TWI226334B - Monoclonal antibodies against human CD40 - Google Patents

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TWI226334B
TWI226334B TW088102330A TW88102330A TWI226334B TW I226334 B TWI226334 B TW I226334B TW 088102330 A TW088102330 A TW 088102330A TW 88102330 A TW88102330 A TW 88102330A TW I226334 B TWI226334 B TW I226334B
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Alejandro A Aruffo
Diane Hollenbaugh
Anthony W Siadak
Karen K Berry
Linda J Harris
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Bristol Myers Squibb Co
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Description

1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 發明背景 免疫/發炎反應是經由一連串複雜的反應來調節。像 c D 4 o/g P 3 9的接受器/配位體配對是這些重要的 過程之一。g P 3 9/CD 4 0交互作用能調節一些重要 的訊息事件，譬如被活化之T細胞和其它免疫系統之有作 用細胞間的訊息，可導致免疫/發炎反應增幅。透過C D 4 0傳導訊息的反應包括體液性免疫反應中的T細胞輔助 B細胞、經由單核球引發細胞激素、以及經由內皮細胞表 現附著分子。 C D 4 0是第一型細胞的表面接受器，也是腫瘤壞死 因子接受器（tumor necrosis factor receptor, TNFR)超級 基因家族的成員之一。雖然C D 4 0剛開始被鑑定爲B細 胞抗原，但目前已相信C D 4 0可表現在全部的抗原呈獻 細胞（A P C )，包括樹狀細胞、角質細胞和單核球。在 某些情況下，C D 4 0也可表現在行爲像A P C的細胞上 ，譬如血管內皮細胞、或直接與T細胞或T細胞前驅物交 互作用的胸腺上皮細胞。最近，也報導C D 4 0能表現在 成纖維細胞、嗜酸性白血球、已活化之T細胞。C D 4 0 也曾被發現表現在癌細胞上，此證據原始是來自爲鑑別一 些C D 4 0 +的上皮性癌瘤和黑色素細胞瘤衍生細胞株而衍 生出的。（Clark and Ledbetter，Proc. Natl. Acad. Sci.( 1 986) 83:4494-98; Schriever et al., J. Exp. Med. ( 1 989) 169:2043-58; Caux et al., J. Exp, Med. (1994)180:1263-72;
Alderson et al., J. Exp. Med.( 1993) 178:669-74; Young et 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) a4規格（21 ox297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 4 1226334 A7 B7 五、發明説明（2 ) al.，Int. J. Cancer ( 1 989) 43:786-94; Paulie et al.,
Cancer Immunol· Immunother. ( 1 9 8 5)20:23-28; Denfeld et al ，Eur. J. Immunol. ( 1 996) 26:2329-34; Gaspari et al., Eur. J. Immunol. ( 1 996) 26:1 37 1 -77; Peguet-Navarro et al., JN_ Immunol. (1997) 158:144-52; Hollenbaugh et al., J. Exp. Med. ( 1 995) 1 82:33-40; Galy and Spits, J. Immunol, (1992 )149:775-82; Yellin et al., J. Leukoc. Biol. ( 1 995) 58: 209-16; Ohkawara et al., J. Clin. Invest. (1996) 97:1761-66 ) ° CD 4 0的表現型式與其配位體，也就是g p 3 9不 同。gp39是腫瘤壞死因子（TNF)家族蛋白質成員 之一，是一暫時表現於被活化T細胞上的第二型細胞表面 蛋白質。gp39又名CD40L、 TRAP、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) T-B AM，而現在來自白血球硏討會正式命名爲 C D 1 5 4。在活體外試驗中，T細胞活化後約2 — 4小 時會出現g P 3 9，6 - 8小時出現尖峰程度，然後蛋白 質量會也速減少並於刺激後2 4小時就偵測不到。 g P 3 9的表現也在嗜酸性白血球和肥大細胞曾被偵測到 。（Noelle et al·，Proc. Natl. Acad, Sci. ( 1 992) 89:6550-54; Hollenbaugh et al., EMBO J. ( 1 992) 1 1:43 1 3-2 1;
Spriggs et al., J, Exp. Med. (1 992) 1 76:1 543-50; Graf et al., Eur. J. Immunol. (1 992) 22:3 1 9 1 -94; Vovey et al.,
Mol. Immunol. (1994)31:471-84; Castle et al., J. Immunol. (1993) 151-1777-88; Roy et al., J. Immunol. ( 1 993) 1 5 1： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1226334 A7 B7 五、發明説明（3 ) 2497-2510; Gauchat et al., Nature (1993) 365:340-43; Gauchat et al., Eur· J. Immunol. ( 1 995) 25:863-65; Koshy et al., J. Clin. Invest. ( 1 996) 98:826-37; Desai-Mehta et al., J. Clin. Invest. ( 1 9 9 6) 9 7 : 2 0 6 3 - 7 3 )。 C D 4 0是一有潛力的訊息接受器，提供一機制使被 活化的T細胞調節廣泛的免疫和發炎反應。在活體外和活 體內硏究以基因重組型式的g P 3 9配位體和抗C D 4 0 單株抗體作用，顯示在全部已知的C D 4 0 +細胞中可透過 此接受器傳導訊息引起細胞性反應，且其結果不僅因細胞 型態有所改變，也隨其同時發生的其它接受器之訊息而調 節結果。譬如在B細胞中，當C D 4 0訊息與I L 一 4接 受器訊息連接時會導致B細胞增殖並製造I g E同型抗體 ，然而當C D 4 0訊息與I L 一 1 〇接受器訊息連接時則 導致B細胞增殖並製造I g G同型抗體。（Gordon et al.， Eur. J. Immunol. ( 1 9 8 7) 1 7: 1 535-3 8; Rousset et al., _ Exp. Med. ( 1 99 1 ) 173:705-710; Jabara et al., J. Exp. Med. ( 1 990) 1 72: 1 86 1 -64; Gascan et al., J. Immunol. (1991) 147:8-13 ) 。C D 8 0和C D 8 6是T細胞重要的共刺激分 子，可與 C D 2 8 和 C T L A 4 結合（Goldstein et al.， Mol. Immunol. (1996) 33: 541-52)，透過 C D 8 0 和 C D 8 6經由g p 3 9媒介的C D 4 0訊息可能在細胞性 免疫上扮演一角色。 C D 4 0 / g p 3 9接受器/配位體系統是許多已活 化T細胞和其它免疫系統細胞間製造性的交互作用系統之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5-T»
T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 ) 一。然而，有一些發現提議此種交作用在人類體液性免疫 反應中是獨特且爲調節中心。特別是在g P 3 9表現或結 構缺陷時，導致人類免疫缺乏，如已知的X -聯結高 I gM (X - Η I M)症候群。此種免疫缺乏症的特徵是 無法製造I g Μ以外的其它抗體，因此g Ρ 3 9和 C D 4 0間的製造性交互作用對作用性體液性免疫反應是 需要的。（Allen et al·，Science ( 1 993) 259:990-93; Aruffo et al., Cell ( 1 993) 72:29 1 -300; Di Santo et al., Nature (1993) 361:541-43; Fuleihan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90(6): 2170-73; KorLhaure et al., Nature (1 993) 3 6 1: 539-541; Notarangelo et al., Immunodef. Rev. (1992) 3:101-22)。同樣的，最近的數據指出由C D 4 0 分子缺失所導致非一 X -聯結Η I Μ症候群。使用基因破 壞技術已能製造缺之CD 4 0或g ρ 3 9的老鼠。這些老 鼠表現出與Η I Μ症候群相同特徵的表現型，因此建議此 種老鼠能做爲測驗活體內效應的適當動物模型，以抗C D 4 0或抗g ρ 3 9單株抗體處理阻斷CD4 0和g Ρ 3 9 間的交互作用。K a w a b e e t a 1 ·，Immunity (1994) 1:167-78; Xu et al., Immunity ( 1 994) 1:423-43 1; Renshaw et al., _ Exp. Med. ( 1 994) 1 80: 1 889- 1 900; Castigli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 994) 9 1:1 2 1 35-39)。 在活體內抑制C D 4 0 / g p 3 9交互作用之影響的 硏究已使用大鼠抗g Ρ 3 9 m A b ( M R 1 )廣泛進行於 正常老鼠和疾病老鼠模型中。此抗體的免疫抑制能力反應 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1226334 A7 B7 五、發明説明（5 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在其完全抑制T細胞依賴性抗原與體液性免疫反應（Foy. et al·，J. Exp. Med. ( 1 993) 1 7 8 :1 567-75 )。使用此抗體處 理幾個免疫疾病之老鼠模型，也顯現抑制情形，包括經由 細胞性免疫反應媒介的那些反應。以抗- g p 3 9處理而 顯現抑制情形的疾病模型包括膠原所引發的關節炎、實驗 性過敏性腦脊髓炎、狼瘡腎炎、移植排斥、和移植物對宿 主疾病等等。（Dune et al.，Science ( 1 993) 26 1:1 328-30; Berry, et al., unpublished; Gerritse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 995) 93:2499-504; Mohan et al., J. Immunol. ( 1 995) 1 5 4:1 470- 1 480; Larsen et al., Transplantation ( 1 996) 6 1:4-9: Hancock et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 996)93:1 3967-72; Parker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 995) 92:95 60-64; Durie, et al., J. Clin, Invest. ( 1 994) 94:1 333-3 8, Wallace, et al., unpublished)。C D 4 0 / g P 3 9在增幅細胞性免疫反應 的角色可能是直接的，透過刺激一組能表現C D 4 0的被 化T細胞，或間接透過引發細胞激素和表現能與T細胞接 受器CD 2 8和CTLA — 4結合的CD 8 0和CD 8 6 之重要共刺激細胞表面分子。此抑制者的抗發炎效果已經 由硏究氧誘發肺受傷的老鼠模型證實之。在活體內之發炎 作用的提議是經由活體外的結果證明，刺激血管內皮細胞 和單核球的C D 4 0可表現細胞附著分子、一氧化氮（ N〇）、基質金屬蛋白酶及前發炎細胞激素（kiener et al· ，J. Immunol· ( 1 995) 1 55:49 1 7-25; Malik et al., J. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇 X297公釐）-8 _ 1226334 A7 B7 五、發明説明（6 )
Immunol. ( 1 995) 1 56:3952-60; Hollenbaugh et al., J. Exp · Med· ( 1 995) 1 82: 33-40 )。 在猴子體內以抗人類g P 3 9單株抗體硏究顯現的生 物意義是在活體內抑制g P 3 9和C D 4 0間的交互作用 ，是靈長類的有效免疫抑制劑。抗- g P 3 9單株抗體已 被證明對T細胞依賴性抗原之抗體反應能有效抑制，也能 保護同種移植之排斥，這些結果與嚙齒類中所觀察到的相 似。 綜合以上之硏究顯示：能破壞g P 3 9和C D 4 0間 交互作用的試劑將有潛力作爲免疫抑制能和抗發炎試劑。 因此，需要一有效阻斷CD 4 0/g P 3 9交互作用的方 法，以提供免疫抑制或抗發炎作用。本發明之目的是要提 供一抗體可以阻斷g P 3 9和C D 4 0間的交互作用。 本發明的另一目的是提供一嵌合性抗體能有效阻斷 C D 4 0和g p 3 9間的交互作用。 本發明額外之目的是提供一人類化抗體能有效阻斷 C D 4 0和g p 3 9間的交互作用。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明更進一步之目的是一調節免疫反應的方法’經 由給與一抗體、嵌合性抗體、或本發明之人類化抗體。此 方法可能有用於治療任何自體免疫疾病，和皮膚或其它器 官移植。 本發明包含一新穎的抗體，更佳是一嵌合性抗一人類 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 9 _ 1226334 A7 B7 五、發明説明（11) 顯示抗OVA I gM抗體的分析結果。圖8 b顯不抗一 OVA IgG抗體的分析結果。 圖9顯示在靈長類中的抗—KLH抗體反應。圖9 a 顯示抗一 KLH I gM抗體的分析結果。圖9 b顯示抗 -K L Η I g G抗體的分析結果。 圖1 0顯示7E 1— G 1和7E 1— 0213抗體抑制 I g G抗體對S R B C反應能力的比較。 圖1 1顯示以7 E 1 - G 2 b抑制對S R B C抗體反 應的劑量反應情形。 圖1 2顯示本發明之嵌合性抗體的重鏈和輕鏈區域表 現載體圖。 圖1 3提供一表現載體的核苷酸序列’能表現本發明 之嵌合性抗體的重鏈。編碼人類抗體插入訊號序列啓始 Met ATG (核苷酸1000 — 1002)以粗體字 表示。核苷酸1057到142 2 (SEQ ID N 0 : 5 )劃線處提供一較佳編碼本發明抗體可變重鏈的核苷酸 序列。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1 4提供一表現載體的核苷酸序列，能表現本發明 之嵌合性抗體的輕鏈。編碼人類抗體插入訊號序列啓始 Met ATG (核苷酸1005 — 1007)以粗體字 表示。核苷酸1065到1388(SEQ ID N 0 ： 6)劃線處提供一較佳編碼本發明抗體可變輕鏈的核苷酸 序歹U。 圖1 5顯示排列比對老鼠抗一 C D 4 0可變區和一人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ ^ 1226334 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12) 類模板序列。老鼠抗- C D 4 0重鏈和輕鏈可變區的胺基 酸序列被用來鑑定同質的人類種系（germline )序列。 C D R s (劃線處）的殘基數與定義以k a b a t e t a 1 ·爲基礎 (kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest (5th Ed), Washington DC: United Stated Department of Health and Human Services; Kabat, E.A·, et al.，（ 1 977 )，J. Biol. Chem. 252:6609-66 1 6)。序 列中相異處以直線表示，而在結合表現資料庫中之結構位 置以星號做記號。 圖1 6顯示在固定抗原上不同的人類化抗一 C D 4 0 的力價結果。從每個資料庫選出不同的細菌表現嵌合性抗 一 CD40 F a b描述其圖示如下：嵌合性（實心圓圈 )，HuI — 19C11 (空心圓圈），Hun — c w 4 3 (空心正方形），H u m — 2 B 8 (實心三角形 )’（實心正方形）表示無關係的F a b是來自1 5毫升 細菌培養液週邊空間所釋放之物質並連續稀釋後，與固定 在微力價板上的C D 4 0 - I g抗原作用。抗體結合的定 量分析如下所述。 圖1 7證明抗體親和力關係於抑制可溶性g p 3 9與 C D 4 0 — I g結合。g p 3 9是c D 4〇接受器的配位 體’將g P 3 9捕捉在微力價板上。然後將2微克/毫升 C D 4 0〜I g與不同量的已純化嵌合性（實心圓圈）、 Hun— cw43 (空心正方形）、Hum— 2B8 (實 心三角形）、Hun/m—2B12(空心圓圈）及無關 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-15- 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（13 ) 係（實心正方形）F a B —起在微力價板上作用。 C D 4 0 - I g與g P 3 9結合的定量分析如下所述。 圖1 8顯示在不同活性之老鼠架構剩餘數之定量分析 。從發揮最大效用的資料庫H u I ( A )及架構/ HCDR3資料庫Hun (B)選出的最具活性之不同抗 - C D 4 0的可變區皆鑑定其在資料庫之骨架位置的胺基 搬序列。每個獨特之不同物的歸類仍以其在8個架構資料 庫位置之全部老鼠剩餘量之數目爲基礎。H u I資料庫及 H u Π資料庫分別有3 4及1 4個選殖株被定序，其中分 別有2 4及1 0個獨特的不同選殖株。實線代表選自同一 數目隨機挑選之不同物的預期序列分布。 發明的詳細說明 本文發明者已發展出具有免疫抑制特性的嵌合性和人 類化抗一人類C D 4 0抗體。此種抗一人類C D 4 0抗體 很明顯可應用於治療上。本文發明者也已發展一非常相配 的抗一老鼠C D 4 0 m A b (非常相配於抗一人類 CD40 mAb)可使用於硏究抗—CD40 m A b 在一些老鼠模型治療免疫和發炎性疾病之效用。實際上 CD 4 0是一訊息分子，因此發展抗一 CD 4 0抗體頗爲 複雜。能與此抗原結合之抗體的歸類基礎是具有刺激 CD40訊息能力及阻斷CD40/gp 3 9交互作用能 力者。 申請者的抗一人類CD40 mAb可阻斷CD40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 x 297公釐）-16 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 許, 1226334 A7 B7 五、發明説明（14) /g P 3 9交互作用是挑選自一群廣泛的抗一 C D 4 0 m A b。標識爲2 · 2 2 0的抗體是嵌合性及人類化的。 嵌合性〃抗體包含一輕鏈及一重鏈；輕鏈由輕鏈-可變 區及一不變區所組成；重鏈由重鏈-可變區及-不變區所 組成。嵌合性抗體所含的可變區來自一種類’而不變區來 自另一種類（譬如將老鼠可變區結合人類不變區）（參考 U.S. Patents 4，816，397 及 4 ’ 816，567) 。每一輕鏈可變區（VL)及重鏈可變區（VH)所構成 之 ''骨架〃區域被3個稱爲 ''互補決定區域〃或vx C D R s 〃的高氷可變區所打斷。''人類化〃抗體包含人 類抗體骨架區域和結合來自提供者老鼠或大鼠免疫球蛋白 的 C D R s 部分。（參考 U.S. Patent 5，530，101)。本發明範圍包括含有衍生自本文 中所揭示之老鼠可變區鏈之C D R s的人類化抗體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 最直接人類化一個抗體的方法就是從提供者m A b的 C D R s 移植到人類骨架上（Jones, P.T.，et al.，（1 998) Nature 32 1:522-525 )。然而，有一些骨架殘基是支持 C D R結構，而且接觸抗原之移植的老鼠C D R s到人類 骨架模板上，可能降低人類化後之m A b的結合活性（ Foote, J·，et al.，（1 992) J. Mol. Biol. 224:487-499 )。要 評估對抗體親和力之特殊骨架殘基的可能分布存在2個問 題。第1，要預測一特殊m A b能提供維持親和力及專一 性之骨架殘基之重要角色是困難的。第2，骨架位置與親 代m A b和人類模板不同，因此很難預測衍生自老鼠親代 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 17 _ '' 1226334 A7 B7 五、發明説明（15) 或人類模板的胺基酸是否能產生更有活性的m A b。因此 ，完全依賴結構預測而人類化抗體的方法常常失敗。 先前技藝包含描述常用抗體工程策略的文中曾提出， 人類化之後很難維持抗體的結合活性（Rosok，M.〗.，et al.， ( 1 996) J. Biol. Chem. 27 1:226 1 1 -226 1 8 )。親代m A b 和 人類模板胺基酸之間的不同有潛力之重要骨架殘基可使用 單一步驟將之特性化，經由合成及表現含有全部可能組合 的親代及骨架位置上有問題之人類模板胺基酸於組合性的 抗體資料庫上，然後經由篩選來鑑定所展現之不同的合適 骨架結構，之後以D N A序列分析合適的骨架結構。通常 序列分析許多活性選殖株後顯示出重要骨架位置需要表現 一特別的胺基酸。反觀，在活性選殖株中表現相當頻率的 老鼠或人類胺基酸在資料庫骨架位置的通常是功能比較不 重要的骨架位置。如此人類化版本的抗體仍保有親代 m A b結合活性者可快速以功能性結合作用鑑定之。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 抗體人類化及親和力成熟化的方法常以謹慎的步驟執 行（在前之 Rosok ( 1 996); Yelton，D.E·，et al·，（ 1 995) J. Immunol. 1 55:1 994-2004; Wu，H·，et al·，（ 1 998) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042; Baca, M., et al.,( 1 997) J. Biol. Chem. 272:1 0678- 1 0684; Marks, J.D., et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010)。使用以下敘述的 改良式策略，許多老鼠m A b 2 · 2 2 0人類化版本所 展現的親和力相當於或比所產生的嵌合性F a b更好。 