TR201809636T4 - Antikor-ilaç konjugatı. - Google Patents

Antikor-ilaç konjugatı. Download PDF

Info

Publication number
TR201809636T4
TR201809636T4 TR2018/09636T TR201809636T TR201809636T4 TR 201809636 T4 TR201809636 T4 TR 201809636T4 TR 2018/09636 T TR2018/09636 T TR 2018/09636T TR 201809636 T TR201809636 T TR 201809636T TR 201809636 T4 TR201809636 T4 TR 201809636T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
group
drug
compound
drug conjugate
Prior art date
Application number
TR2018/09636T
Other languages
English (en)
Inventor
Masuda Takeshi
Naito Hiroyuki
Nakada Takashi
Yoshida Masao
Ashida Shinji
Miyazaki Hideki
Kasuya Yuji
Morita Koji
Abe Yuki
Ogitani Yusuke
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50477169&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201809636(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of TR201809636T4 publication Critical patent/TR201809636T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/48—Ergoline derivatives, e.g. lysergic acid, ergotamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)

Abstract

Antitümör etkisi ve güvenlik bakımından mükemmel olan bir antitümör ilaç olarak aşağıdaki formül ile temsil edilen antitümör bileşiğin, aşağıdaki formül ile temsil edilen bir yapıya sahip bir bağlayıcı ile antikora konjuge edildiği antikor-ilaç konjugatı sağlanır: -L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2) n 1 -L a -L b -L c -, burada antikor, L1'in terminaline bağlanır ve antitümör bileşik, bağlantı pozisyonu olarak 1. pozisyonda amino grubunun nitrojen atomu ile Lc'nin terminaline bağlanır.

Description

TARIFNAME ANTIKOR-ILAÇ KONJUGATI Teknik Saha Mevcut bulus, bir baglayici yapisi kismi ile tümör hücrelerini hedefleyebilen bir antikora konjuge edilmis antitümör ilaca sahip antikor-ilaç konjugati ile ilgilidir, bu konjugat, antitümör ilaç olarak faydalidir.
Alt Yapi Teknigi Bir antikor-ilaç konjugati (ADC), antijeninin kanser hücreleri yüzeyinde ifade edildigi ve ayni zamanda hücresel internalizasyon kapasitesine sahip bir antijene baglanan bir antikora konjuge edilmis sitotoksisitesi olan bir ilaca sahiptir ve bu nedenle ilaci selektif olarak kanser hücrelerine uygular ve bu sekilde ilacin kanser hücrelerinde birikmesine neden olmasi ve kanser hücrelerini öldürmesi beklenir (Bakiniz, Patent Disi Literatürler yönelik olarak bir anti-CD22 antikoruna konjuge edildigi ADC'Ieri açiklar. ADC olarak kalikamisinin, anti-CD33 antikoruna konjuge edildigi Mylotarg (Gemtuzumab ozogamisin), akut miyeloid lösemiye yönelik terapötik bir ajan olarak onaylanmistir.
Ayrica, son olarak auristatin E'nin, anti-CD30 antikoruna konjuge edildigi Adcetris (Brentuksimab vedotin), Hodgkin Ienfoma ve anaplastik büyük hücreli Ienfomaya yönelik terapötik bir ajan olarak onaylanmistir (bakiniz Patent Disi Literatür 4). Simdiye kadar onaylanmis olan ADCllerde bulunan ilaçsar, DNA veya tubulini hedef alir.
Düsük molekül agirlikli antitümör bilesikler olan kamptotesin derivelerine iliskin olarak antitümör etki sergilemek üzere topoizomeraz I'i inhibe eden bilesikler bilinir. Bunlar arasinda, asagidaki formül ile temsil edilen bir antitümör bilesik kamptotesinin suda çözünebilen bir derivesidir (Patent Literatürü 1 ve 2). Klinik ortamlarda halihazirda kullanilan irinotekanin aksine bir enzim ile yapilan aktivasyon gereksizdir. Ayrica topoizomeraz I üzerindeki inhibitör aktivite, ayni zamanda klinik ortamlarda kullanilan irinotekan ve topotekanin farmasötik olarak aktif temel maddesi olan SN-38'den daha yüksektir ve daha yüksek in vitro sitosidal aktivite, çesitli kanser hücrelerine karsi elde edilir. Özellikle P-glikoprotein ifadesi nedeniyle SN-38 veya benzerine karsi dirence sahip kanser hücrelerine karsi etki gösterir. Ayrica subkütanöz olarak bir insan tümörü transplante edilmis fare modelinde güçlü antitümör etki göstermistir ve bu nedenle klinik çalismalara tabi tutulmustur, ancak henüz piyasaya sunulmamistir (bakiniz Patent Disi Literatürler 5 ila 10). Eksatekanin ADC olarak etkili bir sekilde fonksiyon yapip yapmadigi henüz belirsizdir.
DE-310, eksatekanin, GGFG peptit ara parçasi ile biyobozunur karboksimetildekstran polialkol polimerine konjuge edildigi bir komplekstir (Patent Literatürü 3). Eksatekanin, polimer ön ilaç formuna dönüstürülmesi ile yüksek kan retansiyon özelligi muhafaza edilebilir ve ayni zamanda bir tümör alanina yüksek hedeflenebilme özelligi, tümör dokularindaki retansiyon özelliginin ve tümörde yeni olusan kan damarlarinin artmis permeabilitesinin kullanilmasi ile pasif olarak arttirilir. DE-310 ile bir enzim araciligiyla peptit ara parçanin klevaji yoluyla eksatekan ve bir amino grubuna bagli glisin içeren eksatekan, temel aktif madde olarak sürekli salinir. Sonuç olarak farmakokinetikler gelistirilir ve DE-310'nun, eksatekan dozajinin, klinik disi çalismalarda çesitli tümör degerlendirme modellerine göre eksatekanin tek basina uygulandigi durumdan daha düsük olmasina ragmen tek basina uygulanan eksatekandan daha yüksek etkinlige sahip oldugu bulunmustur. DE-31O için kinik bir çalisma yapilmistir ve etkili vakalar insanlarda dogrulanmistir, burada temel aktif maddenin, normal dokulara göre tümörde biriktigini ileri süren bir rapor yer alir ancak ayni zamanda DE-310 ve temel aktif maddenin bir tümörde birikmesinin, normal dokulardaki birikiminden çok da farkli olmadigini ve bu nedenle insanlarda pasif hedeflemenin gözlenmedigini gösteren rapor da bulunmaktadir (bakiniz Patent Disi Literatürler 11 ila 14). Sonuç olarak DE-310 da ticari hale getirilmemistir ve eksatekanin, bu tür bir hedeflemeye yönlendirilmis bir ilaç olarak etkili bir sekilde fonksiyon yapip yapmadigi henüz belli degildir.
DE-31O ile ilgili bir bilesik olarak -NH(CH2)4C(=O)- ile temsil edilen bir yapi kisminin, bir ara parça yapisi olarak kullanilan - GGFG-NH(CH2)4C(=O)-'yu olusturmak üzere - GGFG- ara parçasi ile eksatekan arasina yerlestirildigi bir kompleks de bilinmektedir (Patent Literatürü 4). Ancak kompleksin antitümör etkisi de bilinmemektedir.
Antibody-Drug Conjugates: Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies. 14, 529-537.; Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer.
Tumour-targeted chemotherapy with immunoconjugates of calicheamicin.
The discovery and development of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin potent antitumor activity against human tumors in vitro and in vivo. pancreatic tumor cells and their CPT-11-resistant variants cultured in vitro and xenografted into nude mice. water-soluble camptothecin analog, exhibits potent antitumor activity against a human lung cancer cell line and its SN-38-resistant variant. camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.
DX-8951f: summary of phase I clinical trials. 310 with a novel carrier system and its preclinical data. a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f: Potent antitumor activities in various murine tumor models. 703-711.; Phase I and pharmacokinetic study of DE-310 in Patients with Advanced Solid Tumors. 347.; DE-310, a macromolecular prodrug of the topoizomerase-I-inhibitor exatecan (DX-8951), in patients with operable solid tumors.
Bir antikor ile tümör tedavisine iliskin olarak, antikorun bir antijeni tanimasi ve tümör hücrelerine baglanmasi durumunda dahi yetersiz bir antitümör etki gözlenebilir ve daha etkili bir antitümör antikorun gerekli oldugu durum söz konusudur. Ayrica düsük molekül agirlikli birçok antitümör bilesik, bilesiklerin, mükemmel antitümör etkiye sahip olmasina ragmen yan etki ve toksisite gibi güvenlik bakimindan problem teskil eder, güvenligin daha da arttirilmasi yoluyla üstün terapötik etkinin saglanmasi amaçlanmaktadir. Dolayisiyla mevcut bulusun amaci, antitümör etki ve güvenlik bakimindan mükemmel olan, mükemmel terapötik etkiye sahip antitümör ilacin saglanmasidir.
Bulusçular, antitümör bilesik olan eksatekanin, bir baglayici yapisi kismi araciligiyla tümör hücrelerini hedefleyebilen, yani tümör hücrelerini tanima özelligi, tümör hücrelerine baglanma özelligi, tümör hücreleri içinde internalize olma özelligi, tümör hücrelerine karsi sitosidal aktivite veya benzeri özelliklere sahip antikora konjugasyon yoluyla antikor-ilaç konjugatina dönüstürülmesi durumunda antitümör bilesigin, tümör hücrelerinde bilesigin antitümör etkisini spesifik olarak göstermek üzere tümör hücrelerine daha emin bir sekilde uygulanabildigini ve bu nedenle antitümör etkinin kesin olarak sergilenebildigini ve ayni zamanda antikorun artmis sitosidal etkisinin beklendigini ve antitümör bilesik dozunun, bilesigin tek basina uygulandigi duruma göre azaltilabildigini ve bu nedenle antitümör bilesigin normal hücreler üzerindeki etkisinin, daha yüksek güvenlik saglanacak sekilde azaltilabildigini düsünmüstür.
Bu baglamda bulusçular, spesifik bir yapiya sahip baglayici olusturmustur ve antikor ve eksatekanin, baglayici ile birbirine konjuge edildigi bir antikor-ilaç konjugatini elde etmede basari göstermistir ve bu sekilde mevcut bulusu tamamlamak amaciyla konjugat tarafindan sergilenen mükemmel antitümör etkiyi dogrulamistir.
Mevcut bulus spesifik olarak asagidakiler ile ilgilidir. antitümör bilesik: asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayici ile bir antikora konjuge edilir: Burada antikor, L“in terminaline baglanir, antitümör bilesik, baglanti pozisyonu olarak 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu ile Lc'nin terminaline baglanir, nl, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, L1, -(Süksinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-. -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, - C(=O)-sik.Hekz(1, 4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- veya -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-'yu temsil eder; burada n2, 2 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, n3, 1 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, n4, 1 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, L2, -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n5-C(=O)- veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, ne, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan tetrapeptit kalintisini temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3 bagimsiz olarak bir hidrojen atomunu temsil eder, LC, -C(=O)-'yu temsil eder, -(Süksinimid-3-iI-N)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda antikora baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayicidaki metilen grubuna baglanir, -(N-li-3-diminiksuS)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda L2`ye baglanir ve 1. Pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayici yapisindaki metilen grubuna baglanir, sik.Hekz(1,4), 1,4-siklohekzilen grubunu temsil eder ve L2, -S-(CH2)nG-C(=O)- oldugunda L1, -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksu8)-'dir.
Mevcut bulus ayrica, asagidakilerden her biri ile ilgilidir. gruptan seçilen bir yapidir: -(SükSInImId-3-II-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-C(=O)-(NH-DX) -(SüksinimId-3-II-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- -(SükSInImId-3-Il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz- C(=O)-(NH-DX) -(SükSinimid-3-iI-N)-CH20H2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCH2CH2- -(SÜkSInImId-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH20H2CH2-C(=O)-(NH-DX) - (SÜksinImId-3-II-N)-CH2CH2CH20H2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz'O-CHz- C(=O)-(NH-DX) - (SÜkSinImId-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) - (SüksinimId-S-iI-N)-CH2CHz-C(=O)-NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2- - (SüksinImId-3-Il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CHzCHzo-CH2CH20-CH2CH2' - (SüksinimId-3-II-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CHzCHzO-CH2CH20-CH2CH20- -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiksuS)-S-CH20H2-C(=O)-GGFG- N H-CH2CH2CH2-C(=O)-( N H-DX) burada -(NH-DX), asagidaki formüle ile temsil edilen bir grubu temsil eder: burada 1. Pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur -GGFG-, -Gly-Gly-Phe-Gly- olan bir peptit kalintisini temsil eder. antitümör bilesik: asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayici ile antikora konjuge burada antikor, L“in terminaline baglanir, antitümör bilesik, baglanti pozisyonu olarak 1. Pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu ile Lc'nin terminaline baglanir, n1, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, L1, -(Süksinimid-3-iI-N)-(CH2)n2-C(=O)-'yu temsil eder, burada n2, 2 ila 5 olan bir tamsayiyi temsil eder, L2, -NH-(CHz-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O) veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 2 veya 4 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan tetrapeptit kalintisini temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3, bir hidrojen atomunu temsil eder, L°, -C(=O)-'yu temsil eder ve -(Süksinimid-3-iI-N)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda antikora baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayici yapisindaki metilen grubuna baglanir.
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- veya -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-'dur.
-NH-CHg-O-CHz-C(=O)-'dur. yapisi, asagidaki gruptan seçilen bir yapidir: -(Süksinimid-3-iI-N)-CHzCHzCHzCH20H2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Süksinimid-3-iI-N)-CHzCHzCH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O- CHz-C (:0) - (NH-DX) burada -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir grubu temsil eder: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur. yapidir: -(Süksinimid-3-iI-N)-CHzCH20H2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX). için konjuge edilen seçilmis bir ilaç-baglayici yapisina ait birimlerin ortalama için konjuge edilen seçilmis bir ilaç-baglayici yapisina ait birimlerin ortalama ilaç konjugati tarafindan hedeflenen bir hücre, tümör hücresidir. anti-A313 antikoru, anti-BY-HS antikoru, anti-CanAg antikoru, anti-CD20 antikoru, anti-CD22 antikoru, anti-CD30 antikoru, anti-CD33 antikoru, anti-CD56 antikoru, anti-CD70 antikoru, anti-CEA antikoru, anti-Cripto antikoru, anti-EphA2 antikoru, anti-G250 antikoru, anti-MUC1 antikoru, anti-GPNMB antikoru, anti-integrin antikoru, anti-PSMA antikoru, anti-tenaskin-C antikoru, anti-SLC44A4 antikoru veya anti-mezotelin antikorudur. anti-B7-H3 antikoru, anti-CDSO antikoru, anti-CD33 antikoru veya anti-CD7O antikorudur. anti-B7-H3 antikorudur. içeren bir ilaçtir. içeren antitümör ilaç ve/veya antikanser ilaçtir. prostat kanseri, glioblastom multiforme, yumurtalik kanseri, pankreas kanseri, gögüs kanseri, melanom, karaciger kanseri, mesane kanseri, mide kanseri veya özofagus kanserine karsi kullanilmaya yönelik [1] ila [4]'ten herhangi birinde tanimlanan antitümör ilaç ve/veya antikanser ilaçtir. konjugatini veya tuzunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyon bilesenini içeren farmasötik bilesimdir.
Q-(CH2)nQ-C(=O)-L23-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-LC-(NH-DX) burada Q, (maleimid-N-il)-'i temsil eder, no, 2 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, Lza, -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan bir tetrapeptit kalintisini temsil eder, n1, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3 bagimsiz olarak bir hidrojen atomunu temsil eder, LC, -C(=O)-“yu temsil eder, (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur. tamsayidir, -NH-(CH2)n1-La-Lb-, -NH-CHz-O-CHz- veya -NH-CH20H2-O-CH2-'dii. (maleimid-N-il)-CHzCH20H2CHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz- C(=0)-(NH-DX) or C(=O)-(NH-DX), burada (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur. (maleimid-N-iI)-CH2CH2CH- elde edilmesine yönelik olarak asagidaki formül ile temsil edilen bir baglayicidir: burada L1, antikora yönelik baglanti pozisyonudur, L°, antitümör bilesige yönelik baglanti pozisyonudur, nl, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, L1, -(Süksinimid-3-iI-N)-(CH2)n2-C(=O)-'yu temsil eder, burada n2, 2 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, L2, -NH-(CHz-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O) - veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan tetrapeptit kalintisini temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3 bagimsiz olarak bir hidrojen atomunu temsil eder, L°, -C(=O)-'yu temsil eder, -(Süksinimid-3-iI-N)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda antikora baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayici yapisindaki metilen grubuna baglanir. antitümör bilesik ile baglanti pozisyonu olmasi kosuluyla asagidaki gruptan seçilen [22]'ye göre baglayicidir: - (Süksinimid-3-iI-N)-CH2CH20H2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz- - (Süksinimid-3-iI-N)-CHzcHzcHzcHzcHz-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- antitümör bilesik ile baglanti pozisyonu olmasi kosuluyla asagidaki olan [23]'e göre baglayicidir: -(Süksinimid-3-il-N)-CHzCH2CH20H20H2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- antikor, indirgeyici bir kosulda islenir ve akabinde asagida gösterilen bilesikten seçilen bir bilesik ile reakte edilir: C(=O)-GGFG-NHCHzcHzcHz-C(=O)-(NH-DX), C(=O)-(NH-DX), or (maleimid-N-il)-CH20H20H20HzCHg-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz- C(=O)-(NH-DX), yukarida (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur. akabinde asagida gösterilen bilesik ile reakte edilir: (maleimid-N-iI)-CH20HzCH-(NH- NH2-CH20H20H2-C(=O)-(NH-DX), NHz-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) veya HO-CHz-C(=O)-(NH-DX), burada -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur.
Bulusun Avantajli Etkileri Bir baglayici araciligiyla spesifik bir yapi ile konjuge edilen antitümör bilesik eksatekana sahip antikor-ilaç konjugati ile mükemmel antitümör etki ve güvenlik elde edilebilir.
Sekillerin Kisa Açiklamasi edilmis insan melanom hatti A375 hücreleri üzerindeki etkisini gösterir. Sekilde, içi bos eskenar dörtgenlerin oldugu çizgi, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, içi bos üçgenlerin oldugu çizgi, M30-H1-L4P antikorunun etkisini gösterir ve içi bos dairelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir. insan melanom hatti A375 hücreleri üzerindeki etkisini gösterir. Içi bos eskenar dörtgenlerin oldugu çizgi, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, içi dolu karelerin oldugu çizgi, 0.1 mg/kg'de uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir, X isaretlerinin oldugu çizgi, 0.3 mg/kg'de uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir, içi dolu üçgenlerin oldugu çizgi, 1 mg/kg'de uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir ve içi bos dairelerin oldugu çizgi, 3 mg/kg'de uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir. insan küçük hücreli olmayan kanser hatti CaIu-6 hücreleri üzerindeki etkisini gösterir.
