PL197143B1

PL197143B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor ekspresji, komórka gospodarza, region zmienny lekkiego łańcucha lub ciężkiego łańcucha, chimeryczne przeciwciało, humanizowane przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie chimerycznego przeciwciała

Info

Publication number: PL197143B1
Application number: PL342668A
Authority: PL
Inventors: Alejandro A. Aruffo; Diane Hollenbaugh; Anthony W. Siadak; Karen K. Berry; Linda J. Harris; Barbara A. Thorne; Jurgen Bajorath; Wiliam D. Huse; Herren Wu; Jeffry D. Watkins
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2008-03-31
Also published as: AU2671699A; EE200000470A; IL137294A; ID25792A; CN1307484A; JP2002503495A; CO4830493A1; PL342668A1; BR9908045A; CN1198647C; BG65010B1; BG104778A; PE20000268A1; ZA991307B; CZ20003008A3; AU751064B2; CA2321165A1; UA71909C2; EP1054692A2; KR100564376B1

Abstract

1. Cz asteczka kwasu nukleinowego kodujaca zmienny region la ncucha lekkiego lub la ncucha ciezkiego wybrana z grupy obejmuj acej: a) cz asteczk e kwasu nukleinowego zawieraj ac a sekwencj e nukleotydow a o numerze SEQ ID NO: 5 lub 6. b) cz asteczk e kwasu nukleinowego zawieraj ac a sekwencj e nukleotydow a koduj ac a sekwencj e aminokwasow a o numerze SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 8, 10 lub 12; c) cz asteczk e kwasu nukleinowego koduj ac a biologicznie aktywn a cz esc regionu zmiennego kodowanego przez cz asteczk e kwasu nukleinowego jak podano w a) lub w b); i d) cz asteczk e kwasu nukleinowego zawieraj ac a sekwencj e nukleotydow a koduj ac a sekwencj e aminokwasow a, która jest co najmniej w 90% identyczna z sekwencj a aminokwasow a kodowan a przez któr akolwiek z sekwencji aminokwasowych od a) do c). 10. Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca chimeryczne przeciwcia lo jak zdefiniowano w za- strz. 7 lub humanizowane przeciwcia lo jak zdefiniowano w zastrz. 8. 11. Zastosowanie chimerycznego przeciwcia la jak zdefiniowano w zastrz. 7 lub humanizowa- nego przeciwcia la jak zdefiniowano w zastrz. 8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do lecze- nia chorób w których po srednicz a komórki T. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor ekspresji, komórka gospodarza, region zmienny lekkiego łańcucha lub ciężkiego łańcucha, chimeryczne przeciwciało, humanizowane przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie chimerycznego przeciwciała. W odpowiedziach immunologicznych/zapalnych pośredniczy złożona seria wzajemnych oddziaływań. W procesach tych, ważna okazuje się jedna z par receptor/ligand, a mianowicie CD40/gp39. Interakcja gp30/CD40 jest pośrednikiem w szeregu ważnych wydarzeń sygnałowych, zachodzących między aktywnymi komórkami T a innymi komórkami efektorowymi układu odpornościowego, i prowadzących do amplifikacji odpowiedzi immunologicznej/zapalnej. Do odpowiedzi na przekazywanie sygnału poprzez CD40 zalicza się takie zjawiska, jak wzmacnianie przez komórki T aktywności komórek B w immunologicznej odpowiedzi humoralnej, indukowanie cytokin przez monocyty i ekspresja cząsteczek regulujących adhezję zachodząca w komórkach śródbłonka.

CD40 jest receptorem powierzchniowym komórki typu I i członkiem supergenowej rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFR). Aczkolwiek pierwotnie CD40 identyfikowano jako antygen komórek B, obecnie uważa się, że jest on produktem ekspresji wszystkich komórek prezentujących antygen (APC), włączając w to komórki dendrytyczne, keratynocyty i monocyty. Do ekspresji CD40 dochodzi także w przypadku tych typów komórek, które w pewnych warunkach mogą być czynne jako APC, takich jak naczyniowe komórki śródbłonka lub komórki zaangażowane w bezpośrednich interakcjach z komórkami T lub prekursorami komórek T, takie jak grasicze komórki nabłonkowe. Ostatnio, doniesiono również, że do ekspresji CD40 może dochodzić także w przypadku fibroblastów, granulocytów kwasochłonnych i aktywnych komórek T. Obserwowano również ekspresję CD40 w komórkach rakowych. Dowód na to wywodzi się przede wszystkim z identyfikacji niektórych linii ^kom^óre^k ra^kow^yc^{h i} czermakowycfi ^będąc^yc^h CD⁴⁰+. [^Clar^{k i} Ledbetter, ^Proc. ^Nah. Aca^d. Sc^ 8^3,4494 -4498 (1986); Schriever i in., J. Exp. Med., 169, 2043 - 2058 (1989); Caux i in., J. Exp. Med., 180, 1263 - 1272 (1994); Alderson i in., J. Exp. Med., 178, 669 - 674 (1993); Young i in., Int. J. Cancer, 43, 786 - 794 (1989); Paulie i in., Cancer Immunol. Immunother., 20, 23 - 28 (1985); Denfeld i in., Eur. J. Immunol., 26, 2329 - 2334 (1996); Gaspari i in., Eur. J. Immunol., 26, 1371 - 1377 (1985); Peguet-Navarro i in., J. Immunol., 158, 144 - 152 (1997); Hollenbaugh i in., J. Exp. Med., 182, 33 - 40 (1995); Galy i Spits, J. Immunol., 149, 775 - 782 (1992)]; komórki T.

gp39 znana jest także jako CD40L, TRAP, T-BAM i posiada obecnie oficjalne oznaczenie CD nadane przez Leukocyte Workshop, CD 154. W testach przeprowadzonych in vitro, gp39 pojawia się na komórkach T po upływie mniej więcej 2 do 4 godzin od aktywacji komórki T i osiąga szczytowy poziom w czasie od 6 do 8 godzin. Następnie, poziom białka raptownie spada i staje się niewykrywalny po upływie 24 godzin od stymulacji. Ekspresję gp39 wykryto także na granulocytach kwasochłonnych i komórkach tucznych. [Noelle i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6550 - 6554 (1992); Hollenbaugh i in., EMBO J., 11, 4313 - 4321 (1992); Spriggs i in., J. Exp. Med., 176, 1543 - 1550 (1992); Graf i in., Eur. J. Immunol., 22, 3191 - 3194 (1992); Covey i in., Mol. Immunol., 31,471 - 481 (1994); Castle i in., J. Immunol., 151, 1777 - 1788 (1993); Roy i in., J. Immunol., 151, 2497 - 2510 (1993); Gauchat i in., Nature, 365, 340 - 343 (1993); Gauchat i in., Eur. J. Immunol., 25, 863 - 865 (1995); Koshy i in., J. Clin. Invest., 98, 826 - 837 (1996); Desai-Mehta i in., J. Clin. Invest., 97, 2063 - 2073 (1996)].

CD40 jest wysoce aktywnym receptorem w układzie przekazywania sygnałów, zapewniającym funkcjonowanie mechanizmu dla aktywnych komórek T, jeśli chodzi o regulację szerokiego zakresu odpowiedzi immunologicznych i zapalnych. Badania przeprowadzone in vitro i in vivo z udziałem rekombinantowych form ligandu gp39 i mAb anty-CD40 wykazały, że przekazywanie sygnału poprzez ten receptor prowadzi do odpowiedzi komórkowej we wszystkich znanych komórkach CD40+, i że wynik tego zmienia się nie tylko w zależności od rodzaju komórki, ale także jest modulowany przez jednoczesne wydarzenia sygnałowe zachodzące z udziałem innych receptorów. I tak, na przykład, w przypadku komórek B, przesyłanie sygnału poprzez CD40 w połączeniu z przekazywaniem przez receptor IL-2 prowadzi do proliferacji komórek B i wytwarzania przeciwciał izotypu IgE, podczas gdy przekazywanie sygnału poprzez CD40 w połączeniu z sygnałami z receptora IL-10 prowadzi do proliferacji komórek B i wytwarzania przeciwciał izotypu IgG [Gordon i in., Eur. J. Immunol., 17, 1535 1538 (1987); Rousset i in., J. Exp. Med., 173, 705 - 710 (1991); Jabara i in., J. Exp. Med., 172, 1861 1864 (1990); Gascan i in., J. Immunol., 147, 8 - 13 (1991). Przesyłanie sygnału poprzez CD40, w którym pośredniczy gp39, może odgrywać pewną rolę w komórkowej odporności na zakażenie poprzez

PL 197 143 B1 indukowanie CD80 i CD86, ważnych cząsteczek kostymulujących komórki T, które wiążą CD28 i CTLA4 [Goldstein i in., Mol. Immunol., 33, 541 - 552 (1996)].

Układ receptor/ligand CD40/gp39 jest jednym z wielu systemów zaangażowanych w efektywnej interakcji między zaktywowanymi komórkami T a innymi komórkami układu odpornościowego. Jednakże, wyniki szeregu badań nasuwają sugestię, że to wzajemne oddziaływanie jest unikalne i zasadnicze dla regulacji immunologicznej odpowiedzi humoralnej u ludzi. W szczególności wykazano, że defekty ekspresji gp39 lub struktury są przyczyną niedoboru odpornościowego u ludzi, znanego jako zespół hiperimmunoglobulinemii M sprzężonej z płcią (X-HIM). Ten niedobór odpornościowy charakteryzuje się niezdolnością dotkniętych nim osobników do wytwarzania przeciwciał innych niż przeciwciała izotypu IgM, co wskazuje na to, że dla wystąpienia skutecznej immunologicznej odpowiedzi humoralnej potrzebne jest istnienie efektywnej interakcji między gp39 a CD40 [Allen i in., Science, 259, 990 - 993 (1993); Aruffo i in., Cell, 72, 291 - 300 (1993); Di Santo i in., Nature, 361, 541 - 543 (1993); Fulihan i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 90(6), 2170 - 2173 (1993); Korthauer i in. Nature, 361, 539 - 541 (1993); Notarangelo i in., Immunodef. Rev., 3, 101- 122 (1992). Podobnie, otrzymane w ostatnim czasie dane wskazują na to, że zespół HIM nie sprzężonej z płcią u ludzi spowodowany jest przez braki istniejące w cząsteczce CD40. Z zastosowaniem techniki celowanego wyłączenia czynności genu otrzymano myszy z brakiem CD40 lub gp39. Myszy takie wykazują fenotyp o takiej samej charakterystyce jak zespół HIM, co sugeruje, że myszy mogą stanowić odpowiedni model, na którym można testować skutki in vivo postępowania dokonywanego z udziałem przeciwciał monoklonalnych (rnAb), czy to anty-CD40, czy anty-gp35, blokujących interakcję między CD40 a gp39 [Kawabe i in., Immunity, 1, 167 - 178 (1994); Xu i in., Immunity, 1, 423 - 431 (1994); Renshaw i in., J. Exp. Med., 180, 1889 1900 (1994); Castigli i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12135 - 12139 (1994).

Skutki zahamowania in vivo interakcji CD40/gp39 poddano wyczerpującym badaniom u myszy normalnych i na mysich modelach chorobowych, przy użyciu chomiczego mAb przeciw mysiej gp39 (MR1). Immunosupresyjna zdatność przeciwciała odzwierciedla się jego zdolnością do całkowitego zahamowania immunologicznej odpowiedzi humoralnej na antygeny zależne od komórek T [Foy i in., J. Exp. Med., 178, 1567 - 1575 (1993)]. Na szeregu mysich modeli chorób immunologicznych wykazano występowanie zahamowania w wyniku podziałania przeciwciałem, w tym zahamowania, w którym rolę pośrednika grają komórkowe odpowiedzi immunologiczne. Do modeli chorobowych, co do których wykazano, że ulegają zahamowaniu w wyniku działania anty-gp39, należy zapalenie stawów indukowane kolagenem, doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, liszaj, zapalenie nerek, odrzucenie przeszczepu i reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi [Durie i in., Science, 261, 1328 1330 (1993); Berry i in., dane nieopublikowane; Gerritse i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 2499 2504 (1995); Mohan i in., J. Immunol., 154, 1470 - 1480 (1995); Larsen i in., Transplantation, 61,4 - 9 (1996); Hancock i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13967 - 13972 (1996); Parker i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9560 - 9564 (1995); Durie i in., J. Clin. Invest., 94, 1333 - 1338 (1994); Wallace i in. (dane nieopublikowane). Rola CD40/gp39 odgrywana w amplifikacji immunologicznej odpowiedzi komórkowej może polegać na oddziaływaniu bezpośrednim, poprzez stymulowanie subpopulacji zaktywowanych komórek T, które są zdolne do ekspresji CD40, albo pośrednim, poprzez indukcję cytokin i ekspresję ważnych kostymulujących cząsteczek powierzchniowych komórki, takich jak CD80 i CD86, które wiążą się z receptorami CD28 i CTLA-4 komórek T. Działanie przeciwzapalne inhibitora wykazano w badaniach przeprowadzonych na mysim modelu uszkodzenia płuca spowodowanego tlenem. Oddziaływania in vivo na stan zapalny zasugerowane są wynikami badań, które wykazują stymulowanie CD40 na naczyniowych komórkach śródbłonka i monocytach, prowadzące do ekspresji komórkowych cząsteczek adhezyjnych, tlenku azotu (NO), macierzowych metaloproteinaz i cytokin ułatwiających rozwój reakcji zapalnych [Kiener i in., J. Immunol., 155, 4917 - 4925 (1995); Malik i in., J. Immunol., 156, 3952 - 3960 (1995); Hollenbaugh i in., J. Exp. Med., 182, 33 - 40 (1995).

Badania na małpach przeprowadzone z udziałem mAb przeciw ludzkiej gp39 wykazały, że substancje biologiczne hamujące interakcję między gp39 a CD40 in vivo są skutecznymi środkami immunosupresyjnymi u naczelnych. Wykazano, że mAb anty-gp39 działają skutecznie, jeśli chodzi o hamowanie odpowiedzi przeciwciał na antygeny zależne od komórek T i zabezpieczanie przeszczepów alogenicznych przed odrzuceniem. Są to wyniki analogiczne do otrzymanych w przypadku gryzoni.

Podsumowując, powyższe badania wykazały, że środki powodujące rozerwanie interakcji między gp39 a CD40 mogą być silnymi środkami immunosupresyjnymi i przeciwzapalnymi. Dlatego też, występuje w tej dziedzinie potrzeba dysponowania skutecznym sposobem blokowania interakcji

PL 197 143 B1

CD40/gp39 w celu uzyskiwania efektu immunosupresyjnego lub przeciwzapalnego. Zamiarem niniejszego wynalazku jest dostarczenie przeciwciała blokującego interakcję między gp39 a CD40.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie przeciwciała chimerycznego, skutecznego pod względem blokowania interakcji między CD40 a gp39.

Dodatkowym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie przeciwciała humanizowanego, skutecznego pod względem blokowania interakcji między CD40 a gp39.

Dalszym celem niniejszego wynalazku jest sposób modulowania odpowiedzi immunologicznej polegający na stosowaniu przeciwciała, przeciwciała chimerycznego lub przeciwciała humanizowanego. Sposób ten może okazać się przydatny w leczeniu szeregu chorób autoimmunizacyjnych, jak również przy transplantacjach skóry lub innych narządów.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmienny region łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego wybrana z grupy obejmującej:

a) cząsteczkę kwasu mu^leirK^tw^c^o zawierającą sekwencję niu^let^tt^c^c^twą o numerze SEQ ID NO: 5 lub 6;

b) cząsseczkę kwasu nuHeinowego zawierającą sekwen^ę nukkeotydową kodującą sekwen^j aminokwasową numerze SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 8, 10 lub 12;

c) cząs1:eczkę kwasu nukleinowego koduącą biologicznie aktywną regionu zmiennego kodowanego przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak podano w a) lub w b); i

d) cząsseczkę kwasu nukkeinowego zawierającą sekwenecę nukleotydową kodującą sekwenecę aminokwasową, która jest co najmniej w 90% identyczna z sekwencją aminokwasową kodowaną przez którąkolwiek z sekwencji aminokwasowych od a) do c).

Następnie przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczne przeciwciało zawierające łańcuch lekki i łańcuch ciężki wybrana z grupy obejmującej:

a) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1 lub jej biologicznie aktywną część oraz łańcuch ciężki;

b) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję, aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 2 lub jej biologicznie aktywną część oraz łańcuch lekki;

c) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1 lub jej biologicznie aktywną część oraz region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 lub jej biologicznie aktywną część;

d) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% identyczna z sekwencją aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1 oraz łańcuch ciężki; i

e) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% identyczna z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 2 oraz łańcuch lekki.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca humanizowane przeciwciało wybrane z grupy obejmującej:

a) cząsseczkę kwasu nukkeinowego zawierającą sekwenecę kod^ącą regionu zmiennego łańcucha lekkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencje aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1;

b) cząsseczkę kwasu nuMe^owego zawierającą sekwenecę nukleotydową kod^ącą regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencje aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 2.

c) cząsseczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwenecę kod^ącą regionu zmiennego łańcucha lekkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub 12;

d) cząsseczkę kwasu nuMe^owego zawierającą sekwenicę nukleotydową kodującą regionu zmiennego łańcucha ciężkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10;

e) cząsseczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwenecę nukleotydową kodującą regionu zmiennego łańcucha lekkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencje aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1 oraz sekwencję nukleotydową kodującą zmienny region łańcucha ciężkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10;

PL 197 143 B1

f) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą część r^ęgio^ nu zmiennego łańcucha lekkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub 12 oraz sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha ciężkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10; i

g) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą część regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 i sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha lekkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub 12.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji zawierający cząsteczki kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza zawierająca cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku jak zdefiniowano powyżej lub wektor według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również region zmienny lekkiego łańcucha lub ciężkiego łańcucha kodowany przez cząsteczkę kwasu, która koduje ten zmienny region łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest chimeryczne przeciwciało kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego która koduje to chimeryczne przeciwciało.

Przedmiotem wynalazku jest także humanizowane przeciwciało kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową, która koduje to humanizowane przeciwciało jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało chimeryczne jak humanizowane przeciwciało według wynalazku, które wiąże się z ludzkim CD40.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca chimeryczne przeciwciało lub humanizowane przeciwciało.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie chimerycznego przeciwciała lub humanizowanego przeciwciała według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób w których pośredniczą komórki T. Korzystnie choroby obejmują reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu, cukrzycę Typu I, łuszczycę, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy toczeń rumieniowaty lub miastenię ciężką rzekomoporaźną.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania chimerycznego przeciwciała lub humanizowanego przeciwciała jak zdefiniowano do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby charakteryzowanej przez komórki CD40-pozytywne. Korzystnie komórki CD40-pozytywne są komórkami nowotworowymi lub złośliwymi.

Chimeryzowanego monoklonalnego przeciwciała (mAb) przeciw ludzkiemu CD40, według niniejszego wynalazku blokuje interakcję między gp39 a CD40. Zgodnie z jednym z wykonań niniejszego wynalazku, szczególnie korzystne chimeryzowane mAb przeciw ludzkiemu CD40 określa się jako „chi220”. chi220 jest to chimeryczne przeciwciało obejmujące mysie zmienne i ludzkie stale regiony kappa i gamma 1. chi220, podobnie do jego macierzystego mysiego mAb, wiąże się z CD40 i, w rezultacie, skutecznie blokuje immunologiczne odpowiedzi humoralne na zadziałanie antygenów zależnych od komórek T, w sposób zależny od dawki.

Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także humanizowane przeciwciała anty-CD40, blokujące interakcję między gp39 a CD40. W jednym z wykonań niniejszego wynalazku, humanizowane przeciwciało określa się jako F4; w innym wykonaniu humanizowane przeciwciało określa się jako L3.17. Do korzystnych humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku należą ludzkie zmienne regiony ciężkie i zmienne regiony lekkie, ze wszczepionymi do nich mysimi regionami determinującymi komplementarność (CDR).

Przeciwciała anty-CD40 według niniejszego wynalazku, a korzystnie ujawnione w nim przeciwciała chimeryczne i humanizowane, są skuteczne pod względem modulowania immunologicznych odpowiedzi humoralnych wobec antygenów zależnych od komórek T, przy zapaleniu stawów indukowanym kolagenem i odrzucaniu przeszczepów. Przeciwciała anty-CD40 według niniejszego wynalazku, a korzystnie ujawnione w nim przeciwciała chimeryczne i humanizowane, także są użyteczne z uwagi na ich właściwości przeciwzapalne (podobne do właściwości obserwowanych w przypadku anty-gp39).

Przeciwciała według niniejszego wynalazku, w szczególności chimeryczne przeciwciało antyCD40 chi220 oraz humanizowane przeciwciała anty-CD40 F4 i L3.17, znajdują szerokie zastosowania terapeutyczne, włączając w to choroby autoimmunizacyjne, choroby zapalne i transplantację. Biorąc pod uwagę zaobserwowanie ekspresji CD40 na komórkach nowotworów złośliwych szeregu różnych

PL 197 143 B1 typów histologicznych, staje się oczywiste potencjalna możliwość onkologicznego zastosowania przeciwciał anty-CD40, zwłaszcza chimerycznych i humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku.

W tekście niniejszego zgłoszenia patentowego użyto następujących oznaczeń skrótowych, zresztą znanych specjalistom w tej dziedzinie wiedzy; APC (komórka prezentująca antygen); CDR (region determinujący komplementarność); CHO (jajnik chomika chińskiego); CIA (zapalenie stawów indukowane kolagenem); C_max (maksymalne stężenie w surowicy); COS (linia komórkowa fibroblastów afrykańskiego koczkodana zielonego); DMARD (leki przeciwreumatyczne modyfikujące przebieg choroby); ELISA (enzymatyczny test immunoabsorpcyjny); EPT (punkt końcowy miareczkowania); EU (jednostka endotoksyny); Fab (fragment wiążący antygen); FITC (izotiocyjanian fluoresceiny); Hu (humanizowany); h106-2 (humanizowane mAb anty-gp39); HAMA (ludzkie przeciwciała przeciwmysie); i.m. (domięśniowo); KLH (hemocyjanina); mAb (przeciwciało/przeciwciała monoklonalne); MTX (metotreksat); OVA (owoalbumina); PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami); PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy); PE (fikoerytryna); s.c. (podskórnie); SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylo-sodowym); SEC (chromatografia żelowo-permeacyjna); SRBC (krwinki czerwone barana); STR (reaktor z mieszadłem); TNF (czynnik martwicy nowotworu); VL (region zmienny lekkiego łańcucha przeciwciała); VH (region zmienny ciężkiego łańcucha przeciwciała).

Kwas nukleinowy kodujący korzystny łańcuch lekki przeciwciała chimerycznego według niniejszego wynalazku (przeciwciało chimeryczne 2.220) zdeponowano w American Type Culture Collection. Kwas nukleinowy kodujący korzystny łańcuch ciężki przeciwciała chimerycznego według niniejszego wynalazku (2.220) zdeponowano w American Type Culture Collection.

Kwas nukleinowy kodujący korzystny łańcuch lekki przeciwciała humanizowanego według niniejszego wynalazku (przeciwciało humanizowane F4) zdeponowano w American Type Culture Collection. Kwas nukleinowy kodujący dodatkowy korzystny łańcuch lekki przeciwciała humanizowanego według niniejszego wynalazku (przeciwciało humanizowane L3.17) zdeponowano w American Type Culture Collection. Kwas nukleinowy kodujący korzystny łańcuch lekki przeciwciała humanizowanego według niniejszego wynalazku (F4 i L3.17) zdeponowano w American Type Culture Collection.

