TW202320859A - 一種含抗ｔｒｏｐ２抗體藥物偶聯物的醫藥組成物及其用途 - Google Patents

一種含抗ｔｒｏｐ２抗體藥物偶聯物的醫藥組成物及其用途 Download PDF

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Abstract

本揭露關於一種含抗TROP2抗體藥物偶聯物的醫藥組成物及其用途。具體而言，本揭露關於一種醫藥組成物，其包含在緩衝液中的抗體藥物偶聯物。本揭露的醫藥組成物具備良好的穩定性。

Description

一種含抗TROP2抗體藥物偶聯物的醫藥組成物及其用途
本揭露屬於藥物製劑領域，具體關於一種包含抗TROP2抗體藥物偶聯物的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。
這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒素的高效性，同時又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精準地結合腫瘤細胞並降低對正常細胞的影響(Mullard A,(2013)Nature Reviews Drug Discovery,12：329-332；DiJoseph JF,Armellino DC,(2004)Blood,103：1807-1814)。
用於抗體藥物偶聯物的具有細胞毒性的小分子有幾類，其中有一類是喜樹鹼衍生物，它們藉由抑制拓撲異構酶I而具有抗腫瘤作用。報導喜樹鹼衍生物依沙替康(化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’：6,7]咪唑并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮) 應用於抗體藥物偶聯物(ADC)的文獻有WO2014057687；Clinical Cancer Research(2016)22(20)：5097-5108；Cancer Sci(2016)107：1039-1046。但仍需進一步開發療效更好的ADC藥物。
但是，ADC具有比抗體更複雜的異質結構，因此，對用於治療目的ADC製劑提出了更大的挑戰。
本揭露提供一種醫藥組成物，其包含抗體藥物偶聯物和緩沖劑，其中該抗體藥物偶聯物具有如下所示的結構：
Figure 111127403-A0202-12-0002-1
如上所述的抗體藥物偶聯物參照PCT/CN2021/073279的說明書中第41頁中抗體偶聯物實施例3-1 ADC-1製備；
其中，
PD3為抗TROP2抗體，其來源參照PCT/CN2021/073279中第41頁的抗體PD3，包含如SEQ ID NO：1所示的重鏈(PCT/CN2021/073279中的SEQ ID NO：13)和如SEQ ID NO：2(PCT/CN2021/073279中的SEQ ID NO：14)所示的輕鏈：
PD3的重鏈胺基酸序列：
Figure 111127403-A0202-12-0002-3
Figure 111127403-A0202-12-0003-4
SEQ ID NO：1；
PD3的輕鏈胺基酸序列：
Figure 111127403-A0202-12-0003-6
SEQ ID NO：2；
n為1至10，較佳為1至8，更佳為3至5，最佳為約4；
該醫藥組成物的緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，pH為約5.0至約6.5，較佳pH為約5.5至約6.5，更佳pH為約5.9至約6.2。
在可選的實施方案中，醫藥組成物中該緩衝劑的pH值約為5.0至約6.5，非限制性的實施例包括約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5，以及這些點值之間的任意範圍；較佳pH為約5.5至約6.5，更佳pH為約5.9至約6.2。
在可選的實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑濃度為大約5mM至約50mM，非限制性的實施例包括10mM、12mM、15mM、16mM、17mM、 18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM以及這些點值之間的任意範圍，較佳為大約10mM至約50mM，更佳為大約20mM至約40mM；最佳為約30mM。
在可選的實施方案中，醫藥組成物還包含表面活性劑。可選自聚山梨酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。較佳的表面活性劑是聚山梨酯80或聚山梨酯20，更佳為聚山梨酯80。
在可選的實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.01mg/mL至約1.0mg/mL，較佳為約0.05mg/mL至約0.5mg/mL，更佳為約0.1mg/mL至約0.3mg/mL約或約0.2mg/mL至約0.6mg/mL，最佳為約0.2mg/mL，非限制性的實施例包括約0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL，以及這些點值之間的任意範圍。
在可選的實施方案中，前述醫藥組成物還包含糖。本揭露的“糖”包含常規組成物(CH2O)n及其衍生物，包括單糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，還原性糖，非還原性糖等等。該糖可選自葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，麥芽糖，右旋糖苷，甘油，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇， 甘露醇，密裡二糖，松三糖，蜜三糖，甘露三糖，水蘇糖，麥芽糖，乳果糖，麥芽酮糖，山梨醇，麥芽糖醇，乳糖醇，異-麥芽酮糖等等。較佳的糖是非還原性二糖，更佳自二水合海藻糖或蔗糖，最佳為蔗糖。
在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中糖的濃度為約25mg/mL至約80mg/mL，較佳約30mg/mL至約50mg/mL，非限制性的實施例包括25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL以及這些點值之間的任意範圍，較佳為40mg/mL。
在可選的實施方案中，前述醫藥組成物還包含胺基酸及其鹽，該胺基酸及其鹽較佳選自甘胺酸和精胺酸鹽酸鹽，更佳為甘胺酸。
在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該甘胺酸濃度為約6mg/mL至約15mg/mL，為約7mg/mL至約11mg/mL，較佳為約7mg/mL至約10mg/mL，更佳為約7mg/mL至約9mg/mL，為約8mg/mL至約9mg/mL，非限制性的實施例包括約6mg/mL、6.5mg/mL、7mg/mL、7.2mg/mL、7.6mg/mL、7.8mg/mL、8mg/mL、8.5mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、10.2mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL以及這些點值之間的任意範圍，最佳為約9mg/mL。
在可選的實施方案中，醫藥組成物中該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，大約1mg/mL至約100mg/mL，非限制性的實施例包括1mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL以及這些點值之間的任意範圍，較佳為大約10mg/mL至約30mg/mL；更佳為 約18mg/mL至約22mg/mL，最佳為約20mg/mL。具體的，非限制性的實施例包括20.1mg/mL、20.2mg/mL、20.3mg/mL、20.4mg/mL、20.5mg/mL、20.6mg/mL、20.7mg/mL、20.8mg/mL、20.81mg/mL、20.82mg/mL、20.83mg/mL、20.84mg/mL、20.85mg/mL、20.86mg/mL、20.87mg/mL、20.88mg/mL、20.89mg/mL、20.9mg/mL、20.9mg/mL、20.91mg/mL、20.92mg/mL、20.93mg/mL、20.94mg/mL、20.95mg/mL、20.96mg/mL、20.97mg/mL、20.98mg/mL、20.99mg/mL、21mg/mL以及這些點值之間的任意範圍。該以蛋白濃度計，是指以抗體藥物偶聯物中的抗體部分的濃度計。
在可選的實施方案中，藥物載量(n)的範圍可以是每個抗Trop2抗體結合細胞毒性藥物的平均數，非限制性的實施例包括每個抗體結合細胞毒性藥物的平均個數約為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12以及這些點值之間的任意範圍。較佳自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的範圍。示例性的，載藥量可以為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值。n是小數或整數。
在可選的實施方案中，藥物載量(n)為約4。
在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：
