CN104755494B

CN104755494B - 抗体－药物偶联物

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Publication number: CN104755494B
Application number: CN201380053256.2A
Authority: CN
Inventors: 益田刚; 内藤博之; 中田隆; 吉田昌生; 芦田真二; 宫崎秀树; 粕谷裕司; 森田浩司; 阿部有生; 扇谷祐辅
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2013-10-10
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2033-10-10
Also published as: WO2014057687A1; MX2019004502A; IL294622B1; RS57278B1; US10195288B2; US20160279259A1; IL294622B2; TW202033499A; HUE048748T2; ZA201501825B; KR102369419B1; SI3342785T1; KR20230024433A; IL238143A0; AU2022203560A1; JP2018008982A; US10973924B2; CN109081871B; RS60000B1; AU2013328111A1

Abstract

作为抗肿瘤效果和安全性方面优异的抗肿瘤药，本发明提供一种抗体－药物偶联物，所述抗体－药物偶联物的特征在于，其是将下式所示的抗肿瘤性化合物与抗体经由下式：‑L¹‑L²‑L^P‑NH‑(CH₂)n¹‑L^a‑L^b‑L^c‑所示的结构的接头连接而成的(抗体连接于L¹的末端，抗肿瘤性化合物以1位的氨基的氮原子为连接部位、连接于L^c的末端)。

Description

抗体－药物偶联物

技术领域

本发明涉及作为抗肿瘤药有用的抗体－药物偶联物，其是将能以肿瘤细胞为靶标的抗体和抗肿瘤性药物经由接头结构部分连接而成的。

背景技术

向与在癌细胞表面表达、并且能向细胞内化的抗原结合的抗体上连接具有细胞毒性的药物得到的抗体－药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)能够选择性地向癌细胞输送药物，从而可预计其能使药物在癌细胞内蓄积，并杀死癌细胞(参照非专利文献1～3)。作为ADC，例如，于抗CD33抗体连接卡奇霉素(calicheamicin)而成的Mylotarg(吉妥单抗，Gemtuzumab ozogamicin)作为急性髓细胞性白血病的治疗药已得到批准。另外，最近，于抗CD30抗体连接耳他汀E而成的Adcetris(Brentuximab vedotin)作为霍奇金淋巴瘤和未分化大细胞淋巴瘤的治疗药得到批准(参照非专利文献4)。迄今为止被批准的ADC中含有的药物以DNA或微管蛋白为靶标。

作为抗肿瘤性的低分子化合物，已知作为抑制拓扑异构酶I而呈现抗肿瘤作用的化合物的喜树碱衍生物。其中，下式

[化1]

所示的抗肿瘤性化合物(依沙替康，化学名：(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)是水溶性的喜树碱衍生物(专利文献1、2)。与目前临床中使用的伊立替康不同，不需要通过利用酶进行活化。另外，与作为伊立替康的药效本体的SN-38、同在临床中使用的拓扑替康相比，拓扑异构酶I抑制活性更强，在体外(in vitro)针对多种癌细胞具有更强的杀细胞活性。尤其是，对于通过P-糖蛋白的表达而对SN-38等显示耐性的癌细胞也显示效果。另外，在小鼠的人肿瘤皮下移植模型中也显示出强抗肿瘤效果，虽然进行了临床试验，但没有上市(参照非专利文献5～10)。尚不清楚依沙替康作为ADC是否有效发挥作用。

DE-310是经由GGFG肽间隔物(spacer)将依沙替康连接于生物分解性的羧甲基葡聚糖多元醇聚合物而成的复合体(专利文献3)。通过将依沙替康形成高分子前体药物，从而保持较高血中滞留性，进而利用针对肿瘤新生血管的透过性的亢进和肿瘤组织滞留性，从而提高了被动地指向肿瘤部位的指向性。通过用酶对DE-310的肽间隔物进行切断，作为活性本体的依沙替康、及甘氨酸连接于氨基的依沙替康被持续地游离出。结果，药物动力学得以改善，在非临床试验中的各种肿瘤的评价模型中，对于DE-310而言，尽管依沙替康的给予量少于给予依沙替康单一药剂时的给予量，但却显示出比给予依沙替康单一药剂时更高的有效性。已对DE-310实施了临床试验，虽然有报道称确认到对人有效的患者例、活性本体更多地蓄积于肿瘤(相较于正常组织)，但另一方面，也有报道称在人体中DE-310及活性本体在肿瘤中的蓄积与在正常组织中的蓄积并无明显不同，并未在人体中发现被动靶位(非专利文献11～14参照)。结果，DE-310也未上市，尚不清楚依沙替康作为这种指向靶位的药物是否有效发挥功能。

作为DE-310的相关化合物，还已知将-NH(CH₂)₄C(＝O)-所示的结构部分插入-GGFG-间隔物与依沙替康之间、以-GGFG-NH(CH₂)₄C(＝O)-为间隔物结构的复合体(专利文献4)，但完全不清楚关于该复合体的抗肿瘤效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平5－59061号公报

专利文献2：日本特开平8－337584号公报

专利文献3：国际公开WO1997/46260小册子

专利文献4：国际公开WO2000/25825小册子

非专利文献

非专利文献1：Ducry,L.,等.Bioconjugate Chem.(2010)21,5-13.；Antibody-Drug Conjugates:Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies.

非专利文献2：Alley,S.C.,等.Current Opinion in Chemical Biology(2010)14,529-537.；Antibody-drug conjugates:targeted drug delivery for cancer.

非专利文献3：Damle N.K.Expert Opin.Biol.Ther.(2004)4,1445-1452.；Tumour-targeted chemotherapy with immunoconjugates of calicheamicin.

非专利文献4：Senter P.D.,等.Nature Biotechnology(2012)30,631-637.；Thediscovery and development of brentuximab vedo tin for use in relapsed Hodgkinlymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma.

非专利文献5：Kumazawa,E.,Tohgo,A.,Exp.Opin.Invest.Drugs(1998)7,625-632.；Antitumour activity of DX-8951f:a new camptothecin derivative.

非专利文献6：Mitsui,I.,Kumazawa,E.,Hirota,Y.,等.Jpn J.Cancer Res.(1995)86,776-782.；A new water-soluble camptothe cin derivative,DX-8951f,exhibits potent antitumor activity against human tumors in vitro and in vivo.

非专利文献7：Takiguchi,S.,Tohgo,A.,等.Jpn J.Cancer Res.(1997)88,760-769.；Antitumor effect of DX-8951,a novel cam ptothecin analog,on humanpancreatic tumor cells and their CPT-1 1-resistant variants cultured in vitroand xenografted into nude mice.

非专利文献8：Joto,N.等.Int J Cancer(1997)72,680-686.；DX-8951f,a water-soluble camptothecin analog,exhibits potent ant itumor activity against ahuman lung cancer cell line and its SN-3 8-resistant variant.

非专利文献9：Kumazawa,E.等.Cancer Chemother.Pharmaco l.(1998)42,210-220.；Potent and broad antitumor effects of DX-8951f,a water-solublecamptothecin derivative,against various human tumors xenografted in nudemice.

非专利文献10：De Jager,R.,等.Ann N Y Acad Sci(2000)922,260-273.；DX-8951f:summary of phase I clinical trials.

非专利文献11：Inoue,K.等.Polymer Drugs in the Clinical Stage,Edited byMaeda等.(2003),145-153.；CM-dextran-polyalco hol-camptothecin conjugate,DE-310with a novel carrier system and its preclinical data.

非专利文献12：Kumazawa,E.等.Cancer Sci(2004)95,168-175.；DE-310,a novelmacromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f:Potentantitumor activities in various murine tumor models.

非专利文献13：Soepenberg,O.等.Clinical Cancer Research,(2005)11,703-711.；Phase I and pharmacokinetic study of DE-310 in Patients with AdvancedSolid Tumors.

非专利文献14：Wente M.N.等.Investigational New Drugs(2005)23,339-347.；DE-310,a macromolecular prodrug of the topoisomerase-I-inhibitor exatecan(DX-8951),in patients with operable solid tumors.

发明内容

发明所要解决的技术问题

在利用抗体进行的肿瘤的治疗中，有时也观察到即使抗体能识别抗原并结合于肿瘤细胞、抗肿瘤效果仍不充分的情况，存在需要效果更好的抗肿瘤抗体的情况。另外，在抗肿瘤性的低分子化合物中，存在很多虽然抗肿瘤效果优异但存在副作用、毒性方面等安全性上的问题的化合物，对于低分子抗肿瘤化合物而言，进一步提高安全性、获得更优异的治疗效果也是课题。即，本发明的课题在于获得并提供抗肿瘤效果和安全性方面优异的、具有优异的治疗效果的抗肿瘤药。

用于解决技术问题的手段

本申请的发明人认为，通过将作为抗肿瘤性化合物的依沙替康经由接头结构部分连接于能将肿瘤细胞作为靶标的抗体(即，具有能识别肿瘤细胞的特性、能结合于肿瘤细胞的特性，能向肿瘤细胞内化的特性、或针对肿瘤细胞具有细胞毒性的特性中的一种或更多种特性抗体)而转化为抗体－药物偶联物化合物，能实现以下效果：如果是针对肿瘤细胞具有细胞毒性的抗体，则能增强其细胞毒性，此外，能更可靠地将抗肿瘤性化合物转移至肿瘤细胞、使该化合物的抗肿瘤效果在肿瘤细胞内特异性地发挥，因此，能在可靠地发挥抗肿瘤效果的同时，使得抗肿瘤性化合物的给予量较之单独给予该化合物时有所减少，因此，能实现更高的安全性。

因此，本发明人成功地创造出特定结构的接头，并获得经由该接头将抗体和依沙替康连接而成的抗体－药物偶联物，而且发现该化合物发挥优异的抗肿瘤效果，从而完成了本发明。

即本申请发明涉及：

[1]抗体－药物偶联物，其特征在于，其是将下式

[化2]

所示的抗肿瘤性化合物与抗体经由下式：

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

所示的结构的接头连接而成的。

此处，抗体连接于L¹的末端，抗肿瘤性化合物以1位的氨基的氮原子为连接部位、连接于L^c的末端，

式中，

n¹表示0～6的整数，

L¹表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-、-CH₂-C(＝O)-NH-(CH₂)n³-C(＝O)-、-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-、或-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-，

此处，n²表示2～8的整数，n³表示1～8的整数，n⁴表示1～8的整数，

L²表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-、-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-、或单键，

此处，n⁵表示1～6的整数，n⁶表示1～6的整数，

L^P表示由2～7个氨基酸构成的肽残基，

L^a表示-C(＝O)-NH-、-NR¹-(CH₂)n⁷-、-O-、或单键，

此处，n⁷表示1～6的整数，R¹表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基、-(CH₂)n⁸-COOH、或-(CH₂)n⁹-OH，其中n⁸表示1～4的整数，n⁹表示1～6的整数，

L^b表示-CR²(-R³)-、-O-、-NR⁴-、或单键，

此处，R²及R³各自独立地表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基、-(CH₂)n^a-NH₂、-(CH₂)n^b-COOH、或-(CH₂)n^c-OH，R⁴表示氢原子或碳原子数为1～6的烷基，n^a表示0～6的整数，n^b表示1～4的整数，n^c表示1～4的整数，但n^a为0时，R²及R³不相同，

L^c表示-CH₂-或-C(＝O)-，

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化3]

所示的结构，以该结构的3位与抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构内的亚甲基连接，

-(N-ly-3-diminiccuS)-为下式：

[化4]

所示的结构，以该结构的3位与L²连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构内的亚甲基连接，

cyc.Hex(1,4)表示1，4-亚环己基，

L²为-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-时，L¹成为-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-。

进而，本申请发明涉及以下各项。

[2][1]所述的抗体－药物偶联物，其中，L^c为-C(＝O)-。

[3][1]或[2]所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体与L¹的化学键为，

在存在于抗体的铰链部的二硫键部分中形成的硫醚键、

在存在于抗体的铰链部的二硫键部分中形成的二硫键、或

在存在于构成抗体的氨基酸的侧链上的氨基或末端的氨基中形成的酰胺键。

[4][1]～[3]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，L^P的肽残基为由选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基。

[5][1]～[3]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，L^P为由4个氨基酸构成的肽残基。

[6][1]～[3]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，L^P为-GGFG-。

[7]抗体－药物偶联物，其特征在于，其是将下式

[化5]

所示的抗肿瘤性化合物与抗体经由下式：

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

所示的结构的接头连接而成的。

式中，

n¹表示0～6的整数，

此处，n⁵表示1～6的整数，n⁶表示1～6的整数，

L^P表示GGFG的四肽残基，

L^a表示-O-或单键，

L^b表示-CR²(-R³)-或单键，

此处，R²及R³表示氢原子，

L^c表示-C(＝O)-，

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化6]

-(N-ly-3-diminiccuS)-为下式：

[化7]

cyc.Hex(1,4)表示1，4-亚环己基，

[8][1]～[7]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，L¹为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-或-CH₂-C(＝O)-NH-(CH₂)n³-C(＝O)-。

[9][1]～[7]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，L¹为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-。

[10][1]～[7]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，L¹为-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-或-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-。

[11][1]～[9]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，n²为2～5的整数，L²为单键。

[12][1]～[9]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，n²为2～5的整数，L²为-NH-(CH₂CH₂O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-，n⁵为2或4。

[13][1]～[12]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-为具有4～7个原子的链长的部分结构。

[14][1]～[12]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-为具有5或6个原子的链长的部分结构。

[15][1]～[14]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-为，

-NH-(CH₂)₃-C(＝O)-、

-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-、或

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-C(＝O)-。

[16][1]～[15]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，药物－接头结构部分为选自以下药物－接头结构组中的1种药物－接头结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

此处，-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化8]

-(N-ly-3-diminiccuS)-为下式：

[化9]

cyc.Hex(1,4)表示1，4-亚环己基，

-(NH-DX)为下式：

[化10]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团，

-GGFG-表示-Gly-Gly-Phe-Gly-的肽残基。

[17][1]～[9]及[11]～[14]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，于-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-连接药物而成的药物－接头结构部分为选自以下组中的1种药物－接头结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

此处，-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化11]

-(NH-DX)表示下式：

[化12]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[18]抗体－药物偶联物，其特征在于，其是将下式

[化13]

所示的抗肿瘤性化合物与抗体经由下式：

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

所示的结构的接头连接而成的。

此处，抗体连接于L¹的末端，抗肿瘤性化合物连接于L^c的末端，

式中，

n¹表示0～6的整数，

L¹表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-，经由在存在于抗体的铰链部的二硫键部分中形成的硫醚键连接于抗体，但

此处，n²表示2～8的整数，

L²表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-或单键，

此处，n⁵表示1～6的整数，

L^P表示GGFG的四肽残基，

L^a表示-O-或单键，

L^b表示-CR²(-R³)-或单键，

此处，R²及R³表示氢原子，

L^c表示-C(＝O)-，

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化14]

所示的结构，以该结构的3位与抗体连接，在1位的氮原子上与包含该结构的接头结构内的亚甲基连接。

[19][18]所述的抗体－药物偶联物，其中，n²为2，L²为-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-，n⁵为2，n¹为3，L^a及L^b均为单键，或

n²为5，L²为单键，n¹为1，L^a为-O-，L^b为-CR²(-R³)-，或

n²为5，L²为单键，n¹为2，L^a为-O-，L^b为-CR²(-R³)-。

[20][18]或[19]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，n²为2～5的整数，L²为单键。

[21][18]或[19]所述的抗体－药物偶联物，其中，n²为2～5的整数，L²为-NH-(CH₂CH₂O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-，n⁵为2或4。

[22][18]～[21]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-为，

-NH-(CH₂)₃-C(＝O)-、

-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-、或

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-C(＝O)-。

[23][18]～[22]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，药物－接头结构部分为选自以下药物－接头结构的组中的1种药物－接头结构：

此处，-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化15]

-(NH-DX)表示下式：

[化16]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[24][23]所述的抗体－药物偶联物，其中，于-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-连接药物而成的药物－接头结构部分为选自以下组中的1种药物－接头结构：

此处，-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化17]

-(NH-DX)表示下式：

[化18]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[25][1]～[24]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种的药物－接头结构相对于1抗体而言的平均连接数为1～10个的范围。

[26][1]～[24]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种的药物－接头结构相对于1抗体而言的平均连接数为2～8个的范围。

[27][1]～[24]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种的药物－接头结构相对于1抗体而言的平均连接数为3～8个的范围。

[28][1]～[27]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为具有能识别靶细胞的特性、能与靶细胞结合的特性、能向靶细胞内化的特性、杀伤靶细胞的特性中的一种或更多种特性的抗体。

[29][1]～[27]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体－药物偶联物作为靶标的细胞是肿瘤细胞。

[30][1]～[27]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗A33抗体、抗B7－H3抗体、抗CanAg抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、或抗Mesothelin抗体。

[31][1]～[27]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗B7－H3抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、或抗CD70抗体。

[32][1]～[27]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗B7－H3抗体。

[33]药物，其含有[1]～[32]中任一项所述的抗体－药物偶联物、其盐、或它们的水合物。

[34]抗肿瘤药及/或抗癌药，其含有[1]～[32]中任一项所述的抗体－药物偶联物、其盐、或它们的水合物。

[35][34]所述的抗肿瘤药及/或抗癌药，其用于应用于肺癌、肾癌、尿道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、或食道癌。

[36]药物组合物，其含有作为活性成分的[1]～[32]中任一项所述的抗体－药物偶联物、其盐、或它们的水合物，和药学上可接受的制剂成分。

[37][36]所述的药物组合物，其用于应用于肺癌、肾癌、尿道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、或食道癌。

[38]肿瘤及/或癌的治疗方法，其特征在于，给予[1]～[32]中任一项所述的抗体－药物偶联物、其盐、或它们的水合物。

[39]下式所示的药物－接头中间体化合物：

Q-(CH₂)n^Q-C(＝O)-L^2a-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)

式中，Q表示(马来酰亚胺-N-基)-、HS-、X-CH₂-C(＝O)-NH-、或(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-，

X表示溴原子或碘原子，

n^Q表示2～8的整数，

L^2a表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-、或单键，

此处，n⁵表示1～6的整数，

L^P表示由选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的2～7个氨基酸构成的肽残基，

n¹表示0～6的整数，

L^a表示-C(＝O)-NH-、-NR¹-(CH₂)n⁷-、-O-、或单键，

L^b表示-CR²(-R³)-、-O-、-NR⁴-、或单键，

L^c表示-CH₂-或-C(＝O)-，

(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化19]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)为下式

[化20]

所示的氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化21]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[40][39]所述的药物－接头中间体化合物，其中，L^c为-C(＝O)-。

[41][39]或[40]所述的药物－接头中间体化合物，其中，L^P为由4个氨基酸构成的肽残基。

[42][39]～[41]中任一项所述的药物－接头中间体化合物，其中，L^P为-GGFG-。

[43][39]～[42]中任一项所述的药物－接头中间体化合物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为，

-NH-CH₂CH₂-、

-NH-CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂-O-CH₂-、或

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-。

[44][39]～[42]中任一项所述的药物－接头中间体化合物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为，

-NH-CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂-O-CH₂-、或

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-。

[45][39]～[44]中任一项所述的药物－接头中间体化合物，其中，n^Q为2～6的整数。

[46][43]所述的药物－接头中间体化合物，其中，Q为(马来酰亚胺-N-基)-，

n^Q为2～5的整数，

L^2a为单键。

[47][44]所述的药物－接头中间体化合物，其中，Q为(马来酰亚胺-N-基)-，

n^Q为2～5的整数，

L^2a为单键。

[48][39]～[42]中任一项所述的药物－接头中间体化合物，其中，Q为(马来酰亚胺-N-基)-，

n^Q为2～5的整数，

L^2a为-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-，

n⁵为2～4的整数，

-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为，

-NH-CH₂CH₂-、

-NH-CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂-O-CH₂-、或

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-。

[49][48]所述的药物－接头中间体化合物，其中，n⁵为整数2或4，

-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-，

-NH-CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂-O-CH₂-、或

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-。

[50]以下化合物：

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、或

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

此处，(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化22]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

X表示卤原子，

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-为下式

[化23]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化24]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[51]以下化合物：

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、或

此处，(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化25]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化26]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[52]以下化合物：(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)或

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

此处，(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化27]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化28]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[53]选自以下组中的化合物：

NH₂-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、

NH₂-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、

NH₂-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、

NH₂-CHCH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、及

HO-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

式中，-(NH-DX)为下式

[化29]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。[54]下式

[化30]

所示的化合物。

[55]下式：

[化31]

所示的化合物。

[56]下式

[化32]

所示的化合物。

[57]抗体－药物偶联物的制造方法，其特征在于，利用以下方法将药物－接头部分连接于抗体，所述方法是：

使下式所示的化合物：

Q-(CH₂)n^Q-C(＝O)-L^2a-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)

与抗体或其反应性衍生物反应，

在存在于抗体的铰链部的二硫键部分中形成硫醚键的方法；或

在存在于构成抗体的氨基酸的侧链上的氨基或末端的氨基中形成酰胺键方法。

式中，Q表示(马来酰亚胺-N-基)-、HS-、X-CH₂-C(＝O)-NH-、或

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-，

X表示溴原子或碘原子，

n^Q表示2～8的整数，

L^2a表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-、或单键，

此处，n⁵表示1～6的整数，

n¹表示0～6的整数，

L^a表示-C(＝O)-NH-、-NR¹-(CH₂)n⁷-、-O-、或单键，

此处，n⁷表示1～6的整数，R¹表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基、-(CH₂)n⁸-COOH、或-(CH₂)n⁹-OH，n⁸表示1～4的整数，n⁹表示1～6的整数，

L^b表示-CR²(-R³)-、-O-、-NR⁴-、或单键，

L^c表示-CH₂-或-C(＝O)-，

(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化33]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)为下式

[化34]

所示的氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化35]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[58][57]所述的制造方法，其中，

将药物－接头部分连接于抗体的方法是以下方法中任一种方法：

在对抗体进行还原处理后，使其与Q为马来酰亚胺基或X-CH₂-C(＝O)-NH-的化合物反应而形成硫醚键的方法，

使抗体与Q为(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-的化合物反应而形成酰胺键的方法，或

使抗体与式Q¹-L^1a-Q²所示的化合物反应后，与Q为SH的化合物反应，利用酰胺键而形成药物－接头结构的方法，

[式中，Q¹表示(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-、(3-磺基-吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-、R^Q-O-C(＝N)-、或O＝C＝N-，

L^1a-表示-cyc.Hex(1,4)-CH₂-、碳原子数为1～10的亚烷基、亚苯基、-(CH₂)n⁴-C(＝O)-、-(CH₂)n^4a-NH-C(＝O)-(CH₂)n^4b-、或-(CH₂)n^4a-NH-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-，

Q²表示(马来酰亚胺-N-基)、卤原子、或-S-S-(2-吡啶基)，

R^Q表示碳原子数为1～6的烷基，n⁴表示1～8的整数，

n^4a表示0～6的整数，n^4b表示1～6的整数，

(3-磺基-吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-为下式

[化36]

所示的氮原子是连接部位的基团，该磺酸可形成锂盐、钠盐、钾盐，

cyc.Hex(1,4)表示1，4-亚环己基，

(2-吡啶基)表示2－吡啶基。]

[59][57]或[58]所述的制造方法，其中，选择的1种的药物－接头结构在每1抗体上的平均连接数为1～10个的范围。

[60][57]或[58]所述的制造方法，其中，选择的1种的药物－接头结构在每1抗体上的平均连接数为2～8个的范围。

[61][57]或[58]所述的制造方法，其中，选择的1种的药物－接头结构在每1抗体上的平均连接数为3～8个的范围。

[62][57]～[61]中任一项所述的制造方法，其中，抗体－药物偶联物作为靶标的细胞为肿瘤细胞。

[63][57]～[61]中任一项所述的制造方法，其中，抗体为抗A33抗体、抗B7－H3抗体、抗CanAg抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、或抗Mesothelin抗体。

[64][57]～[61]中任一项所述的制造方法，其中，抗体为抗B7－H3抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、或抗CD70抗体。

[65][57]～[61]中任一项所述的制造方法，其中，抗体为抗B7－H3抗体。

[66]抗体－药物偶联物，其是利用[57]～[65]中任一种制造方法得到的。

[67]抗体－药物偶联物，其是在抗体的铰链部的硫醚键部分形成硫醚键而得到的，其特征在于，在还原条件下对抗体进行处理后，使选自以下化合物组中的化合物反应：

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

此处，(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化37]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化38]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[68]抗体－药物偶联物，其是在抗体的铰链部的硫醚键部分形成硫醚键而得到的，其特征在于，在还原条件下对抗体进行处理后，使选自以下化合物组中的化合物反应：

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)、或

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

此处，(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化39]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

[化40]

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

[69][67]或[68]所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种的药物－接头结构在每1抗体上的平均连接数为1～10个的范围。

[70][67]或[68]所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种的药物－接头结构在每1抗体上的平均连接数为2～8个的范围。

[71][67]或[68]所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种的药物－接头结构在每1抗体上的平均连接数为3～8个的范围。

[72][67]～[71]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体－药物偶联物作为靶标的细胞为肿瘤细胞。

[73][67]～[71]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗A33抗体、抗B7－H3抗体、抗CanAg抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、或抗Mesothelin抗体。

[74][67]～[71]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗B7－H3抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、或抗CD70抗体。

[75][67]～[71]中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗B7－H3抗体。

[76]下式所示的接头，其用于得到经由接头将药物和抗体连接而成的抗体－药物偶联物。

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

此处，L¹为连接于抗体的连接部位，L^c为连接于抗肿瘤性化合物的连接部位，

式中，

n¹表示0～6的整数，

此处，n⁵表示1～6的整数，n⁶表示1～6的整数，

L^P表示由2～7个氨基酸构成的肽残基，

L^a表示-C(＝O)-NH-、-NR¹-(CH₂)n⁷-、-O-、或单键，

L^b表示-CR²(-R³)-、-O-、-NR⁴-、或单键，

L^c表示-CH₂-或-C(＝O)-，

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

[化41]

-(N-ly-3-diminiccuS)-为下式：

[化42]

cyc.Hex(1,4)表示1，4-亚环己基，

[77][76]所述的接头，其选自以下组，其中，左端为与抗体的连接部位，右端为与抗肿瘤性化合物的连接部位。

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

[78][76]所述的接头，其选自以下组，其中，左端为与抗体的连接部位，右端为与抗肿瘤性化合物的连接部位。

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

[79][76]所述的接头，其选自以下组，其中，左端为与抗体的连接部位，右端为与抗肿瘤性化合物的连接部位。

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

[80][76]所述的接头，其选自以下组，其中，左端为与抗体的连接部位，右端为与抗肿瘤性化合物的连接部位。

发明的效果

通过经由特定结构的接头连接抗肿瘤性化合物依沙替康而成的抗体－药物偶联物，可实现优异的抗肿瘤效果及安全性。

附图说明

[图1]图1表示B7－H3变体(variant)1的氨基酸序列(序列号1)。

[图2]图2表示B7－H3变体2的氨基酸序列(序列号2)。

[图3]图3表示M30－H1型重链的氨基酸序列(序列号9)。

[图4]图4表示M30－H2型重链的氨基酸序列(序列号10)。

[图5]图5表示M30－H3型重链的氨基酸序列(序列号11)。

[图6]图6表示M30－H4型重链的氨基酸序列(序列号12)。

[图7]图7表示M30－L1型轻链的氨基酸序列(序列号13)。

[图8]图8表示M30－L2型轻链的氨基酸序列(序列号14)。

[图9]图9表示M30－L3型轻链的氨基酸序列(序列号15)。

[图10]图10表示M30－L4型轻链的氨基酸序列(序列号16)。

[图11]图11表示M30－L5型轻链的氨基酸序列(序列号17)。

[图12]图12表示M30－L6型轻链的氨基酸序列(序列号18)。

[图13]图13表示M30－L7型轻链的氨基酸序列(序列号19)。

[图14]图14表示M30抗体重链的氨基酸序列(序列号20)。

[图15]图15表示M30抗体轻链的氨基酸序列(序列号21)。

[图16]图16表示B7－H3变体1的核苷酸序列(序列号26)。

[图17]图17表示抗体－药物偶联物(2)对皮下移植的人黑色素瘤株A375细胞的效果。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，白三角线表示M30－H1－L4P抗体的效果，白色圆形线表示抗体－药物偶联物(2)的效果。

[图18]图18表示抗体－药物偶联物(2)对皮下移植的人黑色素瘤株A375细胞的效果。白色菱形线表示无处置的肿瘤，黑色方块线表示给予0.1mg/kg抗体－药物偶联物(2)时的效果，线－X－表示给予0.3mg/kg时的效果，黑色三角线表示给予1mg/kg时的效果，白色圆形线表示3mg/kg给予时的效果。

[图19]图19表示抗体－药物偶联物(2)对皮下移植的人非小细胞肺癌株Calu－6细胞的效果。白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色三角线表示M30－H1－L4P抗体的效果，白色圆形线表示抗体－药物偶联物(2)的效果。

[图20]图20表示抗体－药物偶联物(1)、(13)、(41)、(55)对皮下移植的人黑色素瘤株A375细胞胞的效果。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色圆形线表示抗体－药物偶联物(1)的效果，白色三角线表示抗体－药物偶联物(13)的效果，线－X－表示抗体－药物偶联物(41)的效果，白色方块线表示抗体－药物偶联物(55)的效果。

[图21]图21表示抗体－药物偶联物(13)、(41)、(55)对皮下移植的人非小细胞肺癌株Calu－6细胞的效果。白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色圆形线表示DE-310的效果，白色三角线表示抗体－药物偶联物(13)的效果，线－X－表示抗体－药物偶联物(41)的效果，白色方块线表示抗体－药物偶联物(55)的效果。

[图22]图22表示抗体－药物偶联物(17)、(18)、(19)、(59)、(60)、(61)对皮下移植的人黑色素瘤株A375细胞的效果。图中黑色菱形线表示无处置的肿瘤，黑色方块线表示抗体－药物偶联物(17)的效果，白色方块线表示抗体－药物偶联物(18)的效果，白色圆形线表示抗体－药物偶联物(19)的效果，黑色三角线表示抗体－药物偶联物(59)的效果，白色三角线表示抗体－药物偶联物(60)的效果，线－X－表示抗体－药物偶联物(61)的效果。

具体实施方式

本发明的抗体－药物偶联物是抗肿瘤性抗体经由接头结构部分连接抗肿瘤性化合物而成的抗肿瘤性药物，以下进行详细说明。

[抗体]

本发明的抗体－药物偶联物中使用的抗体指免疫球蛋白，是含有免疫特异性地与抗原结合的抗原结合部位的分子。作为本发明的抗体，可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY中的任一类(class)，优选IgG。另外，作为亚类(subclass)，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2中的任何，优选IgG1及IgG2。抗体可以来源于任一物种，但可优选例举人、大鼠、小鼠及兔。当来源于人以外的物种时，优选使用公知的技术，将其嵌合化或人源化。本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但优选单克隆抗体。

本发明的抗体只要是能将肿瘤细胞作为靶标的抗体即可。即，在经由接头连接具有抗肿瘤活性的药物后，作为抗体，优选具有能识别肿瘤细胞的特性、能结合于肿瘤细胞的特性、能进入到肿瘤细胞内而内化的特性、以及损伤肿瘤细胞的特性中的一种或更多种特性。