Içi bos eskenar dörtgenlerin oldugu çizgi, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, içi bos üçgenlerin oldugu çizgi, M30-H1-L4P antikorunun etkisini gösterir ve içi bos dairelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir. transplante edilmis insan melanom hatti A375 hücreleri üzerindeki etkilerini gösterir.
Sekilde içi bos eskenar dörtgenlerin oldugu çizgi, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, içi bos dairelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (1) etkisini gösterir, içi bos üçgenlerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (13) etkisini gösterir, X isaretlerinin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (41) etkisini gösterir ve içi bos karelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (55) etkisini gösterir. transplante edilmis insan küçük hücreli olmayan akciger kanseri hatti Calu-6 hücreleri üzerindeki etkilerini gösterir. Içi bos eskenar dörtgenlerin oldugu çizgi, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, içi bos dairelerin oldugu çizgi, DE-310 etkisini gösterir, içi bos üçgenlerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (13) etkisini gösterir, X isaretlerinin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (41) etkisini gösterir ve içi bos karelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (55) etkisini gösterir. subkütanöz olarak transplante edilmis insan melanom hatti A375 hücreleri üzerindeki etkilerini gösterir. Sekilde içi dolu eskenar dörtgenlerin oldugu çizgi, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, Içi dolu karelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (17) etkisini gösterir, Içi bos karelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (18) etkisini gösterir, içi bos dairelerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (19) etkisini gösterir, içi dolu üçgenlerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (59) etkisini gösterir, içi bos üçgenlerin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (60) etkisini gösterir ve X isaretlerinin oldugu çizgi, antikor-ilaç konjugatinin (61) etkisini gösterir.
Düzenlemelerin Açiklamasi Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugati, bir antitümör antikorun, bir baglayici yapisi kismi ile antitümör bilesige konjuge edildigi antitümör ilaçtir ve asagida detayli olarak açiklanir.
Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatindan kullanilan antikor, immünoglobulin anlamina gelir ve bir antijene immün spesifik olarak baglanan bir antijen baglama bölgesini içeren bir moleküldür. Mevcut bulusun antikorunun sinifi, IgG, IgE, IgM, IgD, lgA ve lgY'den herhangi biri olabilir ve tercihen IgG'dir. Mevcut bulus antikorunun alt sinifi, lgG1, lgG2, Antikor, herhangi bir türden derive edilebilir ve bu türlerin tercih edilen örnekleri, insanlar, siçanlar, fareler ve tavsanlari içerebilir. Insan türü disindaki bir türden derive edilmesi durumunda tercihen, iyi bilinen bir teknik kullanilarak kimerize veya hümanize edilir. Mevcut bulus antikoru, poliklonal bir antikor veya monoklonal bir antikordur ve tercihen monoklonal bir antikordur.
Mevcut bulus antikoru, tümör hücrelerini hedefleyebilenler olabilir. Mevcut bulus antikorunun, bir baglayici ile antitümör aktiviteye sahip bir ilaç ile konjuge edilmesi nedeniyle antikor tercihen, bir tümör hücresini tanima özelligi, bir tümör hücresine baglanma özelligi, bir tümör hücresinde internalize olma özelligi ve bir tümör hücresine hasar verebilme özelliginin bir veya birkaçina sahiptir.
Antikorun tümör hücrelerine karsi baglanma aktivitesi, akis sitometrisi kullanilarak dogrulanabilir. Antikorun tümör hücrelerine internalizasyonu, (1) hücrelere eklenen bir antikorun, terapötik antikora baglanan sekonder bir antikor (floresan olarak etiketlenmis) kullanilarak floresans mikroskobu altinda görüntülenmesine iliskin analiz sekonder bir antikor (floresans olarak etiketlenmis) kullanilarak hücrelere eklenen floresans miktarinin ölçülmesine iliskin analiz (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, hücrelere girmesi üzerine salindigi, terapötik antikora baglanan bir immünotoksinin dogrulanabilir.
Antikorun antitümör aktivitesi, tümör hücrelerine karsi sitotoksik bir aktiviteye veya sitosidal etkiye refere eder ve hücre büyümesine karsi inhibitör aktivitenin belirlenmesi yoluyla in vitro olarak dogrulanabilir. Örnegin antikora yönelik hedef proteini asiri ifade eden bir kanser hücresi kültürlenir ve antikor, odak olusumu, koloni olusumu ve sferoid büyümesine karsi inhibitör aktiviteyi belirlemek amaciyla kültür sistemine degisen konsantrasyonlarda eklenir. Antitümör aktivite, örnegin antikorun, hedef proteini yüksek oranda ifade eden transplante edilmis tümör hücre hatti ile deney faresine uygulanmasi ve kanser hücresindeki degisimin belirlenmesi yoluyla in vivo olarak dogrulanabilir.
Antikor-ilaç konjugatindan konjuge edilen ilacin, antitümör etki saglamasi nedeniyle gerekli olmamakla birlikte antikorun antitümör etkiye sahip olmasi daha çok tercih edilir.
Antitümör etkinin saglanmasi ve ayni zamanda tümör hücrelerinin ilaç tarafindan spesifik ve selektif olarak hasara ugratilmasi amaciyla antikorun, tümör hücrelerine göç etmek üzere internalize olma özelligine sahip olmasi Önemlidir ve tercih edilir.
Bu tür bir antikorun örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere anti-A33 antikoru, anti-B7- H3 antikoru, anti-CanAg antikoru, anti-CD2O antikoru, anti-CD22 antikoru, anti-CDSO antikoru, anti-CD33 antikoru, anti-CD56 antikoru, anti-CD70 antikoru, anti-CEA antikoru, anti-Cripto antikoru, anti-EphA2 antikoru, anti-G250 antikoru, anti-MUCl antikoru, anti-GPNMB antikoru, anti-integrin antikoru, anti-PSMA antikoru, anti- tenaskin-C antikoru, anti-SLC44A4 antikoru ve anti-mezotelin antikorunu içerebilir.
Mevcut bulus antikoru tercihen, anti-CD30 antikoru, anti-CD33 antikoru, anti-CD70 antikoru veya anti-BY-H3 antikoru ve daha çok tercih edildigi üzere anti-BY-H3 antikorudur.
Mevcut bulus antikoru, hayvanlarin, antijenik bir polipeptit ile immünize edilmesi ve in vivo olarak üretilen antikorlarin toplanmasi ve saflastirilmasini içeren, genellikle teknikte gerçeklestirilen bir yöntem kullanilarak elde edilebilir. Antijenin kökeni insanlar ile sinirli degildir ve hayvanlar, fare, siçan ve benzeri gibi Insan disi bir hayvandan derive edilen bir antijen ile immünize edilebilir. Bu durumda elde edilen heterolog antijene baglanan antikorlarin insan antijenleri ile çapraz reaktivitesi, insan hastaligina uygulanabilen bir antikor yönünden tarama yapilmasi amaciyla test edilebilir.
Alternatif olarak antijene karsi antikorlar üreten antikor üreten hücreler,m0n0klonal antikorlarin elde edilebildigi hibridomlari olusturmak amaciyla teknikte bilinen bir hücreleri ile kaynastirilir.
Antijen, antijenik proteini kodlayan bir geni üretmek üzere konakçi hücrelerin genetik olarak gelistirilmesi yoluyla elde edilebilir. Spesifik olarak antijen geninin ifadesine izin veren vektörler hazirlanir ve konakçi hücreye transfer edilir, böylece gen ifade edilir. Bu sekilde ifade edilen antijen saflastirilabilir.
Anti-CD30 antikoru, anti-CD33 antikoru ve anti-CD70 antikoru, sirasiyla teknikte bilinen bir yaklasim ile elde edilebilir.
Mevcut bulusta kullanilan B7-H3 antikoru tercihen, asagida açiklanan özelliklere sahip Olanlardir: (1) Asagidaki özelliklere sahip bir antikor: (a) B7-H3'e spesifik olarak baglanma, (b) antikora bagimli hücre aracili fagositoz (ADCP) aktivitesine sahip olma ve (0) in vivo antitümör aktiviteye sahip olma. (2) (1)'e göre antikordur, burada B7-H3, SEQ ID NO: 1 veya 2 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren bir moleküldür. (3) (1) veya (2)'ye göre antikordur, burada antikor, agir zincire tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 3 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren CDRH1, SEQ ID NO: 4 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren CDRH2 ve SEO ID NO: 5 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren CDRHB'e ve hafif zincir tamamlayicilik belirleme bölgeleri olarak SEQ ID NO: 6 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren CDRL1, SEQ ID NO: 7 ile temsil edilen amino asit içeren CDRL3'e sahiptir. (4) (1) ila (3)”ten herhangi birine göre antikordur, burada sabit bölgesi, insandan (5) (1) ila (4)'ten herhangi birine göre antikordur, burada antikor, hümanize bir antikordur. (6) (5)`e göre antikordur, burada antikor, (a) SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisi, (b) SEQ ID NO: 10”daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisi, (0) SEQ ID NO: 11'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisi, (d) SEQ ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisi, (e) (a) ila (d) dizilerinin herhangi biri ile en az %95 veya daha yüksek homolojiye sahip amino asit dizisi ve (f) en az bir amino asidin delesyonlari, yer degisimleri veya eklemeleri ile (a) ila (d) dizilerinin herhangi birinden derive edilen amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesine ve (g) SEO ID NO: 13'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisi, (h) SEQ ID NO: 14'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisi, (i) SEQ ID NO: 15'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisi, (j) SEO ID NO: 16'daki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino sit dizisi, (k) SEO ID NO: 17'deki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisi, (I) SEQ ID NO: 18'deki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisi, (m) SEQ ID NO: 19'daki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisi, (n) (9) ila (m) dizilerinden herhangi biri ile en az %95 veya daha yüksek homolojiye sahip amino asit dizisi ve (o) en az bir amino asidin delesyonlari, yer degisimleri veya eklemeleri ile (9) ila (m) dizilerinin herhangi birinden derive edilen amino asit dizisinden olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesine sahiptir. (7) (6)'ya göre antikordur, burada antikor, SEQ ID NO: 9idaki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 13'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 14'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEQ içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 15'teki amino asit degisken bölgesi, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 16'daki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO lD NO: 17'deki amino asit pozisyonlari 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEO ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEQ ID NO: 18'deki amino asit pozisyonlari 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi. SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 19”daki amino asit pozisyonlari 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEQ ID NO: 12`deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 13'teki amino asit pozisyonlari 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEQ ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 14iteki amino asit pozisyonlari 21 ila 128 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir degisken bölgesi, SEQ ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEO içeren hafif zincir degisken bölgesi ve SEO ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 141 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir degisken bölgesi ve SEQ lD NO: 16`daki amino asit pozisyonlari 21 ila 128 gruptan seçilen agir zincir degisken bölgesine ve hafif zincir degisken bölgesine sahiptir. (8) (6) veya (7)'ye göre antikordur, burada antikor, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 131teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 14`teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEQ lD NO: 91daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 15'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEQ ID NO: 9”daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEQ ID NO: 16'daki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 17ideki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 18'deki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir. SEO içeren agir zincir ve SEO ID NO: 19'daki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 12'deki amino asit SEO ID NO: 13fteki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO lD NO: 14'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 15'teki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincir ve SEO ID NO: 12'deki amino asit pozisyonlarinda 20 ila 471 açiklanan amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 16'daki amino asit pozisyonlarinda 21 ila 233 açiklanan amino asit dizisini içeren hafif zincirden olusan gruptan seçilen bir agir zinciri ve hafif zinciri içerir. (9) (6) ila (8)'e göre antikordur, burada antikor, SEO ID NO: 9 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 13 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 9 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 14 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 9 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 15 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 9 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 16 ile edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO lD NO: 17 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 9 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 18 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 9 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 19 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 12 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 13 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 12 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO lD NO: 14 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir, SEO ID NO: 12 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 15 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincir ve SEO ID NO: 12 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren agir zincir ve SEO ID NO: 16 ile temsil edilen amino asit dizisini içeren hafif zincirden olusan gruptan seçilen bir agir zinciri ve bir hafif zinciri (10) (8) veya (9)'a göre antikordur, burada antikor, agir zincirde SEQ ID NO: 9 veya 12 ile temsil edilen amino asit dizisinin karboksi terminalinde amino asit içermez. (11) (1) ila (10)'dan herhangi birine göre antikorun üretilmesine yönelik bir yöntem ile elde edilen bir antikordur, bu yöntem, antikoru kodlayan bir polinükleotidi içeren bir ifade vektörü ile transforme edilen konakçi hücrenin kültürlenmesi ve ilgili antikorun, önceki adimda elde edilen kültürlerden toplanmasi adimlarini içerir. (12) (1) ila (11)'den herhangi birine göre antikordur, burada bir glikan modifikasyonu, antikora bagimli sitotoksik aktiviteyi arttirmak amaciyla regüle Buradan sonra, bulusta kullanilan BT-HS antikoru açiklanmaktadir.
Burada kullanildigi üzere “kanser” ve “tümör” terimleri, ayni anlamda kullanilir.
Burada kullanildigi üzere “gen” terimi, sadece DNA'yi degil ayni zamanda mRNA”sini, Burada kullanildigi üzere “polinükleotid” terimi, nükleik asit ile ayni anlamda kullanilir ve ayni zamanda DNA, RNA, problar, oligonükleotidler ve primerleri içerir.
Burada kullanildigi üzere “polipeptit” ve “protein" terimleri, ayrim yapilmadan kullanilir.
Burada kullanildigi üzere ”hücre” terimi, bir hayvandaki hücreleri ve kültürlenmis hücreleri içerir.
Burada kullanildigi üzere "B7-H3" terimi, B7-H3 proteini ile ayni anlamda kullanilir ve ayni zamanda B7-H3 varyanti 1`e ve/veya B7-H3 varyanti 2'ye refere eder.
Burada kullanildigi üzere “CDR“ terimi, tamamlayicilik belirleme bölgesine (CDR) refere eder ve bir antikor molekülünün her agir ve hafif zincirinin, üç tamamlayicilik belirleme bölgesine (CDR'Ier) sahip oldugu bilinir. CDR ayni zamanda çok degisken bölge olarak adlandirilir ve bir antikorun her agir ve hafif zincirinin degisken bölgesinde bulunur. Primer yapisinda olaganüstü derecede yüksek degiskenlige sahip olan bir bölgedir ve her agir ve hafif polipeptit zincirin primer yapisinda üç ayri CDR bulunur. Bu spesifikasyonda bir antikorun CDRiIerine iliskin olarak, agir zincirin CDR'Ieri, agir zincirin amino asit dizisinin amino-terminal tarafindan CDRHi, CDRH2 ve CDRH3 ile temsil edilir ve hafif zincirin CDR'Ieri, hafif zincirin amino asit dizisinin amino-terminal tarafindan CDRL1, CDRL2 ve CDRL3 ile temsil edilir. Bu bölgeler, tersiyer yapida birbirine yakindir ve antikorun baglandigi antijene yönelik spesifikligi belirler.
Burada kullanildigi üzere “melezleme, kesin kosullar altinda gerçeklestirilir” ifadesi, melezlemenin, ticari olarak temin edilebilen melezleme solüsyonu olan ExpressHyb Melezleme Solüsyonu (Clontech, Inc. tarafindan üretilmistir) içinde 68°C'de melezleme gerçeklestirilmesi veya üzerine DNA`nin immobilize edildigi bir filtre kullanilarak 0.7 ila solüsyonu (1 x 880 solüsyonu, kullanilarak 68°C'de veya buna esdeger kosullar altinda yikama yapilmasi yoluyla saglanabildigi bir prosese refere eder. 1. B7-H3 B7-H3, es-uyarici molekül olarak antijen sunan hücreler üzerinde ifade edilen B7 ailesinin bir üyesidir ve immün aktiviteyi arttirmak veya baskilamak amaciyla T hücreler üzerindeki reseptör üzerine etki ettigi kabul edilir.
B7-H3, tek geçisli, transmembran yapisina sahip bir proteindir ve B7-H3'ün N-terminal hücre disi dimeni iki varyant içerir. B7-H3 varyanti 1 (4Ig-BY-H3), iki bölgede sirasiyla V benzeri veya C benzeri lg domeni içerir ve BT-H3 varyanti 2 (2Ig-B7-H3), bir bölgede sirasiyla V benzeri veya C benzeri lg domeni içerir.
Bulusta kullanilacak BY-H3 için oldugu gibi B7-H3 direkt olarak, insan veya insan disi bir memelinin (siçan veya fare gibi) B7-H3 ifade eden hücrelerinden saflastirilir ve kullanilir veya yukarida açiklanan hücrelerin hücre membrani fraksiyonu hazirlanir ve kullanilir. B7-H3 ayrica, in vitro sentezi veya genetik mühendisligi yoluyla konakçi hücrede üretimi yoluyla elde edilebilir. Genetik mühendisliginde spesifik olarak B7-H3 cDNA'nin, B7-H3 cDNA'yi ifade edebilen bir vektöre entegre edilmesinden sonra B7- H3, bunun bir enzim, bir substrat ve transkripsiyon ve translasyon için gerekli bir enerji maddesini içeren bir solüsyon içinde sentezlenmesi veya B7-H3'ün prokaryotik veya ökaryotik transforme bir baska konakçi hücre içinde ifade edilmesi ile elde edilebilir.
Insan B7-H3 varyanti 1 geninin açik okuma çerçevesine (ORF) ait amino asit dizisi, Dizi Listesinde SEQ ID NO: 1 ile temsil edilir. Ayrica SEQ ID NO: 1 dizisi, Sekil 1'de gösterilir.
Insan B7-H3 varyanti 2 geninin ORF”sine ait amino asit dizisi, Dizi Listesinde SEO ID NO: 2 ile temsil edilir. Ayrica SEQ ID NO: 2 dizisi, Sekil 2'de gösterilir.
Ayrica bir veya birkaç amino asidin, BY-H3'ün yukarida açiklanan amino asit dizilerinden herhangi birinde sübstitüe edildigi, silindigi ve/veya eklendigi bir amino asit dizisinden olusan ve ayni zamanda proteininkine esdeger biyolojik aktiviteye sahip olan bir protein, BY-H3'e dahil edilir.