(a)以蛋白濃度計，約10mg/mL至約30mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.1mg/mL至約0.3mg/mL的聚山梨酯，(c)約30mg/mL至約50mg/mL的糖，(d)約7mg/mL-11mg/mL甘胺酸和(e)約20mM至約40mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該組成物的pH為約5.5-6.5；
較佳地，該醫藥組成物包含如下組分：
(a)以蛋白濃度計，約18mg/mL至約22mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)約40mg/mL的蔗糖，(d)約9mg/mL甘胺酸和(e)約30mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組成物的pH為約5.9-6.2；
更佳地，該醫藥組成物包含如下組分：
(a)以蛋白濃度計，約20mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)約40mg/mL的蔗糖，(d)約9mg/mL甘胺酸和(e)約30mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組成物的pH為約6.0。
在可選的實施方案中，前述任一項的醫藥組成物是液體製劑。本發明的液體製劑或者複溶後的製劑，具有較好的穩定性，在冷藏溫度(4℃)保存至少3個月。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃的溫度保存包括1個月、2個月、3個月在內的時段後表現出期望的特徵。進一步的，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括40℃的溫度保存1個月後表現出期望的特徵。
本揭露還提供一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其特徵在於該製劑複溶後可形成如上所述的醫藥組成物。
本揭露還提供一種製備含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑的方法，其中包括將如上所述的醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。
在可選的實施方案中，製備包含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑的方法中該冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。藉由冷凍製劑和隨後在適於一次乾燥的溫度使水昇華，進行冷凍乾燥。在此條件下，產物溫度低於製劑的低共熔點或坍塌溫度。通常，一次乾燥的溫度範圍為約-30至25℃(假設產物在一次乾燥過程中保持冷凍)。製劑、容納樣品的容器(例如，玻璃小瓶)的大小和類型以及液體的體積決定了乾燥所需的時間，該時間的範圍可為幾小時至幾天(例如40-60小時)。二次乾燥階段可在約0-40℃進行，這主要取決於容器的類型和大小以及採用的蛋白的類型。二次乾燥時間由產物中的期望殘餘水分水平決定，通常需要至少約5小時。通常，低壓凍乾的製劑的含水量小於約 5%，較佳小於約3%。壓力可與在一次乾燥步驟中應用的壓力相同，較佳的，二次乾燥的壓力低於一次乾燥。冷凍乾燥條件可以隨製劑和小瓶大小而變化。
在本揭露的一個可選實施例中，將4.4mL的組成物原液進行凍乾，凍乾程序如下所示：預凍溫度依次為5℃和-45℃，一次乾燥的溫度為-20℃，真空度為10Pa，二次乾燥的溫度為25℃，真空度依次為10Pa和1Pa。
在一些實施方案中，凍乾製劑於2-8℃穩定至少16天，至少1個月，至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該凍乾製劑於40℃穩定至少7天，至少14天，至少28天或至少30天。
本揭露還提供一種包含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，該凍乾製劑藉由將如上所述的抗體藥物偶聯物的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
本揭露還提供一種含抗體藥物偶聯物的複溶溶液，其特徵在於該複溶溶液是藉由將如上所述的凍乾製劑經複溶製備獲得。
本揭露還提供製備上述複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經複溶的步驟，其複溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。
在可選的實施方案中，該複溶溶液包含如下組分：
(a)約10mg/mL至約30mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.1mg/mL至約0.3mg/mL的聚山梨酯，(c)約25mg/mL至約80mg/mL的蔗糖，(d)約7mg/mL-11mg/mL甘胺酸和(e)約10mM至約40mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該組成物的pH為約5.5-6.5；
較佳地，該醫藥組成物包含如下組分：
(a)約18mg/mL至約22mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)約40mg/mL的蔗糖，(d)約9mg/mL甘胺酸和(e)約30mM組胺酸-鹽酸組胺酸，該組成物的pH為約5.9-6.2；
更佳地，該醫藥組成物包含如下組分：
(a)約20mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)約40mg/mL的蔗糖，(d)約9mg/mL甘胺酸和(e)約30mM組胺酸-鹽酸組胺酸，該組成物的pH為約6.0。
本揭露還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有如上所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液。在一些實施方案中，該容器為中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。
本揭露還提供前述的醫藥組成物或凍乾製劑或複溶溶液或製品在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
本揭露還提供治療疾病的方法，包括提供前述的醫藥組成物或凍乾製劑或複溶溶液或製品。
本揭露還提供作為藥物的前述的醫藥組成物，或凍乾製劑，或複溶溶液，或製品，用於治療疾病的用途。
本揭露還提供作為藥物的前述的醫藥組成物，或凍乾製劑，或複溶溶液，或製品，較佳的，該藥物用於治療或預防腫瘤疾病。
在可選的實施方案中，該疾病或腫瘤為與TROP2介導的疾病或病症。
本揭露還提供作為藥物的前述的醫藥組成物，或凍乾製劑，或複溶溶液，或製品，在製備治療和/或預防腫瘤和癌症的藥物中的用途，其中該腫瘤和癌症較佳頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、 口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌；更佳的，該淋巴瘤選自：何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤；該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌；該白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。
如所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，本揭露中所述各個實施方案的一項、一些或所有特性可以進一步組合以形成本揭露的其它實施方案。本揭露的以上實施方案和藉由組合得到的其他實施方案藉由下面的詳述進一步說明。
發明詳述
本揭露提供一種更利於生產和給藥，性能穩定的醫藥組成物。其中，不期望的不穩定性可包括下列任何一項或多項：聚集、脫醯胺化(例如Asn脫醯胺化)、氧化(例如Met氧化)、異構化(例如Asp異構化)、剪裁(clipping)/水解/片段化(例如鉸鏈區片段化)、琥珀醯亞胺形成、不成對的半胱胺酸、毒素的解離等。具體地，本揭露所述的醫藥組成物包含抗體藥物偶聯物和緩衝劑。
術語
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本揭露將申請WO2020063673中的全部內容引入本揭露。
“抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)是把抗體藉由連接單元與具有生物活性的細胞毒素或具有細胞殺傷活性的小分子藥物相連。
“載藥量”也稱藥物抗體比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每個抗體所偶聯的藥物的平均數量。其可在例如每個抗體偶聯約1至約10個藥物的範圍內，並且在某些實施例中，在每個抗體偶聯約1至約8個藥物的範圍內，較佳自2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、3-4、3-5、5-6、5-7、5-8和6-8的範圍。示例性的，載藥量可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。本揭露的ADC通式包括與前述一定範圍內的藥物偶聯的抗體的集合。在本揭露的實施方式中，載藥量可表示為n。可用常規方法如UV/可見光光譜法，質譜，ELISA試驗和HPLC測定載藥量。
