BR122021014396B1 - Compostos intermediários ligantes de fármacos, e ligante - Google Patents

Compostos intermediários ligantes de fármacos, e ligante Download PDF

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Hiroyuki Naito
Takashi Nakada
Masao Yoshida
Shinji Ashida
Hideki Miyazaki
Yuji Kasuya
Koji Morita
Yuki Abe
Yusuke OGITANI
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Abstract

É fornecido um conjugado anticorpo-fármaco que pode ser usado como um agente antitumor que tem um excelente efeito antitumor e é altamente seguro, o referido conjugado sendo caracterizado por ser produzido por ligação de um composto antitumor representado pela fórmula (1) a um anticorpo por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- (em que o anticorpo é ligado ao terminal de L1, e o composto antitumor é ligado ao terminal de Lc na qual o sítio de ligação do composto antitumor é um átomo de nitrogênio em um grupo amino localizado na posi-ção-1).

Description

Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a um conjugado de anticor- po-fármaco tendo um fármaco antitumor conjugado a um anticorpo capaz de atingir células de tumor por meio de uma porção de estrutura do ligante, o conjugado sendo útil como um fármaco antitumor.
Técnica Antecedente
[0002] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) tendo um fármaco com citotoxicidade conjugado a um anticorpo, cujo antígeno é expresso sobre a superfície de células de câncer e que também se liga a um antígeno capaz de internalização celular, e, portanto, pode liberar o fármaco seletivamente para células de câncer e é, desse modo, esperado causar o acúmulo do fármaco dentro de células de câncer e matar as células de câncer (ver, Literaturas de Não Patente 1 a 3). Como um ADC, Mylotarg (Gemtuzumabe ozogamicina) em que cali- queamicina é conjugado a um anticorpo anti-CD33 é aprovado como um agente terapêutico para leucemia mieloide aguda. Além disso, Adcetris (Brentuximabe vedotin), em que auristatina E é conjugada a um anticorpo anti-CD30, foi recentemente aprovado como um agente terapêutico para linfoma de Hodgkin e linfoma de célula grande ana- plásica (ver, Literatura de Não Patente 4). Os fármacos contidos em ADCs que foram aprovados até agora alvejam DNA ou tubulina.
[0003] Com respeito a um antitumor, compostos de baixo peso molecular, derivados de camptothecina, compostos que inibem a topoisomerase I de exibir um efeito antitumor, são conhecidos. Entre eles, um composto antitumor representado pela fórmula abaixo Fórmula 1
Figure img0001
(exatecano, nome químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro -9-hidróxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]qui- nolin-10,13(9H,15H)-diona) é um derivado solúvel em água de campto- tecina (Literatura de Patente 1 e 2). Ao contrário do irinotecano atualmente usado em cenários clínicos, uma ativação por uma enzima é desnecessária. Além disso, a atividade inibitória sobre topoisomerase I é maior do que SN-38 que é uma principal substância farmaceutica- mente ativa de irinotecano e topotecano também usados em cenários clínicos, e maior atividade citocida in vitro é obtida contra várias células de câncer. Em particular, exibe o efeito contra células de câncer que têm resistência a SN-38 ou similares, devido à expressão de P- glicoproteína. Além disso, em um modelo de camundongo subcutane- amente transplantado tumor humano, ele exibiu um potente efeito antitumor, e, desse modo, passou por estudos clínicos, porém não foi co-locado no mercado ainda (ver, Literaturas de Não Patente 5 a 10). ainda não está claro se ou não exatecano funciona efetivamente como um ADC.
[0004] DE-310 é um complexo em que exatecano é conjugado a um polímero de poliálcool de carboximetildextrana biodegradável por meio de um espaçador de peptídeo de GGFG (Literatura de Patente 3). Convertendo exatecano em uma forma de um profármaco de polímero, de modo que uma propriedade de retenção de sangue elevada possa ser mantida e também uma elevada propriedade alvejável para uma área de tumor é passivamente aumentada utilizando a permeabi lidade aumentada de vasos sanguíneos recentemente formados dentro de tumor e propriedade de retenção em tecidos de tumor. Com DE- 310, por meio de uma clivagem do espaçador de peptídeo por enzima, exatecano e exatecano com glicina conectada a um grupo amino são continuamente liberados como uma principal substância ativa. Como um resultado, os farmacocinéticos são melhorados e DE-310 foi descoberto ter maior eficácia do que o exatecano administrado sozinho, embora a dosagem de exatecano é menor do que no caso da administração de exatecano sozinho de acordo com vários modelos de avaliação de tumor em estudos não clínicos. Um estudo clínico foi conduzido para DE-310, e casos efetivos foram confirmados em humanos, em que um relato sugerindo que a principal substância ativa acumula-se em um tumor senão em tecidos normais estava presente, entretanto, existe também um relato indicando que o acúmulo de DE-310 e a principal substância ativa em um tumor não é muito diferente do acúmulo em tecidos normais em humanos, e, desse modo, nenhum alvejamen- to passivo é observado em humanos (ver, Literaturas de Não Patente 11 a 14). Como um resultado, DE-310 não foi também comercializado, e ainda não está claro se ou não exatecano funciona efetivamente como um fármaco orientado para tal alvejamento.
[0005] Como um composto relativo a DE-310, um complexo em que uma porção de estrutura representado por -NH(CH2)4C(=O)- é inserida entre espaçador de -GGFG- e exatecano para formar -GGFG- NH(CH2)4C(=O)- usado como uma estrutura espaçadora é também conhecido (Literatura de Patente 4). Entretanto, o efeito antitumor do complexo não é conhecido absolutamente.
Lista de Citação Literatura de Patente
[0006] Literatura de Patente 1: Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 5-59061
[0007] Literatura de Patente 2: Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 8-337584
[0008] Literatura de Patente 3: Publicação Internacional No. WO 1997/46260
[0009] Literatura de Patente 4: Publicação Internacional No. WO 2000/25825
Literatura de Não Patente
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[0012] Literatura de Não Patente 3: Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452; Quimioterapia dirigida ao tumor com imu- noconjugados de caliqueamicina.
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[0023] Literatura de Não Patente 14: Wente M. N. et al. Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.; DE-310, um profármaco macromolecular do inibidor de topoisomerase I exatecano (DX-8951), em pacientes com tumores sólidos operáveis.
Sumário da Invenção Problema Técnico
[0024] Com respeito ao tratamento de tumor por um anticorpo, um efeito antitumor insuficiente pode ser observado mesmo quando o anticorpo reconhece um antígeno e liga-se a células de tumor, e existe um caso em que um anticorpo antitumor mais efetivo é necessário. Além disso, muitos compostos antitumor de baixo peso molecular têm um problema em segurança como efeito colateral e toxicidade mesmo que os compostos tenham um excelente efeito antitumor, permanece como um objetivo obter um efeito terapêutico superior ainda realçando a segurança. Desse modo, um objetivo da presente invenção é conseguir fornecer um fármaco antitumor tendo um excelente efeito terapêutico, que é excelente em termos de efeito antitumor e segurança. Métodos para Solucionar o Problema
[0025] Os inventores pensam que, quando um composto antitumor exatecano é convertido em um conjugado de anticorpo-fármaco, por meio de uma porção de estrutura do ligante, por conjugação ao anticorpo, que é capaz de atingir células de tumor, que é tendo uma propriedade de reconhecimento de células de tumor, uma propriedade de ligação a células de tumor, uma propriedade de internalização dentro de células de tumor, uma atividade citocida contra células de tumor, ou similares, o composto antitumor pode ser mais seguramente liberado para células de tumor para especificamente exibir o efeito antitumor do composto em células de tumor, e, desse modo, o efeito antitumor pode ser seguramente exibido e também um efeito citocida realçado do anticorpo é esperado, e a dose do composto antitumor pode ser reduzida em comparação a um caso de administração do composto sozinho, e, desse modo, uma influência do composto antitumor sobre células normais pode ser aliviada de modo que maior segurança possa ser alcançada.
[0026] Neste contexto, os inventores criaram um ligante com uma estrutura específica e sucedida na obtenção de um conjugado de anti- corpo-fármaco em que o anticorpo e exatecano são conjugados um ao outro por meio do ligante, e confirmaram um excelente efeito antitumor exibido pelo conjugado para desse modo completar a presente invenção.
[0027] Especificamente, a presente invenção refere-se aos seguintes. [1] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela fórmula a seguir: Fórmula 2
Figure img0002
é conjugado a um anticorpo por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: -L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-,
[0028] Aqui, o anticorpo é conectado ao terminal de L1, o composto antitumor é conectado ao terminal de Lc com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como posição de conexão, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2- C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, n3 representa um número inteiro de 1 a 8, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S- (CH2)n6-C(=O)-, ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, n6 representa um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma ligação simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH20n8-COOH, ou -(CH2)nE-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, nE representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH20nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 3
Figure img0003
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 4
Figure img0004
que é conectada a L2 na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, cic.Hex(1,4) representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno, e quando L2 é -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 é -C(=O)-cic.Hex(1,4)- CH2-(N-li-3-diminiccuS)-.
[0029] A presente invenção também se refere a cada um dos seguintes. [2] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que Lc é -C(=O)-. [3] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que a ligação entre o anticorpo e L1 é uma ligação de tioéter que é formada em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte de articulação do anticorpo, uma ligação de dissulfeto que é formada em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte de articulação do anticorpo, ou uma ligação de amida que é formada em um grupo amino presente em uma cadeia lateral de um aminoácido constituindo o anticorpo ou no grupo amino terminal. [4] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que o resíduo de peptídeo de Lp é um resíduo de aminoácido compreendendo um aminoácido selecionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico. [5] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que Lp é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos. [6] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que Lp é -GGFG-. [7] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela fórmula a seguir: Fórmula 5
Figure img0005
é conjugado a um anticorpo por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: - L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-,
[0030] Aqui, o anticorpo é conectado ao terminal de L1, o composto antitumor é conectado ao terminal de Lc com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2- C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, n3 representa um número inteiro de 1 a 8, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S- (CH2)n6-C(=O)-, ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, n6 representa um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG, La representa -O- ou uma ligação simples, Lb representa -CR2(-R3)- ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um representa um átomo de hidrogênio, Lc representa -C(=O)-, - (Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 6
Figure img0006
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, - (N-li-3-diminiccuS)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 7
Figure img0007
que é conectada a L2 na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, cic.Hex(1,4) representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno, e quando L2 é -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 é -C(=O)-cic.Hex(1,4)- CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. [8] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [7], em que L1 é -(Succinimid-3-il-N)-(C=2)n2- C(=O)- ou -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-. [9] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [7], em que L1 é -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2- C(=O)-. [10] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [7], em que L1 é -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)- ou -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-. [11] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que n2 é um número inteiro de 2 a 5, e L2 é uma ligação simples. [12] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9], em que n2 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, e n5 é 2 ou 4. [13] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [12], em que -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos. [14] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [12], em que -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos. [15] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [14], em que -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é - NH-(CH2)3-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou - NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-. [16] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [15], em que a porção de estrutura fármaco- ligante é uma estrutura fármaco-ligante selecionada do grupo consistindo nas seguintes estruturas fármaco-ligante: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) em que, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 8
Figure img0008
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 9
Figure img0009
que é conectada a L2 na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, cic.Hex(1,4) representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno, -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 10
Figure img0010
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão, e -GGFG- representa um resíduo de peptídeo de -Gly-Gly-Phe-Gly-. O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [9] e [11] a [14], em que a porção de estrutura fármaco- ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-Lp-NH-(CH20n1-La-Lb-Lc- é uma estrutura fármaco-ligante selecionada do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0031] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura represen- tada pela fórmula a seguir: Fórmula 11
Figure img0011
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e conectado a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, e -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 12
Figure img0012
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [18] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela fórmula a seguir: Fórmula 13
Figure img0013
é conjugado a um anticorpo por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: -L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.
[0032] Aqui, o anticorpo é conectado ao terminal de L1, o composto antitumor é conectado ao terminal de Lc, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- e é conectado a o anticorpo por meio de uma ligação de tioéter que é forma da em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte de articulação do anticorpo, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG, La representa -O- ou uma ligação simples, Lb representa -CR2(-R3)- ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um representa um átomo de hidrogênio, Lc representa -C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 14
Figure img0014
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1. [19] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [18], em que n2 é 2, L2 é -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, n5 é 2, n1 é 3, e ambos La e Lb são ligações simples, n2 é 5, L2 é uma ligação simples, n1 é 1, La é -O-, e Lb é - CR2(-R3)-, or n2 é 5, L2 é uma ligação simples, n1 é 2, La é -O-, e Lb é - CR2(-R3)-. [20] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [18] ou [19], em que n2 é um número inteiro de 2 a 5, e L2 é uma liga- ção simples. [21] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [18] ou [19], em que n2 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH- (CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, e n5 é 2 ou 4. [22] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [18] a [21], em que -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é -NH-(CH203-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-CJO)-, ou -NH-(CH202-O-CH2-C(=O)-. [23] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [18] a [22], em que a porção de estrutura fármaco- ligante é uma estrutura fármaco-ligante selecionada do grupo consistindo nas seguintes estruturas fármaco-ligante: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX)
[0033] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 15
Figure img0015
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, e -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 16
Figure img0016
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma posição de conexão. [24] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [23], em que a porção de estrutura fármaco-ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é uma estrutura fármaco- ligante selecionada do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2@-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0034] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 17
Figure img0017
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, e -(NH-DX) representa um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 18
Figure img0018
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [25] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [24], em que um número médio de unidades se-lecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 1 a 10. [26] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [24], em que um número médio de unidades se-lecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 2 a 8. [27] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [24], em que um número médio de unidades se- lecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 3 a 8. [28] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [27], em que o anticorpo é um anticorpo tendo uma ou mais de uma propriedade de reconhecimento de uma célula alvo, uma propriedade de ligação a uma célula alvo, uma propriedade de internalização em uma célula alvo, e uma propriedade de dano a uma célula alvo. [29] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [27], em que uma célula que é alvejada pelo con-jugado de anticorpo-fármaco é uma célula de tumor. [30] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [27], em que o anticorpo é um anticorpo anti-A33, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-CanAg, um anticorpo anti- CD20, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-CD56, um anticorpo anti-CD70, um anti-corpo anti-CEA, um anticorpo anti-Cripto, um anticorpo anti-EphA2, um anticorpo anti-G250, um anticorpo anti-MUC1, um anticorpo anti- GPNMB, um anticorpo anti-integrina, um anticorpo anti-PSMA, um an-ticorpo anti-tenascina, um anticorpo anti-SLC44A4, ou um anticorpo anti-mesotelina. [31] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [27], em que o anticorpo é um anticorpo anti-B7- H3, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, ou um anticorpo anti-CD70. [32] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [27], em que o anticorpo é um anticorpo anti-B7- H3. [33] Um fármaco contendo o conjugado de anticorpo- fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [32], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo. [34] Um fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer con-tendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [32], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo. [35] O fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer de acordo com [34], que é aplicado ao câncer de pulmão, câncer renal, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, ou câncer de esôfago. [36] Uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [32], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo como um componente ativo, e um componente de formulação farmaceuticamente aceitável. [37] A composição farmacêutica de acordo com [36], que é aplicada ao câncer de pulmão, câncer renal, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, ou câncer de esôfago. [38] Um método para tratar tumor e/ou câncer compre-endendo administrar o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [32], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo. [39] Um composto intermediário ligante de fármaco re-presentado pela fórmula a seguir: Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX).
[0035] Na fórmula, Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2- C(=O)-NH-, ou (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, X representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo, nQ representa um número inteiro de 2 a 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos selecionados de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citruli- na, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma liga-ção simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 repre-senta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)n9-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, n9 representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH20nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 19
Figure img0019
em que o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, (pirrolidina-2,5- diona-N-ila) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 20
Figure img0020
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 21
Figure img0021
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [40] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com [39], em que Lc é -C(=O)-. [41] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com [39] ou [40], em que Lp é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos. [42] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com qualquer um de [39] a [41], em que Lp é -GGFG-. [43] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com qualquer um de [39] a [42], em que -NH-(CH20n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-. [44] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com qualquer um de [39] a [42], em que -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-(CH202-O-CH2-. [45] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com qualquer um de [39] a [44], em que nQ é um número inteiro de 2 a 6. [46] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com [43], em que P é (maleimid-N-il)-, nQ é um número inteiro de 2 a 5, e L2a é uma ligação simples. [47] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com [44], em que P é (maleimid-N-il)-, nQ é um número inteiro de 2 a 5, e L2a é uma ligação simples. [48] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com qualquer um de [39] a [42], em que P é (maleimid-N-il)-, nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, n5 é um número inteiro de 2 a 4, e -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-. [49] O composto intermediário ligante de fármaco de acordo com [48], em que n5 é um número inteiro de 2 ou 4, e - NH-(CH2)n1-La-Lb- é - NH-CH2CH2CH2-, - NH-CH2-O-CH2-, ou - NH-CH2CH2-O-CH2-. [50] Um composto dos seguintes: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2 CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2 CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2θ-CH2CH2θ-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2@-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), or (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0036] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 22
Figure img0022
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, X representa um átomo de halogênio, (Pirrolidina-2,5-diona- N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 23
Figure img0023
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 24
Figure img0024
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [51] Um composto dos seguintes: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), OU (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0037] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 25
Figure img0025
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 26
Figure img0026
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [52] Um composto dos seguintes: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) ou (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX).
[0038] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 27 0 0
Figure img0027
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 28
Figure img0028
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [53] Um composto selecionado do seguinte grupo: NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e HO-CH2-C(=O)-(NH-DX) em que -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 29
Figure img0029
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [54] Um composto representado pela fórmula a seguir: Fórmula 30
Figure img0030
[55] Um composto representado pela fórmula a seguir: Fórmula 31
Figure img0031
[56] Um composto representado pela fórmula a seguir:
Figure img0032
[57] Um método para produzir um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo reagir um composto representado pela fórmula a seguir: Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) com um anticorpo ou um derivado reativo do mesmo e conjugar uma porção ligantea de fármaco ao anticorpo por um método para formar uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte de articulação do anticorpo, ou por um método para formar uma ligação de amido em um grupo amino presente em uma cadeia lateral de um aminoácido constituindo o anticorpo ou no grupo amino terminal.
[0039] Na fórmula, Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2- C(=O)-NH-, ou (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, X representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo, nQ representa um número inteiro de 2 a 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos selecionados de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citruli- na, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma liga-ção simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 repre-senta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH20n8-COOH, ou -(CH2)nE-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, nE representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH20nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 33
Figure img0033
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, (Pirrolidina-2,5-diona-N-ila) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 34
Figure img0034
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 35
Figure img0035
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [58] O método de produção de acordo com [57], em que o método para conjugar uma porção ligantea de fármaco a um anticorpo é um método de reduzir o anticorpo e depois disso formar uma ligação de tioéter pela reação com o composto em que Q é um grupo maleimidila ou X-CH2-C(=O)-NH-, um método de formar uma ligação de amido pela reação com o composto em que Q é (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, ou um método de reagir o anticorpo com um composto repre-sentado pela fórmula Q1-L1a-Q2 [em que Q1 representa (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, (3-Sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, RQ-O-C(=N)-, ou O=C=N-, L1a- representa -cic.Hex(1,4)-CH2-, um grupo alquileno tendo 1 a 10 átomos de carbono, um grupo fenileno, -(CH2)n4-C(=O)-, - (CH2)n4a-NH-C(=O)-(CH2)n4b-, ou -(CH2)n4a-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)- CH2-, Q2 representa (maleimid-N-ila), um átomo de halogênio, ou -S-S-(2-piridila), RQ representa um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de car-bono, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, n4a representa um número inteiro de 0 a 6, n4b representa um número inteiro de 1 a 6, (3-Sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 36
Figure img0036
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e este ácido sul- fônico é capaz de formar um sal de lítio, sal de sódio, ou sal de potássio, cic.Hex(1,4) representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno, e (2-piridila) representa um grupo 2-piridila] e depois disso reagir com o composto em que P é SH para formar a estrutura fárma- co-ligante por uma ligação de amida. [59] O método de produção de acordo com [57] ou [58], em que um número médio de unidades selecionadas da estrutura fár- maco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 1 a 10. [60] O método de produção de acordo com [57] ou [58], em que um número médio de unidades selecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 2 a 8. [61] O método de produção de acordo com [57] ou [58], em que um número médio de unidades selecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 3 a 8. [62] O método de produção de acordo com qualquer um de [57] a [61], em que uma célula que é alvejada pelo conjugado de anticorpo-fármaco é uma célula de tumor. [63] O método de produção de acordo com qualquer um de [57] a [61], em que o anticorpo é um anticorpo anti-A33, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-CanAg, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti- CD33, um anticorpo anti-CD56, um anticorpo anti-CD70, um anticorpo anti-CEA, um anticorpo anti-Cripto, um anticorpo anti-EphA2, um anticorpo anti-G250, um anticorpo anti-MUC1, um anticorpo anti-GPNMB, um anticorpo anti-integrina, um anticorpo anti-PSMA, um anticorpo an- ti-tenascina, um anticorpo anti-SLC44A4, ou um anticorpo anti- mesotelina. [64] O método de produção de acordo com qualquer um de [57] a [61], em que o anticorpo é um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, ou um anticorpo anti-CD70. [65] O método de produção de acordo com qualquer um de [57] a [61], em que o anticorpo é um anticorpo anti-B7-H3. [66] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido pelo mé-todo de produção de acordo com qualquer de [57] a [65]. [67] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido formando uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de sulfeto em uma parte de articulação de um anticorpo, em que o anticorpo é tratado em uma condição de redução e depois disso reagido com um composto selecionado do grupo de composto mostrado abaixo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2θ-CH2CH2θ-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), or (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0040] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 37
Figure img0037
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 38
Figure img0038
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão. [68] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido formando uma ligação de tioéter em um sítio de ligação de sulfeto presente em uma parte de articulação de um anticorpo, em que o anticorpo é tratado em uma condição de redução e depois disso reagido com um composto selecionado do grupo de composto mostrado abaixo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2- O-CH2-C(JO)-(NH-DX), ou (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(JO)-(NH-DX).
[0041] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 39
Figure img0039
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 40
Figure img0040
onde o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma posi ção de conexão. [69] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [67] ou [68], em que um número médio de unidades selecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 1 a 10. [70] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [67] ou [68], em que um número médio de unidades selecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 2 a 8. [71] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [67] ou [68], em que um número médio de unidades selecionadas da estrutura fármaco-ligante conjugado por anticorpo é em uma faixa de 3 a 8. [72] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [67] a [71], em que uma célula que é alvejada pelo conjugado de anticorpo-fármaco é uma célula de tumor. [73] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [67] a [71], em que o anticorpo é um anticorpo anti- A33, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-CanAg, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-CD56, um anticorpo anti-CD70, um anticorpo anti-CEA, um anticorpo anti-Cripto, um anticorpo anti-EphA2, um anticorpo anti-G250, um anticorpo anti-MUC1, um anticorpo anti- GPNMB, um anticorpo anti-integrina, um anticorpo anti-PSMA, um an-ticorpo anti-tenascina, um anticorpo anti-SLC44A4, ou um anticorpo anti-mesotelina. [74] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [67] a [71], em que o anticorpo é um anticorpo anti-B7- H3, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, ou um anticorpo anti-CD70. [75] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [67] a [71], em que o anticorpo é um anticorpo anti-B7- H3. [76] Um ligante representado pela fórmula a seguir: -L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- para obter um conjugado de anticorpo- fármaco em que um fármaco é conjugado a um anticorpo por meio do ligante.
[0042] No acima, L1 é a posição de conexão para o anticorpo, Lc é uma posição de conexão para um composto antitumor, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C (=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, n3 repre-senta um número inteiro de 1 a 8, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6- C(=O)-, ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, n6 repre-senta um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma liga-ção simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 repre-senta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)nE-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, nE representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 41
Figure img0041
que é conectada ao anticorpo na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 42
Figure img0042
que é conectada a L2 na posição 3 do mesmo e é conectada a um grupo metileno na estrutura do ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, cic.Hex(1,4) representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno, e quando L2 for -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 seja -C(=O)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. [77] O ligante de acordo com [76], que é selecionado do seguinte grupo, contanto que o terminal esquerdo seja uma posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito seja uma posição de co nexão com o composto antitumor: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(JO)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(JO)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(JO)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(JO)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)- -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-CJO)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-CJO)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-CJO)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. [78] O ligante de acordo com [76], que é selecionado do seguinte grupo, contanto que o terminal esquerdo seja uma posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito seja uma posição de conexão com o composto antitumor: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. [79] O ligante de acordo com [76], que é selecionado do seguinte grupo, contanto que o terminal esquerdo seja a posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito seja a posição de conexão com o composto antitumor: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. [80] O ligante de acordo com [76], que é selecionado do seguinte grupo, contanto que o terminal esquerdo seja a posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito seja a posição de conexão com o composto antitumor: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. Efeitos Vantajosos de Invenção
[0043] Com um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um composto antitumor exatecano conjugado por meio de um ligante com uma estrutura específica, um excelente efeito antitumor e segurança podem ser alcançados. Breve Descrição de Figuras
[0044] Figura 1: Figura 1 mostra uma sequência de aminoácido de B7-H3 variante 1 (SEQ ID NO: 1).
[0045] Figura 2: Figura 2 mostra uma sequência de aminoácido de B7-H3 variante 2 (SEQ ID NO: 2).
[0046] Figura 3: Figura 3 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H1 (SEQ ID NO: 9).
[0047] Figura 4: Figura 4 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H2 (SEQ ID NO: 10).
[0048] Figura 5: Figura 5 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H3 (SEQ ID NO: 11).
[0049] Figura 6: Figura 6 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H4 (SEQ ID NO: 12).
[0050] Figura 7: Figura 7 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L1 (SEQ ID NO: 13).
[0051] Figura 8: Figura 8 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L2 (SEQ ID NO: 14).
[0052] Figura 9: Figura 9 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L3 (SEQ ID NO: 15).
[0053] Figura 10: Figura 10 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L4 (SEQ ID NO: 16).
[0054] Figura 11: Figura 11 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L5 (SEQ ID NO: 17).
[0055] Figura 12: Figura 12 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L6 (SEQ ID NO: 18).
[0056] Figura 13: Figura 13 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L7 (SEQ ID NO: 19).
[0057] Figura 14: Figura 14 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada de anticorpo M30 (SEQ ID NO: 20).
[0058] Figura 15: Figura 15 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve de anticorpo M30 (SEQ ID NO: 21).
[0059] Figura 16: Figura 16 mostra uma sequência de nucleotídeo de B7-H3 variante 1 (SEQ ID NO: 26).
[0060] Figura 17: Figura 17 mostra o efeito de um conjugado de anticorpo-fármaco (2) em células A375 de linhagem de melanoma hu-mano subcutaneamente transplantadas. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito de um anticorpo M30-H1- L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2).
[0061] Figura 18: Figura 18 mostra o efeito do conjugado de anti- corpo-fármaco (2) em células A375 de linhagem de melanoma humano subcutaneamente transplantadas. A linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) adminis-trado em 0,1 mg/kg, a linhagem com marcas X retrata o efeito do con-jugado de anticorpo-fármaco (2) administrado em 0,3 mg/kg, a linhagem com triângulos cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo- fármaco (2) administrado em 1 mg/kg, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado em 3 mg/kg.
[0062] Figura 19: Figura 19 mostra o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) sobre células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de célula não pequena humana subcutaneamente transplantada. A linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito de um anticorpo M30-H1-L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2).
[0063] Figura 20: Figura 20 mostra os efeitos de conjugados de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), e (55) sobre células A375 de linhagem de melanoma humano subcutaneamente transplantadas. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (1), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (55).
[0064] Figura 21: Figura 21 mostra os efeitos de conjugados de anticorpo-fármaco (13), (41), e (55) sobre células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de célula não pequena humana subcutaneamen- te transplantada. A linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito de DE-310, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (55).
[0065] Figura 22: Figura 22 mostra os efeitos de conjugados de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), e (61) sobre células A375 de linhagem de melanoma humano subcutaneamente transplantadas. Na figura, a linhagem com losangos cheios retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (17), a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (18), a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticor- po-fármaco (19), a linhagem com triângulos cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (59), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (60), e a linha- gem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (61).
Descrição de Modalidades
[0066] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é um fármaco antitumor em que um anticorpo de antitumor é conjugado a um composto de antitumor por meio de uma porção de estrutura do ligante e explicado em detalhes abaixo.
Anticorpo
[0067] O anticorpo usado no conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção significa uma imunoglobulina e é uma molécula contendo um sítio de ligação a antígeno imunoespecificamente ligando a um antígeno. A classe do anticorpo da presente invenção pode ser qualquer de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY e é preferivelmente IgG. A subclasse do anticorpo da presente invenção pode ser qualquer de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2 e é preferivelmente IgG1 ou IgG2. O anticorpo pode ser derivado de quaisquer espécies, e exemplos preferidos das espécies podem incluir humanos, ratos, camundongos, e coelhos. No caso de quando derivado de outro do que espécies humanas, ele é preferivelmente quimerizado ou humanizado usando uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal e é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[0068] O anticorpo da presente invenção pode ser aquele que é capaz de atingir células de tumor. Visto que o anticorpo da presente invenção é conjugado com um fármaco tendo atividade antitumor por meio de um ligante, o anticorpo preferivelmente possui uma ou mais de uma propriedade de reconhecer uma célula de tumor, uma propriedade de ligação a uma célula de tumor, uma propriedade de internali- zação em um célula de tumor, e uma propriedade de danificar uma célula de tumor.