抗体向肿瘤细胞的结合性可使用流式细胞仪确认。抗体进入到肿瘤细胞内可使用以下方法确认：(1)使用与治疗抗体结合的二抗(荧光标记)、用荧光显微镜观察进入到细胞内的抗体的检验(Cell Death and Differentiation(2008)15,751-761)；(2)使用与治疗抗体结合的二抗(荧光标记)、测定进入到细胞内的荧光量的检验(Molecular Biology ofthe Cell Vol.15,5268-5282,December 2004)；或者，(3)Mab-ZAP检验，其中使用与治疗抗体结合的免疫毒素，其进入到细胞内之后会放出毒素从而抑制细胞增殖(BioTe chniques28:162-165,January 2000)。

抗体的抗肿瘤活性是指对肿瘤细胞的细胞毒活性、杀细胞效果，可通过在体外(invitro)测定抑制细胞增殖的抑制活性来确认。例如，可培养过量表达了抗体的靶标蛋白质的癌细胞株，向培养体系中添加各种浓度的抗体，测定针对灶点形成(focus formation)、集落(colony)形成及球体生长(spheroid growth)的抑制活性。可通过在体内(In vivo)，例如向移植了高表达靶标蛋白质的肿瘤细胞株的裸鼠(nude mouse)赋予抗体，测定癌细胞的变化，来确认抗肿瘤活性。需要说明的是，由于抗体－药物偶联物连接发挥抗肿瘤效果的药物，因而抗体自身不必须具有抗肿瘤效果，但具有抗肿瘤效果是更优选的。从发挥抗肿瘤效果方面考虑，抗体具有内化而转移至肿瘤细胞内的性质，对于通过药物特异性地·选择性地杀伤肿瘤细胞是重要的，是优选的。

作为这样的抗体，可例举抗A33抗体、抗B7－H3抗体、抗CanAg抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体，但不限于此。

作为本发明的抗体，优选为抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD70抗体及抗B7－H3抗体，进一步优选为抗B7－H3抗体。

本发明的抗体可通过使用本领域中通常实施的方法，用作为抗原的多肽对动物进行免疫，采集、纯化在生物体内产生的抗体而获得。抗原的来源不限于人，也可用来源于小鼠、大鼠等人以外的动物的抗原对动物进行免疫。该情况下，通过对与取得的异种抗原结合的抗体与人抗原的交叉性进行试验，可选出可应用于人的疾病的抗体。

另外，也可按照已知的方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，通过将产生针对抗原的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，从而建立杂交瘤，获得单克隆抗体。

需要说明的是，抗原可通过利用基因操作使宿主细胞产生编码抗原蛋白的基因而得到。具体而言，可制作可表达抗原基因的载体，将其导入至宿主细胞，使该基因表达，将表达的抗原纯化。

抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD70抗体可分别基于WO2002/043661、美国专利第5，773，001号、WO2006/113909，利用已知的手段得到。

作为本发明中使用的B7－H3抗体，优选具有以下特性的抗体。

(1)抗体，其特征在于，具有以下特性；

(a)特异性地与B7－H3结合，

(b)具有抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)活性

(c)在体内(in vivo)具有抗肿瘤活性

(2)上述(1)所述的抗体或该抗体，其中，B7－H3为包含序列号1或2中记载的氨基酸序列的分子。

(3)上述(1)或(2)所述的抗体，其中，作为重链中的互补性决定区，具有：包含序列号3所示的氨基酸序列的CDRH1、包含序列号4所示的氨基酸序列的CDRH2及包含序列号5所示的氨基酸序列的CDRH3，以及，作为轻链中的互补性决定区，具有：包含序列号6所示的氨基酸序列的CDRL1、包含序列号7所示的氨基酸序列的CDRL2及包含序列号8所示的氨基酸序列的CDRL3。

(4)上述(1)～(3)中任一项所述的抗体，其中，恒定区为来源于人的恒定区。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其是经人源化的。

(6)上述(5)所述的抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：

所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列选自(a)序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列、(b)序列号10中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列、(c)序列号11中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列、(d)序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列、(e)与(a)～(d)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、及(f)(a)～(d)的序列中1个或数个氨基酸被缺失、取代或添加而成的氨基酸序列，以及

所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列选自(g)序列号13中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(h)序列号14中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(i)序列号15中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(j)序列号16中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(k)序列号17中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(l)序列号18中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(m)序列号19中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列、(n)与(g)～(m)的序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、及(o)(g)～(m)的序列中1个或数个氨基酸被缺失、取代或添加而成的氨基酸序列。

(7)上述(6)所述的抗体，其具有选自下组的重链可变区和轻链可变区：

所述组由：包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号13中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号14中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号15中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号16中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号17中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号18中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号19中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号13中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号14中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号15中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区、以及包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链的可变区及包含序列号16中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链的可变区

构成。

(8)上述(6)或(7)所述的抗体，其包含选自下组的重链和轻链：

所述组由

选自包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号17中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号18中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号19中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链、以及包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链

构成。

(9)上述(6)～(8)中任一项所述的抗体，其包含选自下组的重链和轻链：

所述组由：

包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号17中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号18中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号19中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中记载的氨基酸序列的轻链、包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中记载的氨基酸序列的轻链、以及包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中记载的氨基酸序列的轻链

构成。

(10)上述(8)或(9)所述的抗体，其中，重链为序列号9或12中记载的氨基酸序列中羧基末端的氨基酸缺失的重链。

(11)抗体，其是利用下述的制造抗体的方法得到的，所述制造抗体的方法包括以下工序：工序(1)，培养经下述表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体含有编码上述(1)～(10)中任一项所述的抗体的多核苷酸；及工序(2)，从在工序(1)中得到的培养物中收集目标抗体。

(12)上述(1)～(11)中任一项所述的抗体，为了增强抗体依赖性细胞损伤活性，而进行了糖链修饰。

以下，对本发明中使用的B7－H3抗体进行说明。

本说明书中，“癌”与“肿瘤”以相同含义使用。

本说明书中，术语“基因”，不仅包括DNA，还包括其mRNA、cDNA及其cRNA。

本说明书中，术语“多核苷酸”，以与核酸相同的含义使用，其也包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸、及引物。

本说明书中，“多肽”和“蛋白质”以无区别的方式使用。

本说明书中，“细胞”也包括动物个体内的细胞、培养细胞。

本说明书中，“B7－H3”以与B7－H3蛋白质相同的含义使用，还表示B7－H3变体1及/或B7－H3变体2。

本说明书中的“CDR”指互补性决定区(CDR：Complemetarity deterring region)。已知抗体分子的重链及轻链中分别有3个CDR。CDR也被称为高度可变区(hypervariabledomain)，其为在抗体的重链及轻链的可变区内一级结构的变异性特别高的部位，在重链及轻链的多肽链的一级结构上，分别地，分离在3处。本说明书中，关于抗体的CDR，将重链的CDR从重链氨基酸序列的氨基末端侧开始表示为CDRH1、CDRH2、CDRH3，将轻链的CDR从轻链氨基酸序列的氨基末端侧开始表示为CDRL1、CDRL2、CDRL3。这些部位在立体结构上相互接近，决定针对结合的抗原的特异性。

本发明中，“在严格条件下进行杂交”是指，在市售的杂交溶液ExpressHybHybridization Solution(Clontech,Inc.制)中于68℃进行杂交，或者，在通过使用固定有DNA的滤膜、在0.7－1.0M的NaCl存在下于68℃进行杂交、然后使用0.1－2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度SSC中包含150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)于68℃进行洗涤，而能够进行鉴定的条件下或在与其同等的条件下进行杂交。

1.B7－H3

B7－H3是在抗原递呈细胞中作为辅助刺激分子表达的B7家族中的一员，认为其作用于T细胞上的受体而促进或抑制免疫作用。

B7－H3是具有1级膜贯通结构的蛋白质，在B7－H3的N末端侧的细胞外区域存在2种变体。B7－H3变体1(4Ig－B7－H3)中存在各2处的V或C样Ig结构域(domain)，B7－H3变体2(2Ig－B7－H3)中存在各1处的V或C样Ig结构域。

本发明中使用的B7－H3可从人、非人哺乳动物(大鼠、小鼠等)的B7－H3表达细胞中直接纯化而使用，或制备该细胞的细胞膜级分而使用，另外，可通过体外(in vitro)合成B7－H3、或利用基因操作而在宿主细胞中产生而获得。基因操作中，具体而言，将B7－H3cDNA并入可表达的载体，然后在含有进行转录和翻译而需要的酶、底物及能量物质的溶液中进行合成，或通过转化其他原核生物、或真核生物的宿主细胞而表达B7－H3，由此，可得到该蛋白质。

人B7－H3变体1基因的开放阅读框(ORF)的氨基酸序列记载于序列表的序列号1。另外，序列号1的序列记载于图1。

人B7－H3变体2基因的ORF的氨基酸序列记载于序列表的序列号2。另外，序列号2的序列记载于图2。

另外，包含在上述各B7－H3的氨基酸序列中1个或数个氨基酸被取代、缺失及/或添加而成的氨基酸序列、并且与该蛋白质具有同等的生物活性的蛋白质也包含在B7－H3中。

除去信号序列的成熟人B7－H3变体1相当于包含序列号1所示的氨基酸序列的第27位至第534位的氨基酸残基的氨基酸序列。另外，除去信号序列的成熟人B7－H3变体2相当于包含序列号2所示的氨基酸序列的第27位至第316位的氨基酸残基的氨基酸序列。

2.抗B7－H3抗体的制造

本发明的针对B7－H3的抗体可使用常规方法用选自B7－H3或B7－H3的氨基酸序列中的任意的多肽对动物进行免疫，收集、纯化在生物体内产生的抗体而得到。作为抗原的B7－H3的生物种类不限于人，也可使用来源于小鼠、大鼠等人以外的动物的B7－H3对动物进行免疫。该情况下，通过对取得的异种B7－H3结合的抗体与人B7－H3的交叉性进行试验，可选出可应用于人的疾病的抗体。

另外，也可按照已知的方法(例如，Kohler and Milstein，Nat ure(1975)256，p.495－497、Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibodi es，p.365－367，Plenum Press，N.Y.(1980))，通过将产生针对B7－H3的抗体的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合而建立杂交瘤，得到单克隆抗体。

需要说明的是，作为抗原的B7－H3可通过利用对B7－H3基因进行基因操作而在宿主细胞中表达而得到。

具体而言，可制作可表达B7－H3基因的载体，将其导入至宿主细胞，使该基因表达，将表达的B7－H3纯化。以下，具体说明针对B7－H3的抗体的取得方法。

(1)抗原的制备

作为用于制作抗B7－H3抗体的抗原，可举出B7－H3或包含其至少6个连续氨基酸的部分氨基酸序列的多肽、或向它们中添加任意的氨基酸序列或载体而成的衍生物。

B7－H3可从人的肿瘤组织或肿瘤细胞中直接纯化而使用，另外，可通过体外(invitro)合成B7－H3、或利用基因操作而在宿主细胞中产生而获得。

基因操作中，具体而言，将B7－H3的cDNA并入可表达的载体，然后在含有进行转录和翻译而需要的酶、底物及能量物质的溶液中进行合成，或通过转化其他原核生物、或真核生物的宿主细胞而表达B7－H3，由此，可得到抗原。

另外，也可通过使连接作为膜蛋白质的B7－H3的细胞外区域与抗体的恒定区的融合蛋白质在适当的宿主·载体系中表达，从而作为分泌蛋白质而得到抗原。

B7－H3的cDNA例如可通过所谓PCR方法而获得：以表达B7－H3的cDNA的cDNA文库作为模板，使用特异性地扩增B7－H3cDNA的引物，进行聚合酶链反应(以下称为“PCR”)(参照Saiki，R.K.，等.Science(1988)239，p.487－489)。

作为多肽的体外(in vitro)合成，可举出例如Roche Diagnostics,Inc.制的Rapid Translation System(RTS)，但不限于此。

作为原核细胞的宿主，可举出例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。为了将目标基因在这些宿主细胞内转化，用包含来源于能适合于宿主的种类的复制子即复制起点、调节序列的质粒载体转化宿主细胞。另外，作为载体，优选具有可向转化细胞赋予表现型(表型)的选择性赋予的序列的载体。

真核细胞的宿主细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞，作为脊椎动物细胞，常使用例如作为猴的细胞的COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175－182、ATCC CRL－1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL－1658)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞、ATCCCCL－61)的二氢叶酸还原酶缺陷株系(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，p.4126－4220)等，但不限于这些。

可按照常规方法培养如上所述地得到的转化体，通过该培养，可在细胞内或细胞外产生目标多肽。

作为该培养中使用的培养基，可适当选择与采用的宿主细胞相应的常用的各种培养基，如果是大肠杆菌，例如，可根据需要向LB培养基中添加氨苄西林等抗生素、IPMG而使用。

通过上述培养而在转化体的细胞内或细胞外产生的重组蛋白可通过利用了该蛋白质的物理性质、化学性质等的各种已知的分离操作方法进行分离·纯化。

作为该方法，具体而言，可例举例如基于通常的蛋白质沉淀剂的处理、超滤、分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种液相色谱法、透析法、它们的组合等。

另外，通过在表达的重组蛋白上连接包括6个残基的组氨酸标签，从而能用镍亲和柱高效地纯化。或者，通过在表达的重组蛋白上连接IgG的Fc区域，从而能用蛋白A柱高效地纯化。

通过组合上述方法，能容易地以高收率、高纯度大量制造目标多肽。

(2)抗B7－H3单克隆抗体的制造

作为与B7－H3特异性地结合的抗体的例子，可举出与B7－H3特异性地结合的单克隆抗体，其取得方法如下所述。

在制造单克隆抗体时，通常需要下述这样的作业工序。

即，

(a)纯化作为抗原使用的生物体高分子，

(b)通过向动物注射抗原而将其免疫后，采集血液并检测其抗体效价，确定脾脏摘出的时机，然后制备抗体产生细胞的工序，

(c)制备骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)，

(d)进行抗体产生细胞与骨髓瘤的细胞融合，

(e)筛选产生目标抗体的杂交瘤群，

(f)分割成单一细胞克隆(克隆)，

(g)根据情况，培养用于大量制造单克隆抗体的杂交瘤，或饲育移植了杂交瘤的动物，

(h)对如上所述地制造的单克隆抗体的生理活性、及其结合特异性进行研究，或检验作为标记试剂的特性，等等。

以下，按照上述工序的顺序详细说明单克隆抗体的制作方法，但该抗体的制作方法不限于此，例如也可使用脾细胞以外的抗体产生细胞及骨髓瘤。

(a)抗原的纯化

作为抗原，可使用利用上述那样的方法制备的B7－H3或其一部分。

另外，也可将利用B7－H3表达重组体细胞而制备的膜级分、或B7－H3表达重组体细胞自身、以及利用本领域技术人员公知的方法化学合成而得到的本发明的蛋白质的部分肽作为抗原使用。

(b)抗体产生细胞的制备

将工序(a)中得到的抗原、与弗氏完全或不完全佐剂、或硫酸铝钾之类的助剂混合，作为免疫原而免疫实验动物。作为实验动物，可无障碍地使用已知的杂交瘤制作方法中使用的动物。具体而言，可使用例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。但是，从与摘出的抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞的获得容易性等的观点考虑，优选将小鼠或大鼠作为被免疫动物。

另外，对于实际使用的小鼠及大鼠的系统没有特别限制，在小鼠的情况下，例如可使用各系统A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，而在大鼠的情况下，例如可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。

这些小鼠及大鼠可从例如CLEA Japan,Inc.、Charles River LaboratoriesJapan,Inc.等实验动物饲育销售商获得。

其中，考虑到与后述的骨髓瘤细胞的融合适应性，作为被免疫动物，关于小鼠，特别优选BALB/c系统，关于大鼠，特别优选Wistar及Low系统。

另外，考虑抗原的人与小鼠的同源性，优选使用除去了自身抗体的降低了生物体机能的小鼠，即自己免疫疾病小鼠。

需要说明的是，这些小鼠或大鼠的免疫时的周龄优选为5～12周龄、进一步优选为6～8周龄。

为了通过B7－H3或其重组体而将动物免疫，可使用例如Weir，D.M.，Handbook ofExperimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)、Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles CThomas Publisher Springfield，Illinois(1964)等中详细记载的已知的方法。

这些免疫方法中，可合适地用于本发明中的方法例如如下所述。

即，首先，将作为抗原的膜蛋白质级分、或表达抗原的细胞向动物的皮内或腹腔内给予。

但是，为了提高免疫效率，优选并用两者，前半段进行皮内给予，后半段或仅最终进行腹腔内给予，可特别地提高免疫效率。

抗原的给予时间表根据被免疫动物的种类、个体差别等的不同而不同，通常，优选设定为抗原给予次数为3～6次、给予间隔为2～6周，进一步优选给予次数为3～4次、给予间隔为2～4周。

另外，抗原的给予量根据动物的种类、个体差别等的不同而不同，通常设定为0.05～5mg、优选0.1～0.5mg左右。

对于追加免疫而言，在如上所述的抗原给予的1～6周后、优选2～4周后、进一步优选2～3周后进行。

需要说明的是，进行追加免疫时的抗原给予量根据动物的种类、大小等的不同而不同，通常，例如小鼠情况下，设定为0.05～5mg、优选0.1～0.5mg、进一步优选0.1～0.2mg左右。

从上述追加免疫开始1～10天后、优选2～5天后、进一步优选2～3天后，无菌地从被免疫动物取出包含抗体产生细胞的脾脏细胞或淋巴细胞。此时，测定抗体效价，若将抗体效价达到足够高的动物作为抗体产生细胞的供给源使用，可提高以后的操作的效率。

作为此处使用的抗体效价的测定方法，可举出例如RIA法或ELISA法，但不限于这些方法。

本发明中的抗体效价的测定例如可利用ELISA法，按照以下记载的步骤进行。

首先，将纯化或部分纯化的抗原吸附于ELISA用96孔板等的固相表面，进而利用与抗原没有关系的蛋白质例如牛血清白蛋白(以下称为“BSA”)覆盖未吸附抗原的固相表面，将该表面洗涤，使其接触作为一抗的分级稀释的试样(例如小鼠血清)，使上述抗原与试样中的抗体结合。

进而，作为二抗，添加经酶标记的针对小鼠抗体的抗体，使其与小鼠抗体结合，洗涤后添加该酶的底物，通过测定因基于底物分解而发生的显色而导致的吸光度的变化等，而算出抗体效价。

可按照已知的方法从被免疫动物的脾脏细胞或淋巴细胞分离抗体产生细胞(例如，Kohler等.，Nature(1975)256，p.495，；Kohler等.，Eur.J.Immunol.(1977)6，p.511，；Milstein等.，Nature(1977)，266，p.550，；Walsh，Nature，(1977)266，p.495)。例如，在脾脏细胞的情况下，可利用普通方法分离抗体产生细胞：将脾脏切碎，用不锈钢网过滤细胞，然后悬浮于伊格尔最小限度培养基(MEM)，分离抗体产生细胞。

(c)骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)的制备

对于用于细胞融合的骨髓瘤细胞没有特别限制，可以从已知的细胞株中适当选择。但是，考虑到从融合细胞选择杂交瘤时的便利性，优选使用其选择过程已确立的HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，Hypoxanthine－guanine phosphoribosyltransferase)缺损株。

即，为来源于小鼠的X63－Ag8(X63)、NS1－ANS/1(NS1)、P3X63－Ag8.U1(P3U1)、X63－Ag8.653(X63.653)、SP2/0－Ag14(SP2/0)、MPC11－45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等，来源于大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，来源于人的U266AR(SKO－007)、GM1500·GTG－A12(GM1500)、UC729－6、LICR－LOW－HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4－1(NP41)等。这些HGPRT缺损株例如可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)等获得。

对于这些细胞株而言，用适当的培养基例如8－氮鸟嘌呤培养基[在RPMI－1640培养基中添加了谷氨酰胺、2－巯基乙醇、庆大霉素、及胎牛血清(以下称为“FBS”)，进一步添加8－氮鸟嘌呤而成的培养基]、Iscove改良Dulbecco培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium；以下称为“IMDM”)、或用Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium；称为以下“DMEM”)进行继代培养，在细胞融合的3～4天前用正常培养基[例如含有10％FCS的ASF104培养基(味之素株式会社制)]进行继代培养，在融合当天预先确保2×10⁷以上的细胞数。

(d)细胞融合

对于抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的融合而言，可按照已知的方法(Weir，D.M.，Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell ScientificPublications，Oxford(1987)、Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，ExperimentalImmunochemistry，Charles C Thomas Publisher Springfield，Illinois(1964)等)，在不极度降低细胞的生存率的程度的条件下适当实施。

这样的方法例如可使用在聚乙二醇等高浓度聚合物溶液中混合抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的化学方法、利用电刺激的物理方法。其中，上述化学方法的具体例如下所示。

即，当使用聚乙二醇作为高浓度聚合物溶液时，在分子量1500～6000、优选2000～4000的聚乙二醇溶液中，于30～40℃、优选35～38℃的温度对抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行1～10分钟、优选5～8分钟混合。

(e)杂交瘤群的选择

对于通过上述细胞融合而得到的杂交瘤的选择方法没有特别限制，通常可使用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸嘧啶核苷，hypoxanthine,aminopterin,thymidine)选择法(Kohler等.，Nature(1975)256，p.495；Milstein等.，Nature(1977)266，p.550)。

该方法在使用无法在氨基蝶呤中生存的HGPRT缺损株的骨髓瘤细胞得到杂交瘤的情况下是有效的。

即，通过在HAT培养基中培养未融合细胞及杂交瘤，从而仅选择性地残留具有针对氨基蝶呤的耐性的杂交瘤，并且使其增殖。

(f)分割成单一细胞克隆(克隆)

作为杂交瘤的克隆法，例如可使用甲基纤维素法、软琼脂糖法、有限稀释法等已知的方法(例如参照Barbara，B.M.and Stanley，M.S.：Selected Methods in CellularImmunology，W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))。这些方法中，特别优选甲基纤维素法等三维培养法。例如，将通过细胞融合而形成的杂交瘤群悬浮于ClonaCell－HYSelection Medium D(StemCell Technologies公司制#03804)等甲基纤维素培养基中而进行培养，通过回收形成的杂交瘤集落，而可得到单克隆杂交瘤。培养回收的各杂交瘤集落，在得到的杂交瘤培养上清液中，选择稳定确认抗体效价的株作为B7－H3单克隆抗体产生杂交瘤株。

作为如上所述地建立的杂交瘤株的例子，可举出B7－H3杂交瘤M30。需要说明的是，本说明书中，将B7－H3杂交瘤M30所产生的抗体记载为“M30抗体”或简记为“M30”。

M30抗体的重链具有序列表的序列号20所示的氨基酸序列。另外，M30抗体的轻链具有序列表的序列号21所示的氨基酸序列。需要说明的是，序列表的序列号20所示的重链氨基酸序列中，由第1～19位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由第20～141位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，由第142～471位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。另外，序列表的序列号21所示的轻链氨基酸序列中，由第1～22位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由第23～130位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，由第131～235位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

(g)通过培养杂交瘤来制备单克隆抗体

对于如上所述地选择的杂交瘤而言，可通过对其进行培养，而高效地得到单克隆抗体，但优选在培养之前，筛选产生目标单克隆抗体的杂交瘤。

该筛选可采用已知的方法进行。

本发明中的抗体效价的测定例如可利用在上述(b)项中说明的ELISA法进行。

利用以上的方法得到的杂交瘤，可在液氮中或－80℃以下的冰箱中以冷冻状态进行保存。

对于完成了克隆的杂交瘤，将培养基从HT培养基换成正常培养基而进行培养。

大量培养可利用使用了大型培养瓶的旋转培养、或旋动培养进行。从该大量培养中的上清液中，利用凝胶过滤等本领域技术人员公知的方法进行纯化，从而可得到本发明的特异性地与蛋白质结合的单克隆抗体。

另外，向同系的小鼠(例如，上述的BALB/c)、或Nu/Nu小鼠的腹腔内注射杂交瘤，使该杂交瘤增殖，由此，可得到大量含有本发明的单克隆抗体的腹水。

当在腹腔内给予时，如果事先(3～7天前)给予2，6，10，14－四甲基十五烷(2，6，10，14－tetramethyl pentadecane)(姥鲛烷)等矿物油，则可得到量更多的腹水。

例如，向与杂交瘤同系的小鼠的腹腔内预先注射免疫抑制剂，使T细胞失活，然后20天后，使10⁶～10⁷个的杂交瘤·克隆细胞悬浮于不含血清的培养基中(0.5ml)并向腹腔内给予，通常，在腹部膨胀、腹水积存时，从小鼠采集腹水。通过该方法，可得到与培养液中相比为约100倍以上的浓度的单克隆抗体。

通过上述方法得到的单克隆抗体例如可利用Weir，D.M.：Hand book ofExperimental Immunology，Vol.I，II，III，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1978)中记载的方法纯化。

如上所述地得到的单克隆抗体针对B7－H3具有高抗原特异性。

(h)单克隆抗体的检测

对于如上所述地得到的单克隆抗体的同种型及亚类，可如下所述地进行确定。

首先，作为鉴定法，可举出Ouchterlony法、ELISA法、或RIA法。

Ouchterlony法虽然简单，但在单克隆抗体浓度低时需要进行浓缩操作。

另一方面，当使用ELISA法或RIA法时，使培养上清液与抗原吸附固相直接反应，进而使用作为二抗的各种免疫球蛋白同种型、亚类相对应的抗体，由此，可鉴定单克隆抗体的同种型、亚类。

另外，作为更简单的方法，也可利用市售的鉴定用的试剂盒(例如，Mouse TyperKit；Bio-Rad Laboratories,Inc.制)等。

此外，蛋白质的定量可利用Folin Lowry法、及从280nm时的吸光度[1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml]计算的方法进行。

此外，当再次实施(2)的(a)～(h)的工序，另外地独立获得单克隆抗体时，可获得与M30抗体具有同等的细胞损伤活性的抗体。作为这样的抗体中的一例，可举出与M30抗体结合至相同表位的抗体。M30识别作为B7－H3的细胞外区域中的结构域的IgC1结构域或IgC2结构域中的表位，与IgC1结构域或IgC2结构域或两者结合，因此，尤其是可举出存在于B7－H3的IgC1结构域或IgC2结构域的表位作为该表位。新制作的单克隆抗体结合于M30抗体结合的部分肽或部分立体结构时，可判断为该单克隆抗体结合于与M30抗体相同的表位。另外，通过确认该单克隆抗体与M30抗体竞争向B7－H3结合(即，该单克隆抗体妨碍M30抗体与B7－H3的结合)，从而即使不确定具体的表位的序列或结构，也能判断该单克隆抗体与M30抗体结合于相同的表位。在确认到表位相同的情况下，可强烈预期该单克隆抗体具有与M30抗体同等的细胞损伤活性。

(3)其他抗体

本发明的抗体中，除了包括上述针对B7－H3的单克隆抗体之外，还包括以降低针对人的异种抗原性等为目的而进行了人为修饰的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人抗体等。这些抗体可使用已知的方法制造。

作为嵌合抗体，可举出将抗体的可变区和恒定区互不相同的抗体例如来源于小鼠或大鼠来源的可变区接合于来源于人的恒定区而成的嵌合抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851－6855，(1984))。

作为人源化抗体，可举出向来源于人的抗体仅组合了互补性决定区(CDR；complementarity determining region)而成的抗体(参照Nature(1986)321，p.522－525)、利用CDR移植法除了向人抗体移植CDR的序列之外、还移植一部分构架的氨基酸残基而成的抗体(国际公开小册子WO90/07861)。

然而，作为来源于M30抗体的人源化抗体，只要保持M30抗体的全部6种CDR序列、具有抗肿瘤活性即可，不限于特定的人源化抗体。需要说明的是，M30抗体的重链可变区具有包含序列表的序列号3所示的氨基酸序列的CDRH1(NYVMH)、包含序列号4所示的氨基酸序列的CDRH2(YINPYNDDVKYNEKFKG)、及包含序列号5所示的氨基酸序列的CDRH3(WGYYGSPLYYFDY)。另外，M30抗体的轻链可变区具有包含序列表的序列号6所示的氨基酸序列的CDRL1(RASSRLIYMH)、包含序列号7所示的氨基酸序列的CDRL2(ATSNLAS)、及包含序列号8所示的氨基酸序列的CDRL3(QQWNSNPPT)。

作为小鼠抗体M30的人源化抗体的实例，可举出下述重链和下述轻链的任意组合，所述重链包括含有(1)包含序列表的序列号9、10、11或12的第20～141位的氨基酸残基的氨基酸序列、(2)与上述(1)的氨基酸序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、及(3)包含在上述(1)的氨基酸序列中1个或数个氨基酸被缺失、取代或添加而成的氨基酸序列中的任一的重链可变区，所述轻链包括含有(4)包含序列号13、14、15、16、17、18或19的第21～128位的氨基酸残基的氨基酸序列、(5)与上述(4)的氨基酸序列具有至少95％以上的同源性的氨基酸序列、及(6)包含在上述(4)的氨基酸序列中1个或数个氨基酸被缺失、取代或添加而成的氨基酸序列中任一的轻链可变区。

需要说明的是，本说明书中的“数个”指1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、或1或2个。

另外，作为本说明书中的氨基酸的取代，优选保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是，在与氨基酸侧链相关的氨基酸群组内发生的取代。优选的氨基酸群组如下所述：酸性群组＝天冬氨酸、谷氨酸；碱性群组＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性群组＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；及非带电极性家族＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。其他的优选氨基酸群组如下所述：脂肪族羟基群组＝丝氨酸及苏氨酸；含酰胺群组＝天冬酰胺及谷氨酰胺；脂肪族群组＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；以及芳香族群组＝苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸。所述氨基酸取代，优选在不降低具有原来的氨基酸序列的物质的特性的范围内进行。

作为上述重链及轻链的优选组合的抗体，可举出包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号13中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号14中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号15中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号16中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号17中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号18中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号9中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号19中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号13中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号14中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，包括具有包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号15中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体，以及包括具有包含序列号12中氨基酸编号20～141中记载的氨基酸序列的重链可变区的重链及具有包含序列号16中氨基酸编号21～128中记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的抗体。

作为更优选组合的抗体，可举出：

包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号17中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号18中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号19中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中氨基酸编号第21～233位的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中氨基酸编号第21～233位的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、以及包括包含序列号12中氨基酸编号20～471中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中氨基酸编号21～233中记载的氨基酸序列的轻链的抗体。

另外，作为其他一些优选组合，可举出包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号17中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号18中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号9中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号19中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号13中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号14中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、包括包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号15中记载的氨基酸序列的轻链的抗体、以及包括包含序列号12中记载的氨基酸序列的重链及包含序列号16中记载的氨基酸序列的轻链的抗体。

可通过将显示与上述的重链氨基酸序列及轻链氨基酸序列的高同源性的序列进行组合，来选择具有与上述的各抗体同等的细胞损伤性活性的抗体。这样的同源性通常为80％以上的同源性，优选为90％以上的同源性，更优选为95％以上的同源性，最优选为99％以上的同源性。另外，还可通过将重链或轻链的氨基酸序列中1个～数个氨基酸残基被取代、缺失或添加的氨基酸序列进行组合，来选择具有与上述的各抗体同等的细胞损伤性活性的抗体。

两种氨基酸序列间的同源性可通过使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，ZhengZhang，Webb Miller，and David J.Lipman(1997)，“Gapped BLAST and PSI－BLAST：a newgeneration of protein database search programs”，Nucleic Acids Res.25：3389－3402)的默认参数而确定。Blast algorithm也可通过利用互联网访问www.ncbi.nlm.nih.gov/blast来使用。

