SK12092000A3 - Protilátky proti ľudským CD40 - Google Patents

Description

1 1J? Um-um PROTILÁTKY PROTI ĽUDSKÝM CD40

Doterajší stav techniky

Imunitné/zápalové odpovede sú sprostredkované komplexnou sériou interakcií. Jeden pár receptoru/ligandu, ktorý sa ukázal ako dôležitý v týchto procesoch, je CD40/gp39. Interakcia gp39/CD40 sprostredkuje rad dôležitých signálnych udalostí medzi aktivovanými T-bunkami a inými efektorovými bunkami imunitného systému, ktoré vedú k amplifikácii imunitnej/zápalovej odpovedi. Odpovede na signalizáciu prostredníctvom CD40 zahrňujú pomoc T-buniek B-bunkám v humorálnej imunitnej odpovedi, indukcii cytokínov monocytmi a expresii adhézie molekúl endoteliálnymi bunkami. CD40 je typ I receptora na bunkovom povrchu a patrí do skupiny supergénov receptorov faktoru nekrózy tumoru (TNFR). Napriek tomu, že bol pôvodne identifikovaný ako antigén B-buniek, dnes sa predpokladá, že jeho expresia je spôsobovaná všetkými antigén-prezentujúcimi bunkami (APC), vrátane dendritových buniek, keratínocytov a monocytov. Expresia CD40 je tiež spôsobená bunkovými typmi, ktoré za určitých podmienok môžu pôsobiť ako APC, ako napríklad vaskulárnymi endoteliálnymi bunkami alebo bunkami zúčastňujúcimi sa priamych interakcií s T-bunkami alebo prekurzormi T-buniek, ako napríklad epiteliálnymi bunkami týmusu. Nedávno sa tiež ukázalo, že expresia CD40 môže byť spôsobená fibroblastami, eozinofilmi a aktivovanými T-bunkami. Expresia CD40 bola tiež pozorovaná v rakovinových bunkách. Dôkazy na to sú primárne odvodené od identifikácie niektorých bunkových línií odvodených od karcinómov a melanómov, ktoré sú CD40+. (Clark a Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 4494 - 4498 (1986); Schriever a koľ, J. Exp. Med. 169. 2043 - 2058 (1989); Caux a koľ, J. Exp. Med. 180. 1263 -1272 (1994); Alderson a koľ, J. Exp. Med. 178, 669 - 674 (1993); Young a koľ, Int. J. Cancer 43, 786 - 794 (1989); Paulie a koľ, Cancer Immunoľ Immunother. 20, 23 - 28 (1985); Denfeld a koľ, Eur. J. Immunoľ 26, 2329 - 2334 (1996); Gašpari a koľ, Eur. J. Immunoľ 26, 1371 - 1377 (1996); Peguet-Navarro a koľ, J. Immunoľ 158. 144 - 152 (1997); Hollenbaugh a koľ, J. Exp. Med. 182. 33 -40 (1995); Galy a Spits, J. Immunoľ 149. 775 - 782 (1992); T-bunky. Gp39 je známy tiež ako CD40L, TRAP, T-BAM a teraz má oficiálne 2 označenie CD zworkshopu o leukocytoch CD154. V skúškach in vitro sa objavuje gp39 na T-bunkách približne 2 až 4 hodiny po aktivácii T-buniek a najvyššie hladiny dosahuje po 6 až 8 hodinách. Hladina proteínu potom rýchlo klesá a 24 hodín po stimulácii už nie je detegovateľná. Expresia gp39 bola tiež detegovaná na eozinofiloch a mastocytoch (Noelle a koľ. Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 6550 - 6554 (1992); Hollenbaugh a kol., EMBO J. Y\_, 4313 - 4321 (1992); Spriggs a kol., J. Exp. Med. 176. 1543 - 1550 (1992); Graf a koľ, Eur. J. Immunol. 22, 3191 - 3194 (1992); Covey a kol., Mol. Immunol. 31., 471 - 484 (1994); Castle a koľ, J. Immunol. 151. 1777 -1788 (1993); Roy a koľ, J. Immunol. 151, 2497 - 2510 (1993); Gauchat a koľ, Náture 365. 340 - 343 (1993); Gauchat a koľ, Eur. J. Immunol. 25, 863 - 865 (1995); Koshy a koľ, J. Clin. Invest. 98. 826 - 837 (1996); Desai-Mehta a koľ, J. Clin. Invest. 97, 2063-2073 (1996). CD40 je silný signálny receptor, poskytujúci mechanizmus pre aktivované T-bunky na reguláciu širokého okruhu imunitných a zápalových odpovedí. Štúdie in vitro a in vivo s rekombinantnými formami ligandov gp39 a s anti-CD40 monoklonálnymi protilátkami ukázali, že signalizácia prostredníctvom týchto receptorov vedie k bunkovej odpovedi u všetkých známych CD40* buniek a tento výsledok sa odlišuje nielen pri type buniek, ale je tiež modulovaný súbežnými signálnymi udalosťami sprostredkovanými ostatnými receptormi. V B-bunkách napríklad signalizácia CD40 v spojení so signalizáciou IL-4 receptormi vedie k proliferácii B-buniek a tvorbe protilátok izotypu IgE, zatiaľ čo signalizácia CD40 v spojení so signálmi zlL-10 receptora vedie k proliferácii B-buniek a tvorbe protilátok izotypu IgG (Gordon a koľ, Eur. J. Immunol. 17, 1535 -1538 (1987); Rouset a koľ, J. Exp. Med. 173, 705 - 710 (1991); Jabara a koľ, J. Exp. Med. 172, 1861 - 1864 (1990); Gascan a koľ, J. Immunol. 147, 8 - 13 (1991). Signalizácia CD40 sprostredkovaná gp39 môže hrať úlohu v bunkovej imunite prostredníctvom indukcie CD80 a CD86, dôležitých kostimulačných molekúl T-buniek, ktoré viažu CD28 a CTLA4 (Goldstein a koľ, Moľ Immunol. 33, 541 - 552 (1996).

Systém receptor/ligand CD40/gp39 je jedným z mnohých systémov, zapojených do produktívnej interakcie medzi aktivovanými T-bunkami a inými bunkami imunitného systému Avšak rad poznatkov ukazuje, že táto interakcia je jedinečná a ústredná v regulácii humorálnej imunitnej odpovede u ľudí. Najmä t r 3 defekty v expresii alebo štruktúre gp39 sa ukázali ako príčina ľudskej imunodeficiencie známej ako hyper IgM syndróm (HIM), viazaný na X-chromozóm. Táto imunodeficiencia je charakterizovaná neschopnosťou postihnutých jedincov vytvárať iné protilátky ako daného IgM izotypu, čo indikuje, že produktívna interakcia medzi gp39 a CD40 je nutná pre účinnú humorálnu odpoveď (Alien a koľ, Science 259. 990 - 993 (1993); Aruffo a kol., Celí 72, 291 - 300 (1993); Di Santo a kol., Náture 361. 541 - 543 (1993); Fuleihan a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. 90(6). 2170 -2173 (1993); Korthauer a koľ, Náture 361. 539 - 541 (1993); Notarangelo a koľ, Immunodef. Rev. 3, 101 -122 (1992). Podobne posledné údaje indikujú, že HIM syndróm, ktorý nie je viazaný na X-chromozóm u ľudí, je spôsobený defektmi v molekule CD40. Použitím technológie, vedúcej ku knockoutu génu (vyradenie génu z činnosti), boli pripravené myši, ktorým chýba CD40 alebo gp39. Tieto myši prejavujú fenotyp, ktorý má rovnaké charakteristiky ako HIM syndróm, z čoho možno predpokladať, že myš môže slúžiť ako vhodný model, na ktorom možno vyskúšať in vivo účinky liečby buď anti-CD40 alebo anti-gp39 monoklonálnych protilátok, ktoré blokujú interakciu medzi CD40 a gp39 (Kawabe a koľ, Immunity 1, 167 - 178 (1994); Xu a koľ, Immunity 1, 423 - 431 (1994); Renshaw a koľ, J. Exp. Med. 180, 1889 -1900 (1994); Castigli a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 12135 -12139 (1994). Účinky in vivo inhibicie interakcie CD40/gp39 sa intenzívne študovali na normálnych myšiach a myších modeloch choroby s použitím škrečej monoklonálnej protilátky proti myšej gp39 (MR1). Imunosupresívna kapacita protilátky sa odráža v jej schopnosti kompletne inhibovať humorálnu imunitnú odpoveď na T-bunky dependentné antigény (Foy a koľ, J. Exp. Med. 178. 1567 - 1575 (1993). Na niekoľkých myších modeloch chorôb sa tiež ukázalo, že tieto choroby boli inhibované liečbou protilátkou, vrátane tých chorôb, sprostredkovaných bunkovými imunitnými odpoveďami. Ukázalo sa, že modely chorôb boli inhibované liečbou anti-gp39, vrátane artritídy indukovanej kolagénom, experimentálnej alergickej encefalomyelitídy, lupus nefritis, rejekcie transplantátov a reakcie štepu proti hostiteľovi (Durine a koľ, Science 261. 1328 - 1330 (1993); Berry a koľ, nevydané; Gerritse a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 2499 - 2504 (1995); Mohan a koľ, J. Immunoľ 154. 1470 - 1480 (1995); Larsen a koľ, Transplantation 61, 4 - 9 (1996); Hancock a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 13967 - 13972 (1996); Parker a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 9560 - 9564 (1995); Durie a koľ, J. Clin. Invest. 94. 4 1333 - 1338 (1994); Wallace a kol., nevydané). Úloha CD40/gp39 v amplifikácii bunkovej imunitnej odpovede môže byť priama, prostredníctvom stimulácie subpopulácie aktivovaných T-buniek, ktoré sú schopné expresie CD40 alebo nepriamo prostredníctvom indukcie cytokínov a expresie dôležitých kostimulačných molekúl bunkového povrchu, ako CD80 a CD86, ktoré viažu k T-bunkám receptory CD28 a CTLA-4. Protizápalové účinky inhibítorov boli ukázané štúdiami na myšom modeli poškodenia pľúc indukovanom kyslíkom. Účinky na zápal in vivo sa predpokladajú na základe výsledku in vitro, ktoré ukazujú stimuláciu CD40 na bunkách cievneho endotelu a monocytoch, ktorých výsledkom je expresia molekúl bunkovej adhézie, oxidu dusnatého (NO), metaloproteinázy matrixu a prozápalových cytokínov (Kiener a kol., J. Immunol. 155. 4917 - 4925 (1995); Malik a kol., J. Immunol. 156, 3952 - 3960 (1995); Hollenbaugh a kol., J. Exp. Med. 182, 33 - 40 (1995). Štúdie s monoklonálnymi protilátkami proti ľudským gp39 na opiciach ukázali, že biologické látky, ktoré inhibujú interakciu medzi gp39 a CD40 in vivo sú účinnými imunosupresivnymi látkami u primátov. Anti-gp39 monoklonálne protilátky sa ukázali účinnými v inhibícii protilátkových odpovedí na antigény dependentné na T-bunkách a pri ochrane alografných štepov pred rejekciou. Tieto výsledky sú analogické ako u hlodavcov. Štúdie uvedené vyššie súhrnne ukázali, že látky, ktoré prerušujú interakciu medzi gp39 a CD40, budú silné imunosupresívne a protizápalové látky. Preto je potrebný účinný spôsob blokovania interakcie CD40/gp39, aby poskytol imunosupresívny a protizápalový účinok. Cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť protilátku, ktorá blokuje interakciu medzi gp39 a CD40. Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť chimému protilátku účinnú pri blokovaní interakcie medzi CD40 a gp39.

Doplnkovým cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť humanizovanú protilátku účinnú pri blokovaní interakcie medzi CD40 a gp39. Ďalším cieľom predloženého vynálezu je spôsob modulácie imunitnej odpovede podávaním protilátky, chimérnej protilátky alebo humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu. Spôsob môže byť účinný pri liečbe mnohých autoimunitných chorôb, rovnako ako transplantácie kože a iných orgánov. 5

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález zahrňuje novú protilátku, výhodnejšie chimerizovanú monoklonálnu protilátku proti ľudským CD40, ktorá blokuje interakciu medzi gp39 a CD40. V jednom uskutočnení podľa predkladaného vynálezu je zvlášť výhodná chimerizovaná monoklonálna protilátka proti ľudským CD40 nazývaná „chi220„. Chi220 je chimérna protilátka obsahujúca rozličné myšie a ľudské kappa a gama 1 konštantné oblasti. Chi220 sa, ako jej materská myšia m-protilátka, viaže na CD40 a výsledkom je účinné blokovanie humorálnej imunitnej odpovede na antigény dependentné na T-bunkách v režime závislom od dávok. V rámci predkladaného vynálezu sú tiež humanizované protilátky proti CD40, ktoré blokujú interakciu medzi gp39 a CD40. V jednom uskutočnení podľa predkladaného vynálezu je humanizovaná protilátka označená ako F4, v inom uskutočnení humanizovaná protilátka je označená ako L3.17. Výhodné humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu zahrňujú ľudské premenlivé ťažké a premenlivé ľahké oblasti s myšími naštepovanými CDRs.

Protilátky proti CD40 podľa predkladaného vynálezu, výhodne chimérne a humanizované protilátky tu opísané sú účinné v modulácii humorálnej imunitnej odpovede proti antigénom dependentným na T-bunkách, artritíde indukovanej kolagénom a rejekciou transplantátov. Protilátky proti CD40 podľa predkladaného vynálezu, výhodne chimérne a humanizované protilátky tu opísané sú tiež užitočné vďaka svojim protizápalovým vlastnostiam (ktoré sú rovnaké ako vlastnosti pozorované u anti-gp39).

Protilátky podľa predkladaného vynálezu, výhodne anti-CD40 chimérne a humanizované protilátky chi220 a anti-CD40 a humanizované protilátky F4 a L3.17 majú široké liečebné uplatnenie, zahrňujúce autoimunitné ochorenia, zápalové ochorenia a transplantácie. Vďaka expresii CD40 pozorovanej v malígnych bunkách niekoľkých histologických typov je evidentné potenciálne uplatnenie protilátok proti CD40 v onkológii, najmä chimérnych a humanizovaných protilátok podľa predkladaného vynálezu.

Nasledujúce skratky sú používané v predkladanej prihláške a sú známe odborníkom v odbore: APC (antigén presenting celí - bunka prezentujúca antigén), CDR (complementarity-determining región - oblasť určujúca komplementárnu), CHO (chinese hamster ovary - vaječník čínskeho škrečka), CIA (collagen-induced arthritis - artritída indukovaná kolagénom), Cmax (maximálna koncentrácia v sére), COS (línia bunkových fibroblastov africkej zelenej opice), DMARD (disease modifying anti-rheumatic drugs - antireumatiká modifikujúce priebeh choroby), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay - enzýmová imunoanalýza), EPT (end point titers -konečné titre), EU (endotoxin units - jednotky endotoxínu), FAB (antigén binding fragment - fragment viažuci antigén), FITC (fluoroizotiokyanát), Hu humanizovaný, h106-2 humanizovaná monoklonálna protilátka proti gp39, HAMA (human anti-mouse antibodies - ľudské protimyšie protilátky), im (intramuskulárny), KLH (keyhole limpet hemocyanin -), mAb monoklonálna protilátka, MTX (metotrexát), OVA (ovalbumín), PBS (phosphate buffered saline - roztok soli pufrovaný fosforečnanom), PCR (polymerase Chain reaction - polymerázová reťazová reakcia), PE (phycoeritherin), sc (subkutánna - podkožná), SDS-PAGE (elektroforéza na géle polyakrylamidu síranu dodecylsodného), SEC (size exclusion chromatography -vylučovacia chromatografia), SRBC (sheep red blood celíš - červené ovčie krvinky), STR (stirred tank reactor - reakčná nádobka s miešaním), TNF (tumor necrosis factor - faktor nekrózy tumoru), VL (premenlivá oblasť ľahkého reťazca protilátky), VH premenlivá oblasť ťažkého reťazca protilátky).

Nukleová kyselina kódujúca výhodný ľahký reťazec chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu (chimérnej protilátky 2.220) bola uložená v Americkej zbierke typov kultúr a bolo jej pridelené vstupné číslo ATCC_. Nukleová kyselina kódujúca výhodný ťažký reťazec chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu (chimérnej protilátky 2.220) bola uložená v Americkej zbierke typov kultúr a bolo jej pridelené vstupné číslo ATCC_.

Nukleová kyselina kódujúca výhodný ľahký reťazec humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu (humanizovanej protilátky F4) bola uložená v Americkej zbierke typov kultúr a bolo je pridelené vstupné číslo ATCC_.

Nukleová kyselina kódujúca doplňujúci výhodný ľahký reťazec humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu (humanizovanej protilátky L3.17) bola uložená v Americkej zbierke typov kultúr a bolo jej pridelené vstupné číslo ATCC_.

Nukleová kyselina kódujúca výhodný ťažký reťazec humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu (F4 a L3.17) bola uložená v Americkej zbierke typov kultúr a 7 bolo jej pridelené vstupné číslo ATCC_.

Tieto spomínané úschovy budú udržované za podmienok Budapeštianskej dohody o medzinárodnom uznávaní úschov mikroorganizmov pre účely patentovej procedúry. Tieto úschovy sú poskytované iba ako výhoda (potreba) pre odborníkov v odbore a nie sú priznaním, že úschova je požadovaná podľa § 112 U.S.C.35. Sekvencia polynukleotidov obsiahnutá v uschovaných látkach, rovnako ako sekvencia aminokyselín polypeptidov nimi kódovaných, sú tu zahrnuté v odkazoch a sú kontrolnými v prípade akéhokoľvek konfliktu s akýmkoľvek opisom sekvencií, tu podaným. Na prípravu, použitie alebo predaj uschovaných látok je možné požadovať licenciu a žiadna táto licencia tu nie je udelená. Všetky odkazy citované v tejto prihláške, ako vyššie tak nižšie uvedené, sú tu zahrnuté v ich celku.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje inhibíciu naviazania sgp39 na Rajiho bunky protilátkami proti ľudskému CD40.

Obrázok 2 je schematickým náčrtom protokolu štúdie u primátov. Dni liečby sú vyznačené kosoštvorcami. Imunizácia SRBC a KLH sú označené obdĺžnikmi a trojuholníkmi. Zvieratá liečené 2.36 neboli zahrnuté v štúdii po fáze I a zvieratá liečené 1.106 neboli zahrnuté v štúdii po fáze II.

Obrázok 3 ukazuje protilátkovú odpoveď anti-SRBC u primátov. Obrázok 3a ukazuje výsledky analýzy IgM protilátok proti SRBC. Obrázok 3b ukazuje výsledky analýzy IgG protilátok proti SRBC.

Obrázok 4a ukazuje sekvenciu premenlivej oblasti ľahkého reťazca chi220 zvýraznené (SEQ ID NO:1) a obrázok 4b ukazuje sekvenciu premenlivej oblasti ťažkého reťazca chi220 zvýraznené (SEQ ID NO:2). Podčiarknuté sekvencie na obrázku 4a a 4b sú vložené signálne sekvencie ľudskej protilátky s najbližšou homológiou, ktoré sa použili ako templát na humanizáciu.

Obrázok 5 ukazuje výsledky skúšok in vitro testujúcich chimérne a humanizované protilátky podľa predkladaného vynálezu. Obrázok 5a ukazuje naviazanie chi220 a h220v3 na hCD40-mG2b v skúške založenej na metóde ELISA. 8 r ·

Obrázok 5b ukazuje inhibíciu kostimulácie ľudských B-buniek s protilátkami proti ľudským CD40 sprostredkovanej sgp39.

Obrázok 6 ukazuje IgM anti-SRBC protilátkovú odpoveď. Obrázok 6a ukazuje výsledky na opiciach získané dávkami 10, 40 alebo 100 mg/kg chi220. Obrázok 6b ukazuje výsledky na opiciach získané dávkami 0,1 alebo 1 mg/kg chi220.

Obrázok 7 ukazuje IgG anti-SRBC protilátkovú odpoveď. Obrázok 7a ukazuje výsledky na opiciach získané dávkami 10, 40 alebo 100 mg/kg chi220. Obrázok 7b ukazuje výsledky na opiciach získané dávkami 0,1 alebo 1 mg/kg chi220.

Obrázok 8 ukazuje anti-OVA protilátkovú odpoveď u primátov. Obrázok 8a ukazuje výsledky analýzy IgM protilátok anti-OVA. Obrázok 8b ukazuje výsledky analýzy IgG protilátok anti-OVA.

Obrázok 9 ukazuje anti-KLH protilátkovú odpoveď u primátov. Obrázok 9a ukazuje výsledky analýzy IgM protilátok anti-KLH. Obrázok 9b ukazuje výsledky analýzy IgG protilátok anti-KLH.

Obrázok 10 ukazuje porovnanie schopnosti protilátky 7E1-G1 a 7E1-G2b znížiť IgG protilátkovej odpovede na SRBC.

Obrázok 11 ukazuje závislosť inhibície protilátkovej odpovede na SRBC pomocou 7E1-G2b od dávky.

Obrázok 12 ukazuje expresiu vektorových máp oblasti ťažkého reťazca a oblasti ľahkého reťazca chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu.

Obrázok 13 poskytuje sekvenciu nukleových kyselín (SEQ ID NO:5) na expresiu vektora, schopnú spôsobiť expresiu ťažkého reťazca chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu. Iniciačný kodón ATG (nukleotidy 1000 - 1002), kódujúci štartujúce Met vložené signálne sekvencie ľudskej protilátky sú zvýraznené. Nukleotidy 1057 až 1422 (SEQ ID NO: 13), ktoré sú podčiarknuté, poskytujú výhodnú sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu premenlivý ťažký reťazec protilátky podľa predkladaného vynálezu.

Obrázok 14 poskytuje sekvenciu nukleových kyselín (SEQ ID NO:6) na expresiu vektora, schopnú spôsobiť expresiu ľahkého reťazca chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu. Iniciačný kodón ATG (nukleotidy 1005 - 1007), kódujúci štartujúce Met vložené signálne sekvencie ľudskej protilátky sú zvýraznené. g

Nukleotidy 1065 až 1388 (SEQ ID NO: 14), ktoré sú podčiarknuté, poskytujú výhodnú sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu premenlivý ľahký reťazec protilátky podľa predkladaného vynálezu.

Obrázok 15 ukazuje poradie premenlivých oblastí reťazcov myšej anti-CD40 a sekvencie ľudského templátu. Sekvencie aminokyselín premenlivých oblastí H a L reťazcov myšej anti-CD40 sa použili na identifikáciu homológnych ľudských sekvencii zárodočných línii. Číslovanie zvyškov a definícia CDRs (podčiarknuté) sú založené na Kabat a koľ (Kabat E. A. a koľ, Sequences of proteins of immunological interst, 5. vydanie (1991). Washington DC: United States department of Health and Human Services: Kabat E. A. a koľ, J. Bioľ Chem. 252. 6609 - 6616 (1977). Rozdiely v sekvencii sú určované vertikálnymi líniami a rámcové pozície charakterizované v kombinatorickej knižnici expresie sú označené hviezdičkou.

Obrázok 16 ukazuje výsledky titrácie humanizovaných anti-CD40 variantov na imobilizovanom antigéne. Charakterizované boli bakteriálny expresovaný chimérny anti-CD40 FAB a zvolené varianty z každej z knižníc. Chimérny (plné kolieska), Hu I-19C11 (prázdne kolieska), Hu II-CW43 (prázdne štvorčeky), Hu III-2B8 (plné trojuholníky) a nevýznamné (plné štvorčeky) FAB sa uvoľnili z periplazmatického priestoru 15 ml bakteriálnej kultúry a jednotlivé, po sebe nasledujúce, zriedenia sa inkubovali s antigénom CD40-lg, imobilizovaným na mikrotitračných doštičkách. Väzba protilátok bola kvantifikovaná spôsobom opísaným nižšie.

Obrázok 18 ukazuje, ako afinita protilátok koreluje s inhibíciou väzby rozpustnej gp39 na CD40-lg. Ligand pre receptor CD40, gp39 sa zachytil na mikrotitračnej doštičke. Následne sa ko-inkubovali rôzne množstvá chimérne (plné kolieska), Hu II-CW43 (prázdne štvorčeky). Hu III-2B8 (plné trojuholníky), Hu ll/lll-2B12 (prázdne trojuholníky) a nevýznamné (plné štvorčeky) FAB s 2 pg/ml CD40-lg na mikrotitračnej doštičke. Väzba CD40-lg na gp39 bola kvantifikovaná spôsobom opísaným nižšie.

Obrázok 18 ukazuje kvantifikáciu myších rámcových zvyškov v aktívnych variantoch. Premenlivé oblasti najaktívnejších variantov anti-CD40 z knižnice rámcovej optimalizácie Hu I (A) a knižnice rámcovej optimalizácie HCDR3 sa sekvencovali, aby sa identifikovali aminokyseliny na pozíciách pracovnej knižnice čítacích rámcov. Každý jednotlivý variant sa kategorizoval na základe celkového • * počtu myších zvyškov, ktoré sa udržali na 8 pozíciách pracovnej knižnice čítacích rámcov. Sekvencovalo sa tridsaťjeden klonov z knižnice Hu I a štrnásť klonov z knižnice Hu II, čo viedlo k identifikácii 24 a 10 jednotlivých variantov. Pevná línia indikuje rozdelenie sekvencií, aké sa očakáva od rovnakého počtu náhodne zvolených variantov.

Podrobný opis vynálezu Pôvodcovia poskytli chimérne a humanizované protilátky proti ľudským CD40 s imunosupresívnymi vlastnosťami. Takéto protilátky proti ľudským CD40 majú zrejmé využitie ako liečivá. Pôvodcovia tiež poskytli úzko spojené monoklonálne protimyšie protilátky proti CD40 (úzko spojené s monoklonálnymi protilátkami proti ľudským CD40), ktoré sú využiteľné na štúdium účinkov monoklonálnych protilátok proti CD40 v rade myších modelov imunitných a zápalových ochorení. Vývoj protilátok proti CD40 komplikuje skutočnosť, že CD40 je silná signálna molekula. Protilátky, ktoré sa viažu na tento antigén, možno kategorizovať na základe schopnosti stimulovať signalizáciu CD40 rovnako ako schopnosti blokovať interakciu CD40/gp39.

Monoklonálna protilátka proti ľudským CD40, predložená prihlasovateľmi patentu, ktorá blokuje interakciu CD40/gp39, bola vybratá z rozsiahleho zoznamu anti-CD40 monoklonálnych protilátok. Protilátka, označovaná ako 2.220, bola chimerizovaná a humanizovaná. „Chimérne,, protilátky zahrňujú ľahký reťazec a ťažký reťazec: ľahký reťazec zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca a stálu oblasť ľahkého reťazca; ťažký reťazec zahrňuje premenlivú oblasť ťažkého reťazca a stálu oblasť ťažkého reťazca. Chimérne protilátky zahrňujú premenlivé oblasti jedného druhu a stále oblasti iného druhu (napríklad myšie premenlivé oblasti spojené s ľudskými stálymi oblasťami). (Pozri napríklad U.S. patenty 4816397 a 4816567). Každá z premenlivých oblastí ľahkého reťazca (VL) a premenlivých oblastí ťažkého reťazca (VH) sa skladá z „rámcových,, oblastí prerušených tromi hyperpremenlivými oblasťami nazývanými „oblasti určujúce komplementaritu„ alebo „CDRs„: „Humanizované,, protilátky obsahujú protilátky s ľudskými premenlivými oblasťami, kombinované s CDRs z darcovského myšieho alebo krysieho imunoglobulínu. (Pozri napríklad U.S. patent 5530101). Humanizované protilátky 11 obsahujúce CDRs, odvodené z myších premenlivých reťazcov opísaných tu, sú tiež zahrnuté v rámci predkladaného vynálezu.

Najzrejmejšia prístupová cesta k humanizácii protilátky sa skladá z naštepovania CDRs od darcovskej monoklonálnej protilátky na ľudský rámec (Jone P. T. a kol., Náture 321. 522 - 525 (1986). Avšak isté zvyšky rámcov podporujú štruktúru CDR a kontaktný antigén očkujúci myšiu CDRs na ľudské rámcové templáty, môžu znížiť väzbovú aktivitu výslednej humanizovanej monoklonálnej protilátky (Foote J. a kol., J. Mol. Biol. 224. 487 - 499 (1992). Hodnotenie možného príspevku zvyškov špecifického rámca na afinitu protilátky prináša dva problémy. Po prvé je obtiažne predvídať, ktoré zvyšky rámca hrajú kľúčovú úlohu pri udržaní afinity a špecificity u jednotlivej monoklonálnej protilátke. Po druhé je pre rámcové pozície, ktoré sa odlišujú medzi materskou monoklonálnou protilátkou a ľudským templátom, obtiažne predvídať, či aminokyselina odvodená z myšieho rodiča alebo ľudského templátu prinesie aktívnejšiu monoklonálnu protilátku. Z hľadiska výsledkov preto nie sú vždy úspešné spôsoby humanizácie protilátok, spoliehajúce výhradne na predikciách štruktúry. Súčasné poznatky odboru obsahujú opis stratégie všeobecného inžinierstva protilátok, ktorá zodpovedá ťažkostiam pri zachovaní aktivity viazať protilátky po humanizácii (Rosok M. J. a kol., J. Biol. Chem. 271. 22611 - 22618 (1996). Potenciálne významné zvyšky rámcov, ktoré sa odlišujú medzi materskou monoklonálnou protilátkou a ľudským templátom, sú charakterizované v jedinom stupni syntézou a expresiou knižnice kombinatórnych protilátok, ktorá obsahuje všetky možné kombinácie materských a ľudských aminokyselín templátu v rámci skúmanej pozície. Varianty ukazujúce optimálnu štruktúru rámca sú identifikované vyhľadávaním (skríningom) a následne je (sú) optimálna rámcová štruktúra (rámcové štruktúry) určené sekvencovaním DNA. Typicky odhalia sekvencujúce viacnásobné klony rozhodujúce rámcové pozície, potrebné na expresiu príslušnej aminokyseliny. Obrátene, expresia myšej alebo ľudskej aminokyseliny v pozícii pracovnej knižnice čítacích rámcov v rovnakej frekvencii v aktívnych klonoch je v súlade s menej dôležitou funkciou tejto jednotlivej rámcovej pozície. Takto je humanizovaná verzia protilátky, ktorá zabezpečuje väzbovú aktivitu materskej monoklonálnej protilátky, rýchlo identifikovaná na základe funkčnej väzby.