本發明中申請者的嵌合性抗- C D 4 0抗體於本文中 -18- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1226334 Α7 Β7 五、發明説明彳6 ) 名爲'、c h i 2 2 0 〃 。申請者的非常相配之抗一老鼠 CD40 mAb於本文中名爲''7E 1〃 。本發明中申 請者的人類化抗一 CD40抗體於本文中名爲>F4〃及 、、L 3 7 的同型 分分子 造的抗 chi Μ* ΤΤ rf-t 體及匕 。以c 體內及 C D 4 討論。 熟於此 簡 免疫反 • 17〃。 E1的兩個不同的同型異體被產 異體可使用於檢查抗一 C D 4 0 在治療免疫 一老鼠C D 2 2 0的性 們在免疫疾 h i 2 2 0 7 E 1在老 0 mAb 本文中所描 技藝之人士 要總括，申 應。同樣的 和發炎性疾病臨證前 40 mAb篩選基 質相配，以及此m A 病之老鼠模型的活體 和其親代老鼠m A b 鼠體內的硏究顯示， 是有潛力的免疫抑制 述之硏究所使用的標 生。這兩個7 E 1 m A b的F c部 模型的角色。所製 準是要與 b所產生的同型變 內活性也包含其中 2 2 2 0在猴子 這些抗- 劑，以下將更詳細 準技術皆已熟知於 請者的抗體在猴子體內顯示抑制體液性 ，7 E 1的2個同型變體非常相配於抗 請 先 閲 讀 背 之 注 意 ί 項 再 填 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一老鼠C D 4 0 m A b顯示免疫抑制活性於一些人類疾 病的臨證前模型中。綜合言之，這些發現指出 chi 220、F4和L3 · 17有用於治療自體免疫疾 病和移植的臨床應用。 以下的範例僅供舉例參考，且不限制本發明申請案中 所定義之申請範圍。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2】ΟΧ 297公釐） -19- 1226334 A7 B7 經濟部中央檬準局員工消費合作社印製 五、發明説明（17 ) 範例1 篩選老鼠抗一人類c D 4 0抗體 A ·分離和活體外特性描述 以人類C D 4 0聯合蛋白質爲免疫原，使用標準融合 瘤技術製造一方格可對抗人類C D 4 0的單株抗體。篩選 可與C D 4 0 +細胞株和聯合蛋白質結合的抗體。將分析g P 3 9和C D 4 0結合情形，以及透過C D 4 0刺激之功 能性分析做爲抗體選殖株的特性分析。然後將被篩選到的 抗體分析其在靈長類細胞之交叉反應力，以評估此抗體使 用於靈長類臨證前模型之適用度。 1 .免疫化及聯合 使用兩個聯合物來產生融合瘤以製造抗-人類 CD40 mAb s。將含有人類CD40細胞外區域聯 合到老鼠I g G 2 b抗體的樞紐、C Η 2及C Η 3區域所 形成（h C D 4 0 - m G 2 b )的重組體聯合物做爲免疫 原，對6 - 8週大雌性B A L B / c老鼠進行免疫化以產 生免疫淋巴細胞。 聯合物40 — 1方面，將3 0微克hCD4 ◦ — in G 2 b ί谷於佛朗德氏元全佐劑（complete Freund’s adjvant )成2 0 0微升的乳劑，初次在皮下3 - 4處對老 鼠進行免疫化。以類似方法於第2 1天將溶於佛朗德氏完 全佐劑的h C D 4 0 - m G 2 b對此動物追加，然後於第 3 7天經由靜脈內注射溶於P B S的3 0微克h C D 4 0 一 m G 2 b做爲最後前一聯合物免疫化。聯合物4 〇 - 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •Aw. IT·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20· 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（18) 方面的免疫化類似上述方法，除了以瑞比佐劑（尺-7 3 0，Ribi adjuvant )取代佛朗德氏佐劑。追加免疫化 於第2 1及第4 2天進行，最後前-聯合物追加於第5 8 天進行。 最後一次追加注射後3天，從脾臟及淋巴結收取白血 球並使用標準方法以3 : 1的比例與X 6 3 — A g 8 · 6 5 3老鼠骨髓瘤細胞融合（Kearney et al.，J. Immunol. ( 1 97 9) 1 23:1 548-50; Lane, J. Immunol, ( 1 9 8 5) 8 1 :223-28 )。將每個聯合物之細胞懸浮液播種到1 0個9 6 孔細胞培養板上，使其密度約每孔含1 7 0，0 0 0個細 胞（前一聯合）。 2 ·篩選及選殖 有兩種格式被使用於鑑定m A b s對天然人類 C D 4 0之專一性。全部凹孔內的細胞培養上淸液初步以 E L I S A爲基礎格式的方法篩選它們結合到C D 4 0 +、 被E B V轉形的人類B細胞株（1 A 2 - 2 C )的能力。 然後以E L I S A爲基礎格式的方法測試每個上淸液與純 化之重組聯合蛋白質h C D 4 0 — I g的反應力。 h C D 4 〇 — I g是由人類C D 4 0細胞外區域聯合到人 類I g G 1抗體的樞紐、c Η 2和C Η 3區域所組成。另 外以類似作法與一構築好不相關的人類I g聯合蛋白質 L e u 8 - h I g 進行測試（Hollenbaugh，et al·，EMBO 乙（ 1 992) li:4313_432 1 )。綜合細胞結合數據及與前一聯 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 21 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（19) 合蛋白質反應力之結果，確定對天然C D 4 0具專一性的 抗體約有2 0 0個主要凹孔。 所需要的抗一 CD 4 0 mAb要具有一重要的功能 特性是能夠完全阻斷C D 4 0與其配位體g P 3 9交互作 用的能力。因此，下一步的抗體篩選是要評估全部具 C D 4 0專一性之主要凹孔的上淸液，抑制可溶性的重組 老鼠C D 8 —人類g p 3 9聯合蛋白質s g p 3 9結合到 已用EL I SA爲基礎格式固定的hCD40— I g上的 能力。那些可以完全抑制此交互作用的凹孔，隨後以相同 格式測力價，以確立那個凹孔含有最高力價之抑制性抗體 。從這個分析中篩選出1 0個最強抑制力的主要凹孔進行 選殖。 選殖分泌合適抗體細胞需由2個步驟方法完成。來自 每個主要凹孔的細胞首先以1 0細胞/凹孔密度播種爲、、 小選殖株〃，之後經由一有限稀釋方法將此最高力價的 C D 4 0專一性 ''小選殖株〃凹孔形成選殖株。 3 .進一步的特性描述 使用6種分析格式進一步描述此抗體的特性，這些分 析法是抑制s g p 3 9結合到人類B細胞，經由 s g p 3 9加上抗I g Μ所引發抑制B細胞的增殖，抑制 經由被活化之Τ細胞所引起的Β細胞活體外抗體之合成， 與抗I g Μ直接共刺激Β細胞，與可交叉聯結之抗一 ^輕 鏈抗體及抗I g Μ共刺激Β細胞，以及與抗I g μ、二級 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -22- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} ♦ · 1226334 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 抗c D 4 0 m A b ( G 2 8 - 5 )共刺激B細胞。此 m A b已知擁有強力的共刺激力可完全阻斷◦ d 4 0 / gp39的交互作用。 此分析法可篩選出4種m A b s : 1 · 6 6 ( 1 S G 2 b ) . 2.36(IgG2a)、2.174( I g G 1 )和2 · 2 2 0 ( I g G 2 a )。繼續利用各種 測試來分析m A b s的特色。在一實驗中將來自人類B細 胞株的R a j i細胞與2或2 0微克/毫升之不同抗一 CD40 mAb培養作用，之後再加入未稀釋的C〇S 細胞含有mCD80 — gp 3 9聯合蛋白質（s gp 3 9 )之上淸液做第二次的培養作用。要偵測已經合的 s g p 3 9可將此細胞進一步與F I T C標識之抗一 m C D 8 m A b作用後，以螢光活化細胞分類掃描（ F A C S。a n )來分析得知。抑制力的百分比可經由將樣 品第一次在沒有抗體作用下的平均螢光値除以樣品在有抗 體作用下的平均螢光値（圖1 )。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —--------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
如圖1所顯示，此4個m A b s皆有能力完全抑制 s g p 3 9聯合蛋白質結合到表現高量C D 4 0的人類B 細胞株上，雖然在2 . 1 7 4的組別需相對較高濃度的抗 體才能完全阻斷。使用人類扁桃腺B細胞也得到類似數據 。這些數據可經由兩種分析法平行比較。第一項是顯示每 個m A b皆可完全阻斷s g p 3 9爲介質之共刺激人類扁 桃腺B細胞。第二項是每個m A b可在活體外之T細胞依 賴性B細胞抗體合成分析法中顯示抑制I g G和I g Μ的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇><297公釐）-23 - 1226334 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（21 ) 製造。 4個抗體中有3個在抗- I g Μ存在下對共刺激B細 胞的增殖顯示有限能力。M A b 2 · 2 2 0有較一致的能 力去引發微弱的共刺激活性。加入一抗- zc輕鏈抗體使用 於交叉聯結抗C D 4 0 m A b s時，2 · 3 6可得到顯 著的共刺激活性，然而其它3個抗體的此活性則不受影響 。當G28 — 5與此4個新抗—CD40 mAb s配對 結合時顯示其共刺激能力是被不同的調節。M A b s 1 · 6 6和2 · 1 7 4，特別是2 · 1 7 4能增強 G 2 8 — 5共刺激能力，而2 · 2 2 0和2 · 3 6則是抑 制它。 下列篩選的基礎是在人類活體外系統的演變，此4個 抗CD40 mAb s進一步檢試其在非人類之靈長類硏 究的活體內演變之適合度。此分析的兩個關鍵點爲每個抗 體在活體外結合到靈長類B細胞及抑制它的相對能力，以 及T細胞依賴性B細胞抗體合成。全部4個m A b s可與 狐猴（Macaca fascicularis) B細胞交叉作用，2 · 3 6和 2 · 2 2 0比2 · 1 7 4和1 · 6 6有較高程度的結合。 m A b s 2 . 1 7 4和1 · 6 6出現較低之結合力並非 其特殊之同型因素所造成，因爲已證實其它與抗-CD40 mAb s相配之同型抗體（G28 — 5和 2 · 118)具有2 · 36和2 · 22〇相當之結合力。 這些結果與在人類B細胞中所觀察到的有所違悖’因爲在 人類B細胞中每個m A b s被證實具類似之結合力。至於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐）-24 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 許· 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22) 此4個m A b s在猴子B細胞中抑制抗體合成的能力與其 結合力一致。 B .活體內特性描述 有兩個硏究於非人類之靈長類中進行，皆是使用老鼠 的抗一人類CD40 mAb s來評估抗一 CD40做爲 免疫抑制劑之合適性，以及篩選適當的抗體做進一步的硏 發。首先比較被篩選的4個抗一 CD4 0 mAb s在活 體內之淸除及急性毒性。這些結果被使用於篩選2 . 3 6 和2 · 2 2 0兩個抗體，然後於第二個硏究中測試，而第 二個硏究設計是要評估對T依賴性抗原及急性毒性之抗體 反應抑制制力之功效。 以2 · 3 6和2 . 2 2 0硏究靈長類功效 以先前的發現爲基礎，評估m A b s 2 · 3 6和 2 · 2 2 0以靜脈內注射給與狐猴之後，它們抑制T依賴 性抗體反應之能力。此硏究分爲3個階段（圖2 )。在階 段1，4組包括一隻或兩隻公狐猴及兩隻母狐猴，每隻狐 猴在第1天從靜脈內注射綿羊紅血球細胞（S R B C s ) 免疫化，然後再於第1、3和5天給與2 0毫克/公斤的 2 · 3 6 ，2 · 2 2〇，1 · 1〇6 (正對照組，即 I g G 1老鼠抗一人類g ρ 3 9 )、或L 6 (負對照組， 即I g G 2 a老鼠抗一人類腫瘤抗原）。檢測對S R B C 免疫原的I g Μ和I g G力價，實驗和對照組物品的血淸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23) 濃度，抗-實驗或對照組物品之抗體的存在，血淸免疫球 蛋白濃度，週邊血液白血球計數，以及週邊血液白血球的 不同次群組的出現頻率。在第2階段，將對照及實驗組物 品淸除後，以S R B C s和二級抗原K L Η免疫這些動物 ，做爲評估免疫耐受度的引發及所觀察之免疫抑制性的轉 換。在第3階段，將被篩選的動物再免疫化一次，以測定 在額外給與S R B C s之後，最初的抑制抗—S R B C抗 體反應是否恢復，並且評估對K L Η的二級抗體反應。 有一實驗結果顯示M A b 2 . 2 2 0顯著抑制對 S R B C s的一級抗體反應（圖3 )。於第1階段的第1 、3和5天以20毫克/公斤的任一mAb 1.106 、L6、2 · 36或2 · 220處理猴子。猴子以 S R B C免疫化進行於第1、2及3階段的第1天。圖 3 a顯示分析I g Μ抗一 S R B C抗體之血淸樣品結果； 圖3 b顯示分析I g G抗一 S R B C抗體之血淸樣品結果 。每組（n = 3或4)數據以幾何平均抗一 SRB C力價 來表不。 一級反應的高峰中I g Μ和I g G分別被抑制8 5 % 和9 8 %。當血淸中的m A b 2 . 2 2 0淸除到可偵測 的程度以下時，對S R B C s二級反應的高峰中I g Μ和 I g G仍分別被抑制7 9 %和5 6 %，這是與階段1的負 對照組反應比較而得。而與正對照組m A b 1.106 比較時，則觀察到對S R B C s有強烈的二級抗體反應。 對S R B C s的三級反應沒被抑制，表示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐）_ 26 - ΜΨ—丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂、_ 1226334 A7 B7 五、發明説明（24) m A b 2 · 220可引發一延長的免疫抑制力，但不是 免疫耐受力。以K L Η免疫化所有動物可引發一級和二級 抗K L Η反應，因此認爲此免疫抑制力是可復原的。階段 2並不包括以2 · 3 6處理動物，因爲在階段1的硏究 2 · 3 6已沒什麼有意義的抑制力。 血淸濃度的平均高峰發生於最後一劑量之後，分別是 2 · 220爲744微克/毫升和2 . 36爲405微克 /毫升。當血淸中mAb s 2 · 3 6於第1 5天已淸除 至可偵測的程度以下時，m A b s 2 2 0 —直到第2 9 天才淸除。mAb s 2 · 36和2 . 220皆是免疫原 性的。 在任何動物沒有觀察到藥物相關的臨床現象，譬如體 重改變或食物攝取改變，或改變血淸I g濃度或血液學。 唯一與藥物相關之觀察發現爲，使用mAb s 2.36 和2 · 2 2 0會分別暫時降低週邊B細胞7 0 %和4 3 % 。處理後2 - 3週才可復原B細胞至正常範圍。 綜合言之，m A b 2 · 2 2 0可顯著抑制對 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) SRBCs的抗體反應而2·36不行。雖然 mAb 2 · 2 0可引發延長的抗原專一性免疫抑制力， 但它是可復原的。基於這些發現，mAb 2.220是 可選做進一步的硏發。 範例2 嵌合性抗體ch i 220的產生 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明説明（26) 最相配於老鼠2 · 2 2 0之訊號序列插入到人類抗體中。 這些P C R產物插入到含有編碼人類^不變區域或人類 r 1不變區域序列的載體中，以分別產生完整的輕鏈或重 鏈。此載體也含有合適之抗藥性基因’以產生及增殖穩定 表現之蛋白質。最初硏究蛋白質特性是經由暫時表現之 C〇S細胞中所製造的蛋白質來硏究，隨後經由蛋白質A 純化。 舉例而言，製造嵌合性抗體的細胞株之產生是以分開 表現此嵌合性抗體重鏈和輕鏈之載體經由共轉染到 C Η〇D G 4 4細胞中，並使用高複印數目的電穿透法來 促進共整合（U.S. Patent 4，9 5 6，2 8 8 )。 c h i 2 2 0的重鏈和輕鏈分別選殖到P D 1 7和 pD 1 6表現載體。這兩個載體衍生自InVitrogen質體 p cDNA3，且含有以下特色（圖12) : (1) p c DNA 3的新黴素抗藥基因被老鼠二氫葉酸鹽還原酶 基因（D H F R )取代，並受控制於無增強子S V 4 0啓 動子之下（也稱爲 ''減弱之D H F R 〃 ；注意只有啓動子 被減弱，而不是DHF R酵素，此無增強子之啓動子仍含 有S V 4 0複製之啓源，所以這些載體能用於暫時性之 C〇S轉染）；（2)有興趣的基因是從CMV啓動子表 現，且聚腺苷酸訊號是來自牛生長激素基因；（3 )有興 趣基因的表現匣兩側是轉錄終結序列（例如：5 /是啓動 子和是聚A位置）；（4)此載體含有兩個可區分之 限制酶位置之多聯結子，位於3 /端啓動子處是爲了選殖 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1r 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -29- 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（27) 有興趣的基因，位於5 >端啓動子是爲了利於轉染時之直 線化；（5 )安比西林抗藥基因和C ο < E 1啓源有用於 在大腸桿菌中增殖質體。 所使用的重鏈和輕鏈基因是由基因組構築，且經由下 列的修飾：（1 )重鏈訊號胜肽、可變區域和C Η 1區域 的編碼序列是連續的（譬如：不含內插序列）；（2 )輕 鏈訊號胜肽和可變區域的編碼序列是連續的。 其它的表現載體已知於熟知此技藝之人士，以及能表 現本發明之嵌合性抗體者皆計畫於本發明中。能表現本發 明之嵌合性抗體重鏈的表現載體之有用核苷酸序列顯示於 圖1 3 ;能表現本發明之嵌合性抗體輕鏈的表現載體之有 用核苷酸序列顯示於圖1 4。 此嵌合性抗體（'' c h i 2 2 0 〃 ）的重鏈和輕鏈完 整胺基酸序列，包括可變區域和不變區域如下所示（粗體 字之胺基酸表示可變區域之重鏈和輕鏈）； 重鏈序列（S E Q ID N 0 ： 3 ) QIQLVQSGPE LKKPGETVRI SCKASGYAFT TTGMQWVQEM PGKGLKWIGW 50 工NTHSGVPKY VEDFKGRFAF SLETSANTAY LQISNLKNED TATYFCVRSG 100 NGNYDLAYFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 150 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 200 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 250 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 300 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 35〇 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 400 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 450 GK 452輕鏈序列（S E Q ID N 0 · 4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i—訂· 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) Μ規格（210X297公釐）-30 - 1226334 A7 B7 五、發明説明（28) DIVLTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY 50 ASHSISGIPS RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGIYYCQH GHSFPWTFGG 10〇 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 數個2 2 0人類化型式被產生，此製法包含鑑別同質 性最接近v Η和V L區域之老鼠和人類種系序列。此老鼠 種系序列被使用於鑑別因親和力成熟之過程中所產生之體 細胞突變的可能位置。此人類序列被使用做爲模板和已知 或猜測對結合專一性很重要的序列可用於置換人類ν Η和 V L序列的區域。這些序列的結構被模擬化，並做爲同質 性最接近之蛋白質的模板並解決其結晶結構。使用P C R 直接突變作用產生編碼人類化型式之質體，並經由暫時表 現於C 0 S細胞來用於製造抗體。本發明之嵌合性和人類 化抗體之活體外分析結果描述於圖5。圖5 a顯示結合分 析的結果，測試c h i 2 2 0和h 2 2 0 v 3以 EL I SA爲基礎之分析時結合到h CD 4 0 — mG 2 b 之能力。免疫子一 2盤內的凹孔以溶於P B S濃度爲1 〇 毫微克/毫升的h C D 4 0 - mG 2 b塗層2小時。然後 加入樣子稀釋劑（Genotic Systems )阻斷凹孔，並加入所 指定濃度之抗體。作用1小時後，淸洗凹孔，使用已接合 氧化酶之山羊抗一人類I g G抗體偵測抗體的存在。 H220V3是人類化型式的mA2 · 220。重複兩次 之凹孔平均爲數値，且錯誤線條代表標準偏差。 圖5 b _示測試抑制s g P 3 9爲介質與抗一人類 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 31 _ 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（29) C D 4 0 m A b s共刺激人類B細胞之分析結果。放置 人類扁桃腺B細胞（5 0，〇 〇 〇 /凹孔）與s g p 3 9 聯合蛋白質作用，2 0微克/毫升兔子抗人類I gM塗層 免疫小珠和所指示之抗C D 4 0 m A b s濃度，或只控 制於9 6凹孔盤之培養液。開始培養7 2小時後，全部凹 孔加入1微居里/凹孔（u C i /w e 1 1 ) 〔 3 Η〕胸腺 核苷，然後再培養1 8小時。之後收取細胞並以閃爍計數 器測量〔3 Η〕胸腺核脊倂入的量。 基於活體外分析之結果（圖5 a和5 b顯示嵌合性和 人類化抗體能有效結合C D 4 0及抑制B細胞刺激），此 嵌合性抗體被選擇做進一步硏究。 範例3 c h i 2 2 0之功效 A ·嵌合性m A b 2 · 2 2 0 :在非人類之靈長類中之單 一劑量功效硏究 c h i 2 2 0在孤猴體內評估其抑制對T細胞依賴性 抗原一級和二級體液性免疫反應。在一硏究中，每組的4 隻猴子於接受單一靜脈內大藥九劑量之1 〇、4 0或 1 0 0毫克/公斤c h i 2 2 0或無菌磷酸鹽緩衝生理食 鹽水（P B S )控制組前，以綿羊紅血球細胞（ S R B C s )免疫化，且立刻給與一個二級免疫化之卵白 蛋白。全部以3個不同濃度c h i 2 2 0處理之猴子，皆 觀察到實質抑制對抗S R B C s之一級體液性免疫反應， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) «L--訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明説明（3〇) 證明c h i 2 2 0在靈長內的功效。全部以c h i 2 2 0 處理之猴子，皆觀察到劑量依賴型暫寺耗盡周邊B細胞之 情形，而恢復時間也是劑量依賴型。