[0069] A atividade de ligação do anticorpo contra células de tumor pode ser confirmada usando citometria de fluxo. A internalização do anticorpo em células de tumor pode ser confirmada usando (1) um ensaio de visualizar um anticorpo incorporado em células sob um microscópio de fluorescência usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando-se ao anticorpo terapêutico (Cell Death e Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) um ensaio de medir a quantidade de fluorescência incorporada em células usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando-se ao anticorpo terapêutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, Dezembro de 2004), ou (3) um ensaio Mab-ZAP usando uma imunotoxina ligando-se ao anticorpo terapêutico em que a toxina é liberada mediante incorporação em células para inibir desenvolvimento celular (Bio Techniques 28: 162-165, Janeiro de 2000).
[0070] A atividade antitumor do anticorpo refere-se a uma atividade citotóxica ou efeito citocida contra células de tumor e pode ser con-firmada in vitro determinando atividade inibitória contra desenvolvimento celular. Por exemplo, uma linhagem de célula de câncer superex- pressando uma proteína alvo para o anticorpo é cultivada, e o anticorpo é adicionado em concentrações de variação no sistema de cultura para determinar uma atividade inibitória contra formação de focos, formação de colônia, e desenvolvimento esferóide. A atividade antitumor pode ser confirmada in vivo, por exemplo, administrando o anticorpo a um camundongo nu com uma linhagem de célula de tumor transplantada altamente expressando a proteína alvo, e determinando mudança na célula de câncer. Visto que o fármaco conjugado no conjugado de anticorpo-fármaco exerce um efeito antitumor, é mais preferido, porém não essencial que o anticorpo em si deva ter um efeito antitumor. Para exercer o efeito antitumor e também para especificamente e seletivamente danificar células de tumor pelo fármaco, é importan- te e também preferido que o anticorpo deva ter a propriedade de inter-nalizar para migrar em células de tumor.
[0071] Exemplos de um tal anticorpo podem incluir, porém não limitados a, um anticorpo anti-A33, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-CanAg, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti- CD56, um anticorpo anti-CD70, um anticorpo anti-CEA, um anticorpo anti-Cripto, um anticorpo anti-EphA2, um anticorpo anti-G250, um anticorpo anti-MUC1, um anticorpo anti-GPNMB, um anticorpo anti- integrina, um anticorpo anti-PSMA, um anticorpo anti-tenascina, um anticorpo anti-SLC44A4, e um anticorpo anti-mesotelina.
[0072] O anticorpo da presente invenção é preferivelmente um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-CD70, ou um anticorpo anti-B7-H3, e mais preferivelmente um anticorpo anti- B7-H3.
[0073] O anticorpo da presente invenção pode ser obtido usando um método usualmente realizado na técnica, que envolve imunizar animais com um polipeptídeo antigênico e coletar e purificar anticorpos produzidos in vivo. A origem do antígeno não é limitada a humanos, e os animais podem ser imunizados com um antígeno derivado de um animal não humano tais como um camundongo, um rato e similares. Neste caso, a reatividade cruzada de anticorpos ligando-se ao antíge- no heterólogo obtido com antígenos humanos pode ser testada para avaliar quanto a um anticorpo aplicável a uma doença humana.
[0074] Alternativamente, células produtoras de anticorpo que produzem anticorpos contra o antígeno são fundidas com células de mi- eloma de acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) para estabilizar hibridomas, das quais anticorpos monoclonais podem ser, por sua vez obtidos.
[0075] O antígeno pode ser obtido geneticamente construindo células hospedeiras para produzir um gene codificando a proteína anti- gênica. Especificamente, os vetores que permitem expressão do gene antígeno são preparados e transferidos para células hospedeiras de modo que o gene seja expresso. O antígeno desse modo expresso pode ser purificado.
[0076] O anticorpo anti-CD30, o anticorpo anti-CD33, e o anticorpo anti-CD70 podem ser obtidos por um método conhecido na técnica com referência a WO2002/043661, Patente dos Estados Unidos No. 5,773,001, e WO2006/113909, respectivamente.
[0077] O anticorpo B7-H3 usado na presente invenção é preferivelmente aquele tendo propriedades como descrito abaixo. (1) um anticorpo tendo as seguintes propriedades: (a) especificamente ligando-se a B7-H3, (b) tendo atividade de fagocitose mediada por célula de-pendente de anticorpo (ADCP), e (c) tendo atividade antitumor in vivo. (2) O anticorpo de acordo com (1), em que B7-H3 é uma molécula compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1 ou 2. (3) O anticorpo de acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo tem CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 3, CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 4, e CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 5 como complementaridade de cadeia pesada determinando regiões, e CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 7, e CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 8 como complementaridade de cadeia leve determinando regiões. (4) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (3), em que a região constante do mesmo é uma região constante derivada de humano. (5) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (4), em que o anticorpo é um anticorpo humanizado. (6) O anticorpo de acordo com (5), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em (a) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9, (b) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 10, (c) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 11, (d) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12, (e) uma sequência de ami-noácido tendo pelo menos 95% ou homologia maior em quaisquer das sequências (a) a (d), e (f), uma sequência de aminoácido derivada de quaisquer das sequências (a) a (d) pelas deleções, substituições, ou adições de pelo menos um aminoácido, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em (g), uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 13, (h) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 14, (i) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 15, (j) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 16, (k) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 17, (l) uma sequência de amino-ácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 18, (m) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 19, (n) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% ou homologia maior em quaisquer das sequências (g) a (m), e (o), uma sequência de aminoácido derivada de quaisquer das sequências (g) a (m) pelas deleções, substituições, ou adições de pelo menos um aminoácido. (7) O anticorpo de acordo com (6), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 13, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 14, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 15, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 16, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoáci- do 21 a 128 em SEQ ID NO: 17, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 18, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 19, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 13, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 14, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 15, e a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de amino- ácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 16. (8) O anticorpo de acordo com (6) ou (7), em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma se quência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoá- cido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 15, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 16, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compre-endendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 17, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoáci- do 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 18, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 19, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 15, e a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 16. (9) O anticorpo de acordo com qualquer de (6) a (8), em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreen-dendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 15, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 17, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido re-presentada por SEQ ID NO: 18, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 19, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 15, e a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16. (10) O anticorpo de acordo com (8) ou (9), em que o anti-corpo carece de um aminoácido no terminal carbóxi da sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 ou 12 na cadeia pesada. (11) um anticorpo obtido por um método para produzir o anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (10), o método compreen-dendo as etapas de: cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo; e coletar o anticorpo de interesse das culturas obtido na etapa anterior. (12) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (11), em que a modificação de um glicano é regulada a fim de realçar atividade citotóxica dependente de anticorpo.
[0078] A seguir, o anticorpo B7-H3 usado na invenção é descrito.
[0079] Os termos "câncer" e "tumor" quando usados aqui são usa- dos com o mesmo significado.
[0080] O termo "gene" quando usado aqui inclui não somente DNA, mas também mRNA do mesmo, cDNA do mesmo e cRNA do mesmo.
[0081] O termo "polinucleotídeo" como usado aqui é usado com o mesmo significado como um ácido nucleico e também inclui DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos, e iniciadores.
[0082] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" como usados aqui são usados sem distinção.
[0083] O termo "célula" como usado aqui também inclui células em um indivíduo animal e células cultivadas.
[0084] O termo "B7-H3" como usado aqui é usado no mesmo significado como proteína B7-H3, e também refere-se a B7-H3 variante 1 e/ou B7-H3 variante 2.
[0085] O termo "CDR" como usado aqui refere-se a uma região determinando complementaridade (CDR), e é conhecido que cada cadeia leve e pesada de uma molécula de anticorpo tem três regiões de-terminando complementaridade (CDRs). O CDR é também chamado a região hipervariável, e está presente em uma região variável de cada cadeia leve e pesada de um anticorpo. Ele é um sítio que tem variabi-lidade não usualmente elevada em sua estrutura primária, e existem três CDRs separados na estrutura primária de cada cadeia de polipep- tídeo leve e pesada. Nesta especificação, quando para os CDRs de um anticorpo, os CDRs da cadeia pesada são representados por CDRH1, CDRH2, e CDRH3 do lado do terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia pesada, e os CDRs da cadeia leve são representados por CDRL1, CDRL2, e CDRL3 do lado do terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia leve. Estes sítios estão próximos uns aos outros na estrutura terciária e determinam a especificidade para um antígeno ao qual o anticorpo liga-se.
[0086] A frase "hibridização é realizada sob condições rigorosas" como usada aqui refere-se a um processo em que hibridização é realizada sob condições sob as quais a identificação possa ser alcançada realizando hibridização a 68 °C em uma solução de hibridização comercialmente disponível ExpressHyb Hibridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) ou realizando hibridização a 68 °C na presença de NaCl a 0,7 a 1,0 M usando um filtro tendo DNA imobilizado nele, seguido por realização de lavagem a 68 °C usando 0,1 a 2 x solução de SSC (1 x solução de SSC é composta de NaCl a 150 mM e citrato de sódio a 15 mM) ou sob condições equivalentes a isso. 1. B7-H3
[0087] B7-H3 é um membro da família B7 expresso sobre células apresentadoras de antígeno como uma molécula coestimulatória, e é considerado agir sobre um receptor sobre T células para realçar ou suprimir atividade imune.
[0088] B7-H3 é uma proteína tendo uma estrutura de transmem- brana de única passagem, e o domínio extracelular de terminal N de B7-H3 contém duas variantes. A variante 1 de B7-H3 (4Ig-B7-H3) contém um domínio Ig semelhante a V ou semelhante a C em dois sítios, respectivamente, e a variante 2 de B7-H3 (2Ig-B7-H3) contém um do-mínio Ig semelhante a V ou semelhante a C em um sítio, respectiva-mente.
[0089] Como para B7-H3 a ser usado na invenção, B7-H3 pode ser diretamente purificado de células expressando B7-H3 de um mamífero humano ou um não humano (tal como um rato ou um camundongo) e usado, ou uma fração de membrana celular das células acima descritas pode ser preparada e usada. Além disso, B7-H3 pode ser obtida por síntese in vitro da mesma ou produção da mesma em uma célula hospedeira por meio de engenharia genética. Na engenharia genética, especificamente, após cDNA de B7-H3 ser integrado em um vetor capaz de expressar cDNA de B7-H3, B7-H3 pode ser obtido sin-tetizando-a em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para a transcrição e translação, ou expressando B7-H3 em outra célula hospedeira transformada pro- cariótica ou eucariótica.
[0090] A sequência de aminoácido de uma estrutura de leitura aberta (ORF) de um gene de variante 1 de B7-H3 humano é representada por SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência. Além disso, a sequência de SEQ ID NO: 1 é mostrada na figura 1.
[0091] A sequência de aminoácido de uma ORF de um gene de variante 2 de B7-H3 humano é representado por SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequência. Além disso, a sequência de SEQ ID NO: 2 é mostrada na figura 2.
[0092] Além disso, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido em que um ou diversos aminoácidos são substituídos, deletados e/ou adicionados em qualquer das sequências de aminoáci- dos de B7-H3 acima descritas e também tem uma atividade biológica equivalente àquela da proteína é também incluída em B7-H3.
[0093] A variante 1 de B7-H3 humana madura da qual a sequência sinal foi removida corresponde a uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 27 a 534 da sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1. Além disso, a variante 2 de B7- H3 humana madura da qual a sequência sinal foi removida corresponde a uma sequência de aminoácido consistindo em 27 a 316 do sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2. 2. Produção de anticorpo anti-B7-H3
[0094] O anticorpo contra B7-H3 da invenção pode ser obtido por imunização de um animal com B7-H3 ou um polipeptídeo arbitrário se-lecionado da sequência de aminoácido de B7-H3, e coletando e purifi-cando o anticorpo produzido in vivo de acordo com um procedimento comum. As espécies biológicas de B7-H3 a serem usadas como um antígeno não estão limitadas a ser humano, e um animal pode ser imunizado com B7-H3 derivado de um animal que não humano, tal como um camundongo ou um rato. Neste caso, examinando a reativi- dade cruzada entre um anticorpo ligando-se à B7-H3 heteróloga obtida e B7-H3 humana, um anticorpo aplicável a uma doença humana pode ser selecionado.
[0095] Além disso, um anticorpo monoclonal pode ser obtido de um hibridoma estabelecido fundindo-se células produtoras de anticorpo que produzem um anticorpo contra B7-H3 com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).
[0096] B7-H3 a ser usada como um antígeno pode ser obtida ex pressando o gene B7-H3 em uma célula hospedeira usando engenharia genética.
[0097] Especificamente, um vetor capaz de expressar o gene B7- H3 é produzido, e o vetor resultante é transfectado em uma célula hospedeira para expressar o gene, e em seguida, o B7-H3 expresso é purificado. A seguir, um método de obtenção de um anticorpo contra B7-H3 é especificamente descrito. Preparação de antígeno
[0098] Exemplos do antígeno a ser usado para produzir o anticorpo anti-B7-H3 incluem B7-H3, um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido parcial compreendendo pelo menos 6 ami- noácidos consecutivos de B7-H3, e um derivado obtido adicionando-se uma determinada sequência de aminoácido ou veículo a ele.
[0099] B7-H3 pode ser purificado diretamente de tecidos de tumor humano ou células de tumor e usado. Além disso, B7-H3 pode ser obtido sintetizando-o in vitro ou produzindo-o em uma célula hospedeira por engenharia genética.
[00100] Com respeito à engenharia genética, especificamente, após o cDNA de B7-H3 ser integrado em um vetor capaz de expressar o cDNA de B7-H3, B7-H3 pode ser obtido sintetizando-o em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para a transcrição e translação, ou expressando B7-H3 em outra célula hospedeira transformada procariótica ou eucariótica.
[00101] Além disso, o antígeno pode também ser obtido como uma proteína secretória expressando uma proteína de fusão obtida ligando o domínio extracelular de B7-H3, que é uma proteína de membrana, a uma região contante de um anticorpo em um sistema vetor-hospedeiro apropriado.
[00102] O cDNA de B7-H3 pode ser obtido, por exemplo, por um método assim chamado método de PCR, em que uma reação de cadeia de polimerase (doravante citada como "PCR") é realizada usando uma biblioteca de cDNA expressando cDNA de B7-H3 como um padrão e iniciadores que especificamente aplificam o cDNA de B7-H3 (ver Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).
[00103] Como a síntese in vitro do polipeptídeo, por exemplo, Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc. pode ser exemplificado, porém não está limitado a ele.
[00104] Exemplos das células hospedeiras procarióticas incluem Escherichia coli e Bacillus subtilis. A fim de transformar as células hospedeiras com um gene alvo, as células hospedeiras são transfor-madas por um vetor plasmídeo compreendendo um réplicon, isto é, um derivado de origem de replicação de uma espécie compatível com o hospedeiro, e uma sequência regulatória. Além disso, o vetor prefe-rivelmente tem uma sequência capaz de impor seletividade fenotípica sobre a célula transformada.
[00105] Exemplos de células hospedeiras eucarióticas incluem célu- las de vertebrado, células de inseto, e células de levedura. Como as células de vertebrado, por exemplo, células COS de símios (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos muri- nos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e linhagens deficientes de di- hidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células de ovário de hamster chinês (Células CHO; ATCC: CCL-61); e similares são freqüentemente usados, entretanto, as células não estão limitadas a elas.
[00106] O transformante desse modo obtido pode ser cultivado de acordo com um procedimento comum, e pelo cultivo do transformante, um polipeptídeo alvo é produzido intracelularmente ou extracelular- mente.
[00107] Um meio adequado a ser usado para a cultura pode ser se-lecionado de vários meios de cultura comumente usados, dependendo das células hospedeiras empregadas. Se a Escherichia coli for empre-gada, por exemplo, um meio LB suplementado com um antibiótico, tal como ampicilina ou IPMG, quando necessário, pode ser usado.
[00108] Uma proteína recombinante produzida intracelularmente ou extracelularmente pelo transformante através de tal cultura pode ser separada e purificada por qualquer de vários métodos de separação conhecidos utilizando a propriedade física ou química da proteí- na.Exemplos específicos dos métodos incluem o tratamento com um precipitante de proteína comum, ultrafiltração, vários tipos de cromato- grafia líquida, tais como cromatografia de peneira molecular (filtração de gel), cromatografia por adsorção, cromatografia por permuta de íon, e cromatografia por afinidade, diálise, e uma combinação dos mesmos.
[00109] Além disso, por ligação de uma etiqueta de seis resíduosde histidina a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de afinidade de níquel. Alternativamente, ligando a região Fc de IgG a uma proteína recombi- nante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de proteína A.
[00110] Combinando-se os métodos acima descritos, uma grande quantidade de um polipeptídeo alvo pode ser facilmente produzida em produção elevada e pureza elevada. (2) Produção de anticorpoo monoclonal anti-B7-H3
[00111] Exemplos do anticorpo específico que se liga a B7-H3 incluem um anticorpo específico monoclonal que se liga a B7-H3, e um método de obtenção do anticorpo é como descrito abaixo.
[00112] A produção de um anticorpo monoclonal geralmente requer as seguintes etapas operacionais de: (a) purificação de um biopolímero a ser usado como um an-tígeno; (b) preparação de células produtoras de anticorpo por imu-nização de um animal por injeção do antígeno, coleção do sangue, ensaio de seu título de anticorpo para determinar quando quando o baço é excisado; (c) preparação de células de mieloma (doravante citada como "mieloma"); (d) fusão das células produtoras de anticorpo com o mielo- ma; (e) avaliação de um grupo de hibridomas produzindo um anticorpo desejado; (f) divisão dos hibridomas em clones celulares individuais (clonagem); (g) opcionalmente, cultivar o hibridoma ou criação de um animal implantado com o hibridoma para produzir uma grande quantidade de um anticorpo monoclonal; (h) exame do anticorpo monoclonal desse modo produzido quanto à atividade biológica e especificidade de ligação, ou ensaio do mesmo quanto às propriedades como um reagente rotulado; e similares.
[00113] Doravante, o método de produção de um anticorpo monoclonal será descrito em detalhes seguindo as etapas acima, entretanto, o método não está limitado a elas, e, por exemplo, células produtoras de anticorpo exceto células de baço e mieloma podem ser usadas. (i) Purificação de antígeno
[00114] Como o antígeno, B7-H3 preparado pelo método como acima descrito ou um peptídeo parcial do mesmo pode ser usado.
[00115] Além disso, uma fração de membrana preparada de células recombinantes expressando B7-H3 ou as células recombinantes ex-pressando as próprias B7-H3, e também um peptídeo parcial da proteína da invenção quimicamente sintetizado por um método conhecido por aqueles versados na técnica pode também ser usado como o antí- geno. (j) Preparação de células produtoras de anticorpo
[00116] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante, tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund ou sulfato de potássio de alumínio e a mistura resultante é usada como um imunógeno para imunizar um animal experimental. Como o animal experimental, qualquer animal usado em um método de produção de hi- bridoma conhecido pode ser usado sem qualquer problema. Especificamente, por exemplo, um camundongo, um rato, uma cabra, uma ovelha, um gado vacum, um cavalo, ou similares, podem ser usados. Entretanto, do ponto de vista de facilidade de disponibilidade de células de mieloma a serem fundidas acom as células produtoras de anticorpo extraídas, um camundongo ou um rato é preferivelmente usado como o animal a ser imunizado.
[00117] Além disso, a linhagem de um camundongo ou um rato a ser usado não é particularmente limitada, e no caso de um camundongo, por exemplo, várias linhagens, tais como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, e 129 e similares podem ser usadas, e no caso de um rato, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer e similares podem ser usados.
[00118] Estes camundongos e ratos são comercialmente disponíveis de criadores / distribuidores de animais experimentais, por exemplo, CLEA Japan, Inc. e Charles River Laboratories Japan, Inc.
[00119] Entre estes, em consideração de compatibilidade de fusão com células de mieloma descritas abaixo, no caso de um camundongo, a linhagem BALB/c, e no caso de um rato, as linhagens Wistar e Low são particularmente preferidas como o animal a ser imunizado.
[00120] Além disso, em consideração de homologia antigênica entre humanos e camundongos, é também preferido usar um camundongo tendo função biológica diminuída para remover auto-anticorpos, isto é, um camundongo com uma doença autoimune.
[00121] A idade de tal camundongo ou rato no momento de imunização é preferivelmente de 5 a 12 semanas de idade, mais preferivelmente 6 a 8 semanas de idade.
[00122] A fim de imunizar um animal com B7-H3 ou um recombi- nante do mesmo, por exemplo, um método conhecido descrito em detalhes, por exemplo, em Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ou similares, pode ser usado.
[00123] Entre estes métodos de imunização, um método específico preferido é, por exemplo, como segue.
[00124] Isto é, primeiro, uma fração de proteína de membrana ser vindo como o antígeno ou células usadas para expressar o antígeno é/são intradermicamente ou intraperitonealmente administradas a um animal.
[00125] Entretanto, a combinação de ambas as rotinas de administração é preferida para aumentar a eficiência de imunização, e quando a administração intradérmica é realizada na primeira metade e a admi-nistração intraperitoneal é realizada na última metade ou apenas na última dosagem, a eficiência de imunização pode ser particularmente aumentada.
[00126] A escala de administração do antígeno varia, dependendo do tipo de animal a ser imunizado, diferença individual ou similares. Entretanto, em general, uma escala de administração em que a frequência de administração do antígeno é de 3 a 6 vezes e o intervalo de dosagem é de 2 a 6 semanas é preferida, e uma escala de administração em que a frequência de administração do antígeno é de 3 a 4 vezes e o intervalo de dosagem é de 2 a 4 semanas é mais preferida.
[00127] Além disso, a dose do antígeno varia dependendo do tipo de animal, diferenças individuais ou similares, entretanto, a dose é ge-ralmente estabelecida em 0,05 a 5 mg, preferivelmente cerca de 0,1 a 0,5 mg.
[00128] Uma imunização de reforço é realizada 1 a 6 semanas, pre-ferivelmente 2 a 4 semanas, mais preferivelmente 2 a 3 semanas após a administração do antígeno como descrito acima.
[00129] A dose do antígeno no momento da realização da imunização de reforço varia dependendo do tipo ou tamanho do animal ou similares, entretanto, no caso de, por exemplo, um camundongo, a dose é geralmente estabelecida em 0,05 a 5 mg, preferivelmente 0,1 a 0,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a 0,2 mg.
[00130] Células de baço ou linfócitos incluindo células produtoras de anticorpo são assepticamente removidas do animal imunizado 1 a 10 dias, preferivelmente 2 a 5 dias, mais preferivelmente 2 a 3 dias após a imunização de reforço. Neste momento, o título de anticorpo é medido, e se um animal tendo um título de anticorpo suficientemente aumentado é usado como uma fonte de suprimento das células produtoras de anticorpo, o procedimento subseqüente pode ser realizado mais eficientemente.
[00131] Exemplos do método de medição do título de anticorpo a ser usado aqui incluem um método RIA e um método ELISA, porém o método não está limitado a eles.
[00132] Por exemplo, se um método ELISA é empregado, a medição do título de anticorpo na invenção pode ser realizada de acordo com os procedimentos como descrito abaixo.
[00133] Primeiramente, um antígeno purificado ou parcialmente purificado é adsorvido à superfície de uma fase sólida tal como uma placa de 96 cavidades para ELISA, e a superfície da fase sólida não tendo nenhum antígeno adsorvido a ela é coberta com uma proteína não relacionada ao antígeno, tal como albumina de soro bovino (doravante citada como "BSA"). Após lavar a superfície, a superfície é trazida em contato com uma amostra serialmente diluída (por exemplo, soro de camundongo) como um anticorpo primário para permitir o anticorpo na amostra ligar-se ao antígeno.
[00134] Além disso, como um anticorpo secundário, um anticorpo rotulado com uma enzima contra um anticorpo de camundongo é adi-cionado e é permitido ligar-se ao anticorpo de camundongo. Após la-vagem, um substrato para a enzima é adicionado e uma mudança em absorvência que ocorre devido ao desenvolvimento da cor induzido por degradação do substrate ou similares, é medida e o título de anticorpo é calculado com base na medição.
[00135] A separação das células produtoras de anticorpo das células de baço ou linfócitos do animal imunizado pode ser realizada de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por exemplo, no caso de células de baço, um método geral em que as células produtoras de anticorpo são separadas por homogeneização do baço para obter as células por meio de filtração com uma malha de aço inoxidável e suspendendo as células em Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) pode ser empregado. (k) Preparação de células de mieloma (doravante citada como "mi-eloma")
[00136] As células de mieloma a serem usadas para fusão celular não estão particularmente limitadas e células adequadas podem ser selecionadas de linhagens celulares conhecidas. Entretanto, em con-sideração de conveniência quando um hibridoma é selecionado de cé-lulas fundidas, é preferido usar uma linhagem deficiente de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase) cujo procedimento de seleção foi estabelecido.
[00137] Mais especificamente, exemplos da linhagem deficiente de HGPRT incluem X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63- Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8,653(X63,653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11- 45,6TG1,7(45,6TG), FO, S149/5XXO, e BU,1 derivados de camundon-gos; 210.RSY3.Ag,1,2,3(Y3) derivados de ratos; e U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) e 8226AR/NIP4-1(NP41) derivados de humanos. Estas linhagens defici-entes de HGPRT estão disponíveis de, por exemplo, a American Type Culture Collection (ATCC) ou similares.
[00138] Estas linhagens celulares são subcultivadas em um meio apropriado, tal como um meio de 8-azaguanina [um meio obtido adici-onando-se 8-azaguanina a um meio de RPMI 1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, e soro de bezerro fetal (do- ravante citado como "FCS")], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (doravante citado como "IMDM"), ou Dulbecco's Modified Eagle Medium (doravante citado como "DMEM"). Neste caso, 3 a 4 dias antes da realização da fusão celular, as células são subcultivadas em um meio normal [por exemplo, um meio de ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) contendo FCS a 10X] para garantir não menos do que 2 x 107 células no dia de fusão celular. (l) Fusão celular
[00139] Fusão entre as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma pode ser apropriadamente realizada de acordo com um método conhecido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), sob condições tais que a taxa de sobrevivência de células não é excessivamente reduzida.
[00140] Como tal método, por exemplo, um método químico em que as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma são misturadas em uma solução contendo um polímero, tal como polietileno gli- col em uma alta concentração, um método físico usando estimulação elétrica, ou similares, pode ser usado. Entre estes métodos, um exemplo específico do método químico é como descrito abaixo.
[00141] Isto é, no caso onde o polietileno glicol é usado na solução contendo um polímero em uma alta concentração, as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma são misturadas em uma solução de polietileno glicol tendo um peso molecular de 1500 a 6000, mais preferivelmente 2000 a 4000 em uma temperatura de 30 a 40°C, preferivelmente de 35 a 38°C durante 1 a 10 minutos, preferivelmente 5 a 8 minutos. (m) Seleção de um grupo de hibridomas
[00142] O método de seleção de hibridomas obtido pela fusão celu lar acima descrita não é particularmente limitado. Geralmente, um mé-todo de seleção de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) é usado.
[00143] Este método é efetivo quando hibridomas são obtidos usando as células de mieloma de uma linhagem deficiente de HGPRT que não pode sobreviver na presença de aminopterina.
[00144] Isto é, por cultura de células não fundidas e hibridomas em um meio de HAT, apenas hibridomas resistentes à aminopterina são seletivamente deixados sobreviver e proliferar. (n) Divisão em clone cellular individual (clonagem)
[00145] Como um método de clonagem para hibridomas, um método conhecido, tal como um método de metilcelulose, um método de agarose suave, ou um método de diluição limitante pode ser usado (ver, por exemplo, Barbara, B. M. e Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman e Company, San Francisco (1980)). Entre estes métodos, particularmente, um método de cultura tridimensional tal como um método de metilcelulose é preferido. Por exemplo, o grupo de hibridomas produzidos por fusão celular é suspenso em um meio de metilcelulose tal como ClonaCell-HY Selection Medium D (fabricado por StemCell Technologies, inc., #03804) e cultivado. Em seguida, as colônias de hibridoma formadas são colhidas, por meio das quais os hibridomas monoclonais podem ser obtidos. As colônias de hibridoma respectivas colhidas são cultivadas, e um hibri- doma que foi confirmado ter um título de anticorpo estável em um so- brenadante de cultura de hibridoma obtido é selecionado como uma linhagem de hibridoma de produção de anticorpo monoclonal de B7- H3.
[00146] Exemplos da linhagem de hibridoma desse modo estabelecida incluem o hibridoma M30 de B7-H3. Nesta especificação, um an ticorpo produzido pelo hibridoma M30 de B7-H3 é citado como "anticorpo M30 " ou simplesmente "M30".
[00147] A cadeia pesada do anticorpo M30 tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 20 na Listagem de Sequência. Além disso, a cadeia leve do anticorpo M30 tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 21 na Listagem de Sequência. Na cadeia pesada a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 20 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 19 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 142 a 471 é uma região constante. Além disso, na sequência de aminoácido de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 21 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 22 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 23 a 130 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 131 a 235 é uma região constante. (o) Preparação de anticorpo monoclonal por cultura de hibridoma
[00148] Por cultura do hibridoma desse modo selecionado, um anticorpo monoclonal pode ser eficientemente obtido. Entretanto, antes da cultura, é preferido realizar a avaliação de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal alvo.
[00149] Em tal avaliação, um método conhecido pode ser empregado.
[00150] A medição do título de anticorpo na invenção pode ser realizada, por exemplo, por um método ELISA explicado no item (b) descrito acima.
[00151] O hibridoma obtido pelo método descrito acima pode ser armazenado em um estado congelado em nitrogênio líquido ou em um congelador a -80°C ou abaixo.
