UA71909C2 - Chimeric anti-human cd40, nucleic acid molecule, expression vector, pharmaceutical composition for treatment of diseases mediated by t-cells containing chimeric body - Google Patents

Description

Опис винаходу

Імунні/запальні реакції опосередковуються складною послідовністю взаємодій. Відомо, що однією з важливих 2 систем при здійсненні таких взаємодій є пара СО40/д9р39, що належить до систем типу "ліганд-рецептор".

Взаємодія СО40/др39 опосередковує численні важливі сигнальні реакції між активованими Т-клітинами й іншими ефекторними клітинами імунної системи, що приводить до посилення імунного/запального відгуку. Відгуки на сигнальні реакції за допомогою СО40 включають допомогу Т-клітин В-клітинам у процесі гуморального імунного відгуку, індукцію цитокінів моноцитами й експресію молекул адгезії на ендотеліальних клітинах. 70 Срабо належить до поверхневих клітинних рецепторів типу І і є членом родини рецепторів фактора некрозу пухлин (ТМЕК). Незважаючи на те, що спочатку СО40 був ідентифікований як В-клітинний антиген, сьогодні вважається, що він експресується всіма антиген-презентативними клітинами (АПК), включаючи дендритні клітини, кератиноцити і моноцити. СО40 також експресується такими типами клітин, які спроможні функціонувати як АПК у визначених умовах, наприклад судинними ендотеліальними клітинами або клітинами, залученими до прямої взаємодії з Т-клітинами, або попередниками Т-клітин, такими як епітеліальні клітини тимусу. Нещодавно було також повідомлено, що СО40 може експресуватися фібробластами, еозинофілами й активованими

Т-клітинами. Показана можливість експресії СО4О також клітинами злоякісних пухлин. Підтвердження цьому спочатку було отримано шляхом ідентифікації визначених клітинних ліній, що походять від карциноми і меланоми, які були позитивними за СО40 |Сіагк апа І едрецег, Ргос. Май. Асайд. Зсі. (1986) 83; 4494-98;

Вспгівмег єї аї.,.. Ехр. Мей (1989) 169:2043-58; Саих еї аіЇ.,, 9. Ехр. Мей. (1994) 180:1263-72; АїЇІдегвоп еї аі., У. Ехр. Мей. (1993) 178:669-74; Моцпд еї аї., Іпї 9. Сапсег (1989) 43:786-94; Рацшіе еї аїЇ., Сапсег

Іттипої. Іттипоїйег. (1985) 20:23-28; ЮОепівеій ей аїЇ.,, Еицг. 9. Іттипої. (1996) 26:2329-34; Савзрагі еї аї.,

Ешцг. 9. Іттипої. (1996) 26:1371-77; РедцеїМамагто еї аїЇ. 9. Іттипо!ї (1997) 158:144-52; НоПепрацонй еї аї.,

У. Ехр. Меа. (1995) 182:33-40; Са|у апа 5ріїв. У). Іттипої (1992) 149:775-821. с 29 СбрЗО відомий також як СО40Ї, ТКАР, Т-ВАМ і. нещодавно на Робочій нараді з лейкоцитарних антигенів Ге) одержав офіційну познаку СО 154. У дослідженнях іп міо др39 виявляється на Т-клітинах приблизно через 2-4 години після активації Т-клітин і досягає пікових значень через 6-8 годин. Потім рівень білка швидко падає і стає таким, що не визначається, через 24 годин після стимуляції. Експресія др3О виявляється також на еозинофілах і гладких клітинах. (МоеПе еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. (1992) 89:6550-54; НоПепрацонй еї аї., о

ЕМВО 3. (1992) 11:4313-21; Зргіддз еї аїЇ., У. Ехр. Меа. (1992) 176:1543-50; ОСгаї еф аі. Ей. 9У. ІптптипоЇї «3 (1992) 22:3191-94; Сомеу сеї аїЇ.,, Мої. ІттипоЇї. (1994) 31:471-84; СавзЦе еї аїЇ, 9. Іттипої. (1993) 151:1777-88; Коу еї аї., У. Іттипої. (1993) 151:2497-2510; Сацснаї еї аіЇ., Майте (1993) 365:340-43; Сациснаї Ме. его а). Еицг. у. Іттипої. (1995) 25:863-65; Ковзпу еї аї., 9. Сійп. Іпмеві. (1996) 98:826-37; ЮОезаі-Мена ес а, У. Сііп. Іпмеві (1996) 97:2063-73). 3о С040 є можливим сигнальним рецептором, що забезпечує механізм, за допомогою якого активовані Т-клітини в регулюють широкий спектр імунних і запальних реакцій. Експерименти іп мйго і іп мімо із рекомбінантними формами ліганду одр39 і моноклональними антитілами (мАТ) проти СО40 показали, що сигнал, який передається за допомогою згаданого рецептора, призводить до клітинного відгуку в усіх відомих СО40"-клітинах, і що такий « результат не тільки варіює залежно від типу клітин, але також моделюється за рахунок конкурентних сигнальних -о 70 процесів, обумовлених іншими рецепторами. У В-клітинах, наприклад, сигнальні процеси за участі СО40, що с тісно взаємодіють із сигнальними процесами на основі рецепторів ІЇ-4, приводять до проліферації В-клітин і :з» продукування антитіл ізотипу Ід Е, у той час як сигнальні процеси за участі СЮО40 разом з сигналами від рецепторів ІЇ/-10, приводять до проліферації В-клітин і з продукування антитіл ізотипу дД ОО |Согаоп еї аї.,

Ешцг. 9У. Іттипої. (1987) 17:1535-38; Коиззеї еї аїЇ.,, 9. Ехр. Мей. (1991) 173:705-710; дарага еї аї., 9. Ехр. 395 Мей. (1990) 172:1861-64; Сазсап еї аїЇ., У. Іттипої. (1991) 147:8-13). брЗО9, що опосередковує сигнальні процеси за участі СО40О, може грати певну роль у клітинному імунітеті за рахунок індукування СО8О і СО86, - важливих молекул Т-клітин, що співстимулюють, які зв'язують СО28 і СТІ А4 |Соїавівїп еї аї!., Мої. Іттипо). (1996) 33:541-521.

Система "СОр40/др39 рецептор/ліганд" є однією з численних систем, залучених до продуктивної взаємодії між (ав) 50 активованими Т-клітинами й іншими клітинами імунної системи. Проте, численні дані дозволяють припустити, що с така взаємодія є унікальною і відіграє центральну роль у регуляції гуморального імунного відгуку в людини.

Зокрема показано, що дефекти структури одр39 і недостатність його експресії є причиною імунодефіциту в людини, відомого як Х-зв'язаний гіперсиндром ЯМ (Х-НІМ). Зазначений імунодефіцит характеризується нездатністю індивідуумів продукувати антитіла будь-якого іншого ізотипу, ніж ізотипу (ЯМ, що свідчить про 59 необхідність продуктивної взаємодії між др39 ії СО40 для забезпечення ефективного гуморального імунного

ГФ) відгуку |Аїйеп еї аїЇ. Зсіепсе (1993) 259:990-93; Агийо сеї аїЇ.,, Сей (1993) 72:291-300; Оі Запо еї аї., 7 Майте (1993) 361:541-43; ГРшіеіїйнап еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. (1993) 90(6) :2170-73; Копйацег еї аї.,

Маїцге (1993) 361:539-541; Моїіагапдею еї аїЇ., Іттиподеї. Кем. (1992) 3:101-22). Подібно цьому нещодавно отримані дані свідчать про те, що Х-незв'язаний НІМ-синдром людини обумовлений дефектами СО40-молекули. бо Використовуючи технологію генного нокауту, були отримані миші, що втратили СО40 або др39. Ці миші мають фенотип, який виявляє ті самі ознаки, що і фенотип при НІМ-синдромі, дозволяючи припустити, що такі миші є підхожою моделлю для тестування іп мімо ефектів уведення мАТ проти СО40 або др39, що блокують взаємодію між СО40 ії др39 (Кажшаре еї аї., Іттипйу (1994)1:167-78; Хи еї аїі., Іттипйу (1994) 1:423-431; Кепезпам еї а!., У. Ехр. Меа. (1994) 180:1889-1900; Савійдії еї аі., Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА (1994) 91:12135-39). бо Ефекти іп мімо інгібування взаємодії СО40/др39 інтенсивно вивчались на нормальних мишах і моделях захворювання на тваринах за використання моноклональних антитіл хом'ячка проти миші (МК).

Імуносупресорна спроможність антитіл відбивала їхню властивість цілком інгібувати гуморальний імунний відгук на залежні від Т-клітин антигени |Боу еї аїЇ., У. Ехр. Меа. (1993) 178:1567-75). На моделях мишей було показано, що деякі захворювання імунної системи, включаючи ті, що опосередковуються клітинними імунними реакціями, інгібуються при використанні зазначених антитіл. Моделі на тваринах показали, що до захворювань, які інгібуються антитілами проти др39, належать індукований колагеном артрит, експериментальний алергічний енцефаломіеліт, люпозний нефрит, відторгнення трансплантату і реакція "трансплантат проти хазяїна" |Оигіє еї аІ,, Зсіепсе (1993) 261:1328-30; Вегу еї аїЇ., неопубл.; Сегтіївзе еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. сі. ОБА (1995) 7/0 93:2499-504; Мойап ек аї., у. Іттипої. (1995) 154:1470-1480; Іагвеп еї а. Тгаперіапіайоп (1996) 61:4-9;

Напсоск еї аї., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА (1996) 93:13967-72; РагКег еї аїЇ.,, Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА (1995) 92:9560-64; ие ей аїЇ.,, 9. Сііп. Іпмевзі. (1994) 94:1333-38; МУаПйасе сеї аїЇ., неопубл.). Роль сра40/дрз39 в ампліфікації клітинного імунного відгуку може бути безпосередньою, через стимуляцію субпопуляції активованих Т-клітин, що спроможні експресувати СО40, або опосередкованою, через індукцію цитокінів й 7/5 експресію важливих співстимулюючих поверхневих клітинних молекул, у тому числі СОВО ії СО86, що зв'язують

Т-клітинні рецептори СО28 і СТІ А-4. Протизапальні ефекти інгібітора показані при вивченні експериментальних моделей індукованого киснем ушкодження легенів на мишах. Дію на запалення іп мімо можна уявити, виходячи з результатів іп мйго, що показують стимуляцію СО40 на судинних ендотеліальних клітинах і моноцитах, що приводить до експресії молекул клітинної адгезії, оксиду азоту (МО), матриксних металопротеїназ і запальних 2о цитокінів |Кіепег еї аї., У. Іттипої. (1995) 155:4917-25; Майк ек а, У. Іттипої. (1995) 156:3952-60;

НоїІепрацон еї! а/!., У. Ехр. Меа. (1995) 182:33-401.

Проведені на мавпах дослідження при використанні моноклональних антитіл проти др39 людини показали, що біологічні сполуки, що інгібують взаємодію між СО40 і др39 іп мімо, є ефективними імуносупресорними агентами в приматів. Показано, що мАТ проти др39 ефективно інгібують антитільний відгук на залежні від сч орб Т-клітин антигени і запобігають відторгненню алотрансплантатів. Ці результати аналогічні результатам, о отриманим на гризунах.

Узяті разом, вищеописані дослідження показали, що агенти, що руйнують взаємодію між СО40 і др39, можуть бути можливими імуносупресорними і протизапальними сполуками. Таким чином, існує необхідність у розробці ефективного методу блокування взаємодії СО40 і одр39 для забезпечення імуносупрессивного або Ге! зо протизапального ефекту. Мета даного винаходу полягає в одержанні антитіл, що блокують взаємодію між адрЗ39 і содо. -

Інший об'єкт винаходу стосується химерного антитіла, що ефективно блокує взаємодію між др39 і 2040. Ге!

Ще один об'єкт винаходу стосується гуманізованого антитіла, що ефективно блокує взаємодію між оре і сра40. --

Винахід також стосується способу модулювання імунного відгуку шляхом використання антитіл, химерних ча антитіл або гуманізованих антитіл, отриманих відповідно до винаходу. Спосіб може бути корисний для лікування багатьох аутоімунних захворювань, а також при трансплантації шкіри або інших органів.

Даний винахід стосується нових антитіл і, зокрема, химерних моноклональних антитіл проти СО40 людини (МАТ), що блокують взаємодію між др39 і СО40. В одному з варіантів здійснення винаходу найкращі химерні мАТ « проти СО40 людини позначені як "спі220". Спі220 являють собою химерні антитіла, що містять варіабельні з с ділянки антитіла миші і постійні ділянки капа і гамма-1 антитіл людини. Спі220, як і відповідні "батьківські" . антитіла, зв'язують СО40 і, у результаті, ефективно блокують гуморальні імунні відгуки на залежні від а Т-клітин антигени дозо-залежним чином.

Винахід також стосується гуманізованих антитіл проти СО40, що блокують взаємодію між ор39 і СО40.

Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу гуманізовані антитіла позначені як "Б4"; в іншому -І випадку вони мають позначення "13.17". Кращі гуманізовані антитіла відповідно до даного винаходу містять варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів антитіл людини з "щепленими" на них СОК антитіл миші. - Антитіла проти СО40 відповідно до даного винаходу, переважно химерні і гуманізовані антитіла, є

Ге) ефективними для модулювання гуморального імунного відгуку на залежні від Т-клітин антигени, індукованих 5ор Колагеном артритів і відторгнення трансплантату. Заявлені антитіла проти СО40, кращими з яких є розкриті тут о химерні і гуманізовані антитіла, також є корисними завдяки своїм протизапальним властивостям (що є подібними

Ге) до властивостей антитіл проти др39).

Антитіла відповідно до даного винаходу, особливо химерні антитіла спі220 проти СО40, гуманізовані антитіла Г4 і 13.17 проти СО40 мають широке терапевтичне застосування і, зокрема, можуть використовуватися для лікування аутоїмунних і запальних захворювань, а також для запобігання відторгнення трансплантатів.

Оскільки експресія СО40 показана для злоякісних клітин різноманітних гістологічних типів, потенційна (Ф) можливість застосування антитіл проти СО40 в онкології, особливо отриманих відповідно до даного винаходу ка химерних і гуманізованих антитіл, видається очевидною.

У даному описі використовуються такі абревіатури, відомі фахівцям у даній галузі досліджень: АПК бо (клітина, що презентує антиген); СОМ (ділянка що визначає комплементарність, від англ. сотріетепіагіу-ае(епттіпіпу гедіоп); СНО (клітини яєчника китайського хом'ячка); ІКА (індукований колагеном артрит); Свпах (максимальна сироваткова концентрація); СО (клітинна лінія фібробластів африканської зеленої мартишки); АРЛВЗ (антиревматичні лікию, що впливають на захворювання); ЕГІЗА (імуносорбентний аналіз із пов'язаним ферментом); КТТ (кінцева точка титрування); ОЕ (одиниця ендотоксину); Бар (фрагмент, що 65 антигензв'язує); ФІТЦ (фторізотіоцианат); Ни (гуманізований); пі 06-2 (гуманізоване моноклональне антитіло проти ор39); НАМА (антитіла людини проти імуноглобулінів миші); ГМФ (геоцианін молюска фісурелі); в/м

(внутрішньом'язово); МАТ (моноклональне антитіло); МТХ (метотрексат); ОВА (овальбумін); РВЗ (фосфатний буферний розчин); РСК (полімеразна ланцюгова реакція); РЕ (фікоерітерін), зс (підшкірний), З0О5-РАСЕ (електрофорез у поліакриламидному гелі при наявності додецилсульфату натрію); ЗЕС (хроматографія з

Виключенням за розміром); ЕО (еритроцити вівці); РРП (резервуарний реактор із перемішуванням); ТМЕ (фактор некрозу пухлин); М, (варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла); М н (варіабельна ділянка важкого ланцюга антитіла).

Нуклеїнова кислота, що кодує кращий легкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (химерного антитіла 2.220), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним 7/0 номером

АТСС - Нуклеїнова кислота, що кодує кращий важкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (2.220), - депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС .

Нуклеїнова кислота, що кодує кращий легкий ланцюг гуманізованого антитіла, отриманого відповідно до /5 даного винаходу (гуманізованого антитіла Р4), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС - Нуклеїнова кислота, що кодує додатковий кращий легкий ланцюг гуманізованого антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (гуманізованого антитіла І 3.17), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС /Д. Нуклеїнова кислота, що кодує кращий важкий ланцюг гуманізованого антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу (антитіл РА і 13.17), депонована в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером АТСС .

Депозити, про які йде мова у даному описі, підтримуються відповідно до Будапештської угоди про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Депонування здійснене, головним чином, для зручності роботи фахівців у даній галузі досліджень і не є обов'язковим. Послідовності нуклеотидів, що містяться в депонованому матеріалі, так само, як і амінокислотні послідовності, ідо ними сч ов Кодуються, наведені тут у якості посилань для контролю тих чи інших конфліктних ситуацій, пов'язаних з описом о і розкриттям зазначених послідовностей.

Всі посилання, наведені вище і далі в даному описі, використовуються виключно з метою кращого розуміння сутності винаходу.

На Фіг.1 показане інгібування зв'язування зорЗ9 із клітинами Каїї під дією МАТ проти СО40 людини. Ге! зо На Фіг.2 наведена схема досліджень, здійснених на приматах. Дні лікування відзначені ромбами. Імунізація

ЕО Її ГМФ відзначена прямокутниками і трикутниками відповідно. Тварини, оброблені 2.36, не вивчалися після о

Фази І, а тварини, оброблені 1.106, не вивчалися після Фази ІІ. Ге!

На Фіг.3 показаний антитільний відгук на ЕО у приматів. На Фіг.ЗА наведені результати аналізу при використанні антитіл (ЯМ проти ЕО. На Фіг.3В представлені результати аналізу при використанні антитіл ДС 0/7

Зв проти ЕО. ї-

На Фіг.4А показана послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга спі220 (5ЕО ІЮО МО/:1), а на Фіг.48 - послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга спі220 (ЗЕО ІЮО МО:2). На Фіг.4А і 48 підкреслені вбудовані сигнальні послідовності антитіла людини з найбільш близьким ступенем гомології, що використовувалися в якості матриці для гуманізування. «

На Фіг.5 представлені результати досліджень іп міго, що стосуються тестування химерних і гуманізованих з с антитіл, отриманих відповідно до винаходу. На Фіг.5А показана зв'язувальна активність спі220 і п220у3 із пяСО40 - то26 в ЕП І5А. На Фіг.5В показане інгібування опосередкованого здр39 співстимулювання В-клітин мАТ з проти СО40 людини.

На Фіг.б6 показаний антитільний відгук ІМ на ЕО. На Фіг.бА представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили 10, 40 або 10Омг/кг спі220. На Фіг.6В8 представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили -І 0,1 або мг/кг спі220.

На Фіг.7 показаний антитільний відгук ЇЯС на ЕО. На Фіг.7А представлені результати, отримані на мавпах, - яким уводили 10, 40 або 100мг/кг спі220. На Фіг.7В представлені результати, отримані на мавпах, яким уводили со 0,1 або мг/кг спі220.

На Фіг.8 показаний антитільний на ОВА у приматів. На Фіг.8А представлені результати аналізу при о використанні І9М проти ОВА. На Фіг.8А представлені результати аналізу при використанні дО проти ОВА.

Ге) На Фіг.9 показаний антитільний відгук на ГМФ у приматів. На Фіг.9А представлені результати аналізу при використанні І9М проти ГМФ. На Фіг.98 представлені результати аналізу (ДО проти ГМФ.

На Фіг.10 показана порівняльна спроможність антитіл 7Е1-01 і 7Е1-526 придушувати антитільний відгук ЇДО ов наєЕо.

На Фіг.11 показане дозо-залежне інгібування антитільного відгуку на ЕО за допомогою 7Е 1-26.

Ф) На Фіг.12 показані карти вектора експресії для ділянки важкого ланцюга і ділянки легкого ланцюга ка химерного антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу.

На Фіг.13 показана послідовність нуклеїнової кислоти вектора експресії, спроможного експресувати важкий бо ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до заявленого винаходу. Стартовий кодон АТО (нуклеотиди 1000-1002), що кодує початкову амінокислоту метіонін (Ме) вбудованої сигнальної послідовності антитіла людини, виділений жирним шрифтом. Нуклеотиди 1057-1422 (ЗЕО ІЮ МО:5) підкреслені. Вони утворюють кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, отриманого згідно з даним винаходом. 65 На Фіг.14 показана послідовність нуклеїнової кислоти вектора експресії, спроможного експресувати легкий ланцюг химерного антитіла, отриманого відповідно до винаходу. Стартовий кодон АТО (нуклеотиди 1005-1007),

що кодує початковий метіонін (Ме!) вбудованої сигнальної послідовності антитіла людини, виділений жирним шрифтом. Нуклеотиди 1065-1388 (ЗЕО ІЮ МО:6) підкреслені. Вони утворюють кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу.

На Фіг.15 показані упорядковані варіабельні ділянки антитіла миші проти СО40 і матричні послідовності антитіла людини. Амінокислотні послідовності варіабельних ділянок легких і важких ланцюгів антитіл миші проти

СОр40 використовувалися для ідентифікації гомологічних послідовностей зародкової лінії людини. Нумерація залишків амінокислот і визначення СОК (підкреслені) засновані на роботах |Кабраї, Е.А., еї аї., (1991),

Зедицепсез ої ргоїеіпв ої іттипоіодіса! іпіегеві (Б? Ед). Уазпіпдіоп ОС: Опйейд Зіаіез Оерагтепі ої Неайй апа 70 Нитап Зегуісев; Кабраї, Е.А., еї аї., (1977) У. Віої. Спет. 252:6609-6616)Ї. Розходження в послідовностях відзначені вертикальними лініями, а положення амінокислот на каркасних ділянках, охарактеризовані в комбінаторній експресійній бібліотеці, відзначені зірочками.

На Фіг.16 представлені результати титрування гуманізованих варіантів анти-СО40 з імобілізованим антигеном. Схарактеризовані експресовані в бактеріях Гар-фрагменти химерних анти-СО40 і відібрані варіанти з 75 Кожної бібліотеки. Химерні (зафарбовані кружки), Ни І - 19211 (незафарбовані кружки), Ни І - СМ/ 43 (незафарбовані квадрати), Ни І -288 (зафарбовані трикутники) і недоречні фрагменти Рар (зафарбовані квадрати) були отримані з периплазматичного простору бактерій (культура об'ємом 15мл), причому серійні розведення зазначеної культури були інкубовані з антигеном СО40-Ід, імобілізованим на планшетах для мікротитрування. Зв'язування з антитілами вимірювали так, як описано нижче.

На Фіг.17 показана кореляція афінності антитіл і інгібування зв'язування розчинного др39 із СО40-І9.

Ліганд для рецептора СО40, др39, був імобілізований на планшетах для мікротитрування. Відповідно до цього, різноманітні кількості очищених химерних (зафарбовані кружки), Ни ІІ - СМУ43 (незафарбовані квадрати), Ни ПІ - 288 (зафарбовані трикутники), Ни ПЛИ - 2812 (незафарбовані кружки) і Рар-фрагментів (зафарбовані квадрати), що не стосуються справи, спільно інкубували з 2мкг/мл СО40-Ід, імобілізованим на планшеті для Га Ммікротитрування. Зв'язування СО40-1Ід із др39 кількісно визначали так, як описано нижче.

На Фіг.18 показане кількісне визначення залишків каркасних ділянок активних антитіл миші. Варіабельні і9) ділянки найактивніших анти-СО40О варіантів з оптимізованої бібліотеки каркасних ділянок Ни | (А) і оптимізованої бібліотеки каркасних діллнок НСОКЗ Ни ІІ (В) були секвеновані для визначення амінокислот на положеннях бібліотеки каркасних ділянок. Кожний унікальний варіант був описаний на підставі загальної Ге»!

Кількості залишків у 8 положеннях каркасної ділянки антитіла миші. 34 клони з бібліотеки Ни І і 14 клонів із бібліотеки Ни ІЇ були секвеновані, що дало можливість ідентифікувати 24 і 10 унікальних варіантів відповідно. о

Жирними лініями відзначений розподіл послідовностей, очікуваний від еквівалентного числа вибірково Ге»! відібраних варіантів.

Даний винахід стосується химерних і гуманізованих антитіл із СО40 людини з імуносупресорними -- властивостями. Такі антитіла проти СО40 людини мають очевидні терапевтичні сфери використання. Винахід - стосується також близькоспоріднених мАТ проти СО40 миші (близькоспоріднених антитіл до мАТ проти СО40 людини), що є корисними для вивчення можливостей анти-СР40 терапії за допомогою мАТ на численних моделях мишей (модулювання імунних і запальних захворювань). Одержання антитіл проти СО40 « ускладнюється тою обставиною, що СО40 є ефективною сигнальною молекулою. Антитіла, що зв'язуються з даним антигеном, можуть бути ідентифіковані на підставі їхньої спроможності стимулювати сигнальні властивості щей с С040 так само, як і їхньої спроможності блокувати взаємодію СО40/дрзо. ц Заявлені мАТ проти СО40 людини, що блокують взаємодію СО40/дрЗ9, відбирали з ектензивної панелі мАТ "» проти СО40. Антитіла, позначені як 2.220, були гуманізовані і химеризовані. "Химерні" антитіла містять легкий ланцюг і важкий ланцюг. Легкий ланцюг включає варіабельну ділянку і постійну ділянку. Важкий ланцюг також 5 включає варіабельну ділянку і постійну ділянку. Химерні антитіла містять варіабельні ділянки від одного виду -І і постійні ділянки від іншого виду (наприклад, варіабельні ділянки миші сполучені з постійними ділянками людини). (Див., наприклад, патенти США 4816397 і 4816567). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюга (М) і - кожна варіабельна ділянка важкого ланцюга (М) містить три каркасні ділянки (їатемжогк), що перериваються (Се) трьома гіперваріабельними ділянками, які називаються "ділянки, що визначають комплементарність" або СОК. "Гуманізовані" антитіла - це такі антитіла, у яких каркасні ділянки антитіл людини скомбіновані з СОК о донорних Ід миші або пацюка (див., наприклад, патент США 5530101). В об'єм даного винаходу входять (Че) гуманізовані антитіла, що містять СОК, які походять з варіабельних ділянок антитіл миші.

Найбільш прямий підхід щодо одержання гуманізованих антитіл полягає в "пересадці" СОК донорних мАТ на каркасні ділянки антитіла людини (|(опев, Р.Т., ей аїЇ.,, Майте 321:522-525 (1986)). Проте, визначені амінокислотні залишки каркасних ділянок підтримують структуру СОК, і "щеплення" СОК миші, що антиген-зв'язують, до каркасних ділянок антитіл людини може зменшити зв'язувальну спроможність отриманих

Ф, гуманізованих мАТ ГРооїе, .)., еї аїі., У. Мої. Віої. 224:487-499 (1992)). Оцінка можливого внеску специфічних ко залишків каркасних ділянок в афінність антитіл має дві проблеми. По-перше, для визначених мАТ важко прогнозувати, які саме залишки каркасних ділянок грають критичну роль у підтримці афінності і специфічності бо антитіл. По-друге, для положень каркасних ділянок, що є різними у "батьківських" мАТ і матричних ділянок антитіл людини, важко прогнозувати, чи обумовить амінокислота, яка походить з батьківського антитіла миші або матричної ділянки антитіла людини, більш високу активність мАТ. Відповідно до цього, методи гуманізування антитіл, що засновані виключно на прогнозуванні структури, не завжди є успішними.

Нині добре відома загальна стратегія інженерії антитіл, яка успішно долає труднощі щодо підтримки 65 зв'язувальної активності антитіл після гуманізування |(КозоК, М. ., еї аї., Т. Віої. Спет. 271:22611-22618 (1996)). Потенційна важливість амінокислотних залишків каркасних ділянок, які різняться в батьківських мАТ і матричних ділянок антитіл людини, характеризується на певній стадії шляхом синтезу й експресії комбінаторної бібліотеки антитіл, яка містить усі можливі комбінації батьківських і донорних амінокислотних залишків на каркасних ділянках, що цікавлять дослідника. Варіанти, які виказують оптимальну структуру каркасних ділянок, ідентифікуються шляхом скринінгу і, відповідно до цього, оптимальна структура (або структури) каркасної ділянки (або ділянок) визначаються шляхом секвенування ДНК. Зазвичай, секвенування численних активних клонів виявляє критичні положення амінокислотних залишків на каркасних ділянках, що потребують експресії. навпаки, експресія амінокислоти людини або миші в бібліотеці каркасних ділянок з еквівалентною частотою в активних клонах узгоджується з меншою функціональною важливістю визначеного положення амінокислотного /о залишку в каркасній ділянці. Таким чином, гуманізоване антитіло, що зберігає зв'язувальну активність батьківського мАТ, без суттєвих труднощів можна ідентифікувати на підставі його функціональної зв'язувальної спроможності.

Способи гуманізування антитіл і забезпечення "дозрівання" афінності часто здійснюються як відокремлені стадії одного процесу (КозокК (1996), (взирга); Мемоп, ОО. Е. еї аї., У. ІттипоїЇ. 155:1994-2004 (1995); Ми, Н. 7/5 ек аї, Рос. Май. Асай. Зсі. ОА 95:6037-6042 (1998); Васа, М. ей аі, 17 Віої Спет. 272:10678-10684 (1997); Магкв, У. О. еї аї., 9. Віої. Спет. 267:16007-16010 (1992)). За допомогою модифікованої стратегії, описаної нижче, були отримані численні версії гуманізованих антитіл 2.220 миші, що володіють афінністю, еквівалентною або кращою, ніж афінність химерних Рар-фрагментів.