Depozyt (depozyty), na które powołano się w niniejszym opisie, przetrzymywane są zgodnie z postanowieniami Układu Budapeszteńskiego (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Micoro-Organisms) dla celów postępowania patentowego. Depozyty te udostępnia się jedynie, jako udogodnienie, specjalistom w tej dziedzinie techniki i nie ma do nich dostępu w sensie żądania depozytu zgodnie z 35 U.S.C § 112. Sekwencja (sekwencje) polinukleotydów zawarte w zdeponowanych materiałach, jak również sekwencja aminokwasów polipeptydów w nich zakodowanych, są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki i służą dla kontroli w przypadku jakiegokolwiek konfliktu z jakimkolwiek opisem sekwencji zamieszczonych w niniejszym tekście. Dla wytworzenia, zastosowania lub sprzedaży zdeponowanych materiałów może być wymagana licencja, przy czym dokumentem niniejszym nie udziela się żadnej tego rodzaju licencji.

Wszystkie odnośniki przytaczane w niniejszym zgłoszeniu patentowym, czy to w powyższej, czy poniższej części tekstu, są w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia hamowanie wiązania sgp39 z komórkami Raji przez mAb przeciw ludzkiemu CD40.

Figura 2 jest to przedstawienie w sposób schematyczny protokołu badania naczelnych. Dni potraktowania wskazano rombami. Uodpornianie z udziałem SRBC i KLH wskazano, odpowiednio, prostokątami i trójkątami. Zwierząt potraktowanych 2.36 nie badano po fazie I, a zwierząt potraktowanych 1.106 nie badano po fazie II.

Figura 3 przedstawia odpowiedź polegająca na wytwarzaniu przeciwciała anty-SRBC u naczelnych. Figura 3a pokazuje wyniki analizy przeciwciał anty-SRBC klasy IgM. Figura 3b pokazuje wyniki analizy przeciwciał anty-SRBC klasy IgG.

Figura 4a pokazuje drukiem tłustym sekwencję zmiennego regionu łańcucha lekkiego chi220 (SEQ ID No: 1), a fig. 4b pokazuje drukiem tłustym sekwencję zmiennego regionu łańcucha ciężkiego chi220 (SEQ ID NO: 2). Sekwencje pokreślone na fig. fig. 4a i 4b są to wstawione sygnałowe sekwencje ludzkiego przeciwciała o najściślejszej homologii, których używa się jako matrycy humanizacyjnej.

Figura 5 przedstawia wyniki in vivo testów z udziałem chimerycznego i humanizowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Figura 5a pokazuje wiązanie się chi220 i h220v3 z hCD40-mG2b w teście opartym na technice ELISA. Figura 5b pokazuje hamowanie kostymulacji, w której pośredniczy sgp39, ludzkich komórek B przez mAb przeciw ludzkiemu CD40.

PL 197 143 B1

Figura 6 przedstawia odpowiedź polegającą na wytwarzaniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgM.

Figura 6a pokazuje wyniki dla małp otrzymujących dawkę 10, 40 lub 100 mg/kg chi220. Figura 6b pokazuje wyniki dla małp, które otrzymały dawkę 0,1 lub 1 mg/kg chi220.

Figura 7 przedstawia odpowiedź polegającą na wytwarzaniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgG. Figura 7a pokazuje wyniki dla małp otrzymujących 10, 40 lub 100 mg/kg chi220. Figura 7b pokazuje wyniki dla małp, które otrzymały dawkę 0,1 lub 1 mg/kg chi220.

Figura 8 przedstawia odpowiedź polegającą na wytwarzaniu przeciwciała anty-OVA u naczelnych. Figura 8a pokazuje wyniki analizy przeciwciał anty-OVA klasy IgM. Figura 8b pokazuje wyniki analizy przeciwciał anty-OVA klasy IgG.

Figura 9 przedstawia odpowiedź polegającą na wytwarzaniu przeciwciała anty-KLH u naczelnych. Figura 9a pokazuje wyniki analizy przeciwciał anty-KLH klasy IgM. Figura 9b pokazuje wyniki analizy przeciwciał anty-KLH klasy IgG.

Figura 10 pokazuje porównanie zdolności przeciwciała 7E1-G1 i 7E1-G2b do tłumienia odpowiedzi, polegającej na wytwarzaniu przeciwciała klasy IgG, na zadziałanie SRBC.

Figura 11 pokazuje zależną od dawki odpowiedź jako zahamowanie przez 7E1-G2b odpowiedzi, polegającej na wytwarzaniu przeciwciała, na zadziałanie SRBC.

Figura 12 przedstawia mapy wektorów ekspresyjnych dla regionu łańcucha ciężkiego i regionu łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała według niniejszego wynalazku.

Figura 13 podaje sekwencję kwasu nukleinowego dla wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji łańcucha ciężkiego chimerycznego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Drukiem tłustym wyróżniono startowe ATG (nukleotydy 1000 - 1002), kodujące startową Met wstawionej sekwencji sygnałowej przeciwciała ludzkiego. Nukleotydy 1057 - 1422 (SEQ ID NO: 5), podkreślone, dostarczają korzystną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmienny łańcuch ciężki przeciwciała według niniejszego wynalazku.

Figura 14 podaje sekwencję kwasu nukleinowego dla wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Drukiem tłustym wyróżniono startowe ATG (nukleotydy 1005 - 1007), kodujące startową Met wstawionej sekwencji sygnałowej przeciwciała ludzkiego. Nukleotydy 1065 - 1388 (SEQ ID NO: 6), podkreślone, dostarczają korzystną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmienny łańcuch lekki przeciwciała według niniejszego wynalazku.

Figura 15 przedstawia uszeregowanie sekwencji mysich zmiennych regionów anty-CD40 i sekwencji ludzkiej matrycy. Sekwencje aminokwasów łańcuchów H i L mysich zmiennych regionów antyCD40 wykorzystano do identyfikacji homologicznych sekwencji ludzkiej linii zarodkowej. Numerację reszt i definicję CDR (podkreślone) oparto na pracach Kabata i in. [E.A. Kabat i in.: „Sequences of proteins of immunological interest” (wyd. V), Washington DC, United States Department of Health and Human Services (1991); E.A. Kabat i in., J. Biol. Chem., 252, 6609 - 6616 (1977)]. Odmienności występujące w sekwencjach wskazano liniami pionowymi, a pozycje szkieletu scharakteryzowane w kombinatorycznej bibliotece sekwencji ulegających ekspresji zaznaczono gwiazdką.

Figura 16 pokazuje wyniki miareczkowania humanizowanych wariantów anty-CD40 na immobilizowanym antygenie. Scharakteryzowano otrzymane w wyniku ekspresji bakteryjnej Fab chimerycznego anty-CD40 i wybrane warianty z każdej z bibliotek. Z przestrzeni periplazmatycznej 15 ml hodowli bakteryjnych uwolniono Fab chimeryczne (kółka pełne), Hu I-19C11 (kółka otwarte), Hu II-CW43 (kwadraty otwarte, Hu III-2B8 (trójkąty pełne) oraz nie związane z przedmiotem badań (kwadraty pełne), i kolejne rozcieńczenia współinkubowano z antygenem CD40-Ig immobilizowanym na płytkach do mikromiareczkowania. Wiązanie przeciwciała kwantyfikowano sposobem opisanym w dalszej części niniejszego opisu.

Figura 17 przedstawia korelację powinowactwa przeciwciała z hamowaniem wiązania się rozpuszczalnej gp39 z CD40-Ig. Ligand dla receptora CD40, gp39, wychwycono na płytce do mikromiareczkowania. Następnie, na płytce do mikromiareczkowania, przeprowadzono współinkubację różnych ilości Fab: oczyszczonych chimerycznych (kółka pełne), Hu II-CW43 (kwadraty otwarte), Hu III-2B8 (trójkąty pełne), HU II/III-2B12 (kółka otwarte) i nie związanych z przedmiotem badań (kwadraty pełne), z 2 Lg/ml CD40-Ig. Wiązanie CD40-Ig z gp39 kwantyfikowano sposobem opisanym w dalszej części niniejszego opisu.

Figura 18 przedstawia kwantyfikowanie reszt szkieletowych mysich obecnych w wariantach aktywnych. Zmienne regiony najbardziej aktywnych wariantów anty-CD40 z optymalizacyjnej biblioteki szkieletowej Hi I (A) i optymalizacyjnej biblioteki szkielet/HCDR3 Hu II (B) sekwencjonowano w celu

PL 197 143 B1 zidentyfikowania aminokwasów w pozycjach biblioteki szkieletowej. Każdy unikalny wariant sklasyfikowano w oparciu o całkowitą liczbę reszt mysich utrzymanych w 8 pozycjach bibliotki szkieletowej. Sekwencjonowaniu poddano 34 klony z biblioteki HU I i czternaście klonów z biblioteki Hu II, dzięki czemu zidentyfikowano, odpowiednio, 24 i 10 unikalnych wariantów. Linia ciągła wskazuje rozkład sekwencji oczekiwany na podstawie jednakowej liczby wariantów wybranych losowo.

Twórcy niniejszego wynalazku otrzymali chimeryczne i humanizowane przeciwciała przeciw ludzkiemu CD40 o właściwościach immunosupresyjnych. Takie przeciwciała przeciw ludzkiemu CD40 znajdują oczywiste zastosowania jako leki. Twórcy niniejszego wynalazku otrzymali także ściśle dopasowane mAb przeciw mysiemu CD40 (ściśle dopasowane do mAb przeciw ludzkiemu CD40) użyteczne przy badaniu (na szeregu modeli mysich) skutków leczenia choroby immunologicznej i zapalnej, które to badanie prowadzi się z zastosowaniem mAb anty-CD40. Opracowanie przeciwciał anty-CD40 ulega skomplikowaniu w wyniku tego, że CD40 jest silnie działającą cząsteczką przekazującą sygnały. Przeciwciała, które wiążą się z tym antygenem, można klasyfikować na zasadzie ich zdolności do stymulowania przekazywania sygnałów przez CD40, jak również ich zdolności do blokowania interakcji CD40/gp39.

Opracowane przez twórców niniejszego wynalazku mAb przeciw ludzkiemu CD40, które blokuje interakcję CD40/gp39, wybrano spośród wyczerpująco zestawionego zespołu szeregu mAb antyCD40. Przeciwciało, oznaczone 2.220, schimeryzowano i zhumanizowano. Przeciwciała „chimeryczne” obejmują łańcuch lekki i łańcuch ciężki: łańcuch lekki złożony jest ze zmiennego regionu łańcucha lekkiego i stałego regionu łańcucha lekkiego; łańcuch ciężki złożony jest ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego i stałego regionu łańcucha ciężkiego. Przeciwciała chimeryczne obejmują zmienne regiony pochodzące od jednego gatunku i stałe regiony pochodzące od innego gatunku (na przykład, zmienne regiony mysie połączone ze stałymi regionami ludzkimi). (Patrz, na przykład: patenty Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4816397 i 4816567). Każdy zmienny region łańcucha lekkiego (VL) i zmienny region łańcucha ciężkiego (VH) składa się z regionów „szkieletowych” przerwanych trzema hiperzmiennymi regionami zwanymi „regionami determinującymi komplementarność” (lub „CDR”). Do przeciwciał „humanizowanych” należą przeciwciała z ludzkimi regionami szkieletowymi połączone z CDR pochodzącymi z donorowej immunoglobuliny myszy lub szczura. (Patrz, na przykład: patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5530101). Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem humanizowane przeciwciała obejmujące CDR pochodzące ze zmiennych łańcuchów mysich ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu.

Najprostsze podejście do dokonania humanizacji przeciwciała polega na wszczepieniu do ludzkiego szkieletu CDR pochodzących od donorowego mAb [P.T. Jones i in., Nature, 321, 522 - 525 (1986)]. Jednakże, pewne reszty szkieletu podtrzymują strukturę CDR i wszczepiające antygen kontaktowy mysie CDR na ludzkich matrycach szkieletowych mogą osłabiać wiążącą aktywność wytwarzanego tak humanizowanego mAb [J. Foote i in., J. Mol. Biol., 224, 487 - 499 (1992)].

Oszacowanie potencjalnego wpływu specyficznych reszt szkieletu na powinowactwo przeciwciała nastręcza dwa problemy. Po pierwsze, trudno jest przewidzieć dla poszczególnych mAb jakie reszty szkieletu odgrywają decydującą rolę z utrzymywaniu powinowactwa i swoistości. Po drugie, trudno jest przewidzieć dla tych pozycji szkieletu, które wykazują różnicę między macierzystym mAb a ludzką matrycą, czy aminokwas pochodzący z macierzystej mysiej czy ludzkiej matrycy dostarcza bardziej aktywnego mAb. W rezultacie, sposoby dokonywania humanizacji przeciwciał opierające się wyłącznie na przewidywaniach dotyczących struktury, nie zawsze kończą się powodzeniem.

W dotychczasowym stanie techniki, istnieje opis ogólnej strategii bioinżynieryjnej obróbki przeciwciał, z zaznaczeniem trudności w utrzymaniu aktywności wiązania przeciwciała po jego humanizacji [M.J. Rosok i in., J. Biol. Chem., 271, 22611 - 22618 (1996)]. Potencjalnie ważne reszty szkieletowe, różniące się od macierzystego mAb i matrycy ludzkiej, charakteryzuje się jednoetapowo za pomocą syntezy i doprowadzenia do ekspresji kombinatorycznej biblioteki przeciwciał, obejmującej (w interesujących pozycjach szkieletu) wszystkie możliwe kombinacje aminokwasów pochodzących od macierzystej i ludzkiej matrycy. Warianty wyróżniające się optymalną strukturą szkieletu identyfikuje się przez skrining (badanie przesiewowe), po czym ustala się optymalną strukturę (struktury) szkieletu metodą sekwencjonowania DNA. Typowo, sekwencjonowanie wielu aktywnych klonów pozwala odkryć decydujące pozycje szkieletu, wymagające ekspresji konkretnego aminokwasu. I na odwrót, ekspresja aminokwasu mysiego lub ludzkiego w bibliotecznej pozycji szkieletu, zachodząca z równoważną częstotliwością w klonach aktywnych jest zgodna z mniej ważną funkcją przypisaną dla tej konkretnej pozycji szkieletu. Tak więc, w oparciu o takie funkcjonalne wiązanie się, zostaje szybko zidentyfikowaPL 197 143 B1 na humanizowana wersja przeciwciała monoklonalneo, zachowująca wiążącą aktywność macierzystego mAb.

Procesy humanizacji przeciwciała i „dojrzewania powinowactwa” przeciwciał w miarę formowania się odpowiedzi immunologicznej przeprowadza się często w oddzielnych etapach [rosok (1996), supra; D.E. Yelton i In., J. Immunol., 155, 1994 - 2004 (1995); H. Wu i In., Proc. Natl. AScad. Sci., 95, 6037 - 6042 (1998); M. Baca i In., J. Biol. Chem., 272, 10678 - 10684 (1997); J. D. Marks i in., J. Biol. Chem., 267, 16007 - 16010 (1992)]. Z zastosowaniem zmodyfikowanej strategii opisanej w poniższej części niniejszego opisu, wytworzono wiele humanizowanych odmian mysiego mAb 2.200, wykazujących powinowactwo równoważne powinowactwu wykazywanemu przez chimeryczny Fab, lub nawet lepsze od niego.

Opracowane przez twórców niniejszeg wynalazku chimeryczne przeciwciało anty-CD40 według niniejszego wynalazku określa się w niniejszym opisie jako „chi220”.

Opracowane przez twórców niniejszego wynalazku ściśle dopasowane mAb przeciw mysiemu CD40 według niniejszego wynalazku określa się w niniejszym opisie jako „7E1”.

Opracowane przez twórców niniejszego wynalazku humanizowane przeciwciała anty-CD40 według niniejszego wynalazku określa się w niniejszym opisie jako „F4” i „L3.17”.

Wytworzono także izotypowo odmienne warianty 7E1. Te dwa warianty 7E1 są użyteczne przy badaniu roli części Fc cząsteczki w leczeniu z udziałem mAb anty-CD40 i w przedklinicznych modelach chorób immunologicznych i zapalnych. W niniejszym opisie przedstawiono także wytwarzanie mAb przeciw mysiemu CD40, kryteria stosowane w selekcji przeciwciała dopasowanego do właściwości chi220, wytwarzanie izotypowych wariantów mAb i ich aktywność in vivo w mysich modelach choroby immunologicznej. Badania przeprowadzone na małpach z udziałem zarówno chi220 jak i jego macierzystego mysiego mAb 2.220, oraz badania przeprowadzone na myszach z udziałem 7E1, wykazały, że te mAb anty-CD40 są silnymi środkami immunosupresyjnymi, co zostanie przedyskutowane w sposób bardziej szczegółowy w poniższej części niniejszego opisu. Badania tu opisywane przeprowadzono z wykorzystaniem typowej techniki znanej specjalistom w tej dziedzinie wiedzy.

Podsumowując, wykazano, że opracowane przez twórców niniejszego wynalazku przeciwciała wykazują aktywność polegającą na tłumieniu u małp immunologicznej odpowiedzi humoralnej. Podobnie, dwa izotypowe warianty ściśle dopasowanego mAb przeciw mysiemu CD40, 7E1, wykazały aktywność immunosupresyjną w szeregu przedklinicznych modeli choroby u ludzi. Łącznie więc, odkrycia te wskazują na to, że chi220, F4 i L3.17 są użyteczne pod względem klinicznego zastosowania do leczenia chorób autoimmunizacyjnych i przy transplantacji.

Następujące przykłady podano tylko dla objaśnienia i nie ograniczają one w jakikolwiek sposób zakresu wynalazku, określonego jedynie przez załączone zastrzeżenia.

P r z y k ł a d 1

Selekcja mysiego przeciwciała przeciw ludzkiemu CD40

A. Wyodrębnianie i charakteryzacja in vitro.

Wytworzono zestaw przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiemu CD40 z zastosowaniem typowej technologii hybrydoma, przy użyciu ludzkiego białka fuzyjnego CD40 jako immunogenu. Przeciwciała poddawano skriningowi pod względem wiązania się z CD40 przy użyciu zarówno linii komórek CD40+, jak i białek fuzyjnych. Do scharakteryzowania klonowanych przeciwciał wykorzystano testy wiązania się gp39 z CD40 oraz funkcjonalne testy stymulowania poprzez CD40. Następnie, wyselekcjonowane przeciwciała scharakteryzowano pod względem aktywności krzyżowej z komórkami naczelnych w celu oszacowania przydatności przeciwciał do zastosowania w przedklinicznych modelach naczelnych.

1. Uodpornienie i fuzja.

Przeprowadzono dwie fuzje w celu utworzenia hybrydomów produkujących mAb przeciw ludzkiemu CD40. Dokonano uodpornień w celu wytworzenia limfocytów odpornościowych u 6 - 8-tygodniowych myszy BALB/c, samic, z zastosowaniem jako immunogenu rekombinantowego białka fuzyjnego złożonego z pozakomórkowej domeny ludzkiego CD40 sfuzjowanej ze strukturą stykową, domenami CH2 i CH3 mysiego przeciwciała IgG2b (hCD40-mG2b).

W celu przeprowadzenia fuzji 40-1, mysz wstępnie uodporniono przez podskórne podanie w 3 - 4 miejscach emulsji złożonej z 30 μο hCD40-mG2b w kompletnym adiuwancie Freunda (ogółem 200 μg emulsji). W dniu 21 od podania, zwierzę potraktowano w podobny sposób, podając dawkę podtrzymującą hCD40-mG2b w niekompletnym adiuwancie Freunda, po czym, w dniu 37, poddano je końcowemu prefuzyjnemu uodpornieniu przez dożylne wstrzyknięcie 30 μg hCD40-mG2b w PBS.

PL 197 143 B1

Fuzje 40-2 wykonano w podobny sposób, z tą różnicą, że zamiast adiuwanta Freunda użyto adiuwanta Ribi (R-730). Uodpornienia podtrzymujące przeprowadzono w dniach 21 i 42, z końcową podtrzymującą dawką prefuzyjną w dniu 58.

Po upływie 3 dni od końcowego, podtrzymującego wstrzyknięcia, zebrano leukocyty ze śledziony i węzłów limfatycznych i sfuzjowano, w sposób typowy, we wzajemnym stosunku ilościowym 3 : 1, z mysimi komórkami szpiczaka X63-Ag8.653 [Kearney i in., J. Immunol., 123, 1548 - 1550 (1979); Lane, J. Immunol., 81, 223 - 228 (1985)]. Zawiesiny komórek z każdej fuzji wysiano na 96-studzienkowe płytki do hodowli komórkowych, z gęstością posiewu wynoszącą w przybliżeniu 170000 całkowitych komórek (prefuzja) na studzienkę.

2. Skrining i klonowanie.

Do zidentyfikowania mAb o swoistości względem natywnego ludzkiego CD40 użyto formatów dwutestowych. Supernatanty z hodowli komórkowych ze wszystkich studzienek poddano wstępnie skriningowi pod względem ich zdolności do wiązania się z linią ludzkich komórek B CD40+, transformowanych EBV (1A2-C2), w formacie opartym na technice ELISA. Następnie, każdy supernatant przetestowano w formacie opartym na technice ELISA pod względem reaktywności z oczyszczonym, rekombinantowym białkiem fuzyjnym, złożonym z pozakomórkowej domeny ludzkiego CD40 zfuzjowanej ze strukturą stykową, domenami CH2 i CH3 ludzkiego przeciwciała IgG1, hCD40-Ig, i podobnie skonstruowanym, nie mającym w tym przypadku istotnego znaczenia, ludzkim białkiem fuzyjnym Ig, Leu8-hlg [Hollenbaugh i in., EMBO J., 11,4313 - 4321 (1992)]. Reaktywność z tym pierwszym, a nie z tym ostatnim białkiem fuzyjnym, w połączeniu z danymi dotyczącymi wiązania się komórki, pozwoliła ustalić obecność przeciwciała swoistego dla natywnego CD40 w mniej więcej 200 studzienkach testowych (ang. master wells).

Kluczową właściwością czynnościową wymaganą dla pożądanego mAB anty-CD40 była jego zdolność do całkowitego blokowania wzajemnego oddziaływania CD40 i jego ligandu, a mianowicie gp39. Stąd też, w następnym etapie selekcji przeciwciała, wszystkie swoiste wobec CD40 supernatanty ze studzienek testowych oceniono pod względem ich zdolności do hamowania wiązania się rozpuszczalnego, rekombinantowego, białka fuzyjnego (mysia CD8-ludzka gp39, sgp39), z immobilizowanym hCD40-Ig, w formacie opartym na technice ELISA. Następnie, te supernatanty, które całkowicie hamowały wspomnianą interakcję zmiareczkowano w tym samym formacie w celu ustalenia, które studzienki wykazywały najwyższe miano przeciwciała hamującego. Na podstawie tej analizy, do klonowania wybrano 10 najsilniej hamujących studzienek testowych.

Klonowanie komórek wydzielających odpowiednie przeciwciało przeprowadzono w procesie dwuetapowym. Komórki z każdej studzienki testowej wpierw „miniklonowano” przy gęstości posiewu wynoszącej 10 komórek/studzienkę, a potem swoisty względem CD-40 „miniklon” o najwyższym mianie poddano formalnemu klonowaniu metodą kolejnych rozcieńczeń.