在兩最高劑量中’觀 察到周邊血液T細胞之組平均絕對數有暫時輕微減少。暫 時最少降低血淸I g Μ濃度之情形已觀察到，且無藥物相 關改變在血淸I g G或I g Α濃度上。 爲評估免疫耐受度之引發性及免疫抑制活性之回復力 ，全部猴子以〇VA、 SRBCs和一新抗原、KLH於 第1 4 9天免疫化，當每組血淸c h i 2 2 0濃度低於 1 0 0毫克/公斤時認爲是具免疫抑性的（〜1 0微克/ 毫升），且其周邊血液B細胞數目已恢復前劑量濃度。最 低劑量濃度之抗- S RB C反應，通常與對照組猴子之一 級抗一 SRB C抗體反應比較。然而，對SRB C s的抗 體反應在處理過兩個較高劑量濃度之猴子中仍部分或實質 抑制。 爲進一步探索劑量依賴型之免疫抑制和B細胞耗盡情 形，第二個硏究進行如下，額外的猴子（4 /組）以 SRBCs免疫化，然後給與單一劑量之〇·1或1·0 毫克/公斤之c h i 2 2 0或PB S。兩劑量濃度皆觀察 到對S R B C s之次適宜免疫抑制之抗體反應。適度耗盡 周邊血液B細胞之情形已證實於第8天接受1 . 0毫克/ 公斤chi 220的猴子，而第29天回復。在0 · 1毫 克/公斤方面，觀察到周邊血液B細胞減少平均値和百分 比，但數値並未在正常範圍之B細胞百分比以外。周邊血 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-· 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（31 ) 液B細胞之絕對値限制範圍尙未建立。周邊血液T細胞數 之暫時最小降低和輕微減少活體內T細胞增殖之情形皆觀 察於接受1毫克/公斤ch i 2 20之猴子中。最後’並 尙無證明補體之活化或藥物相關之改變在血淸I L - 6或 T N F α中。在活體內的T細胞活化、補體活化、和血淸 細胞激素濃度在以1 0、4 0或1 0 0毫克/公斤 c h i 2 2 0處理的猴子內並沒有評估。 在兩硏究中，測試物體給與c h i 2 2 0之血液循環 濃度之後檢驗血淸樣本，並評估對抗測試物體之抗體形成 。藥物動力學分析指出c h i 2 2 0的平均血淸濃度高峰 (C m a x )與劑量之增加並沒有成比例之形式增加，當給 與劑量增加時c h i 2 2 0的半衰期變得較長。當給與 0 · 1、1或10毫克/公斤時ch i 220是具免疫原 性的。當血液循環濃度高於1 0微克/毫升時，出現 c h i 2 2 0能抑制直接對抗它的抗體反應。 1 .實驗程序 以上所提之最初硏究中，狐猴被分配成四組，每組由 兩雄猴及兩隻雌猴組成。全部猴子先於c h i 2 2 0或對 照組物品前在第2 8天給與〇V A ( 5毫克/公斤肌肉內 和1 0毫克/公斤皮下）免疫化。在第1天’全剖猴子以 S R B C s ( 1 · 7毫升/公斤的1 0 %懸浮液，靜脈內 )免疫化，並在接受單一靜脈內大藥九劑量之1〇、40 或100毫克/公斤ch i 220或無菌PBS對照組之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-34 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 鬌· 1Γ· 1226334 A7 B7 _ 一· —— —— - -- "' _··Μ ·_—_ ' ............... ............... " 五、發明説明I 32 ) 前，馬上以OVA ( 5毫克/公斤肌肉內和1 〇毫克/公 斤皮下）給與二級免疫化。在第1 4 9天’當血淸 c h i 2 2 0濃度下降低於假設之免疫抑制範圍（〜1 〇 微克/毫升）且全部組之周邊血液B細胞已回復到前劑量 濃度後，以OVA、SRBCs和KLH(l〇毫克/動 物，肌肉內）免疫化全部猴子。以K L Η免疫化的目的是 要顯示全剖猴子在處理c h i 2 2 0之後能對新抗原產生 免疫反應。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了證明關於免疫抑制力和周邊B細胞耗盡之較好劑 量反應，在第二個硏究中（兩隻/性別/組）額外的猴子 以SRBCs免疫，並於第1天給與單一劑量之0 · 1或 1 · 0毫克/公斤的c h i 2 2 0或對照組P B S。在兩 硏究期間於選定時間點偵測血液學參數和周邊白血球次族 群。猴子接受10、40或100毫克/公斤 c h 1 2 2 0時偵測血淸化學參數，但在0 . 1和1毫克 /公斤劑量濃度時不偵測，因爲在較高劑量時未觀察到藥 物相關之調查結果。此外也測量I g Μ、 I g G、 IgA 和c h i 2 2 0在血淸的濃度。爲評估功效，來自給與免 疫原前和其後每週之合適血淸樣品決定其對抗S R B C和 OVA免疫原所形成之專一性IgM和IgG抗體。在第 1天給與測試物品之前及其後每週，決定接受 c h 1 2 2 0之猴子對抗測試物品所形成之專一性I g Μ 和I g G抗體。使用幾何平均力價比較各組間的抗體反應 。此外，測量全部溶血性補體活性（C Η 5 Q )和C 4 d片 ^^張尺度適用中國國家標準（匸奶）人4規格（210'乂297公釐）~「35_ 一 1226334 A7 B7 五、發明説明（33) 斷濃度，並決定接受0 · 1或1毫克/公斤Ch i 220 之猴子在給與C h 1 2 2 0之後選定時間點的丁 N F - α 和I L - 6濃度。在活體內周邊血液Τ細胞活化也於第 1 7和3 1天接受0 · 1和1毫克/公斤c h i 2 20之 猴子以刀豆素（concanavalmA )刺激後，評估 c h i 2 2 0在T細胞對促細胞分裂劑反應之影響。最後 ，全部猴子每天觀察其毒性之臨床症狀、每週之體重記錄 、和偵測每日之食物攝取。 在第1天猴子在接受載體或10、4 0或1〇〇毫克 /公斤chi 220 (圖6a)，或0 · 1或1毫克/公 斤〇]1122〇（圖613)之前，以3尺8(：免疫。以 EL I SA分析血淸樣品中的I gM抗SRBC抗體。每 組（n = 2〔100毫克/公斤於第15天後〕或4)以 幾何平均抗一 SRBC抗體終點力價（EPT)表示其數 據，此處之E P T相當於大於兩倍平均盤背景吸收値之最 大稀釋血淸値的倒數。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 ·結果 a·抗一SRBC抗體反應 當給與猴子10、 40或100毫克/公斤時， c h i 2 2 0能有效實質抑制對抗—S R B C s的一級抗 體反應。對照組一級I g Μ抗一 S R B C抗體反應的高峰 是在第8天，而以10、 40和100毫克/公斤 c h 1 2 2 0處理的猴子與對照組比較時，平均一級 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 1226334 A7 B7 五、發明説明（34) I g Μ抗一 S R B C抗體反應被抑制近9 2 - 9 4 % (圖 6a)。以10、40或100毫克/公斤劑量濃度之組 平均I gM抗一 SRB C抗體反應經過到第8 5天仍未變 成正性結果。對照組一級I g G抗一 S R B C抗體反應的 高峰是在第15天，而接受10、 40和100毫克/公 斤的猴子與對照組比較時，平均一級I g G抗一 S R B C 抗體反應分別被抑制9 8 %、9 9 %和8 5 % (圖7 a ) 。在1 0 0毫克/公斤組中有較高劑量前抗一 S R B C抗 體力價主要原因可能是缺乏劑量依賴性免疫抑制力。大致 而言，以1 0或100毫克/公斤ch i 220處理的猴 子經過8 5天仍不會引起一級I gG抗一 SRBC抗體反 應。然而，有兩隻以4 0毫克/公斤c h i 2 2 0處理的 猴子對S R B C s有延遲之一級I g G抗體反應（與對照 組反應大小相比較）在第3 6天，第5 1天達高峰。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在第1 4 9天，當c h i 2 2 〇血淸濃度下降低於假 設之免疫抑制濃度（〜1 0微克/毫升）及全部組的周邊 血液B細胞回復到劑量前濃度後，以S R B C s做第二次 免疫化。如預期般，對照組猴子引起對S R B C s強烈的 二級抗體反應。以1 0毫克/公斤c h i 2 2 0處理猴子 時與對照組比較可引起對S R B C s —級I g Μ和I g G 抗體反應。然而，4 0毫克/公斤劑量濃度仍部分抑制對 S RB C s的抗體反應，以及1 〇 〇毫克/公斤劑量是實 質抑制。雖然以4 0毫克/公斤c h i 2 2 0處理的兩隻 猴子先前引起微弱對S R B C s —級抗體反應，並發展出 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）_ 37 · 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（35) I g Μ和I g G抗S R B C抗體力價特性之二級抗體反應 ，而此組其它兩隻猴子和其餘以1 0 0毫克/公斤 c h i 2 2 0處理的猴子，與對照組猴子之平均一級抗一 S R B C抗體反應比較時仍達約9 0 %被抑制。 給與0 · 1或1 · 0毫克/公斤ch i 220之後觀 察對S R B C s的次合適免疫抑制之抗體反應（圖6 b和 7 b )。然而全部以c h i 2 2 0處理的猴子能引起對 SRB C s抗原之正性I gM抗體反應，以1毫克/公斤 c h i 2 2 0處理之猴子與對照組反應平均高峰比較時， 全盤之平均高峰I gM抗SRB C抗體反應被抑制約5 6 %。以0 · 1毫克/公斤ch i 220處理的猴子沒有觀 察到抑制I g Μ抗一 S R B C反應。對照組猴子的平均 I gM抗一 SRBC抗體反應高峰在第1 5天，而接受 0 · 1和1 · 0毫克/公斤ch i 220的猴子在第8天 。整體上以0 · 1和1 · 0毫克7公斤ch i 220處理 的猴子平均高峰I g G抗一 S R B C抗體反應分別被抑制 5 6 %和4 2 %。對照組及以1毫克/公斤c h i 2 2 0 處理之猴子的平均IgG抗一SRBC抗體反應高峰在第 15天，而接受0 · 1毫克/公斤ch i 220的猴子在 第8天。 b.抗一OVA抗體反應 猴子於第一天以靜脈內給與劑量1 0，4 0或1 0〇 毫克/公斤chi 220。此外，全部猴子於第28、1 I--------ΛΨII (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I--訂-· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- 1226334 Α7 Β7 五、發明説明（36) 和1 4 9左以〇V A免疫化。血淸樣本被分析I g M (圖 8 a )或I g G (圖8 b )抗〇 V A抗體情形。每組（n =2〔 1 〇 〇毫克/公斤於第1 5天後〕或4)以幾何平 均抗一〇V A終點力價（E P T )表示其數據，此處之 E P T相當於大於兩倍平均盤背景吸收値之最大稀釋血淸 値之倒數。 接受10、40或100毫克/公斤chi 220之 猴子在硏究期間每週偵測其對抗Ο V A之專一性I g M和 I g G抗體之形成。全部猴子的一級和二級抗〜〇v A抗 體反應變異很高且通常是微弱的（圖8)。第一天接受 c h i 2 2 0的猴子比對照組猴子有較大的抗一〇v a抗 體力價。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I.-------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在第1 4 9天，給與猴子第三次OVA免疫化。全部 猴子於免疫後7天內引起對OVA之正性IgG抗體反應 。對照組和以1 0毫克/公斤c h i 2 2 0處理之猴子有 二級抗體反應之抗體力價特性’而以4 0或1 0 〇毫克/ 公斤c h i 2 2 0處理的猴子發展的抗體力價較具二級抗 體反應的特性。 c ·抗—KLH抗體反應 猴子於第一天以靜脈內給與劑量1 〇，4 0或1 0 0 毫克/公斤ch i 220。此外，全部猴子於第149天 以KLH免疫化。分析血淸樣本抗一KLH抗體之IgM (圖9 a )或I g G (圖9 b )的情形。每組（η = 2 〔 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39 - 1226334 A7 B7 五、發明説明（37) 1 0 0毫克/公斤於第1 5天後〕或4 )以幾何平均抗一 KLH終點力價（EPT)表示其數據，此處之EPTs 才目#於大於兩倍平均盤背景吸收値之最大稀釋血淸値之倒 數。 在第1 4 9天，當Ch 1 2 2 0血淸濃度下降低於假 設之免疫抑制濃度（〜1 〇微克/毫升）及全部組的周邊 血液B細胞回復到劑量前濃度後，以κ L Η ( 1 〇毫克/ 動物’肌肉內）免疫化猴子。全部猴子引起對K L Η的正 性I g Μ和I g G抗體反應，證明對新抗原之反應能力不 受牽累（圖9 )。 d ·測試物品和抗-測試物品抗體反應之血淸濃度 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 給與c h i 2 2 0之後檢驗血淸樣本以決定測試物品 的循環濃度，並評估對抗此測試樣本之抗體形成。給與 1 0或4 0毫克/公斤劑量3分鐘後和給與1 〇 〇毫克/ 公斤劑量6小時後，出現c h i 2 2 0的平均高峰血淸濃 度（Cmax)。以1〇，40或100毫克/公斤 c h i 2 2〇處理之猴子的c h i 2 2 0 C m a x値分別 爲329，2429和2343微克/毫升。然而在40 和1 0 0毫克/公斤組的個別猴子有相當之C m a X差異變 動。以10，40或100毫克/公斤chi 220處理 之猴子的平均血淸c h i 2 2 0半衰期經評估分別約 1 1 4，1 7 3 和 3 1 5 小時。 給與c h i 2 2 0 3分鐘之後，出現相對於〇 · 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-4〇 - 1226334 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（38) 和1毫克/公斤劑量之平均C m a X値分別爲1 · 7 7和 3 3微克/毫升。在每一劑量濃度中所觀察之 c h i 2 2 0的血淸濃度沒有通性相關之差異。平均 A U C : n f値對〇 · 1和1毫克/公斤劑量分別是 1 5 · 5和8 4 7微克•小時/毫升。綜觀，當劑量給與 增加時此硏究假設c h i 2 2 0半衰期變得延遲。再者， c h i 2 2 0的C m a X增加與劑量增加不成比例。 雖然I g Μ抗一測試物品反應在接受1 〇，4 0或 1 0 0毫克/公斤c h i 2 2 0之猴子內是最小化或不存 在，而接受1 0毫克/公斤c h i 2 2 0的猴子可觀察到 專一性I g G抗一測試物品。接受1 〇毫克/公斤 c h i 2 2 0之猴子在第2 9天；其平均I g G抗一測試 物品抗體反應變成正性的，約1週後平均組c h i 2 2 0 血淸濃度降低到1 0微克/毫升以下，以及第3 6天和 4 3天的高峰在幾何平均力價爲1 2，6 2 7時。以1 0 毫克/公斤c h 1 2 2 0處理之猴子出現I g G抗一測試 物品抗體時也同時偵測到在耗盡之後B細胞數目增加。在 測量的最後一天（第1 4 9天），接受4 0或1 〇 0毫克 /公斤c h i 2 2 0之猴子仍不能引起對抗c h i 2 2 0 之正性抗體反應，雖然在第5 7天（4 0毫克/公斤組） 或第9 2天（1 0 0毫克/公斤組）組平均c h i 2 2 0 血淸濃度低於1 0微克/毫升。 給與0.1或1毫克/公斤（：]1丨2 2 0時是具免疫 原性的。在硏究期間的第1 5天，接受Ο · 1或1毫克/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）· 41 - — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
—1T 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（39) 公斤c h i 2 2 0的4隻猴子中有3隻有微弱正性I gM 抗一測試物品抗體反應。以1毫克/公斤c h i 2 2 0處 理的4隻猴子中有3隻在第2 2天有顯著之I gG抗一測 試物品抗體反應，高峰位在幾何平均終點力價爲 1 6，6 1 8時。綜觀，接受0 · 1毫克/公斤 c h i 2 2 0之猴子的幾何平均I g G抗一測試物品抗體 反應不是正性的，且只有1隻猴子有微弱之正性I g G抗 -測試物品抗體反應，高峰位在第2 2天之終點力價爲 2，4 3 0時。這些數據推測出c h i 2 2 0能對抗本身 之免疫抑制性抗體反應是在血淸濃度約大於1 〇微克/毫 升時。 範例4 人類化抗一CD40抗體F4和L3·17的產生 文獻中已有很多已知的方法被使用於m A b s的人類 化。以結構爲基礎的方法已證明較有用，但很多涉及結合 活性之骨架殘基所產生之複雜性則減少成功的速率。與其 用模擬預測最合適之骨架基礎，不如用以下所描述之抗體 資料庫方法，以篩選許多組合體來鑑定具活性的骨架構形 。突變作用配合篩選方法可分析很多變體且模擬活體內之 成熟方法（^¥16\^<1111]\^]：]^，厂0.，6{&1.，（1992)了· Biol. Chem. 267:1 6007- 1 60 1 0 )。密碼基礎之突變作用所構 築之資料庫可特性化專一殘基，且比隨機突變方法有效率 。譬如，產生錯誤之P C R不能使用於合成組合性骨架資 I---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）_ 42 - 1226334 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1 2 3 4〇) 料庫。再者，隨機突變作用產生大量更分歧之資料庫，且 很不幸運的絕大多數之突變並未增強m A b的結合活性。 因此，必須篩選大量的選殖株以鑑定出活性變體。 一名爲 ''導向篩選〃的策略已被使用來從噬菌體顯示 資料庫分離人類m A b s，此資料庫是使用老與m A b爲 模板以兩步驟完成的方法（Jespers, L.S.，et al., (1994) Bio/Techn〇l〇gy 1 2:899-903)。最近利用噬菌體顯示技術的導 向篩選有所改變，亦即使用一嵌合性F d片斷從一含有人 類L鏈及被移植之老鼠C D R 3的資料庫中篩選一 L鏈（ Rader, C., et al., ( 1 998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 89 10-89 1 5 )。隨後使用此最具活性之L鏈從含有它鼠 H C D R 3之人類Η鏈資料庫中篩選Η鏈。經由這些方法 分離出的m A b s是完整的人類的（Jespers如上）或大部 分是人類的（Rader，如上），但此方法的每一步驟中所產 生的大量變異性抗體，使得使用親和力加強方法成爲必需 的。 以下的材料和方法被使用於產生本發明之人類化抗-CD40 抗體 F4 和 L3 · 17。 —--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
II 1 ·嵌合性抗一 C D 4 0之構築 2 合成及純化編碼抗一 C D 4 0老鼠m A b 2 · 2 2〇 的V η和V t剖分一致之寡核苷酸序列（6 9 - 7 5鹽基長 3 度）。經由將每一部分一致之寡核苷酸2 5微微莫耳濃度 與p f u DNA聚合酶（Stratagene)組合成含有5個循 4 度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210父297公釐1 ~-43- 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（41 ) 環的5 0微升P C R反應：9 4 °C變性2 0秒，5 0 °C連 結3 0秒，跳到7 2 °C超過1分鐘，並維持在7 2 °C 3 0 秒。隨後將連結溫度增加到5 5 °C後進行2 5個循環。使 用相同的程式，將反向引子和生物素鍵結之正向引子進一 步增幅1微升的聯合產物於1 〇 〇微升之P C R反應中。 經由洋菜膠體電泳、電分離此產物，並經由T 4聚核苷酸 激酶（Boehringer Mannheim)磷酸酯化作用，然後在2 5 °〇的5毫莫耳濃度Tris — C1、ρΗ7·5，〇·5 毫莫耳濃度EDTA，1莫耳濃度NaC 1和〇 . 〇5% Tween 2 0 中與鏈卵白素磁珠（Boehringer Mannheim) 作用1 5分鐘。然後淸洗此珠，然後在2 5 t以0 . 1 5 莫耳濃度N a〇Η與非一生物素鍵結的負股D N A作用 1 0分鐘以分離之。嵌合性抗一 CD40 F a b在一修 飾過的Μ 1 3 I X 1 0 4 載體內合成（kristensson，Κ· et al·, ( 1 995) Vaccines 95，pp. 39-43, ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.)，名爲 M13 IX104CS ;亦即使用Vh和Vl寡核苷酸在超 過3倍莫耳濃度的尿核苷酸鹽化之載體模板經由雜化突變 作用而合成（Rosok，M.J·，et al.，（1 996) J. Biol. Chem. 27 1:226 1 1 -226 1 8; Kunkel, T.A. ( 1 985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492)。此 Ml 3 I X 1 0 4 載體以絲胺 酸取代kappa和r 1不變區域末端的半胱胺酸殘基來加以修 飾。將此反應物以電穿透作用進入D Η 1 0 B細胞內，並 置於X L - 1 Blue層上。 丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 44· 1226334 Α7 Β7 五、發明説明（42) 2 ·結合性骨架和骨架/ C D R 3資料庫之構築 結合性骨架資料庫（H u I )的合成是經由修飾過相 同於構築嵌合性抗- C D 4 0的方法。合成編碼人類模板 Η和L可變區域之骨架區域的部分一致之寡核苷酸和老鼠 抗一C D R s ，如 kabat et al·所定義（kabat，Ε.Α·，et al·， (1991) Sequences of Proteins of immunological interest ( 5th Ed), Washington DC:United Stated Department of Health and Human Services; kabat, E.A., et al., (1 997) J. Biol. Chem· 25 2:6609-66 19 )。合成編碼老鼠和人類7個 V η和1個V κ骨架位置之胺基酸的退化性寡核苷酸（圖 1 5，殘基以星號做記號）。 骨架/HCDR3 (Hun)和骨架/HCDR3/ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) L C D R 3 ( H u ΙΠ )資料庫的合成是經由修飾過相同於 結合性骨架資料庫之合成方法。C D R殘基選擇做突變化 用的是HCDR3中的S e r95 — Ty r1Q2以及 LCDR3 中的 G 1 n89 — Th r97 (圖 1 5，劃線處） 。編碼HCDR 3和L CDR 3之寡核苷酸被設計來突變 單一 C D R殘基，且經由引入N N ( G / T )在每個位置 中來合成，如技藝中所描述（Glaster，S.M. et al.，（1992) J· Immunol. 149:3903-3913 )。將編碼骨架資料庫和非—資 料庫老鼠CDR s的部分一致之寡核苷酸與2 5微微莫耳 編碼已突變之H C D R 3寡核脊酸結合，或與2 5微微莫 耳編碼已突變之H C D R 3和L C D R 3之一的寡核苷酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）_ 45 一 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) 結合。 3 .篩選噬菌體表現資料庫 H u Π和H u ΠΙ資料庫最初篩選是經由一修飾過的溶 菌斑掘起方法，名爲捕捉掘起方法已知於技藝中（Watkins， J. D·，et al., ( 1 998) Anal. Biochem. 256:1 69- 1 77 ) 〇 簡 而言之，將附著上山羊抗-人類kappa的硝化纖維濾紙（ 8 2 -毫米）以1 % B S A阻斷，然後沾到含有被噬菌體 感染之細菌層之洋菜膠平板上。在初次篩選時，噬菌體以 1 0 5噬菌體/ 1 0 0 -毫米平板之濃度於平板上。補捉噬 菌體表現抗一 C D 4 0變體F a b s之後，將此濾紙以溶 於PBS之5毫微克/毫升CD40 — I g且含1% B S A，在2 5 t作用3小時。將此濾紙以含有〇 · 1 % Tween 2 0之P B S潤濕4次，並與山羊抗一老鼠 1 g G 2 b —鹼性磷酸酶結合（southern Biotechnology ) 之抗體在含有1%B SA的P B S中稀釋3 0 0 0倍後於 2 5 °C作用1小時。然後以含有0 · 1 % T w e e η 2 0的 P B S淸洗此濾紙4次，並如所描述的顯影（Watkins ( 1 99 8)，如上）。爲分離出個別選殖株，挑起初次篩選之正 性溶菌斑，以較低密度（< 1 0 3噬菌體/ 1 0 0 -毫米平 板）再倒平板，且使用相同方法篩選。 H u I結合性資料庫第一次篩選是經由E L I S A， 可快速評估相關親和力的變體（Watkins, J.D.，et al·，（ 1997) Anal，Birchem. 253:37-45 )。此外，E L I S A 可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 46 _ I-------ΦII (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 1226334 A7 B7 五、發明説明（44) 使用於鑑定經由捕捉掘起篩選出的選殖株共分析特性°簡 而言之，微力價平板附著上5微克/毫升山羊抗-人類 kappa (Southern Biotechnology)抗體，並以含 3 % B S A 的 P B S阻斷。然後將取自大腸桿菌培養上淸液或細胞分解 物的5 0微升F a b在2 5 °C與此平板作用1小時，平板 以含有0 · 1 % Tween 2 0之P B S洗3次後，與溶於含 有1%BSA之PBS的〇 · 1微克/毫升CD40 — I g在2 5 °C作用2小時。此平板以含有0 · 1 % Tween 2〇之PBS洗3次，並與山羊抗一老鼠I gG2b —鹼 性磷酸酶結合之抗體在含有1 % B S A的P B S中稀釋 3 0 0 0倍後於2 5 °C再作用1小時。平板以含有0 . 1 % Tween 2 0之P B S洗3次，並如技藝中所描述的顯影 (Watkins ( 1 997)如上）。