術語“接頭單元”或“連接片段”或“連接單元”是指一端與抗體或其抗原結合片段連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與藥物相連。
接頭，包括延伸物、間隔物和胺基酸單元，可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。
可以用以下非限制性方法控制細胞毒性藥物的載量，包括：
(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比，
(2)控制反應時間和溫度，
(3)選擇不同的反應試劑。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本揭露所述的“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。通常，天然的完整抗體由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。
本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。
“組胺酸緩衝劑”是包含組胺酸的緩衝劑。組胺酸緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸組胺酸，組胺酸-醋酸組胺酸，組胺酸-磷酸組胺酸，組胺酸-硫酸 組胺酸等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑可由組胺酸與鹽酸配製而成，或者由組胺酸與鹽酸組胺酸配製而成。
“枸櫞酸鹽緩衝劑”是包括枸櫞酸根離子的緩衝劑。枸櫞酸鹽緩衝劑的實例包括枸櫞酸-枸櫞酸鈉、枸櫞酸-枸櫞酸鉀、枸櫞酸-枸櫞酸鈣、枸櫞酸-枸櫞酸鎂等。較佳的枸櫞酸鹽緩衝劑是枸櫞酸-枸櫞酸鈉。
“琥珀酸鹽緩衝劑”是包括琥珀酸根離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉鹽、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。較佳的琥珀酸鹽緩衝劑是琥珀酸-琥珀酸鈉鹽。示例性的，該琥珀酸-琥珀酸鈉可由琥鉑酸與氫氧化鈉配製而成，或由琥鉑酸與琥珀酸鈉鹽配製而成。
“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸根離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-枸櫞酸等。較佳的磷酸鹽緩衝劑是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉。
“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、組胺酸-醋酸組胺酸、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝劑是醋酸-醋酸鈉。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體藥物偶聯物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本揭露中，“醫藥組成物”和“製劑”並不互相排斥。
本揭露中所述醫藥組成物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。
“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。
本文所用術語“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本揭露和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
本揭露所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體藥物偶聯物在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的醫藥組成物，較佳地，醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。
穩定的製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、較佳6個月、更佳1年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃的溫度保存包括1個月、2個月、3個月在內的時段後表現出期望的特徵。進一步的，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括40℃的溫度保存包括10天、20天、1個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的例子：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、較佳不超過約5%的抗體單體發生聚集或降解。藉由視覺分析，製劑是淡黃色近無色澄明液體或者無色，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、較佳不超過約5%的減少。通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。
如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體藥物偶聯物沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該抗體藥物偶聯物在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。
如果抗體藥物偶聯物沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和CE-SDS等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。
如果抗體藥物偶聯物在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該抗體藥物偶聯物在藥物製劑中“保留它的生物活性”。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，所屬技術領域具有通常知識者能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
常規的醫藥組成物的製備見中國藥典。
術語“載體”用於本揭露的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合化合物的組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效， 但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“置換”是指溶解抗體蛋白的溶劑體系的置換，例如，使用穩定製劑的緩衝體系經物理操作方式將含抗體蛋白的高鹽或高滲溶劑體系置換，從而使抗體蛋白存在於穩定製劑中。所稱物理操作方式包括但不限於超濾、透析或離心後複溶。
圖1係ADC對BxPC3細胞和MiaPaCa2混合細胞的旁觀殺傷活性結果圖。
以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非是對本揭露範圍的限制。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如參照冷泉港實驗室出版的《抗體技術實驗手冊》，《分子選殖手冊》；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
製備例1
I.抗體的製備
本揭露中使用的對照分子hRS7參照專利WO03074566構建，TINA抗體參照專利WO2015098099A1構建，其序列分別如下：
hRS7重鏈：
Figure 111127403-A0202-12-0018-7
Figure 111127403-A0202-12-0018-8
SEQ ID NO：3；
hRS7輕鏈：
Figure 111127403-A0202-12-0018-9
SEQ ID NO：4；
TINA重鏈：
Figure 111127403-A0202-12-0018-10
Figure 111127403-A0202-12-0019-11
Figure 111127403-A0202-12-0019-12
SEQ ID NO：5；
TINA輕鏈：
Figure 111127403-A0202-12-0019-13
SEQ ID NO：6。
II.ADC的製備
ADC原液藥物載量分析
ADC是一種抗體交聯物類藥物，其治療疾病的機理是依賴抗體的靶向性將毒素分子運送到細胞中，進而將細胞殺死。藥物的載量對藥效起著決定性的作用。
一、UV-Vis計算方法
使用紫外法對ADC原液的藥物載量進行測定。
實驗方法
將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。
結果計算
採用紫外分光光度法(使用儀器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度計)測定ADC原液載量，其原理是在某波長下ADC原液的總吸光值等於細胞毒性藥物與單株抗體在該波長下吸光值的加和，即：
(1)A280nm=εmab-280bCmab+εDrug-280bCDrug
εDrug-280：藥物在280nm平均莫耳消光係數5100；