3. Dalsza charakteryzacja.

Dla dalszego scharakteryzowania przeciwciał posłużono się sześcioma formatami testowymi. Były to:

- hamowanie wiązania się sgp39 z ludzkimi komórkami B,

- hamowanie proliferacji komórek B indukowanej przez sgp39 + anty-IgM,

- hamowanie in vitro syntezy przeciwciała przez komórki B indukowanej zaktywowanymi komórkami T,

- bezpośrednia kostymulacja komórek B przez anty-IgM,

- kostymulacja komórek B przez anty-IgM w obecności wiążącego krzyżowo przeciwciała z łańcuchem lekkim typu anty-kappa,

- kostymulacja komórek B przez anty-IgM w obecności drugiego mAb anty-CD40, a mianowicie G28-5. To drugie mAb znane jest z tego, że wykazuje wysoką aktywność kostymulującą i niecałkowite blokowanie interakcji CD40/gp39. Włącza się je, w zastosowaniach porównawczych, do wielu tego typu badań.

Analiza ta doprowadziła do wyselekcjonowania czterech mAb: 1.66 (IgG2b), 2.36 (IgG2a), 2.174 (IgG1) i 2.220 (IgG2a). Testy przeprowadzono w celu scharakteryzowania mAb. W jednym z takich eksperymentów, komórki z linii Raji ludzkich komórek B inkubowano z 2 lub 20 pg/ml rozmaitych mAb anty-CD40, po czym następowała druga inkubacja w nierozcieńczonym supernatancie komórek COS, zawierającym białko fuzyjne mCD8-gp39 (sgp39). Związane sgp39 wykrywano za pomocą dalszej inkubacji komórek z mAb anty-mCD8 znakowanym FITC i analizy komórek na FACScan.

PL 197 143 B1

Obliczano procent zahamowania przez podzielenie średniej fluorescencji próbek inkubowanych z przeciwciałem przez średnią fluorescencję próbek bez przeciwciała w pierwszej inkubacji (fig. 1).

Jak to uwidoczniono na fig. 1, każde z tych czterech mAb było zdolne do całkowitego zahamowania wiązania się białka fuzyjnego sgp39 z linią ludzkich komórek B, w których dochodziło do ekspresji CD40 na wysokim poziomie, aczkolwiek w przypadku 2.174 dla uzyskania całkowitej blokady niezbędne okazało się względnie wysokie stężenie przeciwciała. Podobne dane uzyskano przy użyciu ludzkich migdałkowych komórek B. Dane te porównano w dwóch testach czynnościowych. Po pierwsze, wykazano, że każde mAb było zdolne do całkowitego zablokowania zachodzącej za pośrednictwem sgp39 kostymulacji ludzkich migdałkowych komórek B. Po drugie, każde z nich wyraźnie hamowało wytwarzanie IgG i IgM w in vitro teście obejmującym zależną od komórek T syntezę przeciwciał przez komórki B.

U trzech spośród czterech przeciwciał stwierdzono ograniczoną zdolność do kostymulowania proliferacji komórek B w obecności anty-IgM. mAb 2.220 okazało się bardziej konsekwentne pod względem zdolności do indukowania słabej aktywności kostymulującej. Przy dodaniu przeciwciała z łańcuchem lekkim typu anty-kappa, używanego do sieciowania mAb anty CD40, 2.36 wykazało znaczącą aktywność kostymulacyjną, podczas gdy aktywność innych trzech przeciwciał nie uległa naruszeniu. Wykazano, że zdolność G28-5 do kostymulacji jest modulowana w sposób zróżnicowany w przypadku sparowania go w kombinację z każdym spośród czterech nowych mAb anty-CD40. mAb 1.66, a zwłaszcza 2.174, wzmagały kostymulację G28-5, podczas gdy 2.220 i 2.36 tłumiły ją.

Po przeprowadzeniu selekcji opartej na ocenie w ludzkich układach in vitro, cztery mAb antyCD40 poddano dalszemu badaniu pod względem ich przydatności dla oceny dokonywanej in vivo w trakcie badań nad zwierzęcymi naczelnymi. Dwoma kluczowymi punktami analizy były: względna moc każdego z nich do wiązania się z komórkami B naczelnych oraz tłumienie in vitro zależnej od komórek T syntezy przeciwciał przez komórki B. Stwierdzono, że wszystkie cztery mAb dawały reakcję krzyżową z komórkami B makaka (Macacus fascicularis). Przeciwciała 2.36 i 2.220 wiążą się chętniej niż 2.174 i 1.66. Niższe pozorne wiązanie się mAb 2.174 i 1.66 nie wynikało z ich konkretnego izotypu, ale raczej z innych zademonstrowanych poziomów wiązania się mAb anty-CD40 dopasowanych do izotypu, porównywalnych z 2.36 i 2.220 (na przykład, G28-5 i 2.118). Wyniki te kontrastowały z wynikami uzyskanymi dla ludzkich komórek B, w przypadku których każde z mAb wykazywało porównywalny poziom wiązania się. Stwierdzono, że zdolność omawianych czterech mAb do tłumienia syntezy przeciwciał przez komórki B małp okazuje się równoległa do zdolności wiązania się.

B. Charakteryzacja in vivo.

Przeprowadzono dwa badania na zwierzęcych naczelnych przy użyciu mysich mAb przeciw ludzkiemu CD40 w celu dokonania oceny przydatności anty-CD40 jako środka immunosupresyjnego, a także w celu wyselekcjonowania przeciwciała odpowiedniego do dalszych opracowań. W pierwszym teście, porównano ze sobą klirens i ostrą toksyczność wspomnianych czterech wyselekcjonowanych mAb anty-CD40. Otrzymane wyniki posłużyły do wyselekcjonowania dwóch przeciwciał, a mianowicie 3.36 i 2.220, które następnie przebadano w drugim teście, zaprojektowanym tak, aby dokonać oceny skuteczności hamowania polegającej na wytwarzaniu przeciwciał w odpowiedzi na zadziałanie antygenu zależnego od T i ostrej toksyczności.

Badania skuteczności na naczelnych z udziałem 2.36 i 2.220.

W oparciu o wcześniejsze odkrycia, dokonano oceny mAb 2.36 i 2.220 pod względem ich zdolności do tłumienia zależnej od T odpowiedzi polegającej na wytwarzaniu przeciwciał, po dożylnym podaniu małpom makakom. Badanie to podzielono na trzy fazy (fig. 2). W fazie I małpy, w czterech grupach złożonych z jednego lub dwóch samców i dwu samic makaka w każdej grupie, uodporniono przez dożylne podanie każdemu zwierzęciu, w dniu 1, krwinek czerwonych barana (SRBC), po czym potraktowano w dniach 1, 3 i 5 20 mg/kg mAb 2.36, 2.220, 1.106 (mysia IgGl przeciw ludzkiej gp39, kontrola pozytywna) lub L6 (IgG2a, mysi antygen przeciw ludzkiemu nowotworowi, kontrola negatywna). Oznaczano miano IgM i IgG2 wobec immunogenu SRBC, poziom czynników testowych i kontrolnych w surowicy, obecność przeciwciał przeciw czynnikom testowym i kontrolnym, poziom immunoglobulin w surowicy, liczbę leukocytów w krwi obwodowej oraz częstotliwość występowania rozmaitych subpopulacji limfocytów krwi obwodowej. W fazie II, po zaniku materiałów kontrolnych i testowych, zwierzęta uodporniono przy użyciu SRBC i drugiego antygenu, a mianowicie hemocyjaniny (KLH), dla oszacowania indukcji tolerancji immunologicznej i odwracalności obserwowanej immunosupresji. W fazie III, wybrane zwierzęta powtórnie uodporniono w celu ustalenia, czy odzyskana została, wstępnie stłumiona, odpowiedź polegająca na wytwarzaniu przeciwciała anty-SRBC w następstwie

PL 197 143 B1 dodatkowej prowokacji z udziałem SRBC, a także dla oszacowania wtórnej odpowiedzi, w postaci przeciwciała, na zadziałanie KLH.

Przeprowadzono eksperyment w celu pokazania, że mAb 2.220 wyraźnie tłumił pierwotną odpowiedź na zadziałanie SRBC polegająca na wytwarzaniu przeciwciała (fig. 3). Małpy potraktowano dawkami 20 mg/kg albo mAb 1.106, L6, 2.36 albo 2.220 w fazie I, w dniach 1, 3 i 5. Małpy uodporniano przy użyciu SRBC w dniu 1 fazy I, II i III. Figura 3a pokazuje wyniki badania prób surowicy poddanych analizie na zawartość przeciwciał anty-SRBC, IgM. Dane wyrażono jako geometryczną średnią miana anty-SRBC dla każdej grupy (n = 3 lub 4).

Szczytowa pierwotna odpowiedź ulegała zahamowaniu w 85% i 98% dla, odpowiednio, IgM i IgG. Po klirensie mAb 2.220 w surowicy do poziomu poniżej granicy wykrywalności, szczytowa wtórna odpowiedź na zadziałanie SRBC jeszcze była hamowana w 79% i 56% dla, odpowiednio, IgM i IgG, w porównaniu z odpowiedzią kontroli negatywnej w fazie I. Stanowiło to kontrast wobec kontroli pozytywnej, mAb 1.106, w przypadku której obserwowano silną wtórną odpowiedź na zadziałanie SRBC polegająca na wytwarzaniu przeciwciała. Trzecia odpowiedź na SRBC nie uległa zahamowaniu, co wskazuje na fakt, że mAB 2.220 indukowała wydłużoną w czasie immunosupresję, ale nie tolerancję immunologiczną. Wszystkie zwierzęta uodpornione przy użyciu KLH wykazywały pierwotną i wtórną odpowiedź anty-KLH, co nasuwa sugestię, że immunosupresja była zjawiskiem odwracalnym. Zwierząt potraktowanych 2.36 nie włączono w fazę II, ponieważ w fazie I testu nie zaobserwowano żadnego znaczniejszego efektu hamowania.

Średnie szczytowe stężenie w surowicy, występujące bezpośrednio po podaniu ostatniej dawki, wynosiło 744 i 405 ng/ml dla mAb, odpowiednio, 2.220 i 2.36. Podczas gdy mAb 2.36 zanikało z surowicy do poziomu poniżej granicy wykrywalności najdalej do dnia 15, mAb 2.220 nie zanikało aż do dnia 29. Oba mAb, tak 2.36 jak i 2.220, były immunogenne.

Nie uzyskano żadnych obserwacji klinicznych związanych z lekiem, zmianą masy ciała lub dotyczących spożywania pożywienia, albo zmian w hematologii lub poziomie Ig w surowicy u żadnego ze zwierząt. Jedynym zauważonym zjawiskiem związanym z lekiem były przejściowe, 70% i 43%, zmniejszenia ilości obwodowych komórek B dla mAb, odpowiednio, 2.36 i 2.220. Powrót do normalnego poziomu komórek B następował w okresie 2-3 tygodni po podziałaniu.

Podsumowując, mAb 2.220, inaczej niż 2.36, znacząco tłumiło odpowiedź na zadziałanie SRBC polegającą na wytwarzaniu przeciwciała. Aczkolwiek mAb 2.220 indukowało przedłużoną w czasie immunosupresję swoistą względem antygenu, zjawisko to było odwracalne. Na podstawie tych odkryć, do dalszego opracowania wybrano mAb 2.220.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie chimerycznego przeciwciała chi220

W celu zbadania immunogenności mysiego przeciwludzkiego mAb 2.220, wytworzono postacie rekombinantowe, w których regiony zmienne są sfuzjowane ze stałymi regionami ludzkimi, po czym porównano je pod względem in vitro skuteczności. Przyjęto przy tym dwa podejścia do zagadnienia: wytworzenie przeciwciała chimerycznego, zawierającego nie zmienione mysie regiony zmienne, oraz formy zhumanizowane, w których mysie regiony hiperzmienne (CDR) wszczepione są do ludzkich sekwencji szkieletowych w obrębie regionów zmiennych. Przeciwciała chimeryczne zachowują właściwości macierzystego przeciwciała dotyczące wiązania antygenu, ale w ich przypadku prawdopodobieństwo zaistnienia immunogenności może być większe. Prawdopodobieństwo to w przypadku przeciwciał humanizowanych jest mniejsze, ale mutacje wprowadzone w procesie humanizacji mogą wpłynąć na wiązanie antygenu.

A. Konstrukcja i in vitro charakteryzacja przeciwciał chimerycznych i humanizowanych.

Metodą PCR, z mAb anty-CD40 2.220 otrzymano regiony VL i VH. cDNA wytworzono z RNA wyodrębnionego z komórek hybrydoma, w których zachodzi ekspresja mAb 2.220, przy użyciu antysensownego startera swoistego względem IgG1 lub swoistego względem C„ w celu otrzymania regionów, odpowiednio, VH lub VL. Do tych jednoniciowych DNA dodano ogon poli(G). Następnie, regiony zmienne amplifikowano metodą PCR przy użyciu, jako startera sensownego, oligonukleotydu zawierającego sekwencję poli(C), komplementarną do ogona poli-G, oraz zwarty zespół starterów antysensownych. Następnie, otrzymany produkt PCR wstawiono do wektora bakteryjnego z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych znajdujących się w starterach. Po tym, metodą didezoksy sekwencjonowania nukleotydu sekwencjonowano liczne klony. Przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty, zaczynając od etapu RNA i otrzymane sekwencje były takie same.

PL 197 143 B1

W celu otrzymania chimerycznej formy przeciwciała, zmienne regiony amplifikowano metodą PCR przy użyciu starterów, które wprowadzały sekwencję kodującą sekwencję sygnałową ludzkiego przeciwciała o najściślejszym dopasowaniu do sekwencji 2.220, jak to przedstawiono na fig. 4. Podkreślone części zmiennej sekwencji łańcucha lekkiego (fig. 4a) i zmiennej sekwencji łańcucha ciężkiego (fig. 4b) oznaczają wstawioną sekwencję sygnałową przeciwciała ludzkiego o najściślejszej homologii do mysiej 2.220. Te produkty PCR wstawiono do wektora zawierającego sekwencje kodujące stałe regiony ludzkiego łańcucha kappa lub ludzkiego łańcucha γ1, w celu utworzenia całkowitego łańcucha, odpowiednio, lekkiego lub ciężkiego. Wektory zawierały także odpowiednie geny odporności na leki do generowania i amplifikowania stabilnych linii, w których dochodziłoby do ekspresji białka. Białko do wstępnej charakteryzacji wytworzono metodą czasowej ekspresji z komórek COS, po czym przeprowadzano oczyszczanie białka A.

Przykładowo, linię komórek wytwarzających przeciwciało chimeryczne wytworzono za pomocą kotransfekcji komórek CHO DG44, z oddzielnymi wektorami ekspresji dla łańcuchów, ciężkiego i lekkiego przeciwciała chimerycznego, przy czym do stymulowania kointegracji użyto metody elektroporacji dużej liczby kopii. (Patrz: patent Stanów Zjednoczonych Ameryki 4956288). Łańcuchy ciężki i lekki chi220 klonowano do wektorów ekspresyjnych, odpowiednio, pD17 i pD16. Oba wektory wywodzą się z plazmidu pcDNA3 (InVitrogen) i odznaczają się następującymi cechami znamiennymi (fig. 12): (1) gen oporności na neomycynę z pcDNA3 zastąpiony jest genem mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), pod kontrolą nie zawierającego enhancera promotora SV40 (także określanego jako „osłabiona DHFR”; należy zauważyć, że jedynie promotor był osłabiony, a nie enzym DHFR - nie zawierający enhancera promotor ciągle jeszcze zawiera miejsce inicjacji replikacji SV40, tak, że wektorów tych można użyć w tymczasowych tranfekcjach COS); (2) ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania wywodzi się od promotora CMV, a sygnał poliadenylacji od genu bydlęcego hormonu wzrostu; (3) kaseta ekspresyjna dla genu będącego przedmiotem zainteresowania jest oflankowana sekwencjami terminacji transkrypcji [to znaczy 5' do promotora, a 3' do miejsca poli(A)]; (4) wektory zawierają dwa odmienne polilinkery miejsca restrykcji, jeden 3' do promotora dla klonowania genu będącego przedmiotem zainteresowania, oraz jeden 5' do promotora dla wektora linearyzacji przed transfekcją; (5) gen oporności na ampicylinę i miejsce inicjacji replikacji Co1E1 dla namnażania się plazmidu w E. coli.

Użyte geny łańcucha ciężkiego i lekkiego były to konstrukty genomowe z następującymi modyfikacjami: (1) sekwencje kodujące łańcuch ciężki peptydu sygnałowego, regionu zmiennego i domeny CH1 były ciągłe (to znaczy nie zawierały intronów); oraz (2) sekwencje kodujące łańcuch lekki peptydu sygnałowego i regiony zmienne były ciągłe.

W niniejszym wynalazku brane są pod uwagę także i inne wektory ekspresyjne znane specjalistom w tej dziedzinie wiedzy, zdolne do ekspresji przeciwciała chimerycznego według niniejszego wynalazku. Na fig. 13 pokazano sekwencję kwasu nukleinowego użytecznego w wektorze ekspresyjnym zdolnym do ekspresji łańcucha ciężkiego przeciwciała chimerycznego według niniejszego wynalazku. Na fig. 14 pokazano sekwencję kwasu nukleinowego użytecznego w wektorze ekspresyjnym zdolnym do ekspresji łańcucha lekkiego chimerycznego przeciwciała według niniejszego wynalazku.

Poniżej przedstawiono całkowitą sekwencję aminokwasów łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała chimerycznego („chi220”), włącznie z regionami zmiennymi i stałymi (aminokwasy wyróżnione drukiem tłustym wskazują: region zmienny ciężki i region zmienny lekki):

Sekwencja łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO: 3)

QIQLVQSGPE LKXPGETVRI SCKASGYAFT TTGMQWVQEM PGKGLKWIGW 50

INTHSGVPKY VEDFKGRFAF SLETSANTAY LQISNLKNED TATYFCVRSG 100

NGNYDLA.YFA YW<GQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 150

VKDYFPEPVT VSWSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 200

QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 250

KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYTOGVEVH NAKTKPREEQ 300

YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPJ^IEKT ISKAKGQPRE 350

PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIATOWESNG QPENNYKTTP 400

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQXGN^!3C SVMHEALHNH YTQIKSLSLSP 450

GK 452

PL 197 143 B1

Sekwencja łańcucha lekkiego (SEQ ID NO: 4)

DXVLTQSPAT LSVTPGDRVS ASHSISGIPS RPSGSGSGSD GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD LSSPVTKSFN RGEC

LSCRASQSIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKT 50 FTLSINSVEP EDVGIY?CQH GHSFPWTFGG 100 SDEQLKSGTA SWCILNNFY PREAKVQWKV 150

STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 214

Wytworzono szereg różnych humanizowanych form 220. Proces ten obejmuje identyfikację sekwencji mysiej i ludzkiej linii zarodkowej o najściślejszej homologii z domenami VH i VL. Sekwencji mysiej linii zarodkowej użyto do identyfikacji prawdopodobnych miejsc położenia mutacji somatycznych, które powstały w trakcie procesu dojrzewania powinowactwa. Następnie, sekwencji ludzkich użyto jak matrycy i regiony sekwencje poznane jako ważne pod względem swoistości wiązania, lub podejrzewane o to, zastąpiono w sekwencjach ludzkich przez zarówno VH jak i VL. Następnie, struktury tych sekwencji zmodelowano przy użyciu jako matrycy białka o najściślejszej homologii, którego struktura krystaliczna jest wyjaśniona. Wytworzono plazmidy kodujące formy humanizowane z zastosowaniem mutagenezy kierowanej PCR i użyto ich do otrzymania przeciwciała przez czasową ekspresję z komórek COS. Testy in vitro przeprowadzono z udziałem przeciwciał chimerycznych i humanizowanych według niniejszego wynalazku i otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 5. Figura 5a pokazuje wyniki badań nad wiązaniem przy testowaniu wiązania się chi220 i h220v3 z hCD40-mGb2b w oparciu o technikę ELISA. Studzienki płytek Immulon-2 powleczono hCD40-mG2b w stężeniu 10 ng/ml w PBS na 2 godziny. Studzienki zablokowano Specimen Diluent (Genetic Systems) i dodano przeciwciała we wskazanych stężeniach. Po upływie 1-godzinnej inkubacji, studzienki przemyto i dokonano detekcji przeciwciała przy użyciu skoniugowanego z peroksydazą koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG. H220v3 jest to zhumanizowana forma mAb 2.220. Podane wartości są to średnie z duplikatów studzienek, a słupki błędu wyobrażają odchylenie standardowe.

Figura 5b pokazuje wyniki badań, w których testowano zahamowanie zachodzącej za pośrednictwem sgp39 kostymulacji ludzkich komórek B przez mAB przeciw ludzkiemu CD40. Ludzkie migdałkowe komórki B w spoczynku (50000/studzienkę) inkubowano z białkiem fuzyjnym sgp39, 20 pg/ml immunogranulek pokrytych króliczą przeciwludzką IgM i wskazanymi stężeniami mAbs anty-CD40 lub tylko podłoża (kontrola), w 96 studzienkach. Po upływie 72 godzin od zapoczątkowania hodowli, wszystkie studzienki znakowano impulsowo [³H]tymidyną, (1 pCi/studzienkę), po czym hodowlę komórek prowadzono jeszcze w ciągu 18 godzin. Następnie, komórki zebrano i ilość włączonej [³H]tymidyny zmierzono przy użyciu licznika scyntylacyjnego.

Na podstawie wyników opisanych tu in vitro testów (fig. fig. 5a i 5b, pokazujące skuteczne wiązanie się tak chimerycznego, jak i humanizowanego przeciwciała z CD40 i zahamowaną stymulację komórek B), do dalszego opracowania wybrano przeciwciało chimeryczne.

P r z y k ł a d 3

Skuteczność działania chi220

A. Chimeryczne mAb 2.220: badanie skutków działania dawki pojedynczej u naczelnych zwierzęcych.

W badaniach z udziałem małp makaków dokonano oceny chi220 pod względem zdolności do tłumienia pierwotnych i wtórnych immunologicznych odpowiedzi humoralnych na zadziałanie antygenów zależnych od komórek T.

W teście pierwszym, małpy (w grupach po cztery sztuki) uodporniano krwinkami czerwonymi barana (SRBC) i poddawano wtórnemu uodpornianiu owoalbuminą (OVA) tuż przed zaaplikowaniem pojedynczego dożylnego bolusa albo chi220 w dawce 10, 40 lub 100 mg/kg, albo jałowej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako kontroli. Dla wszystkich trzech poziomów dawkowania zaobserwowano zasadniczą supresję pierwotnej immunologicznej odpowiedzi humoralnej na zadziałanie SRBC, co pokazuje skuteczność działania chi220 u naczelnych. Stwierdzono zależną od dawki czasową utratę komórek B krwi obwodowej u wszystkich małp potraktowanych chi220, przy czym czas upływający do odzyskania pierwotnego poziomu również był zależny od dawki. Przy dwu najwyższych dawkach zaobserwowano czasowe, łagodne zmniejszenie grupowo średniej wartości absolutnej liczby komórek T krwi obwodowej. Stwierdzono czasowe minimalne zmniejszenie poziomu IgM w surowicy, bez związanych z lekiem zmian w poziomie IgG lub IgA w surowicy.

PL 197 143 B1

W celu oszacowania indukcji tolerancji immunologicznej i odwracalności aktywności immunosupresyjnej, wszystkie małpy uodporniono przy użyciu OVA, SRBC i neoantygenu, hemocyjaniny (KLH), w dniu 149, gdy poziom chi220 w surowicy w grupie 100 mg/kg był poniżej poziomów uznanych za immunosupresyjne (~10 ug/ml) i liczba komórek B krwi obwodowej powróciła do poziomu sprzed dawkowania. Odpowiedź anty-SRBC przy najniższym poziomie dawek była na ogół porównywalna z pierwotną odpowiedzią anty-SRBC u małp kontrolnych. Jednakże, odpowiedź w postaci przeciwciała na zadziałanie SRBC była ciągle jeszcze, częściowo lub w zasadniczym stopniu, stłumiona u małp potraktowanych lekiem na dwóch najwyższych poziomach dawkowania.