[00152] Após conclusão de clonagem, o meio é mudado de um meio de HT para um meio normal, e o hibridoma é cultivado.
[00153] Cultura em larga escala é realizada por rotação da cultura usando um grande frasco de cultura ou por cultura rotatória. A partir do sobrenadante obtido pela cultura em larga escala, um anticorpo mono-clonal que especificamente liga-se à proteína da invenção pode ser obtido por purificação usando um método conhecido por aqueles ver-sados na técnica tal como filtração de gel.
[00154] Além disso, o hibridoma é injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma linhagem como o hibridoma (por exemplo, o acima descrito BALB/c) ou um camundongo Nu/Nu para proliferar o hibridoma, por meio do qual os ascites contendo uma grande quantidade do anticorpo monoclonal da invenção pode ser obtida.
[00155] No caso onde o hibridoma é administrado na cavidade abdominal, se um óleo mineral, tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano) for administrado 3 a 7 dias antes a ele, uma maior quantidade dos ascites pode ser obtida.
[00156] Por exemplo, um imunossupressor é previamente injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma linhagem do hibridoma para inativar células T. 20 dias depois disso, 106 a 107 células de clone de hibridoma são suspensas em um meio livre de soro (0,5 ml), e a suspensão é administrada na cavidade abdominal do camundongo. Em geral, quando o abdômen é expandido e enchido com o ascite, o ascite é coletado do camundongo. Por este método, o anticorpo monoclonal pode ser obtido em uma concentração que é cerca de 100 vezes ou muito maior do que aquela na solução de cultura.
[00157] O anticorpo monoclonal obtido pelo método acima descrito pode ser purificado por um método descrito, por exemplo, em Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Sci-entific Publications, Oxford (1978).
[00158] O anticorpo monoclonal desse modo obtido tem alta especi-ficidade de antígeno para B7-H3. (p) Ensaio de anticorpo monoclonal
[00159] O isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal desse modo obtido podem ser determinados como segue.
[00160] Primeiramente, exemplos do Método de identificação incluem um método Ouchterlony, um método ELISA, e um método RIA.
[00161] Um Método Ouchterlony é simples, porém quando a con-centração do anticorpo monoclonal é baixa, uma operação de conden-sação é requerida.
[00162] Por outro lado, quando um método ELISA ou um método RIA é usado, diretamente reagindo o sobrenadante de cultura com uma fase sólida adsorvida pelo antígeno e usando anticorpos correspondentes a vários tipos de isótipos de imunoglobulina e subclasses como anticorpos secundários, o isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal podem ser identificados.
[00163] Além disso, como um método mais simples, um kit de iden-tificação comercialmente disponível (por exemplo, Mouse Typer Kit fabricada por Bio-Rad Laboratories, Inc.) ou similares, pode também ser usado.
[00164] Além disso, a determinação quantitativa da proteína pode ser realizada pelo método Folin Lowry e um método de cálculo com base na absorvência a 280 nm [1,4 (OD 280) = Imunoglobulina 1 mg/ml].
[00165] Além disso, mesmo quando o anticorpo monoclonal é sepa-radamente e independentemente obtido realizando novamente as etapas de (a) a (h) em (2), é possível obter um anticorpo tendo a atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo M30. Como um exemplo de tal anticorpo, um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo do anticproo M30 pode ser exemplificado. O M30 reconhece um epítopo no domínio lgC1 ou lgC2, que é um domínio no domínio extracelular B7-H3, e ligase ao domínio lgC1 ou o domínio lgC2 ou ambos. Portanto, como o epítopo para o anticorpo da invenção, particularmente, um epítopo presente no domínio lgC1 ou lgC2 de B7-H3 pode ser exemplificado. Se um anticorpo monoclonal recentemente produzido liga um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial àquela a qual o anticorpo M30 liga-se, pode ser determinado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epítopo do anticorpo M30. Além disso, confirmando que o anticorpo monoclonal compete com o anticorpo M30 ao qual se liga a B7- H3 (isto é, o anticorpo monoclonal inibé a ligação entre o anticorpo M30 e B7-H3), pode ser determinado que o anticorpo monoclonal ligase ao mesmo epítopo do anticorpo M30 mesmo se a estrutura ou sequência de epítopo específica não foi determinada. Quando é confirmado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epítopo do anticorpo M30, o anticorpo monoclonal é fortemente esperado que tenha uma atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo M30. (3) Outros anticorpos
[00166] O anticorpo da invenção inclui não somente o anticorpo monoclonal acima descrito contra B7-H3, porém também um anticorpo recombinante obtido por modificação artificial para o propósito de diminuir a antigenicidade heteróloga para humanos, tais como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Estes anticorpos podem ser produzidos usando um método conhecido.
[00167] Como o anticorpo quimérico, um anticorpo no qual regiões variáveis e constantes do anticorpo são derivadas de diferentes espécies, por exemplo, um anticorpo quimérico, no qual uma região variável de anticorpo derivado de camundongo ou de rato é conectada a uma região constante de anticorpo derivado de humano, pode ser exemplificado (ver Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,6851-6855, (1984)).
[00168] Como o anticorpo humanizado, um anticorpo obtido integrando apenas uma região de determinação de complementariedade (CDR) em um anticorpo derivado de humano (ver Nature (1986) 321, pp. 522-525), e um anticorpo obtido enxertando uma parte dos resíduos de aminoácido da estrutura, bem como a sequência de CDR a um anticorpo humano por um método de enxerto de CDR (WO 90/07861) pode ser exemplificado.
[00169] Entretanto, o anticorpo humanizado derivado do anticorpo M30 não está limitada a um anticorpo humanizado específico contanto que o anticorpo humanizado tenha todos os 6 tipos de sequências de CDR do anticorpo M30 e tenha uma atividade antitumor. A região variável de cadeia pesada do anticorpo M30 tem CDRH1 (NYVMH) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequência, e CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 5 na Listagem de Sequência. Além disso, a região variável de cadeia leve do anticorpo M30 tem CDRL1 (RASSRLIYMH) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6 na Listagem de Sequência, CDRL2 (ATSNLAS) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 7 na Listagem de Sequência, e CDRL3 (QQWNSNPPT) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequência.
[00170] Como um exemplo do humanizado anticorpo de um anticorpo de camundongo M30, uma combinação arbitrária de uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesada consistin do em qualquer um de (1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9, 10, 11, ou 12 na Listagem de Sequência, (2) uma sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácido (1) descrita above, e (3) uma sequência de aminoácido em que um ou diversos aminoácidos na sequência de aminoácido (1) descrita acima são deletados, substituídos ou adicionados e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em qualquer um de (4) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 na Listagem de Sequência, (5) uma sequência de aminoáci- do tendo uma homologia de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácido (4) descrita acima, e (6) uma sequência de aminoá- cido em que um ou diversos aminoácidos na sequência de aminoácido (4) descrita acima são deletados, substituídos ou adicionados pode ser exemplificada.
[00171] O termo "diversos" como usado aqui se refere a 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, ou 1 ou 2.
[00172] Como a substituição de aminoácido nesta especificação, uma substituição de aminoácido conservativa é preferida. A substituição de aminoácido conservativa refere-se a uma substituição que ocorre dentro de um grupo de aminoácidos relacionados às cadeias laterais de aminoácido. Grupos de aminoácido preferidos são como segue: um grupo acídico (ácido aspártico e ácido glutâmico); um grupo básico (lisina, arginina, e histidina); um grupo não polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, e triptofano); e uma família polar não carregada (glicina, asparagina, glutamina, ciste- ína, serina, treonina, e tirosina). Grupos de aminoácido mais preferidos são como segue: um grupo hidróxi alifático (serina e treonina); um grupo contendo amida (asparagina e glutamina); um grupo alifático (alanina, valina, leucina, e isoleucina); e um grupo aromático (fenilala- nina, triptofano, e tirosina). Tal substituição de aminoácido é preferi-velmente realizada dentro de uma faixa que não prejudica as proprie-dades de uma substance tendo a sequência de aminoácido original.
[00173] Como um anticorpo que tem uma combinação preferida de uma combinação preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de ami- noácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em a cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 15; um anticorpo consistindo em a cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 16; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 17; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de ami- noácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 19; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 15; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve com-preendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado.
[00174] Além disso, como um anticorpo que tem uma combinação mais preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 15; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 16; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada con-sistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de amino- ácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 17; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de amino- ácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 19; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de ami- noácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoá- cido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 15; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado.
[00175] Além disso, como um anticorpo que tem outra combinação mais preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma se-quência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 17; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve con-sistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; um an-ticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma se quência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado.
[00176] Combinando-se uma sequência tendo uma alta homologia com a sequência de aminoácido de cadeia pesada acima descrita com uma sequência tendo uma alta homologia com a sequência de amino- ácido de cadeia leve acima descrita, é possível selecionar um anticorpo tendo a atividade citotóxica equivalente àquela de cada dos anticorpos acima descritos. Tal homologia é geralmente uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente uma homologia de 90% ou mais, mais preferivelmente uma homologia de 95% ou mais, mais preferivelmente uma homologia de 99% ou mais. Além disso, combinando-se uma sequência de aminoácido em que um a diversos resíduos de aminoácido são substituídos, deletados ou adicionados na sequência de aminoácido de cadeia pesada ou cadeia leve, é também possível selecionar um anticorpo tendo uma atividade citotóxica equivalente àquela de cada um dos anticorpos acima descritos.
[00177] A homologia entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando parâmetros padrões de algoritmo Blast versão 2,2,2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). O algoritmo Blast pode ser usado também através da Internet acessando o site www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[00178] Na sequência de aminoácido de cadeia pesada representada por SEQ ID NO: 9, 10, 11 ou 12 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 19 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 142 a 471 é uma região constante. As sequências de SEQ ID NO: 9, 10, 11 e 12 são mostradas nas Figs. 3, 4, 5 e 6 respectivamente.
[00179] Além disso, na sequência de aminoácido de cadeia leve representada por SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 20 é uma sequência sinal, uma sequência de ami- noácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 129 a 233 é uma região constante. As sequências de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 são mostradas na figura 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13 respectivamente.
[00180] Além disso, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo humano que se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo M30. Um anticorpo humano anti-B7-H3 refere-se a um anticorpo humano tendo apenas uma sequência de um anticorpo derivado de um cromossoma humano. O anticorpo humano anti-B7-H3 pode ser obtido por um método usando um camundongo produtor de anticorpo humano, tendo um fragmento de cromossoma humano compreendendo genes de cadeia leve e pesada de um anticorpo humano (ver Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic e Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e lijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).
[00181] Tal camundongo produtor de anticorpo humano pode ser criado especificamente como segue. Um animal geneticamente modifi-cado em que locos de gene de cadeia leve e pesada de imunoglobulina endógena foram rompidos, e em vez disso, locos de gene de cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana foram introduzidos por meio de um vetor de cromossoma artificial de levedura (YAC) ou similares, é criado produzindo um animal nocaute e um animal transgênico e acasalando estes animais.
[00182] Além disso, de acordo com uma técnica de DNA recombi- nante, usando cDNAs codificando cada de tal cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano, e preferivelmente um vetor compreendendo tais cDNAs, células eucarióticas são transformadas, e uma célula transformante que produz um anticorpo humano monoclonal re- combinante é cultivada, por meio da qual o anticorpo pode também ser obtido a partir do sobrenandante de cultura.
[00183] Aqui, como o hospedeiro, por exemplo, células eucarióticas, preferivelmente células mamíferas tais como células CHO, linfócitos, ou células de mieloma podem ser usadas.
[00184] Além disso, um método de obtenção de um anticorpo humano derivado de exibição de fago selecionado de uma biblioteca de anticorpo humano (ver Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.) é também conhecido.
[00185] Por exemplo, um método de exibição de fago em que uma região variável de um anticorpo humano é expressa sobre a superfície de um fago como um anticorpo de cadeia simples (scFv), e um fago que se liga a um antígeno é selecionado (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) pode ser usado.
[00186] Analisando o gene do fago selecionado com base na liga ção a um antígeno, uma sequência de DNA codificando a região variável de um anticorpo humano que se liga a um antígeno pode ser de-terminada.
[00187] Se a sequência de DNA de scFv que se liga a um antígeno é determinada, um anticorpo humano pode ser obtido preparando-se um vetor de expressão compreendendo a sequência e introduzindo o vetor em um hospedeiro apropriado para expressá-lo (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
[00188] Se um anticorpo humano recentemente produzido liga-se a um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial à qual o anticorpo M30 liga-se, pode ser determinado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo M30. Além disso, confirmando que o anticorpo humano competes com o anticorpo M30 para o que se liga a B7-H3 (isto é, o anticorpo humano inibe a ligação entre o anticorpo M30 e B7-H3), pode ser determinado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo M30 mesmo se a estrutura ou sequência de epítopo específica não foi determinada. Quando é confirmado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo M30, o anticorpo humano é fortemente acreditado ter uma atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo M30.
[00189] Os anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, ou an-ticorpos humanos obtidos pelo método acima descrito são avaliados quanto a propriedade de ligação a um antígeno por um método conhecido ou similar, e um anticorpo pode ser selecionado.
[00190] Como um exemplo de outro índice para uso na comparação das propriedades de anticorpos, a estabilidade de anticorpos pode ser exemplificada. A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é um dis-positivo capaz de rapidamente e precisamente medir uma temperatura de ponto médio de desnaturação térmica (Tm) a ser usada como um índice favorável da estabilidade conformacional relativa de proteínas. Medindo-se os valores Tm usando DSC e comparando-se os valores, uma diferença em estabilidade térmica pode ser comparada. É conhecido que a estabilidade de armazenagem de anticorpos mostra alguma correlação com a estabilidade térmica de anticorpos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265273), e um anticorpo preferido pode ser selecionado usando a estabilidade térmica como um índice. Exemplos de outros índices para seleção de anticorpos incluem os seguintes aspectos: a produção em uma célula hospedeira apropriada é elevada; e a agregabilidade em uma solução aquosa é baixa. Por exemplo, um anticorpo que mostra a maior produção nem sempre mostra a maior estabilidade térmica, e, portanto, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para a administração a humanos fazendo avaliação abrangente com base nos índices acima descritos.
[00191] Na invenção, uma variante modificada do anticorpo é também incluída. A variante modificada refere-se a uma variante obtida submetendo-se o anticorpo da invenção à modificação química ou bio-lógica. Exemplos da variante quimicamente modificada incluem variantes quimicamente modificadas ligando-se a uma porção química a um esqueleto de aminoácido, variantes quimicamente modificadas com uma cadeia de carboidrato ligada a N ou ligada a O, etc. Exemplos da variante biologicamente modificada incluem variantes obtidas por modificação pós-translacional (tais como glicosilação ligada a N ou ligada a O, processamento de terminal N ou C, desamidação, isomerização de ácido aspártico, ou oxidação de metionina), e variantes em que um resíduo de metionina foi adicionado à terminação N que é expressa em uma célula hospedeira procariótica.
[00192] Além disso, um anticorpo rotulado a fim de possibilitar a de- tecção ou isolação do anticorpo ou um antígeno da invenção, por exem-plo, um anticorpo rotulado por enzima, um anticorpo rotulado por fluores-cência, e um anticorpo rotulado por afinidade são também incluídos no significado de variante modificada. Tal variante modificada do anticorpo da invenção é útil para melhorar a estabilidade e retenção sanguínea do anticorpo original da invenção, reduzindo a antigenicidade do mesmo, detectando ou isolando tal anticorpo ou antígeno, e assim por diante.
[00193] Além disso, regulando a modificação de um glicano que é ligado ao anticorpo da invenção (glicosilação, desfucosilação, etc.), é possível realçar uma atividade citotóxica celular dependente do anticorpo. Como a técnica para a regulação da modificação de um glicano de anticorpos, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. são conhecidos. Entretanto, a técnica não está limitada a eles. No anticorpo da invenção, um anticorpo, em que a modificação de um glicano é regulada, é também incluído.
[00194] No caso onde um anticorpo é produzido primeiro isolando um gene de anticorpo e em seguida introduzindo o gene em um hospedeiro apropriado, uma combinação de um hospedeiro apropriado e um vetor de expressão apropriado pode ser usada. Exemplos específicos do gene de anticorpo incluem uma combinação de um gene codificando uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo descrita nesta especificação e um gene codificando uma sequência de cadeia leve da mesma. Quando uma célula hospedeira é transformada, é possível inserir o gene de sequência de cadeia pesada e o gene de sequência de cadeia leve no mesmo vetor de expressãor, e também em diferentes vetores de expressão separadamente.
[00195] No caso onde células eucarióticas são usadas como o hos-pedeiro, células animais, células de planta, e microorganismos euca- rióticos podem ser usados. Como as células animais, células mamíferas, por exemplo, células COS de símios (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e linhagens deficientes de di-hidrofolato redu- tase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células de ovário de hamster chinês (Células CHO; ATCC: CCL-61) pode ser exemplificadas.
[00196] No caso onde células procarióticas são usadas, por exemplo, Escherichia coli e Bacillus subtilis podem ser exemplificados.
[00197] Introduzindo-se um gene de anticorpo desejado nestas células por meio de transformação, e cultivando as células desse modo transformadas in vitro, o anticorpo pode ser obtido. No Método de cultura acima descrito, a produção pode algumas vezes variar, dependendo da sequência do anticorpo e, portanto, é possível selecionar um anticorpo que é facilmente produzido como um produto farmacêutico usando a produção como um índice entre os anticorpos tendo uma atividade de ligação equivalente. Portanto, no anticorpo da invenção, um anticorpo obtido por um método de produção de um anticorpo, charac- terizado por incluir uma etapa de cultura da célula hospedeira transformada e uma etapa de coleção de um anticorpo desejado de um produto cultivado obtido na etapa de cultura é também incluída.
[00198] Sabe-se que um resíduo de lisina na terminação carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula mamífera cultivada é deletado (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), e sabe-se também que dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) na terminação carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula mamífera cultivada são deletados e um resíduo de prolina recentemente localizado na terminação carboxila é amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Entretanto, tal deleção e modificação da sequência de cadeia pesada sequence não afeta a afinidade de ligação a antígeno e a função efetora (a ativação de um complemento, a citotoxicidade celular dependente do anticorpo, etc.) do anticorpo. Portanto, na invenção, um anticorpo submetido a tal mo-dificação é também incluído, e uma variante de deleção em que um ou dois aminoácidos foram deletados na terminação carboxila da cadeia pesada, a variante obtida por amidação da variante de deleção (por exemplo, a cadeia pesada em que o resíduo de prolina de terminal carboxila foi amidado), e similares podem ser exemplificadas. O tipo de variante de deleção tendo uma deleção na terminação carboxila da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a invenção não é limitado às variantes acima, contanto que a afinidade de ligação a antígeno e a função efetora sejam conservadas. As duas cadeias pesadas de cons-tituição do anticorpo de acordo com a invenção podem ser de um tipo selecionado do grupo que consiste em uma cadeia pesada de tamanho natural e a variante de deleção acima descrita, ou podem ser de dois tipos em combinação selecionados delas. A relação da quantidade de cada variante de deleção pode ser afetada pelo tipo de células mamíferas cultivadas que produzem o anticorpo de acordo com a invenção e as condições de cultura, entretanto, um caso onde um resíduo de aminoácido na terminação carboxila foi deletado em ambas as cadeias pesadas contidas como componentes principais no anticorpo de acordo com a invenção pode ser exemplificado.
[00199] Como isótipo do anticorpo da invenção, por exemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) pode ser exemplificado, e IgG1 ou IgG2 pode ser exemplificado preferivelmente.
[00200] Como a função do anticorpo, geralmente uma atividade de ligação a antígeno, uma atividade de neutralização da atividade de um antígeno, uma atividade de realce da atividade de um antígeno, uma atividade de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) podem ser exemplificadas. A função do anticorpo da invenção é uma atividade de ligação a B7-H3, preferivelmente uma atividade de fagoci- tose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), mais prefe-rivelmente uma atividade de citotoxicidade (atividade antitumor) para célula de tumor mediada por uma atividade de ADCP. Além disso, o anticorpo da invenção pode ter uma atividade ADCC e/ou uma atividade CDC em adição a uma atividade de ADCP.
[00201] O anticorpo obtido pode ser purificado para homogeneidade. A separação e purificação do anticorpo pode ser realizada empregando-se um método de separação e purificação de proteína convencional. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado apropriadamente selecionando e combinando cromatografia de coluna, filtração por filtro, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese de gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese por focagem isoelé- trica, e similares (Strategies for Proteína Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), porém o método não está limitado a eles.
[00202] Exemplos de tal cromatografia incluem cromatografia por afinidade, cromatografia por permuta de ion, cromatografia hidrofóbica, cromatografia por filtração de gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia por adsorção.
[00203] Tal cromatografia pode ser realizada empregando-se cro-matografia líquida, tal como HPLC ou FPLC.
[00204] Como uma coluna a ser usada em cromatografia por afinidade, uma coluna de proteína A e uma coluna de proteína G podem ser exemplificadas. Por exemplo, como uma coluna usando uma coluna de proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) e similares pode ser exemplificadas.
[00205] Além disso, usando um veículo tendo um antígeno imobilizado nele, o anticorpo pode também ser purificado utilizando a propri- edade de ligação do anticorpo ao antígeno.
Composto de antitumor
[00206] O composto antitumor a ser conjugado ao conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é explicado. O composto anti-tumor não é particularmente limitado se ele for um composto tendo um efeito antitumor e um grupo substituinte ou uma estrutura parcial per-mitindo a conecção a uma estrutura do ligante. Quando uma parte ou o ligante inteiro é clivado em células de tumor, a porção de composto antitumor é liberada para mostrar o efeito antitumor do composto anti-tumor. Quando o ligante é clivado em uma posição de conexão ao fármaco, o composto antitumor é liberado em sua estrutura intrínseca para exibir seu efeito antitumor intrínsico.
[00207] Exemplos do composto antitumor podem incluir doxorubici- na, daunorubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato, agente antitumor com base em platina (cis-platina ou derivados da mesmo), taxol ou derivatives do mesmo, e camptotecina ou derivatives da mesma (agente antitumor descrito na Patente Japonesa Depositada Aberta ao Público No. 6-87746). No conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, exatecano como um derivado de camptotecina (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3- di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona; mostrado na seguinte fórmula) pode ser preferivelmente usado. Fórmula 43
Figure img0043
[00208] Embora tendo um excelente efeito antitumor, exatecano não foi comercializado como um fármaco antitumor. O composto pode ser facilmente obtido por um método conhecido e o grupo amino na posição 1 pode ser preferivelmente usado como a posição de conexão à estrutura do ligante. Além disso, embora o exatecano possa ser também liberado em células de tumor, enquanto parte do ligante está ainda ligado a ela, ele é um excelente composto que exibe um excelente efeito antitumor mesmo em tal caso.
[00209] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco, o número de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo é um fator essencial que tem uma influência sobre a eficácia e segurança. A produção do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada definindo-se a condição de reação incluindo as quantidades de uso de materiais brutos e reagentes para a reação, a fim de ter um número constante de moléculas de fármaco conjugado, uma mistura contendo diferentes números de moléculas de fármaco conjugado é geralmente obtido ao contrário da reação química de um composto de baixo peso molecular. O número de fármacos conjugados em uma molécula de anticorpo é expresso ou especificado pelo valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugado. A menos que especificamente descrito de outro modo como um princípio, o número de moléculas de fármaco conjugado significa um valor médio, exceto em um caso em que ele representa um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um número específico de moléculas de fármaco conjugado que é incluído em uma mistura de conjugado de anticorpo-fármaco tendo diferente número de moléculas de fármaco conjugado. O número de moléculas de exatecano conjugadas a uma molécula de anticorpo é controlável, e como um número médio de moléculas de fármaco conjugado por anticorpo, cerca de 1 a 10 exatecanos podem estar ligados. Preferivelmente, é 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8. Entretanto, uma pessoa versada na técnica pode planejar uma reação para conjugar um número requerido de moléculas de fármaco a uma molécula de anticorpo com base na descrição dos exemplos do presente pedido e pode obter um anticorpo conjugado com um número controlado de moléculas de exatecano.
[00210] Por que o exatecano tem uma estrutura de camptotecina, sabe-se que o equilíbrio muda para uma estrutura com um anel de lactona fechado (anel fechado) em um meio acídico aquoso (por exemplo, pH 3 aproximadamente) porém ele muda para uma estrutura com um anel de lactona aberto (anel aberto) em um meio básico aquoso (por exemplo, pH 10 ou aproximadamente). Um conjugado de fármaco sendo introduzido com um resíduo de exatecano corresponde à estrutura de anel fechado e a estrutura de anel aberto é também acreditada ter o mesmo efeito antitumor e é desnecessário dizer que qualquer uma delas inclui-se no escopo da presente invenção. Estrutura de ligante
[00211] No que diz respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, a estrutura de ligante para conjugar um fármaco antitumor ao anticorpo é explicada. O ligante tem uma estrutura da se-guinte estrutura: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.
[00212] O anticorpo é conectado ao terminal de L1 (terminal oposto à conexão a L2), e o fármaco antitumor é conectado ao terminal de Lc (terminal oposto à conexão a Lb).
[00213] n1 representa um número inteiro de 0 a 6 e é preferivelmente um número inteiro de 1 a 5, e mais preferivelmente 1 a 3. 1. L1
[00214] L1 é uma porção no ligante representado pela seguinte estrutura: - (Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, - C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- No acima, n2 é um número inteiro de 2 a 8, n3 é um número inteiro de 1 a 8, e n4 é um número inteiro de 1 a 8.
[00215] No ligante tendo uma estrutura representada por - (Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- de L1, "-(Succinimid-3-il-N)-" tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 44
Figure img0044
[00216] Posição 3 da estrutura parcial acima é a posição de conexão ao anticorpo. A ligação ao anticorpo na posição 3 é caracterizada ligando-o com formação de tioéter. Por outro lado, o átomo de nitrogênio na posição 1 da porção de estrutura é conectado ao átomo de carbono de metileno que está presente dentro do ligante incluindo a estrutura. Especificamente, -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-L2- é uma estrutura representada pela fórmula a seguir (aqui, "anticorpo-S-" origina-se de um anticorpo). Fórmula 45
Figure img0045
[00217] Na fórmula, n2 é um número inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 2 a 5.
[00218] No ligante tendo uma estrutura representada por -CH2- C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)- de L1, n3 é um número inteiro de 1 a 8, pre-ferivelmente 2 a 6. Este ligante é conectado ao anticorpo no seu átomo de carbono de terminal metileno e tem a seguinte estrutura para conexão por formação de tioéter, como com o ligante anterior (aqui, "anti- corpo-S-" origina-se de um anticorpo).
[00219] Anticorpo-S-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-.
[00220] No ligante tendo uma estrutura representada por -C(=O)- cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1, "-(N-li-3-diminiccuS)-" tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 46
Figure img0046
[00221] Nesta porção de estrutura, o átomo de nitrogênio na posição 1 é conectado ao átomo de carbono de metileno presente na estrutura do ligante contendo esta estrutura. O átomo de carbono na posição 3 é conectado ao átomo de enxofre terminal de -S-(C=20n6- C(=O)- de L2 no ligante. Esta porção -S-(CH20n6-C(=O)- de L2 no ligan- te forma uma estrutura de ligante combinada somente com -C(=O)-cic. Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1 no ligante. No acima, "-cic.Hex (1,4)-" contido no ligante representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno. No ligante, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- é conectado ao anticorpo com ligação de formação de amida em seu carbono de carbonila terminal (aqui, "anticorpo-NH-" origina-se de um anticorpo). Fórmula 47
Figure img0047
[00222] O grupo amino do anticorpo para esta ligação de formação de amida é o grupo amino terminal de uma cadeia lateral de um resíduo de lisina no anticorpo ou um grupo amino no terminal N do anticorpo. Referido ligante de uma estrutura pode conectar-se formando ligação de éster com o grupo hidróxi de um aminoácido no anticorpo exceto tal ligação de amida.
[00223] A porção de estrutura "-cic.Hex(1,4)-" contida em referido ligante pode ser um grupo alquileno cíclico saturado divalente exceto o grupo 1,4-ciclo-hexileno, isto é, um grupo hidrocarboneto saturado cíclico divalente tais como um grupo ciclobutileno, um grupo ciclopenti- leno, um grupo cicloeptaleno, ou um grupo ciclooctaleno, um grupo hidrocarboneto aromático divalente tais como um grupo fenileno ou um grupo naftileno, ou um grupo heterocíclico divalente saturado de 5 ou 6 membros, parcialmente saturado, aromático contendo 1 ou 2 heteroá- tomos. Alternativamente, esta porção pode ser um grupo alquileno divalente tendo 1 a 4 átomos de carbono. A conexão ao grupo divalente pode ocorrer em posições adjacentes ou em posições distantes.
[00224] No ligante tendo uma estrutura representada por -C(=O)- (CH2)n4-C(=O)- como L1, n4 é um número inteiro de 1 a 8, e preferivel-mente 2 a 6. Este ligante é também conectado por ligação de formação de amida em seu grupo carbonila terminal com um grupo amino do anticorpo, como com os ligantees mencionados acima (ver a seguinte fórmula; na estrutura do mesmo, "anticorpo-NH-" origina-se de um anticorpo).
[00225] Anticorpo-NH-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-L2-.