Proces humanizácie protilátky a vyzretia (maturácia) afinity sa často 12 uskutočňuje v šetrných stupňoch (Rosok, (1996), pozri vyššie; Yelton D. E. a kol., J. Immunol. 155, 1994 - 2004 (1995); Wu H. a kol., Prac. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6037 - 6042 (1998); Bača M. a kol., J. Biol. Chem. 272, 10678 -10684 (1997); Marks J. D. a koľ, J. Biol. Chem. 267. 16007 - 16010 (1992). S použitím modifikovanej stratégie opísanej nižšie boli pripravené viacnásobné humanizácie verzie myších monoklonálnych protilátok 2.220, vykazujúce afinitu zhodnú alebo lepšiu ako chimérna FAB.

Chimérna protilátka anti-CD40, poskytnutá predkladateľmi vynálezu, je tu označovaná ako „chi220„. Úzko spojená protimyšia monoklonálna protilátka proti CD40, poskytnutá predkladateľmi vynálezu, je tu označovaná ako „7E1„. Humanizované protilátky anti-CD40, poskytnuté predkladateľmi vynálezu, sú tu označované ako „F4„ a „L3.17,,.

Pripravené boli dva varianty izotypu 7E1. Tieto dva varianty 7E1 sú využiteľné pri skúmaní úlohy podielu Fc molekuly pri liečbe monoklonálnou protilátkou proti CD40 v preklinických modeloch imunitných a zápalových ochorení. Príprava monoklonálnej protilátky proti myším CD40, kritériá pre voľbu tej, ktorá je vlastnosťami vhodná k chi220, príprava izotypových variantov monoklonálnych protilátok a ich aktivita in vivo na myších modeloch imunitných chorôb, sú tu tiež poskytnuté. Štúdie ako s chi220 tak s ich materskou myšou monoklonálnou protilátkou 2.220 na opiciach, rovnako ako štúdie s 7E1 na myšiach ukázali, že tieto anti-CD40 monoklonálne protilátky sú účinné imunosupresívne látky a ich výsledky budú detailnejšie diskutované ďalej. Štúdie tu opísané boli uskutočňované s použitím štandardnej techniky známej odborníkovi v odbore.

Zhrnuté, ukázalo sa, že protilátky poskytnuté predkladateľmi vynálezu znižujú humorálnu imunitnú odpoveď u opíc. Rovnako tak vykázali dva izotypové varianty úzko spojených monoklonálnych protilátok proti myším CD40, 7E1 imunosupresívnu aktivitu v mnohých preklinických modeloch štúdií ľudských chorôb. Zhrnuté, tieto výsledky ukazujú, že chi220, F4 a L3.17 sú užitočné pre ich klinické využitie pri liečbe autoimunitných chorôb a transplantácií.

Nasledujúce príklady slúžia iba na ilustračné ciele a neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je určený iba patentovými nárokmi. 13

Príklady uskutočnenia vynálezu Príklad 1 A. Izolácia a charakterizácia in vitro

Panel monoklonálnych protilátok sa pripravil proti ľudským CD40 s použitím štandardnej technológie hybridómov s ľudským proteínom fúzie CD40 ako imunogénom. Protilátky na vázbu na CD40 sa vyhľadali pomocou ako bunkovej línie CD40+, tak proteínmi fúzie. Skúšky gp39, viažuce sa na CD40, a funkčné skúšky stimulácie prostredníctvom CD40 sa použili na charakterizáciu klonovaných protilátok. Zvolené protilátky sa potom charakterizovali pre ich skríženú reaktivitu s bunkami primátov, aby sa zistila vhodnosť protilátok na použitie v preklinických modeloch u primátov. 1. Imunizácia a fúzia

Uskutočnili sa dve fúzie na generovanie hybridómov vytvárajúcich monoklonálne protilátky proti ľudským CD40. Imunizácie pre vznik imunitných lymfocytov sa uskutočnili na 6 až 8 týždňových samičkách myší BALB/c s použitím ako imunogénov rekombinantých proteínov fúzie zložených z extracelulárnej domény ľudskej CD40 fúzovanej k naviazaniu, CH2 a CH3 domény myšej protilátky lgG2b (hCD40-mG2b).

Na fúziu 40-1 sa myš spočiatku imunizovala subkutánne na 3 až 4 miestach emulziou (celkovo 200 μΙ) 30 pg hCD40-mG2b v kompletnom Freundovom adjuvans. Zviera sa 21. deň rovnakým spôsobom podporne injikovalo hCD40-mG2b v nekompletnom Freundovom adjuvans a potom sa mu 37. deň aplikovala finálna pre-fúzová imunizácia intravenóznou injekciou 30 pg hCD40-mG2b v PBS. Imunizácia na fúziu 40-2 sa uskutočnila rovnakým spôsobom s výnimkou toho, že adjuvans Ribi (R-730) nahradil Freundovo adjuvans. Podporné imunizácie sa uskutočnili v 21. a 42. dni s finálnou pre-fúzovou injekciou 58. deň.

Tri dni po finálnych podporných injekciách sa získali leukocyty zo sleziny a lymfatických uzlín a fúzovali sa v pomere 3:1 sX63-Ag8.653 myšími myelómovými bunkami s použitím štandardných metód (Kearney a koľ, J. Immunol. 123, 1548 - 14 1550 (1979); Lane, J. Immunol. 81, 223 - 228 (1985). Suspenzia buniek z každej fúzie sa naočkovala do desiatich platní na kultiváciu, obsahujúcich každá 96 jamiek pri doštičkovej denzite približne 170000 celkových buniek (pred fúziou) na jamku. 2. Skríning (vyhľadávanie) a klonovanie

Použili sa dva formáty skúšok na identifikáciu monoklonálnych protilátok v prírodnej humanizovanej CD40. Supernatanty bunkovej kultúry zo všetkých jamiek sa spočiatku podrobili vyhľadávaniu (skríningu) na určenie ich schopnosti viazať CD40-pozitívnu EBV-transformovanej línie ľudských buniek (1A2-2C) vo formáte založenom na metóde ELISA. Každý supernatant sa potom testoval vo formáte založenom na metóde ELISA na reaktivitu s purifikovaným rekombinantným fúzovaným proteínom, skladajúcim sa z extracelulárnych domén ľudskej CD40 fúzovanej k naviazaniu, CH2 a CH3 domén ľudskej lgG1 protilátky, hCD40-lg a rovnakým spôsobom vytvoreným nevýznamným ľudským Ig fúzovaným proteínom, Leu8-lg (Hollenbaugh a koľ, EMBO J. JM, 4313 - 4321 (1992). Reaktivita s predtým uvedeným fúzovaným proteínom, nie s tým, ktorý bol uvedený naposledy, v spojení s údajmi o bunkovej väzbe, ukázali na prítomnosť protilátky špecifickej pre prírodnú CD40 v približne 200 hlavných jamkách. Kľúčovou funkčnou vlastnosťou pre požadovanú anti-CD40 monoklonálnu protilátku bola kapacita úplne blokovať interakciu CD40 a jej ligandu gp39. Takto sa ako ďalší krok vo výbere protilátky všetky supernatanty zo špecifických hlavných jamiek CD40 hodnotili s ohľadom na ich schopnosť inhibovať väzbu rozpustného rekombinantného myšieho CD8-ľudského gp39 fúzneho proteínu, sgp39, na imobilizovaný hCD40-lg vo formáte založenom na metóde ELISA. Tie, ktoré kompletne inhibovali túto interakciu, sa následne titrovali v rovnakom formáte, aby sa určilo, ktoré jamky obsahovali najvyšší titer inhibujúci protilátky. Desať najsilnejšie inhibujúcich hlavných jamiek z tejto analýzy bolo vybraných na klonovanie.

Klonovanie vhodných buniek vylučujúcich protilátku sa uskutočnili v procese pozostávajúcom z dvoch krokov. Bunky z každej hlavnej jamky sa najskôr „miniklonovali,, pri hustote očkovania 10 buniek na jamku, po ktorom sa CD40-špecifický „miniklon,, s najvyšším titrom formálne klonoval pomocou metódy limitného zrieďovania. r r 15 3. Ďalšia charakterizácia

Na charakterizáciu protilátok sa použilo šesť formátov skúšok. Boli to inhibícia väzby gp39 na ľudské B-bunky, inhibícia proliferácie B-buniek indukovanej sgp39 spolu santi-lgM, inhibícia syntézy protilátky in vitro B-bunkami indukovanými aktivovanými T-bunkami, priama kostimulácia B-buniek pomocou anti-lgM, kostimulácia B-buniek pomocou anti-lgM za prítomnosti ľahkého reťazca anti-kappa protilátky imobilizovaného pomocou cross-linking a kostimulácia B-buniek pomocou anti-lgM za prítomnosti druhej anti-CD40 monoklonálnej protilátky, G28-5. Táto monoklonálna protilátka je známa svojou kostimulačnou aktivitou a tým, že kompletne blokuje interakciu CD40/gp39. S cieľom porovnania bola táto protilátka zahrnutá v mnohých skúškach.

Tieto analýzy viedli k výberu štyroch monoklonálnych protilátok: 1.66 (lgG2b), 2.36 (lgG2a), 2.174 (lgG1) a 2.220 (lgG2a). Uskutočňovali sa testy na charakterizáciu monoklonálnych protilátok. V jednom experimente sa inkubovali bunky z ľudskej B-bunkovej línie Raji s 2 alebo 20 pg/ml rôznych anti-CD40 monoklonálnych protilátok, po tejto inkubácii nasledovala druhá inkubácia v nezriedenom supernatante COS buniek, obsahujúcom proteín fúzie mCD8-gp39 (sgp39). Viazaný sgp39 sa detegoval ďalšou inkubáciou buniek santi-mCD8 monoklonálnou protilátkou, označovanou FITC a analýzou buniek na FACScane. Percento inhibície bolo spočítané delením strednej fluorescencie vzoriek inkubovaných s protilátkou strednej fluorescencie vzoriek bez protilátky pri prvej inkubácii (Obrázok 1).

Ako je vidieť na obrázku 1, každá z týchto štyroch monoklonálnych protilátok bola schopná kompletne inhibovať väzbu proteínu fúzie sgp39 na línie ľudských B-buniek vykazujúcich vysoké hladiny CD40, aj keď v prípade 2.174 bola ku kompletnému blokovanie potrebná relatívne vysoká koncentrácia. Podobné údaje boli získané s použitím ľudských tonzilárnych B-buniek. Po druhé, každá z nich významne inhibovala tvorbu IgG a IgM v skúške in vitro syntézy protilátky B-buniek dependentných na T-bunkách.

Tri z týchto štyroch protilátok vykázali obmedzenú schopnosť kostimulácie proliferácie B-buniek za prítomnosti anti-lgM. Monoklonálna protilátka 2.220 bola 16 stálejšia vo svojej schopnosti vyvolať slabú kostimulačnú aktivitu. Pridaním anti-kappa ľahkého reťazca protilátky, použitej na cross-link imobilizáciu anti-CD40 monoklonálnych protilátok, získala 2.36 významnú kostimulačnú aktivitu, zatiaľ čo aktivita ostatných troch protilátok nebola ovplyvnená. Ukázalo sa, že kostimulačná schopnosť G28-5 bola odlišne modulovaná, keď bola spárovaná v kombinácii s každou zo štyroch nových anti-CD40 monoklonálnych protilátok. Monoklonálne protilátky 1.66 a obzvlášť 2.174 zvyšovali kostimuláciu G28-5, zatiaľ čo 2.220 a 2.36 ju znižovali. Po selekcii založenej na hodnotení v ľudských systémoch in vitro boli štyri anti-CD40 monoklonálne protilátky ďalej skúšané pre ich vhodnosť na hodnotenie in vivo v štúdiách na primátoch iných ako ľuďoch. Dva kľúčové prvky analýzy boli relatívna potencia každej z nich viazať B-bunky primátov a supresia syntézy protilátky B-buniek dependentných na T-bunkách za podmienok in vitro. Zistilo sa, že každá zo štyroch monoklonálnych protilátok reagovala skrížené s B-bunkami Cynomolgus macaque (Macaca fascicularis). 2.36 a 2.220 viazali s väčšou aviditou ako 2.174 a 1.66. Nižšia zrejmá väzbovosť monoklonálnych protilátok 2.174 a 1.66 nebola spôsobená ich jednotlivými izotypmi, pretože iné izotypovo spojené anti-CD40 monoklonálne protilátky vykázali väzbové hladiny porovnateľné s 2.36 a 2.220 (napr. G28-5 a 2.118). Tieto výsledky boli v kontraste s výsledkami pozorovanými na ľudských B-bunkách, kde každá z monoklonálnych protilátok vykázala porovnateľnú väzbovosť. Schopnosť štyroch monoklonálnych protilátok znižovať syntézu protilátok opičími B-bunkami sa ukázala zhodná so schopnosťou väzby. B. Charakterizácia in vivo

Uskutočnili sa dve štúdie na primátoch iných ako človek s použitím myších monoklonálnych protilátok proti ľudským CD40 na zhodnotenie vhodnosti anti-CD40 ako imunosupresívne látky a na vybratie vhodnej protilátky na ďalší vývoj. Po prvé sa porovnala clearance a akútna toxicita in vivo štyroch zvolených anti-CD40 monoklonálnych protilátok. Tieto výsledky sa použili na voľbu dvoch protilátok, 2.36 a 2.220, ktoré boli potom testované v druhej štúdii pripravenej na hodnotenie účinnosti inhibície protilátkovej odpovede na T-dependentný antigén a akútnej toxicity. 17 . . . - r Štúdie účinnosti 2.36 a 2.220 na primátoch

Na základe predchádzajúcich zistení sa hodnotili monoklonálne protilátky 2.36 a 2.220 z hľadiska ich schopnosti znižovať T-dependentnú protilátkovú odpoveď po intravenóznom podaní opiciam Cynomolgus. Táto štúdia bola rozdelená na tri fázy (obrázok 2). Vo fáze I bola každá zo štyroch skupín, zložených z jedného alebo dvoch samčekov a jednej alebo dvoch samičiek opíc Cynomolgus, imunizovaná intravenózne v dni 1 ovčími červenými krvinkami (SRBCs) a potom liečená monoklonálnou protilátkou 2.36, 2.220, 1.106 (lgG1 myšej protilátky proti ľudskej gp39 - pozitívna kontrola) alebo L6 (lgG2a myšej protilátky proti ľudskému tumorovému antigénu - negatívna kontrola) v dávke 20 mg/kg v 1., 3. a 5. dni. Určil sa titer IgM a IgG na imunogén SRBC, sérové hladiny testovaných a kontrolných látok, prítomnosť protilátok proti testovaným a kontrolným látkam, hladiny sérových imunoglobulínov, počet leukocytov v periférnej krvi a frekvencie rôznych subpopulácií lymfocytov v periférnej krvi. Vo fáze II, potom čo zvieratá vylúčili testované a kontrolné látky, boli imunizované SRBC a druhým antigénom, KLH (keyhole limpet hemocyanin), aby sa zhodnotila indukcia imunologickej tolerancie a reverzibilita pozorovanej imunosupresie. Vo fáze III sa vybrané zvieratá reimunizovali, aby sa zistilo, či pôvodne znížená protilátková anti-SRBC odpoveď sa opäť vrátila do pôvodného stavu po doplnkovom teste SRBC a zhodnotila sa sekundárna protilátková odpoveď na KLH.

Uskutočnil sa experiment, aby sa ukázalo, že monoklonálna protilátka 2.220 významne znižovala primárnu protilátkovú odpoveď na SRBCs (obrázok 3). Opice sa liečili buď monoklonálnou protilátkou 1.106, L6, 2.36 alebo 2.220 v 1., 3. a 5. dni fázy I dávkou 20 mg/kg. Opice sa imunizovali SRBC v 1. dni fázy I, II a III. Obrázok 3a ukazuje výsledky vzoriek séra, ktoré boli analyzované na IgM protilátky proti SRBC. Obrázok 3b ukazuje výsledky vzoriek séra, ktoré boli analyzované na IgG protilátky proti SRBC. Dáta sú vyjadrené v geometrickom priemere titra anti-SRBC pre každú skupinu (n = 3 alebo 4).

Vrcholová primárna odpoveď bola inhibovaná 85 % pre IgM a 98 % IgG. Potom, čo clearance monoklonálnej protilátky 2.220 v sére sa dostala pod úroveň detegovateľnosti, vrcholová sekundárna odpoveď na SRBCs bola stále inhibovaná 79 % pre IgM a 56 % IgG v porovnaní s kontrolnou odpoveďou vo fáze I. To bolo v protiklade s pozitívnou kontrolou, monoklonálna protilátka 1.106, kde bola 18 pozorovaná silná sekundárna protilátková odpoveď na SRBC. Terciárna odpoveď na SRBC nebola inhibovaná, čo ukazuje, že monoklonálna protilátka 2.220 indukuje prolongovanú imunosupresiu, ale nie imunologickú toleranciu. Všetky zvieratá imunizované KLH mali primárnu a sekundárnu anti-KLH odpoveď, čo ukazuje, že imunosupresia je reverzibilná. Zvieratá liečené 2.36 sa nezahrnuli do fázy II, pretože vo fáze I štúdie neboli pozorované významné inhibicie.

Priemerné vrcholové sérové koncentrácie, ktoré sa objavili ihneď po poslednej dávke, boli 744 pg/ml pre monoklonálnu protilátku 2.220 a 405 pg/ml pre 2.36. Zatiaľ čo sérum sa očistilo od monoklonálnej protilátky 2.36 pod úroveň detegovateľnosti za 15 dní, u monoklonálnej protilátky 2.220 sa neočistilo až do 29. dňa. Obidve monoklonálne protilátky 2.36 a 2.220 boli imunogénne. U žiadneho zvieraťa na nevyskytli nijaké klinické pozorovania spojené s liečivami, ani zmeny telesnej hmotnosti, spotreby potravy alebo zmeny hematologické alebo hladín séróvých Ig. Jediným pozorovaným zistením, spojeným s liečivami, boli prechodné poklesy v percentuálnom zastúpení periférnych B-buniek o 70 % u monoklonálnej protilátky 2.36 a 43 % u monoklonálnej protilátky 2.220. Návrat B-buniek na normálnu hladinu sa prejavil počas 2 až 3 týždňov po liečbe.

Zhrnuté, monoklonálna protilátka 2.220 významne znížila protilátkovú odpoveď na SRBCs, zatiaľ čo 2.36 nie. Napriek tomu, že monoklonálna protilátka 2.220 indukovala prolongovanú na antigén špecifickú imunosupresiu, bola táto imunosupresia reverzibilná. Na základe týchto zistení bola na ďalší vývoj vybratá monoklonálna protilátka 2.220.

Príklad 2

Príprava chimérnej protilátky chi220

Na ovplyvnenie imunogenicity myšej monoklonálnej protilátky protiľudskej 2.220, sa pripravili rekombinantné formy, v ktorých sa premenlivé oblasti fúzovali k ľudským stálym oblastiam a porovnávala sa ich účinnosť in vitro. Dva použité prístupy boli príprava chimérnej protilátky, obsahujúca nezmenené myšie premenlivé oblasti a humanizované formy, v ktorých sa myšie hyperpremenlivé oblasti (CDRs) naštepovali na ľudské rámcové sekvencie v rámci premenlivých oblastí. Chimérne protilátky sa udržujú vlastnosti viažuce antigén, ako majú ich materské protilátky, ale r f Γ r * + » Ψ * - r · * 19 . je u nich väčšia pravdepodobnosť, že humanizované protilátky budú imunogénne. Je menej pravdepodobné, ale mutácie zavedené pri humanizácii môžu ovplyvniť väzbovosť antigénu. A. Vytvorenie a charakterizácia in vitro chimérnych a humanizovaných protilátok

Oblasti VL a VH anti-CD40 monoklonálnej protilátky 2.220 sa získali PCR. cDNA sa pripravila z RNA izolovanej z hybridómov expresujúcich 2.220 monoklonálnu protilátku s použitím lgG1-špecifického alebo CK-špecifického anti-sense priméru (priméru protizmyslovej orientácie), aby sa získali oblasti VH alebo VL. Poly-G koniec sa pridal k týmto jednoduchým špirálovým DNA. Premenlivé oblasti sa potom amplifikovali PCR s použitím ako sense priméru (priméru zmyslovej orientácie) oligonukleotidu obsahujúceho sekvenciu poly-C komplementárnu k poly-G koncu a hniezda anti-sense primérov (primérov zmyslovej orientácie). Produkt získaný PCR sa potom vložil do bakteriálneho vektora s použitím reštrikčných miest zahrnutých v priméroch. Viacnásobné klony sa potom sekvencovali dideoxy-nukletidovým sekvencovaním. Uskutočnili sa dva nezávislé pokusy, ktoré začínali vo fáze RNA a získané sekvencie boli rovnaké.

Na prípravu chimérnej formy protilátky sa premenlivé oblasti amplifikovali PCR s použitím primérov, ktoré zaviedli sekvenciu, kódujúcu signálnu sekvenciu ľudskej protilátky, ktorá bola zistená ako najbližšie spojená so sekvenciou 2.220, ako ukazuje obrázok 4. Podčiarknuté podiely sekvencie premenlivého ľahkého reťazca (obrázok 4a) a sekvencie premenlivého ťažkého reťazca (obrázok 4b) označujú vložené signálne sekvencie ľudskej protilátky s najbližšou homológiou k myšej 2.220. Tieto produkty PCR sa vložili do vektora obsahujúceho sekvenciu kódujúcu stále oblasti ľudskej kappa alebo ľudskej τ1, aby vznikol kompletný ľahký alebo ťažký reťazec. Vektory tiež obsahovali vhodné gény rezistencie na liečivá pre prípravu a amplifikáciu stálych línií expresujúcich proteín. Proteín k iniciálnej charakterizácii sa vytvoril prechodnou expresiou z buniek COS, po ktorej nasledovalo čistenie proteínu A.

Ako príklad, línie buniek vytvárajúcich chimérnu protilátku sa vytvorili transfekciou buniek CHO DG44 s oddelenými vektormi expresie pre ľahké a ťažké reťazce chimérnej protilátky a vysoko-kópiová elektroporačná metóda sa použila na 20 podporu kointegrácie. (pozri U.S. Patent 4956288). Ťažké a ľahké reťazce chi220 sa klonovali do vektorov pD17 a pD16 v tomto poradí. Obidva vektory sú odvodené od in vitro plazmidu pcDNA3 a obsahujú nasledujúce články (pozri obrázok 12): (1) gén rezistencie na neomycín z pcDNA3 sa nahradil génom myšej reduktázy dihydrofolátu (DHFR) za kontroly promótora SV40 bez enhanceru (tiež označovanom ako „oslabený DHFR,,; stojí za pozornosť, že iba promótor bol oslabený, nie enzým DHFR - promótor bez enhancera stále obsahuje SV40 pôvod replikácie, a tak tieto vektory možno použiť pri prechodných COS transfekciách); (2) gén, o ktorý ide, je expresovaný z CMV promótora a signál na polyadenyláciu je z génu hovädzieho rastového hormónu; (3) kazeta expresie pre gén, o ktorý ide, je obklopená sekvenciami na ukončenie transkripcie (napríklad 5' do promótora a 3' do miesta poly A); (4) vektory obsahujúce dva odlišné polylinkery s reštrikčnými miestami, jeden 3' k promótoru na klonovanie génu, o ktorý ide, a jeden 5' k promótoru na linearizáciu vektora pred transfekciou; (5) gén rezistencie na ampicilín a Co1E1 pôvod na plazmidovú propagáciu v E. coli.

Použité gény ťažkého a ľahkého reťazca boli genómové produkty s nasledujúcimi modifikáciami: (1) kódujúca sekvencia na signálny peptid ťažkého reťazca, premenlivá oblasť a CH1 doména boli priľahlé (neobsahovali žiadne intróny) a (2) kódujúca sekvencia na signálny peptid ľahkého reťazca a premenlivá oblasť boli priľahlé.

Iné vektory expresie, známe odborníkovi v odbore, ktoré sú schopné expresie chimérnej protilátky, sú predvídané v predkladanom vynáleze. Sekvencia nukleových kyselín použiteľná vo vektore expresie, schopnom expresie ťažkého reťazca chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu je ukázaná na obrázku 13; sekvencia nukleových kyselín použiteľná vo vektore expresie, schopnom expresie ľahkého reťazca chimérnej protilátky podľa predkladaného vynálezu je ukázaná na obrázku 14.

Kompletná sekvencia aminokyselín ťažkého a ľahkého reťazca chimérnej protilátky (,,chi220„), zahrňujúca premenlivé a stále oblasti, je uvedená nižšie (zvýraznené aminokyseliny označujú premenlivý ťažký a premenlivý ľahký reťazec):

Sekvencia ťažkého reťazca (SEQ ID NO:3) • r r r 21 QXQLVQSGPE LKKPGETVRI SCKASGYAFT TTGMQWVQEM PGKGLKWIGW 50 INTHSGVPKY VEDFKGRFAF SLETSANTAY LQISNLKNED TATYFCľVRSG 100 NGNYDLAYFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 150 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 200 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 250 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 30 0 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 350 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 4 00 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 450 GK 452

Sekvencia ľahkého reťazca (SEQ ID N0:4) DIVLTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY 50 ASKSISGXPS RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGIYYCQH GHSFPWTFGG 100 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSXD STYSLSSTLT LSKADYEKHK Vv\CEVTWňr onr LSSPVTKSFN RGSC “ y ľ?:

Pripravilo sa niekoľko humanizovaných foriem 220. Tento proces zahrňuje identifikáciu myších a ľudských sekvencií zárodočných línií s najbližšou homológiou k VH a VL doménam. Myšie sekvencie zárodočných línií sa použili na identifikáciu pravdepodobných lokácií somatických mutácií, ktoré vznikli počas procesu dozrievania afinity. Ľudské sekvencie sa potom použili ako templáty a tie oblasti sekvencie, u ktorých je známe alebo sa predpokladá, že sú dôležité vo väzbovej špecificite, sa nahradili v ľudských sekvenciách ako VH, tak VL. Štruktúry týchto sekvencií sa potom modelovali s použitím ako templátu proteínu s najbližšou homológiou, pre ktorý sa rozpustila kryštalická štruktúra. Plazmidy kódujúce humanizované formy sa pripravili s použitím PCR riadenej mutagenézy a použili sa na prípravu protilátky prechodnou expresiou z COS buniek. Skúšky in vitro sa uskutočnili schimérnymi a humanizovanými protilátkami podľa predkladaného vynálezu a ich výsledky ukazuje obrázok 5. Obrázok 5a ukazuje výsledky väzbovej skúšky testujúcej väzbu chi220 a h220v3 na hCD40-mG2b v skúške založenej na metóde ELISA. Jamky doštičiek lmmulon-2 sa potiahli hCD40-mG2b v koncentrácii 10 ng/ml v PBS počas 2 hodín. Jamky boli blokované vzorkovým rozpúšťadlom (Genetic systems) a pridali sa protilátky v označených koncentráciách. Nasledovala inkubácia počas 1 hodiny, jamky sa premyli, detegovala sa prítomnosť protilátky 22 ' s použitím IgG kozej protiľudskej protilátky značenej peroxidázou. H220v3 je humanizovaná forma monoklonálnej protilátky 2.220. Hodnoty sú priemerom z dvojitých jamiek a stĺpce chýb predstavujú štandardnú odchýlku.

Obrázok 5b ukazuje výsledky skúšky testujúcej inhibíciu kostimulácie, sprostredkovanej sgp39, ľudských B-buniek s monoklonálnymi protilátkami proti ľudským CD40. Ľudské tonzilárne B-bunky v pokojovej fáze (50000 na jamku) sa inkubovali sproteínom fúzie spg39, 20 pg/ml imunoguľôčkami (immunobeads) potiahnutými králičím protiľudským IgM a označenými koncentráciami monoklonálnymi protilátkami proti CD40 alebo iba médiom na kontrolu na doštičkách s 96 jamkami. 72 hodín po iniciácii kultúr sa všetky jamky označili [3H]tymidínom na hodnotu 1 uCi na jamku a bunky sa kultivovali počas ďalších 18 hodín. Bunky sa potom pozbierali a začlenený [3H]tymidín sa meral na počítači scintiláciou.

Na základe výsledkov skúšok in vitro (obrázky 5a a 5b, ktoré ukazujú, že ako chimérna, tak humanizovaná protilátka účinne viazala CD40 a inhibovala stimuláciu B-buniek) bola na ďalšiu štúdiu vybraná chimérna protilátka.