Заявлені в даному винаході химерні антитіла проти СО40 позначені як "спі220". Близькоспоріднені їм мАТ 2о проти Сраб миші позначені як "7Е1". Гуманізовані антитіла проти СО40, отримані відповідно до даного винаходу, позначені тут як "БА" і "13.17".

Були отримані два різних ізотипних варіанти 7Е1. Ці варіанти можуть застосовуватися для визначення ролі

Ес-ділянки молекули у терапії, що базується на використанні мАТ проти СО40, у доклінічних модельних випробуваннях стосовно імунних і запальних захворювань. Даним винаходом також пропонуються: одержання с

МАТ проти СО40 миші; критерії відбору мАТ, що мають властивості, близькі до властивостей спі220; одержання ізотипових варіантів мАТ і їхня активність іп мімо у випробуваннях на моделях мишей стосовно імунологічних і) захворювань. Експерименти з спі220 і відповідними "батьківськими" мАТ 2.220 миші на мавпах, як і експерименти з 7Е1 на мишах, показали, що зазначені мАТ проти СО40 є сильними імуносупресорними агентами (які докладніше розглядаються нижче). Всі нижчеописані експериментальні дослідження були здійснені за Ге! зо стандартною методикою, добре відомою фахівцям у даній галузі.

У цілому, заявлені антитіла спроможні придушувати гуморальний імунний відгук у мавп. Аналогічним чином, о два ізотипових варіанти близькоспоріднених мАТ проти СО40 миші і, зокрема, антитіл 7ЕЇ1 виказують Ге! імуносупресорну активність у численних доклінічних випробуваннях з модельних захворювань людини. Усі отримані дані показують, що спі220, Е4 і 13.17 корисні у клінічному лікуванні аутоїмунних захворювань і при (87 трансплантації. ї-

Нижче наведені приклади лише ілюструють даний винахід і в жодній мірі не обмежують його об'єму, що визначається формулою винаходу.

Приклад 1

Відбір антитіл миші проти СО40 людини «

А. Виділення антитіл і характеризація іп міго з с Панель моноклональних антитіл проти СО40 людини була отримана за допомогою стандартної гібридомної . технології із застосуванням злитого білка СО40 людини в якості імуногена. Антитіла були піддані скринінгу на "» зв'язування з СО40 за допомогою клітинної лінії СО40 " і злитих білків. Дослідження зв'язування одр39 із СО4О і функціональні експерименти стимуляції за допомогою СО4О використовувалися для характеризації клонованих 75 антитіл. Відібрані антитіла потім характеризували на перехресну реактивність з клітинами приматів для -І визначення їхньої придатності з метою проведення модельних доклінічних випробувань на приматах. 1. Імунізація і злиття - Для одержання гібридом, які продукують МАТ проти СЮО40 людини, використовувалися два злиття. Імунізацію (Се) для одержання імунних лімфоцитів здійснювали на 6-8 тижневих самках мишей ВАЇ В/с з використанням у якості імуногена рекомбінантно злитого білка, що містив позаклітинний домен СО40 людини, сполучений із шарнірною о ділянкою, доменами СН2 і СНЗ антитіла миші ІдД26 (ИСО40-то26). (Че) Для злиття 40-1 мишу спочатку піддавали імунізації підшкірним шляхом в 3-4 ділянки емульсією (загальний об'єм 200мкл), що містила ЗоОмкг ИСО40-то26 у повному ад'юванті Фрейнда. Аналогічним чином тварину на 21-й день бустирували НСО40-то2р у неповному ад'юванті Фрейнда, а потім піддавали остаточній імунізації перед

Зпиттям на 37-й день шляхом внутрішньовенної ін'єкції ЗоОмкг АСО40-то26 у РВ5. Імунізацію для злиття 40-2 здійснювали аналогічним чином, за винятком того, що ад'ювант Фрейнда був замінений на ад'ювант Ківі (К-730).

Ф, Бустерну імунізацію проводили на 21-й і 42-й дні з остаточною ін'єкцією перед злиттям на 58-й день. ко За З дні після останніх бустерних ін'єкцій відбирали лейкоцити із селезінки і лімфатичних вузлів і зливали їх у співвідношенні 3:11 із мієломною клітинною лінією миші Х63-А98.653 за стандартною методикою бо ІКеатеу еї аї., У. Іттипої. 123:1548-50 (1979); Гапе, у). Іттипої. 81:223-28 (1985)). Клітинні суспензії від кожного злиття висівали в десять 96-лункових планшетів для культур тканин із густиною близько 170000 клітин (у розрахунку на клітини до злиття) на лунку. 2. Скринінг і клонування

Для ідентифікації мАТ із специфічністю до нативного СО40 людини використовувалися два підходи. 65 Супернатанти клітинних культур із усіх лунок були спочатку піддані скринінгу за їхньою спроможністю зв'язуватися з позитивними по СО40, трансформованими вірусом Епштейна-Бара В-клітинами лінії ТА2-2С за методом ЕЇГІЗА. Потім кожний супернатант тестували в ЕЇІЗА на реакційну спроможність з очищеним рекомбінантно злитим білком, що містив позаклітинний домен СО40 людини, злитий з шарнірною ділянкою, доменами СНО і СНЗ антитіла Ідсе1 людини, ЯСО40-Ід, і аналогічним чином сконструйованим нерелевантним

ЗлИитТиМ білком Ід людини, І еи8-під (НоПепрацодй, еї аІ.,, ЕМВО 3. 11:4313-4321 (1992)). Реакційна спроможність стосовно першого, але не другого злитого білка, разом із даними щодо зв'язування клітин підтвердили наявність антитіл, специфічних до нативного СО40, приблизно в 200 лунках.

Ключовою функціональною особливістю для потрібних мАТ проти СО40 є їхня спроможність цілком блокувати взаємодію СО40 із своїм лігандом др39. Таким чином, наступною стадією відбору антитіл явилося 7/0 дослідження супернатантів із усіх лунок із специфічними до СО40 антитілами на їхню спроможність інгібувати зв'язування розчинного рекомбінантно злитого білка, що містив СО8 миші і др39 людини, зарз9, з імобілізованим пСО40-Ід за методом ЕГІ5А. Супернатанти, які цілком інгібували дану взаємодію, були потім піддані титруванню таким самим чином для визначення того, які лунки містили найбільші кількості антитіл, що інгібують. По результатах цих досліджень були відібрані 10 лунок із найбільш яскраво вираженою інгібіторною активністю для /5 подальшого клонування.

Клонування гібридом, що продукують потрібні антитіла, здійснювали в два етапи. Клітини з кожної лунки спочатку "мініклонували" з густиною засівання 1Оклітин/лунку, після чого специфічні до СО40 "мініклони" з найвищим титром активності клонували за звичайним методом обмежувальних розведень.

З. Подальша характеризація антитіл

Для характеризації антитіл використовувалися шість експериментів: з інгібування зв'язування зоар39 із

В-клітинами людини; інгібування проліферації В-клітин, індукованою зодр39 і анти-І9М; інгібування синтезу іп міо антитіл В-клітинами, індукованого Т-клітинами; безпосередня співстимуляція В-клітин анти-І4м; співстимуляция В-клітин анти-(ЮМ у присутності антитіла з перехресним зв'язуванням легкого капа-ланцюга і співстимуляція В-клітин анти-ІДМ при наявності інших мАТ проти СО40, (528-5. Відомо, що антитіла (328-5 мають сч ов сильну спільну стимуляторну активність і не повністю блокують взаємодію СО40/дрз39. З метою порівняння вони включені в багато експериментів, що тут описані. і)

Результати тестів були використані для відбору чотирьох мАТ - 1.66(Ід0265), 2.36 (Ід02а), 2.174 (І9ДС1) і 2.220 (ІдС2а) - і для Їхньої характеризації. В одному з експериментів клітини з В-клітинної лінії людини Каїї інкубували з 2 або 20мкг/мл різноманітних мАТ проти СО40, після чого здійснювалася друга інкубація з Ге! зо Нерозведеним супернатантом клітин СО5, що містили злитий білок тСО8-др39 (зодр39). Зв'язування зар39 визначали подальшим інкубуванням клітин із міченими ФІТЦ мАТ проти тСОв8 і аналізом клітин на проточному о цитофлуориметрі. Відсоток інгібування обчислювали шляхом ділення величини флуоресценції зразків, Ге! інкубованих з антитілами, на величину флуоресценції зразків без антитіл при першому інкубуванні (Фіг.1).

Як показано на Фіг.1, кожне з чотирьох мАТ було здатне цілком інгібувати зв'язування злитого білка зар39 -- із В-клітинною лінією людини, що експресує високі рівні СО40, хоч у випадку 2.174 була потрібна порівняно ї- висока концентрація антитіл для повного блокування. Подібні дані були отримані при використанні В-клітин мигдалин людини. Ці дані були рівнобіжними в двох функціональних експериментах. По-перше, було показано, що кожне мАТ здатне цілком блокувати опосередковану здр39 співстимуляцію В-клітин мигдалин людини.

По-друге, кожне мАТ суттєво інгібувало утворення ІдС і ОМ у дослідженнях іп мйго залежних від Т-клітин « утворення антитіл В-клітинами. з с Три з чотирьох антитіл показали обмежену спроможність до співстимуляції проліферації В-клітин при наявності анти-І9М. МАТ 2.220 було більш стабільним у своїй спроможності індукувати слабку співстимуляторну ;» активність: При додаванні антитіл до легкого капа-ланцюга, що використовувались для перехресного зв'язування

МАТ проти СО40, мАТ 2.36 виявляли значну співстимуляторну активність, у той час як активність трьох інших антитіл не виявлялася. Було показано, що співстимуляторна спроможність (28-5 диференційовано -І модулюється, коли зазначені антитіла об'єднуються з кожним із чотирьох нових мАТ проти СО40. Антитіла мАТ 1.66 і особливо 2.174 посилювали співстимуляцію під впливом 528-5, у той час як 2.220 і 2.36 придушували Її. - Після відбору, заснованого на використанні іп міго систем клітин людини, чотири мАТ проти СО40 піддавали со подальшим випробуванням в дослідженнях іп мімо на приматах, а не на людині. Основними процедурами аналізу були оцінка за відносною ефективністю зв'язування антитіл із В-клітинами приматів і придушення іп мйго о залежного від Т-клітин синтезу антитіл В-клітинами. Було виявлено, що всі чотири мАТ перехресно реагують із

Ге) В-клітинами макаки циномолгус (Масаса тазсісціагів). мАТ 2.36 і 2.220 зв'язуються з зазначеними клітинами більш ефективно, ніж 2.174 і 1.66. Слабкіша зв'язувальна спроможність мАТ 2.174 і 1.66 не була зумовлена їхнім ізотипом, оскільки інші антитіла збіжного ізотипу виявляли рівні зв'язування, порівнянні з такими у дв антитіл 2.36 ї 2.220 (наприклад, (28-5 і 2.118). Зазначені результати суперечать результатам, отриманим за використання В-клітин людини, коли кожне з чотирьох антитіл мало порівняну зв'язувальну активність.

Ф) Спроможність чотирьох мАТ придушувати антитільний синтез В-клітинами мавп була паралельною їхній ка зв'язувальній спроможності.

Б. Характеризація іп мімо во Були проведені два експерименти на приматах, не подібних до людей, за використання мАТ миші проти

СОр40 людини для вивчення їхніх імуносупресорних властивостей і відбору відповідних антитіл для подальших досліджень. По-перше, проводили порівняння кліренсу іп мімо і гострої токсичності чотирьох відібраних раніше

МАТ проти СО40. Результати досліджень дозволили відібрати два антитіла - 2.36 і 2.220, які далі тестували в другому експерименті для того, щоб визначити ефективність інгібування антитільного відгуку на Т-залежні б5 антигени і гостру токсичність.

Вивчення мАТ 2.36 і 2. 220 на приматах

На підставі попередніх експериментів була зроблена оцінка мАТ 2.36 і 2.220 на їхню спроможність придушувати Т-залежний антитільний відгук після внутрішньовенного введення їх мавпам циномолгус.

Зазначене дослідження розділили на три фази (Фіг.2). Під час Фази | мавп циномолгус, розподілених на чотири

Групи, кожна з яких складалася з одного або двох самців і двох самок, імунізували внутрішньовенно в 1-й день еритроцитами вівці (ЕС) і потім обробляли 2Омг/кг мАТ 2.36, 2.220, 1.106 (позитивний контроль: ІДС1 миші проти др39 людини) або 1 6 (негативний контроль: Іде2А миші проти пухлинного антигена людини) у дні 1, З і 5.

Визначали також титри І9М і до стосовно імуногена ЕС, сироваткові рівні випробуваних і контрольних антитіл, наявність антитіл проти випробуваних і контрольних антитіл, рівні сироваткових імуноглобулінів, кількість 70 лейкоцитів периферичної крові і частоту спостереження різноманітних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові. На Фазі ІІ після здійснення відповідних експериментів Фази І тварин імунізували ЕО і другим антигеном, гемоцианіном молюска фіссуреллі (ГМФ) для виявлення індукції імунологічної толерантності й оборотності імуносупресії, що спостерігається. На Фазі Ії відібраних тварин повторно імунізували для виявлення того, чи спроможний спочатку супресований антитільний відгук на ЕО відновлятися після додаткового введення ЕО і для 7/5 оцінки другого антитільного відгуку на ГМФ.

Експеримент здійснювали для того, щоб показати, що мАТ 2.220 у суттєвій мірі придушують первинний антитільний відгук на ЕО (Фіг.3). Мавпам уводили 20мг/кг мАТ 1.106, 16, 2.36 або 2.220 на Фазі| у дні 1, З і 5. Мавп імунізували БО в день 1 Фаз І, І ії І. На Фіг.ЗА представлені результати досліджень зразків сироватки на присутність (ЯМ проти ЕО; на Фіг.3В представлені результати досліджень зразків сироватки на присутність до до ЕО. Дані виражені в геометричних значеннях титру антитіл проти ЕО для кожної групи (п-З або 4).

Пікові значення інгібування первинного відгуку складають 8595 для І9М і 9895 для дО відповідно. Наступне звільнення мАТ 2.220 із сироватки пов'язане зі зниженням їхніх рівнів, що виявляються; пікові значення інгібування повторного відгуку складають ще 79905 і 5695 для І9М і дос, відповідно, в порівнянні з негативним с ов Контрольним відгуком на Фазі І. Це суперечить позитивному контрольному результату з мАТ 1.106, згідно з яким забезпечується сильний вторинний антитільний відгук на ЕО. Третинний відгук на ЕО не інгібується, засвідчуючи і) те, що мАТ 2.220 індукує пролонговану імуносупресію, а не імунологічну толерантність. В усіх тварин, імунізованих ГМФ, виявлявся первинний і вторинний відгук на ГМФ, дозволяючи припустити, що імуносупресія є оборотною. Тварини, оброблені мАТ 2.36, не були включені у Фазу Ії, оскільки на Фазі ІЇ досліджень не Ге! зо Виявилося жодного суттєвого інгібіторного ефекту.

Головний пік концентрації сироватки, що виявлявся відразу ж після введення останньої дози, становив 744 |і о 405мкг/мл для мАТ 2.220 і 2.36 відповідно. У той час як мАТ 2.36, що звільнюються із сироватки, забезпечують Ге! на 15-й день зниження рівнів, що визначаються, мАТ 2.220 не звільняються аж до 29-го дня. Як мАТ 2.36, так і

МАТ 2. 220 є імуногенними. --

Не було виявлено жодних клінічних ускладнень, пов'язаних з уведенням препаратів, у тому числі змін ваги ї- тіла або споживання їжі, а також гематологічних змін або змін рівнів їд у піддослідних тварин. Була зареєстрована лише одна зміна, яка полягала у тимчасовому зменшенні на 7095 і 4395 кількості периферичних

В-клітин під впливом мАТ 2.36 і 2.220 відповідно. Відновлення кількості В-клітин до нормальних рівнів, відбувається в межах 2-3 тижнів після введення препаратів. «

У цілому мАТ 2.220 значно придушують антитільний відгук на ЕО, а мАТ 2.36 - ні. Незважаючи на те,що мАТ в) с 2.220 індукують пролонговану антигенспецифічну імуносупресію, остання є оборотною. На підставі зазначених спостережень антитіла мАТ 2.220 були відібрані для подальших досліджень. з Приклад 2

Одержання химерних антитіл сСМ220

Для надання імуногенності мишачим мАТ 2.220 проти СО40 людини були отримані їхні. рекомбінантні форми, -і у яких варіабельні ділянки були злиті з постійними ділянками антитіл людини. Такі антитіла перевіряли на ефективність іп міго. Для одержання химерних антитіл використовувалися два підходи. Власне химерні антитіла - містили незмінені варіабельні ділянки антитіл миші, а в гуманізованих антитілах гіперваріабельні ділянки

Те) антитіл миші (СОК) були прищеплені до послідовностей каркасних ділянок антитіл людини в межах варіабельних Ділянок. Химерні антитіла зберігали антигензв'язувальні властивості "батьківських" антитіл, але могли мати о велику імовірність імуногенності. Гуманізовані антитіла імуногенними були з меншою імовірністю, проте,

Ге) мутації, що генерувались в процесі гуманізування, могли впливати на антигензв'язувальну активність.

А. Конструювання і характеризація іп міго химерних і гуманізованих антитіл

Варіабельні ділянки легких і важких ланцюгів (М, і Мн) тАТ 2.220 проти СО40 одержували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСК). кКДНК отримували на основі РНК, виділеної з гібридоми, що експресує

МАТ 2.220, при використанні Ід 1-специфічного або С,-специфічного антисмислового праймера з утворенням Мн (Ф, і Му відповідно. До одноланцюгових кКДНК додавали полі-О хвіст. Після цього варіабельні ділянки ампліфікували ко за допомогою РСК, при використанні смислового олігонуклеотидного праймера, що містив полі-С послідовність, комплементарну полі-С хвосту, і гніздового набору антисмислових праймерів. Отриманий РСК-продукт далі бо Вбудовували у бактеріальний вектор за допомогою сайтів рестрикції, введених у праймери. Після цього за допомогою дідеоксинуклеотидного методу секвенували численні клони. Однаковим шляхом було проведено два незалежних експерименти, починаючи зі стадії одержання РНК і послідовностей.

Для конструювання химерних антитіл варіабельні ділянки ампліфікували за допомогою РСК при використанні праймерів, що інтродукують послідовність, яка кодує сигнальну послідовність антитіл людини, найбільш близьку 65 до послідовності 2.220, як показано на Фіг.4. Підкреслені ділянки варіабельних послідовностей легкого ланцюга (Фіг.4А) і важкого ланцюга (Фіг. 48) означають вбудовані сигнальні послідовності антитіла людини з найбільшою гомологією із послідовностями антитіла миші 2.220. Продукти РСК потім вбудовували у вектор, що містив послідовності, які кодували постійні ділянки капа-ланцюга антитіла людини або у1-ланцюга антитіла людини, з одержанням повного легкого або важкого ланцюга відповідно. Вектори містили також підхожі гени стійкості до Лікв для одержання й ампліфікації стабільних ліній, що експресують білок. Білок для початкової характеризації одержували шляхом транзиторної експресії в клітинах СО5 і подальшого очищення за допомогою білка А.

У якості прикладу, лінії клітин, що продукують химерні антитіла, одержували шляхом співтрансфекції клітин

СНО 0044 окремими векторами експресії важкого і легкого ланцюгів химерного антитіла за допомогою 7/0 висококопійного кількісного методу електропорації (див. Патент США Мо4956288), що забезпечував співінтеграцію. Важкі і легкі ланцюги спі22О0 були клоновані у вектори експресії рО17 і рО16 відповідно.

Обидва ці вектори походили з плазміди рсОМАЗ ІпМіодеп і містили такі конструктивні елементи (Фіг.12): (1) ген стійкості до неоміцину з рсОМАЗ заміщений на ген дигідрофолатредуктази миші (ОМЕК) під контролем позбавленого енхансера промотора 5М40 (цей ген також позначений як "ослаблений" ген ОНЕК; слід звернути 7/5 увагу на те, що "ослабленим" фактично є тільки промотор, а самий фермент - ні; позбавлений енхансера промотор усе ще містить ориджин реплікації 5М40 і, таким чином, відповідні вектори можуть бути використані для транзиторної трансфекції клітин СО); (2) потрібний ген експресується з промотора СМУ, а сигнал поліаденілювання походить від гена бичачого гормону росту; (3) касета експресії потрібного гена фланкірувалась послідовностями термінації транскрипції (тобто послідовність 5 примикає до промотора, а го послідовність З - до полі-А сайта); (4) вектори містять два окремих полілінкерних сайта рестрикції, один у напрямку З3' до промотора для клонування потрібного гена й один у напрямку 5' до промотора для лінеаризації вектора до трансфекції; (5) ген стійкості до ампіциліну й ориджин СОЇЕ1 для розмноження плазміди в Е. Соїї.

Гени важких і легких ланцюгів використовувалися для одержання геномних конструктів із такими модифікаціями: (1) послідовності, що кодують, для сигнального пептиду важкого ланцюга, варіабельної ділянки і с домену СНІ були безперервними (тобто не містили інтронів); (2) послідовності, що кодують, для сигнального пептиду легкого ланцюга і варіабельної ділянки були також безперервними. о

Об'ємом даного винаходу також охоплюються відомі фахівцям інші вектори експресії, що спроможні експресувати заявлені химерні антитіла. Послідовність нуклеїнової кислоти, використана в експресійному векторі, спроможному визначати синтез важкого ланцюга заявленого химерного антитіла, показана на Фіг.13; Ф послідовність нуклеїнової кислоти, використана в експресійному векторі, спроможному визначати синтез легкого ланцюга заявленого химерного антитіла, показана на Фіг.14. о

Повна амінокислотна послідовність важкого і легкого ланцюгів химерного антитіла (спі220), включаючи ду варіабельні і постійні ділянки, наведена нижче (жирним шрифтом виділені амінокислоти варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів). -

Послідовність важкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МО:З) че ! ОІ9О1Х7ОЗОРЕ ІККРОЕТУКІ 5СКАБСУАЕТ ТІСМОМУОЕК РОКСІКМНІСЯ 50

ІМТНОСУРКУ УКОРКСВРАК ЗІЕТЗАМТАХ СОІ5МЬКМЕО ТАТУРСУВеС 100 о КОМУПЬАХКА ХМСОСТЬУТУ ЗААЗТКОРБУ ЕРІАРББК5Т БОСТААЦОСІ 150 й МКОУЕРЕРУТ УЄЯМОСАЬТе СУНТЕРАУТО ББСІУБЬБОУ УТУРБОБЬСТ 200 етліх ТЕУКОЛЛЮ ЕКОН ВССУ; КАТЯ 5 « ї УМЕТУВУМву ТТУБНООНІМ СКЕХКСКУБЄМ КАБРАРІБЕКТ ІБКАКСОРНЕ 350 70 | ЕІЕеосстЕ МУНЛЧИНЕ ЛКК ЗЖНЕК УТОКВІЯР о з ; ск со 452 с Послідовність легкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МО 4) "з ТІУПТОЗРАТ ББУТРСОКУЄ І5СВАБОВІВ БУБИЖУООКЕ НЕВРВШЬІКІ 50 й АБЗНЗІБСІРЗ ВРБОБОВОБО ЕТОБЗІМНБМЕР ЕРУСІУХСОН СНОЕРИТЕСО 100

СТКЦЕЇКЕТУ ААРБУБІЕРР БОЕОГІКБСТА БУУСІІММЕУ РЯБАКУОНКУ 150 "ЕМАБО5СМ5О ЕБУТЕОрБКО 5тТуУБІБОТІТ Б5КАПТЕКНК МУАСЕУТНОС 200 1ББРУТКБЕМ ВСЕС зи

Ше Отримано кілька гуманізованих форм 220. Спосіб їх отримання включає у себе ідентифікацію послідовностей - клітин зародкової лінії людини і миші, що мають максимальну гомологію з доменами Мн і М,. Домени зародкових клітин миші використовувалися для ідентифікації сприятливих місць локалізації соматичних мутацій, що о генерують у процесі афінного дозрівання. Далі послідовності клітин людини використовувалися в якості матриці, о 20 | ділянками послідовності, для котрих відомо або очікується, що вони є важливими для зв'язувальної специфічності, заміщувались відповідні ділянки в послідовностях М н і М; антитіл людини. Структуру таких с послідовностей моделювали, використовуючи в якості матриці білок з найбільш близькою гомологією, для якого відома кристалічна структура. Плазміди, що кодують гуманізовані форми антитіл, одержували за методом

РСЕК-спрямовуваного мутагенезу і використовували для генерації антитіл шляхом транзиторної експресії в 595 клітинах СО5. Дослідження іп мійго здійснювали з химерними і гуманізованими антитілами, отриманими (ФІ відповідно до даного винаходу; результати цих досліджень представлені на Фіг.5. На Фіг.5А показані результати тестування зв'язувальної спроможності спі220 і п220у3 з НСО40-то206 за методом ЕГІЗА. Лунки планшетів о Іттишоп-2 покривали НСО40-то2брБу концентрації ТОнг/мл у РВ5 протягом 2 годин. Лунки блокували реагентом

Зресітеп Оіїцепі (Сзепеїіс Зувіетв), і далі в них добавляли антитіла у визначених концентраціях. Через 1 бо годину інкубування лунки відмивали, і наявність антитіл виявляли за допомогою кон'югованих із пероксидазою антитіл кози до дО людини. Н220у3 являє собою гуманізовану форму мАТ 2.220. Отримані результати є середніми для двох лунок, а короткі лінії відповідають стандартному відхиленню.

На Фіг.5В представлені результати тестування гальмівного впливу мАТ проти СО40 людини на опосередковувану зодр3О співстимуляцію В-клітин людини. В-клітини мигдалин людини (5000Окл/лунку), що бо перебувають у стані спокою, інкубували зі злитим білком зодр39, 20мкг/мл антитілами кролика проти І9М людини,

адсорбованими на імунобусах, і визначеними концентраціями мАТ проти СО40 або контрольного препарату в 9б-лункових планшетах. Через 72 години після "закладання" культур усі лувки пульсово мітили ТмкКі/лунку

ІЗНІ-тимідином, і далі клітини культивували протягом ще 18 годин. Після цього клітини збирали, і на сцинціляційному лічильнику міряли включення |зНІ|-тимідину.

По результатах досліджень іп міїго (Фіг.5А і. 5В, на яких показане ефективне зв'язування СО40 химерними і гуманізованими антитілами і інгібування В-клітинної стимуляції) для подальших експериментів були відібрані химерні антитіла.

Приклад З 70 Ефективність спі220

А. Химерні мАТ 2.220: вивчення однодозової ефективності на приматах, не подібних до людей

Спі220 оцінювали в експериментах на мавпах циномолгус на їхню спроможність придушувати первинний і вторинний гуморальні імунні відгуки на залежні від Т-клітин антигени. В одному з експериментів групу з чотирьох мавп імунізували ЕО, а потім здійснювали другу імунізацію овальбуміном (ОВА) безпосередньо перед /5 введенням однократних внутрішньовенних болюсних доз спі220, що складали 10, 40 або 10Омг/кг, або стерильного фосфатного буферного розчину (РВ5) у якості контрольного препарату. При всіх трьох зазначених рівнях спостерігали значне придушення первинного гуморального імунного відгуку на ЕО, що є свідченням ефективної дії спі220 у приматів. Дозо-залежне транзиторне зменшення числа В-клітин периферичної крові спостерігалося у всіх оброблених спі220 мавп; час відновлення числа В-клітин також залежав від дози. При двох найвищих дозах спостерігалося транзиторне помірне зменшення абсолютного числа Т-клітин периферичної крові. Також відзначалося транзиторне мінімальне зменшення рівнів сироваткових ІМ без будь-яких пов'язаних із уведенням препаратів змін сироваткових рівнів до або ІдА.

Для оцінки індукції імунологічної толерантності й оборотності імуносупресорної активності проводили імунізацію всіх мавп овальбуміном (ОВА), ЕО і неоантигеном, ГМФ на 149-й день, коли сироваткові рівні спі22о сч ов У групі тварин, що одержували їх у дозі 10Омг/кг, були нижче рівнів, оцінюваних як імуносупресорні (приблизно 10мкг/мл), а число В-клітин периферичної крові відновилося до вихідних рівнів. Антитільний відгук на ЕО при і) найнижчій дозі, у цілому, був порівнянний із первинним антитільним відгуком на ЕО у контрольних мавп. Проте, антитільний відгук на ЕО був ще частково або суттєво придушений у мавп, оброблених двома найбільшими дозами антитіла. б зо Для подальшого вивчення дозо-залежної імуносупресії і зниження числа В-клітин було проведене друге дослідження, у якому додаткових мавп (по чотири в групі) імунізували ЕО, а потім уводили їм однократні дози о спі220, що складали 0,1 або 1,О0мг/кг, або РВ5. При обох дозах спостерігалася субоптимальна імуносупресія Ге! антитільного відгуку на ЕО. Помірне зменшення кількості В-клітин периферичної крові, з усією очевидністю, виявлялося у мавп, що одержували 1,Омг/кг спі 220 на 8-й день, і відновлялося на 29-й день. При дозі 0О,Тмг/кг -- спостерігалося зменшення середнього числа і відсоткового вмісту В-клітин периферичної крові, але ці значення ї- не виходили за межі звичайних показників відсоткового вмісту В-клітин. Взагалі норми абсолютного числа

В-клітин периферичної крові не були встановлені. У мавп, що одержували 1мг/кг спі220, виявлялося транзиторне мінімальне зменшення числа Т-лімфоцитів периферичної крові і помірне зменшення Т-клітинної проліферації ех мімо. | нарешті, не було даних на користь активації комплемента або пов'язаних із уведенням препаратів змін « бироваткових рівнів 1-6 або ТМРЇ.. Т-клітинна активація ех мімо, активація комплемента і рівні сироваткових з с цитокінів не виявлялися в мавп, що одержували 10, 40 або 10Омг/кг спі220.

