KR20010052174A - 사람 ｃｄ40에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

출원인은 gp39와 CD40간의 상호작용을 차단하는 새로운 키메릭 및 사람화 항-사람 CD40항체을 발견하였다. 본발명의 항-CD40 항체는 T세포-의존성 항원에 대한 체액성 면역반응을 조절하는데 효과적이며, 또한 항-면역원성 특성에 유용하다.

Description

사람 ＣＤ40에 대한 항체{ANTIBODIES AGAINST HUMAN CD40}

본발명은 gp39와 CD40간의 상호작용을 차단하는 새로운 키메릭 및 사람화 항-사람 CD40항체에 관한 것이다. 본발명의 항-CD40 항체는 T세포-의존성 항원에 대한 체액성 면역반응을 조절하는데 효과적이며, 또한 항-면역원성 특성에 유용하다.

면역/염증 반응을 복잡한 일련의 상호작용에 의해서 매개된다. 이러한 과정에서 주용한 것으로 보이는 하나의 수용체/리간드 쌍은 CD40/gp39이다. gp39/CD40간의 상호작용은 활성 T세포와 면역/염증 반응의 증폭을 선도하는 면역시스템의 다른 이펙터(effector)간의 다수의 중요한 신호전달을 매개한다. CD40을 통한 신호전달에 대한 반응은 체액성 면역 반응에서 T세포가 B세포를 도와 모노사이트에 의한 사이토키닌의 유도, 및 내피세포에 의한 분자의 부착을 발현시키는 것을 포함한다.

CD40은 유형 I세포의 표면 수용체이고 종양전이인자 수용체(TNFR) 수퍼유전자 군의 일원이다. CD40은 처음에 B세포로 확인되었음에도 불구하고, CD40은 현재 수지상 세포, 케라티노사이트 및 모노사이트를 포함하는 모든 항원 제공세포(APC)에서 발현되는 것으로 믿어진다. CD40은 또한 혈관상피세포와 같은 특정조건하에서 APC로 작용할 수 있는 세포유형 또는 갑상성 상피세포와 같은 T세포 또는 T세포 전구체와의 직접적인 상호작용에 관련된 세포에서 발현된다. 더욱 최근에는, 섬유아세포, 호산구 및 활성 T세포에 의해서 발현될 수 있음이 보고되었다. C40의 발현은 종양세포에서도 관찰된다. 이들에 대한 증거는 주로 CD40+ T세포를 갖는 몇몇 암종 및 흑색종의 동정에서 유래된다(Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. (1986) 83:4494-98; Schriever et al., J. Exp. Med. (1989) 169:2043-58; Caux et al., J. Exp. Med. (1994) 180:1263-72; Alderson et al., J. Exp. Med. (1 993) 178:669-74; Young et al., Int. J. Cancer (1989) 43:786-94; Paulie et al., Cancer Immunol. Immunother. (1985) 20:23-28; Denfeld et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:2329-34; Gaspari et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:1371-77; Peguet-Navarro et al., J. Immunol. (1997) 158:144-52; Hollenbaugh et al., J. Exp. Med. (1995) 182:33-40; Galy and Spits, J. Immunol. (1992) 149:775-82; Yellin et al., J. Leukoc. Biol. (1995) 58:209-16; Ohkawara et al., J. Clin. Invest. (1996) 97:1761-66). Gp39는 또한 CD40L, TRAP, T-BAM으로 알려져 있으며, CD154의 Leukocyte Workshop으로부터 공식적인 CD로 지겅되었다. 시험관내 분석에서, gp39는 T세포 활성화후에 약 2-4시간에 T세포상에 나타나며 약 6-8시간에 최고수준을 나타낸다. 그런 후에 단백질 수준은 빠르게 감소하고 자극후 24시간이 경과하면 탐지되지 않는다. gp39 발현은 또한 호산구 및 마스트 (mast) 세포에서 탐지된다 (Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6550-54; Hollenbaugh et al., EMBO J. (1992) 11:4313-21; Spriggs et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1543-50; Grafet al., Eur. J. Immunol. (1992) 22:3191-94; Covey et al., Mol. Immunol. (1994)31:471-84; Castle et al., J. Immunol. (1993) 151:1777-88; Roy et al., J. Immunol. (1993) 151:2497-2510; Gauchat et al., Nature (1993) 365:340-43; Gauchat et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25:863-65; Koshy et al., J. Clin. Invest. (1996) 98:826-37; Desai-Mehta et al., J. Clin. Invest. (1996) 97:2063-73).

CD40는 활성화된 T세포에 대한 기작을 제공하여 광범위한 면역/염증 반응을 조절하는 강력한 신호 수용체이다. gp39 리간드와 항-CD40의 재조합 형태로 행한 시험관내 및 생체내 연구에 의하면, 이 수용체를 통한 신호전달은 모든 알려진 CD40+세포의 세포반응을 유도하며, 그 결과는 세포유형마다 다를 뿐만 아니라 다른 수용체를 통한 동시적인 신호전달에 의해서 조절된다. 예를 들면 B세포에서 IL-10 수용체에에 의한 신호와 함께 CD40의 신호는 B세포 증식과 IgE 이소타입(isotype) 항체의 생산을 유도하고, IL-10수용체에서 온 신호와 함께 CD40의 신호는 B세포 증식과 IgG 이소타입 항체의 생산을 유도한다(Gordon et al., Eur. J. Immunol. (1987) 17:1535-38; Rousset et al., J. Exp. Med. (1991) 173:705-710; Jabara et al., J. Exp. Med. (1990) 172:1861-64; Gascan et al., J. Immunol. (1991) 147:8-13). gp39맥 CD40 신호전달은 CD80 및 CD86의 유도를 통한 세포성 면역반응, CD28에 결합하는 T세포 공동자극 분자 및 CTLA4에서 중요한 역할을 수행할 수 있다(Goldstein et al., Mol. Immunol. (1996) 33:541-52).

CD40/gp39수용체/리간드 시스템은 활성화 T세포와 면역시스템의 다른 세포간의 생산성 상화작용에 관련된 많은 시스템중 하나이다. 그러나, 다수의 보고에 의하면, 이러한 상호작용은 사람의 체액성 면역반응의 조절에 독특하고 핵심적임을 제시한다. 특히, gp39 발현 또는 구조상의 결합은 X-관련 하이퍼 IgM(X-HIM) 증후군으로 알려진 사람 면역결핍증의 원인이다. 이 면역결핍증은 감염된 개체가 IgM이소타입 이외의 다른 항체를 생산할 수 없는 것이 특징이며, 이러한 사실은 gp39와 CD40간의 생산성 상호작용이, 효과적인 체액성 면역반응을에 필수적임을 나타낸다(Allen et al., Science (1993) 259:990-93; Aruffo et al., Cell (1993) 72:291-300; Di Santo et al., Nature (1993) 361:54143; Fuleihan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90(6):2170-73; Korthauer et al., Nature (1993) 361:539-541; Notarangelo et al., Immunodef Rev. (1992) 3:101-22). 이와 같이, 최근자료에 의하면, CD40 분자상의 결함으로 사람의 비-X관련 HIM증후군을 야기시켰다. 유전자 녹아웃 기술을 사용하여 CD40 또는 gp39가 결핍된 마우스를 생산했다. 이들 마우스들은 HIM증후군과 동일한 특성을 갖는 표현형을 나타냈으며, 이는 마우스가 CD40 및 gp39간의 상호작용을 차단할 수 있는 항-CD40 또는 항-gp39 mAb에 의한 생체내 처리의 효과를 시험하기 위한 적합한 모델일 수 있음을 나타낸다(Kawabe et al., Immunity (1994) 1:167-78; Xu et al., Immunity (1994) 1:423-431; Renshaw et al., J. Exp. Med. (1994) 180:1889-1900; Castigli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:12135-39).

정상적인 마우스 및 햄스터 항-마우스 gp39 mAb(MR1)을 사용하여, 질병을 갖는 마우스에서 CD40/gp39 상호작용의 생체내 저해효과가 폭넓게 연구되었다(Foy, et al., J. Exp. Med.(1993) 178:1567-75). 세포성 면역반응에 의해서 매개되는 것을 포함하는 항체로 처리함으로써 몇몇 마우스의 면역질환을 저해함을 제시하였다. 항-gp39 로 처리하여 저해된 질병모델은 콜라겐 유도 관절염, 실험적 알레기르성 뇌척수염, 낭창 신염, 이식거부 및 숙주대 이식편 질병을 포함한다 (Durie et al., Science (1993) 261:1328-30; Berry, et al., unpublished; Gerritse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 93:2499-504; Mohan et al., J. Immunol. (1995) 154:1470-1480; Larsen et al., Transplantation (1996) 61:4-9; Hancock et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:13967-72; Parker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:9560-64; Durie, et al., J. Clin. Invest. (1994) 94:1333-38; Wallace, et al., unpublished). 세포성 면역반응의 증폭에 있어서 CD40/gp39의 역할은 CD40을 발현할 수 있는 활성화 T세포의 서브셋을 통한 직접적인 것과, 사이토키닌의 유도와 T세포 수용체인 CD28 및 CTLA-4에 결합하는 CD80 및 CD86과 같은 중요한 공동자극성 세포 표면분자의 발현을 통한 간접적인 것일 수 있다. 산소-유도 폐손상의 마우스 모델의 연구에 의하면, 상기 저해제의 항-염증성 효과를 설명할 수 있다. 생체내 염증에 대한 효과를 혈관상피세포 및 모노사이트상에서 CD40의 자극하여 세포 부착성 분자, 일산화질소, 매트릭스 메탈로단백질 분해효소 및 전염증성 사이토키닌의 발현을 설명할 수 있는 시험관내 연구에 의해서 제시된다(Kiener et al., J. Immunol.(1995) 155:4917-25; Malik et al., J. Immnol. (1995) 156:3952-60; Hollenbaugh et al. J. Exp.Med.(1995) 182:33-40).

원숭이에서 항-사람 gp39 mAb로 행한 연구에 의하면, 생체내에서 gp39와 CD40간의 상호작용을 저해하는 생물학은 영장류에서 유효한 면역억제제임을 나타낸다. 항-gp39 mAbs는 T-세포 의존성 항원에 대한 항체반응을 효과적으로 저해하고, 거부반응으로부터 동종이식편을 효과적으로 보호하므로, 설치류에서 나타난 것과 유사한 결과를 나타낸다.

종합적으로 상기연구에서, gp39-CD40간의 상호작용을 저해하는 작용제는 잠재적인 면역억제제 또는 항염증제일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 면역억제효과 또는 항염증효과를 제공하기 위해서 CD40/gp39간의 상호작용을 차단하는 효과적인 방법이 본기술분야에서 필요하다. 본발명의 목적은 gp39 및 CD40간의 상호작용을 차단하는 항체를 제공하는 것이다.

본발명의 또다른 목적은 CD4 및 gp39간의 상호작용을 차단하는데 효과적인 키메릭 항체를 제공하는 것이다.

본발명의 추가적인 목적인 CD40 및 gp39간의 상호작용을 차단하는데 효과적인 사람화(humanized) 항체를 제공하는 것이다.

본발명의 또다른 목적은 본발명의 항체, 키메릭 항체, 또는 사람화 항체를 투여함으로써 면역반응르 조절하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 피부 또는 다른 기관 이식뿐만 아니라, 어떠한 자기면역질환을 치료하는데 유용할 것이다.

발명의 요약

본발명은 gp39 및 CD40가의 상호작용을 차단하는 신규한 항체, 더욱 바람직하게는 키메릭 항-사람 CD40 단클론 항체(mAb)을 포함한다. 본발명의 일례에서, 특히 바람직한 키메릭 항-사람 CD40 mAb를 "chi220"이라 한다. chi220은 쥐의 가변영역과 사람의 카파 및 감마1 불변영역으로 이루어지는 키메릭 항체이다. 모 마우스 mAb와 같이 chi220은 CD40에 결합하며, 그 결과로 양-의존성 방식으로 T-세포 의존성 항원에 대한 체액성 면역반응을 효과적으로 차단한다.

또한, gp39 및 CD40간의 상호작용을 차단하는 사람화 항-CD40은 본발명의 보호범위내에 포함된다. 본발명의 일예에서, 사람화 항체를 F4라 한다; 또다른 일례에서 사람화 항체를 L3.17이라 한다. 본발명의 바람직한 사람화 항체는 사람의 중쇄(heavy chain) 가변영역과 경쇄(light chain) 가변영역 및 그안에 쥐의 CDR 이식을 포함한다.

본발명의 항-CD40 항체, 바람직하게는 여기에 기술된 사람화 키메릭 항체는 T-세포 의존성 항원, 콜라겐 유도성 관절염, 및 이식거부에 대한 체액성 면역반응을 조절하는 데 효과적이다. 본발명의 항-CD40, 바람직하게는 여기에 기술된 사람화 키메릭 항체는 또한 이들의 항염증적 특성으로 유용하다(이는 항-gp39에서 나타난 것과 유사하다).

본발명의 항체, 특히 항-CD40 키메릭 항체 chi220 및 항-CD40 사람화 F4 및 L3.17은 자기면역질환, 염증성 질환 및 이식을 포함하는 광범위한 치료적 응용을 가진다. 수개의 조직적합성 유형의 악성세포에서 CD40의 발현이 관찰되기 때문에, 항-CD40항체, 특히 본발명의 사람화 키메릭 항체의 잠재적인 종양학적 적용이 분명하다.

다음 약자가 본명세서에서 사용되며 본기술분야의 전문가에게 알려져 있다: APC(항원 제시세포); CDR(보체-결정 영역); CHO(중국 햄스터 난소); COS(아프리카 녹색 원숭이);CIA(콜라겐 유도성 관절염); Cmax(최대 혈청농도); DMARD(질병개질 항-류마티스 약물); ELISA(효소-연결 면역흡수 분석); EPT(최종점 농도); EU(엔도톡식 단위); Fab(항체결합 단편); FITC(플루오로이소티오시아네치트); Hu(사람화); h106-2(사람화 항-gp39 mAb); HAMA(사람 항-마우스 항체); im(근육내);KLH(키홀 림펫 헤모시아닌); mAb(단클론 항체); MTX(메토트렉세이트); OVA(오브알부민); PBS(포스페이트 완충 식염수); PCR(폴리머라제 사슬 반응); PE(피코에리쎄린); sc(피하); SDS-PAGE(소디움 도데실 설푸에트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동); SEC(크기 배제 크로마토그래피); SRBC(양 적혈구); STR(교반 탱크 반응기); TNF(종양전이인자); VL(항체 경쇄 가변영역); VH(항체 중쇄 가변영역).

본발명의 키메릭 항체(키메릭 항체 2.220)의 바람직한 경쇄를 코딩하는 핵산은 Americal Type cell collection에 기탁하여 기탁번호 ATCC-----를 수여받았다. 본발명의 키메릭 항체(2.220)의 바람직한 중쇄를 코딩하는 핵산을 ATCC에 기탁하고 기탁번호 ATCC----를 수여받았다.