需要说明的是，序列表的序列号9、10、11或12所示的重链氨基酸序列中，由第1～19位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由第20～141位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，由第142～471位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。分别地，序列号9的序列被记载于图3，序列号10的序列被记载于图4，序列号11的序列被记载于图5，序列号12的序列被记载于图6。

另外，序列表的序列号13、14、15、16、17、18或19所示的轻链氨基酸序列中，由第1～20位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由第21～128位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，由第129～233位的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。序列号13的序列被记载于图7，序列号14的序列被记载于图8，序列号15的序列被记载于图9，序列号16的序列被记载于图10，序列号17的序列被记载于图11，序列号18的序列被记载于图12，序列号19的序列被记载于图13。

作为本发明的抗体，还可举出结合于与M30抗体相同的表位的人抗体。抗B7－H3人抗体是指，仅具有来源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体。抗B7－H3人抗体可通过以下方法得到：使用了具有包含人抗体的重链和轻链的基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照Tomizuka，K.等.，Nature Genetics(1997)16，p.133－143，；Kuroiwa，Y.et.al.，Nucl.Acids Res.(1998)26，p.3447－3448；Yoshida，H.et.al.，Animal CellTechnology：Basic and Applied Aspects vol.10，p.69－73(Kitagawa，Y.，Matsuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999.；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，p.722－727等。)。

这样的人抗体产生小鼠具体可按照以下方式建立，通过制作敲除动物及转基因动物，以及使这些动物彼此交配，制作出以下动物：内源性免疫球蛋白重链及轻链的基因座被破坏，代替地，经由酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome，YAC)载体等导入了人免疫球蛋白重链及轻链的基因座的基因重组动物。

另外，也可通过基因重组技术，利用分别编码这样的人抗体的重链及轻链的cDNA、优选包含该cDNA的载体而转化真核细胞，培养产生基因重组人单克隆抗体的转化细胞，由此，从培养上清液中得到该抗体。

此处，作为宿主，可使用例如真核细胞、优选CHO细胞、淋巴细胞、骨髓瘤等哺乳动物细胞。

另外，还已知取得从人抗体文库中筛选的噬菌体展示来源的人抗体的方法(参照Wormstone，I.M.et.al，Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002)43(7)，p.2301－2308；Carmen，S.et.al.，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002)，1(2)，p.189－203；Siriwardena，D.et.al.，Ophthalmology(2002)109(3)，p.427－431等。)。

例如，可使用使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)而在噬菌体表面表达，选择与抗原结合的噬菌体的噬菌体展示法(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105－1116)。

通过对通过与抗原结合而选择的噬菌体的基因进行分析，可确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。

如果明确与抗原结合的scFv的DNA序列，则可通过制作具有该序列的表达载体，导入至适当的宿主而使其表达，从而取得人抗体(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433－455、Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105－1116)。

若新制作的人抗体结合于M30抗体的结合部分肽或部分立体结构，则可判断为该人抗体结合于与M30抗体相同的表位。另外，通过确认该人抗体与M30抗体竞争性地结合B7－H3(即，该人抗体妨碍M30抗体与B7－H3的结合)，从而即使不确定具体的表位的序列或结构，也能判断该人抗体与M30抗体结合于相同的表位。当确认了表位相同时，强烈期待该人抗体具有与M30抗体同等的细胞损伤活性。

对于通过以上的方法得到的嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体，可利用已知的方法等评价针对抗原的结合性，选出合适的抗体。

作为比较抗体性质时的其他指标的一例，可举出抗体的稳定性。差示扫描量热测定仪(DSC)是能快速且准确地测定适于作为蛋白的相对结构稳定性的指标的热变性中点(Tm)的装置。使用DSC测定Tm值，比较其值，由此可比较热稳定性的不同。抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性显示一定程度的相关性(Lori Burton，et.al.，PharmaceuticalDevelopment and Technology(2007)12，p.265－273)，以热稳定性为指标，可选出合适的抗体。作为用于选出抗体的其他指标，可举出在适当的宿主细胞中的收量高，以及在水溶液中的凝集性低。例如收量最高的抗体不一定显示最高的热稳定性，因此，有必要基于上文说明的指标综合判断，选出最合适向人给予的抗体。

本发明的抗体中也包括抗体的修饰体。该修饰体是指，对本发明的抗体实施化学修饰或生物修饰而成的修饰体。化学修饰体中，包括化学部分连接于氨基酸骨架的化学修饰体、连接于N－连接或O－连接的糖链的化学修饰体等。生物修饰体中，包括翻译后经修饰(例如，N－连接或O－连接的糖基化、N末端或C末端的加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化)的生物修饰体，使用原核生物宿主细胞进行表达从而于N末端添加甲硫氨酸残基而得到的生物修饰体。另外，为了能进行本发明的抗体或抗原的检出或分离而标记的标记物例如酶标记物、荧光标记物、亲和标记物也被包括在所述修饰物的含义之内。这样的本发明的抗体的修饰物对于改善原来的本发明的抗体的稳定性及血中滞留性、抗原性的降低、所述抗体或抗原的检出或分离等是有用的。

另外，通过调节连接于本发明的抗体的糖链修饰(糖基化、脱岩藻糖化等)，可增强抗体依赖性细胞损伤活性。作为抗体的糖链修饰的调节技术，已知WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等，但不限于此。本发明的抗体也包括调节了该糖链修饰的抗体。

在分离抗体基因后，导入至适当的宿主来制作抗体时，可使用适当的宿主与表达载体的组合。作为抗体基因的具体例，可举出组合编码本说明书中记载的抗体的重链序列的基因、及编码轻链序列的基因而成的抗体基因。当转化宿主细胞时，重链序列基因和轻链序列基因可被插入到同一表达载体中，或者也可被插入到分别的表达载体中。

当将真核细胞作为宿主使用时，可使用动物细胞、植物细胞、真核微生物。尤其是，作为动物细胞，可举出哺乳类细胞，例如，作为猴的细胞的COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175－182、ATCC CRL－1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL－1658)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞、ATCC CCL－61)的二氢叶酸还原酶缺损株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126－4220)。

当使用原核细胞时，例如可举出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

通过转化而向这些细胞中导入目标抗体基因，通过体外(in vitro)培养经转化的细胞，而可得到抗体。该培养中，随着抗体的序列的不同，收量有时存在差异，在具有同等结合活性的抗体中，可使用收量作为指标筛选出容易生产药物的抗体。因此，本发明的抗体中也包括通过以下制造方法得到的抗体，所述方法的特征在于，包括培养上述经转化的宿主细胞的工序，及从在该工序中得到的培养物中收集目标抗体或该抗体的功能性片段的工序。

需要说明的是，已知哺乳类培养细胞所生产的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A，705：129－134(1995))，另外，重链羧基末端的甘氨酸、赖氨酸的2个氨基酸残基缺失，新位于羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化(AnalyticalBiochemistry，360：75－83(2007))。然而，这些重链序列的缺失及修饰不影响抗体的抗原结合能力及效应子功能(补体的活化、抗体依赖性细胞毒作用等)。因此，本发明也包括受到了该修饰的抗体及该抗体的功能性片段，可举出在重链羧基末端缺失1个或2个氨基酸的缺失体、被经酰胺化的该缺失体(例如羧基末端部位的脯氨酸残基被酰胺化的重链)等。但是，只要能保持抗原结合能力及效应子功能即可，本发明涉及的抗体的重链的羧基末端的缺失体不限于上述种类。构成本发明涉及的抗体的2条重链可以是完全长度及选自上述的缺失体中的重链中的任一种，也可以是任意两种的组合。各缺失体的量比可受到产生本发明涉及的抗体的哺乳类培养细胞的种类及培养条件的影响，作为本发明涉及的抗体的主成分，可举出2条重链的双方的羧基末端的1个氨基酸残基缺失的情况。

作为本发明的抗体的同种型，可举出例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)等，可优选举出IgG1或IgG2。

作为抗体的功能，通常，可举出抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞损伤(ADCC)活性及补体依赖性细胞损伤(CDC)活性，本发明涉及的抗体所具有的功能是针对B7－H3的结合活性，优选为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)活性，更优选为针对肿瘤细胞的通过ADCP活性的细胞损伤活性(抗肿瘤活性)。进而，本发明的抗体除了具有ADC P活性之外，还可以同时具有ADCC活性及/或CDC活性。

对于得到的抗体，可纯化至均一(homogeneity)。对于抗体的分离、纯化而言，可使用通常的蛋白质所使用的分离、纯化方法。例如，可适当选择、组合柱色谱法、滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等，可对抗体进行分离、纯化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory CourseManual，Daniel R.Marshak等.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring HarborLaboratory(1988))，但不限于这些。

作为色谱法，可举出亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、吸附色谱法等。

这些色谱法可利用HPLC、FPLC等液相色谱法进行。

作为亲和色谱法中使用的柱，可举出蛋白A柱、蛋白G柱。例如，作为使用了蛋白A柱的柱，可举出Hyper D，POROS，Sephar ose F.F.(Pharmacia)等。

另外，也可使用将抗原固定的载体，利用针对抗原的结合性来纯化抗体。

[抗肿瘤性化合物]

对于连接于本发明的抗体－药物偶联物的抗肿瘤性化合物进行说明。作为抗肿瘤性化合物，只要是具有抗肿瘤效果的化合物、具有能连接于接头结构的取代基、部分结构的化合物即可，没有特别限制。对于抗肿瘤性化合物而言，接头的一部分或全部在肿瘤细胞内被切断而游离出抗肿瘤性化合物部分从而显示抗肿瘤效果。在与药物的连接部分切断接头时，以抗肿瘤性化合物的本来的结构游离出抗肿瘤性化合物，发挥其本来的抗肿瘤效果。

作为抗肿瘤性化合物，可举出例如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(b leomycin)、安西他滨(cyclocytidine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、铂系抗肿瘤剂(顺铂(cisplatin)或其衍生物)、紫杉醇(taxol)或其衍生物、喜树碱或其衍生物(日本特开平6-87746号公报中记载的抗肿瘤剂)等。本发明的抗体－药物偶联物中，可优选使用作为喜树碱衍生物的依沙替康((1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮；下式：)

[化43]

该依沙替康具有优异的抗肿瘤活性，但尚未作为抗肿瘤药在市场上销售。该化合物可利用已知的方法容易地获得，可优选将1位的氨基作为连接于接头结构的连接部位使用。另外，有时依沙替康以连接接头的一部分的状态游离于肿瘤细胞内，即使在这样的状态下，也能发挥优异的抗肿瘤效果。

抗体－药物偶联物中，连接于1分子的抗体的药物的连接数是其影响有效性、安全性的重要因子。对于抗体－药物偶联物的制造而言，为了使药物的连接数为定数，可规定反应的原料·试剂的使用量等的反应条件而进行实施，但与低分子化合物的化学反应不同，通常以连接不同数目的药物的混合物的形式获得。用平均值即平均药物连接数，规定、表示连接于每分子抗体的药物的连接数。本发明中，原则上只要没有特别说明，即，除了表示具有不同的药物连接数的抗体－药物偶联物混合物中包含的具有特定的药物连接数的抗体－药物偶联物的情况之外，药物的连接数是指平均值。可控制连接于抗体分子的依沙替康的连接数，作为每抗体的药物平均连接数，可连接1～10个左右的依沙替康，优选为2～8个，更优选为3～8个。需要说明的是，本领域技术人员可根据本申请的实施例的记载，来设计在抗体上连接必要数目的药物的反应，可得到控制了依沙替康的连接数的抗体。

依沙替康具有喜树碱结构，由此可知，在酸性水性介质中(例如pH3左右)，平衡向形成内酯环的结构(闭环体)偏移，另一方面，在碱性水性介质中(例如pH10左右)，平衡向内酯环开环的结构(开环体)偏移。导入了对应于上述闭环结构及开环结构的依沙替康残基的药物偶联物，均可期待同等的抗肿瘤效果，显然无论哪一种均包含于本发明的范围内。

[接头结构]

对于本发明的抗体－药物偶联物中将抗肿瘤性药物与抗体连接的接头结构进行说明。该接头具有下式：

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

的结构，抗体连接于L¹的末端(与连接L²的一侧相反的末端)，抗肿瘤性药物连接于L^c的末端(与连接L^b的一侧相反的末端)。

n¹表示0～6的整数，优选为1～5的整数，更优选为1～3。

1.L¹

L¹为

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-、

-CH₂-C(＝O)-NH-(CH₂)n³-C(＝O)-、

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-、或

-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-

的各结构所示的结构的接头。此处，n²为2～8的整数，n³为1～8的整数，n⁴为1～8的整数。

接头L¹中的-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-所示的结构的接头中，“-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-”具有下式

[化44]

所示的结构。该部分结构中的3位是与抗体的连接部位。而且该3位处的与抗体的连接的特征是形成硫醚而进行连接。另一方面，该结构部分的1位的氮原子与存在于包含该结构的接头内的亚甲基的碳原子连接。即-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-L²-为下式所示的结构(此处，“抗体－S－”是来源于抗体。)。

[化45]

式中，n²为2～8的整数，优选为2～5。

L¹中的-CH₂-C(＝O)-NH-(CH₂)n³-C(＝O)-所示的结构的接头中，n³为1～8的整数，优选为2～6。该接头用末端的亚甲基的碳原子与抗体连接，但与上文所述同样，具有形成硫醚而进行连接的下述结构(此处，“抗体－S－”为来源于抗体。)：

抗体-S-CH₂-C(＝O)-NH-(CH₂)n³-C(＝O)-L²-。

L¹中的-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-所示的结构的接头中，此处“-(N-ly-3-diminiccuS)-”具有下式：

[化46]

所示的结构。该结构部分中，1位的氮原子与存在于包含该结构的接头内的亚甲基碳原子连接。3位的碳原子与接头L²中的-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-的末端的硫原子连接。需要说明的是，该L²的接头-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-形成仅与L¹接头中的-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-组合而成的接头结构。此处，接头中包含的“-cyc.Hex(1,4)-”表示1，4－亚环己基。接头-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-在末端的羰基碳上与抗体形成酰胺键而与抗体连接(下式；此处，“抗体－NH－”为来源于抗体。)。

[化47]

作为形成该酰胺键的抗体的氨基，只要是抗体的赖氨酸残基的侧链的末端氨基、或抗体N末端的氨基即可。需要说明的是，该结构的接头除了可形成酰胺键之外，也可与抗体的氨基酸的羟基形成酯键而与抗体连接。

另外，虽然该接头中包含“-cyc.Hex(1,4)-”结构部分，但除了1，4－亚环己基之外，也可以是除此之外的2价的饱和环状亚烷基，例如亚环丁基、亚环戊基、亚环庚基、亚环辛基等2价的环状饱和烃基，可以是亚苯基、亚萘基等2价的芳香族烃基，还可以是5元环、6元环的饱和、部分饱和、或芳香族的、包含1或2的杂原子的2价的杂环基。此外，还可以是碳原子数为1～4的2价的亚烷基。需要说明的是，向2价基的连接可以是在相邻的位置，也可以是在存在间隔的位置。

接头L¹中的-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-所示的结构的接头中，n⁴为1～8的整数，优选为2～6。该接头也与上述的接头同样，用末端的羰基与抗体的氨基形成酰胺键而进行连接(下式；该结构中，“抗体－NH－”为来源于抗体。)。

抗体-NH-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-L²-。

作为接头L¹的具体例，可举出：

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂C(＝O)NH-CH₂-C(＝O)-、

-CH₂C(＝O)NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂C(＝O)NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂C(＝O)NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂C(＝O)NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-

-C(＝O)-Aryl-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-

-C(＝O)-cyc.Het-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-

-C(＝O)-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-等，

(Aryl表示2价的芳香族烃基，cyc.Het表示2价的环状杂环基。)。

2.L²

接头L²为

-NH-(CH₂CH₂O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-、或

-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-、

所示的结构的接头，但接头L²也可以不存在，该情况下，L²为单键。另外，n⁵为1～6的整数，n⁶为1～6的整数。

接头L²中的-NH-(CH₂CH₂O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-所示的结构的接头中，n⁵为1～6的整数，优选为2～4。该接头用末端的氨基与接头L¹连接，用相反侧的羰基与接头L^P连接。

接头L²中的-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-中，n⁶为1～6的整数，优选为2～4。

作为接头L²的具体例，可举出：

-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-、

-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-、

-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-、

-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-、

-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-、

-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-等。

此外，当接头L²为-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-时，组合的接头L¹为-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-，因此，作为-L¹-L²-接头的具体例，可举出：

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-等。

3.L^P

接头L^P为由2～7个氨基酸构成的肽残基。即，通过2～6个氨基酸以肽键连接而成的寡肽的残基而构成。接头L^P在N末端与接头L²连接，在C末端与接头-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-部分的氨基连接。对于构成接头L^P的氨基酸没有特别限制，例如为L-或D-氨基酸，优选为L-氨基酸。另外，除了α－氨基酸之外，也可以是β－丙氨酸、ε－氨基己酸、γ－氨基丁酸等结构的氨基酸，此外，可以是例如经N－甲基化的氨基酸等非天然型的氨基酸。

对于接头L^P的氨基酸序列没有特别限制，作为构成的氨基酸，可举出苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)、亮氨酸(Leu；L)，甘氨酸(Gly；G)、丙氨酸(Ala；A)、缬氨酸(Val；V)、赖氨酸(Lys；K)、瓜氨酸(Cit)、丝氨酸(Ser；S)、谷氨酸(Glu；E)、天冬氨酸(Asp；D)等。这些中可优选举出苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。可根据氨基酸的种类，来控制药物游离的模式。氨基酸的数目可以是2～7个。

作为接头L^P的具体例，可举出：

-GGF-

-DGGF-

-(D-)D-GGF-

-EGGF-

-GGFG-

-SGGF-

-KGGF-

-DGGFG-

-GGFGG-

-DDGGFG-

-KDGGFG-

-GGFGGGF-

[上述的“(D-)D”是指D－天冬氨酸]。作为本发明抗体－药物偶联物中特别优选的接头L^P，可举出-GGFG-。

接头-NH-(CH₂)n¹-所示的结构部分中，n¹为0～6的整数，优选为1～5的整数，更优选为1～3。该部分的氨基部分与接头L^P的C末端连接。

4.L^a

接头L^a是-C(＝O)-NH-、-NR¹-(CH₂)n⁷-、-O-的各结构中的任一种，或是单键，n⁷为1～6的整数，R¹为氢原子、碳原子数为1～6的烷基、-(CH₂)n⁸-COOH、或-(CH₂)n⁹-OH，n⁸为1～4的整数，n⁹为1～6的整数。

接头L^a中的酰胺结构-C(＝O)-NH-在氮原子侧与L^b连接。接头L^a中的-NR¹-(CH₂)n⁷-结构部分中，n⁷为1～6的整数，优选为1～3。该部分在亚甲基侧与L^b连接。R¹为氢原子或碳原子数为1～6的烷基，碳原子数为1～6的烷基时，可以是直链状，也可以是支链状。可举出例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、2－甲基丁基、新戊基、1－乙基丙基、己基、异己基、4－甲基戊基、3－甲基戊基、2－甲基戊基、1－甲基戊基、3,3－二甲基丁基、2,2－二甲基丁基、1,1－二甲基丁基、1,2－二甲基丁基、1,3－二甲基丁基、2,3－二甲基丁基及2－乙基丁基等。这些中优选为甲基或乙基。R¹为-(CH₂)n⁸-COOH所示的结构时，n⁸为1～4的整数，优选为1或2。R¹为-(CH₂)n⁹-OH所示的结构时，n⁹为1～6的整数，优选为1或2。作为R¹，优选为氢原子、甲基、乙基、-CH₂COOH、-CH₂CH₂-COOH、或-CH₂CH₂-OH，更优选为氢原子、甲基、-CH₂COOH。进一步优选为氢原子。需要说明的是，接头L^a部分可以是-O-、或单键。

5.L^b

接头L^b为-CR²(-R³)-、-O-、-NR⁴-各结构中的任一种，或是单键，R²及R³各自独立地为氢原子、碳原子数为1～6的烷基、-(CH₂)n^a-NH₂、-(CH₂)n^b-COOH、或-(CH₂)n^c-OH，R⁴为氢原子或碳原子数为1～6的烷基，n^a为0～6的整数，n^b为1～4的整数，n^c为0～4的整数，但n^a或n^c为0时，R²及R³不相同。

R²及R³为烷基时，该烷基为与R¹中的烷基作同样解释的烷基。R²及R³为-(CH₂)n^a-NH₂的结构时，n^a为0～6的整数，优选为0，或为3～5。需要说明的是，n^a为0时，R²及R³不相同。R²及R³为-(CH₂)n^b-COOH的结构时，n^b为1～4的整数，优选为1或2。R²及R³为-(CH₂)n^c-OH的结构时，n^c为0～4的整数，优选为1或2。

作为R²及R³，优选为氢原子、甲基、乙基、-NH₂、-CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂COOH、-CH₂CH₂-COOH、-CH₂OH、或-CH₂CH₂-OH，更优选为氢原子、甲基、-NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂COOH、-CH₂CH₂-COOH、-CH₂OH、或-CH₂CH₂-OH。进一步优选为氢原子。

R⁴为碳原子数为1～6的烷基，该烷基为与R¹中的烷基作同样解释的烷基。作为R⁴，优选为氢原子或甲基，更优选为氢原子。

作为接头-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-所示的结构的具体例，可举出：

-NH-CH₂-

-NH-CH(-Me)-

-NH-C(-Me)₂-

-NH-CH₂-CHMe-

-NH-CH(-CH₂OH)-

-NH-CH(-CH₂COOH)-

-NH-CH(-CH₂CH₂COOH)-

-NH-CH(-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂)-

-NH-CH₂CH₂-

-NH-CH₂-O-CH₂-

-NH-CH₂CH₂-O-

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-

-NH-CH₂CH₂C(-Me)₂-

-NH-CH₂CH₂NH-

-NH-CH₂CH₂NH-CH₂-

-NH-CH₂CH₂NMe-CH₂-

-NH-CH₂CH₂NH-CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂NMe-CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂COOH)-CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂CH₂OH)-CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂CH₂OH)-CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂C(＝O)-NHCH(-CH₂OH)-

-NH-CH₂CH₂CH₂C(＝O)-NHCH(-CH₂COOH)-

-NH-CH₂CH₂CH₂C(＝O)-NHCH(-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂)-

-NH-CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH(NH₂)-等。

其中可优选举出：

-NH-CH₂-

-NH-CH₂-CH(Me)-

-NH-CH(-CH₂OH)-

-NH-CH(-CH₂CH₂COOH)-

-NH-CH₂CH₂-

-NH-CH₂-O-CH₂-

-NH-CH₂CH₂-O-

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-

-NH-CH₂CH₂C(-Me)₂-

-NH-CH₂CH₂NH-

-NH-CH₂CH₂NH-CH₂-

-NH-CH₂CH₂NMe-CH₂-

-NH-CH₂CH₂NMe-CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂COOH)-CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂CH₂OH)-CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂CH₂OH)-CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂C(＝O)-NHCH(-CH₂OH)-

-NH-CH₂CH₂CH₂C(＝O)-NHCH(-CH₂COOH)-

-NH-CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-等。

可更优选举出：

-NH-CH₂-

-NH-CH₂CH₂-

-NH-CH₂-O-CH₂-

-NH-CH₂CH₂-O-

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-

-NH-CH₂CH₂NH-

-NH-CH₂CH₂NH-CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂COOH)-CH₂-

-NH-CH₂CH₂N(-CH₂CH₂OH)-CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂C(＝O)-NHCH(-CH₂COOH)-

-NH-CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-。

进一步优选为：

-NH-(CH₂)₃-、

-NH-CH₂-O-CH₂-、

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-。

6.L^c

接头L^c为-CH₂-或-C(＝O)-。在该接头与抗肿瘤性化合物连接。作为接头L^c，更优选-C(＝O)-。

接头-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c优选为4～7原子的链长的接头，进一步优选具有5或6原子的链长的接头。

本发明的抗体－药物偶联物在转移至肿瘤细胞内后，接头部分被切断，游离出NH₂-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)所示的结构的药物衍生物而显示抗肿瘤作用。作为从本发明的抗体－药物偶联物中游离而显示抗肿瘤效果的抗肿瘤性衍生物，可举出具有于上文中说明的接头-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-所示的结构连接L^c、末端为氨基的结构部分的抗肿瘤性衍生物，特别优选的抗肿瘤衍生物如下所示：

NH₂-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

NH₂-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

NH₂-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

NH₂-CHCH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

需要说明的是，确认了在NH₂-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)的情况下，位于该分子内的缩醛胺结构不稳定，进一步自分解而游离出O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。这些化合物也可作为本发明的抗体－药物偶联物的制造中间体合适地使用。

在以依沙替康为药物的本发明的抗体－药物偶联物中，优选将下述结构的药物－接头结构部分[-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)]连接于抗体。对于这些药物－接头结构部分而言，作为每1抗体的平均连接数，可以是1～10，优选为2～8，更优选为3～8。

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

这些中更优选以下这些。

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

进一步优选以下这些。

本申请的抗体－药物偶联物中，对于连接抗体和药物的接头结构而言，通过连接上文中说明的接头各部分中所述的优选的结构，可构建优选的接头。作为这样的接头结构，可合适地使用以下结构的接头。需要说明的是，结构的左端是与抗体连接部位，右端是与药物的连接部位。

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

这些中更优选以下这些。

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-

-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-。

可进一步优选举出以下这些。

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-。

[制造方法]

下面，对于本发明的抗体－药物偶联物或其制造中间体的代表性的制造方法进行说明。需要说明的是，下文中，为了表示化合物，使用各反应式中所示的化合物的编号。即，称为“式(1)的化合物”、“化合物(1)”等。另外，关于其他编号的化合物，也以同样方式记载。

1.制造方法1

经由硫醚而将抗体和接头结构连接的式(1)所示的抗体－药物偶联物例如可通过下述的方法来制造。

[化48]

[式中，AB表示具有巯基的抗体，L¹’表示L¹所示的接头结构中接头末端为马来酰亚胺基(下式)

[化49]

的结构(此处，氮原子为连接部位。)、或末端为卤素结构的接头，而且表示L¹中的-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-中，-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为马来酰亚胺基的基团；或L¹中的-CH₂C(＝O)NH-(CH₂)n³-C(＝O)-的末端的亚甲基被卤化而成为卤代乙酰胺的、卤素-CH₂C(＝O)NH-(CH₂)n³-C(＝O)-基团。另外，-(NH-DX)为下式：

[化50]

所示的结构，表示依沙替康的1位的氨基的氢原子被去除1个而产生的基团。另外，上述的反应式中，式(1)的化合物中，以1个从药物至接头末端的结构部分与1个抗体连接而成的结构的形式进行了记载，但这是为了说明方便，实际上，相对于1个抗体分子而言连接有多个该结构部分的情况较多。该情况在以下的制造方法的说明中也同样。]

即，通过使利用后述的方法而可获得的化合物(2)与具有巯基的抗体(3a)反应，可制造抗体－药物偶联物(1)。

具有巯基的抗体(3a)可利用本领域技术人员公知的方法获得(Hermanson，G.T、Bioconjugate Techniques、pp.56－136、pp.456－493、Academic Press(1996))。例如，可举出以下方法：使Traut’s试剂与抗体的氨基作用；使N－琥珀酰亚胺基S－乙酰硫代链烷酸酯(N-succinimidyl S-acetylthioalkanoate)类与抗体的氨基作用后，与羟基胺作用；在使N－琥珀酰亚胺基3－(吡啶基二硫代)丙酸酯作用后，使还原剂作用；使二硫苏糖醇、2－巯基乙醇、三(2－羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)等还原剂与抗体作用而将抗体内铰链部的二硫键还原从而产生巯基；等等，但不限于这些方法。

具体而言，作为还原剂，相对于每一个抗体内铰链部二硫醚键，使用0.3～3摩尔当量TCEP，在含有螯合剂的缓冲液中，使其与抗体反应，由此，可得到部分或完全地将抗体内铰链部二硫醚还原而得到的抗体。作为螯合剂，可举出例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)等。可以以1mM～20mM的浓度使用它们。作为缓冲液，可使用磷酸钠、硼酸钠、乙酸钠溶液等。在具体的例子中，于4℃～37℃使抗体与TCEP反应1～4小时，由此，可得到部分或完全还原而具有巯基的抗体(3a)。

需要说明的是，此处，通过实施在药物－接头部分添加巯基的反应，可通过硫醚键而连接药物－接头部分。

接下来，相对于每一个具有巯基的抗体(3a)，可使用2～20摩尔当量的化合物(2)，制造每1个抗体连接2个～8个药物而成的抗体-药物偶联物(1)。具体而言，在含有具有巯基的抗体(3a)的缓冲液中，添加溶解有化合物(2)的溶液并使其进行反应。此处，作为缓冲液，可使用乙酸钠溶液、磷酸钠、硼酸钠等。反应时的pH为5～9，更优选在pH7附近反应。作为溶解化合物(2)的溶剂，可使用二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N－甲基－2－吡啶酮(NMP)等有机溶剂。可以以1～20％v/v将溶解有化合物(2)的有机溶剂溶液添加到含有具有巯基的抗体(3a)的缓冲液中并进行反应。反应温度为0～37℃、更优选为10～25℃，反应时间为0.5～2小时。可通过利用含硫醇试剂使未反应的化合物(2)的反应性失活而结束反应。含硫醇试剂例如为半胱氨酸或N－乙酰－L－半胱氨酸(NAC)。更具体而言，添加相对于使用的化合物(2)而言1～2摩尔当量的NAC，于室温孵育10～30分钟，由此使反应结束。

对于制造的抗体－药物偶联物(1)，可利用以下的共通操作，进行浓缩、缓冲液交换、纯化、抗体浓度及每一分子抗体的药物平均连接数的测定，进行抗体－药物偶联物(1)的鉴定。

共通操作A：抗体或抗体－药物偶联物水溶液的浓缩

在Amicon Ultra(50，000MWCO，Millipore Corporation)的容器内，放入抗体或抗体－药物偶联物溶液，使用离心机(Allegra X－15R，Beckman Coulter，Inc.)进行离心操作(以2000G～3800G离心5～20分钟)，将抗体或抗体－药物偶联物溶液浓缩。

共通操作B：抗体的浓度测定

使用UV测定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific In c.)，按照制造商规定的方法，进行抗体浓度的测定。此时，使用随着抗体不同而不同的280nm吸光系数(1.3mLmg^－1cm^－1～1.8mLmg^－1cm^－1)。

共通操作C－1：抗体的缓冲液交换

按照制造商说明书的方法，用含有氯化钠(137mM)及乙二胺四乙酸(EDTA，5mM)的磷酸缓冲液(10mM，pH6.0)(本说明书中称为PBS6.0/EDTA。)将使用了Sephadex G－25载体的NAP－25柱(Cat.No.17－0852－02，GE Healthcare Japan Corporation)平衡化。针对一根该NAP－25柱，装填2.5mL抗体水溶液，然后分离用PBS6.0/EDTA3.5mL洗脱的级分(3.5mL)。利用共通操作A将该级分浓缩，使用共通操作B，进行抗体浓度的测定，然后使用PBS6.0/EDTA，将抗体浓度调整为10mg/mL。

共通操作C－2：抗体的缓冲液交换

按照制造商规定的方法，用含有氯化钠(50mM)及EDTA(2mM)的磷酸缓冲液(50mM，pH6.5)(本说明书中称为PBS6.5/ED TA。)将使用了Sephadex G－25载体的NAP－25柱(Cat.No.17－0852－02，GE Healthcare Japan Corporation)平衡化。针对一根该NAP－25柱，装填2.5mL抗体水溶液，然后分离获取用PBS6.5/ED TA3.5mL洗脱的级分(3.5mL)。利用共通操作A将该级分浓缩，使用共通操作B进行抗体浓度的测定，然后使用PBS6.5/EDTA，将抗体浓度调整为20mg/mL。