4 · D N A 序歹[J 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 單股D N A被分離出以及本發明之人類化抗體的η和 L鏈可變區域基因，經由螢光二去氧核苷酸終結方法（ perkin-Elmer，Foster City，CA)定序列。 人類化抗體F 4輕鏈可變區域之核苷酸（S E Q ID N〇：7)和胺基酸（SEQ ID N 0 : g ) 如下： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0'〆297公釐） 1226334 A7 B7 五、發明説明（45) GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT 4 2 EIVLTQSPATLSLS14 CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84 PGERATLSCRASQS28
ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AA； ISDYLHWYQQK CCT GGC CAG 126 P G Q 42 GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC ATC TCT 168
A
P
R
L
L
I
Y
Y
A
S
H
S 工
S 56
GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 210 GIPARFSGSGSGTD70 TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 2 52 FTLTIS SLEPEDFA84 GTT TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TTT CCT TGG ACC TTC 294 V YYCQHGHSFPWTF0 GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT AAA GGGTKVEIK (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 人類化抗體F 4和L 酸（s E Q ID NO N〇：1 0 )序列如下
7的重鏈可變區域之核苷 和胺基酸（S E Q ID 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 ϋ\Α GGA CGG TTT GTC TTC 210 K G R F V F 70 CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT 42 QVQLVQSGSELKKP14 GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCC 84 GASVKVSCKAS G Y A 28 TTC ACT ACC ACT GGC ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA 126 FTTTGMQWVRQAPG42 CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC ACC CAC AGC GGG 168 QGLEWMGWINTHSG56
GTC CCA AAG TAT GTC GAG GAC TTC VPKYV EDF 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 48 - 2 4 4 8 4 1 8 2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1226334 A7 ______B7 五、發明説明（46 ) TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTG CAG ATC AGC 252 SLDTSVSTAYLQIS84 AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACT GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA 294 SLKAEDTAVYYCAR98 TCT GGC AAT GGG AAC TAT GAC CTG GCA TAC TTT AAG TAT TGG 336 SGNGNYDLAYFKYW 112 GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 366 GQGTLVTVSS 122 人類化抗體L 3 · 1 7的輕鏈可變區域之核苷酸（ SEQ ID 1^〇：11)和胺基酸（3已（3 ID N〇：1 2 )序列如下：
GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT EIVLTQSPATLSLS
CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT PGERATLSCRASQS ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126 工 S D Y L H W Y Q Q K P G Q 42 GCT A CCC P AGG R CTC L CTC L ATC I TAT Y TAC Y GCA A TCC s CAC H TCC S ATC I TCT s 168 56 GGC G ATC 工 CCA P GCC A AGG R TTC F AGT S GGC G AGT S GGG G TCT S GGG G ACA T GAC D 210 70 TTC F ACT T CTC L ACC T ACT 工 AGC S AGC S CTA L GAG E CCT P GAA E GAT D TTT F GCA A 252 84 GTT V TAT Y TAC Y TGT C CAG Q CAT H GGC G CAC H TCT S TAT Y CCT P TGG W ACC T TTC F 294 98 GGA G GGG G GGG G ACC T AAG K GTG V GAA E ATT I AAA K 321 107 5 · F a b的表現和純化 一些F a b s選殖到在阿拉伯糖調節之d B A啓動子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 4Q _ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
1226334 A7 B7 五、發明説明（47 ) 控制下的表現載體中。此外，將一六-組胺酸標識聯合到 Η鏈的羧端，以利於鎳鉗合樹脂的純化。純化之F a b如 描述中定量（watkins ( 1 997)，如上）。 6 ·特性分析 免疫子Π微力價平板附著溶於PBS的〇.1微克/ 毫升CD40 - I g在4°C1 6小時，並以含3%BSA 之PBS阻斷。此平板以含有〇 · 1% Tween 2 0之 P B S洗3次，且將從周邊細胞質釋放之F a b以含有1 % B S A之P B S連續稀釋3倍後與此平板在2 5 °C作用 2小時。隨後以含有0 · 1 % Tween 20之PBS淸洗平 板4次，並以山羊抗-人類kappa -鹼性磷酸酶結合之抗體 在含有1%BSA之PBS中稀釋2〇〇〇倍後在2 5°C 作用1小時以偵測抗體。然後以含有0 . 1 % Tween 2 0 之P B S淸洗平板4次，並顯影（watkin (1997)如上）。 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 ---------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲測試變體的受體結合之抑制，免疫子Π微力價平板 附著上2微克/毫升抗一老鼠CD 8以捕捉表現於CD 8 區域的sgp39聯合蛋白質。平板以含有〇·05% Tween 2 0之PB S洗一次，並以含3%B SA的P B S阻 斷。平板以含有0 · 0 5% Tween 20之PBS洗一次， 並與含有飽和濃度之s g p 3 9的細胞培養液於2 5 °C作 用2小時。未結合之s g p 3 9被抽出並將此平板以含有 ◦ · 0 5 % Tween 20之PBS洗2次。之後在PBS中 將2 5微升的純化變體F a b s連續稀釋3倍，並加入 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 5〇 _
7 7 A B 1226334 五、發明説明（49 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 流動速率爲2 0微升/分鐘下進行。解離速率常數（koff )是經由分析解離階段所測量之6個數値的平均。以 B I A求値3 · 〇程式來分析感應片數據° Kd是從 =f f / n計算而來。剩餘的F a b以延長解離作用 在每次測量後移除。 人類化抗體F 4和L 3 · 1 7與嵌合性F a b比較分 析其動力學結果如下表1所示： 表 1 選殖株ID# K〇n Koff Kd 註解 嵌合性触 8.43E+5 2.65E-3 3.14毫微莫耳濃度 以木瓜酵素切割嵌合性2.220IgG 製備而成 F4 2.00E+6 4.77E-4 0.24毫微莫耳濃度 人類化 L3.17 3.17E+6 3.28E-4 0.10毫微莫耳濃度 人類化 8 .人類化結果 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如上所討論，老鼠抗一 C D 4 0 m A b可變區域骨 架序列被使用於鑑別大部分同質於人類種系序列。Η鏈骨 架殘基有7 4 %相同於人類種系V Η 7 ( 7 — 4 . 1 )和 J Η 4序列，然而L鏈有7 5 %相同於人類種系V K m ( L 6 )和J K 4序列。Η和L鏈可變序列之排列比較顯示 於圖 1 5。CDR 殘基定義如 kabat et al. (kabat，Ε.Α.，et al·，(1991) Sequences of proteins of immunological 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1226334 Α7 Β7 五、發明説明（5〇) interest (5th Ed), Washington DC:United States Department of Health and Human Services; kabat, E. A., et al., (1997 )J· Biol· Chem. 252:6609-66 1 6)即以劃線表示，排除同質 性分析。老鼠m A b s和人類模板骨架殘基不同處是各別 評估的。 以結構和序列分析爲基礎，除了 H C D R 3之外的抗 體C D R皆展現有限數目的主鏈構形，名爲公認結構（ Chothia, C. et al., (1 987) J. Mol. Biol. 1 96:901 -9 1 7; Chothia，C·，et al·，（ 1 989) Nature 342:877_ 8 8 3 )。再者， 一些決定C D R環主要鏈構形的重要殘基已決定（Chothia (1 987)，如上；〇11(^1^(1989)如上）。老鼠抗一〇〇4〇 的公認骨架殘基因而被鑑定，且得知人類模板Η和L鏈骨 架內全部重要公認位置之胺基酸與對應之老鼠殘基相同。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 表面曝露之老鼠胺基酸並未發現於正常人類抗體，可 能有助於人類化mAb的免疫產生力（Padlan，Ε.Α. (1991) Mol. Immunol. 28:489-498 )。因此，老鼠抗—C D 4 0 和人類模板間不同之骨架殘基已分析，且以溶劑曝露爲基 礎預測抗體是隱藏或位於表面（Padlan (1991)，如上）。 C D R末端的溶劑曝露骨架殘基不期望對抗原結合有所助 益，因此除了兩個Η鏈殘基外，其餘改變爲相對應於人類 胺基酸以降低潛在之免疫產生力。Η鏈殘基2 8和4 6被 推測是溶劑曝露的。然而Η 2 8位於H C D R 1區域內如 Chothia et al.，如上所定義，且與抗原具潛力父互作用。 此外，在老鼠m A b Η 4 6的離胺酸不常見且明顯與人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐）_ 53 - 1226334 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（51 ) 類模板的麩胺酸不同。因此，老鼠和人類Η 2 8和Η 4 6 殘基皆表現於結合性資料庫中（圖1 5打星號）。 剩餘的不同骨架殘基，全部猜測最可能隱藏於抗體內 評估他們的：（1 )接近C D R s ; ( 2 )有潛力與V κ - V η交接處之相反區域接觸者；（3 )相關之相異胺基酸； (4 )在調節C D R活性中之預期重要性，如Studnicka et al.所述（Studnicka，G.M·，et al. (1994) Protein Eng. 7: 8 05 -8 1 4 )。大部分的L鏈骨架相異之隱藏性殘基位置被認 爲不可能直接包含於C D R的構形。然而L 4 9位在鄰近 L C D R 2處，具接觸V η區域之潛力，且與人類殘基不相 關，可能包含於決定L C D R 2的構形。基於這些原因， 老鼠和人類L 4 9的胺基酸皆表現於結合性骨架資料庫（ 圖1 5，打星號）。 分析老鼠Η鏈序列和人類模板是較複雜的。老鼠 m A b的Η 9殘基是脯胺酸，而人類模板含有一不相關的 絲胺酸殘基。位置Η 9可能在調節C D R構形上也扮演一 角色，因此也選爲一結合性資料庫位置（圖1 5打星號） 。剩餘隱藏於骨架的殘基中，老鼠抗一 C D 4 0和Η鏈模 板不同者位於骨架位置3 8、3 9、4 8和9 1。老鼠抗 一CD40 mAb的Η38和Η39分別是麩醯胺酸和 麩胺酸，然而人類模板分別爲精胺酸和麩醯胺酸。殘基 Η 3 8在近H C D R 1內，其麩醯胺酸—精胺酸的改變是 非-保守性的，且在老鼠A b s內此位置表現麩醯胺酸是 有些不常見。同樣的，隱藏性胺基酸麩胺酸-麩醯胺酸是 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) IT: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 54 - 1226334 A7 B7 五、發明説明（52 ) 非-保專性差異，Η 3 9是具V κ潛力的接觸殘基’且在老 鼠m A b s內表現麩胺酸是不常見的。殘基Η 4 8非常接 近H C D R 2，而Η 9 1被預測爲高危險位置具V κ區域潛 力接觸。因此老鼠和人類基被表現於Η 3 8、3 9、4 8 和9 1 (圖1 5打星號）。 綜合言之，骨架資料庫是由老鼠C D R s移植到人類 糢板所組成。此外，L鏈上的一骨架殘基和Η鏈上的七個 骨架殘基被認爲對維持m A b活性非常重要。全部這些位 置皆經由合成一結合性資料庫表現全部可能的老鼠和人類 這些胺基酸的結合，以分析特性。此資料庫名爲H u I的 全部變異性是2 8或2 5 6個變體（下列之表2 )。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表2 :噬菌體表現抗一 C D 4 0抗體資料庫的摘要 資料庫 資料庫位置 大小+ 贫年々BB + 師进 Hu I 骨架 256 2.4 X 103 Hu Π 骨架，HCDR3 1.1 X 105 2.0 X 106 Hu m 骨架，HCDR3，LCDR3 3.1 X 107 5.5 X 105 *以D N A序列爲基礎之不同 選 殖株 ;數 目。3 2個密 碼使用 於編碼每個C D R位置的全 剖 2 0 個 胺基酸 〇 + H u I 資料庫以E L I S A 篩 選， 使 用表現於小量 細困培 養之抗體 (Watkins ( 1 997)如 上 )° Η u Π和 Hun 資料庫 置於在X L 1 一 blue /洋菜膠層上 ，使得每1 0 0毫米平 板有1〇 5溶菌斑，且經由捕 捉 掘起 丨法 篩選（ W atkin LS ( 1 998)如上）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1226334 A7 B7 五、發明説明（53) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) H u I資料庫表現在小量（< 1毫升）的細菌培養中 ，然後把從周邊細胞質間隙所釋放的F a b定量固定到微 力價板上，以E L I S A直接比較抗體的結合活性（ Watkms ( 1 997)，如上）。雖然有些變體結合到標的抗原的 親和力比嵌合性F a b好，且已鑑定，且大部分所篩選到 的H u I選殖株都比嵌合性抗一 C D 4 0 F a b活性低 。近6 %隨機篩選的H u I變體與嵌合性F a b比較時展 現活性。鑑別許多H u I變體與嵌合性C D 4 0之活性比 較的結果可解釋大部分重要的骨架殘基是包括在結合型資 料庫中。 經濟部中央標準局舅工消費合作社印裂 活性選殖株進一步的特性分析以滴定在已固定的抗原 ’確認這些變體的增強親和力。例如：選殖株1 9 c 1 1 比嵌合性F a b具較強親和力結合到C D 4 0接受器，此 結果經由轉移滴定槪廓證明之（圖1 6，空心圓對實心圓 )。將3 4個最具活性的選殖株做D N A定序，並鑑別出 有2 4個是獨特骨架結合，每個包含2 - 6個老鼠骨架殘 基（數據未顯示）。 LCDR3和HCDR3直接接觸抗原，與其它 C D R s交互作用，並常影響抗體的親和力和專一性（ Wilson, I.A., et al.? ( 1 993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 113-118; Padlan, E.A. (1 994) Mol. Immunol. 31: 169-217 )。此外，L C D R 3和H C D R 3的構形經由部分特定 骨架殘基所決定。爲鑑定最具活性之抗體，使用密碼爲基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 56· 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（54) 礎之突變作用（Glasei·，S.M·, et al·，（1992) J· Immunol. 149: 3903-3913)去合成的寡核苷酸’之後在^^ C D R 3每 個位置導入突變，一次一個，使得每個C D R殘基皆表現 過全部2 0個胺基酸。每個寡核苷酸編碼不超過改變一個 單一的胺基酸。將編碼H C D R 3資料庫的寡核苷酸與編 碼結合性骨架及其它C D R s的部分重複寡核甘酸混合在 一起以製造一骨架/H C D R 3資料庫。此資料庫的變異 性爲1 · lxlO5，命名爲ΗιιΠ (表2，如上）。 L C D R 3的資料庫合成也是以類似的方法。編碼 L C D R 3，H C D R 3和結合性骨架的寡核苷酸被使用 於製造一骨架/HCDR3/L CDR 3資料庫，名爲 Hum。此資料庫的多數骨架/SDR3結合之結果造成 複雜性爲3 · 1 X 1 0 7 (表2，如上）。 骨架資料庫與L CDR 3和/或HCDR 3之突變結 合後可增加人類化抗- C D 4 0變體的潛在變異性從 2 5 6到大於1 〇 7。爲更有效率的篩選這些較大的資料庫 ，使用名爲捕捉掘起的修飾之溶菌斑掘起分析法（Watkms (1 998)，如上）篩選。簡而言之，將已被噬菌體感染的細 菌倒在固體洋膠膠層上，隨後蓋上已附著F a b -專一性 抗原在上面的硝化纖維濾紙。當捕捉到接近定量之噬菌體 表現F a b後，以5毫微/毫升CD4 0— I g聯合蛋白 質爲探針與濾紙作用。因爲濾紙加入探針的抗原是在低於 F a b之K d以下的濃度，所以只有表現增加親和力的變 體可偵測到。使用8 2毫米濾紙，篩選上面含有& 1 0 5變 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）_ 57 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，蟄· 、1T;- 1226334 A7 B7 __ 五、發明説明（55) 體之> 1 06Hu Π變體和> 1 〇5Huin資料庫變體的濃 紙，以鑑定表現較高親和力的選殖株（表2 )。 因爲濾紙上的噬菌體密度太高，因此挑出正性溶菌班 後再做成較低密度後，再篩選一次。隨後以E L I S A進 一步特性化這些在捕捉掘起分析中具有最強比色訊號的變 體。如預期般，經由捕捉掘起篩選到的大部分選殖株比嵌 合性F a b更易結合到C D 4 0。將變體滴定到固定的 C D 4 0 — I g上，鑑定出很多選殖株比嵌合性和人類比 F a b展現更好的親和力（圖1 6，比較空心矩形和實心 三角及圓圈）。 骨架/ C D R突變後而增強親和力者以D N A定序鑑 定之。獨特可變區域序列在1 0 / 1 3 H u Π變體和 3/4 Hum變體中鑑定之。Hun和Hum變體包括 1一5老鼠骨架殘基和〇 - 2 CDR3突變，摘要如下列 表3 。 