본발명의 사람화 항체(사람화 항체 F4)의 바람직한 경쇄를 코딩하는 핵산을 Americal Type cell collection에 기탁하여 기탁번호 ATCC-----를 수여받았다. 본발명의 사람화 항체(F4 및 L3.17)의 바람직한 중쇄를 코딩하는 핵산을 Americal Type cell collection에 기탁하여 기탁번호 ATCC-----를 수여받았다. 본명세서에서 언급된 기탁물은 특허출원을 위한 미생물의 기탁에 관한 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 존속기간동안에 유지될 것이다. 이들 기탁물은 단지 본기술분야의 전문가에게 편의를 위해서만 제공될 것이며, 미국특허법 제 112조의 요구된 기탁이 허가되지 않는다. 기탁된 물질에 포함된 폴리뉴클레오타이드의 서열, 그이외에 이들에 의해서 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 참고문헌으로 본명세서에 병합되었으며, 본명세서에 기재된 서열과 상반되는 경우에 우선한다. 기탁물을 제조, 판대 또는 사룡을 위한 실시권이 허여될 수도 있으나 그러한 실시권이 여기서 부여되지는 않는다.

본출원에서 앞에 또는 뒤에서 언급한 모든 참고문헌은 그 전체로서 참고문헌으로 본명세서에 병합된다.

도 1은 항-사람 CD40 mAbs에 의한 라지(Raji)세포에 결합하는 sgp39의 저해를 나타낸다.

도 2는 계략적인 영장류 연구절차이다. 치료일수는 다이아몬드형으로 나타냈다. SRBC 및 KLH로 면역화는 직사각형 및 삼각형으로 각각 나타냈다. 2.36으로 처리된 동물은 1상이후에는 연구하지 않았고 1.106으로 처리한 동물은 2상이후에는 연구하지 않았다.

도 3은 영장류에서 항-SRBC 항체반응을 나타낸다. 도 3a는 IgM 항-SRBC 항체에 대한 분석결과를 나타낸다. 도 3b는 IgG 항-SRBC항체에 대한 분석결과를 나타낸다.

도 4a는 진하게 표시한 chi220의 경쇄 가변영역의 서열을 나타내고(SEQ ID NO:1), 도 4b는 진하게 표시한 chi220의 중쇄 가변영역의 서열을 나타낸다(SEQ ID NO:2). 도 4a 및 4b에 나타낸 서열은 사람화 주형으로 사용된 가장 동질성이 큰 사람 항체의 삽입된 시그널 서열을 나타낸다.

도 5는 본발명의 사람화 키메릭 항체를 시험한 시험관애 실험 결과를 나타낸다. 도 5a는 ELISA에 기반을 둔 분석에서 hCD40-mG2bh에 대한 chi220 및 h220v3의 결합을 나타낸다. 도 5b는 항-사람 CD40 mAbs와 함께 sgp39-매개 사람 B세포의 공동자극을 저해하는 것을 나타낸다.

도 6은 IgM 항-SRBC 항체반응을 나타낸다. 도 6a은 10, 40 또는 100 mg/kg의 chi220의 투여받은 원숭이로부터 얻은 결과를 나타낸다. 도 6b는 0.1 또는 1 mg/kg chi220을 투여받은 원숭이로부터 얻은 결과를 나타낸다.

도 7은 IgG 항-SRBC 항체반응을 나타낸다. 도 7a는 10, 40 또는 100 mg/kg의 chi220의 투여받은 원숭이로부터 얻은 결과를 나타낸다. 도 7b는 0.1 또는 1 mg/kg chi220을 투여받은 원숭이로부터 얻은 결과를 나타낸다.

도 8은 영장류에서 항-OVA 항체반응을 나타낸다. 도 8a은 IgM 항-OVA 항체에대한 분석결과를 나타낸다. 도 8b는 IgG 항-OVA 항체에 대한 분석결과를 나타낸다.

도 9은 영장류에서 항-KLH 항체반응을 나타낸다. 도 9a은 IgM 항-OVA 항체에대한 분석결과를 나타낸다. 도 9b는 IgG 항-KLH 항체에 대한 분석결과를 나타낸다.

도 10은 SRBC에 대한 IgG 항체반응을 억제하는 7E1-G1 및 7E1-G2b 항체의 능력을 비교한 것이다.

도 11은 7E1-G2b로 SRBC에 대한 항체반응의 저해의 양반응을 나타낸다.

도 12는 본발명의 키메릭 항체의 중쇄영역과 경쇄영역에 대한 발현벡터 지도를 나타낸다.

도 13은 본발명의 키메릭 항체의 중쇄를 발현할 수 있는 발현벡터에 대한 핵산서열(SEQ ID NO:5)를 제공한다. 사람의 항체의 삽입된 시그널서열의 개시 Met을 코딩하는 개시 ATG(핵산 1000-1002)는 진하게 표시했다. 밑줄그은 뉴클레오타이드 1057-1422(SEQ ID NO:13)은 본발명의 항체의 중쇄가변영역을 코딩하는 바람직한 핵산서열을 제공한다.

도 14는 본발명의 키메릭 항체의 경쇄를 발현할 수 있는 발현벡터에 대한 핵산서열(SEQ ID NO:6)를 제공한다. 사람의 항체의 삽입된 시그널서열의 개시 Met을 코딩하는 개시 ATG(핵산 1005-1007)는 진하게 표시했다. 밑줄그은 뉴클레오타이드 1065-1388(SEQ ID NO:14)은 본발명의 항체의 경쇄가변영역을 코딩하는 바람직한 핵산서열을 제공한다.

도 15는 쥐의 항-CD40 가변영역 및 사람의 주형 서열을 배열을 나타낸다. 쥐의 항-CD40 H 및 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열은 상동 사람 배선(胚線) 서열을 확인하기 위해서 사용된다. 잔기의 숫자 및 CDR(밑줄을 그어표시함)의 정의는 Kabat등에 기초하고 있다(Kabat, E.A. et al. (1991)) Sequences of proteins of immunological interest(5th Ed.) Washinton DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A., et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616). 서열상의 차이는 수직선으로 표시했고, 조합발현(combinatorial expression) 라이브러리에서 특징인 부분은 별표로 표시했다.

도 16은 고정화 항체상에서 사람화 사람-CD40 변이체의 농도를 나타낸다. 박테리아에서 발현되는 키메릭 항-CD40 Fab및 각각의 상기 라이브러리에서 선택된 변이체를 특성화한다. 키메릭(채워진 원형), Hu I-19C11(원형), Hu II-CW43(빈 네모), Hu III-2B8(채워진 삼각형), 및 관계없는 Fab(채워진 네모)을 15ml 박테리아 배양액의 원형질막 주위공간으로부터 유리시키고 일련의 희석액을 마이크로 티터 플레이트상에 고정화된 CD40-Ig항원으로 배양하였다. 아래에 기술한 방법으로 항체결합을 정량화한다.

도 17은 항체친화성과 CD40-Ig에 결합하는 수용성 gp39의 저해와의 관계를 나타낸다. CD40 수요체, 즉 gp39에 대한 리간드를 마이크로티터 플레이트에서 잡았다. 이어서, 여러가지 양의 정제된 키메릭(채워진 원형), Hu I-19C11(원형), Hu II-CW43(빈 네모), Hu III-2B8(채워진 삼각형), 및 관계없는 Fab(채워진 네모)를 마이크로티터 플레이트상에서 2㎍/ml CD40-Ig으로 함께 배양하였다. gp39에 대한 CD40-Ig의 결합을 다음에 기술한 방법으로 정량화하였다.

도 18은 활성 변이체에서 쥐의 골격잔기의 정량화를 나타낸다. 골격 최적화 라이브러이 Hu I(A) 및 골격/HCDR3 최적화 라이브러리 Hu II(B)로부터 얻어진 대부분의 활성 항-CD40변이체의 가변영역에 대한 서열분석을 행하여 골격 라이브러 위치에서 아민노산을 확인하였다. 8 골격 라이브러리 위치에 남아있는 쥐의 잔기 전체숫자에 기초하여 각각의 독특한 변이체를 범주화하였다. Hu I라이브러리로부터 34 클론 및 Hu II라이브러리로부터 14개 클론을 서열분석한 결과, 24변이체 및 10변이체 각각을 동정하게 되었다. 굵은선(solid line)은 동일한 수의 임의선택된 변이체로부터 예상된 서열분포를 나타낸다.

본발명자는 면역억제특성을 갖는 사람화 키메릭 항-사람 CD40항체를 개발했다. 이러한 항-사람 CD40 항체는 치료제로서 명백한 적용을 갖는다. 본발명자들은 또한 면역질환 및 염증성 질환을 갖는 다수의 마우스 모델에서 항-CD40 mAb 치료효과 연구에 유용한, 밀접하게 맞추어지는 항-마우스 CD40 mAb(항-사람 CD40 mAb에 가깝게 맞는)은 개발하였다. CD40이 강력한 신호전달분자라는 사실때문에 항-CD4항체의 개발은 복잡하다. CD40/gp39 상호작요을 차단하는 능력뿐만 아니라 CD40 신호전달을 자극하는 능력에 기초하여 이 항원에 결합하는 항체를 분류했다.

CD40/gp39 상호작용을 차단하는 출원인의 항-사람 CD40 mAb는 광범위한 패널의 항-CD40 mAbs로부터 선택되었다. 2.220로 라벨링된 항체는 키메릭 및 사람에 맞추어진 것이다. "키메릭" 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함한다; 경쇄는 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역으로 이루어지고; 중쇄는 중쇄 가변영역과 중쇄 불변영역으로 이루어진다. 키메릭 항체는 한 종의 가변영역과 다른종의 불변영역을 포함한다(예컨대, 사람의 불변영역에 결합된 마우스의 가변영역)(미국특허 제4,816,397 및 제 4,816,567호를 참조할 것). 각각의 경쇄 가변영역(VL) 및 중쇄 가변영역(VH)은 "보체 결정영역" 또는 "CDR"로 불리오는 3개의 초가변영역으로 중단된 "골격(framework)"영역으로 이루어진다. "사람화(humanized)" 항체는 공여자 마우스 또는 래트의 면역글로불린의 CDR과 결합된 사람의 골격영역을 갖는 항체를 포함한다(미국특허 제 5,530,101을 참조할 것). 본명세서에 기술된 쥐의 가변사슬의 CDR를 포함하는 사람화 항체도 본발명의 보호범위에 포함된다.

항체를 사람화하는 가장 간단한 방법은 사람골격상에 공여자의 mAb의 CDR를 이식하는 것으로 이루어진다(Jones, P.T., et al., (1986) Nature 321: 522-525). 그러나, 어떤 골격 잔기는 CDR골격를 지탱하고, 사람의 골격주형상의 쥐 CDR의 이식된 항체의 접촉은 얻어진 사람화 mAb의 결합활성을 감소시킬 수 있다(Foote, J., et al., (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499). 구체적 골격 잔기가 항체친화성에 대한 잠재적인 기여을 분석하는 것은 두가지 문제점을 가진다. 첫째, 구체적인 mAb에 대해서는, 친화성과 특이성을 유지하는에 핵심적인 역할을 하는 골격 잔기를 예측하는 것이 어렵다. 둘째로, 모 mAb 와 사람 주형간에 차이가 있는 골격위치에 대해서는, 쥐의 모 mAb 또는 사람주형중 어디에서 유래된 아미노산이 더 활성인 mAb을 얻는 지를 예측하기가 어렵다. 결론적으로, 골격적 예측에 전적으로 의존적인 항체 사람화 방법은 항상 성공하는 것은 아니다.

종래기술은 항체 가공기술을 기술하고, 사람화에 이은 항체결합활성의 유지 어려움을 개시하고 있다(Rosok, M. J., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618). 모 mAb와 사람주형간에 차이가 있는, 잠재적으로 중요한 골격잔기의 특징은 문제의 골격위치에서 모든 가능한 조합의 모아미노산과 주형아미노산을 포함하는 조합 항체 라이브러리를 한 단계로 합성하고 발현하는데 있다. 최적 골격구조를 나타내는 변이체를 스크리닝으로 확인한 후에, DNA서열분석에 의해서 최적 골격 구조를 결정한다. 일반적으로, 다수 활성 클론의 서열분석결과, 특별한 아미노산의 발현을 필요로 하는 핵심적인 골격 위치를 나타낸다. 역으로, 라이브러리 골격 위치에서 활성 클론에서 동등한 빈도로 사람 아미노산 또는 쥐 아미노산이 발현된다는 것은 구체적 골격 위치에 대해 덜 중요한 기능과 일치한다. 따라서, 모 mAb의 결합활성을 유지하는 사람화 항체는 기능적 결합에 기초하여 빠르게 동정한다.

항체 사람화 및 친화성 성숙 과정은 별개의 단계로 종종 수행된다(Rosok (1996), 상기문헌; Yelton, D.E., et al., (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Wu, H., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042; Baca, M., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684; Marks, J.D., et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010). 다음에 기재된 변형된 방법을 사용하여, 키메릭 Fab와 같거나 더 좋은 활성을 나타내는 쥐 mAb 2.220의 다중 사람화 버젼을 생성하였다.

본발명의 키메릭 항-CD40항체를 "Chi 220"이라 한다. 출원인의 가장 밀접하게 짝을 형성하는 항-마우스 CD40 mAb를 "7E1"이라 한다. 출원인의 사람화 항-CD40항체를 "F4" 및 "L3.17"이라 한다.

7E1의 두가지 다른 이소타입 변이체를 제조하였다. 이들 두 변이체는 면역질환 및 염증성 질환의 전임상 모델에서 항-CD40 mAb 치료에 있어서 상기 분자의 Fc 부분의 역할을 조사하는데 유용하다. chi220 특성에 적합한 하나를 선택하는데 사용되는 기준, 항-마우스 CD40 mAb의 생성, mAb의 이소타입 변이체의 생성 및 면역질환의 마우스 모델에서 생체내 활성을 본명세서에서 또한 제시하고 있다. 두 chi220과 이들의 원숭이에서의 모 쥐 mAb220로 행한 연구에서, 이들 항-CH40 mAb는 강력한 면역억제제임을 나타내며, 이하에서 더욱자세히 설명할 것이다. 본명세서에 기술된 연구는 본기술분야의 전문가에게 알려진 표준기술을 사용하여 수행하였다.

요컨대, 출원인의 항체는 원숭이에서 체액성 면역반응을 억제하였다. 이와 유사하게, 밀접하게 짝지워진 항-마우스 CD40 mAb, 7E1의 두 이소타입 변이체는 다수의 사람질환의 전임상 모델에서 면역억제 활성을 나타냈다. 이와 함께, 이러한 사실은 chi 220, F4, 및 L3.17이 자기면역질환 및 이식의 치료에서 임상적용에 유용함을 나타낸다.

다음의 실시예는 단지 본발명의 예시를 위한 것이며, 본발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.

실시예 1:쥐의 항-사람 CD40 항체의 선별

A. 동정 및 시험관 특성화

이뮤노겐으로서 사람 CD40 융합단백질을 사용하는 표준 하이브리도마 기술로 사람 CD40에 대한 단클론 항체 패널을 제조하였다. CD40+ 세포주와 융합 단백질을 사용하여 CD40에 결합하는 특성으로 항체를 선별하였다. CD40 에 대한 gp39의 결합분석 및 CD40에 의한 자극으로 기능분석을 사용하여 클로닝된 항체를 특성화하였다. 그런후에 전임상 영장류 모델에서 사용을 위한 항체의 적합성을 분석하기 위해서, 선택된 항체에 대해서 영장류 세포와의 교차반응성을 특성화하였다.

1. 면역화 및 융합

항-사람 CD40 mAbs을 제조하는 하이브리도마를 제조하기 위해서 두 융합체를 사용하였다. 힌지(hinge)부분에 융합된 사람 CD40의 세포외 도메인, 쥐의 IgG2b 항체(hCD40-mG2b)의 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지는 재조합 융합단백질을 이뮤노겐으로 사용하여, 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 면역 림프구를 생성하기 위한 면역화를 하였다.

