. Exp. Med.174(6):1639-52 (1991)]. 그 밖의 다른 아주 상동적인 인간 항체 사슬은 인간화된 항체 골격, 특히 카뱃에 의해 규정된 바와 같이 인간 서브그룹 4로부터의 카파 경쇄 및 인간 서브그룹 1으로부터의 중쇄를 제공한다.
일반적으로, 동일한 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄는 2개의 사슬의 어셈블링시에 부적합성의 가능성을 감소시키기 위해 골격 서열을 제공한다. I2R 항체는 3D1 중쇄 및 경쇄에 대하여 고도의 상동성을 나타내기 때문에 최초의 인간화된 항체 모델에 대한 골격을 제공하는 쪽으로 선택되었다. 그러나, 3D1 경쇄 가변 영역은 I2R을 포함하여 어떠한 다른 영역과 비교하여 H2F 골격에 대한 아주 높은 상동성을 나타낸다. 그러므로, H2F는 대신에 인간화된 3D1 경쇄 가변 영역에 대한 골격을 제공하는 쪽으로 선택되었고, 반면에 I2R은 중쇄 가변 영역에 대한 골격을 제공하는 쪽으로 선택되었다.
컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCODE [참고문헌: Levittet al., J. Mol. Biol.168:595 (1983)]은 3D1 가변 도메인의 분자적 모델을 구성하는데 사용되었는데, 잠재적으로 이들과 상호작용하는 CDR에 충분히 근접하여 있는 3D1 골격에 아미노산의 위치를 정하는데 사용되었다. 인간화된 3D1 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 설계하기 위해, 마우스 3D1 중쇄로부터의 CDR은 인간 I2R 중쇄의 골격 영역 내로 이식되었고, 마우스 3D1 경쇄로부터의 CDR은 인간 H2F 경쇄의 골격 영역내로 이식되었다. 컴퓨터 모델이 CDR과 상당히 접촉하여 있는 곳이라 제안한 골격 위치에서, 마우스 항체로부터의 아미노산이 본래의 인간 골격 아미노산 대신에 사용되었다. 인간화된 3D1의 경우에, 이러한 대체는 중쇄의 잔기 27, 30, 48, 67, 68, 70 및 72, 및 잔기 22에서 이루어졌다. 더욱이, 인간 항체의 데이터베이스에 있는 이들의 위치에서 드물게 발생하는 골격 잔기는 이들 위치에서 인간 콘센서스 아미노산에 의해 대체되었다. 인간화된 3D1의 경우에, 이러한 대체는 중쇄의 잔기 113 및 경쇄의 잔기 3에서 이루어졌다.
인간화된 3D1 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열은 도 2a 및 2b에 도시되어 있다. 그러나, 잠재적인 CDR 접촉 잔기의 대부분은 항체가 여전히 항원에 대한 상당한 친화성을 보유하게 할 수 있는 다른 아미노산의 대체부분을 따른다. 표 1에는 대안적인 아미노산이 적합할 수 있는 골격에서의 다수의 위치가 수록되어 있다(LC = 경쇄, HC = 중쇄). 표에 명시된 위치는 성숙 사슬의 제 1 아미노산 으로부터의 아미노산의 수이고, 이러한 위치는 2줄의 밑줄로 나타내어져 있다(도 2a-2b). 예를 들어, 위치 LC-22는 2줄로 밑줄친 아스파르트산 D로부터 시작하여 22번째의 아미노산이다(또는 개시 코돈으로부터 42번째의 아미노산이다).
표 1. 아미노산 대체 및/또는 교체
| 위치 | 인간화된 3D1 | 대체부 |
| LC-22 | S | N |
| HC-27 | Y | G |
| HC-30 | T | S |
| HC-48 | I | M |
| HC-67 | K | R |
| HC-68 | A | V |
| HC-70 | M | I |
| HC-72 | V | A |
마찬가지로, 인간화된 3D1 중쇄 및 경쇄에서 CDR과 접촉하고 있지 않은 다수의 골격 잔기는 인간화된 항체의 친화성 또는 비면역원성의 상당한 손실 없이, I2R 및 H2F 골격의 상응하는 위치로부터, 다른 인간 항체로부터, 마우스 3D1 항체로부터, 또는 다른 마우스 항체로부터 아미노산의 치환부를 수용할 수 있다. 표 2에는 대안적인 아미노산이 적합할 수 있는 골격내의 다수의 추가 위치가 수록되어 있다.
표 2. 골격 영역 아미노산 치환부 및/또는 대체부
| 위치 | 인간화된 3D1 | 대체부 |
| LC-3 | V | Q |
| HC-113 | T | I |
다양한 대안적인 아미노산의 선택은 친화성, 특이성, 비면역원성, 제조의 용이성, 및 그 밖의 요망 특성의 다양한 조합을 가질 수 있는 인간화된 3D1의 버전을 생성시키는데 사용될 수 있다. 이와 같이, 상기 표에 기재된 예는 제한을 목적으로 제공되는 것이 아니라 예시를 목적으로 제공된다.
실시예 3 : 인간화된 3D1의 구성
인간화된 가변 영역 아미노산 서열을 상기한 바와 같이 디자인하였다면, 유전자는 시그날 펩티드, 스플라이드 도너 시그날 및 적합한 제한 부위를 포함하는 이들을 코딩시키도록 구성된 것이다(도 2a-2b). 경쇄 및 중쇄 가변 영역 유전자를 길이가 약 65 내지 80개의 염기 범위인 8개의 중복 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 구성시키고 증폭시켰다[참고문헌 : Heet al., J. Immunol. 160:1029 (1998)]. 올리고를 쌍을 이루는 방식(pairwise)으로 아닐링시키고 DNA 폴리머라아제 I의 클레노우(Klenow) 단편으로 연장시켜, 4개의 이중 가닥 단편을 생성시켰다. 생성된 단편을 변성(denatured)시키고, 아닐링시키고, 클레노오 단편으로 연장시켜 2개의 단편을 생성시켰다. 이들 단편을 변성시키고, 쌍을 이루는 방식으로 아닐링시키고, 한번 더 연장시켜, 전장 유전자를 생성시켰다. 생성된 생성물을 Taq 폴리머라아제를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키고, 겔-정제시키고, XbaI로 분해시키고, 다시 겔-정제시키고, 경쇄의 발현을 위한 pVk 및 중쇄의 발현을 위한 pVg4 또는 pVg2.M3의 XbaI 부위로 서브클로닝시켰다. 카파(kappa) 경쇄 발현을 위한 pVk 벡터는 이미 공지되어 있다[참고문헌: Coet al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]. γ1 불변 영역 유전자를 함유하는 pVg1의 XbaI-BamHI 단편[참고문헌: Coet al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을, γ4 유전자의 CH1 엑손 앞에 있는 HindIII 부위로부터 유전자의 CH4 엑손 다음에 있는 NsiI 부위 이후의 270bp까지 연장된 인간 g4 불변 영역 유전자의 약 2000bp 단편[참고문헌: Ellison and Hood,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:1984 (1992)]으로 대체시킴으로써 γ4 중쇄 발현을 위한 pVg4 벡터를 구성시켰다. γ2 중쇄 발현을 위한 pVg2.M3 벡터는 콜(Cole) 등의 문헌[J. Immunol. 159:3613 (1997)]에 기술되어 있다. pVg2.M3은 위치 234와 237에 있는 아미노산 Val과 Gly을 Ala로 치환시킴으로써 인간 야생형 IgG2로부터 돌연변이된다. 이러한 변이체는 이의 Fc 수용체와의 상호작용이 약화되어, 최소의 항체 이펙터 활성을 지닌다.
최종 플라스미드의 구조는 누클레오티드 서열화 및 제한 맵핑에 의해 입증되었다. 모든 DNA 조작은 당업자에게 널리 공지된 표준 방법에 의해 수행되었다.
두 개의 인간화된 3D1, 즉, IgG4와 IgG2.M3를 비교 실험을 위해 생성시켰다. 인간화된 3D1 (IgG4 또는 IgG2.M3)를 생성시키는 세포주를 작제하기 위해, 경쇄 및 각각의 중쇄 플라스미드를 마우스 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581)내로 트랜스펙션시켰다. 플라스미드를 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 CHO 세포내로 또한 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시키기 전에, 중쇄와 경쇄 함유 플라스미드를 제한 엔도누클레아제를 사용하여 선형화시켰다. 카파 사슬 및 γ2 사슬은 FspI를 사용하여 선혀화시켰고; γ4 사슬은 BstZ18I를 사용하여 선형화시켰다. 약 20㎍의 경쇄와 중쇄 플라스미드를 PBS 중에서 1 x 107개의 세포내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션은 제조업자의 지시에 따라 360V 및 25μFD 커패시턴스에서 진 펄서 (Gene Pulser) 장치 (BioRad)를 사용하는 일렉트로포레이션에 의해 수행하였다. 각각의 트랜스펙션으로부터의 세포를 4개의 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 2일 후, 선택 배지 (DMEM, 10% FCS, 1xHT 보충물 (Sigma), 0.25㎎/㎖ 크산틴, 1㎍/㎖ 미코페놀산)를 적용하였다.
약 2주 후에, 나타난 클론을 ELISA에 의해 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. 고생산성 클론으로부터의 항체는, 세포를 규정 배지 (10% FCS가 보충된 DMEM)에서 컨플루언시까지 성장시킨 후, 배지를 무혈청 배지 (Hybridoma SMF; Gibco)로교환하고, 최대 항체 역가가 배양물 중에서 수득될 때까지 배양함으로써 제조하였다. 배양물 상층액을 단백질-A-세파로스 컬럼 (Pharmacia)을 통과시키고; 항체를 0.1M 글리신, 100mM NaCl, pH 3으로 용리시키고, 중화시킨 후, 포스페이트 완충 식염수 (PBS)내로 교환시켰다. 항체의 순도는 이를 아크릴아미드겔상에서 분석함으로써 입증하고, 이의 농도는 OD280판독에 의해 결정하였는데, 1.0㎎의 항체 단백질은 1.4의 OD280을 지니는 것으로 가정하였다.
실시예 4: 인간화된 안티-B7-2 항체의 친화도:
경쟁 결합 검정:
B7-2 항원에 대한 뮤린 및 인간화된 3D1 항체의 상대적 친화도를 경쟁 결합 검정에 의해 측정하였다. 표지되지 않은 인간화된 또는 뮤린 3D1 항체의 3배 연속 희석물을 고정량의 방사성 요오드화된 뮤린 3D1 항체와 혼합하였다 (2% 우태아 혈청을 함유하는 PBS 중에서 시험 당 40,000 내지 50,000 cpm).
그 후, 세포 표면 rhB7-2 (CHO/hB7-2)를 발현하는 1 x 105개의 CHO 세포를 첨가하고, 혼합물 (전체 부피 200㎕)을 서서히 진탕시키면서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포-항체 현탁액을 100㎕의 80% 디부틸 프탈레이트-20% 올리브 오일을 함유하는 사르슈테트 마이크로 튜브 (Sarstedt Micro Tubes) (part #72.702)로 이동시켰다. 마이크로퓨지에서 원심분리시킨 후, 사르슈테트 튜브를 수 분간 드라이 아이스내로 집어넣었다. 세포 결합된125I는 각각의 튜브 (세포 펠레트를 함유함)의 팁을 신틸레이션 바이알내로 클립핑하고 감마 계수기로 계수함으로써 결정하였다. 결합된 및 유리된 총갯수를 결정하고, 비를 베르조프스키(Berzofsky)와 베르코워(Berkower)의 방법 (J. A. Berzofsky and I. J. Berkower, in Fundamental Immunology 9ed. W.E. Paul), Raven Press (New York), 595 (1984))에 따라 차가운 경쟁 항체의 농도에 대해 플로팅하였다.
세포주:
막 표면상에서 hB7-2를 발현하는 재조합 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 B7-2 cDNA 서열로 트랜스펙션되고 G418 내성을 지닌 세포로부터 클로닝하였다. 선택적 압력하에서의 다수의 계대에 걸친 CHO 세포 표면상에서의 hB7-2의 발현을 뮤린 안티-B7 항체와 FACS 분석을 이용하여 확인하였다.
125
I 표지된 안티-hB7 mAb의 제조 및 특징화:
안티-hB7 항체를 제조업자 (Amersham Corp., Arlington Hts, IL)의 지시에 따라125I-볼튼-헌터 (125I-Bolton-Hunter)와의 반응에 의해125I로 표지시켰다. 단백질을 NAP-25 컬럼을 사용하여 유리 시약으로부터 분리하였다. HPLC 크기-배제 컬럼을 사용하여, 항체가 온전한 상태로 있고 응집되어 있지 않음을 확인하고, 표지되지 않은 항체로부터 제조된 표준물질에 대해 단백질 농도를 측정하였다. 표지화는 전형적으로 단백질 1㎍ 당 4 내지 8 마이크로큐리를 나타내거나 표지된 항체 분자의 약 30 내지 60%를 나타내었다.
결과:
경쟁 결합 그래프는 도 3에 도시되어 있다. 각각의 데이터 지점은 3중 결정실험의 평균을 나타낸다. 결과는 인간화된 IgG4 및 인간화된 IgG2.M3 안티-인간 B7-2 항체 둘 모두가 뮤린 안티-인간 B7-2 항체와 유사한 높은 결합 친화도 (약 1 x 109M-1)를 지님을 보여주고, 이는 3D1의 인간화 과정에서 B7-2에 대한 친화도가 손실되지 않음을 나타낸다. 뮤린 및 인간화된 안티-B7-2 둘 모두는 높은 친화도를 지니면서 세포 표면 발현된 hB7-2를 인식한다.
실시예 5. CHO/hB7 세포에 대한 인간화된 안티-B7 mAb의 직접 결합:
세포 결합 검정:
결합 검정을 세포를 웰 당 10,000 CHO/hB7-2 세포로 96-웰 조직 배양 플레이트상에 플레이팅함으로써 시작하였다. 2일 후, 유착 세포를 무지방 분류 단백질 (비특이적 결합을 블록킹하기 위해) 및 아지드화 나트륨 (세포에 의한 항체의 내재화를 방지하기 위해)를 함유하는 검정 완충액으로 서서히 세척하였다. 직접 결합 검정을 위해,125I-표지된 안티-B7 항체 (I-뮤린 안티-인간 B7-2; 826 cpm/fmol; 인간화된 안티-인간 B7-2, 883 cpm/fmol)을 검정 완충액에서 연속 희석시키고, 세포상에서 밤새 인큐베이션시킴으로써, 항체가 세포-표면 B7에 결합하여 평형을 이루도록 한다. 결합되지 않은 항체를 세포로부터 서서히 세척시키고, 결합된125I-항체를 I 신틸런트(scintillant) 및 광검출기 시스템을 사용하여 검출하였다. CHO 세포에 대한 비특이적 결합은 동일한 방식으로 각각의 희석물에 대해 결정하였지만, 항체에 의해 인식되지 않는 B7-1 분자를 발현시키는 세포를 시험하였다.
결과:
직접 결합 그래프는 도 4에 도시되어 있다. 비특이적 결합이 공제된 3중 웰의 평균치인 데이터를 그래프패드 프리즘제이 (Graphpad PrismJ) 소프트웨어를 사용하여 쌍곡 포화 곡선이 되게 하였다. 최대 결합의 절반에 상응하는 농도로서 결정된 항체의 KD는 뮤린 및 인간화된 안티-B7-2 mAb가 B7-2에 대해 유사한 친화도 및 높은 친화도 (약 109m)를 지님을 나타내었다. 뮤린 및 인간화된 안티-B7-2 항체 둘 모두는 높은 친화도를 지니면서 세포 표면 발현된 hB7-2를 인식한다.
실시예 6: 단백질 리간드에 대한 인간화된 안티-B7 mAb의 결합:
BIACORE
에 의한 친화도 결정:
BIACORE바이오센서 (BIACORE; Uppsalla, Sweden)을 사용하여 인간 B7-2Ig에 대한 뮤린 및 인간화된 안티-B7-2 인간 항체의 결합 속도론을 결정하였다. 인간 B7-2Ig (hB7-2Ig)를 BIACORE센서 칩의 덱스트란 매트릭스상에 고정시켰다. 인간화된 및 뮤린 안티-인간 B7-2를 200, 100, 50 및 20 nM에서 시험하였다. 각각의 희석물을 작업 당 4회 시험하고, 전체 3회의 개별적 작업을 수행하였다. 안티-인간 B7-2 항체 결합을 서피스 플라스몬 레조넌스 (Surface Plasmon Resonance (SPR))에 의해 실시간으로 측정하고, BIA 평가 소프트웨어 (버전 3.1)로 2가 결합 모델을 사용하여 전반적 분석을 수행하였다. 각각의 샘플에 대해, 결합 (ka), 해리 (kd), 및 평형 해리 상수 (KD)를 결정하였다.
hB7-2 Ig의 제조:
가용성 형태의 hB7-2Ig를 이러한 단백질을 분비하도록 공학처리된 CHO 세포의 배양 배지로부터 회수하였다. 재조합 hB7-2Ig는 B7-2 유전자의 세포외 도메인에 상응하는 DNA 코딩 서열을 인간 IgG1 중쇄의 힌지-CH2-CH3 도메인에 융합시킴으로써 유도시켰다. 재조합 hB7-2Ig를 단백질 A에 의해 배양 배지로부터 정제하였다.