В обох експериментах сироваткові зразки досліджувались після введення спі220 на циркулюючі рівні ;» випробуваних сполук і утворення антитіл проти цих сполук. Фармакокінетичний аналіз показав, що основна пікова концентрація спі220 у сироватці (С пах) не збільшується пропорційно уведеній дозі, а період півжиття 9Ппі220 збільшується в міру зростання дози. Було знайдено, що Спі220 є імуногенними при введенні в дозах 01, -І 1 ї тОмг/кг. Виявилось, що при циркулюючій концентрації, більшій за 1Омкг/мл, спі220 спроможні придушувати спрямований до них антитільний відгук. - 1. Протокол експерименту

Ге) На початковій стадії описаних вище досліджень мавпи циномолгус були розподілені по чотирьох групах, в 5р Кожну з яких входили по дві самки і по два самці. Всіх мавп імунізували за 28 днів до введення спі220 або о контрольної ін'єкції ОВА (5мг/кг внутрішньом'язово і 1Омг/кг підшкірно). У 1-й день усіх мавп імунізували ЕО

Ге) (1,7мл/кг; 1095 суспензія підшкірно), після чого проводили другу імунізацію ОВА (5мг/кг внутрішньом'язово і 10мг/кг підшкірно) безпосередньо перед введенням однократної внутрішньовенної болюсної дози спі220, що складала 10, 40 або 100мг/кг, або стерильного РВ5 у якості контрольного препарату. На 149-й день після того, в як сироваткові рівні спі220 упали нижче рівнів, оцінюваних як можливі імуносупресорні (приблизно 1Омкг/мл), а кількість В-клітин периферичної крові відновилася до перед-дозових рівнів у всіх групах, мавп імунізували

Ф) ОВА, ЕО і ГМФ (1Омг/тварину внутрішньом'язово). Мета імунізації ГМФ полягала в тому, щоб показати, що мавпи ка спроможні генерувати імунний відгук на неоантиген після введення спі220.

Для того, щоб продемонструвати кращий дозовий відгук відповідно до імуносупресії і зменшення числа бо В-клітин периферичної крові, додаткових мавп (дві самиці і два самці) у другому досліді імунізували ЕО і потім однократною дозою спі220 у кількості 0,1мг/кг або 1,Омг/кг, або РВЗ у якості контрольного препарату на 1-й день. В обох експериментах у визначені періоди часу безперервно спостерігали за гематологічними параметрами і субпопуляціями лімфоцитів периферичної крові. Хімічні параметри сироватки крові оцінювали в мавп, що одержували 10, 40 або 10Омг/кг спі220, але не оцінювали при дозах 0,1 і мг/кг, оскільки при більш б5 Високих дозах жодних ефектів, пов'язаних із уведенням препаратів, не спостерігалося. Крім того, визначали сироваткові рівні ЯМ, Ідс, ІДА і спі220. Виявляли також специфічний. І9М- і ІдсС-антитільний відгук на імуногени. ЕО й ОВА у відповідних зразках сироватки, отриманих безпосередньо перед уведенням імуногена і за тиждень після цього. Специфічний ІдМ- і Ід-антитільний відгук на випробувані антитіла в мавп, що одержували спі220, визначали до введення антитіл на 1-й день і за тиждень після цього. Для порівняння антитільного відгуку між групами використовували геометричні значення титрів. Крім того, визначали загальну гемолітичну активність комплемента (СН5»о) і рівень С4а-фрагмента, а також рівні ТМЕ-о і 1/-6 у мавп, що одержували 0,1 або мг/кг спі220, у визначених періодах часу після введення спі220. Проводили ех мімо дослідження активації

Т-клітин периферичної крові після стимуляції конканаваліном А у мавп, що одержували 0,1 і мг/кг спі220, на 17-й ії 31 -й дні для виявлення впливу спі220 на реакцію Т-клітин на мітоген. | нарешті, усіх мавп обстежували 7/0 щодня на виявлення клінічних симптомів токсичності, визначення щотижневої ваги тіла і щоденного споживання їжі.

Мавп імунізували ЕО до введення їм контрольного препарату або 10, 40 чи 10Омг/кг спі220О (Фіг.бА), або 0,1 чи мг/кг спі220 (Фіг) на 1-й день. Зразки сироватки аналізували на ІдМ-антитіла проти ЕО за методом

ЕІЗА. Одержані дані виражали через геометричні значення кінцевої точки титрування (КТТ) для антитіл проти 75 ЕО для кожної групи (п-2 (10Омг/кг, 15-й день) або 4), коли КТТ була еквівалентною оберненому найбільшому розведенню сироватки з поглинанням, більшим ніж у 2 рази середнього рівня фону. 2. Результати

А. Антитільний відгук на ЕО

При введенні спі220 мавпам у дозах 10, 40 або 100Омг/кг ефективність цих антитіл виявила себе у значному придушенні первинного антитільного відгуку на БО. У піковий (8-й) день контрольного первинного

ІдМ-антитільного відгуку на ЕО первинний ІдМ-антитільний відгук на ЕО придушувався приблизно на 92-94965 порівняно з контрольним препаратом у мавп, що одержали 10, 40 і 10Омг/кг спі220 (Фіг.бА). Групове значення

ІдМ-антитільного відгуку на ЕО не ставало позитивним аж до 85-го дня при дозах 10, 40 або 10Омг/кг. На піковий (15-й) день контрольного первинного ІдС-антитільного відгуку на ЕО первинний Ідс-відгук на ЕО с придушувався на 9895, 9995 і 85950 у мавп, що одержували 10, 40 і 10Омг/кг спі220 відповідно в порівнянні з контрольним зразком (Фіг.7А). Більш високі вихідні (до введення доз) антитільні титри щодо ЕО у групі, яка о одержала 10Омг/кг спі220, можуть бути підраховані при явній утраті дозозалежної імуносупресії. Більш того, у мавп, що отримали 10 або 100Омг/кг спі220, первинний ІдС-антитільний відгук на ЕО не виявлявся до 85-го дня досліджень. Проте, дві мавпи, які одержали 4Омг/кг спі220, виявляли затриманий первинний Ідс- антитільний Ге») зо Відгук на ЕО (за амплітудою порівнянний із контрольним відгуком), який ставав позитивним на З6-й день і досягав піка на 51 -й день досліду. о

На 149-й день після того, як сироваткові рівні спі22О упали нижче прогнозованих імуносупресорних рівнів Ф (приблизно 1Омкг/мл), а рівні В-клітин периферичної крові відновилася до перед-дозових рівнів у всіх групах, мавп імунізували еритроцитами ЕО другий раз. Як і очікувалося, контрольні мавпи виявили сильний вторинний -

Зз5 дО- антитільний відгук на ЕО. У мавп, які одержали 1Омг/кг спі220, виявлявся первинний ІдМ- і ї-

ІдО-антитільний відгук на ЕС, який у цілому був порівнянний із первинним антитільним відгуком у контрольних мавп. Проте, антитільний відгук на ЕО був усе ще частково придушений при дозі 4Омг/кг і суттєво придушений при дозі 10Омг/кг. Незважаючи на те, що в двох мавп, що отримали спі220 у дозі 4Омг/кг, у котрих попередньо визначався слабкий первинний антитільний відгук на ЕС, розвивався вторинний антитільний ІдМ- і Ідс-відгук на «

ЕО. Антитільний відгук на ЕО у двох інших мавп тієї ж групи й інших мавп, котрі одержали 10Омг/кг спі220, був Щ-0 с придушений приблизно на 9095 порівняно із середнім первинним відгуком на ЕО у контрольних мавп. й Субоптимальна імуносупресія антитільного відгуку на ЕО спостерігалася після введення спі220 у дозах 0,1 «» або 1,Омг/кг (Фіг.6В і 78). У той час як у всіх мавп, що одержували спі220, розвивався позитивний ІдМ-відгук на ЕО, загальний пік І9М-відгуку був придушений приблизно на 5695 у мавп, що одержували спі220 у дозі мг/кг,

У порівнянні із середнім піковим значенням контрольного відгуку. Ніякого придушення ІдМ-відгуку не -і спостерігалося в мавп, що одержували 0,1мг/кг спі220. Значення Ід9М-відгуку на ЕО досягало піка на 15-й день у контрольних мавп і на 8-й день у мавп, що одержували 0,1 і 1,Омг/кг спі220. Більш того, середній піковий - Ідб-відгук на ЕО був придушений на 5695 і 4295 у мавп, що одержали 0,1 і 1,Омг/кг спі220о відповідно. Ідо-відгук

Те) на ЕО досягав пікового значення на 15-й день у контрольних мавп і мавп, оброблених мг/кг спі220, і на 18-й день у мавп, що одержували 0,мг/кг спі220. - Б. Антитільний відгук на ОВА

Ге) Мавп імунізували внутрішньовенно дозами 10, 40 або 1О0Омг/кг спі220 у 1-й день. Крім того, усіх мавп імунізували овальбуміном (ОВА) у дні 28,1 і 149. Зразки сироватки аналізували на вміст ІМ (Фіг.8А) або ІдО (Фіг.88) проти ОВА. Отримані дані виражені в геометричних значеннях кінцевої точки титру (КТТ) анти-ОВА для 5Б Кожної групи (п-2 (10Омг/кг, 15-й день) або 4), коли КТТ були еквівалентні оберненому найбільшому розведенню сироватки при поглинанні, що більш, ніж у два рази, перевищувало середній рівень фону. іФ) Специфічне утворення ІдМ- і Ідб-антитіл проти ОВА контролювали щотижня під час спостереження за ко мавпами, які одержували 10, 40 або 10Омг/кг спі220. Первинний і вторинний антитільний відгуки на ОВА змінювались у широких межах і, у цілому, були слабкими у всіх мавп (Фіг.8). Мавпи, що одержували спі220 у 1-й бо день, мали більш високі титри антитіл до ОВА порівняно з мавпами контрольної групи.

На 149-й день мавпам вводили третинну імунізацію ОВА. Всі мавпи виявили позитивний ІдС-антитільний відгук на ОВА протягом 7 днів після введення. Контрольні мавпи і мавпи, яким вводилось 1Омг/кг спі220, мали титри антитіл, характерні для третинного антитільного відгуку, у той час як мавпи, яким вводили 40 або 10Омг/кг спі220, мали титри антитіл більш характерні для вторинного антитільного відгуку. 65 В. Антитільний відгук на ГМФ

Мавпам внутрішньовенно вводили спі220 у дозах 10, 40 або 1О0Омг/кг у 1-й день. Крім того, усіх мавп імунізували ГМФ на 149 день. Зразки сироватки аналізували на вміст І9М (Фіг.9А) та дос (Фіг.9В) антитіл проти

ГМФ. Отримані дані представлені як геометричні значення кінцевої точки титру (КТТ) антитіл проти ГМФ для кожної групи (п-2 (10Омг/кг на 15-й день) або 4), причому значення КТТ є еквівалентними оберненому найбільшому розведенню сироватки при поглинанні, що перевищує більш ніж у 2 рази фонове значення.

На 149-й день після того, як сироваткові рівні спі220 упали нижче величин, оцінюваних як можливі імуносупресорні (приблизно 1Омкг/мл), а рівні В-клітин периферичної крові відновились до перед-дозових рівнів у всіх групах, мавп імунізували ГМФ (внутрішньом'язово 1Омг/тварину).

Всі мавпи виявляли позитивні антитільні відгуки на ІМ і до, засвідчуючи те, що спроможність реагувати уо чна новий антиген не порушується (Фіг.9).

Г. Сироваткові рівні випробуваних антитіл і антитіл проти випробуваних Ід

Зразки сироватки досліджували після введення спі220, щоб визначити циркулюючі рівні випробуваних антитіл і виявити можливість формації антитіла проти цих антитіл. Середній пік сироваткової концентрації (Сіпах) спі220 спостерігався через З хвилини після введення доз 10 і 4Омг/кг і через 6 годин після введення /5 ДОЗИ 10Омг/кг. Величини Стах для спі220 складали 329, 2429 і 234Змкг/мл у мавп, яким уводили 10, 40 і 10Омг/кг спі220 відповідно. Проте, спостерігалися суттєві індивідуальні варіації величин С лах У окремих мавп у групах, що одержували 40 і 10Омг/кг спі220. Згідно з проведеними оцінками, середнє значення періоду півжиття спі220 складало 114, 173 і 315 годин у мавп, що одержували 10, 40 і 10Омг/кг спі220 відповідно.

Середні величини Саух, ЩО спостерігались за три хвилини після введення спі220, складали 1.77 і 33 для

ДОЗ 0,1 ї їмкг/кг відповідно. У межах кожної дози жодних суттєвих розбіжностей між сироватковими рівнями спі220 не спостерігалося. Середні значення АОС іп складали 15,5 і 847мкгч/мл для доз 0,1 їі 1,Омг/кг відповідно. В цілому проведені експерименти дозволяють припустити, що період півжиття спі220 збільшується в міру зростання дози введених антитіл. Більш того, очевидно, що С пах СПі220 збільшується диспропорційно збільшенню дози. с

Незважаючи на те, що антитільний відгук (ОМ на випробувані антитіла був мінімальним або не спостерігався в мавп, що одержували 10, 40 і 100Омг/кг спі220, суттєвий ІдсС-антитільний відгук на випробувані антитіла був і) виявлений у тварин, яким уводили 1Омг/кг спі220. Такий відгук виявлялася на 29 день-після введення спі220, приблизно через тиждень після того, як середнє значення сироваткової концентрації спі220 падало нижче 1Омкг/мл, і досягав пікових значень на 36-й і 43-й дні при геометричному значенні титру 12,627. Поява Ге! зо дсб-антитіл проти випробуваних мАТ у мавп, що одержали 1Омг/кг спі220, збігалося з першим проявом збільшення числа В-клітин після зниження їхньої кількості. До останнього дня дослідів (149) мавпи, які о одержали 40 і 100мг/кг, усе ще не виявляли позитивного антитільного відгуку на спі220, незважаючи на те, що Ге! середні сироваткові рівні спі220 у групах були нижче 1Омкг/мл аж до 57-го дня (4Омг/кг) або до 92 дня (10Омг/кг).

Спі220 були імуногенними при введенні в дозах 0,1 або мг/кг. У трьох із чотирьох мавп, що одержували ї"7 з5 спі220 у дозах 01 або мг/кг, спостерігався слабкий позитивний ІдМ-антитільний відгук на випробувані ча антитіла на 15-й день досліджень. У трьох із чотирьох мавп, що одержували спі220 у дозі 1мг/кг, спостерігався значний ІдС-антитільний відгук на випробувані антитіла на 22-й день, досягаючи середнього пікового геометричного значення кінцевої точки титру 16,618. Крім того, середнє геометричне значення Ідб-антитільного відгуку на випробувані антитіла не було позитивним у мавп, що одержували 0,1мг/кг спі220, і тільки в однієї « мавпи, яка одержала 0,мг/кг спі220, спостерігався слабкий позитивний Ідс-антитільний відгук на випробувані з с антитіла, який досяг пікового значення КТТ 2430 на 22-й день. У цілому, наведені дані дозволяють припустити, що спі220 спроможні імуносупресувати імунний відгук проти них самих при сироваткових рівнях, що ;» перевищують приблизно 1Омкг/мол.

Приклад 4

Одержання гуманізованих антитіл РЕА і І 3.17 проти СО40 -І На сьогоднішній день відомі різноманітні способи гуманізування мАТ. З'ясовано, що можна використовувати структурні підходи, але вони є складними через те, що велике число амінокислотних залишків каркасних ділянок, - потенційно залучених у зв'язувальну активність, зменшує шанси на успішне одержання заданих антитіл. Скоріше

Ге) не модельне прогнозування оптимальної структури каркасних ділянок, а одержання бібліотеки генів антитіл, як 5р показано нижче, дозволяє ідентифікувати активні конформації каркасних ділянок, базуючись на скринінгу о численних комбінацій. Мутагенез у комплексі з методами селекції забезпечує аналіз багатьох варіантів і імітує

Ге) процес "дозрівання" антитіл іп мімо, див. огляд (Магкв5, 9.О., еї аїі., У. Віої. Спет. 267:16007-16010 (1992)|).

Заснований на заміні кодонів мутагенез дозволяє конструювати бібліотеки, що характеризують внесок специфічних залишків у зв'язувальну спроможність і, таким чином, є більш ефективним, ніж підхід, заснований дво на вибірковому мутагенезі. Наприклад, РСК, що пов'язана з можливістю виникнення помилок, не може бути використана для синтезу комбінаторних бібліотек каркасних ділянок, описаних нижче. Більш того, вибірковий

Ф) мутагенез приводить до створення більшого числа, різноманітних бібліотек і, на жаль, велика частина мутацій ка не збільшує зв'язувальної активності мАТ. Відповідно до цього, для ідентифікації активних варіантів скринінгу повинна бути піддана більша кількість клонів. во Відомо про використання стратегії, що зветься "спрямованою селекцією", для виділення мАТ людини з фагової бібліотеки в дві стадії за використання мАТ гризунів у якості матриці МЮезреге, /.5., еї аї.,

Віо/Гесппоіосду 12:899-903 (1994) Нещодавно був описаний варіант методу спрямованої селекції при використанні фагової бібліотеки, згідно з яким химерний Ба-фрагмент використовувався для відбору І -ланцюга з бібліотеки, що містила І -ланцюги людини з щепленими СОКЗ миші |Кадег, С, еї аї., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 65 95:8910-8915 (1998)). Відповідно до цього, найактивніший І -ланцюг використовувався для відбору Н-ланцюга з бібліотеки Н-ланцюгів людини, що містили НСОКЗ миші. Антитіла, виділені за допомогою згаданих методів, були,

по суті, антитілами людини езреге, 1.5., еї аї., Віо/Гесппоіоду 12:899-903 (1994) або здебільшого антитілами-людини (|Кадег, С, еї аїЇ., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 95:8910-8915 (1998)) проте велика розмаїтість антитіл на кожній стадії викликала необхідність використання методів збагачувальної хроматографії.

Для одержання гуманізованих антитіл РА і 13.17 проти СО40 відповідно до даного винаходу були використані такі матеріали і методи. 1. Конструювання химерних антитіл проти СО4О0

На основі послідовності мАТ 2.220 миші проти СО40 були синтезовані і очищені перекривані олігонуклеотиди, що кодують Мн і М, (69-75 нуклеотидів у довжину). Варіабельні домени Н і Ї були синтезовані окремо шляхом 70 об'єднання 25пкМ кожного з перекриваних олігонуклеотидів із ДНК-полімеразою Ріи (Зігаїадепе) у 5Омкл суміші для РСкК-реакції, проведеної у 5 циклів: денатурації при 947С протягом 20с, відпалювання при 507"С протягом

ЗОс, підвищення температури до 72"7С протягом хв. і витримування суміші при 727С протягом З0с. Температуру відпалювання збільшували послідовно до 557С протягом 25 циклів. За цією ж самою схемою для подальшої ампліфікації їмкл злитого продукту в 100мкл суміші для РСК використовували обернений праймер і біотинільований спрямовуючий праймер. Продукти РСК очищали в агарозному гелі шляхом електрофорезу, електроелюювали і фосфорилювали полінуклеотидкіназою Т4 (Воепгіпдег Мапппеїйт) і потім інкубували з покритими стрептавідином магнітними бусами (Воепгіпдег Мапппеїт) у 5мМ Тріс-СІ, рН 7,5, 0,5ММ ЕДТА, 1М масі ї 0,0595 Твіну 20 протягом 15хв. при 25"С. Буси відмивали, а не підданий біотинілюванню мінус-ланцюг ДНК елюювали інкубуванням із 0,015М МаоОН при 25"С протягом 1Охв. Химерний Раб-фрагмент проти СО40 синтезували за допомогою модифікованого вектора М131Х104 (|Кгівіепезоп, К., еї аЇ., Массіпез 95, рр.39-43,

Соій Зргіпд Нагрог І арогаїогу, Соїй Зргіпд Нагрог, ММ (1995)), позначеного як М131Х104С5, отриманого гібридизаційним мутагенезом |(КозоК, М.9., ей аї., У. Віої. Спет. 271:22611-22618 ; Кипкеї, Т. А. Ргос. Маї.

Асай. Зсі. ОБА 82:488-492 (1985)) при використанні Мн і М, олігонуклеотидів у З-кратному молярному надлишку уридинільованої векторної матриці. Вектор М131Х104 був модифікований шляхом заміщення цистеїнових сч ов залишків на кінці капа і у1 постійних ділянок на серин. Реакційну суміш шляхом електропорації уводили у клітини рНТІ0ОВ і титрували за допомогою системи ХІ -1 Віце. о 2. Конструювання комбінаторних бібліотек каркасних ділянок і каркасних ділянок із СОКЗ

Комбінаторну бібліотеку каркасних ділянок (Ни І) синтезували за тим самим методом, що використовувався для одержання химерних антитіл проти СО40 із визначеними модифікаціями. Були синтезовані перекривані Ге»)

Зо олігонуклеотиди, що кодують каркасні ділянки Н і Ї. варіабельних доменів матричних антитіл людини і СОК мишачих антитіл проти СО40, визначених Е.А. Кабатом |Караї, Е. А., еї аї., Послідовності білків, що о становлять собою інтерес з боку імунології (5 Ед.), Муавпіпдіоп ОС: Опієд Зіаїез Оерагітепі ої Неайй апа со)

Нитап Зегмісез (1991); Караї, Е.А., еї аї., У. Віої. Спет. 252:6609-6616 (1977)) Також були синтезовані вироджені олігонуклеотиди, що кодують амінокислоти як людини, так і миші в семи положеннях М у і одному -- положенні Мк каркасних ділянок (Фіг.15, залишки відзначені зірочками). їч-

Бібліотеки каркасних ділянок із НСОКЗ (Ни І) ії НСОКЗЛСОМЗ (Ни ІІ) були синтезовані за тим самим методом, що і комбінаторні бібліотеки каркасних ділянок, із визначеними модифікаціями. СОК-залишками, відібраними для мутагенезу, були такі: Зег2-Туг02 у НСОВЗ і СіІпбЗ9-Тнг?" у | СОВЗ (Фіг.15, підкреслені). Для « забезпечення мутації визначеного залишку СОК були спроектовані олігонуклеотиди, що кодують НСОКЗ і

СОКЗ, а їхній синтез здійснювали шляхом уведення ММ(С/Т) у кожному положенні так, як описано в |СіІавзег, - с З.М., еї аї., У. Іттипої. 149:3903-3913 (1992)). Перекривані олігонуклеотиди, що кодують бібліотеку каркасних и ділянок, Її СОК миші не з бібліотеки, об'єднували з 25пкМ олігонуклеотидів, що кодують мутантну ділянку НСОКЗ, є» або з 25пкМ кожного з олігонуклеотидів, що кодують мутовані ділянки НСОКЗ і СОМЗ.

З. Скринінг фагових експресійних бібліотек

Бібліотеки Ни ІІ ї Ни І спочатку піддавали скринінгу за модифікованим способом збору бляшок, який має -і назву "захоплення бляшок" (ММаїКіпе, 9.О., еї аї.,, Апа)Ї. Віоспет. 256:169-177 (1998)) При цьому - нітроцелюлозні фільтри (82-мм) покривали антитілами кози проти капа-ланцюгів антитіла людини, блокували 1956-м БСА і наносили на чашки з агаром, що містили бактеріальний газон, інфікований фагами. Спочатку фаги се) наносили в концентрації 10Уфагів/л00мм чашку. Після захоплення експресованого фагами варіанта Бар проти о 20 с040, фільтри інкубували З години при 25"С із Бнг/мл СО40-Ід у РВ5, що містив 195 БСА. Фільтри відмивали чотири рази розчином РВ5, який містив 0,195 Твіну 20, і далі інкубували з антитілами кози проти ДО оь миші, с кон'югованими з лужною фосфатазою (Зошегтт Віогесппоіоду), З000-кратно розбавленим, у РВ5, що містить 195

БСА, протягом 1 години при 25"С. Після цього фільтри відмивали 4 рази розчином РВ5, що містив 0,195 Твіну 20, і піддавали обробці так, як описано вище |МУаїКкіп5, У.О., еї аЇ.,, АпаЇ. Віоспет. 256:169-177 (1998)). Для 22 виділення окремих клонів позитивні бляшки, відібрані при першому скринінгу, збирали і переносили при меншій (ФІ густині («10Зфагів/100мм чашку) і потім піддавали скринінгу за тим самим методом.

Комбінаторну бібліотеку Ни І спочатку піддавали скринінгу за методом ЕГ І5А, який забезпечує швидку оцінку о відносних афінностей варіантів антитіл (МуаїКіпе, У.О. еї аї., АпаїЇ. Віоспйет. 253:37-45 (1997)). Крім того, метод ЕГІЗА використовували для характеризації клонів, ідентифікованих за методом захоплення. Планшети 60 для мікротитрування покривали бмкг/мл антитіл кози проти капа-ланцюгів антитіла людини (Зошщегп

Віогїесппоіоду) і блокували З95-ним розчином БСА в РВ5. Потім 5Омкл Ра із культурного супернатанту Е. Соїї або клітинного лізату інкубували в чашках протягом 1 години при 25"С. Далі чашки відмивали три рази РВ5, який містив 0,195 Твіну 20, і О,Тмкг/мл СО40-Ід у РВ5, що містив 195 БСА, протягом 2 годин при 257С. Після цього чашки відмивали три рази розчином РВ5, який містив 0,195 Твіну 20 і добавляли кон'югат антитіл кози проти бо Ідбоь миші з лужною фосфатазою, З000-кратно розведеним розчином РВЗ, що містив 195 БСА, протягом 1 години при 25"С. Чашки відмивали три рази розчином РВ5, який містив 0,195 Твіну 20, і обробляли відомим шляхом Г(ММаїкіпв, .О., еї аі!., АпаіІ. Віоспет. 253:37-45 (1997). 4. Секвенування ДНК

Ізволювали одноланцюгову ДНК і секвенували гени варіабельних ділянок Н- і І -ланцюгів заявлених гуманізованих антитіл за допомогою методу флуоресцентної дідеоксинуклеотидної термінації (РегКкіп-ЕІтег,

Еовіег Су, СА).

Нижче наведені нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:7) і амінокислотна послідовність (ЗЕ ІЮ МО:8) варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла Б4:

САА АТТ сто ТТа АСА САС ТСТ ССА бос о дос ста тст Отто тет 42

Б І Ж Б От 0 5 Р АТ ьЬ 5 щь 85 14

ССА СОС САЛА ВСА ССС АСС СТО ТОС ТОСОАбСО ССС АСТ САС АСТ 84

Р Об Б В А ТТ ь 5 с В А 5 0 5 28

АТТ АОС САТ ТАС ТТА САТ ТО ТАС САД СА ААА-ССТ бос сла 126

І 5 Ів) ї ве н Ж ї о (9) Кк Е с (о) а?