융합 40-1을 위해서, 완전한 Freund 부형제에서 30㎍ hCD40-mG2b 에멀젼(전체는 200㎕)를 3-4부위에 피하로 초기에 상기 마우스를 면역화하였다. 완전한 Freund 부형제중 hCD40-mG2b을 21일째에 유사하게 상기 동물에게 투여한 후에, PBS중 30㎍ hCD40-mG2b 을 37일째에 정맥으로 주사하여 최종적으로 전-융합 면역화를 수행하였다. Ribi 부형제(R-730)로 Freund 부형제를 대체한 것만을 제외하고는 융합 40-2을 위한 면역화를 상기와 같이 수행하였다. 추가 면역을 21일 째 및 42일째에 수행하였고, 최종 전-융합 주입을 58일째에 면역화하였다.

최종 추가주입후 3일째에, 지라 및 림프구로부터 림프구를 수확하고 표준방법(Kearney et al., J. Immunol. (1979) 123:1548-50; Lane, J. Immunol. (1985) 81:223-28))을 사용하여 X63-Ag8.653마우스 골수종 세포와 3:1 비율로 융합시켰다. 각 융합체의 세포현탁액을 10개 96-웰 세포배양판에 약 각 웰당 전체세포가 170,000(융합전)의 밀도가 되도록 하였다.

2. 선별 및 클로닝

천연 사람CD40에 대한 특이도로서 mAb를 확인하기 위해서 두가지 분석방법을 사용하였다. 먼저, ELISA 기재 방식에서 CD40양성,EBV-형질전환된 사람 B세포주(1A2-2C)에 결합능으로 모든 웰의 세포배양 상등액을 선별하였다. 그런후에, 사람 IgG1 항체의 힌지, CH2, 및 CH3에 융합된 사람 CD40의 세포외 도메인, hCD40-Ig, 및 유사하게 제조된 무관한 사람 Ig융합단백질, Leu8-hIg로 이루어지는 정제된 제조합 융합단백질과의 반응성을 ELISA 기재 방식에서 각각의 상등액에대해 시험하였다(Hollenbaugh, et al., EMBO J.(1992) 11:4313-4321). 후자단백질이 아니라 전자단백질과의 반응성은 세포결합자료와 합쳐서 약 200 매스터 웰에서 천연 CD40에 대한 항체특이성의 존재가 확립되었다.

원하는 항-CD40 mAb에 대한 핵심적인 기능은 CD40과 이의 리간드인 gp39의 상호작용을 완전히 차단하는 능력이다. 따라서, 항체 선별의 다음단계로서, 모든 CD40 특이적 매스터웰 상등액에 대해 ELISA기재 방식으로 고정화된 hCD40-Ig에 대한 수용성, 재조합 쥐 CD8-사람 gp39 융합 단백질인 sgp 39의 결합을 저해하는 능력을 조사하였다. 이러한 상호작용을 완전히 저해하는 것을 동일한 방식으로 적정하여, 최고 저해능을 갖는 항체를 포함하는 웰을 수립하였다. 이러한 분석으로부터, 클로닝을 위해서 가장 강하게 저해하는 매스터웰중 10개를 선택하였다.

적합한 항체 분비세포의 클로닝을 두단계로 수행하였다. 먼저, 최고로 적정한 후에, 각 매스터웰에서 얻은 세포를 접종밀도 10세포/웰 에서 "미니클로닝"을 하고, CD-40 특이적 미니클론을 제한 희석법으로 클로닝하였다.

3. 추가적인 특성분석

추가적으로 항체의 특성을 분석하기 위해서 6가지 분석방법을 사용하였다. 이러한 방법은 사람 B세포에 대한 sgp39의 결합 저해, sgp39 및 항-IgM에 의해 유도된 B세포 증식의 저해, 활성화 T세포에 의해 유도된 B세포에 의한 시험관애 항체합성의 저해, 항-IgM과 함께 B세포의 직접적 공동자극, 교차 항-카파 경쇄항체의 존재하에 항-IgM과 함께 B세포의 공동자극, 및 두번째 항-CD40 mAb, G28-5의 존재하에 항-IgM과 함께 B-세포의 공동자극이다. 이 mAb는 강한 공동자극활성을 가지며 CD40/gp39의 상호작용을 불완전하게 차단하는 것으로 알려졌다. 이들분석에 있어서 비교를 위해 이들을 포함하였다.

이러한 분석으로 4가지 mAb을 선별하였다:1.66(IgG2b), 2.36(IgG2a), 2.174(IgG1), 2.220(IgG2a). mAb의 특성분석을 위한 실험을 수행하였다. 한실험에서, 살함 B세포주 Raji에서 얻은 세포를 다양한 항-CD40 mAb 2 또는 20㎎/ml으로 배양한 후에, mCD8-gp39 융합단백질(sgp39)을 함유하는 희석하지 않은 COS세포 상등액에서 배양하였다. FITC 표지된 항-mCD8 mAb와 함께 세포를 추가로 배양함으로써 결합된 sgp39를 탐지하고, FACS캔상의 세포를 분석하였다. 항체와 함께 배양한 샘플의 평균 형광도를 첫번째 배양에서 항체없이 배향한 샘플의 평균형광도로 나누어 저해 퍼센트를 계산하였다(도 1).

도 1에서 나타낸 바와 같이, 이들 4가지 mAb는 각각 CD40을 높은 수준으로 발현하는 사람의 B세포주에 대한 sgp39 융합단백질의 결합을 완전히 저해할 수 있으며, 다만 2.174의 경우에는 완전한 차단을 위해서 상대적으로 높은 농도의 항체를 필요로 한다. 사람 편도 B세포에서도 비스한 자료가 얻어졌다. 이들 자료는 두가지 기능분석에서도 비슷하였다. 첫째, 각각의 mAb는 사람 편도 B세포의 sgp39-매기 공동자극을 완전히 차단할 수 있었다. 둘째, 시험관내 T세포-의존성 B세포 항체의 합성분석에서 IgG 및 IgM의 생산을 각각은 상당힌 저해하였다.

4가지 항체중 3가지는 항-IgM의 존재하에 B세포 증식을 공동으로 자극하는 제한된 능력을 나타냈다. mAb 2.220는 약한 공동자즉 활성을 유도하는 능력과 더욱 일치하였다. 교차결합을 위해서 사용된 항-카파 경쇄 항체의 첨가로, 항-CD 40 mAbs, 2.36은 상당한 공동자극활성을 얻었으나, 다른 3가지 항체의 활성에는 영향을 없었다. G28-5이 4가지 새로운 항-CD40 mAbs중 각각과 함께 짝을 형성한 경우에 이의 공동자극능이 다르게 조절됨을 나타냈다. mAbs 1.66 및 특히 2.174 는 G28-5의 공동자극을 향상시켰으나, 2.220 및 2.36은 억제하였다.

시험관내 사람 시스템에서 측정에 기초를 둔 선별에 이어서, 추가로 4가지 항-CD40 mAbs에 대해 사람을 제외한 영장류에서 생체내 측정에 대한 적합성을 추가로 조사하였다. 이 분석의 두가지 중요한 점은 영장류 B세포에 결합 및 시험관에서 억제하는 각각의 상대적인 능력, T-세포 의존성 B세포 항체합성이다. 4가지 mAbs 모두는 cynomologus macaque(Macaca fascicularis) B세포와 교차반응을 함을 알수 있었다. 2.36 및 2.220이 2.174 및 1.66보다 더 높은 활성으로 결합하였다. 다른 이소타입-짝형성 항-CD40 mAbs(예, G28-5 및 2.118)가 2.36 및 2.220에 필적할 만한 결합을 설명하기 때문에, mAbs 2.174 및 1.66의 더 낮은 결합이 이들의 특별한 이소타입이 원인은 아니다. 이러한 결과는 각각의 mAbs가 비스한 결합을 설명하는 사람 B세포에서 관찰된 것과는 상반된 것이다. 4가지 mAbs의 원숭이 B세포에 의한 항체합성을 억제하는 능력은 결합하는 능력과 같다는 것을 알 수 있었다.

B. 생체내 특성화

면역억제제로서 항-CD40의 적합성을 측정하고 추가 개발을 위해 적합한 항체를 선별하기 위해서, 쥐의 항-사람 CD40 mAbs을 사용하여 사람이외의 영장류에서 두가지 연구를 수행하였다. 첫째, 4가지 선택된 항-CD40 mAbs의 생체내 클리어런스(clearance) 및 급성독성을 비교하였다. 이들 결과를 사용하여 두가지 항체, 2.36 및 2.220를 선택한 후에, T-의존성 항체 에 대한 항체반응의 저해 및 급성독성상에 있어서 효과를 측정하기 위한 두번째 연구를 수행하였다.

2.36 및 2.220의 영장류 효능 연구

상기 발견에 기초하여, mAbs 2.36 및 2.220에 대해 cynomolgus원숭이에 정맥으로 주사한 후에 T-의존성 항체반응르 억제하는 지를 조사하였다. 이연구는 세단계로 구분된다(도 2). 1단계에서, 하나 또는 두마리 수컷 및 두마리 암컷 cynomolgus원숭이로 이루어지는 4그룹에 대해서 각각 양의 적혈구세포(SRBS)을 1일째에 정맥으로 면역화한후에, 1일째, 3일째 및 5일재에 20mg/kg의 mAbs 2.36, 2.220, 1.106(IgG1 쥐의 항-사람 gp39, 양성대조구) 또는 L6(IgG2a쥐의 항-사람 종양 항원, 음성대조구)를 처치하였다. SRBC 이뮤노겐에 대한 IgM 및 IgG 농도, 시험 및 대조구에서 혈청수준, 항-테스트 및 대조구 항체의 존재, 혈청 면역글로불린 수준, 모세혈관 림프구 수 및 모세혈과 림프구의 다양한 하위집단의 빈도를 결정하였다. 2단계에서, 대조구와 시험군을 제거한 후에, 면역관용의 유도 및 관찰된 면역억제의 가역성을 측정하기 위해서 SRBC 및 두번째 항원인 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 면역화하였다. 3단계에서, KLH에 대한 두번째 항체를 측정하기 위해서, 그리고 추가적인 SRBC 자극에 따라 먼저 억제된 항-SRBC항체반응이 회복되는지를 결정하기 위해서 선택된 동물을 재면역화하였다.

mAbs 2.220이 SRBC에 대한 영장류 항체반응을 상당히 억제함을 보이기 위해서 실험을 수행하였다(도 3). 단계1의 1일째, 3일째, 및 5일째에 mAbs 1.106, L6, 2.36 또는 2.220중 어느 하나를 20mg/kg로 원숭이에 처치하였다. 단계 1, 2, 및 3중 1일째에 SRBC로 원숭이를 면역화하였다. 도 3a는 IgM 항-SRBC 항체에 대해 분석한 혈청샘플의 결과를 나타낸다; 도 3b는 IgG 항-SRBC항체에 대해 분석한 혈청샘플의 결과를 나타낸다. 각각의 그룹(n=3, 또는 4)에 대해 산술적 평균 항-SRBC 농도로 자료를 표시하였다.

IgM 및 IgG에 대해서 최대 1차반응은 85% 및 98%가 각각 저해되었다. 탐지가능한 수준이하로 혈청에서 mAbs 2.220을 제거한 후에, 1단계의 음성 대조구에 비해서 IgM 및 IgG에 대해서 SRBC에 대한 최대 두번째 반응은 여전히 79% 및 56%이 저해되었다. 이는 SRBC에 대한 강한 두번째 항체반응이 관찰된 mAbs 1.106즉 양성대조구에 상반된 것이다. SRBC에 대한 3차반응은 저해되지 않았으며, 이는 mAbs2.220이 연장된 면역억제를 유도하였으나 면역관용을 유도하지 못했음을 나타낸다. KLH로 면역화된 모든 동물은 1차 항-KLH반응과 2차 항-KLH반응을 나타냈으며, 이는 면역억제가 가역적임을 나타낸다. 상기 연구의 1단계에서 상당한 저해를 나타내지 않았기 때문에, 2.36으로 처리한 동물은 2단계에 포함되지 않았다. 마지막 투여후에 즉각 나타나는 평균 최대 혈청농도는 mAbs 2.220 및 2.36에 대해서 각각 744 및 405 ㎍/ml이었다. 여기서, 15일째에 탐지가능한 수준이하로 혈청에서 mAb 2.36을 제거한 경우에, mAb 2.220는 29일지까지 제거되지 않았다. mAb 2.36 및 2.220은 모두 면역원성을 가진다.

어떠한 동물에서도 혈액학적 또는 혈청 Ig 수준상의변화, 체중 또는 음식섭취상의 변화, 약물관련 임상관찰은 없었다.관찰된 유일한 약물관련 발견은 mAb 2.36 및 2.220에 의해 모세혈관 B세포가 일시적으로 70% 및 43%가 각각 감소했다는 것이다. B세포에서 정상세포로의 회복은 처치후 2-3주내에 일어났다.

요컨대, mAb 2.220은 SRBC에 대한 항체반응을 상당히 억제하였으나, 2.36은 그렇지않았다. 비록 mAb 2.220이 연장된 항원-특이적 면역억제를 유도함에도 불구하고, 이는 가역적이다. 이러한 발견에 기초하여 추가 개발을 위해서 mAb 2.220을 선택하였다.

실시예 2: 키메릭 항체 chi220의 제조

쥐의 항-사람 mAb 2.220의 면역원성을 설명하기 위해서, 가변영역이 사람의 불변영역에 융합된 재조합 형태를 제조하여 시험관내에서 효능을 측정하였다. 사용된 두가지 방법은 변형되지 않은 쥐의 가변영역을 포함하는 키메릭 항체의 제조, 및 가변영역내에서 사람의 골격서열상에 쥐의 초가변영역(CDR)이 이식된 사람화 형태이다. 키메릭 항체는 모 항체의 항원결합특성을 가지고 있으나 면역원성이 더 클 수 있다. 사람화 항체는 면역원성이 낮을 것 같으나, 사람화에 도입된 변이가 항원결합에 영향을 미칠 수 있다.

A. 키메릭항체 및 사람화 항체의 제조 및 시험관내 특성화

항-CD40 mAb 2.220의 VL 및 VH을 PCR로 얻었다. VH 및 VL을 각각 얻기 위해서 IgG1-특이적 안티센스 프라이머 또는 Ck-특이적 안티센스 프라이머를 사용하여 2.220 mAb를 발현하는 하이브리도마로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 이들 단일사슬 cDNA에 폴리-G 꼬리를 첨가하였다. 폴리-G 꼬리에 상보적인 폴리-C 서열을 함유하는 올리고뉴클레오라티드 센스 프라이머와 안티센스 플라이머의 네스티드(nested) 세트를 사용하여 PCT로 가변영역을 증폭하였다. 얻어진 PCT산물을 프라이머에 포함된 제한효소자리를 포함하는 박테리아 벡터에 삽입하였다. 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석으로 다수 클론의 서열을 분석하였다 . RNA 단계부터 두가지 독립적인 실험을 수행한 결과 얻어진 서열이 동일하였다.

키메릭 형태의 항체를 제조하기 위해서, 도 4에 나타낸 바와 같이 2.220에 가장 근접한 사람항체의 시그널서열을 코딩하는 서열에 도입된 프라이머를 사용한 PCT로 가변영역을 증폭하였다. 경쇄 가변서열중 밑줄 그은 부부은(도 4a) 및 중쇄 가변영역(도 4b)는 쥐의 2.220에 가장 상동성이 높은 사람 항체의 시그널서열의 삽입을 나타낸다. 완전한 경쇄 또는 중쇄를 각각 얻기 위해서, 사람 카파 또는 사람 γ1의 불변영역의 코딩서열을 포함하는 벡터에 이들 PCT산물을 도입하였다. COS세포로부터 일시적 발현에 이어서 단백질 A를 정제함으로써 최초 특성화를 위한 단백질을 얻었다.