Príklad 3 Účinnosť chi220 A. Chimérna monoklonálna protilátka 2.220: Štúdia účinnosti v jednej dávke na primátoch iných ako ľuďoch.

Chi220 sa hodnotila na opiciach Cynomolgus z hľadiska jej schopnosti znižovať primárnu a sekundárnu humorálnu imunitnú odpoveď na antigény dependentné na T-bunkách. V jednej štúdii sa skupiny štyroch opíc imunizovali ovčími erytrocytmi (SRBCs) a dostali ovalbumín (OVA) na sekundárnu imunizáciu tesne pred podaním jednej intravenóznej bolusovej dávky buď chi220 v dávke 10,40 alebo 100 mg/kg alebo sterilného roztoku soli pufrovanej fosforečnanom (PBS) ako kontroly. Pozorovalo sa významné zníženie primárnej humorálne imunitnej odpovede na SRBCs vo všetkých troch dávkach, čo demonštruje účinnosť chi220 u primátov. Pozorovaná bola prechodná, od dávky závislá deplecia periférnych B-buniek u všetkých opíc, liečených chi220 a čas, v ktorom sa B-bunky dostali späť na pôvodnú hladinu, tiež závisel od dávky. Vo dvoch najvyšších dávkach boli pozorované prechodné mierne poklesy priemerného absolútneho počtu periférnych T-buniek. 23 r ψ c .-

Tiež boli pozorované prechodné minimálne poklesy hladín IgM vsére, ale neboli pozorované žiadne zmeny hladín IgG alebo IgA v sére, spojené s podávaním liečiva.

Na hodnotenie indukcie imunitnej tolerancie a reverzibility imunosupresívnej účinnosti sa všetky opice imunizovali OVA, SRBCs a neoantigénom, keyhole limpet hemocyanin (KLH) v 149. dni, keď sérové hladiny chi220 v skupine s dávkou 100 mg/kg boli už pod hladinami, o ktorých sa predpokladá, že sú imunosupresívne (približne 10 pg/ml) a počty periférnych B-buniek sa vrátili na hladiny pred podaním dávky. Anti-SRBC odpoveď pri najnižšej dávke bola všeobecne porovnateľná s primárnou anti-SRBC protilátkovou odpoveďou u kontrolných opíc. Protilátková odpoveď na SRBC bola teda stále čiastočne alebo významne znížená u opíc liečených dvoma vyššími dávkami.

Na ďalšie preskúmanie závislosti imunosupresie a deplecie B-buniek od dávky sa uskutočnila druhá štúdia, v ktorej sa ďalšie opice (štyri na skupinu) imunizovali SRBCs a potom sa im dala chi220 v jednej dávke 0,1 alebo 1,0 mg/kg alebo PBS. Suboptimálna imunosupresia protilátkovej odpovede na SRBCs bola pozorovaná pri oboch dávkach. Mierna deplecia periférnych B-buniek bola evidentná u opíc, ktoré dostali dávku 1,0 mg/kg chi220 na 8. deň a vrátila sa na pôvodnú hladinu na 29. deň. Pri dávke 0,1 mg/kg bol pozorovaný pokles priemerného počtu a percentuálneho zastúpenia periférnych B-buniek, ale hodnoty neboli mimo normálneho rozmedzia percentuálneho zastúpenia B-buniek. Na absolútne počty periférnych B-buniek neboli zatiaľ stanovené limity. U opíc, ktoré dostali dávku 1 mg/kg chi220, boli pozorované prechodné minimálne poklesy počtu periférnych T-buniek a mierne poklesy v proliferácii T-buniek ex vivo. A nakoniec nebola dokázaná aktivácia komplementu ani zmeny vsérových hladinách IL-6 alebo TNFa, spojené s podávaním liečiva. Aktivácia T-buniek ex vivo, aktivácia komplementu a hladiny cytokínov vsére sa nehodnotili u opíc, ktoré dostali dávku 10, 40 alebo 100 mg/kg chi220. V obidvoch štúdiách sa skúšali vzorky séra po podaní chi220 na hladiny testovanej látky v obehu a na hodnotenie tvorby protilátky proti nej. Farmakokinetická analýza ukázala, že priemerná maximálna koncentrácia v sére (Cmax) chi220 nerástla proporcionálne v závislosti od dávky a že biologický polčas chi220 sa predĺžil pri zvýšení podanej dávky. Zistilo sa, že chi220 je imunogénna pri podaní v dávkach 0,1, 1 alebo 10 mg/kg. Pri koncentráciách v obehu nad 10 pg/ml sa zdá, že chi220 24 môže znížiť protilátkovú odpoveď zameranú proti nej. 1. Protokol experimentu V úvodnej štúdii, ktorá bola spomenutá vyššie, sa pridelili opice Cynomolgus do štyroch skupín, skladajúcich sa z dvoch samcov a dvoch samíc. Všetky opice sa 28 dní pred podaním chi220 alebo kontroly imunizovali OVA (5 mg/kg intramuskulárne a 10 mg/kg subkutánne). 1. deň sa všetky opice imunizovali SRBCs (1,7 ml/kg 10 % suspenzie intravenózne) a druhú imunizáciu OVA dostali (5 mg/kg intramuskulárne a 10 mg/kg subkutánne) tesne pred podaním jednej intravenóznej bolusovej dávky buď chi220 v dávkach 10, 40 alebo 100 mg/kg alebo sterilného PBS ako kontrolu. V 149. dni, potom čo hladiny chi220 v sére poklesli pod zdanlivo imunosupresívne hladiny (približne 10 pg/ml) a hodnoty periférnych B-buniek sa vrátili na hladiny pred podaním dávky vo všetkých skupinách, sa opice imunizovali OVA, SRBCs a KLH (10 mg/zviera intramuskulárne). Cieľom imunizácie KLH bolo ukázať, že opice sú schopné začať imunitnú odpoveď na neoantigén potom, čo boli liečené chi220. S cieľom demonštrovať lepšiu závislosť odpovede od dávky u imunosupresie a deplecie periférnych B-buniek, ďalšie opice sa v druhej štúdii (dve jedného pohlavia na skupinu) imunizovali SRBCs a potom dostali jednu dávku buď chi220 v dávke 0,1 alebo 1,0 mg/kg alebo PBS ako kontrola v 1. dni. Monitorovali sa hematologické parametre a subpopulácia lymfocytov periférnej krvi vo zvolených časoch počas oboch štúdií. Monitorovali sa sérové chemické parametre u opíc, ktoré dostali dávky chi220 10, 40 alebo 100 mg/kg, ale tieto parametre sa nemonitorovali u opíc, ktoré dostali dávky 0,1 alebo 1,0 mg/kg, pretože vo vyšších dávkach neboli zistené žiadne pozorovania so vzťahom k liečivu. Okrem toho sa merali hladiny IgM, IgG a IgA a chi220 v sére. Na hodnotenie účinnosti sa zisťovala tvorba špecifických IgM a IgG protilátok proti SRBC a OVA imunogénom vo vhodných vzorcoch séra získaných tesne pred aplikáciou imunogénu a po týždňoch potom. Tvorba špecifických IgM a IgG protilátok proti testovanej látke u opíc, ktorý bola aplikovaná chi220, sa merala pred podaním testovanej látky v 1. dni a potom po týždňoch . Pri porovnávaní protilátkovej odpovede skupinami sa použili geometrické priemery titrovaných hodnôt. Okrem toho sa merala celková hemolytická aktivita komplementu 25 (CHso) a hodnoty C4d fragmentu a hodnoty TNF-α a IL-6 sa určovali u opíc, ktoré dostali dávky 0,1 alebo 1 mg/kg chi220 vo zvolených časoch po podaní chi220. Aktivácia ex vivo T-buniek periférnej krvi sa tiež hodnotila po stimulácii konkanavalínom A u opíc, ktoré dostali dávky 0,1 alebo 1 mg/kg chi220 v 17. a 31. dni, aby sa hodnotili účinky chi220 na odpoveď T-buniek na mitogén. Nakoniec boli všetky opice pozorované z hľadiska klinických známok toxicity, telesná hmotnosť sa zaznamenávala týždenne a spotreba potravy denne.

Opice sa imunizovali SRBC pred podaním nosiča alebo chi220 v dávke 10, 40 alebo 100 mg/kg (obrázok 6a) alebo chi220 v dávke 0,1 alebo 1 mg/kg (obrázok 6b) v 1. dni. Vzorky séra sa analyzovali na IgM protilátky proti SRBC pomocou ELISA. Dáta sú vyjadrené ako geometrický priemer konečného titra (end-point titer - EPT) anti-SRBC protilátky pre každú skupinu (n = 2 [100 mg/kg po 15 dňochj alebo 4), kde EPT je ekvivalentný recipročnej hodnote najvyššieho zriedenia séra s absorbanciou väčšou ako dvojnásobok priemeru pozadia doštičky. 2. Výsledky

a. Protilátková odpoveď proti SRBC

Pri podaní opiciam v dávkach 10, 40 alebo 100 mg/kg bola chi220 účinná na významné zníženie primárnej protilátkovej odpovede proti SRBCs. V dni s najvyššou hladinou primárnej protilátkovej IgM odpovede proti SRBC (8. deň), sa priemerná primárna protilátková IgM odpoveď proti SRBC znížila približne o 92 až 94 % u opíc, liečených chi220 v dávkach 10, 40 alebo 100 mg/kg v porovnaní s kontrolou (obrázok 6a). Priemerná protilátková IgM odpoveď proti SRBC v skupine sa nestala pozitívnou v priebehu 85. dňa pri dávkach 10, 40 alebo 100 mg/kg. V dni s najvyššou hladinou primárnej protilátkovej IgG odpovede proti SRBC (15. deň), sa priemerná primárna protilátková IgG odpoveď proti SRBC znížila o 98 až 99 a 85 % u opíc, liečených chi220 v dávkach 10, 40 alebo 100 mg/kg v tomto poradí v porovnaní s kontrolou (obrázok 7a). Vyššie celkové titre protilátky proti SRBC pred podaním dávky mohli spôsobiť zjavnú absenciu závislosti imunosupresie od dávky. Celkovo, u opíc liečených chi220 v dávke 10 alebo 100 mg/kg sa nezvyšovala primárna protilátková IgG odpoveď proti SRBC až do 85. dňa. Avšak dve opice liečené chi220 v dávke 40 mg/kg mali oneskorenú primárnu protilátkovú IgG odpoveď proti SRBC r r 26 (porovnateľnú s veľkosťou kontrolnej odpovede), ktorá sa stala pozitívnou na 31. deň a vrchol dosiahla na 51. deň. 149. deň potom, čo hladiny chi220 poklesli pod údajne imunosupresívne hodnoty (približne 10 pg/ml) a hladiny B-buniek v periférnej krvi sa vo všetkých skupinách vrátili na pôvodnú úroveň, sa opice druhýkrát imunizovali SRBCs. Ako sa predpokladalo, u kontrolných opíc sa zvýšila silná sekundárna protilátková IgG odpoveď proti SRBCs. Opice liečené chi220 v dávke 10 mg/kg vykazovali primárne IgM a IgG protilátkové odpovede na SRBCs všeobecne porovnateľné s primárnou odpoveďou u kontrolných opíc. Protilátková odpoveď na SRBCs bola však stále čiastočne znížená pri dávke 40 mg/kg a významne znížená pri dávke 100 mg/kg. Aj keď sa u dvoch opíc liečených chi220 v dávke 40 mg/kg, ktoré predtým vykázali slabé primárne protilátkové odpovede na SRBC, vytvorili titre IgM a IgG protilátok proti SRBC charakteristické pre sekundárnu protilátkovú odpoveď, protilátkové odpovede proti SRBC u ostatných dvoch opíc tejto skupiny a u zvyšných opíc, liečených chi220 v dávke 100 mg/kg, boli stále znížené približne o 90 % v porovnaní s priemerom primárnej protilátkovej odpovede proti SRBC u kontrolných opíc.

Suboptimálna imunosupresia protilátkovej odpovede na SRBC bola pozorovaná po podaní 0,1 alebo 1,0 mg/kg chi220 (obrázky 6b a 7b). Zatiaľ čo všetky opice liečené chi220 vykázali pozitívnu IgM protilátkovú odpoveď a SRBC antigén, celkový priemerný vrchol IgM protilátkovej odpovede proti SRBC sa znížil približne o 56 % u opíc liečených chi220 v dávke 1 mg/kg v porovnaní s priemerným vrcholom kontrolnej odpovede. U opíc liečených chi220 v dávke 0,1 mg/kg nebolo pozorované žiadne zníženie protilátkovej odpovede na SRBC. Priemerná IgM protilátková odpoveď na SRBC dosiahla vrchol 15. deň u kontrolných opíc a 8. deň u opíc, ktoré dostali 0,1 a 1,0 mg/kg chi220. Celkovo sa priemerný vrchol IgG protilátkovej odpovede proti SRBC znížil približne o 56 % a 42 % u opíc liečených chi220 v dávke 0,1 a 1,0 mg/kg v danom poradí. Priemerná IgG protilátková odpoveď na SRBC dosiahla vrchol 15. deň u kontrolných opíc a u opíc, liečených 1 mg/kg chi220 a 8. deň u opíc, ktoré dostali 0,1 mg/kg chi220.

b. Protilátková odpoveď proti OVA

Opiciam sa 1. deň podala intravenózna dávka 10, 40 alebo 100 mg/kg chi220. r ο 27

Navyše sa všetky opice imunizovali OVA 28., 1. a 149. deň. Vzorky séra sa analyzovali na IgM (obrázok 8a) alebo IgG (obrázok 8b) protilátky proti OVA. Údaje sú vyjadrené ako geometrický priemer konečných titrov (EPT) protilátok proti OVA pre každú skupinu (n = 2 [100 mg/kg po 15 dňoch] alebo 4), kde EPT sú ekvivalentné recipročnej hodnote najvyššieho zriedenia séra s absorbanciou väčšou ako dvojnásobok priemeru pozadia doštičky.

Tvorba špecifických IgM a IgG protilátok proti OVA sa monitorovala týždenne počas štúdie u opíc, ktoré dostali chi220 v dávkach 10, 40 alebo 100 mg/kg. Primárne a sekundárne protilátkové odpovede proti OVA boli veľmi premenlivé a u všetkých opíc všeobecne slabé (obrázok 8). Opice, ktorým sa podala chi220 1. deň, mali väčšie titre protilátky proti OVA ako opice v kontrolnej skupine. 149. deň dostali opice terciámu imunizáciu OVA. Všetky opice vykázali pozitívne IgG protilátkové odpovede na OVA počas 7 dní po imunizácii. Kontrolné opice a opice liečené chi220 v dávke 10 mg/kg mali titre protilátok charakteristické pre terciámu protilátkovú odpoveď, zatiaľ čo opice liečené chi220 v dávke 40 alebo 100 mg/kg mali titre protilátok viac charakteristické pre sekundárnu protilátkovú odpoveď.

c. Protilátkové odpoveď proti KLH

Opiciam sa 1. deň podala intravenózna dávka 10, 40 alebo 100 mg/kg chi220. Navyše sa všetky opice imunizovali KLH 149. deň. Vzorky séra sa analyzovali na IgM (obrázok 9a) alebo IgG (obrázok 9b) protilátky proti KLH. Údaje sú vyjadrené ako geometrický priemer konečných titrov (EPT) protilátok proti KLH pre každú skupinu (n = 2 [100 mg/kg po 15 dňoch] alebo 4), kde EPT sú ekvivalentné recipročnej hodnote najvyššieho zriedenia séra s absorbanciou väčšou ako dvojnásobok priemeru pozadia doštičky. V 149. dni, potom čo hladiny chi220 vsére poklesli pod zdanlivo imunosupresívne hladiny (približne 10 pg/ml) a hodnoty periférnych B-buniek sa vrátili na hladiny pred podaním dávky vo všetkých skupinách, sa opice imunizovali KLH (10 mg/zviera intramuskulárne). Všetky opice vykázali pozitívne IgM a IgG protilátkové odpovede na KLH, čo ukazuje, že schopnosť imunitnej odpovede na nový antigén potom nebola oslabená. 28 d. Sérové hladiny testovacej látky a protilátkové odpovede proti testovacej látke

Vzorky séra sa skúšali po podaní chi220, aby sa určili hladiny cirkulujúcej testovacej látky a hodnotila tvorba protilátky proti nej. Maximálna koncentrácia chi220 v sére (Cmax) sa objavila tri minúty po podaní dávky 10 alebo 40 mg/kg a šesť hodín po podaní dávky 100 mg/kg. Hodnoty Cmax chi220 boli 329, 2429 a 2343 pg/kg u opíc liečených dávkami 10, 40 alebo 100 mg/kg. Významná variabilita sa však objavila u jednotlivých opíc v skupinách liečených dávkami 40 a 100 mg/kg. Priemerný polčas chi220 v sére bol odhadnutý približne na 114, 173 a 315 hodín u opíc liečených dávkami 10, 40 alebo 100 mg/kg.

Priemerné hodnoty Cmax tri minúty po podaní chi220 bolí 1,77 a 33 pg/ml pre dávky 0,1 a 1 mg/kg v tomto poradí. Neboli pozorované žiadne rozdiely sérových hladín chi220 v závislosti od pohlavia pri žiadnej dávke. Priemerné hodnoty AUCi„f boli 15,5 a 847 pg.h/ml pre dávky 0,1 a 1 mg/kg v tomto poradí. Zhrnuté, výsledky štúdií ukazujú, že polčas chi220 sa predlžuje so zvyšujúcou sa dávkou. Navyše sa zdá, že Cmax chi220 rastie nerovnomerne s rastúcou dávkou.

Aj keď IgM odpoveď na testovaciu látku u opíc, ktorým sa podala dávka 10, 40 alebo 100 mg/kg chi220, bola minimálna alebo chýbala vôbec, bola pozorovaná významná IgG odpoveď na testovaciu látku u opíc, ktorým sa podala dávka 10 mg/kg chi220. Priemerná IgG odpoveď na testovaciu látku u opíc, ktorým sa podala dávka 10 mg/kg chi220, bola pozitívna 29. deň, približne 1 týždeň potom, čo priemerná koncentrácia chi220 v sére poklesla pod hodnotu 10 pg/ml a dosiahla vrchol na 36. a 43. deň pri titre s geometrickým priemerom 12,627. Výskyt IgG protilátok proti testovacej látke u opíc, ktorým sa podala dávka 10 mg/kg chi220 sa tiež zhodoval s prvým detegovateľným nárastom počtu B-buniek nasledujúcom po deplecii. Až do posledného dňa merania (149. deň) opice, ktorým sa podala dávka 40 alebo 100 mg/kg chi220, stále nevykázali pozitívnu protilátkovú odpoveď proti chi220, aj keď priemerné sérové hladiny chi220 boli nižšie ako 10 pg/ml do 57. dňa (u skupiny, ktorá dostala 40 mg/kg) alebo do 92. dňa (u skupiny, ktorá dostala 100 mg/kg).

Chi220 bola imunogénna pri podaní v dávke 0,1 alebo 1 mg/kg. Tri zo štyroch opíc, ktorým sa podala dávka 0,1 alebo 1 mg/kg chi220, mali do 15. dňa štúdie slabo pozitívnu IgM protilátkovú odpoveď proti testovacej látke. Tri zo štyroch opíc, ktorým ·* r 29 1 ; ; sa podala dávka 1 mg/kg chi220, mali do 22. dňa štúdie významnú IgG protilátkovú odpoveď proti testovacej látke, ktorá dosiahla vrchol pri titre s výsledným geometrickým priemerom 16,618. Celkovo, geometrický priemer IgG protilátkovej odpovede na testovaciu látku nebol pozitívny u opíc, ktorým sa podala dávka 0,1 mg/kg chi220 a iba jedna opica, ktorej sa podala dávka 0,1 mg/kg chi220, mala slabo pozitívnu IgG protilátkovú odpoveď na testovaciu látku, ktorá dosiahla vrchol 22. deň pri konečnom titre 2430. Zhrnuté, tieto údaje naznačujú, že chi220 je schopná imunosupresie protilátkovej odpovede proti nej pri hladinách v sére väčších ako približne 10 pg/ml.

Príklad 4

Príprava humanizovaných protilátok F4 a L3.17 proti CD40

Na humanizáciu monoklonálnych protilátok sa použilo mnoho spôsobov známych v odbore. Prístupy založené na štruktúre sa ukázali ako užitočné, ale komplexnosť, ktorá vychádza z vysokého počtu rámcových zvyškov, potenciálne sa zúčastňujúcich väzbovej aktivity, znižuje mieru úspešnosti. Skôr ako predvídanie optimálneho rámca založeného na modelovaní, umožňuje identifikáciu aktívnych konformácií rámca založených na skríningu početných kombinácií prístup knižnice protilátok, ktorý je opísaný nižšie. Prístupy mutagenetické spojené do spôsobov výberu umožňujú analýzu mnohých variantov a mimiky v procese maturácie in vivo (zhrnutých v Marks J. D. a kol., J. Biol. Chem. 267. 16007 - 16010 (1992). Mutagenéza založená na kodóne umožňuje vytvorenie knižníc, ktoré charakterizujú príspevok špecifických zvyškov a takto je účinnejšia ako prístupy náhodnej mutagenézy. Napríklad vysokokontrolovaná PCR nemôže byť použitá na syntézu knižníc kombinatórnych rámcov, opísanú nižšie. Okrem toho náhodná mutagenéza vytvára väčšie a rozmanitejšie knižnice a nanešťastie väčšina mutácií nezvyšuje väzbovú aktivitu monoklonálnej protilátky. V dôsledku toho musí prejsť skríningom väčší počet klonov, aby sa identifikovali aktívne varianty.

Stratégia pomenovaná „riadený výber,, sa použila na izoláciu ľudskej monoklonálnej protilátky z fágovej knižnice v procese, pozostávajúcom z dvoch krokov, ktorý používa hlodavčiu monoklonálnu protilátku ako templát (Jespers L. S. a koľ, Bio/Technology 12, 899 - 903 (1994). Nedávno bola opísaná variácia riadeného 30 výberu používajúca technológie využívajúce fágové knižnice, v ktorej sa použil chimérny Fd fragment na výber L reťazca z knižnice, obsahujúcej ľudské L reťazce s naštepovaným myším CDR3 (Rader C. a koľ, Proc Natl. Acad. Sci. USA 95, 8910 -8915 (1998). Následne sa použil najaktívnejší L reťazec na výber H reťazca z knižnice ľudských H reťazcov obsahujúci myšiu HCDR3. Monoklonálne protilátky izolované týmito prístupmi sú výhradne ľudské (Jespers, pozri vyššie) alebo väčšinou ľudské (Rader, pozri vyššie), ale značná rozmanitosť protilátok, ktorá vzniká v každom kroku procesu, spôsobuje nutnosť použitia spôsobov zvyšujúcich afinitu.

Na prípravu humanizovaných protilátok F4 a L3.17 proti CD40 podľa predkladaného vynálezu sa využili nasledujúce materiály a postupy: 1. Príprava chimérnej protilátky proti CD40

Pripravili sa a purifikovali prekrývajúce oligonukleotidy kódujúce VH a VL (69 -75 báz na dĺžku) na základe sekvencie myšej monoklonálnej protilátky 2.220 proti CD40. Premenlivé H a L domény sa syntetizovali oddelene kombinovaním 25 pmol každého z prekrývajúcich sa oligonukleotidov s Pfu DNA polymerázou (Stratagene) v 50 μΙ PCR reakciou skladajúcou sa z 5 cyklov: denaturácia pri teplote 94 eC počas 20 sekúnd, chladenie pri teplote 50 °C počas 30 sekúnd, dosiahnutie teploty 72 °C počas 1 minúty a udržiavanie pri teplote 72 °C počas 30 sekúnd. Následne sa chladiaca teplota zvýšila na 55 eC v 25 cykloch. Reverzný primér a biotínom značený forward primer sa použili, aby sa ďalej amplifikoval 1 μΙ fúzneho produktu v 100 μΙ PCR reakciou s použitím rovnakého postupu. Produkty sa čistili elektroforézou na agarózovom géle, podrobili sa elektroelúcii a fosforylácii pomocou T4 polynukleotidovej kinázy (Boehringer Mannheim) a potom sa inkubovali so streptavidínovými magnetickými guľôčkami (Boehringer Mannheim) v 5 mM Tris-Cl s pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCI a 0,05 % Tweenom 20 pri teplote 25 °C počas 15 minút. Guľôčky sa premyli a mínusové vlákna DNA neoznačené biotínom sa vymyli inkubáciou s 0,15 M NaOH pri teplote 25 °C počas 10 minút. Chimérna anti-CD40 FAB sa syntetizovala v modifikovanom M131X104 vektore (Kristensson K. a kol., Vaccines 95, 39 - 43 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1995), pomenovanom M13IX104CS, cestou hybridizačnej mutagenézy (Rosok M. J. a kol., J. Biol. Chem. 271. 22611 - 22618 (1996); Kunkel T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. «- ψ USA 82, 488 - 492 (1985) s použitím VH a VL oligonukleotidov v trojnásobnom molárnom nadbytku uridinylátovaných vektorových templátov. Vektor M131X104 sa modifikoval výmenou cysteínových zvyškov na konci kappa a τ1 stálych oblastí zo serín. Reakcia bola elektroporovaná do DH10B buniek a titrovaná na bunkách of XL-1 Blue. 2. Príprava kombinatórneho rámca a knižníc rámec/CDR3

Knižnica kombinatórnych rámcov (Hu I) sa syntetizovala rovnakým spôsobom, použitým na prípravu chimérnej anti-CD40 s modifikáciami. Syntetizovali sa prekrývajúce sa oligonukleotidy kódujúce rámcové oblasti H a L premenlivých domén ľudského templátu a myších anti-CD40 CDRs, ako ich definoval Kabat a kol. (Kabat E. A. a kol., Sequences of proteins of immunological interst, 5. vydanie, (1991). Washington DC: United States department of Health and Human Services; Kabat E. A. a kol., J. Biol. Chem. 252. 6609 - 6616 (1977). Pripravili sa degenerované oligonukleotidy, kódujúce ako myšie tak ľudské aminokyseliny na siedmich VH a jednej VK rámcovej pozícii (obrázok 15, zvyšky označené hviezdičkou).

Knižnice rámec/HCDR3 (Hu II) a rámec/HCDR3/LCDR3 (Hu III) sa syntetizovali rovnakým spôsobom ako knižnica kombinatórnych rámcov s modifikáciami. Zvyšky CDR vybraté na mutagenézu boli: Ser95-Tyr102 v HCDR3 a Gln89-Thr97 v LCDR3 (obrázok 15, podčiarknuté). Oligonukleotidy kódujúce HCDR3 a LCDR3 sa označili pre premenu jednoduchého CDR zvyšku a syntetizovali sa zavedením NN (G/T) v každej pozícii, ako je v odbore opísané (Glaser S. M. a koľ, J. Immunol. 149, 3903 - 3913 (1992). Prekrývajúce sa oligonukleotidy kódujúce myšiu CDRs z knižnice rámcov a tie, ktoré nie sú z knižnice rámcov sa skombinovali s 25 pmol oligonukleotidov kódujúcich mutované HCDR3 alebo 25 pmol každého z oligonukleotidov kódujúcich mutované HCDR3 a LCDR3. 3. Skríning fágových expresných knižníc

Hu II a Hu III sa najskôr vyhľadali modifikovaným plakovým prístupom známym v odbore, pomenovaným capture lift (Watkins J. D. a kol., Anál. Biochem. 256. 169-177 (1998). V stručnosti, vnútrocelulózové filtre (82-mm) sa potiahli kozou 32 protiľudskou kappa, obsadili 1 % BSA a nasadili na agarovú doštičku obsahujúcu fágy infikovanej bakteriálnej bunky. V začiatočnom skríningu sa fágy vysadzovali s hustotou 105 fágov na 100 mm doštičku. Po zachytení fágy expresovaných anti-CD40 variant FAB sa filtre inkubovali počas 3 hodín pri teplote 25 °C s 5 ng/ml anti-CD40-lg v PBS obsahujúcom 1 % BSA. Filtre sa premyli štyrikrát PBS, obsahujúcom 0,1 % Tweenu 20 a inkubovali sa kozím protimyším lgG2b-alkalickým fosfatázovým konjugátom (Southern Biotechnology) zriedeným 3000-krát v PBS obsahujúcom 1 % BSA počas 1 hodiny pri teplote 25 °C. Filtre sa štyrikrát premyli PBS obsahujúcom 0,1 % Tweenu 20 a vyvolali postupom opísaným Watkinsom (1998), pozri vyššie. Na izoláciu individuálnych klonov, sa pozitívne plaky z počiatočného skríningu vybrali a vysadili s nižšou hustotou (103 fágov na 100 mm doštičku) a vyhľadávali sa rovnakým spôsobom.