共通操作D－1：抗体－药物偶联物的纯化

用市售的磷酸缓冲液(PBS7.4，Cat.No.10010－023，Invitrogen)、含有氯化钠(137mM)的磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.0；本说明书中称为PBS6.0。)或含有山梨糖醇(5％)的乙酸缓冲液(10mM，p H5.5；本说明书中称为ABS。)中的任一种缓冲液将NAP－25柱平衡化。在该NAP－25柱中装填抗体－药物偶联物反应水溶液(约1.5mL)，用制造商规定的量的缓冲液洗脱，由此分离获取抗体级分。将该分离获取的级分再次装填至NAP－25柱，用缓冲液洗脱，进行凝胶过滤纯化操作，反复操作计2～3次，由此，得到了除去了未连接的药物接头、低分子化合物(三(2－羧基乙基)膦盐酸盐(TCE P)，N－乙酰－L－半胱氨酸(NAC)，二甲基亚砜)的抗体－药物偶联物。

共通操作E：抗体－药物偶联物中的抗体浓度及每一分子抗体的药物平均连接数的测定

抗体－药物偶联物中的连接药物浓度可通过以下方式算出：测定抗体－药物偶联物水溶液在280nm及370nm这两种波长下的UV吸光度，然后进行下述计算，由此算出。

由于某一波长下的总吸光度等于存在于体系内的所有吸收化学物质种类的吸光度的和[吸光度的加成性]，所以，假设在抗体与药物偶联前后，抗体及药物的摩尔吸光系数不发生变化时，抗体－药物偶联物中的抗体浓度及药物浓度如下述的关系式所示。

A₂₈₀＝A_D，280+A_A，280＝ε_D，280C_D+ε_A，280C_A 式(1)

A₃₇₀＝A_D，370+A_A，370＝ε_D，370C_D+ε_A，370C_A 式(2)

此处，A₂₈₀表示280nm时的抗体－药物偶联物水溶液的吸光度，A₃₇₀表示370nm时的抗体－药物偶联物水溶液的吸光度，A_A，280表示280nm时的抗体的吸光度，A_A，370表示370nm时的抗体的吸光度，A_D，280表示280nm时的偶联物前体的吸光度，A_D，370表示370nm时的偶联物前体的吸光度，ε_A，280表示280nm时的抗体的摩尔吸光系数，ε_A，370表示370nm时的抗体的摩尔吸光系数，ε_D，280表示280nm时的偶联物前体的摩尔吸光系数，ε_D，370表示370nm时的偶联物前体的摩尔吸光系数，C_A表示抗体－药物偶联物时的抗体浓度，C_D表示抗体－药物偶联物时的药物浓度。

此处，ε_A，280、ε_A，370、ε_D，280、ε_D，370可使用事先准备的值(计算推定值或由化合物的UV测定得到的实测值)。例如，ε_A，280可由抗体的氨基酸序列利用已知的计算方法(ProteinScience,1995,vol.4,2411-2423)推定。ε_A，370通常为0。ε_D，280及ε_D，370可通过测定以一定的摩尔浓度溶解使用的偶联物前体的溶液的吸光度并根据朗伯比尔定律(吸光度＝摩尔浓度×摩尔吸光系数×吸收池光程)得到。测定抗体－药物偶联物水溶液的A₂₈₀及A₃₇₀，将它们的值代入式(1)及(2)，解联立方程式，从而可求出C_A及C_D。进而，通过将C_D除以C_A，从而可求出每1抗体的药物平均连接数。

制造方法1中的式(2)所示的化合物是下式中的任一种。

[化51]

卤素-CH₂C(＝O)NH-(CH₂)n³-C(＝O)-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)

上述式中，n¹、n²、n³、L²、L^P、L^a、L^b及L^c如上文中定义，L^c为与药物的连接部位。

作为在上述的本发明化合物的制造中有用的中间体而优选的是，作为n²，为2～5的整数，L²为-NH-(CH₂CH₂O)n⁵-CH₂CH₂-C(＝O)-或单键，n⁵为2～4，L^P为GGFG，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-优选为-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-、NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-、-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-的部分结构。另外，作为卤素，优选为溴或碘。对于这些化合物，具体而言，可例举以下化合物[此处，(马来酰亚胺-N-基)是指马来酰亚胺基(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)]。

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

X-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

此处，式中的X表示溴原子或碘原子。这些溴化合物及碘化合物均可合适地作为制造中间体使用。

需要说明的是，为了确保偶联物的量，可将在同样条件下制作得到的平均药物数为同等程度的多个偶联物(例如±1程度)混合形成新的批次(lot)。该情况下，平均药物数处于混合前的平均药物数的范围内。

2.制造方法2

式(1)所示的抗体－药物偶联物中，与抗体的键为酰胺基，是在接头内具有硫醚键的接头，具体而言，-L¹-L²-为-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-S-(CH₂)n⁶-C(＝O)-的结构也可利用下述的方法制造。

[化52]

[式中，AB-L¹’表示抗体与接头L¹连接、而且L¹的末端转化为N－马来酰亚胺基的基团，具体而言，为AB-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-(N-ly-3-diminiccuS)-中-(N-ly-3-diminiccuS)-转化为马来酰亚胺基的结构。L²’表示末端为巯基的HS-(CH₂)n⁶-C(＝O)-基，AB表示抗体。]

即，可通过使利用后述的方法可获得的化合物(2a)、与连接具有马来酰亚胺基的接头的抗体(3b)反应，制造抗体－药物偶联物(1)。

具有马来酰亚胺基的抗体(3b)也可利用本领域技术人员公知的方法得到(Hermanson，G.T、Bioconjugate Techniques、pp.56－136、pp.456－493、Academic Press(1996))。例如可举出使具有与氨基、羟基的结合性、具有马来酰亚胺基的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)等二官能性接头作用于配体的氨基而导入马来酰亚胺基等的方法，但不限于这些。

例如，可合适地使用将针对氨基的反应性部分、和针对硫醇基的反应性部分用接头连接而成的化合物。此处，针对氨基的反应性部分只要是活性酯、酰亚胺酯等即可，另外，硫醇反应性部分可以是马来酰亚胺基、卤化乙酰、卤化烷基、以及二硫代吡啶基等。

作为用于针对构成抗体的氨基酸的氨基或羟基、尤其是氨基经由酰胺键构建接头的方法，首先，与抗体反应的化合物可以是下式所示的化合物。

Q¹-L^1a-Q²

Q²表示(马来酰亚胺-N-基)、卤原子、或-S-S-(2-吡啶基)，

R^Q表示碳原子数为1～6的烷基、n⁴表示1～8的整数，n^4a表示0～6的整数，n^4b表示1～6的整数。]

此处，R^Q可以是碳原子数为1～6的烷基，更优选为甲基或乙基。

作为L^1a中的亚烷基，可以是碳原子数为1～10的亚烷基。作为亚苯基，可以是邻亚苯基、间亚苯基、对亚苯基中的任一种，更优选为对亚苯基、或间亚苯基。

作为L^1a，可优选举出-cyc.Hex(1,4)-CH₂-、-(CH₂)₅-NH-C(＝O)-cyc.Hex(1,4)-CH₂-、-(CH₂)₂-NH-C(＝O)-CH₂-、-(CH₂)₅-NH-C(＝O)-(CH₂)₂-、-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₃-、-(CH₂)₅-、-(CH₂)₁₀-、-(对-Ph)-、-(间-Ph)-、-(对-Ph)-CH(-CH₃)-、-(CH₂)₃-(间-Ph)-、或-(间-Ph)-NH-C(＝O)-CH₂-。

作为Q¹，优选为(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-，Q²优选为(马来酰亚胺-N-基)，当想要形成二硫键时，可使用-S-S-(2-吡啶基)。

此处，(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-为下式

[化53]

所示的氮原子是连接部位的基团，(3-磺基-吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-为下式

[化54]

所示的氮原子是连接部位的基团，该磺酸可形成锂盐、钠盐、钾盐，优选为钠盐，cyc.Hex(1,4)表示1，4-亚环己基，

(马来酰亚胺-N-基)为下式

[化55]

所示的、氮原子是连接部位的基团，

(2-吡啶基)表示2－吡啶基，(对-Ph)表示对亚苯基，(间-Ph)表示间亚苯基。

作为这样的化合物，例如为4－(N－马来酰亚胺基甲基)环己烷－1－羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)、N－琥珀酰亚胺基－4－(N－马来酰亚胺基甲基)－环己烷－1－甲酸－(6－氨基己酸酯)(LC－SMCC)、κ－马来酰亚胺基十一烷酸N－琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ－马来酰亚胺基丁酸N－琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε－马来酰亚胺基己酸N－羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基－N－羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N－(α－马来酰亚胺基乙酰氧基)－琥珀酰亚胺酯(AMAS)、6－(β－马来酰亚胺基丙酰胺)己酸琥珀酰亚胺基酯(SMPH)、N－琥珀酰亚胺基－4－(对马来酰亚胺基苯基)－丁酸酯(SMPB)、N－(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、N－琥珀酰亚胺基－4－(碘乙酰)－氨基苯甲酸酯(SIAB)、N－琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SI A)、N－琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)N－琥珀酰亚胺基3－(溴乙酰胺)丙酸酯(SBAP)、N－琥珀酰亚胺基－3－(2－吡啶并二硫代)丙酸酯(SPDP)、及琥珀酰亚胺基氧基羰基－α－甲基－α－(2－吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)等化合物。

具体而言，例如，将相对于抗体(3)为2～6当量的SMCC装入pH6～7的磷酸缓冲液中，在室温下反应1～6小时，由此，SMCC的活性酯与抗体反应，可得到具有马来酰亚胺基的抗体(3b)。得到的抗体(3b)可通过下述的共通操作D－2进行纯化，用于与以下化合物(2a)的反应。

共通操作D－2：4－(N－马来酰亚胺基甲基)－环己烷－1－羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)衍生物化抗体的纯化

用PBS6.5/EDTA将NAP－25柱平衡化。向该NAP－25柱装填含有4－(N－马来酰亚胺基甲基)－环己烷－1－羧酸琥珀酰亚胺基酯(本说明书中称为SMCC。)衍生物化抗体的反应液(约0.5mL)，用制造商规定量的缓冲液进行洗脱，从而分离获取抗体级分，进行纯化。

对于供于与接头的连接的抗体的氨基而言，只要是N末端氨基及/或赖氨酸残基所具有的氨基即可，但不限于这些。还可以利用丝氨酸残基所具有的羟基形成酯键而与接头。

化合物(2a)与连接具有马来酰亚胺基的接头的抗体(3b)的反应，可以与制造方法1中说明的化合物(2)与具有巯基的抗体(3a)的反应方法的情况同样地进行。

对于制造的抗体－药物偶联物(1)的浓缩、缓冲液交换、纯化、抗体浓度及基于每一分子抗体的药物平均连接数的测定的抗体－药物偶联物(1)的鉴定可以与制造方法1同样地进行。

制造方法2中，式(3b)所示的化合物具有以下结构(下式；该结构中“抗体－NH－”为来源于抗体。)。

[化56]

用于制造本发明的抗体－药物偶联物的中间体的具有上述结构的化合物如下所述(式中，n为1～10的整数，优选为2～8，更优选为3～8。)。

[化57]

此外，作为末端为巯基的本发明的化合物，可举出以下的化合物。

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

3.制造方法3

经由酰胺键将药物接头部分和抗体连接而成的式(1)所示的抗体－药物偶联物，可利用以下的方法来制造。例如，可优选使用L¹为-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-时的活性酯L¹’，例如(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-。此外，L²为单键时，例如可利用下述的方法来制造。

[化58]

即，通过使利用后述的方法可获得的化合物(2b)与抗体(3)反应，可制造抗体－药物偶联物(1)。

化合物(2b)具有与抗体的氨基、羟基的结合性。对于抗体的氨基、羟基而言，如制造方法2中所述，分别表示例如抗体所具有的N末端氨基及/或赖氨酸残基所具有的氨基、丝氨酸残基所具有的羟基，但不限于这些。

化合物(2b)是包含N－羟基琥珀酰亚胺基酯基的活性酯，但也可使用其他活性酯，例如磺基琥珀酰亚胺基酯基、N－羟基邻苯二甲酰亚胺酯、N－羟基磺基邻苯二甲酰亚胺酯、邻－硝基苯基酯、对－硝基苯基酯、2，4－二硝基苯基酯、3－磺酰基－4－硝基苯基酯、3－羧基－4－硝基苯基酯、五氟苯基酯等。

对于化合物(2b)与抗体(3)的反应而言，相对于一个抗体(3)，使用2～20摩尔当量的化合物(2b)，可制造相对于1个抗体连接1个～10个药物的抗体-药物偶联物(1)。具体而言，向含有抗体(3)的缓冲液中，添加溶解有化合物(2b)的溶液而进行反应，由此，可制造抗体－药物偶联物(1)。此处，作为缓冲液，可使用乙酸钠溶液、磷酸钠、硼酸钠等。反应时的pH可以是5～9，更优选在pH7附近进行反应。作为溶解化合物(2b)的溶剂，可使用二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N－甲基－2－吡啶酮(NMP)等有机溶剂。以1～20％v/v将溶解化合物(2b)的有机溶剂溶液添加到含有抗体(3)的缓冲液中而使其反应。反应温度为0～37℃、更优选为10～25℃，反应时间为0.5～20小时。

制造的抗体－药物偶联物(1)的浓缩、缓冲液交换、纯化、抗体浓度及基于每一分子抗体的药物平均连接数的测定的抗体－药物偶联物(1)的鉴定可以与制造方法1同样地进行。

制造方法3中，(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-具有以下结构。

[化59]

作为具有上述的部分结构的本发明的化合物，可举出以下化合物。

4.制造方法4

之前的制造方法中使用的中间体式(2)或(2b)所示的化合物及它们的药理学上可接受的盐例如可利用下述方法制造。

[化60]

[式中，L^c为-C(＝O)-，与-(NH-DX)的结合形成酰胺键，L¹’表示被转化为末端马来酰亚胺基、或末端卤代乙酰基、或(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-(CH₂)n⁴-C(＝O)-的结构的L¹，P¹、P²及P³表示保护基。]

将羧酸(5)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，在碱存在下，使其与NH₂－DX[表示依沙替康；化学名：(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮](4)或其药理学上可接受的盐反应，由此可制造化合物(6)。

该反应可使用肽合成中通常使用的反应试剂和条件。活性酯包括各种物质，例如可使用N，N’－二环己基碳二亚胺或1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐等缩合剂，使对硝基苯酚等酚类、N－羟基苯并三唑或N－羟基琥珀酰亚胺等与羧酸(5)反应而制造。另外，活性酯也可利用以下反应来制造：羧酸(5)与五氟苯基三氟乙酸酯等的反应；羧酸(5)与1－苯并三唑基氧基三吡咯烷磷鎓六氟亚磷酸酯的反应；羧酸(5)与氰基膦酸二乙酯的反应(盐入法)；羧酸(5)与三苯基膦及2，2’－二吡啶基二硫醚的反应(向山法)；羧酸(5)与4－(4，6－二甲氧基－1，3，5－三嗪－2－基)－4－甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)之类的三嗪衍生物的反应；等等。另外，也可通过利用在碱存在下用亚硫酰氯、草酰氯等酰卤处理羧酸(5)而可进行制造的酰卤法等而进行反应。可通过在适当的碱的存在下，在惰性溶剂中，于－78℃～150℃使如上所述地得到的羧酸(5)的活性酯、混合酸酐、或酰卤与化合物(4)反应，而制造化合物(6)(需要说明的是，“惰性溶剂”是指，在采用该溶剂的反应中，不抑制实施的反应的溶剂。)。

作为上述各工序中使用的具体的碱，可举出例如碳酸钠、碳酸钾、乙醇钠、丁醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、氢化钾等碱金属或碱土金属的碳酸盐、碱金属醇盐、碱金属氢氧化物或氢化物，或以正丁基锂之类的烷基锂、二异丙基氨基锂之类的二烷基氨基锂为代表的有机金属碱；双(三甲基甲硅烷基)氨基锂之类的双甲硅烷基胺的有机金属碱；或吡啶、2，6－二甲基吡啶、可力丁、4－二甲基氨基吡啶、三乙基胺、N－甲基吗啉、二异丙基乙基胺、二氮杂双环[5.4.0]十一碳－7－烯(DBU)之类的有机碱等。

作为本反应中使用的惰性溶剂，可举出二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等卤代烃系溶剂；四氢呋喃、1，2－二甲氧基乙烷、二氧杂环己烷等醚系溶剂；苯、甲苯等芳香族烃系溶剂；N，N－二甲基甲酰胺、N，N－二甲基乙酰胺、N－甲基吡咯烷－2－酮等酰胺系溶剂。除了上述惰性溶剂之外，根据情况，还可以使用二甲基亚砜、环丁砜等亚砜系溶剂；丙酮、甲基乙基酮等酮系溶剂；等等。

对于化合物(6)的L^a及L^b而言，如后所述，其羟基、羧基、氨基等可以被有机化合物合成中通常使用的保护基保护。具体而言，作为羟基的保护基，可举出甲氧基甲基等烷氧基甲基；苄基、4－甲氧基苄基、三苯基甲基等芳基甲基；乙酰基等烷酰基；苯甲酰基等芳酰基；叔丁基二苯基甲硅烷基等甲硅烷基；等等。对于羧基而言，可形成与甲基、乙基、叔丁基等烷基、烯丙基、或苄基等芳基甲基的酯等而进行保护。对于氨基而言，除了可通过叔丁基氧基羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基等烷基氧基羰基；烯丙基氧基羰基、9－芴基甲基氧基羰基、苄基氧基羰基、对甲氧基苄基氧基羰基、对(或邻)硝基苄基氧基羰基等芳基甲基进行保护之外，还可通过乙酰基等烷酰基；苄基、三苯基甲基等芳基甲基；苯甲酰基等芳酰基；或2，4－二硝基苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基等芳基磺酰基等在肽合成中通常使用的氨基的保护基进行保护。上述的保护基的形成和脱除可按照通常实施的方法进行。

作为化合物(6)的末端氨基的保护基P¹，可使用叔丁基氧基羰基、9－芴基甲基氧基羰基、苄基氧基羰基等在肽合成中通常使用的氨基的保护基。作为其他的氨基的保护基，可举出乙酰基等烷酰基；甲氧基羰基、乙氧基羰基等烷氧基羰基；对甲氧基苄基氧基羰基、对(或邻)硝基苄基氧基羰基等芳基甲氧基羰基；苄基、三苯基甲基等芳基甲基；苯甲酰基等芳酰基；或2，4－二硝基苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基等芳基磺酰基。保护基P¹可根据保护氨基的化合物的性质等进行取舍。

通过使得到的化合物(6)的末端氨基的保护基P¹脱保护，可制造化合物(7)。可根据该保护基来选择试剂、条件。

将N末端被P²保护的肽羧酸(8)衍生为活性酯、混合酸酐等，与得到的化合物(7)进行反应，由此，可制造化合物(9)。形成肽羧酸(8)与化合物(7)的肽键的反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择而使用。保护基P²可从化合物(6)的保护基中说明的那些中适当选择而使用，可根据保护氨基的化合物的性质等进行取舍选择。另外，也可如在肽合成中通常使用的那样，针对构成肽羧酸(8)的氨基酸或肽，依次反复进行反应和脱保护而使其伸长，来制造化合物(9)。

通过将得到的化合物(9)的氨基的保护基P²脱保护，可制造化合物(10)。可根据该保护基来适当选择试剂、条件。

将羧酸(11)及(11b)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，使其与得到的化合物(10)进行反应，由此可制造化合物(2)或(2b)。形成羧酸(11)或(11b)与化合物(10)的肽键的反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可以从在化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。

化合物(9)例如也可利用下述方法来制造。

将N末端被P²保护的肽羧酸(8)衍生为活性酯、混合酸酐等，在碱存在下，使其与羧基被P³保护的胺化合物(12)反应，由此，可制造化合物(13)。形成肽羧酸(8)与化合物(12)的肽键的反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。化合物(13)的氨基的保护基P²可从化合物(6)的保护基中说明的那些中适当选择使用。作为羧基的保护基P³，可使用有机合成化学中、尤其是肽合成中作为羧基的保护基通常使用的保护基，具体而言，可从甲基、乙基、叔丁基等烷基酯、烯丙基酯、苄基酯等化合物(6)的保护基中说明的那些中适当选择使用。该情况下，需要利用不同的方法或条件可除去氨基的保护基和羧基的保护基。例如，可举出P²为叔丁基氧基羰基、P³为苄基的组合等情况作为代表。这些保护基可根据保护氨基和羧基的化合物的性质等从上文中说明的保护基中取舍选择，在将这些保护基切断时，也可根据该保护基来选择试剂、条件。

通过将得到的化合物(13)的羧基的保护基P³脱保护，可制造化合物(14)。可根据该保护基来选择试剂、条件。

将得到的化合物(14)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，在碱存在下，使其与化合物(4)反应，由此可制造化合物(9)。该反应可适用在肽合成中通常使用的反应试剂、条件，反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从在化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。

化合物(2)或(2b)例如也可利用下述方法来制造。

通过将化合物(13)的氨基的保护基P²脱保护，可制造化合物(15)。可根据该保护基来选择试剂、条件。

将羧酸衍生物(11)或(11b)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，在碱存在下，使其与得到的化合物(15)反应，由此可制造化合物(16)或(16b)。形成肽羧酸(11)或(11b)与化合物(15)的酰胺键的反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。

通过将得到的化合物(16)或(16b)的羧基的保护基脱保护，可制造化合物(17)或(17b)。可以与化合物(14)的制造中的羧基的脱保护同样地进行。

将化合物(17)或(17b)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，在碱存在下，使其与化合物(4)反应，由此可制造化合物(2)或(2b)。该反应可适用在肽合成中通常使用的反应试剂、条件，反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从在化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。

5.制造方法5

中间体式(2)所示的化合物也可通过下述方法制造。

[化61]

[式中，L¹’为末端被转化为马来酰亚胺基、或卤代乙酰基的结构的L¹，P⁴表示保护基。]

将化合物(11)衍生为活性酯、混合酸酐等，在碱存在下，使其与C末端被P⁴保护的肽羧酸(18)反应，由此可制造化合物(19)。形成肽羧酸(18)与化合物(11)的肽键的反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。化合物(18)的羧基的保护基P⁴可从化合物(6)的保护基中说明的那些中适当选择使用。

通过将得到的化合物(19)的羧基的保护基脱保护，可制造化合物(20)。可以与化合物(14)的制造中的羧基的脱保护同样地进行。

将得到的化合物(20)转化为活性酯、或混合酸酐等，使其与化合物(7)反应，由此可制造化合物(2)。该反应可适用在肽合成中通常使用的反应试剂、条件，反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从在化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。

6.制造方法6

制造方法2中记载的制造中间体(2a)、且其中L^2’为被转化为末端巯基烷酰基的结构的L²的化合物，可通过下述方法来制造。

[化62]

将具有末端巯基的羧酸(21)转化为活性酯、或混合酸酐等，使其与化合物(10)反应，由此可制造化合物(2a)。该反应可适用在肽合成中通常使用的反应试剂、条件，反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从在化合物(4)的合成中说明的那些中适当选择使用。

另外，将化合物(21)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，使其与化合物(15)反应，将得到的化合物(22)的羧基的保护基脱保护，由此可制造化合物(23)。

将化合物(23)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，在碱存在下，使其与化合物(4)反应，由此可制造化合物(2a)。该反应可适用在肽合成中通常使用的反应试剂、条件，反应条件、试剂、及碱、惰性溶剂可从在化合物(6)的合成中说明的那些中适当选择使用。

7.制造方法7

以下，对制造方法4中记载的制造中间体(10)中n¹＝1、L^a＝O、及L^b＝CR²(-R³)的化合物(10c)的制造方法进行详细说明。式(10c)所示的化合物、其盐或它们的溶剂化物例如可利用下述的方法来制造。

[化63]

[式中，L^P、R²、及R³与上文中定义相同，L表示乙酰基或氢原子等，X及Y表示包括1～3个氨基酸的寡肽，P⁵及P⁷表示氨基的保护基，P⁶表示羧基的保护基。]

式(24)所示的化合物可通过日本特开2002－60351号公报中记载的方法、文献(J.Org.Chem.，51卷，3196页，1986年)记载的方法、或应用该方法根据需要进行保护基的除去、官能团转化，而进行制造。或者，可通过针对末端氨基被保护的氨基酸或氨基被保护的寡肽的酸酰胺与醛或酮进行处理而得到。

在惰性溶剂中，在酸或碱存在下，在冷却下～室温下，使化合物(24)与具有羟基的化合物(25)进行反应，由此可制造化合物(26)。作为使用的酸，可举出例如氢氟酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸等无机酸、乙酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、甲磺酸等有机酸、四氟硼酸盐、氯化锌、氯化锡、氯化铝、氯化铁等路易斯酸等。特别优选对甲苯磺酸。作为使用的碱，可从上文说明的碱中适当选择，特别优选叔丁醇钾等碱金属醇盐、氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物、氢化钠、氢化钾等碱金属氢化物、以二异丙基氨基锂等二烷基氨基锂为代表的有机金属碱、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂等双甲硅烷基胺的有机金属碱等。作为反应中使用的溶剂，可使用四氢呋喃、1，4－二氧杂环己烷等醚系溶剂；苯、甲苯等芳香族烃系溶剂；等等。上述的溶剂可形成与水的混合物。另外，作为P⁵所例举的氨基的保护基，通常，只要是用于保护氨基的基团即可，没有特别限制，作为代表的氨基的保护基，可举出制造方法4中记载的氨基的保护基，本反应中，有时将P⁵所例举的氨基的保护基切断。该情况下，根据需要，需要使其与适当的氨基的保护试剂反应。

化合物(27)可通过将化合物(26)的保护基P⁶除去来制造。此处，关于作为P⁶所例举羧基的保护基，制造方法4中记载了代表的羧基的保护基，但该情况下，氨基的保护基P⁵与羧基的保护基P⁶优选为可利用不同的方法或条件除去的保护基。例如，可举出P⁵为9－芴基甲基氧基羰基、P⁶为苄基的组合等作为代表的情况。这些保护基可根据保护氨基及羧基的化合物的性质等选择取舍，在除去这些保护基时，可根据该保护基来选择试剂、条件。

将羧酸(27)衍生为活性酯、混合酸酐、或酰卤等，在碱存在下，使其与化合物(4)及它们的药理学上可接受的盐反应，由此制造化合物(28)，将得到的化合物(28)的保护基P⁵除去，由此可制造化合物(29)。在化合物(4)与羧酸(27)的反应及除去保护基P⁶的反应中，可使用与制造方法4中说明的相同的试剂、反应条件。

通过使化合物(29)与末端氨基被保护的氨基酸或氨基被保护的寡肽(30)反应，来制造化合物(9c)，将得到的化合物(9c)的保护基P⁷除去，由此可制造化合物(10c)。作为P⁷所例举的氨基的保护基，通常，只要是用于保护氨基的基团即可，没有特别限制，作为代表的氨基的保护基，可举出制造方法4中记载的氨基的保护基，在除去该保护基时，也可根据保护基来选择试剂、条件。化合物(29)与化合物(30)的反应中，可适用肽合成中通常使用的反应试剂、条件。利用上述方法制造的化合物(10c)可按照上述的制造方法转化为本发明化合物(1)。

8.制造方法8

以下，对于制造方法4中记载的制造中间体(2)中n¹＝1、L^a＝O、及L^b＝CR²(-R³)的化合物(2c)的制造方法进行详细说明。式(2c)所示的化合物、其盐或它们的溶剂化物例如可利用下述方法来制造。

[化64]

[式中，L^1’、L²、L^P、R²、及R³与上文中定义相同，Z表示包括1～3个氨基酸的寡肽，P⁸表示氨基的保护基，P⁹表示羧基的保护基。]

通过除去末端氨基及羧基被保护的氨基酸或寡肽(31)的保护基P⁸，而制造化合物(32)，使得到的胺体(32)与化合物(11)反应，由此可制造化合物(33)。作为P⁸所例举的氨基的保护基，通常，只要是用于保护氨基的基团即可，没有特别限制，作为代表的氨基的保护基，可举出制造方法4中记载的氨基的保护基。另外，在除去保护基P⁸时，也可根据该保护基来选择试剂、条件。在化合物(32)与羧酸(11)的反应中，可使用与制造方法4中说明的相同的试剂、反应条件。

通过除去化合物(33)的保护基P⁹，而制造化合物(34)，使得到的羧酸(34)与化合物(29)反应，由此制造制造中间体(2c)。关于作为P⁹而例举的羧基的保护基，制造方法4中记载了代表的羧基的保护基，在该脱保护反应中，可使用与制造方法4中说明的相同的试剂、反应条件。另外，在化合物(29)与羧酸(34)的反应中，可适用肽合成中通常使用的反应试剂、条件。上述方法中制造的化合物(2c)可按照上述制造方法转化为本发明化合物(1)。

9.制造方法9

以下，对制造方法4中记载的制造中间体(17)中n¹＝1、L^a＝O、及L^b＝CR²(-R³)的化合物(17c)的制造方法进行详细说明。式(17c)所示的化合物、其盐或它们的溶剂化物例如可利用下述方法来制造。

[化65]

[式中，L^1’、L²、L^P、R²、R³、X、Y、P⁵、P⁶、及P⁷与上文中定义相同。]

通过将末端氨基及末端羧基被保护的化合物(26)的氨基的保护基P⁵脱保护，而制造化合物(35)，使得到的胺体(35)与末端氨基或氨基被保护的寡肽(30)反应，由此可制造化合物(36)。作为P⁵所例举的氨基的保护基，通常，只要是用于保护氨基的基团即可，没有特别限制，作为代表的氨基的保护基，可举出制造方法4中记载的氨基的保护基。另外，在除去保护基P⁵时，可根据该保护基来选择试剂、条件。此处，作为P⁶所例举的羧基的保护基及P⁷所例举的氨基的保护基，作为代表的保护基，可举出制造方法4中记载的羧基及氨基的保护基，优选可利用同样二方法或条件除去羧基的保护基P⁶和氨基的保护基P⁷的保护基。例如，可举出P⁶为苄基酯基、P⁷为苄基氧基羰基的组合等作为代表的情况。

化合物(37)可通过将化合物(36)的羧基的保护基P⁶和氨基的保护基P⁷除去来制造。也可通过分别依次除去羧基的保护基P⁶和氨基的保护基P⁷，而制造化合物(37)，如果是可利用相同的方法或条件除去P⁶和P⁷的保护基，则可在一个工序中除去两者而制造化合物(37)。

通过使得到的化合物(37)与化合物(11)反应，可制造化合物(17c)。在化合物(37)与化合物(11)的反应中，可使用与在制造方法4中说明的相同的试剂、反应条件。

作为本发明的抗体－药物偶联物的制造中有用的制造中间体，之前说明了下式：

[化66]

所示的化合物，此外，下式：

Q-(CH₂)n^Q-C(＝O)-L^2a-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)

所示的一组化合物也是成为在本发明的抗体－药物偶联物的制造中有用的制造中间体的化合物。

即，上述式中，Q为(马来酰亚胺-N-基)-、HS-、X-CH₂-C(＝O)-NH-、或(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-，