W drugim teście, przeprowadzonym w celu dalszego badania zależności immunosupresji i ubytku komórek B od wielkości dawki, dodatkowe małpy (po cztery w grupie) uodporniono SRBC, po czym podano im pojedynczą dawkę chi220 wynoszącą 0,1 lub 1,0 mg/kg, albo PBS. Dla obu poziomów dawkowania zaobserwowano suboptymalną immunosupresję odpowiedzi polegającej na wytwarzaniu przeciwciała przeciw SRBC. Stwierdzono umiarkowany ubytek komórek B krwi obwodowej u małp, które otrzymały 1,0 mg/kg chi220, do dnia 8, z odwracaniem tego do dnia 29. Przy dawce 0,1 mg/kg zaobserwowano zmniejszenie średniej liczby i procentu komórek B krwi obwodowej, ale wartości te nie przekraczały normalnych znanych dotychczas zakresów dla procentu komórek B. Nie zostały ustalone te dotychczasowe granice dla absolutnych liczb komórek B krwi obwodowej. Czasowe minimalne zmniejszenia liczby komórek T krwi obwodowej i łagodne zmniejszenia proliferacji komórek T ex vivo stwierdzono u tych małp, które otrzymały chi220 w dawce wynoszącej 1 mg/kg. W końcu nie znaleziono dowodu na aktywację komplementu lub na zmiany związane z lekiem, jeśli chodzi o poziom IL-6 lub TNFa w surowicy. W przypadku małp otrzymujących dawki chi220 wynoszące 10, 40 lub 100 mg/kg, nie oceniano ex vivo aktywacji komórek T, aktywacji komplementu i poziomu cytokiny we krwi.

W obu tych testach próbki surowicy badano, po podaniu chi220, pod względem krążeniowych poziomów materiału testowanego oraz w celu dokonania oceny tworzenia przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu. Analiza farmakokinetyczna wykazała, że średnie szczytowe stężenie (Cmax) chi220 w surowicy nie wzrasta proporcjonalnie do przyrostu dawki oraz, że okres półtrwania chi20 stawał się coraz to dłuższy w miarę zwiększania się stosowanej dawki. Stwierdzono, że chi220 był immonogenny w przypadku podawania go w dawce wynoszącej 0,1, 1 lub 10 mg/kg. Okazuje się, że przy krążeniowych stężeniach powyżej 10 ug/kg, chi220 może tłumić odpowiedź polegającą na tworzeniu przeciwciała skierowanego przeciw niemu.

1. Protokół eksperymentu.

W pierwszym ze wspomnianych powyżej testów, małpy makaki poprzydzielano do czterech grup złożonych, każda, z dwóch samców i dwu samic. Wszystkie małpy uodporniono na 28 dni przed podaniem chi220 lub czynnika kontrolnego przy użyciu OVA (5 mg/kg, i.m. oraz 10 mg/kg s.c.). W dniu 1, wszystkie małpy uodporniono przy użyciu SRBC (1,7 mg/kg 10% zawiesiny, i.v.), i poddano je powtórnemu uodpornianiu przy użyciu OVA (5 mg/kg, i.m. oraz 10 mg/kg, s.c.), tuż przed podaniem pojedynczego dożylnego bolusa albo chi220 (w dawce 10, 40 lub 100 mg/kg), albo jałowej PBS jako kontroli. W dniu 149, po obniżeniu się poziomu chi220 w surowicy poniżej domniemywanego poziomu immunsupresji (~10 ug/ml) i po powrocie poziomu komórek B krwi obwodowej do wartości przeddawkowej we wszystkich grupach zwierząt, małpy uodporniono z zastosowaniem OVA, SRBC i KLH (10 mg/zwierzę, i.m.). Celem uodpornienia przy użyciu KLH było wykazanie, że małpy posiadały zdolność rozwijania odpowiedzi immunologicznej na neoantygen po potraktowaniu chi220.

W drugim teście, w celu zademonstrowania lepszej odpowiedzi na dawkę w odniesieniu do immunosupresji i ubytku komórek B we krwi obwodowej, dodatkowe małpy użyte w układzie (dwie/płeć/grupę) uodporniono przy użyciu SRBC, po czym podano im pojedynczą dawkę albo chi220 (0,1 lub 1,0 mg/kg), albo PBS jako kontrolę (dzień 1). W trakcie obu tych badań, w wybranych punktach czasowych monitorowano parametry hematologiczne i subpopulacje limfocytów krwi obwodowej. Chemiczne parametry surowicy monitorowano u tych małp, które otrzymały chi220 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg, ale nie 0,1 i 1 mg/kg, ponieważ przy wyższych dawkach nie zauważono zjawisk związanych z lekiem. Oprócz tego, mierzono poziom IgM, IgG, IgA i ch220 w surowicy. Dla oceny skuteczności działania, w odpowiednich próbkach surowicy pobranych tuż przed podaniem immunogenu oraz po podaniu, co tydzień, oznaczano powstawanie swoistych przeciwciał klasy IgM i IgG przeciw immunogenom SRBC i OVA. Tworzenie swoistego przeciwciała klasy IgM i IgG o aktywności skierowanej przeciw testowanemu materiałowi u małp, które otrzymały chi220 oceniano przed podaniem substancji testowanej w dniu 1 i następnie cotygodniowo. Przy porównywaniu odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciał między poszczególnymi grupami, stosowano średnie geome16

PL 197 143 B1 tryczne mian. Poza tym, mierzono całkowitą hemolityczną aktywność komplementu (CH₅₀) i poziom fragmentu C4d, a także poziom TNF-α i IL-6 u małp otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 0,1 lub 1 mg/kg w wybranych punktach czasowych po podaniu chi220. Oceniano także ex vivo aktywację komórek T krwi obwodowej po stymulacji konkanawaliną A u małp otrzymujących chi220 w dawkach wynoszących 0,1 i 1 mg/kg w dniu 17 i 31, dla oszacowania skutków oddziaływania chi220 na reaktywność komórek T wobec mitogenu. W końcu, wszystkie małpy poddawano codziennej obserwacji pod względem klinicznych objawów toksyczności, masę ciała rejestrowano co tydzień, a spożycie karmy monitorowano codziennie.

Małpy uodporniano SRBC przed otrzymaniem vehiculum lub chi220 [w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg (fig. 6a), lub w dawce wynoszącej 0,1 lub 1 mg/kg (fig. 6b)] w dniu 1. Próbki surowicy analizowano na obecność przeciwciał anty-SRBC klasy IgM z wykorzystaniem techniki ELISA. Otrzymane dane wyrażono jako średnią geometryczną miana przeciwciała anty-SRBC w punkcie końcowym miareczkowania (EPT) dla każdej grupy [n = 2 (grupa 100 mg/kg, poza dniem 15) lub 4], przy czym wartość EPT jest równoważna odwrotności największego rozcieńczenia surowicy, z absorbancją większą niż dwukrotna wartość średnia tła płytki.

2. Wyniki.

a. Odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC.

W przypadku podania małpom chi220 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg, chi220 okazało się skuteczne, jeśli chodzi o zasadnicze tłumienie pierwotnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała o aktywności skierowanej przeciw SRBC. W szczytowym dniu kontrolnej pierwotnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgM (dzień 8), średnia pierwotna odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgM była stłumiona w przybliżeniu w 92 - 94% u małp potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg, w porównaniu z kontrolami (fig. 6a). Grupowo średnia odpowiedź, polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgM, nie stała się dodatnia przez 85 dni przy dawce na poziomie 10, 40 lub 100 mg/kg. W szczytowym dniu kontrolnej pierwotnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgG (dzień 15), średnia pierwotna odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgG była stłumiona w przybliżeniu w 98%, 99% i 85% u małp potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej, odpowiednio, 10, 40 lub 100 mg/kg, w porównaniu z kontrolami (fig. 7a). Wyższe całościowe przeddawkowe miana przeciwciała anty-SRBC w grupie 100 mg/kg można przypisać oczywistemu brakowi immunosupresji zależnej od dawki. Ogólnie, małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej 10 lub 100 mg/kg nie rozwijają pierwotnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgG przez 85 dni. Jednakże, dwie małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej 40 mg/kg wykazały opóźnioną pierwotną odpowiedź w postaci wytworzenia przeciwciała anty-SRBC klasy IgG (porównywalną pod względem rzędu wielkości z odpowiedzią kontroli), która stała się dodatnia do dnia 36, a osiągnęła szczyt w dniu 51.

W dniu 149, po obniżeniu się poziomu chi220 w surowicy poniżej domniemywanej wartości poziomu immunosupresji (~10 ąg/ml) i po powrocie poziomu komórek B krwi obwodowej do wartości przeddawkowej we wszystkich grupach zwierząt, małpy uodporniono po raz drugi przy użyciu SRBC. Jak oczekiwano, małpy kontrolne rozwinęły silną wtórną odpowiedź na zadziałanie SRBC w postaci wytworzenia przeciwciała klasy IgG. Małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej 10 mg/kg rozwijały pierwotne odpowiedzi na zadziałanie SRBC w postaci wytworzenia przeciwciał klasy IgM i IgG, na ogół porównywalne z pierwotnymi odpowiedziami, polegającymi na wytwarzaniu przeciwciał, u małp kontrolnych. Jednakże, odpowiedź na zadziałanie SRBC, polegająca na wytworzeniu przeciwciała, ciągle jeszcze była tłumiona w przypadku dawki wynoszącej 40 mg/kg i w zasadniczym stopniu stłumiona w przypadku dawki wynoszącej 100 mg/kg. Aczkolwiek dwie małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej 40 mg/kg (które pierwotnie rozwinęły słabe, polegające na wytworzeniu przciwciała, odpowiedzi na zadziałanie SRBC) ujawniły miana przeciwciał anty-SRBC klas IgM i IgG charakterystyczne dla wtórnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciał, to jednak odpowiedzi, polegające na wytworzeniu przeciwciał anty-SRBC, u dwu innych małp w tej grupie i u małp pozostałych potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej 100 mg/kg ciągle jeszcze były w około 90% stłumione w porównaniu ze średnią pierwotną, polegającą na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC, odpowiedzią u małp kontrolnych.

Suboptymalną immunosupresję odpowiedzi na zadziałanie SRBC, polegającej na wytworzeniu przeciwciała, zaobserwowano po podaniu chi220 w dawce wynoszącej 0,1 mg/kg (fig. fig. 6a i 7b). Podczas gdy wszystkie potraktowane chi220 małpy rozwinęły dodatnią odpowiedź na zadziałanie

PL 197 143 B1 antygenu SRBC polegającą na wytworzeniu przeciwciała klasy IgM, ogólna średnia szczytowa odpowiedź w postaci wytworzenia przeciwciała anty-SRBC klasy IgM ulegała supresji wynoszącej w przybliżeniu 56% u małp potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej 1 mg/kg, w porównaniu ze średnią odpowiedzią szczytową. Nie zaobserwowano żadnej supresji odpowiedzi, polegającej na wytworzenia przeciwciała anty-SRBC klasy IgM, u małp potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej 0,1 mg/kg. Średnia odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgM osiągała szczyt w dniu 15 u małp kontrolnych, a u małp otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 0,1 i 1 mg/kg w dniu 8. Ogólnie, średnia szczytowa odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgG ulegała 56% i 42% supresji u małp potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej, odpowiednio, 0,1 i 1,0 mg/kg. Średnia odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-SRBC klasy IgG osiągała szczyt w dniu 15 u małp kontrolnych i małp otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 1 mg/kg, a u małp otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 0,1 mg/kg w dniu 8.

b. Odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-OVA.

Małpom podano dożylnie chi220 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg, w dniu 1. Oprócz tego, wszystkie małpy uodporniono przy użyciu OVA w dniach 28, 1 i 149. Próbki surowicy analizowano w aspekcie przeciwciał anty-OVA klasy IgM (fig. 8a) lub IgG (fig. 8b). Otrzymane dane wyrażono jako średnią geometryczną miana przeciwciała anty-OVA w punkcie końcowym miareczkowania (EPT) dla każdej grupy [n = 2 (grupa 100 mg/kg, poza dniem 15) lub 4], przy czym wartości EPT są równoważne odwrotnościom największego rozcieńczenia surowicy, z absorbancją większą niż dwukrotna wartość średnia wartości tła płytki.

Tworzenie swoistych przeciwciał anty-OVA klasy IgM i IgG monitorowano co tydzień w trakcie testu na małpach otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg. Pierwotna i wtórna odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciał anty-OVA była wysoce zmienna i, na ogół, słaba u wszystkich małp (fig. 8). Małpy wyznaczone do przyjmowania chi220 w dniu 1 wykazywały wyższe miana przeciwciała anty-OVA niż małpy z grupy kontrolnej.

W dniu 149, małpy poddano trzeciemu uodpornianiu z udziałem OVA. Wszystkie małpy rozwinęły pozytywną odpowiedź polegającą na wytworzeniu przeciwciała anty-OVA klasy IgG w ciągu 7 dni od prowokacji. Małpy kontrolne i małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej 10 mg/kg wykazywały miano przeciwciała charakterystyczne dla trzeciorzędowej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała, podczas gdy małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej albo 40, albo 100 mg/kg wykazywały miana przeciwciała bardziej charakterystyczne dla wtórnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała.

c. Odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała anty-KLH.

Małpom podano dożylnie chi220 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg, w dniu 1. Oprócz tego, wszystkie małpy uodporniono przy użyciu KLH w dniu 149. Próbki surowicy analizowano w aspekcie przeciwciał anty-KLH klasy IgM (fig. 9a) lub IgG (fig. 9b). Otrzymane dane wyrażono jako średnią geometryczną miana przeciwciała anty-KLH w punkcie końcowym miareczkowania (EPT) dla każdej grupy [n = 2 (grupa 100 mg/kg, poza dniem 15) lub 4], przy czym wartości EPT są równoważne odwrotnościom największego rozcieńczenia surowicy, z aborbancją większą niż dwukrotna wartość średnia wartości tła płytki.

W dniu 149, po obniżeniu się poziomu chi220 w surowicy poniżej domniemywanej wartości poziomu immunosupresji (~10 pg/ml) i po powrocie poziomu komórek B krwi obwodowej do wartości przeddawkowej we wszystkich grupach zwierząt, małpy uodporniono przy użyciu KLH (10 mg/zwierzę,

i.m.). Wszystkie małpy rozwinęły pozytywną odpowiedź na zadziałanie KLH w postaci wytworzenia przeciwciał klas IgM i IgG, wykazując w ten sposób, że zdolność do odpowiedzi na zadziałanie nowego antygenu nie została narażona na uszczerbek (fig. 9).

d. Poziom materiału testowanego i odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu w surowicy.

Próbki surowicy poddano badaniu po podaniu chi220, w celu określenia krążeniowych poziomów materiału testowanego i dla oszacowania tworzenia przeciwciała o aktywności skierowanej przeciw materiałowi testowanemu. Średnie szczytowe stężenie chi220 w surowicy (Cmax) wystąpiło po upływie 3 minut od podania dawek wynoszących 10 lub 40 mg/kg, i po upływie 6 godzin od podania dawki wynoszącej 100 mg/kg. Wartości Cmax dla chi220 wynosiły: 329, 2429 i 2343 pg/ml u małp potraktowanych chi220 w dawkach wynoszących, odpowiednio, 10, 40 lub 100 mg/kg. Jednakże, wystąpiło tu znaczne odchylenie wartości Cmax u poszczególnych małp w grupach 40 mg/kg i 100 mg/kg. Oznaczono średni okres półtrwania chi220 w surowicy i wynosił on, w przybliżeniu, 114, 173 i 315

PL 197 143 B1 godzin u małp potraktowanych chi220 w dawkach wynoszących, odpowiednio, 10, 40 lub 100 mg/kg. Średnie wartości Cmax po upływie 3 minut od podania chi220 wynosiły 1,77 i 33 ng/ml dla dawek, odpowiednio, 0,1 i 1 mg/kg. Dla każdego poziomu dawkowania nie zaobserwowano żadnych powiązanych z płcią różnic poziomu chi220 w surowicy. Średnie wartości AUC_inf wynosiły 15,5 i 847 ng.h/ml dla dawek, odpowiednio, 0,1 i 1 mg/kg. Łącznie, wyniki badań nasuwają sugestie, że w miarę zwiększania się stosowanej dawki, wydłuża się okres półtrwania chi220. Następnie, wydaje się, że wartość Cmax chi220 zwiększa się w sposób nieproporcjonalny do przyrostu dawki.

Aczkolwiek nie wystąpiła tu odpowiedź w postaci immunoglobuliny klasy IgM o swoistości skierowanej przeciw materiałowi testowanemu, względnie była ona tylko minimalna, u małp otrzymujących chi200 w dawce wynoszącej 10, 40 lub 100 mg/kg, to u małp, którym podano chi220 w dawce wynoszącej 10 mg/kg, zaobserwowano wyraźną odpowiedź polegającą na wytworzeniu przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu klasy IgG. Średnia odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu klasy IgG u małp otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 10 mg/kg stawała się pozytywna w dniu 29, mniej więcej po upływie tygodnia od spadku grupowo średniej wartości stężenia chi220 w surowicy poniżej 10 ng/ml i osiągała wartość szczytową w dniach 36 i 43 przy średniej geometrycznej miana wynoszącej 12,627. Pojawienie się przeciwciał przeciw materiałowi testowanemu klasy IgG u małp potraktowanych chi220 w dawce wynoszącej 10 mg/kg było także zgodne z pierwszymi wykrywalnymi wzrostami liczby komórek B zachodzącymi po ich utracie. Do ostatniego dnia pomiaru (dzień 149) małpy otrzymujące chi220 w dawce wynoszącej 40 lub 100 mg/kg jeszcze nie rozwinęły pozytywnej odpowiedzi polegającej na wytworzeniu przeciwciała przeciw chi220, aczkolwiek grupowo średnie poziomy chi220 w surowicy znajdowały się poniżej 10 ng/ml do dnia 57 (grupa 40 mg/kg) lub dnia 92 (grupa 100 mg/kg).

Chi220 był immunogenny przy podawaniu w dawce wynoszącej 0,1 lub 1 mg/kg. Trzy lub cztery małpy, które otrzymywały chi220 w dawce wynoszącej albo 0,1, albo 1 mg/kg, wykazywały słabe dodatnie odpowiedzi, polegające na wytworzeniu przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu klasy IgM, do dnia 15 w trakcie testu. Trzy lub cztery małpy potraktowane chi220 w dawce wynoszącej 1 mg/kg wykazywały znaczące odpowiedzi polegające na wytworzeniu przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu klasy IgG do dnia 22, z osiągnięciem wartości szczytowych przy geometrycznej średniej punktu końcowego miareczkowania wynoszącego 16618. Ogólnie, geometrycznie średnia odpowiedź polegająca na wytworzeniu przeciwciała przeciw materiałowi testowanemu klasy IgG nie była pozytywna u małp otrzymujących chi220 w dawce wynoszącej 0,1 mg/kg, i tylko małpa, która otrzymała chi220 w dawce wynoszącej 0,1 mg/kg, wykazała pozytywną odpowiedź polegającą na wytworzeniu przeciwciała, osiągając wartość szczytową przy punkcie końcowym miareczkowania wynoszącym 2430 w dniu 22. Łącznie, dane te nasuwają sugestię, że chi220 jest zdolne do immunosupresyjnego oddziaływania na odpowiedź polegającą na wytworzeniu przeciwciała przeciw sobie samemu, przy poziomie w surowicy wyższym od mniej więcej 10 ng/ml.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał anty-CD40 F4 i L3.17

Do przeprowadzenia humanizacji przeciwciał monoklonalnych (mAb) wykorzystano szereg różnych metod znanych w tej dziedzinie techniki. Użyteczne okazały się podejścia do zagadnienia oparte na strukturze, ale zakres powodzenia zmniejszyły powikłania wynikające z dużej liczby reszt szkieletowych potencjalnie zaangażowanych w aktywności wiązania się. Raczej niż przewidywania dotyczące optymalnego szkieletu oparte na modelowaniu, podejście oparte na bibliotece przeciwciał, opisane poniżej, umożliwia identyfikację aktywnych konformacji szkieletu na podstawie badań przesiewowych czyli skriningu wielu kombinacji. Podejście mutagenetyczne powiązane z metodami selekcyjnymi umożliwia analizę wielu wariantów i naśladuje zachodzący in vivo proces dojrzewania [przegląd w: J.D. Marks i in., J. Biol. Chem., 267, 16007 - 16010 (1992)]. Mutageneza kodonowa umożliwia kontruowanie bibliotek charakteryzujących się udziałem swoistych reszt i przez to jest bardziej efektywna od podejścia uwzględniającego mutagenezę losową. I tak, na przykład, skłonnej do błędów metody PCR nie można użyć do syntezy kombinatorycznych bibliotek szkieletowych opisanych w poniższej części niniejszego opisu. Ponadto, mutageneza losowa prowadzi do utworzenia większych, bardziej zróżnicowanych bibliotek i, niestety, większość mutacji nie wzmaga aktywności wiązania mAb. W rezultacie, dla zidentyfikowania wariantów aktywnych należy dokonać skriningu dużej liczby klonów.

Do wyodrębnienia ludzkich mAb z fagowej biblioteki prezentacyjnej, w procesie dwuetapowym, z zastosowaniem mAn gryzonia jako matrycy, posłużono się strategią zwaną „selekcją kierowaną” [L.S. Jespers i in., Bio/Technology, 12, 899 - 903 (1994)]. Ostatnio, opisano odmianę selekcji kierowaPL 197 143 B1 nej, stosującą fagowe technologie prezentacyjne, w których używa się chimerycznego fragmentu Fd do wyselekcjonowania łańcucha L z biblioteki obejmującej ludzkie łańcuchy L z wszczepionym mysim regionem CDR3 [C. Rader i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8910 - 8915 (1998)]. W następstwie, najbardziej aktywnego łańcucha L użyto do wyselekcjonowania łańcucha H z ludzkiej biblioteki łańcuchów H, zawierającej mysi HCDR3. mAb wyodrębnione w takim rozwiązaniu są wyłącznie ludzkie (Jespers, wyżej) lub w większości ludzkie (Rader, wyżej), ale wielka różnorodność przeciwciał wprowadzanych w każdym etapie procesów zmusza do zastosowania metod wzmagania powinowactwa.

Wykorzystano następujące materiały i metody do wytworzenia humanizowanych przeciwciał anty-CD40 F4 i L3.17 według niniejszego wynalazku.