Hu I kombinatórna knižnica sa najskôr preskúmavala metódou ELISA, ktorá umožňuje rýchle zhodnotenie relatívnych afinít variantov (Watkins J. D. a kol., Anál. Biochem. 253, 37 - 45 (1997). Okrem toho sa ELISA použila na charakterizáciu klonov, identifikovaných skríningom metódou capture lift. V stručnosti, mikrotitračné doštičky sa potiahli 5 μ g/ml kozej protiľudskej kappa (Southern Biotechnology) a blokovali 3 % BSA v PBS. ďalej sa 50 μΙ FAB zo supematantu kultúry Escheríchia coli alebo z bunkového lyzátu inkubovala na doštičke počas 1 hodiny pri teplote 25 °C, doštička sa premyla trikrát PBS obsahujúcom 0,1 % Tweenu 20 a 0,1 pg/ml CD40-lg v PBS obsahujúcom 1 % BSA počas 2 hodín pri teplote 25 °C. Doštička sa premyla trikrát PBS, obsahujúcom 0,1 % Tweenu 20 a pridal sa kozí protimyší lgG2b-alkalický fosfatázový konjugát zriedený 3000-krát v PBS obsahujúcom 1 % BSA počas 1 hodiny pri teplote 25 °C. Doštička sa trikrát premyla PBS obsahujúcom 0,1 % Tweenu 20 a vyvolala postupom opísaným Watkinsom (1997), pozri vyššie.

4. Sekvencovanie DNA

Jednoduchá závitnica DNA sa izolovala a gény premenlivých oblastí H a L reťazcov humanizovaných protilátok podľa predkladaného vynálezu sa sekvencovali metódou fluorescenčnej dideoxynukleotidovej terminácie (Perkin - Elmer, Foster City, CA).

Sekvencia nukleových kyselín (SEQ ID NO:7) a aminokyselín (SEQ ID NO:8) f r 33 premenlivého ľahkého reťazca humanizovanej protilátky F4 je nasledujúca: GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT 42 E I V L T Q S P A T L s L s 14 CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84 P G E R A T L S C R A S Q S 28 ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126 I S D Y L H W Y Q Q K P G Q 42 GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC ATC TCT 168 A P R L L I Y Y A- S H s I S 56 GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 210 G I P A R F S G S G S G T D 70 TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 252 F T L T I S S L E P E D F A 84 GTT TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TTT CCT TGG ACC TTC 294 V Y Y C Q H G H S F P W T F 98 GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT AAA 321 G G G T K V E I K 107

Sekvencia nukleových kyselín (SEQ ID NO:9) a aminokyselín (SEQ ID NO: 10) premenlivého ťažkého reťazca humanizovaných protilátok F4 a 13.17 je nasledujúca: CAG GTG CAG CTG .GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT 42 Q V Q L V Q S G S E L K K P 14 GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCC 84 O O G A S V K V S C K A S G Y A 28 TTC ACT ACC ACT GGC ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA 126 F T T T G M Q W V R Q A P G 42 CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC ACC CAC AGC GGG 168 Q G L E W M G W I N T H S G 56 GTC CCA AAG TAT GTC GAG GAC TTC AAA GGA CGG TTT GTC TTC 210 V P K Y V E D F K G R F V F 70 TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTG CAG ATC AGC 252 s L D T S V S T A Y L Q I S 84 AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACT GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA 294 S L K Ά E D T A v · Y Y C A R 98 TCT GGC AAT GGG AAC TAT GAC CTG GCA TAC TTT AAG TAT TGG 336 s G N G N Y D L A Y F K Y W 112 GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 366 G Q G T L V T V S S 122 34

Sekvencia nukleových kyselín (SEQ ID ΝΟ.Ί1) a aminokyselín (SEQ ID NO: 12) premenlivého ľahkého reťazca humanizovanej protilátky L3.17 je nasledujúca: GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT 42 E I V L T Q S P A T L S L S 14 CCA GGG GAA AGA < GCC ACC CTC ' TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84 P G E R A T L s C R A S Q S 28 ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126 I S D Y L H W Y Q Q K P G Q 42 GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC ATC TCT 168 . A P R L L I Y Y A s H s I s 56 GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 210 G I P A R F S G S G S G T D 70 TTC ACT CTC ACC ACT AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 252 F T L T I S S L E P E D F A 84 GTT TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TAT CCT TGG ACC TTC 294 V Y Y C Q H G H S Y P W T F 98 GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT AAA 321 G G G T K V E I K 107

5. Expresia a čistenie FAB

Niektoré FAB sa klonovali do vektora expresie pod kontrolou arabinózou-regulovaného BAD promótora. Okrem toho sa slučka šiestich histidínov fúzovala ku karboxylovému koncu H reťazca, aby sa umožnilo čistenie nikel-chelátujúcimi živicami. Čistená FAB sa kvantifikovala, ako je opísané Watkinsom (1997), pozri vyššie. 6. Charakterizačné skúšky

Mikrotitračné doštičky Immulon II sa potiahli 0,1 pg/ml CD40-lg v PBS obsahujúcom 1 % BSA počas 16 hodín pri teplote 4 °C a blokovali sa 3 % BSA v PBS. Doštičky sa premyli trikrát PBS, obsahujúcim 0,1 % Tweenu 20 a FAB uvoľnená z periplazmatického priestoru sa zriedila sériovo trojnásobne v PBS, r f r r obsahujúcom 1 % BSA a inkubovala s doštičkou počas 2 hodín pri teplote 25 °C. Potom sa doštička premyla štyrikrát PBS, obsahujúcim 0,1 % Tweenu 20 a naviazanie protilátky sa detegovalo inkubáciou s kozím protimyším lgG2b-alkalickým fosfatázovým konjugátom zriedeným 2000-krát v PBS, obsahujúcom 1 % BSA počas 1 hodiny pri teplote 25 °C. Doštička sa štyrikrát premyla PBS, obsahujúcim 0,1 % Tweenu 20 a vyvolala sa kolorimetricky (Watkins (1997), pozri vyššie).

Na testovanie variantov na inhibíciu naviazania ligandu sa mikrotitračné doštičky Immulon II potiahli 2 pg/ml protimyšej CD8 na zachytenie proteínu fúzie sgp39, ktorý expresuje CD8 doménu. Doštičky sa prepláchli jedenkrát PBS, obsahujúcim 0,05 % Tweenu 20 a blokovali 3 % BSA v PBS. Doštička sa raz premyla PBS obsahujúcim 0,05 % Tweenu 20 a inkubovala médiom bunkovej kultúry obsahujúcim nasýtené hladiny sgp39 počas 2 hodín pri teplote 25 °C. Nenaviazaný sgp39 sa odsal a doštička sa dvakrát premyla PBS obsahujúcim 0,05 % Tweenu 20. Potom sa pridalo 25 pl čisteného variantu FAB zriedeného sériovo 3-krát v PBS a potom 25 μΙ roztoku 4 pg/ml CD40-ľudský Ig v PBS. Doštičky sa inkubovali počas 2 hodín pri teplote 25 °C a potom trikrát premyli PBS, obsahujúcim 0,05 % Tweenu 20. Naviazaný CD40-lg sa detegoval po 1-hodinovej inkubácii pri 25 °C s kozím F(ab')2 protiľudským IgG Fcx-špecifickým chrenovým peroxidázovým konjugátom (Jackson), zriedeným 10000-krát v PBS. Doštička sa štyrikrát premyla PBS, obsahujúcim 0,05 % Tweenu 20 a väzba sa kvantifikovala kolorimetricky inkubáciou s roztokom 1 mg/ml orto-fenyléndiamíndihydrochloridu a 0,003 % peroxidom vodíka v 50 mM kyseliny citrónovej, 100 mM hydrogenfosforečnanu sodného s pH 5. Reakcia sa ukončila pridaním kyseliny sírovej do konečnej koncentrácie 0,36 M a určila sa absorbancia pri 490 nm. 7. Analýza BIAcore

Konštanty kinetiky interakcie medzi CD40 a anti-CD40 variantmi sa určili pomocou rezonancie plazmónového povrchu (BIAcore). Fúzny proteín CD40-lg sa imobilizoval na hydrochlorid (1-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl]-karbodiimidu a N-hydroxysukcínimidom aktivovaný snímací čip CM5 injikovaním 8 μΙ roztoku 10 μg/ml CD40-lg v 10 mM octanu sodného, pH 4. CD40-lg sa imobilizoval pri nízkej denzite (približne 150 RU), aby sa zabránilo znovunaviazaniu FAB počas disociačnej fázy. 36

Aby sa získali asociačné konštanty (kon). určil sa väzbový pomer pri šiestich rôznych koncentráciách FAB v rozmedzí 25 až 600 nM v PBS pri prietokovej rýchlosti 20 μΙ/min. Disociačné konštanty (k0ff) sa určili ako priemer šiestich meraní získaných analýzou disociačnej fázy. Senzogramy sa analyzovali pomocou 3.0 programu BIA hodnotenia. Kd sa počítala z Kd = k0ff/k0n. Zvyšková FAB sa odstránila po každom meraní prolongovanou disociáciou. Výsledky analýzy kinetiky humanizovaných protilátok F4 a L3.17 porovnané s chimérnou FAB ukazuje tabuľka 1:

Tabuľka 1: ID kloň kon k0ff Kd Poznámka Chimérna FAB 8,43 x 10' 2,65 x 10'3 3,14 nM Pripravená štiepením chimérneho 2.220 IgG papaínom F4 2,00x10° 4,77 x 10’4 0,24 nM Humanizovaná L3.17 3,17 x 10° 3,28 x 10"4 0,10 nM Humanizovaná 8. Výsledky humanizácie

Ako je uvedené vyššie, rámcové sekvencie premenlivej oblasti myšej monoklonálnej protilátky anti-CD40 sa použili na identifikáciu najviac homológnych ľudských zárodočných sekvencií. Zvyšky rámca H reťazca boli zo 74 % identické ľudským zárodočným sekvenciám VH7 (7 - 4,1) a JH4, zatiaľ čo L reťazec bol zo 75 % identický príslušným ľudským zárodočným sekvenciám VKIII (L6) a JK4. Poradie premenlivých sekvencií H a L reťazcov ukazuje obrázok 15. Zvyšky CDR, ako ich definoval Kabat a kol. (Kabat E. A. a koľ, Seguences of proteins of immunological interst, 5. vydanie, 1991). Washington OC: United States department of Health and Human Services; Kabat E. A. a kol., J. Biol. Chem., 252. 6609 - 6616, 1977) sú podčiarknuté a boli vylúčené z analýzy homológie. Zvyšky rámcov, kde boli odlišnosti medzi myšími monoklonálnymi protilátkami a ľudskými templátmi, sa hodnotili jednotlivo.

Na základe štruktúrnej a sekvenčnej analýzy možno povedať, že protilátkové CDRs s výnimkou HCDR3 vykazujú obmedzený počet hlavných konformácií reťazca, pomenovaných kanonické štruktúry (Chothia C. a kol., J. Mol. Biol. 196, 901 - 917 37 t t * (1987); Chothia C. a kol., Náture 342. 877 - 883 (1989). Navyše sa identifikovali určité zvyšky rozhodujúce na určenie konformácie hlavného reťazca loopov COR (Chothia (1987), pozri vyššie, Chothia (1989), pozri vyššie). Kanonické rámcové zvyšky myšej anti-CD40 sa preto identifikovali a zistilo sa, že aminokyseliny vo všetkých rozhodujúcich kanonických pozíciách v rámci rámcov H a L reťazcov ľudských templátov sú identické s príslušnými myšími zvyškami.

Myšie povrchové aminokyseliny, ktoré sa normálne nenachádzajú v ľudských protilátkach, pravdepodobne prispievajú k imunogenicite humanizovanej monoklonálnej protilátky (Padlan E. A., Mol. Immunol. 28, 489 - 498 (1991). Preto sa analyzovali zvyšky rámcov, v ktorých sú odlišnosti medzi myšou anti-CD40 a ľudskými templátmi a na základe expozície rozpúšťadla sa predikovalo, či sú skryté alebo lokalizované na povrchu (Padlan (1991), pozri vyššie). U rezíduí rámcov vystavených rozpúšťadlu distálnych na CDRs sa nepredpokladalo, že by významne prispievali k väzbe antigénu a preto s výnimkou dvoch zvyškov H reťazcov sa všetky zmenili na príslušnú ľudskú aminokyselinu, aby sa znížila potenciálna imunogenicita. Predikované bolo, že zvyšky 28 a 46 H reťazca boli vystavené rozpúšťadlu. Avšak H28 je umiestnený vnútri oblasti HCDR1, ako ju definoval Chothia a kol., pozri vyššie a potenciálne interaguje s antigénom. Navyše lyzín v H46 v myšej monoklonálnej protilátke je niečo neobvyklé a významne sa odlišuje od kyseliny glutámovej ľudského tempiátu. Preto sa myšie a ľudské zvyšky na H28 a H46 expresovali v kombinatorickej knižnici (obrázok 15, hviezdičky).

Zostávajúce odlišné zvyšky rámcov, u všetkých z nich bolo predikované, že sú väčšinou skryté vnútri protilátky, sa hodnotili z hľadiska: (1) blízkosti k CDRs; (2) spôsobilosti kontaktovať doménu na opačnom vlákne VK - VH interface; (3) príbuznosti odlišných aminokyselín; (4) predpokladaného významu v modulácii aktivity CDR, ako ho definoval Studnička (Studnička G. M. a kol., Protein Eng. 7, 805 - 814 (1994). Väčšina rozdielov v skrytých zvyškoch rámca L reťazca sa týkala aminokyselín v pozíciách, ktoré sa nepovažujú za pravdepodobne priamo zapojené do konformácie CDR. Avšak L49 je umiestená v susedstve s LCDR2, potenciálne kontaktuje VH doménu, nie je vo vzťahu k ľudskému zvyšku a môže byť zahrnutá do určenia konformácie LCDR2. Z týchto dôvodov boli ako myšie tak ľudské aminokyseliny v L49 expresované v kombinatorickej knižnice rámcov (obrázok 15, hviezdičky). 38

Analýza sekvencie myšieho H reťazca a ľudského templátu bola komplexnejšia. Zvyšok H9 je prolín v myšej monoklonálnej protilátke, zatiaľ čo ľudský templát obsahuje nesúvisiaci serínový zvyšok. Pozícia H9 môže tiež hrať úlohu pri modulácii konformácie CDR a preto bola zvolená ako miesto kombínatórnej knižnice (obrázok 15, hviezdičky). Zostávajúce skryté zvyšky rámca, ktoré sa odlišovali medzi myšou anti-CD40 a templátom H reťazca boli v rámcový pozíciách 38, 39, 48 a 91. Myšia monoklonálna protilátka proti CD40 obsahovala glutamín a kyselinu glutámovú v pozíciách H38 a H39 v tomto poradí, zatiaľ čo ľudský templát obsahoval arginín a glutamín. Zvyšok H38 je v blízkosti HCDR1, zámena glutamín-arginín nie je spätne realizovateľná a expresia glutamínu na tomto mieste u myších protilátok je niečo nezvyčajné. Podobne, zámena glutámovej kyseliny za glutamín je nekonzervatívnym rozdielom pre skryté aminokyseliny, H39 je potenciálny VK kontaktný zvyšok a kyselina glutámová je niečo nezvyčajného u myších monoklonálnych protilátok. Zvyšok H48 je v značnej blízkosti k HCDR2 a o H91 sa predpokladá, že je miestom veľmi rizikovým (Studnička (1994), pozri vyššie, Harris L. a kol., Prot. Sci. 4, 306 -310 (1995), ktoré potenciálne kontaktuje VK doménu. Ako myšie tak ľudské zvyšky sa teda expresovali v pozíciách H38, 39, 48 a 91 (obrázok 15, hviezdičky).

Zhrnuté, knižnica rámcov sa skladala z myších CDRs naštepovaných do ľudských templátov. Navyše jeden zvyšok rámca na L reťazci a sedem zvyškov rámca na H reťazci sa považuje za potenciálne dôležité na udržanie aktivity monoklonálnej protilátky. Všetky tieto miesta sa charakterizovali syntézou kombinatórnej knižnice, ktorá expresovala všetky možné kombinácie myších a ľudských aminokyselín, nájdených v týchto zvyškoch. Celková diverzita tejto knižnice, pomenovanej HU I, bola 28 alebo 256 variantov (tabuľka 2, nižšie).

Tabuľka 2: Súhrn knižníc fágovo expresovaných anti-CD40 protilátok

Knižnica Pozícia knižnice Veľkosť* Skrínované+ Hu I rámec 256 2,4 x 10J Hu II rámec, HCDR3 1,1 X 10s 2,0 x 10B Hu III rámec, HCDR3, LCDR3 3,1 x 10' 5,5 x 10b 39 t e * Množstvo jedinečných klonov založené na sekvencii DNA. Tridsaťdva kodónov sa použilo na kódovanie všetkých 20 aminokyselín na každej pozícii CDR. + Knižnica Hu I bola skrínovaná metódou ELISA s použitím protilátok expresovaných v bakteriálnych kultúrach v malom meradle (Watkins (1997), pozri vyššie). Knižnice Hu II a Hu III sa nasadili na XL-1 Blue bunky na agare s hustotou 105 plakov na 100 mm misku a skrínovali sa metódou capture lift (Watkins (1998), pozri vyššie).

Knižnica Hu I sa expresovala v bakteriálnych kultúrach v malom meradle (< 1 ml), rovnaké množstvá FAB uvoľnené z periplazmatického priestoru sa zachytávali na mikrotitračnej doštičke a väzbová aktivita protilátok sa porovnávala priamo metódou ELISA (Watkins (1997), pozri vyššie). Aj keď identifikované varianty, ktoré viažu cieľový antigén s afinitami porovnateľnými alebo lepšími ako chimérna FAB, väčšina skrínovaných klonov z Hu I bola menej aktívna ako chimérna anti-CD40 FAB. Približne 6 % náhodne vybratých variantov Hu I vykázalo väzbové aktivity porovnateľné s chimérnou FAB (dáta nie sú uvedené). Identifikácia viacpočetných variantov Hu I s aktivitou porovnateľnou s chimérnou CD40 je v súlade s výkladom, že najviac rozhodujúce zvyšky rámcov boli obsadené v kombinatórnej knižnici.

Aktívne klony sa ďalej charakterizovali titráciou na imobilizovaný antigén, potvrdzujúci identifikáciu viacpočetných variantov so zvýšenou afinitou. Napríklad kloň 19C11 viaže receptor pre CD40 s väčšou afinitou než chimérna FAB, ako ukazuje zmena titračného profilu (obrázok 16, prázdne kolieska verzus plné kolieska). Sekvencovanie DNA 34 najaktívnejších klonov viedlo k identifikácii 24 jedinečných kombinácií rámcov, z ktorých každá obsahuje 2 až 6 myších zvyškov rámca (dáta nie sú uvedené). LCDR3 a HCDR3 kontaktujú antigén priamo, ínteragujú s inými CDRs a často významne ovplyvňujú afinitu a špecificitu protilátok (Wilson I. A. a koľ, Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 113 - 118 (1993), Padlan E. A., mol. Immunol. 31. 169 - 217 (1994). Navyše sú konformácie LCDR3 a HCDR3 určené čiastočne určitými zvyškami rámcov. Na identifikáciu najaktívnejšej protilátky sa použila mutagenéza založená na kodóne (Glaser S. M. a kol., J. Immunol. 149. 3903 - 3913 (1992), aby sa syntetizovali oligonukleotidy, ktoré zavedú mutáciu do každej pozície v HCDR3, vždy iba jednu, vznikajúcu pri expresii všetkých 20 aminokyselín v každom zvyšku CDR. 40 Žiadny oligonukleotid nekódoval viac ako jednu zmenu aminokyseliny. Zásoba oligonukleotidov kódujúcich knižnicu HCDR3 sa zmiešala s prekrývajúcimi sa oligonukleotidmi, kódujúcimi kombinatórny rámec a inými CDRs, aby sa vytvorila knižnica rámec/HCDR3. Diverzita tejto knižnice, pomenovanej Hu II bola 1,1 x 105 (tabuľka 2, pozri vyššie). Knižnica pre LCDR3 sa syntetizovala rovnakým spôsobom. Oligonukleotidy kódujúce LCDR3, HCDR3 a kombinatórny rámec sa použili na vytvorenie knižnice rámec/HCDR3/LCDR3 pomenovanej Hu III. Veľké množstvá kombinácií rámec/CDR3 vzniklo v knižnici s komplexitou 3,1 x 107 (tabuľka 2, pozri vyššie).

Kombinovaním mutácií v LCDR3 a/alebo HCDR3 s knižnicou rámcov vzrástla potenciálna diverzita humanizovaných variantov anti-CD40 z 256 na viac ako 107. Aby sa aj tieto knižnice skrínovali efektívnejšie, použila sa modifikovaná plaková skúška, pomenovaná capture lift (Watkins (1998), pozri vyššie). V stručnosti, fágmi infikované baktérie sa nasadili na agarové doštičky a následne sa pokryli vnútrocelulózovými filtrami, ktoré boli potiahnuté reagentom špecifickým na FAB. Po zachytení takmer rovnakých množstiev fágovo expresovanej FAB sa filtre skúšali 5 ng/ml CD40-lg fúzneho proteínu. Pretože filtre boli skúšané antigénom s koncentráciou významne nižšou ako je Kd FAB, boli detegovateľné iba varianty so zvýšenou afinitou. Viacpočetné klony vykazujúce vyššiu afinitu sa identifikovali po skríningu viac ako 106 variantov z knižnice Hu II a viac ako 10s variantov z knižnice Hu III s použitím 82 mm filtrov, obsahujúcich približne 105 variantov na filter. Z dôvodov vysokej denzity fágov na filtroch sa pozitívne plaky zozbierali a znovu nasadili pri nižšej denzite a opäť skrínovali. Následne sa charakterizovali metódou ELISA varianty vytvárajúce najintenzívnejší kolorimetrický signál v skúške capture lift. Ako sa očakávalo, väčšina klonov identifikovaných skríningom capture lift viazala CD40 lepšie ako chimérna FAB. Titrácia variantov na imobilizovaný CD40-lg identifikovala viacpočetné klony vykazujúce afinitu väčšiu ako chiméme a humanizované FAB (obrázok 16, porovnaj prázdne štvorčeky a plné trojuholníky s kolieskami).

Mutácie rámec/CDR. ktoré prepožičiavajú zvýšenú afinitu, sa identifikovali sekvencovaním DNA. Sekvencie jedinečných premenlivých oblastí sa identifikovali v 10/13 Hu II variantoch a 3/4 Hu III variantoch. Ako varianty Hu II tak Hu III obsahovali 1 až 5 myších zvyškov rámcov a 0 až 2 mutácie CDR3, ako nižšie zhrňuje tabuľka 3. 41

Tabuľka 3. Simultánna optimalizácia zvyšku rámca a CDR identifikuje varianty s vyššou afinitou

Knižnica Kloň Zvyšky myšieho rámca* CDR mutácia chimérny (43) 0 Hu I 19C11 (2) H28, 48 0 Hu II CW43 (3) H9, 28, 91 HCDR3,101A-»R 2B12 (5) H9, 28, 38, 46, 48 HCDR3,1U1A-»K Hu lll 2B12 (5) H9, 28, 38, 46, 48 HCDR3,101A-»K 2B8 (1) H28 HCDR3, 101A-»K LCDR3, 96R-»Y * Počet zvyškov myšího rámcov, ktoré sa odlišujú od najviac homológnych ľudských zárodočných sekvencií založených na definícii CDRs, podanej Kabatom a koľ, pozri vyššie. Počet zvyškov myších rámcov, odlišujúcich sa od ľudského templátu, je označený v zátvorkách. Všetky rozdiely rámcov medzi myšou monoklonálnou protilátkou a humanizovanými verziami sú umiestnené na H reťazci (H) v označených pozíciách s použitím systému číslovania, použitého Kabatom a kol.

Afinity bakteriálne expresovaných chimérnych FAB a zvolených variantov z každej z knižníc sa charakterizovali dôkladnejšie s použitím merania povrchovej plazmónovej rezonancie, aby sa určili asociačné a disociačné konštanty čistenej FAB s imobilizovaným CD40-lg. Chimérna antí-CD40 mala disociačnú konštantu K<j = 3,14 nMav súlade s výsledkami skríningu mnoho variantov vykázalo vyššie afinity. Dva z najlepších klonov, F4 a L3.17 mali Kd 0,24 nM a 0,10 nM (v danom poradí) (tabuľka 1). Zlepšené afinity variantov anti-CD40 boli prevažne výsledkom pomalších disociačných konštánt, pretože asociačné konštanty boli veľmi podobné u všetkých variantov (v rozmedzí 0,9 až 3,2 x 106 M*1s'1).

Nakoniec sa varianty, vykazujúce zvýšenú afinitu testovali na ich spôsobilosť blokovať väzbu ligandu gp39 na receptor CD40. Všetky varianty inhibovali väzbu rozpustného proteínu fúzie CD40-lg na imobilizovaný antigén gp39 v závislosti od dávky, ktorá korelovala s afinitou FAB (obrázok 17). Napríklad najsilnejším inhibítorom väzby ligandu na protein fúzie CD40-!g bol variant 2B8, čo bol tiež p - 42 variant s najvyššou afinitou k CD40 (obrázok 17). Variant 2B8 vykázal približne 17-krát vyššiu afinitu k CD40 ako chimérna FAB a inhiboval väzbu ligandu približne 7-krát účinnejšie.

Príklad 5

Systém myšieho modelu

Predkladatelia patentu tiež vyvinuli a testovali in vivo krysiu protimyšiu monoklonálnu protilátku označenú 7E1-G1. Príprava tejto protilátky sa uskutočnila, aby sa preskúmali možnosti liečby anti-CD40 u myšieho modelu autoimunitnej, zápalovej a posttransplantačnej choroby. Primárnym cieľom systému myšieho modelu bolo pripraviť protimyší modelový systém, ktorý napodobňoval kompletnú silnú blokádu interakcie gp39/CD40, ako má 2.220, zatiaľ čo by mal slabú kostimulačnú aktivitu a testovať ju in vivo na štandardných modeloch choroby. A. Izolácia a charakterizácia protimyších CD40 monoklonálnych protilátok 7E1-G1 a 7E1-G2b 1. Imunizácia, fúzia a charakterizácia

Rekombinantný myší proteín fúzie CD40 a imunoglobulínu, skladajúci sa z extracelulárnej oblasti myšej CD40 fúzovaný na naviazanie, CH2 a CH3 domény myšej lgG2a protilátky (mCD40-mlg) sa použili na imunizáciu 8 týždňových samičiek krýs Lewis cestou inokulácie do labky. Tri dni po poslednej imunizácii sa fúzovali leukocyty z odtekajúcich miazgových uzlín s X63-Ag8.653 bunkami myšieho myelómu, aby sa vytvorili heterohybridómy krysy x myš. Jamky, obsahujúce protilátku špecifickú pre prírodnú myšiu CD40, sa identifikovali na reaktivitu s pôvodným mCD40-mlg imunogénom metódou ELISA a na reaktivitu s CD40 pozitívnymi myším B-bunkami lymfómovej bunkovej línie (WEHI-231, ATCC CRL-1702). Supernatanty sa potom testovali na spôsobilosť inhibovať naviazanie mCD40-mlg na rozpustný rekombinantný proteín fúzie mCD8-myší gp39, mgp39, myší ekvivalent sgp39. Približne dvanásť z pôvodných jamiek s najsilnejšími inhibítormi sa klonovali pomocou metódy limitného zrieďovania.