결과:
표 3은 뮤린 및 인간화된 안티-인간 B7-2 mAb 둘 모두에 대해 수득된 평균값을 나타낸다. SPR에 의해 결정된 뮤린 및 인간화된 안티-B7-2 mAb에 대한 결합 상수는 안티-B7-2 mAb의 뮤린 및 인간화된 형태가 유사하고, 뮤린 안티-B7-2 mAb가 인간화된 안티-B7-2 보다 고정된 hB7-2 Ig에 대해 약간 더 높은 결합 상수를 지님을 보여준다. 뮤린 안티-B7-2 mAb에 대해 계산된 약 2.8배 더 높은 친화도가 실제값을 나타낼 수 있지만, 뮤린과 인간화된 안티-B7-2 mAb 사이의 약간의 차이가 인간화 공정 도중에 도입될 수 있다. 또 다른 가능성이 이러한 항체의 제조, 처리 및 분석 도중의 기술적 변화로 인해 일어날 수 있다. 실시예 4, 5 및 7에 나타난 바와 같이, 세포 기초 검정에 있어서 인간화된 hB7-2 결합 친화도의 차이는 관찰되지 않았다.
표 3: BIACORE에 의해 결정된 안티-B7-2 mAb의 친화도
| mAb | 평균 KD |
| 뮤린 안티-B72- | 1.8 x 10-9M |
| 인간화된 안티-B7-2 | 5.1 x 10-9M |
실시예 7: 인간화된 항-B-7-2에 의한 T-세포 보조자극의 억제
CD28+T 세포/CHO-B7 증식 분석
본원에서 설명된 바와 같이 CD28+T 세포를 한번 세척하고 RPMI 완전 배지에서 재현탁시키고, 5x105세포/㎖의 세포 밀도로 2ng/㎖ PMA(Calbiochem)을 공급하였다. CD28+T 세포(100㎕, 5x104세포)를 항체/CHO/hB7-2 혼합물(하기 참조)에 첨가시키고, 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션시키고, [3H]-티미딘(NEN, Boston, MA) 1 마이크로큐리로 배양물을 최종 6시간 동안 펄싱시켜 T 세포 증식을 측정하였다. 세포를 필터에서 수득하고, 혼입된 방사능을 신틸레이션 계수관에서 측정하였다.
재료:
CD28+ 인간 세포는 설명된 바와 같이(June et al., Cell. Biol. 7:4472-4481(1987)) 인간 말초혈 림프구의 면역흡수를 이용하여 네거티브 선택(negative selection)에 의해 분리되었다. 건강한 인간 공여자의 류코포레시스(leukophoresis)에 의해 백혈구 연층을 수득하였고, 말초혈 림프구(PBL)를 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리시켰다. 단핵세포를 플라스틱 흡수에 의해 PBL로부터 제거시켰다. CD28+ T 세포를 비접착 세포로부터 CD11, CD20, CD16 및 CD14(이 항체 세트는 모든 B 세포, 단핵세포, 거대 과립 림프구 및 CD28-T 세포를 피복시킬 것이다)에 대한 항체를 사용하는 네거티브 선택과 산양 항-마우스 면역글로불린-피복된 자기 입자를 사용하는 자기 비드 분리에 의해 비접착 세포로부터 분리시켰다.
CHO/hB7-2 세포를 Ca2+및 Mg2+(PBS)가 없는 인산염 버퍼 염수에서 0.5mM EDTA와 함께 인큐베이션시켜 조직 배양물 플레이트로부터 분리시키고, 새롭게 제조된 파라포름알데히드로 고정시켰다.
항-B7-2 항체의 다양한 농도(중복)를 미세역가 플레이트(flat-bottom, 96-well, Costar, Cambridge, MA)의 100㎕ RPMI 완전 배지(RPMI 1640 배지, 10% 태아 소혈청(FBS), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)에서 1x104CHO/hB7-2 세포를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 예비인큐베이션시켰다.
결과:
도 5는 뮤린과 인간화된 항-hB7-2 mABs에 의한 인간 CD28+T 세포 증식의 억제 결과를 보여준다. 두 항체 모두는 두 항체가 유사하고 B7-2 T- 세포 자극 신호를 억제하는데 매우 효과적임을 나타내는 유사한 IC50(Inhibitory concentration 50%; T 세포 증식을 최대 50%까지 억제하기 위해 요구되는 항체의 양) 값 72pm(뮤린 항-hB7-2) 및 50pm(인간화된 항-hB7-2)으로 B7-2 구동된 T-세포 증식의 투여량 의존 억제를 나타낸다. 이는 높은 친화도 항-B7-2 mAbs가 인간 T 세포의 활성 및/또는 증식을 억제(예를들면, 예방)하여 B7-2 작용성을 차단할 수 있다는 것을 설명한다. 이러한 mAbs는 T 세포 반응을 억제하기 위한 생체내 사용에서 유사한 능력을 나타내는 것으로 예상된다.
실시예 8: 마우스 1F1 가변 영역 cDNAs의 클로닝과 서열화
마우스 1F1 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNAs를 앵커링된(anchored) PCR을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 분리된 mRNA로부터 클로닝시켰다(Co et al., J. Immunol. 148: 1149(1992)). 사용된 5' 프라이머는 cDNA에 부가된 폴리-dG 테일로 어닐링되고, 3' 프라이머는 소정 영역에 어닐링되었다. 그런 다음, 증폭된 유전자 단편을 플라스미드 pUC19에 삽입시켰다. 누클레오티드 서열을 VH및 VLcDNA 양쪽에 대해 여러개의 독립적인 클론으로부터 결정하였다. 중쇄의 경우, 전형적인 마우스 중쇄 가변 영역을 나타내는 단일의 독특한 서열이 확인되었다. 경쇄의 경우, 두개의 독특한 서열 (둘 모두 마우스 경쇄 가변 영역에 대해 상동임)이 확인되었다. 그러나, 하나의 서열은 V-J 접합지점에서 프레임 이동을 일으키는 실종 누클레오티드로 인해 작용하지 못하고, 비생산성 대립유전자로서 확인되었다. 다른 서열은 전형적인 작용성 마우스 카파(kappa) 사슬 가변 영역을 나타내었다. 중쇄 및 작용성 경쇄의 가변 영역 cDNA 서열과 번역된 아미노산 서열이 도 6a와 6b에 각각 제시되어 있다. 마우스 VH는 카바트(Kabat)의 중쇄 서브그룹 II(C)에 속한다. 마우스 VK 서열은 카바트의 마우스 카파 사슬 서브그룹 IV에 속한다.
실시예 9: 인간화된 1F1 가변 영역의 디자인
인간화된 항체에서 마우스 항체의 결합 친화도를 유지하기 위해, 문헌[Queen et al.]의 일반적인 과정을 따랐다[Queen et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86: 10029(1989) 및 미국 특허 제 5,585,089호 및 제 5,693,762호]. 골격 잔기를 선택하는 것은 높은 결합 친화도를 유지하는데 중요할 수 있다. 원리적으로 임의의 인간 항체의 골격 서열은 CDR 그래프팅을 위한 주형으로 조력할 수 있지만, 이러한 골격에 직쇄 CDR 치환시키는 것은 항원에 대한 결합 친화도를 상당히 손상시킬 수 있음이 설명되었다[Tempest et al., Biotechnology 9:266(1992)]. 인간 항체가 본래의 마우스 항체에 일치하면 할 수록, 인간 골격이 친화도를 감소시킬 수 있는 마우스 CDRs의 변형 가능성이 덜 할 것이다. 카바트 항체 서열 데이터베이스에 대한 서열 동일성 조사에 기초하여[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S.Department of Health and Human Services(1991)], III-2R[Manheimer-Lory et al., J.Exp.Med.176: 309(1992)]를 선택하여 인간화된 1F1 중쇄 가변 영역과 인간화된 1F1 경쇄 가변 영역 모두에 골격을 제공하였다. 다른 높은 동일한 인간 항체 사슬이 또한 인간화된 항체 골격, 특히 인간 서브그룹 1의 중쇄 및 카바트에 의해 정의된 서브그룹 1의 카파 경쇄를 제공하는데 적합하다.
일반적으로 동일한 인간 항체로부터 중쇄와 경쇄가 선택되어 두개의 사슬의 조립에서 불일치성을 감소시키도록 골격 서열을 제공한다. III-2R 항체는 1F1 중쇄와 경쇄에 대한 높은 동일성을 보이므로, 인간화된 항체에 골격을 제공하도록 선택된다. 인간화된 1F1 중쇄 가변 도메인은 마우스 1F1 중쇄 골격의 것과 동일하거나 79% 서열 동일성을 갖는 87 골격 잔기중 69 잔기를 갖는다. 인간화된 1F1 경쇄 가변 도메인은 마우스 1F1 경쇄 골격의 것과 동일하거나 69% 서열 동일성을 갖는 80 골격 잔기 중 55 잔기를 갖는다.
컴퓨터 프로그램 ABMOD와 ENCAD[Levitt et al., J.Mol.Biol. 168:595(1983)]를 1F1 가변 도메인의 분자 모델을 제작하는데 사용하였으며, 이 분자 모델은 CDRs에 충분히 접근하여 잠재적으로 상호작용하는 1F1 골격에서 아미노산을 위치시키기 위해 사용되었다. 인간화된 1F1 중쇄와 경쇄 가변 영역을 디자인하기 위해, 마우스 1F1 중쇄의 CDRs를 인간 III-2R 중안쇄의 골격 영역에 그래프팅시키고, 마우스 1F1 경쇄의 CDRs를 인간 III-2R 경쇄의 골격 영역에 그래프팅시켰다. 컴퓨터 모델이 CDRs와 거의 접촉하는 골격 위치에서, 마우스 항체의 아미노산이 초기 인간 골격 아미노산으로 치환되었다. 인간화된 1F1을 위해, 이는 중쇄의 잔기 1, 24, 27, 28, 29, 30, 48, 67 및 68과 경쇄의 47 및 72에서 행해졌다. 더우기, 인간 항체의 데이터베이스의 이들의 위치에서 거의 발생하지 않는 골격 잔기를 이들의 위치에서 인간 일치 아미노산으로 치환시켰다. 인간화된 1F1을 위해, 이는 중쇄의 잔기 17, 74 및 113과 경쇄의 잔기 44에서 행해졌다. 전체적으로, 인간화된 1F1 중쇄 가변 도메인은 인간 III-2R 중쇄 가변 도메인과 일치하는 88 잔기를 갖고, 인간화된 1F1 경쇄 가변 도메인은 III-2R 경쇄 가변 도메인과 일치하는 88 잔기를 갖는다.
인간화된 1F1 항체 중쇄와 경쇄 가변 영역의 서열은 도 7a와 7b에 제시되어 있다. 그러나, 많은 잠재적인 CDR 접촉 잔기는 항체가 항원에 대해 실질적인 친화도를 유지하도록 하는 다른 아미노산의 치환을 따라야 한다. 표 4는 대체의 아미노산이 적합한 골격에서 위치의 수를 기재한다(LC = 경쇄, HC = 중쇄).
표 4
| 위치 | 인간화된 1F1 | 대체물 |
| HC-1 | E | Q |
| HC-24 | P | A |
| HC-27 | F | G,Y |
| HC-28 | N | T |
| HC-29 | I | F |
| HC-30 | K | S,T |
| HC-48 | I | M |
| HC-67 | K | R |
| HC-68 | A | V |
| LC-72 | Y | F |
또한, 인간화된 1F1 중쇄와 경쇄에서 CDRs와 접촉하지 않는 골격 잔기의 다수는 인간화된 항체의 친화성과 비면역원성의 상당한 손실 없이 III-2R 골격의 해당 위치, 다른 인간 항체, 마우스 1F1 항체 또는 다른 마우스 항체로부터의 아미노산의 치환을 수용할 수 있다.
표 5는 대체 아미노산이 적합한 골격의 추가 위치 수를 기재하고 있다.
표 5
| 위치 | 인간화된 1F1 | 대체물 |
| HC-16 | A | S |
| HC-74 | T | K |
| HC-113 | T | I |
| LC-44 | A | S,V |
다양한 대체 아미노산의 선택은 친화성, 특이성, 비면역원성, 용이한 제조 및 다른 바람직한 특성의 조합을 변화시키면서 인간화된 1F1의 변형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 앞의 표에서 실시예는 예시의 방법으로 제시한 것으로 제한하려는 것은 아니다.
실시예 10: 인간화된 1F1의 제조
인간화된 가변 영역 아미노산 서열이 앞서 설명된 바와 같이 디자인되면, 신호 펩티드, 접합 도너 신호 및 적절한 제한 부위(도 7a와 7b)를 포함하는 유전자는이들을 암호화하도록 제조되었다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 제조하고, 약 65 내지 80 염기 길이의 합성 올리고누클레오티드를 8번 중복시켜서 증폭시켰다[참조: He et al., J.Immunol.160: 1029(1998)]. 올리고를 한쌍씩 어닐링시키고 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편으로 연장시켜, 4개의 이중 가닥 단편을 수득하였다. 생성된 단편을 변성시키고, 한쌍씩 어닐링시키고, 클레나우로 연장시켜, 2개의 유전자를 수득하였다. 이러한 단편을 변성시키고, 한쌍씩 어닐링시키고, 다시 한번 연장시켜, 완전한 길이의 유전자를 수득하였다. 생성된 생성물을, Taq 폴리머라제를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키고, 겔 정제시키고, XbaI로 소화시키고, 다시 겔 정제시키고, 중쇄의 발현을 위한 pVg2.M3의 XbaI 부위와 경쇄의 발현을 위한 pVk로 서브클로닝시켰다. 인간 γ2 중쇄 발현을 위한 pVg2.M3 벡터가 이전에 설명되었다[Cole et al., J.Immunol. 159:3613(1997)]. pVg2.M3 플라스미드의 인간 γ2 일정 영역은 Ala의 위치 234와 237에서 아미노산 Val과 Gly를 대신함으로써 야생형 인간 γ2 일정 영역으로부터 돌연변이되었다. 이러한 돌연변이체는 이의 Fc 수용체와의 상호작용이 감소되었고, 따라서 최소의 항체 효과인자 활성을 갖는다. 인간 카파 경쇄 발현을 위한 pVk 벡터가 이전에 설명되었다[참조: Co et al., J.Immunol.148:1149(1992].
최종 플라스미드의 구조는 누클레오티드 서열과 제한 맵핑에 의해 확인되었다. 모든 DNA 조작은 당업자에게 널리 공지된 표준 방법으로 수행되었다.
인간화된 1F1 항체의 IgG2.M3 형태를 결합 연구를 위해 발생시켰다. 인간화된 1F1을 생성하는 세포주를 제조하기 위해, 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 마우스 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14(ATCC CRL 1581)으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 이전에, 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 제한 엔도누클레아제를 사용하여 선형화시켰다. FspI를 사용하여 γ2 중쇄 플라스미드와 카파 경쇄 플라스미드를 선형화시켰다. 중쇄 플라스미드 약 40㎍과 경쇄 플라스미드 20㎍을 PBS에서 1x107세포로 트랜스펙션시켰다. 형질 감염은 제조자의 지시에 따라 360 내지 25μFD 전기용량에서 유전자 맥동기 장치(BioRad)를 사용하여 엘렉트로포레이션(electroporation)으로 이루어졌다. 각 트랜스펙션된 세포들을 4개의 96-웰 조직 배양 플레이트에 두고, 2일 후에 선택 배지(DMEM, 10% FCS, 1xHT 공급물(Sigma), 0.25㎎/㎖ 산틴(xanthine), 1㎍/㎖ 미코페놀산)를 적용시켰다.
약 2주 후, 나타난 클론을 ELISA의 항체를 생성하기 위해 스크리닝시켰다. 고생산 클론으로 인한 항체는 정상 배지(10% FCS를 지닌 DMEM)에서 세포를 융합하게 성장시켜 제조된 다음, 배지를 혈청 유리 배지(Hybridoma SFM; GIBCO)로 대체하고, 배지에서 최대 항체 역가가 얻어질 때까지 배양되었다. 배양 상청액을 단백질 A-세파로스 칼럼(Pharmacia)에 통과하게 하고, 항체를 0.1M 글리신, 100mM NaCl, pH 3으로 용리시키고, 후속하여 인산 완충 식염수(PBS)로 교환하였다. 항체의 순도는 항체를 아크릴아미드 겔에서 분석하여 확인하였고, 농도는 항체 단백질 1.0㎎이 OD280판독 1.4를 갖는다는 가정에서, OD280판독으로 측정하였다.
또한 인간화된 1F1 항체의 IgG4 형태가 발생하고 앞서 설명된 방식을 따라 정제되었다.
CHO 세포에서 고수준의 발현을 허용하도록, 완전히 인간화된 인간 1F1(h1F1)과 인간 3D1(h3D1) 경쇄 및 중쇄 유전자가 각각 독립적으로 선택될 수 있고 증폭될 수 있는 발현 벡터 pED로 서브클로닝되었다[Kaufman R.J., et al., Nucl Acids Res., 19:4485-4490(1991)]. pED-유도된 발현 플라스미드를 서열화하여 이들이 적절한 h1F1과 h3D1 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 것을 입증하였다. lgG2m3 CH3 도메인의 마지막에서 두번째의 아미노산이 모든 공개된 lgG2 및 lgG1 서열에 대해 이 위치에서 기록된 글리신 잔기와 대조적으로 세린임을 발견하였다. 이 세린을 pED 발현 작제물에 대해 보다 일반적인 글리신으로 대체하였다. h1F1 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드(pED.1F1v2KA 및 pED.1F1v2G2m3gly)를 선형화하고, 혈청 유리 현탁 배양물에서 성장을 위해 예비 조작된 CHO PADUKX.153.8 세포주로 코트랜스펙션시켰다[Sinacore M.S. et al., Biotechnol. Bioeng. 52:518-528(1996)]. h3D1을 발현하는 세포주는 선형화된 플라스미드 pED.3D1KA 및 pED.3D1G2m3gly로 코트랜스펙션에 의해 동일한 방식으로 발생되었다. 각 경우에, 경쇄 및 중쇄 유전자를 CHO 세포 게놈으로 안정하게 통합한 다음 메토트렉세이트(methotrexate) 선택 및 증폭하여, 재조합 h1F1 또는 h3D1 세포주가 발생하였다. 항-B7-1 또는 항-B7-2를 발현하는 CHO 세포주를 혈청 유리 성장 배지에서 배양하고, 분비된 항체를 단백질 A 세파로스 상에서 크로마토그래피에 의해 조절된 배양 상청액으로부터 정제하였다. 결합된 항체를 산 완충액에서 용리시킨 다음 pH 7.0으로 중화시켰다. 정제된 항체는 PBS로 완충액 교환되고 살균 여과되었다.