ОСТ ССС Або СТО СТО АТО ТАТ ТАС ОСА ТС САС ТОС АТО ТСтТ 168

А ОВ ОВ ОВ Ь 1 0 Я Я А 5 НН 5 І 8 56

СОС АТС ССА сс доб ТС АСТ ОС АСТ боб ТСТ Сб АСА САС 210 с І в А Кк КЕ 5 б 5 а 5 с т р 70

ТТС АСТ СТО АСС АТС АОС АС ОСТА САб о ССТ САА САТ ТТТ ССА 252

ЕТ Вт І 8 85 Б Б Р Б 895 ЕЕ А в84 сТТ ТАТ ТАС ТСТ САб САТ СОС САС ОТСТ ТТ ССТ тб дес Отто 294 ж Ж Ж с00 нн б Н.В ЕЕ Р М т в 98

ФОСА СОС СО АСС ААС СТО САА АТТ ААА 321 б (с с т Кк ХМ Е І Кк 107

Нуклеотидна послідовність (ЗЕО І МО:9) і амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:10) варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованих антитіл ГА і 13.17 мають такий вигляд: с

САС сто САС Сто СТО САА ТСТ бсо ТСТ САС ТТ ААб о ААб ССТо 42

Ох 0 ь мМ 05 6 5 Б Б КК Р 15 Ге) бос сссС тТсА СТО ААС СТІ ТОС ТОС ААС ОСТ ТСТ СОА ТАС осссоО ва

Ге; А 5. Кк х 5 с Кк А 5 Є; ї А 28

ТТ АСТ все АСТ ОС АТО САС ОТСо сто ССА САС ОСС ССТ ОСА 126

Е ТТ т о М Ге) ІЙ М р: о вд Р с 42 Ф

САА соб СТІ сао тос АТО ОСА ТО АТС ААС АСС САС АбС боб 168 о б 71 ЕЕ М М б я І М т но 5 бо 56 о

СТО ССА ААС ТАТ СТО САС САС ТТ ААА СбА СОС тТтІТ сто ТтТо 210

М Р Кк 4 У Е р Е к б Кк Е У Е 70 Ф

ТСС ТТо САС АЄС тТСтТ сто АоС АСб СА ТАТ СТО САб АТС АОС 252 5 ь о т 5 У 5. т А ї ь о І КУ ва ч /АСС СТА АДС ОСТ САС САС АСТ ССС сто ТАТ ТАС ОТСТ Осо АСА 294 8 ь КК А Б 0 т А М У У с А В 98 ї- тст ОСС ААТ боб ААС ТАТ САС СТО СА ТАС ТТІ ААС ТАТ ТОб 336 в'в нн а М 195 АТ Е Кк ях м 12

ОСС САС о ССА АСС Сто СТО СС сто То ТсА 366 с (с) с т. У т У 8 5 122 «

Нуклеотидна послідовність (ЗЕО І МО:11) і амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:12) варіабельної З ділянки легкого ланцюга гуманізованого антитіла І 3.17 мають такий вигляд: с САД АТТ СтТС ТТС АСА САС ОТСТ ССА соС АС осто тТстТ о тТтб ТстТо 42

Е І У І т о 8 Р А т ї 5 1 5 14 :з» ССА соб сСАА АСА ССС о АСС Сто тес тТоС Асо сСС АСТ САС АсТо 84

Р б Е Ек А т ї 5 с І А 5 (о) 5 28

АТТ АБС САТ ТАС ОТТА САТ ТОб ТАС САА САС ААА ССТ СОС САС 126 1 5 р») У М н я ї о о Кк в о о 142 -І ОСТ ССО АСс Сто СТО АТО ТАТ ТАС ССА ТОС САС ТоС АТО тТстТ 168

А Р в ї М І У ї А 5 н 5 І 5 5е - СОС АТС ССА бССАСС ТТС АСстТ обсС АСТ бос ТТ Осо АСА САС 210 ; І Р А В Е 6 б 5 в 5 с т о то се) ТТС АСТ СТО АСС АСТ АСС АОС СТА САС ССТ САА САТ тт ССА 252

ЕК т 1 т І Б 8 ї Е Р Е ? Е А 84 є ШИ в

СТІ ТАТ ТАС ТСТ САС САТ СОС САС ТСТ ТАТ ССТ о ТОб дос ото 294

М У ї с о н с н Б У І-й І; и м ЕК 98 с СбА боб боб СС Ас СТО СА АТТ АВА з21 (с. б вот к У Е І Кк . 107 5. Експрагія й очищення Рай

Деякі Рар були клоновані у векторі експресії під контролем регульованого арабінозою ВАЮО-промотора. Крім о того, послідовність із б гіслидинових залишків була злита з карбокси-кінцевою ділянкою Н-ланцюга для забезпечення очищення на смолі, що утворює нікель-хелатні комплекси. Очищені Раб були схарактеризовані так, іме) як описано нижче (мМаїКіпв, .О., еї аі., Апаї. Віоспет. 253:37-45 (1997)). 6. Характеризація Рар 60 Планшети Іттиїоп ІІ для мікротитрування покривали 0,1мкг/мл СО40-Ід у РВ5 протягом 16 годин при 4С і блокували 396 розчином БСА в РВ5. Потім планшети відмивали три рази в РВ5, що містив 0,195 Твіну 20, Її звільнювані з периплазматичного простору Раб розбавляли послідовними триразовими розведеннями в РВ5, що містив 195 БСА. Далі планшети інкубували з Раб протягом 2 годин при 25"С. Потім планшети відмивали чотири рази РВ5, що містив 0,195 Твіну 20, і виявляли зв'язувальну спроможність антитіл інкубуванням їх з антитілами 65 кози проти капа-ланцюгів антитіл людини, кон'югованими з лужною фосфатазою, 2000-кратно розведеними РВ5, що містили 1906 БСА, протягом 1 години при 25"7С. Далі планшети чотири рази відмивали РВ5, що містив 0,190

Твіну 20, і результати враховували колориметричним шляхом |ММаїКкіпв, У.О., еї аї., АпаїЇ. Віоспет. 253:37-45

Для тестування варіантів на інгібування зв'язування ліганду планшети Іттиоп Ії покривали 2мкг/мл антитілами проти СО8 миші для захоплення злитого білка здар39, що експресує домен СО8. Планшети 1 раз відмили РВ5, який містив 0,0595 Твіну 20 і блокували 395 розчином БСА в РВ5. Потім планшети один раз відмили

РВБ5, що містив 0,0595 Твіну 20, і інкубували з культурним середовищем клітин, яке містило насичені рівні зар39, протягом 2 годин при 25"С. Білок здр39, що не зв'язався, відсмоктали, а планшети відмили два рази РВ5, що містив 0,0595 Твіну 20. Потім 25мкл очищеного варіанта Бар, послідовно трикратно розведеного РВ5, 70 добавили в лунки і до них внесли 25мкл Ід проти СО40 людини з концентрацією 4мкг/мл у РВ5. Далі планшети інкубували 2 години при 25"С і тричі відмили РВ5, що містив 0,0595 Твіну 20. Зв'язування СО40-Ід виявили через 1 годину інкубації при 257С із (РабБ)»-фрагментами антитіл кози проти Есу ДС людини, кон'югованими з пероксидазою хріну (дасквоп), 10000-кратно розведеною РВ5. Далі планшети відмили 4 рази РВ5, що містив 0,059о5 Твіну 20, і зв'язування визначали за кількісним колориметричним методом шляхом інкубування з мг/мл 75 о-фенілендіаміндигідрохлориду і 0,00395 пероксиду водню в 50ММ оцтової кислоти, 100мМ Ма»НРО»,, рН 5.

Реакцію зупинили доданням НьзоО, до кінцевої концентрації 0,36М і визначили поглинання на хвилі 49Онм. 7, Аналіз за методом ВіАсоге

Кінетичні константи взаємодії між СО40 і варіантами антитіл проти СО40 визначали за методом поверхневого плазмонного резонансу (ВІАсоге). Злитий білок сраб-Ід імобілізували з 20. (1-етил-3-І(З-диметиламінопропил|-карбодіїмідом гідрохлоридом) і активованим // М-гідроксисукцинімідом сенсорним чипом СМ5 шляхом уведення мкл 1Омкг/мл СО40-д у 10мММ ацетаті натрію, рН 4. СО40-І9 імобілізували за низької густини (приблизно 150 КИ) для запобігання повторного зв'язування Рарб під час дисоціації. Для одержання констант швидкості асоціації (Коп) швидкість зв'язування Раб у шести концентраціях 25-600НМ у РВЗ визначали при швидкості потоку 20мкл/хв. Константи швидкості дисоціації (Кож) розраховували су як середні значення шести вимірювань, отримані під час аналізу фази дисоціації. Сенсограми аналізували за допомогою програми ВІА 3.0. Ку обчисляли за формулою К 4-Коп/Коп. Залишкові Рар-фрагменти видаляли о шляхом пролонгованої дисоціації після кожного вимірювання.

Результати кінетичного аналізу гуманізованих антитіл Р4 і 13.17 у порівнянні з химерними Раб представлені в Таблиці 1: Ф 7 о

Ф

- м 8. Результати гуманізування

Як описано вище, послідовності каркасних ділянок варіабельної області мАТ миші проти СО40 використовувалися для ідентифікації, найбільшою мірою, гомологічних послідовностей зародкової лінії людини. «

Залишки каркасних ділянок Н-ланцюга були на 7495 ідентичні послідовностям МН7(7-4.1) і ЗНА зародкової лінії -о с людини, у той час як І -ланцюг був на 7595 ідентичним відповідним послідовностям МКІЇ! (І 6) і УК4 зародкової лінії людини. Вирівняні варіабельні послідовності Н- і | -ланцюгів показані на Фіг.15. Залишки СОК, визначені ;» Кабатом. (|Кабаї, Е.А., єї аі., Секвенування послідовностей білків, що становлять імунологічний інтерес (5

Ед), УМУазпіпдіоп ОС: Опіей 5іаїез Юераптепі ої Неакй апа Нитап бегмісез (1991); Кабраї, Е.А., еї аї., 9.

Віої. Спет. 252:6609-6616 (1997)) підкреслені і виключені з аналізу на гомологію. Залишки каркасних ділянок, -І що різняться у МАТ миші і матричних антитіл людини, оцінювалися індивідуально.

По результатах структурного аналізу й аналізу послідовностей ділянки СОК антитіл за винятком НСОКЗ - виявляли обмежене число основних конформацій ланцюга, які звуться канонічними структурами |Споїпіа, С. еї о аі.,, У. Мої. ВіоЇї. 196:901-917 (1987); Споїйіа, С. еї аїЇ.,, Майте 342:877-883 (1989)). Більш того, були ідентифіковані певні залишки, критичні для виявлення основних конформацій петель СОК |Споїпіа, С. еї аї.,.. о Мої. ВіоІ. 196:901-917 (1987); СпоїШйіа, С. еї аЇ., Майте 342:877-883 (1989)) Були також ідентифіковані

Ге канонічні залишки каркасної ділянки анти-СО40 миші, і було показано, що амінокислоти у всіх критичних канонічних позиціях каркасних ділянок Н- і | -ланцюга матриць людини ідентичні відповідним амінокислотним залишкам антитіл миші.

Експоновані на поверхні амінокислотні залишки антитіл миші, які зазвичай в антитілах людини не виявляються, швидше за все дають певний внесок в імуногенність гуманізованих мАТ ГІРадіап, Е.А. Мої. Іттипої. (Ф. 28:489-498 (1991)). Таким чином, були проаналізовані залишки каркасних ділянок, що відрізняються в анти-СО40 ко миші і матричних антитілах людини, і на основі експонування в розчині було завбачене місце їхнього знаходження - тобто усередині або на поверхні антитіл (Радіап, Е.А. Мої. Іттипої. 28:489-498) (1991)). Не во очікувалося, що експоновані в розчин залишки каркасних ділянок, дистальні відносно СОК, дають істотний внесок у зв'язування антигена, і тому за винятком двох залишків Н-ланцюга, усі були замінені на відповідні амінокислоти людини для зниження можливої імуногенності. Для залишків 28 і 46 Н-ланцюга було завбачено, що вони є експонованими в розчин. Проте Н28 локалізований у межах НСОК1-ділянки, як визначено в праці (Споїйпіа еї а! (див. вище) і, можливо, взаємодіє з антигеном. Крім того, лізин Ні4б у мАТ миші до деякої міри є в5 нетиповим і істотно відрізняється від глутамінової кислоти в матричному антитілі людини. Таким чином, залишки

Н28 їі Н4Є в антитілах миші і людини були експресовані в комбінаторній бібліотеці (Фіг.15, відзначені зірочками).

Решту різноманітних залишків каркасних ділянок для котрих завбачено, що вони здебільшого "утоплені" в антитіло, оцінюють за такими показниками: (1) близькості до СОК; (2) спроможності контактувати з протилежним доменом Мк-Мн-простору; (3) ступенем доречності різноманітних амінокислот; і (4) прогнозованим ступенем важливості в модулюванні СОК-активності, як визначено в праці |Зійапіска, О.М., еї аїЇ., Ргоївіп. Епа. 7:805-814 (1994)). Велика частина розходжень занурених амінокислотних залишків каркасних ділянок І -ланцюга відносилась до споріднених амінокислот у положеннях, для яких вважалось малоймовірним їхнє безпосереднє залучення до конформації СОК. Проте, 149 локалізований у безпосередній близькості від | СОКО2 і такий, що потенційно контактує з Му-доменом, не зв'язаний із залишком людського походження і може бути залучений у /о детермінацію конформації ГСОК2. З цих причин амінокислоти мишачого і людського походження в положенні

І 49 експресуються в комбінаторній бібліотеці каркасних ділянок (Фіг.15, відзначені зірочками).

Аналіз послідовності Н-ланцюга миші і матричних послідовностей людського походження був більш складним. Залишок НО був проліном у мАТ миші, у той час як матриця людського походження містила неспоріднений залишок серину. Положення НО також може грати певну роль у модулюванні конформації СОК і, /5 таким чином, воно було відібране в якості сайта комбінаторної бібліотеки (Фіг.15, відзначені зірочками).

Решта занурених залишків каркасної ділянки, що різнилися в анти-СР40 миші і матриці Н-ланцюга, знаходилася в положеннях 38, 39, 48 і 91 каркасної ділянки. мАТ миші проти СО40 містили глутамін і глутамінову кислоту в положеннях НЗ8 і НЗО відповідно, у той час як матриця людського походження містила аргінін і глутамін.

Залишок НЗВ8 знаходився поблизу від НСОКІ, зміна глутамін -»аргінін не є консервативною, а експресія го глутаміну в цьому сайті в мАТ миші до деякої міри незвичайна. Аналогічним чином, зміна глутамінова кислота. »глутамін є неконсервативним розходженням для занурених амінокислот, НЗО є потенційним контактним залишком Му, а глутамінова кислота до деякої міри є нетиповою для мАТ миші. Залишок Ні8 знаходиться в безпосередній близькості від НСОКЗ і НО і завбачено, що це положення є сайтом високого ризику ІЗіцапіска,

С.М., еї аї., Ргоївіп Епо. 7:805-814 (1994); Наїтів, І, еї аї!.,, Ргої. Зсі. 4:306-310 (1995)), що потенційно контактуєз «СМ

Мк-домєном. Таким чином, амінокислотні залишки як антитіл миші, так і людини експресувались у положеннях о

НЗ8, 39, 48 і 91 (Фіг.15, відзначені зірочками).

У цілому, бібліотека каркасних ділянок складалася з СОК миші, щеплених на матриці людського походження.

Крім того, один залишок каркасної ділянки І -ланцюга і 7 залишків каркасної ділянки Н-ланцюга розглядалися як потенційно важливі для підтримки активності мАТ. Всі зазначені сайти були схарактеризовані шляхом синтезу (о) комбінаторної бібліотеки, що експресувала усі можливі комбінації амінокислот людини і миші, знайдених на цих залишках. Загальний діапазон розмаїтості бібліотеки, позначеної як Ни І, складався з 28 або 256 варіантів о (Таблиця 2, нижче). Ге») - зв ча « " 7 с тридцять два кодони. п ""Бібліотеку Ни І піддавали скринінгу за методом ЕГІЗА, використовуючи антитіла, експресовані у дрібномасштабних бактеріальних п » культурах Г(Маїкіпв», у.О., еї аі!., Апа!. Віоспет. 253:37-45 (1997)). Бібліотеки Ни ІІ ї Ни Ії були висіяні на газони з ХІ-1 блакитним 256:169-177 (1998).

Ше Бібліотеку Ни І експресували в дрібномасштабних («1мл) бактеріальних культурах, однакові кількості Раб, - що звільнюються з периплазматичного простору, поміщали в планшети для мікротитрування, і зв'язувальну активність антитіл порівнювали безпосередньо за методом ЕЇІЗА (ММаїКкіпв, 9.О., еї аї., Апаї. Віоспет. о 253:37-45 (1997) Незважаючи на те, що були ідентифіковані варіанти, що зв'язують антиген-мішень з о 20 афінністю, яка є порівнянною або перевищує активність химерного Раб, більшість скринованих клонів Ни | були менш активними, ніж химерний Раб проти СО40. Приблизно 695 випадково відібраних варіантів Ни | виказували с зв'язувальну активність, порівнянну з химерним Раб (дані не наведені). Ідентифікація численних варіантів Ни з активністю, порівнянною з активністю химерного Раб СО40, погоджувалася з інтепретацією даних про те, що більшість критичних залишків каркасної ділянки включена в комбінаторну бібліотеку. 29 Активні клони були схарактеризовані далі титруванням на імобілізованому антигені, що забезпечує (ФІ ідентифікацію численних варіантів зі збільшеною афінністю. Наприклад, клон 19211 зв'язував СО40-рецептор із більш високою афінністю, ніж химерний Рар, як це підтверджується зсувом профілю титрування (Фіг.16, о незафарбовані кружки в порівнянні з зафарбованими). ДНК-секвенування 34 найактивніших клонів дозволило ідентифікувати 24 унікальні комбінації каркасних ділянок, кожна з яких містила 2-6 залишків каркасних ділянок 60 антитіл миші (дані не наведені).

ГСОКЗ Її НСОКЗ контактують з антигеном безпосередньо, реагуючи з іншими СОК, і часто значним чином впливають на афінність і специфічність антитіл (|ММівоп, ІА еї аї., Сит. Оріп. Зігисі. ВіоїЇ. 3:113-118 (1993); Раїдап, Е.А. Мої. Іттипої. 31:169-217 (1994)). Крім того, конформація СОКЗ ії НСОКЗ частково була визначена за допомогою залишків каркасної ділянки. Для ідентифікації найактивнішого антитіла був бо використаний мутагенез кодонів |Сіазег, 5.М. еї аї., у). Іттипої. 149:3903-3913 (19923 з метою синтезу олігонуклеотидів, що вводять мутації в кожне положення в НСОКЗ, одну за один раз, приводячи до експресії всіх 20 амінокислот у кожному залишку СОК. Кожний олігонуклеотид, кодує не більш ніж одну зміну амінокислоти.

Пул олігонуклеотидів, що кодують бібліотеку НСОМКЗ, змішували з перекриваними олігонуклеотидами, що

Кодують комбінаторну бібліотеку караксних ділянок і інші СОК, для одержання бібліотеки "каркасна ділянка/НСРРУ". Розмаїтість зазначеної бібліотеки, позначеної як Ни ІІ, оцінювалася величиною 1,1х10 5 (Таблиця 2, див. вище). Бібліотека | СОКЗ була синтезована аналогічним чином. Олігонуклеотиди, що кодують

ГСОМЗ, НСОКЗ і комбінаторну бібліотеку каркасних ділянок використовували для одержання бібліотеки "каркасні ділянки/НСОКЗЛ СОКУ", позначеної як Ни ІІІ. Велика кількість комбінацій "каркасна ділянка/СРРЗ" у бібліотеці 70 оцінювалося величиною 3,1х107 (Таблиця 2, див. вище).

Комбіновані мутації в /СОКЗ і/або НСОКЗ у бібліотеці каркасних ділянок збільшили число потенційних варіантів гуманізованих анти-СО40 від 256 до більш, ніж 107. З метою більш ефективного скринінгу таких бібліотек був використаний модифікований метод відбору бляшок, відомий як "захоплення бляшок" (МУаїкіпв,

У.0., еї аІ., АпаІ. Віоспет. 256:169-177 (1998)). Полягав він у тому, що інфіковані фагом бактерії поміщали 75 на твердий агар, і на агар послідовно нашаровували нітроцелюлозні фільтри, покриті Рар-специфічним реагентом. Після захоплення практично близьких кількостей експресованих фагами Бар фільтри обробляли 5нг/мл злитого білка СО40-Ід. Оскільки на фільтри був нанесений антиген у концентраціях, значно нижчих за Ку

Еар, виявлялися лише ті варіанти, що виказували підвищену афінність. Численні клони з більш високою афінністю ідентифікували по результатах скринінгу більш ніж 106 варіантів бібліотеки Ни ІІ і більш ніж 105 варіантів бібліотеки Ни Ії за допомогою 82мм фільтрів, що містили близько 105 варіантів на фільтр (Таблиця 2).

Через високу густину фагів на фільтрах позитивні бляшки відбирали, пересівали на чашки з більш низькою густиною і знову піддавали їх скринінгу. Далі варіанти, які продукували найбільш інтенсивний колориметричний сигнал у методі "захоплення бляшок" схарактеризували за допомогою ЕЇ ІЗА. Як і очікувалося, більшість клонів, ідентифікованих скринінгом захоплення бляшок, зв'язували СО40 краще, ніж химерний Раб. Титрування варіантів.їД «СМ на імобілізованому СО40-Ід дозволило ідентифікувати численні клони з більшою афінністю, ніж химерний і о гуманізований Раб (Фіг.16, порівняння незафарбованих квадратів, зафарбованих трикутників і кружків).

Мутації "каркасні ділянки/С ОК", що забезпечували посилену афінність, ідентифікували секвенуванням ДНК.

Унікальні послідовності варіабельних ділянок ідентифікували в 10 із 13 Ни ІІ варіантів і в З із 4 Ни варіантів. Варіанти Ни ІІ ї Ни І, що містили 1-5 залишків мишачого походження в каркасних областях і 0-2 (о) зо сСОокЗ-мутації, підсумовані в Таблиці З нижче. о

Ф

- вжи 010000600111060м ни 1всм1111111111еняия1111111111111о1111 ин НИ ИН НК ННЯ НС нс з й визначене по числу СОК згідно з (Кабаї еї а!.) (див. вище). Число залишків у каркасних ділянках АТ миші, що відрізняються від матриць

АТ людини, укладено в скобки. Всі розходження в каркасних ділянках між мАТ миші і гуманізованими версіями АТ локалізовані на Н-ланцюгу (Н) у позначених положеннях відповідно до нумераційної системи Кабата (Карваї еї а!.) (див. вище). -І - Афінність експресованих у бактеріях химерних Бар і відібраних варіантів із кожної бібліотеки була схарактеризована більш докладно за методом поверхневого плазмонного резонансу для визначення (Се) швидкостей асоціації і дисоціації очищених Раб з імобілізованим СО40-Ід. Химерні анти-СР40 мали константу о 50 дисоціації ка-3,14нМ і, узгоджуючись з результатами скринінгу, багато варіантів виявляли більш високу афінність. Два з кращих клонів - Е4 і 13.17 - мали К.-0,24нМ і О1ОнНМ відповідно (Таблиця 1). Підвищення 3е) афінності варіантів анти-СР4А0О виказували переважно більш повільну швидкість дисоціації, у той час як величини швидкості асоціації були схожими в усіх варіантів (розкид від 0,9 до 3,2х109М7187,

ІЇ нарешті, варіанти з підвищеною афінністю тестували на їхню спроможність блокувати зв'язування ліганду 2о др3О із рецептором СО40. Всі варіанти гальмували зв'язування розчинного злитого білка СО40-Ід з о імобілізованим антигеном др39 дозо-залежним чином, що корелювало з афінністю Рар (Фіг.17). Наприклад, найсильніший інгібітор зв'язування ліганду зі злитим білююом СО40-Ід являв собою варіант 288, який також був ю варіантом із найбільш високою афінністю проти СО40 (Фіг.17). Варіант 288 виказував приблизно у 17 разів вищу афінність із СО40, ніж химерні Раб, і гальмував зв'язування ліганду приблизно у 7 разів ефективніше. 60 Приклад 5

Модельна система на мишах

Автори також одержали і тестували іп мімо моноклональні антитіла пацюка проти СО40 миші, позначені як 7ТЕ1-52р, і їхні попередники 7Е1-51. Одержання таких антитіл було пов'язане з необхідністю вивчення анти-СРАО-терапії аутоїмунних, запальних і трансплантаційних захворювань на модельних системах мишей. У 65 першу чергу завдання полягало в тому, щоб створити конкурентні антитіла проти антитіл миші, які б імітували 2.220 і блокували зв'язування др39/С040 за слабкої співстимулюючої активності, і протестувати такі антитіла іп мімо на експериментальних моделях захворювань.

А. Одержання і характеристика мАТ 7Е1-01 і 7Е1-5265 проти СО40 миші 1. Імунізація, злиття і характеристика

Для імунізації 8-тижневих самок пацюків І ем/із через подушечки лап використовували рекомбінантно злитий білок миші СО40-Ід, що складався з позаклітинної ділянки СО40 миші, злитої з шарнірною ділянкою, СНО- і

СНЗ-доменів антитіла ї(д902а миші (тСО40-тід). Через три дні після останньої імунізації лейкоцити з дренованих лімфатичних вузлів зливали з клітинами мієломи Х63-Ад8.653 миші для одержання гетерогібридом пацюк/миша.

Лунки, що містили антитіла, специфічні до нативного СО40 миші, ідентифікували на реактивність із початковим 7/0 їмуногеном тСО040-тід в ЕГІЗА і на реактивність із позитивною по СО40 В-клітинною лімфомною лінією

МУЕНІ-231, АТСС СКІ-1702. Потім супернатанти тестували на їхню спроможність інгібувати зв'язування тсО40-тід із розчинним, рекомбінантно злитим білюм тСО8-др39 миші, тор39, еквівалентом здар39 мишачого походження. Приблизно 12 із усіх лунок із найбільш сильною інгібіторною активністю клонували за методом обмежувальних розведень.

Після клонування проводили дослідження функціональності на культурних супернатантах й очищених антитілах для більш точної оцінки спроможності мАТ проти СО40 інгібувати взаємодію др39 миші і СО40 і визначення їхніх стимуляторних властивостей. Інгібіторні властивості визначали за спроможністю АТ інгібувати зв'язування торзЗО із М/ЕНІ-231 за допомогою відомих стандартних методик. Стимуляторні властивості визначали шляхом індукції густої гомотипової адгезії клітин УУЕНІ-231 і проліферації В-клітин селезінки при наявності антитіл і анти-ЮМ за відомими методами. Таким чином, були ідентифіковані три мАТ (5АЗ, 7Е1-О1 і 8Е1), що із найбільшою імовірністю були антитілами 2.220 проти СО40 людини з очікуваним рівнем співстимуляторної активності і спроможністю блокувати др39/С040. 2. Селекція 7Е1 як основного МАТ проти СО40О миші

Експерименти іп мімо на мишах мали на меті визначити те, які з мАТ проти СО40, що блокують і володіють сч об співстимуляторною активністю, найбільш ефективно придушують специфічний антитільний відгук на Т-залежні антигени. У зв'язку з цим вивчали супресію ІдбС-антитільного відгуку на ЕО у мишей під впливом мАТ проти СО40 і) миші. Групи з п'ятьох мишей ВАЇ В/с були імунізовані 1хХ1089 ЕО й одночасно оброблені інтраперитонеально 1мг

МАТ БАЗ, 7Е1-51 або 8ЕЇ1Ї проти СО40 миші. У якості контрольних зразків брали групи аналогічним чином імунізованих мишей, оброблених МК1 (антитіла хом'ячка проти др39 миші, позитивний контрольний зразок Ге»! 25Омкг), б6ЕЗ9 (антитіла пацюка проти др39, негативний контрольний зразок, їмг) або РВ5. У мишей визначали титри Ід до ЕО в ЕГІБА на 7, 14, 21 ії 35-й дні. Результати показали, що коли тварині вводять одну дозу - антитіл при одночасному введенні антигена ЕО, мАТ 7Е1-С1 виказує більш ефективне придушення Ід-відгукуна Фд)

ЕО порівняно з мАТ 5АЗ або 8Е1. Таким 52 - чином, зазначене мАТ було відібране як найбільш перспективне моноклональне антитіло проти СО40 для - вивчення на мишах.

З. Варіант мАТ 7Е1-01 із переключеним ізотипом 7Е1-51 не виказує ефекторних функціональних властивостей, порівнянних із властивостями химерного мАТ « 2.220 проти СО40 миші (наприклад, (дО пацюка не є ефективними у якості (ДС1 людини в реакції зв'язування 70 Комплемента і взаємодії з Рс-рецептором), і профіль специфічної антитільної супресії іп мімо для 7Е1 не такий - с показовий, як для мАТ 2.220 в дослідженнях на приматах. Таким чином, антитіло зі специфічністю 7Е1, але ц ізотипу АТ пацюка більш близького до (91 людини, буде мати ефекторні функції, більш схожі з такими в ІдС1 "» людини. З цією метою за методом субселекції був отриманий природний варіант 7Е1 із переключеним ізотипом, тобто переключеня здійснювали в напрямку ІдсСт1 - ІдсС2рБ ІНаїе еї аїЇ., У. ІттипоїЇ. Меїйодз 103(1):59-67 (1987)). Коротко, мАТ проти СО40 ізотипу Д52р було ідентифіковане за методом ЕГІЗА серед супернатантів -І 96-лункових планшетів, у які висівали 100Окл/лунку початкової гібридоми 7Е1. Клітини поміщали у планшети з з густиною 200 і далі 20 клітин у розрахунку на лунку, і кожного разу відбирали лунки, позитивні за утворенням

Ідо2р. Далі клітини з відібраних лунок 2 рази тестували за методом обмежувальних розведень і виділяли клони (Се) 7ТЕ1, що продукували ІдДО2р переключеного ізотипу 7Е1 -52р.