Po klonovaní sa uskutočnili funkčné skúšky so supernatantami kultúr a čistenou protilátkou, aby sa presnejšie ohodnotila spôsobilosť anti-CD40 monoklonálnej protilátky inhibovať interakciu myšej gp39 s CD40 a určiť ich stimulačné vlastnosti. Inhibičné vlastnosti sa merali schopnosťou inhibovať väzbu mgp39 na WEHI-231 s použitím štandardných postupov, známych v odbore. Stimulačné vlastnosti sa merali indukciou pevnej homotypovej adhézie WEHI-231 buniek a proliferáciou slezinových B-buniek za prítomnosti protilátky a anti-lgM s použitím postupov, známych v odbore. Z týchto výsledkov sa určili tri monoklonálne protilátky (5A3, 7E1-G1 a 8E1), ktoré sú najviac podobné protiľudskej CD40 monoklonálnej protilátke 2.220 s ohľadom na blokádu gp39/CD40 a na úroveň kostimulačnej aktivity. 2. Výber 7E1 ako prednostne použiteľnej protimyšej CD40 monoklonálnej protilátky Štúdie in vivo na myšiach boli zamerané na identifikáciu, ktorá z blokujúcich/nestimulujúcich anti-CD40 monoklonálnych protilátok najsilnejšie znižuje špecifické protilátkové odpovede na T-dependentný antigén. Študovalo sa zníženie IgG protilátkovej odpovede na SRBC u myší pomocou protimyšej CD40 monoklonálnej protilátky. Skupiny piatich myší BALB/c sa imunizovali IV (intravenózne) 1 x 108 SRBCs a súbežne sa liečili ip (intraperitoneálne) 1 mg protimyšími CD40 monoklonálnymi protilátkami 5A3, 7E1-G1 alebo 8E1. Ako kontroly sa skupiny rovnako imunizovaných myší liečili MR1 (škrečia protimyšia gp39, pozitívna kontrola, 250 μς), 6E9 (krysí protiľudský gp39, negatívna kontrola, 1 mg) alebo PBS. Myši sa hodnotili na titre IgG anti-SRBC metódou ELISA 7., 14., 21. a 35. deň. Výsledky ukazujú, že pri podaní jednej dávky v dobe expozície antigénom SRBCs sa prejavuje monoklonálna protilátka 7E1-G1 ako účinnejší supresor IgG odpovede na SRBC v porovnaní s monoklonálnymi protilátkami 5A3 alebo 8E1, a preto bola vybratá ako prednostne použiteľná anti-CD40 monoklonálna protilátka pre štúdie na myšiach. 3. Izotypová zámena variantov monoklonálnej protilátky 7E1-G1 7E1-G1 nemal charakteristiky efektorovej funkcie porovnateľné s charakteristikami chimérnej 2.220 protiľudskej Cd40 monoklonálnej protilátky 44 (napríklad krysí lgG1 nie je taký účinný, ako ľudský lgG1 pri fixácii komplementu a Fc receptorovej interakcii) a profil supresie špecifickej protilátky in vivo nie je u 7E1-G1 taký kompletný, ako bol pozorovaný u monoklonálnej protilátky 2.220 u primátov. Hľadala sa teda protilátka, ktorá má špecificitu 7E1, ale s krysím izotypom podobnejším ľudskej lgG1 vo svojich efektorových schopnostiach. K tomu sa pripravil prírodný izotypový zámenný variant 7E1 z lgG1 na lgG2b pomocou metódy sib-selekcie (Hae a kol., J. Immunol. Methods 103(1). 59 - 67 (1987). Stručne, anti-CD40 monoklonálna protilátka izotypu lgG2b sa identifikovala metódou ELISA medzi supernatantami z doštičky s 96 jamkami, ktorá bola nasadená bunkami pri 1000 bunkách/jamku s pôvodným 7E1 hybridómom. Následné série nasadenia a identifikácie lgG2b pozitívnych jamiek pri nasadzovacej hustote 200 a potom 20 buniek na jamku, nasledovaných dvoma sériami klonovania pomocou metódy limitného zrieďovania, viedli k izolácii clonal lgG2b zámenných variantov 7E1, 7E1-G2b. 7E1-G2b je všeobecne uznávaný zámenný variant lgG1 ako sa ukázalo na troch skupinách údajov. Po prvé, sekvencovanie N-konca ťažkého reťazca ukázalo, že obidve verzie boli zhodné vo zvyškoch prvých 35 aminokyselín. Po druhé, analýza PCR používajúca priméry špecifické pre premenlivý ťažký reťazec CDRs 7E1-G1 získala spojenie vhodnej veľkosti z cDNA, získanej buď z 7E1-G1 alebo z 7E1-G2b a nie z dvoch ďalších nesúvisiacich protilátok. Nakoniec hodnotenie väzbovej aktivity čistených podielov týchto dvoch verzií na imobilizovaný mCD40-hlg metódou ELISA s použitím anti-kappa zvyškového reagentu podalo zásadne rovnaké titračné krivky. B. Štúdie in vivo 1. Porovnanie in vivo 7E1-G1 a 7E1-G2b v modeli protilátkovej odpovede 7E1-G1 sa porovnávala s 7E1-G2b na účinnosť in vivo s použitím SRBCs ako antigénu dependentného na T-bunkách. Skupiny troch až piatich zvierat sa imunizovali iv (intravenózne) SRBC a súbežne liečili ip (intraperitoneálne) protilátkami 7E1-G1 alebo 7E1-G2b v dávkach 1, 0,25 alebo 0,1 mg látky v 0. dni, ako ukazuje obrázok 10. Protimyšia gp39 monoklonálna protilátka MR1 slúžila ako pozitívna kontrola na imunosupresívny účinok. Monoklonálne protilátky 6E9 a PBS slúžili v danom poradí ako kontroly irelevantnou monoklonálnou protilátkou a žiadnou 45 monoklonálnou protilátkou. Myši sa hodnotili na titre anti-SRBC metódou ELISA 7., 14. a 21. deň. Titre predstavovali spočítané zriedenia séra, aby sa získala hodnota OD = 0,3 v teste ELISA. Ako ukazuje obrázok 10, 7E1-G2b znížil IgG protilátkovú odpovecf na SRBCs v dávkach, v ktorých ju neznížil 7E1-G1. 2. Závislosť odpovede od dávky 7E1-G2b v myšom modeli T-dependentného antigénu. 7E1-G2b sa skúšal na modeli primárnej imunitnej odpovede dependentnej na T-bunkách s použitím SRBC ako antigénu. 7E1-G2b sa testoval v rôznych dávkach, aby sa určila najnižšia účinná dávka. Myši BALB/c (n = 5) sa intravenózne injikovali 1 x 10® SRBCs a liečili sa jednou injekciou 7E1-G2b v indikovaných dávkach alebo MR1 (protimyšia gp39) alebo PBS podanou v rovnakom čase ako antigén v 1. deň. Obrázok 11 ukazuje IgG odpoveď proti SRBC v 7., 16. a 28. dni. Uvádzané hodnoty sú hodnoty absorbancie pri meraní metódou ELISA pri zriedení séra 1/50. Stĺpce chýb predstavujú štandardnú odchýlku.

Ako ukazuje obrázok 11, jednodávková liečba 7E1-G2b v dávke 25 pg/myš (1,25 mg/kg) znížila IgG imunitnú odpoveď o 87 % 16. deň a úplná supresia sa dosiahla dávkami 50 alebo 100 pg 16. deň. V 28. dni dávka 50 pg/myš znížila IgG odpoveď o 89 % a dávka 100 pg/myš spôsobila úplnú supresiu. Stojí za pozornosť, že MR1 sa použila ako pozitívna kontrola na imunosupresiu v suboptimálnej dávke 100 pg/myš. 3. 7E1-G2b v preventívnom myšom modeli kolagénom indukovanej artritídy (CIA) Štandardný experimentálny myší model pre reumatoidnú artritídu, model kolagénom indukovanej artritídy (CIA) sa použil na určenie účinku 7E1-G2b na prevenciu artritídy. 6 až 8 týždňovým samcom myší DBA/1J sa injikovalo 200 pg kuracieho kolagénu typu II (CH) v kompletnom Freundovom adjuvans intradermálne 0. deň. Liečba 7E1-G2b v dávke 250 pg na jednu dávku sa podala intraperitoneálne každé 4 dni, počínajúc 7. dňom. Kontrolná skupina sa liečila PBS v rovnakej dávkovacej schéme. Všetkým myšiam sa podal CH v nekompletnom Freundovom adjuvans 21. deň. U myší bola denne pozorovaná veľkosť opuchu labky a subjektívne skórovaná na stupnici 0 až 3, kde 3 sa rovnalo maximálnemu opuchu a 46 erytému. Labky sa tiež denne merali posuvným meradlom. Udávané klinické skóre bolo odvodené od súčtu skóre každej labky v okamihu vykrvácania a delené celkovým počtom zvierat v každej skupine. Uvádzané hodnoty sú priemerným rozmedzím skupín.

Rozvoj artritídy a tým spôsobený zápal kĺbov u myší bol úplne inhibovaný liečbou 7E1-G2b, ako ukazuje tabuľka 4 nižšie. Myši liečené 7E1-G2b boli v priebehu 90 dní úplne bez choroby.

Tabuľka 4. Liečba artritídy indukovanej kolagénom

Skúp Tx Incidencia artritídy Medián (rozmedzie) deň nástupu Medián (rozmedzie) klin. skóre Medián (rozmedzie) rozmer labky 7E1-G1 0/5 0 0 0,075 7E1-G2b 0/5 0 0 0,075 kontrola PBS 4/4 30 (27-32) 3,5 (3-4) 0,114(0,110-0,117)

Ako bolo ukázané vyššie, protilátky podľa predkladaného vynálezu sú silnými imunomodulátormi s liečebným využitím pri mnohých chorobách.

Predkladaný vynález zahrňuje chimérne a humanizované protilátky, ako bolo opísané vyššie, s doplňujúcimi konzervatívnymi substitúciami aminokyselín, ktoré nemajú žiadny podstatný efekt na naviazanie CD40. Konzervatívna substitúcia typicky zahrňuje substitúciu jednej aminokyseliny za inú s rovnakými charakteristikami, teda substitúcia v rámci týchto skupín: valín, glycín; glycín, alanín; valín, izoleucín, leucín; kyselina asparágová, kyselina glutámová; asparagín, glutamín; serín, treonín; lyzín, arginín; a fenylalanín, tyrozín. V jednom ohľade je predkladaný vynález zameraný na produkciu chimérnych a/alebo humanizovaných protilátok, ako je opísané vyššie, expresiu rekombinantných segmentov DNA kódujúcich myší ľahký premenlivý reťazec a myší ťažký premenlivý reťazec (alebo ich časti), pripojené k segmentom DNA kódujúcim ľudské stále oblasti. Príkladné sekvencie DNA, označené v súlade s predkladaným vynálezom, kódujú polypeptidové reťazce zahrňujúce akúkoľvek oblasť ľahkého 47 premenlivého reťazca alebo jej časť, ako ukazuje SEQ 10 N0:1 alebo jej depozitný ATCC kloň, a/alebo akúkoľvek oblasť ťažkého premenlivého reťazca alebo jej časť, ako ukazuje SEQ ID N0:2 alebo jej depozitný ATCC kloň. V rámci predkladaného vynálezu sú tiež zahrnuté odhalené oblasti ľahkého a ťažkého premenlivého reťazca a ich aktívne alebo funkčné časti. Imunologický kompetentné alebo funkčné formy proteínu alebo ich častí sa tu tiež nazývajú ako „oblasť ľahkého/ťažkého premenlivého reťazca alebo ich biologicky aktívna časť,,. V tomto prípade ich biologicky aktívna časť zahrňuje časť spomenutého ľahkého alebo ťažkého reťazca, ktorá, pokiaľ je začlenená do protilátky, stále umožňuje, aby protilátka viazala ľudský CD40.

Zvlášť sú v rámci predkladaného vynálezu zahrnuté sekvencie nukleových kyselín kódujúce premenlivý ľahký reťazec a premenlivý ťažký reťazec protilátky podľa predkladaného vynálezu. Napríklad nukleotidy 1057 až 1422 (SEQ ID NO:5) na obrázku 13 poskytujú výhodnú sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu premenlivý ťažký reťazec protilátky podľa predkladaného vynálezu; nukleotidy 1065 až 1388 (SEQ ID NO:6) na obrázku 14 poskytujú výhodnú sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu premenlivý ľahký reťazec protilátky podľa predkladaného vynálezu. SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO: 11 ukazujú výhodnú sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu premenlivý ľahký reťazec humanizovaných protilátok podľa predkladaného vynálezu; SEQ ID NO:9 ukazuje výhodnú sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu premenlivý ťažký reťazec humanizovanej protilátky podľa predkladaného vynálezu. Plazmidy zahrňujúce polynukleotidy, ktoré ukazujú SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11 boli deponované s ATCC.

Chimérne a/alebo humanizované protilátky, ktoré sa viažu na ľudský CD40 a ktoré zahrňujú polypeptidy, ktoré sú značne homológne alebo vykazujú značnú zhodnosť sekvencie so sekvenciami premenlivého ľahkého a ťažkého reťazca odhalenými tu, sú tiež spomínané v predkladanom vynáleze. Napríklad chimérne protilátky zahrňujúce oblasť ľahkého reťazca, vykazujúcu zhodnosť najmenej v asi 85 % sekvencie, výhodnejšie najmenej vaši 90 % sekvencie a ešte výhodnejšie najmenej vaši 95 % sekvencie a najvýhodnejšie najmenej vaši 98 % sekvencie s oblasťou ľahkého reťazca, ako ju ukazuje SEQ ID NO:4 sú zahrnuté do rámca predkladaného vynálezu. Zvlášť sú tiež zahrnuté do rámca predkladaného vynálezu chimérnej protilátky, zahrňujúce premenlivú oblasť ľahkého reťazca, vykazujúce 48 zhodnosť najmenej v asi 85 % sekvencie, výhodnejšie najmenej vaši 90 % sekvencie a ešte výhodnejšie najmenej vaši 95 % sekvencie a najvýhodnejšie najmenej v asi 98 % sekvencie s premenlivou oblasťou ľahkého reťazca, ako ju ukazuje SEQ ID ΝΟ.Ί. Tiež sú zahrnuté do rámca predkladaného vynálezu humanizované protilátky zahrňujúce oblasť ľahkého reťazca, vykazujúce zhodnosť najmenej v asi 85 % sekvencie, výhodnejšie najmenej v asi 90 % sekvencie a ešte výhodnejšie najmenej v asi 95 % sekvencie a najvýhodnejšie najmenej v asi 98 % sekvencie s oblasťou ľahkého reťazca, ako ju ukazuje SEQ ID NO:8 a/alebo SEQ ID NO: 12. Doplnkovo sú zahrnuté do rámca predkladaného vynálezu chimérne protilátky zahrňujúce oblasť ťažkého reťazca, vykazujúce zhodnosť najmenej v asi 85 % sekvencie, výhodnejšie najmenej vaši 90 % sekvencie a ešte výhodnejšie najmenej vaši 95 % sekvencie a najvýhodnejšie najmenej vaši 98 % sekvencie s oblasťou ťažkého reťazca, ako ju ukazuje SEQ ID NO:3. Zvlášť sú tiež zahrnuté do rámca predkladaného vynálezu chimérne protilátky zahrňujúce premenlivú oblasť ťažkého reťazca, vykazujúce zhodnosť najmenej v asi 85 % sekvencie, výhodnejšie najmenej v asi 90 % sekvencie a ešte výhodnejšie najmenej v asi 95 % sekvencie a najvýhodnejšie najmenej v asi 98 % sekvencie s premenlivou oblasťou ťažkého reťazca, ako ju ukazuje SEQ ID NO:2. Doplnkovo sú zahrnuté do rámca predkladaného vynálezu humanizované protilátky zahrňujúce oblasť ťažkého reťazca, vykazujúce zhodnosť najmenej v asi 85 % sekvencie, výhodnejšie najmenej vaši 90 % sekvencie a ešte výhodnejšie najmenej vaši 95 % sekvencie a najvýhodnejšie najmenej v asi 98 % sekvencie s oblasťou ťažkého reťazca, ako ju ukazuje SEQ ID NO: 10.

Segmenty DNA typicky ďalej zahrňujú sekvencie kontroly expresie DNA operatívne spojené so sekvenciami kódujúcimi chimérnu alebo humanizovanú protilátku, obsahujúcu prirodzene asociované alebo heterologné oblasti promótora. Výhodne sekvencie kontroly expresie budú eukaryotické promótorové systémy vo vektoroch schopných transformácie alebo transfekcie eukaryotických hostiteľských buniek, ale tiež možno použiť kontrolnú sekvenciu pre prokaryotických hostiteľov. Keď sa vektor začlenil do vhodnej bunky, udržuje sa hostiteľ za podmienok vhodných pre vysokú úroveň expresie sekvencie nukleotidov a, ak je žiaduce, môže nasledovať zber a čistenie premenlivého ľahkého reťazca, ťažkého reťazca, dimérov ľahkého/ťažkého reťazca alebo nedotknutej protilátky, viažucich sa fragmentov alebo 49 *· r p r iných foriem imUnoglobulínov. (Pozri Beychok S., Celíš of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N. Y. (1979)). Protilátky s jednoduchým reťazcom možno tiež produkovať spojením sekvencií nukleových kyselín, kódujúcich oblasti VL a VH tu odhalených s DNA kódujúcou polypeptidový linker.

Prokaryotickí hostitelia, ako je E. coli a iné mikróby, ako kvasinky, možno použiť na expresiu protilátky podľa predkladaného vynálezu. Navyše k mikroorganizmom možno tiež použiť bunkovú kultúru cicavčích tkanív na expresiu a produkciu protilátky podľa predkladaného vynálezu. Eukaryotické bunky možno preferovať, pretože v odbore bolo vyvinutých mnoho vhodných línií hostiteľských buniek, schopných sekrécie nedotknutých imunoglobulínov, do ktorých možno zahrnúť CHO bunkové línie, rôzne COS bunkové línie, HeLa bunky, myelómové bunkové línie a hybridómy. Expresia vektorov pre tieto bunky môže zahrňovať sekvencie kontroly expresie, ako je promótor alebo enhancer a miesta nevyhnutné na spracovanie informácie, ako sú miesta viažuce ribozómy, miesta spojenia RNA, miesta polyadenylácie a transkripčné terminátorové sekvencie, všetky známe v odbore.

Vektory obsahujúce segmenty DNA, ktoré sú predmetom záujmu (teda sekvencia kódujúca ťažký a/alebo ľahký reťazec a sekvencia kontroly expresie) možno preniesť do hostiteľskej bunky dobre známymi spôsobmi, ktoré sa líšia v závislosti od typu bunkového hostiteľa. Napríklad transfekcia chloridom vápenatým sa bežne používa pri prokaryotických bunkách, zatiaľ čo pôsobenie fosforečnanom vápenatým alebo elektroporáciou možno použiť u iných bunkových hostiteľov. (Pozri napríklad Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)).

Keď sú expresované, môžu sa celé protilátky, ich diméry, jednotlivé ľahké a ťažké reťazce alebo iné formy imunoglobulínov podľa predkladaného vynálezu čistiť podľa štandardných postupov v odbore, zahrňujúcich precipitáciu síranom amónnym, metódu stĺpcovej afinity, stĺpcovú chromatografiu, elektroforézu na géle a podobne. Výhodné sú významne čisté imunoglobulíny s najmenej 90 až 95 % homogenitou a najvýhodnejšie sú tie s 98 až 99 % homogenitou na farmaceutické použitie.

Protilátky podľa predkladaného vynálezu majú svoje typické uplatnenie v liečbe chorôb sprostredkovaných protilátkovo a/alebo sprostredkovaných T- 50 bunkami. Typické stavy choroby vhodnej na liečbu zahrňujú reakciu štepu proti hostiteľovi a rejekciu transplantátu, autoimunitné choroby ako diabetes I. typu, lupienka, rozptrúsená skleróza, reumatoidná artritída, systémový lupus erythematosus a myastenia gravis.

Protilátky a farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu sú užitočné najmä pri parenterálnom podaní, napríklad subkutánne, intramuskulárne alebo intravenózne. Farmaceutické prípravky na parenterálne podanie budú zvyčajne zahrňovať roztok protilátky rozpustenej vo vhodnom nosiči, výhodne vo vodnom nosiči. Použiť možno mnoho vodných nosičov, dobre známych v odbore, napríklad vodu, pufrovanú vodu, roztok chloridu sodného, glycínu a podobne. Tieto roztoky sú sterilné a celkovo bez obsahu častíc. Tieto farmaceutické prípravky možno sterilizovať konvenčnými dobre známymi postupmi. Tieto prípravky môžu obsahovať farmaceutický vhodné pomocné látky, ak sú potrebné preto, aby sa priblížili fyziologickým podmienkam, ako sú pH adjustujúce a pufrovacie látky, toxicitu adjustujúce látky a podobne, napríklad octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, láktát sodný, ľudský albumín, atď.

Prípravky obsahujúce protilátky podľa predkladaného vynálezu možno použiť na profylaktické alebo liečebné ciele. Pri liečebnom použití sa prípravky podávajú pacientovi, ktorý už trpí chorobou v množstve dostatočnom na liečbu alebo prinajmenšom na čiastočné spomalenie choroby a jej komplikácií. Takéto množstvo sa definuje ako „terapeuticky účinná dávka,,. Množstvá účinné na toto použitie budú závisieť od toho, ako ťažký je stav choroby a celkový stav pacientovho vlastného imunitného systému a môže ho určiť odborník v odbore.

Pri profylaktickom použití sa prípravky podávajú pacientovi, ktorý ešte netrpí chorobou, aby sa zvýšila pacientova odolnosť (znížila imunitná odpoveď). Dostatočné množstvo, aby sa toho dosiahlo, sa definuje ako „profylaktický účinná dávka,,. Presné množstvá na toto použitie budú opäť závisieť od stavu pacientovho zdravia a celkovej úrovne jeho imunity. Výhodné profylaktické použitie je na prevenciu rejekcie transplantátu, napríklad rejekciu transplantovanej obličky.

Aj keď bol predkladaný vynález opísaný v niektorých podrobnostiach cestou ilustrácií a príkladov kvôli jasnosti a porozumeniu, bude zrejmé, že určité zmeny a modifikácie možno uskutočniť v rámci pripojených patentových nárokov.

ZOZNAM SEKVENCII <1Í0> Arufio, Aiejančro A.

Siačak, Anrhony W.

Berrv, Karen K.

Harns, Linca Thorne, Barbara A-Bajorath, Jurgen Kusa, William D.

Wu, Herren Watkins, Jeffry D. <120> PROTILÁTKY PROTI ĽUDSKÉMU CD40 <130> DB2a sekvencie <140> 09/247,352 <141> 1995-02-10 <150 09/025,291 <151> 1998-02-19 <160 14 <170> Patenrlr. Ver. 2.0 <210> 1 <2ii> 108 <212> ?P.T <213> Ľudské a myšie <400 1

Asp íle Val Leu Thr Gin Ser Fro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly * ς 10 15 Asp Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Íle Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp ľvr Gin Gin Lvs Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu íle 35 40 45 r>ys Tyr Ala Ser His Ser Z Ser Gly Z lô Pro cer Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp <TW — Leu Ser íle Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Glv íle Tyr Tyr Cvs Gin His Gly His Ser Phe Pro Trp η 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Αχ g 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> ??.T <213> . . Ľudské a myšie <400> 2

Gin íle Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Arg íle Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Thr Thr Thr 20 25 30 Gly Met Gin Tr? Val Gin Glu Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys ľr? Zle 35 - 40 45 Gly Tr? íle Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Val Glu As? Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr .Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin íle Ser Asn Leu Lys Asn Glu A.S? Th~ Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Vsi Are Ser Gly Asn Gly- Asn Tyr As? Leu Ala ľvr CHe Ala Tyr Tr? 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Vsi Ser Ala 115 120 <210> Ξ <21i> 451 <212> ??.T < 213 > Ľudské a myšie <4G0> 5

Gin íle Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Arg íle Ser Cvs Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Thr 20 25 30 Γ>3

Gly Met Gin Trp Val Gin Glu Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp íle 35 40 45 GIv Trp Íle Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Val Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser A.la Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin íle Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Asn. Gly Asn Tyr A. s p Leu Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 C ar Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cvs Leu Val Lys As? Tyr DKa Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly A.la Leu "hr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu - y- Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val ?ro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn 155 200 205 His Lys ?ro Sar Asn ψ. Lys Val As? Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cvs Asp Lys Thr His Cvs Pro Pro Cys Pro Ala Pro Giu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val IjÔU pH o Pre Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 ľle Ser A.rr Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 2 65 270 Giu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trs Tyr Val Asp Gly val Glu Val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu T* U y- Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 - 320 Lvs Glu Tvr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle 325 - 330 335 Glu Lys Thr íle Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Are Glu ?ro Gin Val 340 345 350 T vr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 355 360 365 Leu Τ'v, — Cys Leu Val Lys Gly PJjQ Τ'V Pro Ser A s? Tie Ala Val Glu 370 375 330 Trc Glu Ser Asn Gly C-ln Pro C-lu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 335 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe La u Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Giv Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tvr Thr Gin Lvs Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 :o Giv Lvs 450 <2X0> 4 <211> 214 <212> ?RT <213> Ľudské a myšie <400> 4

Asp r-1 1 1 Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly n - 10 15 A.sp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu íle m r s 35 40 45

Lys Tyr'Ala Ser His Ser íle Ser Gly íle Pro Cer Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser íle Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Gly íle Tyr Tvr Cys Gin His Gly His Ser Phe Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala .Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 ‘175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 . ·. 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 5 <211> 8614 <212> DNA <213> Ľudské a myšie <400> 5 gacggatcgg gagarctgct aggtgacctg aagcgcgccg gcttcgaata gccaaagtaa 60 ccttttttct taacttcatt ttatrttatt tttgagatgg agtttggcgc cgatctcccg 120 accccctatg gtcgactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtatc 180 rgctccctgc ttgtgtgrtg gaggtcgccg agtagtgcgc gagcaaaatt taagctacaa 240 caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg cgttttgcgc 300 rgcttcgcga tgtacgggcc agatacacgc gttgacactg attattgact agttattaat 360

π * zzzzzacaaz ZBBBCZBBZB gzazcazaaa tt-racaaa“ aazgcezzzz zzzzazzgca zzczazzzgz CZZZZZZZ Cc zazzzzzcaz zgzazczzaz czzzzzzzzz zzzzczzgaz zzzzzzcczg cgcgggga.c ZZcZZCZc z s zzzzzzzzzz czczczzzcz zzz ttazzzc zzzzzzzzzz cgtca=aa=t zzzzzzzzzz cazcacaaa" t-CäCSLssZS zzzzzzzzzz Z ZZEZZZZZZ zzzzzzzzza ac-carcaa- ZZSZCZZeZZ SZZ-ZZZZa^. zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz zzzzzczzzb. ezzszzzzze zbzzzzzzZz ZZCZZZZBBB zzzzzazzzz zzzzzazzaz ezzezzzzze agsataaag. zzzzzzzzzz zzzzzzzzaa ZZBZZZB.ZZZ zazzzazazz zzzzzzzzzz cczzczczcz zzczzzzzza czczzzbb.bc zzzzzzzzzz ZZZZZZZZZZ caaczczczz zzazazzzzz -zzczzzzzz zzzzzzzzzz cczzzazzaz- c:cic:ca== cgzzgzaaza czzzzzzczz caraatcagg cgaaagaaca zzzzagzaaa zzzzzzzzzz accgraaaaa zzzzzzazgz zazaggzzzz CscsCCC^äC aggazzazaa azzzzcczzg cgr.tccccc zzgzagzzzz czzzzzzzcz MM zaczzzzzzg czzzzzzzzz aZZZZZCCZZ zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz ZZBBZ.ZZZZB czzzzzzzzz 3Z Z e ^ ~ 3Z Z Z Z ZZZZZZZZZZ azczzzaczz zzzzzzzzza čagagrgagg zazzžazzcz CZ ZZZEZäCä zzzzzzzzzg Z.ZZZCZCZZB. ac-a=grcra czzzzzzzzz BZBZZB.Z Z ZZ zzzzzzzzzz ZZZCZCľcSľ zzzzzzzzzz “rggaaaaa: zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz ľZcčscaaE» zzczzaHíl czzzzzzzcz “IC - - - ZZZ SZ czzzzzzzac czzczzzzca EZ-E2.EE ZZ Z ä —«-"ä = CCTC zzzzzzzzza • ZEZ3LZ - ä - Z zzzzzzzzzz - - ZHCC ZZZZZZZ22E “•saaas — —a zzzzzzzzzz :aaz:_aaa= zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz ZZZc.Cs.CZZB. ZZSäZZZZZS zzzzzzzzzz caccta"ctc ΕΖΖΖΞΖΖΖΖΖ czzzzzzzzz zzzzzzzzzz -3C3“zb.czC zzzzzzzzzz aZšIssCušZ CBZBCCZZBZ zzczzazzzz zzzzcczczz zzzzzzaazz zzzzzzzzzz ac==acgc~ zzczzzzzza czzzzzzzzz ZBB.ZccB.ZCB. Siíjí-?4'!- zzczzgzaaz ::£C5::£š: zzzzzzzzza CZZ Ξ.ΕΖ 2.C“ Z ZZZZC3 EZZZ zzzzzzzzzz CC Z E ZBZCCB zczzzczzzz S «U W M M zzzzzzzzzz ΖΖΖ'ΖΞΖΖΖΐΖ zzzzzgzzzz caazga.caa zzczzczzzz zzczzzzzza czzczzczzz š ti* «"cttac zzzgzaagaz zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz zzzczzzczz azaazazzzz azzczzczzz ZZcCZZZZZC zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz cczzzazazc azaazzzzaa SSZZZCZZaZ zzzzzzzzzz CZZZZZZZZZ czzzzzzzcz zzzaaggazz ZZaZZZCZZZ zzazzzcczz zzccbzzz bb czzazzczzz czzzzzzczz ctcczcazca zzzczzzczz ZZZZZZZZZB czzzzzzzzz CSe CZZEcEE ZZZZZZZZZZ zzzzzzzzzz zzzzzzzzzz ZBBBZZZZZB BZBZZZBZBZ zzzzzzzzzz tcaa~a~“a" zczzzcazzz zzzzzzzzzz Z “C“ zzcbzc zzzzzzzzzz ZZZZZZZZZZ aazaa&czaa zzzzzzzzzz zzczbzbzzz ZZZZZBBcBZ ZZZZBZZ ""5 6130 6240 6300 6360 6420 6430 6Ξ40 660 0 6550 6720 57 = 0 6340 6500 6550 7020 7030 714 0 720 0 7260 7320 7330 7440 7Ξ00 7550 7 520 7530 7740 7 = 00 ”350 7=20 7=30 504 0 9100 2150 3220 5290 3340 3400 3450 5520 3 53 0 3514 <210> 5 <Ξ11> 3 = 53 <2 ιξ> osa <2L2> Ľudské a myšie Η 51 <•4 C0> 6