Sinyal dizisinin çikarildigi olgun insan B7-H3 varyanti 1, SEQ ID NO: 1 ile temsil edilen amino asit dizisinin amino asit kalintilarindan 27 ila 534 olusan amino asit dizisine karsilik gelir. Ayrica sinyal dizisinin çikarildigi olgun insan B7-H3 varyanti 2, SEQ ID NO: 2 ile temsil edilen amino asit dizisinin amino asit kalintilarindan 27 ila 316 olusan amino asit dizisine karsilik gelir. 2. Anti-B7-H3 antikorunun üretimi Bulusun B7-H3”üne karsi antikor, bir hayvanin, B7-H3 veya B7-H3'ün amino asit dizisinden seçilen rastgele bir polipeptit ile immünize edilmesi ve ortak bir prosedüre göre in vivo olarak üretilen antikorun toplanmasi ve saflastirilmasi yoluyla elde edilebilir. Bir antijen olarak kullanilacak biyolojik B7-H3 türü, insan olmasi ile sinirlandirilmaz ve bir hayvan, fare veya siçan gibi insan disindaki bir hayvandan derive edilen B7-H3 ile immünize edilebilir. Bu durumda elde edilen heterolog B7-H3'ye baglanan bir antikor ile insan B7-H3 arasindaki çapraz reaktivitenin incelenmesi ile bir insan hastaligina uygulanabilen bir antikor seçilebilir.
Ayrica monoklonal bir antikor, B7-H3'e karsi antikor üreten antikor üreten hücrelerin göre miyelom hücreleri ile kaynastirilmasi yoluyla olusturulan bir hibridomdan elde edilebilir.
Bir antijen olarak kullanilacak BT-H3, genetik mühendisligi kullanilarak B7-H3 geninin konakçi bir hücrede ifade edilmesi yoluyla elde edilebilir.
Spesifik olarak B7-H3 genini ifade edebilen bir vektör üretilir ve elde edilen vektör, geni ifade etmek üzere konakçi hücreye transfekte edilir ve akabinde ifade edilen B7-H3 saflastirilir. Buradan sonra B7-H3'e karsi bir antikoru elde etme yöntemi spesifik olarak açiklanir. (1) Antijen hazirlanisi Anti-BY-H3 antikorunun üretilmesi amaciyla kullanilacak antijenin örnekleri, B7-H3, B7- H3'ün en az 6 ardisik amino asidini içeren kismi bir amino asit dizisinden olusan bir polipeptit ve buna belirli bir amino asit dizisinin veya tasiyicinin eklenmesi ile elde edilen bir deriveyi içerir.
B7-H3, direkt olarak insan tümör dokularindan veya tümör hücrelerinden saflastirilir ve kullanilir. Ayrica BT-H3, bunun in vitro olarak sentezlenmesi veya genetik mühendisligi ile konakçi hücrede üretilmesi yoluyla elde edilebilir.
Genetik mühendisligine iliskin olarak spesifik olarak B7-H3 cDNA'nin, B7-H3 cDNA'yi ifade edebilen bir vektöre entegre edilmesinden sonra B7-H3, bunun, bir enzim, bir substrat ve transkripsiyon ve translasyon için gerekli bir enerji maddesini içeren solüsyon içinde sentezlenmesi veya BY-Hß'ün prokaryotik veya ökaryotik transforme bir baska konakçi hücre içinde ifade edilmesi yoluyla elde edilebilir.
Antijen ayrica, bir membran proteini olan, B7-H3'ün hücre disi domeninin uygun bir konakçi-vektör sisteminde bir antikorun sabit bölgesine baglanmasi ile elde edilen bir füzyon proteininin ifade edilmesi yoluyla salgilayici protein olarak elde edilebilir.
B7-H3 cDNA örnegin, PCR olarak adlandirilan bir yöntem ile elde edilebilir, burada bir polimeraz zincir reaksiyonu (buradan sonra “PCR” olarak refere edilir), kalip olarak B7- H3 cDNA'yi ifade eden bir cDNA kütüphanesi ve spesifik olarak B7-H3 cDNA'yi çogaltan primerler kullanilarak gerçeklestirilir (bakiniz, Saiki, R. K., et al., Science, Polipeptidin in vitro sentezi olarak örnegin Roche Diagnostics, Inc. tarafindan üretilen Hizli Translasyon Sistemi (RTS) örnek verilebilir, ancak bununla sinirli degildir.
Prokaryotik konakçi hücrelerin örnekleri, Escherichia coli ve Bacillus subtilis'i içerir.
Konakçi hücreleri hedef gen ile transforme etmek amaciyla konakçi hücreler, bir replikonu, yani konakçi ile uyumlu bir türden derive edilen replikonu ve regülatör bir dizi içeren plazmid vektörü ile transforme edilir. Ayrica vektör tercihen, transforme hücreye fenotipik selektivite verebilen bir diziye sahiptir. Ökaryotik konakçi hücrelerin örnekleri, omurgali hücreleri, böcek hücreleri ve maya hücrelerini içerir. Omurgali hücreleri olarak örnegin maymun COS hücreleri (Gluzman, Y., Cell, (, mürin fibroblastlari NIH3T3 (ATCC dihidrofolat redüktazdan yoksun suslari (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. hücreler, bunlarla sinirli degildir.
Bu sekilde elde edilen transformant, genel bir prosedüre göre kültürlenebilir ve transformantin kültürlenmesi ile hedef bir polipeptit, hücre içinde veya hücre disinda üretilir.
Kültürleme için kullanilacak uygun bir ortam, kullanilan konakçi hücrelere bagli olarak yaygin olarak kullanilan çesitli kültür ortamlarindan seçilebilir. Escherichia coli'nin kullanilmasi halinde örnegin gerektigi sekilde ampisilin veya IPMG gibi bir antibiyotik eklenen bir LB ortami kullanilabilir.
Bu tür bir kültürleme yoluyla transformant ile hücre içinde veya hücre disinda üretilen rekombinant bir protein, proteinin fiziksel veya kimyasal özelligi kullanilarak bilinen çesitli ayirma yöntemlerinden herhangi biri ile ayrilabilir ve saflastirilabilir.
Yöntemlerin spesifik örnekleri, yaygin bir protein çökeltisi ile muamele, ultrafiltrasyon, moleküler elek kromatografisi (jel filtrasyonu)i adsorpsiyon kromatografisi, iyon degistirme kromatografisi ve afinite kromatografisi gibi sivi kromatografisinin çesitli türleri, diyaliz ve kombinasyonunu içerir.
Ayrica, alti histidin kalintisindan olusan bir etiketin, ifade edilecek rekombinant proteine baglanmasi ile protein, nikel afinite kolonu ile etkili bir sekilde saflastirilabilir. Alternatif olarak IgG Fc bölgesinin, ifade edilecek rekombinant bir proteine baglanmasi ile protein, protein A kolonu ile etkili bir sekilde saflastirilabilir.
Yukarida açiklanan yöntemlerin kombine edilmesi ile büyük miktarda hedef polipeptit, yüksek verim ve yüksek saflikta kolaylikla üretilebilir. (2) Anti-BT-H3 monoklonal antikorunun üretimi B7-H3,e antikor spesifik baglanmanin örnekleri, B7-H3'e monoklonal antikor spesifik baglanmasini içerir ve bu antikor elde etme yöntemi, asagida açiklanan gibidir.
Monoklonal bir antikorun üretimi genel olarak asagidaki islem adimlarini gerektirir: (a) antijen olarak kullanilacak biyopolimerin saflastirilmasi; (b) bir hayvanin antijen enjeksiyonu ile immünize edilmesi yoluyla antikor üreten hücrelerin hazirlanmasi, kanin alinmasi, dalagin kesip alinma zamanini belirlemek üzere antikor titresinin analiz edilmesi; (c) miyelom hücrelerinin (buradan sonra “miyelom” olarak refere edilir) hazirlanmasi; (d) antikor üreten hücrelerin miyelom ile kaynastirilmasi; (e) istenen antikoru üreten hibridomlarin bir grubunun taranmasi; (f) hibridolarin tekli hücre klonlarina bölünmesi (klonlama); (g) istege bagli olarak hibridomun kültürlenmesi veya büyük miktarda monoklonal antikor üretmeye yönelik hibridom ile implante edilen bir hayvanin yetistirilmesi; (h) bu sekilde üretilen monoklonal antikorun biyolojik aktivite ve baglanma spesifikligi yönünden incelenmesi veya bunun, etiketli bir reaktif olarak özellikler yönünden analiz edilmesi; ve benzeri.
Buradan sonra monoklonal bir antikoru üretme yöntemi, yukaridaki adimlar takip edilerek detayli olarak açiklanacaktir ancak yöntem, bununla sinirlandirilmaz ve örnegin dalak hücreleri ve miyelom disindaki diger antijen üreten hücreler kullanilabilir. (a) Antijenin saflastirilmasi Antijen olarak yukarida açiklanan yöntem ile hazirlanan B7-H3 veya kismi bir peptidi kullanilabilir.
Ayrica B7-H3 ifade eden rekombinant hücrelerden hazirlanan bir membran fraksiyonu veya BT-H3 ifade eden rekombinant hücreler ve ayni zamanda teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem ile kimyasal olarak sentezlenen bulus proteininin kismi bir peptidi (b) Antikor üreten hücrelerin hazirlanisi Adimda (a) elde edilen antijen, tam veya tam olmayan Freund adjuvani veya alüminyum potasyum sülfat gibi bir adjuvan ile karistirilir ve elde edilen karisim, deney hayvanini immünize etmek amaciyla immünojen olarak kullanilir. Deney hayvani olarak bilinen bir hibridom üretim yönteminde kullanilan herhangi bir hayvan sorunsuzca kullanilabilir. Spesifik olarak örnegin fare, siçan, keçi, koyun, sigir, at veya benzeri kullanilabilir. Ancak özütlenen antikor üreten hücreler ile kaynastirilacak miyelom hücrelerinin elde edilmesinin kolayligi açisindan immünize edilecek hayvan olarak tercihen fare veya siçan kullanilir.
Ayrica kullanilacak fare veya siçan susu özellikle sinirlandirilmaz ve fare durumunda örnegin, A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R llI, SJL, SWR, WB ve 129 ve benzeri gibi çesitli suslar kullanilabilir ve siçan durumunda örnegin, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer ve benzeri kullanilabilir.
Bu fareler ve siçanlar, örnegin CLEA Japan, Inc. ve Charles River Laboratories Japan, edilebilir.
Bunlar arasinda, yukarida açiklanan miyelom hücreleri ile kaynastirilmaya uygunluk göz önünde tutularak fare durumunda BALB/c susu ve siçan durumunda Wistar ve Low suslari immünize edilecek hayvan olarak özellikle tercih edilir.
Ayrica insanlar ve fareler arasindaki antijenik homoloji göz önünde bulunduruldugunda ayni zamanda otoantikorlari uzaklastirmak üzere biyolojik fonksiyonu azaltilmis olan bir farenin, yani, otoimmün hastaligi olan bir farenin kullanilmasi tercih edilir.
Bu fare veya siçanin immünizasyon zamanindaki yasi tercihen 5 ila 12 hafta, daha çok tercih edildigi üzere 6 ila 8 haftadir.
Bir hayvanin, B7-H3 veya rekombinanti ile immünize edilmesi amaciyla örnegin Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. l. ll. lll., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental lmmunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, lllinois'de (1964) detayli olarak açiklanan örnegin bilinen bir yöntem veya benzeri kullanilabilir.
Bu immünizasyon yöntemleri arasindan bulusta tercih edilen spesifik yöntem örnegin asagidakidir.
Diger bir deyisle ilk olarak antijen olarak görev yapan membran protein fraksiyonu veya antijeni ifade etmesi saglanan hücreler, bir hayvana intradermal olarak veya intraperitoneal olarak uygulanir.
Ancak her iki uygulama yolunun kombinasyonu, immünizasyon etkinliginin arttirilmasi için tercih edilir ve ilk yarida intradermal uygulama yapildiginda ve ikinci yarida intraperitoneal uygulama yapildiginda veya sadece son dozlamada immünizasyon etkinligi özellikle arttirilabilir.
Antijenin uygulama plani, immünize edilecek hayvanin türü, bireysel farklilik veya benzerlerine bagli olarak degisir. Ancak genel olarak antijenin uygulanma sikliginin 3 ila 6 kez ve dozlama araliginin 2 ila 6 hafta oldugu bir uygulama plani tercih edilir ve antijenin uygulanma sikliginin 3 ila4 kez ve dozlama araliginin 2 ila 4 hafta oldugu bir uygulama plani daha çok tercih edilir.
Ayrica antijen dozu, hayvanin türü, bireysel farkliliklar veya benzerlerine bagli olarak degisir, fakat doz gelen olarak 0.05 ila 5 mg'ye, tercihen yaklasik 0.1 ila 0.5 mg'ye ayarlanir.
Güçlendirici bir immünizasyon, yukarida açiklandigi üzere antijenin uygulanmasindan 1 ila 6 hafta, tercihen 2 ila 4 hafta, daha çok tercih edildigi üzere 2 ila 3 hafta sonra gerçeklesti rilir.
Güçlendirici immünizasyonun gerçeklestirilme zamanindaki antijen dozu, hayvanin türüne ve boyutuna veya benzerine bagli olarak degisir, ancak örnegin fare durumunda doz genel olarak, 0.05 ila 5 mg'ye, tercihen 0.1 ila 0.5 mg'ye, daha çok tercih edildigi Üzere yaklasik 0.1 ila 02 mg'ye ayarlanir.
Antikor üreten hücreleri içeren dalak hücreleri veya Ienfositler, güçlendirici immünizasyondan 1 ila 10 gün, tercihen 2 ila 5 gün, daha çok tercih edildigi üzere 2 ila 3 gün sonra immünize hayvandan aseptik olarak çikarilir. Bu zamanda antikor titresi ölçülür ve yeteri derecede yüksek antikor titresine sahip bir hayvanin, antikor üreten hücrelerin tedarik kaynagi olarak kullanilmasi halinde sonraki prosedür daha etkili bir sekilde gerçeklestirilebilir.
Kullanilacak antikor titresini ölçme yönteminin örnekleri, RIA yöntemi ve ELISA yöntemini içerir, ancak yöntem, bunlarla sinirli degildir. Örnegin bir ELlSA yönteminin kullanilmasi halinde bulusta antikor titresinin ölçümü, asagida açiklanan prosedürlere göre gerçeklestirilebilir.
Ilk olarak saflastirilmis veya kismen saflastirilmis bir antijen, ELISA için 96 gözlü bir plaka gibi kati bir fazin yüzeyine adsorbe edilir ve üzerine antijen adsorbe edilmemis kati fazin yüzeyi, bovin serum albümin (buradan sonra “BSA” olarak refere edilir) gibi antijen ile ilgisi olmayan bir protein ile kaplanir. Yüzeyin yikanmasindan sonra yüzey, numunedeki antikorun antijene baglanmasini saglamak amaciyla primer antikor olarak seri olarak seyreltilmis bir numune (örnegin fare serumu) ile temas ettirilir.
Ayrica sekonder antikor olarak fare antikoruna karsi bir enzim ile etiketlenmis bir antikor eklenir ve fare antikoruna baglanmasi saglanir. Yikama islemi sonrasinda enzime yönelik bir substrat eklenir ve maddenin parçalanmasi ile indüklenen renk gelisimi veya benzeri nedeniyle meydana gelen absorbanstaki degisiklik ölçülür ve antikor titresi, bu ölçüme göre hesaplanir.
Antikor üreten hücrelerin, immünize hayvanin dalak hücrelerinden veya Ienfositlerinden hücreleri durumunda antikor üreten hücrelerin, paslanmaz çelik elek ile filtrasyon yoluyla hücreleri elde etmek üzere dalagin homojenize edilmesi ve hücrelerin Eagle Minimum Esansiyel Ortamda (MEM) süspanse edilmesi ile ayrildigi genel bir yöntem kullanilabilir. (c) Miyelom hücrelerinin hazirlanisi (buradan sonra “miyelom” olarak refere Hücre füzyonu için kullanilacak miyelom hücreleri özellikle sinirlandirilmaz ve uygun hücreler, bilinen hücre hatlarindan seçilebilir. Ancak kaynasik hücrelerden bir hibridomun seçilme zamaninin uygunlugu dikkate alindiginda seçim prosedürünün belirli oldugu bir HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibozil transferaz) yoksun susun kullanilmasi tercih edilir.
Daha spesifik olarak HGPRT yoksun susun örnekleri, X63-Ag8(X63), N81- siçanlardan derive edilen , GM ve insanlardan derive edilen ,i içerir. Bu HGPRT yoksun suslar örnegin Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan (ATCC) veya benzerinden temin edilebilir.
Bu hücre suslari, 8-azaguanin ortami [8-azaguaninin, glutamin, 2-merkaptoetan0l, gentamisin ve fötal dana serumu (buradan sonra "FCS” olarak refere edilir) eklenen RPMI 1640 ortamina eklenmesi ile elde edilen bir ortamdir], Iscove Modifiye Dulbecco Ortami (buradan sonra "IMDM" olarak refere edilir) veya Dulbecco Modifiye Eagle Ortami (buradan sonra "DMEM" olarak refere edilir) gibi uygun bir ortam içinde alt kültürlenir. Bu durumda hücre füzyonunun gerçeklestirilmesinden 3 ila 4 gün önce hücreler, hücre füzyonu gününde 2 x 107'den az olmayan hücre saglamak amaciyla normal ortam [örnegin, %10 FCS içeren ASF104 ortami (Ajinomoto Co., Ltd. tarafindan üretilmistir)] içinde alt kültürlenir. (d) Hücre füzyonu Antikor üreten hücreler ile miyelom hücreleri arasindaki füzyon, hücrelerin hayatta kalma oraninin asiri derecede azaltilmadigi kosullar altinda bilinen bir yönteme (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental göre uygun sekilde gerçeklestirilebilir.
Bu tür bir yöntem olarak, örnegin antikor üreten hücrelerin ve miyelom hücrelerinin, yüksek konsantrasyonda polietilen alkol gibi bir polimeri içeren bir solüsyon içinde karistirildigi kimyasal bir yöntem, elektrik uyariminin kullanildigi fiziksel bir yöntem veya benzeri kullanilabilir. Bu yöntemler arasindan kimyasal yöntemin spesifik bir örnegi asagida açiklanan gibidir.
Yani, yüksek konsantrasyonda polimer içeren solüsyonda polietilen glikolün kullanildigi durumda antikor üreten hücreler ve miyelom hücreleri, 30 ila 40°C arasinda, tercihen ila 38°C arasinda olan bir sicaklikta 1 ila 10 dakika, tercihen 5 ila 8 dakika boyunca sahip polietilen glikolün solüsyonu içinde karistirilir. (e) Hibridomlarin bir grubunun seçimi Yukarida açiklanan hücre füzyonu ile elde edilen hibridomlari seçme yöntemi özellikle sinirlandirilmaz. Genel olarak bir HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) seçim yöntemi kullanilir.