Клон 7Е1-526р продукував антитіла переключеного варіанта ізотипу ІдДО1, що підтверджується трьома різними о дослідженнями. По-перше, М-кінцеве секвенування важкого ланцюга показало, що як отримані антитіла, так і (Че) антитіла-попередники ідентичні першим З5 амінокислотним залишкам. По-друге, РСК при використанні праймерів, специфічних до СОК варіабельної ділянки важкого ланцюга 7Е1-51, приводить до утворення молекул відповідного розміру на матриці кКДНК, отриманої з 7Е1-51 або 7Е1-52р, а не з двох інших Неспоріднених антитіл. | нарешті, оцінка зв'язувальної активності очищених антитіл двох версій з імобілізованим СО40-пІд в ЕГІЗА при використанні анти-капа індикаторного реагенту дала практично однакові о криві титрування. ко Б. Дослідження іп мімо 1. Порівняння 7Е1-51 і 7Е1-52Б5 на моделі антитільного відгуку іп мімо во 7Е1-61 порівнювали з 7Е1-52Б5 на ефективність іп мімо при використанні ЕО в якості залежного від Т-клітин антигена. Групи з 3-5 тварин імунізували внутрішньовенно ЕО й одночасно інтраперитонеально антитілами 7Е1-51 або 7Е1-52Ь у дозах 1, 0,25 або 0,1мг речовини в день 0, як показано на Фіг.10. Антитіла мАТ МК1 проти 9р39 миші служили позитивним контрольним реагентом на імуносупресорний ефект. Антитіла мАТ 6Е9 і РВ5 служили в якості недоречних мАТ і контрольних реагентів не-мАТ відповідно. Мишей оцінювали на титри антитіл 65 проти ЕО за методом ЕГІЗА на 7, 14 і 21-й дні. Титри відповідали обчисленому розведенню сироватки, що дає

О00-3 в ЕП ІЗА. Як показано на Фіг.10, 7Е1-526 придушували ІдО-відгук на ЕО в дозах, коли 7Е1-01 не були активні. 2. Дозовий відгук 7Е1-5265 на Т-залежні антигени на моделях мишей 7ТЕ1-52Ь оцінювали на залежний від Т-клітин первинний імунний відгук на моделях при використанні ЕО в якості антигена. 7Е1-52р тестували в різноманітних дозах для визначення найменшої ефективної дози. Мишей

ВАЇ В/с (п-5) ін'єктували ІМ 1х1ОЗЕО, а також здійснювали одну ін'єкцію 7Е1-02Б у встановлених дозах, або МА1 (антитіла проти др39 миші), або РВ5 вводили в той самий час у якості антигена в день 0. На Фіг.11 показаний

Ід-відгук на ЕО на 7, 16 ії 28-й дні. Одержані значення відповідають поглинанню в ЕГІЗА при розведенні сироватки 1/50. Рисками позначене стандартне відхилення. 70 Як видно на Фіг.11, одна обробка 7Е1-52Б5 у дозі 25мкг/мишу (1,25мг/кг) приводила до придушування

Ід-їімунного відгуку на 8795 на 16-й день, а в дозах 50 або 100мкг - цілком на 16-й день. На 28-й день доза 5Омкг/мишу придушувала Ід-відгук на 8995, а доза 10О0мкг/мишу - цілком. Слід звернути увагу на те, що МК1 використовувався в якості позитивного контрольного зразка імуносупресії в субоптимальній дозі 10О0мкг/мишу. 3. 7Е1-626 і запобігання індукованому колагеном артриту (ІКА) на моделях мишей

Стандартна експериментальна модель ревматоїдного артриту миші, модель індукованого колагеном артриту (ІКА), використовувалася для визначення ефекту 7Е1-320О0 щодо запобігання артриту. Самок мишей ОВАЛ.) (віком 6-8 тижнів) ін'єккгували 20Омкг колагену типу ! курчати (К І) у повному ад'юванті Фрейнда внутрішньовенно в день 0. 7Е1-52р у дозі 250мкг уводили інтраперитонеально кожні чотири дні, починаючи з 7-го. Контрольну групу обробляли РВЗ за тією самою дозовою схемою. Потім всіх мишей на 21-й день бустирували К ІЇ у неповному ад'юванті Фрейнда. За тваринами спостерігали щодня, реєструючи набряки лап і оцінюючи їх за шкалою 0-3, де цифра З відповідає максимальному набряку й еритемі. Крім того, лапи щодня вимірювали штангенциркулем. Загальні клінічні показники одержували, сумуючи дані по кожній лапі під час умертвіння тварин і ділячи їх на загальне число тварин у кожній групі. Значення відповідних величин представляли у вигляді середніх результатів по групах. с

Розвиток артриту і супутнє запалення суглобів цілком інгібувалось при введенні 7Е1-520Б, як показано в

Таблиці 4 нижче. У мишей, яких обробляли 7Е1-52Б, цілком були відсутні симптоми захворювання протягом 90 і9) днів.

Ф зо

ВШ іа а с ст Ф пе 017986001006161 ов тв; 01000960010019 005 - зв м

Як показано вище, заявлені антитіла є сильними імуномодуляторами і можуть знайти терапевтичне застосування для лікування різноманітних захворювань.

Даний винахід стосується химерних і гуманізованих антитіл, описаних вище, із додатковими консервативними « амінокислотними замінами, що практично не справляють суттєвого впливу на зв'язування СО40. Консервативні 2 с заміни, зазвичай, включають до свого числа заміщення однієї амінокислоти на іншу, яка володіє подібними властивостями, наприклад, заміщення в межах таких груп: валін, гліцин; гліцин, аланін; валін, ізолейцин, :з» лейцин; аспарагінова кислота, глутамінова кислота; аспарагін, глутамін; серин, треонін; лізин, аргінін; і фенілаланін, тірозин.

Один з аспектів винаходу стосується одержання химерних і/або гуманізованих антитіл, як описано вище, -І шляхом експресії рекомбінантних сегментів ДНК, що кодують варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів Ід миші (або їхні фрагменти), сполучені із ДНК-сегментами, що кодують постійні ділянки Їд людини. Прикладом - отриманої відповідно до винаходу ДНК-послідовності, що кодуює поліпептидний ланцюг, який містить о варіабельну ділянку легкого ланцюга або її фрагмент, може служити послідовність ЗЕО ІЮО МО 1 або відповідний депонований клон АТСС. Прикладом отриманої відповідно до винаходу ДНК-послідовності, що кодує о поліпептидний ланцюг, який включає у себе варіабельну ділянку важкого ланцюга або її фрагмент, може

Ге) служити послідовність ЗЕО ІЮ МО:2 або відповідний депонований клон АТСС.

Винахід стосується також варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів Ід, а також їхніх активних або функціональних фрагментів. Імунологічно значущі або функціональні форми білка або його фрагментів називаються тут варіабельними ділянками легкого/важкого ланцюга або їх біологічно активними частинами. В аналізованому випадку біологічно активні частини білка включають до свого числа фрагмент згаданих легкого (Ф. або важкого ланцюгів, які у складі антитіла усе ще забезпечують зв'язування антитіла з СО40 людини. ко Винахід також стосується послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів заявленого антитіла. Наприклад, нуклеотиди 1057-1422 (5ЕБЕО ІЮО МО:5), показані на Фіг.13, бр являють собою кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу; нуклеотиди 1065-1388 (5ЕО ІЮО МО:6), показані на Фіг.14, являють собою кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, отриманого відповідно до даного винаходу. ЗЕ ІЮ МО:7 і БЕО ІЮ МО:11 є кращими послідовностями нуклеїнової кислоти, що кодують варіабельні ділянки легких ланцюгів заявлених гуманізованих антитіл; ЗЕО ІЮ 65 МО:9 являє собою кращу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюіа заявленого гуманізованого антитіла. Плазміди, які містять полінуклеотиди ЗЕО ІЮ МО:7, ЗЕО ІЮ МО:9 і ЗЕО ІЮ

МО:11, депоновані в АТСС.

Химерні і/або гуманізовані антитіла, що зв'язують СО40 людини і включають у себе поліпептиди, в сутності гомологічні або такі, що мають практично ідентичні послідовності амінокислот по відношенню до послідовностей варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів, описаних відповідно до даного винаходу, також включені в об'єм винаходу. Наприклад, об'ємом даного винаходу охоплюються також химерні антитіла, що містять ділянку легкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 85905, і краще, якщо принаймні на 9095, а ще краще, якщо принаймні на 9595, і найкраще, якщо принаймні на 9895 ідентична послідовності легкого ланцюга ЗЕО І

МО:4. Точніше, об'ємом даного винаходу також охоплюються химерні антитіла, що містять варіабельну ділянку /о легкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 8595, краще, якщо принаймні на 9095, ще краще, якщо принаймні на 9595, і найкраще, якщо принаймні на 9895 є ідентичною послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:1. Крім того, в об'єм винаходу включені гуманізовані антитіла, що містять ділянку легкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 8595, краще, якщо принаймні на 9095, ще краще, якщо принаймні на 9595 і, найкраще, якщо принаймні на 9895 є ідентичною послідовності ділянки легкого ланцюга ЗЕО 75.10 МО:8 і/або ЗЕО ІЮ МО 12.

Крім того, в об'єм даного винаходу включені химерні антитіла, що містять ділянку важкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 8595, краще, якщо принаймні на 9095, ще краще, якщо принаймні на 9595, і найкраще, якщо принаймні на 9895 є ідентичною послідовності ділянки важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:3. Точніше, в об'єм даного винаходу також включені химерні антитіла, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 8595, краще, якщо принаймні на 9095, ще краще, якщо принаймні на 9590, і найкраще, якщо принаймні на 9895 є ідентичною послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга ЗЕО ІЮ

МО:2. Крім того, об'ємом даного винаходу охоплюються також гуманізовані антитіла, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка за своєю послідовністю принаймні на 8595, краще, якщо принаймні на 9095, ще краще, якщо принаймні на 9595, і найкраще, якщо принаймні на 9895 є ідентичною варіабельній ділянці важкого с ов ланцюга ЗЕО І МО:10.

Фрагменти ДНК також містять ДНК-послідовність, яка контролює експресію, функціонально пов'язану з і) послідовностями, що кодують химерне або гуманітарне антитіло, що включає природні або гетерологічні промоторні ділянки. Краще, якщо послідовності, що контролюють експресію, являли собою еукаріотичні промоторні системи у векторах, спроможних трансформувати або трансфікувати еукаріотичні клітини-хазяїни, Ге! зо проте для прокаріотичних хазяїв можуть бути використані контролюючі послідовності. Після включення вектора в підхожу клітину-хазяїн така клітина підтримується в умовах, необхідних для забезпечення високого рівня о експресії нуклеотидних послідовностей і, якщо це потрібно, у подальшому можуть здійснюватися збір і очищення Ге! варіабельної ділянки легкого ланцюга, важкого ланцюга, димеров легкогол-важкого ланцюга або інтактного антитіла, зв'язувальних фрагментів або інших форм імуноглобуліну, див. (ВеуспоК, 5., "Клітини синтезу -- імуноглобулінів", Асадетіс Ргезв, М.У. (1979))Ї. Одноланцюгові антитіла можуть бути отримані шляхом з'єднання ї- послідовностей нуклеїнової кислоти, що кодують розкриті в даному описі ділянки М; і Мн з ДНК, що кодує поліпептидний лінкер.

Для експресії антитіл, отриманих відповідно до даного винаходу можуть бути використані прокаріотичні хазяїни, наприклад, Е. соїї, й інші мікроорганізми, наприклад, дріжджі. Крім мікроорганізмів для експресії й « одержання заявлених антитіл можуть використовуватись клітинні культури тканин ссавців. Еукаріотичні клітини з с можуть виявитися кращими; сьогодні відомі численні лінії клітин-хазяїнів, спроможні секретувати інтактні імуноглобуліни, до яких належать, наприклад, СНо-клітинні лінії, різноманітні СО5-клітинні лінії, клітини ;» Неїа, мієломні клітинні лінії і гібридоми. Вектори експресії для зазначених клітин можуть включати послідовності, що контролюють експресію, наприклад промотори або енхансери, і необхідні для процесінгу інформаційні сайти, наприклад, сайти зв'язування рибосом, сайти сплайсінгу РНК, сайти поліаденілювання, -І послідовності термінації транскрипції, відомі на сьогоднішній день.

Вектори, що містять необхідні ДНК-фрагменти (наприклад, послідовності, що кодують важкі і/або легкі - ланцюги, і контролюючі експресію послідовності) можуть бути перенесені в клітини-хазяїни добре відомими

Ге) методами, що залежать від типу клітини-хазяїна. Наприклад, у випадку прокаріотичних клітин, зазвичай, б5р Використовують метод кальцій-хлоридної трансфекції у той час як у випадку еукаріотичних клітин о використовують кальцій-фосфатну преципітацію або електропорацію, див., наприклад, |Мапіаїйв, еї аї.,

Ге) "Молекулярне клонування: лабораторний посібник", Соїд Зргіпа Нигрог Ргезз (19823).

Після експресії цілі антитіла, їхні димери, окремі легкі їі важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів, заявлені відповідно до даного винаходу, можуть бути очищені за відомими стандартними методами, наприклад, ов преципітації сульфатом амонію, афінної хроматографії на колонках, гель-електрофорезу і т.д. Для фармацевтичного використання кращими є практично очищені, гомогенні на 90-9595 Ід, а ще кращими - Ід, (Ф, гомогенні на 98-9996. ка Заявлені антитіла можуть знайти застосування в терапії захворювань, опосередкованих антитілами і/або

Т-клітинами. До таких захворювань належать, наприклад, хвороба "трасплантат проти хазяїна", аутоімунні бр Захворювання, наприклад, діабет типу І, псоріаз, множинний склероз, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчий лишай і міастенія гравіс. Крім того, зазначені антитіла можуть використовуватися для попередження відторгнення трансплантату.

Отримані відповідно до винаходу антитіла і фармацевтичні композиції особливо придатні для парентерального застосування, наприклад, підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного. 65 Фармацевтичні композиції для парентерального застосування зазвичай містять розчин антитіла в підхожому і краще, якщо водяному носії. Відомі різноманітні водяні носії, які можуть бути використані в зазначених цілях,

і серед них, зокрема, вода, забуферна вода, фізіологічний розчин, гліциновий розчин і т.д. Ці розчини є стерильними і вільними від частинок. Зазначені фармацевтичні композиції можуть бути стерилізовані за допомогою відповідних добре відомих методів. Такі композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для забезпечення визначених фізіологічних умов, наприклад, сполуки для доведення рН і буферні компоненти, регулятори токсичності й інші сполуки, наприклад, ацетат натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, лактат натрію, альбумін людини і т.д.

Композиції, що містять заявлені антитіла, можуть використовуватися в профілактичних і/або терапевтичних цілях. При терапевтичному застосуванні дані композиції уводяться хворому, що вже страждає на те чи інше /о захворювання, у кількості, достатній для його лікування абр принаймні для зм'якшення симптомів захворювання і запобігання ускладнень. Кількість, що відповідає зазначеним умовам, визначається як "терапевтично ефективна доза", що залежить від важкості захворювання, загального стану імунної системи хворого і встановлюється фахівцем у даній ділянці досліджень.

У профілактичних цілях композиції, що містять заявлені антитіла, уводяться пацієнту, у котрого ще не /5 розвилося визначене захворювання, для того, щоб підсилити опірність до нього (придушити імунний відгук).

Кількість препарату, що при цьому вводиться хворому, визначається як "профілактично ефективна доза". У конкретному випадку ця кількість залежить від стану здоров'я хворого і ступеня виразності імунітету. До кращого профілактичного застосування належить запобігання відторгнення трансплантату, наприклад, пересадженої нирки.

Незважаючи на те, що у даному описі винахід детально розкритий на Прикладах найкращого його висвітлення, цілком зрозуміло, що це не виключає різноманітні модифікації і варіанти винаходу, які не виходять за межі викладеної нижче його формули.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ , сч «110» АРУФФО, Алейандро, А, о

ХОЛЛЕНБАУ, Даєн -

САЙДЕК, Ентоні, В.;

БЕРРІ, Карен, К. . І

ХЕРРІС, Лінда, Дж. /

ТОРН, Барбара, А,

БЕЙОРЕТ, Юрген; й ХЬЮОЗ, Уільям, Д. (є)

ВУ, Херрен

УОТКІНС, Джеффрі, Д. й о «1205 Антитіла проти СО40 людини Ге! «130у Послідовність ОБ2а «- «140» 09/247,352 «141» 1939-02-10 . те «150» 09/026,291 «151» 1998-02-19 «160» 14 й « «170» РацепсІп Мек. 2.07 , о, с «2102 1 и «211» 108 "» «2122 РВТ «213» Людина і миша . 6 «4002 ї Й -І АБр ті Маї Пцеш ТП Сіп 5Зек Рхо АТа Тих Цей бек Маї ТІ Рко біу 1 З 10 15 - ; :

Авр Ак Маії бек їео Зех Суз Агу АТа бек бів Зег І1е бЗех Азр Тут . 29 25 зо се)

Бей чів Тгр Тух піп біп Буз бех БЕЗ бійц'бЗепоЗко Аг цеї еп І1е , ав) 35 й 407 45 (Че) Бцуз Ту А1а бЗек Ніз бек І1є зех с1у І116 рхо вег Акад Ре Зек с1у 5о 55 єо

Зек Ссіу Зекх сіу бек Ар Рпе Твг ПцепсзЗег І1є Азп бег Уаі Сіцш Рго 65 70 15 во сіц Азр Уа1ї біу І12е Тух Тух Суз біп Ніз б1у Ніз бек Рпе Рго Тгр іме) 60 б5

85 . 50 95

ТВг Рре Сіу б1у б1у Тпг Буз Печ бі Г1е Гуз Акд ; 100 105 «2102 2 «211» 122 «212» ЗВТ «2135 Людина і миша «4005 2 710 біп 11 сіп цец маї біп бек біу Рго бій їш уз уз Рко Сіу Сіш 1 5 10 15

ТрЕ Уа1ї Акд І1е Зек Суз Буз А1а4 Зехт біу Тук Аїа РНе Тс ТБбг о ТБбЕ 20 25 о с1іу Мес біп Тгр Уаї біп біц Меб Ргро біу цуз б1у Геч Був Тгр І1е 4 5 35 0 4 с1у Тер Ізїе Азп ТБлоНівз бЗех б1іу Уаі Рго Пуз Тук Уаї біц Азр РрБе зо .55 бо цуз біу Аг Рпе Аза Рпе б5ех еп бСіц Тк бек Аза Азп ТБ Аїа Туг 65 70 15 во

Те біп І1е Бех Азп Бем Пуз Азп Сім Дер ТВх Аїа ТЕ Тух Рне Суз 85 90 95 чаї Ака Зех біу Азп С1іу Азп Тух Азр Пе Аза Тух Рне Аза Туг ТІр 100 105 110 біу біп біу ТБ це Маї ТЬх Уаії 5ех Аза с 115 120 о - к210» З «211» 4531 «2122 РІ «213» Дюдина і миша» Ге) «400» 5 Й о с1іп Т1е сіл Пец Уаї б1іп бек біу Рко Сіш Тем Буз цуз Рго біу сій 1 5 10 15 Ге»)

ТВх Уаї Ах І1їв бех Суз Пуз Аза бек Сіу Тут Аза Ре ТпПх ТБг ТЬг 20 25 зо «- в. - . ит -й о іе) 60 б5

Сіу Меє Сіп Тгр Маї Сіп бій Мес ого б1у уз б1у їм цуз Тер Т1е І 35 40 " 15

І - б1у Тхр ї1їе Ап ТП Ні Зег Сіу Ма! Рто Пуз Туг Чаї бій Ар Ра 50 55 во ши уз біу Аг Рпе А1а Рпе бег Те бСіп Тпх Зек АІТа Азп Тпх Аїа Туг 65 70 75 80

Пец біп І1їе бек Азп Мей цув Азп бі Ар ТЬБх Аза ТпІ Тух Ре Суз 85 20 95

Чаї Аку бек Сіу Азп біу Азп Тух Азр Пец Аза Туг Рпе А1а Тук Ткр 100 105 о

Сіу біп б1у ТБк Без Уаї Тв Узі 5ек А1а А1а бек Тпк Пуз б1у Рхо 115 120 125

Зег Маї Ре Рго Бїецш А1ї1а Рко Зек Зег Пуз Зек Тк бек біу С1у Тйг 130 135 140

Віа Аіа цеч біу Суз Пец Чаї пух Азр Тук Ре Рко біп Рко Уаї Тік 145 150 155 160

Уаї Берг ТЕр Азп бек С1іу А1а Цей Того бех б1іу Чаї Нів Тпт Рре рко 165 170 115 "

Віа Маї цеч біп бек бек С1іу цеч тТук бег Пец 5Зех бек Маї Уаї тах 180 185 190

Уаї Рго бЗег бек бек Пен Сіу ТЬх біп Таг Туг І1е Суз Азп Узі деп 135 299 205

Ніз Пух Рхо бек Азп ТЕ пу Ма! Азр Пуз Ду Маї біц Ркго Пуз бек 210 215 220 о

Суз Азо цуз Тпх Ніз Тіг Суз Ро Рго Суз Рхо Аїа Рго бій цец Геп ! 225 230 235 . 240 о1у біу Рго баг Уаї Рме Пец Рве Рго Рто Цуз Рко уз Аєр Тих Пец (є) 245 250 й 255 то | о

Ії Бек Аку ТБх Рхо бій Ма) Тпх Суз Маї Уаї Уа1 Азр Уаї Зек віз 260 265 270 5 бі Ар Рго бі Уа1ї Буз Рме Азп Тго Тут Маї Азр Сіу Уаі! Сі уаї 218 280 285 ьо в. - . ит -й г ШИ іе) 60 б5

Нів Авп Аза Цуз Тпх Буз Рго Ак бій бій біп Тук Ап Бек Тпх туг 290 295 ; : 300 , й -

Акд Маї Маї бек Маї Цемш Те Уаі ем Ні Сіп Азр Тер Гей Азп Сіу 305 310 315 320

Й . цуз бі Тук Пуз Суз уз Маї Зек Азп Пуз Аїа цею Ртгто Кіа Рго І18 325 330 335 бій цуз Тк І1е Зек Муз А1а Туз біу біп Рго Агд бі) Ркго Сіп Уаї 340 315 - 350

Тухк ТБЕ Пец Рго Рго бех Акд Азр біц тей ТБх Буз Азп б1іп Уа1 5Зег 355 зво 365 реч Тв оСуз пе Уаї Гуз біу Рре Тух Рго бек Азр І1є Аїа Уа1 сіц 370 3175 ЗВО:

Тер б) бек Азп б1іу Сіп Рко С1іц Азп Азп Тук уз ТВг ТВгоРго Рго за5 390 395 400

Уаї Бец А5р Зег Азр біу бег Рре Ре Бец Тук бЗег Ббуз Те Тйтх Уа1ї 405 410 415 т

Азр цуз бекс Акд Тер біл сів сіу Абп Уаї Ве Бех Суз Бек Маї Меє 420 425 430.

Ніз сій А1а Гей Ніз Ап Ніз Тух ТБх Сіп Цуз Бех цец бек Беч бек 435 440 445

Рго сіу уз 450. «210» 4 . Й о «2112 214 кг1225 рДТ , - х213» Людина і миша» «400» 4 І

Азр І1е Маї Пцеч Тіт біп бег Рго Віа ТВЕ цем Бех Уаї Тік Рго с1у (22) ї З 10 - - 15 о

Авр Ага Маї бек їец бех Суз Акд Аіа бек біп 5Єг Іїе Зек Азр Туг 20 25 30 Ге!)

Тен Ніз Тгр Туг біп Сіп Туз Сет Ніз Сі бек Рко Ак Геп Пен І11е

Зо 35 10 15 - йуз Тук Аїа бек Ніз бег І1е Зег б1у І12 Рго бех Ак Ре Зех С1у 5о 58 во

Зек б1у бег С1у Зег А5р Ріе ТЕ Пец бек І1е Азп бек Уа1 С1ц Рго й « 65 70 75 80 614 А5р Уаї б1у Іїе Туг Туг Суз бів Ніз біу Ніз бех Рпе Рго Тур с 85 за Й 95 " ТВх Рпе с1іу б1у С1іу ТпПх Пуз Пеш б1іц І1е уз Агд ТБг Уаї Аза А1а

ГІ » 100 105 110

Рко бБег Уа1ї Рпе ЇІ1е Рпе Рго Рко бет Азр б1з б1іп бе уз бег б1у 115 120 125 -І ТпІ Аїа 5ек Уаї Уаї Сув цей Пер Азп Азп Рре Тук Рго Акд бі діа 130 135 140 -й йуз Уаї біп Тер Гуз Уаії Азр Абп АтТа Пец біп Зек б1у Азп бек біп 145 150 , 155 - 160 бі Зек Уаї тах бій Сіп Азр бек ПЦуз Азр Зег ТЬг Тук бЗег їв» 5ег . ав) Й з 165 170 "175 "

Ге) Бек Тих цей Тах Тез бег о Пуз А1їа Аєр Туг біц Пуз Ні цув Чаї Тук - 180 185 190 й

Аїа Су5 біц уаї ТВЕ Ніз біп біу йец Бек бек Рко Ма) Тпх Гуз б5ег 195 200 205 оо Рпе Азп Агд С1у Січ Суз 210 - ка «210» 5 й І «211» 8614 «2122 ДИК , «2135 Людина і миша Й 60 «400» 5 Й

Засадаєсод дадассстодсе адуєдассод аддсусдссоя дстс:созаса дссададесаа бо ссттЕЩЕЕСЕ баасеєсаєсє ссаєсстаєс сссуадаєду адсссодсде суаєссесссо 120 ассссстасу десдасестс адтасаатсс дссстдасодс сосатзуєта адссадтаєс 180 жястссстдс стдсусассд Чадассоссд адсадсдсос дадсазаась сгадстасаа 240 саздудсааду сттдассдас аассдсасуа адааєсьуст сададстачу состстосус 300 тдстЕсосуа сгасодуєс адасасасос дссдасаєсд ассассдасс здстаєсадє 360 бо адсаассзаєт сасодддсса стадстсата дсссасасає ддассьсеус дікасаєває 420 ссасоддсаза содсссдесе дустдассдс ссаасдассс ссусссаєсто асуссвзасаа 480 сдасосасує сСсссатадка асдссаакад ддасссссса Седассотсаа содосодасе 540 аєссасддса аассдсссас стддсадтас ассаадсдса ссатасусса адсасосссе 600 ссаєсдасдє сзасдасоді азасодсссу сссдосаста Сдсссздсас асдассттає 660

Фдодассттсс састтодсад Сасасссасу бастадссає сдссастасс ахадсдаєас 720 дуссссддса дсасаєсаає адоддсуєосає адсоутстда сссасодода ссЕссаадіс 780

Єссассссаї сдасдєсаас дддадстеує Сссудсасса зааєсзасуд дастткссза 840 аасуссдсаа саассссдсс ссассдасос ааасасдсод садусосуса судсчсдада 900 сстатасаад сададссстс Судуссзасса дадаасссас сусскассдд сттаєсоваа 960 жтаатасдас ссастабадо дадасссаад сссддтасса годастддас стддадчааєс 1020 стсттстт9 тоддсадсадс аасаддсдсс састсссада сСссадтсоддє дсаасстода 1080 сссдадстда адаздсссдуд ачасасадсс аддчассссст дсаадостсс содадсасосс 1140 70 сесасааста ссддаасоса дсддотусаа дадасоссад дааздсостс даадссдаєс 1200 содстодасаа зсасссасіс содадсдсса азасасудсад аадассссаза дуддасодеЕст 1250 дсстЕсесЕє Єддааасстс суссвасассо дсатаєстас адасазусаа ссісааавзає 1320 саддасасад ссзсодсасиї стдсдідада ссспддазкд деіаастаєда сстадсстас 1380 сЕсдсссаст д3ддссазуд дасастддсс астотсостд садстласаєс саадддссса 1440 ссддЕссвсс ссостддсасс сессетссаад адсассостд додусесадс ддссссддус 1500 сусссудсса адудчастассс ссссдаассо дсдасозсояє ссодгасьс адчсусссво 1560 ассадсддсо сусасассст сссудстосс ссасадссст саддассста сосссссадс 1620 адсудсдудсда ссдсдсссос садсадсссуд ддсасссада сссасасссд саасдсдаає 1680 сасазудссса дсаасассаз дусодасаад ааадссддсд ададдссадс асадодадод 1740 - адддедсс:д ссддаадсса дасссадсас ссстдсстдд асдсатсссу уссаєсосадс 1800 сссадесссад дудсадсазудд садуссссдє седссісвес асссодаддс ссостдсссодс 1860 сссастсасд сссадоддада додссткстд дсесетсссс садудс:сст9ду дсадодсасад 1920

ЯЧссаддедсс сстаасссад дсссотдсаса сазадодоса дусуссдддс ссадасссдс 1980 саададссат асссоддаду ассстссссс сдасстаадс ссассосаза ддссавасскс 2040 тссастссст садстеддас асестстеке сесссадаст ссадтаассс ссааєстест 2100 сеседсадад сссаааєсст додасаааас ссасасатдє ссассосдсс садствадес 2160 адсссаддес ссдссстсса дстсазадосу ддасаддєде сстададсад сссдсаєсса 2220

Фадасаддсс ссадссодує сстдасасоє ссасстссає состтссїса дсасссдаас 2280 сссо9д99999 ассубсадуес сЕссостосс ссусаааасс саадсасасс стсаєсдаєсть 2340 сссудасссс сдадуєсаса сусогодтоо содасусдад ссасогадас сстдадуєса 2400 адсссаасто дсасуєодас дасусддадо сосасгатдє саадасгазд ссдсодаддада 2460 адсадсасаа садсасдстас сосусоддєса дсуссстсас суссстусас садчассодде 2520 сдаасодсаа ддадсасаад содсааддсст ссаасааадс сстсссадсс сесаєсдада 2580 сеІ "з ааассаєстс сааадссааа одсоддассс дсодддсосо адддссасає ддасадасос 2640 сддстсадсс сассстстдс ссобададсо ассустустас саасстосос ссстасадад 2700. Ге) садссессзавд, Зассасазує дсасассстс сссссасссс дддассадсе дассаадаас 2760 Й садуссадсс сдасстдсст осдссазаддс ссстаєссса дсдасассос сосодадесоя 2820 дачадчсзаса дасауссода саасаассас аадассасдс сесссстдст додассесдає 2880 дассссстІст тссестасад саадсосасс деддасаада дсздстлоса дсадоддаас 2940 десстстсає дстссдсдат ссасдадуєт стдсасаасе ассасасуса даададсстс 3000 скесстдсстс содуєаазасо адсосузсод сеодсаадес сссдстсссс дддссстсдє 3060 (є) ддссодсасса ддаєдсстод сасусасссе ссдтасастас стссссудсд сссадсасду 3120 зо заасааздса сссадсдстд ссссдддссс седсдадасс дсдаєсоєтс сссссасодуу 3180 «сздоассзад сссдадосст сзодсддсасо адодадосад адсодосссс ассдесссса 3240 (ав) сассудссса достдстодсад дсососстод дссссссадо дсододсеса дссадасост 3300 дсесссудса додсодасЯа ССЕдссадсд сддсестсес тссадсадса сесассстод 3360 (є) чссддассас додаадсссс аддадссссо у9удасадас асасадсссс Едсстстоата 3420; ддачасьдсс седтсссогу адсдссосод сссосссдас соссасудссс асесудудус 3480 че асдсстадес сасдсдсста доудасадусс сбссстсасс сасссасссс сасодсаста 3540 асссстддсе дссстдссса оссесдсасе сусасодуда сасаассоас Сссододаса 3600 ї-