[00226] Exemplos específicos de L1 no ligante podem incluir -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2C(=O)NH-CH2-C(=O)-, - CH2C(=O)NH-CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C(=O)-Aril-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C(=O)-cic.Het-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- - C(=O)-CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. (Arila representa um grupo hidrocarboneto aromático divalente, e cic.Het representa um grupo heterocíclcio cíclico divalente). 2. L2
[00227] L2 é um ligante representado pela seguinte estrutura: -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, ou -S-(CH2)n6-C(=O)-, L2 pode não estar presente, e em um tal caso, L2 é uma ligação simples. No acima, n5 é um número inteiro de 1 a 6, e n6 é um número inteiro de 1 a 6.
[00228] No ligante tendo uma estrutura de -NH-(CH2CH2O)n5-CH2- CH2-C(=O)- como L2, n5 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 2 a 4. Esta porção no ligante é conectada a L1 em seu grupo amino terminal e é conectada a Lp em seu grupo carbonila no outro terminal.
[00229] No ligante tendo uma estrutura de -S-(CH2)n6-C(=O)- como L2, n6 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 2 a 4.
[00230] Exemplos específicos de L2 podem incluir -NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-CJO)-.
[00231] Quando L2 for -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 para ser combinado com isso é -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. Exemplos específicos de -L1-L2- podem incluir -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. 3. Lp
[00232] O ligante Lp é um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos. Especificamente, ele consiste em um resíduo de oli- gopeptídeo em que 2 a 6 aminoácidos são ligados por uma ligação de peptídeo. O ligante Lp é conectado a L2 em seu terminal N e é conectado ao grupo amino de porção de -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- do ligante em seu terminal C. O aminoácido constituindo Lp no ligante não é particularmente limitado, entretanto, exemplos do mesmo incluem um amino- ácido L ou D, preferivelmente um aminoácido L. E, ele pode ser um aminoácido tendo uma estrutura tais como β-alanina, ácido ε- aminocaproico, ou ácido y-aminobutírico além de um a-aminoácido, além disso, ele pode ser um aminoácido de tipo não natural tal como aminoácido N-metilado.
[00233] A sequência de aminoácido de Lp não é particularmente limitada, porém exemplos do aminoácido constituinte incluem fenilala- nina (Phe; F), tirosina (Tyr; Y), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), alanina (Ala; A), valina (Val; V), lisina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), ácido glutâmico (Glu; E), e ácido aspártico (Asp; D). Entre eles, exemplos preferidos incluem fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico. Dependendo do tipo do ami- noácido, o padrão de liberação de fármaco pode ser controlado. O número do aminoácido pode ser entre 2 a 7.
[00234] Exemplos específicos de Lp podem incluir -GGF- -DGGF- -(D-)D-GGF- -EGGF- -GGFG- -SGGF- -KGGF- -DGGFG- -GGFGG- -DDGGFG- -KDGGFG- -GGFGGGF- [no acima, "(D-)D" representa um ácido D-aspártico].
[00235] Particularmente exemplos preferidos de Lp para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem incluir -GGFG-.
[00236] Na estrutura representada por -NH-(CH2)n1- dentro do ligante, n1 é um número inteiro de 0 a 6 e é preferivelmente um número inteiro de 1 a 5, e mais preferivelmente 1 a 3. O grupo amino desta porção é conectado ao terminal C de LP no ligante. 4. La
[00237] O ligante La é representado por qualquer de estruturas - C(=O)-NH-, -NR1-(CH20n7-, e -O- ou é uma ligação simples. No acima, n7 é um número inteiro de 1 a 6, R1 é um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou - (CH2)nE-OH, n8 é um número inteiro de 1 a 4, e n9 é um número inteiro de 1 a 6.
[00238] A estrutura amida -C(=O)-NH- dentro do ligante La é conec- tada a Lb em seu lado de átomo de nitrogênio. Na porção de estrutura de -NR1-(CH2)n7- dentro de La, n7 é um número inteiro de 1 a 6, e pre-ferivelmente 1 a 3. Esta porção é conectada a Lb em seu lado de meti- leno. R1 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono pode ser linear ou ramificado. Exemplos do mesmo podem incluir um grupo metila, um grupo etila, um grupo propila, um grupo isopropila, um grupo butila, um grupo isobutila, um grupo sec-butila, um grupo terc-butila, um grupo pentila, um grupo isopentila, um grupo 2- metilbutila, um grupo neopentila, um grupo 1-etilpropila, um grupo hexila, um grupo isoexila, um grupo 4-metilpentila, um grupo 3- metilpentila, um grupo 2-metilpentila, um grupo 1-metilpentila, um grupo 3,3-dimetilbutila, um grupo 2,2-dimetilbutila, um grupo 1,1- dimetilbutila, um grupo 1,2-dimetilbutila, um grupo 1,3-dimetilbutila, um grupo 2,3-dimetilbutila, e um grupo 2-etilbutila. Deles, um grupo metila ou um grupo etila é preferido. Quando R1 tem uma estrutura representada por -(CH20n8-COOH, n8 é um número inteiro de 1 a 4, e preferivelmente 1 ou 2. Quando R1 tem uma estrutura representada por - (CH2)nE-OH, n9 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 1 ou 2. R1 é preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo etila, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, ou -CH2CH2-OH, e mais preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, ou -CH2COOH. É também preferivelmente um átomo de hidrogênio. A porção La do ligante pode ser -O- ou uma ligação simples. 5. Lb
[00239] O ligante Lb é qualquer de estruturas -CR2(-R3)-, -O-, e - NR4- ou é uma ligação simples. No acima, R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH20na-NH2, -(CH20nb-COOH, ou - (CH20nc-OH, R4 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na é um número inteiro de 0 a 6, nb é um número inteiro de 1 a 4, e nc é um número inteiro de 0 a 4. Quando na ou nc for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro.
[00240] Quando cada de R2 e R3 é um grupo alquila, este grupo alquila é interpretado como definido no grupo alquila de R1. Quando R2 e R3 têm uma estrutura de -(CH20na-NH2, na é um número inteiro de 0 a 6, e preferivelmente 0, ou é 3 a 5. Quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro. Quando R2 e R3 têm uma estrutura de -(CH20nb- COOH, nb é um número inteiro de 1 a 4, e preferivelmente 1 ou 2. Quando R2 e R3 têm uma estrutura de -(CH20nc-OH, nc é um número inteiro de 0 a 4, e preferivelmente 1 ou 2.
[00241] Cada de R2 e R3 é preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo etila, -NH2, -CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2 CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, - CH2OH, ou -CH2CH2-OH, e mais preferivelmente um átomo de hidro-gênio, um grupo metila, -NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, -CH2 CH2-COOH, -CH2OH, ou -CH2CH2-OH. Eles são também preferivelmente átomos de hidrogênio.
[00242] Quando R4 é um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, este grupo alquila é interpretado como definido no grupo alquila de R1. R4 é preferivelmente um átomo de hidrogênio ou um grupo meti- la, e mais preferivelmente um átomo de hidrogênio.
[00243] Exemplos específicos da estrutura representada por -NH- (CH20n1-La-Lb- como o ligante podem incluir - NH-CH2- -NH-CH(-Me)- - NH-C(-Me)2- -NH-CH2-CHMe- - NH-CH(-CH2OH)- - NH-CH(-CH2COOH)- - NH-CH(-CH2CH2COOH)- - NH-CH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2C(-Me)2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2- - NH-CH2CH2NH-CH2CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2@H)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2@H)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2@H)- - NH-CH2CH2CH2C(JO)-NHCH(-CH2COOH)- -NH-CH2CH2CH2C(JO)-NHCH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH(NH2)-.
[00244] Deles, exemplos preferidos do mesmo podem incluir - NH-CH2- - NH-CH2-CH(Me)- - NH-CH(-CH2@H)- - NH-CH(-CH2CH2COOH)- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2C(-Me)2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2@H)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
[00245] Mais exemplos preferidos do mesmo podem incluir - NH-CH2- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
[00246] Outros exemplos preferidos do mesmo podem incluir - NH-(CH2)3-, - NH-CH2-O-CH2-, e - NH-(CH2)2-O-CH2-. 6. Lc
[00247] O ligante Lc é -CH2- ou -C(=O)-. Referido ligante é conectado ao composto antitumor. Lc do ligante é mais preferivelmente - C(=O)-.
[00248] No ligante, o comprimento de cadeia de -NH-(CH2)n1-La-Lb- Lc é preferivelmente um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos, e mais preferivelmente um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.
[00249] No que diz respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, quando ele for transferido para o interior de células de tumor, a porção de ligante é clivada e o derivado de fármaco tendo uma estrutura representada por NH2-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) é liberado para expressar uma ação antitumor. Exemplos do derivado de antitumor exibindo um efeito antitumor por liberação do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção incluem um derivado de antitumor tendo uma porção de estrutura em que a estrutura representada por -NH-(CH20n1-La-Lb- do ligante é ligada com Lc e tem um grupo amino terminal, e os particularmente preferidos incluem os seguintes. NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
[00250] Entretanto, em caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), foi confirmado que, quando a estrutura aminal na molécula for instável, ela novamente sofre uma auto-degradação para liberar o seguinte HO- CH2-C(=O)-(NH-DX). Aqueles compostos podem ser também preferivelmente usados como um intermediário de produção do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção.
[00251] Para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente inven ção em que exatecano é usado como um fármaco, é preferível que a porção de estrutura fármaco-ligante tendo a seguinte estrutura [-L1-L2- Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)] seja conectada a um anticorpo. O número de conjugado médio da porção de fármaco-ligante de estrutura por anticorpo pode ser 1 a 10. Preferivelmente, é 2 a 8, e mais preferi-velmente 3 a 8. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(JO)-(NH-DX)
[00252] Entre eles, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(JO)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(JO)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(JO)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2@-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2@-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(JO)-(NH-DX).
[00253] Os particularmente preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(JO)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2θ-CH2CH2θ-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00254] No que diz respeito à estrutura de ligante para conjugar o anticorpo e um fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco do presente pedido, o preferido ligante pode ser construído conectando preferidas estruturas mostradas para cada parte do ligante explicado acima. Quando para a estrutura de ligante, aqueles com a seguinte estrutura pode ser preferivelmente usado. Entretanto, o terminal esquerdo da estrutura é uma posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito é uma posição de conexão com o fármaco. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
[00255] Entre eles, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00256] Os particularmente preferidos incluem os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-CJO)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. Método de produção
[00257] Em seguida, explicações são dadas para o método repre- sentativo para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou um intermediário de produção do mesmo. Entretanto, os compostos são a seguir descritos com o número de composto mostrado em cada fórmula de reação. Especificamente, eles são referidos como um "composto da fórmula (1)", um "composto (1)", ou similares. Os compostos com números exceto aqueles são também descritos similarmente. 1. Método de produção 1
[00258] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é ligado à estrutura de ligante por meio de tioéter pode ser produzido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 48
Figure img0048
[Na fórmula, AB representa um anticorpo com um grupo sulfidrila, e L1' representa estrutura de ligante de L1 em que o ligante terminal é um grupo maleimidila (fórmula mostrada abaixo) Fórmula 49
Figure img0049
(na fórmula, o átomo de nitrogênio é a posição de conexão) ou o terminal é halogênio, e representa um grupo em que a porção - (Succinimid-3-il-N)- em -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- de L1 é um grupo maleimidila ou um grupo halogen-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- em que terminal metileno em -CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- de L1 é halogenado para formar haloacetamida. Além disso, o -(NH-DX) repre-senta uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 50
Figure img0050
e representa um grupo que é derivado removendo um átomo de hidro-gênio do grupo amino na posição 1 de exatecano. Além disso, o com-posto da fórmula (1) na fórmula de reação acima é descrito como uma estrutura em que uma porção de estrutura de fármaco ao ligante terminal conecta-se a um anticorpo. Entretanto, é somente a descrição dada por uma questão de conveniência, e existem na realidade muitos casos em que uma pluralidade das porções de estrutura são conectadas a uma molécula de anticorpo. O mesmo aplica-se à explicação do método de produção descrito abaixo.]
[00259] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2), que é obtido pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila.
[00260] O anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila pode ser obtido por um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos includem: reagente de Traut é reagido com o grupo amino do anticorpo; S-acetiltioalcanoatos de N-succinimidila são reagidos com o grupo amino do anticorpo seguidos por reação com hidroxilami- na; após reagir com 3-(piridilditio)propionato de N-succinimidila, o anticorpo é reagido com um agente de redução; o anticorpo é reagido com um agente de redução tais como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, e clori- drato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reduzir a ligação de dis- sulfeto em uma parte de articulação no anticorpo para formar um grupo sulfidrila, porém não é limitado a isso.
[00261] Especificamente, usando 0,3 a 3 molares equivalentes de TCEP como um agente de redução por dissulfeto em parte de articula ção no anticorpo e reagindo com o anticorpo em uma solução de tampão contendo um agente de quelação, o anticorpo com dissulfeto par-cialmente ou completamente reduzido em parte de articulação no anti-corpo pode ser obtido. Exemplos do agente de quelação incluem ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA) e ácido pentaacético de dietile- notriamina (DTPA). Isto pode ser usado em concentração de 1 mM a 20 mM. Exemplos do solução de tampão que podem ser usados incluem uma solução de fosfato de sódio, borato de sódio, ou acetato de sódio. Como um exemplo específico, reagindo o anticorpo com TCEP a 4 °C a 37 °C durante 1 a 4 horas, o anticorpo (3a) tendo grupo sulfi- drila parcialmente ou completamente reduzido pode ser obtido.
[00262] Entretanto, realizando a reação para adicionar um grupo sulfidrila a uma porção ligantea de fármaco, a porção ligantea de fár- maco pode ser conjugada por uma ligação de tioéter.
[00263] Em seguida, usando 2 a 20 molares equivalentes do composto (2) pelo anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) em que 2 a 8 moléculas de fármaco são conju-gadas por anticorpo pode ser produzido. Especificamente, é suficiente que a solução contendo o composto (2) dissolvido nela seja adicionada a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. Aqui, exemplos da solução de tampão que podem ser usado incluem solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, e borato de sódio. pH para a reação é 5 a 9, e mais preferivelmente a reação é realizada perto de pH 7. Exemplos do solvente para dissolver o composto (2) incluem um solvente orgânico tais como sulfóxi- do de dimetila (DMSO), formamida de dimetila (DMF), acetamida de dimetila (DMA), e N-metil-2-piridona (NMP). É suficiente que a solução de solvente orgânico contendo o composto (2) dissolvido seja adicionada em 1 a 20% v/v a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. A temperatura de reação é 0 a 37 °C, mais preferivelmente 10 a 25 °C, e o tempo de reação é 0,5 a 2 horas. A reação pode ser terminada desativando a reatividade de composto não reagido (2) com um reagente contendo tiol. Exemplos do reagente contendo tiol incluem cisteína e N-acetil-L-cisteína (NAC). Mais especificamente, 1 a 2 equivalentes molares de NAC são adicionados ao composto (2) usado e, incubando em temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos, a reação pode ser terminada.
[00264] O conjugado de anticorpo-fármaco produzido (1) pode ser submetido a, após concentração, permuta de tampão, purificação, e medição de concentração de anticorpo e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo de acordo com pro-cedimentos comuns descritos abaixo, identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1).
[00265] Procedimento comum A: Concentração de solução aquosa de anticorpo ou conjugado de anticorpo-fármaco
[00266] A um recipiente Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation), uma solução de anticorpo ou conjugado de anticorpo- fármaco foi adicionada e a solução do anticorpo ou conjugado de anti-corpo-fármaco foi concentrada por centrifugação (centrífuga durante 5 a 20 minutos a 2000 G a 3800 G) usando uma centrífuga (Allegra X- 15R, Beckman Coulter, Inc.).
[00267] Procedimento comum B: Medição de concentração de anticorpo
[00268] Usando um detector de UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), medição da concentração de anticorpo foi realizada de acordo com o método definido pelo fabricante. Naquele momento, coe-ficiente de absorção a 280 nm diferente para cada anticorpo foi usado (1,3 mLmg-1cm-1 a 1,8 mLmg-1cm-1).
[00269] Procedimento comum C-1: Permuta de tampão para anticorpo
[00270] Coluna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (10 mM, pH 6,0) (é referido como PBS6,0/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (137 mM) e ácido tetraacéti- co de diamina de etileno (EDTA, 5 mM) de acordo com o método definido pelo manual de instrução do fabricante. Solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL em coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6,0/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Após medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada para 10 mg/mL usando PBS6,0/EDTA.
[00271] Procedimento comum C-2: Permuta de tampão para anticorpo
[00272] Coluna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (50 mM, pH 6,5) (é referido como PBS6,5/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (50 mM) e EDTA (2 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. Solução aquosa do an-ticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL a coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6,5/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Após medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada para 20 mg/mL usando PBS6,5/EDTA.
[00273] Procedimento comum D-1: Purificação de conjugado de an- ticorpo-fármaco
[00274] Coluna NAP-25 foi equilibrada com qualquer tampão selecionado de tampão de fosfato comercialmente disponível (PBS7,4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), tampão de fosfato de sódio (10 mM, pH 6,0; é referido como PBS6,0) contendo cloreto de sódio (137 mM), e tampão de acetato contendo sorbitol (5 %) (10 mM, pH 5,5; é referido como ABS na especificação). Solução aquosa da reação de conjugado de anticorpo-fármaco foi aplicada em uma quantidade de cerca de 1,5 mL à coluna NAP-25, e em seguida eluída com o tampão em uma quantidade definida pelo fabricante para coletar a fração de anticorpo. A fração coletada foi novamente aplicada à coluna NAP-25 e, repetindo 2 a 3 vezes no total o processo de purificação de filtração de gel para eluição com tampão, o conjugado de anticorpo-fármaco excluindo ligante de fármaco não conjugado e um composto de baixo peso molecular (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L- cisteína (NAC), e sulfóxido de dimetila) foi obtido.
[00275] Procedimento comum E: Medição de concentração de anticorpo em conjugado de anticorpo-fármaco e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo.
[00276] A concentração de fármaco conjugada no conjugado de an- ticorpo-fármaco pode ser calculada medindo absorvância de UV de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em dois comprimentos de onda de 280 nm e 370 nm, seguidos por realização do cálculo mostrado abaixo.
[00277] Uma vez que a absorvância total em qualquer comprimento de onda for igual à soma da absorvância de todas as espécies químicas que absorvem luz que estão presentes em um sistema [aditividade de absorvância], quando o coeficiente molar de absorções do anticorpo e o fármaco permanecerem os mesmos antes e após conjugação entre o anticorpo e o fármaco, a concentração de anticorpo e a concentração de fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco são expressas com as seguintes equações. A280 J AD,280 + AA,280 J SD,280CD + SA,280CA Equação (1) A370 J AD,370+ AA,370 J SD,370CD + SA,370CA Equação (2)
[00278] No acima, A280 representa a absorvância de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco a 280 nm, A370 representa a absorvância de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo- fármaco a 370 nm, AA,280 representa a absorvância de um anticorpo a 280 nm, AA,370 representa a absorvância de um anticorpo a 370 nm, AD,280 representa a absorvância de um precursor conjugado a 280 nm, AD,370 representa a absorvância de um precursor conjugado a 370 nm, SA,280 representa o coeficiente molar de absorção de um anticorpo a 280 nm, SA,370 representa o coeficiente molar de absorção de um anticorpo a 370 nm, SD,280 representa o coeficiente molar de absorção de um precursor conjugado a 280 nm, SD,370 representa o coeficiente molar de absorção de um precursor conjugado a 370 nm, CA representa a concentração de anticorpo em um conjugado de anticorpo-fármaco, e CD representa a concentração de fármaco em um conjugado de anticorpo-fármaco.
[00279] Como para SA,280, SA,370, SD,280, e SD,370 no acima, valores an-teriormente preparados (valor estimado com base no cálculo ou valor de medição obtido por medição de UV do composto) são usados. Por exemplo, SA,280 pode ser estimado de uma sequência de aminoácido de um anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Proteína Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). SA,370 é geralmente zero. SD,280 e SD,370 podem ser obtidos com base em lei de Lambert-Beer (Absorvância = concentração molar x coeficiente molar de absorção x comprimento de trilha celular) medindo a absorvância da solução em que o conjugado precursor a ser usado é dissolvido em uma certa concentração molar. Medindo A280 e A370 de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco e resolvendo as equações simultâneas (1) e (2) usando os valores, CA e CD podem ser obtidos. Além disso, dividindo CD por CA, o número médio de fármaco conjugado por anticorpo pode ser obtido.
[00280] O composto representado pela fórmula (2) no método de produção 1 é qualquer composto representado pela fórmula a seguir: Fórmula 51
Figure img0051
[00281] Na fórmula, n1, n2, n3, L2, Lp, La, Lb, e Lc são como já defi nido, e Lc é uma posição de conexão para o fármaco.
[00282] Em um intermediário útil em produzir um tal composto da presente invenção, preferivelmente, n2 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, n5 é um número inteiro de 2 a 4, Lp é GGFG, e -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é uma estrutura parcial de -NH-CH2CH2-C(=O)-, NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-CJO)-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-CJO)-. Halogênio é preferivelmente bromo ou iodo. Exemplos específicos destes compostos podem incluir os seguintes [aqui, (maleimid-N-il) representa um grupo maleimidila (grupo 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-ila)]. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2θ-CH2CH2θ-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(JO)-(NH-DX)
[00283] Na fórmula, X representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo. Todos estes compostos de bromo e iodo podem ser preferivelmente usados como intermediários de produção.
[00284] A fim de garantir uma quantidade do conjugado, uma pluralidade de conjugados obtidos sob condições de produção similares para terem um número equivalente de fármacos (por exemplo, cerca de ± 1) pode ser misturada para preparar novos lotes. Neste caso, o número médio de fármacos cai entre os números médios de fármacos nos conjugados antes da mistura. 2. Método de produção 2
[00285] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é conectado por meio de um grupo amida a um ligante e tendo uma ligação de tioéter dentro do ligante, especificamente, uma estrutura em que -L1-L2- é -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N- li-3-diminiccuS)-S-(CH2)n6-C(=O)-, pode ser também produzida pelo seguinte método. Fórmula 52
Figure img0052
[00286] Na fórmula, AB-L1' representa um grupo que o anticorpo e ligante L1 são conectados e, além disso, o terminal de L1 é convertido em um grupo N-maleimidila. Este grupo especificamente tem uma es-trutura em que -(N-li-3-diminiccuS)- em AB-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N- li-3-diminiccuS)- é convertido em um grupo maleimidila. L2' representa um grupo HS-(CH2)n6-C(=O)- em que o terminal é um grupo mercapto, e AB representa o anticorpo.
[00287] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2a), que é obtido pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3b) que é conectado ao ligante tendo um grupo maleimidila.
[00288] O anticorpo (3b) tendo um grupo maleimidila pode ser também obtido por um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos incluem: um ligante bifuncional, tal como succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), que é capaz de ligar-se a um grupo amino ou um grupo hidroxila e tem um grupo maleimidila que é deixado reagir sobre o grupo amino do ligante para introduzir um grupo maleimidila, porém não é limitado a isso.
[00289] Por exemplo, um composto tendo uma porção reativa por grupo amino e uma porção reativa por grupo tiol ligadas por meio de um ligante pode ser preferivelmente usado. Aqui, a porção reativa por grupo amino pode ser éster ativo, éster de imida, ou similares, e a porção reativa por tiol pode ser maleimidila, haleto de acetila, haleto de alquila, ditiopiridila, ou similares.
[00290] Como um método para construir o ligante com grupo amino ou grupo hidróxi de um aminoácido constituindo o anticorpo, particularmente por meio de uma ligação de amido com o grupo amino, o composto a ser primeiro reagido com o anticorpo pode ser um composto representado pela fórmula a seguir: Q1-L1a-Q2.
[00291] [Na fórmula, Q1 representa (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O- C(=O)-, (3-Sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, RQ-O-C(=N)-, ou O=C=N-, L1a- representa -cic.Hex(1,4)-CH2-, um grupo alquileno tendo 1 a 10 átomos de carbono, um grupo fenileno, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH- C(=O)-(CH2)n4b-, ou -(CH2)n4a-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-, Q2 representa (maleimid-N-ila), um átomo de halogênio, ou -S-S-(2- piridila), RQ representa um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, n4 re-presenta um número inteiro de 1 a 8, n4a representa um número inteiro de 0 a 6, e n4b representa um número inteiro de 1 a 6.]
[00292] No acima, RQ é um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, e mais preferivelmente um grupo metila ou um grupo etila.
[00293] O grupo alquileno de L1a pode ser aqueles tendo 1 a 10 átomos de carbono. O grupo fenileno pode ser qualquer de configurações orto, meta, e para e é mais preferivelmente um grupo para - ou meta-fenileno.
[00294] Exemplos preferidos de L1a podem incluir -cic.Hex(1,4)-CH2- , -(CH2)5-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-, -(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-, - (CH2)5-NH-C(=O)-(CH2)2-, -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -(CH2)10-, -(para-Ph)-, -(meta-Ph)-, -(para-Ph)-CH(-CH3)-, -(CH2)3-(meta-Ph)-, e - (meta-Ph)-NH-C(=O)-CH2-.
[00295] Q1 é preferivelmente (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, Q2 é preferivelmente (maleimid-N-ila), ou -S-S-(2-piridila) pode ser usado quando uma ligação de dissulfeto deve ser formada.
[00296] No acima, (pirrolidina-2,5-diona-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 53
Figure img0053
em que o átomo de nitrogênio como uma posição de conexão, e (3-sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 54
Figure img0054
em que o átomo de nitrogênio é uma posição de conexão, e este ácido sulfônico é capaz de formar um sal de lítio, sal de sódio, ou sal de po-tássio, e preferivelmente sal de sódio, cic.Hex(1,4) representa um grupo 1,4-ciclo-hexileno, (maleimid-N-ila) é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 55
Figure img0055
onde o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, (2-piridila) representa um grupo 2-piridila, (para-Ph) representa um grupo para-fenileno, e (meta-Ph) representa um grupo meta-fenileno.
[00297] Exemplos de um tal composto incluem sulfosuccinimidil-4- (N-maleimidilmetil)ciclo-hexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC), N-succi- nimidil-4-(N-maleimidilmetil)-ciclo-hexano-1-carbóxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster de ácido undecanoico de K-maleimi- dila (KMUA), N-succinimidil éster de ácido butírico de y-maleimidila (GMBS), N-hidroxisuccinéster de imida de ácido caproico de ε-maleimi- dila (EMCS), m-maleimidilbenzoil-N-hidroxisuccinéster de imida (MBS), N-(a-maleimidilacetóxi)-succinéster de imida (AMAS), succinimidil-6- (β-maleimidilpropionamida)hexanoato (SMPH), 4-(p-maleimidilfenil)- butirato de N-succinimidila (SMPB), N-(p-maleimidilfenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), iodoaceta- to de N-succinimidila (SIA), bromoacetato de N-succinimidila (SBA), 3- (bromoacetamida)propionato de N-succinimidila (SBAP), N-succinimi- dil-3-(2-piridoditio)propionato (SPDP), e succinimidiloxicarbonil-α-metil- α-(2-piridilditio)tolueno (SMPT).
[00298] Especificamente, por exemplo, reagindo 2 a 6 equivalentes de SMCC com o anticorpo (3) em um tampão de fosfato de pH 6 a 7 em temperatura ambiente durante 1 a 6 horas, o éster ativo de SMCC pode reagir com o anticorpo para produzir o anticorpo (3b) tendo um grupo maleimidila. O anticorpo obtido (3b) pode ser purificado por procedimento comum D-2 descrito abaixo, e usado para a reação seguinte com o composto (2a).
[00299] Procedimento comum D-2: Purificação de anticorpo derivado de 4-(N-maleimidilmetil)-ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (SMCC).
[00300] Coluna NAP-25 foi equilibrada com PBS6,5/EDTA. A solução de reação contendo o anticorpo derivado de 4-(N-maleimidilmetil)- ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (aqui, referido como SMCC) foi aplicada em uma quantidade de cerca de 0,5 mL à coluna NAP-25, e em seguida eluída com o tampão em uma quantidade definida pelo fabricante para coletar o fração de anticorpo para purificação.
[00301] O grupo amino do anticorpo para conectar-se ao ligante pode ser um grupo amino de terminal N e/ou um grupo amino realizado por um resíduo de lisina, porém não é limitado a isso. Alternativamente, o anti-corpo pode ser conectado ao ligante com formação de ligação de éster por uso de um grupo hidróxi realizado por um resíduo de serina.
[00302] A reação do composto (2a) com o anticorpo (3b) conectado ao ligante tendo um grupo maleimidila pode ser realizada da mesma maneira como o método para reagir o composto (2) com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila como mencionado no Método de produção 1.
[00303] Para o conjugado de anticorpo-fármaco (1) preparado, con centração, permuta de tampão, purificação, e identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1) pela medição de concentração de anticorpo e um número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo podem ser realizados da mesma maneira como Método de produção 1.
[00304] O composto representado pela fórmula (3b) no Método de produção 2 tem a seguinte estrutura (ver a seguinte fórmula; na estrutura do mesmo, "anticorpo -NH-" origina-se de um anticorpo). Fórmula 56
Figure img0056
[00305] Um composto que é um intermediário para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção e tem a estrutura acima é como descrito abaixo (na fórmula, n é um número inteiro de 1 a 10, preferivelmente 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8). Fórmula 57
Figure img0057
[00306] Além disso, exemplos do composto da presente invenção em que o terminal é um grupo mercapto podem incluir os seguintes. HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(JO)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2@-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2@-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) 3. Método de produção 3
[00307] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é conjugado à porção ligantea de fármaco por meio de uma ligação de amido pode ser produzido por um método descrito abaixo. Por exemplo, como para -C(=O)-(CH20n4-C(=O)- de L1, seu éster ativo L1', por exemplo, (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)- (CH20n4-C(=O)-, pode ser preferivelmente usado. Quando L2 for uma ligação simples, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produ-zido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 58
Figure img0058
[00308] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2b), que é obtido pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3).