1. Konstrukcja chimerycznego anty-CD40.

W oparciu o sekwencję mysiego mAb anty-CD40 2.220 zsyntetyzowano i oczyszczono zachodzące wzajemnie na siebie oligonukleotydy kodujące Vh i Vl (długość 69 - 75 zasad). Oddzielnie zsyntetyzowano zmienne domeny H i L za pomocą połączenie ze sobą 25 pmoli każdego z zachodzących wzajemnie na siebie oligonukleotydów przy użyciu polimerazy DNA Pfu (Stratagene) w 50 μΙ mieszaniny reakcyjnej PCR, przy czym cały proces złożony był z 5 cykli obejmujących: denaturację w temperaturze 94°C w ciągu 20 sekund, sprzęganie w temperaturze 50°C w ciągu 30 sekund, podwyższanie temperatury do 72°C w ciągu 1 minuty i utrzymywanie w temperaturze 72°C w ciągu 30 sekund. Następnie, na 25 cykli, temperaturę sprzęgania podwyższono do 55°C. Do dalszego amplifikowania 1 μl produktu fuzyjnego w 100 μl mieszaniny reakcyjnej PCR, przy zastosowaniu tego samego programu, użyto odwrotnego startera i poddanego obróbce biotyną startera „w przód”. Otrzymane produkty poddano oczyszczaniu metodą elektroforezy w żelu agarozowym, a potem elektroelucji i następnie fosforylowano je przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 (Boehringer Mannheim), po czym inkubowano z kulkami streptawidynowo-magnetycznymi (Boehringer Mannheim) w 5 mM Tris-Cl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl i 0,05% Tween 20, w ciągu 15 minut, w temperaturze 25°C. Kulki przemyto i nie biotynylowany DNA „nić minus” eluowano przez inkubację z 0,15 M NaOH w temperaturze 25°C, w ciągu 10 minut. Zsyntetyzowano chimeryczny Fab anty-CD40 w zmodyfikowanym wektorze M13IX104 [K. Kristensson i in.: „Vaccines 95”, str. 39 - 43, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1995)] o nazwie M13IX104CS, za pomocą mutagenezy hybrydyzacyjnej [M.J. Rosok i in., J. Biol. Chem., 271, 22611 - 22618 (1996); T.A. Kunkel, proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 - 492 (1985)] przy użyciu oligonukleotydów Vh i Vl w 3-krotnym molowym nadmiarze urydynylowanej matrycy wektorowej. Wektor M13IX104 zmodyfikowano przez zastąpienie seryną reszt cysteiny na końcu stałych regionów kappa i γ 1. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono metodą elektroporacji do komórek DH10B i zmiareczkowano na warstwie XL-1 Blue.

2. Konstrukcja kombinatorycznej biblioteki szkieletowej i szkielet/CDR3.

Kombinatoryczną bibliotekę szkieletową (Hu I) zsyntetyzowano w taki sam sposób, jakiego użyto do skonstruowania chimerycznego anty-CD40, ale z pewnymi modyfikacjami. Zsyntetyzowano zachodzące wzajemnie na siebie oligonukleotydy kodujące szkieletowe regiony zmiennych domen H i L ludzkiej matrycy i mysich CDR anty-CD40, według definicji podanej przez Kabata i in. [E.A. Kabat: “Sequences of proteins of immunological interest” (wyd. V), Washington DC, United States Department of Health and Human Services; E.A.Kabat i in., J. Biol. Chem., 252, 6609 - 6616 (1977)]. Zsyntetyzowano też oligonuklotydy zdegenerowane, kodujące zarówno mysie jak i ludzkie aminokwasy w siedmiu pozycjach Vh i jednej Vk szkieletu (fig. 15, reszty zaznaczono gwiazdkami).

Biblioteki szkielet/HCDR3 (Hu II) i szkielet/HCDR3/LCDR3 (Hu III) zsyntetyzowano w taki sam sposób jak w przypadku kombinatorycznej biblioteki szkieletowej, ale z pewnymi modyfikacjami. Do muta^genez^y u^żyto nast^ępn^yc^h w^yse^le^kcjonowan^yc^h resz^t CD^R: ^Ser⁹⁵-^Tyr¹⁰² w ^{HCDR3 i} G^-W⁹⁷w LCDR3 (fig. 15, podkreślono). Oligonukleotydy kodujące HCDR3 i LCDR3 przeznaczono do mutowania pojedynczej reszty CDR i zsyntetyzowano za pomocą wprowadzenia NN(G/T) w każdą pozycję, jak to opisano w dotychczasowym stanie techniki [S.M. Glaser i in., J. Immunol., 149, 3903 - 3919 (1992)]. Zachodzące wzajemnie na siebie Oligonukleotydy kodujące bibliotekę szkieletową i nie stanowiące biblioteki mysie CDR połączono z 25 pmolami oligonukleotydów kodujących zmutowane HCDR3 lub z 25 pmolami każdego z oligonukleotydów kodujących zmutowane HCDR3 i LCDR3.

3. Badanie przesiewowe fagowych bibliotek ekspresyjnych

Biblioteki HuII i HuIII poddano wstępnie skriningowi wykorzystując zmodyfikowane, znane w tej dziedzinie techniki podejście polegające na podnoszeniu łysinek, nazywane „podniesienie z wychwytem” (ang. „capture lift”) [J.D. Watkins i in., Anal. Biochem., 256, 169 - 177 (1998)]. Mówiąc krótko, filtry celulozowe (82 mm) pokryto kozim przeciwludzkim kappa, zablokowano 1°% BSA i naniesiono na

PL 197 143 B1 płytkę z agarem zawierającym warstwę bakterii zakażonych fagiem. W skriningu wstępnym, fagi posiewano z zachowaniem gęstości 10⁵ fagów/100 mm płytkę. Po wychwyceniu przez filtry wariantu Fab anty-CD40 wytworzonego w wyniku ekspresji zachodzącej z udziałem fagów, filtry inkubowano w ciągu 3 godzin w temperaturze 25°C z 5 ng/ml CD40-Ig w PBS zawierającej 1% BSA. Następnie filtry wypłukano 4 razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20 i inkubowano z koniugatem kozia przeciwmysia IgG2b-fosfataza alkaliczna (Southern Biotechnology) rozcieńczonym 3000-krotnie w PBS zawierającej 1% BSA, w ciągu godziny, w temperaturze 25°C. Następnie filtry przemyto cztery razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20 i wywołano sposobem opisanym [Watkins (1998), wyżej]. W celu wyodrębnienia poszczególnych klonów, łysinki pozytywne ze wstępnego skriningu powybierano i powtórnie wysiano przy mniejszej gęstości (<10³ fagów/100 mm płytkę), po czym poddano skriningowi w takim samym rozwiązaniu.

Kombinatoryczną bibliotekę Hu I wpierw poddano skriningowi techniką ELISA, pozwalającą na dokonanie szybkiej oceny względnego powinowactwa wariantów [J.D. Watkins i in., Anal. Biochem., 253, 37 - 45 (1997)]. Poza tym, techniki ELISA użyto do scharakteryzowania klonów zidentyfikowanych w skriningu przeprowadzonym metodą podniesienia z wychwytem. Mówiąc krótko, płytki do mikromiareczkowania pokryto 5 ng/ml kozim przeciwludzkim kappa (Southern Biotechnology) i zablokowano 3% PSA w PBS. Następnie, 50 ąl Fab z supernatantu hodowli Escherichia coli lub z lizatu komórkowego inkubowano z płytką w ciągu godziny w temperaturze 25°C, po czym płytkę przemyto 3 razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20, oraz 0,1 ąg/ml CD40-Ig w PBS zawierającą 1% BSA, w ciągu 2 godzin, w temperaturze 25°C. Następnie płytkę przemyto 3 razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20 i na godzinę w temperaturze 25°C, dodano konjugat kozia przeciwmysia IgG2b-fofataza alkaliczna, rozcieńczony 3000-krotnie w PBS zawierającej 1% BSA. Następnie, płytkę przemyto 3 razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20, po czym wywołano sposobem opisanym w tej dziedzinie techniki [Watkins (1997), wyżej],

4. Sekwencjonowanie DNA

Wyodrębniono jednoniciowy DNA, po czym sekwencjonowano geny zmiennych regionów łańcuchów H i L humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku, z wykorzystaniem fluorescencyjnej metody didezoksy terminacji nukleotydu (Perkin-Elmer, Foster City, CA).

Sekwencja kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 7) i aminokwasów (SEQ ID NO: 8) zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała F4 przedstawia się następująco:

GAA

ATT

GTG

TTG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

42

E

I

V

L

T

Q

S

P

A

T

L

S

L

S

14

CCA

GGG

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGT

CAG

AGT

84

P

G

E

R

A

T

L

s

C

R

A

S

Q

S

28

ATT

AGC

GAT

TAC

TTA

CAT

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

CAG

126

I

S

D

Y

L

H

W

Y

Q

X

P

G

Q

42

GCT

CCC

AGG

CTC

ATC

TAT

TAC

GCA

TCC

CAC

TCC

ATC

TCT

168

A

P

R

L

I

Y

A

S

H

s

I

s

56

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

210

G

I

P

A

R

F

S

G

S

G

S

G

T

D

70

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

GCA

252

• F

T

L

T

I

S

L

E

P

E

D

F

A

84

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAT

GGC

CAC

TCT

TTT

CCT

TGG

ACC

TTC

294

V

Y

C

Q

H

G

H

S

F

P

W

T

F

98

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATT

AAA

321

G

T

K

V

E

I

X

107

PL 197 143 Β1

Sekwencja kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 9) i aminokwasów (SEQ ID NO: 10) zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanych przeciwciał F4 i L3.17 przedstawia się następująco:

CAG

GTG

CAG

CTG

GTG

CAA

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

CCT

42

Q

V

Q

L

V

Q

s

G

S

E

L

K

P

14

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

GCC

84

G

A

S

V

K

V

s

C

K

A

s

G

Y

A

28

TTC

ACT

ACC

ACT

GGC

ATG

CAG

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

.GGA

126

F

T

G

M

Q

W

V

R

Q

A

P

G

42

CAA

GGG

CTT

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATC

AAC

ACC

CAC

AGC

GGG

168

Q

G

L

E

W

M

G

W

I

N

T

H

S

G

56

GTC

CCA

AAG

TAT

GTC

GAG

GAC

TTC

AAA

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

210

V

P

K

Y

V

E

D

F

K

G

R

F

V

F

70

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTG

CAG

ATC

AGC

252

S

L

D

T

s

V

S

T

A

Y

L

Q

I

S

84

AGC

CTA

AAG

GCT

GAG

GAC

ACT

GCC

GTG

TAT

TAC

TGT

GCG

AGA

294

S

L

K

A

E

D

T

A

V

Y

C

A

R

98

TCT

GGC

AAT

GGG

AAC

TAT

GAC

CTG

GCA

TAC

TTT

AAG

TAT

TGG

336

S

G

N

G

N

Y

D

L

A

Y

F

K

Y

W

112

GGC

CAG

GGA

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

366

G

Q

G

T

L

V

T

V

S

s

122

Sekwencja kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 11) i aminokwasów (SEQ ID NO: 12) zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała L3.17 przedstawia się następująco:

GAA E

ATT I

GTG V

TTG ACA CAG TCT CCA GCC

ACC CTG TCT TTG TCT

42 14

L

T

Q

S

P

A

T

L

S

L

s

CCA

GGG

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGT

CAG

AGT

84

P

G

E

R

A

T

L

s

c

R

A

S

Q

S

28

ATT

AGC

GAT

TAC

TTA

CAT

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

CAG

126

I

S

D

Y

L

H

W

Y

Q

K

P

G

Q

42

GCT

CCC

AGG

CTC

ATC

TAT

TAC

GCA

TCC

CAC

TCC

ATC

TCT

168

A

P

R

L

I

Y

A

s

H

s

I

s

56

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

210

G

I

P

A

R

F

S

G

S

G

S

G

T

D

70

TTC

ACT

CTC

ACC

ACT

AGC

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

GCA

252

F

T

L

T

I

S

L

E

P

E

D

F

A

84

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAT

GGC

CAC

TCT

TAT

CCT

TGG

ACC

TTC

294

V

Y

C

Q

H

G

H

s

Y

P

W

T

F

98

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATT

AAA

321

G

T

K

V

E

I

K

107

5. Ekspresja i oczyszczanie Fab.

Niektóre fragmenty Fab klonowano do wektora ekspresyjnego pod kontrolą regulowanego arabinozą promotora BAD. Oprócz tego, do końca C łańcucha H sfuzjowano sześciohistydynowy znacz22

PL 197 143 B1 nik, w celu umożliwienia oczyszczania przy użyciu żywic chelatujących nikiel. Oczyszczony Fab kwantyfikowano sposobem już opisanym [Watkins (1997), wyżej].

6. Testy dotyczące charakteryzacji.

Płytki do mikromiareczkowania Immulon II pokrywano 0,1 pg/ml CD40-Ig w PBS, w ciągu 16 godzin, w temperaturze 4°C, po czym zablokowano 3% BSA w PBS. Płytki przemyto 3 razy w PBS zawierającej 0,1% Tween 20 i Fab uwolniony z przestrzeni periplazmatycznej rozcieńczono seryjnie 3-krotnie w PBS zawierającej 1% BSA i inkubowno z płytką w ciągu 2 godzin, w temperaturze 25°C. Następnie, płytkę przemyto 4 razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20 i przeprowadzono detekcję wiązania przeciwciała za pomocą inkubowania z koniugatem kozi przeciwludzki kappa-fosfataza alkaliczna, rozcieńczonym 2000-krotnie w PBS zawierającej 1% BSA, w ciągu godziny, w temperaturze 25°C. Płytkę przemyto 4 razy PBS zawierającą 0,1% Tween 20 i wywołano kolorymetrycznie [Watkins (1997), wyżej].

W celu przetestowania omawianych wariantów pod względem aktywności hamowania wiązania ligandu, płytki do mikromiareczkowania Immulon II pokryto 2 pg/ml przeciwmysią CD8 w celu wychwycenia białka fuzyjnego sgp39, z udziałem którego dochodzi do ekspresji domeny CD8. Następnie, płytki przemyto jeden raz PBS zawierającą 0,05% Tween 20 i zablokowano 3% BSA w PBS, po czym płytkę przemyto jeden raz PBS zawierającą 0,05% Tween 20 i inkubowano z udziałem podłoży do hodowli komórkowych, zawierających wysycające ilości sgp39, w ciągu 2 godzin, w temperaturze 25°C. Nie związane sgp39 odessano i płytkę przemyto 2 razy PBS zawierającą 0,05% Tween 20. Następnie, dodano 25 pl oczyszczonych wariantowych Fab rozcieńczonych kolejno 3-krotnie w PBS, a potem 25 pl 4 pg/ml CD40-ludzkiej Ig w PBS. Płytki inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 25°C i przemyto 3 razy PBS zawierającą 0,05% Tween 20. Związaną CD40-Ig wykrywano po 1-godzinnej inkubacji w temperaturze 25°C z koniugatem kozia F(ab')2 przeciwludzka IgG Fcyspecyficzna peroksydaza chrzanowa (Jackson), rozcieńczonym 10000-krotnie w PBS. Płytkę przemyto 4 razy PBS zawierającą 0,05% Tween 20 i wiązanie skwantyfikowano kolorymetrycznie za pomocą inkubowania z 1 mg/ml dichlorowodorkiem o-fenylenodiaminy i 0,003% nadtlenkiem wodoru w 50 mM kwasie cytrynowym, 100 mM Na2HPO4, pH 5. Reakcję zakończono za pomocą dodania H2SO4 do końcowego stężenia 0,36 M i oznaczono absorbancję przy 490 nm.

7. Analiza BIAcore

Stałe kinetyczne dla interakcji między CD40 a wariantami anty-CD40 oznaczono metodą „surface plasmon resonance” (BIAcore). Białko fuzyjne CD40-Ig immobilizowano na czipie sensora CM 5 aktywowanego chlorowodorkiem 1-etylo-3(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu i N-hydroksysukcynoimidem, za pomocą wstrzyknięcia 8 pl 10 pg CD-40 w 10 mM octanie sodu, pH 4. CD-40-Ig immobilizowano przy niskiej gęstości (~150 RU) w celu zapobieżenia powtórnemu wiązaniu się Fab w trakcie fazy dysocjacji. W celu otrzymania stałych szybkości asocjacji (kon), oznaczono szybkość wiązania dla sześciu różnych stężeń Fab, w zakresie od 25 do 600 nM w PBS, przy szybkości przepływu wynoszącej 20 pl/min. Stałe szybkości dysocjacji (ko) były średnimi z wyników sześciu pomiarów otrzymanych przy badaniu fazy dysocjacji. Sensorogramy analizowano z zastosowaniem programu BIAevaluation 3.0. K_d obliczono z równania:

^Kd = k_off/k_on

Resztkowy Fab usuwano po każdym pomiarze za pomocą przedłużonej dysocjacji.

Wyniki analizy kinetyki dla humanizowanych przeciwciał F4 i L3.ll w porównaniu z Fab chimerycznym przedstawiono w poniższej tabeli 1.

T a b e l a 1

Klon ID #	Kon	Koff	Kd	Uwagi
Fab chimeryczny	8,43E+5	2,65E-3	3,14 nM	Otrzymany przez rozszczepienie papainą chimerycznej IgG 2.220
F4	2,00E+6	4,44E-4	0,24 nM	Humanizowane
L3.17	3,17E+6	3,28E-4	0,10 nM	Humanizowane

8. Wyniki humanizacji

Jak to omówiono w powyższej części niniejszego opisu, do identyfikacji większości homologicznych sekwencji ludzkiej linii zarodkowej używano sekwencji szkieletowych zmiennego regionu mysiej

PL 197 143 B1 mAb anty-CD40. Reszty szkieletu łańcucha H były w 74% identyczne z sekwencjami ludzkiej linii zarodkowej VH7(7-4.1) i JH4, podczas gdy łańcuch L był w 75% identyczny z odpowiednimi sekwencjami ludzkiej linii zarodkowej VKIII(L6) i JK4. Uszeregowanie zmiennych sekwencji łańcucha H i L przedstawiono na fig. 15. Reszty CDR, jak to zdefiniowali Kabat i in. [E.A. Kabat i in., „Sequences of proteins of immunological interest” (wyd. V), Washington DC: United States Department of Healthh and Human Services; E.A. Kabat i in., J. Biol. Chem., 252, 6609 - 6616 (1977)] są podkreślone i zostały wyłączone z analizy homologii. Reszty szkieletowe wykazujące różnicę między mysią mAb a matrycami ludzkimi oceniano pojedynczo.

W oparciu o wyniki analizy strukturalnej i sekwencyjnej stwierdzono, że CDR przeciwciał, z wyjątkiem HCDR3, występują w ograniczonej liczbie konformacji łańcucha głównego, zwanych strukturami kanonicznymi [C. Chothia i in., J. Mol. Biol., 196, 901 - 917 (1987); C. Chothia i in., Nature, 342, 877 - 883 (1989)]. Ponadto, zidentyfikowano pewne reszty decydujące dla oznaczania konformacji głównego łańcucha pętli CDR [Chothia (1987), wyżej; Chothia (1989), wyżej). To też, reszty kanonicznego szkieletu mysiego anty-CD40 zidentyfikowano i ustalono, że aminokwasy we wszystkich decydujących pozycjach kanonicznych w obrębie szkieletów łańcucha H i L matryc ludzkich były identyczne z odpowiednimi resztami mysimi.

Mysie aminokwasy eksponowane powierzchniowo, nie znajdowane normalnie w przeciwciałach ludzkich, prawdopodobnie uczestniczą w immunogenności humanizowanego mAb [E.A. Padlan, Mol. Immunol., 28, 489 - 498 (1991)]. Dlatego też, reszty szkieletu odróżniające mysie anty-CD40 od ludzkich matryc, poddano analizie i na podstawie wyników ekspozycji na rozpuszczalnik prognozowano, czy są one ukryte, czy umiejscowione na powierzchni przeciwciała [Padlan (1991), wyżej]. Nie oczekiwano, aby eksponowane na rozpuszczalnik reszty szkieletowe odległe od CDR przyczyniały się w znaczniejszej mierze do wiązania antygenu, i stąd, z wyjątkiem dwu reszt łańcucha H, wszystkie wymieniono na odpowiedni ludzki aminokwas w celu zmniejszenia potencjalnej immunogenności. Przewidywano, że reszty łańcucha H 28 i 46 były eksponowane na rozpuszczalnik. Jednakże, H28 znajduje się w obrębie regionu HCDR1, jak do zdefiniowali Chothia i in. (wyżej) i potencjalnie oddziaływuje wzajemnie z antygenem. Oprócz tego, udział lizyny w H46 w mysim mAb jest w pewnym stopniu nieprawdopodobny, a do tego jest ona znacząco różna od kwasu glutaminowego ludzkiej matrycy. Dlatego, w kombinatorycznej bibliotece zaistniała ekspresja mysich i ludzkich reszt w H28 i H46 (fig. 15, gwiazdki).

Pozostałe odróżniające reszty szkieletowe, co do których przewidywano, że są w głównej mierze ukryte w przeciwciele, oceniono pod względem: (1) zbliżenia do CDR; (2) potencjału kontaktowania się z przeciwległą domeną w powierzchni międzyfazowej Vk - Vh; (3) sposobu powiązania ze sobą odmiennych aminokwasów; (4) przewidzianego znaczenia dla modulowania aktywności CDR, według definicji Studnickiej i in. [G.M. Studnicka i in., Protein Eng., 7, 805 - 814 (1994)]. Większość różnic szkieletu łańcucha L w resztach ukrytych stanowiły aminokwasy w pozycjach uważanych za nieprawdopodobne z punktu widzenia bezpośredniego zaangażowania w konformacji CDR. Jednakże, L49 graniczy z LCDR2, potencjalnie kontaktuje się z domeną Vh, nie jest powiązany z resztą ludzką i może uczestniczyć w oznaczaniu konformacji LCDR2. Dla tych powodów, doprowadzono do ekspresji aminokwasów tak mysich jak i ludzkich w L49 w kombinatorycznej bibliotece szkieletowej (fig. 15, gwiazdka).

Bardziej skomplikowana okazała się analiza sekwencji mysiego łańcucha H i matrycy ludzkiej. W mysim mAb resztę H9 stanowi prolina, podczas gdy matryca ludzka zawiera nie spokrewnioną z nią resztę serynową. Pozycja H9 może także grać rolę w modulowaniu konformacji CDR i przez to wybrano ją jako miejsce biblioteki kombinatorycznej (fig. 15, gwiazdki). Pozostałe ukryte reszty szkieletu odróżniające mysie anty-CD40 od matrycy z łańcuchem H znajdowały się w pozycjach szkieletu 38, 39, 48 i 91. Mysie mAb anty-CD40 zawierało glutaminę i kwas glutaminowy w, odpowiednio, H38 i H39, podczas gdy matryca ludzka zawierała argininę i glutaminę. Reszta H38 znajduje się w pobliżu HCDR1, wymiana glutamina > arginina nie jest konserwatywna i ekspresja glutaminy w tym miejscu mysich mAb jest w pewnym stopniu wyjątkowa. Podobnie, wymiana kwas glutaminowy > glutamina nie stanowi konserwatywnej różnicy dla ukrytych aminokwasów, H39 jest potencjalną resztą kontaktową Vk, a obecność kwasu glutaminowego jest do pewnego stopnia nieprawdopodobna, jeśli chodzi o mysie mAb. Reszta H48 znajduje się w ścisłej bliskości z HCDR2, a H91 jak się przewiduje, jest miejscem wysokiego ryzyka [Studnicka (1994), wyżej. L. Harris i in., Prot. Sci., 4, 396 - 310 (1995)], które potencjalnie kontaktuje z domeną Vk. Toteż, doszło do ekspresji zarówno mysich jak i ludzkich reszt w H38, 39 i 91 (fig. 15, gwiazdki).

PL 197 143 B1

Podsumowując, biblioteka szkieletowa zawierała mysie CRD wszczepione do matryc ludzkich. Poza tym, jedną resztę szkieletową w łańcuchu L i siedem reszt szkieletowych w łańcuchu H, uznano za potencjalnie znaczące dla utrzymywania aktywności przez mAb. Wszystkie te miejsca scharakteryzowano przez zsyntetyzowanie biblioteki kombinatorycznej, w której ma miejsce ekspresja wszystkich możliwych kombinacji mysich i ludzkich aminokwasów znajdujących się w tych resztach. Całkowity zbiór tej biblioteki, nazwanej Hu I, wynosił 2⁸ lub 256 wariantów (tabela 2, poniżej).