실시예 11: 인간화된 1F1의 성질
B7-1 항원에 대한 인간화된 1F1 항체와 마우스의 친화성은 방사 요오드화된 인간화된 1F1 항체와 경쟁적으로 결합시켜 측정되었다. 표지되지 않은 마우스 또는 인간화된 1F1 항체의 3배의 일련의 희석액을 2% 태아 송아지 혈청, 0.1% 나트륨 아자이드를 함유하는 PBS에서 방사 요오드화된 인간화된 1F1 항체(시험당 40,000-50,000cpm)의 고정된 양과 혼합시켰다. 세포 표면 rhB7-1을 발현하는 3x104CHO 세포를 후속하여 첨가하고, 혼합물(전체 부피 200㎕)을 2시간 동안 4℃에서 부드럽게 흔들면서 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 세포 항체 현탁액을 80% 디부틸 프탈레이트 20% 올리브유 100㎕를 함유하는 사르스테드(Sarstedt) 마이크로 튜브(파트 72.702번)로 옮겼다. 마이크로퓨지(microfuge)에서 원심분리시킨 후, 사르스테드 튜브를 수분 동안 드라이 아이스에 넣었다. 세포-결합된125I는 신틸레이션 바이알로 각 튜브(셀 펠렛을 함유한다)의 팁을 클리핑하고 감마 계수기에서 계수하여 결정되었다. 결합된 유리 계수를 측정하고, 베르조프스키 및 베르코워(Berzofsky and Berkower)의 방법에 따라 차가운 경쟁자 항체의 농도에 대해 비를 플로팅하였다[J.A. Berzofsky and I.J.Berkower, in Fundamental Immunology, W.E.Paul, Raven Press, New York, pp.595-644(1984)].
도 8은 경쟁적인 결합 그래프를 보여준다. 각 데이터 점은 3번 측정한 평균값을 나타낸다. 이 결과는 IgG2.M3 항체가 마우스 항체의 농도(약 1x10-9M-1)에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여주며, 1F1의 인체 적응에서 친화성의 손실이 없음을 나타낸다.
B7-1 항원에 대한 마우스 및 인간화된 1F1 항체의 친화성을 방사성 표지화된 항체의 결합의 스캐차드(Scatchard) 분석으로 확인하였다. 방사성 표지화된 마우스 또는 인간화된 1F1 항체의 2배 연속 희석액을 전체 부피가 200㎕인 2% FCS, 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS중에서 세포 표면 rhB7-1을 발현시키는 5×104CHO 세포로 인큐베이션시켰다. 혼합물을 온화하게 교반시키면서 4℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 그후, 세포 항체 현탁액을 10% 디부틸 프탈레이트-20% 올리브유 100㎕를 함유하는 사르슈테트 마이크로 튜브(Sarstedt Micro Tubes)(part #72.702)에 옮겼다. 마이크로퓨지에서의 원심분리후에, 사르슈테트 튜브를 수분동안 건조 아이스내로 플러징시켰다. 신틸레이션 유리병내로 각각의 튜브의 팁을 클리핑시키고 감마 카운터에서 계수함으로써 세포 결합된125I를 결정하였다. 결합된 계수치 및 유리된 계수치를 결정하고, 그 비를 스캐차드 방법에 따른 결합된 항체의 농도에 대해서 도시하였다 [참고 문헌: Scatchard, Ann, N.Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949)]. 데이타를 한 라인에 맞추는데 최소 스퀘어 방법을 사용하였으며, 라인의 기울기로부터 자명한 Ka를 결정하였다.
스캐차드 도시를 도 9A 및 도 9B에 제시하였다. 각각의 데이타 점은 2회 측정치의 평균값을 나타내는 것이다. 그 결과는 IgG2.M3 항체가 마우스 항체의 결합 친화도(약 1x109M-1)와 유사한 결합 친화도를 갖는 것을 나타내는 것이며, 1F1의 인간화에서 친화도 손실이 전혀 없음을 확인하는 것이다.
실시예 12: 인간화된 항-B7-1 모노클로날 항체
경쟁적 결합 검정:
B7-1 항원에 대한 뮤린 및 인간화된 항-B7-1(1F1) 항체의 상대적인 친화도를 경쟁적 결합 검정으로 결정하였다. 표지화되지 않은 뮤린 또는 인간화된 항-B7-1 mAbs의 3배 연속 희석액을 고정량의 방사성 표지화된 뮤린 항-B7-1 mAb(2% 소태아 혈청을 함유하는 PBS중의125I-anti-B7-1, 2800 cpm/fmol; 40,000-50,000 cpm/test)와 혼합하였다. 표면상에서 hB7-1을 발현시키는 1x105CHO/hB7-1 세포를 연속적으로 첨가하고, 혼합물(전체 부피=200㎕)을 온화하게 교반시키면서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그후, 세포 항체 혼합물을 80% 디부틸 프탈레이트-20% 올리브유 100㎕를 함유하는 사르슈테트 마이크로 튜브(파트# 72.702)에 옮겼다. 마이크로퓨지에서의 원심분리후에, 사르슈테트 튜브를 수분 동안 건조 아이스내로 플런징시켰다. 신틸레이션 유리병내로 각각의 튜브의 팁을 클리핑시키고 감마 카운터에서 계수함으로써 세포 결합된125I-표지화된 mAb를 결정하였다. 결합된 계수치 및 유리된 계수치를 결정하고, 그 비를 스캐차드 방법에 따른 결합된 항체의 농도에 대해서 도시하였다.
CHO/hB7-1 세포주:
표면상에서 hB7-1을 발현시키는 재조합 중국산 햄스터 오베리(CHO: Chinease Hamster Ovary) 세포주는 hB7-1 cDNA 서열 및 G418 내성 마커로 트랜스펙션된 CHO 세포로부터 클로닝시켰다. 선택적인 압력하에 많은 패시지에 대한 CHO 세포 표면상에서 hB7-1의 적합한 발현은 뮤린 항-B7-1 mAb 및 FACS 분석을 이용하여 확인하였다.
125
I-표지화된 항-B7-1 mAb의 제조 방법:
뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb를 제조자(Amersham Corp, Arlington Heights, IL)의 지시에 따라125I-Bolton Hunter 시약과 반응시킴으로써125I 요오드로 표지화시켰다. NAP-25 칼럼을 이용하여 단백질을 유리 시약으로부터 분리시켰다. 표지화후의 항체 보전 및 응집 상태를 증명하고 단백질 농도를 결정하는데 HPLC 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다. 표지화는 보편적으로 4 내지 8 마이크로큐리125I/mAb ㎍ 를 초래하며 이는 표지화된 항체 분자의 30 내지 60%로 추정된다. 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb의 특이적 활성은 각각 2800cpm/fmol 및 950cpm/fmol 이다.
결과:
경쟁적인 결합 데이타를 나타내는 그래프가 도 10에 도시되어 있다. 각각의 데이타 점은 3회 측정의 평균을 나타내는 것이다. 결과는 인간화된 항-B7-1 및 뮤린 항-B7-1 모두가 유사하게 B7-1에 대해서 고친화도(약 1x10-9M)를 가지며, 이는 인간화된 항-B7-1 mAb에 대해서는 친화도 손실이 전혀 없음을 나타낸다. 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 모두는 세포 표면 발현된 B7-1에의 결합을 위한 표지화된 뮤린 항-B7-1 mAb와 유사하게 및 효과적으로 경쟁한다.
실시예 13: B7-1에의 인간화된 항-B7-1 mAb의 직접적인 결합
세포 결합 검정:
완전한 배지중에서 10,000 세포/웰로 96 웰 조직 배양 플레이트상에서 CHO/hB7-1 세포를 플레이팅시킴으로써 결합 검정을 시작하고 플레이트를 2일 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 유착 세포를 검정 완충액(무지방 건조 밀크 및 아지드화나트륨을 함유하는 PBS)로 온화하게 세척하였다.125I로 표지된 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb를 검정 완충액중에서 연속적으로 희석시키고 4℃에서 세포를 밤새 인큐베이션시켜 결합을 평형에 도달하게 하였다. 결합하지 않은 표지화된 항체를 검정 완충액으로 연속하여 온화하게 세척함으로써 세포로부터 제거하고, 결합된125I 표지화된 항체를125I 신틸런트 및 검출 시스템을 이용하여 검출하였다. 표적 CHO 세포가 뮤린 또는 인간화된 항-B7-1 mAb에 의해 결합되지 않는 hB7-2를 발현시키는 것을 제외하고는 앞서 기술된 바와 동일한 방식으로 비특이적인 결합을 표지화된 항체의 각각의 희석을 위해서 결정하였다.
결과:
직접적인 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프를 도 11에 도시하였다. 특이적 결합을 뺀 3회 측정치의 평균값을 계산하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 과포화 결합 곡선에 맞추었다. 뮤린 및 인간화된 항체 모두에 대해서 결합 부위의 최대 포화의 절반에 상응하는 항체의 농도로서 결정되는 결합 상수(KD)는 2가지 항체 모두가 B7-1에 대해서 유사하게 고친화도(약 10-9M)를 가짐을 나타낸다.뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb는 모두 세포 표면 발현된 인간 B7-1을 인식한다.
실시예 14: 단백질에의 뮤린 및 인간화된 항-B7-1의 결합
리간드:
바이어코어(BIACORE)
에 의한 친화도 결정:
바이어코어바이오센서(BIOCORE, Uppsalla, Sweden)을 인간 B7-1Ig(hB7-1Ig) 단백질에의 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 모노클로날 항체의 결합 속도를 결정하는데 사용하였다. 인간 B7-1Ig를 바이어코어센서 칩의 덱스트란 매트릭스상에 고정시켰다. 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb를 고정화된 hB7-1Ig상에서 200, 100, 50 및 20nM에서 시험하였다. 각각의 mAb 희석액을 조작시마다 4회 시험하였으며, 전체 3회의 분리 조작을 수행하였다. 항-인간 B7-1Ig 결합을 SPR(Surface Plasmon Resonance)에 의해 실시간 측정하고 전체 분석을 BIA 평가 소프트웨어(버전 3.1)에서 2가 결합 모델을 사용하여 수행하였다. 각각의 샘플에 있어서, 결합 상수(ka), 해리 상수(kd) 및 평형 해리 상수(KD)를 결정하였다.
표 6은 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb 모두에 대해서 결정하였다. SPR에 의해 결정되는 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb에 대한 결합 상수는 항-B7-1 mAb의 뮤린 및 인간화된 형태가 유사하며, 뮤린 항-B7-1 mAb는 인간화된 항-B7-1의 경우보다 hB7-1Ig 단백질에 대해서 다소 높은 결합 친화도를 가짐을 보여주고 있다. 뮤린 항-B7-1 mAb에 대해서 관찰되는 5배 높은 결합 친화도는 인간화 공정 동안에 도입되는 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb 사이의 실질적이나 약간의 차이를 나타낼 수있다. 대안적으로, 개개의 mAb의 제조, 처리 및 분석에 있어서의 기술적 변화는 이들 작은 차이를 설명할 수 있다. 실시예 12, 14 및 19에 제시된 바와 같이, 세포 결합 또는 기능 검정에서 뮤린 및 인간화된 항-B7-1 mAb 사이에는 차이가 전혀 관찰되지 않았다.
표 6: 바이어코어에 의해 결정되는 항-B7-1의 친화도
| mAb | 평균 KD | 표준편차 |
| 뮤린 항-B7-1 | 5.6 x 10-10M | 1.9 x 10-10M |
| 인간화된 항-B7-1 | 2.8 x 10-9M | 1.2 x 10-9M |
hB7-1Ig의 제조방법:
hB7-1Ig의 가용성 형태를 단백질을 분비시키도록 공정되는 CHO 세포의 배양 배지로부터 회수하였다. 인간 IgG1 중쇄의 힌지-CH2-CH3 도메인에 hB7-1 유전자의 세포외 도메인을 엔코딩시키는 DNA 서열을 융합시킴으로써 재조합 hB7-1Ig를 유도하였다. 재조합 단백질을 단백질 A 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 정제하였다.
실시예 15: 인간화된 B7-1 Ab에 의한 T 세포 보조자극의 억제
CD28
+
T 세포/CHO-B7 증식 검정
본원에 기술된 바와 같이 분리된 CD28+T 세포를 일단 세척하고, 5x105세포/ml의 세포 밀도까지 2ng/ml PMA(Calbiochem)로 보충된 RPMU 완전 배지중에서 재현탁시켰다. CD28+T 세포(100㎕; 5x104세포)를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션시킨 항체/CHO/hB7-1 세포 혼합물(하기 참조)에 첨가하고, 마지막 6시간 동안 1uCi의 [3H]-티미딘(NEN, Boston, MA)로 배양물을 펄싱시킴으로써 T 세포 증식을 측정하였다. 세포를 여과지상에서 거두고, 이용된 방사능을 신틸레이션 계수에 의해 측정하였다.
재료:
기술된 바와 같이 인간 말초혈 림프구로부터 면역흡수를 이용한 네가티브 선택에 의해 CD28+T 세포를 단리시켰다 [참조 문헌: June et al., Mol. Cell Biol. 7:4472-4481]. 간단하게, 건강한 인간 공여자의 류코포레시스(leukophoresis)에 의해 백혈구 연층을 수득하였고, 말초혈 림프구(PBL)를 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리시켰다. 단핵세포를 플라스틱 흡수에 의해 PBL로부터 제거시켰다. CD11, CD20, CD16 및 CD14(이 항체 세트는 모든 B 세포, 단핵세포, 거대 과립 림프구 및 CD28-T 세포를 피복시킬 것이다)에 대한 항체를 사용하는 네거티브 선택과 산양 항-마우스 면역글로불린-피복된 자기 입자를 사용하는 자기 비드 분리에 의해 비유착 세포로부터 CD28+T 세포를 단리시켰다.
CHO/hB7-1 세포를 Ca2+및 Mg2+(PBS)가 없는 인산염 완충된 염수와 0.5mM EDTA를 사용하여 인큐베이션시켜 조직 배양물 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 세척한 후, 새롭게 제조된 파라포름알데히드로 고정시켰다.
항-B7-1 항체의 다양한 농도(중복)를 미세역가 플레이트(flat-bottomed, 96 well, Costar, Cambridge, MA)의 100㎕ RPMI 완전 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)에서 1x104CHO/hB7-1 세포를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 예비인큐베이션시켰다.
결과:
도 12는 뮤린과 인간화된 항-B7-1 mABs 형태에 의한 인간 CD28+T 세포 증식의 억제 결과를 보여준다. 모노클로날 항체 모두는 두 항체가 모두 유사하고 B7-1 T 세포 동시자극 신호를 억제하는데 매우 효과적임을 나타내는 유사한 IC50(Inhibitory concentration 50%; T 세포 증식을 최대 50%까지 억제하기 위해 요구되는 항체의 양) 값 110pM(인간화된 항-B7-1) 및 220pM(뮤린 항-B7-1)으로 B7-1 유도된 T-세포 증식의 투여량 의존 억제를 나타낸다. 이는 고친화도 항-B7-1 mAbs가 인간 T 세포의 활성 및/또는 증식을 억제 또는 예방하여 B7-1 작용성을 차단할 수 있음을 설명한다. 이러한 mAbs는 T 세포 반응을 억제하기 위한 생체내 사용에서 유사한 능력을 나타내는 것으로 예상된다.
실시예 16: 항-B7-1 및 항-B7-2 mAb에 의한 혼합된 림프구 반응의 억제
혼합된 림프구 반응(MLR: Mixted lymphocyte reaction): 인간 정상 말초혈 림프구(PBL)(반응제)를 106세포/ml의 최종 농도에서 5% CO2중에 37℃에서 5% 심장 불활성화된 인간 AB 혈청을 함유하는 RPMI 1640중에 조사된(2,500cGy) 정상 공여자 PBL(자극제)로 배양하였다. 나타난 경우, 뮤린 항-hB7-1 또는 항-hB7-2 항체를 단독으로(10㎍/ml), 조합하여(각각 10㎍/ml), 및 CTLA4Ig와 비교하여(10 내지20㎍/ml) 첨가하였다. 배양물을 200㎕의 최종 농도로 미소역가 플레이트에서 3번 배양시키고, 배양의 마지막 16시간 동안 [3H]-티미딘 혼입에 의해 증식을 검정하였다. 이차 MLR을 반응제로서 주요 MLR로부터 유도된 세포를 사용하여 수행하였다. 이제 세포를 세척하고, 밤새 배양시키고, 동일하거나 상이한 제 3의 자극제 PBL을 사용하여 상기와 같이 재자극하였다. 2차 MLR에는 억제인자를 전혀 첨가하지 않았다.
결과:
도 13에 도시된 결정화는 B7 억제인자(항-B7, CTLA4Ig)의 유무에 관계없이 1차 1가지 방식의 MLR을 수행함으로써 이루어졌다. 증식은 배양한지 3, 4 또는 5일 경과후에 측정하였다.