Bu yöntem, hibridomlarin, aminopterin varliginda hayatta kalamayan HGPRT yoksun susun miyelom hücreleri kullanilarak elde edilmesi durumunda etkilidir.
Yani, kaynastirilmamis hücrelerin ve hibridomlarin HAT ortaminda kültürlenmesi ile sadece aminopterine karsi dirençli hibridomlarin selektif olarak hayatta kalmasina ve prolifere olmasina izin verilir. (f) Tekli hücre klonuna bölünme (klonlama) Hibridomlara yönelik klonlama yöntemi olarak metil selüloz yöntemi, yumusak agaroz yöntemi veya sinirlayici dilüzyon yöntemi gibi bilinen bir yöntem kullanilabilir (bakiniz, örnegin Barbara, B. M. and Stanley, M. 8.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Bu yöntemler arasindan özellikle metilselüloz yöntemi gibi üç boyutlu bir kültür yöntemi tercih edilir. Örnegin hücre füzyonu ile üretilen hibridomlarin grubu, CIonaCeII-HY Seçim Ortami D (StemCelI Technologies, inc. tarafindan üretilmistir, #03804) gibi metilselüloz ortaminda süspanse edilir ve kültürlenir. Akabinde olusturulan hibridom kolonileri toplanir, böylelikle monoklonal hibridomlar elde edilebilir. Toplanan ilgili hibridom kolonileri kültürlenir ve elde edilen bir hibridom kültür üst fazinda stabil bir antikor titresine sahip oldugu dogrulanan bir hibridom, BY-H3 monoklonal antikor üreten hibridom susu olarak seçilir.
Bu sekilde olusturulan hibridom susunun örnekleri, B7-H3 hibridomu M30'u içerir. Bu spesifikasyonda B7-H3 hibridomu M30 ile üretilen bir antikor, "M30 antikoru" veya basit sekilde “M30" olarak refere edilir.
M30 antikorunun agir zinciri, Dizi Listesinde SEQ ID NO: 20 ile temsil edilen bir amino asit dizisine sahiptir. Ayrica M30 antikorunun hafif zinciri, Dizi Listesinde SEQ ID NO: 21 ile temsil edilen amino asit dizisine sahiptir. Dizi Listesinde SEQ ID NO: 20 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisinde amino asit kalintilarindan 1 ila 19 olusan bir amino asit dizisi, bir sinyal dizisidir, amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan bir amino asit dizisi, degisken bir bölgedir ve amino asit kalintilarindan 142 ila 471 olusan bir amino asit dizisi, sabit bir bölgedir. Ayrica Dizi Listesinde SEQ ID NO: 21 ile temsil edilen hafif zincir amino asit dizisinde amino asit kalintilarindan 1 ila 22 olusan bir amino asit dizisi, sinyal dizisidir, amino asit kalintilarindan 23 ila 130 olusan bir amino asit dizisi, degisken bir bölgedir ve amino asit kalintilarindan 131 ila 235 olusan bir amino asit dizisi, sabit bir bölgedir. (g) Hibridomun kültürlenmesi ile monoklonal antikorun hazirlanisi Bu sekilde seçilen hibridomun kültürlenmesi ile monoklonal bir antikor etkili bir sekilde elde edilir. Ancak kültürleme öncesinde hedef monoklonal antikoru üreten bir hibridomun taranma isleminin yapilmasi tercih edilir.
Bu tür bir tarama isleminde, bilinen bir yöntem kullanilabilir.
Bulusta antikor titresinin ölçümü, örnegin yukarida açiklanan (b) maddesinde açiklanan ELISA yöntemi ile gerçeklestirilebilir.
Yukarida açiklanan yöntem ile elde edilen hibridom, -80°C veya altinda bir dondurucuda veya sivi nitrojen içinde donmus halde saklanabilir.
Klonlamanin tamamlanmasindan sonra ortam, HT ortamindan normal bir ortama degistirilir ve hibridom kültürlenir.
Büyük ölçekli kültür, büyük bir kültür sisesi kullanilarak rotasyon kültürü ile veya döner kültür ile gerçeklestirilir. Büyük ölçekli kültürden elde edilen üst fazdan spesifik olarak bulus proteinine baglanan monoklonal bir antikor, jel filtrasyonu gibi teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem kullanilarak saflastirma ile elde edilebilir.
Ayrica hibridom, hibridomu prolifere etmek amaciyla hibridom ile ayni susta olan bir farenin (örnegin yukarida açiklanan BALB/c) veya Nu/Nu farenin karin bosluguna enjekte edilir, böylelikle büyük miktarda bulusun monoklonal antikorunu içeren assit elde edilebilir.
Hibridomun, karin bosluguna uygulandigi durumda 2,6,10,14-tetrametil pentadekan (pristan) gibi mineral bir yagin, bundan 3 ila 7 gün önce uygulanmasi halinde büyük miktarda assit elde edilebilir. Örnegin bir immün baskilayici, T hücrelerini inaktive etmek amaciyla hibridom ile ayni sustaki bir farenin karin bosluguna önceden enjekte edilir. 20 gün sonra 106 ila 107 hibridom klon hücresi, serumsuz ortamda (0.5 ml) süspanse edilir ve süspansiyon, farenin karin bosluguna uygulanir. Genel olarak karin genislediginde ve assit ile doldugunda assit, fareden toplanir. Bu yöntem ile monoklonal antikor, kültür solüsyonunkinden yaklasik 100 kat veya çok daha yüksek olan bir konsantrasyonda Yukarida açiklanan yöntem ile elde edilen monoklonal antikor, örnegin Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford'da (1978) açiklanan bir yöntem ile saflastirilabilir.
Bu sekilde elde edilen monoklonal antikor, B'I-H3 için yüksek antijen spesifikligine sahiptir. (h) Monoklonal antikorun analizi Bu sekilde elde edilen monoklonal antikorun izotipi ve alt sinifi asagidaki sekilde belirlenebilir.
Ilk olarak tanimlama yönteminin örnekleri, Ouchterlony yöntemi, ELISA yöntemi ve RIA yöntemini içerir.
Ouchterlony yöntemi basittir, ancak monoklonal antikor konsantrasyonu düsük oldugunda yogusturma islemi gerekir.
Diger taraftan bir ELISA yöntemi veya RIA yöntemi kullanildiginda kültür üst fazinin direkt olarak antijen adsorbe edilmis kati faz ile reakte edilmesi ve sekonder antikorlar olarak immünoglobulin izotiplerinin ve alt siniflarinin çesitli tiplerine karsilik gelen antikorlarin kullanilmasi ile monoklonal antikorun izotipi ve alt sinifi tanimlanabilir.
Ayrica, daha basit bir yöntem olarak ticari olarak temin edilebilen bir tanimlama kiti (örnegin Bio-Rad Laboratories, Inc. tarafindan üretilen Fare Tipleme Kiti veya benzeri kullanilabilir.
Ayrica bir proteinin nicel tayini, Folin Lowry yöntemi ve 280 nm'deki absorbansa dayali hesaplama yöntemi ile gerçeklestirilebilir [ = Immünoglobulin 1 mg/ml].
Ayrica monoklonal antikor, (2),deki (a) ila (h)'deki adimlarin tekrar gerçeklestirilmesi yoluyla ayri ve bagimsiz olarak elde edildiginde dahi M30 antikorununkine esdeger sitotoksik bir aktiviteye sahip antikorun elde edilmesi mümkündür. Bu tür bir antikorun bir örnegi olarak M30 antikoru ile ayni epitopa baglanan bir antikor örnek verilebilir.
M30, B7-H3 hücre disi domenindeki domen olan IgC1 veya IgC2 domenindeki epitopu tanir ve IgC1 domenine veya IgC2 domenine veya her ikisine baglanir. Bu nedenle bulus antikoruna yönelik epitop olarak B7-H3'ün IgC1 veya !902 domeninde bulunan bir epitop Örnek verilebilir. Yeni üretilen bir monoklonal antikorun, M30 antikorunun baglandigi kismi tersiyer yapiya veya kismi bir peptide baglanmasi halinde monoklonal antikorun, M30 antikoru ile ayni epitopa baglandigi belirlenebilir. Ayrica monoklonal antikorun, B7-H3'e baglanma için M30 antikoru ile yaristiginin (yani monoklonal antikor, M30 ile B7-H3 arasindaki baglanmayi inhibe eder) dogrulanmasi ile spesifik epitop dizisinin veya yapisinin belirlenmemis olmasi durumunda dahi monoklonal antikorun, M30 antikoru ile ayni epitopa baglandigi belirlenebilir. Monoklonal antikorun, M30 antikoru ile ayni epitopa baglandigi dogrulandiginda bu monoklonal antikorun, M30 antikorununkine esdeger sitotoksik bir aktiviteye sahip olmasi yüksek oranda beklenir. (3) Diger antikorlar Bulusun antikoru, sadece B7-H3'e karsi yukarida açiklanan monoklonal antikoru degil ayni zamanda kimerik antikor, hümanize antikor ve insan antikoru gibi insanlara karsi heterolog antijenikligin azaltilmasi amaciyla yapay modifikasyon ile elde edilen rekombinant bir antikoru da içerir. Bu antikorlar, bilinen bir yöntem ile üretilebilir.
Kimeirk antikor olarak antikor degisken ve sabit bölgelerinin, farkli türlerden derive edildigi bir antikor, örnegin fare veya siçandan derive edilen antikor degisken bölgesinin, insandan derive edilen antikor sabit bölgesine baglandigi kimerik bir antikor Hümanize antikor olarak, sadece bir tamamlayicilik belirleme bölgesinin (CDR) insandan derive edilen bir antikora entegre edilmesi ile elde edilen bir antikor (bakiniz kalintilarinin bir parçasinin, CDR greftleme yöntemi (WO 90/07861) ile insan antikoruna greftlenmesi yoluyla elde edilen bir antikor örnek verilebilir.
Ancak M30 antikorundan derive edilen hümanize antikor, hümanize antikorun, M30 antikorunun CDR dizilerinin 6 tipine sahip oldugu ve antitümör aktiviteye sahip oldugu sürece spesifik hümanizez antikor ile sinirlandirilmaz. M30 antikorunun agir zincir degisken bölgesi, Dizi Listesinde SEO ID NO: 3 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH1 (NYVMH), Dizi Listesinde SEQ ID NO: 4 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) ve Dizi Listesinde SEO ID NO: 5 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRH3'e (WGYYGSPLYYFDY) sahiptir.
Ayrica M30 antikorunun hafif zincir degisken bölgesi, Dizi Listesinde SEO ID NO: 6 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRL1 (RASSRLIYMH), Dizi Listesinde SEQ ID NO: 7 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRL2 (ATSNLAS) ve Dizi Listesinde SEQ ID NO: 8 ile temsil edilen amino asit dizisinden olusan CDRL3'e (QQWNSNPPT) sahiptir.
Bir fare antikorunun M30 hümanize antikorunun bir örnegi olarak (1) Dizi Listesinde asit dizisi, (2) yukarida açiklanan amino asit dizisi (1) ile en az %95 veya daha fazla homolojiye sahip bir amino asit dizisi ve (3) yukarida açiklanan amino asit dizisindeki (1) bir veya birkaç amino asidin silindigi, sübstitüe edildigi veya eklendigi bir amino asit dizisinin herhangi birinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve kalintilarindan 21 ila 128 olusan bir amino asit dizisi, (5) yukarida açiklanan amino asit dizisi (4) ile en az %95 veya daha fazla homolojiye sahip bir amino asit dizisi ve (6) yukarida açiklanan amino asit dizisindeki (4) bir veya birkaç amino asidin, silindigi, sübstitüe edildigi veya eklendigi bir amino asidin herhangi birinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirin rastgele bir kombinasyonu örnek verilebilir.
Bu spesifikasyondaki amino asit sübstitüsyonu olarak konservatif bir amino asit sübstitüsyonu tercih edilir. Konservatif amino asit sübstitüsyonu, amino sit yan zincirleri ile ilgili amino asitlerin bir grubu içinde görülen bir sübstitüsyona refere eder. Tercih edilen amino asit gruplari sunlardir: asidik grup (aspartik asit ve glutamik asit): bazik grup (Iizin, arjinin ve histidin): polar olmayan bir grup (alanin, valin, lösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metiyonin ve triptofan) ve yüksüz polar aile (glisin, asparajin, glutamin, sistein, serin, treonin ve tirozin). Daha çok tercih edilen amino asit gruplari sunlardir: alifatik hidroksi grubu (serin ve treonin); amid içeren grup (asparajin ve glutamin); alifatik grup (alanin, valin, lösin ve izolösin) ve aromatik grup (fenilalanin, triptofan ve tirozin). Bu tür bir amino asit sübstitüsyonu tercihen, orijinal amino asit dizisine sahip bir maddenin özelliklerini bozmayan bir aralikta gerçeklestirilir.
Yukarida açiklanan bir agir zincir ve hafif zincirin tercih edilen kombinasyonuna sahip bir antikor olarak SEQ lD NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 13'ün amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 14'ün amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 15'in amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 9*un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 16'nin amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 17*nin amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 18'in amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 19”un amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 12`nin amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 13'ün amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 12'nin amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 14'ün amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor; SEO ID NO: 12”nin amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 15'in amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor ve SEO ID NO: 12'nin amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan amino asit dizisinden olusan agir zincir degisken bölgesini içeren bir agir zincir ve SEO ID NO: 16'nin amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan amino asit dizisinden olusan hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincirden olusan bir antikor örnek verilebilir.
Ayrica yukarida açiklanan agir zincir ve hafif zincirin daha çok tercih edilen bir kombinasyonuna sahip bir antikor olarak SEO ID NO: 9`un amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 13`ün amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEO ID NO: 9`un amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 14'ün amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEO ID NO: 9lun amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 15'in amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEO ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 16'nin amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 9iun amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 17'nin amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ lD NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 18`in amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 19'un amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 12'nin amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 13iün amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 12'nin amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 14'ün amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 12'nin amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 15'in amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor ve SEO ID NO: 12'nin amino asit kalintilarindan 20 ila 471 olusan amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 16'nin amino asit kalintilarindan 21 ila 233 olusan amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor örnek verilebilir.
Ayrica yukarida açiklanan agir zincir ve hafif zincirin daha çok tercih edilen bir baska kombinasyonuna sahip bir antikor olarak SEQ ID NO: 9'un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 13'ün amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 9`un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 14'ün amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 15”in amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEO ID NO: 9'un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ ID NO: 16'nin amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ ID NO: 17'nin amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 9'un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 18'in amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEO ID NO: 9'un amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEQ lD NO: 19'un amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 12'nin amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 13'ün amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 12'nin amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 14'ün amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor; SEQ ID NO: 12'nin amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 15'in amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor ve SEO ID NO: 12'nin amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 16'nin amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan antikor örnek verilebilir.
Yukarida açiklanan agir zincir amino asit dizisi ile yüksek homolojiye sahip bir dizinin yukarida açiklanan hafif zincir amino asit dizisi ile yüksek homolojiye sahip bir dizi ile kombine edilmesi yoluyla yukarida açiklanan antikorlardan her birininkine esdeger sitotoksik aktiviteye sahip bir antikorun seçilmesi mümkündür. Bu tür bir homoloji genellikle, %80 veya daha fazla olan homoloji, tercihen %90 veya daha fazla olan homoloji, daha çok tercih edildigi üzere %95 veya daha fazla olan homoloji, en çok tercih edildigi üzere %99 veya daha fazla olan homolojidir. Ayrica bir ila birkaç amino asit kalintisinin, agir zincir veya hafif zincir amino asit dizisinde sübstitüe edildigi, silindigi veya eklendigi bir amino asit dizisinin kombine edilmesi yoluyla ayni zamanda yukarida açiklanan antikorlardan her birininkine esdeger sitotoksik aktiviteye sahip bir Iki amino asit dizisi arasindaki homoloji, Blast algoritmasi versiyon 2.2.2'nin (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schâffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSl-BLAST: a new varsayilan parametreleri kullanilarak belirlenebilir. Blast algoritmasi ayni zamanda, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast sitesine erisilerek Internet yoluyla kullanilabilir.
Dizi Listesinde SEQ ID NO: 9, 10, 11 veya 12 ile temsil edilen agir zincir amino asit dizisinde amino asit kalintilarindan 1 ila 19 olusan bir amino asit dizisi, sinyal dizisidir, amino asit kalintilarindan 20 ila 141 olusan bir amino asit dizisi, degisken bir bölgedir ve amino asit kalintilarindan 142 ila 471 olusan bir amino asit dizisi, sabit bir bölgedir. zincir amino asit dizisinde amino asit kalintilarindan 1 ila 20 olusan bir amino asit dizisi, sinyal dizisidir, amino asit kalintilarindan 21 ila 128 olusan bir amino asit dizisi, degisken bir bölgedir ve amino asit kalintilarindan 129 ila 233 olusan bir amino asit Ayrica bulus antikoru, M30 antikoru ile ayni epitopa baglanan bir insan antikorunu içerir. Anti-B7-H3 insan antikoru, sadece bir insan kromozomundan derive edilen bir antikor dizisine sahip insan antikoruna refere eder. Anti-B7-H3 insan antikoru, insan antikorunun agir ve hafif zincir genlerini içeren insan kromozomu parçasina sahip insan antikoru üreten bir farenin kullanildigi bir yöntem ile elde edilebilir (bakiniz Tomizuka, Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bu tür bir insan antikoru üreten fare, spesifik olarak asagidaki sekilde olusturulabilir.
Endojen immünoglobulin agir ve hafif zincir geni Iokuslarinin bozuldugu ve bunun yerine maya yapay kromozom (YAC) vektörü veya benzeri araciligiyla insan immünoglobulin agir ve hafif zincir geni Iokuslarinin yerlestirildigi genetik olarak modifiye edilmis bir hayvan, knockout hayvan ve transgenik hayvan üretilmesi ve bu hayvanlarin çiftlestirilmesi yoluyla olusturulur.
Ayrica rekombinant DNA teknigine göre insan antikorunun bu tür agir zincir ve hafif zincirinden her birini kodlayan cDNA'lar ve tercihen bu tür cDNA'Iari içeren bir vektör kullanilarak ökaryotik hücreler transforme edilir ve rekombinant insan monoklonal antikorunu üreten transformant hücre kültürlenir, böylelikle antikor ayni zamanda, kültür üst fazindan elde edilebilir.
Burada konakçi olarak örnegin ökaryotik hücreler, tercihen memeli hücreleri, örnegin CHO hücreleri, lenfositler veya miyelom hücreleri kullanilabilir.