T a b e l a 2

Podsumowanie bibliotek przeciwciał anty-CD40 utworzonych w wyniku ekspresji fagowej

Biblioteka	Pozycja w bibliotece	Wielkość*	Poddano skriningowi'
Hu I	Szkielet	256	2^,4 ^χ 10³
Hu II	Szkielet, HCDR3	1^,1 ^χ 10⁵	2^,0 ^χ 10⁶
Hu III	Szkielet, HCDR3, LCDR3	3^,1 ^χ 10⁷	5^,5 ^χ 10⁵

* Liczba klonów unikalnych w oparciu o sekwencje DNA. Do zakodowania wszystkich 20 aminokwasów w każdej pozycji CDR używa się 32 kodonów.

Bibliotekę Hu I poddano skriningowi techniką ELISA przy użyciu przeciwciał utworzonych w wyniku ekspresji w hodowlach bakteryjnych prowadzonych w małej skali [Watkins (1997), wyżej]. Biblioteki Hu II i Hu III wysiano na płytki z warstwami XL-1 Blue/agar z gęstością 10⁵ łysinek na 100 mm płytkę i poddano skriningowi metodą podnoszenia z wychwytem [Watkins (1998), wyżej].

Biblioteka Hu I powstała w wyniku ekspresji w hodowlach bakteryjnych prowadzonych w małej skali (<1 ml). Jednakowe ilości Fab uwolnionego z przestrzeni periplazmatycznej wychwycono na płytkę do mikromiareczkowania i aktywność wiązania się przeciwciał porównano bezpośrednio, z zastosowaniem techniki ELISA [Wakins (1997), wyżej]. Aczkolwiek zidentyfikowano warianty wiążące docelowy antygen z powinowactwem porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez chimeryczny Fab, albo nawet lepszym, to jednak większość poddanych skriningowi klonów Hu I okazała się mniej aktywna od chimerycznego Fab anty-CD40. W przybliżeniu 6% losowo wyselekcjonowanych wariantów Hu I przejawiało aktywność wiązania porównywalną z aktywnością chimerycznego Fab (dane nie uwidocznione). Identyfikacja licznych wariantów Hu I o aktywności porównywalnej z aktywnością chimerycznego CD40 jest zgodna z interpretacją, że najbardziej decydujące reszty szkieletu zawarte były w bibliotece kombinatorycznej.

Klony aktywne charakteryzowano dalej za pomocą miareczkowania na immobilizowanym antygenie, z potwierdzeniem identyfikacji wielu wariantów o wzmożonym powinowactwie. I tak, na przykład, klon 19C11 wiąże receptor CD40 z większym powinowactwem niż chimeryczny Fab, jak to pokazano przesunięciem profilu miareczkowania (fig. 16, kółka otwarte vs. kółka pełne). Sekwencjonowanie DNA 34 najbardziej aktywnych klonów doprowadziło do zidentyfikowania 24 unikalnych kombinacji szkieletów, z których każda zawierała od 2 do 6 mysich reszt szkieletowych (dane nie uwidocznione).

LCDR3 i HCDR3 kontaktują antygen bezpośrednio, przejawiają interakcję z innymi CDR3 i częstokroć znacząco wpływają na powinowactwo i swoistość przeciwciał [I.A. Wilson i in., Curr. Opin. Struct. Biol., 3, 113 - 118 (1993); E.A. Padian, Mol. Immunol., 31, 169 - 217 (1994)]. Oprócz tego, konformacja LCDR3 i HCDR3 określana jest w części przez pewne reszty szkieletu. W celu zidentyfikowania przeciwciała o największej aktywności, zastosowano metodę mutagenezy kodonowej [S.M. Glaser i in., J. Immunol., 149, 3903 - 3913 (1992)], w wyniku czego zsyntetyzowano oligonukleotydy, które wprowadzają mutacje w każdej pozycji HCDR3, po jednej na raz, co prowadzi do uzyskania ekspresji wszystkich 20 aminokwasów na każdą resztę CDR. Każdy oligonukleotyd kodował nie więcej niż pojedynczą zmianę aminokwasu. Cały zbiór oligonukleotydów kodujących bibliotekę HCDR3 zmieszano z oligonukleotydami zachodzącymi, kodującymi szkielet kombinatoryczny i inne CDR, w celu utworzenia biblioteki szkielet/HCDR3. Zbiór tej biblioteki, nazwanej Hu II, wynosił 1,1 x 105 (tabela 2, powyżej). W podobny sposób zsyntetyzowano bibliotekę dla LCDR3. Oligonukleotydów kodujących LCDR3, HCDR3 i szkielet kombinatoryczny użyto do wytworzenia biblioteki szkielet/HCDR3/LCDR3, nazwanej Hu III. Rezultatem dużej liczby kombinacji szkielet/CDR3 była biblioteka o zbiorze wynosząc^ym ^3,1 x ^10? (tatie^ 2, ^pow^yżej).

Kombinowanie mutacji w LCDR3 i/lub HCDR3 z biblioteką szkieletową podwyższało potencjalny zbiór humanizowanych wariantów anty-CD40 z 256 do ponad 107 W celu przeprowadzenia skriningu tych wielkich bibliotek w sposób skuteczniejszy, zastosowano zmodyfikowany test podnoszenia łysiPL 197 143 B1 nek, nazywany „testem podnoszenia z wychwytem” [Watkins (1998), wyżej)]. Mówiąc krótko, zakażone fagiem bakterie umieszczono na warstwach stałej pożywki agarowej, po czym naniesiono na nie filtry nitrocelulozowe pokryte odczynnikiem swoistym dla Fab. Po wychwyceniu prawie jednakowych ilości Fab utworzonych w wyniki ekspresji fagowej, filtry sondowano 5 ng/ml białka fuzyjnego CD40-Ig. Ponieważ filtry sondowano antygenem w stężeniu zasadniczo poniżej Kd Fab, wykrywalne były jedynie warianty przejawiające wzmożone powinowactwo. W następstwie skriningu >10⁶ wariantów z Hu II i >10⁵ wariantów z Hu III, przy użyciu 82 mm filtrów zawierających «10⁵wariantów/filtr, zidentyfikowano liczne klony wykazujące wyższe powinowactwo (tabela 2).

Z uwagi na wysoką gęstość fagów na filtrach, wybrano łysinki pozytywne, wysiano ponownie na płytki przy mniejszej gęstości i ponownie poddano skriningowi. Następnie, warianty wytwarzające najbardziej intensywny sygnał kolorymetryczny w teście podnoszenia z wychwytem charakteryzowano w dalszym ciągu z zastosowaniem techniki ELISA. Jak oczekiwano, większość klonów zidentyfikowanych w skriningu przeprowadzonym metodą podnoszenia z wychwytem wiązała CD40 lepiej niż chimeryczny Fab. Miareczkowanie wariantów na immobilizowanym CD40-Ig pozwoliło zidentyfikować wiele klonów wykazujących powinowactwo większe od powinowactwa chimerycznego i humanizowanego Fab (fig. 16, porównaj kwadraty otwarte i trójkąty pełne z kółkami).

Mutacje szkielet/CDR nadające wzmożone powinowactwo zidentyfikowano metodą sekwencjonowania DNA. Unikalne sekwencje zmiennych regionów zidentyfikowano w 10/13 wariantów Hu II i w 3/4 wariantów Hu III. Zarówno warianty Hu II jak i Hu III zawierały od 1 do 5 reszt szkieletowych i od 0 do 2 mutacji CDR3, jak to podsumowano w poniższej tabeli 3.

T a b e l a 3

Jednoczesna optymalizacja reszt szkieletowych i CDR pozwala zidentyfikować warianty o większym powinowactwie

Biblioteka	Klon	Mysie sekwencje szkieletowe*	Mutacje CDR
	chimeryczny	(43)	0
Hu I	19C11	(2) H28, 48	H
Hu II	CW43 2B12	(3) H9, 28,91 (5) H9, 28, 38, 46, 48	HCDR³, ¹⁰¹A -> R HCDR³, 'OA -> K
Hu III	2B12 2B8	(5) H9, 28, 38, 46, 48 (1) H28	CDR3, 10¼ ->K HCDR3, 101A -> R R3, ⁹6r -> Y

* Liczba mysich reszt szkieletowych, które różnią się od najbardziej homologiczne sekwencji ludzkiej linii zarodkowe na zasadzie definicji CDR podanej przez Kabata i in. (wyżej). Liczba mysich reszt szkieletowych różniących się od matrycy ludzkiej wskazana jest w nawiasach. Wszystkie różnice dotyczące szkieletu występujące między mysim mAb a odmianami humanizowanymi znajdują się w łańcuchu H (H) w pozycjach wskazanych, z zastosowaniem systemu numeracji podanym przez Kabata i in.

Powinowactwo chimerycznego Fab, powstałego w wyniku ekspresji bakteryjnej, i wybranych wariantów z każdej z omawianych bibliotek, charakteryzowano dokładniej z zastosowaniem metody „surface plazmon resonance” w celu oznaczenia szybkości asocjacji i dysocjacji oczyszczonego Fab z udziałem immobilizowanego CD40-Ig. Chimeryczne anty-CD40 wykazywało stałą dysocjacji K_d= 3,14 nM, zgodnie z wynikami skriningu, przy czym liczne warianty przejawiały większe powinowactwo. Dwa z najlepszych klonów, F4 i L3.17, wykazały wartość Kd, odpowiednio, 0,24 nM i 0,10 nM (tabela 1). Polepszone powinowactwo wariantów anty-CD40 wynikało przeważnie z mniejszej szybkości dysocjacji, ponieważ wartości szybkości asocjacji były dla wszystkich wariantów podobne i mieściły s^ię w za^kresto od ^0,9 do ^3,2 x ^{106 M} ¹s¹).

W końcu, warianty wykazujące wzmożone powinowactwo przebadano pod względem ich zdolności do blokowania wiązania się ligandu gp39 z receptorem CD40. Wszystkie warianty hamowały wiązanie się rozpuszczalnego białka fuzyjnego CD40-Ig z immobilizowanym antygenem gp39 w sposób zależny od dawki, co było zgodne z powinowactwem Fab (fig. 17). I tak, na przykład, najsilniejszym inhibitorem wiązania liganda z białkiem fuzyjnym CD40-Ig okazał się wariant 2B8, który był jednocześnie wariantem o najwyższym powinowactwie do CD40 (fig. 17). Wariant 28 wykazywał powinowactwo do CD40 «17-krotnie wyższe od powinowactwa chimerycznego Fab i «7 razy skuteczniej hamował wiązanie ligandu.

PL 197 143 B1

P r z y k ł a d 5

Mysi układ modelowy

Twórcy wynalazku opracowali i przebadali in vivo szczurze mAb przeciw mysiemu CD40, oznaczone 7E1-G2b, oraz jego poprzednika, 7E1-G1. Wytworzenia tego przeciwciała dokonano w zamiarze wyszukania potencjalnej metody terapii anty-CD40 z wykorzystaniem mysich modeli choroby autoimunizacyjnej, zapalnej i związanej z transplantacją. Pierwszym celem mysiego układu modelowego było wytworzenie przeciwmysiego partnera naśladującego całkowitą i silną blokadę przez 2.220 interakcji gp39/CD40, przy jednoczesnej słabej aktywności kostymulacyjnej, a także przebadanie go in vivo na typowych eksperymentalnych modelach chorób.

A. Wyodrębnianie i charakteryzacja monoklonalnych przeciwciał przeciw mysiemu CD40, 7E1-G1 i 7E1-G2b.

1. Uodpornianie, fuzja i charakteryzacja.

Rekombinantowego mysiego białka fuzyjnego CD40-immunoglobulina złożonego z pozakomórkowego regionu mysiego CD40 zfuzjowanego ze strukturą stykową, domenami CH2 i CH3 mysiego przeciwciała IgC2a (mCD40-mIg), użyto do uodpornienia samicy szczura Lewis, w wieku 8 tygodni, przez wszczepienie poprzez poduszeczkę łapy. Po upływie trzech dni od ostatniego uodpornienia, dla utworzenia komórek typu heterohybrydoma szczur x mysz, z komórkami mysiego szpiczaka X63-Ag8.653 sfuzjowano leukocyty z drenujących węzłów chłonnych. Studzienki zawierające przeciwciało swoiste dla natywnego mysiego CD40 zidentyfikowano pod względem reaktywności z oryginalnym immunogenem mCD40-mIg z wykorzystaniem techniki ELISA, oraz pod względem reaktywności z linią CD40-pozytywnych komórek B chłoniaka mysiego (WEHI-231, ATCC CRL-1702). Następnie zbadano supernatanty pod względem zdolności do hamowania wiązania się mCD40-mIg z rozpuszczalnym, rekombinantowym białkiem fuzyjnym mCD8-mysia gp39, mgp39, mysim równoważnikiem sgp39. Metodą kolejnych rozcieńczeń sklonowano około 12 najsilniejszych inhbitorowych studzienek kontrolnych.

Po klonowaniu, przeprowadzono testy czynnościowe z udziałem supernatantów hodowli i oczyszczonego przeciwciała, w celu dokładniejszego oszacowania zdolności mAb anty-CD40 do hamowania interakcji mysiej gp39 z CD40, oraz w celu określenie ich właściwości stymulacyjnych. Właściwości inhibicyjne zmierzono poprzez zdolność hamowania wiązania się mgp39 z WEHI-231 z zastosowaniem sposobów typowych, znanych w tej dziedzinie techniki. Właściwości stymulacyjne zmierzono poprzez indukcję spoistej, homotypowej adhezji komórek WEHI-231 i proliferację śledzionowych komórek B w obecności przeciwciała i anty-IgM, z zastosowaniem metod znanych w tej dziedzinie techniki. Na podstawie uzyskanych tak wyników, ustalono, że trzy mAb (5A3, 7E1-G1 i 8E1) są najbardziej podobne do mAb przeciw ludzkiemu CD40 2.220 w odniesieniu do blokady gp39/CD40 i poziomu aktywności kostymulującej.

2. Selekcja 7E1 jako wiodącego mAb przeciw mysiemu CD40.

Celem in vivo badań na myszach było zidentyfikowanie blokującego/niestymulującego mAb anty-CD40 najsilniej działającego pod względem tłumienia swoistych odpowiedzi, w postaci wytwarzania przeciwciał, na zadziałanie antygenu T-zależnego. Badano supresję odpowiedzi w postaci wytworzenia przeciwciała IgG na SRBC u myszy z udziałem mAb przeciw mysiemu CD40. Myszy BALB/c w grupach po 5 sztuk uodporniano i.v. 1 x 10⁸ SRBC i zarazem traktowano i.p. po 1 mg mAb przeciw mysiemu CD40: 5A3, 7E1-G1 lub 8E1. Jako kontroli użyto grup myszy uodpornionych w podobny sposób, potraktowanych MR1 (przeciwmysia gp39, kontrola pozytywna, 250 μο), 6E9 (szczurza przeciwludzka gp39, kontrola negatywna, 1 mg) lub PBS. Myszy oceniano pod względem miana IgG antySRBC, z zastosowaniem techniki ELISA, w dniach 7, 14, 21 i 35. Otrzymane wyniki wskazały na to, że w przypadku podania przeciwciała (jako dawki pojedynczej) w czasie antygenowej prowokacji przy użyciu SRBC, mAb 7E1-G1 okazało się (w porównaniu z mAb 5A3 lub 8E1) bardziej skutecznym supresorem odpowiedzi w postaci IgG anty-SRBC i dlatego wybrane zostało jako wiodące mAb antyCD40 do badań na myszach.

3. Wariant mAb 7E1-G1 z przestawionym izotypem.

7E1-G1 nie wykazuje charakterystyki funkcji efektorowej porównywalnej z funkcją chimerycznego mAb przeciw ludzkiemu CD40 2.220 (co oznacza, że szczurza IgG1 nie jest efektywna jako ludzka IgG1 przy wiązaniu dopełniacza i w interakcji receptora Fc), a profil supresji swoistego przeciwciała in vivo dla 7E1 nie był tak kompletny jak profil dla mAb 2.220 u naczelnych. Toteż, poszukiwano przeciwciała o swoistości 7E1, ale o izotypie szczurzym bardziej podobnym do ludzkiej IgG1 pod względem zdolności efektorowej. W tym celu, wytworzono naturalny wariant 7E1 z przestawionym (z IgG1

PL 197 143 B1 na IgG2b) izotypem, z zastosowaniem metody „sib-selekcji” [Hake i in., J. Immunol. Methods, 103(1), 59 - 67 (1987)]. Mówiąc krótko, techniką ELISA, spośród supernatantów z płytek 96-studzienkowych, posianych z gęstością 1000 komórek/studzienkę oryginalnymi hybrydomami 7E1, zidentyfikowano mAb anty-CD40 izotypu IgG2b. Następujące po tym rundy wysiewania na płytki i identyfikowania studzienek IgG2b-dodatnich przy gęstości posiewu wynoszącej 200, a potem 20 komórek/studzienkę, z następującymi później dwiema rundami klonowania z zastosowaniem metody kolejnych rozcieńczeń, doprowadziły do wyodrębnienia klonalnego IgG2b-przestawionego wariantu 7E1, a mianowicie 7E1-G2b.

7E1-G2b jest usankcjonowanym przestawionym wariantem IgG1, jak to zademonstrowano przy pomocy trzech zestawów danych. Po pierwsze, N-terminalne sekwencjonowanie łańcucha ciężkiego wykazało, że obie wersje były identyczne dla pierwszych 35 reszt aminokwasowych. Po drugie, analiza PCR z użyciem starterów swoistych dla CDR ze zmiennym łańcuchem ciężkim 7E1-G1 dawała odpowiedniej wielkości pasmo cDNA, otrzymane czy to z 7E1-G1 czy 7E1-G2b, a nie dwóch innych, niespokrewnionych przeciwciał. Po trzecie, przy ocenie aktywności wiązania się oczyszczonych partii obu tych wersji z immobilizowaną mCD40-hIg, przeprowadzonej z zastosowaniem techniki ELISA przy użyciu odczynnika będącego znacznikiem anty-kappa, otrzymano identyczne w zasadzie krzywe miareczkowania.

B. Badania in vivo.

1. In vivo porównanie 7E1-G1 z 7E1-G2b na modelu odpowiedzi w postaci przeciwciała.

Dokonano porównania 7E1-G1 z 7E1-G2b pod względem skuteczności działania in vivo, przy użyciu SRBC jako antygenu zależnego od komórek T. Zwierzęta w grupach po 3 lub 5 sztuk uodporniono i.v. przy użyciu SRBC i zarazem potraktowano przeciwciałem 7E1-G1 lub 7E1-G2b w dawce wynoszącej 1, 025 lub 0,1 mg związku w dniu 0, jak to pokazano na fig. 10. Jako pozytywnej kontroli działania immunosupresyjnego użyto mAb przeciw mysiej gp39, a mianowicie MR1. Jako mAb nie będące przedmiotem zainteresowania i nie stanowiące kontroli mAb posłużyły, odpowiednio, mAb 6E9 i PBS. Myszy oceniano pod względem miana anty-SRBC z zastosowaniem techniki ELISA w dniach 7, 14 i 21. Miano przedstawia obliczone rozcieńczenie surowicy dające wartość OD = 0,3 w teście ELISA. Jak to pokazano na fig. 10, 7E1-G2b tłumiło odpowiedź w postaci IgG na zadziałanie SRBC w dawkach, przy których 7E1-G1 nie wywierało takiego działania.

2. Zależna od dawki 7El-G2b odpowiedź w mysim modelu antygenu T-zależnego.

Badaniu poddano 7El-G2b w modelu z zależną od komórek T pierwotną odpowiedzią immunologiczną, przy użyciu SRBC jako antygenu. 7E1-G2b przetestowano w różnych dawkach w celu ustalenia najniższej dawki skutecznej. Myszom BALB/c (n = 5) wstrzyknięto i.v. 1 x 10⁸ SRBC i potraktowano je pojedynczym wstrzyknięciem 7E1-G2b we wskazanych dawkach, lub MR1 (przeciwmysia gp39) lub PBS, podawanym w tym samym czasie co antygen, w dniu 0. Na fig. 11 pokazano odpowiedź w postaci IgG anty-SRBC w dniach 7, 16 i 28. Podane dane są to wartości absorbancji w teście ELISA przy rozcieńczeniu surowicy wynoszącym 1/50. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe.

Jak to pokazano na fig. 11, pojedyncze potraktowanie 7E1-G2b w dawce wynoszącej 25 ug/mysz (1,25 mg/kg) tłumiło odpowiedź immunologiczną, polegającą na wytworzeniu IgG, w 87% w dniu 16, natomiast całkowitą supresję w dniu 16 uzyskiwano w przypadku dawek wynoszących 50 lub 100 ug. W dniu 28, dawka wynosząca 50 ug/mysz tłumiła odpowiedź polegającą na wytworzeniu IgG w 89%, a dawka wynosząca 100 ug/mysz zapewniała całkowitą supresję. Należy zauważyć, że jako pozytywnej kontroli immunosupresji użyto MR1 w dawce suboptymalnej wynoszącej 100 ug/mysz.

3. 7E1-G2b w zapobiegawczym mysim modelu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA).

Do określenia wpływu 7E1-G2b na zapobieganie zapaleniu stawów, użyto typowego eksperymentalnego mysiego modelu zapalenia stawów reumatoidalnego, a mianowicie modelu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA). Myszom DBA/1J (samce, w wieku 6-8 tygodni) wstrzyknięto śródskórnie 200 jag kolagenu kurczęcia typu II (CII) w kompletnym adiuwancie Freunda, w dniu 0. Podawanie 7E1-G2b w ilości wynoszącej 250 ug/dawkę, i.p., stosowano co 4 dni zaczynając od dnia 7. Grupie kontrolnej podawano PBS według tego samego schematu dawkowania. Wszystkim myszom zaaplikowano w dniu 21 dawkę podtrzymującą CII w niekompletnym adiuwancie Freunda. Dokonywano codziennej obserwacji myszy, ze zwróceniem uwagi na spuchnięcie łap, i z subiektywnymi zapisami wyników obserwacji na skali od 0 do 3, na której 3 odpowiada maksymalnemu obrzękowi i rumieniowi. Codziennie także mierzono łapy przy użyciu suwmiarki. Zanotowane zapisy kliniczne pochodziły z zsumowania zapisów dla każdej łapy w czasie uśmiercenia zwierzęcia i podzielenia otrzymanej tak

PL 197 143 B1 sumy przez całkowitą ilość zwierząt w każdej grupie. Podane wartości są to średnie zakresy danej grupy.

Rozwój zapalenia stawów, a stąd stanu zapalnego stawów u myszy, całkowicie zahamowywano leczeniem obejmującym podawanie 7E1-G2B, jak to przedstawiono w poniższej tabeli 4. Myszy poddane działaniu 7E1-G2b w zupełności uwolniono od tej choroby w ciągu 90 dni.

T a b e l a 4

Leczenie zapalenia stawów indukowanego kolagenem

Grupa Tx	Częstość występowania zapalenia stawów	Dzień wystąpienia średnio (zakres)	Średnia (zakres) ocena kliniczna	Średnia (zakres) pomiaru łapy
7E1-G1	0/5	0	0	0,075
7E1-G2b	0/5	0	0	0,075
PBS (kontrola)	4/4	30 (27 - 32)	3,5 (3 - 4)	0,114 (0,110 - 0,117)

Jak to przedstawiono powyżej, przeciwciała według niniejszego wynalazku są silnymi immunomodulatorami, z możliwością zastosowań leczniczych przeciw różnym chorobom.

Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem przeciwciała chimeryczne i humanizowane, jak powyżej opisano, z dodatkowymi konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, nie wywierającymi zasadniczo żadnego wpływu na wiązanie CD40. Do typowych podstawień konserwatywnych należy podstawienie jednego aminokwasu innym aminokwasem o podobnej charakterystyce, na przykład podstawienia w obrębie następujących grup: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; oraz fenyloalanina, tyrozyna.