Za.ZqZ3.ZCCZ C3Z3ZCZZZZ agcccggg-g acczgacccz czzzzcczzz qaazaqzzaq 50 3ZZ33CZZZZ ZZZZZZ33ZZ ZZaZZZZBZZ ZZBZZZZZZ3 u£zcgsCw·· qccqzzzazz 120 ΖΖΖΖΖ3ΖΖΖΖ CZáZZZZZZa zz~zzazzaz ?5 - gccg%-c « zzzzzzazza aqzzaaqcza 150 2 -í 0 Z3Z33C33ZZ C33ZZCZZZ3 c:ra;aa::r cazzaazaaz czzzzzazzz 2 00 2=0 4.0 ΖΖ33Ζ3ΖΖ33 r zzazazccca zzzqzqzzaz 3Ζ33ΖΖΖ3ΖC cgcccggczg azzzzczaac zazzqazqzz 4 30 ——~—~zq3cq ~=zg~~cc=a aazaqqqazz zzzzazzqaz g wCsa^ccrc” 34 0 ZZ3ZZ3ZZZ3 CZZZ333CZZ czzazzzzzz azzacazcaa czqzazcaza zcczaaqzaz 500 C3ZZZZ33ZZ azzzzaaazz qzzzzzczzq cazzazczzz aqzacazzaz 550 ZZZ3ZZZZ3Z r~ccc~2c;“ cccsg«azaz zzazzzazza czzazzqzza zZaczazqqz 720 Z3ZCCZZZZZ ZZZZ3ZZ3Z3 zzaazzczzz zzzazaqcqc tľtraczcac 730 CZZ3ZZZ3ZZ zzaazzzz az zzzzzzzzzz caccaasarc aacqzqazzz 340 ZZZ3333ZZZ zzzzzzzzzz zazqcaaazq qzcqzzaqqz qzzzazzczz 900 aZäaZZäZaZ - — - g g ^· - aazzacacaa zzzazzzzzz -ZZZZZZZäZ 250 ZZ&33ZZ33Z 3ZZ3ZZZ3ZZ a~acggagac aazzzzzc zazzazzqaa zzzzzazzzz ' 0 ~ 3ZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZ zzzzzzzzzz zazazazzaz zzzazazazz . «* 3 3ZZZZZZ3CZ zzzazzzzaz zazazaqaqz zzzzzzzzzz zczacqqzza * · J ZaCZZIZZaZ zzazazzzzz azzaacaaaa 5--*«**'*3^ 220 ZZZZZ3ZZ33 3Z5.ZZZZZZZ z-zzzzazzz zzzzzazzzz ŕ·“ ^ azzzzzazzz 115 zzzazzazza azazzzzzza azzzz aaz az « Λ « / 3ZZ3ZZZZZ3 3Z3ZZZZZ3C a:c:::::r: zqqaqqcazz aazczqqaaa - 2 3 ZZ333ZZZ33 CZZZZZ3ZZZ ZZZ3C3Z33Z zzzzzaazzq qzzaazzzaz zzzaazzzza " j j 33ZZZZZ3ZZ hwCTmwwm aaqzazzzaz zzzazzzzaa 13: ZZZZšZäíäi —;=-zzaaaz ZZZZZäZíäZ ^*^3 3 3 ^ azzzzzaaza aaazaazzza 13 5 ;;s d Z Z B. Z Z 33ZC33Z3ZZ CCC33CZZ3Z zaazaaazzz aaaazazzaa cazzzzaaaz 152 3ZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZ Z3Z33ZZ3ZZ zzqqazaaqc azq zzqzzzz zzzzzzzzzz 153 ZZ33Z3ZZCZ ZZZ3ZZZZZ3 aacaacaaa* zzaaqqczaZ aaczzzqzza czzaaazazz • · 1 rsn*; 3i™" —“ czzzzcacza zzzzzczzza 150 äZZZZ3ZZ3Z Z3ZZZZ333Z ZZCC33ZZCZ zzzzqzzzzc zqzzzzzzza azaaczzzza 12 5 ZZZZ3Z3Z3Z 3CZZC&3CZZ zzazaacqcz c ξ c* s * »*»gg czaazzzzza 132 ZZ3C3ZZCZZ 3Z£Z3ZZ3CZ 3C3CC33ZZ3 zazzazzzaz aqzzzzaqca CCwVwCariCw 1 35 czzzaqzaaa ZZS.Z3ZZ3ZZ azaaazazaa azzczaczzz zcczaaczza czzazcazcz 204 ZZZZÍZZZZZ CZZZZZ3Z33 azaqzzzzaa caqqqsaqaq zzzzagaczz aqaaqzqczz 210 ZZ3ZZZZZZZ ZZZ3ZZZZZ3 CuC .«l&WWMM czzzzazzzz zzzz zczzzz azzzzzzzzz A 4 ^ Í.O Z3Z3ZZZC3Z ZZ3ZZZZZ3Z ·£ WWW — ·» zaqczzazcz ztcacctcac czzzzzzzzc 222 zzzzzzzzzz zaazzzzzza czazaazcaa •äastsäšC" qaazzzzzqz 223 a zzzzzzczz ZZZZZZZZZZ czzazzzaaz aazzazzazz :g::c::::a czaazzazzz 224 3Zá3ZCZ3ZZ aaazazzzaz zzazzzzaaq zzazzzaazz azzzazaaaa 240 3ZZZZ3ZZZZ zzzzzzcaaq azazzzzzzz 24 5 ZZZZZZ3Z3Z Zzzzzzzzzz 4š*4C*23Cä zazazzzzzz zzzzzzzzzz 232 accctrztca azszzzzzzz zzaacczzza zazzzzzzaz azzzazazaz 253 33ZZZZZZZ2. caazzaazza aaqzaaazzz zzzaaaazaa qaaazzzzcz 254 ÍZ333Z3Z33 ZZ3ZZZ3ZZZ caacazqaza acacaazaaa accaazzaaa 27 0 Z333Z333Z3 3ZZZZC333Z czzzaazzzz azzazqqzaz zzacaczzaa zcqaazzzza 27 5 s “ ” 3C3ZZZZZ33 azazgzaczz azqqazzzzz czzzzzzaac qzzzzzazzq 2 = 2 tu t n

«η «Ι| II II» (I |ϋ ι| | (I |Ι «II

α Λ1 *Γ— czazz zcgaz gtaacccacr cgtgcarcca actgarctrc ageaterttt acrttcacca 8640 ccg zz * C · C ? ^bCc^Cäcaä SCcL — Cää™CC aaaatgcrgc asaaaaggga araagggcga 8700 cacrg aaarg rrcaatactr atarrrrtrc "terraara azzzazcacg 8 7 60 C · m uC"CZ CäuCd^CCCc ZôCäZuZwZ^ aaz^zazzza caaaraggcg 8320 W · M M M CCCsC dZ ZCCCCCmŠI S5LčC"ZfC3äC czgazzzz 8S5S <210 7 <211> 221 <212> DMA <212> Ľudské a myšie < 4 C ^ 7 crrragggga aagagcracc caazz rgrgr cgacacagrc rccagccacc zzgzzZ .rgv. ou CZ CZ c zzzca gcgccagrca gagrarcagc zazzaczzaz arrggracca acagaaaccr 120 ccccz zzczz czaccczzzz carcrarrac gcazrrracr CZaZZZZZZg carccoagcc 130 B.CCZ z zazzz gcagrgggzr rgggacagac rrcarrrrra cca» cfi^cäc crragarcsr 240 c aac = zzzzz caczzzazza czzzzazcaz ZZZZaZZZZZ zzcczzccac zzzzzzazzg 300 rrrar esa:: zccaaazzaa = 221 Μ Μ <21Ό> 3 <211> 107 12> ΡΡ.Τ -ι> Ľudské a myšie <400 3 rr .-.1= Thr Leu Ser Leu Ser Prr Gly 10 15

Glu 11= V»1 Leu Thr Glr. Ser ? • ς ílu A.rg A.l a Thr Leu Ser Cys A.rr A.la Ser Glr. Ser íle Ser As? Tyr 2 = 30 p Tyr Glr. G1 5 .ys Prr Gly Gin A.la ?r 40 c .e.rr ueu -eu 4 5

Tyr Tyr Ala Ser Kis 50 íle Ser Glv íle Pro A.la A.rg Phe 55 60 .v Ser Glv Thr A.so Phe Thr "0

Leu Thr íle Ser Ser Leu Glu Pro 75 30

Glu A.so Phe A.la Val T· r Tyr Cys Gin His Gly His Ser Phe Prr 50 55 y Gly Gly Th 100 r Lys Val Glu íle Lys 105 <210 3 t r6t> 13

<211> 366 <212> DNA <2i3> Ľudské a myšie

Gly Asr. Gly Asr. T; :go A_a T vr •r Asp Leu 105 ’r.e i.ys Ty: 110 < 4 j G > 9 caggrgcagc rggrgcaacc rgggrrrgag zzzzzzzzzz agcgaaggrr 60 rcrrgcaagg crrcrggara cgccrrcarr £CC£Cw3^Cä tgcagrgggt gcgacaggcc 120 CCZCCaCäs? CšZCCZc«CC arcaararrc cC£CC^CCmt CCC22šC*£l 130 grcgaccacr rcaaagcacg grrrgrcrrc rccrrggaca ccrcrgtcag caccgcarac 240 crgcacarra gcagccraaa ggcrgaggac acrgccgrgr arraczgrgc gagarcrggc 300 aarggcaacr ä-CäCCuCCC ätsCIttäcC rarrggggcc agggaarcct cgccaccgrc 350 3oo <21C> 10 <211> 122 <212> r."T <213> Lidské a myší <400 10 Glr. Val Gin Leu Val Glr. Sar Gly Sar Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 " 5 10 * ·· Ser Val Lys S £ Γ C\"S -V5 £ Ser Gly Tyr ^ "a Ska m *·*»» m 20 25 30 Gly ŕíer Glr. Trp Val Arg Glr. Ala Prr Gly Glr. Gly Leu Glu Trp Mer 35 40 45 Glv Trc Íle Asr. Thr His Sar Gly Val ?ro Lys Tyr Val Glu Asp ?he 50 50 -ys Gly Arz Pr.a Val ?ha Sar Lau .-.53 Tí'.r Ssr Val Sar Thr Ala Tvr C 70 75 30 Ser Ser Leu Lys .-.la Glu Asp Thr .Ala Val Tyr Tyr Cys 35 90 95

Ala A-~ 5a- ly Glr. Gly Thr

Leu Val Thr Val Ser Se: 120

< 210 > ϋ <211> 321 <212> DNA Ľudské a myšie

M

Cf <400 11 M u m « ^ _ 60 C"C«CCbCC3 ccgccaccca qaqzazzaqz CBZZBZZZBZ cCCusCCc azaqaaaczz 120 cgccaggctc cza.qgcz.zzz CZB.ZZZZs.ZZ czazczzzqq ca zzzzaqcz 130 bzzzzzbzzz qzaczqqqzz zqqqazaqaz ZZZBZZZZCB CZBZZBCZBC czzazaqzzz 240 caqzzzazza zzczcazcaz cgcracrcrr azzzzzqqaz zzzzqqaqqq 300 gcraccsscrg zgqaaazzaa a 321

<210> 12 <21i> 107 <212> ?RT <213> Ľudské a myšie <400 12

Glu "La Val Leu fnu w Glr. 5a- <r » w ^ e •**U «. Leu 5er L· a u Ser 0 Ír 01 A _ v 3 i n L <j 1 " Glu Ar- ^ i · mu «. " — 1 ' r..- ^ a· Ser 5a- la Ser . vr 20 -) 5 im * 30 His m Ty r ŕ" ^ n * rn VJ_.. —y s c-y c' ·· Ala Prs Arr len Leu Zla Ξ5 40 45 7 y r M vr Alä Ser His Sar Zla Sľs * Λ· ,, <c_ v “ * Ä r—« n * · Arg ?h.e Sar Glv 50 55 60 M a M Gly Ser Gly 7-r ΛΑ» Pr*.a T'r.= m U Zle Ser Sar " a·· Glu Pro 55 • U 75 5 Z Ví _ As? ?he Aia Val M , a 4 — n, , • <a Cys Glr. His Gly His Sar m. . v Pro ľrp 35 Z Λ w 95 Thr ?hs y Gly Gly ľr.r lys Val m * .. " * O Lys 100 • n 5 * v —

<210 13 <211> 355 <212> DMA <213> ĽUCjské a myšie <4 30> 13 cagarrcagr zqqzqzaazc zzzazzzzaq czqaaqaaqz czqqaqaqaz aqzcaqqazz 50 zzczqcaaqq czzzzqqqza rrrurzcaza azzaczzcaa zzzazzzqqz czaazacazq 120 czaqqaaaqq czzzqaaczq zazzzqzzqq azaaacazzz aczczqqaqz czzaaaazaz 130 qzacaazazz zcaaqzzazz czzzzzzzzz zzzzzzzaaa czzzzczzaa cazzzzazaz 240 zzazazazaa qcaacczzaa aaazqaqcac azqczzacqz azzzczqzqz qaqazzcqqq 300

GT ίΓ aaúggtaact atgacctggc ctaccctgct tcrgca

<2L0> 14 <211> 324 <212> DMA <2-J> Ľudské a myšie “actggggcc aagggacact ggtcactgrc 360 366 <400> 14 gacactg"c cgacccagtc “ccagccacs czzzczzzza gggccagcca gagra~ragc catgagtccc caaggcctcg caccaaaw3~ aggrtcagúg gcagcggatc agqqzcagaz gaacazgzzq gaazt"aýta C y^ HC33Ca ί ggcaccaagc rggaaatcaa acgr cigcctgrga gacrac~rac gccrccca" u áCECuCiaCä ccrcacagc“

ctccaggaca ac~ggcag=a ccareiczgg gtaccaacag y »CCwLuCäC racagtic'ct 60 acaaaaatca 120 gaccscc^c'c 130 tgtggaacc“ 240 gtccgg-gga 300 324

Claims (30)

1. PATENTOVÉ NÁROKY 1. Premenlivá oblasť ľahkého reťazca, ktorá zahrňuje celú sekvenciu aminokyselín alebo jej biologicky aktívnu časť, ako je ukázaná vSEQ ID NO:1 (obrázok 4a).
2. 2. Premenlivá oblasť ťažkého reťazca, ktorá zahrňuje celú sekvenciu aminokyselín alebo jej biologicky aktívnu časť, ako je ukázaná v SEQ ID NO:2 (obrázok 4b).
3. 3. Chimérna protilátka, ktorá viaže ľudský CD40 a zahrňuje ľahký reťazec a ťažký reťazec, kde spomenutý ľahký reťazec zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca podľa nároku 1.
4. 4. Chimérna protilátka, ktorá viaže ľudský CD40 a zahrňuje ľahký reťazec a ťažký reťazec, kde spomenutý ťažký reťazec zahrňuje premenlivú oblasť ťažkého i reťazca podľa nároku 2.
5. 5. Chimérna protilátka podľa nároku 3, kde spomenutý ťažký reťazec zahrňuje premenlivú oblasť ťažkého reťazca podľa nároku 2.
6. 6. Chimérna protilátka, ktorá viaže ľudský CD40 a zahrňuje ľahký reťazec a ťažký reťazec, vyššie spomenutý ľahký reťazec zahrňuje celú sekvenciu aminokyselín alebo jej biologicky aktívnu časť, ako je ukázaná v SEQ ID NO:4 a vyššie spomenutý ťažký reťazec zahrňuje celú sekvenciu aminokyselín alebo jej biologicky aktívnu časť, ako je ukázaná v SEQ ID NO:3.
7. 7. Molekula nukleovej kyseliny, ktorá zahrňuje sekvenciu nukleotidov kódujúca premenlivú oblasť ľahkého reťazca podľa nároku 1.
8. 8. Molekula nukleovej kyseliny, ktorá zahrňuje sekvenciu nukleotidov kódujúca premenlivú oblasť ťažkého reťazca podľa nároku 2.
9. 9. Vektor expresie, ktorý zahrňuje sekvenciu nukleových kyselín podľa nároku 7.
10. 10. Vektor expresie, ktorý zahrňuje sekvenciu nukleových kyselín podľa nároku 8.
11. 11. Humanizovaná protilátka, ktorá zahrňuje časť premenlivej oblasti ľahkého reťazca podľa nároku 1.
12. 12. Humanizovaná protilátka, ktorá zahrňuje časť premenlivej oblasti ťažkého reťazca podľa nároku 2.
13. 13. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje chimérnu protilátku podľa nároku 5.
14. 14. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje chimérnu protilátku podľa nároku 6.
15. 15. Chimérna protilátka, ktorá viaže ľudský CD40 a zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca a premenlivú oblasť ťažkého reťazca, v ktorej vyššie spomenutá premenlivá oblasť ľahkého reťazca zahrňuje sekvenciu aminokyselín, ktorá má najmenej 90 % zhodnosť sekvencie s premenlivou oblasťou ľahkého reťazca podľa nároku 1.
16. 16. Chimérna protilátka, ktorá viaže ľudský CD40 a zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca a premenlivú oblasť ťažkého reťazca, v ktorej vyššie spomenutá premenlivá oblasť ťažkého reťazca zahrňuje sekvenciu aminokyselín, ktorá má najmenej 90 % zhodnosť sekvencie s premenlivou oblasťou ťažkého reťazca podľa nároku 2.
17. 17. Spôsob liečenia pacienta trpiaceho poruchou sprostredkovanou T-bunkami, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podávanie terapeuticky účinnej dávky farmaceutického prípravku podľa nároku 14 spomínanému pacientovi.
18. 18. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 7, ktorá zahrňuje sekvenciu nukleotidov, ako je ukázaná v SEQ ID NO:6.
19. 19. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 8, ktorá zahrňuje sekvenciu nukleotidov, ako je ukázaná v SEQ ID NO:5.
20. 20. Chimérna protilátka podľa nároku 6, ktorá zahrňuje sekvenciu aminokyselín ľahkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO:4 a sekvenciu aminokyselín ťažkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO:3.
21. 21. Humanizovaná protilátka podľa nároku 11, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO:8.
22. 22. Humanizovaná protilátka podľa nároku 11, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ťažkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ 10 NO:10.
23. 23. Humanizovaná protilátka podľa nároku 12, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO:8.
24. 24. Humanizovaná protilátka podľa nároku 12, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ťažkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO: 10.
25. 25. Humanizovaná protilátka podľa nároku 11, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO:8 a premenlivú oblasť ťažkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO: 10.
26. 26. Humanizovaná protilátka podľa nároku 11, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO: 12.
27. 27. Humanizovaná protilátka podľa nároku 26, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ťažkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID N0:10.
28. 28. Humanizovaná protilátka podľa nároku 11, ktorá zahrňuje premenlivú oblasť ľahkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO: 12 a premenlivú oblasť ťažkého reťazca, ako je ukázaná v SEQ ID NO: 10.
29. 29. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje humanizovanú protilátku podľa nároku 25.
30. 30. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje humanizovanú protilátku podľa nároku 28.

    0 CO o O CM m cr T _J CO E3 O 0 CM o O T“ □ Ľ □ CO v ΕΖΞ3 O- CM X O N >re b Ω O ο o o tO o P) s ** -J 04’ 04 .3 Λ JO -3 < < < < £ E < < < < c £ η c:í 1 í í (Q n jé o N •to k O i H 04 ja< cf Q n O N •OJ k .a O

    0} u tí u a tí c* h £h Z Z P4 *** a x frv* M Q O ca M 0-* H ot 03 u σ x 03 H • fS H • K U u > 03 Ω tí W 03 tí cn > H o tí > 2 a 03 a Z O tí H o H 03 LU r- > tí 03 6 03 &C '—’ z tí tí CO u p» Eh Q N u < 03 σ CM U ·*-* 0) LU 03 03 Ι 03 O U Ο '—' Eh 03 to o tí U *0) .g N > 03 >N .*5 4-1 Q) H Q tí tí .CO 4-> 1_ Ľ) 03 to 0 £ H t-· tí H CO -Q *0) Jg Q a O £ CM 03 ‘CO .CO J H r" 03 c a> M tí M «*4 p n J 03 w 0) n tí < U. O J X CL ‘CO b tí c c tí H tí d) tí tí E O tí H v < « W Im Q. Cu tí ^ < 03 tí a H EH < E tí σ cq x. o N •C8k. Si O H £3< H > Z

    Chi220 h220v3 Koncentrácia protilátky (ng/ml) Obrázok 5a Percento inhibicie

    2.220 Chi220 h220v3 Obrázok 5b kontrola (ΡΓ3

    Obrázok 6b JSi!l JSitt Titer Titer

    Obrázok 7a

    dni štúdie Obrázok 7b kontrola (?3S) 10 mg/kg Chi220 40 mg/kg Chi220 100 mg/kg Chi220 ä 200-

    -28-14 1 15 29 43 57 71 85 156 170 dni štúdie Obrázok 8a Titer 40000-j 35000- — kontrola (P3S ) 30000- 10 mg/kg Chi220 25000- 40 mg/kg Chi220 20000- 100 mg/kg Chi220 15000- 10000- 5000- Oi i M M 1-¾ B -28 -14 1 dni štúdie

    15 29 43 57 71 85 156 170 Obrázok 8b kontrola (P3S) 10 mg/kg Chi220 Titer Titer

    Obrázok 9a 10 mg/kg Chi220 •40 mg/kg Chi220 100 mg/kg Chi220

    149 156 163 170 177 dni štúdie 70000 t —·—kontrola (PBS) 60000j 50000r 40000 j 30000-20000-10000-0* Obrázok 9b 450 τ 400--350-

    Obrázok 10a 7E1-G1 (1mg) 7E1-G1 (0,25mg) 7E1-G1 C0,1mg) 450 τ 400 ŕ 35θ{ 300 { ί α 2501 P 200 j 150 i 100- 50 i 7E1-G2b (1mg) 7E1-G2b (0,25mg) 7E1-G2b (0,1 mg) 0^ 7 -* 14 dni -a 21

    7 14 21 MR1 (0,25mg) MR1 (0,1 mg) 6E9 PBS dni Obrázok 10c k\\\\\\W\\\\\\\\\x I—ľ.···· .y···:·-·· 1—L i-kWWWWV a···:·· ·.·.·: ^\\\\\\\\\\\\\\\\\V PBS CONTROL MR1 100ug 7E1-G2b 6.25ug cien 0 16. den Ľdi 20. den 7E1-G2b 12.5ug Obrázok 11 i- 7E1-G2b 2Sug I- |S I 7E1-G2b 50ug 7E1-G2b 100ug O Tf CM t- v ·. K O v O CO "C ď ď CM O O" vioNvaaosav y reťa«0 Chĺ 220 m,esta linearizácie