經 表3 ·同時發揮較高親和力之變體的骨架和C D R殘基 資料庫選殖株 老鼠骨架殘基* CDR突變 嵌合性 (43) 0 Hu I 19C11 (2)H28,48 0 Hu Π CW43 (3)H9,28,91 HCDR3,101A - R 2B12 (5)H9,28,38,46,48 HCOR3,10lA - K Hu m 2B12 (5)H9,28,38,46,48 HCDR3,101A -> K 2B8 (1)H28 HCDR3,I01A -> K 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-58 - C請先聞讀背面之注意事項存填寫本頁) 部 中 央 準 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 1226334 A7 B7 五、發明説明k 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 LCDR3,96R -> γ *以前述kabat et al.所定義之C D R s爲基礎，老鼠骨架 殘基和人類種系最具同質性序列的相異數目。老鼠骨架 殘基與人類模板相異之數目標於括號內。骨架與老鼠 mAb及人類化版本的全部不同處都落在Η鏈（H)， 使用k a b a t e t a 1.的計數系統指示之。 從每個資料庫所篩選出的變體及細菌表現之嵌合性 F a b的親和力被更徹底的定性，使用表面卵胞體漿遺傳 因子共振測量法來決定純化的F a b與固定之C D 4 0 -I g間的結合和解離速率。嵌合性抗一 C D 4 0的解離常 數K d = 3 · 1 4 η Μ，與篩選結果一致，亦即很多變體 展現較高的親和力。最好的兩個選殖株F 4和L 3 · 1 7 其Kd値分別爲〇·24ηΜ和〇·1〇ηΜ(表1)。 抗- C D 4 0變體的改進親和力主要是因爲較低的解離速 率，而全部變體的結合速率都非常類似（範圍從0 · 9到 3 . 2xl〇6M_1S™1)。 最後測試這些展現增加親和力的變體阻斷g P 3 9配 位體結合到C D 4 0接受器的能力。全部的變體以劑量依 賴性方式抑制可溶性C D 4 0 - I g聯合蛋白質結合到已 固定之g P 3 9抗原，此與F a b s的親和力有關聯（圖 17)。例如：最具潛能抑制配位體結合到C D 4 0 -I g聯合蛋白質的是變異體2B8，而2B8也是對 CD40有最高親和力的變體（圖17)，變體2B8展 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 7—sii —I I - I 1^1 ! II ϋ— - -- - , ι _ t Γ1Ι -59- 1226334 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（57) 現比嵌合性F a b。1 7倍更高的親和力對C D 4 0，及比 嵌合性F a b高& 7倍的抑制配位體結合。 範例5 老鼠模型系統 申請也硏發及活體內測試一老鼠抗-老鼠C D 4 〇 m A b 7E1— G2b及其前身7E1— G1。產生此 抗體主要是爲了探索在老鼠模型中以抗- C D 4 0治療自 體免疫、發炎和移植疾病之潛力。最原始的老鼠模型系統 目標是要生產一抗一老鼠物質能模仿2 · 2 2 0的完全及 阻斷g p 3 9/CD 4 0交互作用的潛能，然而也擁有微 弱的共刺激活性，因此以標準實驗疾病模丑測試其活體內 情形。 A ·分離及特性化分析抗一老鼠C D 4 0單株抗體7 E 1 和 7E 1 — G 2 b 1 .免疫化，聯合和特性化分析 使用一重組老鼠c D 4 0免疫球蛋白聯合蛋白質經由 脫墊注射免疫化8週大的雌Lewis大老鼠，此蛋白質由老鼠 C D 4 0細胞外區域聯合到老鼠I g G 2 a抗體的樞扭區 、CH2 和 CH3 區域（mCD40— mlg)所組成。 最後一次免疫化後三天，把來自逐漸耗竭之淋巴結白血球 細胞與小鼠X 6 2 - A g 8 . 6 5 3的骨髓瘤細胞融合， 以產生一大鼠X小與的異質性融合瘤。經由E L I S A鑑 定凹孔內所含對天然小老鼠C D 4 0的專一性抗體與原始 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-6〇 - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（58) mCD40 - ml g免疫原的反應性如何，也鑑定與 C D 4 Ο + B 細胞瘤細胞株（W Ε Η I — 2 3 1，A T C C C R L - 1 7 Ο 2 )的反應性。然後將上淸液測試其抑 制m C D 4 0 - m I g與可溶性重組m C D 8 -老鼠 gp39聯合蛋白質，mgp39，及當量之sgp39 結合的能力。約1 2個最具抑制者潛力的主凹孔，以有限 稀釋法選殖之。 選殖後以培養上淸液及純化的抗體進行功能性分析， 以更確切評估抗—C D 4 0 m A b s抑制老鼠g p 3 9 和C D 4 0交互作用的能力，並決定他們的共刺激性質。 使用已知的標準步驟方法測量抑制m g ρ 3 9結合到 W Ε Η I - 2 3 1的能力爲其抑制性質。刺激性質的測量 是使用已知的技藝，在抗體及抗- I gM的存在下導入緊 密同型附著的W Ε Η I - 2 3 1細胞和增殖的脾臟B細胞 。從這些結果鑑定出3個m A b s ( 5 A 3、7 Ε 1 — G1和8E1)最像抗—人類CD40 m A b 2 · 2 2 0能阻斷g Ρ 3 9 / C D 4 0及共刺激之活性。 2 ·篩選7Ε1做爲領導抗一老鼠CD40 m A b 此老鼠活體內硏究的目的是要鑑定最具潛力抑制對T -依賴性抗原之專一性抗體反應的阻斷/非刺激型抗-CD40 mAb s。在老鼠體內已硏究使用抗一老鼠 CD40 mAb來抑制抗SRBCs的IgG抗體反應 。每組5隻BALB/c老鼠以1X108 SRBCs免 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_⑺- 1226334 A7 B7 五、發明説明（59) 疫化四次，且同時以1毫克的抗一老鼠C D 4 0 mAbs 5A3、7E1 — G1或8E1腹膜內注射。 對照組以類似的方法免疫’亦即使用M R 1 (田鼠抗一老 鼠SP39 ，正對照，25〇微克），6E9 (大鼠抗〜 人類gp39 ，負對照，1毫克）或PBS處理。在第7 、14、 21和35天以ELISA計算老鼠IgG抗〜 S R B C力價。這些結果指出，當以S R B C s免疫時給 與單一劑量的mAb 7E 1 — G1顯示比mAb s 5A3或8E1更有效率抑制IgG抗一SRBC反應， 因此選擇mAb 7E1-G1爲領導抗一CD40 m A b做它鼠硏究。 3 . m A b 7E1—G1的同型轉啓變體 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 7E1— G1比嵌合性2 · 220抗—人類CD40 m A b不具有影響功能之特性（譬如，大鼠I g G 1不像 人類I g G 1在捕體固定和F c接受器交互作用那麼有效率 )，再者7 E 1在活體內專一性抗體抑制之槪廓比在靈長 類人2·220mAb不完全。如此，發現具有7E1專 一性但結合一大鼠同型的抗體，在影響能力上較像人類 I g G 1。基於此觀點，從I g G 1轉啓爲I g G 2 b的 天然同型7 E 1轉啓變體經由血親篩選技術（Hale et al.， J. Immunol Methods (1 987) 1 03(1):59-6?)產生之。簡而言 之，先在9 6凹孔板上培養原始7 E 1融合瘤1 0 0 0細 胞/凹孔，然後以E L I S A在其上淸液間鑑定出抗一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-62 - 1226334 A7 B7 五、發明説明（6〇) CD40 mAb的I gG2b同型體。連續以培養密度 爲2 0 0篩選鑑定正I g G 2 b凹孔，然後兩次以2 0細 胞/凹孔密度篩選完後，以有限稀釋法選殖出所分離的 7 E 1 IgG2b 轉啓變體，7E1— G2b。 7El_G2b是IgGl的正常轉啓變體，可經由 三組數據證明之。第一，兩個版本的重鏈N -端序列的前 3 5個胺基酸殘基是相同的。第二，使用7 E 1 - G 1重 鏈可變區之專一性引子的p C R分析產物的大小接近來自 7E1— G1 或 7E1—G1 cDNA 所得之 PCR 產 物，但與不相關之抗體所產生之P C R產物則不同大小。 最後，使用抗一 kappa追蹤劑之E L I S A評估大量純化的 兩版本抗體與固定之mCD40 - h I g的結合能力，所 產生的滴定曲線是相同的。 B .活體內硏究 1 ·在抗體反應模型活體內比較7E1 — G1和7E1 — G 2 b 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用S R B C > S做爲T細胞依賴性抗原，在活體內 比較7 E 1 — G 1和7 E 1 - G 2 b的功效。每組3到5 隻動物以靜脈注射S R B C免疫化，同時也以腹膜內注射 1，0 · 25，或0 · 1毫克的抗體7E1 — G1或 7E 1 - G2b於第〇天，如圖1 〇所示。抗一老鼠 g P 3 9 m A b M R 1做爲免疫抑制效應的正對照。 M A b 6 E 9和P B S分別做爲不相關m A b和沒有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-63 - 1226334 A7 _____B7 ______ 五、發明説明（61 )
m A b的對照。老鼠在第7、 1 4和2 1天以E L I S A 測量抗- S R B C的力價。力價表示出所計算的稀釋血淸 在EL I SA中產生0D値=〇 · 3。如圖1〇所示， 7 E 1 - G 2 b對S R B C的I g G抑制反應具劑量性， 而7 E 1 - G 1則無此現象。 2 · T -依賴性抗原老鼠模型的7 E 1 - G 2 b劑量反應 使用S R B C做爲抗原，檢驗在T細胞依賴性之一級 免疫反應模型中的7 E 1 - G 2 b。測試不同劑量的 7 E 1 — 2 b以決定最低之有效劑量。在第〇天以1 X 1 08SRBC s 靜脈注射 BALB/c 老鼠（n = 5 )， 同時並處理所指定劑量的單一注射之7 E 1 - G 2 b或 MR1 (抗—老鼠gP39)或PBS。圖11所顯示是 在第7、 16和28天的IgG抗一SRBC反應。所報 告的數値是血淸稀釋1 / 5 0時的E L I S A吸收値，錯 誤欄是指標準偏差。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如圖1 1所顯示，以2 5微克/老鼠（1 · 2 5毫克 /公斤）之單一劑量7E 1-G2b處理者，在第1 6天 抑制IgG免疫反應達87%，而以50或1〇〇微克劑 量處理者於第1 6天可得到完全抑制效果。在第2 8天， 5 8微克/老鼠抑制I gG反應達8 9%，而1 〇 〇微克 /老鼠完全抑制。注意，在次適合劑量1 0 0微克/老鼠 時，以M R 1爲免疫抑制的正對照組。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -64 - 1226334 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（62) 3 . 7 E 1 - G 2 b在預防性膠原所引發之關節炎（ C I A )老鼠模型 膠原所引發之關節炎模型（C I A )是類風溼性關節 炎的標準實驗性老鼠模型，因此使用於決定7 E 1 -G2b在預防闊節炎上之效果。在第0天對DBA/1 J 雄老鼠（6 - 8週大）皮內注射溶於佛朗德氏完全佐劑的 2 0 0微克雞膠原型Π ( C Π )。從第7天開始，每4左 以腹膜內注射2 5 0微克/劑量的7 E 1 — G 2 b ’對照 組則處理相同劑量之P B S。第2 1天全部老鼠再追打溶 於佛朗德氏完全佐劑的C Π。之後老鼠每天觀察其腳掌腫 脹及紅廯，腫脹分數爲0 - 3，3爲最大値。腳掌也每天 以測徑器測量。所報告的臨床分數是衍生自每次犧牲老鼠 時的每支腳掌分數之總和，除以每組的全部動物數。所報 告之數値位於組的中間數範圍內。 以下表4顯示以7 E 1 - G 2 b治療老鼠關節炎及其 所發展伴隨的發炎反應，結果可被完全抑制。以7 E 1 一 G 2 b處理的老鼠經過9 0天後可完全淸除此疾病。 表4·膠原所引發之關節炎的治療
Tx組 引發關節炎 中間數(範圍） 疾病開始的天數 中間數(範圍） 臨床分數 中間數(範圍） 腳掌之測量 7E1-G1 0/5 0 0 0.075 7E1-G2b 0/5 0 0 0.075 PBS對照組 4/4 30(27-32) 3.5(3-4) 0.114(0.110-0.117 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-65 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1226334 A7 ____B7 五、發明説明（63 ) 如上述之證明，本發明之抗體是具有免疫調節潛能的 ’可用於對抗許多疾病的治療。 本發明包括如上所述之額外加入保守性胺基酸來取代 ’而大體上不影響C D 4 0結合的嵌合性和人類化抗體。 保守性取代典型包括以類似特性之胺基酸取代另一胺基酸 ’譬如，取代在以下同一組內：纈胺酸；甘胺酸，甘胺酸 ’丙胺酸；纈胺酸，異白胺酸，白胺酸；天冬胺酸，麩胺 酸；天冬醯胺酸，麩醯胺酸；絲胺酸，酥胺酸；離胺酸， 精胺酸；和苯丙胺酸，酪胺酸。 本發明是直接製造如上述描述的嵌合性和/或人類化 抗體，經由表現編碼老鼠輕鏈可變區和重鏈可變區（或其 中之部分）的重組D N A片斷及結合編碼人類不變區之 D N A片斷。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據本發明密碼所舉例的D N A序列設計，是組成全 部或一部分之顯示於SEQ ID N〇：1或其存放 A T C C選殖株內的輕鏈可變區域，和/或全部或一部分 之顯示於SEQ ID NO:2或其存放ATCC選殖 株內的重鏈可變區域。 本發明也包含已揭示的重鏈和輕鏈可變區域和其中之 活性或功能部位。此免疫性勝任或功能型式的蛋白質或其 中之部分，於本文中也提爲 ''輕/重鏈可變區域或其中之 生物活性部分〃。在本案例中，一生物活性部分包括該輕 鏈或重鏈部分，當倂入到一抗體內時仍可使此抗體結合到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-66 - 1226334 A7 B7 五、發明説明（64 ) 人類C D 4 0。 本發明特別包含編碼本發明抗體之重鏈和輕鏈可變區 域的核苷酸序列。舉例言之，圖1 3中的核苷酸1 0 5 7 到1 4 2 2 ( S E Q ID N〇：5 )提供一編碼本發 明抗體重鏈可變區域的較佳核苷酸序列；圖1 4中的核苷 酸 1065 到 1388(SEQ ID N〇：6)提供 一編碼本發明抗體輕鏈可變區域的較佳核苷酸序列。 SEQ ID N〇：7 和 SEQ ID NO :11 顯 示本發明人類化抗體編碼輕鏈可變區域之較佳核苷酸序列 ，S E Q ID N 0 : 9顯示本發明人類化抗體編碼重 鏈可變區域之較佳核苷酸序列。顯示於S E Q ID N〇：7，SEQ ID N〇：9 和 SEQ ID N〇：1 1的質體聚核苷酸已存放於A T C C。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 嵌合性和/或人類化抗體可結合到C D 4 0者，其所 包含的多胜肽與本文所揭示之輕鏈和重鏈可變區域本質上 同質或大槪的序列相同者，也計劃列入本發明中。例如： 嵌合生抗體所含有的輕鏈可變區域展現至少約8 5 %序列 相同於顯示在S E Q ID N〇：4的輕鏈可變區域， 或更好至少約9 0 %序列相同，再更好至少約9 5 %序列 相同，以及最好至少約9 8 %序列相同，這些都包括於本 發明之範圍內。更特別的是，嵌合性抗體所含有的輕鏈可 變區域展現至少約8 5 %序列相同於顯示在S E Q ID N〇：1的輕鏈可變區域，或更好至少約9 0 %序列相 同，再更好至少約9 5 %序列相同，以及最好至少約9 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -67- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明説明（65 ) %序列相同，這些都包括於本發明之範圍內。本發明範圍 也包括人類化抗體所含有的輕鏈可變區域展現至少約8 5 %序列相石於顯示在S E Q ID N〇：8和/或 S E Q ID N〇：1 2的輕鏈可變區域，或更好至少 約9 0 %序列相同，再更好至少約9 5 %序列相同，以及 最好至少約9 8 %序列相同。 額外的，嵌合性抗體所含有的重鏈可變區域展現至少 約8 5 %序列相同於顯示在S E Q ID N〇：3的重 鏈可變區域，或更好至少約9 0 %序列相同，再更好至少 約9 5 %序列相同，以及最好至少約9 8 %序列相同，這 些都包括於本發明之範圍內。更特別的是，嵌合性抗體所 含有的重鏈可變區域展現至少約8 5 %序列相同於顯示在 S E Q ID N 0 : 2的重鏈可變區域，或更好至少約 9 0 %序列相同，再更好至少約9 5 %序列相同，以及最 好至少約9 8 %序列相同，這些也都包括於本發明之範圍 內。額外的，人類化抗體所含有的重鏈可變區域展現至少 約8 5 %序列相同於顯示在S E Q ID N〇：1 〇的 重鏈可變區域，或更好至少約9 0 %序列相同，再更好至 少約9 5 %序列相同，以及最好至少約9 8 %序列相同， 這些包括於本發明之範圍內。 D N A片斷典型更進一步包括一表現控制D N A序列 ，可實施的聯結到嵌合性或人類化抗體的編碼序列，包括 天然相關或異質性啓動子區域。此表現控制序列最好是在 載體中的真核啓動子系統能轉形或轉染到真核宿主細胞內 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) l·-、^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -68- 1226334 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（66 ) ，但控制序列也可使用於原核宿主內。一旦此載體倂入到 合適的宿主內，此宿主可在合適的環境下維持此載體並表 現高程度的核苷酸序列，並且如設計般可收集和純化輕鏈 可變區域，重鏈，輕鏈/重鏈雙體或完整之抗體，結合片 斷或其它免疫球蛋白型式（參閱Beychok，S.，“Cells of Immunoglobulin Synthesis”，Acadenic Pross，N.Y.(1979)) 。經由結合本文所揭示之編碼V L和V H區域的核苷酸序 列和編碼多胜肽聯結子D N A來製造單鏈抗體。 像E. coli的原核宿主，及酵母菌等其它微生物可使用 於表現本發明的抗體。除了微生物之外，哺乳動物組織細 胞培養也可使用於表現和製造本發明的抗體。真核細胞可 能較好，因爲技藝中已硏發出很多能分泌完整免疫球蛋白 的合適宿主細胞株，包括C Η 0細胞株，各種C 0 S細胞 株。Hela細胞，骨髓瘤細胞株，和融合瘤。使用於這些細 胞的表現載體包括表現控制序列，譬如啓動子或增強子； 必需之處理訊息位置，譬如核糖體結合/立置、R N A剪接 位置，聚腺核苷酸作用位置，以及已知之轉錄終結序列。 包含有興趣（譬如，重鏈和/或輕鏈編碼序列和表現 擯制序列）D N A片斷的載體，能視不同之細胞宿主型態 經由已熟知的方法轉移到宿主細胞內。譬如：氯化鈣轉染 法常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿透法可能使用於 其它細胞性宿主（參見 Maniatis, et al., “Moleaular (loning ：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Press ( 1 982)) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） -69- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、IT，· 1226334 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（67 ) 一旦表現出時，本發明之整個抗體、他們的雙倍體、 各別的輕鏈和重鏈，或其它免疫球蛋白型式等，能依據技 藝中的標準方法純化，包括硫酸銨沈澱、親和力欄柱、色 層分析柱、膠體電泳法等等。使用於藥物治療用時的免疫 球蛋白純化至少要9 0〜9 5 %同質性爲佳，而9 8到 9 9 %或更同質性者最好。 本發明之抗體將使用於處理抗體調節和/或T細胞調 節之疾病上。典型的合適疾病狀態包括器官移植對宿主的 疾病和移植排斥，和自體免疫疾病如第一型糖尿病、牛皮 癖、多發性硬化症、類風溼性關節炎、紅斑性狼瘡、和重 肌無力症。 本發明的抗體和藥物組成特別使用於非腸道給與途徑 ，譬如：皮下、肌肉內、或靜脈內注射。用於非腸道給與 之藥物組成，通常是將抗體溶解於可接受的攜帶者，最好 是水溶性攜帶者以形成水溶液。技藝中已熟知的各種水溶 性攜帶者譬如：水、緩衝水、生理食鹽水、甘胺酸等等。 這些溶液是無菌且通常不含特別的物質。這些藥物組成已 使用熟知的滅菌技術將之滅菌處理。這些組成分可能包括 藥物學上可接受的輔助物質用以接近生理狀況，譬如P Η 調節劑和緩衝劑、毒性調節劑等等，例如醋酸鈉、氯化鈉 、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、人類白蛋白等等。 含有本發明抗體的組成物能使用於預防藥或/和治療 之處理。在治療應用上，忍受疾病痛苦的病人所給與的組 成分劑量需足夠治癒或至少部分阻止疾病及其倂發症。最 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 l·- T 、言 鮮· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -70- 1226334 A7 B7 五、發明説明（68 ) 適當的劑量是由、、治療有效劑量〃之定義來完成。使用多 少有效劑量將視疾病的嚴重程度和病人自體免疫系統之一 般情形，也可經由熟知技藝之人士決定。 在預防藥的應用上，給與尙未在發病狀態內的病人含 有本發明抗體之組成分以增強病人的抵抗力（抑制免疫反 應）。此種劑量定義爲 ''預防藥有效劑量〃。使用此應用 的精確劑量也是視病人健康狀況和一般免疫力程度而定。 較佳的預防藥使用於防止移植排斥，譬如腎臟移植之排斥 〇 雖然本發明已使用許多例證與範例詳細描述以達淸楚 明瞭的目的，但將來出現一些改變和修飾也可能實行於本 發明之申請範圍內。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -# 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -71 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明說明（70 ) <170> Patentln Ver. 2.0
<210> 1 <211> 1〇8 <212> PRT <213>人與鼠 <400> 1
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 工le Ser Asp Tyr 20 25 30 c
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser His Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Pro 65 70 7 5 80
Glu Asp Val Gly lie Tyr Tyr Cys Gin His Gly His Ser Phe Pro Trp ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -73- -----------------r--:丨訂·'------丨·線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1226334 A7 B7 五、發明說明（71 ) 85 * 90 95 --------it (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <21〇> 2 <211> 122 <212> PRT <213>人與鼠 <400> 2
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 . r 15