1차 MLR에서, 부가의 항-B7-1 mAb 자체는 반응제 T 세포의 증식을 유도하는데 있어서 B7-1 단독에 대해서는 적은 영향을 나타내어 전혀 억제 효과를 미치지 않는다. 항-B7-2 단독은 B7-1 및 B7-2 모두를 결합하는 것으로 공지된 재조합 단백질, 인간 CTL4Ig(hCTL4Ig)에 필적할만한 수준으로 시험된 모든 날에 T 세포 증식을 억제하였다. 항-B7-1 및 항-B7-2의 조합체는 시험된 모든 날에 반응을 완전히 억제하여 T 세포 증식의 가장 효과적인 억제인자였다. hCTL4Ig와 비교하여, 조합된 항-B7-1 및 항-B7-2의 우수한 T 세포 억제능은 hCTL4Ig에 비해 B7-1 및 B7-2에 대한 항-B7 mAb의 높은 친화도를 반영하는 것이다. 조합된 항-B7-1 및 항-B7-2 mAb는 항-B7-2 단독 보다는 T 세포 증식을 더욱 양호하게 억제하며, 이는 T 세포반응을 완전히 억제하는 자극 수용체 모두를 차단할 필요를 증명하는 것이다. 이들 결과는 B7-1 및 B7-2 동시 자극제의 완전한 차단은 MLR중의 타반응성 (alloresponsiveness)을 더욱 완전히 제거함을 보여주는 것이다. 따라서, 이들 결과는 항-B7-1 및 항-B7-2 항체를 모두 포함하는 처리 방법이 이들 항체중 하나를 단독으로 이용했을 때보다 더욱 효과적이며, 특히 동시 자극 분자가 작용성인 경우에 그러하다. 본원에 기술된 반응제/자극제의 쌍은 항-B7-1 단독에 의한 억제에 민감하지 않으며, 일부 반응제/자극제의 쌍은 적절한(0 내지 50%) 항-B7-1 민감도를 나타낸다.
1차 MLR에서의 항-B7 mAb를 이용한 처리가 T 세포 과반응성 또는 아네르기를 전개시키는 지를 결정하기 위해서, 1차 MLR로부터의 반응제 T 세포를 자극제가 1차 MLR과 같은 공여자이거나 제 3 자극제인 2차 MLR에서 시험하였다. 도 14는 항-B7-1 단독으로 처리한, 1차 MLR로부터 수득된 반응제 T 세포가 면역억제 없이 2차 MLR에서 시험되는 경우에 원래의 민감한 세포 및 제 3 자극제 모두에 대해 완전 증식 반응을 나타냄을 보여주는 것이며, 이는 항-B7-1 mAb로의 처리에 의해 B7-1 수용체 단독을 차단하는 것이 반응하는 T 세포에 대한 내성 효과가 전혀 없음을 나타내는 것이다. 이는 1차 MLR이 항-B7-2 단독으로 처리되는 경우에 2차 MLR에서 보여지는 1차 자극제에 대한 반응의 부족과는 대조적이다. 도 15에서의 결과는 항-B7-2 단독으로 처리한 1차 MLR로부터의 반응제 T 세포가 1차 MLR에서 사용된 것과 동일한 반응제에 반응하지 않으나, 관련되지 않은 자극제인 제 3 자극제에 정상적인 증식 반응을 유지시킴을 보여주는 것이며, 이는 이들 반응제 T 세포가 항-B7-2로의 처리에 의해 본래 자극제 PBL에 내성이 되게 하며 내성이 1차 MLR중에 존재하는 자극제 항원에 특이적임을 나타내는 것이다. 이러한 반응제/자극제 쌍을 이용하여, 항-B7-2 단독으로의 처리로 자극제 세포에 대한 내성이 유도되나, 다른 반응제/자극제 쌍을 이용했을때에는 내성의 유도가 완전하지 않을 수 있다.
도 16은 항-B7-1 및 항-B7-2로 처리한 1차 MLR로부터의 반응제 T 세포가 1차 MLR에서 사용된 것과 같은 자극제에 반응하지 않으나, 관련없는 반응제인 제 3 반응제에 대한 정상적인 증식 반응을 유지시킴을 보여주는 것이다. 이는 반응제 T 세포가 조합된 항-B7-1 및 항-B7-2로의 처리에 의해 본래의 자극제 PBL에 내성이 있게 됨을 나타내는 것이다. 이러한 반응제/자극제 쌍으로부터 수득된 결과는 내성 유도가 일반적인 다른 반응제/자극제 쌍에 있어서 보편적이다.
실시예 17: 인간화된 항-B7-1 및 항-B7-2을 사용한 치료에 의한 일차 및 이차 MLR의 억제
요약:
항-B7 mAb의 일차 MLR 억제능, 및 특이적 내성이 있는 고반응성 또는 "내성" 및 이차 MLR의 유도능을 조사하였다. 일차 MLR을 개별적으로 또는 항-B7-mAb 또는 CTLA4Ig와 조합시켜 처리하고, 3일, 4일 및 5일째에 증식을 측정하였다. 조합된 항-B7-1+항-B7-2 mAb 및 CTLA4Ig는 증식을 억제한 반면, 개별적인 항-B7 mAb는 덜 효과적이었다. 일차 MLR로부터의 세포(치료 48시간 후)를 억제제제없이 이차 MLR에 주입하였다. 조합된 항-B7 mAb 또는 CTLA4Ig로 처리된 일차 MLR로부터의 세포는 이차 MLR에서의 원래 자극제에 대해 최소의 반응을 보인반면, 배지 또는 개개의항-B7 mAb 처리된 세포는 잘 반응하였다. 모든 조건으로부터의 세포는 제 3의 자극제에 대해 우수한 반응을 나타내므로써 조합된 항-B7 mAb 또는 CTLA4Ig로 처리된 세포에 대한 일차 MLR에서 보여진 저반응성이 특이적이고 내성이 있음을 입증하였다.
재료 및 방법:
실험 디자인:
세포:
반응제 "A" 세포는 새로 채혈된 혈액으로부터 준비된 PBL이었다. PBL을 피콜(ficoll) 구배 원심분리에 의해 정제하고, 이 세포를 배지로 2회 세척하고, 배지중에 1x106/ml로 현탁시켰다. 원래 자극제 "B" 세포는 류코포레시스(leukophoresis)로부터 준비된 PBL이었다. 세포를 피콜 분리에 의해 정제하고, 배지로 2회 세척하였다. 세포를 일차 MLR에 대해 배지에서 2x106/ml로 현탁하고, 이차 MLR에 대해 1x106/ml로 현탁시켰다. 제 3의 자극제 "C" 세포는 류코포레시스로부터 준비된 PBL이었다. 피콜 분리에 의해 세포를 정제하고, 배지로 2회 세척하였다. 세포를 배지 중에 1x106/ml로 현탁시켰다. "B" 및 "C" 자극제는 2개의 유전학적으로 상이한 인간 도너로부터 얻어진 PBL이다.
배지:
2mM 글루타민, 10mM HEPES, 10% 열 불활성 인간 AB 혈청, 100U/ml 페니실린,100ug/ml 스트렙파마이신 술페이트 및 5ug/ml 글루타민 술페이트를 함유하는 RPMI 1640.
시험 항목:
대조군 Ig는 뮤린 항-HIV 엔벨로프(envelope) 단백질 mAb로부터 유도된 가변 도메인 및 인간 IgG1으로부터 유도된 불변 도메인을 갖는 키메라 mAb이다. 모든 항체, CTLA4Ig, 및 대조군 Ig 용액을 하기 농도로 배지에서 준비하였다: 항-B7-1(40ug/ml), 항-B7-2(40ug/ml), 항-B7-1+항-B7-2(각각 40ug/ml), CTLA4Ig(40ug/ml), CTLA4Ig(80ug/ml) 및 대조군 Ig(40ug/ml).
일차 MLR을 위한 방법:
다음과 같이 수행하였다:
●3.5Gy에서 "B"세포(자극제)를 조사한다.
●96웰 "U"형 미세역가 플레이트 바닥에서, 50ul의 조사된 "B" 세포 + 50ul의 항체, CTLA4Ig, 대조군 Ig 또는 배지를 혼합한다. 총 부피=100ul (1x105B 세포(자극제)과 2X 억제제의 최종 농도 함유). 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.
●100ul의 "A" 세포(반응제)를 첨가한다.
●37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨다.
●2일, 3일 및 4일째에, 1uCi의[3H]-티미딘을 첨가하고, 인큐베이션을 밤새 계속한다.
●세포를 수집하고, 신틸레이션 계수법에 의해 병합된 방사선을 측정한다. 3일, 4일 및 5일로서 결과를 보고한다.
결합된 일차/이차 MLR을 위한 방법:
다음과 같이 수행하였다:
●3.5Gy에서 "B"세포(자극제)를 조사한다.
●벌크(bulk) 일차 MLR. T-25 플라스크에서, 2.5ml의 조사된 "B" 세포(2x106/ml) + 2.5ml의 항체, CTLA4Ig, 대조군 Ig 또는 배지를 혼합한다. 총 부피=5ml (1x105B 세포(자극제)과 2X 억제제의 최종 농도 함유). 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.
●5ml의 "A" 세포(반응제)를 첨가한다. T-25에서의 총 부피=10ml
●37℃, 5% CO2에서 약 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
●세포를 피콜 구배 원심 분리에 의해 수집하고, 빙냉 배지로 2회 세척하고, 배지 중에 1x106/ml로 현탁시킨다. 얼음 상에서 8시간 동안 유지시킨다. 세포를 빙냉 배지로 2회 세척하고, 배지 중에 1x106/ml로 현탁시킨다.
●3.5Gy에서 "C"세포(제 3의 자극제)를 조사한다. 3.5Gy에서 "B"세포(원래 자극제)를 조사한다. "B" 세포 및 "C" 세포는 모두 1x106/ml이다.
●96웰 "U"형 미세역가 플레이트 바닥에서, 100ul의 조사된 "B" 세포 또는 조사된 "C" 세포과 벌크 MLR로부터의 100ul 세포를 혼합한다.
●37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨다.
●2일, 3일 및 4일째에, 1uCi의[3H]-티미딘을 첨가하고, 인큐베이션을 밤새 계속한다.
●세포를 수집하고, 신틸레이션 계수법에 의해 병합된 방사선을 측정한다. 3일, 4일, 5일 및 6일로서 결과를 보고한다.
결과:
하나의 반응제와 두개의 상이한 자극제를 사용하여 수행된 일차 MLR을 개별적인 항-B7 mAb, 조합된 항-B7 mAb, CTLA4Ig, 또는 대조군 Ig로 처리하고, 배양 증식을 3일, 4일 및 5일째에 측정하였다. 항-B7-1은 단독으로 증식에 대해 최소의 억제 효과를 가졌다(1-35%). 항-B7-2은 단독으로 증식에 대해 중간의 억제 효과를 가졌다(30-50%). 조합된 항-B7 mAb 또는 CTLA4Ig는 증식에 대해 최대 억제 효과를 가졌다(86-92%, 항-B7; 82-91%, CTLA4Ig; 도 17 및 18).
자극제 중 하나를 사용하고 억제제를 함유하는 일차 MLR중에서 48시간 인큐베이션시킨 후, 세포를 세척하고, 방치하고, 억제제가 결여된 배양물 중에서 원래의 자극제 및 제 3의 자극제를 사용하는 이차 MLR에 넣었다. 배양 증식을 3, 4, 5 & 6일째에 측정하였다(도 19 및 도 20). 이차 MLR 시험으로부터의 데이터를 편집한 것이 도 21에 제시된다.
최고 증식 반응으로부터 얻어진 데이터를 사용하여, 최고 증식 반응의 일과는 무관하게, 항-B7-1로 처리된 일차 MLR로부터의 세포에 대한 원래 및 제 3의 자극제에 대한 반응은 하기와 같다:
표 7
| 일차 MLR에서의 처리 | 원래 자극제에 대한 반응율(%) | 제 3의 자극제에 대한 반응(%) |
| 배지 | 100 | 100 |
| 항-B7-1 | 70 | 89 |
| 항-B7-2 | 47 | 89 |
| 항-B7-1 + 항-B7-2 | 15 | 89 |
| CTLA4Ig 10 | 19 | 90 |
| CTLA4Ig 20 | 17 | 95 |
| 대조군 Ig | 99 | 105 |
조합된 항-B7 mAb 또는 CTLA4Ig중 어느 하나로 처리된 일차 MLR은 세포에서 이차 MLR에서의 동일한 자극제에 대해 증식에 불응인 것으로 나타났다. 항-B7 mAb을 단독으로 사용한 처리가 덜 효과적이었다. 일차 MLR에서의 처리와는 무관하게, 모든 처리 조건으로부터의 세포는 제 3의 세포에 대해 정상적으로 반응했으며, 이는 조합된 항-B7 mAb 또는 CTLA4Ig로의 처리가 특이적이고, 내성이 있는 저반응성 또는 아너지(anergy)를 초래함을 입증한다.
결론:
조합하여 사용된 인간화된 항-B7 mAb h1F1 및 3D1은 일차 MLR을 억제한다. 이러한 억제는, 조합된 항-B7 mAb로 처리된 일차 MLR로부터의 반응제가 억제제 없이 수행된 이차 MLR에서의 동일 자극제에 대해 불량하게 반응하므로써 특이적이고 내성이 있다. 조합된 항-B7 mAb로 처리된 일차 MLR로부터의 반응제는 이차 MLR에서의 제 3의 자극제에 대해서는 정상적으로 반응한다. 조합된 항-B7 mAb는 일차 및 2차 반응제를 억제하는데 있어서 CTLA4Ig와 마찬가지로 효과적이다. 개별적인 항-B7 mAb는 일차 MLR을 억제하는데 덜 효과적이며, 개개의 항-B7 mAb로의 처리는이차 MLR에서의 아너지 전개를 초래하지 못하였다.
실시예 18: 항-B7 mAb에 의한 인간 이외의 영장류에서의 면역화 반응 억제; 항파상풍 반응의 억제
요약:
일차 및 이차(재현) 항체 반응을 억제하는 항-B7 mAb의 능력을 인간 이외의 영장류 파상풍 면역화 모델에서 측정하였다. 사이노몰구스 원숭이의 4개의 코호트(cohort)(n=3)를 0일째 및 6주후 42일째에 파상풍 독소로 면역화시켰다. 항-파상풍 역가를 매주 측정하였다. 0일째에 인간 항-B7-1 항체(h1F1) 및 항-B7-(h3D1) 둘 모두를 조합하여 1회 10mg/kg으로 투여된 군에서, 항파상풍 독소 항체 반응이 극적으로 억제되었으며, 6마리의 처리된 동물에서 6주의 면역화 기간내 두드러진 역가는 전혀 전개되지 않았다. 또한, 0일째에 조합된 항체로 처리된 동물은 42일째 이들이 염수 또는 또 다른 투여량의 h1F1 및 h3D1을 수용한 것과는 무관하게 42일째에 파상풍 항원으로의 대항에 반응하지 않았다. 0일째에 염수를 수용하고 42일째에만 h1F1 및 h3D1을 수용한 동물의 코호트에서, 파상풍에 대한 이차 항체 반응의 평균 역가는 염수 대조군 코호트에서 관찰된 평균 역가보다 낮았다. h1F1 및 h3D1으로 처리된 동물의 모든 코호트를, h1F1 및 h3D1의 혈청 수준이 검출가능한 한계보다 낮은 경우에 마지막 투여후 112일 후에 제 3 투여량의 파상풍 항원으로 다시 면역화시켰다. 이 시점에서, 동물은 일차 또는 이차 항체 반응과 유사하게 나타난 동태를 갖는 항파상풍 항체를 형성시키므로써 반응하였다. 이러한 데이터는 B7-1 및 B7-2를 항-B7-1 및 항-B7-2로 블록킹시킴에 의한 공동자극의 억제가 이차 항체 반응을 감소시킬 뿐만 아니라 파상풍에 대한 일차 항체 반응을 극적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 면역화 억제로부터의 회복을 보여주며, 이는 파상풍에 대한 장기간 내성이 이 연구에서 달성되지 않았음을 시사한다.
재료 및 방법
시험 및 대조 항목:
항-B7-1(h1F1)
항-B7-1 항체를 느린 IV 주입에 의해 인간 이외의 영장류에게 투여하였다. 처리된 군중 각각의 동물은 연구 0일째 및/또는 42일째에 10mg/kg을 수용하였다.
항-B7(h1D1)
항-B7-2 항체를 느린 IV 주입에 의해 인간 이외의 영장류에게 투여하였다. 처리된 군중 각각의 동물은 연구 0일째 및/또는 42일째에 10mg/kg을 수용하였다.
염수 대조군:
염수(주입용 9% 염화나트륨)를 느린 IV 주입에 의해 인간 이외의 영장류에게 투여하였다. 염수 대조군 및 군 B 및 C의 각각 동물은 연구 0일째 및/또는 42일째에 15ml의 염수를 수용하였다.
정제된 파상풍 독소 항원:
파상풍 독소 항원(University of Massachusetts Medical Center, Biologic Lavoratories)을 0일째에 투여하였다. 모든 동물을 염수 또는 항체 투여후 90분 후에 근육내(IM) 주입에 의한 10 서출한계 단위(LfU) 및 피내(ID) 주입에 의한 1Lf단위로 면역화시켰다. 42일째에, 모든 동물을 염수 또는 항체 투여후 90분에 IM 주입에 의한 10Lf 단위로 면역화시켰다. 84일째에, 모든 동물을 파상풍 특이적 지연 타입 과민성(DTH)에 대한 시험을 하기 위해 ID 주입에 의해 1 Lf 단위로 주입하였다. 군 B, C 및 D의 동물을 마지막 투여(제 2 면역화) 후 112일에 IM 주입에 의한 10Lf 단위로 세번씩 면역화시켰다.
실험 디자인:
12마리의 파상풍을 앓지 않은 4-6kg의 수컷 사이노몰구스 마카쿠에스(Macaca fasicularis)를 군당 세마리의 4개의 실험군으로 나누었다.
군 A: 0일째 및 42일째에 파상풍 독소를 근육내 10Lf 단위(서출한계 단위)로 2회 면역화시켰다.
군 B: 0일째에 파상풍 독소를 근육내 10Lf 단위로 주입하기 적어도 90분 전에 각각의 인간화된 10mg/kg의 항-B7-1(1F1) 및 항-B7-2(3D1)을 정맥내 투여하였다; 파상풍 독소 면역화는 42일째 및 112일째에만 (mAb 사전처리없이) 이루어졌다(일차 면역화로 공동자극 차단).