예로서, 키메릭 항체의 중쇄 및 경쇄 각각에 대한 별개의 발현벡터와 CHO DG44세포를 공동으로 형질감염시켜 키메릭 항체를 생산하는 세포주를 제조하였고, 높은 복제수 전기천공방법을 사용하여 공동 병합을 촉진하였다(미국특허 제 4,956,288참조). chi220 경쇄 및 중쇄를 각각 pD17 및 pD16으로 클로닝하였다. 두 벡터는 InVitrogen 플라스미드 pcDNA3에서 유래되었으며, 다음 특성을 갖는다(도12): (1) 인핸서가 없는 SV40 프로모터의 조절하에 네오마이신 내성유전자가 쥐의 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)로 대체되었다(또한 "약화 DHFR"이라고도 함; 단지 상기 프로모터와 약화되었고 DHFR효소는 아니며, 인핸서가 없는 프로모터는 여전히 SV40의 복제기원을 가지고 있어서 일시적인 COS 형질감염에서 사용되었다); (2) CMV 프로모터로부터 목적 유전자가 발현되고 폴리 아데닐화 신호는 소의 성장호르몬 유전자에서 유래되었다; (3) 목적 유전자의 발현카세트는 전사종결서열로 둘러싸여있다(즉, 프로모터의 5'쪽 및 폴리 A 자리의 3'쪽); (4) 두개의 다른 제한효소 폴리링커를 포함하고 있으며, 목적 유전자의 클로닝을 위해 하나는 프로모터의 3'쪽 그리고 형질감염하기 전에 벡터의 선형화를 위해서 프로모터의 5'쪽에 위치;(5) 암피실린 내성 유전자 및 E.coli에서 플라스미드 증식으르 위한 ColE1 복제기원.

사용된 중쇄와 경쇄 유전자는 다음과 같은 변형을 갖는 게놈 구조물이다:(1) 중쇄 시그널 펩타이드를 위한 코딩서열, 가변영역 및 CH1도메인이 인접해 있고(즉, 인트론이 없음); (2) 경쇄 시스널 펩타이드를위한 코딩서열 및 가변영역이 인접해 있다.

본기술분야의 전문가에게 알려진, 본발명의 키메릭 항체를 발현할 수 있는 다른 발현 벡터를 본발명의 범위내이다. 본발명의 키메릭 항체의 중쇄를 발현할 수 있는 발현벡터에 유용한 핵산서열은 도 13에 나타냈으며; 본발명의 경쇄를 발현할 수 있는 발현벡터에 유용한 핵산서열은 도 14에 나타냈다.

가변영역과 불변영역을 포함하는 키메릭 항체("chi220")의 중쇄 및 경쇄의 완전한 아미노산 서열은 다음과 같다(진하게 표시한 아미노산은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 나타낸다)

중쇄 서열(SEQ ID NO:3)

경쇄 서열(SEQ ID NO:4)

220의 몇가지 사람화 형태를 제조하였다. 이러한 방법에는 VH 및 VL 도메인에 최대 상동성을 갖는 쥐 및 사람의 생식세포주 서열의 확인이 포함된다. 친화성 성숙과정에서 일어잔 체세포 변이의 가능한 위치를 확인하기 위해서 쥐의 생식세포주 서열을 사용하였다. 그런 후에, 사람 서열을 주형으로 사용하였고 결합 특이성에 중요하다고 알려졌거나 의심되는 서열부분은 VH 및 VL 모두에 대한 사람 서열에서 대체되었다. 결정구조를 알기 위한 최대 상동성을 갖는 단백질을 주형으로 사용하여 이들 서열의 구조를 모델링하였다. PCR에 의한 돌연변이야기법으로 사람화 형태를 코딩하는 플라스미드를 제조하고, COS세포부터 일시적 발현으로 항체를 제조하였다. 본발명의 키메릭 항체 및 사람화 항체에 시험관내 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5a는 ELISA에 기초를 둔 분석에서 hCD40-mG2hb에 대한 chi220 및 h220v3의 결합을 측정하기 위한 결합분석결과를 나타낸다. 2시간동안 PBS중 10ng/ml 의 농도로 hCD40-mG2b로 이뮬론-2 플레이트의 웰을 코팅하였다. Specimen Diluent(Genetic Systems)로 웰을 차단하고, 지시된 농도로 항체를 첨가하였다. 1시간 반응후에, 웰을 세척하고 퍼옥시다제-접합 염소 항-사람 IgG 항체을 사용하여 항체의 존재를 탐지하였다. H220v3은 mAb 2.220의 사람화 형태이다. 수치는 2웰의 평균치이고 오차는 표준편차를 나타낸다.

도 5b는 항-사람 CD40 mAb와 함께 sgp39-매개 사람 B세포의 공동자극의 저해을 측정하는 분석결과를 나타낸다. 휴지기 사람 편도 B세포(50,000/웰)을 sgp39 융합 단백질, 20㎍/ml 토끼 항-사람 IgM로 코팅된 면역비드 및 항-CD40 mAb의 소정의 농도 또는 중간대조구만으로 96웰 플레이트에서 배양하였다. 초기배양후 72시간째에, 모든 웰에 1uCi/웰 [3H]티미딘으로 펄스를 주고 18시간동안 추가로 배양하였다. 세포를 수확하여 섬광계수기로 포함된 [3H] 티미딘을 측정하였다.

시럼관내 분석결과(도 5a 및 5b는 둘다 CD40에 효과적으로 결합된 키메릭 항체 및 사람화 항체를 나타냄)에 기초하여 추가 연구를 위한 키메릭 항체를 선택하였다.

실시예 3: chi220의 효능

A.키메릭 mAb 2.220: 사람이외의 영장류에서 단일-투여양 효능 연구

T-세포 항원에 대한 1차 및 2차 체액성 면역반응을 억제하는 chi220의 능력에 대해서 cynomolgus원숭이에서 chi220를 측정하였다. 한가지 연구에서, SRBC로 4마리 원숭이 그룹을 면역화하고, chi220을 10, 40, 또는 100mg/kg 또는 또는 대조구로서 멸균 인산완충 식염수(PBS)을 단일투여량으로 정맥으로 투여하기 직전에 2차 면역을 위한 오브알부민(OVA)를 주입하였다. 세가지 투여량 수준 모두에서 SRBC에 대한 1차 체액성 면역반응의 실질적인 억제가 관찰되었으며, 이는 영장류에서의 chi220의 효능을 나타낸다. chi220으로 처리한 모든 원숭이에서 회복시간이 투여량 의존성을 갖는 말초혈 B세포의 일시적 감소가 관찰되었다. 두가지 최고 투여량에서, 말초혈 T세포의 평균 절대적 수치가 일시적으로 약간 감소하였다. 혈청 IgM 수준의 일시적 최소 감소과 관찰되었으나 IgG 또는 IgA의 혈청수준에서 약물관련 변화는 없었다.

면역관용의 유도 및 면역억제의 가역성을 측정하기 위해서, 100mg/kg그룹에서 chi220의 수준이 면역억제라 믿어지는 수준(~10㎍/ml)이하이고 말초혈 B세포의 수가 투여전 수준으로 되돌아간 시점인 149일째에 OVA, SRBC, 네오안티젠(neoantigen), KLH로 모든 원숭이를 면역화하였다. 최저 투여량 수준에서 항-SRBC 반응은 일반적으로 대조구 원숭이에서 1차 항-SRBC항체반응과 유사했다. 그러나, SRBC에 대한 항체반응은 여전히 두가지 더 높은 투여량 수준으로 처리한 원숭이에서 부분적으로 억제 또는 실질적으로 억제되었다.

면역억제 및 B세포 소멸여부에 따른 투여량을 추가적으로 개발하기 위해서, 추가적인 원숭이(4/그룹)을 SRBC로 면역화한 후에, 0.1 또는 1.0 mg/kg chi220 또는 PBS를 1회 투여한 두번째 연구를 수행하였다. 두가지 투여량 모두에서 SRBC에 대한 항체반응의 부분최적화(suboptimal)면역억제가 관찰되었다. 8일까지 1.0mg/kg chi220을 투여받고, 0.1mg/kg으로 29일까지 번복한 원숭이에서, 말초혈 B세포의 중간 소멸이 명백하고, 말초혈 B세포의 평균수 및 퍼센트상의 감소가 관찰되었으나, 그 수치는 B세포 퍼센트에 대한 정상적인 추이범위의 밖에 있지 않았다. 추이한계는 말초혈 B세포의 절대적인 수에 대해 확립되지 않았다. 말초혈 T세포수의 일시적인 최소감소 및 생체외 T세포 증식의 약간의 감소가 1mg/kg chi220을 받은 원숭이에서 관찰되었다. 마지막으로, IL-6 및 TNFα의 혈청수준상의 보체활성화 또는 약물관련 변화에 대한 증거는 없었다. 10, 40, 또는 100 mg/kg ci220으로 처리한 원송이에서 생체외 T세포 활성화, 보체활성화 및 혈청 사이토킨 수준은 측정되지 않았다.

두가지 연구에서, 시험체의 수준을 순환시키기 위해서 Chi220을 투여한 후에 혈청 샘플을 조사하고, 시험체에 대한 항체형성을 측정하였다. 약동역학적 분석에 의하면, chi220의 평균 피크 혈청농도(Cmax)는 투여량 증가에 비례하여 증가하지 않았고, 투여량을 증가시킴에 따라 chi220의 반감기는 연장되었다. 0.1, 1, 10mg/kg을 투여하는 겨웅에 chi220은 면역원성을 갖는 것으로 확인되었다. 10 ㎍/ml이상의 농도를 순환시킨 경우에, chi220은 이에 대한 항체반응을 억제하는 것같다.

1. 실험절차

상기 첫번째 연구에서, 암컷 두마리와 수컷 두마리로 이루어진 4 그룹에 cynomolgus 원숭이를 넘겼다. chi220 또는 대조구 OVA로 투여하기 전에, 모든 원숭이를 28일간 면역화하였다(1.7 ml/kg, im 및 10mg/kg, sc). 1일째에, SRBC로 모든 원숭이를 면역화하고(10% 현탁액 1.7 ml/kg, iv), 10, 40, 또는 100mg/kg chi220 또는 대조구로서 멸균 PBS중 어느 하나를 정맥내로 큰 덩어리 투여량을 일회 받은 후 즉시, OVA로 두번째 면역화를 하였다(5mg/kg, im 및 10mg/kg, sc).149일째에, chi220의 혈청수준이 잠재적인 면역억제수준(~10㎍/ml)이하로 떨어지고 말초혈 B세포 수준이 모든 그룹에서 투여하기 전 수준으로 되돌아온 후에, 상기 원숭이를 OVA, SRBC, 및 KLH(10mg/동물, im)로 면역화하였다. KLH 면역화의 목적은 상기 원숭이가 chi220의 처리후에 새로운 항체에 대해 면역반응을 일으킬 수 있는지를 알아보는 것이다.

면역억제 및 말초혈 B세포 고갈에 관한 더 나은 투여량 반응을 설명하기 위해서, 두번재 연구에서 추가 원숭이(두마리/성/그룹)을 SRBC로 면역화한 후에, 1일째에 0.1 또는 1.0mg/kg chi220 또는 대조구로서 PBS중 어느 하나를 일회 투여하였다. 두연구동안 선택된 시간에 혈액학적 인자 및 말초혈 림프구 부분모집단를 모니터하였다. 10, 40, 또는 100 mg/kg chi220를 받은 원숭이에서 혈청 화학적 인자를 모니터하였으나, 더 높은 투여량에서 약물관련 발견이 관찰되지 않았기 때문에 0.1 및 1 mg/kg 투여량 수준에서는 모니터 하지 않았다. 추가로, IgM, IgG, IgA 및 chi220의 혈청수준을 측정하였다. 효능을 측정하기 위해서, 이뮤노젠의 투여바도 저이나 일주일후에 얻어진 적합한 혈청샘플에서 SRBC 및 OVA에 대한 특이적 IgM 및 IgG 항체형성을 결정하였다. chi220을 받은 원숭이에 대해서 시험체에 대한 특이적 IgM 및 IgG 항체형성을 시험체 투여 1일전 또는 1주일후에 결정하였다. 그룹간의 항체반응을 비교할 때 산술평균 농도를 사용하였다. 이에 더하여, 0.1 또는 1 mg/kg chi220을 받은 원숭이에서, chi220투여후 선택된 시간에 전체 용혈성 보체활성(CH₅₀) 및 C4d 단편 수준을 측정하고, TNF-α, 및 IL-6 수준을 chi220투여후에 선택된 시간에 결정하였다. 또한 미토겐에 대한 T세포 반응성에 대한 chi220 의 효과를 측정하기 위해서, 17일째 및 31일째에 0.1 및 1 mg/kg chi220 을 받은 원숭이에서 콘카나발린 A(concanavalin)로 자극한 후에 생체외 말초혈 T세포 활성화를 측정하였다. 마지막으로, 독성의 임상적 징후에 대해 매일 모든 원숭이에 대해서 관찰하고, 체중을 매주 측정하고, 음식소비를 매일 모니터 하였다.

담체, 10, 40 또는 100mg/kg(도 6a) 또는 0.1 또는 1mg/kg chi220(도 6b)을 1일째에 투여하기전에 SRBC로 원숭이를 면역화하였다. ELISA방법으로 IgM 항-SRBC항체에 대해 혈청을 분석하였다. 각 그룹에 대해서 산술평균 항-SRBC 항체 종말농도(EPT)로서 자료를 표시하였으며(n=2 [15일이후에는 100 mg/kg 군] 또는 4), 여기서 EPT는 배경 평균판의 것보다 두배이상의 흡광도를 갖는 샘플의 최대 희석의 역수에 상당한다.