X为溴原子或碘原子，

n^Q为2～8的整数，

L^2a表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-、或单键，

此处，n⁵表示1～6的整数，

L^P表示由2～7个氨基酸构成的肽残基，

n¹表示0～6的整数，

L^a表示-C(＝O)-NH-、-NR¹-(CH₂)n⁷-、-O-、或单键，

L^b表示-CR²(-R³)-、-O-、-NR⁴-、或单键，

L^c表示-CH₂-或-C(＝O)-，

(马来酰亚胺-N-基)-为下式

[化67]

所示的结构的基团(氮原子为连接部位)，(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-为下式

[化68]

所示的结构的基团(氮原子为连接部位)，-(NH-DX)为下式

[化69]

所示的结构的基团(1位的氨基的氮原子为连接部位)。

作为制造中间体，优选L^c为-C(＝O)-的化合物。

另外，作为L^P的肽残基是由选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基的化合物作为制造中间体是优选的。在这样的肽残基中，L^P为由4个氨基酸构成的肽残基的化合物作为制造中间体是优选的。更具体而言，L^P为-GGFG-的化合物作为制造中间体是优选的。

此外，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物作为制造中间体是优选的，更优选为-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-C(＝O)-的化合物。

n^Q为2～6的整数的化合物作为制造中间体是优选的。

L^2a为单键、或n⁵为2～4的整数的化合物作为制造中间体是优选的。

另外，Q为(马来酰亚胺-N-基)-时，n^Q为2～5的整数，L^2a为单键，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物作为制造中间体是优选的。更优选-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物。此外，优选n^Q为整数2或5的化合物。

此外，Q为(马来酰亚胺-N-基)-时，n^Q为2～5的整数，L^2a为-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-、n⁵为2～4的整数、-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物作为制造中间体是优选的。更优选为n⁵为整数2或4的化合物。此外，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物是优选的。

Q为HS-时，n^Q为2～5的整数，L^2a为单键，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物作为制造中间体是优选的。更优选-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物。

Q为X-CH₂-C(＝O)-NH-时，X为溴原子的化合物是作为制造中间体优选的化合物。n^Q为2～8的整数的化合物是优选的，L^2a为单键化合物是优选的，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物作为制造中间体是优选的。

Q为(吡咯烷-2,5-二酮-N-基)-O-C(＝O)-时，n^Q为2～5的整数，L^2a为单键，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物作为制造中间体是优选的。更优选-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为-NH-CH₂CH₂CH₂-、-NH-CH₂-O-CH₂-、或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-的化合物。

更具体而言，以下化合物是作为制造中间体优选的化合物。

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

HS-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

Br-CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-(NH-DX)

需要说明的是，本发明的抗体－药物偶联物由于在大气中放置、或进行重结晶而有吸收水分、保持吸附的水的情况、或成为水合物的情况，这样的含有水的化合物及盐也包含在本发明之内。

另外，本发明中也包括用各种放射性或非放射性同位素标记的化合物。构成本发明的抗体－药物偶联物的原子中的一种以上，也可以含有非天然比例的原子同位素。作为原子同位素，可举出例如氘(²H)、氚(³H)、碘－125(¹²⁵I)或碳－14(¹⁴C)等。另外，本发明化合物可以用例如氚(³H)、碘－125(¹²⁵I)或碳－14(¹⁴C)之类的放射性同位素进行放射性标记。经放射性标记的化合物作为治疗或预防剂、研究试剂例如检验试剂、及诊断剂、例如体内图像诊断剂是有用的。对于本发明的抗体－药物偶联物的所有同位素变体而言，无论是否具有放射性，均包含于本发明的范围内。

＜药物＞

本发明的抗体－药物偶联物针对癌细胞显示细胞损伤活性，因此，可作为药物尤其是针对癌的治疗剂及/或预防剂使用。

作为本发明的抗体－药物偶联物适用的癌的种类，可举出肺癌、肾癌、尿道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌等，关于作为治疗对象的癌细胞，只要是表达抗体－药物偶联物中的抗体可识别的蛋白的癌细胞即可，不限于上述癌细胞。

本发明的抗体－药物偶联物可优选向哺乳动物给予，更优选人。

作为含有本发明的抗体－药物偶联物的药物组合物中使用的物质，可考虑给予量、给予浓度，从本领域中通常使用的制剂添加物或其他物中适当选择使用。

本发明的抗体－药物偶联物可以以含有1种以上的药学上的适应性成分的药学组合物的形式给予。例如，上述药学组合物中，代表性地，含有1种以上的药学载体(例如灭菌的液体(例如水及油(包含石油、动物、植物、或合成来源的油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)))。在静脉内给予上述药学组合物的情况下，水是更具有代表性的载体。另外，食盐水溶液、以及葡萄糖水溶液及甘油水溶液也可作为液体载体，尤其是可用于注射用溶液。适当药学赋形剂在该领域中是已知的。根据需要，上述组合物中还可以含有微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲化剂。适当的药学载体的例子记载于E.W.Martin的“Remington’sPharmaceutical Sciences”中。其处方与给予的方式相对应。

各种输送系统是已知的，可以为了给予本发明的抗体－药物偶联物而使用。作为导入方法，可举出皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、及皮下路径，但不限于这些。例如可以利用输液或快速浓注(bolus injection)进行给予。在特定的优选实施方式中，上述配体药物连接体的给予利用输液进行。肠胃外的给予是优选的给予路径。

代表性的实施方式中，将上述药学组合物形成向人静脉内给予的药学组合物，按照常规步骤形成处方。代表性地，用于静脉内给予的组合物是灭菌的等张姓的水性缓冲液中的溶液。根据需要，上述药物还可以含有增溶剂及用于缓解注射部位的疼痛的局麻剂(例如利多卡因)。通常，上述成分可以通过以下任一方式供给：以经密封的容器(例如将显示活性剂的量的安瓿或药囊等密封)中的干燥冷冻干燥粉末或无水的浓缩物的形式，分别地或在单位剂型中一起混合地供给。预定通过输液来给予上述药物时，例如可将上述药物放入到含有灭菌的制药级的水或食盐水的输液瓶中。当通过注射来给予上述药物时，可提供注射用灭菌水或食盐水的安瓿，以使得例如在给予前混合上述成分。

本发明的药物组合物，可以是仅含有本申请的抗体－药物偶联物的药物组合物，也可以是含有抗体－药物偶联物及至少一种其他癌治疗剂的药物组合物。也可将本发明的抗体－药物偶联物与其他癌治疗剂一同给予，由此，可增强抗癌效果。出于这种目的使用的其他抗癌剂，可与抗体－药物偶联物同时地、分别地或连续地向个体给予，也可改变给予间隔而进行给予。作为这样的癌治疗剂，可举出白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)(CPT－11)、紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、索拉非尼(sorafenib)、长春碱(vinblastin)或国际公开第WO2003/038043号小册子中记载的药剂、以及LH－RH类似物(亮丙瑞林(leupro relin)、戈舍瑞林(goserelin)等)、磷酸雌二醇氮芥(estramustin ephosphate)、雌激素拮抗剂(estrogen antagonist)(他莫昔芬(t amoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香酶抑制剂(aromatas e inhibitor)(阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)等，但只要是具有抗肿瘤活性的药剂，就不受限制。

这样的药物组合物可以作为具有选定的组成和必要的纯度的制剂，以冷冻干燥制剂或液状制剂的形式形成制剂。作为冷冻干燥制剂而形成制剂时，可以是含有本领域中可使用的适当的制剂添加物的制剂。另外，在液体制剂的情况也同样，可以作为含有本领域中可使用的各种的制剂添加物的液状制剂而形成制剂。

药物组合物的组成及浓度根据给予方法的不同而变化，但从本发明的药物组合物中包含的抗体－药物偶联物针对抗体－药物偶联物的抗原的亲和性、即针对抗原的解离常数(Kd值)方面考虑，亲和性越高(Kd值越低)时，即使为少量的给予量，也能发挥药效。因此，当确定抗体－药物偶联物的给予量时，也可基于抗体－药物偶联物与抗原的亲和性的状况来设定给予量。当将本发明的抗体－药物偶联物向人给予时，例如，可以以约0.001～100mg/kg给予1次，或以1～180天1次的间隔多次给予。

实施例

通过以下所示的实施例具体地说明本发明，但本发明不受它们的限制。另外，不对这些实施例进行任何方式的限定性解释。另外，本说明书中，没有特别记载的试剂、溶剂及起始材料可由市售的供给源容易地获得。

参考例1 M30－H1－L4抗体

利用已知方法制造包括包含序列号9中氨基酸编号20～471所示的氨基酸序列的重链及包含序列号16中氨基酸编号21～233所示的氨基酸序列的轻链的抗体(属于抗B7－H3抗体的人源化抗体)，将得到的人源化抗B7－H3抗体记为M30－H1－L4抗体(或简记为“M30－H1－L4”)。

参考例2 M30－H1－L4P抗体

利用已知的方法将连接于上述中得到的M30－H1－L4抗体的糖链修饰脱岩藻糖化而进行调节，将得到的调节了糖链修饰的抗体记为M30－H1－L4P抗体(或简记为“M30－H1－L4P”)。

参考例3 抗CD30抗体

参照日本特表2005－506035制作了抗CD30抗体。将其序列示于序列号27、28。

参考例4 抗CD33抗体

参照日本特开平8－48637号制作了抗CD33抗体。将其序列示于序列号29、30。

参考例5 抗CD70抗体

参照日本特表2008－538292制作了抗CD70抗体。将其序列记载为序列号31、32。

实施例1 4－氨基－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代(oxo)－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]丁酰胺

[化70]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯

将4－(叔丁氧基羰基氨基)丁酸(0.237g、1.13mmoL)溶解于二氯甲烷(10mL)，添加N－羟基琥珀酰亚胺(0.130g、1.13mmoL)及1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.216g、1.13mmoL)并搅拌1小时。将该反应溶液滴加至添加有化合物(4)的甲磺酸盐(0.500g、0.94mmoL)及三乙基胺(0.157mL、1.13mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺溶液(10mL)中，于室温搅拌一天。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]纯化得到的残留物，得到了标题化合物(0.595g、定量)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.31(9H，s)，1.58(1H，t，J＝7.2Hz)，1.66(2H，t，J＝7.2Hz)，1.82－1.89(2H，m)，2.12－2.21(3H，m)，2.39(3H，s)，2.92(2H，t，J＝6.5Hz)，3.17(2H，s)，5.16(1H，d，J＝18.8Hz)，5.24(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.59－5.55(1H，m)，6.53(1H，s)，6.78(1H，t，J＝6.3Hz)，7.30(1H，s)，7.79(1H，d，J＝11.0Hz)，8.40(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(APCI)m/z：621(M+H)⁺

工序2：4－氨基－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]丁酰胺

将上述工序1中得到的化合物(0.388g、0.61mmoL)溶解于二氯甲烷(9mL)中。添加三氟乙酸(9mL)并搅拌4小时。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]纯化得到的残留物，得到了标题化合物的三氟乙酸盐(0.343g、定量)。将抗体－药物偶联物(13)、(14)向患癌小鼠给予时，在肿瘤中确认到该化合物。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.79－1.92(4H，m)，2.10－2.17(2H，m)，2.27(2H，t，J＝7.0Hz)，2.40(3H，s)，2.80－2.86(2H，m)，3.15－3.20(2H，m)，5.15(1H，d，J＝18.8Hz)，5.26(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.54－5.61(1H，m)，6.55(1H，s)，7.32(1H，s)，7.72(3H，brs)，7.82(1H，d，J＝11.0Hz)，8.54(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(APCI)m/z：521(M+H)⁺

实施例2 抗体－药物偶联物(1)

[化71]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－(叔丁氧基羰基)甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[d e]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

将N－(叔丁氧基羰基)甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酸(0.081g、0.19mmoL)溶解于二氯甲烷(3mL)，添加N－羟基琥珀酰亚胺(0.021g、0.19mmoL)及1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.036g、0.19mmoL)并搅拌3.5小时。将该反应溶液滴加至添加有实施例1的化合物(0.080g、0.15mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺溶液(1.5mL)中，于室温搅拌4小时。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]纯化得到的残留物，得到了标题化合物(0.106g、73％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.36(9H，s)，1.71(2H，m)，1.86(2H，t，J＝7.8Hz)，2.15－2.19(4H，m)，2.40(3H，s)，2.77(1H，dd，J＝12.7，8.8Hz)，3.02(1H，dd，J＝14.1，4.7Hz)，3.08－3.11(2H，m)，3.16－3.19(2H，m)，3.54(2H，d，J＝5.9Hz)，3.57－3.77(4H，m)，4.46－4.48(1H，m)，5.16(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.55－5.60(1H，m)，6.53(1H，s)，7.00(1H，t，J＝6.3Hz)，7.17－7.26(5H，m)，7.31(1H，s)，7.71(1H，t，J＝5.7Hz)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，7.92(1H，t，J＝5.7Hz)，8.15(1H，d，J＝8.2Hz)，8.27(1H，t，J＝5.5Hz)，8.46(1H，d，J＝8.2Hz).

MS(APCI)m/z：939(M+H)⁺

工序2：甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺三氟乙酸盐

将上述工序1中得到的化合物(1.97g、2.10mmoL)溶解于二氯甲烷(7mL)。添加三氟乙酸(7mL)并搅拌1小时。减压馏去溶剂，添加甲苯，进行共沸，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]纯化得到的残留物，得到了标题化合物(1.97g、99％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d6)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.71－1.73(2H，m)，1.82－1.90(2H，m)，2.12－2.20(4H，m)，2.40(3H，s)，2.75(1H，dd，J＝13.7，9.4Hz)，3.03－3.09(3H，m)，3.18－3.19(2H，m)，3.58－3.60(2H，m)，3.64(1H，d，J＝5.9Hz)，3.69(1H，d，J＝5.9Hz)，3.72(1H，d，J＝5.5Hz)，3.87(1H，dd，J＝16.8，5.9Hz)，4.50－4.56(1H，m)，5.16(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，s)，5.55－5.60(1H，m)，7.17－7.27(5H，m)，7.32(1H，s)，7.78－7.81(2H，m)，7.95－7.97(3H，m)，8.33－8.35(2H，m)，8.48－8.51(2H，m).

MS(APCI)m/z：839(M+H)⁺

工序3：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

向上述工序2中得到的化合物(337mg，0.353mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(1.2mL)溶液中，添加三乙基胺(44.3mL，0.318mmoL)、6－马来酰亚胺己酸N－琥珀酰亚胺基酯(119.7mg，0.388mmoL)，于室温搅拌1小时。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝5：1(v/v)]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到了标题化合物(278.0mg，76％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.3Hz)，1.12－1.22(2H，m)，1.40－1.51(4H，m)，1.66－1.76(2H，m)，1.80－1.91(2H，m)，2.05－2.21(6H，m)，2.39(3H，s)，2.79(1H，dd，J＝14.0，9.8Hz)，2.98－3.21(5H，m)，3.55－3.77(8H，m)，4.41－4.48(1H，m)，5.15(1H，d，J＝18.9Hz)，5.24(1H，d，J＝18.9Hz)，5.40(1H，d，J＝17.1Hz)，5.44(1H，d，J＝17.1Hz)，5.54－5.60(1H，m)，6.53(1H，s)，6.99(2H，s)，7.20－7.27(5H，m)，7.30(1H，s)，7.70(1H，t，J＝5.5Hz)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，8.03(1H，t，J＝5.8Hz)，8.08(1H，t，J＝5.5Hz)，8.14(1H，d，J＝7.9Hz)，8.25(1H，t，J＝6.1Hz)，8.46(1H，d，J＝8.5Hz).

MS(APCI)m/z：1032(M+H)⁺

工序4：抗体－药物偶联物(1)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，使用制造方法1中记载的共通操作C－1及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.0/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。将该溶液(1.25mL)放入到1.5mL聚丙烯制管(tube)中，向其中添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.025mL；相对于一分子抗体为3.0当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0625mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下向上述溶液中添加含有二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.109mL)和上述工序3中得到的化合物10mM的二甲基亚砜溶液(0.039mL；相对于一分子抗体为4.6当量)，使用试管振荡器(tube rotator)(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.008mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液6mL，然后利用共通操作A，将溶液浓缩。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝235300(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5000(实测平均值)、ε_D，370＝19000(实测平均值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：13.02mg/mL，抗体收量：9.1mg(73％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.4

实施例3 抗体－药物偶联物(2)

[化72]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(2)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(4.0mL)采集至15mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.118mL；相对于一分子抗体为4.6当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.200mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：于22℃孵育上述溶液10分钟后，添加含有10mM实施例2的工序3中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.236mL；相对于一分子抗体为9.2当量)，于22℃孵育40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.00471mL)，进而于22℃孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液17.5mL。

抗体浓度：1.80mg/mL，抗体收量：26.1mg(65％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.9

实施例4 抗体－药物偶联物(3)

[化73]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(3)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作C－1及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.0/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。将该溶液(1.25mL)放入到1.5mL聚丙烯制管中，向其中添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液0.051mL(相对于一分子抗体为6.0当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0625mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.067mL)和含有10mM实施例2的工序3中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.085mL；相对于一分子抗体为10.0当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌60分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.013mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液6mL。

抗体浓度：1.67mg/mL，抗体收量：10.02mg(80％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.3

实施例5 抗体－药物偶联物(4)

[化74]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(4)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作C－1及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.0/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。将该溶液(1.25mL)放入到1.5mL聚丙烯制管中，向其中添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.051mL；相对于一分子抗体为6.0当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0625mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.025mL)和含有10mM实施例2的工序3中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.127mL；相对于一分子抗体为15.0当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌60分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.019mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：1.19mg/mL，抗体收量：7.14mg(57％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.5

实施例6 抗体－药物偶联物(5)

[化75]

混合几乎全部量的实施例4和实施例5的抗体－药物偶联物，利用共通操作A将溶液浓缩，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：15.37mg，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.7

实施例7 抗体－药物偶联物(6)

[化76]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(6)

抗体的还原：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.75)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至2mL管，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液0.0297mL(相对于一分子抗体为4.6当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：于22℃孵育上述溶液10分钟后，添加实施例2的工序3中得到的化合物10mM二甲基亚砜溶液(0.0593mL；相对于一分子抗体为9.2当量)，于22℃孵育40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0119mL；相对于一分子抗体为18.4当量)，进而于22℃孵育20分钟，终止药物接头的反应。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝270400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5000(实测平均值)、ε_D，370＝19000(实测平均值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：0.99mg/mL，抗体收量：5.94mg(59％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.3

实施例8 抗体－药物偶联物(7)

[化77]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(7)

抗体的还原：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.75)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至2mL管，添加30mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0148mL；相对于一分子抗体为6.9当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：于22℃孵育上述溶液10分钟后，添加实施例2的工序3中得到的化合物30mM二甲基亚砜溶液(0.0297mL；相对于一分子抗体为13.8当量)，于22℃孵育40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0178mL；相对于一分子抗体为27.6当量)，进而于22℃孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：0.99mg/mL，抗体收量：5.94mg(59％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.8

实施例9 抗体－药物偶联物(8)

[化78]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(8)

抗体的还原：针对参考例4中制作的抗CD33抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.66)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至2mL管，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0297mL；相对于一分子抗体为4.6当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝256400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5000(实测平均值)、ε_D，370＝19000(实测平均值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.06mg/mL，抗体收量：6.36mg(64％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.4

实施例10 抗体－药物偶联物(9)

[化79]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(9)

抗体的还原：针对参考例4中制作的抗CD33抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.66)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至2mL管，添加30mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0148mL；相对于一分子抗体为6.9当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体浓度：0.95mg/mL，抗体收量：5.70mg(57％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.7

实施例11 抗体－药物偶联物(10)

[化80]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(10)

抗体的还原：针对参考例5中制作的抗CD70抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.69)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至2mL管，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0297mL；相对于一分子抗体为4.6当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝262400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5000(实测平均值)、ε_D，370＝19000(实测平均值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.00mg/mL，抗体收量：6.00mg(60％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.2

实施例12 抗体－药物偶联物(11)

[化81]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(11)

抗体的还原：针对参考例5中制作的抗CD70抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.69)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至2mL管，添加30mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0148mL；相对于一分子抗体为6.9当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体浓度：0.96mg/mL，抗体收量：5.76mg(58％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.6

实施例13 抗体－药物偶联物(12)

[化82]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－[3－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)丙酰]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对实施例2的工序2中得到的化合物(80mg，0.084mmoL)，使用3－马来酰亚胺丙酸N－琥珀酰亚胺基酯(24.6mg，0.0924mmoL)代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(60.0mg，73％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.89(3H，t，J＝7.3Hz)，1.70－1.78(2H，m)，1.81－1.94(2H，m)，2.12－2.23(4H，m)，2.42(3H，s)，2.81(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，3.01－3.15(3H，m)，3.16－3.23(2H，m)，3.30－3.35(1H，m)，3.58－3.71(6H，m)，3.71－3.79(1H，m)，4.44－4.51(1H，m)，5.19(1H，d，J＝19.0Hz)，5.27(1H，d，J＝19.0Hz)，5.43(1H，d，J＝17.6Hz)，5.47(1H，d，J＝17.6Hz)，5.57－5.63(1H，m)，6.56(1H，s)，7.02(2H，s)，7.17－7.22(1H，m)，7.22－7.30(5H，m)，7.34(1H，s)，7.73(1H，t，J＝5.6Hz)，7.83(1H，d，J＝10.7Hz)，8.08(1H，t，J＝5.6Hz)，8.15(1H，d，J＝7.8Hz)，8.30(2H，dt，J＝18.7，5.7Hz)，8.49(1H，d，J＝8.8Hz).

MS(APCI)m/z：990(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(12)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及上述工序1中得到的化合物，利用与实施例2的工序4同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：12.16mg/mL，抗体收量：8.5mg(68％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.4

实施例14 抗体－药物偶联物(13)

[化83]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－{3－[2－(2－{[3－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)丙酰]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰}甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对实施例2的工序2中得到的化合物(100mg，0.119mmoL)，使用二异丙基乙基胺(20.8μL，0.119mmoL)代替三乙基胺，使用3－(2－(2－(3－马来酰亚胺丙酰胺)乙氧基)乙氧基)丙酸N－琥珀酰亚胺基酯(50.7mg，0.119mmoL)代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(66.5mg，48％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.85(3H，t，J＝7.4Hz)，1.65－1.74(2H，m)，1.77－1.90(2H，m)，2.07－2.19(4H，m)，2.30(2H，t，J＝7.2Hz)，2.33－2.36(2H，m)，2.38(3H，s)，2.76(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，2.96－3.18(9H，m)，3.42－3.44(4H，m)，3.53－3.76(10H，m)，4.43(1H，td，J＝8.6，4.7Hz)，5.14(1H，d，J＝18.8Hz)，5.23(1H，d，J＝18.8Hz)，5.38(1H，d，J＝17.2Hz)，5.42(1H，d，J＝17.2Hz)，5.52－5.58(1H，m)，6.52(1H，s)，6.98(2H，s)，7.12－7.17(1H，m)，7.18－7.25(4H，m)，7.29(1H，s)，7.69(1H，t，J＝5.5Hz)，7.78(1H，d，J＝11.3Hz)，7.98－8.03(2H，m)，8.11(1H，d，J＝7.8Hz)，8.16(1H，t，J＝5.7Hz)，8.23(1H，t，J＝5.9Hz)，8.44(1H，d，J＝9.0Hz).

MS(APCI)m/z：1149(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(13)

抗体浓度：12.76mg/mL，抗体收量：8.9mg(71％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.4

实施例15 抗体－药物偶联物(14)

[化84]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(14)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及实施例14的工序1中得到的化合物，利用与实施例4的工序1同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：1.60mg/mL，抗体收量：9.60mg(77％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.1

实施例16 抗体－药物偶联物(15)

[化85]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(15)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及实施例14的工序1中得到的化合物，利用与实施例5的工序1同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：1.64mg/mL，抗体收量：9.84mg(79％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.1

实施例17 抗体－药物偶联物(16)

[化86]

混合几乎全部量的实施例15和实施例16的抗体－药物偶联物，利用共通操作A将溶液浓缩，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：17.30mg，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.5

实施例18 抗体－药物偶联物(17)

[化87]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(17)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(100mL、抗体1g)放入到250mL烧瓶中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(2.43mL；相对于一分子抗体为3.6当量)，进一步添加1M磷酸氢二钾水溶液(5mL)。用pH计确认该溶液的pH为7.4附近后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(3.51mL；相对于一分子抗体为5.2当量)及二甲基亚砜(2.14mL)，在15℃水浴中用搅拌器搅拌130分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC水溶液(0.547mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：针对上述溶液，使用由超滤膜(Merck Japan、Pellicon XL Cassette、Biomax 50KDa)、管泵(tube pump)(Cole-Parmer International MasterFlex Pump型号77521－40、泵压头(Pump Head)型号7518－00)及管(Cole-Parmer InternationalMasterFlex Tube L/S16)构成的超滤装置，进行超滤纯化。即，一边向反应液中滴加作为纯化缓冲液的ABS(计800mL)，一边进行超滤纯化，由此，在除去未连接的药物接头及其他低分子量试剂的同时将缓冲液替换为ABS，进一步进行浓缩，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液约70mL。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝235300(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝4964(实测值)、ε_D，370＝18982(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：14.5mg/mL，抗体收量：1.0g(约100％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.5

实施例19 抗体－药物偶联物(18)

[化88]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(18)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(5mL、抗体50mg)放入到15mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.135mL；相对于一分子抗体为4当量)。用pH计确认该溶液的pH为7.4附近后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.219mL；相对于一分子抗体为6.5当量)及二甲基亚砜(0.064mL)，在15℃水浴中孵育90分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC水溶液(0.033mL；相对于一分子抗体为9.8当量)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液19mL。

抗体浓度：2.17mg/mL，抗体收量：41mg(82％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.0

实施例20 抗体－药物偶联物(19)

[化89]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(19)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(4mL、抗体40mg)放入到15mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.140mL；相对于一分子抗体为5.2当量)。用pH计确认该溶液的pH为7.4附近后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.232mL；相对于一分子抗体为8.6当量)，在15℃水浴中孵育90分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC水溶液(0.035mL；相对于一分子抗体为12.9当量)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液13mL。

抗体浓度：2.36mg/mL，抗体收量：31mg(77％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.9

实施例21 抗体－药物偶联物(20)

[化90]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(20)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.25mL、抗体12.5mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0287mL；相对于一分子抗体为3.4当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(NacalaiTesque，Inc.；0.0625mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0439mL；相对于一分子抗体为5.2当量)及二甲基亚砜(0.0267mL)，在15℃的水浴中孵育1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mMNAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0066mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液6mL后，利用共通操作A，将溶液浓缩。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：8.7mg(70％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.5

实施例22 抗体－药物偶联物(21)

[化91]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(21)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.25mL、抗体12.5mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0439mL；相对于一分子抗体为5.2当量)(0.0287mL；相对于一分子抗体为3.4当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0625mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0726mL；相对于一分子抗体为8.6当量)，在15℃的水浴中孵育1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－AldrichCo.LLC)水溶液(0.011mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：8.3mg(66％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.5

实施例23 抗体－药物偶联物(22)

[化92]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(22)

抗体的还原：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.75mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0065mL；相对于一分子抗体为2.5当量)，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0116mL；相对于一分子抗体为4.5当量)及二甲基亚砜(0.0098mL)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0017mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液2.5mL。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝270400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝4964(实测值)、ε_D，370＝18982(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：0.86mg/mL，抗体收量：2.2mg(54％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：2.5

实施例24 抗体－药物偶联物(23)

[化93]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(23)

抗体的还原：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.75mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.35mL、抗体3.5mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0113mL；相对于一分子抗体为5当量)，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0204mL；相对于一分子抗体为9当量)及丙二醇(关东化学株式会社、0.18mL)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0031mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：0.41mg/mL，抗体收量：1.0mg(29％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.1

实施例25 抗体－药物偶联物(24)

[化94]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(24)

抗体的还原：针对参考例4中制作的抗CD33抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.66mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0065mL；相对于一分子抗体为2.5当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0058mL)。确认该溶液的pH为7.0±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0116mL；相对于一分子抗体为4.5当量)及二甲基亚砜(0.0101mL)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(S igma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0017mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝256400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝4964(实测值)、ε_D，370＝18982(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.25mg/mL，抗体收量：3.1mg(78％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.7

实施例26 抗体－药物偶联物(25)

[化95]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(25)

抗体的还原：针对参考例4中制作的抗CD33抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.66mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0129mL；相对于一分子抗体为5当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.006mL)。确认该溶液的pH为7.0±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0233mL；相对于一分子抗体为9当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0035mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：1.17mg/mL，抗体收量：2.9mg(73％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.3

实施例27 抗体－药物偶联物(26)

[化96]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(26)

抗体的还原：针对参考例5中制作的抗CD70抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.69mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0065mL；相对于一分子抗体为2.5当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0058mL)。确认该溶液的pH为7.0±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例14的工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0116mL；相对于一分子抗体为4.5当量)及二甲基亚砜(0.0101mL)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0017mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝262400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝4964(实测值)、ε_D，370＝18982(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.14mg/mL，抗体收量：2.9mg(71％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.8

实施例28 抗体－药物偶联物(27)

[化97]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(27)

抗体的还原：针对参考例5中制作的抗CD70抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.69mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0129mL；相对于一分子抗体为5当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.006mL)。确认该溶液的pH为7.0±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体浓度：1.13mg/mL，抗体收量：2.8mg(71％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.4

实施例29 抗体－药物偶联物(28)

[化98]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－[19－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)－17－氧代－4，7，10，13－四氧代－16－氮杂十九烷－1－酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对实施例2的工序2中得到的化合物(90mg，0.107mmoL)，使用二异丙基乙基胺(18.7μL，0.107mmoL)代替三乙基胺，使用1－马来酰亚胺基－3－氧代－7，10，13，16－四氧杂－4－氮杂十九烷－19－酸N－琥珀酰亚胺基酯(55.1mg，0.107mmoL)代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(50mg，37％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.85(3H，t，J＝7.2Hz)，1.64－1.74(2H，m)，1.77－1.90(2H，m)，2.06－2.19(4H，m)，2.27－2.32(2H，m)，2.33－2.37(2H，m)，2.38(3H，s)，2.72－2.80(3H，m)，2.96－3.19(6H，m)，3.39－3.48(10H，m)，3.52－3.75(10H，m)，4.39－4.48(1H，m)，5.14(1H，d，J＝18.8Hz)，5.23(1H，d，J＝18.8Hz)，5.38(1H，d，J＝17.0Hz)，5.42(1H，d，J＝17.0Hz)，5.52－5.58(1H，m)，6.52(1H，s)，6.98(1H，s)，7.13－7.24(5H，m)，7.29(1H，s)，7.69(1H，t，J＝5.5Hz)，7.78(1H，d，J＝10.9Hz)，7.98－8.03(2H，m)，8.10(1H，d，J＝7.8Hz)，8.16(1H，t，J＝5.7Hz)，8.23(1H，t，J＝5.7Hz)，8.44(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(APCI)m/z：1237(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(28)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作C－1及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.0/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。将该溶液(1.25mL)放入到1.5mL聚丙烯制管中，向其中添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.025mL；相对于一分子抗体为3.0当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0625mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.102mL)和含有10mM上述工序1中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.047mL；相对于一分子抗体为5.5当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.009)mL，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：13.60mg/mL，抗体收量：9.5mg(76％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.3

实施例30 抗体－药物偶联物(29)

[化99]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－(叔丁氧基羰基)－β－丙氨酰甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对实施例2的工序2中得到的化合物(0.839g，1.00mmoL)，使用N－(叔丁氧基羰基)－β－丙氨酸代替4－(叔丁氧基羰基氨基)丁酸，与实施例1的工序1同样地进行反应，不进行纯化地将得到的粗产物用于下一工序。

工序2：β－丙氨酰甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对上述工序1中得到的粗产物，与实施例2的工序2同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.610g，67％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.67－1.77(2H，m)，1.79－1.92(2H，m)，2.09－2.22(4H，m)，2.40(3H，s)，2.46－2.55(2H，m)，2.82－2.73(1H，m)，2.95－3.13(5H，m)，3.14－3.21(2H，m)，3.55－3.80(6H，m)，4.44－4.52(1H，m)，5.20(2H，dd，J＝35.0，19.0Hz)，5.42(2H，s)，5.53－5.60(1H，m)，6.54(1H，s)，7.14－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.67(2H，brs)，7.72－7.78(1H，m)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，8.10－8.17(2H，m)，8.29(1H，t，J＝5.9Hz)，8.42(1H，t，J＝5.7Hz)，8.47(1H，d，J＝8.6Hz).