[00309] O composto (2b) é capaz de conectar ao grupo amino ou grupo hidroxila do anticorpo. O grupo amino e grupo hidroxila do anticorpo refere-se a, como descrito no Método de produção 2, por exemplo, um grupo amino de terminal N realizado pelo anticorpo e/ou um grupo amino realizado por um resíduo de lisina e um grupo hidróxi realizado por um resíduo de serina, respectivamente, porém eles não são limitados a isso.
[00310] O composto (2b) é éster ativo composto de um grupo N- hidroxisuccinimidil éster. Alternativamente, outros éster ativos, por exemplo, um grupo sulfosuccinimidil éster, N-hidroxiftalimidil éster, N- hidroxisulfoftalimidil éster, orto-nitrofenil éster, para-nitrofenil éster, 2,4- dinitrofenil éster, 3-sulfonil-4-nitrofenil éster, 3-carbóxi-4-nitrofenil éster, e pentafluorofenil éster, podem ser usados.
[00311] Usando 2 a 20 equivalentes molares do composto (2b) por anticorpo (3) na reação do composto (2b) com o anticorpo (3), o con-jugado de anticorpo-fármaco (1) em que 1 a 10 moléculas de fármaco são conjugadas por anticorpo pode ser produzido. Especificamente, a solução contendo o composto (2b) dissolvido nela pode ser adicionada a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3) para a reação para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco (1). Aqui, exemplos da so-lução de tampão que podem ser usados incluem solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, e borato de sódio. pH para a reação pode ser 5 a 9, e mais preferivelmente a reação é realizada perto de pH 7. Exemplos do solvente para dissolver o composto (2b) incluem um sol-vente orgânico tais como sulfóxido de dimetila (DMSO), formamida de dimetila (DMF), acetamida de dimetila (DMA), e N-metil-2-piridona (NMP). É suficiente que a solução de solvente orgânico contendo o composto (2b) dissolvido aí seja adicionada a 1 a 20 % v/v a uma so-lução de tampão contendo o anticorpo (3) para a reação. A temperatura de reação é 0 a 37°C, mais preferivelmente 10 a 25°C, e o tempo de reação é 0,5 a 20 horas.
[00312] Para o conjugado de anticorpo-fármaco produzido (1), con-centração, permuta de tampão, purificação, e identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1) pela medição de concentração de anticorpo e um número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo podem ser realizados da mesma maneira como Método de produção 1.
[00313] A porção (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4- C(=O)- no Método de produção 3 tem a seguinte estrutura. Fórmula 59
Figure img0059
[00314] Exemplos do composto da presente invenção tendo a estrutura parcial acima podem incluir os seguintes. (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) 4. Método de produção 4
[00315] O composto representado pela fórmula (2) ou (2b) como um intermediário usado no método de produção anterior e um sal farmaco- logicamente aceitável do mesmo podem ser produzidos pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 60
Figure img0060
[00316] Na fórmula, Lc é -C(=O)- e é conectado a -(NH-DX) com formação de ligação de amida, L1' representa estrutura de L1 em que o terminal é convertido em um grupo maleimidila ou um grupo haloaceti- la, ou em (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, e P1, P2, e P3 cada um representa um grupo de proteção.
[00317] O composto (6) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico (5) em um éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com NH2-DX [indicando exatecano; nome químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9- hidróxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona] (4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo.
[00318] Reagentes de reação e condições que são comumente usados para síntese de peptídeo podem ser empregados para a reação. Existem vários tipos de éster ativo. Por exemplo, ele pode ser produzido reagindo fenois tais como p-nitrofenol, N-hidróxi benzotriazol, N-hidróxi succinimida, ou similares, com o ácido carboxílico (5) usando um agente de condensação tal como N,N'-diciclo- hexilcarbodiimida ou cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbo- diimida. Além disso, o éster ativo pode ser também produzido pela reação do ácido carboxílico (5) com trifluoroacetato de pentafluorofenila ou similares; a reação do ácido carboxílico (5) com hexafluorofosfito de oxitripirrolidinofosfônio de 1-benzotriazolila; a reação do ácido carboxílico (5) com cianofosfonato de dietila (método de dispersão); a reação do ácido carboxílico (5) com trifenilfosfina e dissulfeto de 2,2'-dipiridila (método de Mukaiyama); a reação do ácido carboxílico (5) com um derivado de triazina tais como cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2- il)-4-metilmorfolínio (DMTMM); ou similares. Além disso, a reação pode ser também realizada por, por exemplo, um método de haleto de ácido pelo qual o ácido carboxílico (5) é tratado com haleto de ácido tais como cloreto de tionila e cloreto de oxalila na presença de uma base. Reagindo o éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou haleto de ácido do ácido carboxílico (5) obtidos conformemente com o composto (4) na presença de uma base adequada em um solvente inerte a -78°C a 150°C, o composto (6) pode ser produzido. (Entretanto, " solvente inerte " indica um solvente que não inibe a reação para a qual o solvente é usado.)
[00319] Exemplos específicos da base usada para cada etapa descrita acima incluem carbonato de um metal de álcali ou um metal terroso de álcali, um alcóxido de metal de álcali, hidróxido ou hidreto de um metal de álcali incluindo carbonato de sódio, carbonato de potássio, etóxido de sódio, butóxido de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidreto de sódio, e hidreto de potássio, base organo- metálica representada por um alquil lítio incluindo n-butil lítio, dialqui- lamino lítio incluindo di-isopropilamida de lítio; base organometálica de bissililamina incluindo bis(trimetilsilil)amida de lítio; e base orgânica incluindo piridina, 2,6-lutidina, colidina, 4-dimetilaminopiridina, trietila- mina, N-metil morfolina, di-isopropiletilamina, e diazabiciclo[5,4,0] un- dec-7-eno (DBU).
[00320] Exemplos do solvente inerte que é usado para a reação da presente invenção incluem um solvente de hidrocarboneto halogenado tais como diclorometano, clorofórmio, e tetracloreto de carbono; um solvente de éter tais como tetraidrofurano, 1,2-dimetoxietano, e dioxano; um solvente de hidrocarboneto aromático tais como benzeno e to- lueno; e um solvente de amida tais como N,N-dimetil formamida, N,N- dimetil acetamida, e N-metilpirrolidin-2-ona. Além deles, um solvente de sulfóxido tais como sulfóxido de dimetila e sulfolano; e um solvente de cetona tais como acetona e metil etil cetona pode ser usado dependendo do caso.
[00321] O grupo hidróxi, grupo carbóxi, grupo amino, ou similares, de La e Lb no composto (6) pode ser protegido com um grupo de prote ção que é comumente usado em síntese de composto orgânico, como mencionado mais tarde. Especificamente, exemplos do grupo de pro-teção para um grupo hidroxila incluem um grupo alcoximetila tal como grupo metoximetila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila, grupo 4-metoxibenzila, e grupo trifenilmetila; um grupo alcanoíla tal como grupo acetila; um grupo aroíla tal como grupo benzoíla; e um grupo silila tal como grupo terc-butil difenilsilila. O grupo carbóxi pode ser protegido, por exemplo, como um éster com um grupo alquila tais como grupo metila, grupo etila, e grupo terc-butila, um grupo alila, ou um grupo arilmetila tal como grupo benzila. O grupo amino pode ser protegido com um grupo de proteção para um grupo amino que é geralmente usado para síntese de peptídeo, por exemplo, um grupo alqui- lóxi carbonila tais como grupo terc-butilóxi carbonila, grupo metoxicar- bonila, e grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetila tais como aliloxicar- bonila, grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, grupo benzilóxi carbonila, grupo parametoxibenzilóxi carbonila, e grupo para (ou orto) nitroibenzi- lóxi carbonila; um grupo alcanoíla tal como grupo acetila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila e grupo trifenil metila; um grupo aroí- la tal como grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila tais como grupo 2,4-dinitrobenzeno sulfonila ou grupo ortonitrobenzeno sulfonila. Proteção com e desproteção do grupo de proteção podem ser realizadas de acordo com um método comumente realizado.
[00322] Em relação ao grupo de proteção P1 para o grupo amino terminal do composto (6), um grupo de proteção para um grupo amino que é geralmente usado para síntese de peptídeo, por exemplo, grupo terc-butilóxi carbonila, grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, e grupo benzilóxi carbonila, pode ser usado. Exemplos do outro grupo de proteção para um grupo amino incluem um grupo alcanoíla, tal como, grupo acetila; um grupo alcoxicarbonila tais como grupo metoxicarbonila e grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetóxi carbonila tais como grupo parametoxibenzilóxi carbonila, e grupo para (ou orto)nitroibenzilóxi carbonila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila e grupo trifenil metila; um grupo aroíla tal como grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila tais como grupo 2,4-dinitrobenzeno sulfonila e grupo ortonitroben- zeno sulfonila. O grupo de proteção P1 pode ser selecionado dependendo de, por exemplo, propriedades de um composto tendo um grupo amino a ser protegido.
[00323] Por desproteção do grupo de proteção P1 para o grupo amino terminal do composto (6) obtido, o composto (7) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00324] O composto (9) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico de peptídeo (8) tendo o terminal N protegido com P2 em um éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto (7) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar um ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico de peptídeo (8) e o composto (7) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P2 pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6), e a seleção pode ser feita com base em, por exemplo, as propriedades do composto tendo um grupo amino a ser protegido. Como é geralmente usado para síntese de peptídeo, repetindo seqüencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo constituindo o ácido carbo- xílico de peptídeo (8) para o alongamento, o composto (9) pode ser também produzido.
[00325] Desprotegendo P2 como o grupo de proteção para o grupo amino do composto (9) obtido, o composto (10) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00326] E possível produzir o composto (2) ou (2b) derivatizando o ácido carboxílico (11) ou (11b) em um éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (10) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico (11) ou (11b) e o composto (10) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00327] O composto (9) pode ser também produzido pelo seguinte método, por exemplo.
[00328] O composto (13) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico de peptídeo (8) tendo o terminal N protegido com P2 em éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto de amina (12) tendo o grupo carbóxi protegido com P3 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico de peptídeo (8) e o composto (12) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P2 para o grupo amino do composto (13) pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6). Em relação ao grupo de proteção P3 para um grupo carbóxi, um grupo de proteção comumente usado como um grupo de proteção para um grupo carbóxi em química sintética orgânica, em particular, síntese de peptídeo pode ser usado. Especificamente, ele pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6), por exemplo, ésteres com um grupo alquila, tais como, um grupo metila, um grupo eti- la, ou um terc-butila, alil ésteres, e benzil ésteres. Em tal caso, é necessário que o grupo de proteção para um grupo amino e o grupo de proteção para um grupo carbóxi possam ser removidos por um diferente método ou diferentes condições. Por exemplo, um exemplo repre sentativo inclui uma combinação em que P2 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P3 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser selecionados daqueles supracitados dependendo de, por exemplo, as propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo car- bóxi a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00329] Por desproteção do grupo de proteção P3 para o grupo car- bóxi do composto (13) obtido, o composto (14) pode ser produzido. Reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00330] O composto (9) pode ser produzido derivatizando o composto (14) obtido em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00331] O composto (2) ou (2b) pode ser também produzido pelo seguinte método, por exemplo.
[00332] Por desproteção do grupo de proteção P2 para o grupo amino do composto (13), o composto (15) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00333] O composto (16) ou (16b) pode ser produzido derivatizando o derivado de ácido carboxílico (11) ou (11b) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (15) obtido na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma liga ção de amido entre o ácido carboxílico de peptídeo (11) ou (11b) e o composto (15) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).
[00334] Por desproteção do grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (16) ou (16b) obtido, o composto (17) ou (17b) pode ser produzido. Isto pode ser realizado similar à desproteção do grupo carbóxi para produzir o composto (14).
[00335] O composto (2) ou (2b) pode ser produzido derivatizando o composto (17) ou (17b) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (4) na pre-sença de uma base. Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). 5. Método de produção 5
[00336] O composto representado pela fórmula (2) de um intermediário pode ser também produzido pelo seguinte método. Fórmula 61
Figure img0061
[00337] Na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura em que o terminal é convertido em um grupo maleimidila ou um grupo ha- loacetila, e P4 representa um grupo de proteção.
[00338] O composto (19) pode ser produzido derivatizando o composto (11) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o ácido carboxílico de peptídeo (18) tendo o terminal C protegido com P4 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico de peptídeo (18) e o composto (11) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P4 para o grupo carbóxi do composto (18) pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6).
[00339] Por desproteção do grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (19) obtido, o composto (20) pode ser produzido. Isto pode ser realizado similar à desproteção do grupo carbóxi para produzir o composto (14).
[00340] O composto (2) pode ser produzido derivatizando o composto (20) obtido em éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto (7). Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de pep- tídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). 6. Método de produção 6
[00341] O intermediário de produção (2a) descrito no Método de produção 2 em que L2' corresponde a L2 tendo uma estrutura em que o terminal é convertido em um grupo mercaptoalcanoíla pode ser produzido pelo seguinte método. Fórmula 62
Figure img0062
[00342] O composto (2a) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico (21) tendo um grupo mercapto terminal em éster ativo, ani-drido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto (10). Para a reação, condições e reagentes de reação que são geral-mente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (4).
[00343] Além disso, o composto (23) pode ser produzido derivati- zando o composto (21) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, reagindo-o com o composto (15), e desprotegendo o grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (22) obtido.
[00344] O composto (2a) pode ser produzido derivatizando o composto (23) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). 7. Método de produção 7
[00345] A seguir, o método para produzir o composto (10c) tendo n1 = 1, La = O, e Lb = CR2(-R3) no intermediário de produção (10) descrito no Método de produção 4 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (10c), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 63
Figure img0063
[00346] Na fórmula, Lp, R2, e R3 são como definidos acima, L representa um grupo acetila, um átomo de hidrogênio, ou similares, X e Y cada representa um oligopeptídeo consistindo em 1 a 3 aminoácidos, P5 e P7 cada representa um grupo de proteção para um grupo amino, e P6 representa um grupo de proteção para um grupo carbóxi.
[00347] Um composto representado pela fórmula (24) pode ser produzido usando ou aplicando o método descrito em Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 2002-60351 ou a literatura (J. Org. Chem., Vol. 51, página 3196, 1986), e se necessário, removendo os grupos de proteção ou modificando os grupos funcionais. Alternativamente, pode ser também obtido tratando um aminoácido com um grupo amino terminal protegido ou amida de ácido de oligopeptídeo com grupo amino protegido com aldeído ou cetona.
[00348] Reagindo o composto (24) com o composto (25) tendo um grupo hidroxila em uma temperatura variando de sob resfriamento para temperatura ambiente em um solvente inerte na presença de um ácido ou uma base, o composto (26) pode ser produzido. Exemplos do ácido que podem ser usados incluem ácido inorgânico, tais como, ácido hidrofluórico, ácido hidroclórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e ácido bórico; um ácido orgânico, tais como, ácido acético, ácido cítrico, ácido paratoluenossulfônico, e ácido metanossulfônico; e um ácido de Lewis, tais como, tetrafluoroborato, cloreto de zinco, cloreto de estanho, cloreto de alumínio, e cloreto de feroo. Ácido parato-luenossulfônico é particularmente preferido. Em relação à base a ser usada, qualquer uma das bases supracitadas pode ser adequadamente selecionada e usada. Exemplos preferidos das mesmas incluem um alcóxido de metal de álcali tal como terc-butóxido de potássio, um hi-dróxido de metal de álcali tais como hidróxido de sódio e hidróxido de potássio; hidreto de metal de álcali tais como hidreto de sódio e hidreto de potássio; base organometálica representada por dialquilamino lítio tal como di-isopropilamida de lítio; e base organometálica de bissilila- mina tal como bis(trimetilsilil)amida de lítio. Exemplos do solvente a ser usado para a reação incluem um solvente de éter tais como tetraidro- furano e 1,4-dioxano; e um solvente de hidrocarboneto aromático tais como benzeno e tolueno. Aqueles solventes podem ser preparados como uma mistura com água. Além disso, o grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P5 não é particularmente limitado se ele for um grupo comumente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Entretanto, na presente reação, o grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P5 pode ser clivado. Em tal caso, é necessário realizar a reação com um reagente adequado para proteger um grupo amino como pode ser requerido.
[00349] O composto (27) pode ser produzido removendo o grupo de proteção P6 do composto (26). Aqui, apesar dos exemplos representa- tivos do grupo de proteção para um grupo carbóxi como exemplificado por P6 serem descritos no Método de produção 4, é desejável neste caso que o grupo de proteção P5 para um grupo amino e o grupo de proteção P6 para um grupo carbóxi sejam os grupos de proteção que podem ser removidos por um diferente método ou diferentes condições. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação em que P5 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila e P6 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser selecionados dependendo de, por exemplo, as propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a serem protegidos. Para remoção dos grupos de proteção, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.
[00350] O composto (29) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico (27) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (4) e um sal farma- cologicamente aceitável do mesmo para produzir o composto (28) se-guido por remoção do grupo de proteção P5 do composto (28) obtido. Para a reação entre o composto (4) e o ácido carboxílico (27) e a reação para remover o grupo de proteção P6, os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados.
[00351] O composto (10c) pode ser produzido reagindo o composto (29) com um aminoácido com grupo amino terminal protegido ou o oli- gopeptídeo (30) com grupo amino protegido para produzir o composto (9c) e removendo o grupo de proteção P7 do composto (9c) obtido. O grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P7 não é particularmente limitado se ele for geralmente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos do mesmo incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Para remover o grupo de proteção, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção. Para a reação entre o composto (29) e o composto (30), condições e reagentes de reação que são comumente usados para síntese de peptídeo podem ser empregados. O composto (10c) produzido pelo método supracitado pode ser derivatizado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrito acima. 8. Método de produção 8
[00352] A seguir, o método para produzir o composto (2c) tendo n1 = 1, La = O, e Lb = CR2(-R3) no intermediário de produção (2) descrito no Método de produção 4 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (2c), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 64
Figure img0064
[00353] Na fórmula, L1', L2, LP, R2, e R3 são como definidos acima, Z representa um oligopeptídeo consistindo em 1 a 3 aminoácidos, P8 re-presenta um grupo de proteção para um grupo amino, e P9 representa um grupo de proteção para um grupo carbóxi.
[00354] O composto (33) pode ser produzido removendo o grupo de proteção P8 do aminoácido ou oligopeptídeo (31) com grupo amino terminal protegido e grupo carbóxi para produzir o composto (32) e re-agindo a forma amina obtida (32) com o composto (11). O grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P8 não é parti-cularmente limitado se ele for um grupo comumente usado para a pro-teção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os gru- pos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Além disso, para remover o grupo de proteção P8, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção. Para a reação entre o composto (32) e o ácido carboxílico (11), os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados.
[00355] O intermediário de produção (2c) pode ser produzido removendo o grupo de proteção PE do composto (33) para produzir o composto (34) e reagindo o ácido carboxílico obtido (34) com o composto (2E). Os exemplos representativos do grupo de proteção para um grupo carbóxi como exemplificado por PE são descritos no Método de produção 4. Para a reação de desproteção dos mesmos, os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados. Para a reação entre o composto (2E) e o ácido carboxílico (34), condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados. O composto (2c) produzido pelo método supracitado pode ser derivati- zado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrito acima. E. Método de produção E
[00356] A seguir, o método para produzir o composto (17c) tendo n1 = 1, La = O, e Lb = CR2(-R3) no intermediário de produção (17) descrito no Método de produção 4 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (17c), um sal ou um solvato do mesmo pode ser também produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 65
Figure img0065
Na fórmula, L1', L2, Lp, R2, R3, X, Y, P5, P6, e P7 são como definidos acima.
[00357] O composto (36) pode ser produzido por desproteção do grupo de proteção P5 para o grupo amino do composto (26) com grupo amino terminal protegido e grupo carbóxi para produzir o composto (35) e reagindo a forma de amina obtida (35) com o oligopeptídeo (30) com grupo amino terminal protegido ou grupo amino protegido. O grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P5 não é particularmente limitado se ele for um grupo comumente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Além disso, para remover o grupo de proteção P5, rea-gentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção. Aqui, apesar dos exemplos representativos do grupo de pro-teção para um grupo carbóxi como exemplificado por P6 e o grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P7 incluirem os grupos de proteção para um grupo carbóxi e um grupo amino que são descritos no Método de produção 4, é desejável que o grupo de proteção P6 para um grupo carbóxi e o grupo de proteção P7 para um grupo amino sejam os grupos de proteção que podem ser removidos pelo mesmo método ou mesmas condições. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação em que P6 é um grupo benzil éster e P7 é um grupo benzilóxi carbonila.
[00358] O composto (37) pode ser produzido removendo o grupo de proteção P6 para o grupo carbóxi do composto (36) e o grupo de proteção P7 para o grupo amino do composto (36). O composto (37) pode ser também produzido seqüencialmente removendo o grupo de proteção P6 para o grupo carbóxi e o grupo de proteção P7 para o grupo amino, ou o composto (37) pode ser produzido removendo de uma vêz ambos os grupos de proteção P6 e P7 que podem ser removidos pelo mesmo método ou mesmas condições.
[00359] O composto (17c) pode ser produzido reagindo o composto obtido (37) com o composto (11). Para a reação entre o composto (37) e o composto (11), os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados. No precedente, o composto representado pela fórmula a seguir: Fórmula 66
Figure img0066
é descrito como um intermediário de produção útil para produzir o con-jugado de anticorpo-fármaco da presente invenção. Além disso, um grupo de compostos representados pela fórmula a seguir: Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) são também compostos que servem como intermediários de produção úteis para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente in-venção.
[00360] Especificamente, na fórmula acima, Q é (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2-C(=O)-NH-, ou (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, X é um átomo de bromo ou um átomo de iodo, nQ é um número inteiro de 2 a 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, Lp representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma liga-ção simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 repre-senta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH20n8-COOH, ou -(CH2)nE-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, nE representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, (maleimid-N-il)- é um grupo tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 67
Figure img0067
(na fórmula, o átomo de nitrogênio é a posição de conexão), (pirrolidi- na-2,5-diona-N-il)- é um grupo tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 68
Figure img0068
(na fórmula, o átomo de nitrogênio é a posição de conexão), -(NH-DX) é um grupo tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 69
Figure img0069
(na fórmula, o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão).
[00361] Um composto em que Lc é -C(=O)- é preferido como um intermediário de produção.
[00362] Em relação ao resíduo de peptídeo de Lp, um composto de um resíduo de aminoácido consistindo em um aminoácido selecionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico é preferido como um intermediário de produção. Entre aqueles resíduos de peptídeo, um composto em que Lp é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos é preferido como um intermediário de produção. Mais especificamente, um composto em que Lp é -GGFG- é preferido como um intermediário de produção.
[00363] Além disso, em relação ao -NH-(CH20n1-La-Lb-, um composto de -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é pre-ferido como um intermediário de produção. Um composto de NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)- é mais preferido.
[00364] Em relação ao nQ, um composto em que ele é um número inteiro de 2 a 6 é preferido como um intermediário de produção.
[00365] Um composto em que L2a é uma ligação simples ou n5 é um número inteiro de 2 a 4 é preferido como um intermediário de produção.
[00366] Quando Q for (maleimid-N-il)-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1- La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é pre-ferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH- (CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido. Um composto em que nQ é um número inteiro de 2 ou 5 é também preferido.
[00367] Além disso, quando Q for (maleimid-N-il)-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2- CH2-CJO)-, n5 é um número inteiro de 2 a 4, e -NH-(CH20n1-La-Lb- é - NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2 CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que n5 é um número inteiro de 2 ou 4 é mais preferido. Um composto em que -NH- (CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2- O-CH2- é também preferido.
[00368] Quando Q for HS-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH- CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2 CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La- Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido.
[00369] Quando Q for X-CH2-C(=O)-NH-, um composto em que X é um átomo de bromo é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 8 é preferido, também um composto em que L2a é uma ligação simples é preferido, e um composto em que -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção.
[00370] Quando Q for (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou - NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido.
[00371] Mais especificamente, os seguintes são compostos preferido como intermediários de produção. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) Br-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
[00372] Entretanto, o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, quando é deixado no ar ou recristalizado, pode absorver umidade para ter água de adsorção ou transformar um hidrato, e um tal composto e um sal contendo água são também incluídos na presente invenção.
[00373] Um composto rotulado com vários isótopos radioativos ou não radioativos é também incluído na presente invenção. Um ou mais átomos constituindo o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem conter um isótopo atômico em relação não natural. Exemplos do isótopo atômico incluem deutério (2H), trítio (3H), iodo- 125 (125l), e carbono-14 (14C). Além disso, o composto da presente invenção pode ser radioativo rotulado com um isótopo radioativo tais como trítio (3H), iodo-125 (125l), carbono-14 (14C), cobre-64 (64Cu), zir- cônio-89 (89Zr), iodo-124 (124l), flúor-18 (18F), índio-111 (111l), carbono- 11 (11C) e iodo-131 (131l). O composto rotulado com um isótopo radioativo é útil como um agente terapêutico ou profilático, um reagente para pesquisa tal como um reagente de ensaio e um agente para diagnóstico tal como um agente de imagem de diagnóstico in vivo. Sem ser relacionado à radioatividade, qualquer tipo de variante de isótopo do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção está dentro do escopo da presente invenção.
Fármacos
[00374] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção exibe a atividade citotóxica contra células de câncer, e desse modo, pode ser usado como um fármaco, particularmente como um agente terapêutico e/ou agente profilático para câncer.
[00375] Exemplos do tipo de câncer ao qual o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é aplicado incluem câncer de pulmão, câncer renal, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, ou câncer de esôfago, entretanto, não está limitado a eles, contanto que seja uma célula câncer expressando, em uma célula de câncer como um objeto de tratamento, uma proteína que o anticorpo dentro do conjugado de anticorpo-fármaco possa reconhecer.
[00376] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser preferivelmente administrado a um mamífero, porém é mais preferivelmente administrado a um humano.
[00377] Substâncias usadas em uma composição farmacêutica contendo conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem ser adequadamente selecionadas e aplicadas de aditivos de formulação ou similares, que são geralmente usados na técnica, tendo em vista a concentração de dosagem ou administração.
[00378] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica contendo pelo menos um ingrediente farmaceuticamente adequado.
[00379] Por exemplo, a composição farmacêutica acima tipicamente contém pelo menos um veículo farmacêutico (por exemplo, líquido es-terilizado). Por exemplo, água e óleo (óleo de petróleo e óleo de origem animal, origem de planta, ou origem sintética (o óleo pode ser, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo ou similares)). Água é um veículo mais típico quando a composição farmacêutica acima for administrada intravenosamente. Solu ção salina, uma solução de dextrose aquosa, e uma solução de glice- rol aquosa podem ser também usadas como um veículo líquido, em particular, para uma solução de injeção. Um veículo farmacêutico ade-quado é conhecido na técnica. Se desejado, a composição acima pode também conter uma quantidade de traço de um agente umectante, um agente emulsificante, ou um agente de tamponamento de pH. Exemplos de veículo farmacêutico adequado são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. As formulações corres-pondem a um modo de administração.
[00380] Vários sistemas de liberação são conhecidos e eles podem ser usados para administrar o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção. Exemplos da rotina de administração incluem rotinas intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, e sub-cutâneas, porém não limitados a isso. A administração pode ser feita por injeção ou injeção de bolus, por exemplo. De acordo com uma modalidade preferida específica, a administração do conjugado de an-ticorpo-fármaco é realizada por injeção. Administração parenteral é uma rotina de administração preferida.
[00381] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita, como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a humanos, de acordo com os procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em uma solução aquosa de tampão estéril e isotônica. Se necessário, o fármaco pode conter um agente solubilizante e anestésicos locais para aliviar a dor em sítio de injeção (por exemplo, lignocaína). Geralmente, o ingrediente acima é fornecido individualmente como qualquer um de pó liofilizado ou um concentrado anidroso contido em um recipiente que é obtido por meio de selagem de uma ampôla ou um sachê tendo uma quantidade do agente ativo ou como uma mistura em uma forma de dosagem unitá ria. Quando o fármaco deve ser administrado por injeção, ele pode ser administrado de um frasco de injeção contendo água ou salina de grau farmacêutico estéril. Quando o fármaco for administrado por injeção, uma ampôla de água estéril ou salina para injeção pode ser fornecida de tal modo que os ingredientes supracitados sejam misturados entre si antes da administração.
[00382] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica contendo somente o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco e pelo menos um agente de tratamento de câncer exceto o conjugado. O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser administrado com outro agente de tratamento de câncer. O efeito anti-câncer pode ser realçado conformemente. Outro agente anti-câncer usado para tal propósito pode ser administrado a um indivíduo simultaneamente com, separadamente de, ou subseqüentemente ao conjugado de anticorpo-fármaco, e pode ser administrado ao mesmo tempo que variando o intervalo de administração para cada. Exemplos do agente de tratamento de câncer incluem abraxano, carboplatina, cisplatina, gen- citabina, irinotecano (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vi- norelbina, fármacos descritos em Publicação Internacional No. WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorelina, goserelina, ou similares), fosfato de estramustina, antagonista de estrogênio (tamoxifeno, raloxifeno, ou similares), e um inibidor de aromatase (anastrozol, le- trozol, exemestano, ou similares), porém não é limitado contanto que ele seja um fármaco tendo uma atividade antitumor.