Зо кдсастстсд ддссстдсод адодассодї: дсадаєуссс асасасасас Есадсссада 3660 сссусссаас ааассссоса седаддєсод ссодссасас ддссассаса сасасасотя 3720 сасдссосас асасодадсс ссасссодус даастдсаса дсасссадас садаздсаачу 3180 ссстсосаса сусдаасаст ссісодасас аддсссссас дадссссасу судсасстса 3840 адусссасда дссістсуудс адсесстсса сагдсєдасс сдссосадаса засссадссс 3900

Есстсссаса гаадасосссс сосадссусс асасасасас асоддаєсас асассасоєс 3960 « асдсссотдЯ сестддесса сстсссадед ссосссеєсс ссдсадоасо даєсадсстс 1020 здаседедсст Єсвадієдсс адссаєстдс осстдсссс ссссссувос сессстсдас 1080 шщ сссоддаадує дссасьссса сідсссевЕс сбаасаааає даддаааєсу саєсодсаєто 4140 с жссдадсада соссаєсста стстододод с9999с9999 садоасадса адазададоа 4200 седодаадас аасадсадос абадссдосда сСасодсдаддс сстасодссс седасосода 1260 ч задаассаудс содудссста аддддасессс ссасусуссс сосадсодсу саттаадсос 1320 п т дасососоєо дсодссасос дсадсусуас сосстасастї дссзососсс кадсосссяс 4380 жсстстсусс Ессовссств сссЕссесос сасдсксосс доддсстссса заазадудаа 4440 ааааадсаєсд сассссаасея адссадсаас сасауессся сссстаассс сосссаєссс 4500 дссоссаасс ссдсссадес ссосссассс сссоссссає доссуастяа ССсСЕсеЕссат 4560 стасдсадад дссдаддсся ссосоддссос єдадссаєссс садзадсадчі дадчаддссо 41620 -І КеЕссададує стадусьсся дсаагаадст содасадссс аддоссдсуа СЕссодсусса 4680 аастсдасуд саассссадс дідаздосстя дсадзасссс асссссодссд ссассасодт 4740

Есдассаєсд аастдсаєсу ссуссусоєс ссазаасаєд додассддса адаасудачда 1800 -- сстассседд сссссудстса ддзасдадет сзадсасстс сзаздазеда ссасаасстс 41860 сстсадсдува дусааасача асссдусдає сасодусадо агаасстуде Естссаєтсс 4920

І«е) суадаадаас сдассосстаа асдасадаає саасасадес сссаусадад аасссагаса 1980 ассассасуа ддадстсаст сссссдссаа аадсесддає дасоссстаа дасстаєсуа 5040 асаассддаа ссддсааудста аадсадасасє достсодаса дссодадооса сстстуєста 5100 (ав) ссассаздсес асуааєсаас саддссасстІ сСадасестсос дсуасазаада гсасдсаада 5160 асттдааадс дасасатсст ссссадааас сдасссдд9у агасасааас стсссссада 5220 (Че) асасссадде дссстссстуд аадсоссадода доаазаздде ассаадтата адсстдаадт 5280 стасуадаад азадассаас задаздасєос сессаадтсс Есгсостсссс Есссазадст 5310 акдсаєстсе асаадассас додасссссу стддссссад асстсссбус дааддаасст 5400 сассссс9усу усусдасаста ассддасааа сезсссасад адасссаазу ссссзздоаса 5460 аасасаазає ссссаадсдт асаасусудсу ааассассда тсстаастує ссососаєтт 5520 хадасстссаа сстасодаас сдасдгаасєод дадсадеддс дозасосстс саасдадага 5580 аасссостс: дсссадазоа аатоссаєст ассодасуасу аддссассудс сдассстсаа 5640 сассстассс ссссааааза даададаазд діздаадасс ссагодастт сссетсадаа 5700 (Ф) ссоссаадсс Сеесдадсіса содссдсдето адсааєздаа ссстсоству сетсдстатт 5760 тасассасаа ауодзаааздс сдсзсстдста сзсаздазаа стасодозаза асассстоса 5820 ке асстстасаа дсадудсасаа садстатаас сасаасасас соссстсссс рассссасас 5880 ачусасадчач сусссуссат "каасаассас чстсаазаас сусусасссс тадссесстта 5940 асссдсааауд дддстаастаз ддазсасссд асдсасаусуд сссодассад адассасааєс 5000 садссасасс асастсдтад аддстттаст соссєсаааа азссссссас асссссссост 6060 60 даасстдааа сасаазасєсоа зсосзатсос соссодтсаас ссусттастсо садстсасаа 6120 бо тодстасааа газадсваса дсассасаза Ссссасазає заадсаєттс Сстсаседса 6180 кЕсСсадесує досссдесса аасссатсава содсасстсат сасосседда ссудссодає 6240 дарсстссад сосоуддаєс ссасдссода десстссусс сассесаасс сосетаєсяс 6300 адсстасаає доссасааає азадсаасад сассасазає Сссасавата задсассттє 6360 тесастусає сссадесдсу усссдсссва асесассаає дсаєссстаєс асуєсстдсає 6420 ассдссдасс сстадссада дсссдосута ассасодсса садседЕстс седсдєдааа 6480 жккоссаєссу стсасааєтс сасасзасає асдадссуда аусагааадс дсазадсстд 6540

ФЧдкодсстаа гдадсдадсе аасссасасс зассосоєтд сусісассдс ссустсссса 6600

Фессдддааас ссдєсоєдсс адссусаєса абдазеЕсудс саасусусод очадчадасод 6660

ЕЕсосоатаєт додсусьсте ссусесссьс дсесассоас ссдссдсосе содесдєссЯя 6720 дссдсудсоа дсоддсаєсад. сссасссааа досодсааса содесаєсса садазссаду 6780

Фддасаасоса дозаадааса гдедадсаза аддссадсаа ааддссадда ассусааааа 6840 даассосоїсо стдодсоусссс сссасадосс ссдссесссі дасдадсаєс асазазаєсу 6900 асосссааус сададдсдас дазасссдас аддастасаз адаєгассаду сатстссссс 6960

Едсаачстсс стсдсдсудсе сосседессс дассссдссу сесассоудає асседсссяс 7020 сЕСтсессст ссоодагосу содсостЕсС Єсаасдсеса сосідсадоає Зссесадеєєс 7080 дасосадсосс дієсдстсса адссодусту с9содсасдаа ссссссустс адсссдассу 7140 стссусстта сссддсаасо ассдссстда дессзасссд дсаадасасу астсатсусс 7200 астоссадса дссасстдуса асадчаєсад сададсоадо сасдсадосо усдстасада 7260

Фдсссссогад содсудсста ассасуусса сассачааду асадсаєссо усаєсссдсус 7320

Естдссуаад ссадссассс ссоддазагад адссодсадс ссссдаєссу дсааасазас 7380 сассоастодс адсоусдоаве СЕЕЕсУвссд саадсадсад астасосуса Чааазааадчу 7440 ассесзадаа дасссстеда кебвсвстас чодусссдас дсссадсдда асдаваасьс 7500 асдссзадудч асессудеса сдадаєсаєс зазазоддаєс сссасстада сссттсезааа 7560

Еказазаєда адЕтссзаас сазассстазад сасасаєдзу єзааосьдду ссдасадста 7620 ссаасодстса зссадідаду сасссаєстс адсдатсесдє ссаєсссуєт сасссаєзуає 76580

Коссесдасто сссуссосде адаєзастас дасасодддад ддеетассак седдсесссад 7740

Едстосааєд асассудсуауд асссасдстс ассддстсса дасстассад саагааасса 7800 дссадссода аддудссдадс дсадуаадеу4д ссссусаасті тсаєссдссс ссагссадтс 7860 сассаассдс сдссодддаад ссададсзад садсссосса десаагадтє сСососаасоє 1920

Едссоссаєє дссасаддса ссосодсдсс асдсесоссд сссдутаєду сттсаєксад 7980 сессодсссс сазасуаєсза досдадссас асуаєссссс асоссосуса ааазадсЯяді 8040 кадсесстес добсстссда ссустуєсад аадсаадєсо дссдсадедс сассастсатє 8100

Чуссасодса дсаседсаєса асссесстас состсасдсса сссусаздає дсссстссдє 8160 часезудсдад сасссаасса адссастссд асзасадсдє асодсуддседас сдадесодстьс 8220 ссдсосодсо сСсзасасоядд асззсассодс дссасатадс адаастсстаа задсссссає 8280 сасстддаааа состстссод дасодаазасе стсагудаєс ккассуссос сдадаєссазд 8340 се ттсоасдстаа сссасссугу сасссзасту ассттсадса ссссттассє ссассадсдт 8200 ссссудусда дсааааасад дазддсаааа соссусааза аадоддаасза доуссасасу 8460 г)

Чазасдс:сда асасссзтас сстессстсЕ Єсаатастсає сдазудсаєтт ассасодеста 8520 стдссссасу адсодасаса сасссдаасу сасстадазаа азсазасааа саддодієссс 8580 дсодсасастс ссссуаааац суссасссуа сятбс т 8614 «2105 6 «211з 8858 «212» ДНК б» «213» Людина і миша " «400» 6 й о дасодассуя4 задасстдсу адсесудуєд асседаддед сдссодсьсс дзатадесад 60 здсаассьсе сеевстсааст сваєсетате Есасисесда загсодачсес удсоссдаєс 120 (о) ссссдаєссс сстасууссоа стсссадсас аасссуссст дабдссосає адссаадсса 180 дсасссустс ссідсесуєу суссодадоє состдадсад сдсусдадса авасстаадс 240 ч- тасазасааду саадусстда ссдасаасід сасуаадаає стдсстадод ссадусоєте 300 сосдстдссс сосдасдтас додссадата сасусуссда сассдаєсає Едассадсса 360 ї-

Зо стаасаусаа ссаассасод дуссассадо сСсакадссса касасодаде сссосаєтас 420 асаасссасу дсазасддсс сосссоустод ассдсссаас дасссссдсс сасесдасоєс 480 ааєаасодасд сакодссссса садтаасодссе аагадуддаст Есссаєсдас дссваєудат 540 ддассасста содевазастд сссасесддс астасаєсаа дедсаєсата гдссаздтас 600 дсесссстаєсї дасдссазсо асодсавасд дсссдсстду саєсаєдесс адсасаєсдас 660 стсасоддас ссссстасес досадтасає ссасусаєса дссассусса сіассаєдоє 720 « часосодссс судсадцтаса ссаасодосо содасадсод сссдасісас доддассссс 1750 аадсссссас сссаєссасо ссаасдодчад Сесоассссод сассавааєс аасоддастї 840 шщ

Кссаааасоє сусаасааст ссдссссаїт дасасазаєа дасодсадас дссстасудсд 900 с сдадосстає абаадсадад соссстоудсс агстададаз сссастдстс ассодсстає 960 соазаєсаас асдастсасо асасддадас ссаадсссауд сассасддаа дссссадстс 1020 п аадстессстї сстсстдсса сестодсосс садасассас содадасаєт дссссдастс 1080 и - ассссссадс сассстуєст дідассссад дадасауадс стсбсссссс сосадудсса 1140 дссададтає саудсдастас стасастасдс ассазсавааа ассасаєдад сстссавдде 1200

ЕЕсссассаа асабдстссо саєтссаєся стдддаєссс сессзддєвсс здасддсадетд 1260 дассадддєс ачдаєссссаст сссадсаєса асадсодсода ассєчаадчає д«ссоддавессь 1320 ассассусєса асаєддссас адссссссо; дддасуєссод содадусасс аадссоцага 1380 -І тсазасутаа дсстсдадсс сстадасаас соудссааєсо дісаассдає содааєсста 1440 аасссстзадоа дсодссодуасу асдсддссає сссссодсста аадсассдад ссстассосза 1500 доссадаазаа дсасаосазад сссссадаас додстодсазад адссссааса азасааєсста 1560 тд даассттаст азодаасадо додааастад даадазасос аааасаєсаа дастстааає 1620 асдссссову дессссісус сасаастасєс сдддасаадс асдссуєттє содесвуєсс 1680

І«е) стаасасдсс стстасссуса азасаасасас ссазудуєза аасестуєса сстагасасс 1740 ассстдсссд ссесттІсст саддаастст достосасса сстдссссса сссссссдсс 1800 асстдчассозу садуссдааас стдсаасстс сессуссуєу госссуссда агаасссста 1860 (ав) ксссададад дссаазусас адсодаасос ддатзасусс сессзассод деіаасстессса 1920

ЗЧчасадсосс асадаасзод асздсзадуа садсасссас здссосздса дсассстозс 19850 (Че) детсадсааа дсадастасу адазасасаа адсстасосе сосдаауєса сссассадод 2040 сстдадессЯ сссоссасаа ададссстсза садоддачад соссададод асагуєдсесс 2100 ссасстдссс сссадсссса дссідасссс сесссассст ссодссессу асссьсьстс 2160 сасадодудас сстасссстат сусодсссос садсстсаєст стсассссас ссесстсстс 2220 ссссстддсе стаассазсос саасоссоса сузасаасуаа сазаасазадс даассьстуєс 2280 асстудсддсс сстсссттсс стсаєттаас аастастаєс гостдссста сбаассасьс 2340 аасттсЕстс агаадсдасс азакаєдтад ссаєсстаауд дсасдстаасс асісасааза 2400 ассаєсстсс астстасттт ассстассат сссстдсазуд асадессосс сесазассса 2460 (Ф) саадссстес дсссісасад сссссссодс сасодтадуа дадасссуст сссесуєеес 2520 соссстсстса дсагассстс атадссст:ї Стзадодусда садоєсссас адссасасатє 2580 ке сстседастс засстссстса дзаєсзасса задсазасст тссаааадза дазасстдст 2640 асагададаа ссасссасед саасаєсаса сазаасааса асасаасаза адсаасєстаза 2700 сазасаааса атадодазає усссаздссс ассасуддсас стадасссаз содаасаєсса 2760 во тоссстастс асасссссаа асаддсассо аддсасссст дестдссазу доссдсаєсу 2820 бо адтастттсс асаасстзає Етаасессаса статастуєу адастааааа сасссастаа 2980 заєдесссоаа аддттстата аадсеуадад асааасатає Естатаастс адсаасссса 2940 стестасатд ассдадсусєс сссасссассаааазастає дсаадаасоє ссазадсаде 3000 кекаєттаса азадссаада атесддавата дсссдагесі ссаасватад аасодадетає 3060 кааасестод такдсестаса састадааса сссазасоаад адаассааса адсстасааст 3120 5 . аєасстассс асасадаєда ассосатааа аасаасуєса сагзададаа асссаасдса 3180 ааадаєзсдс ссесдсасуєє Сссаєссаса газаусссаа аассадуєаа ааасазадет 3240 адааасстуд асудаааєта сесстадссод з999со99с9 адссадсосс содоадаада 3300 саадаааоуд сстссддддє сссудсааєд ссстоєісст сусосодудс сососадеєса 3360

Есасссстдс ассуєсєссдє асасасаєта соссссзааа сзасстссаса сазадаасає 12420 сесабассса досаасадасє адаададдаа саадсаасад дссаадасса асосадссад 3480 хаздссудддо сссоддаєса аасадстсасс сдсстазесс сдсссисето адссстваає 3540 чадссссссі сссадодсос ааддсдсіса асаааасаас аддссстдста ссстссссоде 3600 70 асседсодссс сасссодсса дссаддадса сасасасаса даазстааас дазасаздасс 3660 тЕсадсаадс сдасададда садаассазс сттдсссада сассоддазас ссасдсаєда 3720 асастсасає діссоддзач даддаадодс асасдсааас даддассстс сстсасссста 3780 кддассассо сддссссдсс сесстСадст астсасссас ссаасасасєс стїтстаадта 3840 ссесестссд сстасастсї саадодоєсс аддадтаасо аасасадсає сссстсссті 3900 ааассасссг сзаєссоттс дссстдстїх дсбесестсе ссадссадса седодаааає 3960

ЧЧдудагаадас зудссаєудад азассасаста аддааосасс ссдссстєсо дсссстсдад 4020 аасдссозасо адусаєсааає сссссазаст стддаддсстс: дадсадодус дадасссадс 4080 аасаєссос: ссаасдасас даасстустс асссаєсссо дудодссааа ссдаасазаєс 4140 ааадусаздос асаасссадс сасдаасіст сдсддссдсо сдссаусссс асдсустода 4200

Ессаассосд дзаддуссст астсстатадс дссасстаза суссададссо содстуаєсау 4260 сстсдассос оссстстадс суссадссає седсвотьсо сессессссс дбдсссссст 4320 сдассстуда аддсдссаст сосассдссо сстоссааса азасдадааа ассдсассос 4380 астдссстзад саддсодссає сссассссод ддодсод99с ддодсадоас адсзадодад 4440 здодатосуда асасзасаус адосасоссо додасососс додсссстаста сстсстсаду 4500 содазаскас садсссудос сссасдодує асссссасос дссстдтадс здсдсаєсаа 4560

Чсудсссс399 сосодсоя:: асусасадсо сдассостас асссуссадс оссссаядсос 1620 ссдстсстх суссттсттс ссосссттвс ссуссасуєт суссудуєст сссааазазу 4680 ззааагагад сасусасстс аассаоссза саассасват сссдсссста ассссуссса 4740

Есссосссст застссоссо адсттсосуссс аттстссусо ссаєдостда ссаасттстх 4800

Есаттсастос ауаддсссад сссосстсоу ссоссдзадесо астссадаасо стадсдадуау 4860

Фессттїт99 аодсстадуєс сттсссааза адсстддаса дстсадоадст зсдатттссе 1920 дссааасоту асодсагтсо садсстозад дссадезудса ссттассссс зсодссаєса 4980 садстссасс аседаастос асссоссуссо сдссссаааа сагододаєт здсаадаасо 5040 се " Чадасстасс ссддсстссд сссаддаасо адстсазадса сстссааада асдассасаа 5100 сессттсадо содаадудсгаа садаасстод ссасстасоод саддаааасе сддссстсса 5160 Ге) сесстсгдаг даахсдасст стаааддаса даассаатат адссс:садс ададаастса 5220 аадаассазсс асчаддадсс састттсссд ссаааадссї ддассасодсс ссаадасста 5280 ссдаасаасс ддаастооса адсаазасад асасодссся дасадтсода ддсадстсто 5340 стсассзода асссасдаас сазассадусс ассстадаст стссссдаса гддассасос 5400 адчаасттуа задсдасасс тттс:сссад заастоасттї доддааасас заасстстсс 5460 садаасассс аддсдссстс ссодадусєсс аддаддааза зддсассава хтагаасссся 5520 (є) аадсссасда дазадааадас саасаддзад асуссстсвза дссссссдсс ссссосссаа 5580 зо адссасосає с-ссасаада ссассоддаст сссоссддсс ссадасєсссо ссодсодаадда 5640 ассттастсс сосдудєдсуа сатааєсуда сааасстаєст асададассс ааадссссаг 5700 (ав)

Фусааасаса азасстссаа дсдсасаасо садссаааста сесастстаа седсесуєує 5760 Ге»! актстадаєт ссаасстасд даассдасоа асоддадсає содсудааєсо сссстаасда 3820 ддазаассту ссссдсссад аадазасосс атстадсдас сасоадуста сбуссдастс 5880

Й тсаасаєсст аскссєссаа азаадаадад аааддсадаа дассссааод ассстсстьтс 5940 ч- здаассусса адссссеєда десаєдстут дсвсздасазе асзастьсеєд сссдссстдс 6000

ЗБ сасссасасс асаааддааа аадссдсасс устасасаву аазассаєоу аааазасаєтс 6060 у тчдсаасстст асаадсадоєс асазасадсса саассаєаас агастостст їссссасссс 6120 асасадосає ададсодтстд стассаатаа ссасосссаа адассосота сесстадссс 6180 сЕсаасєсує азадодуєса асазоддазса сттдаєдтає адсоссстда стададаєса 6240

Саассаусса сассасассс дсасасодссс басссдсссї азаваассьс ссасассссс 6300 ссседаассо дазасасааа аєдааєдсаа ссосідетоє саассстостсе ассосадстє 6360 « асаасадстса сааасааадс агзсадсаєса сазассссас агатавадса КЕтсстссас 6120 коасаєсстад кеосадтеко жссаадлстса ссааїдтаєс стаєсаєдсс годаєсоддсе 6180 ддаєдасссяї ссадсасосу дассссатдс хддасссстє сдсссасссс аассєуттста 6540 - седсадссса саасодссас ааасавадса асадсаєсас ааасстсаса засзаадсає 6600 с сесссссаст осаттстаст гдсддттЕді ссааасссат сгасдтаєст тассасуєсть 66560 дсасассстс дасстставоас Сададсссод сотагссасо дссасасссуд СсІсссосоє 6720 в! - даааєтосста сссдстсаса ассссасаса асатассадс судаподсана аздстдтзаза 6780 и ссе9д99сус ссааєдаусо адссаастса саєтгастос дсососостса сеусссоств 6840 кссадссодо азассессся суссадссудс ассааєдаас содссаасдс дсддддадад 6300 зсудссстосо састодосус сссессостї ссссосссас сдасссостд суссссдєсо 6360 кЕсСодстосо дсоаоссодса Есадстсаст сагаасцсоди засзсодіта сссасадазст 7020 саддддаєаза сдсаддааацд аасаєуєдад саааадуєса дсззааддсс асудаассоста 7080 -| азаздоассяс дссдссодсу. Ес ссаса дсіссуссс ссссдасуад сассасаада 7140 ассдасдссс задссачаду Садсуаазсс содасаддасі атазадатас саддсуїстс 7200 Й ря ч сссстддаад ссоссстсусд сустстссто ссссдассст дссустсаєс ддасасстої 7260 ссудсстссст сесстсудда адсоссодсос стсстсаасу стсасостдє адусаєстса 7320 дессдосота ддссосесус Ессзачстсо дссодсдгдса сдаасссссс дессадсссу 7380 (се) ассдстдсус сссасссодс аасксаєсоєс ссдадсссга сссудсааца сасдасстає 7440 соссастодс аасадссасс ддсаасадда ссадсададс дасссасоса досоддсусста 7500 ав) садачссст: сагудсддсдуд сссаассасо дссасассзд азадасадста сссоддсассе 7560 састстост сазоссадтсо асстссадаа азасачесуд сгудсссстда сссоддсааве 76520 заассассудс сдссадссуст одсбссстІс сЕстсазаса дсадаскасу сдсадазаза 7580 і3е) загддасстса гдаадаєсст Етдассттстї: ссасуддуєс сдасодсссау судгасдааа 7740 асссасуста асддаєссту дссасдадас сассазааау даєстссасс садасссттт 7800 тааастаааз асоазадстсс аазссаатсо азадстасаса сСсадсааасе содссссаса 7860 ассассазсо сстаассадст дадусасста сстсадсдає стусстаєсс состсаєсса 7920, тадттасстд асесссссугс дсдтадаєва стасдатасу асададссса ссаєссодсе 7980 ссзосостус засдатасся сддадасссас дстсассодс сстадастта ссадсаасаа 8040 ассадссадс судаадодсс дадсодсадаа дсодссссус аастстаєсс дсстссаєсс 8100

ГФ) адсстасєтаа ссдссдссод даадстадад сазадсадстс дссаудстаас здстстосодса 8160 "асдстсостдс сассдссаса досассосод сдссасусто десстстддє асодсстсає 8220 ко тсадссссод стсссзасуа ссаадусогу сстасасдасс ссссаєдстд сасазаазазд 8280 сздстадстс стсссодтсст седассутто Есадаадтаз дстздссоса дсостассас 8340 тсасддстас досадсастд сасааттстс стассуєсає дссасссуса адасуєссост 8400 стосдассуу ссадсассса ассаадссат сстдадаата дсстасдсуд соассдадес 84650 во чстсссдссс дососсаата соддасааса ссдсдссаса садсадааст Бсзааадсуєс 8520 тсассастод азаасусест ссоддусєсаа аассстсаад дасссттасся ссдстдадає 8580 бо ссадсссдаєсє дсаасссаст сосдсассса аседасесьс адсаєсьссє асессссасса 8640

Чсусстссод дсуадсазаа асадуаадус азаасуссос аааазадчуда асаасддсоа 8700 сасоддазату їтсуаакастс асасессттсс ЕСсстсазта стзссуааде асстатсадуд 8760 детатєдессе саєдадсуда тасасасесд ааєдіаєста дзадаатазга сзаасадчуду 8820 жЕссусусас асеесссссуа азадедссас ссдасуєс т 88а5а 2 «2102 7 Й «211» 321 «212» ДНК - «213» Людина і миша «400» 7 дЧазассдсд: сдасасаздес сссзуссасс ссусссїсЯоє сессауудоа аададссасе 60 сестсседса додссадсса здадстаєсадс даєсастсас ассодсасса асадааасся 120 чассадустс ссаддесссс сассстассас дсассссасе ссаєссстодуд сассссадсс 180 адчсссадтд дсадсодасс содуасадасєс сссассссса ссассадсад сссададестї 240 чаздасссі5 садсстаєста стдїсаусає додссастстї Есссесодас сессодадад 300 дадассзачу содазаєстаз а 321 «210» 8 «211» 101 «212» РТ - «2135 Людинаі миша -" «400» 8 Й Й сіш Т1е Ма) цеш Тахо біп бек Рхо Аза Тпг Гем бек Пед бек Рхо біу 1 5 10 15 бій АкФ А1їа Тато Гей Зех Суз Аку Аїа Бег бій бек І16 бек Авр Тух зо 20

Бец Ніз Тгр Тух біп біп буз Рго С1у Ссіп Аза Рго Асд еп Тем І1е 35 40 45

Тут Тут А1їа Зек Ніз бешх І1е бег б1іу І1е Рго Аїа дк Рпе бек Сіу 50 85 во

Зег біу Зек біу Твх Азр РВе Тіх їси Таг І16 бег Бег Бей б) Рго с 25 65 то 15, . во о

Сбіш Азр ?ве А1їа Маї Тух Туг Суз біп Ніз б1у Ніз 5ег Рпе Рго Тгр 85 зо й 95

ТЕ Рце біу біу біу Тип Буз Маї біш 112 уз 100 105 б «210» 9 - «211» 366 . «212» ДНК (о) «213» Людина і миша , із «4902579 - 0. садусудсадс содсдсзаєс содосстдад ссозадаадс ссдддусстс адсдаадуєє 60 ссстдсааду сеЕсссоддаса сдсссрсасс ассассдуса сдсачсяда: дсчасадусєс 120 - сстддасаад доасседадсд дасоддасод ассаасассс асадсодуді сссазадкає 180 дссуаудасеь єсаааддасу дсЕЕдЕстсс сссседдаса ссеседесад сасдусаєає 240 седсадаєса дсадсссаза ддсідаддас ассдссуєує астассоєус дадаєссоде 300 аасоудаасс асуасссдос асасессаад сассододсс адодаассся доссассяєс 360 жсскса 366 « «2105 10 шщ «211» 122 с «212» РВІ «213» Дюдина і миша" ч п Р. «4002 10 біп Уаї Ссіп Пцец Уа! біп бек СсСіу бек біц Пец пу уз Рго с1у Аза й 1 5 -10 15

Зек Маї Буз Уаі бек Суз Тув А1їа Зех біу Тук Аза Рпе Тік ТЬг Твг -І 20 25 зо 3 сіу Мек біп Тгр Маї Аху біп Аїа Рго біу Сіп сіу цец бій Тгр Меє . 35 40 45 (се) б1іу Тгр І1е Азп Тпг Ні бек б1іу Уаї Рео Буз Тук Уа! бійш Азр Ре 60 ге ШІ цуз біу Акд Ріе Уаї РБе бек Цецш Азор ТВ Зекг Ма! Зек Тіг Аза Туг « е) 65 Й 7о 75 во

Пцев біп І1е Бех бек Пеп Цуз Аза бій Азр ТВтх Аза Уаї Туг Тухг Суз 85 90 95

Аїа Агу бек С1у Авп б1іу Азп Тух Азр Тем Аїа Тук Рне Пуз Тух ТЕр 55 мк 100 105 110

ГФ) сіу біп біу ТВг цеп Уа! ТВг Уа! бек 5ег . 115 120 й «2150» 11 «211» 321 60 «212» ДНК. : «213» Людина і миша бо

«4005» 11 й дазаскоєодє сдасасадсс сссадссасс ссуссттсус ссссадддда аададссаєс 60 стстсстдса дддссадсса дадсаєсадс дассасссас ассдосасса асадавасєст 120 адссадастс ссаддссссє сасстассас дсастоссасі ссасссосьдд сабсссадес 180 адосєсаєсу дсадсддаєс соддасадас сссассстса ссастадсад сссададссс 240 дчаздассссд садсссастста ссодссадсає додссасссосї ассстсддас ссссудуадда 300

Чодассазаду сддаазстаа а 321 «2105 12 Й «211» 107 «2122 ВВ «213» Людина і миша, «400» 12 11 І1е Уаі еп Тпх Сіп Бех Рго Аїа ТПт Пе бег цец бех Рго с1у 1 а 10 15

Січ Агуд А1їа ТБг Без бек Суз Агу Аза бек сіл бек І1е бек Авр Тут 20 25 зо

Геп Ніз Тер Тухк біл біп Гуз Рго Сіу біп Аза Рсо Акд Пец Ген 116 35 «4 45

ТУг Туг Аїа Бех Ніз Зек І1е Бех СІу І1е Рго Діа Акд РВе зек сіу / 50 55 60

Зек біу бет б1іу Так Азр Рпе ТВг Пец ТЛх І1е Бег 5Зек цеш бій Рг 65 70 15 80 сій Азр Ре Аза Уаї Туг Тух Суз біп Ніз біу Ніз бек Тук Рго Тгр 85 90 95

Тр Бне біу б1у біу Тпг уз Маі бі І12е Буз 100 105 «210» 13 - . . і «211» 366 «212» ДНК й (о) «213» Людина і миша «4005 1:13 І Й садасссад: Суусудсаасс содасстдад сідаздаадс сеоддададас адссаддаєс 60 ксссдсзаду сссстдодса сдсссссаса астассоддаа сасачсддус дсаздадаєд 120 Ге»! ссачдааачу усссдазосод дасссодссод асааасассс астстддаде дссаааатає 180

Чсадаадаст ссаадодасу дсссосстьс сссстдуаза сстстдссая сассудсатає 240 ссасадасаа дсгасстсаа азассоадудас асодстасос асссссусує дадчасссоду. 300 («в засдосаасе асдасстдос стасссьдст сассододсс аадддасаст додссассуєс 360 іа кїсбудса . 366 вх : «- «210» 14 «211», 324 . Г «212» ДНК й й «213» Людина і миша: «100» 14

Засаскуєєс сдасссадес Ессадссасс седсссоєда стссадодазда сададссеіст 60 сесЕссєдса дудссадсса Чадсаєстаде чассасссас ассддсасса асазаааєсса 120 « саєдацестс саадуссьсст сатсааасає дссссссаєс ссастссссодд дассссстсе 180 адсстсадтд дсачеоддаєсс адодстсасає сеісассстьса чсассзасач сдсодаасст 240 - заадаєсчєсд даассваєса ссдєссаасає чассасадсе Есссусядас дсссудсода 300 с Часассаздс сддазаєсва асчі 324 . з» 120 0 2 мкг/мл (820 мке/мл п 100 у

ИЙ Й тв Г Й | Й Й - 11 г - Е й й й 12 й т - ПИШИ ї й ший (Че) 1.66 2.36 2174 2.220. (а428-5 Негатив, АТ

Фіг. 1

Фаза Ї Фаза П Фаза ШІ

БіроптАвавв рт МІ тот

Головного оо (Ф; о ін'єкція мат. о 8 15222936 43 59 1 в 15 22 1 а 15 22. ко В во ДНО о о зе Й во зе фгме 12 . їгме2"

Й Фіг 2 Й 60 й бо

160600 к- "Фаза 1 Фаза П Фаза Ш во -е-тАЬчов 1000 ра. Ех а г -тАБіЯ їмо У нич / / тА 236 ї те --тАЬ2.220 ' о, 20 40 во" а 20 о 20 Фіг. ЗА

Фазаї День досліду 5. пе 100000 їза Фаза Й фаза. й --тАБ 106 10 1000 ее ш-й -- МАВ т- з0о -тАв 236 р ---етАь 2220 а шт я пани 1 а 20 40 во о 20 г 20 Фе. ЗВ . Й День досліду

А) Варіабельна ділянка легкого ланцюга (БЕО І МО:1).