Ayrica bir insan antikoru kütüphanesinden seçilen faj gösterimi kökenli insan antikorunu elde etme yöntemi (bakiniz Wormstone, I. M. et al., Investigative Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189- bilinmektedir. Örnegin bir insan antikorunun degisken bölgesinin, tek Zincirli antikor (scFv) olarak bir fajin yüzeyi üzerinde ifade edildigi ve bir antijene baglanan fajin seçildigi (Nature Bir antijene baglanmaya göre seçilen fajin geninin analiz edilmesi ile bir antijene baglanan insan antikorunun degisken bölgesini kodlayan bir DNA dizisi belirlenebilir.
Bir antijene baglanan scFv'nin DNA dizisinin belirlenmesi halinde bir insan antikoru, bu diziyi içeren bir ifade vektörünün hazirlanmasi ve bu vektörün, bunu ifade etmek üzere uygun bir konakçiya yerlestirilmesi yoluyla elde edilebilir ONO 92/01047, WO Yeni üretilen insan antikorunun, M30 antikorunun baglandigi kismi tersiyer yapiya veya kismi bir peptide baglanmasi halinde Insan antikorunun, M30 antikoru ile ayni epitopa baglandigi belirlenebilir. Ayrica insan antikorunun, B7-H3'e baglanma için M30 antikoru ile yaristiginin (yani insan antikoru, M30 antikoru ile B'I-H3 arasindaki baglanmayi inhibe eder) dogrulanmasi ile spesifik epitop dizisi veya yapisinin belirlenmemis olmasi durumunda dahi insan antikorunun, M30 antikoru ile ayni epitopa baglandigi belirlenebilir. Insan antikorunun, M30 antikoru ile ayni epitopa baglandiginin dogrulanmasi durumunda insan antikorunun, M30 antikorununkine esdeger sitotoksik bir aktiviteye sahip olmasi yüksek oranda beklenir.
Yukarida açiklanan yöntem ile elde edilen kimerik antikorlar, hümanize antikorlar veya insan antikorlari, bilinen bir yöntem veya benzeri ile bir antijene baglanma özelligi yönünden degerlendirilir ve tercih edilen bir antikor seçilebilir.
Antikorlarin özelliklerinin karsilastirilmasinda kullanilan bir baska isaretin bir örnegi olarak antikorlarin stabilitesi verilebilir. Diferansiyel taramali kalorimetri (DSC), proteinlerin nispi konformasyonel stabilitesinin uygun bir isareti olarak kullanilacak termal denatürasyon orta nokta sicakligini (Tm) hizli ve dogru bir sekilde ölçebilen bir cihazdir. DSC kullanilarak Tm degerlerinin ölçülmesi ve bu degerlerin karsilastirilmasi yoluyla termal stabilitedeki farklilik karsilastirilabilir. Antikorlarin saklama stabilitesinin, antikorlarin termal stabilitesi ile bir miktar korelasyon gösterdigi (Lori Burton. et. al., bir antikorun, bir isaret olarak termal stabilite kullanilarak seçilebildigi bilinir. Antikorlarin seçilmesine yönelik diger isaretlerin örnekleri asagidaki özellikleri içerir: uygun konakçi hücre içindeki verim yüksektir ve aköz solüsyon içinde agrega olusturabilme özelligi düsüktür. Örnegin en yüksek verimi gösteren bir antikor her zaman için en yüksek termal stabiliteyi göstermez ve bu nedenle yukarida açiklanan isaretlere göre kapsamli degerlendirme yapilmasi yoluyla insanlara uygulanmaya en uygun olan antikorun seçilmesi gerekir.
Bulusa antikorun modifiye bir varyanti da dahil edilir. Bu modifiye varyant, bulus antikorunun, kimyasal veya biyolojik modifikasyona tabi tutulmasi yoluyla elde edilen bir varyanta refere eder. Kimyasal olarak modifiye edilen varyantin örnekleri, kimyasal bir kismin amino asit iskeletine baglanmasi ile kimyasal olarak modifiye edilen varyantlari, N-bagli veya O-bagli karbohidrat zinciri ile kimyasal olarak modifiye edilen varyantlar ve benzerlerini içerir. Biyolojik olarak modifiye edilmis varyantin örnekleri, post-translasyonel modifikasyon (N-bagli veya O-bagli glikozilasyon, N- veya C- terminal isleme, deamidasyon, aspartik asidin izomerizasyonu veya metiyoninin oksidasyonu) ile elde edilen varyantlari ve metiyonin kalintisinin, prokaryotik konakçi hücrede ifade edilmesi yoluyla N terminale eklendigi varyantlari içerir.
Ayrica bulusun antikorunun veya antijeninin saptanmasini veya izolasyonunu saglamak amaciyla etiketlenen bir antikor örnegin enzim etiketli antikor, floresans-etiketli antikor ve afinite-etiketli antikor da modifiye varyant anlamina dahil edilir. Bulus antikorunun bu tür modifiye bir varyanti, bulusun orijinal antikorunun stabilitesinin ve kanda tutulumunun gelistirilmesinde, antijenikliginin azaltilmasinda, bu tür bir antikor veya antijenin saptanmasinda veya izole edilmesinde ve benzeri islemlerde faydalidir.
Ayrica bulusun antikoruna bagli bir glikanin modifikasyonunun regüle edilmesi ile (glikozilasyon, defukozilasyon ve benzeri) antikora bagimli hücresel sitotoksik aktivitenin arttirilmasi mümkündür. Antikorlarin bir glikaninin modifikasyonunun regüle benzeri bilinmektedir. Ancak bu teknik, bunlarla sinirli degildir. Bulusun antikoruna glikan modifikasyonunun regüle edildigi bir antikor da dahil edilir.
Bir antikorun, ilk olarak bir antikor geninin izole edilmesi ve akabinde bu genin, uygun bir konakçiya yerlestirilmesi yoluyla üretildigi durumda uygun bir konakçi ve uygun bir ifade vektörü kombinasyonu kullanilabilir. Antikor geninin spesifik örnekleri, bu spesifikasyonda açiklanan bir antikorun agir zincir dizisini kodlayan bir gen ve hafif zincir dizisini kodlayan bir genin kombinasyonunu içerir. Konakçi hücre transforme edildiginde agir zincir dizisi geninin ve hafif zincir dizisi geninin ayni ifade vektörüne ve ayni zamanda farkli ifade vektörlerine ayri olarak yerlestirilmesi mümkündür.
Konakçi olarak ökaryotik hücrelerin kullanildigi durumda hayvan hücreleri, bitki hücreleri ve ökaryotik mikroorganizmalar kullanilabilir. Hayvan hücreleri olarak memeli ATCC CRL-Çin hamster yumurtalik hücrelerinin (CHO hücreleri; ATCC: GOL-61) dihidrofolat redüktazdan yoksun suslari (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) örnek verilebilir.
Prokaryotik hücrelerin kullanildigi durumda örnegin Escherichia coli ve Bacillus subtilis örnek olarak verilebilir.
Istenen bir antikor geninin transformasyon yoluyla bu hücrelere yerlestirilmesi ve bu sekilde transforme edilen hücrelerin in vitro kültürlenmesi yoluyla antikor elde edilebilir.
Yukarida açiklanan kültür yönteminde verim bazen, antikorun dizisine bagli olarak degisebilir ve bu nedenle esdeger baglanma aktivitesine sahip antikorlar arasinda bir gösterge olarak verimin kullanilmasi yoluyla bir farmasötik olarak kolayca üretilen bir antikorun seçilmesi mümkündür. Bu nedenle bulusun antikoruna transforme konakçi hücrenin kültürlenmesi adimi ve kültürleme adiminda elde edilen kültürlenmis bir üründen istenen antikorun toplanmasi adimini içermesi ile karakterize edilen bir antikor üretme yöntemi ile elde edilen bir antikor da dahil edilir.
Kültürlenmis bir memeli hücresinde üretilen bir antikorun agir zincirinin karboksil terminalindeki Iizin kalintisinin silindigi (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)) bilinir ve ayni zamanda kültürlenmis memeli hücresinde üretilen bir antikorun agir zincirinin karboksil terminalindeki iki amino asit kalintisinin (glisin ve Iizin) silindigi ve karboksil terminaline yeni yerlestirilen bir prolin kalintisinin amid edildigi (Analytical modifikasyonu, antikorun antijen baglama afinitesini ve efektör fonksiyonunu (bir komplemanin aktivasyonu, antikora bagimli hücresel sitotoksisite ve benzeri gibi) etkilemez. Bu nedenle bulusa, bu tür bir modifikasyona tabi tutulan bir antikor dahil edilir ve bir veya iki amino asidin, agir zincirin karboksil terminalinde silindigi bir delesyon varyanti, delesyon varyantinin amidasyonu ile elde dilen bir varyant (örnegin karboksil terminal prolin kalintisinin amid edildigi agir zincir) ve benzeri örnek olarak verilebilir. Bulusa göre antikorun agir zincirinin karboksil terminalinde bir delesyona sahip delesyon varyantinin türü, antijen baglama afinitesi ve efektör fonksiyon korundugu sürece yukaridaki varyantlar ile sinirlandirilmaz. Bulusa göre antikoru olusturan iki agir zincir, tam uzunluktaki agir zincir ve yukarida açiklanan delesyon varyantindan olusan gruptan seçilen bir türde olabilir veya bunlardan seçilen kombinasyon halindeki iki türde olabilir. Her delesyon varyantinin miktarinin orani, bulusa göre antikoru üreten kültürlenmis memeli hücrelerinin türünden ve kültür kosullarindan etkilenebilir, ancak karboksil terminalindeki bir amino asit kalintisinin, bulusa göre antikorda ana bilesenler olarak bulunan iki agir zincirin her ikisinde silindigi bir durum örnek olarak verilebilir.
Bulus antikorunun bir izotipi olarak örnegin, IgG (IgG1, IgG2, lgG3, IgG4) örnek verilebilir ve tercihen IgG1 veya lgG2 örnek verilebilir.
Antikor fonksiyonu olarak genellikle antijen baglama aktivitesi, bir antijenin aktivitesini nötralize etme aktivitesi, bir antijenin aktivitesini arttirma aktivitesi, antikora bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) aktivitesi ve komplemana bagimli sitotoksisite (CDC) aktivitesi örnek verilebilir. Bulus antikorunun fonksiyonu, B7-H3'e baglanma aktivitesi, tercihen antikora bagimli hücre aracili fagositoz (ADCP) aktivitesi, daha çok tercih edildigi üzere ADCP aktivitesinin aracilik ettigi tümör hücresine yönelik sitotoksik aktivitedir (antitümör aktivite). Ayrica bulus antikoru, ADCP aktivitesine ek olarak ADCC aktivitesine ve/veya CDC aktivitesine sahip olabilir.
Elde edilen antikor, homojenlige kadar saflastirilabilir. Antikorun ayrimi ve saflastirilmasi, klasik bir protein ayirma ve saflastirma yöntemi kullanilarak gerçeklestirilebilir. Örnegin antikor, kolon kromatografisi, filtre ile filtrasyon, ultrafiltrasyon, tuz ile çöktürme, diyaliz, preparatif poliakrilamid jel alektroforezi, izoelektrik odaklama elektroforezi ve benzerinin (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) uygun sekilde seçilmesi ve kombine edilmesi yoluyla ayrilabilir ve saflastirilabilir ancak yöntem, bunlarla sinirland irilmaz.
Bu tür kromatografinin örnekleri, afinite kromatografisi, iyon degistirme kromatografisi, hidrofobik kromatografi, jel filtrasyon kromatografisi, revers faz kromatografi ve adsorpsiyon kromatografisini içerir.
Bu tür bir kromatografi, HPLC veya FPLC gibi sivi kromatografisi kullanilarak gerçeklestirilebilir.
Afinite kromatografisinde kullanilacak kolon olarak bir Protein A kolonu ve Protein G kolonu örnek verilebilir. Örnegin Protein A kolonunun kullanildigi bir kolon olarak, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) ve benzerleri örnek verilebilir.
Ayrica, üzerine immobilize edilmis bir antijene sahip bir tasiyici kullanilarak antikor, antikorun antijene baglanma özelligi kullanilarak da saflastirilabilir.
Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatina konjuge edilecek antitümör bilesik açiklanir.
Antitümör bilesik, antitümör etkiye ve baglayici bir yapiya baglanmaya olanak saglayan bir sübstitüent grubuna veya kismi bir yapiya sahip bir bilesik olmasi halinde özellikle sinirlandirilmaz. Baglayicinin bir kismi veya tamami tümör hücrelerinde klevaj edildiginde antitümör bilesik kismi, antitümör bilesigin antitümör etkisini göstermek üzere serbest birakilir. Baglayicinin, ilaca baglanti pozisyonunda klevaj edilmesi nedeniyle antitümör bilesik, intrinsik antitümör etkisini göstermek üzere intrinsik yapisinda serbest birakilir.
Antitümör bilesigin örnekleri, doksorubisin, daunorubisin. mitomisin C, bleomisin, siklositidin, vinkristin, vinblastin, metotreksat, platin bazli antitümör ajan (sisplatin veya deriveleri), taksol veya deriveleri ve kamptotesin veya derivelerini (Japon Patent Bülteni No. 6-87746'da açiklanan antitümör ajan) içerebilir. Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatinda tercihen kamptotesin derivesi olarak eksatekan (((1S,98)-1-amino-9-etil- b]kinolin-10,13(9H,15H)-dion; asagidaki formüle gösterilir) kullanilabilir.
Mükemmel bir antitümör etkiye sahip olmakla birlikte eksatekan, antitümör ilaç olarak ticari hale getirilmemistir. Bilesik, bilinen bir yöntem ile kolay bir sekilde elde edilebilir ve 1. pozisyondaki amino grubu tercihen, baglayici yapisina baglanti pozisyonu olarak kullanilabilir. Ayrica eksatekan, tümör hücrelerinde salinabilirken baglayici parçasinin halen buna bagli olmasina ragmen bu tür bir durumda dahi mükemmel bir antitümör etki sergileyen mükemmel bir bilesiktir.
Antikor-ilaç konjugatina iliskin olarak her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin sayisi, etkinlik ve güvenlik üzerinde etkiye sahip önemli bir faktördür.
Antikor-ilaç konjugatinin üretimi, konjuge ilaç moleküllerinin sabit sayisina sahip olmak amaciyla reaksiyona yönelik ham materyallerin ve reaktiflerin kullanim miktarlarini içeren reaksiyon kosulunun tanimlanmasi ile gerçeklestirilir, düsük molekül agirlikli bir bilesigin kimyasal reaksiyonundan farkli olarak genellikle farkli sayilarda konjuge ilaç molekülü içeren bir karisim elde edilir. Bir antikor molekülünde konjuge edilen ilaçlarin sayisi, ortalama deger, yani konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi ile ifade edilir veya belirtilir. Prensip olarak spesifik sekilde baska biçimde açiklanmadikça konjuge ilaç moleküllerinin sayisi, farkli sayida konjuge ilaç molekülüne sahip antikor-ilaç konjugati karisimina dahil edilen konjuge ilaç moleküllerinin spesifik sayisina sahip bir antikor-ilaç konjugatini temsil ettigi bir durum haricinde ortalama bir degeri ifade eder.
Bir antikor molekülüne konjuge edilen eksatekan moleküllerinin sayisi kontrol edilebilir ve her antikor için konjuge edilen ilaç moleküllerinin ortalama sayisi olarak yaklasik 1 ila 10 eksatekan baglanabilir. Tercihen 2 ila 8 ve daha çok tercih edildigi üzere 3 ila 8idir. Bu arada teknikte uzman bir kisi, mevcut basvurunun Örneklerine iliskin açiklamaya göre bir antikor molekülüne gereken sayida ilaç molekülünün konjuge edilmesine yönelik bir reaksiyonu tasarlayabilir ve kontrollü sayida eksatekan molekülü ile konjuge edilmis bir antikoru elde edenbilir.
Eksatekanin, kamptotesin yapisina sahip olmasi nedeniyle dengenin, aköz asidik bir ortamda (örnegin pH 3 veya benzeri) kapali Iakton halkasi (kapali halka) olan bir yapiya kaydigi bilinir, ancak aköz bazik bir ortamda (örnegin pH 10 veya benzeri) açik yapisina karsilik gelen bir eksatekan kalintisi ile uygulanir ve açik halka yapisinin ayni zamanda ayni antitümör etkiye sahip olmasi beklenir ve bunlardan herhangi birinin, mevcut bulus kapsaminda yer aldiginin söylenmesine gerek yoktur.
Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatina iliskin olarak bir antitümör ilacin antikora konjuge edilmesine yönelik baglayici yapisi açiklanir. Baglayici, asagidaki yapiya sahip bir yapiya sahiptir: Antikor, L1'in terminaline (Lziye baglantinin karsisindaki terminal) baglanir ve antitümör ilaç, LC'nin terminaline (Lb'ye baglantinin karsisindaki terminal) baglanir. n1, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder ve tercihen 1 ila 5 olan ve daha çok tercih edildigi üzere 1 ila 3 olan bir tamsayidir.
L1, asagidaki yapi ile temsil edilen baglayicidaki bir kisimdir: -(Süksinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CHz-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiksu8)- veya Yukarida n2, 2 ila 8 olan bir tamsayidir, n3, 1 ila 8 olan bir tamsayidir ve n4, 1 ila 8 olan bir tamsayidir.
L1`in - (SÜksinimid-3-iI-N)-(CH2)n2-C(=O)- yapisi ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayicida "- (Süksinimid-S-iI-N)-", asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: Yukaridaki kismi yapinin 3. pozisyonu antikora baglanti pozisyonudur. 3. Pozisyondaki antikora yönelik bag, tiyoeter olusumu ile baglanma ile karakterize edilir. Diger taraftan yapi kisminin 1. pozisyonundaki nitrojen atomu, yapiyi içeren baglayici içinde bulunan metilenin karbon atomuna baglanir. Spesifik olarak - (Süksinimid-3-il-N)-(CH2)n2- C(=O)-L2-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapidir (burada "antikor-S-", bir antikordan kökenlenir).
Antikor -3 N- (CH2)n2'C{=OJ'L2- Formülde n2, 2 ila 8 olan ve tercihen 2 ila 5 olan bir tamsayidir.
L1'in - CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)- yapisi ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayicida n3, 1 ila 8, tercihen 2 ila 6 olan bir tamsayidir. Bu baglayici, termina metilenin karbon atomunda antikora baglanir ve önceki baglayici ile oldugu gibi tiyoeter olusumu yoluyla baglanmak amaciyla asagidaki yapiya sahiptir (burada "antikor-S-", bir antikordan kökenlenir). Antikor-S-CHz-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-.