CDrug：藥物的濃度；
εmab-280：單抗原液在280nm平均莫耳消光係數214600；
Cmab：單抗原液的濃度；
b：光程長度為1cm。
同理可以得到樣品在370nm下的總吸光值方程：
(2)A370nm=εmab-370bCmab+εDrug-370bCDrug
εDrug-370：藥物在370nm平均莫耳消光係數19000；
CDrug：藥物的濃度；
εmab-370：單抗原液在370nm消光係數為0；
Cmab：單抗原液的濃度；
b：光程長度為1cm。
由(1)和(2)方程結合單株抗體和藥物在兩個檢測波長下的消光係數和濃度數據可以計算出藥物的載量。
藥物載量=CDrug/Cmab。
二、CE-SDS計算方法
試劑和儀器
SDS-Mw Analysis Kit：Beckman生產，貨號390953，該試劑盒中包含SDS-MW凝膠分離緩衝液、SDS-MW樣品緩衝液、酸性清洗液(0.1mol/L鹽酸溶液)、鹼性清洗液(0.1mol氫氧化鈉溶液)、內標物質(10kDa)。也可採用北京博思雅生 化技術研究院生產的SDS試劑盒，貨號BSYK018，該試劑盒中包含CE-SDS凝膠緩衝液、CE-SDS樣品緩衝液。
烷基化溶液(0.25mo碘乙醯胺溶液)：稱取約0.046g碘乙醯胺，加入1mL超純水溶解混勻，可於2-8℃避光保存7天。
毛細管電泳儀：SCIEX公司PA800plus。
毛細管：非塗層熔融石英毛細管(內徑50μm)，切割至總長為30.2cm，高分辨率方法有效分離長度為20cm。
供試品溶液製備
用SDS樣品緩衝液將供試品稀釋至1mg/mL。取供試品溶液(1mg/mL)95μL，加入0.8mol/L碘乙醯胺水溶液5μL，渦旋混勻。取空白對照95μL，加入0.8mol/L碘乙醯胺水溶液5μL，渦旋混勻，從樣品管中分別取出75μL至樣品瓶中，立即進行分析。
測定方法
1)毛細管的預處理：0.1mol/L氫氧化鈉溶液在60psi壓力下沖洗3分鐘，然後用0.1mol/L鹽酸溶液在60psi壓力下沖洗2分鐘，最後用純水在70psi壓力下沖洗1分鐘。每次運行前應進行。
2)毛細管的預填充：SDS凝膠分離緩衝液在50psi壓力下沖洗15分鐘。每次運行前應進行。
樣品進樣：10kV反相極性電動進樣，還原樣品進樣20秒。
分離：15kV下運行40分鐘，反相極性。
樣品室溫度：18至25℃。
毛細管溫度：18至25℃。
結果分析
基於抗體中打開的二硫鍵游離出的巰基都偶聯上相應的藥物，用Beckman軟體對數據進行分析，以重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈等校正峰面積分別占所有校正峰面積計算。根據公式：DAR=[4 *重鏈(H)峰面積+2 *半抗(H-L)峰面積+4 *雙重鏈(H-H)峰面積+2 *重重輕鏈(H-H-L)峰面積]/[重鏈(H)峰面積/2+半抗(H-L)峰面積/2+雙重鏈(H-H)峰面積+重重輕鏈(H-H-L)峰面積+全抗峰面積]，最終計算出該ADC的加權平均值。
三、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)
1、試劑和儀器：
HPLC系統：WatersH-Class超高效液相色譜儀UPLC系統
檢測器：TUV檢測器(測量波長：280nm)
色譜管柱：BioResolve RP mAb Polyphenyl(2.7μm 4.6*150mm)
2、檢測條件：
管柱溫度：80℃
流速：1.0mL/分鐘
流動相A：0.1%甲酸+0.025%三氟乙酸(TFA)水溶液。
流動相B：0.1% FA+0.025%三氟乙酸(TFA)乙腈溶液。
梯度程序：27.0%B-45.0%B(0.00分鐘-12.00分鐘)，45.0%B-80.0%B(12.00分鐘-13.00分鐘)，80.0%B-80.0%B(13.00分鐘-15.00分鐘)，27.0%B-27.0%B(15.04分鐘-20.00分鐘)，
注入樣品量：5.0μL
3、數據分析
與不結合藥物的抗體輕鏈(L0)和抗體重鏈(H0)相比，結合藥物的輕鏈(結合1個藥物的輕鏈：L1)和結合藥物的重鏈(結合1個藥物的重鏈：H1，結合2個藥物的重鏈：H2，結合3個藥物的重鏈：H3，結合4個藥物的重鏈：H4)的疏水性與 其結合藥物的數目成正比例的增加，並且保留時間延長。因此，可以以L0、L1、H0、H1、H2、H3和H4的順序進行分別沖提。作為比較L0和H0之間的保留時間的結果，將檢測峰分配給L0、L1、H0、H1、H2、H3和H4中的任何一個。
由於藥物接頭吸收UV，根據以下表達式，使用輕鏈、重鏈和藥物接頭的莫耳吸光係數，根據結合的藥物的數目，對所得的峰面積進行校正。計算公式如下：
輕鏈(εLC-280)/(εLC-280+連接藥物數*εdrug-280)
重鏈(εHC-280)/(εHC-280+連接藥物數*εdrug-280)
備註：εLC-280：輕鏈在280nm的莫耳消光係數；
εHC-28：重鏈在280nm的莫耳消光係數；
εdrug-280：毒素在280nm的莫耳消光係數。
表1. 反相色譜載藥量計算表
Figure 111127403-A0202-12-0023-14
備註：LC校正峰面積總和=L0校正峰面積+L1校正峰面積。
HC校正峰面積總和=H0校正峰面積+H1校正峰面積+H2校正峰面積+H3校正峰面積+H4校正峰面積，計算出該ADC的載藥量如下：
載藥量n=2×Σ(連接藥物數×校正峰面積百分比)/100。
製備例2-1 ADC-1
Figure 111127403-A0202-12-0024-15
在37℃條件下，向抗體PD3的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，4.0mL，270nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，67.5μL，675nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(參照WO2020063676A1說明書實施例9的9-A進行製備，2.9mg，2700nmol)溶解於180μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PD3-9-A所示的示例性產物ADC-1的PBS緩衝液(1.93mg/mL，18.4mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.77。
製備例2-2 ADC-2
在37℃條件下，向抗體PD3的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，4.0mL，270nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，143.1μL，1431nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(4.35mg，4050nmol)溶解於270μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS 緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到式PD3-9-A所示的示例性產物ADC-2的PBS緩衝液(1.69mg/mL，17.8mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.59。
製備例2-3 ADC-3
在12℃條件下，在含有2.5mM EDTA的10mM組胺酸-醋酸-Tris緩衝液(pH 7.2)中，含145.24g PD3抗體原液(1.00mmol，用10mM組胺酸-醋酸稀釋至抗體濃度17.5mg/mL)與0.6308克三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，2.20mmol)在恆溫水浴中攪拌反應100分鐘，生成中間體I溶液。滴加2M醋酸調節反應液pH至5.0。
將化合物9-A(4.834g，4.50mmol)溶解於0.456L DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.373L DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴12℃下攪拌反應90分鐘，停止反應。
將上述反應液經0.22μm濾器過濾後，先進行15倍體積等體積超濾(30kd超濾膜包)換液至10%DMSO-30mM組胺酸-醋酸緩衝液(pH=5.0)，再進行18倍體積等體積超濾換液至30mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH=6.0)，加入蔗糖至40g/L、甘胺酸至9g/L、吐溫-80至0.2g/L，得到如式PD3-9-A所示的示例性產物ADC-3(20g/L，132.20g，收率91.0%，反相色譜計算平均值：n=4.0)，最後製成80mg/瓶裝凍乾粉。
製備例2-4 ADC-4
Figure 111127403-A0202-12-0026-16
其合成過程參照WO2015098099實施例19。
在37℃條件下，向抗體TINA的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.0mL，135.4nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，33.8μL，338nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物58(1.4mg，1354nmol)溶解於70μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到式TINA-58所示的示例性標題產物ADC-4的PBS緩衝液(1.13mg/mL，15.1mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.99。