Thr Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Thr 20 25 30
Gly Met Gin Trp Val Gin Glu Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp lie 35 40 45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Val Glu Asp Phe 50 55 60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -74- 1226334 A/_ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（72 ) Λ Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 70 75 80 Leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Asn Gly Asn Tyr Asp Leu Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 3 « <211> 451 <212> PRT <213>人與鼠 <400〉 3 Gin 工le Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Arg He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Thr 20 25 30 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----r---tr-------11 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格(210 x 297公釐） -75 - 1226334 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（73 ) Gly Met Gin Trp Val Gin Glu Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp lie 35 40 45 Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Val Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 、 75 80 Leu Gin lie Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Ar'g Ser Gly Asn Gly Asn Tyr Asp Leu Ala Tyr -Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 丨丨丨----ι!ιλψ 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ——riTi 線·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） _ 7ό _ 1226334 a7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（74) Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr .180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala rPro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 工le Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----rln ------ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -77- 1226334 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（75 ) His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 325 ' 330 335 Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys -Asn Gin Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----l· I —I 1----ί 線·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） · - 1226334 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（76) Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Me匕 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213 >人與鼠 <400> 4 Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lyg Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu lie (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----r--^—訂-------I—. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)、A4規格（210 X 297公釐） -79- A7 1226334 B7_ 五、發明說明（77 ) ·. _ . 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser His Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val Glu Pro 65 70 ； 75 80
Glu Asp Val Gly lie Tyr Tyr Cys Gin His Gly His Ser Phe Pro Trp 85 90 , 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------n---tt-------f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -80- 1226334 A7 B7 五、發明說明（78 ) 165 ' 170 175 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 8614 . f <212> DNA <213 >人與鼠 <400> 5 gacggatcgg gagatctgct aggtgacctg aggcgcgccg gcttcgaata gccagagtaa 60 cctttttttt taattttatt ttattttatt tttgagatgg agtttggcgc cgatctcccg 120 atcccctatg gtcgactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtatc 180 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 tgctccctgc ttgtgtgttg gaggtcgctg agtagtgcgc gagcaaaatt taagctacaa 240 caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg cgttttgcgc 300 tgcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc gttgacattg attattgact agttattaat 360 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1226334 A7 B7 五、發明說明（79 ) agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 420 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 480 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact 540 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcata匕gcca agtacgcccc 600 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 660 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 720 ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 780 tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 840 aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 900 tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa 960 ttaatacgac tcactatagg gagacccaag cttggtacca tggactggac ctggagaatc 1020 ctcttcttgg tggcagcagc aacaggtgcc cactcccaga tccagttggt gcaatctgga 1080 cctgagctga agaagcctgg agagacagtc aggatctcct gcaaggcttc tgggtatgcc 1140 ttcacaacta ctggaatgca gtgggtgcaa gagatgccag gaaagggttt gaagtggatt 1200 ggctggataa acacccactc tggagtgcca aaatatgtag aagacttcaa gggacggttt .1260 gccttctctt tggaaacctc tgccaacact gcatatttac agataagcaa cctcaaaaat 1320 gaggacacgg ctacgtattt ctgtgtgaga tccgggaatg gtaactatga cctggcctac 1380 tttgcttact ggggccaagg gacactggtc actgtctctg cagctagcac caagggccca 1440 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 1500 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 1560 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 1620 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 1680 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttggtg agaggccagc acagggaggg 1740 agggtgtctg ctggaagcca ggctcagcgc tcctgcctgg acgcatcccg gctatgcagc 1800 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 五、發明說明（80 ) cccagtccag ggcagcaagg cccactcatg ctcagggaga gctaggtgcc cctaacccag caagagccat atccgggagg tccactccct cagctcggac ctctgcagag cccaaatctt agcccaggcc tcgccctcca gggacaggcc ccagccgggt tcctgggggg accgtcagtc cccggacccc tgaggtcaca agttcaactg gtacgtggac agcagtacaa cagcacgtac tgaatggcaa ggagtacaag aaaccatctc caaagccaaa cggctcggcc caccctctgc cagccccgag aaccacaggt caggtcagcc tgacctgcct gagagcaatg ggcagccgga ggctccttct tcctctacag gtcttctcat gctccgtgat tccctgtctc cgggtaaatg ggtcgcacga ggatgcttgg aaataaagca cccagcgctg tcaggccgag tctgaggcct 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 caggccccgt ctgcctcttc acccggaggc gggtcttctg gctttttccc caggctctgg gccctgcaca caaaggggca ggtgctgggc accctgcccc tgacctaagc ccaccccaaa accttctctc ctcccagatt ccagtaactc gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag gctgacacgt ccacctccat ctcttcctca ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc ggtgggaccc gtggggtgcg agggdcacat cctgagagtg accgctgtac caacctctgt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca agtgcgacgg ccggcaagcc cccgctcccc cacgtacccc ctgtacatac ttcccgggcg ccctgggccc ctgcgagact gtgatggttc gagtggcatg agggaggcag agcgggtccc 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -83- ctctgcccgc I860 gcaggcacag 1920 tcagacctgc 1980 ggccaaactc 2040 ccaatcttct 2100 caggtaagcc 2160 cctgcatcca 2220 gcacctgaac 2280 ctcatgatct 2340 cctgaggtca 2400 ccgcgggagg 2460 caggactggc 2520 cccatcgaga 2580 ggacagaggc 2640 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3900 tcctctcaca agggtgcccc tgcagccgcc acacacacac aggggatcac acaccacgtc 3960 acgtccctgg ccctggccca cttcccagtg ccgcccttcc ctgcaggacg gatcagcctc 4020 gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tccaccgtgc cttccttgac 4080 cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 4140 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 4200 ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga 4260 aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 4320 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 4380 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc gggcctctca aaaaagggaa 4440 aaaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 4500 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 4560 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 4620 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct tggacagctc agggctgcga tttcgcgcca 4680 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） __ _ ----------------r--丨訂-------！ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1226334 B7___ 五、發明，說明（82) aacttgacgg caatcctagc gtg^aggctg gtaggatttt atccccgctg ccatcatggt 4740 tcgaccattg aactgcatcg tcgccgtgtc ccaaaatatg gggattggca agaacggaga 4800 cctaccctgg cctccgctca gga^cgagtt caagtacttc caaagaatga ccacaacctc 4860 ttcagtggaa ggtaaacaga atctggtgat tatgggtagg aaaacctggt tctccattcc 4920 tgagaagaat cgacctttaa aggacagaat taatatagtt ctcagtagag aactcaaaga 4980 accaccacga ggagctcatt ttcttgccaa aagtttggat gatgccttaa gacttattga 5040 acaaccggaa ttggcaagta aagtagacat ggtttggata gtcggaggca gttctgttta 5100 ccaggaagcc atgaatcaac caggccacct tagactcttt gtgacaagga tcatgcagga 5160 atttgaaagt gacacgtttt tccaagaaat tgatttgggg aaatataaac ttctcccaga 5220 atacccaggc gtcctctctg aggtccagga ggaaaaaggc atcaagtata agtttgaagt 5280 ctacgagaag aaagactaac aggaagatgc tttcaagttc tctgctcccc tcctaaagct 5340 atgcattttt ataagaccat gggacttttg ctggctttag atctctttgt gaaggaacct 5400 tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta 5460 aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt 5520 tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa 5580 aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa 5640 cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccttcagaa 5700 ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt 5760 tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atattctgta 5820 acctttataa gtaggcataa cagttataat cataacatac tgttttttct tactccacac 5880 aggcatagag tgtctgctat taataactat gctcaaaaat tgtgtacctt tagcttttta 5940 atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg ccttgactag agatcataat 6000 cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct 6060 gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa 6120 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I!