L1`in - C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- yapisi ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayicida "-(N-li-3-diminiksuS)-", asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: Bu yapi kisminda 1. pozisyondaki nitrojen atomu, bu yapiyi içeren baglayici yapisinda bulunan metilenin karbon atomuna baglanir. 3. pozisyondaki karbon atomu, baglayicidaki L2'nin -S-(CH2)n5-C(=O)- yapisinin terminal sülfür atomuna baglanir. B aglayicidaki L2'nin -S-(CH2)nG-C(=O)- kismi sadece, baglayicidaki L1'in -C(=O)- sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- yapisi ile kombine baglayici yapisini olusturur.
Yukarida, baglayicida bulunan "-sik.Hekz(1,4)-", 1,4-sikl0hekzilen grubunu temsil eder.
Baglayicida -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)-, terminal karbonil karbonunda amid bagi olusumu ile antikora baglanir (burada antikor-NH-", bir antikordan kökenlenir).
Antikor - NH S'(CH2]n6 «Cç=O)-L-'"~ Bu amid bagi olusumuna yönelik antikorun amino grubu, antikordaki Iizin kalintisinin yan zincirinin terminal amino grubu veya antikorun N terminalindeki amino grubudur.
Bir yapinin söz konusu baglayicisi, bu tür bir amid bagi disinda antikordaki bir amino asidin hidroksi grubu ile ester bagi olusturarak baglanabilir.
Söz konusu baglayicida bulunan yapi kismi "-sik.Hekz(1,4)-". 1,4-sikl0hekzilen grubu disindaki iki degerlikli doymus siklik alkilen grubu, yani iki degerlikli siklik doymus hidrokarbon grubu örnegin, bir siklobütilen grubu, siklopentilen grubu, sikloheptan grubu veya siklooktan grubu, iki degerlikli aromatik hidrokarbon grubu, örnegin fenilen grubu veya naftilen grubu veya 1 veya 2 heteroatom içeren 5 veya 6 üyeli doymus, kismen doymus veya aromatik iki degerlikli heterosiklik grup olabilir. Alternatif olarak bu kisim, 1 ila 4 karbon atomuna sahip iki degerlikli bir alkilen grubu olabilir. Iki degerlikli gruba baglanti, bitisik pozisyonlarda veya uzak pozisyonlarda meydana gelebilir.
L1 olarak - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayicida n4, 1 ila 8 ve tercihen 2 ila 6 olan bir tamsayidir. Bu baglayici, yukarida bahsedilen baglayicilar ile oldugu gibi (bakiniz, asagidaki formül; yapisindaki "antikor-NH-", bir antikordan kökenlenir) terminal karbonil grubunda amid bagi olusumu yoluyla antikorun amino grubu ile baglanir. Antikor-NH-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-L2-.
Baglayicidaki L1'in spesifik ömekleri asagidakileri içerebilir: -(Süksinimid-S-iI-N)-CHzCH2-C(=O)- -(Süksinimid-S-iI-N)-CHzCHzCH2-C(=O)- -(Süksinimid-3-il-N)-CH2CH2CH20H2-C(=O)- -(Süksinimid-S-iI-N)-CH20H20HzCHzCH2-C(=O)- -CH2C(=O)NH-CHzcHzCHz-C(=O)- -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- -C(=O)-AryI-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- -C(=O)-cyc.Het-CH2-(N-li-3-diminiksuS)- (Aril, iki degerlikli aromatik hidrokarbon grubunu temsileder ve sik.Het, iki degerlikli siklik heterosiklik grubu temsil eder).
L2, asagidaki yapi ile temsil edilen bir baglayicidir: -NH-(CchH20)n5-CH2-CH2-C(=O)- veya L2, bulunmayabilir ve bu tür bir durumda L2, tekli bagdir. Yukarida n5, 1 ila 6 olan bir tamsayidir ve nö, 1 ila 6 olan bir tamsayidir.
L2 olarak -NH-(CHzCH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)- yapisina sahip baglayicida n5, 1 ila 6 ve tercihen 2 ila 4 olan bir tamsayidir. Baglayicidaki bu kisim, terminal amino gurubunda Llle baglanir ve diger terminaldeki karbonil grubunda LP'ye baglanir.
L2 olarak -S-(CH2)n6-C(=O)- yapisina sahip baglayicida ne, 1 ila 6 ve tercihen 2 ila 4 olan bir tamsayidir.
L2'nin spesifik örnekleri asagidakileri içerebilir: L2, -S-(CH2)n5-C(=O)- oldugunda bununla kombine edilecek L1, -C(=O)-sik.Hekz(1,4)- CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- yapisidir. Spesifik -L1-L2- örnekleri asagidakileri içerebilir: -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)-S-CH2-C(=O)- -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CHz-(N-Ii-S-diminiksuS)-S-CH20H2-C(=O)- -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)-S-CH2CHzCH2-C(=O)- -C(=O)-sik.Hekz(- Baglayici LP, -GIy-GIy-Phe-Gly- olan peptit kalintisini temsil eden GGFG olan tetrapeptit kalintisidir. Baglayici LP, N terminalinde L2'ye baglanir ve C terminalinde baglayicinin -NH-(CH2)n1-La-Lb-LC-kisminin amino grubuna baglanir.
Baglayici içindeki -NH-(CH2)n1- ile temsil edilen yapida nl, 0 ila 6 olan bir tamsayidir ve tercihen 1 ila 5 ve daha çok tercih edildigi üzere 1 ila 3 olan bir tamsayidir. Bu kismin amino grubu, baglayicida LP'nin C terminaline baglanir.
Baglayici La, -0- veya ile temsil edilir veya tekli bagdir.
Baglayici Lb, -CR2(-R3)- yapisidir veya tekli bagdir. Yukarida her R2 ve R3 bagimsiz olarak bir hidrojen atomunu temsil eder.
Baglayici olarak -NH-(CH2)n1-La-Lb- ile temsil edilen yapinin tercih edilen spesifik örnekleri asagidakileri içerebilir: Tercih edilen diger örnekleri asagidakileri içerebilir: -NH-CH2-O-CH2- ve Baglayici LC, -C(=O)-'dur. Söz konusu baglayici, antitümör bilesige baglanir.
Baglayicida -NH-(CH2 n1-La-Lb-LC yapisinin zincir uzunlugu tercihen, 4 ila 7 atomluk bir zincir uzunlugu ve daha çok tercih edildigi üzere 5 veya 6 atomluk zincir uzunlugudur.
Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatina iliskin olarak, tümör hücrelerinin içine transfer edildiginde baglayici kisim klevaj edilir ve NH2-(CH2)n1-La-Lb-LC-(NH-DX) ile temsil edilen bir yapiya sahip ilaç derivesi, antitümör etkiyi ifade etmek üzere serbest birakilir.
Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatindan serbest kalarak antitümör etki gösteren antitümör derivenin örnekleri, baglayicinin -NH-(CH2)n1-La-Lb- ile temsil edilen yapisinin, L° ile baglandigi ve terminal amino grubuna sahip oldugu bir yapi kismina sahip antitümör derivesini içerir ve özellikle tercih edilenler, asagidakileri içerir.
NHz-CHzCHz-C(=O)-(NH-DX) NHz-CHzCH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) Bu arada NH2-CH2-O-CHz-C(=O)-(NH-DX) durumunda moleküldeki aminal yapi stabil olmadigindan HO-CHz-C(=O)-(NH-DX) yapisini serbest birakmak üzere kendiliinden parçalanmaya maruz kalir. Bu bilesikler ayni zamanda mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatinin ürün ara maddesi olarak kullanilabilir.
Eksatekanin bir ilaç olarak kullanildigi mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatina yönelik olarak [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-LC-(NH-DX)] yapisina sahip ilaç-baglayici yapisi kisminin bir antikora baglanmasi tercih edilir. Her antikor için ilaç-baglayici yapisi kisminin ortalama konjuge sayisi, 1 ila 10 olabilir. Tercihen 2 ila 8 ve daha çok tercih edildigi üzere 3 ila 8'dir.
-(Süksinimid-3-il-N)-CH -(Süksinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(SükSinimid-B-iI-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-C(=O)- -(Süksinimid-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHzCHz-C(=O)- -(SÜkSInImId-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(SüksinimId-S-iI-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz-C(=O)- -(Süksinimid-3-iI-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz- C(=O)-(NH-DX) -(SÜkSInImId-3-II-N )-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CHzO-CHzCHzO-CHzC H2-C(=O )- GGFG-NH-CHzCHz-C(=O)-(NH-DX) -C(=O)-Sik.HekZ(-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) Bunlar arasindan daha çok tercih edilenler asagidakilerdir.
-(Süksinimid-3-iI-N)-CH -(Süksinimid-S-iI-N)-CH- -(Süksinimid-3-iI-N)-CH20H20H20HzcHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz- C(=O)-(NH-DX) -C(=O)-Sik. Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksu8)-S-CHzCH2-C(=O)-GGFG-N H- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). Özellikle tercih edilenler asagidakilerdir.
-(SükSInimId-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(SükSInImId-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz- C(=O)-(NH-DX) Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatinda antikor ile bir ilacin konjuge edilmesine yönelik baglayici yapiya iliskin olarak tercih edilen baglayici, yukarida açiklanan baglayicinin her parçasina yönelik olarak gösterilen tercih edilen yapilarin baplanmasi yoluyla olusturulabilir. Baglayici yapisi olarak tercihen asagidaki yapiya sahip olanlar kullanilabilir. bu arada yapinin sol terminali, antikor ile baglanti pozisyonudur ve sag terminal, ilaç ile baglanti pozisyonudur.
-(Süksinimid-3-il-N)-CH- -(Süksinimid-3-il-N)-CH- -(Süksinimid-B-iI-N)-CH- -(Süksinimid-3-iI-N)-CH- -(Süksinimid-S-il-N)-CH20H20H20HzCHz-C(=O)-GGFG-NH- CH20H2CH2CH20H2-C(=O)- -(Süksinimid-S-iI-N)-CH2CH2CH2CH- -(Süksinimid-3-il-N)-CH20H20H20HzcHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz- GGFG-NH-CHzCHzCHz-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CHzCHzCH2-C(=O)- -C(=O)-Sik.HekZ(-S- Bunlar arasindan daha çok tercih edilenler asagidakilerdir.
-(Süksinimid-S-iI-N)-CHzCH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHzCHz-C(=O)- -(SükSInImId-3-iI-N)-CHzCH2CH2CH2CHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHzCHz-C(=O)- -(SükSInImId-S-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz-C(=O)- -(SÜksinimid-3-iI-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz'O-CHz- GGFG-NH-CHzCHzCHz-C(=O)- sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)-S-CH20H2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-. Özellikle tercih edilenler asagidakileri içerir.
-(Süksinimid-S-iI-N)-CH- -(Süksinimid-S-iI-N)-CH2CH2CH2CH20H2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz- -(Süksinimid-3-iI-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH- GGFG-NH-CHzcHzCHz-C(=O)-. akabinde mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatinin veya bir ürün ara maddesinin üretilmesine yönelik temsili bir yönteme yönelik açiklamalar verilir. Bu arada bilesikler asagida, her reaksiyon formülünde gösterilen bilesik sayisi ile açiklanir. Spesifik olarak bunlar, “formülün (1) bilesigi , bilesik (1)" veya benzeri sekilde refere edilir. Digerleri disindaki numaralara sahip olan bilesikler de benzer sekilde açiklanir. 1. Üretim yöntemi 1 Antikorun, tiyoeter araciligiyla baglayici yapisina baglandigi formül (1) ile temsil edilen antikor-ilaç konjugati, örnegin asagidaki yöntem ile üretilebilir.
Formül 48] 1' l i“ ; i I; I 33 L L -L x'H (CH)]n -L -l. -i -(NH'DX) > AB 11 LF-:P-NH-ECHzini L'-L'-L'~ixii mi) bir maleimidil grubu (asagida gösterilen formül) oldugu L1 baglayici yapisini temsil eder (formülde nitrojen atomu baglanti pozisyonudur) veya terminal, halojendir ve L1'in - (SÜksinimid-3-II-N)-(CH2)n2-C(=O)- kismindaki -(Süksinimid-3-iI-N)- kisminin, bir maleimidil grubu oldugu bir grubu veya L“in -CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- kismindaki terminal metilenin, haloasetamidi olusturmak üzere halojenlendigi halojen- CH20(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- grubunu temsil eder. Ayrica -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiyi temsil eder: ve eksatekanin 1. pozisyonundaki amino grubunun bir hidrojen atomunun uzaklastirilmasi ile elde edilen bir grubu temsil eder. Ayrica yukaridaki reaksiyon formülündeki formülün (1) bilesigi, ilaçtan baglayici terminaline kadar olan bir yapi kisminin bir antikora baglandigi bir yapi olarak açiklanir. Ancak bu sadece kolaylik saglamasi açisindan verilen bir açiklamadir ve esas olarak birçok yapi kisminin bir antikor molekülüne baglandigi birçok durum vardir. Ayni durum, asagida açiklanan üretim yönteminin açiklamasi için de geçerlidir.] Spesifik olarak antikor-ilaç konjugati (1), asagida açiklanan yöntem ile elde edilen bilesigin (2) bir sülfidril grubuna sahip antikor (Sa) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir.
Bir sülfidril grubuna sahip antikor (3a), teknikte iyi bilinen bir yöntem ile elde edilebilir (1996)). Örnekler sunlari içerir: Traut reaktifi, antikorun amino grubu ile reakte edilir; N- süksinimidil S-asetiltiyoalkanoatlar, antikorun amino grubu ile reakte edilir, akabinde hidroksil amin ile reaksiyon gerçeklestirilir; N-süksinimidil 3-(piridilditiyo)pr0pionat ile reakte edildikten sonra antikor, bir sülfidril grubunu olusturmak üzere mentese parçasindaki disülfit bagini indirgemen amaciyla indirgeme ajani ile reakte edilir; antikor, ditiyotreitol, 2-merkaptoetanol ve tris(2-karboksietil)f0sfin hidroklorid (TCEP) gibi bir indirgeme ajani ile reakte edilir, ancak bununla sinirli degildir.
Spesifik olarak antikordaki mentese parçasindaki her disülfit için indirgeme ajani olarak 0.3 ila 3 molar esdeger TCEP kullanilarak ve bir selatlama ajani içeren tampon solüsyonu içinde antikor ile reakte edilerek antikordaki mentese parçasinda kismen veya tamamen indirgenmis disülfit içeren antikor elde edilebilir. Selatlama ajaninin örnekleri, etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve dietilentriamin pentaasetik asidi (DTPA) içerir. 1 mM ila 20 mM konsantrasyonunda kullanilabilir. Kullanilabilen tampon solüsyonunun örnekleri, sodyum fosfat, sodyum borat veya sodyum asetat solüsyonunu içerir. Spesifik bir örnek olarak antikorun, 4°C ila 37°C'de 1 ila 4 saat TCEP ile reakte edilmesi yoluyla kismen veya tamamen indirgenmis sülfidril grubuna sahip antikor (Ba) elde edilebilir.
Bu arada bir sülfidril grubunun, ilaç-baglayici kismina eklenmesine yönelik reaksiyonun gerçeklestirilmesi ile ilaç-baglayici kismi, bir tiyoeter bagi ile konjuge edilebilir. akabinde bir sülfidril grubuna sahip her antikor (Sa) için 2 ila 20 molar esdeger bilesik (2) kullanilarak 2 ila 8 ilaç molekülünün, her antikor için konjuge edildigi antikor-ilaç konjugati (1) üretilebilir. Spesifik olarak bilesigi (2) içerisinde çözünmüs olarak içeren solüsyonun, reaksiyon için bir sülfidril grubuna sahip antikoru (Sa) içeren tampon solüsyonuna eklenmesi uygundur. burada, kullanilabilen tampon solüsyonunun örnekleri, sodyum asetat solüsyonu, sodyum fosfat ve sodyum borati içerir. reaksiyona yönelik pH degeri, 5 ila 9'dur ve daha çok tercih edildigi üzere reaksiyon, yaklasik pH Tde gerçeklestirilir. Bilesigin (2) çözülmesine yönelik solventin örnekleri, dimetil sülfoksit (DMSO), dimetilformamid (DMF), dimetil asetamid (DMA) ve N-metiI-2-piridon (NMP) gibi organik bir solventi içerir. Bilesigi içerisinde çözünmüs olarak içeren organik solvent solüsyonunun, reaksiyon için bir sülfidril grubuna sahip antikoru (3a) içeren tampon solüsyonuna %1 ila 20 v/v'de eklenmesi uygundur. Reaksiyon sicakligi, 0 ila 37°C, daha çok tercih edildigi üzere 10 ila 25°C'dir ve reaksiyon süresi, 0.5 ila 2 saattir.
Reaksiyon, reakte olmamis bilesigin tiyol içeren reaktif ile reaktivitesinin deaktive edilmesi yoluyla sonlandirilabilir. tiyol içeren reaktifin örnekleri, sistein ve N-asetiI-L- sisteindir (NAC). Daha spesifik olarak 1 ila 2 molar esdeger NAC, kullanilan bilesige (2) eklenir ve oda sicakliginda 10 ila 30 dakika inkübe edilerek reaksiyon sonlandirilabilir. Üretilen antikor-ilaç konjugati (1), konsantrasyon, tampon degisimi, saflastirma ve asagida açiklanan ortak prosedürlere göre antikor konsantrasyonunun ve her antikor molekülü için konjuge edilen ilaç moleküllerinin ortalama sayisinin ölçümü sonrasinda antikor-ilaç konjugatinin (1) tanimlanmasi islemine tabi tutulabilir.
Ortak prosedür A: Antikor veya antikor-ilaç konjugatinin aköz solüsyonunun konsantrasyonu Amicon Ultra ( kabina antikor veya antikor-ilaç konjugati solüsyonu eklenmistir ve antikor veya antikor-ilaç konjugati solüsyonu, G'de 5 ila 20 dakika santrifüjlenir) yoluyla konsantre edilmistir.
Ortak prosedür B: Antikor konsantrasyonunun ölçümü Bir UV detektörü (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) kullanilarak antikor konsantrasyonunun ölçümü, üretici tarafindan tanimlanan yönteme göre gerçeklestirilmistir. Bu sirada her antikor için farkli olan 280 nm absorpsiyon katsayisi kullanilmistir (.