[00383] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma formulação de liofilização ou uma formulação líquida como uma formu-lação tendo composição desejada e pureza requerida. Quando formulada como uma formulação de liofilização, ela pode ser uma formula ção contendo aditivos de formulação adequados que são usados na técnica. Também para uma formulação líquida, ela pode ser formulada como uma formulação líquida contendo vários aditivos de formulação que são usados na técnica.
[00384] Composição e concentração da composição farmacêutica podem variar dependendo do método de administração. Entretanto, o conjugado de anticorpo-fármaco contido na composição farmacêutica da presente invenção pode exibir o efeito farmacêutico mesmo em uma pequena dosagem quando o conjugado de anticorpo-fármaco tiver maior afinidade para um antígeno, que é, afinidade maior (= valor de Kd menor) em termos da constante dissociação (que é, valor de Kd) para o antígeno. Desse modo, para determinar a dosagem do conjugado de anticorpo-fármaco, a dosagem pode ser determinada tendo em vista uma situação relativa à afinidade entre o conjugado de anticorpo-fármaco e antígeno. Quando o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção for administrado a um humano, por exemplo, cerca de 0,001 a 100 mg/kg pode ser administrado uma vez ou administrado diversas vezes com um intervalo de um tempo durante 1 a 180 dias.
Exemplos
[00385] A presente invenção é especificamente descrita tendo em vista os exemplos mostrados abaixo. Entretanto, a presente invenção não é limitada a eles. Além disso, não é por nenhum meio interpretada em um sentido limitado. Além disso, a menos que especificamente descrito de outro modo, o reagente, solvente, e material de partida descritos na especificação podem ser facilmente obtidos de um fornecedor comercial. Exemplo de Referência 1 anticorpo M30-H1-L4
[00386] De anticorpos humanizados de um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo composto de uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 16 foi produzido de acordo com um método conhecido na técnica para produzir anticorpo anti-B7-H3 humanizado designado como um anticorpo M30-H1-L4 (ou simplesmente referidos como "M30- H1-L4"). Exemplo de Referência 2 anticorpo M30-H1-L4P
[00387] A modificação de um glicano ligado ao anticorpo M30-H1- L4 obtido acima foi regulada por desfucosilação de acordo com um método conhecido na técnica para produzir anticorpo com a modificação regulada de um glicano designado como um anticorpo M30-H1- L4P (ou simplesmentereferidos como "M30-H1-L4P"). Exemplo de Referência 3 anticorpo anti-CD30
[00388] Um anticorpo anti-CD30 foi produzido com referência à Pu-blicação Nacional de Pedido de Patente Internacional No. 2005506035. Sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 27 e 28. Exemplo de Referência 4 anticorpo anti-OD33
[00389] Um anticorpo anti-CD33 foi produzido com referência à Patente Japonesa Depositada Aberta ao Público No. 8-48637. Sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 29 e 30. Exemplo de Referência 5 anticorpo anti-OD70
[00390] Um anticorpo anti-CD70 foi produzido com referência à Pu-blicação Nacional de Pedido de Patente Internacional No. 2008538292. Sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 31 e 32.
[00391] Exemplo 1 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamida Fórmula 70
Figure img0070
Processo 1: (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizi- no[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)carbamato de terc-butila
[00392] Ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL), N-hidroxisuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) car- bodiimida (0,216 g, 1,13 mmol) foram adicionados, e agitados durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetil formamida (10 mL) carregada com mesilato do composto (4) (0,500 g, 0,94 mmol) e trietilamina (0,157 mL, 1,13 mmol), e agitada em temperatura ambiente durante 1 dia. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido foi purificado por cromatogra- fia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título (0,595 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J=7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J=7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,122,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+ Processo 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamida
[00393] O composto (0,388 g, 0,61 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (9 mL). Ácido trifluoroacético (9 mL) foi adicionado e ele foi agitado durante 4 horas. O solvente foi re-movido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir trifluoroacetato do composto título (0,343 g, quantitativo). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo transportando câncer que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (13) ou (14). 1H-RMN (400 MHz, DIVISOR) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79-1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+ Exemplo 2 conjugado de anticorpo-fármaco (1) Fórmula 71
Figure img0071
Processo 1: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S) -9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[00394] N-(Terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) foi dissolvido em diclorometano (3 mL), N-hidroxisuccini- mida (0,021 g, 0,19 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (0,036 g, 0,19 mmol) foram adicionados e em seguida agitados durante 3,5 horas. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetil formamida (1,5 mL) carregada com o composto (0,080 g, 0,15 mmol) de Exemplo 1, e agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título (0,106 g, 73 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J=7,8 Hz), 2,15-2,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,1, 4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,16-3,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J=5,9 Hz), 3,57-3,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz). MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+ Processo 2: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[00395] O composto (1,97 g, 2,10 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (7 mL). Após adicionar ácido triflu- oroacético (7 mL), ele foi agitado durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e foi carregado com tolueno para destilação azeotrópica. Os resíduos obtidos foram purificados por cromato- grafia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto título (1,97 g, 99%). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J=5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78-7,81 (2H, m), 7,95-7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m). MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] glicilgli- cil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dio- xo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indoli- zino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00396] A uma solução de N,N-dimetilformamida (1,2 mL) do composto (337 mg, 0,353 mmol) obtido no Processo 2 acima, trietilamina (44,3 mL, 0,318 mmol) e hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila (119,7 mg, 0,388 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 5 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (278,0 mg, 76 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,66-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,05-2,21 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=14,0, 9,8 Hz), 2,98-3,21 (5H, m), 3,55-3,77 (8H, m), 4,41-4,48 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,40 (1H, d, J=17,1 Hz), 5,44 (1H, d, J=17,1 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20-7,27 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,70 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,08 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,25 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,5 Hz). MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (1)
[00397] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00398] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 acima (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,008 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação de ligante de fármaco durante mais 20 minutos.
[00399] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00400] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00401] Concentração de anticorpo: 13,02 mg/mL, produção de anticorpo: 9,1 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 3 conjugado de anticorpo-fármaco (2) Fórmula 72
Figure img0072
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (2)
[00402] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (4,0 mL) foi coletada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,118 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,200 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00403] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22°C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,236 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00471 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.
[00404] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 17,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00405] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00406] Concentração de anticorpo: 1,80 mg/mL, produção de anticorpo: 26,1 mg (65%), e número médio de moléculas de fármaco con- jugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,9. Exemplo 4 conjugado de anticorpo-fármaco (3) Fórmula 73
Figure img0073
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (3)
[00407] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticor-po de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Pro-cedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropile- no de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por mo-lécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articu-lação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00408] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 (0,085 mL; 10,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em tem peratura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,013 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00409] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00410] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00411] Concentração de anticorpo: 1,67 mg/mL, produção de anticorpo: 10,02 mg (80%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 5 conjugado de anticorpo-fármaco (4) Fórmula 74
Figure img0074
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (4)
[00412] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00413] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 (0,127 mL; 15,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,019 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fár- maco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00414] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00415] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.
[00416] Concentração de anticorpo: 1,19 mg/mL, produção de anticorpo: 7,14 mg (57%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,5. Exemplo 6 conjugado de anticorpo-fármaco (5) Fórmula 75
Figure img0075
[00417] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticorpo-fármaco de Exemplos 4 e 5 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00418] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 15,37 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,7. Exemplo 7 conjugado de anticorpo-fármaco (6) Fórmula 76
Figure img0076
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (6)
[00419] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubandoa 37 °C durante 1 hora.
[00420] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0593 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anti-corpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0119 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para termi-nar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.
[00421] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00422] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00423] Concentração de anticorpo: 0,99 mg/mL, produção de anticorpo: 5,94 mg (59%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,3. Exemplo 8 - conjugado de anticorpo-fármaco (7) Fórmula 77
Figure img0077
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (7)
[00424] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 mL; 6,9 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00425] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22 °C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0297 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 30 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada durante 40 minutos a 22 °C para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,0178 mL; 27,6 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.
[00426] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00427] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00428] Concentração de anticorpo: 0,99 mg/mL, produção de anticorpo: 5,94 mg (59%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 9 conjugado de anticorpo-fármaco (8) Fórmula 78
Figure img0078
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (8)
[00429] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00430] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22 °C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0593 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0119 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.
[00431] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00432] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28O = 5000 (valor médio medido), e SD,37O = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.
[00433] Concentração de anticorpo: 1,06 mg/mL, produção de anticorpo: 6,36 mg (64%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 10 conjugado de anticorpo-fármaco (9) Fórmula 79
Figure img0079
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (9)
[00434] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 mL; 6,9 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00435] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22 °C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0297 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 30 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0178 mL; 27,6 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.
[00436] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00437] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00438] Concentração de anticorpo: 0,95 mg/mL, produção de anticorpo: 5,70 mg (57%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 11 conjugado de anticorpo-fármaco (10) Fórmula 80
Figure img0080
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (10)
[00439] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00440] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0593 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0119 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.
[00441] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00442] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28O = 5000 (valor médio medido), e SD,37O = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.
[00443] Concentração de anticorpo: 1,00 mg/mL, produção de anticorpo: 6,00 mg (60%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 12 conjugado de anticorpo-fármaco (11) Fórmula 81
Figure img0081
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (11)
[00444] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 mL; 6,9 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37OC durante 1 hora.
[00445] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22OC durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0297 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 30 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada durante 40 minutos a 22°C para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma so-lução aquosa (0,0178 mL; 27,6 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.
[00446] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00447] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00448] Concentração de anticorpo: 0,96 mg/mL, produção de anticorpo: 5,76 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,6. Exemplo 13 conjugado de anticorpo-fármaco (12) Fórmula 82
Figure img0082
Processo 1: N-[3-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanoil] glicil- glicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00449] O composto (80 mg, 0,084 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando propioato de 3-maleimida de N-succinimidila (24,6 mg, 0,0924 mmol) em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (60,0 mg, 73 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,89 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,70-1,78 (2H, m), 1,81-1,94 (2H, m), 2,12-2,23 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,81 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,01-3,15 (3H, m), 3,16-3,23 (2H, m), 3,30-3,35 (1H, m), 3,58-3,71 (6H, m), 3,71-3,79 (1H, m), 4,44-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,27 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,43 (1H, d, J=17,6 Hz), 5,47 (1H, d, J=17,6 Hz), 5,57-5,63 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,02 (2H, s), 7,177,22 (1H, m), 7,22-7,30 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,73 (1H, t, J=5,6 Hz), 7,83 (1H, d, J=10,7 Hz), 8,08 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,15 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30 (2H, dt, J=18,7, 5,7 Hz), 8,49 (1H, d, J=8,8 Hz). MS (APCI) m/z: 990 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (12)
[00450] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 4 de Exemplo 2.
[00451] Concentração de anticorpo: 12,16 mg/mL, produção de anticorpo: 8,5 mg (68%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 14 conjugado de anticorpo-fármaco (13) Fórmula 83
Figure img0083
Processo 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propa- noil]amino}etóxi)etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida.
[00452] O composto (100 mg, 0,119 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando di-isopropiletilamina (20,8 μL, 0,119 mmol) em vez de tri- etilamina e 3-(2-(2-(3-maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato de N-succinimidila (50,7 mg, 0,119 mmol) em vez de hexanoato de 6- maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (66,5 mg, 48 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,85 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,65-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,07-2,19 (4H, m), 2,30 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,332,36 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,18 (9H, m), 3,42-3,44 (4H, m), 3,53-3,76 (10H, m), 4,43 (1H, td, J=8,6, 4,7 Hz), 5,14 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,17 (1H, m), 7,18-7,25 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,11 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,44 (1H, d, J=9,0 Hz). MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (13)
[00453] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 4 de Exemplo 2.
[00454] Concentração de anticorpo: 12,76 mg/mL, produção de anticorpo: 8,9 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 15 conjugado de anticorpo-fármaco (14) Fórmula 84
Figure img0084
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (14)
[00455] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 4.
[00456] Concentração de anticorpo: 1,60 mg/mL, produção de anti corpo: 9,60 mg (77%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,1. Exemplo 16 conjugado de anticorpo-fármaco (15) Fórmula 85
Figure img0085
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (15)
[00457] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 5.
[00458] Concentração de anticorpo: 1,64 mg/mL, produção de anticorpo: 9,84 mg (79%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,1. Exemplo 17 conjugado de anticorpo-fármaco (16) Fórmula 86
Figure img0086
[00459] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticor- po-fármaco de Exemplos 15 e 16 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00460] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 17,30 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,5. Exemplo 18 conjugado de anticorpo-fármaco (17) Fórmula 87
Figure img0087
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (17)
[00461] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (100 mL, 1 g do anticorpo) foi colocada em um frasco de 250 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 mL; 3,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e também com uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (5 mL). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00462] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (2,14 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (3,51 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado com um agitador para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 130 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,547 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00463] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um aparato de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionado gota a gota (um total de 800 mL) como uma solução de tampão para purificação à solução de reação, purificação de ultrafiltração foi realizada para remover ligantees de fármaco não conugados e outros reagentes baixo peso molecular, também substituindo a solução de tampão com ABS, e também con-centrando a solução, para produzir cerca de 70 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00464] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00465] Concentração de anticorpo: 14,5 mg/mL, produção de anti corpo: 1,0 g (cerca de 100 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,5. Exemplo 19 - conjugado de anticorpo-fármaco (18) Fórmula 88
Figure img0088
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (18)
[00466] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (5 mL, 50 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,135 mL; 4 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00467] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (0,064 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,219 mL; 6,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 90 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,033 mL; 9,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente du-rante mais 20 minutos.
[00468] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 19 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00469] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00470] Concentração de anticorpo: 2,17 mg/mL, produção de anticorpo: 41 mg (82%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,0. Exemplo 20 conjugado de anticorpo-fármaco (19) Fórmula 89
Figure img0089
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (19)
[00471] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (4 mL, 40 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,140 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00472] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,232 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 90 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,035 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00473] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 13 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00474] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va- lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00475] Concentração de anticorpo: 2,36 mg/mL, produção de anticorpo: 31 mg (77%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,9. Exemplo 21 conjugado de anticorpo-fármaco (20) Fórmula 90
Figure img0090
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (20)
[00476] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00477] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (0,0267 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0066 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00478] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00479] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00480] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 8,7 mg (70%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,5. Exemplo 22 conjugado de anticorpo-fármaco (21) Fórmula 91
Figure img0091
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (21)
[00481] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipo- tássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00482] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0726 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,011 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fár-maco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00483] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00484] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00485] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 8,3 mg (66%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,5. Exemplo 23 conjugado de anticorpo-fármaco (22) Fórmula 92
Figure img0092
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (22)
[00486] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo). A ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00487] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (0,0098 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00488] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00489] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00490] Concentração de anticorpo: 0,86 mg/mL, produção de anticorpo: 2,2 mg (54%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,5. Exemplo 24 - conjugado de anticorpo-fármaco (23) Fórmula 93
Figure img0093
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (23)
[00491] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,35 mL, 3,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0113 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo). A ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00492] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0204 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) e propileno glicol (Kanto Chemical Co., Inc., 0,18 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0031 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00493] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00494] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 4964 (valor medido), e SD,37Ü = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00495] Concentração de anticorpo: 0,41 mg/mL, produção de anticorpo: 1,0 mg (29%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,1. Exemplo 25 conjugado de anticorpo-fármaco (24) Fórmula 94
Figure img0094
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (24)
[00496] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00497] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00498] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00499] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), εD,280 = 4964 (valor medido), e εD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00500] Concentração de anticorpo: 1,25 mg/mL, produção de anticorpo: 3,1 mg (78%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 26 conjugado de anticorpo-fármaco (25) Fórmula 95
Figure img0095
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (25)
[00501] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37OC durante 1 hora.
[00502] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com posto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00503] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00504] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, εA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), εA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), εD,280 = 4964 (valor medido), e εD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00505] Concentração de anticorpo: 1,17 mg/mL, produção de anticorpo: 2,9 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,3. Exemplo 27 conjugado de anticorpo-fármaco (26) Fórmula 96
Figure img0096
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (26)
[00506] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00507] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00508] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00509] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, εA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), εA,370 = 0 (valor de cál culo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (valor medi-do) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00510] Concentração de anticorpo: 1,14 mg/mL, produção de anticorpo: 2,9 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 28 conjugado de anticorpo-fármaco (27) Fórmula 97
Figure img0097
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (27)
[00511] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37OC durante 1 hora.
[00512] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00513] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00514] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), εD,280 = 4964 (valor medido), e εD,370 = 18982 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00515] Concentração de anticorpo: 1,13 mg/mL, produção de anticorpo: 2,8 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,4. Exemplo 29 conjugado de anticorpo-fármaco (28) Fórmula 98
Figure img0098
Processo 1: N-[19-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1 H-pirrol-1-il)-17-oxo-4,7, 10,13-tetraoxo-16-azanonadecan-1-oil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00516] O composto (90 mg, 0,107 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando di-isopropiletilamina (18,7 μL, 0,107 mmol) em vez de trietilamina e 1 -maleinimida-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonade- can-19-oato de N-succinimidila (55,1 mg, 0,107 mmol) em vez de he- xanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (50 mg, 37 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,85 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,64-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,06-2,19 (4H, m), 2,27-2,32 (2H, m), 2,33-2,37 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,72-2,80 (3H, m), 2,96-3,19 (6H, m), 3,39-3,48 (10H, m), 3,52-3,75 (10H, m), 4,39-4,48 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J=17,0 Hz), 5,42 (1H, d, J=17,0 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (1H, s), 7,13-7,24 (5H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,10 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,44 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (28)
[00517] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00518] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,102 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 acima (0,047 mL; 5,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,009 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00519] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00520] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00521] Concentração de anticorpo: 13,60 mg/mL, produção de anticorpo: 9,5 mg (76 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,3. Exemplo 30 conjugado de anticorpo-fármaco (29) Fórmula 99
Figure img0099
Processo 1: N-(terc-butoxicarbonil)-β-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida.
[00522] O composto (0,839 g, 1,00 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-β-alanina em vez de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico. O produto cru obtido foi usado no pro-cesso seguinte sem purificação. Processo 2: β-Alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H-benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil) glici- namida
[00523] O produto cru obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,610 g, 67 %). 1H-RMN (400 MHz, DIVISOR) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09-2,22 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,46-2,55 (2H, m), 2,82-2,73 (1H, m), 2,95-3,13 (5H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,44-4,52 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=35,0, 19,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,67 (2H, brs), 7,72-7,78 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,10-8,17 (2H, m), 8,29 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,42 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz). Processo 3: N-(bromoacetil)-β-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa- hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il] amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00524] A uma solução de diclorometano (4,5 mL) de ácido 2- bromoacético (96,3 mg, 0,693 mmol), N-hidroxisuccinimida (79,7 mg, 0,693 mmol) e 1,3-di-isopropilcarbodiimida (0,107 mL, 0,693 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente. A solução de reação foi adicionada a uma solução de N,N-dimetil formamida (4,5 mL) do composto (473 mg, 0,462 mmol) obtido no Processo 2 acima e trietilamina (0,154 mL, 1,11 mmol) a 0 °C e agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de reação foi purificada por cro- matografia de coluna de sílica-gel [solvente de eluição: clorofórmio - clorofórmio : metanol = 85 : 15 (v/v)]. O sólido obtido foi lavado com solvente misto de clorofórmio : metanol : dietil éter para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (191 mg, 40 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-de) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,08-2,22 (4H, m), 2,33 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,74-2,83 (1H, m), 2,99-3,12 (3H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,243,30 (2H, m), 3,56-3,77 (6H, m), 3,82 (2H, s), 4,41-4,51 (1H, m), 5,20 (2H, q, J=18,9 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,157,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,21-8,34 (3H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1030, 1032 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (29)
[00525] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00526] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,09 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 (0,059 mL; 7,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,009 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00527] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00528] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00529] Concentração de anticorpo: 13,9 mg/mL, produção de anticorpo: 9,7 mg (78%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 31 conjugado de anticorpo-fármaco (30) Fórmula 100
Figure img0100
[00530] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 30, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 4.
[00531] Concentração de anticorpo: 1,94 mg/mL, produção de anticorpo: 11,64 mg (93 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,6. Exemplo 32 conjugado de anticorpo-fármaco (31) Fórmula 101
Figure img0101
Processo 1: conjugado de anticorpo-farmaco (31)
[00532] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 30, o conjugado de anticorpo-f)rmaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 5.
[00533] Concentração de anticorpo: 1,90 mg/mL, produção de anticorpo: 11,40 mg (91%), e número médio de moléculas de f)rmaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,7. Exemplo 33 conjugado de anticorpo-fármaco (32) Fórmula 102
Figure img0102
[00534] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticorpo-farmaco de Exemplos 31 e 32 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00535] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 21,06 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,0. Exemplo 34 conjugado de anticorpo-fármaco (33) Fórmula 103
Figure img0103
Processo 1: 4-({N6-(terc-butoxicarbonil)-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) car- bonil]-L-lisil}amino)butanoato de terc-butila
[00536] A uma solução de N,N-dimetil formamida (10,0 mL) de Nε- (terc-butoxicarbonil)-Na-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil-L-lisina (1,00 g, 2,14 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,370 g, 3,20 mmol), e cloridrato de éster de ácido 4-aminobutanoico de terc-butila (0,830 g, 4,27 mmol), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,610 g, 3,20 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (0,410 ml, 2,35 mmol) foram adicio-nados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 % e uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio, e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido incolor (1,35 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 1,14-1,42 (4H, m), 1,36 (9H, s), 1,37 (9H, s), 1,48-1,67 (4H, m), 2,18 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,84-2,93 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,84-3,94 (1H, m), 4,18-4,30 (3H, m), 6,76 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,33 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,39-7,45 (3H, m), 7,73 (2H, dd, J=7,3, 2,7 Hz), 7,85-7,92 (3H, m). Processo 2: 4-{[N6-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil]amino}butanoato de terc- butila
[00537] A uma solução de N,N-dimetil formamida (8,00 mL) do composto (1,35 g, 2,22 mmol) obtido no Processo 1 acima, piperidina (2,00 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 1,5 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 3: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc-butoxi- carbonil)-N-(4-terc-butóxi-4-oxobutil)-L-lisinamida
[00538] A uma solução de N,N-dimetil formamida (30,0 mL) da mistura (2,22 mmol) obtida no Processo 2 acima, N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi) carbonil]-L-valina (1,13 g, 3,32 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,310 g, 2,66 mmol), e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,550 g, 2,88 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 18 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido incolor (0,363 g, 23 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,84 (6H, t, J=6,0 Hz), 1,12-1,64 (8H, m), 1,34 (9H, s), 1,38 (9H, s), 1,90-2,04 (1H, m), 2,17 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,79-2,90 (2H, m), 2,99-3,09 (2H, m), 3,83-3,91 (1H, m), 4,08-4,44 (4H, m), 6,71 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,42 (3H, t, J=7,3 Hz), 7,74 (2H, t, J=7,0 Hz), 7,85-7,91 (4H, m). MS (ESI) m/z: 709 (M+H)+ Processo 4: formiato de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N-(3- carboxipropil)-L-lisinamida
[00539] Ao composto (0,363 mg, 0,512 mmol) obtido no Processo 3 acima, ácido fórmico (10,0 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título. O composto foi usado para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 5: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc-butoxi- carbonil)-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamida
[00540] À suspensão de 1,4-dioxano (5,00 mL) do composto (0,512 mmol) obtido no Processo 4 acima, uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio (20,0 ml) e dicarbonato de di-terc- butila (0,178 ml, 0,769 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 3 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 % e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi seca da sobre sulfato de magnésio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido incolor (0,295 g, 88 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,84 (6H, t, J=6,7 Hz), 1,13-1,39 (4H, m), 1,35 (9H, s), 1,48-1,62 (4H, m), 1,91-2,04 (1H, m), 2,20 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,80-2,89 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,87 (1H, dd, J=8,5, 6,7 Hz), 4,06-4,35 (4H, m), 6,71 (1H, t, J=6,0 Hz), 7,32 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,39-7,46 (3H, m), 7,74 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,83-7,94 (4H, m). MS (ESI) m/z: 653 (M+H)+ Processo 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc-butoxi- carbonil)-N-(4-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizino [1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida.
[00541] Mesilato do composto (4) (0,240 g, 0,452 mmol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando o composto (0,295 g, 0,452 mmol) obtido no Processo 5 acima em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto título como um sólido laranja pálido (0,208 g, 43 %). MS (ESI) m/z: 1071 (M+H)+ Processo 7: L-Valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluo- ro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobu- til)-L-lisinamida
[00542] O composto (0,208 g, 0,194 mmol) obtido no Processo 6 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil- N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobu- til)-L-lisinamida
[00543] A mistura (0,194 mmol) obtida no Processo 7 acima foi reagida da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,133 g, 56 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,77 (6H, t, J=5,7 Hz), 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,14-1,71 (10H, m), 1,35 (9H, s), 1,77-1,95 (3H, m), 2,022,23 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,84 (3H, q, J=6,4 Hz), 3,05 (2H, d, J=6,7 Hz), 3,17 (2H, s), 3,26-3,39 (3H, m), 4,01-4,16 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,36-5,48 (2H, m), 5,51-5,60 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,72 (1H, t, J=6,0 Hz), 6,99 (2H, s), 7,31 (1H, s), 7,717,85 (5H, m), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (ESI) m/z: 1041 (M+H)+ Processo 9: trifluoroacetato de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida
[00544] À solução de diclorometano (10,0 ml) do composto (0,110 mg, 0,106 mmol) obtido no Processo 8 acima, ácido trifluoroacético (4,00 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 5 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (70,0 mg, 64 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,76-0,81 (6H, m), 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,31 (4H, m), 1,39-1,56 (8H, m), 1,57-1,74 (3H, m), 1,79-1,96 (3H, m), 2,06-2,18 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,70-2,80 (2H, m), 3,01-3,10 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 4,04 (1H, t, J=7,6 Hz), 4,10-4,20 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,32 (1H, s), 7,61 (3H, brs), 7,75-7,88 (4H, m), 8,43 (1H, d, J=8,5 Hz). MS (ESI) m/z: 941 (M+H)+ Processo 10: conjugado de anticorpo-fármaco (33)
[00545] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 9 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 29.
[00546] Concentração de anticorpo: 12,0 mg/mL, produção de anticorpo: 8,4 mg (67 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 35 conjugado de anticorpo-fármaco (34) Fórmula 104
Figure img0104
Processo 1: N-(3-sulfanilpropanoil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S) -9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida
[00547] O composto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando 3-mercaptopropionato de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (61,2 mg, 66 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,77-1,66 (2H, m), 1,79- 1,92 (2H, m), 2,07-2,24 (4H, m), 2,31-2,47 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,592,69 (2H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,98-3,13 (3H, m), 3,143,23 (2H, m), 3,54-3,79 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=36,8, 19,2 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,03-8,09 (1H, m), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,19-8,29 (2H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 927 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (34)
[00548] Derivatização de SMCC de anticorpo: O anticorpo M30-H1- L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,25 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, carregada com solução de DMSO (0,0063 mL; que corresponde a cerca de 2,55 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo succini- midil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato a 27,6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) em temperatura ambiente, e reagida em temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solução de reação foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-2 para produzir 0,7 mL de uma solução contendo cerca de 5 mg do anticorpo derivado de SMCC.
[00549] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar DMSO (0,045 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 (0,015 mL; que corresponde a cerca de 2,4 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.
[00550] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00551] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00552] Concentração de anticorpo: 3,85 mg/mL, produção de anticorpo: 0,8 mg (16%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,9. Exemplo 36 conjugado de anticorpo-fármaco (35) Fórmula 105
Figure img0105
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (35)
[00553] Derivatização de SMCC de anticorpo: O anticorpo M30-H1- L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,25 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, carregada com solução de DMSO (0,0125 mL; que corresponde a cerca de 5,1 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo succinimi- dil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato a 27,6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) em temperatura ambiente, e reagida em temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solução de reação foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-2 para pro-duzir 0,7 mL de uma solução contendo cerca de 5 mg do anticorpo de-rivado de SMCC.
[00554] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar DMSO (0,03 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 35 (0,03 mL; que corresponde a cerca de 4,8 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.
[00555] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00556] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00557] Concentração de anticorpo: 2,43 mg/mL, produção de anticorpo: 0,5 mg (10%), e número médio de moléculas de fármaco conju- gadas (n) por molécula de anticorpo: 4,2. Exemplo 37 conjugado de anticorpo-fármaco (36) Fórmula 106
Figure img0106
Processo 1: N-{8-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi]-8-oxooctanoil}glicilglicil- L-fenilalanil-N-(4-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizi- no[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
[00558] O composto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando suberato de di(N-succinimidila) em vez de hexa- noato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (77,1 mg, 71 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,21-1,38 (4H, m), 1,43- 1,50 (2H, m), 1,55-1,63 (2H, m), 1,68-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,07-2,22 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,60-2,67 (2H, m), 2,76-2,84 (5H, m), 2,97-3,22 (5H, m), 3,56-3,76 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, q, J=18,8 Hz), 5,37-5,48 (2H, m), 5,53-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,157,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,04 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,09 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,26 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1092 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (36)
[00559] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,25 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, carregada com uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 acima (0,025 mL; que corresponde a cerca de 3,7 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.
[00560] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00561] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00562] Concentração de anticorpo: 6,25 mg/mL, produção de anticorpo: 1,3 mg (26%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 38 conjugado de anticorpo-fármaco (37) Fórmula 107
Figure img0107
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (37)
[00563] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,5 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com uma solução de DMSO contendo DMSO (0,025 mL) e 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 37 (0,025 mL; que corresponde a cerca de 7,4 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.