2. 결과

a. 항-SRBC 항체반응

10, 40 또는 100 mg/kg chi220를 원숭이에게 투여한 경우에, chi220은 SRBC에 대한 1차 항체반응을 실질적으로 억제하는 효과가 있었다. 대조구 1차 IgM 항-SRBC 항체반응(8일째)의 최고 날짜에, 10, 40 또는 100 mg/kg chi220를 투여받은 원숭이에서 대조구에 비해 약 92-94%의 평균 1차 IgM 항-SRBC 항체 반응을 억제하였다(도 6a). 10, 40 또는 100 mg/kg chi220 투여수준에서 85일간 그룹 평균 IgG 항-SRBC 항체반응이 양성이 되지 않았다. 대조구 1차 IgG 항-SRBC 항체반응의 최고날짜에(15일째), 평균 1차 IgG 항-SRBC 항체반응을 10, 40 또는 100 mg/kg chi220를 각각 투여받은 원숭이에서 대조구에 비해서 98%, 99%, 및 85% 억제하였다(도 7a). 100 mg/kg 그룹에서 더 높은 전체 전투여량 항-SRBC 항체농도는 투여량 의존성 면역억제가 분명히 없음을 설명한다. 10, 또는 100 mg/kg chi220로 투여받은 전체 원숭이는 85일동안 1차 IgG gkd-SRBC항체반응을 증가시키지 않았다. 그러나, 40 mg/kg chi220를 투여받은 원숭이중 두마리는 SRBC에 대한 지연된 1차 IgG 항체반응을 가졌으며(크기에서 대조구에 비해), 36일째에 양성이 되었고, 51일째에 최고점에 도달했다.

chi220의 혈청수준이 추정 면역억제 수준(~10 ㎍/ml)이하로 내려가고 말초혈 B세포의수준이 모든 그룹에서 투여전 수준으로 되돌아간 후 149일째에, SRBC로 우너숭이를 2회 면역화하였다. 예상한 바와 같이, 대조구 원숭이는 SRBC에 대한 강한 2차 IgG 항체반응을 일으켰다. 10 mg/kg chi220으로 처리한 원숭이는 대조구 원숭이에서 1차 항체반응에 필적할 만한 SRBC에 대한 1차 IgM 및 IgG 항체반응을 일으켰다. 그러나, SRBC에 대한 항체반응은 여전히 40 mg/kg 투여량 수준에서 부분적으로 억제되었고, 100mg/kg투여량 수준에서 대체적으로 억제되었따. SRBC에 대한 약한 1차 항체반응을 이전에 일으켰던 두마리 원숭이에 40 mg/kg chi220으로 처리한 원숭이가 2차 반응의 특성을 갖는 IgM 및 IgG 항-SRBC 항체농도를 일으켰음에도 불구하고, 그 그룹의 다른 두마리 원숭이와 100mg/kg chi220로 처리한 나머지 원숭이들에서 항-SRBC항체 반응은, 대조 원숭이의 평균 1차 항-SRBC 항체반응에 비해, 여전히 약 90% 억제되었다.

0.1 또는 1.0 mg/kg chi220(도 6b 및 도 7b)을 투여한 후에 SRBC에 대한 부분최적 면역역제를 관찰하였다.chi220으로 처리한 모든 원숭이는 SRBC 항체에 대해 양성 IgM 항체반응을 나타냈으나, 평균 피크 대조구 반응에 비해서 1 mg/kg chi220를 투여받은 원숭이에서 전체 평균 피크 IgM 및 항-SRBC 항체 반응이 약 56% 억제되었다. 0.1 mg/kg chi220로 처리된 원숭이에서는 어떠한 IgM 항-SRBC항체 반응의 억제도 관찰되지 않았다. 평균 IgM 항-SRBC 항체반응은 대조구에서 15일째에 최고였고, 0.1 및 1.0mg/kg chi220을 투여받은 원숭이에서는 8일째가 최고였다. 전체적으로, 0.1 및 1.0mg/kg chi220으로 처리한 원숭이에서 각각 평균 피크 IgG 항-SRBC항체반응이 56% 및 42% 억제되었다. 평균 IgG 항-SRBC 항체반응은 대조구 및 1 mg/kg chi220로 처리된 원숭이에서 15일째 최고였고, 0.1 mg/kg chi220를 투여받은 원숭이에서는 8일째 최고였다.

b. 항-OVA 항체반응

1일째에 10, 40 또는 100 mg/kg chi 220을 정맥으로 원숭이에게 투여하였다. 추가로, 28일전에, 1일째, 149일째에 모든 원숭이를 OVA로 면역화하였다. IgM(도 8a), 및 IgG(도 8b) 항-OVA 항체에 대해 혈청샘프을 분석하였다. 각 그룹에 대해서 산술평균 항-OVA 항체 종말농도(EPT)로서 자료를 표시하였으며(n=2 [15일이후에는 100 mg/kg 군] 또는 4), 여기서 EPT는 배경 평균판의 것보다 두배이상의 흡광도를 갖는 샘플의 최대 희석의 역수에 상당하다.

10, 40 또는 100 mg/kg chi 220을 투여받은 원숭이의 연구동안, OVA에 대한 특이적 IgM 및 IgG 항체형성을 매주 조사하였다. 1차 및 2차 항-OVA항체반응은 매우 다양하였고 모든 원숭이에서 일반적으로 약하였다(도 8). 1일째에 Chi 220을 투여받을 원숭이는 대조구 원숭이보다 더 높은 항-OVA 항체농도를 가졌다.

149일째, 3차 OVA 면역을 상기 원숭이에 하였다. 자극후 7일내에 모든 원숭이는 약성 IgG항체반응을 일으켰다. 대조구 원숭이와 10 mg/kg chi 220를 처리한 원숭이는 3차 항체반응의 특성을 갖는 항체농도를 가졌으며, 여기서 40 또는 100 mg/kg chi 220로 투여받은 원숭이는 2차 항체반응의 특성을 갖는 항체농도를 나타냈다.

c. 항-KLH 항체반응

1일ㅉ에 10, 40 또는 100 mg/kg chi 220을 정맥으로 원숭이에게 투여하였다. 추가로, 149일째에 KLH로 모든 원숭이를 면역하였다. IgM(도 9a) 및 IgG(도 9b) 항-KLH 항체에 대해서 혈청샘플을 분석하였다. 각 그룹에 대해서 산술평균 항-KLH 항체 종말농도(EPT)로서 자료를 표시하였으며(n=2 [15일이후에는 100 mg/kg 군] 또는 4), 여기서 EPT는 배경 평균판의 것보다 두배이상의 흡광도를 갖는 샘플의 최대 희석의 역수에 상당하다.

chi220의 혈청수준이 면역억제라 믿어지는 수준(~10㎍/ml)이하이고 말초혈 B세포의 수가 투여전 수준으로 되돌아간 시점인 149일째에, KLH로(10 mg/동물, im)으로 모든 원숭이를 면역화하였다. 모든 원숭이가 KLH에 대해 양성 IgM 및 IgG 항체반응을 일으켰으며, 이는 새로운 항체에 대해 반응할 수 있는 능력이 손상되지 않았음을 설명한다(도 9).

d. 시험물의 혈청수준 및 항-시험물 항체반응

시험물의 순환수준을 결정하고, 시험물에 대한 항체형성을 측정하기 위해서, chi220 투여후에 혈청샘플을 조사하였다. chi 220의 평균 최고 혈청농도(Cmax)는 10 또는 40 mg/kg chi220의 투여후 3분에 일어나고, 100mg/kg chi220의 투여후 6시간에 일어났다. 10, 40 도는 100 mg/kg chi220로 처리한 원숭이에서, chi 220의 Cmax값은 각각 329, 2429 및 2343 ㎍/ml이었다. 그러나, 40 및 100mg/kg chi220으로 처리한 각 원숭이의 Cmax는 상당한 변화를 나타냈다. 10, 40 또는 100 mg/kg chi220으로 처리한 원숭이에서 chi220의 평균 혈청 반감기는 약 114, 173 및 315인 것으로 추정되었다.

chi 220의 투여후 3분후에 일어나는 평균 Cmax값은 0.1 및 1 mg/kg chi220투여량에 대해 각각 1.77 및 33㎍/ml이었다. 각각의 투여량 수준내에서 성에 따른 chi220혈청수준상의 차이는 없는 것으로 관찰되었다. 이와 함께, 상기 연구에 의하면, 투여량이 증가하면 chi220의 반감기가 연장되는 것으로 보인다. 더욱이, chi220의 Cmax는 투여량 증가에 비례하지 않는 방식으로 증가하였다.

10, 40 또는 100 mg/kg chi220을 투여받은 원숭이에서 IgM 항-시험물 반응이 최소이거나 없을 지라도, 10mg/kg chi220을 받은 원숭이에서 상당한 IgG 항-시험물 항체반응이 관찰되었다. 10mg/kg chi220을 받은 원숭이에서 평균 IgG 항-시험물 항체반응은 Chi 220의 평균 그룹 혈청농도가 10 ㎍/ml이하로 감소한 후 약 1주일인 29일째에 양성이 되었고, 12,627 산술평균 적정농도에서 36일째 및 43일째에 최고값을 나타냈다. 10 mg/kg chi220으로 처리한 원숭이에서 IgG 항-시험물 항체의 출현은 또한 B세포의 고갈후에 최초의 탐지가능한 농도의 B세포수와 일치한다. 측정 마지막날(149일째)에, 40 또는 100 mg/kg chi220을 투여받은 원숭이는 아직도 chi220에 대한 양성항체반응을 일으키지 못했으나, 그룹 평균 chi220 혈청수준이 57일째( 40 mg/kg chi220군) 및 92일째 (100 mg/kg chi220군)까지 10 ㎍/ml이하였다.

0.1 또는 1 mg/kg chi220의 투여시에 Chi220은 면역원성을 나타낸다. 0.1 또는 1 mg/kg chi220중 어느 하나를 받은 4마리 원숭이중 3마리가 연구 15일째까지 약한 양성 IgM 항-시험물 항체반응을 가졌다. 1 mg/kg chi220로 시험한 4마리중 3마리 원숭이는 16,618의 산술평균 종말농도에서 피크를 나타내는 상당한 IgG 항-시험물 항체반응을 나타냈다. 전체적으로, 0.1 mg/kg chi220를 받은 원숭이에서는 산술평균 IgG 항-시험물 항체반응이 양성이 아니며, 0.1 mg/kg chi220을 받은 단지 한마리의 원숭이만이 22일째에 2430의 종말농도의 피크를 갖는 약한 양성 IgG 항-시험물 항체반응을 나타낸다. 총체적으로, 이러한 자료는 약 10 ㎍/ml보다 더 큰 혈청수준의 Chi 220에 대한 항체반응을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 4

사람화 항-CD40 항체 F4 및 L3.17의 생성

mAbs를 사람화하기 위해서 본기술분야에서 알려진 다양한 방법을 사용하였다. 구조에 기초를 둔 접근법이 유용한 것으로 증명되었으나, 결합 활성에 관련된 다수의 골격 잔기에서 부터 야기되는 복잡성이 성공율을 감소시킨다. 모델에 기초를 둔 최적 골격의 예측뿐만 아니라, 하기의 항체 라이브러리 접근은 다수의 조합 스크리닝에 기초를 둔 활성 골격 형태의 확인을 가능하게 한다. 선택방법에 커플링된 돌연변이야기 접근에 의해, 다양한 변이체의 선택이 가능하고 생체내 성숙과정의 모방이 가능하다(reviewed in Marks, J.D., et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010). 코돈에 기초를 둔 변이에 의해서, 구체적 잔기의 기여도를 특징화할 수 있는 라이브러리의 제조가 가능하고, 임의 돌연변이 야기법이 더욱 효과적이다. 예를 들면, error-prone PCR은 하기의 조합 골격 라이브러리의 합성에 사용될 수 없다. 게다가, 임의 돌연변이에 의해서 더 다양한 라이브러리가 제조되고, 불행하게도, 대부분의 변이는 mAb에 대한 결합활성을 향상시키지 못한다. 따라서, 활성 변이체를 동정하기 위해서 다수의 클론을 선별해야만 한다.

"안내 선별(guided selection)"이란 전략은 주형으로서 설취류 mAb을 사용하는 두단계 과정에서 파지 디스플레이 라이브러리로부터 사람 mAbs를 분리하기 위해서 사용된다.(Jesper, L.S., et al., (1994) Bio/Technology 12:899-903). 최근에, 파지 디스플레이 기술을 사용하는 안내선별의 다양한 기술이, 쥐의 CDR3가 이식된 사람의 L사슬을 포함하는 라이브러리로부터 L사슬을 선별하기 위해서 키메릭 Fd 단편을 사용하는 것에 기재되어 있다(Rader, C., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915). 따라서, 쥐 HCDR3를 포함하는 사람 H사슬 라이브러리로부터 H사슬을 선별하기 위해서 대부분 활성 L사슬을 사용하였다. 이러한 접근법에 의해서 동정된 mAb는 완전히 사람의 것이거나(Jespers, 상기문헌) 대부분 사람의 것이나(Rader, 상기문헌), 각 공저에 도입된 큰 항체다양성때문에 친화성 집적법이 필요하게 된다.

다음의 재료 및 방법은 본발명의 사람화 항-CD40 항체 F4 및 L3.17을 제조하기 위해서 사용되었다.

1. 키메릭 항-CD40의 제조

항-CD40 서열에 기초하여, VH 및 VL(69-75 염기길이)을 코딩하는 중복되는 쥐의 mAb 2.220올리고뉴클레오타이드를 합성하고 정제하였다. 다음을 5회순환 주기로 이루어지는 50㎕ PCR 반응에서 Pfu DNA폴리머라제로 중첩 올리고뉴클레오타이드를 각각 25 pmol를 결합함으로써 별개로 VH 및 VL영역을 합성하였다: 20초간 94℃에서 변성, 30초간 50℃에서 접합, 1분이상 72℃에서 램핑(ramp), 30초간 72℃에서 유지. 결과적으로, 접합 온도를 25회동안 55℃로 증가시켰다. 동일한 프로그램을 사용하는 100㎕ PCR반응에서 융합 산물 1㎕을 증폭하기 위해서 역방향 프라이머와 바이오틴화된 정방향 프라이머를 사용하였다. 아가로스겔 전기영동, 전기 용출 및 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer Mannheim)로 인산화로 산물을 정제한 후에, 5mM Tris-CL, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1M NaCl 및 0.05% Tween 20에서 15분간 25℃에서 스트렙타비딘(streptavidin) 전자비드(Boehringer Mannheim)와 함께 반응시켰다. 상기 비드를 세척하고, 0.15M NaOH를 사용하여 25℃에서 10분간 바이오틴화되지 않는 (-) 사슬 DNA를 용출하였다. 3배 초과의 우리딘화된 벡터 주형에서 VH 및 VL 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 혼성화 돌연변이야기법으로(Rosok, M. J., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618; Kunkel. T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492), 변형 M13IX104벡터(Kristensson, K., et al., (1995) Vaccines 95, pp. 39-43, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 즉 M13IX104CS상에서 키메릭 항-CD40 Fab를 합성하였다. 카파 및 γ1 불변영역의 말단에 있는 시스테인잔기를 세린 잔기로 치환하여 상기 M13IX104벡터를 변형하였다. 상기 반응물을 DH10B세포로 전기천공시키고, XL-1 블루위에 깔았다.

2. 조합 골격 및 골격/CDR3 라이브러리의 제조

키메릭 항-CD40의 제조에 사용된 방법과 동일하나 약간 변형한 방법으로 조합 골격 라이브러리(Hu I)을 제조하였다. Kabat등에 의해 정의된(Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest (5th Ed.), Washington DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A., et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616) 사람 주형 및 쥐의 항-CD40 CDR의 H 및 L의 가변영역의 골격구조 영역을 코딩하는 중복 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 7개 VH 및 1 VK에서 쥐와 사람 아미노산을 코딩하는 퇴화된(degenerate) 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다(도 15, 별표로 표시함).

변형을 가하여 조합 골격 라이브러리의 제조방법과 동일한 방법으로 골격/HCDR3(Hu I) 및 골격/HCDR3/LCDR3(Hu III) 라이브러리를 합성하였다. 돌연변이로부터 선별된 CDR잔기는 다음과 같다:HCDR3중 Ser95-Tyr102, LCDR3중 Cln89-Thr97(eh 15, 밑줄로표시). 단일 CDR잔기의 변이를 위해서 HCDR3 및 LCDR3을 코딩하는 CDR잔기를 고안하였고, 종래기술에서 기술한 바와 같이(Glaser, S.M., et al., (1992) J. Immnunol. 149:3903-3913) 각 위치에서 NN(G/T)를 도입함으로써 합성하였다. 골격 라이브러리와 비-라이브러리 쥐 CDR를 코딩하는 중첩 올리고뉴클레오타이드와 변이 HCDR3 및 LCDR3을 코딩하는 각 올리고뉴클레오타이드 25pmol과, 도는 변이된 HCDR3를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 25pmol과 결합하였다.