군 C: 0일째에만(mAb 사전처리없이) 파상풍 독소 면역화를 수용하였다; 42일째 및 154일째에 근육내 파상풍 독소를 10Lf 단위로 주입하기 적어도 90분 전에 각각의 인간화된 10mg/kg의 항-B7-1 및 항-B7-2을 정맥내 투여하였다(이차 면역화로 공동자극 차단).
군 D: 0일째에 근육내 파상풍 독소를 10Lf 단위로 주입하기 적어도 90분 전에 각각의 인간화된 10mg/kg의 항-B7-1(1F1) 및 항-B7-2(3D1)을 정맥내 투여하였다; 42일째에 근육내 파상풍 독소를 10Lf 단위로 주입하기 적어도 90분 전에 각각의 인간화된 10mg/kg의 항-B7-1 및 항-B7-2을 정맥내 투여하고, 154일째에 (mAb 사전처리 없이) 파상풍 독소 면역화를 이루었다(일차 및 2차 면역화로 공동자극 차단).
모든 군은 0일째 및 42일째에 파상풍 면역화를 수용하였다. 군 B, C 및 C는 항-B7 투여후 112일에 제 3의 파상풍 면역화를 수용하였다(표 8).
표 8: 처리군
| 군N=3/군 | 일차 파상풍 면역화0일 | 이차 파상풍 면역화42일 | 삼차 파상풍 면역화0일 |
| A염수 대조군 | 염수 | 염수 | 없음 |
| B일차 면역화 후 항-B7 | 항 B7-1/B7-210mg/kg IV 거환 | 염수 | 112일 |
| C이차 면역화 후 항-B7 | 염수 | 항 B7-1/B7-210mg/kg IV 거환 | 154일 |
| D일차 및 이차 면역화후 항-B7 | 항 B7-1/B7-210mg/kg IV 거환 | 항 B7-1/B7-210mg/kg IV 거환 | 154일 |
모든 군은 0일째 및 42일째에 파상풍 면역화를 수용하였다. 군 B, C 및 C는 항-B7 투여후 112일에 제 3의 파상풍 면역화를 수용하였다.
항파상풍 항체 ELISA:
96-웰 ELISA 플레이트를 4㎍/ml로 파상풍 독소로 코팅하였다. 혈청 샘플의 4-로그(four-log) 역가를 1:100에서 출발하여 수행하였다. 파상풍에 결합하는 Ab를 단일클론성 항인간 IgG와 다클론성 염소 항-RH IgM HRP 컨쥬게이팅된 항체를 조합하여 검출하고, TNB 기질로 전개시켰다.
결과 및 논의:
도 22는 파상풍 독소로 면역화되고 항-B7-1과 항-B7-2 mAb를 조합하여 처리된 원숭이의 항파상풍 IgM + IgG 반응을 보여준다.
사이노몰구스 원숭이를 염수, 또는 10mg/kg 항-B7-1 항체(h1F1)과 10mg/kg 항-B7-2 항체(h3D1)를 조합하여 IV 주입에 의해 투여하였다. 항체 또는 염수 주입 90분 후에, 각각의 동물을 10Lf 단위의 정제된 파상풍 독소로 IM 주입에 의해, 1Lf 단위를 ID 주입에 의해 면역화시켰다. 항파상풍 항체 역가를 매주 측정하였다. 염수 대조군에서, 항파상풍 항체의 평균 로그 역가는 14일까지는 기준선 위로 증가하였고, 49일에 피크였으며, 연구내내 기준선보다 높이 상승되어 유지되었다(도 22). 0일째에 h1F1와 h3D1를 조합하여 수용한 군(군 B 및 D)에서, 처리된 6마리중 어느 것도 42일까지는 두드러진 항파상풍 항체 역가를 가지지 않았다. 42일째에 파상풍 독소로 재자극시킨 경우, 군 B의 동물들은 추가의 항-B7 항체를 전혀 수용하지 못했음에도 불구하고 파상풍에 대한 두드러진 항체 반응을 취하지 않았다(도 22). 혈청분석에서는 상당 수준의 h1F1 및 h3D1이 42일째에 혈청에 잔류(평균 혈청 농도 > 10mg/ml)함을 보여주었다. 군 D의 동물은 파상풍 독소로 재면역화하기 전에 42일에 h1F1 및 h3D1 둘 모두의 또 다른 주입을 수용하였다. 이 군에서 세마리 동물 모두가 연구내내 검출가능한 한계 미만으로 존재하는 항파상풍 역가를 가졌다. 군 C에서, 0일째에 염수를 수용하고 42일째에만 h1F1 및 h3D1을 수용한 동물들은 염수 대조군(군 A)과 유사한 일차 항파상풍 항체 반응을 가졌다. 그러나, 군 C의 이차 반응에서 관찰된 평균 항체 역가는 군 A의 이차 반응에서 관찰된 평균항체 역가보다 낮았다(도 22).
h1F1 및 h3D1의 혈청 농도를 연구내내 모니터링하였으며, 이들 농도가 검출가능한 한계보다 낮은 경우, 군 B, C 및 D를 파상풍 독소로 세번씩 면역화시켰다. 각 군을 마지막 항-B7 항체 주입 후 112일째에 다시 면역화시키고, 추가의 항-B7 항체 처리는 수용하지 않았다. 이 시점에서, 모든 군의 동물은 일차 항체 반응과 유사하게 나타난 동태를 갖는 항파상풍 항체 생성에 의해 반응하였다(도 22).
결론:
이들 데이터는 항-B7-1 및 항-B7-2 항체로 B7-1 및 B7-2를 블록킹함에 의한 공동자극의 억제는 파상풍에 대한 이차 항체 반응을 감소시킬 뿐만 아니라 일차 항체 반응을 극적으로 억제시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 이들 데이터는 면역억제로부터의 회복을 보여주며, 이는 파상풍에 대한 장기간 내성이 이 연구에서 달성되지 않았음을 시사한다.
따라서, 새로운 항원 (파상풍 면역화)에의 노출과 동시에 항-B7 항체의 투여는 새로운 항체 반응을 방지할 수 있으며, 동일한 항원에 대한 2차 반응을 경감시킬 수 있다. 많은 질환 상태가 이러한 항체의 발달에 의해 악화되기 때문에, 항-B7 mAb와 결합한 치료가 이러한 항체의 발달을 방지할 수 있다. 하나의 이러한 질환 상태는 혈우병 환자에서 투여된 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ에 대한 저해 항체의 발달과 그에 따른 이들 생명 구제 화합물의 효능의 경감이다. 항-B7 mAb를 사용한 혈우병 환자의 치료는 저해제 항체의 형성을 방지하거나 감소시킨다.
실시예 19: 파상풍 독소 접종 사이노몰구스 원숭이 모델에서 0.01, 0.1, 또는 10 ㎎/㎏ 투여량으로 조합하여 또는 단독으로 투여한 항-B7-1(h1F1) 및 항-B7-2(h3D1)의 약동학
개요:
사이노몰구스 원숭이에서, 항-B7-1(h1F1) 또는 항-B7-2(h3D1)를 단독으로, 또는 항-B7-1(h1F1) 및 항-B7-2(h3D1)를 조합하여 여러 투여량으로 사용하여 파상풍에 대한 일차 또는 이차 (기억) 반응을 저해하는 능력을 측정했다. 사이노몰구스 원숭이 (총 개체수 n=33)에 h1F1 및 h3D1를 조합하여 10, 1, 0.1 또는 0.01 ㎎/㎏의 정맥내 투여량으로, h1F1 또는 h3D1을 단독으로 10, 1, 또는 0.1 ㎎/㎏의 정맥내 투여량으로, 또는 대조 비히클을 투여했다. 모든 원숭이를, h1F1 및 h3D1 투여 후 1시간 후에 정제 파상풍 독소로 면역화시켰다. 원숭이를 14주째에 파상풍 독소로 다시 면역화시켜 h1F1 및 h3D1 수준이 검출 수준 미만으로 떨어진 경우에 정상적인 면역 기능이 회복되었는지를 측정했다.
일차 항-파상풍 항체반응의 완전한 억제가, h1F1 및 h3D1를 조합한 10 또는 1 ㎎/㎏의 단일 Ⅳ 투여량 이후에 관찰된 반면에, 0.1 ㎎/㎏의 투여량은 단지 부분적인 억제만을 가져왔다. h1F1 또는 h3D1의 단독 투여는 항-파상풍 항체반응의 억제 있어, 동일 투여량의 h1F1 및 h3D1 조합체 만큼 효과적이지는 못했다. 모든 군내의 모든 원숭이가, 파상풍 독소를 사용한 이차 면역화 후, 즉 h1F1 및 h3D1의 농도가 검출 미만(<50 ng/mL)으로 떨어진 후에 높은 항-파상풍 항체 역가를 생성했다. 이는 정상적인 면역기능이 h1F1 및 h3D1 처리의 중단 후에 회복되었으며, 파상풍에 대한 장시간의 내성이 본 연구에서 달성되지 않았음을 제시한다.
재료와 방법:
동물에 대해 표 9에 따라 0일째에 시험 및 대조 (비히클) 물질을 단일 Ⅳ 투여량으로 투여했다. 시험 및 대조 물질을 주사기 펌프 세트를 사용하여 0.1 ml/min/kg (최대 투여량 속도가 1mg/min/kg)으로 말초 정맥을 통해 주입했다. 0일째 t=1시간에서, 모든 동물에 정제 파상풍 독소(Massachusetts Biologic Laboratories, UMass, Jamaica Plain, MA)를 IM 주입에 의한 10 Lf 유닛 (응집 한계) 및 ID 주입에 의한 10 Lf 유닛의 용량으로 투여했다. t=14 주째에 모든 동물에 정제 파상풍 독소를 IM 주입에 의한 10 Lf 유닛 및 ID 주입에 의한 10 Lf 유닛의 용량으로 2차 투여했다. 혈액 샘플을 투여 후 3024시간 (126일)에 이를 때까지 특정 시점에서 정맥천자를 통해 수집했다. 항-파상풍 항체 (IgM 및 IgG)의 혈청 수준을 ELISA를 사용하여 측정했다.
표 9 군명 및 용량 수준
| 군 | 동물의 수 | 항체의 투여량 수준 (mg/kg) | 시험 항원 |
| 1 | 3 | 0 | 투여된 비히클 |
| 2 | 3 | 10 | h1F1 |
| 3 | 3 | 1 | h1F1 |
| 4 | 3 | 0.1 | h1F1 |
| 5 | 3 | 10 | h3D1 |
| 6 | 3 | 1 | h3D1 |
| 7 | 3 | 0.1 | h3D1 |
| 8 | 3 | 10a | h1F1 및 h3D1 |
| 9 | 3 | 1a | h1F1 및 h3D1 |
| 10 | 3 | 0.1a | h1F1 및 h3D1 |
| 11 | 3 | 0.01a | h1F1 및 h3D1 |
항-파상풍 항체 제형:
비히클로 처리한 모든 동물이 검출가능한 항-파상풍 항체 역가를 면역화 후14일부터 생성했다(표 10, 도 23, 24, 및 25). h1F1 및 h3D1를 조합하여 두개의 최고 투여량(10 또는 1 mg/kg)으로의 처리한 결과, 검출가능한 항체 역가의 형성이 모든 동물에서 14주의 관찰기간내에 완전히 억제되었다. 항체 반응의 부분적인 억제가 0.1 mg/kg으로 처리한 동물에서 관찰되었으며, 3마리의 동물중 하나가 검출가능한 항체 역가를 생성했다. h1F1 및 h3D1를 조합하여 0.01 mg/kg으로 처리한 모든 동물이, 검출가능한 항체 역가를 생성했으나, 이 역가는 비히클 대조군에서 관찰된 것과 비교하여 매우 낮았다. 이는 어느 정도 항체 반응의 억제가 달성되었음을 제시한다.
표 10. h1F1 및 h3D1으로 처리하는 동안, 파상풍 독소를 사용하여 일차 접종한 후, 검출가능한 항-파상풍 역가를 생성시킨 사이노몰구스 원숭이의 마리수
| 군 | 처리 | 검출가능한 역가를 생성시킨 동물의 마리수 |
| 1 | 비히클 대조 | 3 |
| 2 | 10 mg/kg h1F1 | 1 |
| 3 | 1 mg/kg h1F1 | 3 |
| 4 | 0.1 mg/kg h1F1 | 2 |
| 5 | 10 mg/kg h3D1 | 1 |
| 6 | 1 mg/kg h3D1 | 1 |
| 7 | 0.1 mg/kg h3D1 | 3 |
| 8 | 10 mg/kg h1F1 및 h3D1 | 0 |
| 9 | 1 mg/kg h1F1 및 h3D1 | 0 |
| 10 | 0.1 mg/kg h1F1 및 h3D1 | 1 |
| 11 | 0.01 mg/kg h1F1 및 h3D1 | 3 |
0.1, 1, 및 10 mg/kg 투여량 군을 함께 고려하는 경우, h1F1 (도 24) 또는 h3D1 (도 25)를 단독으로 처리한 것은, h1F1 및 h3D1을 조합하여 처리한 것 만큼 효과적이지는 못했다. h1F1의 단독 처리 (군 2, 3, 및 4)는 6/9(66%)의 검출가능한 항-파상풍 항체 반응을 지닌 동물을 가져왔다. h3D1의 단독 처리(군 5, 6, 및 7)는 5/9(55%)의 검출가능한 항체를 지닌 동물을 가져온 반면에, h1F1 및 h3D1을조합하여 처리 (군 8, 9, 및 10)한 후에는, 단지 1/9(11%)의 동물만이 검출가능한 항체를 가졌다. 군 11은 h1F1 및 h3D1이 개별적으로 0.01 mg/kg에서 투여된 것이 아니므로 상기 대비에서 제외했다.
1 및 10 mg/kg에서, h1F1 및 h3D1를 조합하여 처리한 동물 중 어느 것에서도 검출가능한 항-파상풍 항체 반응이 없었으나, 이들 투여량 모두에서, h1F1 또는 h3D1를 단독으로 처리한 동물에서는 검출가능한 항체가 존재했다. 동물이 0.1 mg/kg으로 처리되는 경우, 모든 세개의 처리군의 동물에서 검출가능한 항-파상풍 항체가 존재했으나, 조합하여 처리한 군 (1/3)이 h1F1 (2/3) 또는 h3D1 (3/3) 군에서 보다 발생수가 더 적었다.
도 26은 각각의 처리군에 대한 항-파상풍 역가 곡선(AUC) 하의 영역을 도시한다. 이들 AUC 값은 도 23, 24, 및 25에 도시된 항체 역가 곡선을 사용하여 계산했다. 상기 AUC 값은 0 내지 14주에 계산했다. 각 군에서 반응하는 동물의 수를 측정하기 위해, AUC 값을 각 군에서 검출가능한 항체 역가를 생성시킨 동물의 수의 분획으로 가중시켰다. 이러한 플롯은 14주의 관찰 기간을 통한 항체 역가 또는 항체 반응 강도의 누계를 제시한다. h1F1 및 h3D1을 조합하여 10 또는 1 mg/kg으로 처리한 동물 (군 8 또는 9)은, 대조군과 비교하여 항체 반응을 100% 억제했다. h1F1 및 h3D1을 조합하여 0.1 또는 0.01 mg/kg으로 처리한 동물 (군 10 또는 11)은 대조군과 비교하여 항체 반응을 각각 78% 또는 86% (AUC = 402 또는 253 로그 역가ㆍ시간) 억제했다. h1F1 또는 h3D1을 단독으로 처리한 동물 (군 2-7)에서, 항체 반응은 대조군과 비교하여 8.6% 내지 99% (AUC = 1640 내지 5.04 로그 역가ㆍ시간)억제되었다. 이들 데이타는 h1F1 또는 h3D1을 단독으로 처리한 것이 항-파상풍 항체 반응을 억제함에 있어, h1F1 및 h3D1를 조합하여 같은 양으로 사용한 것 만큼 효과적이지 못함을 제시했다.
h1F1 및 h3D1의 투여 14주 후에 파상풍 독소를 사용하여 재면역화시킨 후, 군내의 모든 동물이 높은 항-파상풍 항체 역가(>3 로그 역가)를 생성했으며, 이는 h1F1 및 h3D1를 사용한 처리의 중단 이후에 정상적인 면역기능이 회복되었음과파상풍에 장기간의 내성이 본 연구에서는 달성되지 않았음을 나타낸다. h1F1 및 h3D1를 조합하여 10 mg/kg으로 처리된 동물은, 검출기능한 항체 역가를 지닌 지연된 항체 반응이 일차 항체 반응과 유사함을 보였고, 이것은 일차 면역화에 대한 반응이 완전이 차단됨을 지시한다. 모든 다른 동물은 면역화 후 7일 후에 증가된 항체 역가를 나타냈으며, 이는 일차 반응 보다는 기억 반응에 보다 더 가까왔다.
결론:
일차 항-파상풍 항체 반응의 완전한 억제가, h1F1 및 h3D1를 조합하여 10 또는 1 mg/kg의 단일 Ⅳ 투여량 후에 관찰된 반면, 0.1 mg/kg의 투여량은 단지 부분적인 억제만을 가져왔다. h1F1 또는 h3D1 단독으로 처리한 것은, 항-파상풍 항체 반응을 억제함에 있어 h1F1 및 h3D1를 조합하여 동량으로 처리한 것 만큼 효과적이지 못했다. 모든 군내의 모든 동물은, h1F1 및 h3D1 농도가 검출 미만으로 내려간 후, 파상풍 독소를 사용하여 제 2차 면역화시킨 이후에 높은 항-파상풍 항체 역가를 생성했다. 이것은 정상적인 면역기능이 h1F1 및 h3D1를 사용한 처리의 중단 이후에 회복됨을 제시한다.