[00564] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00565] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00566] Concentração de anticorpo: 4,36 mg/mL, produção de anticorpo: 0,9 mg (18X), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,1. Exemplo 39 conjugado de anticorpo-fármaco (38) Fórmula 108
Figure img0108
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (38)
[00567] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com DMSO (0,017 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 37 (0,023 mL; que corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 4 horas.
[00568] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00569] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 2670 (valor medido), e SD,370 = 15820 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00570] Concentração de anticorpo: 0,55 mg/mL, produção de anticorpo: 1,4 mg (34%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 2,7. Exemplo 40 conjugado de anticorpo-fármaco (39) Fórmula 109
Figure img0109
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (39)
[00571] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm- 1 foi usado). A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com DMSO (0,017 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 37 (0,023 mL; que corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 4 horas.
[00572] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00573] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 2670 (valor medido), e SD,370 = 15820 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00574] Concentração de anticorpo: 0,93 mg/mL, produção de anticorpo: 2,3 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,0. Exemplo 41 conjugado de anticorpo-fármaco (40) Fórmula 110
Figure img0110
Processo 1: conjugado de anticorpo-farmaco (40)
[00575] Conjugação entre ligante de f)rmaco e anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm- 1 foi usado). A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com DMSO (0,017 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 (0,023 mL; que corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticorpo) de Exemplo 37 em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de farmaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 4 horas.
[00576] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-farmaco título.
[00577] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 2670 (valor medido), e SD,370 = 15820 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00578] Concentração de anticorpo: 1,04 mg/mL, produção de anticorpo: 2,6 mg (65 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,1. Exemplo 42 2-(2-Aminoetóxi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de] pi- rano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1 -il]acetamida Fórmula 111
Figure img0111
Processo 1: [2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]carbamato de terc-butila
[00579] Mesilato do composto (4) (3,10 g, 5,47 mol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando ácido {2-[(terc -butoxicarbonil)amino]etóxi}acético (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 2928) (1,55 g, 6,01 mmol) em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonila- mino)butanoico para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (2,56 g, 73 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,26 (9H, s), 1,81-1,91 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,08-3,26 (4H, m), 3,43-3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J=15,1 Hz), 4,05 (1H, d, J=15,1 Hz), 5,14 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,22 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,59-5,66 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,86 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+ Processo 2: 2-(2-Aminoetóxi)-N-[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H-benzo[de] pira- no[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]acetamida
[00580] O composto (1,50 g, 2,36 mol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 1 para produzir trifluorocloridrato do composto título como um sólido amarelo pálido (1,50 g, quantitativo). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo transportando câncer que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (41). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,5 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,15-2,23 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,05 (2H, t, J=5,1 Hz), 3,15-3,23 (2H, m), 3,71 (2H, t, J=5,1 Hz), 4,10 (2H, s), 5,19 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,66 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,73-7,84 (4H, m), 8,55 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+ Exemplo 43 conjugado de anticorpo-fármaco (41) Fórmula 112
Figure img0112
Figure img0113
Processo 1: N-(Terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2- {[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-2-oxoetóxi)etil]glicinamida
[00581] O composto (554 mg, 0,85 mmol) de Exemplo 42 foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 2 para produzir o composto título (775 mg, 95 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,85 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,36 (9H, s), 1,78-1,89 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J=13,4, 9,8 Hz), 2,95 (1H, dd, J=13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,233,32 (2H, m), 3,40-3,62 (8H, m), 3,73 (1H, dd, J=16,5, 5,5 Hz), 4,03 (2H, s), 4,39-4,47 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J=16,8 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,8 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (1H, t, J=5,8 Hz), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,82 (2H, m), 7,90 (1H, t, J=5,2 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,49 (1H, d, J=8,5 Hz). MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+ Processo 2: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)- 9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamida
[00582] O composto (630 mg, 0,659 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título (588 mg, 92 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J=13,4, 10,1 Hz), 2,99 (1H, dd, J=13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,24-3,32 (3H, m), 3,41-3,71 (7H, m), 3,86 (1H, dd, J=16,8, 5,8 Hz), 4,04 (2H, s), 4,52 (1H, td, J=9,0, 4,1 Hz), 5,17 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,87-8,01 (4H, m), 8,29-8,36 (2H, m), 8,46-8,55 (2H, m). MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] glicilgli- cil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)etil]glicinamida
[00583] O composto (240 mg, 0,247 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título (162 mg, 62 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,13-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,78-1,90 (2H, m), 2,09 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,142,21 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,74 (1H, dd, J=13,6, 9,7 Hz), 2,96 (1H, dd, J=13,6, 4,5 Hz), 3,08-3,24 (1H, m), 3,24-3,30 (1H, m), 3,33-3,40 (4H, m), 3,47-3,68 (7H, m), 3,72 (1H, dd, J=16,6, 5,7 Hz), 4,03 (2H, s), 4,42 (1H, td, J=8,6, 4,2 Hz), 5,17 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,747,81 (2H, m), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,03-8,11 (2H, m), 8,22 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (41)
[00584] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 29.
[00585] Concentração de anticorpo: 12,0 mg/mL, produção de anticorpo: 8,4 mg (67 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,5. Exemplo 44 conjugado de anticorpo-fármaco (42) Fórmula 113
Figure img0114
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (42)
[00586] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 5.
[00587] Concentração de anticorpo: 0,83 mg/mL, produção de anticorpo: 4,98 mg (40%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,2. Exemplo 45 conjugado de anticorpo-fármaco (43) Fórmula 114
Figure img0115
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (43)
[00588] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 4.
[00589] Concentração de anticorpo: 1,06 mg/mL, produção de anticorpo: 6,36 mg (51%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 46 conjugado de anticorpo-fármaco (44) Fórmula 115
Figure img0116
[00590] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticorpo-fármaco de Exemplos 44 e 45 foram misturadas a a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00591] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 10,21 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,6. Exemplo 47 conjugado de anticorpo-fármaco (45) Fórmula 116
Figure img0117
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (45)
[00592] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00593] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (0,0267 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43 (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0066 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00594] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00595] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento co- mum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5193 (valor medido), e SD,370 = 20347 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00596] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 9,3 mg (74%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 48 conjugado de anticorpo-fármaco (46) Fórmula 117
Figure img0118
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (46)
[00597] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipo- tássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de arti-culação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00598] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0726 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43 à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,011 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fárma- co em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00599] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00600] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5193 (valor medido), e SD,370 = 20347 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00601] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 7,8 mg (62%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,2. Exemplo 49 N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo -2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β -alaninamida Fórmula 118
Figure img0119
Processo 1: (3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3- oxopropil)carbamato de terc-butila
[00602] Mesilato do composto (4) (500 mg, 0,941 mmol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando N-(terc- butoxicarbonil)-β-alanina em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino) butanoico para produzir o composto título como um sólido amarelo- marrom (616 mg, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,29 (9H, s), 1,86 (2H, dt, J=15,1, 7,3 Hz), 2,04-2,22 (2H, m), 2,31 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,40 (3H, s), 3,10-3,26 (4H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, dd, J=18,8, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J=8,5, 4,2 Hz), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+ Processo 2: N-[(1 S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizi- no[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida
[00603] O composto obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 1 para produzir trifluo- roacetato do composto título como um sólido amarelo (499 mg, 86 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,86 (2H, dquin, J=14,6, 7,2, 7,2, 7,2, 7,2 Hz), 2,06-2,27 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,46-2,57 (2H, m), 3,08 (2H, t, J=6,8 Hz), 3,14-3,24 (2H, m), 5,22 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,29 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, dt, J=8,5, 4,5 Hz), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,74 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+ Exemplo 50 conjugado de anticorpo-fármaco (47) Fórmula 119
Figure img0120
Processo 1: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N- [(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]-β-alaninamida
[00604] O composto (484 mg, 0,780 mmol) de Exemplo 49 foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (626 mg, 87 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,27-1,42 (9H, m), 1,77-1,93 (2H, m), 2,06-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, d, J=1,6 Hz), 2,44-2,54 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J=14,5, 10,2 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,52 (6H, d, J=6,3 Hz), 4,42-4,54 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (1H, dd, J=18,4, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J=8,7, 4,4 Hz), 6,53 (1H, s), 6,98 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,777,84 (1H, m), 7,91 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,16 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,1 Hz), 8,52 (1H, d, J=9,0 Hz). Processo 2: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β- alaninamida
[00605] O composto (624 mg, 0,675 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo (626 mg, 92 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-de) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,86 (2H, tt, J=14,5, 7,2 Hz), 2,07-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,44-2,54 (2H, m), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,58 (2H, d, J=4,7 Hz), 3,69 (3H, td, J=11,2, 5,7 Hz), 3,87 (1H, dd, J=17,0, 5,7 Hz), 4,54 (1H, m, J=17,8, 4,5 Hz), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,51-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,88 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,97 (3H, brs), 8,29-8,38 (2H, m), 8,50 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,55 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] glicilgli- cil-L-fenilalanilglicil-N-[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida
[00606] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido (14,0 mg, 21 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,39-1,51 (4H, m), 1,79-1,91 (2H, m), 2,02-2,20 (2H, m), 2,07 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,30-2,42 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,78 (1H, dd, J=14,1, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,7, 4,9 Hz), 3,12-3,21 (2H, m), 3,26-3,42 (2H, m), 3,50-3,80 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,51-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,84 (2H, m), 8,01 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,14 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,25 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,53 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (47)
[00607] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 4 de Exemplo 2.
[00608] Concentração de anticorpo: 12,27 mg/mL, produção de anticorpo: 8,6 mg (69 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 51 conjugado de anticorpo-fármaco (48) Fórmula 120
Figure img0121
Processo 1: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanoil] glicil- glicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida
[00609] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 50 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando propionato de 3-maleimida de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (36,0 mg, 57 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,85 (2H, dt, J=14,4, 7,5 Hz), 2,05-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,30-2,44 (5H, m), 2,73-2,84 (1H, m), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,17 (3H, d, J=5,1 Hz), 3,26-3,40 (2H, m), 3,41-3,81 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,52-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (2H, d, J=10,2 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,12 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,20-8,31 (2H, m), 8,52 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (48)
[00610] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 4 de Exemplo 2.
[00611] Concentração de anticorpo: 11,59 mg/mL, produção de anticorpo: 8,1 mg (65%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 52 conjugado de anticorpo-fármaco (49) Fórmula 121
Figure img0122
Figure img0123
Processo 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1 H-pirrol-1-il)propa- noil]amino})etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil- 5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alanina- mida
[00612] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 50 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando 3-(2-(2-(3-maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi) propanoato de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido (23,0 mg, 31 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-de) δ: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,77-1,92 (2H, m), 2,07-2,21 (2H, m), 2,27-2,42 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,84 (1H, m), 2,97-3,06 (1H, m), 3,09-3,21 (4H, m), 3,25-3,39 (6H, m), 3,45 (4H, s), 3,50-3,80 (8H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,26 (1H, m, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,51-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,87 (2H, m), 7,938,07 (2H, m), 8,09-8,21 (2H, m), 8,26 (1H, brs), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (49)
[00613] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 29.
[00614] Concentração de anticorpo: 14,50 mg/mL, produção de anticorpo: 10,2 mg (82 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 53 conjugado de anticorpo-fármaco (50) Fórmula 122
Figure img0124
Processo 1: N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4,7,10, 13-tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N- [(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]-β-alaninamida
[00615] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 50 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando 1-maleinimida-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azano- nadecanoato de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido (23,0 mg, 29 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-de) δ: 0,86 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,85 (2H, tt, J=14,6, 7,1 Hz), 2,06-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,28-2,43 (6H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,1, 3,9 Hz), 3,09-3,22 (4H, m), 3,27-3,41 (4H, m), 3,47 (12H, d, J=8,6 Hz), 3,53-3,81 (10H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,53-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,85 (2H, m), 8,03 (2H, d, J=6,6 Hz), 8,11-8,21 (2H, m), 8,27 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (50)
[00616] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 4 de Exemplo 2. Concentração de anticorpo: 13,47 mg/mL, produção de anticorpo: 9,4 mg (75%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,1. Exemplo 54 conjugado de anticorpo-fármaco (51) Fórmula 123
Figure img0125
Processo 1: (6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizi- no[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxoexil)carbamato de terc-butila
[00617] Mesilato do composto (4) (0,500 g, 0,882 mmol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando ácido 6- (terc-butoxicarbonilamino)hexanoico em vez de ácido 4-(terc-butoxicar- bonilamino)butanoico para produzir o composto título (0,620 g, quanti-tativo). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, t, J=7,8 Hz), 1,14-1,28 (2H, m), 1,31 (9H, s), 1,47-1,61 (2H, m), 1,75-1,89 (2H, m), 2,04-2,17 (4H, m), 2,35 (3H, s), 2,81-2,88 (2H, m), 3,09-3,16 (2H, m), 5,10 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,16 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,39 (2H, s), 5,48-5,55 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,73-6,78 (1H, m), 7,26 (1H, s), 7,74 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,39 (1H, d, J=9,0 Hz). Processo 2: trifluoroacetato de 6-amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H-benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]hexanamida
[00618] O composto (0,397 g, 0,611 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 1 para produzir o composto título (0,342 g, 84 %). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,88 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31-1,41 (2H, m), 1,521,70 (4H, m), 1,80-1,94 (2H, m), 2,05-2,18 (2H, m), 2,21 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,40 (3H, s), 2,81 (2H, t, J=7,4 Hz), 3,10-3,25 (2H, m), 3,33 (2H, brs), 5,18 (1H, d, J=19,8 Hz), 5,22 (1H, d, J=19,8 Hz), 5,41 (2H, d, J=16,6 Hz), 5,45 (2H, d, J=16,6 Hz), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J=9,2 Hz). Processo 3: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1 S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa- hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il] amino}-6-oxoexil)glicinamida
[00619] O composto (0,170 g, 0,516 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 2 para produzir o composto título (0,225 g, 91 %). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,43-1,70 (6H, m), 1,87 (2H, td, J=15,0, 7,4 Hz), 2,10-2,22 (3H, m), 2,28-2,37 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,78-2,85 (1H, m), 3,01-3,10 (3H, m), 3,15-3,22 (2H, m), 3,543,61 (5H, m), 3,62-3,69 (1H, m), 4,44-4,53 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,45 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,02 (1H, t, J=6,1 Hz), 7,11-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,63-7,69 (1H, m), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,90-7,96 (1H, m), 8,17 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,28 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=9,0 Hz). Processo 4: Glicilglicil-L-fenilalani l-N-(6-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)glicinamida
[00620] O composto (0,105 g, 0,108 mmol) obtido no Processo 3 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título (0,068 mg, 65 %). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,89 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,15-1,67 (6H, m), 1,791,97 (2H, m), 2,08-2,24 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,76-2,82 (1H, m), 3,003,10 (5H, m), 3,19 (1H, s), 3,50-3,63 (2H, m), 3,64-3,76 (3H, m), 3,843,92 (1H, m), 4,51-4,59 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,24 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,44 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, brs), 7,15-7,29 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,72-7,78 (1H, m), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,968,08 (2H, m), 8,30-8,38 (2H, m), 8,46-8,56 (2H, m). Processo 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] glicilgli- cil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-10,13-dioxo-2,3, 9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-6-oxoexil)glicinamida
[00621] O composto (58 mg, 0,060 mmol) obtido no Processo 4 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título (39 mg, 62 %). 1H-RMN (CD3OD) δ: 0,99 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,27 (2H, td, J=11,6, 6,1 Hz), 1,38-1,44 (2H, m), 1,50-1,63 (6H, m), 1,65-1,80 (2H, m), 1,89-1,98 (2H, m), 2,17-2,25 (3H, m), 2,26-2,36 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,95 (1H, dd, J=14,3, 9,2 Hz), 3,12 (1H, dd, J=13,7, 5,7 Hz), 3,15-3,25 (4H, m), 3,44 (2H, t, J=7,2 Hz), 3,65 (1H, d, J=17,2 Hz), 3,76 (1H, d, J=17,2 Hz), 3,79-3,86 (4H, m), 4,43 (1H, dd, J=8,9, 6,0 Hz), 5,10 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,35 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,56 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,60-5,64 (1H, m), 6,76 (2H, s), 7,12-7,24 (6H, m), 7,58 (1H, s), 7,60 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,68 (1H, t, J=5,7 Hz). MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+ Processo 6: conjugado de anticorpo-fármaco (51)
[00622] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00623] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 acima (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.
[00624] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00625] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00626] Concentração de anticorpo: 0,97 mg/mL, produção de anticorpo: 5,82 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,7. Exemplo 55 conjugado de anticorpo-fármaco (52) Fórmula 124
Figure img0126
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (52)
[00627] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.
[00628] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 de Exemplo 54 (0,0590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0118 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.
[00629] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00630] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00631] Concentração de anticorpo: 0,94 mg/mL, produção de anticorpo: 5,64 mg (56%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,1. Exemplo 56 conjugado de anticorpo-fármaco (53) Fórmula 125
Figure img0127
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (53)
[00632] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00633] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22°C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Proces- so 5 de Exemplo 54 (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de an-ticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.
[00634] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00635] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00636] Concentração de anticorpo: 1,22 mg/mL, produção de anticorpo: 7,32 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,5. Exemplo 57 conjugado de anticorpo-fármaco (54) Fórmula 126
Figure img0128
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (54)
[00637] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00638] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22°C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 de Exemplo 54 (0,0590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0118 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.
[00639] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00640] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca racterísticos foram obtidos.
[00641] Concentração de anticorpo: 1,06 mg/mL, produção de anticorpo: 6,36 mg (64%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,0. Exemplo 58 conjugado de anticorpo-fármaco (55) Fórmula 127
Figure img0129
Processo 1: acetato de ({N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil} ami- no)metila
[00642] A uma mistura contendo N-9-fluorenilmetoxicarbonilglicil- glicina (4,33 g, 12,2 mmol), tetraidrofurano (120 ml), e tolueno (40,0 ml), piridina (1,16 ml, 14,7 mmol) e tetraacetato de chumbo (6,84 g, 14,7 mmol) foram adicionados e refluxados sob aquecimento durante 5 horas. Após a solução de reação ser resfriada para temperatura ambiente, os insolúveis foram removidos por filtração através de celita, e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissol-vidos em acetato de etila e lavado com água e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. Após o solvente ser removido sob pressão reduzida, os resí-duos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica- gel hexano : acetato de etila = 9 : 1 (v/v) - acetato de etila para produzir o composto título como um sólido incolor (3,00 g, 67 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCh) δ: 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J=5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J=7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J=6,6 Hz), 5,26 (2H, d, J=7,0 Hz), 5,32 (1H, brs), 6,96 (1H, brs), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J=7,3 Hz), 7,77 (2H, d, J=7,3 Hz). Processo 2: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil}amino) metó- xi]acetato de benzila
[00643] À solução de tetraidrofurano (40,0 mL) do composto (3,68 g, 10,0 mmol) obtido no Processo 1 acima e glicolato de benzila (4,99 g, 30,0 mmol), terc-butóxido de potássio (2,24 g, 20,0 mmol) foi adicionado a 0°C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com acetato de etila e água a 0°C e extraída com acetato de etila e clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em dioxano (40,0 mL) e água (10,0 mL), carregado com carbonato de hidrogênio de sódio (1,01 g, 12,0 mmol) e cloroformiato de 9-fluorenilmetila (2,59 g, 10,0 mmol), e agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregada com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto título em substância oleosa incolor (1,88 g, 40 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ: 3,84 (2H, d, J=5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J=6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J=6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,15-5,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, brs), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J=7,4 Hz). Processo 3: ácido [({N-[(9H-fIuoren-9-iImetóxi)carboniI]gIiciI} ami- no)metóxi]acético
[00644] O composto (1,88 g, 3,96 mmoI) obtido no Processo 2 acima foi dissoIvido em etanoI (40,0 mL) e acetato de etiIa (20,0 mI). Após adicionar cataIisador de paIádio sobre carbono (376 mg), isto foi agitado sob atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas. Os insoIúveis foram removidos por fiItração através de ceIita, e o soIvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto títuIo como um sóIido incoIor (1,52 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3,62 (2H, d, J=6,3 Hz), 3,97 (2H, s), 4,18-4,32 (3H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 7,29-7,46 (4H, m), 7,58 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,72 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,90 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,71 (1H, t, J=6,5 Hz). Processo 4: 9H-FIuoren-9-iImetiI(2-{[(2-{[(1 S,9S)-9-etiI-5-fIuoro-9- hidróxi-4-metiI-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H-benzo [de]pirano[3',4':6,7]indoIizino[1,2-b]quinoIin-1-iI]amino}-2-oxoetóxi) me- tiI]amino}-2-oxoetiI)carbamato
[00645] Sob resfriamento por geIo, a uma soIução de N,N-dimetiI formamida (10,0 mL) de mesiIato do composto (4) (0,283 g, 0,533 mmoI), N-hidroxisuccinimida (61,4 mg, 0,533 mmoI), e o composto (0,205 g, 0,533 mmoI) obtido no Processo 3 acima, N,N-di-isopropiIeti- Iamina (92,9 μL, 0,533 mmoI) e N,N'-dicicIo-hexiIcarbodiimida (0,143 g, 0,693 mmoI) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. O soIvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coIuna de síIica- geI [cIorofórmio - camada orgânica dividida de cIorofórmio : metanoI : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido marrom pálido (0,352 g, 82 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,81 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,73-1,87 (2H, m), 2,06-2,20 (2H, m), 2,34 (3H, s), 3,01-3,23 (2H, m), 3,58 (2H, d, J=6,7 Hz), 3,98 (2H, s), 4,13-4,25 (3H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,09-5,22 (2H, m), 5,32-5,42 (2H, m), 5,50-5,59 (1H, m), 6,49 (1H, s), 7,24-7,30 (3H, m), 7,36 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,53 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,66 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,75 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,84 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz), 8,77 (1H, t, J=6,7 Hz). MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+ Processo 5: N-[(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida
[00646] A uma solução de N,N-dimetil formamida (11,0 mL) do composto (0,881 g, 1,10 mmol) obtido no Processo 4 acima, piperidina (1,1 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quino- lin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida
[00647] Sob resfriamento por gelo, a uma solução de N,N-dimetil formamida (50,0 mL) da mistura (0,439 mmol) obtida no Processo 5 acima, N-hidroxisuccinimida (0,101 g, 0,878 mmol), e N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (o composto descrito na Patente Japonesa Depositada Aberta ao Público No. 2002-60351) (0,440 g, 0,878 mmol), N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (0,181 g, 0,878 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido laranja pálido (0,269 g, 58 %). MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+ Processo 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hi- dróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1 H,12H-benzo[de] pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil] glicinamida
[00648] A uma solução de N,N-dimetil formamida (4,00 mL) do composto (0,269 g, 0,253 mmol) obtido no Processo 6 acima, piperidi- na (0,251 mL, 2,53 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilgli- cil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida
[00649] A uma solução de N,N-dimetil formamida (10,0 mL) do composto (0,253 mmol) obtido no Processo 7 acima, hexanoato de 6- maleimida de N-succinimidila (0,156 g, 0,506 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,100 g, 38 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,09-1,21 (2H, m), 1,33-1,47 (4H, m), 1,75-1,90 (2H, m), 2,00-2,23 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,69-2,81 (1H, m), 2,94-3,03 (1H, m), 3,06-3,22 (2H, m), 3,23-3,74 (8H, m), 3,98 (2H, s), 4,39-4,50 (1H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,39 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,96 (2H, s), 7,117,24 (5H, m), 7,28 (1H, s), 7,75 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,97 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,09 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=6,5 Hz), 8,48 (1H, d, J=9,0 Hz), 8,60 (1H, t, J=6,5 Hz). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+ Processo 9: conjugado de anticorpo-fármaco (55)
[00650] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00651] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 acima (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,008 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em tem peratura ambiente durante mais 20 minutos.
[00652] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A descrito no Método de produção 1.
[00653] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00654] Concentração de anticorpo: 12,57 mg/mL, produção de anticorpo: 8,8 mg (70%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 59 conjugado de anticorpo-fármaco (56) Fórmula 128
Figure img0130
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (56)
[00655] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00656] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,085 mL; 10,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,013 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00657] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00658] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00659] Concentração de anticorpo: 1,33 mg/mL, produção de anticorpo: 7,98 mg (64%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,9. Exemplo 60 conjugado de anticorpo-fármaco (57) Fórmula 129
Figure img0131
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (57)
[00660] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00661] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,127 mL; 15,0 equivalentes por molé- cuia de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em tem-peratura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,019 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00662] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A descrito no Método de produção 1.
[00663] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00664] Concentração de anticorpo: 0,91 mg/mL, produção de anticorpo: 5,46 mg (44%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 61 conjugado de anticorpo-fármaco (58) Fórmula 130
Figure img0132
[00665] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticorpo-fármaco de Exemplos 59 e 60 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A descrito no Método de pro-dução 1 para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00666] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 12,30 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,4. Exemplo 62 conjugado de anticorpo-fármaco (59) Fórmula 131
Figure img0133
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (59)
[00667] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (100 mL, 1 g do anticorpo) foi colocada em um frasco de 250 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 mL; 3,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e também com uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (5 mL). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00668] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi- cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (3,51 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (2,14 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado com um agitador para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 130 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,547 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00669] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um aparato de ultrafiltração composta de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionado gota a gota (um total de 800 mL) como uma solução de tampão para purificação à solução de reação, purificação de ultrafiltração foi realizada para remover ligantees de fármaco não conugados e outros reagentes de baixo peso molecular, também substituindo a solução de tampão com ABS, e também concentrando a solução, para produzir cerca de 70 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00670] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00671] Concentração de anticorpo: 14,2 mg/mL, produção de anticorpo: 1,0 g (about 100%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 63 conjugado de anticorpo-fármaco (60) Fórmula 132
Figure img0134
Processo 1: conjugado de anticorpo-farmaco (60)
[00672] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (5 mL, 50 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,075 mL; 4 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,0 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00673] Conjugação entre ligante de f)rmaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,219 mL; 6,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,064 mL) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de f)rmaco ao anticorpo em um banho de agua a 15°C durante 90 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,033 mL; 9,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente du-rante mais 20 minutos.
[00674] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 19 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00675] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00676] Concentração de anticorpo: 2,19 mg/mL, produção de anticorpo: 42 mg (83 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,7. Exemplo 64 conjugado de anticorpo-fármaco (61) Fórmula 133
Figure img0135
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (61)
[00677] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (4 mL, 40 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,14 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,0 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00678] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,232 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,035 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00679] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 13 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00680] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00681] Concentração de anticorpo: 2,03 mg/mL, produção de anticorpo: 26 mg (66%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,7. Exemplo 65 conjugado de anticorpo-fármaco (62) Fórmula 134
Figure img0136
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (62)
[00682] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00683] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0267 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0066 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00684] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00685] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00686] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 7,8 mg (62%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 66 conjugado de anticorpo-fármaco (63) Fórmula 135
Figure img0137
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (63)
[00687] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipo- tássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00688] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0726 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,011 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fár- maco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.
[00689] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.
[00690] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va- lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00691] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anticorpo: 7,3 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,4. Exemplo 67 conjugado de anticorpo-fármaco (64) Fórmula 136
Figure img0138
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (64)
[00692] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00693] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0116 mL; 4,5 equivalen tes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00694] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00695] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00696] Concentração de anticorpo: 0,96 mg/mL, produção de anticorpo: 2,4 mg (60 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 68 conjugado de anticorpo-fármaco (65) Fórmula 137
Figure img0139
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (65)
[00697] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00698] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00699] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00700] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, εA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), εA,370 = 0 (valor de cál culo estimado), εD,280 = 5178 (valor medido), e εD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00701] Concentração de anticorpo: 0,39 mg/mL, produção de anticorpo: 1,0 mg (24%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,8. Exemplo 69 conjugado de anticorpo-fármaco (66) Fórmula 138
Figure img0140
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (66)
[00702] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00703] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0116 mL; 4,5 equivalen tes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00704] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00705] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, ε$,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), ε$,370 = 0 (valor de cálculo estimado), εD,280 = 5178 (valor medido), e εD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00706] Concentração de anticorpo: 1,19 mg/mL, produção de anticorpo: 3,0 mg (74%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 70 conjugado de anticorpo-fármaco (67) Fórmula 139
Figure img0141
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (67)
[00707] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00708] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00709] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo- fármaco título.
[00710] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento co- mum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28O = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,37O = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28O = 5178 (valor medido), e SD,37O = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00711] Concentração de anticorpo: 1,24 mg/mL, produção de anticorpo: 3,1 mg (78%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,0. Exemplo 71 conjugado de anticorpo-fármaco (68) Fórmula 140
Figure img0142
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (68)
[00712] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00713] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00714] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00715] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00716] Concentração de anticorpo: 1,10 mg/mL, produção de anticorpo: 2,8 mg (69%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 72 conjugado de anticorpo-fármaco (69) Fórmula 141
Figure img0143
Processo 1: conjugado de anticorpo-fármaco (69)
[00717] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.
[00718] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[00719] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.
[00720] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (valor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.