製備例2-5 ADC-5
Figure 111127403-A0202-12-0026-17
在37℃條件下，向抗體PD3的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.5mL，101.4nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦 (TCEP)的水溶液(10mM，25.3μL，253nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物58(1.05mg，1014nmol，參照專利“CN104755494A中第163頁的實施例58)溶解於60μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到式PD3-58所示的示例性標題產物ADC-5的PBS緩衝液(0.82mg/mL，13.5mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.88。
製備例2-6 ADC-6
Figure 111127403-A0202-12-0027-18
在37℃條件下，向抗體hRS7的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.4mL，94.60nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，50.1μL，501nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物SN38(參照專利CN105407891A第59頁實施例1合成，2.1mg，1419nmol)溶解於50μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管 柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到式hRS7-SN38所示的示例性標題產物ADC-6的PBS緩衝液(1.03mg/mL，11.5mL)，於4℃儲存。
CE-SDS計算平均值：n=7.56。
製備例2-7 ADC-7
Figure 111127403-A0202-12-0028-19
在37℃條件下，向抗體hRS7的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.18mL，147.3nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，36.8μL，368nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(1.58mg，1471nmol)溶解於100μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到式hRS7-9-A所示的示例性標題產物ADC-7的PBS緩衝液(1.10mg/mL，16.4mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.72。
製備例2-8 ADC-8
Figure 111127403-A0202-12-0029-20
在37℃條件下，向抗體hRS7的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.18mL，147.3nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，36.8μL，368nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物58(1.52mg，1473nmol，參照專利“CN104755494A中第163頁的實施例58)溶解於100μLDMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到式hRS7-58所示的示例性標題產物ADC-8的PBS緩衝液(1.02mg/mL，16.8mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.93。
製備例2-9 ADC-9
Figure 111127403-A0202-12-0029-21
在37℃條件下，向抗體TINA的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.95mL，64.2nmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦 (TCEP)的水溶液(10mM，16.0μL，160nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(0.69mg，642nmol)溶解於30μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到式TINA-9-A所示的示例性標題產物ADC-9的PBS緩衝液(0.99mg/mL，7.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.99。
以下用生化測試方法驗證本公開的抗體及偶聯物的活性。
測試例1：抗體蛋白水平結合實驗
用pH7.4的PBS(源培生物，B320)緩衝液將hTROP-2蛋白稀釋至1μg/mL，以100μL/孔的體積加入96孔酶標板中，4℃過夜孵育。棄去液體後，每孔加入300μL用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD，232100)進行封閉，37℃孵育2小時。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.1% tween-20)洗板3次後，每孔加入100μL梯度稀釋的抗體溶液，於37℃孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，每孔加入100μL鼠抗-人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，209-035-088，1：8000稀釋)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，每孔加入100μL TMB顯色受質(KPL，5120-0077)，室溫孵育10-15分鐘，每孔加入50μL 1M H2SO4終止反應，用酶標儀讀取在450nm處的吸收值，用軟體擬合出抗體與抗原的結合曲線，計算出EC50值。抗體與蛋白的結合活性見表2。
表2. 抗體蛋白水平結合活性
Figure 111127403-A0202-12-0030-22
結果顯示，本揭露中的PD3抗體與hTROP-2蛋白具有較高的結合活性。
測試例2：抗體細胞水平結合實驗
將穩轉TROP-2的CHOK1細胞用FACS緩衝液(2%胎牛血清(Gibco，10099141)pH7.4 PBS(Sigma,P4417-100TAB))製備成1×106/mL的細胞懸液，100μL/孔加入96孔圓底板中。離心去除上清後加入50μL/孔用FACS緩衝液稀釋的不同濃度待測抗體，放於4℃冰箱中避光孵育1小時。以FACS緩衝液300g離心洗滌3次後，加入工作濃度的Alexa Fluor 488羊抗-人IgG(H+L)(invitrogen,A-11013)，放於4℃冰箱中避光孵育40分鐘。以FACS緩衝液300g離心洗滌3次後，在BD FACSCantoII流式細胞儀上檢測幾何平均數螢光強度(MFI)，計算抗體對穩轉表達TROP-2的細胞的結合EC50值。抗體與細胞的結合活性見表3。
表3. 抗體細胞水平結合活性
Figure 111127403-A0202-12-0031-23
結果顯示，本揭露中的PD3抗體與表達TROP-2蛋白的細胞具有較高的結合活性。
測試例3：抗體內吞實驗
本實驗的目的是根據DT3C蛋白進入細胞後，活化的DT對細胞進行殺傷，間接反映了抗TROP-2抗體的內吞情況。根據EC50和Emax來評價抗體的體外內吞活性。
DT3C是重組表達的融合蛋白，由白喉毒素的片段A(僅毒素部分)和G群鏈球菌的3C片段(IgG結合部分)融合而成，該蛋白能夠與抗體的IgG部分高度親和，在抗體發生內吞時一同進入細胞，在胞內弗林蛋白酶的作用下，釋放出具有毒性的DT，DT能夠抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻斷蛋白 翻譯過程，最終導致細胞死亡。而未進入細胞的DT3C則不具有殺傷細胞的活性。根據細胞殺傷情況來評價抗體的內吞活性。
用含20%低IgG FBS的新鮮細胞培養基製備細胞懸液，細胞密度為2×104細胞/mL，以50μL/孔加入細胞培養板中，5%二氧化碳37℃培養16小時。用無血清培養基配製4×濃度的DT3C，0.22μm小濾器過濾成無菌溶液。用無血清培養基配製4×濃度的抗體，將80μL DT3C和80μL抗體按照1：1的體積混勻，室溫下靜置孵育30分鐘。取50μL稀釋好的抗體-DT3C混合物加入50μL的細胞中，培養箱中孵育三天。每孔加入50μL CTG，室溫下避光孵育10分鐘，Victor3上讀取化學發光。抗體的內吞活性見表4。
表4. 抗體內吞活性
Figure 111127403-A0202-12-0032-25