    Obrázok 12b Ťažký y reťazec chi 220

    Ľahk\ Obrázok 12a 1 m m* mmm* mmr·^ uaUjuaA WWW m * ŕ* « mmmm mm waw/*4 L· *? W4 * mmmm* mm^m AUg4 WAWW 4w « m m mm mm mmm AWWWWWWWWwW m #*mmmm * * m * ww* 4w^aa^a m mm* m * mm* * UuimaUáoIaA UUViiVľ4~-L_4 4 AA X 4 4 4 Λ 4 4 -Li'Ä,i'4"ilJľAiur 444 gAgA4ww aVjí 1 4 wwww w * m » X m «L » m/«mmi mm aíLUUU4Aaw mmmm* mmmmm W 4 wwrww 4 W4 W AGTACAATCT m / m /-»m * mm m W W 4 w 4 «JAJ. WW CGCATÄGTTA » mmm* mm*mm Agww\glAlU 131 /nm mmmmmmrn m 4 «JW 4 WW W4 WW e* *>im»**mmmmmm 44W4W4W44W m* mmmmmmmm gAgg4www4 w * mm* aViiaVi 4 wwww m * mm* * * * '1 *m UAgUAAAA 4 4 m* * mmm*m* S .AAgWAAUWi m* * mmm* * mm www\www*w\ww mm wwn^^ mm % luU*«UUWUA » mmm % M • « 4 W m* mm^mmmrn* ^j*U»WWWW4 wwl AVJ/VA i rnmmm % m * mm m w 4 auaua! * W Φ1 mmmmt»i mm aaIjsjvi 4. 4 WWWW 241 301 361 421 4S1 541 601 661 721 7S1 841 901 961 1021 1051 1141 1201 1251 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 1101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 m tfUUWtoJWw* TCCCATAGTA aactgcccac CAATGACGGT m» mmmmmm* m 1AÍ4 4\JWWW1W GTACATCAAT TGACGTCAAT CAACTCCGCC CAGAGCTCTC G mmm* m*m* m ϋ»«Α*Α*Λΐ CCÄACGACCC GGACTTTCCA ATCAAGTGTA mmmm mm mmm* ^k.«yJUWVl *A TATTAGTCAT * m mmmmmmm * AUUUW * 1 4 UA mmmmmm* mm* * * lUuw\Uun m m *mmmmmmm AAA*UWVJV»>JU GAGAACCCAC ATTATTGACT m m i m^wpm m m m \JUAU 4 ^ U>LJW mmmmmm* f i m m UW*J^w^i — w TTGACGTCAA TCATATGCCA TGCCCAGTAC CGCTATTACC mmm^ mmmmm% U*waUwvjv\ja AAATCAACGG m* mmmmmmme^ • AWWWW * W .Λ mmmmm* mm^m«· 4 WW* ·Λ^Ρ. · <JV,J mmm % rmrm » m * ww aU * saw rv w mmm»^mm^^m * m* m^^ m m ·ΛΛΐΛν·υηί mm mm »LAU.A*AUVJ mmm m m m mm a u\jw>uwvuC mmmmmmrn m mm^ *aUwa mm mmrnrnm* m* UaU* w*· wjvj.— mmmm»m* * mm L· * UVAUAA a w « m » » m / ww . w.nww ^ w.-. mmm^C* ------------------- mm*mm* *mmm* wTwwn--. 1 ww.n -.g.-.gflwrtg * «-mmm^^mmm»* \s . www i wwrun -.1? --“ . V- . -- . m* m* mmmm» m ÍírtOft 1 www.nw m* * * mm/-w«4m ViAAnggg - - _ m * * mmmm * mm GGCTGG.iT?_l Ä.CACCCACTC TGGAGTGCCA l_l * TT GT - G * ^^ζ* ^mn*r·* * m^m* mmm Q4mr«iT<^«mgm»w mmm* * * mmmm ^ jg/Ά.·, w w - w TGCC.AACA CT n»mm^ ^ nGŕ^-A.GCA_- CCTC.- Ä AAAT m * m m * m * mm m W Λ W W Λ W m. W w w mm* mmm» wim m^mmmmm* m* W . w 1 W 4 w.-.W.—. mmmmmm» * mm - v— W W W J-W*. - w mm» » mm* mm* m mm m 4 m/ <*m * m W íMU 4 Λ - W.“. W— 4 WWWW . Λ W • mmm« mm mmmm mm» * mm m* m* mmmmmm * m^mmmwmm m* m mm * m ^ mmm—m* m» UtfWW^WAUU mmmm m i t /«mm U. «j a WAAU «. W m ^ m m » / m/w'i t UÄWUAWaU·α m mm ŕ»mm»*mmm « »mJM4W*»U«. * m^^ mm^mrnim / «mm * mm mmm^* w 4gAtou* w a /«m* m* rnmmmM» W *Aw\b 4 V*44 CAAGGGCCCA m mm/|«-T*m mmm wwWw%»4»wwww * m m mm mmm**im AWWWWC-w W4 W W1UV· AWl'jUUAUUU UV..A4UWIWU CTCTGCCCGC GCAGGCACAG TCAGACCTGC GGClrAACTC CCAATCTTCT CAGGTAAGCC CCTGCATCCA GCACCTGAAC CTCATGATCT CCTGAGGTCA wu ^(njviAuu CCCATCGAGA GGACAGAGGC CCCTACAGGG GACCAAGAAC CGTGGAGTGG UVMIÍ. « LLunL GCAGG33AAC GAAGAGCCTC GGGCTCTCGC AGTAATCAAT TTACGGTÄAA TGÄCGTATGT ATTTACGGTA. CTATTGÄCST GGGACTTTCC GGTTTTGGCA TCCACCCCÄT AATGTCGTAA TCTATÄTAAG CTC.TTC.rTGG mm mmmmmmm * * a UÄ * mm%rnmmmmm AtLAgvgwv»g * m mmmm m^*m * AWWU * SJVJ * VSA CACAAGCCCA * m m mmmmmmm AVAJUlg4W*U CCCAGTCCAG CCCACTCATG GCTAGGTGCC m * * m *mmm* m UÄAWAWWi* «rimm ^ rnmm^mm* 4 WWÍU4 WWW 4 mmmmmm* m * m U.»U*VIWtUAtf ÄGCCCAGGCC G mm* m* mmmm guAwiguvw. mmmmm^mmmrn * Uw * «JVJWSJVJM CCCGGACCCC AGTTCAACTG AGCAGTACAA ^m * *mmmm* * a UAAlggUAA aaaccatctc Cmm mmmmm mm CAGCCCCGAG CAGGTCAGCC GAGAGCAATG GGCTCCTTCT GTCTTCTCAT TCCCTGTCTC Cmmmmmm» mm AGGACTACTT mmm* m» mmmmmmmm^m W mm* * m* rnm* » WWWVWAUWAA mmvmm* * mmm* U*gUAAuuw\ Gmm* mm» * mm wt-ÄWWAAWW m^m*mmm* m * U· 4 LauvjuaVja Cmwt * mmm* m w 4AAWwWAW * mmmmmm * m m AÍw««cggAgg m*mm^mmm* m LÄux» 4 wggAL C mm* * * mm*r*T* «#W\AA* w* * Pnmm mmmrnmm* 1 wwwww* L. w\ Cm* mmmmmmrn wiUv/*gug X ACCGTCAGTC mm* mmmm* m* 4 WAWW * W%£A G «m* mmmmm* m iaUvj 4 V*waU CAGCACGTAC GGAGTACAAG CACCCTCTGC AACCACAGGT mm* mmmmmmm» X vlAU*édUw* mm m * mmmmm * UVW\VjWwOUA TCCTCTACAG GCTCCGTGAT AGATATACGv. TTAGTTCATA GGCTGACC3C ACGCCAATAG mrwmmm* mm* m 4 4 U\JWÍU 4 AU m m mmmmmmmm aaa*ujwwL«j TACATCTACG rnmmmrnmmm* m VÚVJVrU 4 UUAÍ mmmm mm/mmmrn wwwnw 4 * * u j. C mm mmm * mm^ taAdi · «2AWWW mm m mm m % / * * 4VIWéAAU*A mm m * mmm* % m UAUAUwmAAU k m m* i 'AM1 CTCCTCCAAG C mmmm* » m mm «•«•MgAAW^g mmmmm mmmm^» ww«_www C* mm* mmm«mm AWWAWW4 » O mmmmm» m* * m UW 4 WWAWAAW mmmmm* m mm m WWW * wAWWWW m* m mmmmm/····! UAgwuwwtoO x m m mimrn»**·» mm/« WWW A W* * w«». W Grnrnm^m m* m* \»vw*gw\UA * mmm»wm mmmm AUk.«»gwg*L ACCTTCTCTC GTGACAAAAC Gmmim* * mmmm WiWAAUWWg GCTGACACGT a»wwaw*w ww mm mmmm m*«m m Igwoiljgiljg mmmrnmm^* mÄ WWWW X WWAWW Cm^mmm m^ m * W X W A WW 4. WÄ TGCAAGGTCT GmM»rnmm* mmm W 4. WWWAW ww C mmm * m * m«^m w *. WAWAW 4. W G m* m% mmmmm l.nUAWL* * w G mmm* I * mmm W 4i LAAaunj w GÄACAACTÄC m* * mmmm*mm UÄAUV* «. waWw G m* mm * mm mm» w\luAggs»4 * 4*mmm * mmm /VW 4 WWWAWWW mmm* mmm* m* UgwiL«.wvgA * * * m m m>rn AAAW 4. 4 W W 4 W •CCľGCCTGG CTGCCTCTTC GcrrrľTccc m* * * mmmm m* Laaa\juvjvj wa mm * Amii * mm 4 WAV-»W 4AAW W mm»mmm* m* mm W4 WWUÁVJA* 1 TCÄCÄCATGC GGACAGGTGC CCACCTCCAT CCCCaAAaCC mmm* mmmm* m 4WWAUg4WAW mmm* HH* * mmm 4 gUAlAAéww GCGTCCTGAC CCAACAAAGC mi m/» m m mmm mm W 4 WWWW 4 WWW ACCGCTGTAC CCCCCATCCC 44W4A4WWWA AAGACCACGC GTGGACAAGÄ CTGCACAACC mm»~mm* * mmm UUggwiAUwL CCTÄCATCTG » /% mm mi auAvnw % mm m*mmmmm aLuua* W«_wW ACCCGGAGGC m* mm m Lauuu* vj>j G mmm * M Mm m m m giU\»*uvj\jw CCACCCCAAA CCAGTAACTC mm* mmmmmmm A. m mm* m * mm* m UU*AUAU4AVJ CTCTTCCTCA CAAGGACACC Cm * mm * * m * m mAUWAAWAW m* * m* m* * * m waäwawääaw CGTCCTGCAC CCTCCCAGCC * mmmmm*m* m AUUOs«LALA4 CAACCTCTGT G mm * mm · m mm ww*vl gAJ w * G mm * m* mmm m WWWWWAA, WJW mmrnmmmmm,,,w U· a W*»«_W 4i w w 4 mm* mmmtrnmm* WWVUV9 4 kJVJW\ ACTACACGCA mmmmmmtmmmm UgwjgAUut-k. Cm mmmmmmm m «j * « * X wWw w AGTTATTAAT GTTACATAAC ACGTCAATAA TGGGTGGACT AGTACGCCCC ATGACCTTÄT ATGGTGÄTGC TTTCCÄAGTC GACTTTCCAA mm mmmm m * mm WWW A, CTTATCGAAA m m» * mmmm m * - v-T jvj.n mmmmm*«*m* mm U 4 W<w»Wm WAWW CAACGTGAAT Obrázok 13a 3OSI GGTCGCÄCGA 3121 AAATAAÄGCA V 21 ^ms mmmmm* m 3241 CACTGGCCCA 3301 GCCCTCGGCA 33SI GCTGGGCCÄC 3421 GGAGACTGTC 3481 ATGCCTÄGTC 3541 ACCCCTGGCľ 3601 TGCACrCTCG 3661 CCCGTTCAAC 3721 CACGCCTCAC 3781 TCCTCGCACA 3341 AGGCCCACGA 3901 TCCTCTCACÄ 3961 ACGTCCCTGG 4021 GACTGTGCCT 4081 CCTGGAAGGT 4141 TCľGÄGTAGG 4201 TTGGGAAGAC 4261 AAGAACGAGC 4321 GGCGGGTGTG 4381 TCCTTTCGCT 4441 AAAAAGCÄTG 4501 GCCCCTÄACT 4561 TTATGCÄGAG 4621 TTTTGGÄGGC 4 631 AACTTGACGG 4741 TCGACCATTG 4801 CCTACCCTGG 4361 TTCAGTGGAA 4921 TGAGAAGAÄT 4981 ACCACCACGA 5041 ACAACCGGAA 5101 CCAGGAAGCC 5161 ATTTGAAAGT 5221 ATACCCAGGC 5231 CľACGAGAAG 53 41 ATGCATTTTT 5401 TACTTCTG7G 54 61 AATATAAAAT 5521 TAGATTCCAA 5531 AACCTGTTTT 5641 CATTCTACTC 5701 TTGCTAAGTT 5761 TACACCACAA 5821 ACCTľTATAA 5331 AGGCATAGAG 5941 ATTTGTAAAG 6001 CAGCCATACC 6061 GAACCľGAAA C« rkwo x *********** Uwta » w **mn**0* m « mm AJ * JUWIaU <m**AAA< mmm V» » * ta *0 «AU * O 1 ^ AAl mA^<·«Λ AU V* «Α * « * «J * t WMA<WAA^»m<A ta * S? * WWé * e s· < my AAtA »»»»» * * ««uuuuuvr aa: «. sj *o^w*usj ΑΛΑ «. » * ^7WU%JW<J 1 ΛΑ» Λ Λ A OAÍTI AJUAUV» S· w s· » 4 A^ A' aΑΑ^Λ AWk UAU W w S- CCTGCCCTGG TGCCTCTGTA immmmm V» · sj S m mm mmmmmm AUUUUS«w*U »mmmmm « m ^ tata * tataSpO^\ta CTCCÄTGCCC i Awtimmmmrnmm • mmmms UUU.A AAA1 A« ****** m IjuuaUiuuuu CľCCCTCACC m^ mm*mi mmmm SpU%* Sp *AL*«i* CACGGCACTA • mmmm s vjSpwLA Ammmmm m s mm UUW » wOWsUta CGCATGGGGA **S ms s mmrns 0* wvCaassuas TCCGGGGACA *«Α^Α A • *u .uu s aaaimmm m—i ajuuaS * OSJ GCAGATGCCC s m s m s m S m s m aLaLäwaw^s TCAGCCCAGA im/sm m i ’tataOSXA / MVim s mmmm m V» * UAUU * » OSJ CCGGCCACAC GGCGÄCCACÄ CACACACGTG CCTCGGACAC s m mmmmmaa% AJW* »V«* Wta4“S mmm* • J GCACCGÄGAC ms m«mmmsmm UAUWwWWÍUu mmmmms ms ms * UU* W\UAW\ smmrnm%mms m auuuua.Uaw mmmms aai mm W« UWAUUAUU mAAAAAA—Am *Wtata»«U4UW A i AAi ^ « mm»« UAUU.VUl* » O ΑΛΙ «ΛΑΑΑ 1^* O W\UUU X UA^ Cmm»mm/«tanmmm *W*W<UW S AAtA^ AAl S A no » wAuuaaL CAA»AA« (IWIA * w »ΑφφΑΛ»»Α<Α V»ta» «.OSTWWmta GCAAAAAGCT A*"ai i αλ»«mm O » UŕLAUUU » O TtaGCCG 4» G X C A· m s s mm s /—mm UUAAÍUAU»* s Φα*ααα^α s m ΛAW.UU4UAÍ s m-·* m* *** i m AUUAUAUAA «. Φ/HMWWpAA/ll 1 » * V» * •uuwvrl % S /«ms / s a*s m λλο * auaLa x CAGGCCACCT TCCCAGÄAAT AGGTCCAGGA AGGÄAGÄTGC GGGACTTTTG ATTGGACAAA ATAATGTGTT TGATGAATGG :catct GAAGAGAAAG TÄATAACTAT G ms UAAIAaaaU % ΑΛ>ι·ητ**η< a*'' Aíai í » » *aí » ATGCÄATTGT m S AA 1 AI AAl W^UUé'XSAUSA s mmmmm « i auumuuaI mmni m/—mmmm *V*.“.aUUSa » /««a s m m —« L^UAUUWi ΦΑΦΐmmmmmm mO *AUUUUSU mi m«i i m i w%« *aAu< ^Sta'VUUUÚsÍX »ÁÍ9WOWta' mmmmmmmmms UUUS· «· - W » WU\ AAAAA11 S.V*tata *UV 11111 AA—1 1 A.VlAAUVňjAA mmmmms mmmm ÍUU««A*WWp Cl A1 1 /»>!« Al»1 4AU » s mmm ^mm mm s AU\JUW«UW<JA i mmmmmm a*/· A* wtatawow»o 0*0*0** *PIAAA1 UUUA<, * UUSA ai i i ai s mm s LAAr.WAA » O A »mm a«« • *OVJ* «1 A 1 A ,AU.*VU ms mm m/«mua« ^ O A «USw* » .%A mmmmmi »<"ai U * «JUAUUWl G ^ GACAAGGA AAATATAAAC TTCTCCCaGA ir*' ' n^wfff·· n « mm twÄÄä.A.A JAJ*, « a^ÄÄÄVJX TCTGCTCCCC TCCTAAÄGCT ATCTCTľTGT GAAGGAACCT AGÄTTTAAAG CľCľAAGGTA TTCTAATTGT TTGj.GTATTT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AGGCTACTGG TGACTCTCAA CCAAGGACľT TCCTTCAGAA CTCTTGCTTG CTTTGCTATT TTATGGAAAA ATAľTCTGTA TGTTTTľTCT TACTCCACAC TGTGTACCTľ TAGCTTTTTA mmmmms Aim% m srnsmmmm^sm v-U» * jaS*.i(j A-ibrv- WSU.AA1 « ^ m/tan0*0*0* i /» s mrnmmmmmmm AASpta* tatataar^L· Alwé WwWtaW* TTGrľTAľTG CAGCTTATAA m m 0 1* »ii « m m UUA _ OO ******* * m mm LUimIUWJU a. VJ mmmm % 0* SJVJS· x O m m 0**m** 0* 0* 0* ** % * sjvjvuosjrv ^ ******0*00% m/Vim ^/*1 Sp»Oa * C S GGCCC A A ΑΛΑίΙ ACACGGAGCC mm*^m » > a' mm * uaaLaL* GCCICTCGGC 1 mrnmmmmrnmm auv;u · sjv. w ww 0*0*0*0ΨΚ** 0* 0*0*0* % w · OOS.'taw'S mAAi « W *ΛΟ * » vjS- W Gmms AWAA^1 W WS %M*V WttAmi »0 4. W\* A W »Λ * S H* m A^l ** 0* 0* AAaAwWAUWW Aqrnmmmmmmms éJuguw«w.A A^A 1 ŕ*0" 0* w*osi*«aLow ms φα*^αι i mm WVi i· - «ρΛΛ* - AAA ΛΑΛ 1 /«mm » GCwGaGvjCCG CTAGGCTTTT CAATCCTAGC % S 0*0/*** 0** /*^0%** AA^*UW\*UU Οαμααλ«—^ms «««w wO W · Wt Ga« s s ! m i m * O * ΛΛ.ΛLAbA mm l mmmmmm s WOJtUw» «-ΓΛ GGAGCTCATT m/v'^mm^ « mm^ 1 * JVJW1AU x. A ATGÄATCAAC GACACGTTTT AAÄGACTAAC ATAAGACCAT GTGTGACATA TTTTAAGTGT CCTATGGÄAC GCTCAGAAGA CTCCAAAAAA TTTTGAGTCA AGGAAAAAGC GTAGGCATAA GGGTTAArAA ACATTTGTÄG CATAAAATGA CTG TACATAC CTGCGAGACT AGGGAGG GAG GCCGCCTAGG m m m m nŕvnAPA atfyjuww*wWw GAACTGGACA AGGCCCCCAC CATG CTGACC S 0* * Al A1 A1 A aw\LäUaw\U C0*0»0*0*f imAA «uwwW* » wU r—t/ ·«!«»« pA aaaa »»OWw^W AAl s A»1 111 m ta* ·Ί.% * ΑΑΛΛ * mA Λ m IKIMA ΑΛΑ •uuuu·oWWW (ll/»AA/MI»AAA A •UVUU*UVUU CAlAAAAAAA CA « «Μ1 A1 /mr· UW*AW\W4 « as /«/ai*wnAAmm Lawu * *U«JUs« CÄTAGTCCCG rflAAA AAAA1 m « tataOWWUw\* AA ** »— mm A ΑφΑ «uauu^aXIL ΦΑΑ1A1ΑΑφΑ «^UAWV\JW*w G««l AAl lintw^m * * * CCAAAATATG CÄÄGTACrTC TATGGGTAGG TAATÄTÄGTľ s s s m nno » » * uuai GGTTTGGATA TAGACrCTTT TGATTTGGGG GGAAAAAGGC TTľCAAGTTC CTGGCTTTAG CTACCľACAG ÄAACTACTGA 4ΛΙ AAAm UÄUUÄU i. OSJ X s mm m i ŕ^A s mm ΛΟ 4. UA4 JAi O GTAGAAGACG AGTAATAGAA TACAAGAAAA CATAACATAC GCTCAAAAAT ATGTATAGTG TGCTTTAAAA mmmmmmm i i m -o» -.ox 4.AAU GTGATGGT^TC AU^UOO«Wtaw ****** »M|IH I UVJSJW4 < * /m ľ·* S m « C mm t ** ** * *m** 0* vW\UW\lUVI ACTSTCCCCA Ga^<1 AAA A AAI N«W\J\rVMW4 CAGAGGAAGG —AAAi m mm m s Luuw\LW»wi S S AAA% m AAA /VXWta taAta Ws· w « ms Ami /»#—mm AWtWWlCuéw m s mm% m mmmm JA * WIOWW · w Sp* »tata« * V a s aaa m s nr<mm w\* w\· »o mms ,VlUA A1 A«1 mm P«miTl (jAUUA<U«JV> » * rnmmmm mmmm^ • 4. «wv.uwtaA aa«AAimmmm WtaA* ·Λ·Μ4 1 m« « 0*0*0** *** auaaL«juaua CCACAACCľC αλααλιmmmm » S»wWÍ44W« AACľGAAAGA GACTľATľGA Gmmmmmmmrn% x «i* » o x * · A T CATG CAGGA Obrázok 13b * t 6121 6131 6241 6301 63 61 6421 6431 6541 6601 6661 6721 6731 6341 6301 6361 7021 7031 7141 7201 726i 7321 7331 7441 7501 7561 7621 7631 7741 7301 7361 7921 7981 8041 3101 8151 3221 3231 3341 3401 3461 3521 8581 xxxxmmxxmx » r.v.w w*a * A G m X mm ' M« % ^ WW * W\ WUU1 AAW* < ŕ** * X m JW *. m**\W*.AA T'rCTAGiTGT GATCCTCCAG mm X mmmmmm x * W\lUW«vjvJA mmmm' mx x x m « · « waUv.iI ŕr^ ^ /*MWt % φ GT'TCT'Z'CGw C CATGCCTGGA CACCCCAACľ TGTTTATTGC i mmmx m' ' A' >W* m A*AA1 mmmmx mx x x m WW * « Λ WAA £ X 4 x m m ^ * m x m AAAO WV. · «XU m'mm xmx x x m Lä * Uawvoa * mrpmx m' ' ' mx - * waWlaa * A AAGCATTTTT 1 CJv C^*1 G wJxm mmm'mmmmmm m W * gAVJ * * W * W mrnm^xmmmmx x W A 4i * W «. W WAA x mmm'mmx χ m A W « wA 4. WAA *. GTATCCTATC ATGCCTGTAT • mmmmm x mm >wW * WWAW^ mmm' m mm xmx 1W*AWW*AWA m * κι i*Mm mmmmx WW*. * WWWW ^A x mm'mmmmmx a!w\ X ww _ Ca TAGCľGTTľC CľGTGTGAAA immmx m^*mm U4«AlUUu CTCACAVľTC m x m' mx ' m'm Wk WÄ WAA W% 1 x mmx mmmrnmx AWWAWWwsJWA xmmxmxx x mm AU UA m AAAU * GTAAAGCCTG aLjnJUAAAU mm x <-*w^ χ m mm 1 wrtw x vjau w * W* w *L.w .uwg AACTCACATT. ÄATTGCGTTG x mm ' ' mmmmm AlUAA «LsJUW ASJN* *. <JW\ CCGCľTCCTC GCľCACTGAC CGCTCACTGC m x x mm^mmmrn WVAUu^a«lUUU mmmmmrnmm mm *WWW*WWWWm ccgctttcca V* WWWUWWA GA^fM ^ mmm* gA^AAU«JW\ mmmmmmmmmm WwwwwWw i mmmmmx % mm AW«JV»*WU\U *. mmmx x λ mmmm « ď«J/WVVJW*Wta v-* *. w* w^w· • mmmx mt I· J 4AVJ« - xmmmmm» -Λ x mmmmmx mmx aL»V7\jw;uw\ GTTCTTGAAG mm*mmmmrnx %m .'·· us. *. watww WwL. *-ww * w\j j. ATCľCAAGAA t Mmmm' xmmM Λ L. J «. *AAWWJW mmx ϊtΦŕ,, « *aaaaA.»wa Cm x wui^vju* *A • WWw a sJAw* w TGCTGCAATG äuW\VjN»«»«J\JA fTI ^ ΦΦ ^ ^ ΦφφΦ + mAAm a W* hvimwi/ mm • Ul* wwwaI * CTCCGGTTCC TAGCTCCTTC z* % m/- VJU * .AaUUW^ UAC * S2(J i. VJAw A *OWN»w«IU\«d /%% ^ UA« *g\lAAAA TľCGATGTAA mm* ^ * *U*ggg40A GAAATGTTGA TTGTCľCATG GCGCACATTT G mm Mm mmm WWWWW* W* M G mmmmχmm ' m V»UU *A« Wltf G m x x x m x X m' uaaaUaa wv rnmmmmmmmmm L*uuwg«·« * C x m x m Mmm m m AUAUVJ « WW W rnmmmmm mm mm C* wW*WWWWm mmmmm^ χmmm x gsjvjuAAgwg mmmmm Mmmm ' W* 4 wJV** ^>mA x mm X W <— *J «J -. ΛΑ V— x mmmx mmmm»··^ T m m^m m m mm * JM^'JSJWw.A mmx mmm^i m mm Uwlb «. * AWw * % m mmmmm < »«i nm AWWWW X W W m m m x mi mmmmm m x (JA. w—*. - * WA ^ Ifwnmi»1» m*mm ^ A* ·«» *. UA x mmmmmx x x m au4·« «aaaí ATCAGTGAGG Cmmmmmmm. *m XMg*gg*gx Xφ^mmmmm«m AaaUwWU«JAU «rnmmmmrnx mm AuguuwdAgg mm mmmmm ^ % m éWUwwwuA^g mmmx m^mmmx ww« aUau w wa. mx x mm x mmx x íaaUwa* UAa mmmmmmmrnm « UWiWw«i«WkjA m m % mmm m « m ^ UV«AÍ*gwilA mx m»m< % mmx iAW - wV.wwA mm» «Φ^ mmmm 1 wiA*Agggg CGTľCľTCGS C mmx mmmm mm WwAW*x*WAW G m χ ^ ^ m* m wuuug*.w\g ATACCCATAC X mmmm x m x m x Ayg«3UA*AgÄ mmmmmx x 4 χ m LWwwgAAAAU mmmx mmm' ' ' v» * L.iu * www% mmmm' mmx ' x «, w * sjavw wu*w\ mmm'm' mm mm «. w · A W W W · G' ^ ' m m mm x m AAAWv w^r·· W rpmmmmmwmmm • UWWWN» *·«<«> aUu* j X x \Jt“L x m ^ m ^ ' mm x m .«Vxj x «"«mx m^**^mx AU»A^>JVJ>>«A mm^^ X x x x x m * «. ^.’A^AAAJ mm x m ' mmx mm - gAVJA. w m' mmmx mmmm W\WWaA*W* «· x m x mx x mm x m AUA m »aAU m AW ACCCACGCTC GCAGAAGTGG m***' m x mm X x m S· XAAVJ m mmmmmmm^m m wWétftfiU.W x m^x^xx mw/xw^ AU* xA* * w· xJ x mx x mx mm^·^ A*AA*AUuw GGCGAAAACT CACCCAACTG G X x mmmx χ χ x AAggUAAAA • Al4 *gAA* «J mm mmx m* w ixm x •UWxALgéUA Gmmm^mx x mx 4AA«A xmmmmxrnmx x Ag\7 W WAU wui mmmmmmmmmm x m m x mm x m x x A^U A^ * A* ΑΛ G x mmmmm mmm AUxx* mm''mmmmmx 1 wu\*vju * U-A mm^m^xx mm' x 4. sj . O UAU U^*4 Gmmm x ' mmmm ^ w s«AAU m<v<J m' mx mmmx mm uuAgg m' mm x m ' x m m Wkw *. x mmmm* »m x m m AVJ* *UU»AUC C x xmrnxrnmxm SU\VJ W\U WVVj mo^^^mxm x m UVJVgiW.UAg AAAAAGGATC m x m x m x mm x m ÍA*A*A* UAU x m mm x mmmmm aUuua* r«*g* m x m x mm m m x m UA«AUgggAg x m mm m m#mmm x Ag«guw* U «A mmmmm mx χ m*< 1 ww · gw*«ig * m x mwmmmmmx lAU m m WWW W> x mm mrnmmmmrn AUUWm Ug* ww xmmx mmmmmm *\X UA* WwWWw χ ^ /*m« x mmmm rw\W »AA\9 · m W fT*m—*mx mm mm χ • U*vm\*UWW\ AGAATAGTGC GCCACATAGC mmmx x mmx mm W*W\AUUA*W A mmmmm'mmx * w* •Wiusgt mmmmmmx x x x lggwggAÄAA mmx x m % mm x m *wg\*A* ~λ£ TATTTÄGAAA mmmm WW* W C mm·· m x mmm' ww 4. *.i; Uw\ AAGGCCAGGA GACGAGCATC X m x m x mmx m m AUAlAguxgg mxmx mmmm^ m V-* .AUxuUA* Cm mmmm x m*·^ yj\.«u *g\wsj _ ^mmmmmmmmm GTAAGACACG m x mmm x m *· mm ^A^W *AUVJUJ ACAGTATTľG x mmx mm mm m x Am «aLjíwwí mmmm' mmmm x w w * Unu * ww A mmm'mmmx mx * m W\WwmAWA CľATTTCGTT GGCrrACCAT GATTTATCAG mmx mmmmm* m * mAm W wUVx·* G mmx χ φ' m* *m * éAAÍAU·* mmmm mm x mm m * UU*A4 WW x mmmmmmm m x AmWi*U4UWA m^mmmx mmmm ggggwig * w * mmmmm* x x m x m * WwWmAAWA* AVIAAW4 m mmx mmm» — »*/'»' * aAWWxJW* W 4» TcriTTACľT x xmmmx x mx ' AAUUUAAlAÄ TGÄAGCA7TT x xmx x x m' AA * AAaUVA GGAGAGGCGG WiLmlai CAGAATCAGG ACCGTAAAAA ACAAAAATCG CGTTTCCCCC ACCCGTCCGC A.U.wAUllt AGCCCGACCG ACľTATCGCC GTGCľACAGÄ GTATCTGCGC GCAAACAAAC GAAAAAAAGG ACGAAAACTC ^ « * · * *AM (Afrmv ^AWVW X CATCCATAGT í" JUVtavWUJ CAACAAACCA CCATCCAGTC Λ/·Λ/·Λί » MMwuU>g X CTTCATTCAG AAAAAGCGGT TATCACTCAT GCTTTTCTGT CGAGCTGCTC AAG7GCTCAT TGAGATCCAG TCACCAGCGT uuumawIUi ATCAGGGTTA TAGGGGTTCC Obrázok 13c 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 341 901 96i 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1581 1741 1801 1361 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2321 2381 2941 3001 CTCTCTGgv* » m« ********** m Λ i a uggau a mmmmmm M/*%mm ww mm mm mm mm m m w^g·*^ ^ λ U. UaL . w. ·,-nm- GCGAGAGT.ä.T TAGCSACľAC Φφ«m» mmmmm . InLn\- > gg . g." - ngng . » mm» m»»g TCTCCAAGGC 'ľTCTCATCAA j^ip» mm mmmmrn ^«rvwpnm» mmm mmmmm » mmmm L.gggn1MU« mmmm» mmmmm w »w wngg·.w AGTGGCAGTG GÄTC.AGGSTC ^^^ΦΦΦΦΙ ^Φ imni gm » φρ t » m» mmmmmm» Λί-.-.Us _ ^ ACCTGÄÄGAT GIui’GGAAJIu!lJIl %tpm^ ^wtig/npi » m rnmmmmmmm ngg-.^Lwg. mm» mmmmmm m ggnug..Ugg mmm» mmm» mm _ ggn ggunu·· AAvjn- > _»ngr,ftA mmmm mm mm m m • U.AUA.AAW » m^*mmmmmm m ŕ.Uj.<jgww.. mmmmm mmmm m ls _ ·*>ν._ m m mmm mmmm m _ gAg gg fnrnmmmm mmmm «. m·* «. · JWw*A TGGÄATTCTA imm» · » » » m» ^ φφφ% AAaUaAí m * A TATGľľCCCA > v UJO»AAAL*g GÄCGTCAATG TTTCCTaCT? iggwiu^Awv ****** % φφφΐ UUwt* · uAwg CSTAACAACT ATAAGCAGAG % **** » Mn f* » AW»*gtW UAU 4» CCTCCTGCTA