실시예 20: 인간을 제외한 영장류에서의 항-B7 항체의 혈청 반감기
뮤린-항-hB7-1 및 뮤린-항-hB7-2 mAb를 인간을 제외한 영장류에서 혈청 반감기 및 표적세포 포화도에 대해 시험했다. 세마리의 사이노몰구스 원숭이에 대해 항-hB7-1 및 항-hB7-2 mAb를 조합하여 각각 체중 1 kg당 2, 8, 또는 20 mg의 mAb의 1회 투여량으로 투여했다. 원숭이들을 PBMC (증식성 혈액 모노뉴클리어 세포)에 대한 mAb 결합, 혈청 mAb 농도, 및 영장류 항-마우스 항체 (PAMA) 반응에 대해 분석했다 (표 11). PBMC 포화도를 유세포분석 (FACS)으로 측정하거나(여기서, mAb 용량 투여된 영장류로부터 단리한 PBMCs를 염소-항-뮤린 Ig-PE (% 생체내)로 염색하였다), PBMC를 먼저 항-hB7-1 및 항-hB7-2 mAb와 반응시킨 다음 염소-항-뮤린 Ig-PE (% 생체외)로 측정했다. 여러 시간에서 PBMC 포화도의 수준을 (% 생체내/% 생체외)×10으로 계산하였다. 이러한 연구는, 항-hB7-1 및 항-B7-2 mAb에 대한 PBMC 포화도가, mAb 투여량에 따라 4 내지 6일 (mAbs@2mg/kg), 6 내지 8일 (mAbs@8mg/kg), 및 13 내지 20일 (mAbs@20mg/kg)에 80% 미만으로 떨어짐을 제시했다. 비록 직접적으로 측정된 것은 아니나, 순환하는 B7+세포의 수의 극적인 감소는 없었다.
항-hB7-1 및 항-hB7-2 mAb의 혈청 반감기를, 각각의 mAb에 대해 검출을 위한 표적 및 염소 항-뮤린 Ig HRP/ABTS로서 hB7-1Ig 또는 hB7-2Ig를 사용하여 특이적 ELISA로 측정했다. 이들 분석은 항-hB7-2 및 항-hB7-1 각각에 대해 400 ng/mL 및 200 ng/mL의 감도였다. PAMA 시판중인 키트를 사용하여 측정했다. 두개의 항-hB7mAb 및 PAMA 반응의 혈청 농도를 각각의 mAb에 대한 개별 투여량 수준에서 제시했다. 두개의 mAb 모두가 모든 3개의 투여량 수준에서 유사하게 ~48 시간의 혈청 반감기를 나타냈다. mAb 용량의 증가는, 시험된 모든 용량 및 시간에서 상당한 정도로 혈청 mAb 농도를 증가시켰다. 20 mg/kg으로 투여된 경우, >30 ㎍/mL의 순환 mAb 수준이 투여 후 6일째에 각각의 mAb에 대해 발견되었다.
항-hB7-1 및 항-hB7-2 mAb에 대한 PAMA 반응은 낮았으며, 혈청 mAb 수준이 10 ㎍/mL 미만으로 내려간 후 최초 10일째부터 시작하여 측정할 수 있었다.
또한, 인간화된 항-인간 B7-2 및 B7-1 항체의 혈청 반감기를, 인간화된 항 B7-2 항체 10 mg/kg으로 1회 투여한 사이노몰구스 원숭이 (n=6)에서 측정했다. 혈청 농도를 각각의 항체에 대해 HRP-항 인간 IgG2 및 ABTS를 사용하여 특이적 ELISA로 측정했다.
도 27은 투여 후 42일 동안의 사이노몰구스 원숭이중의 인간화된 B7-2 및 인간화된 B7-1의 혈청 농도를 제시한다.
인간화된 항-인간 B7-2 및 항-인간 B7-1 mAb는, 동일한 수준으로 투여된 뮤린 항-인간 B7-2 및 항-인간 B7-1 mAb에 대한 반감기가 약 2일인 것과 비교할 때, 사이노몰구스 원숭이에서 연장된 혈청 반감기를 나타내며, 이것은 인간화된 항-인간 B7 mAb가 뮤린 항-B7 mAb 보다 더 오랜 기간 순환중에 보유됨을 입증했다.
표 11. 전임상 영장류 연구의 결과
실시예 21. 초항원(superantigen)(독소쇽 증후군 유발독소-1; TSST-1)에 대한 특이적 T-세포 반응의 저해
노드시드(NODscid) 마우스를 108인간 PBLs를 투여하여 인간 림프구를 지니도록 사육했다. 28일 후, 마우스를 인간 B7-1 및 B7-2에 대한 항체 조합체로 처리하거나 (500 mg, I.V.) 처리하지 않고 TSST-1(10mg, I.P.)로 처리했다. 추가로 14일 후에, 복막안의 인간 림프구, T-세포, 및 TSST-1 특이적 T-세포 (Vβ2-TCR-세포)를 인간 CD45, CD4, 및 인간 Vβ2-TCR에 대한 특이적 항체를 사용하는 FACS로 측정했다.
표 12
| 첨가 | 인간 T-세포 (%) | ||
| TSST-1 | 항-B7-1 + 항-B7-2 | 총 | Vβ+ |
| - | - | 10.2 | 3.9 |
| + | - | 27.4 | 12.0 |
| + | + | 23.4 | 3.8 |
결과:
표 12는 hu-노드시드 마우스의 복막안의 총 인간 T 세포 및 Vβ+-TCR 인간 T 세포 (TSST-1 특이적)의 비율을 나타낸다. TSST-1의 처리는 hu-노드시드 마우스내의 인간 T 세포 및 TSST-1 특이적 인간 T 세포 (Vβ2+)의 퍼센트를 크게 증가시켰다. 항-인간 B7-1 및 B7-2 mAb로 처리한 것은 총 인간 T 세포 반응을 천천히 감소시키고, TSST-1 특이적 인간 T 세포의 발현을 완전히 저해했으며, 이는 항-B7 mAb가 인간 T 세포 초항원 매개 반응을 효과적으로 저해할 수 있음을 제시한다.
실시예 22: 사이노몰구스 원숭이 내의 생명지지 신장 이식 모델내에서의 항-B7 항체 h1F1(항-B7-1) 및 h3D1(항-B7-2)의 평가
요약:
이 연구는 사이노몰구스 원숭이 내의 생명지지 신장 이식 모델 내에서 단일 클론 항체 h1F1 (항-B7-1) 및 h3D1 (항-B7-2)의 유효성 및 양립성을 평가하기 위한 것이다. 이러한 항체들의 유효성 및 양립성은 단일요법으로서 뿐만 아니라 사이클로스포린 A(CsA), 라파마이신, 스테로이드와 같은 종래의 면역억제제와 함께 사용되는 경우에 평가하였다.
24마리의 수컷 사이노몰구스 원숭이에게 혈액형이 양립가능하고, 혼합 림프구 반응(MLP)이 일치되지 않는 신장 동종이계 이식편을 수용시켰다. 수용자를 6개 처리군내에서 연속적으로 조사하였는 데, 외과 수술 후(poDay) 최초 56일 동안 면역억제제를 처리하고 나서, 추가적 처리 없이 추가로 65-66일(최대 총 119-120일기간) 동안 관찰하였다:
군 1에는 계획 A에 따라 혼합된 항-B7 항체를 수용시켰다: 외과 수술 전에 h1F1 20 mg/kg + h3D1 20 mg/kg을 처리하고 나서, 외과 수술 후에 h1F1 5 mg/kg 및 h3D1 5 mg/kg을 처리하고, poDay 56일까지 7일 간격으로 9회의 투여시점에 h1F1 5 mg/kg 및 h3D1 5 mg/kg을 처리하였다.
군 2에는 계획 B에 따라 혼합된 항-B7 항체를 수용시켰다: 외과 수술 전에 h1F1 5 mg/kg + h3D1 5 mg/kg을 처리하고 나서, 외과 수술 직후에 h1F1 10 mg/kg 및 h3D1 10 mg/kg을 처리하고, poDay 3일에 처리하고, poDay 7일부터 poDay 56일까지 일주일 간격으로 8회의 연속 투여시에 각 항체를 5 mg/kg 투여하였다.
군 3에는 미소유제(microemulsion) CsA에 더하여 계획 A에 따라 혼합된 항-B7 항체를 수용시켰는 데, 상기는 poDay 0일로부터 poDay 14일까지 24시간 최저치의 농도가 200 내지 300 ng/mL에 도달하도록 계획된 투여량으로 투여하고 나서, poDay 15일부터 최종 투여시 poDay 56일까지 24시간 CsA 최저치가 150 내지 250 ng/mL가 되도록 계획된 투여량으로 투여하였다.
군 4에는 감소되는 투여량의 스테로이드와 함께 계획 A에 따라 혼합된 항-B7 항체(h1F1 및 h3D1)를 투여하였다: 외과 수술 후에 메틸프레드니솔론 2 mg/kg Ⅳ을 투여하고 나서, poDay 2일까지 매일 투여하고, 프레드니손을 0.2 mg/kg에 도달할 때까지 0.5 mg/kg에서 0.05 mg/kg씩 감소시켜 매 3일 간격으로 투여하고, poDay 56일까지 0.2 mg/kg을 계속 투여하였다.
군 5에는 라파마이신과 함께 계획 A에 따라 혼합된 항-B7 항체(h1F1 및h3D1)를 투여하였다: 외과 수술 후에 라파마이신 1 mg/kg을 투여하고 나서, poDay 13일을 지날 때까지 매일 투여하고, 그 후 poDay 56일까지 0.5 mg/kg을 매일 계속 투여하였다.
군 6에는 미소유제(microemulsion) CsA를 투여하였는 데, poDay 0일로부터 poDay 14일까지 24시간 최저치의 농도가 200 내지 300 ng/mL에 도달하도록 계획된 투여량으로 투여하고 나서, poDay 15일부터 최종 투여시 poDay 56일까지 24시간 CsA 최저치가 150 내지 250 ng/mL가 되도록 감소된 투여량으로 투여하였다.
군 7에는 라파마이신 1 mg/kg을 poDay 0일부터 poDay 13일까지 투여하고, 그 후 poDay 14일부터 poDay 56일까지 0.5 mg/kg을 투여하였다.
크레아틴 수준이 최종 신장 거부의 증거로서 해석되는 8.0 mg/dL 초과로 증가하는 경우 동물을 안락사시켰다.
이식되고 처리된 사이노몰구스 원숭이의 생존이 표 13에 기록되어 있다.
표 13. 이식되고 처리된 사이노몰구스 원숭이의 생존 및 진단
| 처리군 | 처리 계획항-B7-1 + 항-B7-2/기타 치료제 | 생존(poDay)* |
| 히스토리컬 대조군 | 없음 | 10 |
| 1 | 계획 A/없음 | 9, 48, 119, 119 |
| 2 | 계획 B/없음 | 12, 14, 18, 120 |
| 3 | 계획 A/CsA | 96, 119, 119, 119 |
| 4 | 계획 A/스테로이드 | 6, 77, 111, 119 |
| 5 | 계획 A/라파마이신 | 69, 73, 81, 114 |
| 6 | mAbs 없음/CsA | 22, 25, 38, 71 |
| 7 | mAbs 없음/라파마이신 | 11, 18, 27, 35 |
* 119/120일까지 생존한 신장 수용자는 연구 프로토콜을 위해 희생되었다.
이 연구 결과는, 인간 이외의 영장류의 동종이계 신장 이식 수용자를 B7-1및 B7-2 단일 클론 항체의 혼합물로 처리하면 장기간의 이식 생존에 이르게 된다는 것을 나타낸다. 군 1의 동물 50%내에서 처리 종결 후 최대 66일 동안 이식 생존이 관찰되었다. 대조적으로, 군 2내에서 사용된 계획 B에 따라 투여된 항체는 처리되는 4개체 동물 중 3개체에서 초기에 발생하는 급성 거부 발작을 극복하기에는 충분하지 못하고, 이 군 중 오직 1개체 동물만이 120일까지 생존하였다. 계획 A와 미소유제 CsA의 조합은 상술된 항체의 유효성에 길항적 면역억제 효과를 나타내지 않고 모든 동물을 장기간 생존하게 하였다. 군 4에서, 항체와 높은 투여량의 스테로이드의 동시 투여가 이러한 인간외 영장류 모델내에서 면역억제 효과에 길항적이지 않았다. 군 5에서, 항체와 라파마이신의 동시 투여가 이러한 인간외 영장류 모델내에서 면역억제 효과에 길항적이지 않았다. 군 6에서, 단지 CsA만으로의 처리는 대부분의 신장 수용자에서 초기 거부를 초래하였다. 이러한 처리군의 결과는 단지 항-B7 항체(군 1)만으로 처리하거나, 항체 + CsA(군 4)의 혼합 처리로 얻어진 것에 비하여 열등하였다. 군 7에서, 라파마이신 단독으로의 처리는 모든 신장 수용자에서 초기 거부를 초래하였다. 이러한 처리군의 결과는 단지 항-B7 항체(군 1)만으로 처리하거나, 항체 + 라파마이신(군 5)의 혼합 처리로 얻어진 것에 비하여 열등하였다.
따라서, 단일 클론 항체 h1F1 및 h3D1은 인간외 영장류의 생명지지 신장 이식 모델내에서의 초기의 말기적 거부를 회피하는 데 유효하다. 항체는 다른 면역억제제와 양립가능하고, 그 유효성은 그것을 미소유제 CsA, 라파마이신 또는 스테로이드와 혼합함으로써 증가되는 것으로 보인다.
하기 연구는 2개 측면으로 나누어진다. 제 1 측면의 목적은 신규한 면역억제 항체 h1F1 및 h3D1이 생명지지 모델내로 신장 이식편을 수용하는 사이노몰구스 원숭이에 단일요법으로서 주어지는 경우 그 유효성을 규명하는 것이다. 면역억제 처리가 동시에 이루어지지 않고 이식된 동물은 이식일로부터 10일 이내에 그 이식을 거부한다. 연구는 2개의 상이한 항체 치료 계획을 시험하도록 고안되었다. 항체 처리는 poDay 56일 이후에는 두 계획 모두에서 불연속이었고, 동물을 이식 거부가 일어날 때까지 또는 119-120일까지 관찰하였다.
이 연구의 제 2측면은 a) h1F1 및 h3D1이 CsA, 라파마이신 또는 스테로이드와 혼합하여 주어지는 경우 CsA, 라파마이신 또는 스테로이드의 면역억제 효과에 길항작용을 하여 이식 생존을 단축시키는가, 또는 b) CsA, 라파마이신 또는 스테로이드가 치료가 동시에 이루어지는 경우(poDay 0일 내지 poDay 56일) 동안 또는 이후 모든 면역억제 치료가 중단된 동안(>poDay 56일)에 h1F1 및 h3D1의 면역억제 효과에 길항작용을 하는가를 시험하기 위하여 고안되었다.
재료 및 방법:
동물:
체중 5 내지 5 kg의 수컷 사이노몰구스 원숭이, 식갑각류 마카크(Macaca fascicularis)를 이 연구에 사용하였다. 동물의 혈액형을 선정하였다. 공여자 및 수용자 원숭이를 ABO 혈액형 시험, 음성 교차 시험(negative cross-match), 쌍방향 MLR에서의 2.5 이상의 자극 지수에 기초하여 짝을 지웠다.
시험 및 대조물:
h1F1 및 h3D1:
항-B7 항체를 주사 펌프에 연결된 주사기에 주입하였다. h1F1 및 h3D1은 항상 혼합하였고, 말초 정맥 카테테르를 통하여 1 mg/kg/min의 최대 주입 속도로 주사하였다.
항체는 각 군에 대하여 정의된 상이한 프로토콜에 따라 주사하였다.
미소유제 CsA(네오럴: Neoral):
미소유제 CsA(네오럴; 100 mg/mL (Novartis))를 실온으로 유지하고 일광 노출에 대하여 보호하였다. 요구되는 투여량(mg/kg으로)에 기초하여 계산된 부피의 네오럴을 최소의 적당한 주사기내로 도입시키고, 희석 없이 비강영양 튜브를 통하여 직접 위내로 주사하였다.
메틸프레드니솔론 및 프레드니손:
메틸프레드니솔론(Solu-Medrol, Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo, MI)을 복원용 자체함유 살균수와 함께 약병으로 제공하고, 제조자의 지시에 따라 복원하였다. 약물을 복원 후에 냉동으로 유지하고, 48시간 후에 방출하였다.
프레드니손(Mutual Pharmaceutical Co., Inc., Philadelphia, PA)을 정제(5 mg)로 제공하였다. 정제를 물 5 mL 당 하나의 정제로 살균수에 용해시키고 최종 용액 농도가 1 mg/mL가 되도록 하였다. 잔류 약물을 각각의 날에 투여가 끝난 후 방출하였다.
실험 고안:
총 24개체의 원숭이에게 생명지지 모델내로 일측성 신장 이식을 수용시켰다.
군 1: h1F1 및 h3D1 단일요법(계획 A):
군 1에 계획 A에 따라 항-B7-1 + 항-B7-2 항체의 혼합물을 단일요법으로 주입하였다: 외과 수술 전에 h1F1 20 mg/kg + h3D1 20 mg/kg을 투여하고 나서, 외과 수술 후에 h1F1 5 mg/kg 및 h3D1 5 mg/kg을 투여하고, poDay 56까지 반복하여 매 7일마다 h1F1 5 mg/kg 및 h3D1 5 mg/kg을 투여하였다.
군 2: h1F1 및 h3D1 단일요법(계획 B):
계획 A 및 B 사이의 주된 차이는 계획 B에서는 외과 수술 전의 제 1 투여량이 20 mg/kg에서 5 mg/kg으로 감소하고, 외과 수술 직후에 5 mg/kg에서 10 mg/kg으로 증가하며, poDay 3일에 추가로 10 mg/kg을 투여한다. 외과 수술 후 투여 계획의 나머지는 계획 A와 동일하다. 따라서, 외과 수술 후에 각 동물에 주어지는 총 항체량은 계획 A 및 B에서 동일하다.