結果顯示，本揭露中的PD3抗體有較高的內吞效率。
測試例4：抗體親和力測定
抗體對TROP-2親和力的檢測，採用捕獲抗體的形式。用偶聯有抗-人IgG抗體(Cat.#BR-1008-39,Lot.# 10260416,GE)的Protein A(Cat.# 29127556,GE)生物傳感芯片親和捕獲抗體，然後於芯片表面流經抗原hTROP-2，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用再生緩衝液Glycine1.5(Cat# BR100354，GE)或3M MgCl2(來自Human antibody capture kit，Cat.#BR100839,GE)將芯片洗淨再生。實驗結束後用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0軟體以(1：1)Langmuir模型擬合數據，得出親和力數值。抗體與蛋白的親和力見表5。
表5. Biacore測定的抗體的親和力
Figure 111127403-A0202-12-0032-26
結果顯示，本揭露中的PD3抗體與hTROP-2的親和力較高。
測試例5：ADC分子細胞活性實驗
該實驗中使用的細胞如下：FaDu(++++)購於ATCC，貨號HTB-43TM；HCC827(+++)，購於ATCC，貨號CRL-2868；Colo205(++)，購於中科院細胞庫，貨號：TCHu102；DMS53(++)，購於ATCC，貨號：CRL-2062TM；SK-OV-3(+)，購於ATCC，貨號：HTB-77；CHO-K1(-)，購於ATCC，貨號：CCL-61TM。其中“+”表示細胞匯總TROP-2的表達量，“+”越多，表示TROP-2的表達量越高，“-”表示不表達TROP-2。
用含10% FBS的新鮮細胞培養基製取細胞懸液，密度為3703細胞/mL，以每孔135μL加入到96孔細胞培養板中，5%二氧化碳37℃16小時培養。ADC樣品用PBS配製成5μM。以此為首濃度，用PBS五倍稀釋，共8個濃度。每孔加入15μL的上述ADC溶液。5%二氧化碳37℃培養6天。每孔加入70μL CTG，室溫下避光孵育10分鐘，Victor3上讀取化學發光利用GraphPad Prism軟體進行數據分析。
結果顯示ADC-1有較強的細胞殺傷效果，而且殺傷效果與腫瘤細胞表面TROP-2表達水平正向相關。
表6. ADC對不同TROP-2表達量細胞的殺傷活性
Figure 111127403-A0202-12-0033-27
按照上述方法進行第二次平行比較實驗，獲得如下結果：
表7. ADC對不同TROP-2表達量細胞的殺傷活性
Figure 111127403-A0202-12-0034-28
測試例6：旁觀殺傷活性實驗
BxPC3(人胰腺癌細胞，ATCC，CRL-1687)和MiaPaCa2細胞(人胰腺癌細胞，biocytogen，B-HCL-014)分別用RPMI1640+10%FBS和DMEM/高葡萄糖+10%FBS培養，細胞用胰酶消化，新鮮培養基中和，1000rpm離心3分鐘，棄上清，細胞用RPMI1640+10%FBS重新懸浮。細胞計數後，將BxPC3細胞密度調整為6×104個/mL，將MiaPaCa2-luc細胞密度調整為1.5×104個/mL。12孔板板1中每孔加入500μL的BxPC3細胞和500μL的MiaPaCa2-luc細胞。12孔板板2中加入500μL的MiaPaCa2-luc細胞和500μL的含10%FBS血清的RPMI1640培養液。5%二氧化碳37℃培養24小時。
ADC樣品配製成40×濃度的中間溶液(0.2μM)。各取25μL上述樣品加入到12孔板相應孔中。設置溶劑對照組。5%二氧化碳37℃培養6天。12孔板中的細胞用胰酶消化，新鮮培養基中和，1000rpm離心3分鐘，棄上清，用1mL的FACS緩衝液(PBS+2.5%FBS)重新懸浮，取20μL的細胞加入20μL的台盼藍，計數。板1的細胞，1000rpm離心3分鐘，棄上清，用100μL的FACS Buffer重新懸浮，加入2μL的TROP-2(EGP-1)單株抗體(MR54)，冰上孵育30分鐘。4℃，2000rpm離心1分鐘，棄去上清，加入150μL FACS緩衝液重新懸浮細胞。用BD FACSVerse檢測。用Flowjo 7.6分析數據。旁觀殺傷活性實驗結果見圖1。
結果顯示，本揭露中的ADC-1有明確的旁觀殺傷效果，ADC並不會殺傷TROP-2陰性的MiaPaCa2細胞，但將表達TROP-2的BxPC3細胞與陰性細胞MiaPaCa2混合後，ADC-1對TROP-2陰性的細胞也有殺傷作用。
體內活性生物學評價
測試例7：Fadu細胞CDX小鼠模型體內藥效評價
將Fadu細胞(3×106個)接種於Balb/c裸鼠右肋部皮下，接種10天後，待腫瘤體積在~245mm3後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為5組，每組8隻。
ADC腹腔注射，於0天和第8天共給藥2次，每隻按體重注射10g/0.1mL，給藥量1mg/kg。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據，共記錄21天。
使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT(每組動物數)計算；採用GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA或One-way ANOVA對數據進行統計學分析。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
結果見表8，表明在1mpk劑量下，ADC-1對FaDu移植瘤有較強的抑瘤效果。
表8. ADC對荷瘤裸鼠FaDu移植瘤的療效
Figure 111127403-A0202-12-0035-29
測試例8：SKOV3細胞CDX小鼠模型體內藥效評價
將SKOV3細胞(5×106個)接種於Balb/c裸鼠右肋部皮下，接種23天後，待腫瘤體積在約180mm3後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為5組，每組8隻。
ADC腹腔注射，共給藥2次，每隻按體重注射10g/0.1mL，給藥量見下表。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT(每組動物數)計算；採用GraphPad Prism軟體作圖，採用雙因子ANOVA或單因子ANOVA對數據進行統計學分析。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
結果顯示見表9，在不同劑量下，ADC-1對SKOV3移植瘤有較強的抑瘤效果，同時抑瘤效果有劑量依賴效應。
效果有劑量依賴效應。
表9. ADC對荷瘤裸鼠SKOV3移植瘤的療效
Figure 111127403-A0202-12-0036-30
測試例9：Colo205細胞CDX小鼠模型體內藥效評價
將Colo205細胞(5×106個)接種於Balb/c裸鼠右肋部皮下，接種10天後，待腫瘤體積在~245mm3後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為6組，每組8隻。
ADC腹腔注射，於第0天(D0)和第10天共給藥2次，每隻按體重注射10g/0.1mL，給藥量10mg/kg。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據，共記錄28天(D28)。
使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT(每組動物數)計算；採用GraphPadPrism軟體作圖，採用雙因子ANOVA或單因子ANOVA對數據進行統計學分析。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
結果見表10，表明在1mpk劑量下，偶聯有化合物9-A的ADC-9和ADC-7對Colo205移植瘤有較強的抑瘤效果。
表10. ADC對荷瘤裸鼠FaDu移植瘤的療效
Figure 111127403-A0202-12-0037-31
製劑
製劑製備與檢測過程中使用的設備及結果計算方法如下：
1)SEC分子排阻色譜法：
根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關係而對溶質進行分離的分析的方法。
SEC%(SEC單體含量百分比)=A單體/A總*100%(A單體為樣品中主峰單體的峰面積，A總為所有峰面積之和。)
SEC測定用儀器：安捷倫1260；管柱：waters，XBrige BEH200Å SEC(300×7.8mm 3.5μm)
2)R-CE毛細管凝膠電泳：
將凝膠移到毛細管中作為支持介質進行的一種電泳，並在一定的電壓下根據樣品分子量的大小進行分離的方法。
R-CE純度百分比=A主峰/A總*100%(A主峰為樣品中輕鏈主峰+重鏈主峰的峰面積，A總為所有峰面積之和。
R-CE測定用儀器：Beckman型號plus800
3)濁度測定：
光線透過水層時受到阻礙的程度，表示水層對於光線散射和吸收的能力，不僅與懸浮物的含量有關，而且還與顆粒成分、大小、形狀及其表面的反射性能有關。藉由對比同一蛋白樣品相同濃度且同一波長(近紫外和可見光波長區域)吸收值，吸收值越大說明濁度越大，樣品中蛋白分子聚集傾向越明顯。測定儀器為多功能酶標儀(Molecular Devices M5)，相同體積樣品加入96孔板讀取吸光度值。
4)滲透壓測定：
冰點法測定滲透壓，以冰點下降值與溶液的莫耳濃度成正比例關係為基礎，採用高靈敏度感溫元件，測定溶液結冰點，藉由電量轉化為滲透壓。儀器廠家羅澤Loser，型號OM815.