МЕАРАОБІРІЛЛЛМЬРОТТОрІУТТОВРАТЬВУТРОВВУВІ БСНАБОВІБОУСНИХООКУ

КРЕРВБЬІКУАВНЕІЗЧІРБАРЗаБаБО5ОЕТІБІМБВУВРЕОУСІЧУСОНОНВЕРИТЕвО аткивІКА й

В) Варіабальна ділянка важкого ланцюга (ВЕО Ір МО:2).

МОРИТЧВІЦПЕЦУАААТСАНЕОТОПУОБСРЕІККРОЕТУВІБСКАЗСХАРТТТОМОМУЕМР

ОКСТКМІОМІНТНВОУРКУУЕОЕКОВРАРВЬЕТЗАМТАУБОІЗМЬКМЕрТАТУКСУВЗаМ

СНІРБАХЕАУНООСТІУТУВА шо

Фіг. 4 ? . 16 І см щі о 52 -ов2о

З

ІЗ 4

Е дв й --- пого 5 . с од о й о 10 20 зо 40 БО концентрація антитіл, гін о

Фіг БА (22) 1005т Й «

Е ВОБ

5 во --52220 че

Е ж --- Спі220 5 гов як пО2ОЗ

В о ї -2095 01004000л1000100 1000 10000 « «Концентрація внтитілинг/мл 40: зов - с- вот. п 7000 - во00 - Контроль (РВ8) щі БОсО --10 мг/кг, См220

Е обо -- 40 (мх/кт. Спі220 то зоб --бомг/кг Свого 2000 - й 1000 -І о як 1 75 29 48 57 71 85 158 170

День досліду Фіг. вА шо водо 7000 -- Контроль (РВЗ) во0о. ---01 мг/кг" СМ220 (Се) БЮ

Е 4000 Уо-- 1 мг/кг: ОВІ220 ав | 50 к оо. 2000. 1000 3е) о - яд 1 в 15 22 28 и День досліду Фіг. 68 25БОФЮТ -- ко «РББ) троль -- 10 о можг Спі220 (Ф) Е 15000. -к- 40 мі/кс; СВО20 е мойкс, сна ка 10000 -е-1оомкг, Орі22о 5О0О 60 о і 1 15 29 43 Б? 71 ВБ 186 170

День досліду

Фіг. 7А б5

500 Й 400 -ь- Контроль (ОРВ3) збо . 300 --01 мг/кг Сві220

Е 2БО е 20 --410 межг Сві220 150. 100 5 . о І ' 8 15 22 29 й

День досліду

Фіг. тв -- Контроль, (РББ) 5О --10 мижт СНі220 у -40 2 мг/ке! СНі220

Й -- 0 о мікг СНі220 Й

Е 00. 200 100 о і» -28-14 1 15 29 43 57 71 ВБ 156 170

День досліду

Фіг. ВА 40000. зБО0о -- Контроль (РН5) зо00о -- 10 мі/кг СМ220 2БОКЮ --- АЮ мгікг Срід20 Й

Е 20000 -Щ о мг/кг СНі220

Є 15000. 10000.

БОЮ о З. -28 -134 1 15 29 43 57 71 85 156170

Ф)

День досліду

Фіг. 88 --Контроль (РБ5) --10мг/кг СНі220 . -к-40 і мг/кг. СВі220 38000. твою Сюди спого Ф зо 74000. 12000. ав) 10000. й 2 8000 т 6000 о зоо (о) 2000. І о «- 149 156 153 170 177

День досліду

З5 Фіг. ЗА І - т0000 -ш«Контроли (РВЗ) 60000 -- мкг Свіооо

БООООЮ осле-4о мі/кго Сніого -

ВО00001 о думсіке, « й 30000. сного і пре ШИ - 10000. у . с 148 івв 163 170 177

Й День досліду . а «Фіг. ав 450 -е-твз-ат йно) 400 . --7Е1-81 (длбмі) 5О. : ; й зво ОТО дм -і в 250

Е 200. 150

З 100.

БО о 7 14 21 се) дель

Фіг. 10А ге ВИШ: ; 400 --тЕї-а25 (П мг) з5О --ТЕ1-625 (ох мг)

Зоо -ТЕ1-025 (Че) БО (и мг)

Е 2005

Козвої о . 5О. і - 7. 14 21

День

ГФ! Фіг. ов бо б5

БО --МН1 (0,25 мг) --

АФ МА о ме) е. . -е-6Е9 І

ЕЕ 300 - --рРВЗ й 200 7 14 21

День - фіг. 10 18 ЕУДень? о Бздентв о Єденьов й 1.4 - 12 Н . . й й ' Й й й є ; й й Як ре й й | Ж . й й -щ й й й ІЙ з тя й їй ог р Й й т ; о є се ге й й й не й ГЕЙ - - - т т . т п п т т 5 г в В д й - а В 5 с т В Е - Я т ро Ф ЕІ . 8 Е б в в я

КУ Е 0-5 п Ф Е 5 5 Ф . ЕЇ Е є Е " гм

Фіг. 11

Вежкий ланцюг сні220 Ге) десі Й

Атрг : о соууМУ КШромотор т сія дм й ко Ка

Я байти лінваризації и лінвар, МН (Миша)

СНІ (Людина) Ге) з0 роі7-см1ні вела ьр Шарнір ав) (У Сплайсінгова сно

А область/полі А Й х сна Ф «У. Промотар 5У4О, позбав- -

Б енхансера

ОНЕН Є ФА ьо

ВЕН Полі Фіг. 12А

Легкий ланцюг спі22о у

Сайти лінезризації

Авсі .

Аті і фокалнни «У ММ Промотор ко я Й

М

ЮК інтрон с у-0 « . рОТв-см111 пос Капа ввва р й - с Сплайсінгова у; с область/полі А п ФУ Промотор 5М40, позбав- и - Хулений внхансера с Капа 3"

ОНР ст -

ЬОН Полі Фіг. 128 1 САСССАТСОО САСАТСТОСТ ВСатолЛОСТо АСОСОСоССо ССТІСИААТА ОССАСАСТАХ бі ССІГІТТТТ? ТААТТТТАТІ ТТАТТТТАТТ ТТТСАСАТОС АСТТТОСОСС ССАТСТСССо,, 121 АТССССТАТО СТССАСТСТС МОТАСЛАТСТ ОСТСТОАТОС СОСАТАСТТА АСССАСТАТО -І їі81 Тестосстос:ТТОТоТСТІо САСОТОССТО АСТАСТОСОС САССАААЛТТ ТАМОСТАСАА 241 СААБОСААСО СТТОАССИАС ААТТОСАТОА АСААТСТОСТ ТАСОСТТАСЯ соттттосос 301 ТсСТТСОССА ТСТАСОСОСС АСАТАТЛССС СТТСАСАТТС АТТАТТСАСТ АСТТАТТААТ 361 АСТААТСААТ ТАСОСОСТСА ТТАСТІСАТА ССССАТАТАТ ССАСТРОСОС СТТАСАТААС р 421 ТТАСССТААА ТОобСССоССТ бОСТОАССоС ССЛАССАССС ССОСССАТТО АСОТСААТАА 481 ТСАССТАТОТ ТСССАТАСТА АССССЛАТАС ССАСТТТССА ТІСАССТСАХ ТОССТОСАСТ 551 АГІТАСОСТА ЛАСТОСССАС ТІСОСАСТАС МТСАЛОТСТА ТСАТАТОССЬ АСТАСССССС 601 СТАТТСАССТ СААТСАСССТ АААТОССССО ССТОССАТТА ТОСССЛЮТАС АТСАССТТАТ

І«е) 51 СССАСТІТОС ТАСТТОЗСАЄ ТАСАТСТАСО ТАТТАСТСАТ СОСТАТТАСС АТОСТОАТоС 721 ОСТІТТСОСА СТАСАТСААТ СОССОТССАТ АСОССТТТСА СТСАСССССА ТТТССААСТО 781 ТССАССОСАТ ТОАССТСААТ СССАСТІТСТ ТТТОССАССА АААТСЛАССС САСТТТОСАА 841 ААТСТОСТАА СААСТОСОСС ССАТІСАСОС АААтТосссос ТАСОСОТСТА СоСТОпБОАСо. 901 ТСТАТАТААС САСАОСТСТС ТСОСТАЛСТА САСЛАСССАС ТОСТТАЄТСІ СТТАТОСАЛА (ав) 361 ТТАКТАСОАС ТСАСТАТАСЯ ЗАСАСССЛЛС СІТОСТАССА ТОСАСТОСАС СТОСАСААТС 1021 СТСТТСТТОо ТОССЛБСЛСС ААСАССТОСС САСТОССАСА ТОСАЄТТССТ, ССВАТСТІСА 1081 ССТОДОСТоА АСАВОССТосС АСАСАСАСТо Зо5АТСТоСТ ссЬДссстус тТосоТАТоСе 1141 ТІСАСААСТА СТССААТОСА СТОССТОСВА САСАТОССВО САВАСОСТТТ СЗАСТОСАТІ. (Че) 1201 СОКТЗСАТАМ АСАСССАСТС ТОСАСТОССА МААТАТСТАЯ ЗАСАСІТСАА, сосасастТІ і261 СССТТСТСТТ ТОСАААССТО ТОССАДСАСТ ССУТАТТЛС АСАТААССАА сстеАЛАМАХ 1121 САССАСАСОС СТАССТАТТТ СТСТІСТОАСА ТОСОБСААТО СТААСТАТОА ССТОСОСТА 1351 ТІТССТІАЄТ ПСССССІАСС ПСАСАСТЛатТо ЗСТОТСТСТО СМСТАССАС ПАДСОССССА 1441 ТооСтТСТТСС ССсТоСсЛСС СТОСТОСАЛО АСсАССТСТо бобосАСАБС сОбСсСстТосос 1501 ТСОСТОСІСА АССАСТАСТТ ССССЗААСОС СТОАСООТОТ СОТОСААСТС АбОСОСОСТО 1561 АССАбСосСо ТОоСАСАССТТ ССССОСТСТС СТАСАСТССТ СЛОСАСТОТА СТОССТеАСС 1623 АСССТССТСА СССТОСОСТО САССЛССТІС СОСАСССАСА ССТАСУТСТО СААСОТОЛАТ 1681 САСААССССА ССААСАССАА ССТОСАСАЛС АААСТТОСТО АБАССССАБОІ АСАбСОАСоС. 1751 восОтТотТСтТо СТООЛАБССА бестТсАСсос ТОСТоССТСо АСбСАТСССВ ОСТАТоСАСо 1801 СССАСТССАС СОСЛОСААСО САСССОСССТ СТОССТСТТС АСССобАСОС СТетосссос забі сссАСТСАТо СТСАБССАСА состоТІстТо сСТТІТТСсСс САСССІСТСо ССАбосСАсСАє 19321 ССТАбСТОСС ССТААСССАб ССССТОСАСА САААССбОСА ббтостобос ТСАСАССТОС. 1981 СААСАСССАТ АТСССССАСО АСССТОСССС ТСАССТААСС ССАССССЛАЛ СбССАМАСТе 2041 ТССАСТСССТ САССТОБСАС АССТТСТСІС СТОСССАСАТТ ССАСТААСТеС ССААТСТТСТ 2101 СТСТССАСАС СССАЛАТСІТ СТСАСААААС ТСАСАСАТОС ССАСССТОСС САССТААСоС 2161 АССССАСССС ТСССССТССА ССТСАЛОССЯ СЗАСАССТОС ССТАСАСТАС ССТОСАТССА ке 2221 СсСАСАСссСс ССАбССсооТ ССТОАСАССТ ССАССТССАТ СТІСТІССТСА БСАССТСААС 2281 ТоСтТСсоссс АСОСТСАСТС ТТССІСТТСС СОССААЛАСС СААССАСАСС СТСАТСАТСТ 2341 СССССАСОСС ТСАССТСАСА ТСССТССТОС ТОСАССТСАЄ ССАСОЛАСАС ССТОАССТСА 2401 АСТІСААСТа СТАССТосСАС СоСоТоСАСо ТОСАТЛАТОС СААСАСАААС СссссосАсо 2461 АССЛЯТАСАА САССЛОСТАС СОТОТССТСА СОСТОСТСАС ССТОСТОСАС СКопАСТОСС 2521 ТОААТОССАА СсАСТАСААС ТССААССТСТ ССААСАЛДОС ССТСССАССС СССАТССАСА во 2581 АААССАТСТС САЛАБССЛАА БОТОбОЛССС СТССССТОСО АСООССАСАТ ССАСАСАССС 2641 СОССТОСоСС САСОСТСТСС ССТСАСАЄТО АССОСТОТАЄС СААССТСТСТ СОСТАСАЄСЯ 2701 САССССССАС ЛАССАСАСОТ СТАСАСССТІ СССССАТССС СОССАТСАССТ САССАЛСААС 2751 САССТОАБСС ТОАССТОССТ ССТСААЛАаСС ТТСТАТОССА СССАСАТСОС ОСТОсАстса 29821 САСАССААТО СОСЛОСОССА СААСААСТАС ААСАССАССС СТОССОТОСТ ССАСТОССАЄ 2881 СОСТОСТТСТ ТОСТСТАСАЄ САЛЕСТСАСС СТОСАСЛАСА ССАССТООСА ссАСоССЛАС 2941 СТСТІСТСАТ ССТССОТСАТ ССАТСАСОСТ СТОСАСААСС АСТАСАСОСА СААСАСССТе 3001 ТесстстстТо ССоСтТААЛАТо АСтТоССАсСосС соебослАдСС сссостТосСсо сссстстобе

Фіг. 18А

3061 ССТОССАССА ОСАТОСТТОс САСОТАСССС СТСТАСАТАС ТТССсбобсо сосАссАТев 3121 АААТАААССА СССАбСОСТО СССТССбССС СТОССАСАСТ СТСАТСЯТІС ТТТОСАСбсб 3181 ТСАСОСССАЄ ТСТОЛОСССТ САСТСССАТИ АСссАБОСАЄ АСССССТОСе АСТОТССОСА. 3241 САСТОСССсА СССТОТОСАС СТСТСССТСС бСССССТАСО СТОСОССТСА ссслосоосТ 3301 ССССТОСОСА СОСТОСООСА ТТЕОССАССЯ ТОбСССТССС ТССАБСАССА Сстосестоо 3361 СТСОСССАС СОСААСОССТ АопЛОСССсТ БСССАСАСАС ВСАСАСССССЯ ТОССТСТОТА 3421 ССАСАСТОТС СТСТТСТСТо АСССССОСТО ТОСТОСССАС СТССАТеСОС АСТСССобоС 3481 АТСССТАСТС САТСТСССТА СОСЛСАСОСС СТОССТСАСС САТСТАСССС СЬСЕБСАСТА 2541 АССССТОССТ СОССТОСССЬ СССТОССАСС СОСАТССССА САСЛАСОСАЄ Тоспоссле 3501 ТОСАСТСТСо сбСССТОТос АСОБАСТОСТ ССАСАТОССС АСАСАСАСАС ТСАБСССАСА 3661 ССССТТСААС АААССССССА СТОСАСОГТОС ССССССАСАС ССССАССАСА САСАСАССТО. 3721 САСООСТСАС АСАСОСАСОС ТСАСССОСОС БААСТОСАСА ОСАСССАБАС САСАССААСО 3781 ТОСТСбСАСА СОТОААСАСТ ССТСОСАСАС АбососссАс пАССесССАСо ССОСАССТСА 3841 АСОСССАСОА СоСТСТСооС АССІТЇСТОСА САТОСТСАСС ТОСІСАСАСА ААССсСАСССС 3901 ТОСТСТСАСА АСССТОСССС ТОСАСССССС АСАСАСАСАС АСОССАТСАС АСАССАССТе 1961 АСстТосстТос СоСТооСССА СТІСОСАСТо ССбСОСТТОС СТОСАБСАСо САТСАСоСТе 4021 САСІСТоССТ ТСТАСТТсСсС АСССАТСТСТ ТстттТеосссс тТосесссоТоо сттосттоАс 4081 ССТОСАЛОСТ СССАСТСССА СТОТОСТТТС СТААТАЛААТ САССАЛАТТЄ САТОСОХТТО 4141 ТСТОМОТАВо ТЕТСАТУСТА ТТСТОбабос ТобоБтооов СЛОСАСЬССА АБОоІОАТА 4201 ТІСССЛАСАС ААТАССАСОС АТОСТОСССА тТосостососСС ТСТАТОСсСтТІ СТОАСОСОСА «251 ААСААССАСС ТООСССТСТА СОССоТАТСС СсАСбСаСоС ТСТАСССбоВ САТТАЛСОСІ 4321 сСсоооТОТО ЗТООТТАСОС ССАСССТОАІ СЗСТАСАСТТ ОСсАбсоссс ТАбСооСово «381 ТоСТТТсСоОСТ ТІСТІСССТІ ССТТТСТОСО САСОТІСОСС СБОССТСТСА АААЛАбООВА 441 ААААЛАБСАТО САТІХІЛАТТ АСТСАССААС САТАСТСССО ССІТТААСТО СОПОСАТССО 170 4501 БСОССТААСТ СССССІАСТТ СОССССАТІС ТСПОССОСАТ СОСТСАСТАА ТТТТТТТТАТ 4561 ТТАТССАСАб бососзссосо ССТОбОССТС ТСАССТАТТС САСААСТАСТ бАССАСоСТТ. 4521 ТІТІССАбОС СТАСССТТТТ ССАЛАААССТ ТОСАСАССТо АСсостосСсА ТТТСбСсСесСА 4631 ЗАСТТСАССОС СЛАТСОСТАСС ОТОХЛАСоСТо ОТАССАТТТІТ АТССССОСТО СОАТСАТОСТ 4741 ТОСАССАТТо ААСТОСАТОС ТОбСОСТОТС ССАААЛТАТО бОБАТТОБСА АБААССбСАСА 4801 ССТАСССТосС ССТССОСТСА ССААССАСТІ СААСТАСТТС САААСААТСА ССАСААССТе 4851 ТТСАСТОСАА СОТАААСАСА АТСТОСТОАТ ТАТООСТАСс ААВАССТСОТ ТСТОСАТТОС 4921 ТСАСААСААТ СОАССТІТАА АОСАСЬСАВТ ТААТАТАСТТ СТОАСТАБАС ААСТОАААСА 4981 АССАССАССА ССАССТСМТТ ТІСТТОСССАЛ ААСТІТОСАТ САТОССТТАА САСТТАТТСА 5041 АСААССОСАА ТТОССААСТА ААСТАСАСАТ ССТТТОСАТА СТОСалССсА СТТСТСТІТА 8101 ССАССАЛССС АТСААТСААС САССССАССТ ТАСАСТСТТТ СТСАСААССА ТСАТОСАССА. 5161 АТІТСАЛАСТ САСАССТТІТ ТСССАСЛААТ ТОАТТТОСсСсС АААТАТАЛАС ТІСТСССАСА. 5221 АТАСССАССС СТССТСТСТО МОСТССЛОСА ССЛАЛААССС АТСЛАСТАТА АСТТТСЛАЄТ 7 5231 СТАСОАСАВС АААСАСТААС ДССААСАТОС ТТІСААСТТС ТСТосСТеСос ТеСтТАдДАСсТ 3341 АТОСАТТТТТ АТААСАССАТ СОСАСТІТТС СТСОСТІТАС АТСІСТТТСТ СААССЛАССТ 715 5401 ТАСТІСТСТО СТСТСАСАТА АТТОСАСААА СТАССТАСАЄ АСАТІТАААС СТСТААОСТА.

Баб1 ААТАТААААТ ТТІТААСТОТ АТААТСТСЇТ АААСТАСТОА ТІСТААТТСТ ТТСТСТАТІТ 5521 ТАСАТТССАА ССТАТОСААС ТСАТСААТОС САССАСТОСТ ССААТОССТІ ТААТОЛОСАА, 5581 ААССТСТІІТ ССТСМСАЛСА ААТОССАТСТ АСТСАТСАТО АСССТАСТОС ТОАСТСТСХА. 5641 САТТСТАСТС СТССАЛААЛА СААСАСАЛАЄ СТАСЛАСАСС ССААССАСТТ ТОСТТСВСЛА 8701 ТТССТААСТТО ТІТТСАСТСА ТОСТСТСТІТ АСТААТАСАА СТСТТОСТІо СТІТОСТАТТ.

БТІ ТАСАССЛСАА АССААЛАЛСС ТССАСТОСТА ТАСАЛАСАЛАА ТТАТССААЛА АТАТТСТСТА

5821 АССТІТАТАХА СТАСССАТАА САСТІТАТААТ САТАЛСАТАС ТСТІТТТТСТ ТАСТОСАСАС

Б8Ві АСОСАТАСАЄ ТСОТСТОСТАТ ТААТААСТАТ ССТСАААААТ ТОТОТАССТІ ТАССТТТТТА. 5941 АТІТТСТАЛАС СОСТТЛАТАА ССЛАТАТТТ АТСТАТАСТО ССТТСАСТАС АСАТСАТААТ 6001 САСССАТАЄС АСАТТТОТА АООТІТТАСТ ТЄСТІТАААА ААССТСССЬС АССТСсСССТ 6061 СААССТСАЛА САТАВААТСА АТОСААТТСТ ТСТТСТТААС ТТСТІТАТТО САССТТАТАА

Фіг. 138 612 ТООТІТАСАМА ТАЛАССААТА ССАТСАСАЛА ТТТСАСАМАТ ААВССАТТТТ ТТТСАСТОСА 6181 ТІСТАСТІСТ ССТІТОТССА ААСТСАТСАА ТОТАТСТІАТ САТОТСТОСА ТСОССТОСАТ 6241 САТССТОСАФ СОСОООСАТС ТСАТОСТОСА СТТСІТСОСс САССССААСТ ТСТТТАТТОС 6301 АССТТАТААТ СОТТАСАЛАТ АЛАССЛАТАС САТСЛСАЛАТ ТТСАСАЛАТА ААССАТТТТІ 6351 ТТСАСТССАТ ТСТАСТТСТО СТТТСТОСЬА АСТСАТСААТ СТАТСТТАТС АТСТСТСТАТ 6421 АСССТССАСС ТСТАССТАСА ПСТТСССФТА АТСАТОСТСА ТАССТОТТТС СТОТСТСАДА 6481 ТТСТТАТССЯ СТСАСЛАТТС САСАСЛАСАТ АССАСССССА АССАТАЛАСТ СТАЛАБССТО 6541 ББСТСССТАА ТОАСТСАССТ ААСТСАСАТТ ААТТОССТТо СВСТСАСТОС СПЕСТТТОСА 6601 СТОСССАЛАС СТСТОСТССС АССТОСАТТА АТСЛАТСССС САДСССССоЄ ССАСАбСССО 6651 ТІТОССТАТТ С55СБСТСТТ ССОСТЕССТС ОСТСАСТОАС ТСОСТОСоСТ спотобТтос се 672Р ССТОСОСССА ССССТАТСАЄ СТСАСТСААА СССССТААТА СССТТАТССА СЛСЛАТСАСЯ 6781 ССАТААСССА СОДААСААСА ТСТСАБСАЛА АССССАССАД ААССССАССА АСССТАЛАДА. 6841 ссссосотТто СТОСОСТТТТ ТОСАТАбОСТ ССбССОСССТ ЗАСОАССАТС АСАЛАКМАТОС 6901 АСССТСААСТ САСАССТСОС САААССССАС АССАСТАТАА АСАТАССАСЯ ССТТТОСССС Ге) 961 ТОСААССТОС СТОСТОСОСТ СТОСТСТІСс САССсТосСсо СТТАССОСАТ АССТоТССЬС. 7021 СТІТСТСОСТ ТОСОСАЛоСо ТОССОСТІТО ТСААТОСТСА СОСТОТАССТ АТСТОАСТТС 7051 сстотТАСстТо СТТСОСТОСА Асстососто ТСТОСАСБАА сососсстто АсссссАсса 7141 СТОСОССТІА ТОСОСІЛАСТ АТСОТСТІОХ СТОСААССос СТААСАСАСС АСТТАТСОСС 7201 АСТОССАССА ССІАСТОСТА АСЛОСАТТАС САСАССбАбс ТАТОТАСоСо СТОСТАСАВА 7261 СТТСТТСААС ТОСТОСССТА АСТАССОСТА САСТАСААСО АСАСТАТТТС СТАТСТОоСОС 7321 ТСТОСТОАЛС ССАСТТАЄСТ ТСОСАЛАЛАС АСТТОСТАВС ТСТІТОАТОСО ССАЛАСАААС 7381 САССССТОСТ АССоСТостТт ТТТТТСТТТо СААССАбСАС АТТАСОСССА САААААААСС 7441 АТСТОААСАМ САТССТТТСА ТСТІТТСТАС ССбОТСТОЛС ОСТСАСТССА АССААААСТО 7501 АССТТАЛСОС АТІТТОСТОА ТСАСАТТАТС МААААССАТС ТТСАССТАСА ТОСТІТТАЛА (є) 7561 ТТАААААТСА АСТТТТАААТ СААТСТАВАС ТАТАТАТСАС ТАААСТТОастТ СТОАСАСТТА. 7621 ССААТОСТТА АТСАСТОАбо САССТАТСТС АСССАТСТОТ СТАТІТОСТТ САТССАТАСТ 7681 ТОССТОАСТС ССССТЄСТСТ АСАТААСТАС САТАСоссАс СОСТТАССАТ СТОССОССАЄ 7741 ТОСТОСЛАТС АТАСОСССАС АСССАСССТС АСССССТССА САТТТАТСАЄ СААТАЛАССА. 1801 СССАСССОСА АССССССАСО ССАСЛАСТОС ТОСТССААСТ ТТАТССОССТ ССАТОСАСТО (ав) 7861 ТАТІТААТІСТ ТОССОССААС СТАСАСТАЛС ТАСТТССССА СТТААТАСТТ ТОСССААСеСТ 7921 ТСТТОССАТІ БСТАСАбССА ТОСТОСТОТС АСССТОСТОС ТІТОСТАТОО СТІСАТТСАЄ. 7981 СТССОСТТОС СЛАССАТСЛА ССОСАСТІТЬС АТСАТССССС АТСТТСТОСА АВАЛАССССТ 8041 ТАССТОСТТС ССТССТОССА ТССТТСТСАЄ ААСТАЛСТТО СОСОСАСТСТ ТАТСАСТСАТ (є) 8101 ССТТАТОССА ССАСТССАТА АТТСТСТТАС ТСТСАТСССА ТОССТААСАТ ОСТТТТСТСТ 8161 САСТССТСАС ТАСТСЛАССА АСТСАТТСТО АСААТАСТСТ АТССОбССАС ССАСТТЄСТО 8121 ТТОССОСЯСО ТСААТАССОС АТААТАССОС СССАСАТАЄС АСААСТТТЛА ААСТОСТСАТ 8281 САТТССАААА СОТТСТТОоа СОССААААСТ СТСАДСсКТО ТТАССОСТСТЇ ТСАСАТОСАЄ. чи: 8341 ТІССАТСТАА СССАСТОСТО САСССААСТО АТСТТСАССА ТСТТТТАСТЕ ТСАССЛОСсТ 8401 ТТСТОСОТСА ССААЛАЛСАС СААСССАЛАА ТСССССЛААА ААСССЛАТАА ССОССЛеХсс 8461 САЛАТСТТСА АТАСТСАТАС ТСТТІССТТТІ ТСААТАТТАТ ТЕААССАТТТ АТСАБСОТТА