工序3：N－(溴乙酰)－β－丙氨酰甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

向2－溴乙酸(96.3mg，0.693mmoL)的二氯甲烷(4.5mL)溶液中，添加N－羟基琥珀酰亚胺(79.7mg，0.693mmoL)、1，3－二异丙基碳二亚胺(0.107mL，0.693mmoL)，在室温下进行搅拌。在0℃下将反应溶液添加到上述工序2中得到的化合物(473mg，0.462mmoL)、三乙基胺(0.154mL，1.11mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(4.5mL)溶液中，于室温搅拌1小时。用硅胶柱色谱法[洗脱溶剂：氯仿～氯仿：甲醇＝85：15(v/v)]纯化反应溶液，用氯仿：甲醇：乙醚混合溶剂洗涤得到的固体，以淡黄色固体形式得到标题化合物(191mg，40％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.67－1.77(2H，m)，1.79－1.92(2H，m)，2.08－2.22(4H，m)，2.33(2H，t，J＝7.0Hz)，2.40(3H，s)，2.74－2.83(1H，m)，2.99－3.12(3H，m)，3.14－3.21(2H，m)，3.24－3.30(2H，m)，3.56－3.77(6H，m)，3.82(2H，s)，4.41－4.51(1H，m)，5.20(2H，q，J＝18.9Hz)，5.42(2H，s)，5.54－5.60(1H，m)，6.54(1H，s)，7.15－7.27(5H，m)，7.31(1H，s)，7.69－7.74(1H，m)，7.80(1H，d，J＝10.9Hz)，8.06(1H，t，J＝5.7Hz)，8.13(1H，d，J＝7.8Hz)，8.21－8.34(3H，m)，8.46(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：1030，1032(M+H)⁺

工序4：抗体－药物偶联物(29)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.09mL)和含有10mM上述工序3中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.059mL；相对于一分子抗体为7.0当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.009mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：13.9mg/mL，抗体收量：9.7mg(78％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.2

实施例31 抗体－药物偶联物(30)

[化100]

(式中“工程”表示“工序”。)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及实施例30的工序3中得到的化合物，利用与实施例4的工序1同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：1.94mg/mL，抗体收量：11.64mg(93％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.6

实施例32 抗体－药物偶联物(31)

[化101]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(31)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及实施例30的工序3中得到的化合物，利用与实施例5的工序1同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：1.90mg/mL，抗体收量：11.40mg(91％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.7

实施例33 抗体－药物偶联物(32)

[化102]

混合几乎全部量的实施例31和实施例32的抗体－药物偶联物，利用共通操作A将溶液浓缩，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：21.06mg，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.0

实施例34 抗体－药物偶联物(33)

[化103]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：4－({N⁶－(叔丁氧基羰基)－N²－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－赖氨酰}氨基)丁酸叔丁酯

向N^ε－(叔丁氧基羰基)－N^α－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－赖氨酸(1.00g，2.14mmoL)、N－羟基琥珀酰亚胺(0.370g，3.20mmoL)、及4－氨基丁酸叔丁酯盐酸盐(0.830g，4.27mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，添加1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.610g，3.20mmoL)及N，N－二异丙基乙基胺(0.410ml，2.35mmol)，在室温下搅拌3天。用乙酸乙酯稀释反应液，用10％柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、及饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥有机层。在减压下馏去溶剂，以无色固体形式得到标题化合物(1.35g，定量)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：1.14－1.42(4H，m)，1.36(9H，s)，1.37(9H，s)，1.48－1.67(4H，m)，2.18(2H，t，J＝7.6Hz)，2.84－2.93(2H，m)，2.99－3.11(2H，m)，3.84－3.94(1H，m)，4.18－4.30(3H，m)，6.76(1H，t，J＝5.4H z)，7.33(2H，t，J＝7.3Hz)，7.39－7.45(3H，m)，7.73(2H，dd，J＝7.3，2.7Hz)，7.85－7.92(3H，m).

工序2：4－{[N⁶－(叔丁氧基羰基)－L－赖氨酰]氨基}丁酸叔丁酯

向上述工序1中得到的化合物(1.35g，2.22mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(8.00mL)溶液中，添加哌啶(2.00mL)，在室温下搅拌1.5小时。减压馏去溶剂，得到含有标题化合物的混合物。不进一步进行纯化地将该混合物用于下一反应。

工序3：N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－缬氨酰－N⁶－(叔丁氧基羰基)－N－(4－叔丁氧基－4－氧代丁基)－L－赖氨酸酰胺

向上述工序2中得到的混合物(2.22mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(30.0mL)溶液中，添加N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－缬氨酸(1.13g，3.32mmoL)、N－羟基琥珀酰亚胺(0.310g，2.66mmoL)、及1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.550g，2.88mmoL)，在室温下搅拌18小时。用乙酸乙酯稀释反应液，用饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥有机层。在减压下馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]纯化得到的残留物，以无色固体形式得到(0.363g，23％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.84(6H，t，J＝6.0Hz)，1.12－1.64(8H，m)，1.34(9H，s)，1.38(9H，s)，1.90－2.04(1H，m)，2.17(2H，t，J＝7.3Hz)，2.79－2.90(2H，m)，2.99－3.09(2H，m)，3.83－3.91(1H，m)，4.08－4.44(4H，m)，6.71(1H，t，J＝5.4Hz)，7.32(2H，t，J＝7.3Hz)，7.42(3H，t，J＝7.3Hz)，7.74(2H，t，J＝7.0Hz)，7.85－7.91(4H，m).

MS(ESI)m/z：709(M+H)⁺

工序4：N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－缬氨酰－N－(3－羧基丙基)－L－赖氨酸酰胺甲酸盐

向上述工序3中得到的化合物(0.363mg，0.512mmoL)中添加甲酸(10.0ml)，在室温下搅拌4小时。在减压下馏去溶剂，得到标题化合物。不进一步进行纯化地将该化合物用于下一反应。

工序5：N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－缬氨酰－N⁶－(叔丁氧基羰基)－N－(3－羧基丙基)－L－赖氨酸酰胺

向上述工序4中得到的化合物(0.512mmoL)的1，4－二氧杂环己烷(5.00mL)悬浮液中，添加饱和碳酸氢钠水溶液(20.0ml)及二叔丁基二碳酸酯(di-tert-butyldicarbonate)(0.178ml，0.769m moL)，在室温下搅拌3小时。用乙酸乙酯稀释反应液，用10％柠檬酸水溶液及饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥有机层。在减压下馏去溶剂，以无色固体形式得到标题化合物(0.295g，88％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.84(6H，t，J＝6.7Hz)，1.13－1.39(4H，m)，1.35(9H，s)，1.48－1.62(4H，m)，1.91－2.04(1H，m)，2.20(2H，t，J＝7.3Hz)，2.80－2.89(2H，m)，2.99－3.11(2H，m)，3.87(1H，dd，J＝8.5，6.7Hz)，4.06－4.35(4H，m)，6.71(1H，t，J＝6.0Hz)，7.32(2H，t，J＝7.6Hz)，7.39－7.46(3H，m)，7.74(2H，t，J＝7.6Hz)，7.83－7.94(4H，m).

MS(ESI)m/z：653(M+H)⁺

工序6：N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]－L－缬氨酰－N⁶－(叔丁氧基羰基)－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)－L－赖氨酸酰胺

针对化合物(4)的甲磺酸盐(0.240g、0.452mmoL)，使用上述工序5中得到的化合物(0.295g，0.452mmoL)代替4－(叔丁氧基羰基氨基)丁酸，与实施例1的工序1同样地进行反应，以淡橙色固体形式得到标题化合物(0.208g，43％)。

MS(ESI)m/z：1071(M+H)⁺

工序7：L－缬氨酰－N⁶－(叔丁氧基羰基)－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)－L－赖氨酸酰胺

针对上述工序6中得到的化合物(0.208g，0.194mmoL)，与上述工序2同样地进行反应，得到含有标题化合物的混合物。不进一步进行纯化地将该混合物用于下一反应。

工序8：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]－L－缬氨酰－N⁶－(叔丁氧基羰基)－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)－L－赖氨酸酰胺

针对上述工序7中得到的混合物(0.194mmoL)，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.133g，56％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.77(6H，t，J＝5.7Hz)，0.87(3H，t，J＝7.3Hz)，1.14－1.71(10H，m)，1.35(9H，s)，1.77－1.95(3H，m)，2.02－2.23(7H，m)，2.40(3H，s)，2.84(3H，q，J＝6.4Hz)，3.05(2H，d，J＝6.7Hz)，3.17(2H，s)，3.26－3.39(3H，m)，4.01－4.16(2H，m)，5.15(1H，d，J＝18.7Hz)，5.24(1H，d，J＝18.7Hz)，5.36－5.48(2H，m)，5.51－5.60(1H，m)，6.52(1H，s)，6.72(1H，t，J＝6.0Hz)，6.99(2H，s)，7.31(1H，s)，7.71－7.85(5H，m)，8.41(1H，d，J＝9.1Hz).

MS(ESI)m/z：1041(M+H)⁺

工序9：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]－L－缬氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)－L－赖氨酸酰胺三氟乙酸盐

向上述工序8中得到的化合物(0.110mg，0.106mmoL)的二氯甲烷(10.0ml)溶液中，添加三氟乙酸(4.00ml)，在室温下搅拌5小时。在减压下馏去溶剂，以淡黄色固体形式得到标题化合物(70.0mg，64％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.76－0.81(6H，m)，0.87(3H，t，J＝7.3Hz)，1.12－1.31(4H，m)，1.39－1.56(8H，m)，1.57－1.74(3H，m)，1.79－1.96(3H，m)，2.06－2.18(7H，m)，2.40(3H，s)，2.70－2.80(2H，m)，3.01－3.10(2H，m)，3.13－3.22(2H，m)，4.04(1H，t，J＝7.6Hz)，4.10－4.20(1H，m)，5.15(1H，d，J＝18.7Hz)，5.24(1H，d，J＝18.7H z)，5.36－5.47(2H，m)，5.52－5.60(1H，m)，6.53(1H，s)，7.00(2H，s)，7.32(1H，s)，7.61(3H，brs)，7.75－7.88(4H，m)，8.43(1H，d，J＝8.5Hz).

MS(ESI)m/z：941(M+H)⁺

工序10：抗体－药物偶联物(33)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及上述工序9中得到的化合物，利用与实施例29的工序2同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：12.0mg/mL，抗体收量：8.4mg(67％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.2

实施例35 抗体－药物偶联物(34)

[化104]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－(3－硫烷基丙酰)甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[d e]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对实施例2的工序2中得到的化合物(84.0mg，0.100mmoL)，使用3－巯基丙酸N－琥珀酰亚胺基酯代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(61.2mg，66％)。

¹H－NMR(DMSO－D₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.77－1.66(2H，m)，1.79－1.92(2H，m)，2.07－2.24(4H，m)，2.31－2.47(3H，m)，2.40(3H，s)，2.59－2.69(2H，m)，2.78(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，2.98－3.13(3H，m)，3.14－3.23(2H，m)，3.54－3.79(6H，m)，4.40－4.50(1H，m)，5.20(2H，dd，J＝36.8，19.2Hz)，5.36－5.47(2H，m)，5.52－5.63(1H，m)，6.54(1H，s)，7.14－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.68－7.74(1H，m)，7.80(1H，d，J＝10.9Hz)，8.03－8.09(1H，m)，8.13(1H，d，J＝7.8Hz)，8.19－8.29(2H，m)，8.46(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：927(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(34)

抗体的SMCC衍生物化：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成20mg/mL的抗体浓度。将该溶液(0.25mL)放入到1.5mL管中，在室温下向其中添加含有27.6mM的4－(N－马来酰亚胺基甲基)环己烷－1－羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC，ThermoFisher Scientific Inc.)的DMSO溶液(0.0063mL；相对于一分子抗体约相当于2.55当量)，在室温下进行2小时反应。使用共通操作D－2纯化该反应液，得到含有约5mg的经SMCC衍生物化的抗体的溶液0.7mL。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加DMSO(0.045mL)和含有10mM上述工序1中得到的化合物的DMSO溶液(0.015mL；相对于一分子抗体约相当于2.4当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌16小时，将药物接头连接于抗体。

纯化：利用共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)纯化上述溶液，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液3.5mL后，利用共通操作A，将溶液浓缩。

特性评价：利用共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝235300(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5000(实测平均值)、ε_D，370＝19000(实测平均值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：3.85mg/mL，抗体收量：0.8mg(16％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：2.9

实施例36 抗体－药物偶联物(35)

[化105]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(35)

抗体的SMCC衍生物化：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成20mg/mL的抗体浓度。将该溶液(0.25mL)放入到1.5mL管中，在室温下向其中添加含有27.6mM的4－(N－马来酰亚胺基甲基)环己烷－1－羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC，ThermoFisher Scientific Inc.)的D MSO溶液(0.0125mL；相对于一分子抗体约相当于5.1当量)，在室温下进行2小时反应。利用共通操作D－2纯化该反应液，得到了含有约5mg经SMCC衍生物化的抗体的溶液0.7mL。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加DMSO(0.03mL)和含有10mM实施例35的工序1中得到的化合物的DMSO溶液(0.03mL；相对于一分子抗体约相当于4.8当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌16小时，将药物接头连接于抗体。

抗体浓度：2.43mg/mL，抗体收量：0.5mg(10％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：4.2

实施例37 抗体－药物偶联物(36)

[化106]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－{8－[(2，5－二氧代吡咯烷－1－基)氧基]－8－氧代辛酰基}甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(4－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－4－氧代丁基)甘氨酸酰胺

针对实施例2的工序2中得到的化合物(84.0mg，0.100mmoL)，使用辛二酸二(N－琥珀酰亚胺基)酯代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(77.1mg，71％)。

¹H－NMR(DMSO－D₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.21－1.38(4H，m)，1.43－1.50(2H，m)，1.55－1.63(2H，m)，1.68－1.76(2H，m)，1.80－1.91(2H，m)，2.07－2.22(6H，m)，2.40(3H，s)，2.60－2.67(2H，m)，2.76－2.84(5H，m)，2.97－3.22(5H，m)，3.56－3.76(6H，m)，4.40－4.50(1H，m)，5.20(2H，q，J＝18.8Hz)，5.37－5.48(2H，m)，5.53－5.62(1H，m)，6.54(1H，s)，7.15－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.71(1H，t，J＝5.5Hz)，7.80(1H，d，J＝10.9Hz)，8.04(1H，t，J＝5.9Hz)，8.09(1H，t，J＝5.9Hz)，8.14(1H，d，J＝7.8Hz)，8.26(1H，t，J＝5.9Hz)，8.47(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：1092(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(36)

抗体与药物接头的偶联：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成20mg/mL的抗体浓度。将该溶液(0.25mL)放入到1.5mL管中，在室温下向其中添加含有10mM上述工序1中得到的化合物的DMSO溶液0.025mL(相对于一分子抗体约相当于3.7当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌16小时，将药物接头连接于抗体。

抗体浓度：6.25mg/mL，抗体收量：1.3mg(26％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.2

实施例38 抗体－药物偶联物(37)

[化107]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(37)

抗体与药物接头的偶联：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成20mg/mL的抗体浓度。将该溶液(0.5mL)放入到1.5mL管内后，在室温下向其中添加DMSO(0.025mL)和含有10mM实施例37的工序1中得到的化合物的DMSO溶液(0.025mL；相对于一分子抗体约相当于7.4当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌16小时，将药物接头连接于抗体。

抗体浓度：4.36mg/mL，抗体收量：0.9mg(18％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：4.1

实施例39 抗体－药物偶联物(38)

[化108]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(38)

抗体与药物接头的偶联：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.75mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管内后，在室温下向其中添加DMSO(0.017mL)和含有10mM实施例37的工序1中得到的化合物的DMSO溶液(0.023mL；相对于一分子抗体为9当量相当)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌4小时，将药物接头连接于抗体。

纯化：利用共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)纯化上述溶液，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液2.5mL。

特性评价：利用共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝270400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝2670(实测值)、ε_D，370＝15820(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：0.55mg/mL，抗体收量：1.4mg(34％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：2.7

实施例40 抗体－药物偶联物(39)

[化109]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(39)

抗体与药物接头的偶联：针对参考例4中制作的抗CD33抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.66mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管内后，在室温下向其中添加DMSO(0.017mL)和含有10mM实施例37的工序1中得到的化合物的DMSO溶液(0.023mL；相对于一分子抗体为9当量相当)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌4小时，将药物接头连接于抗体。

特性评价：利用共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝256400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝2670(实测值)、ε_D，370＝15820(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：0.93mg/mL，抗体收量：2.3mg(58％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：4.0

实施例41 抗体－药物偶联物(40)

[化110]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(40)

抗体与药物接头的偶联：针对参考例5中制作的抗CD70抗体，利用共通操作C－2及B(作为280nm吸光系数，使用1.69mLmg^－1cm^－1)，将介质替换为PBS6.5/EDTA，制备成10mg/mL的抗体浓度。在将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管内后，在室温下向其中添加DMSO(0.017mL)和含有10mM实施例37的工序1中得到的化合物的DMSO溶液(0.023mL；相对于一分子抗体为9当量相当)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌4小时，将药物接头连接于抗体。

特性评价：利用共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝262400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝2670(实测值)、ε_D，370＝15820(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.04mg/mL，抗体收量：2.6mg(65％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：4.1

实施例42 2－(2－氨基乙氧基)－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]乙酰胺

[化111]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：[2－(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯

针对化合物(4)的甲磺酸盐(3.10g、5.47moL)，使用{2－[(叔丁氧基羰基)氨基]乙氧基}乙酸(J.Med.Chem.，1992年，35卷，2928项)(1.55g，6.01mmol)代替4－(叔丁氧基羰基氨基)丁酸，与实施例1的工序1同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(2.56g，73％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.3Hz)，1.26(9H，s)，1.81－1.91(2H，m)，2.13－2.22(2H，m)，2.40(3H，s)，3.08－3.26(4H，m)，3.43－3.53(2H，m)，4.00(1H，d，J＝15.1Hz)，4.05(1H，d，J＝15.1Hz)，5.14(1H，d，J＝18.7Hz)，5.22(1H，d，J＝18.7Hz)，5.40(1H，d，J＝16.6H z)，5.44(1H，d，J＝16.6Hz)，5.59－5.66(1H，m)，6.53(1H，s)，6.86(1H，t，J＝5.4Hz)，7.31(1H，s)，7.79(1H，d，J＝10.9Hz)，8.49(1H，d，J＝9.1Hz).

MS(APCI)m/z：637(M+H)⁺

工序2：2－(2－氨基乙氧基)－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]乙酰胺

针对上述工序1中得到的化合物(1.50g，2.36mol)，与实施例1的工序2同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物的三氟盐酸盐(1.50g，定量)。在向患癌小鼠给予抗体－药物偶联物(41)时，在肿瘤中确认了该化合物。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.5Hz)，1.81－1.92(2H，m)，2.15－2.23(2H，m)，2.41(3H，s)，3.05(2H，t，J＝5.1Hz)，3.15－3.23(2H，m)，3.71(2H，t，J＝5.1Hz)，4.10(2H，s)，5.19(1H，d，J＝18.7Hz)，5.24(1H，d，J＝18.7Hz)，5.43(2H，s)，5.58－5.66(1H，m)，6.55(1H，s)，7.33(1H，s)，7.73－7.84(4H，m)，8.55(1H，d，J＝9.1Hz).

MS(APCI)m/z：537(M+H)⁺

实施例43 抗体－药物偶联物(41)

[化112]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－(叔丁氧基羰基)甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[2－(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)乙基]甘氨酸酰胺

针对实施例42的化合物(554mg，0.85mmol)，与实施例2的工序1同样地进行反应，得到标题化合物(775mg，95％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.85(3H，t，J＝7.3Hz)，1.36(9H，s)，1.78－1.89(2H，m)，2.13－2.22(2H，m)，2.39(3H，s)，2.71(1H，dd，J＝13.4，9.8Hz)，2.95(1H，dd，J＝13.4，4.3Hz)，3.09－3.23(1H，m)，3.23－3.32(2H，m)，3.40－3.62(8H，m)，3.73(1H，dd，J＝16.5，5.5Hz)，4.03(2H，s)，4.39－4.47(1H，m)，5.17(1H，d，J＝18.9Hz)，5.25(1H，d，J＝18.9Hz)，5.41(1H，d，J＝16.8Hz)，5.45(1H，d，J＝16.8Hz)，5.57－5.64(1H，m)，6.54(1H，s)，6.99(1H，t，J＝5.8Hz)，7.13－7.26(5H，m)，7.31(1H，s)，7.76－7.82(2H，m)，7.90(1H，t，J＝5.2Hz)，8.13(1H，d，J＝7.9Hz)，8.27(1H，t，J＝5.8Hz)，8.49(1H，d，J＝8.5Hz).

MS(APCI)m/z：955(M+H)⁺

工序2：甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[2－(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)乙基]甘氨酸酰胺三氟乙酸盐

针对上述工序1中得到的化合物(630mg，0.659mmol)，与实施例2的工序2同样地进行反应，得到标题化合物(588mg，92％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.86(3H，t，J＝7.3Hz)，1.79－1.90(2H，m)，2.13－2.22(2H，m)，2.39(3H，s)，2.71(1H，dd，J＝13.4，10.1Hz)，2.99(1H，dd，J＝13.4，4.3Hz)，3.09－3.23(1H，m)，3.24－3.32(3H，m)，3.41－3.71(7H，m)，3.86(1H，dd，J＝16.8，5.8Hz)，4.04(2H，s)，4.52(1H，td，J＝9.0，4.1Hz)，5.17(1H，d，J＝18.9Hz)，5.25(1H，d，J＝18.9Hz)，5.41(1H，d，J＝16.5Hz)，5.45(1H，d，J＝16.5Hz)，5.56－5.65(1H，m)，6.55(1H，s)，7.13－7.26(5H，m)，7.32(1H，s)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，7.87－8.01(4H，m)，8.29－8.36(2H，m)，8.46－8.55(2H，m).

MS(APCI)m/z：855(M+H)⁺

工序3：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[2－(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)乙基]甘氨酸酰胺

针对上述工序2中得到的化合物(240mg，0.247mmol)，与实施例2的工序3同样地进行反应，得到标题化合物(162mg，62％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.86(3H，t，J＝7.6Hz)，1.13－1.22(2H，m)，1.40－1.51(4H，m)，1.78－1.90(2H，m)，2.09(2H，t，J＝7.6Hz)，2.14－2.21(2H，m)，2.39(3H，s)，2.74(1H，dd，J＝13.6，9.7Hz)，2.96(1H，dd，J＝13.6，4.5Hz)，3.08－3.24(1H，m)，3.24－3.30(1H，m)，3.33－3.40(4H，m)，3.47－3.68(7H，m)，3.72(1H，dd，J＝16.6，5.7Hz)，4.03(2H，s)，4.42(1H，td，J＝8.6，4.2Hz)，5.17(1H，d，J＝18.7Hz)，5.25(1H，d，J＝18.7Hz)，5.40(1H，d，J＝17.2Hz)，5.44(1H，d，J＝17.2Hz)，5.57－5.64(1H，m)，6.52(1H，s)，6.99(2H，s)，7.13－7.25(5H，m)，7.31(1H，s)，7.74－7.81(2H，m)，7.99(1H，t，J＝5.7Hz)，8.03－8.11(2H，m)，8.22(1H，t，J＝5.7Hz)，8.47(1H，d，J＝9.1Hz).

MS(APCI)m/z：1048(M+H)⁺

工序4：抗体－药物偶联物(41)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及上述工序3中得到的化合物，利用与实施例29的工序2同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：12.0mg/mL，抗体收量：8.4mg(67％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.5

实施例44 抗体－药物偶联物(42)

[化113]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(42)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及实施例43的工序3中得到的化合物，利用与实施例5的工序1同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：0.83mg/mL，抗体收量：4.98mg(40％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.2

实施例45 抗体－药物偶联物(43)

[化114]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(43)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及实施例43的工序3中得到的化合物，利用与实施例4的工序1同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：1.06mg/mL，抗体收量：6.36mg(51％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.3

实施例46 抗体－药物偶联物(44)

[化115]

混合几乎全部量的实施例44和实施例45的抗体－药物偶联物，利用共通操作A将溶液浓缩，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：10.21mg，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.6

实施例47 抗体－药物偶联物(45)

[化116]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(45)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例43的工序3中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0439mL；相对于一分子抗体为5.2当量)及二甲基亚砜(0.0267mL)，在15℃的水浴中孵育1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mMNAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0066mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝235300(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5193(实测值)、ε_D，370＝20347(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：9.3mg(74％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.7

实施例48 抗体－药物偶联物(46)

[化117]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(46)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例43的工序3中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0726mL；相对于一分子抗体为8.6当量)，在15℃的水浴中孵育1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－AldrichCo.LLC)水溶液(0.011mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：7.8mg(62％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.2

实施例49 N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

[化118]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：(3－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－3－氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯

针对化合物(4)的甲磺酸盐(500mg、0.941mmoL)，使用N－(叔丁氧基羰基)－β－丙氨酸代替4－(叔丁氧基羰基氨基)丁酸，与实施例1的工序1同样地进行反应，以黄褐色固体的形式得到标题化合物(616mg、定量)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.29(9H，s)，1.86(2H，dt，J＝15.1，7.3Hz)，2.04－2.22(2H，m)，2.31(2H，t，J＝6.8Hz)，2.40(3H，s)，3.10－3.26(4H，m)，5.15(1H，d，J＝18.8Hz)，5.26(1H，d，J＝19.2Hz)，5.42(2H，dd，J＝18.8，16.4Hz)，5.57(1H，dt，J＝8.5，4.2Hz)，6.53(1H，s)，6.78(1H，t，J＝5.5Hz)，7.30(1H，s)，7.80(1H，d，J＝11.0Hz)，8.46(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：607(M+H)⁺

工序2：N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

针对上述工序1中得到的化合物，与实施例1的工序2同样地进行反应，以黄色固体形式得到标题化合物(499mg、86％)的三氟乙酸盐。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.2Hz)，1.86(2H，dquin，J＝14.6，7.2，7.2，7.2，7.2Hz)，2.06－2.27(1H，m)，2.41(3H，s)，2.46－2.57(2H，m)，3.08(2H，t，J＝6.8Hz)，3.14－3.24(2H，m)，5.22(1H，d，J＝18.8Hz)，5.29(1H，d，J＝18.8Hz)，5.43(2H，s)，5.58(1H，dt，J＝8.5，4.5Hz)，6.55(1H，s)，7.32(1H，s)，7.74(3H，brs)，7.82(1H，d，J＝11.0Hz)，8.67(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：507(M+H)⁺

实施例50 抗体－药物偶联物(47)

[化119]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－(叔丁氧基羰基)甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酰－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

针对实施例49的化合物(484mg、0.780mmoL)，与实施例2的工序1同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(626mg、87％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.27－1.42(9H，m)，1.77－1.93(2H，m)，2.06－2.22(2H，m)，2.36(2H，t，J＝7.2Hz)，2.40(3H，d，J＝1.6Hz)，2.44－2.54(2H，m)，2.76(1H，dd，J＝14.5，10.2Hz)，3.02(1H，dd，J＝13.9，4.5Hz)，3.12－3.22(2H，m)，3.52(6H，d，J＝6.3Hz)，4.42－4.54(1H，m)，5.19(1H，d，J＝19.2Hz)，5.26(1H，d，J＝18.4Hz)，5.42(1H，dd，J＝18.4，16.4Hz)，5.57(1H，dt，J＝8.7，4.4Hz)，6.53(1H，s)，6.98(1H，t，J＝5.9Hz)，7.14－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.77－7.84(1H，m)，7.91(1H，t，J＝5.5Hz)，8.16(1H，d，J＝7.8Hz)，8.27(1H，t，J＝5.1Hz)，8.52(1H，d，J＝9.0Hz).