5)蛋白濃度測定：
本揭露中的抗體藥物偶聯物濃度以蛋白的濃度計，即以抗體藥物偶聯物中抗體部分的濃度。
因為抗體藥物偶聯物中的毒素在蛋白特徵吸收波長280nm下有吸收，同時該毒素在370nm下也有吸收，故用以下公式對上述蛋白濃度進行計算：
A280nm=(Cdrug×Edrug-280+CmAb×EmAb-280)×l
A370nm=Cdrug×Edrug-370×l
取
Figure 111127403-A0202-12-0039-32
即：
Figure 111127403-A0202-12-0039-33
式中，A280nm：供試品溶液單份樣品在光程為1cm時在280nm波長處的吸光度平均值；
A370nm：供試品溶液單份樣品在光程為1cm時在370nm波長處的吸光度平均值；
EmAb-280：蛋白在280nm波長處的質量消光係數，為1.532g-1cm-1L；
Edrug-280：毒素在280nm波長處的質量消光係數，5.17g-1cm-1L；
Edrug-370：毒素在370nm波長處的質量消光係數，17.89g-1cm-1L；
R：毒素消光係數在370nm和280nm的比值，為3.46；
CmAb：蛋白的濃度，mg/mL；
l：光程長度，cm(此處光程為1cm)。
若供試液經過稀釋，則蛋白濃度為：C(mg/mL)=CmAb×N，N為稀釋倍數。
蛋白濃度測定儀器：紫外可見分光光度計，型號：Nano Drop One。
實施例1：抗Trop2-ADC抗體製劑緩衝體系和pH篩選
使用下列緩衝液，配製ADC-3的蛋白濃度為10~30mg/mL的抗Trop2-ADC抗體製劑。具體如下：
1)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽(簡稱：CA)，pH5.0，20mg/mL蛋白濃度；
2)10mM CA，pH5.5，20mg/mL蛋白濃度；
3)10mM CA，pH6.0，20mg/mL蛋白濃度；
4)10mM CA，pH6.5，20mg/mL蛋白濃度；
5)10mM琥珀酸-琥珀酸鈉鹽(簡稱：SA)，pH5.0，20mg/mL蛋白濃度；
6)10mM SA，pH5.5，20mg/mL蛋白濃度；
7)10mM SA，pH6.0，20mg/mL蛋白濃度；
8)10mM組胺酸-鹽酸組胺酸(簡稱：His-HCl)，pH5.5，10mg/mL蛋白濃度；
9)10mM His-HCl，pH5.5，20mg/mL蛋白濃度；
10)10mM His-HCl，pH5.5，30mg/mL蛋白濃度；
11)10mM His-HCl，pH6.0，20mg/mL蛋白濃度；
12)10mM His-HCl，pH6.5，20mg/mL蛋白濃度；
製備完成的製劑無菌過濾，灌裝，加塞，軋蓋。考察樣品在強制降解40℃高溫條件下，以外觀、SEC和R-CE為評價指標，考察製劑穩定性。實驗結果見表11。
40℃ M1時，His-HCl體系的外觀的顆粒數少於CA和SA體系，在相同pH值和相同蛋白濃度時His體系的純度項高於CA和SA體系，在相同緩衝體系中隨著pH值的增加SEC單體峰和R-CE主峰下降值變小。在10mM pH5.5 His體系中隨著蛋白濃度的增加SEC聚體略微增加，R-CE純度項無顯著 變化。綜上，緩衝體系較佳His-HCl，pH範圍較佳5.5-6.5，蛋白濃度較佳10mg/mL-30mg/mL。
表11 pH和緩衝體系篩選實驗結果
Figure 111127403-A0202-12-0041-34
備註：D0表示實驗開始時，“M”表示月，例如M1表示一個月；△值表示各條件下放樣後該檢測項與D0的差值，下同。
實施例2：抗Trop2-ADC抗體製劑中表面活性劑篩選
使用10mM pH 6.0 His-HCl緩衝體系，配製含80mg/mL蔗糖，ADC-3的蛋白濃度為20mg/mL含不同濃度聚山梨酯80(簡稱：PS80)的抗Trop2-ADC抗體製劑。具體如下：
1)不含PS80；
2)0.2mg/mL PS80；
3)0.4mg/mL PS80；
4)0.6mg/mL PS80；
製備完成的製劑無菌過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將樣品置於振搖(25℃，300rpm，3天)和高溫(40℃ M1)條件下，以外觀、SEC、R-CE為評價指標，考察製劑穩定性。實驗結果見表12。
實驗結果顯示，所有考察條件下0.2~0.6mg/mL PS80組外觀均優於不含PS80組，0.2mg/mL PS80組高溫1個月後的R-CE純度項主峰下降低於0.4mg/mL和0.6mg/mL組。綜上，PS80濃度較佳0.2mg/mL。
表12 製劑中表面活性劑篩選實驗結果
Figure 111127403-A0202-12-0042-35
實施例3：抗Trop2-ADC抗體製劑糖種類篩選
使用10mM pH 6.0 His-HCl緩衝體系，配製含0.4mg/mL聚山梨酯80，不同糖種類，ADC-3的蛋白濃度為20mg/mL的抗Trop2-ADC抗體製劑。其中不同糖如下，糖含量為溶液滲透壓為等滲時的濃度：
1)80mg/mL蔗糖；
2)88mg/mL二水合海藻糖；
製備完成的製劑無菌過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將樣品置於振搖(25℃，300rpm，3天)、FT5C(-35℃和2~8℃之間凍融5個循環)和高溫(40℃M1)條件下，以外觀、SEC、R-CE為評價指標，考察製劑穩定性。實驗結果見表13。
實驗結果顯示，在不同條件下蔗糖和二水合海藻糖外觀和純度項無顯著性差異。
表13 糖種類篩選實驗結果
Figure 111127403-A0202-12-0043-37
實施例4：抗Trop2-ADC抗體製劑處方優化
使用pH6.0 His-HCl緩衝體系，配製含0.2mg/mL PS80、不同蔗糖濃度和甘胺酸濃度，ADC-3的蛋白濃度為20mg/mL的抗Trop2-ADC抗體製劑。具體如下：
1)10mM His-HCl pH6.0，80mg/mL蔗糖；
2)10mM His-HCl pH6.0，40mg/mL蔗糖，10.2mg/mL甘胺酸；
3)30mM His-HCl pH6.0，70mg/mL蔗糖；
4)30mM His-HCl pH6.0，40mg/mL蔗糖，7.6mg/mL甘胺酸；
採用溶液劑和凍乾劑兩種方式進行考察。
溶液劑：製備完成的製劑無菌過濾，灌裝，加塞，軋蓋。將溶液劑置於高溫(40℃ D10)條件下，以SEC、R-CE為評價指標，考察製劑穩定性。實驗結果見表14。所有組別40℃ D10後純度項無顯著差異。
表14 製劑中滲透壓調節劑篩選實驗結果
Figure 111127403-A0202-12-0044-38
備註：表中“D”表示天，例如D10表示10天。
凍乾劑：製備完成的製劑無菌過濾，灌裝，半加塞，凍乾，壓塞，軋蓋。考察凍乾後的產品外觀和產品複溶情況。凍乾程序如下：
表15 凍乾程序
Figure 111127403-A0202-12-0044-39
結果：
凍乾後粉餅外觀顯示高蔗糖濃度組底部略微縮底，而蔗糖濃度降至40mg/mL，加入甘胺酸後在相同的凍乾條件下，得到的粉餅均勻飽滿，無塌陷。說明降低蔗糖濃度，加入甘胺酸後所需要的一次乾燥時間短於用高蔗糖濃度處方所需的時間。
蔗糖濃度為40mg/mL時，不同緩衝液濃度配製的樣品在經凍乾程序後，外觀都呈現均勻飽滿無塌陷。
表16 滲透壓調節劑篩選凍乾結果
Figure 111127403-A0202-12-0045-40
實施例5：抗Trop2-ADC抗體製劑穩定性實驗
製備ADC-3的蛋白濃度20mg/mL，30mM pH6.0 His-HCl緩衝體系，40mg/mL蔗糖，9.0mg/mL甘胺酸和0.2mg/mL PS80的抗Trop2-ADC製劑。