В521 ТТОТСТСАТО АССОСАТАСА ТАТТТСААТС ТАТТТАСАЛА ААТАААСААА ТАССССТТОС у 8581 ССССАСАТТТ ССССБАААЛЄ ТОССАССТЯА СОТ

Фіг. 13С 1 САСОСАТОБО САСАТСТОСТ АОССССОСТО АССТСАССОС СОСОСОСТТС СЛАТАСССАС ві АСТААССТТТ ТТІТІТТААТТ ТТАТТТТАТІ ТТАТІТТТОА САТОСАСТТТ сбсосесАТе 121 ТССОСАТСОС СТАТОСТСВА СТСТСАСТАС ААТСТОСТСТ САТОСССОСАТ АСТТААСОСА івї СТАТСТОСТС ССТССТІСТо ТСТТССАССТ СОСТСАСТАЄ ТОСОССАССА АЛАТТТАЛСС « 241 ТАСААСАЛОС САМСОСТІСА СССАСААТІЄ САТСЛАБААТ СТОСТТАСОЯ ТТАССОСТТТ 301 ТОСОСТОСТІ СОСОАТОТАС ОСОССАОАТА ТАСОССТТОА САТТСАТТАТ ТСАСТАСТТА 361 ТТААТКОТАК ТСААТТАССЯ ССТСКТТАСТ ТСАТАОСССА ТАТАТССАЄТ ТОСпСОТТАЄ 421 АТААСТТАСО СТАЛАТСССС ССССТОССТО АССссссАЛС САССССОССС САТТОАССТе шщ 481 ААТААТСАСО ТАТОТТСССА ТАСТААСССС ААТАСССАСТ ТІССАТТСАС СТОААТООСТ 541 ОАСТАТТТА СОСТАЛАСТЯ СССАСТТООС АСТАСАТСАХ СТСТАТСАТА ТОССААСТАС 601 ССССССТАТТ СаСОТСААТС АССОТАЛАТо сссобсстос САТТАТОСОС АСТАСАТОАС ( бБЇ СТТАТСОСАС ТТТОСТАСТТ СОСАСТАСАТ СТАССТАТТА СТСАТСОСТА ТТАССАТССТ 721 БАТОСОСТТТ ТСОСАСТАСА ТСААТОСССО ТОСАТАСССС ТІТСАСІСАС ссссАТТТСС 781 ААСТСТССАС СССАТІСАСО ТСААТОБСАС ТІТСТІТТОЗ САССЛААЛАТО ААСБОСАСТТ . 841 ТОСААААТОТ ССТААСАВСТ ССОССССАТТ САСОСАААТО босСостТАСосС сТоТАСеотО. - 901 ССАССТСТАТ АТААССАСАС СТСТСТСОСТ ААСТАСАСАА СССАСТОСТТ АСТОССТТАТ п 961 СОААЛТТАХТ АОСАСТСАСТ АТАББОАСАС ССААЄСТТОС ТАССАТОСАА СССССАЄСТе " 1021 АБСТІСТСІТ ССТІССТОСТА СТСТОССТСС САСАТАССАС СБСАСАСАТІ СТТСТІАСТе 1081 ВСТСТоСЛосС САСССТСТОТ СТСАСТОСАС САСАТАСЛОТ стототттсс ТоСАсобСсА 1141 БССАСАСТАТ ТАСССАСТАС ТТАСАСТОСТ АТСААСАЛАД АТСАСАТОАо ТСТОСЛАСеС 1201 ТІСТСАТСАА сТАТОСТТСС САТТССАТСТ СТоосАТОСС СТССЬССТТС АСТоССЬСТО. 1251 САТСАСССТС АСАТТТСАСТ СТСАСТАТСА ХСАСТсТосА МОСТОЛЬСАТ СІЛА 1321 АТТАСТСТСА ЛСУТССТСЬС АБСІТТСССТ боВССттобе ТОСАБОСАСС ВАБСТОСАВА 13851 ТОЛАХОСТЬА СТСІСОАСТО ТСТАСАТАЛС СОСТСАМТСС СТСЛАТОСАТ ТОСААТТСТА 1441 ААСТСТОАСо СООТСОСАТС АССТОбОСАТ ТСТУТОССТА ААбСАТТОАС ТТТАСТОСАА -І 1501 СОТСЛОАААА ЗСАТОСАЛАЄ СССТСАСАХТ СоСТОААЛО АОСТССАЛСА ААКСАМТІТА. 1561 ПААСТТТАТТ ЛАСОААТАСС СБСААССТАЄ ЗААСЬААСТО ААААСАТОХА САТТТТАААТ 1621 АСсСТТотТТо СТСТОСТТоС ТАТААТТАТС ТОбОАТААСС АТОСТСТІТТ СТОТ-ТОЇСо 1681 СТААСАТССС СТТАТССОСА ААСААСАСАС ССЛАСОССАб ААСТТТОТТА СТТАААСАСС р 1741 АТОСТСТТТО СТІСІТТОСТ САСОААСТОТ бОСТОСАССА ТСТОТСТІСА ТСТІСССоСс 1801 АТСТСАТСАЄ САСТТСАЛАТ СТОСААСТОС СТСТІСТІСТО ТОССТОСТОА АТААСТТСТА 1851 ТСССАСАСАС СССАЛАСТЬС АСТОСАЛССТ СОЛТАЛСОСС СТССЛАТОСО СТААСТОССА 1923 ССЛОАСТОТС АСАСАССАСО АСАССАМССА САБСАССТАС АоССТоласА ССЛСССТОАС (Се) 1981 ССТОАССАЛА ССАСАСТАСО ЛОВААСАСКА МОТСТАСССо ТССОЛАСТСА СССАТСАССЯ 2041 ССТОАССТОС СССОТСАСАА АСАБСТТСАА СлосСОсАСАС ТОТТАСАСОС АСААСТоСОС 2101 ССАССТОСТС СТСАСТТССА СОСТСАСССС СТСССАТОСТ ТТОСССТСТо АСССТТТТТС 2161 САСАСОССАС СТАССССТАТ ТосСооТСстТо САОСТСАТСТ ТТСАССтТоАС ССОССТОСТО С 2221 СТОСТТСССТ ТТААТТАТСС ТАЛТСТТОСА ССАСЛАТСАА ТАААТАЛАСТ СААТСТІТОС ав) 2281 АССТОТОСТТ ТСТСТСТІТС СТСАТІТТААТ ЛАТТАТТАТС ТСТТСТТТТА ССААСТАСТЄ 2341 ААТТТСТСТТ АТААСССАСТ АЛАТАТСТАС ТСАТССТАМ; БСАССТААСС МТТТАТАМАХ 2401 АТСАТОСТІС АТТСТАТТТ? АСССТАТСАТ ССТСТОСААС АСАСТОСТОС СТСАВАСССА 2451 СААСССТУСТ СТОСТСАСАС ТОСОСТОООС САТООТАСВА САСАСТРОСТ ТОСТІСТТІТ « о) 2521 ССССТССТСА ССАЛССССТС АТАСТССТТТ ТТААСССТСА САССТСТТАС АОТСАТАТАТ 2581 ССТТІТСАТТС ДАТТСССТСА СААТСКАССА АДАССАААТТТ ТТСАЛААСАА САААССТОСТ 2641 АТАЛАСАСЛА ТСАТТСАТТС СААСАТСАТА ТААААТААСА ЛСАСАМТАЛА АССЛАТТАМА 2701 ТААЛСВААСА АТАСССАЛАТ СТІТААСТТС АТСАТООТАС ТІАСАСІТАЛ ТОСААТСТСА 2761 ТОССТТАТТІТ АСАТТТТТАА АСАССТІАСТЬ АСОСАСТОСТ СТСТбССААС СОСССТАТТО 2821 АСТАСТТТСС АСААССТАЛТ ТТААТССАСА СТАТАСТОТО АСАТТААЛАА САТТСАТТАК 2883 ААТСТУТССАА АСОТТСТАТА АВОСТОЗОАС АСАЛАТАТАТ ТСТАТААСТС АССААТСОСЬ 2941 СТТСТАСАТО АСТСАСТОТО СССАСССАСС ААААААСТАТ ССААСАЛТСТ ТСАААБСАСС 2001 ТІТАТТТАСА ААЛОССАДАА АТТОСАЛАТА СССОСАТТОТ ССААСААТАЯ ААТСАСТТАТ

Фіг. 14

3061 ТАААСТСТОС ТАТСТТТАТА САТТАСАЛТА СОСААТСАСО АСААТТВАСА АССТАСАВСТ 3121 АТАССТАСТС АСАСАБАТСА АТСІСКТАЛА ДАТААТСТТА САТААСАСКА АСТСААТОСЯ

З181 АААСАТАТСТ ТСТОТАТСТІ С ТТСАТССАТА ТАЛАСТІСАА ААССАССТЬА АЛАТАЛАСТІ 3241 МСАААТТТОС АТОСАААТТА СТСТІАССТО сосстобосо АСТТАСТССС ТОССАСЛАСА 3301 СААСААСССС СТТСТОСССТ СТТССТАЛТО ТТСТСТТССТ ССТСТСОСсТ ТеТоСАЄТТА 3361 ТСАТСТОТОС АСІСТІСТСТ АТАСАСАТТА ТОСІТСЛАЛА ТААСТІСАСА ТАЛАСЛАСАТ 3421 СТТАТАСССА СТТААТАСАТ АСАЛСАСОЛА ТААСТААТАВ СТСААСАССЬ АСССАССТОб. 3481 ТААСТОССОС ССТОССАТСА ЛАТАССТАСС ТОССТАЛТОС ТОСССЯИСТТС АССССТеЛАТ 3541 САСТСТОССТ ТССАССССТО АЛССТОСТСА АСААЛАСАЛС ЛССССТОСТА ТТТТССТОСС 3601 АТСТСТОССС ТСТІТООСТА ОСТАССАССА САСАТАСАТА САЛАТТАЛАТ БАЛАСАСАСС

ЗББ1 ТТСАССААСС ССАСАСАССА САСЛАТТААС СТТССССАСА САСТССААЛС ССАТОТАТСА 3721 АСАСТСАСАТ СТТТОССААС СОССАЛОСОС АСАТОТАЛАТ САССАСТСТТ ССТСАТТСТА 3781 ТобОсОСАСТС ТОССССТОСС ССІСТСАССТ АСТСАТССАТ ССААСАСАСС ТТТСТААЄТА. 3841 ССТСТСТСТО ССТАСАСТСТ САЛССССТТС АССАСТААСТ АЛСЛСАССАТ СоСТТСССТе 3901 АМАТСАСІСА СААТСССТІТ СІССТОСТТТ СТТТТТСТТТ ССАСТСЬСТА СТОССАААСТ 3961 ССССАЛОСАС АСТСАТССАЄ АЛАСТАСАТА АССААССАСС ТТОСОСТТСТ СССТСТІСАЄ 4021 ААТОоТТОАТе АСТАТСАААТ СТТТСАААСТ ТТОобАбОТКТ САСТАСОССТ аАбАСТСАСТ 4091 ХАТСТСССТТ ССЛАТСАСАТ СААСТТОСТС АСТСАТОССТ СООССОСАМА ТТСААСХАТе

А121 АААСОСАСОС АТААТОСАСТ ТАТОААТТСТ ТосСосссестТ тТосСтТАССТТС АССТоТТосА 4201 ТОСААССсСо СААССССОСТ АТІСТАТАСТ СТОАССТАЛА ТОСТАСАССТ СССТОАТОАС. 4261 ССТОСАСТСТ СССТІСТАСТ ТОССАСОСАтТ стотТТстТтІТс Сосстососс бтоссттссТ 4121 ТОАСССТОСА АССТОССАСТ СССАСТОТСО ТТТОСТААТА АААТСАБОАА АТТОСАТОСС 4381 АТТСТСТОАС ТАССТЗІСАТ ТСТАТТСТОС с00сто050т СОООСАССАС АССААСОСОВ 4451 АСОАТТСОСА АСАСААТАСС АСОСАТОСТО СОСАТОСОбТ сбостТоТАТО ОСТТСТоАсо 170 4501 СССАААЛСААС САССТоСОоСС ТСТАбосостТ УрСССсСАССо босототАСС сососАТТАХ 45бі ссособсосо ТоТоОТоЗТТ АСОСОСАССС ТОАССоСТАС АСТІСССАСИ бСССТАСсвС 4521 ССОСТОСТТТ СОСТТТСТІС ССТТССТТТС ТОСССАССТТ СоСобоБоСТ СТСАААЛАЛАЄ 4881 ОЗААЛАМАВАЄ САТССАТСТС ААТТАСІСАЄ СААССАТАСТ СССОСССОСТА АСТССССССА 4741 ТСССоСОССТ ЛАСТСССССС АСТТСІБоСо АТТСТОСоСС ССАТООСТСА СТААТТТТТІ 4801 ТТАТТТАТОС АСАСССССАб ССССОСТСОс ССТСТСАССТ АТТССАСААС ТАСТОАОСАЄ 1851 ССТІТТТТОС МССОСТАССС ТТТТОСААЬА АССТТССАСА ССТСАСОбСТ оСбАТТТОСС 2321 СССАДАСТТО АСООСААТОС ТАСССТСААС ССІССТАбСА ТТІТАТСССС бСТОССАТСА

АЗВі ТССТТСБАСС АТТОМАСТОС АТССТСССсЯ ТОТСССАМАА ТАТСОССАТТ СОСЛАСАВСо 5041 САСАССТАСС СТоСССТССо СТСАССААСС АСТТСААСТА СТЕССАЛАСА АТСАССАСАА. 5101 ССТСТІТСАСТ СОААСОТААА САСААТСТОЇ ТСАТТАТОбО ТАССААААСІ ТОСТІСТОСА 5161 ТТОСТОАСКА СЛАТОСАССТ ТТАЛАССАСА СААТТААТАТ АСТТІСТСАСТ АСАСАЛСТСА у 5221 МАСААССАСС АССАССАССТ САТТІТСТІО ССЛАЛАСТІТ ССАТСАТССС ТТААСАСТТА 5283 ТІСААСАМСС ССЛАТТСОСА АСТАЛАСТАС АСАТССТТТС САТАСТОССА СОСАСТІСТе 5341 ТІТАССАССА АБССАТСААТ СААССЛОССС АССТТАСАСТ СТТТОТОАСА АОСАТСАТОС 3101 АСОААТТТОА АМСТСАСАСС ТТТІТОССАВ АААТТСАТТТ ССССАЛАТАТ АЛАСТТСТОС

ЗА61 САСААГАССС АСОСОТОСТо ТСТСАССТОС АДОСАБСАААА АСБСАТСААЄ ТАТААСТТТо 5521 ААСТСТАСОА САЛОЛААСАЄ ТААСАССЛАС АТССТЕТСАА СТТСТСТОСТ ССССТОСТАА 5581 АССТАТССАТ ТТТТАТАЛСА ССАТСОСЬСТ ТТТОСТСССТ ТТАСАТСТСТ ТТСТОЛАСОХ 85641 АССТІАСТТС ТОТОСТОТСА САТААТТОСА САВАСТАССТ АСАСАСАТТТ АААФСТСТАА, 5701 СОТАЛАТАТА АКАТТТТІАА СТОТАТААТО ТСТТАЛАСТА СТСАТІСТАА ТІСТІТСТОЇ 5761 АТТТГАСАТТ ССААССТАТО СЛАСТСАТОА АТОССАССАс ТОСТОСААТЕ ССТТТААТОА 5821 ССААААССТ ТТТТОСТСАЄ ААСАЛАТССС АТСТАСТОАТ САТСАСОСТА СТОСТСАСТС 5881 ТСААСАТІСТ АСТССТССАА ААЛАСААСАС АААССТАСАА САССССААСО АСТТТССТІЄ 5941 АБААТТССТА ЛОТТТТІТСА СТСАТОСТСТ СТТТАСТЛАТ МСААСТСТІС СТТОСТТТоС 6001 ТАТТТАСАСС АСАААССААА ААССТОСАСТ ССТАТАСАЛС ВАЛАТТАТОЯ ААЛААТАТТС 6051 ТСТААЛССТІТ АТААСТАССС АТААСАСТТА ТААТСАТААС АТАСТСІТТТІ ТІСТТАСІСС

Фіг. 148 5121 АСАСАСОСАТ АСАСТСТСТО СТАТТМАТАА СТАТССТСАА ААМТТСТСТЬ СетттАССТТ 6181 ТТТААТТТСТ ЛААСОСОТТА АТАЛОСАЛТА ТІТСАТОТАТ ЛОТЕССТТОА СТАСАСАТСА 6241 ТААТСАСОСА ТАССАСАТТІ СТАСАССТТ ТАСТТЄСТТТ ЛАЛАЛАССТС СсАСАССТОС 6301 СССТСААССТ САЛАСАТАЛА АТСЛАТОСАА ТТСІТСТІСТ ТААСТТСТТТ АТТССАЄСТЕ 6361 АТАМТССТТА САЛАТАЛАЄС ААТАЗСАТСА СЛАЛТТТСАС ААЛАТАААЄСА ТІТТТТТСАС 6121 ТССАТІСТЬО ТТОТОСТІТС ТОСАДАСІСА ТСААТСТАТС ТТАТСАТСТО ТоБАТССЯСТ 6481 ББАТОАТОСТ ССАЄСОСОСО САТСТСАТОС ТССАСТТСТТ СОСССАСССС ЛАСТІСТІТА 6541 ТТОСАССТТА ТААТОСТТАС ААКТААВОСА АТАОСАТСАС АЛАТТТСАСА ААТААЛССАТ 6601 ТТТТТТСАСТ БСАТТСТАСТ ТСТОСТТТСТ ССАЛАСТСАТ СААТСТАТСТ ТАТСАТОТСТ 6651 СТАТАСССТС САССТСТАСС ТАСАССТТСО ССТААТСАТС СТОУТАССТС ТТІССТоТСТ се 6721 САЛАТТСТТА ТССОСТСАСА АТТОСАСАСА АСАТАССЛСС СОСАЛОСАТА ААСТСТАЛЛС 6781 ССТССоСТосС СТААТСАЄСТИ АССТААСТСОА САТТААТТОС СТТОСССТСА стосесостт 6841 ТесАСТСОСс ААЛССТОТОС ТОССАССТОС АТТААТСААТ ССОССАДССО ССССОСАСАС. 6901 СОССТТТОСо ТАТІССососС тТоттососСтТт сстосстеАс ТоАсСтТебсто состооотоо 6361 ТТСобСТоСо ПСОАБСССТА ТСАССТСАСТ САЛАбССОСТ ААТАСОСТТА ТССАСАСААТ Ге) 7021 САССССАТАА СССАССУЛАСЄ ААСАТСТСАС САДАЛССССА ССААЛАСССС ЛОСААСССТА 7981 ААААССССОС СТТОСТОССО ТТІТТССАТА ББСТОСОССС СОСТОАССАС САТСАСАЛАХ 7141 АТССАСССТС ААСТСАБАСІ ТОбСПАЛАСЄ СБАСАбСАСТ АТАААСАТАС САбоСЗТТТО 7201 ССССТССАЛо СТСоСТОсТо СОСТСТОСТо ТТССОАССсСтТ ОССОСТТАСС ОбАТАССТоТ. т251 ССоССТТстТ СССТІССССА АССоОТОбсосС ТТІСТСМАТО СТСАСбСТОТ АССТАТСТСВ 7321 СТТСОСТСТА ССТОСТТСос ТССАЛОСТоо ССТСІСТОСА ССАЛОСССОС СТтелоСсоо 7381 АССОСТОССС СТТАТСОоОТ ААСТАТООТС ТТОАСТОСЛА СССОСТААСА САСОАСТТАТ. 74А1 СОССАСТОСС АБСАБССАСТ ООІААСАОСА ТІАССАбАСС САСОТАТСТА ббсосТостТА. 7501 САСАСТТСТТ СААСТСоТоС ССТААСТАСо ОСТАСАСТАС ААССАСАСТА ТТТОСТАТСТ (є) 7561 ССОСТСТОСТ СААБССАСТТ АССТТСОСКА ЗААСАСТТОЯ ТАССТСТТСА ТОССССАКАС. т621 АААССЬСОСС ТССТАССССТ ССТТТІТТТО ТТТОСААССА ССАСАТТАСС СОСАСАЛАВА 7581 АЛОСАТСТСА АСААСАТОСТ ТТСАТСТІТТ СТАСССОСТО ТОАСОСТСАЄ ТОПААССАВА 7741 АСТСАССТТА АСССАТТТТО СТСАТСАСАТ ТАТСЗААААС САТСТТСАСС ТАСАТОСТІТ.

Т801 ТААХТІАААА АТСААСТТТТ ЛАЛТСААТСТ АЛАСТАТАТА ТОАСТАААСТ ТОТСТОАСА. ав) 7854 СТТАССЛАТС СТТААТСАСТ САСССАССТА ІСТСАСССАТ СІСТСТАТТІ ССТТСАТССА 7921 ТАСТТОССТЯ АСТССОССТС СТСТАСАТАА СТАССАТАСС ССАССОСТТА ССАТСТОССС 7981 ССАСТоСТосС ЗАТСАТАССС СОАСАСССАС ССТСАСССОС ТОСАСАЖТТА ТСАБСЛАТАА. 8041 АССАСССЛСС СССААСССОС СЛССССАСАА СТоСТОСТоС МАСТІТАТОС сбстосАтсе (є) 8101 АФТСТАТТАА ТТСТТОСССо САЛОСТАСАС ТААСТАСТТС СССАСТТААТ АСТТТССоСА 8161 АССТІСТТОС САТІОСТАСА СОСАТОСТос ТСТСАСОСТС СТСБІТТОСТ АТСОСТІСАТ 8221 ТСАССТОССС ТТСССЛАССА ТСЛАССССАЄ ТТАСАТСАТС ССССАТОТТО ТОСАВАВАЛ 8281 СССТТАССТС СТТСОСТОСТ СССАТСОТТа ТСАСААСТАА стТТбсСсосСА СТСТТАТСАС 8341 ТСАТССТТАТ СССАССАСТО САТААТТСТС ТТАСТСТСАТ ОССАТСССТА АСАТОСТТТТ т

В401 СТОТСАСТОЮ ТСАСТАСТСА АССАЛСТСАТ ТСТОЛСААТА СТОТАХОСОВ СБАССОЛОТ 8461 ССТСТТОССС ССССТСААТА ССССАТАЖТА СОБССССАСА ТАССАСАЛСТ ТТААЛАСТОС 8521 ТСАТСАЇТСо ААААССТТСТ ТСОбСОССАА ДАСТСТСААС САТСТТАССО СТОТТСАСАВ з5 8581 ССАСТІСВЗАХ СТААСССАСТ ССТОСАСССА АСТОАТСТТІС АССАТСТТІТ АСТТТСАССЬ у 8641 СССТІТСТОС СТСАССААЛА АСАСОЛАССОС ААААТСССЬС АЛАКЛАСССА АТААСОСССА. 85701 САСБСАЛАТО ТТСААТАСТО МТАСТСТТСС ТТТТТСААТА ТТАТТСАЛСС АТТТАТСАЦ 8761 СТІАТТСТСТ САТСАССОСА ТАСАТАТТІФ ААТСТАТТТА САААЛАТААА САЛАТАСССЯ 8821 ТІсСОСОСАС АТІТСССССА АААСТОССАС СТОзСОТе о

Фіг. 14с

МК Домен « 1 10 20 Зо 40 ср ВУьТОвРАТЬЖТвСВКуЧЬяСВАВОдХЯВХЬНИТО ОКЕАН ! - мк І уптавритивьс воїн пзсвавОвуянунуо ок ОАРВЬСІХ . с 5о во то во за 100 Й срао ХАЗНІ1ЗСсІ еавевовавовритьсІНСУВРЕрУвтхСсОпанавВИТЕСОСТКТИТЕ щ УКИККА. пАднвАТствАвпевавсвотогту мі ві еРпогАУУТСООВЕКИВИТЕОССТКУВІК

І»

МН Домен 1 10 20 зо 40 соло зусиувноіньккиактултвскавстактттановуо ние коні.

У? очопуовеівьккрио у вскавохї КТтТЕУВИМИМНОХ РоОдсуЕнно

БО бо 7 80 авс ЕКО срай НІНТНІЙЧЕКІУЕОВКОВЕАУЯЬИТеАНТАУОТВЛЬКИВО ТАТУ шк мн нінтнтакртулоситавиітясітв М тлуцотвішклвотаТу ск: аьБсав 110

І«е) сою ВоМоМУрЦАХТЕАХнНООатьутуУвА й - ! Фіг. 15 я 0 0 ХЕВХМСОатТьЬУтТУв (ав) Фіг. 16 і3е) зв

Й а 2.0 е 15 о

Ж .

Ф) й 0.5 90 0.01 ол 1 10 100 60 ЕВЬ (мкг/мл)

Фіг. 17 ча. ов й !

Х 0504, : І с 0.00-т - 0.1 1 о 100

Ба (мкг/мл) й Фіг 8А Й

Бо ж 6 й. і / с

І б дян е Фіг. 188 .

Е в

Її в 5 а 5 з і Й що с 25. 38 и о 012 345568.7 8

Модна

Ф Ге) зо ормула винаходу о 1. Варіабельна ділянка легкого ланцюга химерного антитіла, що зв'язується з СО40 людини, яка містить Ге») амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:1 (Фіг. 4а). 2. Варіабельна ділянка важкого ланцюга химерного антитіла, що зв'язується з СО40 людини, яка містить - амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2 (Фіг. 45). рч- 3. Химерне антитіло, що зв'язується з СЮО40 людини, яке містить легкий і важкий ланцюг, причому зазначений легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність ЗЕО І МО:4, а зазначений важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:З або біологічно активний фрагмент зазначеного антитіла, що « зв'язується з СЮ40 людини. 4. Химерне антитіло за п.3, яке містить легкий ланцюг з амінокислотною послідовністю ЗЕС ІЮ МО4, та - с важкий ланцюг з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:3. ц 5. Химерне антитіло за п.3, яке відрізняється тим, що зазначений легкий ланцюг містить варіабельну "» ділянку легкого ланцюга , яка містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:1. 6. Химерне антитіло за п.3, яке відрізняється тим, що зазначений важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга , яка містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2. -І 7. Химерне антитіло за п.5, яке відрізняється тим, що зазначений важкий ланцюг містить варіабельну -3з ділянку важкого ланцюга , яка містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:2. 8. Молекула нуклеїнової кислоти, що являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує варіабельну ділянку (Се) легкого ланцюга химерного антитіла, що зв'язується з СО40 людини за п.1. 9. Молекула нуклеїнової кислоти за п.8, що являє собою нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:6. о 10. Молекула нуклеїнової кислоти, що являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує варіабельну ділянку (Че) важкого ланцюга химерного антитіла, що зв'язується з СО40 людини за п.2. 11. Молекула нуклеїнової кислоти за п.10, що являє собою нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:5. 12. Вектор експресії, який містить послідовність нуклеїнової кислоти за п.8. 13. Вектор експресії, який містить послідовність нуклеїнової кислоти за п.10. 14. Фармацевтична композиція для лікування захворювань, опосередкованих Т-клітинами, яка містить о химерне антитіло за п.3 та фармацевтично прийнятний носій. ко 15. Фармацевтична композиція для лікування захворювань, опосередкованих Т-клітинами, яка містить химерне антитіло за п.7 та фармацевтично прийнятний носій. 60

Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 1, 15.01.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. б5