Zgodnie z jedną ze swych cech znamiennych, wynalazek niniejszy ukierunkowany jest na wytwarzanie przeciwciał chimerycznych i/lub humanizowanych, jak powyżej opisano, za pomocą doprowadzenia do ekspresji odcinków rekombinantowego DNA kodującego mysi lekki łańcuch zmienny i ciężki łańcuch zmienny (lub ich części), przyłączonych do odcinków DNA kodujących ludzkie stałe regiony. Przykładowe sekwencje DNA skonstruowane według niniejszego wynalazku kodują łańcuchy polipeptydów obejmujących całość lub część zmiennego regionu łańcucha lekkiego, jak to przedstawia SEQ ID NO: 1, albo jego klonu zdeponowanego w ATCC, i/lub całość lub część zmiennego regionu łańcucha ciężkiego, jak to przedstawia SEQ ID NO: 2, lub jego klonu zdeponowanego w ATCC.

Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem ujawnione zmienne regiony łańcucha ciężkiego i lekkiego oraz ich aktywne lub funkcjonalne części. Immunologicznie kompetentna lub funkcjonalna postać białka lub jego części określana jest także w niniejszym opisie jako region zmienny łańcucha lekkiego/ciężkiego lub jego część biologicznie aktywna. W niniejszym przypadku, część biologicznie aktywna obejmuje część wspomnianego lekkiego lub ciężkiego łańcucha, która po włączeniu do przeciwciała w dalszym ciągu umożliwia mu wiązanie się z ludzkim CD40.

W szczególny sposób wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem sekwencje kwasu nukleinowego kodujące zmienny łańcuch ciężki i zmienny łańcuch lekki przeciwciała według niniejszego wynalazku. I tak, na przykład, nukleotydy 1057 do 1422 (SEQ ID NO: 5) z fig. 13 dostarczają korzystną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmienny łańcuch ciężki przeciwciała według niniejszego wynalazku; nukleotydy 1065 do 1388 (SEQ ID NO: 6) z fig. 14 dostarczają korzystną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmienny łańcuch lekki przeciwciała według niniejszego wynalazku. SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 11 przedstawiają korzystne sekwencje kwasu nukleinowego kodujące zmienne łańcuchy lekkie humanizowanych przeciwciał według niniejszego wynalazku; SEQ ID NO: 9 przedstawia korzystną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą zmienny łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Plazmidy obejmujące polinukleotydy pokazane w SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 11, zostały zdeponowane w ATCC.

Wynalazek obejmuje swym zakresem także chimeryczne i/lub humanizowane przeciwciała, które wiążą się z ludzkim CD40 i zawierające polipetydy, zasadniczo homologiczne z nim, albo które przejawiają zasadniczą identyczność sekwencji, oraz zmienne sekwencje łańcucha lekkiego i ciężkiego ujawnione w niniejszym opisie. I tak, na przykład, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem przeciwciała chimeryczne zawierające region łańcucha lekkiego wykazujący co najmniej około 85%

PL 197 143 B1 identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej co najmniej około 98% identyczności sekwencji z regionem łańcucha lekkiego jak przedstawiono w SEQ ID NO: 4. Bardziej szczegółowo, wynalazek obejmuje swym zakresem także przeciwciała chimeryczne zawierające zmienny region łańcucha lekkiego, wykazujący co najmniej około 85% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej co najmniej około 98% identyczności sekwencji ze zmiennym regionem łańcucha lekkiego jak przedstawiono w SEQ ID NO: 1. Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także przeciwciała humanizowane zawierające region łańcucha lekkiego wykazujący co najmniej około 85% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej co najmniej około 98% identyczności sekwencji z regionem łańcucha lekkiego jak przedstawiono w SEQ ID NO: 8 i/lub SEQ ID NO: 12.

Poza tym, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem przeciwciała chimeryczne zawierające region łańcucha ciężkiego wykazujący co najmniej około 85% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej co najmniej około 98% identyczności sekwencji z regionem łańcucha ciężkiego jak przedstawiono w SEQ ID NO: 3. Bardziej szczegółowo, wynalazek obejmuje swym zakresem także przeciwciała chimeryczne zawierające zmienny region łańcucha ciężkiego, wykazujący co najmniej około 85% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej co najmniej około 98% identyczności sekwencji ze zmiennym regionem łańcucha ciężkiego jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2. Dodatkowo, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem także przeciwciała humanizowane zawierające region łańcucha ciężkiego wykazujący co najmniej około 85% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej co najmniej około 95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej co najmniej około 98% identyczności sekwencji z regionem łańcucha ciężkiego jak przedstawiono w SEQ ID NO: 10.

Odcinki DNA typowo zawierają jeszcze sekwencję DNA regulujące ekspresję, operatywnie związaną z sekwencjami, chimeryczną lub humanizowaną, kodującymi przeciwciało, obejmującą naturalnie zasocjowane lub heterologiczne regiony promotorowe. Korzystnie, sekwencje regulujące ekspresję stanowić będą eukariotyczne układy promotorowe w wektorach zdolne do transformowania lub transfekowania eukariotycznych komórek-gospodarzy, ale użyć w tym przypadku można także sekwencji regulujących dla gospodarzy prokariotycznych. Po włączeniu wektora do stosownego gospodarza utrzymuje się gospodarza w warunkach odpowiednich dla osiągania wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydów oraz, jeżeli jest to pożądane, może po tym nastąpić zebranie i oczyszczanie zmiennego łańcucha lekkiego, łańcucha ciężkiego, dimerów łańcuch lekki/ciężki lub przeciwciała nienaruszonego, fragmentów wiążących lub innych form immunoglobulin. [Patrz: S. Beychok, “Cells of Immunoglobulin Synthesis”, Academic Press, N.Y. (1979)]. Można także wytworzyć przeciwciała jednołańcuchowe, za pomocą łączenia sekwencji kwasu nukleinowego kodujących ujawnione w niniejszym opisie regiony VL i VH, z DNA kodującym łącznik polipeptydowy.

Do ekspresji przeciwciała według niniejszego wynalazku można użyć gospodarzy eukariotycznych, takich jak E. coli, oraz innych drobnoustrojów, takich jak drożdże. Oprócz drobnoustrojów, do ekspresji i wytwarzania przeciwciał według niniejszego wynalazku użyć także można hodowli komórek tkanek ssaków. Korzystne okazać się mogą komórki eukariotyczne, a to dla dużej liczby opracowanych w tej dziedzinie techniki odpowiednich linii komórek-gospodarzy, zdolnych do wydzielania nienaruszonych immunoglobulin. Należą tu linie komórek CHO, rozmaite linie komórek COS, komórki HeLa, linie komórek szpiczaka i hybrydomy. Wektory ekspresyjne dla tych komórek mogą obejmować sekwencje regulujące ekspresję, takie jak promotor lub enhancer, oraz niezbędne miejsce informacyjne obróbki, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca rozszczepiania RNA, miejsca poliadenylacji i sekwencje terminacyjne transkrypcji. Wszystkie one znane są w tej dziedzinie techniki.

Wektory, które zawierające interesujące odcinki DNA (to znaczy sekwencje kodujące ciężki i/lub lekki łańcuch oraz sekwencje regulujące ekspresję) można przenosić do komórki gospodarza z wykorzystaniem metod dobrze poznanych, różniących się między sobą w zależności od rodzaju gospodarza. I tak, na przykład, w przypadku komórek prokariotycznych zwykle stosuje się transfekcję z udziałem chlorku wapnia, podczas gdy w przypadku innych komórek-gospodarzy zastosować można

PL 197 143 B1 obróbkę z udziałem fosforanu(V) wapnia lub elektroporację. [Patrz, na przykład: Maniatis i in., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press (1982)].

Po ekspresji, całkowite przeciwciała, ich dimery, pojedyncze łańcuchy lekkie i ciężkie lub inne formy immunoglobulin według niniejszego wynalazku, można poddać oczyszczaniu zgodnie z typowymi sposobami znanymi w tej dziedzinie techniki, włączając w to wytrącanie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, chromatografię kolumnową, elektroforezę żelową itp. Korzystne z punktu widzenia zastosowań farmaceutycznych są immunoglobuliny zasadniczo czyste, o homogenności wynoszącej co najmniej 90 do 95%, a najkorzystniej od 98 do 99% lub jeszcze większej.

Typowo, przeciwciała według niniejszego wynalazku znajdują zastosowanie w leczeniu zaburzeń, w których pośredniczy przeciwciało i/lub komórki T. Do typowych stanów chorobowych nadających się do leczenia należą w tym przypadku takie schorzenia, jak reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi i odrzucenie przeszczepu oraz choroby autoimmunizacyjne, takie jak cukrzyca typu I, łuszczyca, stwardnienie rozsiane, zapalenia stawów reumatoidalne, liszaj rumieniowaty układowy i miastenia.

Przeciwciała i kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku są szczególnie użyteczne przy podawaniu drogą pozajelitową, to znaczy podskórnie, domięśniowo lub dożylnie. Kompozycje farmaceutyczne przeznaczone do stosowania pozajelitowego typowo będą zawierać roztwór przeciwciała rozpuszczonego w dozwolonym nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Można tu użyć szeregu różnych nośników, przy czym wszystkie one są dobrze znane w tej dziedzinie techniki, takich jak, na przykład, woda zbuforowana, roztwór chlorku sodowego, glicyna itp. Roztwory te są jałowe i, na ogół, nie zawierają substancji drobnoziarnistych. Tego rodzaju kompozycje farmaceutyczne można wyjaławiać metodami sterylizacji dobrze znanymi w tej dziedzinie techniki. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dozwolone substancje pomocnicze, zgodne z wymogami dotyczącymi zbliżania się do stanów fizjologicznych, takie jak środki korygujące wartość pH i środki buforujące, środki korygujące toksyczność itp., na przykład octan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, mleczan wapnia, albumina ludzka itd.

Kompozycje zawierające przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować w postępowaniu zapobiegawczym i/lub leczniczym. W zastosowaniach terapeutycznych, kompozycje podaje się choremu już cierpiącemu na daną chorobę, w ilości dostatecznej do wyleczenia lub przynajmniej częściowego zatrzymania postępu choroby i związanych z nią komplikacji. Ilość leku odpowiednią do osiągnięcia tego celu określa się jako „dawkę terapeutycznie skuteczną”. Ilości efektywne w tym zastosowaniu będą zależeć od ciężkości stanu chorobowego i ogólnego stanu własnego układu odpornościowego pacjenta, przy czym mogą one być określone przez specjalistę w tej dziedzinie wiedzy.

W zastosowaniach zapobiegawczych, kompozycje zawierające przeciwciała według niniejszego wynalazku podaje się choremu, który jeszcze nie znajduje się w określonym stanie chorobowym, w celu wzmożenia odporności pacjenta (stłumienia odpowier^^i immunologicznej). Ilość odpowiednią w tym przypadku określa się jako „dawkę profilaktycznie skuteczną”. W tym przypadku, dokładna ilość zastosowanego leku zależy od stanu zdrowia pacjenta i ogólnego poziomu odporności. Korzystnym zastosowaniem profilaktycznym jest zapobieganie odrzuceniu przeszczepu, na przykład odrzuceniu przeszczepu nerki.

Aczkolwiek wynalazek niniejszy opisany został dość szczegółowo dla objaśnienia i przykładowo dla przejrzystości i dobrego jego zrozumienia, jest rzeczą oczywistą, że można w nim dokonać pewnych zmian i modyfikacji mieszczących się w zakresie załączonych zastrzeżeń.

PL 197 143 Β1

Wykaz sekwencji <110> Aruffo, Alejandro A.

Siadak, Anthony W.

Berry, Karen K.

Harris, Linda Thorne, Barbara A.

Bajorath, Jurgen Huse, William D.

Wu, Herren Watkins, Jeffrey D.

<120> Przeciwciała przeciw ludzkiemu CD4G <130> Sekwencja DB2a <140> 09/247352 <141> 1999-02-10 <150> 09/026291 <151> 1998-02-19 <160> 14 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Ludzka i mysia

<400> 1
Asp 1	Ile Val Leu	Thr Gin 5	Ser	Pro	Ala	Thr 10	Leu Ser Val Thr	Pro 15	Gly
Asp	Arg Val Ser 20	Leu Ser	Cys	Arg	Ala 25	Ser	Gin Ser Ile Ser 30	Asp	Tyr
Leu	His Trp Tyr 35	Gin Gin	Lys	Ser 40	His	Glu	Ser Pro Arg Leu 45	Leu	Ile
Lys	Tyr Ala Ser 50	His Ser	Ile 55	Ser	Gly	Ile	Pro Ser Arg Phe 60	Ser	Gly
Ser 65	Gly Ser Gly	Ser Asp 70	Phe	Thr	Leu	Ser	Ile Asn Ser Val 75	Glu	Pro 80

Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gin His Gly His Ser Phe Pro Trp

PL 197 143 Β1

90 95

Thr Phe*Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> PRT

<213> Ludzka i :

mysia

<400> 2

Gin

Ile

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Lys

Pro

Gly

Glu

1

5

10

15

Thr

Val

Arg

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Thr

20

25

30

Gly

Met

Gin

Trp

Val

Gin

Glu

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

His

Ser

Gly

Val

Pro

Lys

Tyr

Val

Glu

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Ala

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Asn

Leu

Lys

Asn

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Val

Arg

Ser

Gly

Asn

Gly

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Tyr

Phe

Ala

Tyr

Trp

100

105

110

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

115 120 <210> 3 <211> 451 <212> PRT <213> Ludzka i mysia

<400> 3 Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1	5	10	15
Thr Val Arg Ile	Ser Cys	Lys Ala Ser Gly Tyr Ala	Phe Thr Thr Thr
20		25	30

PL 197 143 Β1

Gly Met Gin 35

Trp Val Gin

Glu Met 40

Pro

Gly

Lys Gly Leu 45

Lys Trp

Ile

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

His

Ser

Gly

Val

Pro

Lys

Tyr

Val

Glu

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Ala

Phe

Ser

Leu

Glu

Thr

Ser

Ala

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Asn

Leu

Lys

Asn

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Val

Arg

Ser

Gly

Asn

Gly

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Tyr

Phe

Ala

Tyr

Trp

100

105

110

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

115

120

125

-

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

130

135

140

Ala

Leu

Gly Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

145

150

155

160

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

165

170

175

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

180

185

190

Val

Pro

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

195

200

205

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

210

215

220

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

225

230

235

240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

245

250

255

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

260

265

270

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

275 280 285

PL 197 143 Β1

His Asn Ala

Lys Thr

Lys

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser

Thr

Tyr

•

290

295

300

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

305

310

315

320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

340

345

350

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

355

360

365

Leu

Thr

cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

370.

375

380

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

385

390

395

400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

405

410

415

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

420

425

430

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

435

440

445

Pro

Gly

Lys

450 <210> 4 <211> 214 <212> PRT

<213> Ludzka i

mysia

<400> 4

Asp Ile

Val

Leu

Thr Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Val

Thr

Pro

Gly

5

10

15

Asp Arg

Val

Ser

Leu Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Asp

Tyr

20

25

30

Leu His

Trp

Tyr

Gin Gin

Lys

Ser

His

Glu

Ser

Pro

Arg

Leu

Ile

PL 197 143 Β1

40 45

Lys Tyr

Ala

Ser

His Ser Ile Ser Gly 55

Ile

Pro Ser 60

Arg Phe Ser

Gly

50

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Asp

Phe

Thr

Leu

Ser

Ile

Asn

Ser

Val

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Val

Gly

Ile

Tyr

Cys

Gin

His

Gly

His

Ser

Phe

Pro

Trp

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

•175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210> 5 <211> 8614 <212> DNA <213> Ludzka i mysia <400> 5 gacggatcgg gagatctgct aggtgacctg aggcgcgccg gcttcgaata gccagagtaa 60 cctttttttt taattttatt ttattttatt tttgagatgg agtttggcgc cgatctcccg 120 atcccctatg gtcgactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtatc 180 cgctccctgc ttgtgtgttg gaggtcgctg agtagtgcgc gagcaaaatt taagctacaa 240 caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg cgttttgcgc 300 tgcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc gttgacattg attattgact agttattaat 360

PL 197 143 Β1

agtaatcaat	tacggggtca	ttagttcata	gcccatatat	ggagttccgc	gttacataac	420
ttacggtaaa	tggcccgcct	ggctgaccgc	ccaacgaccc	ccgcccattg	acgtcaataa	480
tgacgtatgt	tcccatagta	acgccaatag	ggactttcca	ttgacgtcaa	tgggtggact	540
atttacggta	aactgcccac	ttggcagtac	atcaagtgta	tcatatgcca	agtacgcccc	600
ctattgacgt	caatgacggt	aaatggcccg	cctggcatta	tgcccagtac	atgaccttat	660
gggactttcc	tacttggcag	tacatctacg	tattagtcat	cgctattacc	atggtgatgc	720
ggttttggca	gtacatcaat	gggcgtggat	agcggtttga	ctcacgggga	tttccaagtc	780
tccaccccat	tgacgtcaat	gggagtttgt	tttggcacca	aaatcaacgg	gactttccaa	840
aatgtcgtaa	caactccgcc	ccattgacgc	aaatgggcgg	taggcgtgta	cggtgggagg	900
tctatataag	cagagctctc	tggctaacta	gagaacccac	tgcttactgg	cttatcgaaa	960
ttaatacgac	tcactatagg	gagacccaag	cttggtacca	tggactggac	ctggagaatc	1020
ctcttcttgg	tggcagcagc	aacaggtgcc	cactcccaga	tccagttggt	gcaatctgga	1080
cctgagctga	agaagcctgg	agagacagtc	aggatctcct	gcaaggcttc	tgggtatgcc	1140
ttcacaacta	ctggaatgca	gtgggtgcaa	gagatgccag	gaaagggttt	gaagtggatt	1200
ggctggataa	acacccactc	tggagtgcca	aaatatgtag	aagacttcaa	gggacggttt	1260
gccttctctt	tggaaacctc	tgccaacact	gcatatttac	agataagcaa	cctcaaaaat	1320
gaggacacgg	ctacgtattt	ctgtgtgaga	tccgggaatg	gtaactatga	cctggcctac	1380
tttgcttact	ggggccaagg	gacactggtc	actgtctctg	cagctagcac	caagggccca	1440
tcggtcttcc	ccctggcacc	ctcctccaag	agcacctctg	ggggcacagc	ggccctgggc	1500
tgcctggtca	aggactactt	ccccgaaccg	gtgacggtgt	cgtggaactc	aggcgccctg	1560
accagcggcg	tgcacacctt	cccggctgtc	ctacagtcct	caggactcta	ctccctcagc	1620
agcgtggtga	ccgtgccctc	cagcagcttg	ggcacccaga	cctacatctg	caacgtgaat	1680
cacaagccca	gcaacaccaa	ggtggacaag	aaagttggtg	agaggccagc	acagggaggg	1740
agggtgtctg	ctggaagcca	ggctcagcgc	tcctgcctgg	acgcatcccg	gctatgcagc	1800
cccagtccag	ggcagcaagg	caggccccgt	ctgcctcttc	acccagaggc	ctctgcccgc	1860
cccactcatg	cccagggaga	gggtcttctg	gctttttccc	caggctctgg	gcaggcacag	1920
gctaggtgcc	cctaacccag	gccctgcaca	caaaggggca	ggtgctgggc	tcagacctgc	1980
caagagccaz	atccgggagg	accctgcccc	tgacctaagc	ccaccccaaa	ggccaaactc	2040
tccactccct	cagctcggac	accttctctc	ctcccagatt	ccagtaactc	ccaatcttct	2100
ctctgcagag	cccaaatctt	gtgacaaaac	tcacacatgc	ccaccgtgcc	caggtaagcc	2160
agcccaggcc	tcgccctcca	gctcaaggcg	ggacaggtgc	cctagagtag	cctgcatcca	2220
gggacaggcc	ccagccgggt	gctgacacgt	ccacctccat	ctcttcctca	gcacctgaac	2280
ccctgggggg	accgtcagtc	ttcctcttcc	ccccaaaacc	caaggscacc	ctcatgatct	2340
cccggacccc	tgaggtcaca	tgcgtggtgg	tggacgtgag	ccacgaagac	cctgaggtca	2400
agttcaactg	gtacgtggac	ggcgtggagg	tgcataatgc	caagacaaag	ccgcgggagg	2460
agcagtacaa	cagcacgtac	cgtgtggtca	gcgtcctcac	cgtcctgcac	caggactggc	2520
tgaatggcaa	ggagtacaag	tgcaaggtct	ccaacaaagc	cctcccagcc	cccatcgaga	2580
aaaccatctc	caaagccaaa	ggtgggaccc	gtggggtgca	agggccacat	ggacagaggc	2640
cggctcagcc	caccctctgc	cctgagagcg	accgctgtac	caacctctgt	ccctacaggg	2700
cagccccgag	aaccacaggt	gtacaccctg	cccccatccc	gggatgagct	gaccaagaac	2760
caggtcagcc	tgacctgcct	ggtcaaaggc	ttctatccca	gcgacatcgc	cgtggagtgg	2820
gagagcaatg	ggcagccgga	gaacaactac	aagaccacgc	ctcccgtgct	ggactccgac	2880
ggctccttct	tcctctacag	caagctcacc	gtggacaaga	gcagatggca	gcaggggaac	2940
gtcttctcat	gczccgtgat	gcatgaggct	ctgcacaacc	actacacgca	gaagagcctc	3000
zccctgtctc	cgggtaaatg	agtgcgacgg	ccggcaagcc	cccgctcccc	gggctctcgc	3060
ggtcgcacga	ggatgcttgg	cacgtacccc	ctgtacatac	ttcccgggcg	cccagcatgg	3120
aaataaagca	cccagcgctg	ccctgggccc	ctgcgagact	gtgatggttc	tttccacggg	3180
tcaggccgag	tctgaggcct	gagtggcatg	agggaggcag	agcgggtccc	actgtcccca	3240