工序2：甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酰－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺三氟乙酸盐

针对上述工序1中得到的化合物(624mg、0.675mmoL)，与实施例2的工序2同样地进行反应，以黄色固体形式得到标题化合物(626mg、92％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.86(2H，tt，J＝14.5，7.2Hz)，2.07－2.22(2H，m)，2.36(2H，t，J＝7.2Hz)，2.40(3H，s)，2.44－2.54(2H，m)，2.75(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，3.04(1H，dd，J＝13.7，4.3Hz)，3.12－3.22(2H，m)，3.58(2H，d，J＝4.7Hz)，3.69(3H，td，J＝11.2，5.7Hz)，3.87(1H，dd，J＝17.0，5.7Hz)，4.54(1H，m，J＝17.8，4.5Hz)，5.19(1H，d，J＝19.2Hz)，5.26(1H，d，J＝18.8Hz)，5.43(2H，s)，5.51－5.60(1H，m)，6.55(1H，s)，7.14－7.29(5H，m)，7.32(1H，s)，7.81(1H，d，J＝10.9Hz)，7.88(1H，t，J＝5.7Hz)，7.97(3H，brs)，8.29－8.38(2H，m)，8.50(1H，t，J＝5.7Hz)，8.55(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：825(M+H)⁺

工序3：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酰－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

针对上述工序2中得到的化合物(60.0mg、0.0646mmoL)，与实施例2的工序3同样地进行反应，以固体形式得到标题化合物(14.0mg、21％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.86(3H，t，J＝7.2Hz)，1.12－1.22(2H，m)，1.39－1.51(4H，m)，1.79－1.91(2H，m)，2.02－2.20(2H，m)，2.07(2H，t，J＝7.4Hz)，2.30－2.42(4H，m)，2.40(3H，s)，2.78(1H，dd，J＝14.1，9.4Hz)，3.02(1H，dd，J＝14.7，4.9Hz)，3.12－3.21(2H，m)，3.26－3.42(2H，m)，3.50－3.80(6H，m)，4.40－4.51(1H，m)，5.19(1H，d，J＝19.6Hz)，5.26(1H，d，J＝19.2Hz)，5.42(2H，brs)，5.51－5.62(1H，m)，6.53(1H，s)，6.99(2H，s)，7.13－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.74－7.84(2H，m)，8.01(1H，t，J＝5.3Hz)，8.06(1H，t，J＝5.7Hz)，8.14(1H，d，J＝8.2Hz)，8.25(1H，t，J＝5.7Hz)，8.53(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：1018(M+H)⁺

工序4：抗体－药物偶联物(47)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及上述工序3中得到的化合物，利用与实施例2的工序4同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：12.27mg/mL，抗体收量：8.6mg(69％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.4

实施例51 抗体－药物偶联物(48)

[化120]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－[3－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)丙酰]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酰－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

针对实施例50的工序2中得到的化合物(60.0mg、0.0646mmoL)，使用3－马来酰亚胺丙酸N－琥珀酰亚胺基酯代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以淡黄色固体形式得到标题化合物(36.0mg、57％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.86(3H，t，J＝7.4Hz)，1.85(2H，dt，J＝14.4，7.5Hz)，2.05－2.22(2H，m)，2.40(3H，s)，2.30－2.44(5H，m)，2.73－2.84(1H，m)，3.02(1H，dd，J＝13.9，4.5Hz)，3.17(3H，d，J＝5.1Hz)，3.26－3.40(2H，m)，3.41－3.81(6H，m)，4.40－4.51(1H，m)，5.19(1H，d，J＝19.2Hz)，5.26(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，brs)，5.52－5.61(1H，m)，6.53(1H，s)，6.99(2H，s)，7.13－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.80(2H，d，J＝10.2Hz)，8.03(1H，t，J＝5.5Hz)，8.12(1H，d，J＝8.2Hz)，8.20－8.31(2H，m)，8.52(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：976(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(48)

抗体浓度：11.59mg/mL，抗体收量：8.1mg(65％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.7

实施例52 抗体－药物偶联物(49)

[化121]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－{3－[2－(2－{[3－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)丙酰]氨基})乙氧基]丙酰}甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酰－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

针对实施例50的工序2中得到的化合物(60.0mg、0.0646mmoL)，使用3－(2－(2－(3－马来酰亚胺丙酰胺)乙氧基)乙氧基)丙酸N－琥珀酰亚胺基酯代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以固体形式得到标题化合物(23.0mg、31％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.86(3H，t，J＝7.4Hz)，1.77－1.92(2H，m)，2.07－2.21(2H，m)，2.27－2.42(6H，m)，2.40(3H，s)，2.74－2.84(1H，m)，2.97－3.06(1H，m)，3.09－3.21(4H，m)，3.25－3.39(6H，m)，3.45(4H，s)，3.50－3.80(8H，m)，4.41－4.51(1H，m)，5.19(1H，d，J＝18.4Hz)，5.26(1H，m，J＝18.4Hz)，5.42(2H，brs)，5.51－5.61(1H，m)，6.54(1H，s)，7.00(2H，s)，7.13－7.28(5H，m)，7.31(1H，s)，7.74－7.87(2H，m)，7.93－8.07(2H，m)，8.09－8.21(2H，m)，8.26(1H，brs)，8.54(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：1135(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(49)

使用参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体及上述工序1中得到的化合物，利用与实施例29的工序2同样的方法，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：14.50mg/mL，抗体收量：10.2mg(82％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.8

实施例53 抗体－药物偶联物(50)

[化122]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－[19－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)－17－氧代－4，7，10，13－四氧杂－16－氮杂十九烷－1－酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰甘氨酰－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－β－丙氨酸酰胺

针对实施例50的工序2中得到的化合物(60.0mg、0.0646mmoL)，使用1－马来酰亚胺基－3－氧代－7，10，13，16－四氧杂－4－氮杂十九烷酸N－琥珀酰亚胺基酯代替6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯，与实施例2的工序3同样地进行反应，以固体形式得到标题化合物(23.0mg、29％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.86(3H，t，J＝7.0Hz)，1.85(2H，tt，J＝14.6，7.1Hz)，2.06－2.22(2H，m)，2.40(3H，s)，2.28－2.43(6H，m)，2.78(1H，dd，J＝13.7，9.4Hz)，3.02(1H，dd，J＝14.1，3.9Hz)，3.09－3.22(4H，m)，3.27－3.41(4H，m)，3.47(12H，d，J＝8.6Hz)，3.53－3.81(10H，m)，4.41－4.51(1H，m)，5.19(1H，d，J＝19.2Hz)，5.26(1H，d，J＝18.8Hz)，5.42(2H，brs)，5.53－5.61(1H，m)，6.54(1H，s)，7.00(2H，s)，7.12－7.29(5H，m)，7.31(1H，s)，7.74－7.85(2H，m)，8.03(2H，d，J＝6.6Hz)，8.11－8.21(2H，m)，8.27(1H，t，J＝5.9Hz)，8.54(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：1224(M+H)⁺

工序2：抗体－药物偶联物(50)

抗体浓度：13.47mg/mL，抗体收量：9.4mg(75％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.1

实施例54 抗体－药物偶联物(51)

[化123]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：(6－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－6－氧代己基)氨基甲酸叔丁酯

针对化合物(4)的甲磺酸盐(0.500g，0.882mmoL)，使用6－(叔丁氧基羰基氨基)己酸代替4－(叔丁氧基羰基氨基)丁酸，与实施例1的工序1同样地进行反应，得到标题化合物(0.620g，定量)。

¹H－NMR(DMSO－d₆)δ：0.83(3H，t，J＝7.8Hz)，1.14－1.28(2H，m)，1.31(9H，s)，1.47－1.61(2H，m)，1.75－1.89(2H，m)，2.04－2.17(4H，m)，2.35(3H，s)，2.81－2.88(2H，m)，3.09－3.16(2H，m)，5.10(1H，d，J＝19.4Hz)，5.16(1H，d，J＝19.4Hz)，5.39(2H，s)，5.48－5.55(1H，m)，6.50(1H，s)，6.73－6.78(1H，m)，7.26(1H，s)，7.74(1H，d，J＝10.9Hz)，8.39(1H，d，J＝9.0Hz).

工序2：6－氨基－N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]己烷酰胺三氟乙酸盐

针对上述工序1中得到的化合物(0.397g，0.611mmoL)，与实施例1的工序2同样地进行反应，得到标题化合物(0.342g，84％)。

¹H－NMR(DMSO－d₆)δ：0.88(3H，t，J＝7.2Hz)，1.31－1.41(2H，m)，1.52－1.70(4H，m)，1.80－1.94(2H，m)，2.05－2.18(2H，m)，2.21(2H，t，J＝7.4Hz)，2.40(3H，s)，2.81(2H，t，J＝7.4Hz)，3.10－3.25(2H，m)，3.33(2H，brs)，5.18(1H，d，J＝19.8Hz)，5.22(1H，d，J＝19.8Hz)，5.41(2H，d，J＝16.6Hz)，5.45(2H，d，J＝16.6Hz)，5.53－5.60(1H，m)，6.55(1H，s)，7.32(1H，s)，7.80(1H，d，J＝10.9Hz)，8.49(1H，d，J＝9.2Hz).

工序3：N－(叔丁氧基羰基)甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(6－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[d e]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－6－氧代己基)甘氨酸酰胺

针对上述工序2中得到的化合物(0.170g，0.516mmoL)，与实施例2的工序1同样地进行反应，得到标题化合物(0.225g，91％)。

¹H－NMR(DMSO－d₆)δ：0.88(3H，t，J＝7.4Hz)，1.43－1.70(6H，m)，1.87(2H，td，J＝15.0，7.4Hz)，2.10－2.22(3H，m)，2.28－2.37(1H，m)，2.42(3H，s)，2.78－2.85(1H，m)，3.01－3.10(3H，m)，3.15－3.22(2H，m)，3.54－3.61(5H，m)，3.62－3.69(1H，m)，4.44－4.53(1H，m)，5.17(1H，d，J＝19.2Hz)，5.25(1H，d，J＝19.2Hz)，5.45(2H，s)，5.54－5.61(1H，m)，6.55(1H，s)，7.02(1H，t，J＝6.1Hz)，7.11－7.28(5H，m)，7.33(1H，s)，7.63－7.69(1H，m)，7.82(1H，d，J＝11.0Hz)，7.90－7.96(1H，m)，8.17(1H，d，J＝7.8Hz)，8.28(1H，t，J＝5.5Hz)，8.46(1H，d，J＝9.0Hz).

工序4：甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(6－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－6－氧代己基)甘氨酸酰胺

针对上述工序3中得到的化合物(0.105g，0.108mmoL)，与实施例2的工序2同样地进行反应，得到标题化合物(0.068mg，65％)。

¹H－NMR(DMSO－d₆)δ：0.89(3H，t，J＝7.4Hz)，1.15－1.67(6H，m)，1.79－1.97(2H，m)，2.08－2.24(4H，m)，2.42(3H，s)，2.76－2.82(1H，m)，3.00－3.10(5H，m)，3.19(1H，s)，3.50－3.63(2H，m)，3.64－3.76(3H，m)，3.84－3.92(1H，m)，4.51－4.59(1H，m)，5.17(1H，d，J＝19.4Hz)，5.24(1H，d，J＝19.4Hz)，5.44(2H，s)，5.53－5.61(1H，m)，6.55(1H，brs)，7.15－7.29(5H，m)，7.33(1H，s)，7.72－7.78(1H，m)，7.82(1H，d，J＝11.0Hz)，7.96－8.08(2H，m)，8.30－8.38(2H，m)，8.46－8.56(2H，m).

工序5：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－(6－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－6－氧代己基)甘氨酸酰胺

针对上述工序4中得到的化合物(58mg，0.060mmoL)，与实施例2的工序3同样地进行反应，得到标题化合物(39mg，62％)。

¹H－NMR(CD₃OD)δ：0.99(3H，t，J＝7.4Hz)，1.27(2H，td，J＝11.6，6.1Hz)，1.38－1.44(2H，m)，1.50－1.63(6H，m)，1.65－1.80(2H，m)，1.89－1.98(2H，m)，2.17－2.25(3H，m)，2.26－2.36(3H，m)，2.40(3H，s)，2.95(1H，dd，J＝14.3，9.2Hz)，3.12(1H，dd，J＝13.7，5.7Hz)，3.15－3.25(4H，m)，3.44(2H，t，J＝7.2Hz)，3.65(1H，d，J＝17.2Hz)，3.76(1H，d，J＝17.2Hz)，3.79－3.86(4H，m)，4.43(1H，dd，J＝8.9，6.0Hz)，5.10(1H，d，J＝18.9Hz)，5.25(1H，d，J＝18.9Hz)，5.35(1H，d，J＝16.6Hz)，5.56(1H，d，J＝16.0Hz)，5.60－5.64(1H，m)，6.76(2H，s)，7.12－7.24(6H，m)，7.58(1H，s)，7.60(1H，d，J＝10.9Hz)，7.68(1H，t，J＝5.7Hz).

MS(ESI)m/z：1060(M+H)⁺

工序6：抗体－药物偶联物(51)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0147mL；相对于一分子抗体为2.3当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：于22℃孵育上述溶液10分钟后，添加含有10mM上述工序5中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0295mL；相对于一分子抗体为4.6当量)，于22℃孵育40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.00590mL；相对于一分子抗体为9.2当量)，进而于22℃孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(PBS7.4作为缓冲液)纯化上述溶液，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液6mL。

抗体浓度：0.97mg/mL，抗体收量：5.82mg(58％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：1.7

实施例55 抗体－药物偶联物(52)

[化124]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(52)

抗体的还原：针对参考例2中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0295mL；相对于一分子抗体为4.6当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：于22℃孵育上述溶液10分钟后，添加含有10mM实施例54的工序5中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0590mL；相对于一分子抗体为9.2当量)，于22℃孵育40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－AldrichCo.LLC)水溶液(0.0118mL；相对于一分子抗体为18.4当量)，进而于22℃孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：0.94mg/mL，抗体收量：5.64mg(56％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.1

实施例56 抗体－药物偶联物(53)

[化125]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(53)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至1.5mL管，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0147mL；相对于一分子抗体为2.3当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：于22℃孵育上述溶液10分钟后，添加含有10mM实施例54的工序5中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0295mL；相对于一分子抗体为4.6当量)，于22℃孵育40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－AldrichCo.LLC)水溶液(0.00590mL；相对于一分子抗体为9.2当量)，进而于22℃孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：1.22mg/mL，抗体收量：7.32mg(73％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：1.5

实施例57 抗体－药物偶联物(54)

[化126]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(54)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61)及C－1，用PBS6.0/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(1.0mL)采集至1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0295mL；相对于一分子抗体为4.6当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.050mL)。确认了该溶液的pH为7.4±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体浓度：1.06mg/mL，抗体收量：6.36mg(64％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.0

实施例58 抗体－药物偶联物(55)

[化127]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：乙酸({N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰}氨基)甲基酯

向包含N－9－芴基甲氧基羰基甘氨酰甘氨酸(4.33g，12.2mmol)、四氢呋喃(120ml)、及甲苯(40.0ml)的混合物中，添加吡啶(1.16ml，14.7mmol及四乙酸铅(6.84g，14.7mmol)，加热回流5小时。将反应液冷却至室温，然后利用硅藻土过滤除去不溶物，在减压下浓缩。将得到的残留物溶解于乙酸乙酯，用水及饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥有机层。在减压下馏去溶剂，然后，用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝9：1(v/v)～乙酸乙酯]纯化得到的残留物，以无色固体形式得到标题化合物(3.00g，67％)。

¹H－NMR(400MHz，CDCl₃)δ：2.07(3H，s)，3.90(2H，d，J＝5.1Hz)，4.23(1H，t，J＝7.0Hz)，4.46(2H，d，J＝6.6Hz)，5.26(2H，d，J＝7.0Hz)，5.32(1H，brs)，6.96(1H，brs)，7.32(2H，t，J＝7.3Hz)，7.41(2H，t，J＝7.3Hz)，7.59(2H，d，J＝7.3Hz)，7.77(2H，d，J＝7.3Hz).

工序2：[({N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰}氨基)甲氧基]乙酸苄基酯

在0℃下向上述工序1中得到的化合物(3.68g，10.0mmoL)及乙醇酸苄酯(4.99g，30.0mmoL)的四氢呋喃(40.0mL)溶液中，添加叔丁醇钾(2.24g，20.0mmoL)，在室温下搅拌15分钟。在0℃下向反应溶液中添加乙酸乙酯、水，用乙酸乙酯、氯仿萃取，用硫酸钠干燥得到的有机层，进行过滤。减压馏去溶剂，将得到的残留物溶解于二氧杂环己烷(40.0mL)、水(10.0mL)中，添加碳酸氢钠(1.01g，12.0mmoL)、氯甲酸9－芴基甲酯(2.59g，10.0mmoL)，在室温下搅拌2小时。向反应溶液中添加水，用乙酸乙酯萃取，用硫酸钠干燥得到的有机层，进行过滤。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～0：100]纯化得到的残留物，得到无色油状的标题化合物(1.88g、40％)。

¹H－NMR(400MHz，CDCl₃)δ：3.84(2H，d，J＝5.5Hz)，4.24(3H，t，J＝6.5Hz)，4.49(2H，d，J＝6.7Hz)，4.88(2H，d，J＝6.7Hz)，5.15－5.27(1H，m)，5.19(2H，s)，6.74(1H，brs)，7.31－7.39(7H，m)，7.43(2H，t，J＝7.4Hz)，7.61(2H，d，J＝7.4Hz)，7.79(2H，d，J＝7.4Hz).

工序3：[({N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰}氨基)甲氧基]乙酸

将上述工序2中得到的化合物(1.88g、3.96mmoL)溶解于乙醇(40.0mL)、乙酸乙酯(20.0ml)中。添加钯碳催化剂(376mg)，在氢气氛下，在室温下搅拌2小时。利用硅藻土过滤除去不溶物，减压馏去溶剂，以无色固体形式得到标题化合物(1.52g、定量)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：3.62(2H，d，J＝6.3Hz)，3.97(2H，s)，4.18－4.32(3H，m)，4.60(2H，d，J＝6.7Hz)，7.29－7.46(4H，m)，7.58(1H，t，J＝5.9Hz)，7.72(2H，d，J＝7.4Hz)，7.90(2H，d，J＝7.4Hz)，8.71(1H，t，J＝6.5Hz).

工序4：(2－{[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]氨基}－2－氧代乙基)氨基甲酸9H－芴－9－基甲基酯

在冰冷却下，向化合物(4)的甲磺酸盐(0.283g，0.533mmoL)、N－羟基琥珀酰亚胺(61.4mg，0.533mmoL)、及上述工序3中得到的化合物(0.205g，0.533mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，添加N，N－二异丙基乙基胺(92.9μL，0.533mmoL)及N，N’－二环己基碳二亚胺(0.143g，0.693mmoL)，在室温下搅拌3天。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]纯化得到的残留物，以淡褐色固体形式得到标题化合物(0.352g，82％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.81(3H，t，J＝7.4Hz)，1.73－1.87(2H，m)，2.06－2.20(2H，m)，2.34(3H，s)，3.01－3.23(2H，m)，3.58(2H，d，J＝6.7Hz)，3.98(2H，s)，4.13－4.25(3H，m)，4.60(2H，d，J＝6.7Hz)，5.09－5.22(2H，m)，5.32－5.42(2H，m)，5.50－5.59(1H，m)，6.49(1H，s)，7.24－7.30(3H，m)，7.36(2H，t，J＝7.4Hz)，7.53(1H，t，J＝6.3Hz)，7.66(2H，d，J＝7.4Hz)，7.75(1H，d，J＝11.0Hz)，7.84(2H，d，J＝7.4Hz)，8.47(1H，d，J＝8.6Hz)，8.77(1H，t，J＝6.7Hz).

MS(ESI)m/z：802(M+H)⁺

工序5：N－[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]甘氨酸酰胺

向上述工序4中得到的化合物(0.881g，1.10mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(11.0mL)溶液中，添加哌啶(1.1mL)，在室温下搅拌2小时。减压馏去溶剂，得到含有标题化合物的混合物。不进一步进行纯化地将该混合物用于下一反应。

工序6：N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]甘氨酸酰胺

在冰冷却下，向上述工序5中得到的混合物(0.439mmoL)、N－羟基琥珀酰亚胺(0.101g，0.878mmoL)、及N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯丙氨酸(日本特开2002－60351号公报中记载的化合物)(0.440g，0.878mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(50.0mL)溶液中，添加N，N’－二环己基碳二亚胺(0.181g，0.878mmoL)，在室温下搅拌4天。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]纯化得到的残留物，以淡橙色固体形式得到标题化合物(0.269g，58％)。

MS(ESI)m/z：1063(M+H)⁺

工序7：甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]甘氨酸酰胺

向上述工序6中得到的化合物(0.269g，0.253mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(4.00mL)溶液中，添加哌啶(0.251mL，2.53mmoL)，在室温下搅拌2小时。减压馏去溶剂，得到含有标题化合物的混合物。不进一步进行纯化地将该混合物用于下一反应。

工序8：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]甘氨酸酰胺

向上述工序7中得到的化合物(0.253mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(10.0mL)溶液中，添加6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯(0.156g，0.506mmoL)，在室温下搅拌3天。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.100g，38％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.83(3H，t，J＝7.2Hz)，1.09－1.21(2H，m)，1.33－1.47(4H，m)，1.75－1.90(2H，m)，2.00－2.23(4H，m)，2.36(3H，s)，2.69－2.81(1H，m)，2.94－3.03(1H，m)，3.06－3.22(2H，m)，3.23－3.74(8H，m)，3.98(2H，s)，4.39－4.50(1H，m)，4.60(2H，d，J＝6.7Hz)，5.17(2H，s)，5.39(2H，s)，5.53－5.61(1H，m)，6.50(1H，s)，6.96(2H，s)，7.11－7.24(5H，m)，7.28(1H，s)，7.75(1H，d，J＝11.0Hz)，7.97(1H，t，J＝5.7Hz)，8.03(1H，t，J＝5.9Hz)，8.09(1H，d，J＝7.8Hz)，8.27(1H，t，J＝6.5Hz)，8.48(1H，d，J＝9.0Hz)，8.60(1H，t，J＝6.5Hz).

MS(ESI)m/z：1034(M+H)⁺

工序9：抗体－药物偶联物(55)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC)0.109mL和含有10mM上述工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.039mL；相对于一分子抗体为4.6当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌40分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.008mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：利用制造方法1中记载的共通操作D－1(使用ABS作为缓冲液)将上述溶液纯化，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液6mL后，利用制造方法1中记载的共通操作A，将溶液浓缩。

抗体浓度：12.57mg/mL，抗体收量：8.8mg(70％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.2

实施例59 抗体－药物偶联物(56)

[化128]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(56)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.067mL)和含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.085mL；相对于一分子抗体为10.0当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌60分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.013mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：1.33mg/mL，抗体收量：7.98mg(64％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：4.9

实施例60 抗体－药物偶联物(57)

[化129]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(57)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加二甲基亚砜(Sigma－Aldrich Co.LLC；0.025mL)和含有10mM实施例58工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.127mL；相对于一分子抗体为15.0当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONECorporation)，在室温下搅拌60分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.019mL)，进而在室温下搅拌20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：0.91mg/mL，抗体收量：5.46mg(44％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.3

实施例61 抗体－药物偶联物(58)

[化130]

混合几乎全部量的实施例59和实施例60的抗体－药物偶联物，利用制造方法1中记载的共通操作A将溶液浓缩，得到标题抗体－药物偶联物。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：12.30mg，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.4

实施例62 抗体－药物偶联物(59)

[化131]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(59)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(100mL、抗体1g)放入到250mL烧瓶中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(2.43mL；相对于一分子抗体为3.6当量)，进一步添加1M磷酸氢二钾水溶液(5mL)。用pH计确认该溶液的pH为7.4附近后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(3.51mL；相对于一分子抗体为5.2当量)及二甲基亚砜(2.14mL)，用搅拌器在15℃水浴中搅拌130分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC水溶液(0.547mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

纯化：针对上述溶液，使用由超滤膜(Merck Japan，Pellicon XL Cassette、Biomax 50KDa)、管泵(Cole-Parmer International MasterFlex Pump型号77521－40、泵压头型号7518－00)及管(Cole-Parmer International MasterFlex Tube L/S16)构成的超滤装置，进行超滤纯化。即，一边向反应液中滴加作为纯化缓冲液的A BS(计800mL)，一边进行超滤纯化，由此，在除去未连接的药物接头及其他低分子量试剂的同时将缓冲液替换为ABS，进一步进行浓缩，得到含有标题抗体－药物偶联物的溶液约70mL。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝235300(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5178(实测值)、ε_D，370＝20217(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：14.2mg/mL，抗体收量：1.0g(约100％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.2

实施例63 抗体－药物偶联物(60)

[化132]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(60)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(5mL、抗体50mg)放入到15mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.075mL；相对于一分子抗体为4当量)。用pH计确认了该溶液的pH为7.0附近后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：向上述溶液中添加含有含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.219mL；相对于一分子抗体为6.5当量)及二甲基亚砜(0.064mL)，在15℃水浴中孵育90分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC水溶液(0.033mL；相对于一分子抗体为9.8当量)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：2.19mg/mL，抗体收量：42mg(83％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：4.7

实施例64 抗体－药物偶联物(61)

[化133]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(61)

抗体的还原：针对参考例1中制作的M30－H1－L4P抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.61mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(4mL、抗体40mg)放入到15mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.14mL；相对于一分子抗体为5.2当量)。用pH计确认了该溶液的pH为7.0附近后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.232mL；相对于一分子抗体为8.6当量)，于15℃水浴中孵育60分钟，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC水溶液(0.035mL；相对于一分子抗体为12.9当量)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：2.03mg/mL，抗体收量：26mg(66％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.7

实施例65 抗体－药物偶联物(62)

[化134]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(62)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0439mL；相对于一分子抗体为5.2当量)及二甲基亚砜(0.0267mL)，在15℃的水浴中孵育1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mMNAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0066mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：7.8mg(62％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.4

实施例66 抗体－药物偶联物(63)

[化135]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(63)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0726mL；相对于一分子抗体为8.6当量)，在15℃的水浴中孵育1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－AldrichCo.LLC)水溶液(0.011mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：10.0mg/mL，抗体收量：7.3mg(58％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：5.4

实施例67 抗体－药物偶联物(64)

[化136]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(64)

抗体的还原：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.75mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0065mL；相对于一分子抗体为2.5当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.0058mL)。确认该溶液的pH为7.0±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0116mL；相对于一分子抗体为4.5当量)及二甲基亚砜(0.0101mL)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0017mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝270400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5178(实测值)、ε_D，370＝20217(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：0.96mg/mL，抗体收量：2.4mg(60％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.7

实施例68 抗体－药物偶联物(65)

[化137]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(65)

抗体的还原：针对参考例3中制作的抗CD30抗体，利用制造方法1中记载的共通操作B(作为280nm吸光系数，使用1.75mLmg^－1cm^－1)及C－1，用PBS6.5/EDTA制备成10mg/mL。将该溶液(0.4mL、抗体4mg)放入到1.5mL管中，添加10mM TCEP(东京化成工业株式会社)水溶液(0.0129mL；相对于一分子抗体为5当量)及1M磷酸氢二钾水溶液(Nacalai Tesque，Inc.；0.006mL)。确认该溶液的pH为7.0±0.1内后，于37℃孵育1小时，由此将抗体内铰链部的二硫键还原。

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0233mL；相对于一分子抗体为9当量)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(Sigma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0035mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

抗体浓度：0.39mg/mL，抗体收量：1.0mg(24％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：6.8

实施例69 抗体－药物偶联物(66)

[化138]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(66)

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝256400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5178(实测值)、ε_D，370＝20217(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.19mg/mL，抗体收量：3.0mg(74％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.8

实施例70 抗体－药物偶联物(67)

[化139]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(67)

抗体浓度：1.24mg/mL，抗体收量：3.1mg(78％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.0

实施例71 抗体－药物偶联物(68)

[化140]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(68)

抗体与药物接头的偶联：在室温下，向上述溶液中添加含有10mM实施例58的工序8中得到的化合物的二甲基亚砜溶液(0.0116mL；相对于一分子抗体为4.5当量)及二甲基亚砜(0.0101mL)，使用试管振荡器(MTR－103，AS ONE Corporation)，在室温下搅拌1小时，将药物接头连接于抗体。接下来，添加100mM NAC(S igma－Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0017mL)，进而在室温下孵育20分钟，终止药物接头的反应。

特性评价：利用制造方法1中记载的共通操作E(作为摩尔吸光系数，使用ε_A，280＝262400(计算推定值)、ε_A，370＝0(计算推定值)、ε_D，280＝5178(实测值)、ε_D，370＝20217(实测值))，得到下述的特性值。

抗体浓度：1.10mg/mL，抗体收量：2.8mg(69％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：3.8

实施例72 抗体－药物偶联物(69)

[化141]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：抗体－药物偶联物(69)

抗体浓度：1.16mg/mL，抗体收量：2.9mg(73％)，每一分子抗体的药物平均连接数(n)：7.0

实施例73(实施例58的工序8的化合物的其他途径合成法)

[化142]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酸叔丁酯

在冰冷却下，向N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酸叔丁酯(J.Pept.Res.，1999年，53卷，393项)(0.400g，0.717mmol)的THF(12.0ml)溶液中，添加1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一碳烯(0.400ml)，在室温下搅拌4天，然后进一步添加6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯(0.221g，0.717mmoL)，搅拌3小时。用乙酸乙酯稀释反应液，用10％柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、及饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥有机层。在减压下馏去溶剂，然后用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝9：1(v/v)]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.295g，78％)。

¹H－NMR(400MHz，CDCl₃)δ：1.28－1.36(2H，m)，1.41(9H，s)，1.57－1.71(4H，m)，2.23(2H，t，J＝7.6Hz)，3.09(2H，d，J＝6.0Hz)，3.51(2H，t，J＝7.6Hz)，3.85－4.02(4H，m)，4.69－4.78(1H，m)，6.15(1H，t，J＝4.6Hz)，6.33(1H，d，J＝7.3Hz)，6.60(1H，t，J＝5.0Hz)，6.68(2H，s)，7.10－7.16(2H，m)，7.22－7.31(3H，m).

MS(ESI)m/z：529(M+H)⁺

工序2：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯丙氨酸

向上述工序1中得到的化合物(0.295g，0.558mmoL)的二氯甲烷(8.00ml)溶液中，添加三氟乙酸(4.00mL)，在室温下搅拌18小时。减压馏去溶剂，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.240g，91％)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：1.15－1.23(2H，m)，1.40－1.53(4H，m)，2.10(2H，t，J＝7.6Hz)，2.88(1H，dd，J＝13.7，8.9Hz)，3.04(1H，dd，J＝13.7，5.0Hz)，3.35－3.43(2H，m)，3.58－3.77(4H，m)，4.41(1H，td，J＝7.8，5.0Hz)，7.00(2H，s)，7.16－7.31(5H，m)，8.00(1H，t，J＝5.7Hz)，8.06(1H，t，J＝5.7Hz)，8.13(1H，d，J＝7.8Hz).

工序3：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]甘氨酸酰胺

将上述工序2中得到的化合物(0.572g，1.21mmoL)溶解于二氯甲烷(12.0mL)中，添加N－羟基琥珀酰亚胺(0.152g、1.32mmoL)及1－(3－二甲基氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺盐酸盐(0.253g、1.32mmoL)，搅拌1小时。将该反应溶液添加到实施例58的工序5中得到的混合物(1.10mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(22.0mL)溶液中，在室温下搅拌3小时。向反应溶液中添加10％柠檬酸水溶液，用氯仿萃取，用硫酸钠干燥得到的有机层，进行过滤。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.351g，31％)。设备数据与实施例58的工序8的化合物相同。

实施例74(实施例58的工序8的化合物的其他途径合成法)

[化143]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：[({N－[(9H－芴－9－基甲氧基)羰基]甘氨酰}氨基)甲氧基]乙酸苄基酯

在0℃下，向实施例58的工序1中得到的化合物(7.37g，20.0mmoL)的四氢呋喃(200ml)溶液中添加乙醇酸苄酯(6.65g，40.0mmoL)及对甲苯磺酸一水合物(0.381g，2.00mmoL)，在室温下搅拌2小时30分钟。向反应溶液中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，用硫酸钠干燥得到的有机层，进行过滤。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[己烷：乙酸乙酯＝100：0(v/v)～0：100]纯化得到的残留物，以无色固体形式得到标题化合物(6.75g，71％)。设备数据与实施例58的工序2的化合物相同。

工序2：N－[(苄基氧基)羰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯丙氨酸－N－{[(2－(苄基氧基)－2－氧代乙氧基]甲基}甘氨酸酰胺

在0℃下，向上述工序1中得到的化合物(6.60g，13.9mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(140mL)溶液中，添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳－7－烯(2.22g，14.6mmoL)，在室温下搅拌15分钟。向反应溶液中添加预先在室温下对N－[(苄基氧基)羰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯丙氨酸(6.33g、15.3mmoL)、N－羟基琥珀酰亚胺(1.92g、16.7mmoL)及1－(3－二甲基氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺盐酸盐(3.20g、16.7mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(140mL)溶液搅拌1小时而得到的产物，在室温下搅拌4小时。向反应溶液中添加0.1当量的盐酸，用氯仿萃取，用硫酸钠干燥得到的有机层，进行过滤。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]纯化得到的残留物，以无色固体形式得到标题化合物(7.10g，79％)。

¹H－NMR(DMSO－D₆)δ：2.78(1H，dd，J＝13.9，9.6Hz)，3.05(1H，dd，J＝13.9，4.5Hz)，3.56－3.80(6H，m)，4.15(2H，s)，4.47－4.55(1H，m)，4.63(2H，d，J＝6.6Hz)，5.03(2H，s)，5.15(2H，s)，7.16－7.38(15H，m)，7.52(1H，t，J＝5.9Hz)，8.03(1H，t，J＝5.5Hz)，8.17(1H，d，J＝8.2Hz)，8.36(1H，t，J＝5.7Hz)，8.61(1H，t，J＝6.6Hz).