[00721] Concentração de anticorpo: 1,16 mg/mL, produção de anticorpo: 2,9 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,0. Exemplo 73 (Outro método para sintetizar o composto de Processo 8 de Exemplo 58) Fórmula 142
Figure img0144
Processo 1: alaninato de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) he- xanoil]glicilglicil-L-fenila de terc-butila
[00722] Sob resfriamento por gelo, à solução de THF (12,0 ml) de alaninato de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenila de terc-butila (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, pp. 393) (0,400 g, 0,717 mmol), 1,8-diazabiciclo[5,4,0]-7-undeceno (0,400 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 dias, e em seguida hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila (0,221 g, 0,717 mmol) foi também adi-cionado e agitado durante 3 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 %, uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio, e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. Após o solvente ser removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,295 g, 78 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCh) δ: 1,28-1,36 (2H, m), 1,41 (9H, s), 1,571,71 (4H, m), 2,23 (2H, t, J=7,6 Hz), 3,09 (2H, d, J=6,0 Hz), 3,51 (2H, t, J=7,6 Hz), 3,85-4,02 (4H, m), 4,69-4,78 (1H, m), 6,15 (1H, t, J=4,6 Hz), 6,33 (1H, d, J=7,3 Hz), 6,60 (1H, t, J=5,0 Hz), 6,68 (2H, s), 7,10-7,16 (2H, m), 7,22-7,31 (3H, m). MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+ Processo 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] glicilgli- cil-L-fenilalanina
[00723] A uma solução de diclorometano (8,00 ml) do composto (0,295 g, 0,558 mmol) obtido no Processo 1 acima, ácido trifluoroacéti- co (4,00 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 18 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,240 g, 91 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,15-1,23 (2H, m), 1,40-1,53 (4H, m), 2,10 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,88 (1H, dd, J=13,7, 8,9 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 5,0 Hz), 3,35-3,43 (2H, m), 3,58-3,77 (4H, m), 4,41 (1H, td, J=7,8, 5,0 Hz), 7,00 (2H, s), 7,16-7,31 (5H, m), 8,00 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz). Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1 H-pirrol-1-il)hexanoil]glicil- glicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida
[00724] O composto (0,572 g, 1,21 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em diclorometano (12,0 mL), carregado com N- hidroxisuccinimida (0,152 g, 1,32 mmol) e cloridrato de 1-(3-dimetilami- nopropil)-3-etilcarbodiimida (0,253 g, 1,32 mmol), e agitado durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada a uma solução de N,N-dimetil formamida (22,0 mL) da mistura (1,10 mmol) obtida no Processo 5 de Exemplo 58, e agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. A solução de reação foi carregada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 % e extraída com clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada sobre sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cro- matografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,351 g, 31 %). Os dados instrumentais do composto foram os mesmos como aquele do composto de Processo 8 de Exemplo 58. Exemplo 74 (Outro método para sintetizar composto de Processo 8 de Exemplo 58) Fórmula 143
Figure img0145
Figure img0146
Processo 1: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil}amino) metó- xi]acetato de benzila
[00725] A uma solução de tetraidrofurano (200 ml) do composto (7,37 g, 20,0 mmol) obtida no Processo 1 de Exemplo 58, glicolato de benzila (6,65 g, 40,0 mmol) e monoidrato de ácido p-toluenossulfônico (0,381 g, 2,00 mmol) foram adicionados a 0°C e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas e 30 minutos. A solução de reação foi carregada com uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cro- matografia de coluna de sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto título como um sólido incolor (6,75 g, 71 %). Os dados instrumentais do composto foram o mesmo como aquele do composto de Processo 2 de Exemplo 58. Processo 2: N-[(Benzilóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina-N-{[(2- (benzilóxi)-2-oxoetóxi]metil}glicinamida
[00726] A uma solução de N,N-dimetil formamida (140 mL) do composto (6,60 g, 13,9 mmol) obtido no Processo 1 acima, 1,8-diazabiciclo [5,4,0]undec-7-eno (2,22 g, 14,6 mmol) foi adicionado a 0 °C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com uma solução de N,N-dimetil formamida (140 mL) de N- [(benzilóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6,33 g, 15,3 mmol), N- hidroxisuccinimida (1,92 g, 16,7 mmol), e cloridrato de 1-(3-dimetilami- nopropil)-3-etilcarbodiimida (3,20 g, 16,7 mmol) agitados antecipada-mente em temperatura ambiente durante 1 hora, e agitados em tempe ratura ambiente durante 4 horas. A solução de reação foi carregada com ácido hidroclórico a 0,1 N e extraída com clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido incolor (7,10 g, 79 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 2,78 (1H, dd, J=13,9, 9,6 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,56-3,80 (6H, m), 4,15 (2H, s), 4,47-4,55 (1H, m), 4,63 (2H, d, J=6,6 Hz), 5,03 (2H, s), 5,15 (2H, s), 7,16-7,38 (15H, m), 7,52 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,17 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,36 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,61 (1H, t, J=6,6 Hz). Processo 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil]glicinamida
[00727] A uma solução de N,N-dimetil formamida (216 mL) do composto (7,00 g, 10,8 mmol) obtido no Processo 2 acima, catalisador de paládio sobre carbono (7,00 g) foi adicionado e agitado sob atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 24 horas. Os insolúveis foram removidos por filtração através de celita, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em água, o material insolúvel foi removido por filtração através de celita, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Este procedimento foi repetido duas vezes para produzir o composto título como um sólido incolor (3,77 g, 82 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 2,84 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,08 (1H, dd, J=13,7, 4,7 Hz), 3,50-3,72 (4H, m), 3,77-3,86 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,52-4,43 (1H, m), 4,61 (2H, d, J=6,6 Hz), 7,12-7,30 (5H, m), 8,43 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,70 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,79 (1H, t, J=5,5 Hz). Processo 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilgli- cil-L-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil]glicinamida
[00728] A uma solução de N,N-dimetil formamida (85,0 mL) do composto (3,59 g, 8,48 mmol) obtido no Processo 3 acima, hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila (2,88 g, 9,33 mmol) e trietilamina (0,858 g, 8,48 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de reação foi carregada com ácido hidroclórico a 0,1 N e extraída com clorofórmio e um solvente misto de clorofórmio e metanol [clorofórmio : metanol = 4 : 1 (v/v)]. A camada orgânica obtida foi secada sobre sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido incolor (3,70 g, 71 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 1,13-1,24 (2H, m), 1,42-1,53 (4H, m), 2,11 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,80 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,06 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,37 (2H, t, J=7,2 Hz), 3,56-3,78 (6H, m), 3,97 (2H, s), 4,46-4,53 (1H, m), 4,61 (2H, d, J=6,3 Hz), 7,00 (2H, s), 7,15-7,29 (5H, m), 8,038,20 (3H, m), 8,32 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,60 (1H, t, J=6,7 Hz). Processo 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilgli- cil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] in- dolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetóxi)metil]glicinamida
[00729] A uma solução de N,N-dimetil formamida (40,0 mL) de me- silato do composto (4) (1,14 g, 2,00 mmol), trietilamina (0,202 g, 2,00 mmol), o composto (1,48 g, 2,40 mmol) obtido no Processo 4 acima, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolíneo (0,993 g, 3,00 mmol) contendo 16,4 % de água foram adicionados a 0 °C e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido ama relo pálido (1,69 g, 82 %). Os dados instrumentais do composto foram o mesmo como aquele do composto de Processo 8 de Exemplo 58. Exemplo 75 N-[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indoli- zino[1,2-b]quinolin-1 -il]-2-hidroxiacetamida Fórmula 144
Figure img0147
Processo 1: 2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizi- no[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetilacetato
[00730] Sob resfriamento por gelo, a uma suspensão de N,N-dimetil formamida (20,0 mL) de mesilato do composto (4) (0,500 g, 0,941 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (0,492 mL, 2,82 mmol) e cloreto de acetoxiacetila (0,121 ml, 1,13 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromato- grafia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,505 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,08 (3H, s), 2,08-2,22 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,14-3,21 (2H, m), 4,51 (2H, dd, J=19,4, 14,7 Hz), 5,22 (2H, dd, J=40,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,56-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+ Processo 2: N-[(1 S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7] indolizi- no[1,2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamida
[00731] A uma suspensão de metanol (50,0 mL) do composto (0,504 g, 0,941 mmol) obtido no Processo 1 acima, tetraidrofurano (20,0 ml) e uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 1 N (4,00 ml, 4,00 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação foi terminada pela adição de ácido hidroclóri- co a 1 N (5,00 ml, 5,00 mmol), e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,412 g, 89 %). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo transportando câncer que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (55) ou (56). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-dβ) δ: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,78-1,95 (2H, m), 2,09-2,28 (2H, m), 2,39 (3H, s), 3,07-3,27 (2H, m), 3,96 (2H, d, J=6,0 Hz), 5,11-5,26 (2H, m), 5,42 (2H, s), 5,46-5,54 (1H, m), 5,555,63 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (ESI) m/z: 494 (M+H)+ Exemplo 76 (Outro método para sintetizar composto de Exemplo 75) Fórmula 145
Figure img0148
Processo 1: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2- hidroxiacetamida
[00732] Ácido glicólico (0,0201 g, 0,27 mmol) foi dissolvido em N,N- dimetil formamida (1,0 mL), carregado com N-hidroxisuccinimida (0,0302 g, 0,27 mmol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida (0,0508 g, 0,27 mmol), e agitado durante 1 hora. A so-lução de reação foi adicionada a uma suspensão de N,N-dimetil for-mamida (1,0 mL) carregada com mesilato do composto (4) (0,1 g, 0,176 mmol) e trietilamina (0,025 mL, 0,18 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 10 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,080 g, 92 %). Os dados instrumentais do composto foram o mesmo como aquele do composto obtido no Processo 2 de Exemplo 75. (Exemplo teste 1) Produção de vetor de expressão de variante 1 B7- H3 humano de comprimento natural
[00733] cDNA codificando a variante 1 B7-H3 humano foi amplificado por reação de PCR usando cDNA sintetizado de célula LNCaP (Coleção de Cultura tipo Americana: ATCC) RNA total como um modelo e seguinte grupo iniciador: iniciador 1: 5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 22) e Iniciador 2: 5'-aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgctgtcag- 3' (SEQ ID NO: 23).
[00734] Em seguida, o produto de PCR obtido foi purificado usando MagExtractor PCR & Gel de limpeza (Toyobo Co., Ltd.). O produto pu-rificado foi também digerido com enzimas de restrição (NheI/NotI) e depois disso purificado usando MagExtractor PCR & Gel de limpeza (Toyobo Co., Ltd.). pcDNA3,1 (+) DNA de plasmídeo (Life Technologies) foi digerido com as mesmas enzimas de restrição como acima (NheI/NotI) e depois disso purificado usando MagExtractor PCR & Gel de limpeza (Toyobo Co., Ltd.).
[00735] Estas soluções de DNA purificado foram misturadas, também carregadas com alta ligação (Toyobo Co., Ltd.), e incubada para ligação a 16°C durante 8 horas.
[00736] Células competentes de Escherichia coli DH5α (Life Technologies) foram transformadas pela adição do produto de reação obtido.
[00737] As colônias desse modo obtidas foram submetidas a PCR direto de colônia usando iniciadores de PCR e iniciador reverso de BGH para selecionar os clones candidatos.
[00738] Os clones candidatos obtidos foram cultivados em um meio líquido (LB/Amp), e o DNA de plasmídeo foi extraído com MagExtractor-Plasmid- (Toyobo Co., Ltd.).
[00739] Cada clone obtido foi comparado com a sequência de CDS fornecida pela análise de seqüênciamento entre
[00740] Iniciador 3 (iniciador de promotor de CMV): 5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) e Iniciador 4 (iniciador reverse de BGH): 5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25) Com o DNA de plasmídeo obtido como um modelo.
[00741] Após confirmar a sequência, o clone obtido foi cultivado em 200 mL de meio LB/Amp, e o DNA de plasmídeo foi extraído usando o kit VioGene Plasmid Midi V-100.
[00742] O vetor foi designado como pcDNA3,1-B7-H3. A sequência de um sítio de ORF do gene de variante 1 B7-H3 clonado no vetor é mostrada nas posições de nucleotídeo 1 a 1602 de SEQ ID NO: 26 (Figura 16) na Listagem de Sequência. Também, a sequência de ami- noácido do B7-H3 variante 1 é mostrada em SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência. (Exemplo teste 2) Preparação de célula de CCRF-CEM estavelmente expressando o gene de variante 1 B7-H3.
[00743] pcDNA3,1-B7-H3 produzidos no Exemplo teste 1 foi trans- fectado nas células CCRF-CEM (ATCC) por eletroporação usando Nu- cleofector II (fabricado por Lonza Grupo Ltd.). Em seguida, as células foram também cultivadas durante duas noites em meio RPMI1640 (Life Technologies) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) (posteriormente, referidos como 10% de FBS-RPMI1640) sob condições de 37°C e 5% de CO2.
[00744] Após o dia 2 de cultura, a cultura foi iniciada em 10% de FBS-RPMI1640 contendo 750 μg/mL G418 (Life Technologies) a fim de selecionar as células de CCRF-CEM em que o pcDNA3,1-B7-H3 estava estavelmente integrado.
[00745] Após 1 mês de cultura, a clonagem foi realizada pelo método de diluição limitante a fim de produzir um clone de célula única. Es-pecificamente, as células tendo resistência a G418 foram diluídas em 10 células/mL, inoculadas a uma placa de 96 cavidades em uma con-centração de 100 μL/cavidade, e cultivadas, e as células deixadas pro-liferar foram recuperadas das cavidades individuais.
[00746] Citometria de fluxo foi usado para confirmer a expressão de B7-H3 em cada clone recuperado. Especificamente, cada clone recuperado foi lavado duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois disso suspenso pela adição de PBS contendo 5% de FBS e 10 μg/mL de M30, e deixado descansar a 4°C durante 30 minutos. O clone foi lavado duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois disso suspenso pela adição de fração de lgG de cabra conjugada com Fluores- ceína para IgG de camundongo (Molécula inteira) (#55493, fabricado por ICN Pharmaceuticals, Inc.) diluído 1000 vezes com PBS contendo 5% de FBS, e deixado descansar a 4°C durante 30 minutos. O clone foi lavado duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois disso ressuspenso em PBS contendo 5% de FBS, e detectado usando um citômetro de fluxo (FC500: Beckman Coulter, Inc.).
[00747] As células de CCRF-CEM estavelmente expressando um gene de B7-H3 de variante 1 desse modo obtido por estes procedimentos foram designadas como as células CEM_V1_3.1_2. As células CCRF-CEM de linhagem origem foram usadas como uma linhagem celular sem expressão de B7-H3. (Exemplo teste 3) Teste de Citotoxicidade (1) de conjugado de an-ticorpo-fármaco
[00748] As células CEM_V1_3.1_2 produzidas no Exemplo teste 2 ou as células CCRF-CEM (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referidas como um meio). As células CEM_V1_3.1_2 ou as células CCRF-CEM foram preparadas para ter a concentração de 8 x 104 células/mL usando um meio, adicionado em uma concentração de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular carregada com 65 μL/cavidade de um meio, e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, o anticorpo M30-H1-L4, anticorpo M30-H1-L4P, e o conjugado de anticorpo-fármaco cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 3 dias. Após a cultura, a mi-croplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescen- te CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinEl- mer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: ICso (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGioa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com substância teste tendo a concentração b
[00749] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de relação de células vivas.
[00750] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas por substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 10).
[00751] Os conjugados de anticorpo-fármaco (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52), e (54) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células CEM_V1_3.1_2. Os conjugados de anticorpo-fármaco (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49), e (53) exibiram uma atividade citotóxica de 0,1 < IC50 < 1 (nM) contra as células. Os conjugados de anticorpo-fármaco (33), (34), (47), (48), (50), e (51) exibiram uma atividade citotóxica de 1 < IC50 < 100 (nM) contra as células. Por outro lado, nenhum destes conjugados de anticorpo-fármaco exibiram uma atividade citotóxica contra as células CCRF-CEM (> 100 (nM)). Nem o anticorpo M30-H1-L4 nem o anticorpo M30-H1-L4P exibiram uma atividade citotóxica contra ambas as células (> 100 (nM)). (Exemplo teste 4) Teste de Citotoxicidade (2) de conjugado de an-ticorpo-fármaco
[00752] Células SR de células positivas de antígeno (ATCC) ou células Daudi de células negativas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MORE- GATE) (posteriormente, referidos como um meio). As células SR ou as células Daudi foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio e adicionadas em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD30 e conjugados de anticorpo-fármaco (6) e (7) cada qual diluído em 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 320 pM, 64 pM, 12,8 pM, e 2,6 pM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 3 dias. Após a cultura, a microplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00753] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de relação de células vivas.
[00754] A taxa de sobrevivência das células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência das células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas pela substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)
[00755] Os conjugados de anticorpo-fármaco (6) e (7) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,01 (nM) contra as células SR. Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (6) e (7) não exibiram ne-nhuma atividade citotóxica contra as células Daudi (> 4,0 (nM)). O an-ticorpo anti-CD30 não exibiu nenhuma atividade citotóxica contra ambas as células (> 4,0 (nM)). (Exemplo teste 5) Teste de Oitotoxicidade (3) do conjugado de an-ticorpo-fármaco
[00756] As células SR de células positivas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células SR foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 célu- las/mL usando um meio e adicionadas em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD30 e os conjugados de an- ticorpo-fármaco (22), (23), (38), (64), e (65) cada qual diluído em 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, e 1 pM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavi- dade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Lumi- nescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculada de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00757] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.
[00758] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)
[00759] Os conjugados de anticorpo-fármaco (23), (38), (64), e (65) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,01 (nM) contra as células SR. O conjugado de anticorpo-fármaco (22) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células SR. O anticorpo anti- CD30 não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células SR (> 4,0 (nM)). (Exemplo teste 6) Teste de citotoxicidade (4) de conjugado de an-ticorpo-fármaco
[00760] As células HL-60 de células positivas de antígeno (ATCC) ou as células Raji de células negativas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células HL-60 ou as células Raji foram preparadas para ter a concentração de 8 x 104 células/mL usando um meio e adicionadas em uma concentração de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular carregada com 65 μL/cavidade de um meio. O anticorpo anti- CD33 e conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (9) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 3 dias. Após a cultura, a microplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00761] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cru- zando 50% de Relação de células vivas.
[00762] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 5)
[00763] Os conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (9) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células HL-60. Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (9) não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células Raji (> 100 (nM)). O anticorpo anti-CD33 não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra ambas as células (> 100 (nM)). (Exemplo teste 7) Teste de citotoxicidade (5) de conjugado de an-ticorpo-fármaco
[00764] As células NOMO-1 de células positivas de antígeno (HSRRB) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células NOMO-1 foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio e adicionado em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD33 e conjugados de anticorpo-fármaco (24), (25), e (67) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar durante 30 minutos em temperatura ambiente. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitados. Após a micro- placa ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00765] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.
[00766] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 5)
[00767] O conjugado de anticorpo-fármaco (25) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células NOMO-1. Os conjugados de anticorpo-fármaco (24) e (67) exibiram uma atividade citotóxica de 1 < IC50 < 100 (nM) contra as células. O anticorpo anti-CD33 não exibiu nenhuma atividade citotóxica contra as células NOMO-1 (> 100 (nM)). (Exemplo teste 8) Teste de citotoxicidade (6) do conjugado de an- ticorpo-fármaco
[00768] As células U251 de células positivas de antígeno (ATCC) ou as células MCF-7 de células negativas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referidos como um meio). As células U251 ou as células MCF-7 foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio, adicionado em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular, e cultivada durante a noite. No dia seguinte, o anticorpo anti-CD70 e os conjugados de anticorpo-fármaco (10) e (11) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitados. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00769] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.
[00770] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)
[00771] Os conjugados de anticorpo-fármaco (10) e (11) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 1 (nM) contra as células U251. Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (10) e (11) não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células MCF-7 (> 90 (nM)). O anticorpo anti-CD70 não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra ambas as células (> 100 (nM)). (Exemplo teste 9) Teste de citotoxicidade (7) do conjugado de an-ticorpo-fármaco
[00772] As células U251 de células positivas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referidos como um meio). As células U251 foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio e adicionado em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD70 e conjugados de anti- corpo-fármaco (26), (27), (40), (68), e (69) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi car-regada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00773] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.
[00774] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)
[00775] Os conjugados de anticorpo-fármaco (26), (27), (40), e (69) exibiram uma atividade citotóxica de 1 < IC50 < 10 (nM) contra as células U251. O conjugado de anticorpo-fármaco (68) exibiu uma atividade citotóxica de 10 < IC50 < 100 (nM) contra as células. O anticorpo anti- CD70 não exibiu nenhuma atividade citotóxica contra as células U251 (> 100 (nM)). (Exemplo teste 10) Teste de citotoxicidade (8) de fármaco liberado
[00776] As células A375 (ATCC) foram cultivadas em DMEM (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células A375 foram preparadas para ter a concentração de 4 x 104 células/mL usando um meio, adicionadas em uma concentração de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular (CORNING) carregadas com 65 μL/cavidade de um meio, e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, cada substância teste diluída em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando DMSO foi adicionada em uma concentração de 0,5 μL/cavidade à microplaca. DMSO foi adicionado em uma concentração de 0,5 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. O volume do meio em cada cavidade foi ajustado para 100 μL pela adição de 10 μL/cavidade de um meio, e as células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa. O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração b
[00777] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cru- zando 50% de Relação de células vivas.
[00778] A taxa de sobrevivência de células foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 10)
[00779] O composto de Exemplo (75) e exatecano exibiram uma atividade citotóxica de 0,1 < IC50 < 1 (nM) contra as células A375. O composto de Exemplo (42) exibiu uma atividade citotóxica contra 1 < IC50 < 10 (nM) contra as células. O composto de Exemplo (1) exibiu uma atividade citotóxica contra 10 < IC50 < 100 (nM) contra as células. (Exemplo teste 11) Teste Antitumor (1)
[00780] Camundongo: camundonogos nus BALB/c fêmeas de 5 a 6 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.) foram aclimatizados durante 4 a 7 dias sob condições de SPF antes do uso no experimento. Os camundongos foram alimentados com alimentação sólida esterilizada (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) e fornecido água de torneira esterilizada (preparada pela adição de solução de hi- poclorito de sódio de 5 a 15 ppm).
[00781] Ensaio e expressão de cálculo: Em todos os estudos, o eixo maior e o eixo menor de tumor foram medidos duas vezes em uma semana usando um calibrador eletrônico digital (CD-15C, Mitutoyo Corp.), e o volume do tumor (mm3) foi calculado. A expressão de cálculo é como mostrado abaixo. Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2
[00782] Todos os conjugados de anticorpo-fármaco foram diluídos com salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) e usados em um volume de 10 mL/kg para administração intravenosa à cauda de cada camundongo. As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 8 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutane- amente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. O anticorpo M30-H1-L4P e o conjugado de anticorpo- fármaco (2) foram cada qual intravenosamente administrados em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 11, 18, e 25.
[00783] Os resultados são mostrados na Figura 17. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre o tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do anticorpo M30-H1-L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2).
[00784] Como observado a partir destes resultados, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (2) notavelmente diminuiu o volume do tumor, e nenhum outro desenvolvimento de tumor foi observado após a administração final. Pelo contrário, a administração do anticorpo M30-H1-L4P resultou na progressão do desenvolvimento do tumor.
[00785] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (2) estavam livres de sinais notáveis, tais como perda de peso, sugerindo que o conjugado de anticorpo-fármaco (2) seja pouco tóxico e altamente seguro. (Exemplo teste 12) Teste Antitumor (2)
[00786] As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 6 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 18. O conjugado de anticorpo-fármaco (2) foi intravenosamente administrado em cada dose (0,1, 0,3, e 1,3 mg/kg) à cauda de cada camundongo nos Dias 18, 25, e 32 em uma relação de qw x 3.
[00787] Os resultados são mostrados na Figura 18. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado a 0,1 mg/kg, a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado a 0,3 mg/kg, a linhagem com triângulos cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado a 1 mg/kg, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado a 3 mg/kg. O conjugado de anticorpo- fármaco (2) foi efetivo para a diminuição do tumor de uma maneira dependente de dose. (Exemplo teste 13) Teste Antitumor (3)
[00788] As células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de célula não pequena humana foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 5 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. O anticorpo M30-H1-L4P e conjugado de anticorpo-fármaco (2) foram cada qual intravenosamente administrados em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 11, 18, e 25 em uma relação de qw x 3.
[00789] Os resultados são mostrados na Figura 19. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do anticorpo M30-H1-L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2). A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (2) notavelmente diminuiu o volume de tumor, e ne-nhum outro desenvolvimento de tumor foi observado após a adminis-tração final. Pelo contrário, a administração do anticorpo M30-H1-L4P resultou na progressão do desenvolvimento do tumor.
[00790] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (2) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que o conjugado de anticorpo-fármaco (2) seja pouco tóxico e altamente seguro. (Exemplo teste 14) Teste antitumor (4)
[00791] As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 8 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 21. Os conjugados de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), e (55) foram cada qual in-travenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 21.
[00792] Os resultados são mostrados na Figura 20. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo-fármaco (1), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (55). A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), ou (55) notavelmente diminuiu o volume do tumor, e todos estes conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibitório de desenvolvimento de tumor.
[00793] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), ou (55) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que os conjugados de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), e (55) são pouco tóxico e altamente seguro. (Exemplo teste 15) Teste antitumor (5)
[00794] As células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de célula não pequena humana foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 5 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 12. Os conjugados de anticorpo-fármaco (13), (41), e (55) foram cada qual intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 12. Como um controle comparativo, DE-310 foi intravenosamente administrado em uma dose de 0,1 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 12. Aqui, a acima mencionada dose do conjugado de anticorpo- fármaco foi com base na quantidade do anticorpo no conjugado e a acima mencionada dose de DE-310 foi com base na quantidade do fármaco contido nela. Neste aspecto, as quantidades dos fármacos respectivamente contidos no conjugado de anticorpo-fármaco e DE- 310 foram cerca de 1 : 100. Isto significa que as doses do conjugado de anticorpo-fármaco e DE-310 foram iguais em termos das quantidades dos fármacos contidos nelas.
[00795] Os resultados são mostrados na Figura 21. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito de DE-310, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anti- corpo-fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (55). A adminis tração do conjugado de anticorpo-fármaco (13), (41), ou (55) notavel-mente diminuiu o tumor volume, visto que a administração de DE-310 não exibiu nenhuma redução no volume do tumor.
[00796] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (13), (41), ou (55) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que estes conjugados de an- ticorpo-fármaco são pouco tóxicos e altamente seguros. (Exemplo teste 16) Teste antitumor (6)
[00797] As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 1 x 107 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. Os conjugados de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), e (61) foram cada qual intravenosamente administrado em uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 11 e 18 em uma relação de qw x 2.
[00798] Os resultados são mostrados na Figura 22. Na figura, a linhagem com losangos cheios retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo-fármaco (17), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (18), a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo-fármaco (19), a linhagem com triângulos cheios retrata o efeito do administrado conjugado de anticor- po-fármaco (59), a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo-fármaco (60), e a linhagem com marcas X retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (61).
[00799] A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), ou (61) notavelmente diminuiu o volume do tumor, e todos estes conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibitório de desenvolvimento de tumor.
[00800] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), ou (61) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que estes con-jugados de anticorpo-fármaco são pouco tóxicos e altamente seguros. Texto Livre de Listagem de Sequência SEQ ID NO: 1 - Sequência de aminoácido do B7-H3 variante 1 SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácido do B7-H3 variante 2 SEQ ID NO: 3 - Sequência de aminoácido de CDRH1 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 4 - Sequência de aminoácido de CDRH2 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 5 - Sequência de aminoácido de CDRH3 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 6 - Sequência de aminoácido de CDRL1 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 7 - Sequência de aminoácido de CDRL2 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 8 - Sequência de aminoácido de CDRL3 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 9 - Sequência de aminoácido do M30-H1-cadeia pesada tipo SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada tipo M30-H2 SEQ ID NO: 11 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada tipo M30-H3 SEQ ID NO: 12 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada tipo M30-H4 SEQ ID NO: 13 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L1 SEQ ID NO: 14 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L2 SEQ ID NO: 15 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L3 SEQ ID NO: 16 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L4 SEQ ID NO: 17 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L5 SEQ ID NO: 18 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L6 SEQ ID NO: 19 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L7 SEQ ID NO: 20 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anti-corpo M30 SEQ ID NO: 21 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo M30 SEQ ID NO: 22 - PCR iniciador 1 SEQ ID NO: 23 - PCR iniciador 2 SEQ ID NO: 24 - iniciador promotor de CMV : iniciador 3 SEQ ID NO: 25 - iniciador reverso de BGH : iniciador 4 SEQ ID NO: 26 - Sequência de nucleotideo do B7-H3 variante 1 SEQ ID NO: 27 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo anti-CD30 SEQ ID NO: 28 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo anti-CD30 SEQ ID NO: 29 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo anti-CD33 SEQ ID NO: 30 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo anti-CD33 SEQ ID NO: 31 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo anti-CD70 SEQ ID NO: 32 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo anti-CD70

Claims (6)

1. Composto intermediário ligante de fármaco, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre os seguintes: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), ou (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), em que (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir:
Figure img0149
em que o átomo de nitrogênio é a posição de conexão, e -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir:
Figure img0150
em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão.
2. Composto intermediário ligante de fármaco de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é: (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX).
3. Ligante para obter um conjugado anticorpo-fármaco em que um fármaco é conjugado a um anticorpo por meio do ligante, ca-racterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo a seguir, contanto que o terminal esquerdo é uma posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito é uma posição de conexão com o composto antitumor: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, ou -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
4. Ligante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o terminal esquerdo é uma posição de conexão com o anticorpo e o terminal direito é uma posição de conexão com o composto antitumor, e é: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-.
5. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo de: NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ou HO-CH2-C(=O)-(NH-DX), em que -(NH-DX) é um grupo representado pela fórmula a seguir:
Figure img0151
em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é a posição de conexão.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é HO-CH2-C(=O)-(NH-DX).
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