PL 197 143 Β1 cactggccca ggctgtgcag gtgtgcctgg gccccctagg gtggggctca gccaggggct 3300 gccctcggca gggtggggga tttgccagcg tggccctccc tccagcagca cctgccctgg 3360 gctgggccac gggaagccct aggagcccct ggggacagac acacagcccc tgcctctgta 3420 ggagactgtc ctgttctgtg agcgcccctg tcctcccgac ctccatgccc actcgggggc 3480 atgcctagtc catgtgcgta gggacaggcc ctccctcacc catctacccc cacggcacta 3540 acccctggct gccctgccca gcctcgcacc cgcatgggga cacaaccgac tccggggaca 3600 tgcactctcg ggccctgtgg agggactggt gcagatgccc acacacacac tcagcccaga 3660 ccccttcaac aaaccccgca ctgaggttgg ccggccacac ggccaccaca cacacacgtg 3720 cacgcctcac acacggagcc tcacccgggc gaactgcaca gcacccagac cagagcaagg 3730 tcctcgcaca cgtgaacact cctcggacac aggcccccac gagccccacg cggcacctca 3840 aggcccacga gcctctcggc agcttCtcca catgctgacc tgctcagaca aacccagccc 3900 tcctctcaca agggtgcccc tgcagccgcc acacacacac aggggatcac acaccacgtc 3960 acgtccctgg ccctggccca cttcccagtg ccgcccttcc ctgcaggacg gatcagcctc 4020 gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 4080 cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 4140 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 4200 ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga 4260 aagaaccagc tggggctcra gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 4320 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 4380 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc gggcctctca aaaaagggaa 4440 aaaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 4500 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 4560 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 4620 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct tggacagctc agggctgcga tttcgcgcca-4680 aacttgacgg caatcctagc gtgaaggctg gtaggatttt atccccgctg ccatcatggt 4740 tcgaccattg aactgcatcg tcgccgtgtc ccaaaatatg gggattggca agaacggaga 4800 cctaccctgg cctccgctca ggaacgagtt caagtacttc caaagaatga ccacaacctc 4860 ttcagtggaa ggtaaacaaa atctggtgat tatgggtagg aaaacctggt tctccattcc 4920 tgagaagaat cgacctttaa aggacagaat taatatagtt ctcagtagag aactcaaaga 4980 accaccacga ggagctcatt ttcttgccaa aagtttggat gacgccttaa gacttattga 5040 acaaccggaa ttggcaagra aagtagacat ggtttggata gtcggaggca gttctgttta 5100 ccaggaagcc atgaatcaac caggccaccz tagactcttt gtgacaagga tcatgcaaga 5160 atttgaaagt gacacgtttt tcccagaaat tgatttgggg aaatataaac ttctcccaga 5220 atacccaggc gtcctctctg aagtccagga ggaaaaaggc atcaagtata agtttgaagt 5280 ctacgagaag aaagactaac aagaagatgc tttcaagttc tctgctcccc tcctaaagct 5340 atgcattttt ataagaccat gggacttttg ctggctttag atctctttgt gaaggaacct 5400 tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta 5460 aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt 5520 tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa 5580 aacctgtttt gctcagaaaa aatgccatct agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa 5640 cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccttcagaa 5700 ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt 5760 zacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atattctgta 5820 acctttataa gtaggcataa cagttaraar cataacatac tgttttttct tactccacac 5880 aggcatagag tgtctgctat taataactat gctcaaaaat tgtgtacctt tagcttttta 5940 atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg ccctgactag agatcataat 6000 cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct 6060 gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa 6120

PL 197 143 Β1 tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 6180 ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcggctggat 6240 gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc 6300 agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 6360 ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat 6420 accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 6480 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 6540 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 6600 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 6660 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 6720 gctgcggcga gcggtatcag- ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 67 80 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 6840 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 6900 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 6960 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 7020 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 7080 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 7140 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 7200 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 7260 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 7320 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 7380 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 7440 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 7500 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 7560 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtza 7620 ccaaugctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7680 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7740 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7800 gccacccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 7860 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 7920 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 7980 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 8040 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 8100 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 8160 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 8220 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 8280 cattggaaaa ęgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 8340 ctcgargtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8400 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8460 gaaazgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8520 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8580 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 8614 <210> 6 <211> 8858 <212> DNA <213> Ludzka i mysia

PL 197 143 B1

<400> 6
gacggatcgg	gagatctgct	agcccgggtg	acctgaggcg	cgccggcttc	gaatagccag	60
agtaaccttt	ttttttaatt	ttattttatt	ttatttttga	gatggagttt	ggcgccgatc	120
tcccgatccc	ctatggtcga	ctctcagtac	aatctgctct	gatgccgcat	agttaagcca	180
gtatctgctc	cctgcttgtg	tgttggaggt	cgctgagtag	tgcgcgagca	aaatttaagc	240
tacaacaagg	caaggcttga	ccgacaattg	catgaagaat	ctgcttaggg	ttaggcgttt	300
tgcgctgctt	cgcgatgtac	gggccagata	tacgcgttga	cattgattat	tgactagtta	360
ttaatagtaa	tcaattacgg	ggtcattagt	tcatagccca	tatatggagt	tccgcgttac	420
ataacttacg	gtaaatggcc	cgcctggctg	accgcccaac	gacccccgcc	cattgacgtc	480
aataatgacg	tatgttccca	tagtaacgcc	aatagggact	ttccattgac	gtcaatgggt	540
ggactattta	cggtaaactg	cccacttggc	agtacatcaa	gtgtatcata	tgccaagtac	600
gccccctatt	gacgtcaatg	acggtaaatg	gcccgcctgg	cattatgccc	agtacatgac	660
cttatgggac	tttcctactt	ggcagtacat	ctacgtatta	gtcatcgcta	ttaccatggt	720
gatgcggttt	tggcagtaca	tcaatgggcg	tggatagcgg	tttgactcac	ggggatttcc	780
aagtctccac	cccattgacg	tcaatgggag	tttgttttgg	caccaaaatc	aacgggactt	840
tccaaaatgt	cgtaacaact	ccgccccatt	gacgcaaatg	ggcggtaggc	gtgtacggtg	900
ggaggtctat	ataagcagag	ctctctggct	aactagagaa	cccactgctt	actggcttat	960
cgaaattaat	acgactcact	atagggagac	ccaagcttgg	taccatggaa	gccccagctc	1020
agcttctctt	cctcctgcta	ctctggctcc	cagataccac	cggagacatt	gttctgactc	1080
agtctccagc	caccctgtct	gtgactccag	gagatagagt	ctctctttcc	tgcagggcca	1140
gccagagtat	tagcgactac	ttacactggt	atcaacaaaa	atcacatgag	tctccaaggc	1200
ttctcatcaa	atatgcttcc	cattccatct	ctgggatccc	ctccaggttc	agtggcagtg	1260
gatcagggtc	agatttcact	ctcagtatca	acagtgtgga	acctgaagat	gttggaattt	1320
attactgtca	acatggtcac	agctttccgt	ggacgttcgg	tggaggcacc	aagctggaaa	1380
tcaaacgtaa	gtctcgagtc	tctagataac	cggtcaatcg	gtcaatcgat	tggaattcta	1440
aactctgagg	gggtcggatg	acgtggccat	tctttgccta	aagcattgag	tttactgcaa	1500
ggtcagaaaa	gcatgcaaag	ccctcagaat	ggctgcaaag	agctccaaca	aaacaattta	1560
gaactttatt	aaggaatagg	gggaagctag	gaagaaactc	aaaacatcaa	gattttaaat	1620
acgcttcttg	gtctccttgc	tataattatc	tgggataagc	atgctgtttt	ctgtctgtcc	1680
ctaacatgcc	cttatccgca	aacaacacac	ccaagggcag	aactttgtta	cttaaacacc	1740
atcctgtttg	cttctttcct	caggaactgt	ggctgcacca	tctgtcttca	tcttcccgcc	1800
atctgatgag	cagttgaaat	ctggaactgc	ctctgttgtg	tgcctgctga	ataacttcta	1860
tcccagagag	gccaaagtac	agtggaaggt	ggataacgcc	ctccaatcgg	gtaactccca	1920
ggagagtgtc	acagagcagg	acagcaagga	cagcacctac	agcctcagca	gcaccctgac	1980
gctgagcaaa	gcagactacg	agaaacacaa	agtctacgcc	tgcgaagtca	cccatcaggg	2040
cctgagctcg	cccgtcacaa	agagcttcaa	caggggagag	tgttagaggg	agaagtgccc	2100
ccacctgctc	ctcagttcca	gcctgacccc	ctcccatcct	ttggcctctg	accctttttc	2160
cacaggggac	ctacccctat	tgcggtcctc	cagctcatct	ttcacctcac	ccccctcctc	2220
ctccttggct	ttaattatgc	taatgttgga	ggagaatgaa	taaataaagt	gaatctttgc	2280
acctgtggtt	tctctctttc	ctcatttaat	aattattatc	tgttgtttta	ccaactactc	2340
aatttctctt	ataagggact	aaatatgtag	tcatcctaag	gcacgtaacc	atttataaaa	2400
atcatccttc	attctstttt	accctatcst	cctctgcaag	acagtcctcc	ctcaaaccca	2460
caagccttct	gtcctcacag	tcccctgggc	catggtagga	gagacttgct	tccttgtttt	2520
cccctcctca	gcaagccctc	atagtccttt	ttaagggtga	caggtcttac	agtcatatat	2580
cctttgattc	aattccctga	gaatcaacca	aagcaaattt	ttcaaaagaa	gaaacetgct	2640
ataaagagaa	tcattcattg	caacatgata	taaaataaca	acacaataaa	agcaattaaa	2700
taaacaaaca	atagggaaat	gtttaagttc	atcatggtac	ttagacttaa	tggaatgtca	2760
tgccttattt	acatttttaa	acaggtactg	agggactcct	gtctgccaag	ggccgtattg	2820

PL 197 143 Β1 agtactrtcc acaacctaat ttaatccaca ctatactgtg agattaaaaa cattcattaa 2880 aatgttccaa aggttccata aagctgagag acaaatatat tctataactc agcaatccca 2940 cctctaaatg actgagtgtc cccacccacc aaaaaactat gcaagaatgt tcaaagcagc 3000 tttatttaca aaagccaaaa attggaaata gcccgattgt ccaacaatag aatgagttat 3060 taaactccgg tatgtttata cattagaata cccaatgagg agaattaaca agctacaact 3120 atacctactc acacaaatga atctcataaa aataatatta cataagagaa actcaatgca 3180 aaagatatgt tctgtatgtt ttcatccata taaagttcaa aaccaggtaa aaataaagtt 3240 agaaatttgg atggaaatta ctcttagctg ggggtgggcg agttagtgcc tgggagaaga 3300 caagaaaggg cttctggggt cttggtaatg ttctgttcct cgtgtggggt tgtgcagtta 3360 tgatctargc actgttctgt atacacatta tgcttcaaaa taacttcaca taaagaacat 3420 cttataccca gttaatagat agaagaggaa taagtaatag gtcaagacca acgcagctgg 3480 taagtggggg cctgggatca aatagctacc tgcctaatcc tgcccwcttg agccctgaat 3540 gagtctgcct tccagggctc aaggtgctca acaaaacaac aggcctgcta ttttcctggc 3600 atctgtgccc tgtttggcta gctaggagca cacatacata gaaattaaat gaaacagacc 3660 ttcagcaagg ggacagagga cagaattaac cttgcccaga cactggaaac ccatgtatga 3720 acactcacat gtttgggaag ggggaagggc acatgtaaat gaggactctt cctcattcta 3780 tggggcactc tggccctgcc cctctcagct actcatccat ccaacacacc tttctaagta 3840 cctctctctg cctacactct gaaggggttc aggagtaact aacacagcat cccttccctc 3900 aaatgaczga caatcccttt gtcctgcttt gtttttcttt ccagtcagta ctgggaaagt 3960 ggggaaggac agtcatggag aaactacata aggaagcacc ttgcccttct gcctcttgag 4020 aatgttgatg agtatcaaat ctttcaaact ttggaggttt gagtaggggt gagactcagt 4080 aatgtccctt ccaatgacat gaacttgctc actcatccct gggggccaaa ttgaacaatc 4140 aaaggcaggc ataatccagt tatgaattct tgcggccgct tgctagcttc acgtgttgga 4200 tccaaccgcg gaagggccct attctatagt gtcacctaaa tgctagagct cgctgatcag 4260 cctcgactgt accttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 4320 tgaccccgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 4380 attgtccgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 4440 aggattcgga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg 4500 cggaaacaac cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4560 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4620 ccgctccttt cgctttcrtc ccttcctttc tcgccacgtt cgccgggcct ctcaaaaaag 4680 ggaaaaaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta accccgccca 4740 tcccgcccct aactccgccc aactccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 4800 ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgaact attccagaag tagtgaggag 4860 gcttttrtgg aggcctaggc ttttgcaaaa agcttggaca gctcagggct gcgatttcac 4920 gccaaacttg acggcaatcc tagcgtgaag gctggtagga ttttaccccc gctgccatca 4980

-ggttcgacc attgaactgc atcgtcaccg tgtcccaaaa tatggggatt ggcaagaacg 5040 gagacctacc ctggcctccg ctcaggaacg agttcaagta cttccaaaga atgaccacaa 5100 cctcttcagt ggaaagtaaa cagaatctgg taattatggg taggaaaacc zggttctcca 5160 ttcctgagaa gaatcgacct ttaaaggaca gaattaatat agttctcagt agagaactca 5220 aagaaccacc acgaggagct cattrtcttg ccaaaagttt ggatgacgcc ttaagactza 5280 ttgaacaacc ggaattggca agtaaagtag acatggtttg gatagtcgga ggcagttctg 5340 tttaccagga agccatgaat caaccaggcc accttagact ctttgtgaca aggatcatgc 5400 aggaatttga aagtgacacg tttttcccag aaattgattt ggggaaatat aaacttctcc 5460 cagaataccc aagcgtcctc tctgaggtcc aggaggaaaa aggcatcaag tataagtttg 5520 aagtctacga gaagaaagac taacaggaag atgctttcaa gttctctgct cccctcctaa 5580 agctatgcat ttttataaga ccatgggact tttgctggct ttagatctct ttgtgaagga 5640 accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa 5700

PL 197 143 Β1 ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tattaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt 5760 attttagatt ccaacctatg gaactgataa atgggagcag tggtggaatg cctttaatga 5820 ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc 5880 tcaacattct actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc 5940 agaattgcta agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc 6000 tatttacacc acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc 6060 tgtaaccttt ataagtaggc ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc 6120 acacaggcat agagtgtctg ctattaataa ctatgctcaa aaattgtgta cctttagctt 6180 tttaatttgt aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca 6240 taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 6300 ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 6360 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 6420 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcggct 6480 ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 6540 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 6600 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 6660 gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 6720 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 6780 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 6840 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggcćaacgc gcggggagag 6900 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6960 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 7020 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 7080 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 7140 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac ćaggcgtttc 7200 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 7260 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 7320 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 7380 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 7440 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 7500 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 7560 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aa agagttgg tagctcttga tccggcaaac 7620 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 7680 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 7740 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7800 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7860 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7920 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7980 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 8040 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 8100 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 8160 acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 8220 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tacaaaaaag 8280 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 8340 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 3400 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 8460 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 8520 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8580

PL 197 143 B1 cca^tcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8640 gcgtttctgg gtgagcaaaa a^gg^ggc aaaatgccgc taaaatgggt ataagggcga 6700 cacggaaatg ttgaatactc ttttccaata ttatggaagc atttatcagg 8760 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8820 ^ccgc^^c attŁccccga taagtgtcat ctgacgtc 8858

<210>	7
<211>	321
<212>	DNA
<213>	Ludzka i mysia
<400>	7

gaaattgtgt tgaaacagtc tccagccacc ectttcttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca ggataatagc gaatacctac aatggtacca atctgtatct 120 ^^agę^c ccaggcgcct ccaccattac gctaccccaC cccatcctgg 0^0003900 180 agę^^g^ gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ecaacagcag 240 gaagaatttg cagtttatta ctgtcagcaa ggccactctt tcccttggac cttcggaggg 300 gggtccatgg tggaaattaa a 321 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Ludzka i mysia <400> 8

GLu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Ara

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

GLn

Ser

Ile

Ser

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

GLn

Lys

Pro

Gly

GLn

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

ALa

Ser

His

Ser

Ile

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

GLy

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Lle

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

His

Gly

His

Ser

Phe

Pro

Trp

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 9

PL 197 143 Β1 <211> 366 <212> DNA <213> Ludzka i mysia <400> 9 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcact accactggca tgcagtgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacaccc acagcggggt cccaaagtat 180 gtcgaggact tcaaaggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc gagatctggc 300 aatgggaact atgacctggc atactttaag tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Ludzka i mysia <400> 10

Gin 1

Val

Gin Leu Val Gin 5

Ser Gly Ser Glu 10

Leu Lys Lys

Pro Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Thr

20

25

30

Gly

Met

Gin

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

His

Ser

Gly

Val

Pro

Lys

Tyr

Val

Glu

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Giy

Asn

Gly

Asn

Tyr

Asp

Leu

Ala

Tyr

Phe

Lys

Tyr

Trp

100

105

110

Giy

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115 120 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> Ludzka i mysia

PL 197 143 Β1 <400> 11 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccigtca gagtattagc gattacttac attggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctattac gcatcccact ccatctctgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccactagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcat ggccactctt atccttggac cttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaattaa a 321 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Ludzka i mysia

<400> 12

Gin

Ser

Pro Ala

Thr 10

Leu Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Asp

Tyr

20

25

30

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

His

Ser

Ile

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Glu

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Cys

Gin

His

Gly

His

Ser

Tyr

Pro

Trp

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100 105 <210> 13 <211> 366 <212> DNA <213> Ludzka i mysia <400> 13 cagatccagt tggtgcaatc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaggatc 60 tcctgcaagg cttctgggta tgccttcaca actactggaa tgcagtgggt gcaagagatg 120 ccaggaaagg gtttgaagtg gattggctgg ataaacaccc actctggagt gccaaaatat 180 gtagaagact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcatat 240 ttacagataa gcaacctcaa aaatgaggac acggctacgt atttctgtgt gagatccggg 300

PL 197 143 B1 aatggtaact atgacctggc ctactttgct tactggggcc aagggacact ggtcactgtc 360 tctgca 366

<210>	14
<211>	324
<212>	DNA
<213>	Ludzka i mysia
<400>	14

gacattgttc tggatcaggc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60 ctttcctgca ggggacgcca gagtattagc gactacttac aetggtataa aaaaaaataa 120 aatgagtcta catcaaatat gcttcccatt ccatctctgg gatcceatea 180 aggttcagtg ggcatęgata agggtcagat ttaaetataa gtatcaacag tgtęrgaacct 240 gaagatgttg ggatttatta ctttaaacat ggtcacagct ttaegtggaa gttaggtgga 300 aacaccaaac taggtataaa ^c^^t 324

Claims

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmienny region łańcucha I ekkiego I ub łańcucha ciężkiego wybesus k geupy nbcjmujczcj:

s) cząsteczko kwasu nukleinowego zkwieeejącc sukwanoję nukiecdeclowa o nummeek SEQ I D NO: 5 lub 6.

b) cząsteczko kwasu rιukleinowaco ikwiec^ącc stcwa^ją nuklecdyyowa kodująca kukwakcją smiuokwsuowc o ucmcekc SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 8, 10 lub 12;

z) c^^^ue^c;^^a? kwasu nukloinowaco kodującą bic^loc^ic^r^^^ asaewaą częęć recionu zmiennocg ko0owsucgo pekck zkąutczkkę kasuc ukklciudwcgd jsk poOsuo w s) lub w b); i

0) cząstecząo kwasu kukleinowacg kkwienejąca kukwakoją kuklectyyową kodująca kukwakoją smiudkwsudwą, któes jcut zo usjmuicj w 90% iOcutyzkus k uckwcuzją smiudkwsudwą kd0dwsuą pekck którckolwick k uckwcuzji smiuokwsuowyza oO s) Oo z).

2. kwasu nuHeinowicg kodującz chimeryczne zawionejącz łaricuch

Ickki i łsCzcza ziężki wybesus k grupy dbcjmujązcj:

s) cząsueczkę kwasu πι^Ι^Ι^ϊι^<^\^^(^ο zawierającą sekwencję nuWeotydową kodującą region kmicuuy łsCzkzas Ickkicgo pouisOsjczy uckwcuzję smiudkwsudwą o uumcekc SEQ ID NO: 1 lub jej biologizkuic sktywuc zkęść oesk łsCzkza ziężki;

b) cząsueczkę kwasu nukeinowego zawierającą sekwencZę nukleotydową kodującą region kmicuuy łsCzkzas lckkicgo pouisOsjczy uckwcuzję smiudkwsudwą o uumcekc SEQ ID NO: 2 lub jcj biologizkuic sktywuc zkęść oesk łsCzkza lckki;

z) cząsueczkę kwasu nuWeinowego zawierającą sekwoi-icZę nukleotydową kodującą region kmicuuy łsCzkzas lckkicgo pouisOsjczy uckwcuzję smiudkwsudwą o uumcekc SEQ ID NO: 1 lub jcj biologizkuic sktywuc zkęść oesk ecgiou kmicuuy łsCzkzas ziężkicgo pouisOsjczy uckwcuzję smiuoOwsuowc SEQ ID NO: 2 lub jcj biologizkuic sktywuc Zkęść;

O) cząsueczkę kwasu nukeinowego zawierającą sekwencZę nukleotydową kodującą region kmicuuy łsCzkzas lckkicgo pouisOsjczy uckwcuzję smiudkwsudwą, któes jcut zo usjmuicj w 90% iOcutyzkus k uckwcuzją smiudkwsudwą o uumcekc SEQ ID NO: 1 oesk łsCzkza ziężki; i

c) cząsueczkę kwasu nukeinowego zawierającą sekwencZę nukleotydową kodującą region kmicuuy łsCzkzas ziężkicgo pouisOsjczy uckwcuzję smiudkwsudwą, któes jcut zo usjmuicj w 90% iOcutyzkus k uckwcuzją smiudkwsudwą SEQ ID NO: 2 oesk łsCzkza lckki.

3. Cząsueczka kwasu nukleinoweco kod^ąca humanicowane przeciwciało wybrane z grupy dbcjmujązcj:

PL 197 143 B1

a) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą część regionu zmiennego łańcucha lekkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencje aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1;

b) cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwenecę niJ^I(^(^tt^(^c^\wą kodującą część regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencje aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 2.

c) cząstoczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodLuącą część regionu zmiennego łańcucha lekkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub 12;

d) cząs1:eczkę kwasu nukleinowego sekwenecę nukleotydową kod^ącą część regionu zmiennego łańcucha ciężkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10;

e) cząs1:eczkę kwasu nukleinowego sekwenecę nukleotydową kod^ącą część regionu zmiennego łańcucha lekkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencje aminokwasową o numerze SEQ ID NO: 1 oraz sekwencję nukleotydową kodującą zmienny region łańcucha ciężkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10;

f) ccąsh3eckękw^asunnkk5hioo^eegzzv^k3nrójcąsekw^encćjnnkk5eh/ydo^ą ko0ującącczśśreeiOt nu zmiennego łańcucha lekkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub 12 oraz sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha ciężkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 10; i

g) cząs1:eczkę kwasu nukleinowego sekwenecę nukleotydową kodLuącą część regionu zmiennego łańcucha ciężkiego lub jej biologicznie aktywną część posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 i sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha lekkiego posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8 lub 12.

4. Wektor ekspress zawierający cząsteczkę kwasu nukleinoweeo jak zdefiniowano w jednym z zasti^. 1 do 3.

5. Komórka gospocJarza zawierająca ccąsteeckę kwesu nuj aj zZdfinioweso w j eenym z zastrz. 1 do 3 lub wektor jak zdefiniowano w zastrz. 4.

6. Region zmienny lekkiego łańcucha lub ciężkiego łańcucha kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1.

7. Chimeryczne przeciwciało kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 2.

8. Humanizowaje przeciwciz-o kę0oweso ρ^- ccąsteeckę nwesu nukleinoweeo nzwierajacą sekwencję nukleotydową jak zdefiniowano w zastrz. 3.

9. Chime-yccne przeciwcia-o j ak zdefiniowano w z^^sr^. 7 I ub humanizowane przeciwciało j ak zdefiniowano w zastrz. 8, które wiąże się z ludzkim CD40.

10. Kompozycja narmaceujyccna zawierająca chime-yccne przeciwcia-o j ak zdefiniowano w zastrz. 7 lub humanizowane przeciwciało jak zdefiniowano w zastrz. 8.

11. Zastosowesiz chimeryccneegprzeciwciała j jk zZefinizwaso w zastrz. 7 i ub humanizowanego przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób w których pośredniczą komórki T.

12. Zastosowanie według zaj^z. 11, znamienne tym, że wepomniznochoroby obermują neakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu, cukrzycę Typu I, łuszczycę, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy toczeń rumieniowaty lub miastenię ciężką rzekomoporaźną.

13. Zastosowesizchimerzycr^oeo przeciwciz-aj ak zZefiniowaso w zastrz. 7 I ub humanizowanego przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby charakteryzowanej przez komórki CD40-pozytywne.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że CD40-pozytywne są Κογπογkami nowotworowymi lub złośliwymi.