將製備好的製劑無菌過濾，灌裝，加塞，軋蓋。放置振搖(25℃，300rpm，10天)、FT5C(-35℃和2~8℃之間凍融5個循環)和高溫(40℃M1)強制降解、25℃加速(25℃ M3)和2~8℃長期(4℃ M3)條件下，以外觀、SEC和R-CE為評價指標，考察製劑穩定性。實驗結果見表17。
實驗結果顯示，最終處方製劑外觀在各強制降解條件下均保持澄明，具有較好的穩定性。
表17 穩定性實驗數據
Figure 111127403-A0202-12-0045-41
實施例6：抗Trop2-ADC抗體製劑的凍乾
在30mM pH6.0 His-HCl的緩衝液中，製備ADC-3的蛋白濃度為20mg/mL，40mg/mL蔗糖，9mg/mL甘胺酸和0.2mg/mL PS80的抗Trop2-ADC抗體製劑，將製劑樣品進行凍乾，凍乾程序為預凍、一次乾燥和二次乾燥，凍乾程序見表18。凍乾程序結束後，真空加塞。凍乾後樣品外觀為白色均勻餅狀，水分符合標準，易複溶，複溶後SEC、NR-CE純度項符合標準，結果見表19。複溶後的PH為6.1。
表18 凍乾程序
Figure 111127403-A0202-12-0046-42
表19 凍乾產品數據
Figure 111127403-A0202-12-0046-43
TW202320859A_111127403_SEQL.xml

Claims (17)

  1. 一種醫藥組成物，包含抗體藥物偶聯物和緩衝劑，其中該抗體藥物偶聯物具有如下所示的結構：
    Figure 111127403-A0202-13-0001-49
    其中，
    PD3為抗TROP2抗體，包含如SEQ ID NO：1所示的重鏈和如SEQ ID NO：2所示的輕鏈；
    n為1至10，較佳為1至8；
    該醫藥組成物的緩衝劑為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，pH為約5.0至約6.5，較佳pH為約5.5至約6.5，更佳pH為約5.9至約6.2。
  2. 如請求項1所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的濃度為約10mM至約50mM，較佳為約20mM至約40mM，更佳為約30mM。
  3. 如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含表面活性劑，該表面活性劑較佳為聚山梨酯，更佳為聚山梨酯80或聚山梨酯20，最佳為聚山梨酯80。
  4. 如請求項3所述的醫藥組成物，其中該表面活性劑濃度為約0.01mg/mL至約1.0mg/mL，較佳為約0.1mg/mL至約0.3mg/mL，更佳為約0.2mg/mL。
  5. 如請求項1至4任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含糖，該糖較佳選自蔗糖和二水合海藻糖，最佳為蔗糖。
  6. 如請求項5所述的醫藥組成物，其中該糖濃度為約25mg/mL至約80mg/mL，較佳為約30mg/mL至約50mg/mL，更佳為約40mg/mL。
  7. 如請求項1至6任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含胺基酸或胺基酸鹽，該胺基酸或胺基酸鹽較佳選自甘胺酸和精胺酸鹽酸鹽，更佳為甘胺酸。
  8. 如請求項7所述的醫藥組成物，其中該甘胺酸濃度為約6mg/mL至約15mg/mL，較佳為約7mg/mL至約11mg/mL，更佳為約9mg/mL。
  9. 如請求項1至8任一項所述的醫藥組成物，其中該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，約1mg/mL至約100mg/mL，約10mg/mL至約30mg/mL，約18mg/mL至約22mg/mL。
  10. 如請求項1至9任一項所述的醫藥組成物，其包含如下組分：
    (a)以蛋白濃度計，約10mg/mL至約30mg/mL的所述抗體藥物偶聯物，(b)約0.1mg/mL至約0.3mg/mL的聚山梨酯，(c)約30mg/mL至約50mg/mL的蔗糖，(d)約7mg/mL至約11mg/mL甘胺酸和(e)約20mM至約40mM的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑；該組成物的pH為約5.5-6.5；
    較佳地，該醫藥組成物包含如下組分：
    (a)以蛋白濃度計，約18mg/mL至約22mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)約0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)約40mg/mL的蔗糖，(d)約9mg/mL甘胺酸和(e)約30mM組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑，該組成物的pH為約5.9-6.2。
  11. 一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其特徵在於該凍乾製劑複溶後可形成如請求項1至10任一項所述的醫藥組成物。
  12. 一種製備含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑的方法，其中包括將如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。
  13. 一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，該凍乾製劑藉由將如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
  14. 一種含抗體藥物偶聯物的複溶溶液，其特徵在於該複溶溶液是藉由將如請求項11或13所述的凍乾製劑經複溶製備獲得。
  15. 一種製品，其包括容器，該容器中裝有如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物、如請求項11或13所述的凍乾製劑或如請求項14所述的複溶溶液。
  16. 一種如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物、如請求項11或13所述的凍乾製劑、如請求項14所述的複溶溶液或如請求項15所述製品在製備用於治療TROP-2介導的疾病或病症的藥物中的用途。
  17. 一種如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物、如請求項11或13所述的凍乾製劑、如請求項14所述的複溶溶液或如請求項15所述製品在製備治療和/或預防腫瘤和癌症的藥物中的用途，其中該腫瘤和癌症較佳頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌；更佳的，該淋巴瘤選自：何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤；該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌；該白血病選自：慢性髓細胞 樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。
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