군 3: CsA에 더하여 h1F1 및 h3D1 (계획 A):
군 3에서, 항체 처리(계획 A)는 매일 미소유제 CsA의 경구 투여와 결합된다. 군 3은 미소유제 CsA에 더하여 계획 A에 따라 항체가 투여되는 데, poDay 0일부터 poDay 14일까지는 24시간 최저치 농도가 200 내지 300 ng/mL가 되도록 계획된 투여량으로 투여하고, poDay 15일부터 최종 투여시인 poDay 56일까지는 24시간 CsA 최저치 농도가 150 내지 250 ng/mL가 되도록 감소된 투여량으로 투여한다.
미소유제 CsA는 개비지(gavage)를 통한 짧은 케타민 진정작용에 이어서 개비지를 통해 투여하였다. CsA의 24시간 최저치를 일주일에 3회 측정하고, 매일의 투여량을 조정하여 목표 CsA 최저치를 맞추었다.
군 4: 스테로이드에 더하여 h1F1 및 h3D1 (계획 A):
군 3에서, h1F1 및 h3D1을 점차 감소하는 스테로이드와 혼합하여 계획 A에 따라 투여하였다: 외과 수술 후에 메틸프레드니솔론 2 mg/kg Ⅳ를 투여하고 나서, poDay 2일까지 매일 투여하고, 그 후 프레드니손을 0.5 mg/kg으로부터 0.2 mg/kg에 도달할 때까지 매 3일마다 0.05 mg/kg씩 감소시켜 투여하고 나서, poDay 56일까지 그 투여량을 유지하였다.
외과 수술 후 최초 3일 동안(poDay 0 내지 poDay 2), 동물에게 메틸프레드니솔론 2 mg/kg을 큰 환약으로 정맥내로 투여하였다. poDay 3일로부터 poDay 56일까지, 케타민 진정된 동물에게 0.5 mg/kg에서 출발하여 0.2 mg/kg으로 종결되는 감소되는 계획(도 4 참조)에 따라 개비지를 통하여 프레드니손을 투여하였다.
군 5: 라파마이신에 더하여 h1F1 및 h3D1 (계획 A):
군 5에서, h1F1 및 h3D1을 라파마이신과 혼합하여 계획 A에 따라 투여하였다: 외과 수술 후에 라파마이신 1 mg/kg을 투여하고 나서, poDay 13일을 지날 때까지 매일 투여하고, 그 후 0.5 mg/kg을 poDay 56일까지 매일 유지하였다.
군 6: CsA 단독:
군 6에서, 미소유제 CsA가 투여되는 데, poDay 0일부터 poDay 14일까지는 24시간 최저치 농도가 200 내지 300 ng/mL가 되도록 계획된 투여량으로 투여하고, poDay 15일부터 최종 투여시인 poDay 56일까지는 24시간 CsA 최저치 농도가 150 내지 250 ng/mL가 되도록 감소된 투여량으로 투여한다.
미소유제 CsA는 개비지(gavage)를 통한 짧은 케타민 진정작용에 이어서 개비지를 통해 투여하였다. CsA의 24시간 최저치를 일주일에 3회 측정하고, 매일의 투여량을 조정하여 목표 CsA 최저치를 맞추었다. 지나친 체중 손실을 막거나 또는 신장 기능의 손상이 CsA의 최저치와 관련이 있다고 생각되는 경우에 추가적인 CsA 투여량을 조정하였다.
군 7: 라파마이신:
라파마이신은 개비지(gavage)를 통한 짧은 케타민 진정작용에 이어서 개비지를 통해 투여하였다. 군 7에는 라파마이신을 투여하되, poDay 0일부터 poDay 13일까지는 1 mg/kg으로 투여하고, poDay 14일부터 poDay 56일까지는 0.5 mg/kg으로 투여한다.
결과 및 토의:
히스토리컬 제어군: 아무 처리없는 신장 이식
히스토리컬 데이타는 아무 처리없이 신장 이식된 사이노몰구스 원숭이가 한결같이 이식 후 10일 이내에 이식된 신장을 거부함을 나타낸다.
군 1: 계획 A에 따른 h1F1 및 h3D1의 단일요법:
계획 A에 따라 혼합된 항-B7-1 + 항-B7-2로 처리된 4개체 중 2개체는 연구 기간이 끝날 때(120일)까지 기능성 동종이계 이식편을 보유한 반면, 다른 2개체는 처리 기간 중(9일 및 48일)에 이식된 신장을 거부하였다. 따라서, 계획 A에 따라 처리된 4개체의 신장 수용자 중 3개체가 히스토리컬 대조군보다 길게 이식된 신장을 보유하였고, 이것은 이식된 신장의 거부를 막는 항-B7 치료법의 유효성을 설명하는 것이다.
군 2: 계획 B에 따른 h1F1 및 h3D1의 단일요법:
군 1과 대조적으로, 계획 B에 따라 항-B7 항체로 처리된 4개체 중 단지 1개체만이 poDay 18일이 지나도록 이식된 신장을 보유하였다. 그러나, 이 동물은 연구 기간이 끝날 때(poDay 120)까지 이식된 신장을 보유하였다. 이 데이타는 계획 A에 따른 항-B7 mAbs의 처리가 계획 B에 따라 처리된 동물보다 신장 거부에 대해 보다 나은 면역억제를 일으킨다는 것을 제시한다. 이 결과는 계획 A에 따라 처리된 동물에 있어서 이식 후에 초기 존재하는 항-B7 mAbs의 농도가 보다 높은 것에 기인한다.
군 3: 미소유제 CsA에 더하여 계획 A에 따라 h1F1 및 h3D1으로 치료:
CsA와 혼합하여 계획 A에 따라 항-B7 mAbs로 처리된 모든 동물은 4개체 중 3개체가 연구가 끝날 때(poDay 119)까지 기능성 동종이계 이식편을 보유함으로써 이식된 신장의 거부를 크기 지연시키는 것을 보였다. 이러한 결과는 항-B7 mAbs 단독(군 1)으로 또는 CsA 단독(군 6)으로 처리된 후에 얻어진 결과에 비해 우수하였으며, 이것은 항-B7 mAbs + CsA에 의한 처리 사이에 길항작용이 없고 이러한 시약에 의한 동시처리가 기관 거부를 지연시키는 추가적 이점이 있음을 나타낸다.
군 4: 메틸프레드니솔론/프레드니손에 더하여 계획 A에 따라 h1F1 및 h3D1으로 치료:
스테로이드에 더하여 항-B7 mAbs로 처리된 4개체의 동물 중 하나가 연구 기간이 끝날 때(poDay 119)까지 이식된 신장을 보유하였다. 나머지 3개체의 신장 수용자 중에서, 2개체가 이식된 신장에 대해 지연된 거부를 보였다. 세번 째 원숭이는 높은 투여량의 스테로이드의 투여와 관련이 있는 것으로 믿어지는 요관 괴사로 인해 일찌기(poDay 6) 이식된 신장을 거부하였다. 종합하면, 이러한 데이타는 항-B7 mAbs + 스테로이드의 혼합이 이식된 신장의 거부를 막는 데 효과적이고, 이러한 혼합된 시약의 사용이 금기시 되지 않는다는 것을 나타낸다.
군 5: 스케쥴 A에 따른 h1F1 및 h3D1과 라파마이신을 사용한 치료
스케쥴 A에 따른 항-B7 mAbs와 라파마이신을 병용하여 치료한 4마리 동물 모두 수술후 65일 내지 114일의 기간 동안 치료 기간 이상으로 기능적인 신장 동종이식편을 보유하였다. 이것은 항-B7 mAbs와 라파마이신의 병용 치료가 장기 거부반응을 지연시키는데 유리하고 항-B7 mAbs 단독 치료에 길항하지 않음을 증명하였다.
군 6: CsA 단독 치료
CsA 단독으로 치료한 4마리 동물 모두 이식된 신장에 대해 거부반응을 일으켰고, 4마리중 3마리는 CsA 치료 기간 동안 거부반응을 일으켰다. 이 결과는 항-B7 mAbs와 라파마이신을 병용하여 치료한 동물에서 얻어진 결과 보다 나빴다.
군 7: 라파마이신 단독 치료
라파마이신 단독으로 치료한 4마리 동물 모두 치료 기간 동안 이식된 신장에 대해 거부반응을 일으켰다.
결론:
본 시험의 목적은 생명 유지를 위한 인간 이외의 영장류 신장 이식 모델에서 신규한 모노클로날 항체 h1F1 및 h3D1의 효능 및 적합성을 평가하는 것이었다. 효능은 말기 급성 거부반응(terminal acute rejection)의 발생율 및 궁극적으로는 동종이식(동물) 생존율을 평가함으로써 평가하였다. 비치료된 동물에서 말기 거부반응은 사용한 모델에서 이식후 10일 내에 일어나는 것으로 예측된다. 적합성 및 효능은 전체 7개 치료군에서 시험하였다. 나중 군에 사용된 치료 계획은 시험이 진행됨에 따라 발달되었고 이전의 군의 결과에 기초하였다.
효능의 평가
군 1: h1F1 및 h3D1 단독요법(스케쥴 A)
제 1 치료군의 동물을 추가의 면역억제 요법 없이 h1F1 및 h3D1 만으로 56일간 매주 투약하여 치료하였다. 그 결과 h1F1 및 h3D1 단독요법이 이 군의 4마리 동물중 2마리에서 말기 급성 거부반응을 방지할 수 있고 수술후 48일까지 추가의 원숭이에서 말기 거부반응을 지연시킬 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 투여는 병력있는 대조군에서 나타난 것 이상으로 한 원숭이에서 이식 생존율을 지연시키지 않았다.
군 2: h1F1 및 h3D1 단독요법(스케쥴 B)
제 2 치료군에서 항체의 투약계획 및 스케쥴을 수술후 5일 내지 7일 사이에 군 1에서 나타난 조기 급성 거부반응 에피소드를 방지하도록 바꾸었다. 이 군에서 수술전 용량을 각 mAbs 20mg/kg에서 각 mAbs 5mg/kg으로 감소시켰고 수술후 최초 용량을 각 mAbs 5mg/kg에서 10mg/kg으로 증가시켰다. 따라서, 주술기(perioperative)에 투여된 항생제의 총량은 25mg/kg에서 15mg/kg으로 감소하였다. 수술후 3일째에 10mg/kg의 추가 용량을 투여하였다. 그 후에는, 군 1 및 군 2의 투약 스케쥴은 동일하였다.
4마리 동물중 3마리가 1차 거부반응 에피소드로부터 회복되지 않았다. 단지 1마리만이 전체적인 추적조사 기간 동안 생존하였다. 이것은 초기 주술기 및 수술후 기간 동안 항체의 투여시기 및 용량이 중요함을 증명하는 것이다. 주술기 용량의 감소는 아마 보다 심한 이식 거부반응을 초래하였을 것이고, 수술후 3일째에 추가 용량의 항체 투여는 이러한 결과에 영향을 미치지 않았다.
군 1 및 군 2 모두에서, 임의의 추가 면역억제 요법 없이 장기간 생존한 동물이 있었다.
스케쥴 A(군 1) 및 스케쥴 B(군 2)에 따른 이식 결과를 직접 비교한 결과 스케쥴 A가 권장되었다. 항체의 조합물을 스케쥴 A에 따라 다음 두 군에 투여하였다.
군 3: h1F1 및 h3D1(스케쥴 A)과 CsA
24시간 최저치를 200 내지 300ng/ml 범위로 전달시키기 위한 마이크로에멀션 CsA의 용량을 군 3에 투여하였다. 이 군의 모든 동물은 장기간(>56일) 생존하였고 4마리 동물중 3마리는 추적조사 기간의 종료시까지 말기 급성 거부반응의 증후를 나타내지 않았다. 따라서, 항-B7 항체도 CsA도 나머지 것의 효능에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 이 군에서 중앙 생존은 119일이었고 평균 생존은 113일이었고, 이는 군 1의 생존 기간(중앙치: 84일; 평균치: 74일)보다 우수하지는 않더라도 적어도 동등하게는 양호하였다. 이식 수용자에게 군 3에서와 유사한 최저치를 달성하도록 마이크로에멀션 CsA만을 투여하여(56일 동안) 치료한 추가 치료군(군 6)은 4마리의 이식 수용자 모두가 이식된 신장에 대해 거부반응을 일으켰고 4마리중 3마리가 치료 기간동안 거부반응을 일으킨 것으로 나타났다.
모노클로날 항체와 마이크로에멀션 CsA와의 조합물은 조기 급성 거부반응 에피소드를 피하는데 충분하였다.
군 4: h1F1 및 h3D1(스케쥴 A)와 스테로이드:
h1F1 및 h3D1의 조합물을 점점 감소하는 용량의 스테로이드와 함께 군 4에 투여하였다. 스테로이드 단독의 단독요법은 일반적으로 이 모델에서 말기 동종이식편 거부반응을 방지하기에 충분하지 않다. 이 군에 대하여 고용량의 스테로이드를 선택하여 스테로이드 및 항체가 서로의 효능에 영향을 미치는지 측정하였다. 항-B7 mABs+스테로이드를 병용하여 치료한 4마리 동물중 1마리가 시험 기간이 종료할 때까지(수술후 119일) 이식된 신장을 보유하였다. 나머지 3마리의 신장 이식자중에서, 2마리는 이식된 신장의 지연된 거부반응을 나타냈다. 세번째 원숭이는 고용량 스테로이드의 투여와 관련된 것으로 생각되는 수뇨관 괴사에 기인하여 조기(수술후 6일)에 이식된 신장을 거부하였다.
이 군에서 고용량의 스테로이드의 병용투여가 항체의 효능에 미치는 부정적인 영향은 없는 것으로 나타났다. 인간 이외의 영장류 신장 이식 모델에서 단독요법으로서 사용된 유사한 스테로이드 투약계획의 효능에 관한 이용가능한 데이터가 없기 때문에, 항체 투여가 스테로이드의 면역억제 효능에 영향을 미치는지는 명확하지 않다.
군 5: 스케쥴 A에 따른 h1F1 및 h3D1과 라파마이신을 사용한 치료
스케쥴 A에 따른 항-B7 mAbs와 라파마이신을 병용하여 치료한 4마리 동물 모두 수술후 69일 내지 114일의 기간 동안 치료 기간 이상으로 기능적인 신장 동종이식편을 보유하였다. 이것은 항-B7 mAbs와 라파마이신의 병용 치료가 장기 거부반응을 지연시키는데 유리하고 항-B7 mAbs 단독 치료에 길항하지 않음을 입증하였다. 군 5에서와 유사한 수준을 달성하도록 이식 수용자에게 라파마이신만을 투여하여 치료한 추가의 치료군(군 7)은 4마리 이식 수용자 모두가 치료 기간 동안 이식된 신장에 거부반응을 일으켰다.
군 6: CsA 단독 치료
CsA 단독으로 치료한 4마리 동물 모두 이식된 신장에 대해 거부반응을 일으켰고, 4마리중 3마리는 CsA 치료 기간 동안 거부반응을 일으켰다. 이 결과는 항-B7 mAbs와 라파마이신을 병용하여 치료한 동물에서 얻어진 결과 보다 나빴다.
군 7: 라파마이신 단독 치료
라파마이신 단독으로 치료한 4마리 동물 모두 치료 기간 동안 이식된 신장에 대해 거부반응을 일으켰다. 이 결과는 항-B7 mAbs와 라파마이신을 병용하여 치료한 동물에서 얻어진 결과 보다 나빴다.
실시예 23: B7-1 및 B7-2에 대한 모노클로날 항체를 사용한 유도 요법은 인간 이외의 영장류에서 신장 동종이식편 거부반응의 발현을 지연시킨다
요약
본 시험에서는, B7-1에 대한 모노클로날 항체(h1F1) 및 B7-2에 대한 모노클로날 항체(h3D1)의 단독 및 병용 투여가 붉은털 원숭이에서 급성 신장 동종이식편 거부반응의 발현을 지연시키는 능력에 대하여 시험하였다. 가장 영속적인 효과는B7 리간드 양자 모두를 동시 차단함으로부터 기인하였다. 작용 메카니즘은 T 또는 B 세포의 전체적인 소모와 관련되지 않았다.
재료 및 방법:
실험 계획:
MHC 타이핑 및 공여자-수용자 선택:
공여자-수용자 조합은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II에서 유전적인 비동일성에 근거하여 선택하였다. 이것은 변성 그래디언트 겔 전기영동(denaturing gradient gel electrophoresis) 및 주요 조직적합성 항원 HLA-DRB의 제 2 엑손의 직접 서열화에 의해 정해졌다. 모든 공여자-수용자 쌍에 대해 공여자에 대한 수용자의 T 세포 반응성을 혼합 림프구 반응(MLR) 검정을 사용하여 시험관 내에서 확인하였다. 각 동물을 모든 가능한 공여자에 대해 시험하여 이식에 대해 가장 적합한 쌍을 정하였다.
신장 동종이식:
신장 동종이식은 전술한 바와 같이 수행하였다[참조: Knechtle SJ, et al., Transplantation, 63:1-6(1997); Kirk AD et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:8789-8794(1997); Kirk AD et al., Nature Medicine, 5:686-693(1999)]. 간단히 언급하면, 원숭이 면역결핍증 바이러스 및 헤르페스 B 바이러스에 대해 혈청검사 음성인 무작위교배계 유년기 붉은털 원숭이(18 내지 36월령, 수컷)를 랩스 오브 버지니아, 인코포레이티드(LABS of Virginia, Inc., Yemassee, SC)로부터 입수하였다.