Ortak prosedür C-1: Antikor için Tampon Degisimi Healthcare Japan Corporation), üreticinin kullanim talimati ile tanimlanan yönteme göre sodyum klorid ( içeren fosfat tamponu (10 mM, pH ile dengelenmistir. Antikorun aköz solüsyonu, 2.5 mL miktarinda tek bir MAP-25 kolonuna uygulanmistir ve akabinde toplanmistir. Elde edilen fraksiyon, Ortak Prosedür A ile konsantre edilmistir. Ortak prosedür B kullanilarak antikorun konsantrasyonunun ölçülmesinden sonra antikor konsantrasyonu, PBSG.O/EDTA kullanilarak 10 mg/mL'ye ayarlanmistir.
Ortak prosedür C-2: Antikor için Tampon Degisimi Healthcare Japan Corporation), üreticinin kullanim talimati ile tanimlanan yönteme göre sodyum klorid (50 mM) ve EDTA (2 mM) içeren fosfat tamponu (50 mM, pH 6.5) (spesifikasyonda PBSö.5/EDTA olarak refere edilir) ile dengelenmistir. Antikorun aköz solüsyonu, 2.5 mL miktarinda tek bir NAP-25 kolonuna uygulanmistir ve akabinde, toplanmistir. Elde edilen fraksiyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir. Ortak prosedür B kullanilarak antikor konsantrasyonunun ölçülmesinden sonra antikor konsantrasyonu, PBSB.5/EDTA kullanilarak 20 mg/mL'ye ayarlanmistir.
Ortak prosedür D-1: Antikor-ilaç konjugatinin saflastirilmasi 023, lnvitrogen), sodyum klorid ( içeren sodyum fosfat tamponu (10 mM, pH olarak refere edilir) içeren asetat tamponundan seçilen herhangi bir tampon ile dengelenmistir. antikor-ilaç konjugati reaksiyonunun aköz solüsyonu, yaklasik 1.5 mL miktarinda NAP-25 kolonuna uygulanmistir ve akabinde antikor fraksiyonunu toplamak amaciyla üretici tarafindan tanimlanan bir miktarda tampon ile ayristirilmistir. Toplanan fraksiyon tekrar NAP-25 kolonuna uygulanmistir ve tampon ile ayristirilmaya yönelik jel filtrasyon prosesinin toplamda 2 ila 3 kez tekrar edilmesi yoluyla konjuge olmayan ilaç baglayici ve düsük molekül agirlikli bilesik (tris(2-karb0ksietil)fosfin hidroklorid (TCEP), N-asetil-L-sistein (NAC) ve dimetil sülfoksit) hariç antikor-ilaç konjugati elde edilmistir.
Ortak prosedür E: Antikor-ilaç konjugatijndaki antikor konsantrasyonunun ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisinin ölçümü antikor-ilaç konjugatindaki konjuge ilaç konsantrasyonu, 280 nm ve 370 nm'lik iki dalga boyunca antikor-ilaç konjugatinin aköz solüsyonunun UV absorbansinin ölçülmesi, akabinde asagida gösterilen hesaplamanin yapilmasi ile hesaplanabilir.
Herhangi bir dalga boyundaki toplam absorbansin, bir sistemde bulunan isigi absorbe eden her türün absorbans toplamina esit olmasi [absorbansin toplanabilirligi] nedeniyle, antikorun ve ilacin molar absorpsiyon katsayilarinin, antikor ve ilaç arasindaki konjugasyon öncesinde ve sonrasinda ayni kalmasi durumunda antikor-ilaç konjugatindaki antikor konsatrasyonu ve ilaç konsantrasyonu, asagidaki denklemler ile ifade edilir.
Fîggj - Fi., ;'i ' 33- _j “ EL , ; 5:_ ' 8,3, ._- ': 'Is, Denklem 1..: l Yukarida A280, antikor-ilaç konjugatinin aköz solüsyonunun 280 nm'deki absorbansini temsil eder, A370, antikor-ilaç konjugatinin aköz solüsyonunun 370 nm'deki absorbansini temsil eder, AA,2so, bir antikorun 280 nm'deki absorbansini temsil eder, AA,370, bir antikorun 370 nm'deki absorbansini temsil eder, AD,230, bir konjugat prekürsörünün 280 nm`deki absorbansini temsil eder, AD,370, bir konjugat prekürsörünün 370 nm`deki absorbansini temsil eder, EA,280, bir antikorun 280 nm”deki molar absorpsiyon katsayisini temsil eder, SAßYO, bir antikorun 370 nm'deki molar absorpsiyon katsayisini temsil eder, &0250, bir konjugat prekürsörünün 280 nm”deki molar absorpsiyon katsayisini temsil eder. 80,370, bir konjugat prekürsörünün 370 nm'deki molar absorpsiyon katsayisini temsil eder, CA, bir antikor-ilaç konjugatindaki antikor konsantrasyonunu temsil eder ve CD, bir antikor-ilaç konjugatindaki ilaç konsantrasyonunu temsil eder. (bilesigin UV ölçümü ile elde edilen hesaplama veya ölçüm degerine göre tahmin edilen deger) kullanilir. Örnegin :A280, bilinen bir hesaplama yöntemi (Protein Science, belirli bir molar konsantrasyonda çözüldügü bir solüsyonun absorbansinin ölçülmesi yoluyla Lambert-Beer kanununa göre elde edilebilir (Absorbans=m0lar konsantrasyon x molar absorpsiyon katsayisi x hücre yol uzunlugu). antikor-ilaç konjugatinin aköz solüsyonunun A230 ve A370 degerlerinin ölçülmesi ve degerler kullanilarak es zamanli denklemlerin (1) ve (2) çözülmesi yoluyla CA ve CD elde edilebilir. Ayrica CD degerinin CA degerine bölünmesi yoluyla her antikor için konjuge ilacin ortalama sayisi elde edilebilir. Üretim yöntemi 1'de formül (2) ile temsil edilen bilesik, asagidaki formül ile temsil edilen herhangi bir bilesiktir: Halojen -CHQCl:O)NH-{CH9)nECi'=O)-L34_^`-NH-(CHgln' -La-Lb-L:- (NH-DX) Formülde nl, n2, n3, L2, LP, La, Lb ve LC halihazirda tanimlanan gibidir ve LC, ilaca yönelik baglanti pozisyonudur.
Mevcut bulusun bu tür bir bilesiginin üretilmesinde faydali bir ara üründe tercihen n2, 2 ila 5 arasinda bir tamsayidir, L2, -NH-(CH2CH20)n5-CH2CH2-C(=O)- veya tekli bagdir, ms, 2 ila 4 arasinda bir tamsayidir, LP, GGFG'dir ve -NH-(CH2)n1-La-Lb-L°-, -NH- CchHg-C(=O)-, NH-CH20H2CH2-C(=O)-, -NH-CHz-O-CHz-C(=O)- veya -NH-CH20H2- O-CH2-C(=O)- yapilarinin kismi bir yapisidir. Halojen tercihen brom veya iyottur. Bu bilesiklerin spesifik örnekleri, asagidakileri içerebilir [burada (maleimid-N-il), bir maleimidil grubunu group (2,5-di0kso-2,5-dihidro-1 H-piroI-1 -il grubu) temsil eder]. (maleimid-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-0(=O)-(NH-DX) (maleimId-N-iI)-CH (maleimid-N-iI)-CH (maleimid-N-II)-CH2CH2CH2CH2CHz-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(N H-DX) (maleimId-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-iI)-CH (maleimId-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2CH2-C(=O)-(N H-DX) (maleimId-N-iI)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- (maleimid-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-II)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(N H-DX) (maleimId-N-iI)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(N H- (maleimId-N-II)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (maleimid-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimId-N-iI)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(N H- (maleimid-N-iI)-CH' C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-iI)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CHz'O-CHz-C(=O)-(NH-DX) (maleimId-N-iI)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2'O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-iI)-CHZCH-(NH- (maleimId-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimId-N-iI)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimId-N-II)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- (maleimid-N-iI)-CH20HzCH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H-CHzcHz-O-CHz-C(=O )- (maleImId-N-II)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CHzO-CHzCHzO-CHzCHz-C(=O)-GGFG- NH-CHzCHZCH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH20H2-C (=O)-NH-CHzC Hzo-CH2CHzo-CHZCHzo-CH2CH20- X-CHz-C(=O)-NH-CHzcHz-C(=O)-GGFG-NH-CH20H2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CHz-C(=O)-NH-CH X-CHz-C(=O)-NH-CHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzcHzcHz-C(=O)-(NH-DX) C(=O)-(NH-DX) Formülde X, bir brom atomunu veya bir iyot atomunu temsil eder. Bu brom ve iyot bilesiklerinin tamami tercihen, üretim ara ürünleri olarak kullanilabilir.
Konjugat miktarini güvenceye almak amaciyla ilaçlarin esdeger sayisina (örnegin yaklasik ± 1) sahip olmak üzere benzer üretim kosullari altinda elde edilen birçok konjugat, yeni partiler hazirlamak amaciyla karistirilabilir. bu durumda ilaçlarin ortalama sayisi, karistirma islemi öncesinde konjugatlardaki ilaçlarin ortalama sayilari arasinda yer alir. 2. Üretim yöntemi 2 antikorun, bir amid grubu araciligiyla bir baglayiciya baglandigi ve baglayici içinde bir tiyoeter bagina sahip formül (1) ile temsil edilen antikor-ilaç konjugatinda spesifik olarak -L1-L2-'nin -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)-S-(CH2)n5-C (:0)- oldugu bir yapi ayni zamanda, asagidaki yöntem ile üretilebilir.
L ~L`NH-(CH)]n-L-L-Lc-(NH-DX) _› AB-L-L-L-NH-(CHlln-L-Lî-L-(NH-DXJ Formülde AB-Ll', antikor ve baglayicinin L1 baglandigi ve ayrica L1 terminalinin, N- maleimidil grubuna dönüstürüldügü bir grubu temsil eder. Bu grup spesifik olarak, AB- C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)- yapisindaki -(N-Ii-3-diminiksu8)- kisminin, bir maleimidil grubuna dönüstürüldügü yapiya sahiptir. L2', terminalin, bir merkapto grubu oldugu HS-(CH2)n6-C(=O)- grubunu temsil eder ve AB, antikoru temsil Spesifik olarak antikor-ilaç konjugati (1), asagida açiklanan yöntem ile elde edilebilen bilesigin (2a) bir maleimidil grubuna sahip baglayiciya baglanan antikor (3b) ile reakte Bir maleimidil grubuna sahip antikor (3b) ayni zamanda teknikte iyi bilinen bir yöntem Academic Press (1996)). Örnekler sunlari içerir, bir amino grubuna veya hidroksil grubuna baglanabilen ve bir maleimidil grubuna sahip olan süksinimidil-4-(N- maleimidometil)siklohekzan-1-karboksilat (SMCC) gibi iki fonksiyonlu bir baglayici, bir maleimidil grubunu yerlestirmek amaciyla ligandin amino grubu üzerinde reakte olur, ancak bununla sinirli degildir. Örnegin tercihen, amino grubu reaktif bir kisma ve bir baglayici ile bagli tiyol grubu reaktif bir kisma sahip bir bilesik kullanilabilir. Burada amino grubu reaktif kisim, aktif ester, imid ester veya benzeri olabilir ve tiyol reaktif kisim, maleimidil, asetil helojenür, alkil halojenür, ditiyopiridil veya benzeri olabilir. Özellikle amino grup ile bir amid bagi yoluyla antikoru olusturan amino asidin amino grubu veya hidroksi grubu ile baglayicinin olusturulmasina yönelik bir yöntem olarak antikor ile ilk önce reakte edilecek bilesik, asagidaki formül ile temsil edilen bir bilesik olabilir: Q1-L1a-Q2.
(=O)-, RQ-O-C (=N) - veya O=C=N-'yi temsil eder, L1a-, -sik.Hekz(1, 4)-CH2-, 1 ila 10 karbon atomuna sahip bir alkilen grubu, bir fenilen grubu, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH-C(=O)-(CH2)n4b- veya -(CH2)n4a-NH-C(=O)- Q2, (maleimid-N-il), halojen atomu veya -S-S-(2-Piridil)”i temsil eder, RO, 1 ila 6 karbon atomuna sahip bir alkil grubunu temsil eder, n4, 1 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, n43, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder ve n“, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder.] Yukarida RO, 1 ila 6 karbon atomuna sahip bir alkil grubu ve daha çok tercih edildigi üzere bir metil grubu veya etil grubudur.
L1a'nin alkilen grubu, 1 ila 10 karbon atomuna sahip olanlar olabilir. Fenilen grubu, orto, meta ve para konfigürasyonlarindan herhangi biri olabilir ve daha çok tercih edildigi üzere bir para- veya meta-fenilen grubudur.
Tercih edilen L1a örnekleri, -sik.Hekz(1,4)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-,- (CH2)1o-, -(para-Ph)-,-(meta-Ph)-, -(para-Ph)-CH(-CH3)-, -(CH2)3-(meta-Ph)- ve -(meta- Ph)-NH-C(=O)-CH2-'yi içerir.
Q1 tercihen, (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-'dur, Q2 tercihen, (maleimid-N-il)'dir veya - S-S-(2-Piridil), bir disülfit bagi olusturulacagi zaman kullanilabilir.
Yukarida (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu baglanti pozisyonudur ve (3-Sülf0-pirolidin-2,5-dion-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu baglanti pozisyonudur ve bu sülfonik asit, bir Iityum tuzu, sodyum tuzu veya potasyum tuzu ve tercihen sodyum tuzu olusturabilir, sik.Hekz(1,4), 1,4-siklohekzilen grubunu temsil eder, (maleimid-N-il), asagidaki formül burada nitrojen atomu baglanti pozisyonudur, (2-Piridil), 2-piridil grubunu temsil eder, (para-Ph), bir para-fenilen grubunu temsil eder ve (meta-Ph), bir meta-fenilen grubunu temsil eder.
Bu tür bir bilesigin örnekleri, sülfosüksinimidiI-4-(N-maIeimidilmetil)siklohekzan-1- karboksilat (sülfo-SMCC), N-süksinimidiI-4-(N-maIeimidilmetil)-siklohekzan-1-karboksi- (B-amidokaproat) (LC-SMCC), K-maleimidil undekanoik asit N-süksinimidil ester (KMUA), y-maleimidil bütirik asit N-süksinimidil ester (GMBS), e-maleimidil karproik asit N-hidroksisüksinimid ester (EMCS), m-maleimidiIbenzoiI-N-hidroksisüksinimid ester (MBS), N-(d-maleimidilasetoksi)-süksinimid ester (AMAS), süksinimidil-G-(ß- maleimidilpropiyonamid)hekzanoat (SMPH), N-süksinimidil 4-(p-maleimidiIfeniI)-bütirat (SMPB), N-(p-maleimidilfenil)izosiyanat (PMPI), N-süksinimidiI-4-(iyodoasetil)- aminobenzoat (SIAB), N-süksinimidil iyodoasetat (SIA), N-süksinimidil bromoasetat (SBA), N-süksinimidil 3-(bromoasetamid)propiyonat (SBAP), N-süksinimidiI-B-(Z- piridoditiyo)propiyonat (SPDP) ve süksinimidiloksikarboniI-oi-metiI-d-(2- piridilditiyo)tolueni (SMPT) içerir.
Spesifik olarak örnegin 2 ila 6 esdeger SMCC'nin, pH 6 ila 7 olan fosfat tamponu içinde oda sicakliginda 1 ila 6 saat antikor (3) ile reakte edilmesi yoluyla SMCC'nin aktif esteri, bir maleimidik grubuna sahip antikoru (3b) saglamak üzere antikor ile reakte olabilir. Elde edilen antikor (3b), asagida açiklanan Ortak prosedür D-2 ile saflastirilabilir ve bilesik (2a) ile bir sonraki reaksiyon için kullanilabilir.
Ortak prosedür D-2: Süksinimidil 4-(N-maleimidilmetil)-siklohekzan-1-karboksilat (SMCC)-derive antikorun saflastirilmasi NAP-25 kolonu, PBSö.5/EDT ile dengelenmistir. Süksinimidil 4-(N-maleimidilmetil)- siklohekzan-1-karboksilat (burada SMCC olarak refere edilir)-derive antikoru içeren reaksiyon solüsyonu, yaklasik 0.5 mL miktarinda NAP-25 kolonuna uygulanmistir ve akabinde saflastirma için antikor fraksiyonunu toplamak üzere üretici tarafindan tanimlanan bir miktarda tampon ile ayristirilmistir.
Baglayiciya baglanmaya yönelik antikorun amino grubu, N-terminal amino grubu ve/veya bir lizin kalintisi tarafindan tasinan bir amino grubu olabilir, ancak bununla sinirli degildir. Alternatif olarak antikor, bir serin kalintisi tarafindan tasinan bir hidroksi grubunun kullanilmasi ile ester bagi olusumu ile baglayiciya baglanabilir.
Bilesigin (2a) bir maleimidil grubuna sahip baglayiciya bagli antikor (3b) ile reaksiyonu, bilesigin (2), Üretim yöntemi 1'de bahsedildigi üzere bir sülfidril grubuna sahip antikor (Sa) ile reakte edilmesine yönelik yöntem ile ayni sekilde gerçeklestirilebilir.
Hazirlanan antikor-ilaç konjugatina (1) yönelik olarak antikor-ilaç konjugatinin konsantrasyonu, tampon degisimi, saflastirilmasi ve antikor konsantrasyonunun ve her antikor molekülü için konjuge edilen ilaç moleküllerinin ortalama sayisinin ölçümü ile tanimlanmasi, Üretim yöntemi 1 ile ayni sekilde gerçeklestirilebilir. Üretim yöntemi 2'de formül (3b) ile temsil edilen bilesik, asagidaki yapiya sahiptir (bakiniz asagidaki formül; yapisindaki "antikor -NH-“, bir antikordan kökenlenir).[Formül 55] Antikor -N Mevcut bulusun antikor-ilaç konjugatinin üretilmesine yönelik bir ara ürün olan ve yukaridaki yapiya sahip olan bir bilesik asagida açiklanan gibidir (formülde n, 1 ila 10, tercihen 2 ila 8, daha çok tercih edildigi üzere 3 ila 8 olan bir tamsayidir).