3. 파지 발현 라이브러리의 선별

캡쳐 리프트라 불리우는, 본기술분야에서 알려진 변형된 플락 리프트법(Watkins, J. D., et al., (1998) Anal. Biochem. 256:169-177)에 의해서 먼저 Hu II 및 Hu III을 선별하였다. 요컨대, 염소 항-사람 카파로 니트로셀룰로서 필터(82-mm)를 코팅하고, 1% BSA로 차단하고, 파지가 감염된 박테리아을 함유하는 아가판에 적용하였다. 초기 선별에서, 파지를 10⁵파지/100-mm 판으로 깔았다. 파지-발현 항-CD40변이체 Fab를 캡쳐한 후에, 1% BSA용액을 함유하는 PBS중에 5ng/ml CD40-Ig으로 25℃에서 3시간동안 상기 필터를 반응시켰다. 0.1% 트윈 20을 함유한 PBS로 4회 상기 필터를 헹구고, 1% BSA 함유 PBS에서 3000배 희석한 염소 항-마우스 IgG2b-알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트(Southern Technology)로 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 상기 필터를 세척하고, Watkin (1998)등의 상기문헌에 기술된대로 전개하였다. 각 클론을 분리하기 위해서, 초기 선별에서 양성 플락을 집어내어 저농도(〈10³파지/100-mm 플레이트)로 다시 깔로 동일한 방법으로선별하였다.

변이체의 상대적 친화도를 빨리 분석하는 ELISA법으로, 먼저 Hu I 조합 라이브러리를 선별하였다(Watkins, J.D. et al., (1997) Anal. biochem. 253:37-45). 이에 더하여, 캡쳐 리프트 스크리닝에 의해서 확인된 클론의 특성을 분석하기 위해서 ELISA법을 사용하였다. 요컨대, 5 ㎍/ml 염소 항-사람 카파(Southern Biotechnology)로 마이크로판을 코팅하고, PBS중의 3% BSA로 차단하였다. 그다음에, 대장균 배양상등액 또는 세포용해물로부터 얻은 5 ㎕ Fab를 상기 플레이트와 25℃에서 1시간동안 반응시키고, 0.1% 트윈 20함유 PBS으로 상기 판을 3회 세척하고, 1% BSA함유 PBS중의 0.1 CD40-Ig으로 상기 판을 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 0.1 % 트윈 20함유 PBS로 상기 판을 3회 세척하고, 1% BSA함유 PBS중 3000배 희석한 염소 항-마우스 IgG2b 알카라인 포스파타제 컨쥬게이트을 첨가하여 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 0.1% 트윈 20함유 PBS로 상기 판을 3회 세척하고, 본기술분야에서 기술한 방법(Watkine (1997) 상기문헌)으로 전개하였다.

4. DNA 서열분석

단일사슬 DNA을 분리하고, 형광 디데옥시뉴클레오타이드 종료법(Perkin-Elme, Foster City, CA)으로 본발명의 사람화 항체의 H 및 L 가변영역 유전자의 서열을 분석하였다.

사람화 항체 F4의 경쇄 가변영역의 핵산 (SEQ ID NO:7) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)은 다음과 같다:

사람화 항체 F4 및 L3.17의 중쇄 가변영역의 핵산 (SEQ ID NO:9) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:10)은 다음과 같다:

사람화 항체 L3.17의 경쇄 가변영역의 핵산 (SEQ ID NO:7) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)은 다음과 같다:

5. Fab의 발현과 정제

아라비노스-조절 BAD 프로모터항에 어떤 Fab를 발현벡터로 클로닝하였다. 추가로, 니켈-킬레이팅 수지로 정제하기 위해서 6-히스티딘 택을 H사슬의 카르복시말단에 융합하였다. 정제된 Fab는 Watkins (1997), 상기문헌에 기재된 대로 정량화하였따.

6. 특성화 분석

PBS중의 0.1 ㎍/ml CD40-Ig로 4℃에서 16시간동안 이뮨 II 마이크로티터를 코팅하고, PBS중의 3% BSA로 차단하였다. 상기 판을 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS로 3회세척하고, 원형질막 주위공간으로부터 유리된 Fab를 1% BSA함유 PBS중에 순차적으로 3배로 희석하고 25℃에서 2시간동안 반응시켰다. 이어서, 상기 판을 0.1% 트윈20 함유 PBS로 4회 세척하고, 1% BSA함유 PBS 중에 2000배로 희석한 염소 항-사람 카파-알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트로 25℃에서 1시간동안 항체결합능을

탐지하였다. 0.1% 트윈 20함유 PBS로 상기 판을 4회 세척하고 비색계로 전개하였다(Watkins (1997), 상기문헌).

변이체가 리간드 결합을 저해하는 지를 시험하기 위해서, CD 8 도메인을 발현하는 sgp39 융합단백질을 잡기위해서 2 ㎍/ml 항-쥐CD8로 이뮨 II 마이크로티터 판을 코팅하였다. 0.05% 트윈 20 함유 PBS로 상기 판을 1회 헹구고, PBS중의 3% BSA로 차단시켰다. 0.05% 트윈 20 함유 PBS로 상기 판을 1회 세척하고 sgp39의 포화수준을 포함하는 세포배양배지로 25℃에서 2시간동안 반응시켰다. 결합되지 않는 sgp39를 빨아내고 0.05% 트윈 20 함유 PBS로 상기 판을 2회 세척하였다. 그 다음에, PBS에서 순차적으로 3배로 희석시킨 정제된 Fab 25 ㎕를 첨가하고 PBS중의 4㎕ CD40-사람 Ig을 25㎕으로 첨가하였다. 25℃에서 2시간동안 상기 판을 반응시키고 0.05% 트윈 20 함유 PBS로 3회 세척하였다. PBS중 10000배 희석시킨, 염소 F(ab')2 항-사람 IgG Fcγ-특이적 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Jackson)로 결합된 CD40-Ig을 탐지하였다. 0.05% 트윈20 함유 PBS로 상기 판을 4회 세척하고, 50mM 시트르산중의 1mg/ml O-페닐렌디아만 디하이드로클로라이드 및 0.003% 과산화수소, 100mM Na2HPO4, pH5로 반응시킴으로써 결합을 비색계로 정량화했다. 최종 농도 0.36로 H2SO4를 첨가함으로써 반응을 종결시켰고, 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

7. BIAcore 분석

표면 플라스몬 공명(BIAcore)에 의해서 CD40과 항-CD40 변이체간의 상화작용에 대한 동역학 상수를 결정하였다. pH4의 10mM 소디움 아세테이트중의 10㎍/ml CD40-Ig을 8㎕을 주입함으로써 (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]-카르보디이미드하이드로클로라이드) 및 N-히드록시숙시미드-활성화 센서침 CM5에 CD40-Ig 융합단백질을 고정시켰다. 분리단계에서 Fab의 재결합을 방지하기 위해서 CD40-Ig을 낮은 밀도(~150RU)에서 고정화하였다. 결합속도상수(κon)를 얻기위해서, PBS중 5-600nM 범위내에서 6가지 다른 Fab농도에서 20㎕/분 유속에서 결합상수를 결정하였다. 분해단계를 분석함으로써 얻어진 6개 측정치의 평균치가 분해상수(κoff)이다.

BIA 평가 3.0 프로그램으로 센서그램을 분석하였다. Kd = κoff/κon로부터 Kd를 계산하였다. 연장된 분해에 의한 각각의 측정후에 잔류 Fab를 제거하였다.

키메릭 Fab와 비교하여 사람화 항체 F4 및 L3.17에 대한 동역학분석의 결과를 다음의 표1에 나타냈다.

클론 ID #	κon	κoff	Kd	비고
키메릭 Fab	8.43 E+5	2.65 E-3	3.14 nM	키메릭 2.220 IgG의 파파야 절단으로 준비
F4	2.00 E+6	4.77 E-4	0.24 nM	사람화
L3.17	3.17 E+6	3.28 E-4	0.10 nM	사람화

8. 사람화 결과

상기한 바와 같이, 쥐의 항-CD40 mAb 가변영역 골격 서열을 사용하여 가장 상동성이 높은 사람 생식선 서열을 동정하였다. H사슬 골격 잔기는 사람 생식선 VH7(7-4.1) 및 JH4 서열에 74%가 동일하였으며, L사슬은 대응하는 사람 생식선 VKIII(L6) 및 JK4서열과 75% 동일하였다. 도 15에서 H 및 L 사슬의 가변영역 서열 배열을 나타냈다. Kabat등(Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest (5th Ed), Washington DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A. et al., (1977) J.Biol.Chem. 252:6609-6616)에서 정의된 CDR잔기를 밑줄을 그어 표시했고, 상동성 분석에서 배제했다. 쥐 mAb와 사람 주형간에 차이가 있는 골격 잔기들은 개별적으로 분석하였다.

구조 분석 및 서열분석에 기초하여, HCDR3예외를 갖는 항체 CDR은 정규구조(canonical structure)로 불리우는 제한된 수의 주요 사슬 구조를 나타낸다(Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia, C., et al., (1989) Nature 342:877-883). 더욱이, CDR 루프의 주요 사슬형태를 결정하는데 핵심적인 잔기들을 동정하였다(Chothia, C. et al., (1989) Nature 342:877-883). 쥐의 항-CD40의 정규 골격 잔기를 확인하였고, 사람 주형의 H 및 L사슬 골격내의 모든 핵심적인 정규 위치상의 아미노산이 대응하는 쥐의 잔기와 동일함을 결정하였다.

사람항체에서 비정상적으로 발견되지 않는, 표면-노출 쥐의 아미노산은 사람화 mAb의 면역원성에 기여하는 것같다(Padlan, E.A., (1991) Mol. Immunol. 28:489-498). 따라서, 쥐의 항-CD40과 사람주형간에 차이가 나는 잔기를 분석하였고, 용매노출에 기초하여 항체의 펴면에 묻혀있거나 위치하는 지를 예측하였다(Padlan (1991), 상기 문헌). CDR에 대한 용매-노출 골격잔기는 항원결합에 기여하지 않는 것으로 예상되므로, 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해서 사람 아미노산에 대응하도록 두 H사슬 잔기의 예외적인 부분을 변화시켰다. H사슬 잔기 28 및 46은 용매에 노출될 것으로 예상되었다. 그러나, H28은 Chothia 등의 상기문헌에 정의된 바와 같이 HCDR1영역내부에 위치하고, 잠재적으로 항원과 상호작용을 한다. 추가로, 쥐의 mAb 중 H46의 라이신은 약간 예외적이며 사람 주형의 글루탐산과는 상당히 다르다. 따라서, H28 및 H46에서 쥐 및 사람 잔기는 조합 라이브러리에서 발현되었다(도 15에서 별표로 표시함).

항체내에 대부분 묻혀있을것으로 예상된느 나먼지 다른 골격잔기을 다음에 대해서 평가하였다: (1) CDR의 근접성; (2) Vk-VH경계면에서 반대 도메인과의 접촉가능성; (3) 다른 아미노산과의 관련성; (4) Studnicka등(Studnicka, G.M., et al. (1994) Protein Eng. 7:805-814)에 의해서 정의된 바와 같이 CDR의 조절에 있어서의 중요성. 묻혀진 잔기에서 대부분의 L사슬 골격의 차이는 CDR 형채에 직접적으로 관련되지 않을 것으로 여겨지는 위치에 있는 아미노산과 관련된다. 그러나, L49는 LCDR2에 인접한 위치에 있어 잠재적으로 VH 도메인과 접촉할 수 있고, 사람 잔기와 관련성이 없으며, LCDR2 형태 결정에 관련된다. 이러한 이유로, L49에서 쥐와 사람 아미노산은 모두 조합 골격 라이브러리에서 발현되었다(도 15에서 별포).

쥐의 H사슬서열 및 사람주형의 분석은 더욱 복잡한다. 잔기 H9는 쥐 mAb에 있는 프롤린이고 사람 주형은 관련되지 않는 세린잔기를 포함한다. 위치 H9은 또한 CDR형태 조절에 중요한 역할을 할 수 있어, 조합 라이브러리 자리로서 선택되었다(도 15,별표). 쥐 항-CD40과 H사슬 주형에 차이가 있는 나머지 묻혀진 골격잔기는 골격 위치 38, 39, 48, 및 91이다. 쥐의 항-CD40 mAb는 H38 및 H39에서 글루타민과 글루탐산을 각각 포함하였고, 반면에 사람 주형은 아르기닌과 글루타민을 포함하였다. 잔기 H38은 HCDR1에 가깝고, 글루타민-아르기닌 변화는 비보존적이며, 쥐Ab중 이 위치에서 글루타민의 발현은 약간 의외이다. 이와 유사하게, 글루탐산-글루타민의 변화는 묻혀진 아미노산에 대한 비보존적 차이이며, H39는 가능한 VK 접촉잔기이며, 글루탐산은 쥐의 mAb에서 약간 의외이다. 잔기 H48은 HCDR2에 매우 근접하고, H91은 VK도메인과 접촉가능한 고위험자리일 것으로 예측된다(Studnicka (1994), 상기문헌; Harris, L. et al., (1995) Prot. Sci. 4:3306-310). 따라서, 사람 및 쥐잔기 모두는 H38, 39, 48 및 91에서 발현되었다(도 15, 별표).

요약하면, 골격 라이브러리는 사람주형에 이식된 쥐의 CDR로 이루어진다. 추가로, L사슬의 하나 골격잔기 및

H사슬상의 7 골격잔기는 mAb의 활성을 유지하는데 매우 중요한 것으로 여겨진다. 이들 잔기에사 발견되는 모든 가능한 조합의 쥐 및 사람 아미노산을 발현하는 조합 라이브러리를 합성함으로서 이들 모든 자리의 특성을 분석하였다. Hu I라 불리는 이 라이브러리의 전체 다양성은 2⁸또는 256 변이체이다(표 2).

파지-발현 항-CD40 항체라이브러리의 요약

라이브러리 라이브러리 위치 크기* 선별+

HI 골격 256 2.4 X 103HII 골격, HCDR3 1.1 X 1052.0 X 106HIII 골격, HCDR3, LCDR3 3.1 X 1075.5. X 105

*DNA서열에 기초한 유일한 클론의 수. 32 코돈을 사용하여 각 CDR위치에서 모든 20아미노산을 코딩하였다.

+ 소규모 박테리아 배양에서 발현되는 항체를 사용하는 ELISA로 Hu I을 선별했다(Watkins (1997) 상기문헌). XL-1블루/아카배지에 100-mm디쉬에 105 플락으로 Hu II와 Hu III을 깔고 캡쳐 리프트로 선별하였다(Watkins (1998), 상기문헌).

소규모 박테리아 배양(〈1ml)에서 Hu I라이브러리를 발현시키고, 세포주위막 공각에서 유리된 일정량의 Fab를 마이크로티터 판에서 포획하고, 항체의 결합활성을 ELISA로 직접 비교하였다(Watkins (1997) 상기문헌). 키메릭 Fab와 비슷하거나 더 높은 친화성으로 표적 항원과 결합하는 변이체가 확인되었을 지라도, 대부분의 선별된 Hu I 클론은 키메릭 항-CD40 Fab보다 낮은 활성을 나타냈다.

임의로 선택된 Hu I변이체의 약 6%가 키메릭 Fab(자료를 제시하지 않음)에 비슷한 결합활성을 나타냈다. 키메릭 CD40에 필적할만한 활성을 갖는 다중 Hu I변이체의 확인은 조합 라이브러리에 대부분 핵심적인 골격잔기가 포함되어 있다는 해석과 일치한다.