    „ j«g Laavjvju *. · gA ÍUWWA*VJ φρι < fvm ****** ± wuVa «Awgg tí ^AAAXgu^eW m m m mM » mm i » » m» G m Mmm Mm mmm gw*guAAAu G m m mm m m mmm AA^AAAU «. U. mm MMmmm m m m * gggA»AAUw CmmmMMMMmm mm pmmimMMv <«AAgguW%g AAU**.g4«A GmMmmMm mmm m gg.gu^UUA wa /mm mmm mmmmrn m^mmmmmmm» L.— w»sg* i.gww*gu»'gA G m m mm m mm mm mmmmrn m mmm m gA^.^Ugw». U* wAA^ggg m m m m m m mm mmmm m m m m UAgw\UU*AU w»-íUjw^ m f* m mm m m^mm mm*^^» » mmm» agwgAAU*UA m» mmmmm mm m mmmfmm mm ^**** UAggguAUAU .g**AgA(juu mmmmm» ^mmm mmmm m mm/"^mm UA^M^lUUé CAGCľCATCT TTCACCTCAC ******** m mm » » ggnuAA/. uaa » » mm» mm» mm «A^U GACGGÄTCGG AGTAACC TCCCGATCCC GTATCTGCTC TACAACAAGG TGCGCTGCTT TTAATÄGTAA ATAACTTÄCG AATAATGACG GGACTATTTA GCCCCCTATT CTTÄTGGGÄC GAľGCGGTTT AAGTCTCCAC TCCAAAATGT GGAGGTCTAT ^ \ % m AGCTTCTCTT TCAAACGTAA Ληί·1>·ϋΛΐ>υ GGTCAGAAAA GAACTTTÄTT ACGCTTCTTG CTAACÄTGCC ATCCTGTTTG ATCTGATGAG TCCCAGAGAG UÚAUAU X V) X U GCTGAGCAAA CCTGÄGCTCG CCACCTGCTC CACAGGGGAC CTCCTTGGCT ACCTGTGGTT AATTTC7CTT ATCATCCTTC CAAGCCTTCT CCCCTCCTCA CCTTTGATTC ATAAAGAGAA TAAAGAAACA TGCCTTATTT ÄGTÄCTTTCC AATGTTGCAA CTTCTÄGATG TTTATTTACA GTCTCGAGTC rnmmmmmmmmm gvu*wggA*g G mm mmmm mmm Λ * w wvaIj m mmmmmmmrnm aa(j4aa ..-.gg rnmmmmmm*mm m g* w· · gw mmm» mmmmm» w* ·Α·gwgWA CTT «·* » » mm mmmm mmmm WIU * » JAAA1 mmmm m m mmm ** gw<y^\AAg * au m mm mm mmm **** AUAgACUA^g mmm m m mmsm mm lJW\UAU*A^«l mmmmmm m mm m UU«.c.uiunA CTCAGTTCCA CTACCCCTAT TTÄÄTTATGC xummm mmm m mmmm mm AlAAgugAW* ATTCTATTTT GTCCTCACAG mmm m mmmmmm Uu\AUL^w«U ÄATTCGCTGA TCaT^ Ca^TG mmrnmmmm % mm AlAtftfVJAAAi, ACATTTGTAa ACAACCTAAT m ^» AtfW4* W*A«A m mmmm mmm/^m aU »«gsivg * s» a w AAAGCCAAAA g* W*·· »AU* mmmmmm ** λφφ LgwL*ggv*g TAGTAACGCC CCCACTTGGC m mm mm m % % mm AWgw*AAA*g m m m % mm» m » m VAJW\g*AW\^ ΦΦ1 % Wl • UÁAé< U^g^w^wA· «i C mmmm»m» ^m w* ^AUAA* G m m » m m Mm» m SVSJAAVg V. *. Λ\3 mm mm » mmm mm .μΛ-ΛΛ- -Λ · w AACAACACAC mm mmm m mmmm U-AíjUjaaL· mmmm» m mmm m U^CUAAU.gw % mmmm» m mmm aU* ggAAgg» m mm m*»» mm^m AUAlJUAAUgA mmm m mmmmrn m AJAAAwAUAA m m mmmmmm m m AUAgv·* » WW\ Gmmmm * mmmm Uw*uaLU«»w mm mm mmmm^»m w mm m mmmmrn m » ^m m » mmm m m mmm mm mmmm ** AAA*A*J«.Ag m mm AiAU^ wU«.^_ mm » rpm » » mmm \3ΛΛ * uAaU wA mm m mm mmm mm UÁAU\iUA«A GTTTAAGTTC Awugw *aU * w mmm m mmm» mm • *AAl wm—*\W\ AAGCTGAGAG mmmm mmm»mm UUw.Ute^AUv ATT: As«v* oasjowmS ffvw % mmmm*mg^ *^Ψ%** **l\f t 11 C mmmm» mmm m gw«g,*\g é«*;u CATG aagaat mm mmMmmmmm mm m mm mmmrnm «. UA»AgUWteA m ************* m m AWggWtoWu;Í m m mm ****** * f m AAlAtfVIVSAW* ÄGTACATCAA Gmmmm Wtotoguwlwv CTACGTATTA If\m m » m m m mm m * ggA^Avwgg TTTGTTTTGG GACGCAAATG m m mm m m % m m m AAW«AgAV4AA C mm % mmmmmm MAA'gw* *gy C mm mmm m» % m w·» g^gUÁAU m m mm Mm »mm » Ua* <j\j-ri'jori MP » » m m mmm » _ *AAguuj>gA » » rn rn» » » mmm A-iOUViAi, * X m» » « » m» » m« *AAAAíAAUÄ » mm% mmmm» m A.lLA4gg«AU » mmm» mmmmrn r.gggAU* «.w· /wn» m» /mm/ mm/ι U*A«AW4gAg » m » »»m»m»m AWVW\mA1 Am »»»»»» /mm« m aaaaaaU « Λ X. m mmmm » mmmm gggwOAi mJí. CGCCG'aCT^'C G« mm m m Λ » iJUAU ·** GA-. gwwguA4 TGCGCGAGCA rnmmmm^mm mm m •.‘iggg mm mmm m rmi m Ca**oai*λ* m m m m mm m m ««»» ÍA**n.guAg4 G m rnmmmmmmm AwmWwwgUto TTCCATTGAC Gmmmm mm m mm iUéA*WUA CATTATGCCC GTCATCGCTA TTTGACTCAC CACCAAAATC ^mmm^mm mmm vjuwgg.Augw mmrnm mmm mmm L«WAW*gW·* TACCATGGAA C m'•m mm mm mm mmmm mm pp^» m aaaaUa L w^n mM* MMm» » mm gwigg*AAUg » m» mmmmmmm AUAg m. wU» «L. w GAGACľTGCľ m» m UUÄ'ďW ii Wm *ŕ\W mmm» » » » m» » • · Uaaaa(jaa » m» m» »m» » » AUÄWAAiAAA mm» m » mmm» » * é.W.Wm m.'«A Gmmmmmm» » m «UétfWWAAU » m» mm» » » » » A«A· *AAAAA A w*A*AA^** w Gm» » m » » Wm^Usgvrkl o «. mm» » m» »m» m * -mm m mm mM^» m UAAlAU^Wig G m mm mMm» mm UUUWWOAaL AGTTAAGCCA AAATTTAÄGC TTAGGCGTTT TGACTAGTTA TCCGCGTTÄC CATTGACGTC GTCAATGGGT TGCCAAGTAC AGTACATGAC TTACCATGGT GGGGATTTCC AACGGGACľT Gmmmm mm mmm 4g*AUgu*a ACTGGCTTAT GCCCCAGCTC m*<m/ *mm m mmm b, . w. g.nu . w Ua'IVm'mAAa* mmmm mmmmmm UmOmUm^aMM CTTAÄÄCAGG Tm^mmmmmmm W* A ATAÄCTTCľA GTAACTCGCA GCACCCTGÄC C mm» mm» ****** wig^g AGAAGTGCCG CCCCCTCCTC GAÄTCTTTGC mm» » m#n» mmm L^aaU^aUíU a*a *A1aaaä CTCÄAACCGA TCCTTGTTTľ AGTCATATAT GAAACCTGCľ AGCAATTAAA TGGAATGTCA m Mmmmrn» mmm ggw^g .4. λ x a u CATTCATTAA AGCAATCCCA TCAAAGCAGC AÄTGÄGTTÄT Obrázok 14a 3061 3121 3131 3241 3301 3361 3421 3431 3541 3601 3661 3721 3731 3341 3901 3961 4021 4031 4141 4201 4261 4321 4331 4441 4501 4561 4621 4631 4741 CCGCTC 4801 TTATTTATGC 4351 UL1 2 3 · UVJ 4921 GCCAAACTTG 4931 mm A/Ammmb mm 4i uvj x 1 wuaLL 5041 m b a b aAmb mm UAUAwW 1aCw 5101 CCTCTTCäGT 5151 mm m mm m b mb b * 1Cw4UAUAJl 5221 AAGAACCACC 5231 TľGAACAACG 5341 TTTACCAGGÄ 5401 5461 5521 5531 5641 5701 5761 5321 5331 = 941 5001 6C61 AGGÄATTTGÄ CAGAATACCC AAGTCTACGA AGCTATGCAT ACCTTACTTC GGTAAATATA ArľTTAGÄTT GGAAAACCTG TCÄACÄTTCT i a % b >Τ»η/" % AUAAll^bA TATTTACACC *WXU%Aww« 1 1 bb b T . Λ W w WU1. 4 AA --U-vQ - 4b WIA b mb b mmb b mb AUAA1XaaLA CATAAGAGAA AACCAGGTAA b mmm bmmmmm AU X·AU X UUw Lg x u 1 vjuuu x mb b mmmm b m% *iTW\L« 1 1 Lawv G mm b bmb Am b • WVnVJAW WV mmmmm^jmmmm .wLuwnLii a u AGGCCTGCTA GÄAATTAAAT CÄCTGGAAÄC CCAACACACC AkCACAGCAT Cmbmmb s—-iLa x wiu ·Λ TTGCCCTTCľ m·mm b m a a Am vanLz 4. nLsuwva x Ga a a a Amb b b mm UUUUWWUM mA mm b m Amm m .UW.AUW. 4. w mm m » m b a ľdW.AUAUU. mmAmrnmmAmm b«b1«1W A WW W WW b b b mm b m ab b aaaxuauu.- J • ΛΛΛ>- VJ \J\J Λ 4. Aw · L- AAAGATATGT AGAaaT^TGG C« < t rWVUUWVUUUU TGATCTGTGC CTTATACCCA 4AÄU X UUVJSJVJ Ab AmAmAmAm VjAVf4 1 w1UUÍ1 Am A/AAmm «mm 4^«\i4SJy.CC TTCAGCAAGG ACACTCACAT mmmmAAb Amm * UUVJUN—rtU 1 w CCTCTCľCTG VjÚUUArkUU^VV·» t % mm^^m % m<« ΛΛ-1 L1 4» x UA4U > b mAmAmmmm ΛΛ ^ U XU1·1.1, •-lAAGG CrwGG C mmA1 baaaaa CAm A A b ^ WU AW .» U 1. mAb AAmmmmb • «JA>m "/L. 4b UWA b mmA^m^m b m Λ1 «^4 W1 JAVJ AUUťbX lUSJNJA CA A b b b A b b A •jxjaaauaaU /b , ^ΛΑΛΛΛΛΛϋ •T«« -«ΛίΑ m λ 1 m 1 m b m A b nw\LA<JA i Laň m«mm 4b W 1 U ·Λ> «J 1 4» b m A A b » b mm b AilfUAAAl 4iΛ Amm mm m m m aim v»1 1w1uuuw; Λ L1 b«Jb 1 W 1 U 1 G»«m % b m % m 1 ^ x ««run.«ηϋηΐ CCTGGGATCA TCCAGGGCTC TG7TTGG CTA GGACAGAGGA GWffyw»w<·»· b b m X X „.UUUrLŕV1 mAmAmmmm a A *UOU)b«1dU4i CCTACACTCT Ab b mAAA^"mm W\.1\ · U « «· · · 1 b Am A % m A a b A Λ La 1 U"· _ UU.-VU « m/it « ^ m .“iLj ·Λ· LnAA X. CCAATGACAT aT.-iATCG.-i.G 4í A1··1 b Mf ÍJAAUUWUww 1 g^AMbw/ im s AGGTGCCACľ m\GC,w^r b a 1 « · b m b m m A(jaWu% --n La s· ^ <4IW< »4 ^ WV«9S· 1 «JSIUWL. TGT3GTGGTT CATGGATCTC b b AmAAAAAA AAL. '.«•«JWWw b A1 AAAAA b m AUAVJWWnxxJAlj /vuvau «· · .i<jvj v1 ACvjGGaA.CC b mmA % % m^^A m Λ1«JAALaJL Am A A Lb^LWé GGAAGGTAAA ϋΛΛ1 .^JALUb b m a b m a m ŕ1 «w ÄV-U1WVJŕVJ V1 Jb G A b bmmmmAb ΜΛΛ.· JUUA % ^< TI/" b Λ>J\« —Λ 4. <JAA 1 b b m^A b Ab mm AALa x JAUbiLo auvjwu 4. L· w1 w GAAGAAAGAC TTTTATAAGÄ bili WVJ 1 U » tfA AAATTTľTAA AAb b ÉAmmb mm UWAAL^bAlU m *41·1 W^U ^ « Aw 1 «·<1 wwAA ACaaaGGAaA b mb b<^mb^b«1b Λ J· ΑΛ1b nLT'J W /" % T"A T , L«a· · «.-i' f b fm 0+01um W1 w 1 «aLjw _ bJ C1 1dSJ4AA1«J ^ m % ^ b b lb« b .-¾ « .-1W-IWX i » Λ b^1· b/Tb/1T»b b auaa^ja^uaa AA'ľ AG CTAC C b AALasa· oi2i>A /b^TM /M T· b b La W · AVjsaribj b-A CAGAATTAAC % /bM/bM uuu uaaVjvjvi w Cjt-bíTb^b^^b r,0m09^ L1w« G b b ΑΛ 0» P+ rw2.wvavabj 1 « w GTCC*ľ «jC^^T

    ^.-l^i CAAl «. w «I b mm ŕ *«Tb b mb /•m Λ· * b· -í.-.-í.-iVj 4. rrr b ι"»"/"ΐφ «. ij^w-iuuwb* C/^/^b <4»#-b^mmm «»b_-bW ·<42ν·Μ m / "m b .L..-1.:.w. w«bj AGGCATGCľG m/'ms <"4"#—«i2<1m 4. L.auuunjnj j» b fmA%A+ AU^W^WlLxWbJ AATTAGTCAG AU·· L^gwWbUuu -.-.GCGTGAAG /\-UbJ2L.bJV-Wj ^m^ b «M % b L1 2 w\Vjwn-nv-sj ^b/1b b mmmm»" UA(JAA4y>i4tfW mm b b b r·^· b ^ b ^ b LA2 1 2 1 w 2 1 bJ b /2mb b b /»mb AU.AAAU.AU ^b b ^^b Α·Α1Α+Α+ WkALW.UVJWw a1 a2 a1 m^m mm mm UVJ^U · UVJUWU mm^mmmrn^e^m TGCrrTCAAAA mb b mmb bmb m 14WVbJ « AA 2 4,-VNJ TGCCTAATGC ACAAAACAAC CACATACATA /brtvb/· m mm b m b V«1 4UWWbANOA ACATGTAAAT ACTGATCCAT b mmb mmb b /m ^\\Λ\3Λ^» -.--U-vL-X Qwbwmw ŕ·1' τ·πτπ b mmb b mmb mm Λϋυ.ν.ϋν.Λίί mmmm b m ""'wn • 2 w « «. b m1mmb mmmmm ŕ\L>·. >^-n.-.Uw·.· φ/· mm m m mm mm • U^uuv.ygbi2 GTCACCTAAA m»mmm|mm/^»iTmi^^ /TyywnQmbb A^A m T" · m" i/ · m m mm1 U13SJSJ 4 U\JL9SJ 2 mm m b mm mmmm VavjNJA · nugvj 1 b mrnmmmbmm m A.LMvWiLjv· mm b mmm mu b m 4» vJAL «ÚĽ 2aL mmm mmb m/""1mi X WVJV4W^J 4. 2 m' b mmb mb mm LAAUUVéAU 1 b mm mmm mm mm rv^ lw2w«1«awM CCTCTGAGCT b φ/μ ibfl/b m b mb AuW· « uvjala G mmmmmb mm b W 2 USJ 4AUUA mmmmmmb b b b *U1L« 2>ΛΛΛΑ AGTTCAAGTA mmb mmb mmmm χ^Λχ 3\XLa^JVJ GAATTAATÄT CCAAAAGTTT b mb mmmmmrnm aLaíuu.4. 1Lj b m mmm b m b mm AUW·«AUAUa b b b mmm b n1mm ÁV^« x «3A« 1 1 AGGAGGAAAA ATGCTTTCAA TTTGCľGGCT CÄÄACľACCT m/ i«wb b b mmb 4SJ4 «AAAWmA b mm m m b ^ m b m Al LíUavj^víg w\Lj b τι/m b mmm b m AX L2^UigAÍ b b b m mmb m b b ^VAALl'J 4AUAA GTTTAGTAAT G / >mb mb mb b m S/aA^AUAau mb b φλιmb b m IaaI w\xaaC m «"A / · i a w b mm UUUU.W.A.U maAmmAmbmm W^Ww.13 4íAVJU ACTTGCCAGC mA ammaa Amm Ugv1wi3\jvjv»Wb mmmmmmm^wiib LbbUWWwb2A C a b m/ a/·—m b WV A VJUC A UA ATTCCAGaaG mAmmbAAAAm UU4W\UMULb m b mmmaa b mm XAiUUVJNJA1 2 /«mmm m b « b m^ W 1 2 Lwiaaua mb mmb b b b mm xauuaäaaLL AGTTCTCäGT GGATGATGCC mb mb mmaaa b UAXASJ i LUUA CTTľGTGACA GGGGAAATAT AGGGATCAAG Amrnm^rnmim mm U44li1bbgWtt TTAGATCľCT ACÄGAGATTT CTGATTCTAA mmmmmab b mm iUUiUUAA.g m b m a b a a mm b UAXUAUUl· a Λ GACCCCAAGG AGAACTCTTG b b b b αλλλΙ íA.vjvi bmb aa AXAU4 AGCTACAACT ACTCAATGCA AAATAAAGTT TGGGAGAAGA GGTGCAGTTA 7AAAGAACAT rvV_^._ALrv_l\ru AGCGCTGAAT TTTTCCTGGC GAAACAGACC CCATGTATGA CCTCATTCTA TTTCľľAAGTA CCGTTCCCTC CTGGGAAAG7 GCGTCTTGAG GAGACTCAGT ^ pi im p· _ _ jaaUuuí. ACGTGTTGGA CGCTGATGAG GTGCCTTCCT APw.2CÄn,CGC AGGAAGGGGG GCTTCTGAGG mmAAAb mAib b UUUUSpA4 2AA GCCCTAGCGC CľCAAAAAAG b mmmmAAAm% AW«bWUW«WA CľAATTTTTT mb /"mm b mm b m 1AU X UAUUAU GCGÄTTTCGC GCTGCCÄTCA AAAb b m^ bmm Guwmsmaw ATGACCACAA TGGTTCTCCA AGAGAACTCA TTAAGACTTA GGCAGTTCTG AGGA7CATGC ÄAACTTCTCC 7ATAAGTTTG CGCCTCCTAA T7GTGAAGGA AAAGCTCTAA TTGTTTGTGT CCTTTAATGA CTGCTGACTC ACTľTCCTTC CTTGCTTTGC AAAAATATTC TTCTTACTCC Obrázok 14b 1 w 1 WAVa\J 4i UVw m b b m b /"<· b b m .AAWVUUAAU C^ b W^)·/· b / "M «A4USJSJAL2 ^ b m b b mm^» λ b LAaAA1 .UVJA Gm^m b mb b m<2 4.VJ •rWl^AT'bl GAACľGATGA AAGÄAATGCC 2 bbbb^bbb/1"bm A.'ĽV^LAftUAU ^•mmb uiwi2uv1.gi 3 b b ^ mrnm m ^ /'Wb AAUU^tJWlL2 ATA-ACAGI^ZľA 4 mr^mA2 b 6121 6131 6241 6201 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721 6731 6341 6501 6561 7021 7081 7141 7201 7251 7221 7331 7441 7501 7561 7621 7631 7741 7301 7851 7521 7581 8041 3101 8161 3221 8281 8241 3401 8461 3521 8531 8641 8701 3751 3321 C ta ta tata ta ta tata ta tata ta tatatatatata ta • Λ4. .--ľ. . ΛΑ L. Λ - JW1 L-ru-v —ŕ·1—tam tata^ta ta ta A. -I >a1 tata tatatata <^tatata « tata ta —tata ——— • 1sJ2U2<J· /«« i ^ tatata—m ta Laaa1 1 1 Ua^· TCAATGTATC TGGAGTľCTT tamtatatata tata ta ta A1AwW\^LaL CCAAACrCAT CGTAATCÄTG ta tata tata tata ta tata AWl a V· CAľľAATTGC ta tata ta ta tata ta ta ta Λχ ·ΛΛ·«ΛΛ- tata^»ta— —m — ta ta \~W » W-mJV. _ WAV Caaa<jCCGu « CAAAAGGCCA ta ta tata ta ta1" — tata Issji» · mtatatatam m ta — 1 ··· gwAgv-A tatam tata^m^m ta1nta L^Awggww « w TATCAAAAAG m m ^ ta—m tam mm ÄAAgAA^A.A mtatata1 tatatam ta tatam tatam tam tata L 1AwgA« ALg ta i'xwtam tata—^1#— gvAwAL«»ggw G tata ta—tata^ta ta *ggAV«1gL tam m tatam ta—tata tatatam ta—m m — • AAg^Ag ^ « w gvwAg. é.vxl tata—#—1 ta^^—— tatatata—m—tatam C tatata m tatatatata gWW\«d4 vg G7TGGCCGCA G tatam tata^ta—m wwaa L1wgj 1A G—tata m tata tata ta aLaa· gwgg mmtatamtam m tata AAgvAgAi^L1 GATCTTACCG m ta ta m — ta—— auLa1w·1 1 1 AAAAAAGGGA TTATTGÄAGC ta m m m m m — mmm UAAAAA 1 1^AA ACACAGCCAT — x x 3 1 1 TAÄTCÄGCCÄ CCCTGAACCT ATAATGGTTA TGCATTCTAG GGÄTGATCCT TTGCÄGCľTA TľTTTTCACT GTÄTACCGTC GAAATTGTTA m»· x U«. a. j» uw tamm^ta <—,.»·· V-gjVJX Á TTCGGCľGCG CAGGGGATAA > m m mta4^1#—— ATCGACGCľC CCCCTGGAAG «WS1W1 1 x GTTCGGTGTA ACCGCTGCGC C ta—tam ta^taMM CAGAGCTCTT ^ /'>ŕw Ijwu.wiuL1 AAACCACCGC ÄAGGÄTCrCÄ ACTCACGTTA ΤΑΑΑΓΓΑΑΑΑ GTTACCÄATG CCAGTGCTGC ACCAGCCAGC AGTCTÄTTAA ACGTTGTTGC TGAGCTCCGG CGGTTAGCTC TCATGGTTAT CľGTSACTGG GCTCTTGCCC TCATCATTGG CCAGTTCGAT GCGTTTCľGG CACGGAAATG GTT ATT G7 ď TTCCGCGCAG TACCACATTT GAAACATAAA CAAATAAAGC i» iU xvgsJX x Iaä.uu x Iaw g GACCTCTAGC CTAATGAGTG AAACCTGTC3 ta1 *A1 . uvívín—wi w Ga^i λ «<«» »·X V-Or.gjW«jgJ «Λ CGGAGGAAAG «AGT GAGAG G V« 1 wSa ta » ta «J a mj CCCTTC5GGA WV1W1 1WtaJW tamtam — tatata—ta L1«A«^ta^u1 % / "ta AUWVtfVW^W ta GaaG aviw· Gsi m UAAVWtalV1 ta nv tamtam ta t ta ONJ «AWUUW ta « tata ta ta ta AUAAUAiWtata ta ta ta ta ta AUNJ\>A1 ta ta ta ta» ATGÄAGTTTľ CTTAATCAGT ACTCGCCGTC Í Í —ta1 rn ta ta tata AÄ4 gA1AUta^i tata ta ta tatatatatata V»UUAAU\JVI^w ta ta^ta ta’ CATGGCTACÄ TTCCCAACGÄ CTTCGGTCCT tatatata tatata tatata UVJWAVJWAU ta tf TGÄG7ACTCA — ——— m tatata u\jwg ta ««AA ta a tatatata tatatatatata AAAALg1 X W » GTAACCCACT GTGÄGCAÄAA tatata ta m—m tatata ^ « UAÄ1AW4 W. ta1 ta#·1 LA1gAuwguA ΛΧ m 1 wW W^WľX '"Ί ll G— 1 ta 1 — tatatata «AOAUUrľ1 ta —ta 1 ta — < A1«JAAé,L ta « tata tatata AA.AUW TCGAAACTCA G ta ta tatata ta tata — A^U1 Wl1 gt ta ta tatata ta m ta — m AAA1AAAUW1 —ta—ta tanmm^ffl *g1vjg4· tata tatata—tata lAUAgv1 « ww ta ta^tatata tata tata Ai« vw\w\La AGCľAACTCA —ta— — 1 tata^m— — Agwta^ww.gw —»1·^>η .U - 1U«»«Jta»ta ta —ta1 ta tatata ta tata ta ta WAW ta AAUl1 hl h. G.lG —tatata—m — — —m ta ta w^JALg».. GCTt ftaítata' tataUi TTAGCAGÄGC G tatata ta tata tata1 ta W taAW\W ta 2 5VVJ AAAGaGTTGG TTACTG7 CAT TCTGAGAATA C—ta ta ta ta ta 1 tam wgwgvLALA AACT CTCAAG ACTGATCTTC AAAATGCCGC tt»»T<M»iHtatam m ^m iV1V1 Laa 1 Λ AATGTATTTA ta— ta 1 tata —ta w1 gnvg1 w m m m tamtatatatam Λαα··g·g·a m — ta tatatata m Λ« «gwt.1 1 gA m m m m m m tatatata amL^aa v w 1 m ta m m ta——^m—m .ÄAw«.Ua1« m m m ta m m m ta ta m AV. -. ΑΑΛ W> WA tata 1 tata · tata—»r· •LA.b^w tatatatata1 tatatata LgvwLAw^ww AAATTľCACÄ CAATGTATCT GTCATAGCTG tata^1 1tata%ta> LggAAwVA ^A Gtatata‘—ta tatata1 * 1 gN»gw1LA CGGCCAACGC mta m ^^^tata λ. gAL — <J éM«A1«'\Cgg· 1 A G 01λαλλ wiGCC Ctata^ta m tata m i·· W«aa gAÍOAg AGA. GCCjV_. tamtam /^tatamtam tata m m tatatatatata Ctatatatatam m ta1 wWJg.AAUA G m tatamrn tata— 1 Αϋϋ1Α1υ1Λ m m ta ta m ta 1 ta— m AALWALAg «. Λ mm ta tatata—mta m « é^gw · ^ · 1 sg«r\ ta tam ta m i r i 1i m tata WW\Wrt· «AwV tata1 tatatatata1 ta m UAwgv« w^g ta1 tata—tatam tata gAA w1 « mAWw tata1 tatam m 1 tam _ g?Asj a^wuxL « ta— 1 fftawi tatam ta ta —tamtam LvAVWWWm «Λ tatata m ta1 —tata m ^ vVAUA# « CCľľľAíji-v. CTAGAGATCA CGACACCTCC ATľGCAGCTT TľTTTTľCAC TGGATCGGCT AACTTGTTTA AATAAAGCAT TATCATGTCT TTTCCTGTGT AAGTGTAAAG CTGCCCGCTT GCGGGGAGAG C ta tata· ta— tatata#· ow· w«g\gUg TCCACÄGAAT AGGA ACCGaA CATCACAAAA tam tatatata—mta^ wivjgvwgj GGArACeTGT AGG7ATCTCA ta—tam tatatata^ U 1 1 W\LgywJ ta1 tatam tatamrn — LavúaL · 1a1 ta ta tata tatata tatam USJVgU 1 ow 1a TTTGGTATCT tatatatata tam m mta * fMggvAAAU CGCAGAAAAA TGGAACSAAA TAGATCCTľT TGGTCTGACA CGTTCATCCA C tam tata^tatatata w\ta U tagg^L TCAGCAATAA G tatatata —1 #ptata gw1 wwa! ww m ta— <vg1 1 •LvgLA TGCAAAAAAG GTGTľATCAC AGATGCTTTT ta^ 1 ta^1^ 1 UgAgg«JAUA w TľAAAAGTGC CTGTTGAGAT ACTT7CACCA ATAAGGGCGA ATTľATCAGG CAAATAGGGG Obrázok 14c 1 wiAUM wgAU — —tam tatatatatata 2 LwgAi 1 g ta» tam m —1mmta La .é^1 aw1 w ACCAAGTCAT Ctatatamtam m—m TCGGGGC3AA 3 tatata ta tata ta jgvgAAAyw —ta—tata—»ta VtaUWta N-»· wWtaWI ta ta tatatata ta ta/1 ta ťVgW'J iguLgw tatatata ta ta^—»—Ä * «AAUV« 1 UVJ ta ta ta—1—--^-w1mJ « W G»«iw ta tatatatatata \J «AAÍAWSSA CCTAACľACG ACCT7CGGAA GGTGTľTTTG fftata» ta m/ « i h < · m 11 • 1>JA«w4 a « 1 G A wA1 gA\»AT i t ^ tata1 1 tatata ΑΛΛ1 wAA1 G m ta ——m «ta»» AggvAWte1A G «««tata1 ta1 — 1 m «glAUA.AÄ C ta m ta1 tata—m ta GAGCGCAGAA GAAGCľAGAG G——m m———ta— \JWA1 w1JXmJW tata 1 1 ta —1 ta 4 m ta1 tata m % ta«· j·1 ALAggAALuw ATACT CTTCC TACATATTTG AAAGTGGCAC 5 —ta—ta —m tatata1 L· .j « gwAL>»w^ * l-ν' > — < O U C d — >< * cn >h Sm dl — > < < £h Q £ m 2 -< T“ V Λ U J U N J3 2 - ‘1« L. C W w J3 O rH UJ o O’ o a J _o >< 5« < < 2-1 d *7 -CO < —> CO d r-« — C < -CO O iJj J O CO CO r· co CO t-: > > d d <-* E- Sh < —> > > d d a J pv* rS E-1 E^ U O U U d o a d u O C O 2 2 O K o > >< vs > < < • D í« >* (Ľ d d v ŕ* V > >< d r. U < > J2 _= U a (S C CO C-l mrnrn —m —— tím d ŕ- a 2 S 2 O M M C m 2 S CO O VT P; O -¾- 2 Q O > O O S/ H M r.i j — > v o =- ŕ* o U CJ *-1 O o C3 C3 KS — >* -k d d u O Μ M 5·* d H — S J T S | 1 S 2 1-3 1-3 dl —a CZ m* L· 2 J a d. Λ —4 CO rs u u M -< CO —o Ľ — O O U --p O o o ľ: — o o d: O O d d 'r co _ m - C o c s — < KS U o H -O’ o o > > O-CZ o o > > > > > >< M — > 2 2 2 s O — c O < > ;-d 2 a Q U < >" > o Ľ C£ £-· >H o 2 CO CO dl dl O £h * ^ w · n CO H Γ.Ί r_T PO S-I 2-4 M > > -b3 d d CO CO CO CO < — E- O O 2 -CO >* > CO co w ;_i U U < < CO — d CO CZ rs J n < < u U C-i ŕ- co CO O -I4 P· U u O J h··· P* C Q O CO CO N co — Jh CO -ŕ" OJ H —> > — < u o CZ __ bp nj CO CO > > Ω -íí o o E* -CO U O CO CO d — < dl dl u O U O i* — oo CO CO d d > '--b3 L·. CO M O CZ ŕ-** O b3 >-3 vo CO — < O _j a H ŕ* d d tH a rvi < < H H d -CO d dl U u o U M CO CO! ŕ- CO CO o a w < o< a d di CO r-" > > J J d a J Q > > CO CO o o .§ H M o < < ro ,, c M — > S HQ —— CO in >n •O i—i o o· O ε Ό ΤΓ 0 VK D40 v o 'C D v Ό _ O >Γ « > Q O > O > O > * *

    Obrázok 16 ΑΊ90

    Fab (,ug/ml) Obrázok 17 Identifikované špecifické varianty Identifikované špecifické varianty Obrázok 18a

    Obrázok 18b

    Myšie rámcové rezídua