工序3：甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酸酰胺

向上述工序2中得到的化合物(7.00g，10.8mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(216mL)溶液中，添加钯碳催化剂(7.00g)，在氢气氛下，在室温下搅拌24小时。通过硅藻土过滤除去不溶物，减压馏去溶剂。将得到的残留物溶解于水中，通过硅藻土过滤除去不溶物，减压馏去溶剂，重复2次该操作，以无色固体形式得到标题化合物(3.77g，82％)。

¹H－NMR(DMSO－D₆)δ：2.84(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，3.08(1H，dd，J＝13.7，4.7Hz)，3.50－3.72(4H，m)，3.77－3.86(2H，m)，3.87(2H，s)，4.52－4.43(1H，m)，4.61(2H，d，J＝6.6Hz)，7.12－7.30(5H，m)，8.43(1H，t，J＝5.9Hz)，8.54(1H，d，J＝7.8Hz)，8.70(1H，t，J＝6.3Hz)，8.79(1H，t，J＝5.5Hz).

工序4：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酸酰胺

向上述工序3中得到的化合物(3.59g，8.48mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(85.0mL)溶液中，添加6－马来酰亚胺基己酸N－琥珀酰亚胺基酯(2.88g，9.33mmoL)及三乙基胺(0.858g，8.48mmo L)，于室温搅拌1小时。向反应溶液中添加0.1当量盐酸，用氯仿、及氯仿和甲醇的混合溶剂[氯仿：甲醇＝4：1(v/v)]进行萃取，用硫酸钠干燥得到的有机层，进行过滤。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]纯化得到的残留物，以无色固体形式得到标题化合物(3.70g，71％)。

¹H－NMR(DMSO－D₆)δ：1.13－1.24(2H，m)，1.42－1.53(4H，m)，2.11(2H，t，J＝7.4Hz)，2.80(1H，dd，J＝13.7，9.8Hz)，3.06(1H，dd，J＝13.9，4.5Hz)，3.37(2H，t，J＝7.2Hz)，3.56－3.78(6H，m)，3.97(2H，s)，4.46－4.53(1H，m)，4.61(2H，d，J＝6.3Hz)，7.00(2H，s)，7.15－7.29(5H，m)，8.03－8.20(3H，m)，8.32(1H，t，J＝5.9Hz)，8.60(1H，t，J＝6.7Hz).

工序5：N－[6－(2，5－二氧代－2，5－二氢－1H－吡咯－1－基)己酰基]甘氨酰甘氨酰－L－苯基丙氨酰－N－[(2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙氧基)甲基]甘氨酸酰胺

在0℃下，向化合物(4)的甲磺酸盐(1.14g，2.00mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(40.0mL)溶液中，添加三乙基胺(0.202g，2.00mmoL)、上述工序4中得到的化合物(1.48g，2.40mmoL)、及含水16.4％的4－(4，6－二甲氧基－1，3，5－三嗪－2－基)－4－甲基吗啉鎓氯化物(0.993g，3.00mmoL)，在室温下搅拌1小时。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝8：2(v/v)]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(1.69g，82％)。设备数据与实施例58的工序8的化合物相同。

实施例75 N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－2－羟基乙酰胺

[化144]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：乙酸2－{[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]氨基}－2－氧代乙基酯

在冰冷却下，向化合物(4)的甲磺酸盐(0.500g，0.941mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(20.0mL)悬浮液中，添加N，N－二异丙基乙基胺(0.492mL，2.82mmoL)及乙酰氧基乙酰氯化物(0.121ml，1.13mmoL)，在室温下搅拌1小时。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.505g，定量)。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.4Hz)，1.81－1.92(2H，m)，2.08(3H，s)，2.08－2.22(2H，m)，2.41(3H，s)，3.14－3.21(2H，m)，4.51(2H，dd，J＝19.4，14.7Hz)，5.22(2H，dd，J＝40.1，19.0Hz)，5.43(2H，s)，5.56－5.61(1H，m)，6.53(1H，s)，7.31(1H，s)，7.81(1H，d，J＝11.0Hz)，8.67(1H，d，J＝8.6Hz).

MS(ESI)m/z：536(M+H)⁺

工序2：N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－2－羟基乙酰胺

向上述工序1中得到的化合物(0.504g，0.941mmoL)的甲醇(50.0mL)悬浮液中，添加四氢呋喃(20.0ml)及1当量氢氧化钠水溶液(4.00ml，4.00mmoL)，在室温下搅拌1小时。添加1当量盐酸(5.00ml，5.00mmoL)，终止反应，减压馏去溶剂。用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇：水＝7：3：1(v/v/v)的分配有机层]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.412g，89％)。向患癌小鼠给予抗体－药物偶联物(55)、(56)时，在肿瘤中确认到该化合物。

¹H－NMR(400MHz，DMSO－d₆)δ：0.87(3H，t，J＝7.3Hz)，1.78－1.95(2H，m)，2.09－2.28(2H，m)，2.39(3H，s)，3.07－3.27(2H，m)，3.96(2H，d，J＝6.0Hz)，5.11－5.26(2H，m)，5.42(2H，s)，5.46－5.54(1H，m)，5.55－5.63(1H，m)，6.52(1H，s)，7.30(1H，s)，7.78(1H，d，J＝10.9Hz)，8.41(1H，d，J＝9.1Hz).MS(ESI)m/z：494(M+H)⁺

实施例76(实施例75的化合物的其他途径合成法)

[化145]

(式中“工程”表示“工序”。)

工序1：N－[(1S，9S)－9－乙基－5－氟－9－羟基－4－甲基－10，13－二氧代－2，3，9，10，13，15－六氢－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’：6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－1－基]－2－羟基乙酰胺

将乙醇酸(0.0201g，0.27mmoL)溶解于N，N－二甲基甲酰胺(1.0mL)中，添加N－羟基琥珀酰亚胺(0.0302g、0.27mmoL)及1－(3－二甲基氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺盐酸盐(0.0508g、0.27mmoL)，搅拌1小时。将该反应溶液添加到化合物(4)的甲磺酸盐(0.1g，0.176mmoL)的N，N－二甲基甲酰胺(1.0mL)悬浮液中，添加三乙基胺(0.025mL，0.18mmoL)，在室温下搅拌24小时。减压馏去溶剂，用硅胶柱色谱法[氯仿～氯仿：甲醇＝10：1(v/v)]纯化得到的残留物，以淡黄色固体形式得到标题化合物(0.080g，92％)。设备数据与实施例75的工序2中得到的化合物相同。

(试验例1)全长人B7－H3变体1表达载体的制作

使用从LNCaP细胞(American Type Culture Collection：ATC C)总RNA合成的cDNA作为模板，使用下述引物组：

引物1：

5’－ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag－3’(序列号22)

及引物2：

5’－aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgctgtcag－3’(序列号23)，

进行PCR反应，扩增得到编码人B7－H3变体1的cDNA扩增。

接下来，用MagExtractor PCR&Gel cleanup(TOYOBO公司)纯化得到的PCR产物。然后用限制性酶(NheI/NotI)消化，然后用MagExtractor PCR&Gel cleanup(TOYOBO公司)纯化。针对pcDNA3.1(+)质粒DNA(Life Technologies)，用相同的限制性酶(NheI/NotI)消化后，用MagExtractor PCR&Gel cleanup(TOYOBO公司)纯化。

混合上述纯化DNA溶液，进而添加Ligation high(TOYOBO公司)，在16℃下孵育8小时，进行连接。

将上述反应物添加至大肠杆菌DH5α感受态细胞(Life Technol ogies)中，进行转化。

针对上述中得到的菌落，用PCR引物和BGH反向引物进行菌落直接PCR(colonydirect PCR)，选出候选克隆。

用液体培养基(LB/Amp)进行培养，用MagExtractor－Plasmid－(TOYOBO公司)提取出质粒DNA。

将得到的质粒DNA作为模板，进行

引物3(CMV promoter引物)：

5’－cgcaaatgggcggtaggcgtg－3’(序列号24)

及引物4(BGH reverse引物)：

5’－tagaaggcacagtcgagg－3’(序列号25)

之间的序列分析，对获得的克隆和提供的CDS序列进行比较。

确认序列后，用200mL的LB/Amp培养基培养得到的克隆，使用VioGene公司PlasmidMidi V－100试剂盒，进行质粒DNA的提取。

将该载体命名为pcDNA3.1－B7－H3。该载体中克隆的B7－H3变体1的基因的ORF部分的序列示于序列表的序列号26(图16)的核苷酸编号1～1602。另外，B7－H3变体1的氨基酸序列示于序列表的序列号1。

(试验例2)B7－H3变体1基因稳定表达CCRF－CEM细胞的制备

使用Nucleofector II(Lonza Group Ltd.制)，利用电穿孔法，将试验例1中制作的pcDNA3.1－B7－H3转染至CCRF－CEM细胞(ATCC)。然后，在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(Life Technologies)(以后称为10％FBS－RPMI1640)中，在37℃、5％CO₂的条件下进一步培养两夜。

培养2天后，为了选择稳定地融合了pcDNA3.1－B7－H3的C CRF－CEM细胞，在含有750μg/mL G418(Life Technologies)的10％FBS－RPMI1640中开始培养。

培养1个月后，为了得到单一细胞克隆，利用系列稀释法进行克隆。具体而言，将具有针对G418的耐性的细胞稀释为10个细胞/mL，以100μL/孔的浓度接种于96孔板并进行培养，从各孔回收增殖的细胞。

为了确认回收的各克隆的B7－H3表达，使用了流式细胞术。具体而言，针对回收的各克隆，用含有5％FBS的PBS洗涤2次，然后添加含有10μg/mL M30和5％FBS的PBS将其悬浮，在4℃下静置30分钟。用含有5％FBS的PBS洗涤2次，然后，添加用含有5％FBS的PBS稀释了1000倍的缀合荧光素的抗小鼠IgG的山羊IgG片段(Fluorescein-conjugated goat IgGfraction to mouse IgG)(Whole Molecule)(ICN Pharmaceuticals公司制#55493)而使其悬浮，在4℃下静置30分钟。用含有5％FBS的PBS洗涤2次，然后再悬浮于含有5％FBS的PBS中，用流式细胞仪(FC500：BeckmanCoulter公司)进行检测。

将通过本操作而得到的B7－H3变体1的基因稳定表达的CCRF－CEM细胞被命名为CEM＿V1＿3.1＿2细胞。亲本株CCRF－CEM细胞作为B7－H3非表达细胞株使用。

(试验例3)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(1)

对于试验例2中制作的CEM＿V1＿3.1＿2细胞、CCRF－CEM细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RPMI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将CEM＿V1＿3.1＿2细胞、CCRF－CEM细胞制备成8×10⁴个细胞/mL，以每孔25μL向装有65μL的培养基的96孔细胞培养用微孔板中添加，培养一夜。第二天，以每孔10μL将用培养基稀释成1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM的M30－H1－L4抗体、M30－H1－L4P抗体及抗体－药物偶联物添加至微孔板中。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养3天。培养后，从恒温箱(incubator)中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(plate reader)(PerkinElmer)测量发光量。用下式算出IC₅₀值。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

a、b是活细胞率分别处于50％的两侧(跨越50％)时的浓度，并且a＞b。

各浓度下的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝10)

针对CEM＿V1＿3.1＿2细胞，抗体－药物偶联物(5)、(16)、(21)、(32)、(44)、(45)、(46)、(52)、(54)显示IC₅₀＜0.1(nM)的细胞损伤活性。抗体－药物偶联物(1)、(12)、(13)、(20)、(28)、(29)、(35)、(36)、(37)、(41)、(49)、(53)显示0.1＜IC₅₀＜1(nM)的细胞损伤活性。抗体－药物偶联物(33)、(34)、(47)、(48)、(50)、(51)显示1＜IC₅₀＜100(nM)的细胞损伤活性。另一方面，针对CCRF－CEM细胞，上述所有抗体－药物偶联物均未显示细胞损伤活性(＞100(nM))。M30－H1－L4抗体及M30－H1－L4P抗体针对所有细胞均未显示细胞损伤活性(＞100(nM))。

(试验例4)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(2)

对于抗原阳性细胞的SR细胞(ATCC)、抗原阴性细胞的Daudi细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RPMI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将SR细胞、Daudi细胞制备成2.8×10⁴个细胞/mL，以每孔90μL向96孔细胞培养用微孔板中添加。2小时后，以每孔10μL向微孔板中添加用培养基稀释成40nM、8nM、1.6nM、320pM、64pM、12.8pM、2.6pM的抗CD30抗体及抗体－药物偶联物(6)、(7)。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养3天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(PerkinElmer)测量发光量。IC₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

a、b是活细胞率分别处于50％的两侧(跨越50％)时的浓度，并且a＞b

各浓度时的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝12)

抗体－药物偶联物(6)、(7)针对SR细胞显示IC₅₀＜0.01(nM)的细胞损伤活性。另一方面，针对Daudi细胞，抗体－药物偶联物(6)、(7)未显示细胞损伤活性(＞4.0(nM))。另外，抗CD30抗体针对所有细胞均未显示细胞损伤活性(＞4.0(nM))。

(试验例5)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(3)

对于抗原阳性细胞的SR细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RPMI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将SR细胞制备成2.8×10⁴个细胞/mL，以每孔90μL向96孔细胞培养用微孔板添加。2小时后，以每孔10μL向微孔板中添加用培养基稀释成1000nM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM的抗CD30抗体及抗体－药物偶联物(22)、(23)、(38)、(64)、(65)。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养6天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(PerkinElmer)测量发光量。I C₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

各浓度时的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝12)

抗体－药物偶联物(23)、(38)、(64)、(65)针对SR细胞显示IC₅₀＜0.01(nM)的细胞损伤活性。抗体－药物偶联物(22)针对SR细胞显示IC₅₀＜0.1(nM)的细胞损伤活性。另外，抗CD30抗体针对SR细胞未显示细胞损伤活性(＞4.0(nM))。

(试验例6)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(4)

对于抗原阳性细胞的HL－60细胞(ATCC)、抗原阴性细胞的Raji细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RP MI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将HL－60细胞、Raji细胞制备成8×10⁴个细胞/mL，以每孔25μL向装有65μL的培养基的96孔细胞培养用微孔板中添加。以10μL每孔将用培养基稀释成1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM的抗CD33抗体及抗体－药物偶联物(8)、(9)向微孔板中添加。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养3天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent CellViability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(PerkinElmer)测量发光量。IC₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

各浓度时的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝5)

抗体－药物偶联物(8)、(9)针对HL－60细胞显示IC₅₀＜0.1(nM)的细胞损伤活性。另一方面，针对Raji细胞，抗体－药物偶联物(8)、(9)未显示细胞损伤活性(＞100(nM))。另外，抗CD33抗体针对所有的细胞均未显示细胞损伤活性(＞100(nM))。

(试验例7)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(5)

对于抗原阳性细胞的NOMO－1细胞(HSRRB)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RPMI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将NOMO－1细胞制备成2.8×10⁴个细胞/mL，以每孔90μL向96孔细胞培养用微孔板添加。2小时后，以每孔10μL将用培养基稀释成1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6n M、0.32nM、0.064nM的抗CD33抗体及抗体－药物偶联物(24)、(25)、(67)向微孔板中添加。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养6天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(PerkinElmer)测量发光量。IC₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

各浓度时的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝5)

针对NOMO－1细胞，抗体－药物偶联物(25)显示IC₅₀＜0.1(nM)的细胞损伤活性。抗体－药物偶联物(24)、(67)显示1＜IC₅₀＜100(nM)的细胞损伤活性。另外，抗CD33抗体针对NOMO－1细胞未显示细胞损伤活性(＞100(nM))。

(试验例8)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(6)

对于抗原阳性细胞的U251细胞(ATCC)、抗原阴性细胞的MCF－7细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RPMI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将U251细胞、MCF－7细胞制备成2.8×10⁴个细胞/mL，以每孔90μL添加到96孔细胞培养用微孔板中，培养一夜。第二天，以每孔10μL将用各培养基稀释成1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM的抗CD70抗体及抗体－药物偶联物(10)、(11)向微孔板中添加。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养6天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo LuminescentCell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(PerkinElmer)测量发光量。IC₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

各浓度时的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝12)

抗体－药物偶联物(10)、(11)针对U251细胞显示IC₅₀＜1(nM)的细胞损伤活性。另一方面，针对MCF－7细胞，抗体－药物偶联物(10)、(11)未显示细胞损伤活性(≧90(nM))。另外，抗CD70抗体针对所有细胞均未显示细胞损伤活性(＞100(n M))。

(试验例9)抗体－药物偶联物的细胞损伤性试验(7)

对于抗原阳性细胞的U251细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的RPMI1640(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将U251细胞制备成2.8×10⁴个细胞/mL，以每孔90μL向96孔细胞培养用微孔板添加。2小时后，以每孔10μL将用培养基稀释成1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM的抗CD70抗体及抗体－药物偶联物(26)、(27)、(40)、(68)、(69)向微孔板中添加。向未添加受试物质的孔中各添加10μL的培养基。在37度、5％CO₂下培养6天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪(PerkinElmer)测量发光量。IC₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

各浓度时的细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝12)

抗体－药物偶联物(26)、(27)、(40)、(69)针对U251细胞显示1＜IC₅₀＜10(nM)的细胞损伤活性。抗体－药物偶联物(68)显示10＜IC₅₀＜100(nM)的细胞损伤活性。另外，抗CD70抗体针对U251细胞未显示细胞损伤活性(＞100(nM))。

(试验例10)游离药物的细胞损伤性试验(8)

对于A375细胞(ATCC)，用含有10％的胎牛血清(MOREGATE)的DMEM(GIBCO)(以下称为培养基)进行培养。用培养基将A375细胞制备成4×10⁴个细胞/mL，以每孔25μL向装有65μL的培养基的96孔细胞培养用微孔板(CORNING)中添加，培养一夜。第二天，以每孔0.5μL将用DMSO稀释成1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM的受试物质向微孔板中添加。向未添加受试物质的孔中各添加0.5μL的DMSO。向所有孔中各添加10μL培养基使培养基的液量成为100μL，在37度、5％CO₂下培养6天。培养后，从恒温箱中取出微孔板，在室温下静置30分钟。添加与培养液等量的CellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)并进行搅拌。在室温下静置10分钟后，用平板读数仪测量发光量。IC₅₀值利用下式算出。

IC₅₀(nM)＝antilog((50－d)×(LOG₁₀b－LOG₁₀a)÷(d－c)+LOG₁₀b)

a：受试物质的浓度a

b：受试物质的浓度b

c：添加了浓度a的受试物质时的活细胞率

d：添加了浓度b的受试物质时的活细胞率

细胞生存率利用下式算出。

细胞生存率(％)＝a÷b×100

a：添加了受试物质的孔的发光量的平均值(n＝2)

b：未添加受试物质的孔的发光量的平均值(n＝10)

实施例(75)的化合物及依沙替康针对A375细胞显示0.1＜IC₅₀＜1(nM)的细胞损伤活性。实施例(42)的化合物显示1＜IC₅₀＜10(nM)的细胞损伤活性。实施例(1)的化合物显示10＜IC₅₀＜100(nM)的细胞损伤活性。

(试验例11)抗肿瘤试验(1)

小鼠：针对5－6周龄的雌BALB/c裸鼠(Charles River Labor atories Japan,Inc.)，在实验使用前，在SPF条件下驯化4－7天。用灭菌的固态饲料(FR－2，FunabashiFarms Co.，Ltd)饲喂小鼠，给予灭菌的自来水(添加5－15ppm次氯酸钠溶液而制备)。

测定、计算式：在所有的研究中，每周2次用电子式数显卡尺(electronic digitalcaliper)(CD－15C，Mitutoyo Corp.)测定肿瘤的长径及短径，计算肿瘤体积(mm³)。计算式如下所示。

肿瘤体积(mm³)＝1/2×长径(mm)×[短径(mm)]²

对于抗体－药物偶联物，全部用生理盐水(大塚制药工场)稀释，向尾静脉内给予10mL/kg的液量。从ATCC(American Type Culture Collection)购入人黑色素瘤株A375细胞。将悬浮于生理盐水中的8×10⁶个细胞皮下移植至雌裸鼠的右侧腹部(Day0)，在Day11随机分组。将M30－H1－L4P抗体及抗体－药物偶联物(2)，在Day11、18、25，全部以10mg/kg的用量向尾静脉内给予。

结果示于图17。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色三角线表示M30－H1－L4P抗体，白色圆形线表示抗体－药物偶联物(2)的效果。

通过给予抗体－药物偶联物(2)，肿瘤体积显著减少，最终给予后，未发现进一步的肿瘤增殖。另一方面，在给予M30－H1－L4P抗体的小鼠中，肿瘤的增殖进行。

另外，在给予了抗体－药物偶联物(2)的小鼠中，未出现体重减少等特别明显的观察结果，认为抗体－药物偶联物(2)的毒性弱，安全性也高。

(试验例12)抗肿瘤试验(2)

从ATCC(American Type Culture Collection)购入人黑色素瘤株A375细胞。将悬浮于生理盐水的6×10⁶个细胞皮下移植至雌裸鼠的右侧腹部(Day0)，在Day18随机分组。在Day18、25、32，以各用量qw×3的时间表向尾静脉内给予抗体－药物偶联物(2)(0.1，0.3，1，3mg/kg)。

结果示于图18。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，黑色方块线表示给予抗体－药物偶联物(2)0.1mg/kg时的效果，线－X－表示给予0.3mg/kg时的效果，黑色三角线表示给予1mg/kg时的效果，白色圆形线表示给予3mg/kg时的效果。抗体－药物偶联物(2)用量依赖性地发挥缩小肿瘤的效果。

(试验例13)抗肿瘤试验(3)

从ATCC(American Type Culture Collection)购入人非小细胞肺癌株Calu－6细胞。将悬浮于生理盐水中的5×10⁶个细胞皮下移植至雌裸鼠的右侧腹部(Day0)，在Day11随机分组。将M30－H1－L4P抗体及抗体－药物偶联物(2)，在Day11、18、25，以qw×3的时间表，全部以10mg/kg的用量向尾静脉内给予。

结果示于图19。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色三角线表示M30－H1－L4P抗体，白色圆形线表示抗体－药物偶联物(2)的效果。通过给予抗体－药物偶联物(2)，肿瘤体积显著减少，最终给予后，未发现进一步的肿瘤增殖。另一方面，在给予M30－H1－L4P抗体的小鼠中，肿瘤的增殖进行。

(试验例14)抗肿瘤试验(4)

从ATCC(American Type Culture Collection)购入人黑色素瘤株A375细胞。将悬浮于生理盐水的8×10⁶个细胞皮下移植至雌裸鼠的右侧腹部(Day0)，在Day21随机分组。将抗体－药物偶联物(1)、(13)、(41)、(55)在Day21全部以10mg/kg的用量向尾静脉内给予。

结果示于图20。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色圆形线表示给予抗体－药物偶联物(1)时的效果，白色三角线表示给予抗体－药物偶联物(13)时的效果，线－X－表示给予抗体－药物偶联物(41)时的效果，白色方块线表示给予抗体－药物偶联物(55)时的效果。通过给予抗体－药物偶联物(1)、(13)、(41)、(55)，肿瘤体积显著减少，均发挥了肿瘤增殖抑制效果。

另外，在给予了抗体－药物偶联物(1)、(13)、(41)、(55)的小鼠中，未出现体重减少等特别明显的观察结果，认为抗体－药物偶联物(1)、(13)、(41)、(55)的毒性弱，安全性也高。

(试验例15)抗肿瘤试验(5)

从ATCC(American Type Culture Collection)购入人非小细胞肺癌株Calu－6细胞。将悬浮于生理盐水的5×10⁶个细胞皮下移植至雌裸鼠的右侧腹部(Day0)，在Day12随机分组。将抗体－药物偶联物(13)、(41)、(55)在Day12全部以10mg/kg的用量向尾静脉内给予。另外，作为比较对照，将DE－310在Day12以0.1mg/kg的用量向尾静脉内给予。此处，对于给予量的表示值而言，关于抗体－药物偶联物，是基于抗体的给予量的值，关于DE－310，是基于含有药物的给予量的值，因此，抗体－药物偶联物和DE－310的含有药物量大致为1：100，通过上述给予而给予同等量的含有药剂。

结果示于图21。图中的白色菱形线表示无处置的肿瘤，白色圆形线表示DE-310的效果，白色三角线表示抗体－药物偶联物(13)的效果，线－X－表示抗体－药物偶联物(41)的效果，白色方块线表示抗体－药物偶联物(55)的效果。通过给予抗体－药物偶联物(13)、(41)、(55)，肿瘤体积显著减少，另一方面，在给予DE－310的小鼠中，确认了肿瘤体积的减少。

另外，在给予了抗体－药物偶联物(13)、(41)、(55)的小鼠中，未出现体重减少等特别明显的观察结果，认为这些抗体－药物偶联物的毒性弱，安全性也高。

(试验例16)抗肿瘤试验(6)

从ATCC(American Type Culture Collection)购入人黑色素瘤株A375细胞。将悬浮于生理盐水中的1×10⁷个细胞皮下移植至雌裸鼠的右侧腹部(Day0)，在Day11随机分组。将抗体－药物偶联物(17)、(18)、(19)、(59)、(60)、(61)在Day11、18以qw×2的时间表全部以3mg/kg的用量向尾静脉内给予。

结果示于图22。图中的黑色菱形线表示无处置的肿瘤，黑色方块线表示给予抗体－药物偶联物(17)时的效果，白色三角线表示给予抗体－药物偶联物(18)时的效果，白色圆形线表示给予抗体－药物偶联物(19)时的效果，黑色三角线表示给予抗体－药物偶联物(59)时的效果，白色方块线表示给予抗体－药物偶联物(60)时的效果，线－X－表示给予抗体－药物偶联物(61)时的效果。

通过给予抗体－药物偶联物(17)、(18)、(19)、(59)、(60)、(61)，肿瘤体积显著减少，均发挥了肿瘤增殖抑制效果。

另外，在给予了抗体－药物偶联物(17)、(18)、(19)、(59)、(60)、(61)的小鼠中，未出现体重减少等特别明显的观察结果，认为这些抗体－药物偶联物的毒性弱，安全性也高。

序列号1－B7－H3变体1的氨基酸序列

序列号2－B7－H3变体2的氨基酸序列

序列号3－M30抗体的CDRH1的氨基酸序列

序列号4－M30抗体的CDRH2的氨基酸序列

序列号5－M30抗体的CDRH3的氨基酸序列

序列号6－M30抗体的CDRL1的氨基酸序列

序列号7－M30抗体的CDRL2的氨基酸序列

序列号8－M30抗体的CDRL3的氨基酸序列

序列号9－M30－H1型重链的氨基酸序列

序列号10－M30－H2型重链的氨基酸序列

序列号11－M30－H3型重链的氨基酸序列

序列号12－M30－H4型重链的氨基酸序列

序列号13－M30－L1型轻链的氨基酸序列

序列号14－M30－L2型轻链的氨基酸序列

序列号15－M30－L3型轻链的氨基酸序列

序列号16－M30－L4型轻链的氨基酸序列

序列号17－M30－L5型轻链的氨基酸序列

序列号18－M30－L6型轻链的氨基酸序列

序列号19－M30－L7型轻链的氨基酸序列

序列号20－M30抗体重链的氨基酸序列

序列号21－M30抗体轻链的氨基酸序列

序列号22－PCR引物1

序列号23－PCR引物2

序列号24－CMV启动子引物：引物3

序列号25－BGH反向引物：引物4

序列号26－B7－H3变体1的核苷酸序列

序列号27－抗CD30抗体重链的氨基酸序列

序列号28－抗CD30抗体轻链的氨基酸序列

序列号29－抗CD33抗体重链的氨基酸序列

序列号30－抗CD33抗体轻链的氨基酸序列

序列号31－抗CD70抗体重链的氨基酸序列

序列号32－抗CD70抗体轻链的氨基酸序列

Claims

1.抗体－药物偶联物，其特征在于，其是下式

所示的抗肿瘤性化合物与抗体经由下式：

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

所示的结构的接头连接而成的，

式中，

L¹表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-，

其中，n²表示2～5的整数，

L²表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-或单键，

其中，n⁵表示2或4的整数，

L^P表示GGFG的四肽残基，

-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-为：

-NH-(CH₂)₃-C(＝O)-、

-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-或

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-C(＝O)-，

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

2.权利要求1所述的抗体－药物偶联物，其中，-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-为-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-。

3.权利要求1所述的抗体－药物偶联物，其中，所述接头的结构为选自以下组中的1种结构，

其中，-(NH-DX)表示下式：

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

4.权利要求3所述的抗体－药物偶联物，其中，所述接头的结构为：-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

5.权利要求1～4中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种药物－接头结构相对于每一分子抗体而言的平均连接数为2～8个的范围。

6.权利要求1～4中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，选择的1种药物－接头结构相对于每一分子抗体而言的平均连接数为3～8个的范围。

7.权利要求1～4中任一项所述的抗体－药物偶联物，抗体－药物偶联物作为靶标的细胞是肿瘤细胞。

8.权利要求1～4中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗A33抗体、抗B7－H3抗体、抗CanAg抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗体PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体。

9.权利要求1～4中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗B7－H3抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体或抗CD70抗体。

10.权利要求1～4中任一项所述的抗体－药物偶联物，其中，抗体为抗B7－H3抗体。

11.药物，其含有权利要求1～10中任一项所述的抗体－药物偶联物或其盐。

12.抗肿瘤药及/或抗癌药，其含有权利要求1～10中任一项所述的抗体－药物偶联物或其盐。

13.权利要求12所述的抗肿瘤药及/或抗癌药，其用于应用于肺癌、肾癌、尿道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌或食道癌。

14.药物组合物，其含有作为活性成分的权利要求1～10中任一项所述的抗体－药物偶联物或其盐，和药学上可接受的制剂成分。

15.下式所示的药物－接头中间体化合物，

Q-(CH₂)n^Q-C(＝O)-L^2a-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-(NH-DX)

式中，Q表示(马来酰亚胺-N-基)-，

n^Q表示2～5的整数，

L^2a表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-或单键，

其中，n⁵表示整数2或4，

L^P表示GGFG四肽残基，

-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为：

-NH-CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂-O-CH₂-或

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-，

(马来酰亚胺-N-基)-为下式

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

16.以下化合物：

(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)，

其中，(马来酰亚胺-N-基)-为下式

所示的、氮原子是连接部位的基团，

-(NH-DX)为下式

所示的、1位的氨基的氮原子成为连接部位的基团。

17.权利要求16的化合物，其为：(马来酰亚胺-N-基)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-(NH-DX)。

18.下式所示的接头，其用于得到经由接头将药物与抗体连接而成的抗体－药物偶联物，

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-L^c-

其中，L¹为连接于抗体的连接部位，L^c为用于抗肿瘤性化合物连接的连接部位，

式中，

L¹表示-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH₂)n²-C(＝O)-，

其中，n²表示2～5的整数，

L²表示-NH-(CH₂-CH₂-O)n⁵-CH₂-CH₂-C(＝O)-或单键，

其中，n⁵表示整数2或4，

L^P表示GGFG四肽残基，

-NH-(CH₂)n¹-L^a-L^b-为：

-NH-CH₂CH₂CH₂-、

-NH-CH₂-O-CH₂-或

-NH-(CH₂)₂-O-CH₂-，

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-为下式：

19.权利要求18所述的接头，其选自下组，其中，左侧末端是与抗体的连接部位，右侧末端是与抗肿瘤性化合物的连接部位：

(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-、

(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂-C(＝O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-。

20.权利要求19所述的接头，其为：(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(＝O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(＝O)-

其中，左侧末端是与抗体的连接部位，右侧末端是与抗肿瘤性化合物的连接部位。