고정된 항체와 적정함으로써 활성 클론을 추가로 특성분석한 결과는, 향상된 활성을 갖는 다중 변이체의 존재를 뒷받침하였다. 예를 들면, 클론 19C11은 키메릭 Fab보다 더 높은 친화성으로 CD40 수용체에 결합하며, 이는 적정농도 양상에서 변화에 의해서 설명된다(도 16, 빈원과 채워진 원). 대부분의 활성 클론중 34의 DNA서열분석으로 24 독특한 골격조합을 동정하였고, 각각은 2-6 쥐 골격잔기를 포함하였다(자료는 제시되지 않음).

LCDR3 및 HCDR3는 직접 항원과 접족하고, 다른 CDR과 상호작용하여, 종종 항체의 특이성 및 친화성에 상당한 영향을 미친다(Wilson, I.A. et al., (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:113-118; Padlan, E.A.(1994) Mol. Immunol. 31:169-217). 이에 더하여, 특정 골격 잔기에 의해서 LCDR3 및 HCDR3의 형태를 부분적으로 결정하였다. 대부분의 활성 항체를 확인하기 위해서, 코돈-기재 변이법(Glaser, S.M., et al., (1992) J. Immunol. 149:3903-3913)를 사용하여 HCDR3의 모든 위치에 한번에 하나씩 변이를 유도한 올리고뉴클레오타이드를 합성하였고, 그 결과로 각 CDR잔기에서 모든 20 아미노산이 발현되었다. 각각의 올리고뉴클레오타이드는 한 아미노산 변화만을 코딩하였다. HCDR3 라이브러를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 풀을 다른 CDR및 조합 골격을 코팅하는 중첩 올리고뉴클레오타이드와 혼합하여 골격/HCDR3 라이브러리를 제조하였다. Hu II라 불리우는 이 라이브러리의 다양성은 1.1 X 10⁵이다(표 2). LCDR3에 대한 라이브러리를 비슷한 방법으로 합성하였다. LCDR3, HCDR3 및 조합골격을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 Hu III이라 불리우는 골격/HCDR3/LCDR3 라이브러리를 제조하였다. 다수의 골격/CDR3 조합의 결과 3.1 X 10⁷복잡성을 갖는 라이브러리가 얻어졌다(표 2).

골격 라이브러리를 갖는 LCDR3 및/또는 HCDR3상의 결합변이는 사람화 항-CD40 변이체의 잠재적인 다양성을 256 내지 107이상으로 증가시켰다. 더 큰 라이브러리를 더욱 효율적으로 선별하기 위해서는, 캡쳐 리프트라 불리우는 변형된 플락 리프트 분석을 사용하였다(Watkins (1998)상기문헌). 간략히 말하면, 고체아가 배지위에 파지가 감염된 박테레아를 깔고, Fab-특이적 시약으로 코팅된 니트로셀룰로스 필터를 중층하였다. 거의 일정한 양의 파지-발현 Fab를 포획한 후에, 필터를 5ng/ml CD40- Ig 융합 단백질로 탐침하였다. 실질적으로 Fab의 Kd이하 농도에서 항원으로 필터가 탐침되었기에, 향상된 친화성을 갖는 변이체만 탐지가능하였다. Hu II로부터 〉10⁶변이체를 선별하고 Hu III 라이브러리로부터 〉105변이체를 필터당 10⁵변이체를 포함하는 82-mm 필터를 사용하여 높은 친화성을 나타내는 다수 클론을 확인하였다.(표 2)

필터상의 높은 파지 농도때문에, 양성 플락을 선택하였고 더 낮은 밀도에 다시 깔고 재선별하였따. 이어서, 캡쳐 리프트분석에서 강한 비색신호를 나타내는 변이체를 추가로 ELISA로 특성을 분석하였다. 예상된 바와 같이, 캡쳐 리프트 선별에 의해 확인된 대다수 클론은 키메릭 Fab보다 더 잘 CD40에 결합되어 있었다. 고정환 CD40-Ig상에 고정된 변이체의 농도는 키메릭 및 사람화 Fab보다 더 높은 친화성을 나타내는 다수의 클론을 확인하였다(도 16, 빈 네모, 채워진 삼각형과 원을 비교).

향상된 친화성을 갖는 골격/CDR 변이를 DNA서열분석으로 확인하였다. 10/13 Hu I 변이체 및 3/4 Hu III 변이체에서 유일한 가변영역 서열을 확인하였다. 표 3에 요약한 바와 같이, 두 Hu II 및 Hu III 변이체는 1-5 쥐의 골격잔기 및 0-2 CDR3변이를 포함하였다.

골격 및 CDR잔기의 동시최적화로 더 높은 친화성을 갖는 변이체를 확인

라이브러리	클론	쥐의 골격 잔기*	CDR변이
	키메릭	(43)	0
Hu I	19C11	(2) H28, 48	0
Hu II	CW43 2B12	(3) H9, 28, 91 (5) H9, 28, 38, 46, 48	HCDR3,101A -〉 R HCDR3,101A -〉 R
Hu III	2B12 2B8	(5) H9, 28, 38, 46, 48 (1) H28	HCDR3,101A -〉 K HCDR3,101A -〉 K; LCDR3,96R -〉 Y

*Kabat등의 상기문헌의 CDR정의에 기초하여 가장 상동성이 큰 사람의 생식성 서열과 다른 쥐의 골격잔기의 수. 사람 주형과 다른 쥐의 골격잔기의 수는 괄호안에 나타냈다. 쥐 mAb와 사람화 버젼간에 모든 다른 골격잔기는 Kabat등의 번호체계를 사용하여 표시한 위치에서 H사슬(H)에 위치한다.

고정화된 CD40-Ig과 정제된 Fab의 결합속도 및 분해속도를 결정하기 위해서, 표면 플라스몬 공명측법을 사용하여 박테리아 발현 키메릭 Fab와 상기 각 라이브러리에서 선택된 변이체간의 치환성을 더욱 자세히 분석하였다. 키메릭 항-CD40은 분해상수 Kd가 3.14nM이며, 이는 선별결과와 일치했으며, 많은 변이체는 더 높은 친화성을 나타냈다. 최상의 클론, F4 및 L3.17은 Kd가 0.24nM, 및 0.10nM이다(표 1). 결합상수는 모든 변이체와 유사하기 때문에(0.9-3.2 X 10⁶M^-1s^-1범위), 항-CD40 변이체의 향상된 친화성은 주로 분해상수가 낮아진 때문이다.

마지막으로, 향상된 친화성을 나타내는 변이체가 CD40 수용체에 대한 gp39리간드의 결합의 차단능을 시험하였다. 양의존성 방식으로 고정화된 gp39에 대한 수용성 CD40-Ig 융합단백질의 결합을 모든 변이체가 저해하며, 이는 Fab의친화성과 상관성이 있다(도 17). 예를 들면, CD40-Ig융합 단백질과 리간드결합에 대한 가장 강력한 저해자는 변이체 2B8이며, 이는 또한 CD40에 대한 가장 높은 친화성을 가진 변이체이다(도 17). 변이체 2B8은 키메릭 Fab에보다 CD40에 대한 친화성이 약 17배 높고, 리간드 결합저해를 약 7배이상 효과적으로 수행한다.

실시예 5

마우스 모델계

출원인은 또한 7E10G2b 및 이의 전구체, 7E1-G1을 지정하는 래트 항-쥐 CD40 mAb을 개발하고 생체내 시험을 하였다. 자기면역질환, 염증성 질환, 및 이식질환의 쥐 모델에서 항-CD40 치료의 잠재성을 개발하기 위해서, 상기 항체를 제조하였다. 마우스 모델계의 주요한 목적은 약한 공동자극 활성을 가지나 gp39/CD40에 대한 완전하고도 강력한 2.220의 저해을 모방하는 항-쥐 대응부를 제조하고, 표준실험질환 모델에서 이를 생체내 실험을 위한 것이다.

A. 항-쥐 CD40 단클론 항체 7E1-G1 및 7E1-G2b의 분리 및 특성화

1. 면역화, 융합 및 특성화

마우스 IgG2a항체(mCD40-mIg)의 힌지, CH2, 및 CH3 도메인에 융합된 마우스 CD40의 세포외 영역으로 이루어지는 쥐의 재조합 CD40 면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 각부 접종을 경유하여 8주령 암컷 루이스 래트를 면역하였다. 마지막 면역화후 3일째에, 배농 림프절의 림프구를 X6-Ag8.653 마우스 골수종 세포와 융합하여 래트 X 마우스 헤테로하이브리도마를 제조하였다. 천연 마우스 CD40에 특이적인 항체를 포함하는 웰에서 ELISA로 최초 mCd40-mIg 이뮤노겐과의 반응성을 확이하고, CD40 양성 마우스 B세포 림프종 세포주(WEHI-231, ATcc CRL-1702)와의 반응성을 확인하였다. 수용성, 재조합 mCD8-mIg gp39 융합단백질, mgp39, sgp39의 쥐 동등물에 대한 mCD40-mIg의 결합을 저해하는 능력에 대해서 상등액을 조사하였다. 제한 희석법으로 가장 강력한 저해자 매스터웰의 약 12개를 클로닝하였다.

클로닝후에, CD40과 쥐 gp39와의 상호작용을 저해하는 항-CD40 mAb의 능력을 더욱 정확히 측정하고 이들의 자극특성을 결정하기 위해서, 배양상등액과 정제된 항체로 기능분석을 수행하였다. 본기술분야에서 알려진 표준방법을 사용하여 WEHI-231에 대한 mgp39의 결합을 저해하는 능력을 측정함으로써 저해특성을 측정하였다. 본기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 항체와 항-IgM의 존재하에 비장 B세포의 증식과 WEHI-231 세포의 강한 동형부착의 도입함으로써 자극특성을 측정하였다. 이들 결과로 부터, gp39/CD40 차단 및 공동자극 활성수준면에서 세가지 항체(5A3, 7E1-G1, 8E1)이 가장 항-사람 CD40 mAb 2.220과 같은 것으로 결정되었다.

2. 우세한 항-쥐 CD40 mAb로서 7E1의 선택

마우스에서 생체내 연구의 목적은 차단/비자극 항-CD40 mAb가 T-의존성 항원에 대한 특이적 항체반응을 가장 강력히 억제하는 지를 확인하는 것이다. 마우스에서 항-쥐 CD40 mAb로서 SRBC에대한 IgG항체반응의 억제를 연구하였다. 5 BALB/c마우스 그룹을 1 X 10⁸SRBC로서 IV면역화하고, 동시에 1mg 항-쥐 CD40 mAb 5A3, 7E1-G1, 8E1 ip 처리하였다. 대조구로서, 유사하게 면역한 마우스 그룹을 MR1(햄스터 항-쥐 gp39, 양성대조구, 250㎍), 6E9(래트 항-사람 gp39, 음성대조구, 1mg), 또는 PBS를 처리하였다. 상기 마우스에 대해서 7, 14, 21 및 35일째에 ELISA로 IgG 항-SRBC농도를 평가하였다. 상기 결과에 의하면, SRBC로 항체 자극을 한 때에 단일 투여량 항체로 투여하였을 경우에, mAb 5A3, 또는 8E1에 비해 mAb 7E1-G1이 더욱 효과적인 IgG 항-SRBC에 대한 억제자임이 밝혀졌다. 따라서 쥐연구를 위한 우세한 항-CD40 mAb로서 7E1-G1를 선택하였다.

3. mAb 7E1-G1의 이소타입 스위치 변이체

7E1-G1는 키메릭 2.220 항-사람 CD40 mAb의 것에 필적할만한 효과자 기능특성을 가지고 있지 않으며(즉, 래트 IgG1은 보체고정 및 Fc 수용체 상호작용에서 사람 IgG1만큼 효과적이지 않다), 7E1에 대한 특이적 항체 억제 양상은 영장류에서 2.220 mAb에서 보인 것과 같만큼 완벽하지 않다. 따라서, 7E1 특이성을 가지나 사람 IgG1이상의 효과자 능력을 갖는 래트 이소타입을 갖는 항체를 찾았다. 이를 위해서, IgG 내지 IgG2b까지의 천연 이소타입 스위치 변이체를 선별기술(Hale et al., J. Immunol. Methods (1987) 103(1): 59-67)로 제조하였다. 요약하면, 최초 7E1 하이브리도마로 1000 세포/웰농도로 접종했던 96웰 플레이트의 상등액중에서 ELISA법으로 IgG2b 이소타입의 항-CD40 mAb을 확인하였다. 접종 밀도 200으로 IgG2b 양성웰을 연속적으로 깔고 확인한 후에, 제한희석법으로 2회 클로닝을 하여 7E1, 7E1-G2b의 단일한 IgG2b 스위치 변이체을 분리하였다.

다음의 세가지 자료에 의해서 설명되는 바와 같이, 7E1-G2b는 IgG1의 적합한 스위치 변이체이다. 첫째, 중쇄의 N-말단 서열에 의하면 두가지 버젼은 첫번째 35 아미노산 잔기가 동일하다. 둘째, 7E1-G1의 중쇄 CDR에 대한 특이적 프라이머를 이용한 PCR분석의 결과, 7E1-G1 및 7E1-G2b중 어느 하나로부터 얻어진 cDNA로 부터 적합한 크기의 밴드 및 다른 두가지 무관한 항체를 얻었다. 마지막으로, 항-카파 탐침 시약을 사용한 ELISA에서고정화된 mCD40-hIg에 대한 정제된 다량의 두가지 버젼의 결합활성을 분석한 결과, 본질적으로 동일한 적정농도 곡선을 얻었다.

B. 생체내 연구

1. 항체반응 모델에서 7E1-G2b에 대한 7E1-G1의 생체내 비교

T세포 의존성 항체로서 SRBC를 사용하여 생체내 효능면에서 7E1-G2b와 7E1-G1을 비교하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 3 내지 5마리 동물로 이루어진 그룹을 SRBC iv로 면역화하고, 동시에 항체 7E1-G1와 7E1-G2b 1, 0.25 또는 0.1mg을 0일째에 ip로 처리하였다. 항-쥐gp39 mAb MR1이 면역억제효과에 대한 양성대조구로 작용하였다. mAb 6E9 및 PBS가 각각 무관한 mAb 및 mAb대조구가 없는 것으로 하였다. 7, 14 및 21일째에 ELISA로서 항-SRBC에 대해 마우스를 측정하였다. 적정농도는 ELISA에서 OD값 0.3을 얻는 계산된 혈청희석을 나타낸다. 도 10에서 나타낸 바와 같이, 7E1-G2b는 SRBC에 대한 IgG반응을 억제했으나, 7E1-G1은 억제하지 못했다.

2. T-의존성 항원 마우스 모델에서 7E1-G2b 양반응

항원으로서 SRBC를 사용하여 T세포 의존성 1차 면역반응 모델에서 7E1-G2b를 조사하였다. 최저 유료랴을 결정하기 위해서 다양한 농도에서 7E1-G2b를 시험하였다. 1 X 108 SRBC를 iv로 BALB/c 마우스(n=5)에 주입하고, 정해진 양으로 7E1-G2b를 1회 처리하거나, MR1(항- 쥐 gp39) 또는 PBS를 0일째 항원으로서 동시에 투여하였다. 측정치는 혈청 희석 1/50에서 ELISA흡광도이다. 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.