모든 절차는 전신 마취하에서 수행하였다. 신장 이식은 MHC 분석에 의해 결정된 유전적으로 상이한 공여자-수용자 쌍간에 수행하였다. 장기 채취 및 이식 동안 동물을 헤파린처리(100유닛/kg)하였다. 표준 미세혈관 기법을 사용하여 동종이식편을 이식하여 공여자 신동맥과 수용자 말단 대정맥 및 공여자 신정맥과 수용자 대정맥간에 측부 문합을 끝냈다. 그 후, 일차 요관방광문합술을 하였다. 폐쇄전에 양측 선천 신장 적출술을 완료하였다. 피부 봉합선은 7일 내지 10일 후에 제거하였다.
항-B7-1 및/또는 항-B7-2 항체를 후술된 용량으로 정맥내 투여하였다. 혈청 크레아티닌치 상승에 의해 측정되는 신부전시 또는 AAALAC 표준에 따라 이식전 체중의 15%의 체중 소실이 일어난 경우 동물을 안락사시켰다. 희생된 동물 모두에 대한 부검시 완전한 육안 및 조직병리학적 분석을 수행하였다.
결과 및 검토:
군 I: 대조 동물:
5마리 동물에게 거부반응을 방지하기 위한 어떠한 치료도 없이 신장 동종이식을 수행하였다. 5마리 모두 8일 이내에 급성 거부반응으로 이식편을 상실하였다(표 14, 도 28).
군 II: h1F1 단독요법
2마리 동물을 h1F1 만으로 치료하였다(표 14, 도 28). 이식편 재관류전에 시작하여 20mg/kg의 용량으로 항체를 투여하였다. 거부반응시까지 7일 마다 5mg/kg의 후속 용량을 투여하였다. 이들 두 동물은 8일 및 9일에 거부반응을 일으켜 경미한 이식편 생존 연장을 나타냈다.
군 III: h3D1 단독요법
2마리 동물을 h3D1 만으로 치료하였다(표 14, 도 28). 이식편 재관류전에 시작하여 20mg/kg의 용량으로 항체를 투여하였다. 거부반응시까지 7일 마다 5mg/kg의 후속 용량을 투여하였다. 이들 두 동물은 8일 및 28일에 거부반응을 일으켜 최소한의 이식편 생존 연장을 나타냈다.
군 IV: h1F1 및 h3D1 병용 요법:
4마리 동물을 h1F1 및 h3D1 모두로 치료하였다(표 14, 도 29). 이식편 재관류전에 시작하여 20mg/kg의 용량으로 항체를 투여하였다. 한 동물(AT48)에서, 이식 직후에 5mg/kg의 용량을 투여하였다. 모든 동물에서 5mg/kg 용량을 정해진 기간 동안 또는 거부반응시까지 7일 마다 투여하였다. 항체 투여는 군 IV에서 4마리 동물중 3마리에서 60일 후에 중지하도록 하였다. 한 동물은 80일까지 투여하였다(AC2B). 모든 동물은 47, 67, 227, 및 > 365일의 연장된 이식편 생존을 나타냈다. 한 동물은 이식후 1년의 시점에서 거부반응 없이 잘 생존하였다. 이 동물은 희생시키지 않았으나, 본 시험의 목적상 모니터링을 중지하였다. 거부반응을 일으킨 동물에서 희생 약 1주일 전에 크레아티닌이 기본치에서 상승하기 시작하였다.
h1F1 및 h3DD1 양자 모두를 사용한 병용 요법을 받은 동물은 군 I에 비해 현저하게 연장된 동종이식편 기능을 가졌다(p=0.016). 또한, 생존의 연장은 단독요법 군 둘 모두에 비해 병용 군에서 현저하게 증가하였다.
표 14 붉은털 원숭이의 생존 및 진단
| 이식 일자 | 군 | 치료 | 수용자 | 생존(수술후 일) |
| 1996.12.1 | I | 없음 | X9X | 5 |
| 1996.11.30 | I | 없음 | 1FE | 7 |
| 1996.11.15 | I | 없음 | T4T | 7 |
| 1997.4.2 | I | 없음 | 95052 | 8 |
| 1999.5.3 | I | 없음 | AT5H | 8 |
| 1998.11.2 | II | h1F1 | AC74 | 9 |
| 1999.2.10 | II | h1F1 | 2WN | 8 |
| 1999.2.3 | III | h3D1 | AT5J | 8 |
| 1999.2.16 | III | h3D1 | 2WF | 28 |
| 1998.10.26 | IV | h1F1+h3D1 | AC2B | >365a |
| 1998.10.28 | IV | h1F1+h3D1 | AC8V | 47 |
| 1999.3.1 | IV | h1F1+h3D1 | AT5P | 67b |
| 1999.3.2 | IV | h1F1+h3D1 | AT48 | 227b |
a수술후 치료 80일
b수술후 치료 60일
치료 계획 및 이식된 동물의 결과가 제시된다.
초기 용량으로 20mg/kg 후 5mg/kg, 그 후 매주 용량으로 60 내지 80일 동안 5mg/kg의 인간화된 항체를 투여하였다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및/또는 특허 출원의 교시는 그 전문이 본원에 참고문헌으로 삽입된다.
본 발명이 바람직한 양태를 참조하여 특정적으로 제시 및 기술되었지만, 당업자는 첨부된 청구범위로 포괄되는 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 표현 형식 및 세부사항에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
Claims (80)
- 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 포함하는, B7 분자에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린.
- 제 1항에 있어서, B7 분자가 B7-1 및/또는 B7-2 임을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 인간화된 B7-1 항체와 인간화된 B7-2 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 인간화된 B7-1 항체 및/또는 인간화된 B7-2 항체를 코드화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 포함하는, B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린.
- 제 5항에 있어서, 인간 기원의 면역글로불린의 일부가 인간 불변 영역으로부터 유래됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 6항에 있어서, 인간 불변 영역이 IgG 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 7항에 있어서, 인간 불변 영역이 면역글로불린의 이펙터 기능을 약화시킬 수 있는 돌연변이를 함유함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 8항에 있어서, 인간 불변 영역이 IgG2 불변 영역을 포함하고, 위치 234에 있는 발린 아미노산이 알라닌으로 치환되고/되거나 위치 237에 있는 글리신 아미노산이 알라닌으로 치환됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 7항에 있어서, IgG 불변 영역이 IgG4 불변 영역 및 IgG2 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 5항에 있어서, 항원 결합 영역이 설치류 기원을 지님을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 5항에 있어서, 항원 결합 영역이 설치류 기원의 상보성 결정 영역을 포함하고, 인간 기원의 면역글로불린의 일부가 인간 골격 영역으로부터 유래됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 12항에 있어서, 상보성 결정 영역이 1F1 모노클로날 항체로부터 유래됨을특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- ATCC 수탁 번호 PTA-263으로 수탁된 세포주로부터 유래된, B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린.
- 뮤린 1F1 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 인간 경쇄 골격 영역을 포함하는, B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린 경쇄.
- 제 15항에 있어서, 경쇄가 SEQ ID NO:28의 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린 경쇄.
- a) SEQ ID NO:27,b) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산,c) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 a) 또는 b)에 따른 핵산에 하이브리드화하는 핵산, 및d) a) 또는 b)에 따른 핵산의 상보서열인 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
- 1F1 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 인간 중쇄 골격 영역을 포함하는, B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
- 제 18항에 있어서, 중쇄가 SEQ ID NO:26의 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린 중쇄.
- a) SEQ ID NO:25,b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산,c) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 a) 또는 b)에 따른 핵산에 하이브리드화하는 핵산, 및d) a) 또는 b)에 따른 핵산의 상보서열인 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
- 제 5항의 인간화된 면역글로불린을 코드화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- a) 뮤린 1F1 모노클로날 항체로부터 유래된 항원 결합 영역을 코드화하는 제 1 핵산 서열; 및b) 인간 기원의 면역글로불린의 불변 영역의 일부 이상을 코드화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는, 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코드화하는 융합 유전자.
- B7-1 수용체를 함유하는 제 1 세포를 유효량의 제 5항의 인간화된 면역글로불린과 접촉시키는 것을 포함하여, 제 1 세포와 B7-1을 함유하는 제 2 세포의 상호작용을 억제시키는 방법.
- 치료적 유효량의 제 5항의 인간화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, 장기, 조직 또는 세포가 이식된 개체를 치료하는 방법.
- 치료적 유효량의 제 5항의 인간화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, B7-1에 의해 조절되는 질병을 치료하는 방법.
- (a) B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간 이외의 기원의 항체의 상보성 결정 영역을 결정하는 단계;(b) 단계 (a)에서 결정된 상보성 결정 영역을 이식시키기에 적합한 골격 영역 아미노산 서열을 지닌 인간 항체를 수득하는 단계; 및(c) 단계 (a)의 상보성 결정 영역을 단계 (b)의 인간 항체의 골격 영역내로 이식시킴으로써 B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함하여, 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 포함하는, B7-1에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 제조하는 방법.
- a) B7-1과 항-B7-1 항체 사이에 복합체가 형성되기에 충분할 정도로 샘플을B7-1에 대해 특이적인 인간화된 항체와 접촉시키는 단계, 및b) 복합체 형성의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플 중의 B7-1의 존재 여부를 결정하는 방법.
- 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 포함하는, B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린.
- 제 28항에 있어서, 인간 기원의 면역글로불린의 일부가 인간 불변 영역으로부터 유래됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 29항에 있어서, 인간 불변 영역이 IgG 불변 영역을 포함함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 30항에 있어서, 인간 불변 영역이 면역글로불린의 이펙터 기능을 약화시킬 수 있는 돌연변이를 함유함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 31항에 있어서, 인간 불변 영역이 IgG2 불변 영역을 포함하고, 위치 234에 있는 발린 아미노산이 알라닌으로 치환되고/되거나 위치 237에 있는 글리신 아미노산이 알라닌으로 치환됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 30항에 있어서, IgG 불변 영역이 IgG4 불변 영역 및 IgG2 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 28항에 있어서, 항원 결합 영역이 설치류 기원을 지님을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 28항에 있어서, 항원 결합 영역이 설치류 기원의 상보성 결정 영역을 포함하고, 인간 기원의 면역글로불린의 일부가 인간 골격 영역으로부터 유래됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- 제 35항에 있어서, 상보성 결정 영역이 3D1 모노클로날 항체로부터 유래됨을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린.
- ATCC 수탁 번호 CRL-12524로 수탁된 세포주로부터 유래된, B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린.
- 뮤린 3D1 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 인간 경쇄 골격 영역을 포함하는, B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린 경쇄.
- 제 38항에 있어서, 경쇄가 SEQ ID NO:8의 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린 경쇄.
- a) SEQ ID NO:7,b) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산,c) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 a) 또는 b)에 따른 핵산에 하이브리드화하는 핵산, 및d) a) 또는 b)에 따른 핵산의 상보서열인 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
- 3D1 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 인간 중쇄 골격 영역을 포함하는, B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 중쇄.
- 제 41항에 있어서, 중쇄가 SEQ ID NO:6의 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 인간화된 면역글로불린 중쇄.
- a) SEQ ID NO:5,b) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 코드화하는 핵산,c) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 a) 또는 b)에 따른 핵산에 하이브리드화하는 핵산, 및d) a) 또는 b)에 따른 핵산의 상보서열인 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
- 제 28항의 인간화된 면역글로불린을 코드화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- a) 뮤린 3D1 모노클로날 항체로부터 유래된 항원 결합 영역을 코드화하는 제 1 핵산 서열; 및b) 인간 기원의 면역글로불린의 불변 영역의 일부 이상을 코드화하는 제 2 핵산 서열을 포함하는, 인간화된 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코드화하는 융합 유전자.
- B7-2 수용체를 함유하는 제 1 세포를 유효량의 제 28항의 인간화된 면역글로불린과 접촉시키는 것을 포함하여, 제 1 세포와 B7-2를 함유하는 제 2 세포의 상호작용을 억제시키는 방법.
- 치료적 유효량의 제 28항의 인간화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, 장기, 조직 또는 세포가 이식된 개체를 치료하는 방법.
- 치료적 유효량의 제 28항의 인간화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, B7-2에 의해 조절되는 질병을 치료하는 방법.
- (a) B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간 이외의 기원의 항체의 상보성 결정 영역을 결정하는 단계;(b) 단계 (a)에서 결정된 상보성 결정 영역을 이식하기에 적합한 골격 영역 아미노산 서열을 지닌 인간 항체를 수득하는 단계; 및(c) 단계 (a)의 상보성 결정 영역을 단계 (b)의 인간 항체의 골격 영역내로 이식시킴으로써 B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 제조하는 단계를 포함하여, 인간 이외의 기원의 항원 결합 영역과 인간 기원의 면역글로불린의 일부 이상을 포함하는, B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린을 제조하는 방법.
- a) B7-2와 항-B7-2 항체 사이에 복합체가 형성되기에 충분할 정도로 샘플을 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 항체와 접촉시키는 단계, 및b) 복합체 형성의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플 중의 B7-2의 존재 여부를 결정하는 방법.
- a) 공여자로부터 세포를 수득하는 단계,b) 세포를, 내성을 유도시키기에 충분한 시간 동안, B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린, B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린 및 개체로부터의 수용 세포와 접촉시켜, 혼합물을 수득하는 단계, 및c) 혼합물을 개체에 삽입시키는 단계를 포함하여, 세포를 이를 필요로 하는개체에게 이식시키는 방법.
- 제 51항에 있어서, 공여자로부터의 세포가 골수 또는 혈액으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 51항에 있어서, 수용 세포가 림프구임을 특징으로 하는 방법.
- 제 51항에 있어서, 시간이 약 12시간 내지 약 96시간임을 특징으로 하는 방법.
- 제 54항에 있어서, 시간이 약 36시간 내지 48시간임을 특징으로 하는 방법.
- 제 55항에 있어서, 개체가 증식성 질병, 빈혈, 선천성 대사이상증, 선천성 면역결핍 질병, 및 골수 이형성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택된 질병에 걸려있음을 특징으로 하는 방법.
- 제 56항에 있어서, 증식성 질병이 백혈병, 림프종 및 암으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 57항에 있어서, 빈혈이 겸상적혈구 빈혈, 탈라세미아 및 재생불량성 빈혈로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 51항에 있어서, 개체에게 면역 반응을 조절하는 데에 사용되는 약물을 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 59항에 있어서, 약물이 메토트렉세이트, 라파마이신, 시클로스포린, 스테로이드, CD40 경로 억제제, 이식편 재이용 경로 억제제, IL-2 수용체 길항제 및 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 수용자에게 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린과 유효량의 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하여, 이식편 수용자를 치료하거나 이식편 수용자의 이식편 거부반응을 예방하는 방법.
- 제 61항에 있어서, 칼시뉴린 억제제, 스테로이드, 및 면역 세포의 성장을 정지시키는 면역억제제, 메토트렉세이트, CD40 경로 억제제, 이식편 재이용 경로 억제제, IL-2 수용체 길항제 및 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 칼시뉴린 억제제가 시클로스포린 A 또는 FK506 임을 특징으로 하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 스테로이드가 메틸 프레드니손 또는 프레드니손임을 특징으로 하는 방법.
- 제 62항에 있어서, 면역 세포의 성장을 정지시키는 면역억제제가 라파마이신임을 특징으로 하는 방법.
- 제 61항에 있어서, B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린이 약 1㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏의 양으로 투여되고, B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린이 약 1㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏의 양으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 66항에 있어서, B7-1에 대해 특이적인 면역글로불린과 B7-2에 대해 특이적인 면역글로불린이 수용자가 이식받은 당일에 투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 수용자가 이식받은 당일에, B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린이 약 1㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏으로 투여되고, B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린이 약 1㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 68항에 있어서, B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린과 B7-2에대해 특이적인 인간화된 면역글로불린이 수용자가 이식받은 후에 주기적으로 추가 투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 69항에 있어서, B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린과 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린이 수용자가 이식받은 후에 적어도 매주 추가 투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 70항에 있어서, 수용자가 이식받은 후에 적어도 매주, B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린이 약 1㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏으로 투여되고, B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린이 약 1㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏으로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
- 치료적 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 및/또는 치료적 유효량의 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질병, 감염성 질병, 염증성 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병, 췌도염, 천식, 관절염, 염증성 장 질환, 염증성 피부염, 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 질병에 걸린 개체를 치료하는 방법.
- 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 및/또는 유효량의 B7-2에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린을 캐리어에 함유된 형태로 투여하는것을 포함하여, 장기, 조직, 세포 등이 이식된 개체의 면역 반응을 조절하는 방법.
- 제 73항에 있어서, 장기, 조직, 세포 등이 이식된 개체의 면역 반응을 조절하는 데에 사용되는 약물을 투여하는 것을 포함하며, 이러한 약물이 메토트렉세이트, 라파마이신, 시클로스포린, 스테로이드, CD40 경로 억제제, 이식편 재이용 경로 억제제, IL-2 수용체 길항제 및 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 개체에게, 항원의 존재하에서, 유효량의 B7-1에 대해 특이적인 인간화된 면역글로불린 및/또는 B7-2에 대해 인간화된 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 항원에 대한 항체 반응을 감소시키는 방법.
- 제 75항에 있어서, 개체에게 항원을 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 75항에 있어서, 항원이 파상풍 독소, 인자 VIII, 인자 IX, 인슐린, 성장 호르몬, 및 유전자 전달 벡터로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 예를 들어 자가면역 질병, 감염성 질병, 염증성 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병, 췌도염, 천식, 관절염, 염증성 장 질환, 염증성 피부염, 및 다발성 경화증의 치료에 사용되는, 제 1항의 조성물을 포함하는, B7-1 및/또는 B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린의 용도.
- 세포, 조직 또는 장기를 개체에 이식시키기 위한 약제를 제조하는 데에 사용되는, B7-1 및/또는 B7-2에 대한 결합 특이성을 지닌 인간화된 면역글로불린의 용도.
- 포유동물에게서 항원에 대한 항체 반응을 감소시키기 위한 약제를 제조하는 데에 사용되는, 항원의 존재하에서 B7-1 및/또는 B7-2에 대한 결합 특이성을 지니는 인간화된 면역글로불린의 용도.
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