看 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----:----^-------I - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -85- 1226334 A7 B7 五、發明說明（83 ) —--------------r —tr;--------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 tggttacaaa ttctagttgt gatcctccag agcttataat 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aaaaaggatc aaagcatttt catgtctgga caccccaact ttcacaaata gtatcttatc tagctgtttc agcataaagt cgctcactgc caacgcgcgg tcgctgcgct cggttatcca aaggccagga gacgagcatc agatiaccagg cttaccggat cgctgtaggt ccccccgttc gtaagacacg tatgtaggcg acagtatttg tcttgatccg attacgcgca gctcagtgga ttcacctaga tttcactgca 6180 tcggctggat 6240 tgtttattgc 6300 aagcattttt 6360 atgtctgtat 6420 ctgtgtgaaa 6480 gtaaagcctg 6540 ccgctttcca 6600 ggagaggcgg 6660 cggtcgttcg 6720 cagaatcagg 6780 accgtaaaaa 6840 acaaaaatcg 6900 cgtttccccc 6960 acctgtccgc 7020 atctcagttc 7080 agcccgaccg 7140 acttatcgcc 7200 gtgctacaga 7260 gtatctgcgc 7320 gcaaacaaac 7380 gaaaaaaagg 7440 acgaaaactc 7500 tccttttaaa 7560 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS.)A4規格（210 x 297公釐） · 80 - 1226334 A/ B7 五、發明說明（84 ) ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 7620 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7680 tgcctgactc cccgtcg匕gt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7740 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7800 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 7860 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 7920 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 7980 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 8040 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 8100 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 8160 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 8220 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 8280 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 8340 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8400 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8460 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8520 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8580 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 8614 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 6 ' <211> 8858 <212> DNA <213>人與鼠 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1226334 _B7__ 五、發明說明缸） <400> 6 gacggatcgg gagatctgct agcccgggtg acctgaggcg cgccggcttc gaatagccag 60 agtaaccttt ttttttaatt ttattttatt ttatttttga gatggagttt ggcgccgatc 120 tcccgatccc ctatggtcga ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 180 gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc 240 tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt 300 tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta 360 ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 420 ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 480 aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 540 ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 600 gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 660 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 720 gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 780 aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 840 tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 900 ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat 960 cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagcttgg taccatggaa gccccagctc 1020 agcttctctt cctcctgcta ctctggctcc cagataccac cggagacatt gttctgactc 1080 agtctccagc caccctgtct gtgactccag gagatagagt ctctctttcc tgcagggcca 1140 gccagagtat tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa atcacatgag tctccaaggc 1200 ttctcatcaa atatgcttcc cattccatct ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg 1260 gatcagggtc agatttcact ctcagtatca acagtgtgga acctgaagat gttggaattt 1320 attactgtca acatggtcac agctttccgt ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa 1380 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ••t -----r —tr:-------ί· · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -88- 1226334 A7 B7 五、發明說明（86 ) tcaaacgtaa gtctcgagtc tct^gataac cggtcaatcg gtcaatcgat tggaattcta 1440 aactctgagg gggtcggatg acgtggccat tctttgccta 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tgttgtttta ccaactactc 2340 aatttctctt ataagggact aaatatgtag tcatcctaag gcacgtaacc atttataaaa 2400 atcatccttc attctatttt accctatcat cctctgcaag acagtcctcc ctcaaaccca 2460 caagccttct gtcctcacag tcccctgggc catggtagga gagacttgct tccttgtttt 2520 cccctcctca gcaagccctc atagtccttt ttaagggtga caggtcttac agtcatatat 2580 cctttgattc aattccctga gaatcaacca aagcaaattt ttcaaaagaa gaaacctgct 2640 ataaagagaa tcattcattg c'aacatgata taaaataaca acacaataaa agcaattaaa 2700 taaacaaaca atagggaaat gtttaagttc atcatggtac ttagacttaa tggaatgtca 2760 tgccttattt acatttttaa acaggtactg agggactcct gtctgccaag ggccgtattg 2820 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ·————i— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----：----訂-------f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -89- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明說明) agtactttcc acaacctaat tta^tccaca ctatactgtg agattaaaaa cattcattaa 2880 aatgttgcaa aggttctata aagctgagag acaaatatat tctataactc agcaatccca 2940 cttctagatg actgagtgtc ccc^cccacc aaaaaactat gcaagaatgt tcaaagcagc 3000 tttatttaca aaagccaaaa attggaaata gcccgattgt ccaacaatag aatgagttat 3060 taaactgtgg tatgtttata cattagaata cccaatgagg agaattaaca agctacaact 3120 atacctactc acacagatga atctcataaa aataatgtta cataagagaa actcaatgca 3180 aaagatatgt tctgtatgtt ttcatccata taaagttcaa aaccaggtaa aaataaagtt 3240 agaaatttgg atggaaatta ctcttagctg ggggtgggcg agttagtgcc tgggagaaga 3300 caagaagggg cttctggggt cttggtaatg ttctgttcct cgtgtggggt tgtgcagtta 3360 tgatctgtgc actgttctgt atacacatta tgcttcaaaa taacttcaca taaagaacat 3420 cttataccca gttaatagat agaagaggaa taagtaatag gtcaagacca acgcagctgg 3480 taagtggggg cctgggatca aatagctacc tgcctaatcc tgcccwcttg agccctgaat 3540 gagtctgcct tccagggctc aaggtgctca acaaaacaac aggcctgcta ttttcctggc 3600 atctgtgccc tgtttggcta gctaggagca cacatacata gaaattaaat gaaacagacc 3660 ttcagcaagg ggacagagga cagaattaac cttgcccaga cactggaaac ccatgtatga 3720 acactcacat gtttgggaag ggggaagggc acatgtaaat gaggactctt cctcattcta 3780 匕ggggcactc tggccctgcc cctctcagct actcatccat ccaacacacc tttctaagta 3840 cctctctctg cctacactct gaaggggttc aggagtaact aacacagcat cccttccctc 3900 aaatgactga caatcccttt gtcctgcttt gtttttcttt ccagtcagta ctgggaaagt 3960 9999aa99ac agtcatggag aaactacata aggaagcacc ttgcccttct gcctcttgag 4020 aatgttgatg agtatcaaat ctttcaaact ttggaggttt gagtaggggt gagactcagt 4080 aatgtccctt ccaatgacat gaacttgctc actcatccct gggggccaaa ttgaacaatc 4140 aaaggcaggc ataatccagt tatgaattct tgcggccgct tgctagcttc acgtgttgga 4200 tccaaccgcg gaagggccct attctatagt gtcacctaaa tgctagagct cgctgatcag 4260 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS、)A4規格（210 X 297公釐） -90- ----------------r—訂-------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1226334 _B7 _ 五、發明說明（88 ) cctcgactgt gccttctagt: tgccagccat citgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 4320 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 4380 attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 4440 aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg 4500 cggaaagaac cagctggggc tct^gggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa 4560 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 4620 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccgggcct ctcaaaaaag 4680 ggaaaaaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 4740 tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 4800 ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 4860 gcttttttgg aggcctaggc^ ttttgcaaaa agcttggac^ gctcagggct gcgatttcgc 4920 gccaaacttg acggcaatcc tagcgtgaag gctggtagga ttttatcccc gctgccatca 4980 tggttcgacc attgaactgc atcgtcgccg tgtcccaaaa tatggggatt ggcaagaacg 5040 gagacctacc ctggcctccg ctcaggaacg agttcaagta cttccaaaga atgaccacaa 5100 cctcttcagt ggaaggtaaa cagaatctgg tgattatggg taggaaaacc tggttctcca 5160 ttcctgagaa gaatcgacct ttaaaggaca gaattaatat agttctcagt agagaactca 5220 aagaaccacc acgaggagct cattttcttg ccaaaagttt ggatgatgcc ttaagactta 5280 ttgaacaacc ggaattggca agtaaagtag acatggtttg gatagtcgga ggcagttctg 5340 tttaccagga agccatgaat caaccaggcc accttagact ctttgtgaca aggatcatgc 5400 aggaatttga aagtgacacg tttttcccag aaattgattt ggggaaatat aaacttctcc 5460 cagaataccc aggcgtcctc tctgaggtcc aggaggaaaa aggcatcaag tataagtttg 5520 aagtctacga gaagaaagac taacaggaag atgctttcaa gttctctgct cccctcctaa 5580 agctatgcat ttttataaga ccatgggact tttgctggct ttagatctct ttgtgaagga 5640 accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa 5700 ----------1 -----^ i 丨丨訂·—I—11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 j 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -91 - 1226334 __________ A7 B7 五、發明說明（89 ) ggtaaatata aaatttttaa g匕gtataatg tgttaaacta ctga匕tctaa ttgtttgtgt 5760 attttagatt ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtggaatg cctttaatga 5820 ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc atctagtgat gatgaggcta ctgctgactc 5880 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tcaacattct actcctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gaccccaagg actttccttc 5940 agaattgcta agttttttga gtcatgctgt gtttagtaat agaactcttg cttgctttgc 6000 tatttacacc acaaaggaaa aagctgcact gctatacaag aaaattatgg aaaaatattc 6060 tgtaaccttt ataagtaggc ataacagtta taatcataac atactgtttt ttcttactcc 6120 acacaggcat agagtgtctg ctattaataa ctatgctcaa aaattgtgta cctttagctt 6180 tttaatttgt aaaggggtta ataaggaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca 6240 taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 6300 ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 6360 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 6420 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcggct 6480 ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 6540 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 6600 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 6660 gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 6720 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 6780 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 6840 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 6900 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6960 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 7020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 7080 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa· 7140 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明說明（90 ) atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc dgacaggact ataaagatac caggcgtttc 7200 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 7260 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 7320 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 7380 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 7440 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 7500 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 7560 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 7620 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 7680 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 7740 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7800 零 * taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7860 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7920 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7980 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 8040 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 8100 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 8160 acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 8220 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 8280 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 8340 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 8400 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 8460 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 8520 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8580 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -93- ----------------^----tr------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明說明（91 ) ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8640 gcgtttctgg' gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 8700 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 8760 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8820 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 8858 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> 人與鼠 <400> 7 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc gattacttac attggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctattac gcatcccact ccatctctgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcat ggccactctt ttccttggac cttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaattaa a 321 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213〉人與鼠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） _ 94 . —-------------·——IT:·-------丨線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1226334 … A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明❺2 ) <400> 8 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 工le Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 ' 40 45 Tyr Tyr Ala Ser His Ser lie Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser ^Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Gly His Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .9 1T--------. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 x 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 A7 B7 五、發明課明（93 ) <211> 366 <212> DMA <213 > 人與鼠 <400> 9 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcact accactggca tgcagtgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacaccc acagcggggt cccaaagtat 180 gtcgaggact tcaaaggacg gtt'tgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240 ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc gagatctggc 300 aatgggaact atgacctggc atactttaag tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> 人與鼠 <400> 10
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Thr 20 25 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)、A4規格（210 x 297公釐） -96 - —-------—IMW—l· I—I ^----------HMW (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1226334 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _ B7_五、發明說明（94 ) S Gly Met Gin Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Val Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin lie Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Gly Asn Tyr Asp Leu Ala TyrrPhe Lys Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> 人與鼠 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IT:·!!線 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -97- A7 1226334 __B7___ 五、發明說明（95 ) <400> 11 gaaattgtgt tgacacagtc tcc^gccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc gattacttac attggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catqtattac gcatcccact ccatctctgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccactagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcat ggccactctt atccttggac cttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaattaa a 321
<210> 12 <211> 107 <212〉 PRT <213 > 人與M € <400> 12
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asp Tyr 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） ------------!丨訂\ !_----—線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -98- 1226334 A7 B7 五、發明說明（96 ) '
Tyr Tyr Ala Ser His Ser 工le Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Gly His Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 , <210> 13 ·' <211> 366 <212> DNA <213 > 人與鼠 <400> 13 cagatccagt tggtgcaatc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaggatc 60 tcctgcaagg cttctgggta tgccttcaca actactggaa tgcagtgggt gcaagagatg 120 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ccaggaaagg gtttgaagtg gattggctgg ataaacaccc actctggagt gccaaaatat 180 gtagaagact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcatat 240 ttacagataa gcaacctcaa aaatgaggac acggctacgt atttctgtgt gagatccggg 300 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1226334 A7 B7 五、發明說明（97 ) aatggtaact atgacctggc ctactttgct tactggggcc aagggacact ggtcactgtc 360 tctgca 366 <210> 14 .
<211> 324 <212> DMA 5 ； < 213 > 人與鼠 <400> 14 gacattgttc tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60 ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtatca acaaaaatca 120 catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccatt ccatctctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240 c gaagatgttg gaatttatta ctgtcaacat ggtcacagct ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgt 324 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)、A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1226334 : 6 : : :A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 附件2A :第8 8 1 023 30號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國9 3年10月15日修正 1 · 一種結合至人類C D 4 0之嵌合性抗體，其係由 輕鏈和重鏈所構成，該輕鏈於其可變區域包含S E Q ID N〇：1之全部或生物活性部分之胺基酸序列，且 該重鏈於其可變區域包含S E Q ID N〇：2之全部 或生物活性部分之胺基酸序列。 (SEQ ID Ν〇··1) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1226334 ABCD 六、申請專利範圍(SEQ ID N0:3) QIQLVQSGPE LKKPGETVRI INTHSGVPKY VEDFKGRFAF NGNYDLAYFA VKDYFPEPVT QTYICNVNHK KPKDTLMISR YNSTYRWSV PQVYTLPPSR PVLDSDGSFF GK YViGQGTLVTV VSWNSGALTS PSNTKVDKKV TPEVTCVWD LTVLHQDWLN DELTKNQVSL LYSKLTVDKS SCKASGYAFT SLETSANTAY SAASTKGPSV GVHTFPAVLQ EPKSCDKTHT VSHEDPEVKF GKEYKCKVSN TCLVKGFYPS RWQQGNVFSC TTGMQWVQEM LQISNLKNED FPLAPSSKST SSGLYSLSSV CPPCPAPELL NWYVDGVEVH KALPAPIEKT DIAVEWESNG SVMHEALHNH PGKGLKWIGW 50 TATYFCVRSG 100 SGGTAALGCL 150 VTVPSSSLGT 200 GGPSVFLFPP 250 NAKTKPREEQ 300 ISKAKGQPRE 350 QPENNYKTTP 400 YTQKSLSLSP 450 452 (SEQ ID NO:4) DIVLTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIS bYLHWYQQKS HESPRLLIKY 50 ASHSISGIPS RFSGSGSGSD FTLSINSVEP SDVGIYYCQH GHSFPWTFGG 100 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV 150 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200 LSSPVTKSFN RGEC 214 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3· —種核酸分子，其係由SEQ ID N Ο ： e 之核苷酸序列所構成。(SEQ ID NO:6) 一 .GACATT^GTTOTGACTC 1081 AgTCTCCAGC CACCCTGTCT GTGACTCCAG GAGATAGAGT CTCTCTTTCC TGCAGGGCCA 1141 S-CCAGAGTAT TAGCGACTAC TTACACTGGT ATCAACAAAA ATCACATGAG TCTCCAAGGC 、tT * 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1201 TTCrCATCAA ATATGCTTCC CATTCC^^C7 1261 GATCAGGGTC AGATTTCACT CT 1321 ATTACTGTCA ACATGGTCAC AG 1381 TCAAACGT lTTCCATCT CTGGGATCCC CTCCAGG1 *CAGTATCA ACAGTGTGGA ACCTGAAi ；CTTTCCGT GGACGTTCGG ^GGAGGC： __；TTC AGTGGCAGTG ^AAGAT GTTGGAATTT ^GGAGGCACC AA6CTGGAAA 4 · 一種核酸分子，其係由S E Q 之核苷酸序列所構成。 D N〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇父297公董） 1226334 A8 B8 C8 D8 !CXGA'TCCACTTCGT GCAATCTGGA 1081 CCTGAGCTGA AGAAGCCTGG AGAGACAGTC AGGATCTCCT GCAAGGCTTC TGGGTATGCC 1141 TTCACAACTA CTGGAATGCA GTGGGTGCAA GAGATC3CCAG GAAAGGGTTT gaagtggatt 1201 GGCTGGATAA ACACCCACTC TGGAGTGCCA AAATATGTAG AAGACTTCAA fiGGACGGTTT 1261 GCCTTCTCTT TGGAAACCTC TGCCAACACT GCATAtTTAC AGATAAGCAA rCTCAAAAAT 1321 GAGGACACGG CTACGTATTT CTGTGTGAGA TCGGGC5AATG GTAACTATGA CCTGGCCTAC 1381 TTTGCTTACT GGGGCCAAGG GACACTGGTC ACTGTCTCTG^CA 5 · —種結合至人類C D 4 0之人類化抗體，其係由 輕鏈和重鏈所構成，該輕鏈於其可變區域包含 S E Q ID N 0 : 8之全部或生物活性部分之胺基酸 序列，且該重鏈於其可變區域包含S E Q ID N〇： 1 0之全部或生物活性部分之胺基酸序列。 (SEQ ID N0:8) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT 42 E I V L T Q S P A T L s L s 14 CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84 P G E R A T h s C R A S Q S 28 ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126 I S D Y L H W Y Q Q K P G Q 42 GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC Ατς TCT 168 A P R L L I Y Y A S H s I s 5.6 GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 210 G I P A R F S G S G S G T D 70 TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 252 F T L T I S S L E P E D F A 84 GTT TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TTT CCT TGG ACC TTC 294 V Y Y C Q H G H S F P W T F 98 GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT ΑΛΑ 321 G G G T K V E I K 107 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT 42 QVQLVQSGSELKKP14 GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCC 84 GASVKVSCKAS.GYA28 TTC ACT ACC ACT GGC ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA 12 6 FTTT GMQWVRQAPG42 CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC ACC CAC AGC GGG 168 1226334 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (SEQ ID NO:10) QGLEWMGWINTHSG56 GTC CCA AAG TAT GTC GAG GAC TTC AAA GGA CGG TTT GTC TTC 210 V P K Y V E D F K G R F V F 70 TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTG CAG ATC AGC 2 52 SLDTSVSTAYLQIS84 AGC CTA AAG GCT GAG GAC ACT GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA 2 94 SLKAED TAVYYCAR98 TCT GGC AAT GGG AAC TAT GAC CTG GCA TAC TTT AAG TAT TGG 33 6 SGNGNYDLAYFK YW 112 GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 366 GQGTLVTVSS 122 6 . —種結合至人類c D 4 0之人類化抗體，其係由 輕鏈和重鏈所構成，該輕鏈於其可變區域包含 S E Q ID N〇：1 2之全部或生物活性部分之胺基 酸序列，且該重鏈於其可變區域包含SEQ ID N 0 :1 0之全部或生物活性部分之胺基酸序列。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 )A Ns c /— 準 標 家 國 國 中 用 適 尺 張 紙 7/> 29 X 4 1226334 A8 B8 C8 D8 GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT E IVLTQSPATLSLS 42 14 CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT 84 PGERATLSCRASQS28 ATT AGC GAT TAC TTA CAT TGG TAC CAA CAG AAA CCT GGC CAG 126 I SDYL HWYQQKPGQ42 GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT TAC GCA TCC CAC TCC ATC TCT 168 APRLLIYYASHSIS56 GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT.GGG ACA GAC 210 GIPARFSGSGSGTD70 TTC ACT CTC ACC ACT AGC AGC CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCA 2 52 FTLTISSLEPEDFA84 GTT .TAT TAC TGT CAG CAT GGC CAC TCT TAT CCT TGG ACC TTC 2 94 V Y Y C Q H G GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATT G G G T K V E (SEQ ID NO:10) Q V Q L V Q G A V K V F τ T T G M Q Q G L E W M G 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 v P K Y V E D L L D K T V A E D T H I G C W W F T A S Y P W T F 98 AA 321 K 107 TCT GAG TTG AAG AAG CCT 42 S E L K K P 14 AAG GCT TCT GGA TAC GCC 84 K A s . G Y A 28 GTG CGA CAG GCC CCT GGA 126 V R Q A P G 42 ATC AAC ACC CAC AGC GGG 168 I N T H S G 56 AAA GGA CGG TTT GTC TTC 210 K G R F V F 7 0 GCA TAT CTG CAG ATC AGC 252 A Y L Q I S 84 GTG TAT TAC TGT GCG AGA 294 V y Y C A R 98 TCT GGC AAT GGG AAC TAT GAC CTG GCA TAC TTT AAG TAT TGG SGNGNYDLAYF KYW GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GQGTLVTVSS 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 6 2 3 1 3 1 366 122 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1226334 A8 Β8 C8 D8__ 六、申請專利範圍 _ 7 · —種用於抑制C D 4 0與g p 3 9之交互作用之 藥學組成物，其包含申請專利範圍第1項之嵌合性抗體。 8 · —種用於抑制c D 4 0與g p 3 9之交互作用之 藥學組成物，其包含申請專利範圍第2項之嵌合性抗體。 9 .如申請專利範圍第2項之嵌合性抗體，其係由 S E Q ID N〇：4之輕鏈胺基酸序列和S E Q ID N〇：3之重鏈胺基酸序列所構成。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
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