도 11에서 나타낸 바와 같이, 25㎍ /마우스(1.25 mg/kg)에서 7E1-G2b의 1회 처리로 16일째 IgG 면역반응이 87%만큼이나 억제되었고, 50 ㎍또는 ㎍100 양의 경우에 16일째에 완전히 억제되었다. 부분최적량 100㎍/마우스로 면역억제에 대한 양성 대조구로서 MR1을 사용하였음을 주목하라.

3. 예방적 콜라겐-유동성 관절염(CIA) 마우스 모델에서 7E1-G2b

관절염 예방에 대한 7E1-G2b의 효과를 결정하기 위해서 류마티스 관절염에 대한 표준실험모델인 콜라겐 유도성 관절염 모델을 사용하였다. 완전한 Freund부형제중 닭 콜라겐 유형 II(CII) 200㎍을 DBA/1J 수컷 마우스(6-8주령)에게 0일째 피하로 주입하였다. 7E1-G2b 250 ㎍/투여량을 7일째부터 매일 4일간 처리하였다. 대조구를 동일한 계획에 따라 PBS를 투여하였다. 21일째에 불완전한 Freund 부형제중 CII로 모든 마우스를 재면역화하였다. 상기 마우스의 발부종을 매일 관찰했고 최대 부종 및 홍반을 3점으로 하여 매일 0-3의 점수를 주관적으로 매겼다. 캘리퍼로 매일 부종을 측정하였다. 보고된 임상점수는 희생시에 각 발의 점수를 합산하고 각 그룹에서 전체동물수를 나누어져 얻어졌다. 보고된 수치는 그룹의 중간범위이다.

아래에 표 4에서 나타낸 바와 같이, 7E1-G2b에 의한 치료로 마우스에서 관절염 진전 및 관절 염증을 완전히 저해하였다. 7E1-G2b로 처리한 마우스는 90일째에 완전히 질병이 없어졌다.

상기한 바와 같이, 본발명의 항체는 다양한 질병에 치료용도를 갖는 강력한 면역조절제이다.

본발명은 CD40 결합에 실질적으로 효과가 없는 추가적인 보존적 아미노산 치환체를 가진 키메릭 항체 및 사람화 항체를 포함한다. 보존적 치환체는 전형적으로 비스한 특성을 갖는 다른 아미노산을 또다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대, 다음의 그룹내에서의 치환을 포함한다:발린, 글리신; 그리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파트산, 글루탐산; 아스파라진, 글루타민; 세린, 쓰레오닌; 라이신, 아르기긴; 및 페닐알라닌, 타이로신.

일례에서, 본발명은 사람의 불변영역을 코딩하는 DNA단편에 부착된, 쥐의 경쇄 가변영역과 사람의 중쇄 가변영역(또는 이들의 부분)을 코딩하는 재조합 DNA단편을 발현함으로써, 상기 키메릭 및/또는 사람화 항체를 제조하는 것이다. 본발명에 따른 전형적인 DNA 서열은 SEQ ID NO:1 또는 이의 기탁된 ATCC 클론에서 나타낸 것과 같은 경쇄 가변영역의 일부분 또는 모두, 및/또는 SEQ ID NO:2 또는 이의 기탁된 ATCC 클론에 나타낸 중쇄 가변영역의 일부또는 모두를 포함하는 폴리펩티드 사슬을 코딩한다. 기재된 중쇄 및 경쇄 가변영역 및 이들의 활성 또는 기능적 부분도 모두 본발명의 범위내에 포함된다. 상기 단백질의 면역적으로 유능한 또는 기능적인 형태 또는 이들의 일부분도 또한 본명세서에서 "중쇄/경쇄 가벼영역, 또는 생물학적으로 활성인 이들의 부분"으로 언급된다. 본발명에서, 이들의 생물학적으로 활성인 부분이란, 항체에 병합되는 경우에 여전히 항체가 사람 CD40에 결합하게 하는 것을 이다.

본발명의 항체의 가변중쇄와 가변 경쇄를 코딩하는 핵산서열도 구체적으로 본발명의 범위내에 포함된다. 예를 들면, 도 13의 뉴클레오타이드 1057 내지 1422(SEQ ID NO:5)는 본발명의 항체의 가변 중쇄를 코딩하는 바람직한 핵산서열을 제공한다; 도 14의 뉴클레오타이드 1065-1388(SEQ ID NO: 6)은 본발명의 항체의 가변 경쇄를 코딩하는 바람직한 핵산서열을 제공한다. SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11은 본발명의 사람화 항체의 가변 경쇄를 코딩하는 바람직한 핵산서열을 나타낸다: SEQ ID NO: 9는 본발명의 사람화 항체의 가변 중쇄를 코딩하는 바람직한 핵산서열을 나타낸다: SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:11에서 나타낸 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드는 ATCC에 기탁했다.

사람 CD40에 결합하고, 본명세서에 기재된 가변 중쇄 및 경쇄 서열에 실질적으로 상동성이고 실질적인 서열동일성이 있는 폴리펩타이드를 포함하는 키메릭 및/또는 사람화 항체도 또한 본발명에 포함된다. 예를 들면, SEQ ID NO:4에 나타난 가변경쇄 영역와 약 85%이상의 서열동일성, 바람직하게는 약 90%이상의 서열동일성, 더욱 바람직하게는 약 95%이상의 서열동일성, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 서열동일성을 나타내는 가변 경쇄영역을 포함하는 키메릭 항체도 본발명의 범위에 포함된다. 특히, SEQ ID NO:4에 나타난 가변경쇄 영역와 약 85%이상의 서열동일성, 바람직하게는 약 90%이상의 서열동일성, 더욱 바람직하게는 약 95%이상의 서열동일성, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 서열동일성을 나타내는 가변 경쇄영역을 포함하는 키메릭 항체도 본발명의 범위에 포함된다. 또한, SEQ ID NO:8 및/또는 SEQ ID NO:12 에 나타난 가변경쇄 영역와 약 85%이상의 서열동일성, 바람직하게는 약 90%이상의 서열동일성, 더욱 바람직하게는 약 95%이상의 서열동일성, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 서열동일성을 나타내는 가변 경쇄영역을 포함하는 사람화 항체도 본발명의 범위에 포함된다.

추가적으로, SEQ ID NO:3에 나타난 중쇄 영역와 약 85%이상의 서열동일성, 바람직하게는 약 90%이상의 서열동일성, 더욱 바람직하게는 약 95%이상의 서열동일성, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 서열동일성을 나타내는 중쇄영역을 포함하는 키메릭 항체도 본발명의 범위에 포함된다. 특히, SEQ ID NO:2에 나타난 가변중쇄 영역와 약 85%이상의 서열동일성, 바람직하게는 약 90%이상의 서열동일성, 더욱 바람직하게는 약 95%이상의 서열동일성, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 서열동일성을 나타내는 가변 중쇄영역을 포함하는 키메릭 항체도 본발명의 범위에 포함된다. 추가적으로, SEQ ID NO:10에 나타난 가변중쇄 영역와 약 85%이상의 서열동일성, 바람직하게는 약 90%이상의 서열동일성, 더욱 바람직하게는 약 95%이상의 서열동일성, 가장 바람직하게는 약 98%이상의 서열동일성을 나타내는 가변 중쇄영역을 포함하는 사람화 항체도 본발명의 범위에 포함된다.

DNA단편은 일반적으로 자연적으로 결합되거나 이종 프로모터 영역을 포함하는, 키메릭 또는 사람화 항체를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 발현조절 DNA을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현조절서열은 진핵숙주세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터내의 진핵 프로모터 시스템일 수 있으며, 또한 원핵숙주를 위한 조절서열일 수도 있다. 일단 벡터가 적합한 숙주세포로 병합되면, 상기 높은 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 숙주를 유지하며, 바람직하게는 경쇄 가변영역, 중쇄가변영역, 경쇄/중쇄 이량체, 또는 완전한 항체, 결합단편 또는 다른 면역글로불린 형태를 모으고 정제하는 단계를 이어서 할 수 있다(Beychok, S., "Cells of Immunoglobulin Synthesis", Academic Press, N.Y., (1979)참조). 본명세서에 기재된 VH 및 VL 영역을 코딩하는 핵산을 폴리펩타이드 링커를 코딩하는 DNA로 연결하여 단일사슬 항체를 제조할 수도 있다.

E.coli와 같은 원핵 숙주 및 다른 미생물, 예컨대 효모를 사용하여 본발명의 항체를 발현할 수도 있다. 미생물에 더하여, 포유동물 조직 세포배양물을 사용하여 본발명의 항체를 발현 및 생산할 수도 있다. 완전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 적합한 숙주 세포주, 예컨대 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포주, 골수중 세포주 및 하이브리도마을 포함하는 다수가 본기술분야에서 개발되어 있기 때문에, 진핵세포가 바람직할 수도 있다. 이들 세포이 발현벡터로는 본기수분야에서 알려진 프로모터 또는 인핸서와 같은 발현조절서열, 및 리보좀 결합자리, RNA스플라이싱 자리, 폴리아데닐화 자리, 전사 종료서열와 같은 필요한 가공 정보자리을 포함할수 있다. 잘알려진 방법으로 목적 DNA단편(예, 경쇄 및/또는 중쇄 코딩 서열 및 발현조절서열)을 포함하는 벡터를 숙주세포로 전달할 수 있으며, 전달방법은 숙주세포의 유형에 따라 다르다. 예를 들면, 진핵세포에서는 칼슘 클로라이드 형질감염이 널리 사용되고, 다른 숙주세포에서는 칼슘 포스페이트 처리나 전기천공등이 사용될 수 있다(예, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1982)를 참조).

본발명의 완전한 항체, 이들의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 다른 면역글루불린 형태가 일단 발현되면, 암모늄 설페이트 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동, 기타등등을 포함하는, 본기술분야에서 알려진 표준방법으로 이들을 정제할 수 있다. 약제학적 용도로는, 90 내지 95%이상의 동질성을 갖는 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98 내지 99%, 또는 더욱 동질성이 높은 것이 더욱 바람직하다.

본발명의 항체의 용도는 일반적으로 항체 매개 및/또는 T세포 매개 질병에서 찾을 수 있다. 치료를 위해 적합한 전형적인 질병에는 대숙주이식편 질환과 이식거부, 및 유형 I 당뇨병, 건선, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 중증 근무력증과 같은 자기면역질환이 포함된다.

본발명의 항체 및 약리적 조성물은 특히 비경구, 즉 피하, 균육내, 정맥내 투여에 특히 유용하다. 비경구 투여를 위한 약리적 조성물은 일반적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수용성 담체에 용해된 항체의 용액일 수 있다. 본기술분야에서 널리 알려진 다양한 수용성 담체, 예컨대 물, 완충액, 식염수, 글리신 등과 같은 담체를 사용할 수 있다. 이들 용액은 멸균 또는 일반적으로 미립자 물질이 없다. 종래의 잘 알려진 멸균방법으로 이들 약리적 조성물을 멸균할 수 있다. 상기 조성물은 소디움 아세테이트, 소디움 클로라이트, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소디움 락테이트, 사람 알부민 등과 같은 pH조절제 및 완충제, 독성조절제와 같은 생리적 조건에 필요한, 약리적으로 허용가능한 보조성분을 포함할 수도 있다.

본발명의 항체를 포함하는 조성물을 예방적 치료 및/또는 치료적 처리를 위해서 투여할 수 있다. 치료적 적용에 있어서, 이미 질병을 앓고 있는 환자에게 질병을 치료하거나 적어도 질병 및 합병증을 부분적으로 억제시키기에 충분한 양의 상기 조성물을 투여한다. 이 목적을 달성하기에 적합한 양은 "치료적 유료량"으로서 정의되어 있다. 이러한 목적에 유효한 양은 질병상태의 위중도 및 환자 자신의 면역체계의 일반적인 상태에 따라 결정될 것이며, 본기술분야의 전문가에 의해서 결정될 수 있다.

예방적 적용에 있어서, 환자의 저항성을 향상(면역반응을 억제)하기 위해서 질병에 걸리지 않은 대상에게 본발명의 항체를 포함하는 조성물을 투여한다. 그러한 양은 "예방적으로 유효한 양"으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 환자의 건강상태 및 일반적인 면역수준에 따라 결정된다. 바람직한 예방용도로는 이식거부, 예컨대 신장이식거부을 방지하기 위한 것이 있다.

예를들어 본발명을 자세히 기술하였으나, 이는 발명의 명확성 및 이해를 위해 제시된 것일 뿐 어떠한 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 범위내에서 행해질 수 있음일 명백할 것이다.

Claims (30)

1. SEQ ID NO:1(도 4a)에 나타난 아미노산서열 모두 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분을 포함하는 경쇄 가변영역.
2. SEQ ID NO:2(도 4b)에 나타난 아미노산서열 모두 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분을 포함하는 중쇄 가변영역.
3. 제 1항의 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄, 및 중쇄를 포함하며 사람 CD40에 결합하는 키메릭 항체.
4. 제 2항의 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄, 및 경쇄를 포함하며 사람 CD40에 결합하는 키메릭 항체.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 중쇄는 제 2항의 중쇄 가변영역을 포함하는, 키메릭 항체.
6. SEQ ID NO: 4에 나타난 아미노산서열 모두 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분을 포함하는 경쇄와 SEQ ID NO: 3에 나타난 모든 아미노산서열 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분을 포함하는 중쇄을 포함하고, 사람 CD40에 결합하는 키메릭 항체.
7. 제 1항의 경쇄 가변영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 핵산분자.
8. 제 2항의 중쇄 가변영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 핵산분자.
9. 제 7항의 핵산서열을 포함하는 발현벡터.
10. 제 8항의 핵산서열을 포함하는 발현벡터.
11. 제 1항의 경쇄 가변영역의 일부분을 포함하는 사람화(humanized) 항체.
12. 제 2항의 중쇄 가변영역의 일부분을 포함하는 사람화(humanized) 항체.
13. 제 5항의 키메릭 항체를 포함하는 약리적 조성물.
14. 제 6항의 키메릭 항체를 포함하는 약리적 조성물.
15. 제 1항의 경쇄 가변영역과 90%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역과, 중쇄를 포함하고 사람 CD40에 결합하는 키메릭 항체.
16. 제 2항의 중쇄 가변영역과 90%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과, 경쇄를 포함하고 사람 CD40에 결합하는 키메릭 항체.
17. T 세포 매개성 질환을 갖는 환자에게 치료적 유효량의 제 14항의 약리적 조성물을 투여하는 것으로 이루어지는, T 세포 매개성 질병을 치료하는 방법.
18. 제 7 항에 있어서. SEQ ID NO:6에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자.
19. 제 8 항에 있어서, SEQ ID NO:5에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자.
20. 제 6 항에 있어서, SEQ ID NO:4에 나타난 경쇄 아미노산서열과 SEQ ID NO:3에 나타난 중쇄 아미노산서열을 포함하는 키메릭 항체.
21. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:8에 나타난 경쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
22. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:10에 나타난 중쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
23. 제 12 항에 있어서, SEQ ID NO:8에 나타난 경쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
24. 제 12 항에 있어서, SEQ ID NO:10에 나타난 중쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
25. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:8에 나타난 경쇄 가변영역과 SEQ ID NO:10에 나타난 중쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
26. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:12에 나타난 경쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
27. 제 26 항에 있어서, SEQ ID NO:10에 나타난 중쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
28. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:12에 나타난 경쇄 가변영역과 SEQ ID NO:10에 나타난 중쇄 가변영역을 포함하는 사람화 항체.
29. 제 25항의 사람화 항체를 포함하는 약리적 조성물.
30. 제 28항의 사람화 항체를 포함하는 약리적 조성물.