MJO-Hi-HD 5130.›4142. ariii 0030 .imkani --nh am,c333 :ntkcirL ami CU 70 ani -.<:'L Terminalin, bir merkapto grubu oldugu mevcut bulus bilesiginin örnekleri ayrica asagidakileri içerebilir: HS-CHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-N H-CH2CH2CH2-C(=O)-(N H-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GG FG-N H-CH2C HzCHz-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CHzCHz-C(=O)-GGFG-N H-CHz-O-CHz-C(=O)-(N H-DX) CHzCHzCHz-C(=O)-(NH-DX) NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) C(=O)-GGFG-NH-CHzcchHz-C(=O)-(NH-DX) 3. Üretim yöntemi 3 Antikorun, bir amid bagi araciligiyla ilaç baglayici kismina konjuge edildigi formül (1) ile temsil edilen antikor-ilaç konjugati, asagida açiklanan bir yöntem ile üretilebilir. Örnegin Ll'in -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- kismi için oldugu gibi tercihen aktif esteri L“, örnegin (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=0)- kullanilabilir. L2 tekli bir bag oldugunda antikor-ilaç konjugati (1), örnegin asagidaki yöntem ile üretilebilir. 1 2 7 a i (v 1 F' s. c L »L -L -N H-(CHJni-L -L'-L -(NH-DX) _-> AB-L -Ll-L -NH-(CHzlnl-L -Lh-l. -INH-DX) Spesifik olarak antikor-ilaç konjugati (1), asagida açiklanan yöntem ile elde edilebilen bilesigin (2b) antikor (3) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir.
Bilesik (2b), antikorun amino grubuna veya hidroksil grubuna baglanabilir. Antikorun amino grubu veya hidroksil grubu, Üretim yöntemi 2'de açiklandigi üzere örnegin sirasiyla antikor ile tasinan bir N-terminal amino grubuna ve/veya bir lizin kalintisi ile tasinan bir amino grubuna ve bir serin kalintisi ile tasinan hidroksi grubuna refere eder, ancak bunlar, bunlarla sinirli degildir.
Bilesik (2b), N-hidroksisüksinimidil ester grubundan olusan aktif esterdir. Alternatif olarak diger aktif esterler örnegin bir sülfosüksinimidil ester grubu. N-hidroksiftalimidil ester, N-hidroksisülfoftalimidil ester, orto-nitrofenil ester. para-nitrofenil ester. 2,4- dinitrofenil ester, 3-sülfoniI-4-nitrofenil ester, 3-karboksi-4-nitrofenil ester ve pentaflorofenil ester kullanilabilir.
Bilesigin (2b) antikor (3) ile reaksiyonunda her antikor (3) için 2 ila 20 molar esdeger bilesik (2b) kullanilarak 1 ila 10 ilaç molekülünün her antikor için konjuge edildigi antikor-ilaç konjugati üretilebilir. Spesifik olarak bilesigi (2b) içerisinde çözünmüs olarak içeren solüsyon, antikor-ilaç konjugatini (1) saglamak üzere reaksiyona yönelik antikoru (3) içeren bir tampon solüsyonuna eklenebilir. Burada kullanilabilen tampon solüsyonunun örnekleri, sodyum asetat solüsyonu, sodyum fosfat ve sodyum borati içerir. Reaksiyona yönelik pH degeri, 5 ila 9 olabilir ve daha çok tercih edildigi üzere reaksiyon, pH 7 civarinda gerçeklestirilir. Bilesigin (2b) çözülmesine yönelik solventin örnekleri, dimetil sülfoksit (DMSO), dimetilformamid (DMF), dimetil asetamid (DMA) ve N-metiI-2-piridon (NMP) gibi organik bir solventi içerir. Bilesigi (2b) içinde çözünmüs olarak içeren organik solvent solüsyonunun, reaksiyon için antikoru (3) içeren bir tampon solüsyonuna %1 ila 20 v/v'de eklenmesi uygundur. Reaksiyon sicakligi, 0 ila Üretilen antikor-ilaç konjugatina (1) yönelik olarak antikor-ilaç konjugatinin (1) konsantrasyonu, tampon degisimi, saflastirilmasi ve antikor konsantrasyonunun ve her antikor molekülü için konjuge edilen ilaç moleküllerinin ortalama sayisinin Ölçümü ile tanimlanmasi, Üretim yöntemi 1 ile ayni sekilde gerçeklestirilebilir. Üretim yöntemi 3'teki (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- kismi, asagidaki yapiya sahiptir.
Yukaridaki kismi yapiya sahip mevcut bulus bilesiginin örnekleri, asagidakileri içerebilir: (Pirolidin-- (Pirolidin-- (Pirolidin-2,5-di0n-N-iI)-O-C(=O)-CHzCHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CH20H2- C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CHzcHzCHzCHzcHz-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-- C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-(=O)-CH2CHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHzCHz- C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH2CHzCHzCH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH20H2-C(=O)-(NH-DX) CH20H2CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-- (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH20HzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz- C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CHzCHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH20HzCH2CH20H2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH2CHzCHzCHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH20H2-C(=O)-GGFG-NH-CH20H2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH2CHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCH2-O- CHz-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CH20HzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-di0n-N-iI)-O-C(=O)-CH20HzCHzCH20H2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (Pirolidin-2,5-dion-N-iI)-O-C(=O)-CHzcHz-C(=O)-N H-CH2CH20-CH20H20- 4. Üretim yöntemi 4 Önceki üretim yönteminde ara ürün olarak kullanilan formül (2) veya (2b) ile temsil edilen bilesik ve farmakolojik olarak kabul edilebilir bir tuzu, örnegin asagidaki yöntem ile üretilebilir.
Pî-NH~(CH2)n -L -L -L -iNH-oxi MHz-(CHZJnI-L'IÜ-L“-op3 NHZ (CHzin L7l. L (NH Dxl P-L-NH-(CHzlnI-La-L-L-Opq 8. é 4-9“Lukiiicii1if'bf0-i i› L -NH(CH)n L (Nii DX) 174 9 o 1 .i ii « î H-L -NH-(CZ-IQM -L -L -L-OP i- 15 1' ;P H-L-NH-icngin -L -L -L -tNH-ÜX) `L 11 “mm, 1' 2 * `. a b i 3 i L 'L 'OH 16 veya 16b 11 veya 111› NHz-DX / i'2ii lnb: 4 I'll! lab:: L -L-L-NH-(CHgln -L -L -L '(NH-DX) <_ L -L -L -NH-(CHJm -L -L -L-OH 2 veya 2b 17 veya 17!) Formülde LC, -C(=O)-'dur ve amid bagi olusumu ile -(NH-DX) kismina baglanir, L1', terminalin, bir maleimidil grubuna veya haloasetil grubuna veya (Pirolidin-2,5-di0n-N-il)- O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-'ya dönüstürüldügü L1 yapisini temsil eder ve her Pi, P2 ve P3, bir koruma grubunu temsil eder.
Bilesik (6), karboksilik asidin (5) aktif ester, karisik asit anhidriti, asit halojenür veya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun, NH2-DX [eksatekani gösterir; kimyasal adi: farmakolojik olarak kabul edilebilir bir tuzu ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir.
Peptit sentezi için yaygin olarak kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari reaksiyon için kullanilabilir. çesitli türde aktif ester vardir. Örnegin p-nitrophenol, N-hidroksi benzotriazol, N-hidroksi süksinimid veya benzeri gibi fenollerin, N,N'- disiklohekzilkarbodiimid veya 1-etiI-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorid gibi yogusturma ajani kullanilarak karboksilik asit (5) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir.
Ayrica aktif ester, karboksilik asidin (5) pentaflorofenil trifloroasetat veya benzeri ile reaksiyonu; karboksilik asidin (5) 1-benzotriazolil oksitripirolidinofosfonyum hekzaflorofosfit ile reaksiyonu; karboksilik asidin (5) dietil siyanofosfonat (tuz ile çözünürlügü arttirma yöntemi) ile reaksiyonu; karboksilik asidin (5) trifenilfosfin ve 2,2'- dipiridil (Mukaiyama reaksiyonu) ile reaksiyonu; karboksilik asidin (5) 4-(4,6-dimet0ksi- gibi bir triazin derivesi ile reaksiyonu veya benzeri ile de üretilebilir. Ayrica reaksiyon örnegin, karboksilik asidin (5) tiyonil klorid ve oksalil klorid gibi asit halojenür ile bir baz varliginda muamele edilmesini saglayan asit halojenür yöntemi ile de gerçeklestirilebilir. -78°C ila 150°C`de atil bir solvent içinde uygun bir baz varliginda bilesik (4) ile uygun sekilde elde edilen karboksilik asidin (5) aktif esteri, karisik asit anhidriti veya asit halojenürünün reakte edilmesi yoluyla bilesik (6) üretilebilir. (Bu arada “atil solvent”, solventin kullanildigi reaksiyonu inhibe etmeyen bir solventi belirtir).
Yukarida açiklanan her adim için kullanilan bazin spesifik örnekleri, bir alkali metal veya toprak alkali metalin karbonati, sodyum karbonat, potasyum karbonat, sodyum etoksit, potasyum bütoksit, sodyum hidroksit, potasyum hidroksit, sodyum hidrit ve potasyum hidrit de dahil alkali bir metalin alkali metal oksidi, hidroksiti veya hidriti, n- bütil Iityum, Iityum diizopropilamid de dahil dialkilamino Iityumu içeren bir alkil Iityum ile temsil edilen organometalik baz; Iityum bis(trimetilsilil)amid de dahil bissililaminin organometalik bazi ve piridin, 2,6-lutidin, kollidin, 4-dimetilaminopiridin, trietilamin, N- metilmorfolin, diizopropiletilamin ve diazabisiklo[ de dahil organik bazi içerir.
Mevcut bulusun reaksiyonu için kullanilan atol solventin örnekleri, diklorometan, kloroform ve karbon tetraklorid gibi halojenlenmis bir hidrokarbon solventi; tetrahidrofuran, 1,2-dimet0ksietan ve dioksan gibi bir eter solventi; benzen ve toluen gibi aromatik hidrokarbon solventi ve N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilasetamid ve N- metilpirolidin-2-on gibi bir amid solventini içerir. Bunlara ek olarak dimetil sülfoksit ve sülfolan gibi bir sülfoksit solventi ve aseton ve metil etil keton gibi bir keton solventi, duruma bagli olarak kullanilabilir.
Bilesikteki (6) L3 ve Lb'nin hidroksi grubu, karboksi grubu, amino grubu veya benzeri, daha sonra bahsedilecegi üzere organik bilesik sentezinde yaygin olarak kullanilan bir koruma grubu ile korunabilir. Spesifik olarak bir hidroksil grubuna yönelik koruma grubunun örnekleri, alkoksimetil grubu, örnegin metoksimetil grubu; arilmetil grubu örnegin benzil grubu, 4-metoksibenzil grubu ve trifenilmetil grubu; alkanoil grubu örnegin asetil grubu; aroil grubu örnegin benzoil grubu ve silil grubu örnegin tert-bütil difenilsilil grubunu içerir. Karboksi grubu örnegin bir alkil grubu örnegin metil grubu, etil grubu ve tert-bütil grubu, allil grubu veya arilmetil grubu örnegin benzil grubu ile bir ester olarak korunabilir. Amino grubu, örnegin alkiloksi karbonil grubu örnegin tert- bütiloksi karbonil grubu, metoksikarbonil grubu ve etoksikarbonil grubu; arilmetil grubu örnegin alliloksikarbonil, 9-florenilmetiloksi karbonil grubu, benziloksi karbonil grubu, parametoksibenziloksi karbonil grubu ve para (veya orto)nitrobenziloksi karbonil grubu; alkanoil gribi örnegin asetil grubu; arilmetil grubu örnegin benzil grubu ve trifenil metil grubu; aroil grubu örnegin benzoil grubu ve aril sülfonil grubu örnegin 2,4-dinitrobenzen sülfonil grubu veya ortonitrobenzen sülfonil grubu olmak üzere genellikle peptit sentezi için kullanilan bir amino grubuna yönelik koruma grubu ile korunabilir. Koruma ve koruma grubunun uzaklastirilmasi, yaygin olarak gerçeklestirilen bir yönteme göre gerçeklesti rilebilir.
Bilesigin (6) terminal amino grubuna yönelik koruma grubu (P1) ile ilgili olarak örnegin tert-bütiloksi karbonil grubu, 9-fluorenilmetiloksi karbonil grubu ve benziloksi karbonil grubu gibi genellikle peptit sentezine yönelik kullanilan bir amino grubuna yönelik bir koruma grubu kullanilabilir. Bir amino grubuna yönelik diger koruma gruplarinin örnekleri bir alkanoil grubu örnegin asetil grubu; bir alkoksikarbonil grubu örnegin metoksikarbonil grubu ve etoksikarbonil grubu; bir arilmetoksi karbonil grubu örnegin parametoksibenziloksi karbonil grubu ve para (veya orto)nitr0ibenzil0ksi karbonil grubu; bir arilmetil grubu örnegin benzil grubu ve trifenil metil grubu; bir aroil grubu örnegin benzoil grubu; ve bir aril sülfonil grubu örnegin 2,4-dinitr0benzen sülfonil grubu ve ortonitrobenzen sülfonil grubunu içerir. Koruma grubu (P1) örnegin korunacak bir amino grubuna sahip bir bilesigin özelliklerine bagli olarak seçilebilir.
Elde edilen bilesigin (6) terminal amino grubuna yönelik koruma grubunun (P1) korumasiz birakilmasi ile bilesik (7) üretilebilir. Reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilebilir.
Bilesik (9), P2 ile korunan N terminaline sahip peptit karboksilik asidin (8) aktif bir ester, karistirilmis asit anhidrit veya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun elde edilen bilesik (7) ile reakte edilmesi ile üretilebilir. Peptit karboksilik asit (8) ile bilesik (7) arasinda bir peptit baginin olusturulmasina yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. Koruma grubu (Pz), bilesigin (6) koruma grubuna yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir ve seçim, örnegin korunacak bir amino grubuna sahip bilesigin özelliklerine dayanilarak yapilabilir. Genellikle peptit sentezine yönelik kullanildiginda uzatmaya yönelik peptit karboksilik asidi (8) olusturan amino asit veya peptit reaksiyonu ve korumasiz birakilmasinin sirali olarak tekrar edilmesi ile ayrica bilesik (9) üretilebilir.
Elde edilen bilesigin (9) amino grubuna yönelik koruma grubu olarak P2'nin korumasiz birakilmasi ile bilesik (10) üretilebilir. Reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilebilir.
Karboksilik asidin (11) veya (11b) aktif bir esteri karisik asit anhidrit, asit halojenür veya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun elde edilen bilesik (10) ile reakte edilmesi yoluyla bilesigin (2) veya (2b) üretilmesi mümkündür. Karboksilik asit (11) veya (11b) ile bilesik (10) arasinda bir peptit baginin olusturulmasina yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent, bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir.
Bilesik (9) örnegin asagidaki yöntem ile üretilebilir.
Bilesik (13), P2 ile korunan N terminaline sahip peptit karboksilik asidin (8) aktif ester, karisik asit anhidrit ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bir baz varliginda P3 ile korunan karboksi grubuna sahip amin bilesigi (12) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Peptit karboksilik asit (8) ile bilesik (12) arasinda bir peptit baginin olusturulmasina yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent bilesigin (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. Bilesigin (13) amino grubuna yönelik koruma grubu (PZ), bilesigin (6) koruma grubuna yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. Bir karboksi grubuna yönelik koruma grubu (PS) ile ilgili olarak özellikle peptit sentezi olmak üzere organik sentetik kimyasinda bir karboksi grubuna yönelik bir koruma grubu olarak yaygin sekilde kullanilan bir koruma grubu kullanilabilir. Spesifik olarak bu, örnegin biralkil grubu örnegin bir metil grubu, bir etil grubu veya bir ters-bütil, aIIiI esterler ve benzil esterler ile esterler gibi bilesigin (6) koruma grubuna yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. Bu tür bir durumda bir amino grubuna yönelik koruma grubu ve bir karboksi grubuna yönelik koruma grubun, farkli bir yöntem veya farkli kosullar ile uzaklastirilabilmesi gereklidir. Örnegin temsili bir örnek, P2'nin bir tert-bütiloksi karbonil grubu oldugu ve P3'ün bir benzil grubu oldugu bir kombinasyonu içerir. Koruma gruplari, örnegin korunacak bir amino grubu ve bir karboksi grubuna sahip bir bilesigin özelliklerine bagli olarak yukarida açiklananlardan seçilebilir. Koruma gruplarinin uzaklastirilmasina yönelik olarak reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilebilir.
Elde edilen bilesigin (13) karboksi grubuna yönelik koruma grubunun (P3) korumasiz birakilmasi ile bilesik (14) üretilebilir. Reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilir.
Bilesik (9), elde edilen bilesigin (14) aktif ester, karisik asit anhidrit, asit halojenür halinde derive edilmesi ve bir baz varliginda bilesik (4) ile reakte edilmesi ile üretilebilir.
Reaksiyon için genellikle peptit sentezine yönelik kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari da kullanilabilir ve reaksiyona yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent, bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir.
Bilesik (2) veya (2b) örnegin asagidaki yöntem ile üretilebilir.
Bilesigin (13) amino grubuna yönelik olarak koruma grubunun (P2) korumasiz birakilmasi yoluyla bilesik (15) üretilebilir. Reaktifler ve kosullar. koruma grubuna bagli olarak seçilebilir.
Bilesik (16) veya (16b), karboksilik asit derivesinin (11) veya (11b) aktif ester, karisik asit anhidrit, asit halojenür ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bir baz varliginda elde edilen bilesik (15) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Peptit karboksilik asit (11) veya (11b) ile bilesik (15) arasinda bir amid baginin olusturulmasina yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir.
Elde edilen bilesigin bilesik (16) veya (16b) karboksi grubuna yönelik olarak koruma grubunun korumasiz birakilmasi ile bilesik (17) veya (17b) üretilebilir. Bu, bilesigin (14) üretilmesine yönelik karboksi grubunun korumasiz birakilmasina benzer gerçeklesti rilebilir.
Bilesik (2) veya (2b), bilesigin (17) veya (17b) aktif ester, karisik asit anhidrit, asit halojenür ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bir baz varliginda bilesik (4) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Reaksiyon için genellikle peptit sentezi Için kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari da kullanabilir ve reaksiyona yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent, bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. . Üretim yöntemi 5 Bir ara ürün formülü (2) ile temsil edilen bilesik ayrica asagidaki yöntem araciligiyla üretilebilir. i LIK-OH L 1 -L -04 Formülde L1', terminalin bir maleimidil grubuna veya bir haloasetil grubuna dönüstürüldügü veya P4'ün bir koruma grubu temsil ettigi bir yapiya sahip L1'e karsilik Bilesik (19), bilesigin (11) aktif ester, karisik asit anhidrit ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bir baz varliginda P4 ile korunan C terminali sahip peptit karboksilik asit (18) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Peptit karboksilik asit (18) ile bilesik (11) arasinda bir peptit baginin olusturulmasina yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent, bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. Bilesigin (18) karboksi grubuna yönelik koruma grubu (P4), bilesigin (6) koruma grubuna yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir.
Elde edilen bilesigin (19) karboksi grubuna yönelik koruma grubunun korumasiz birakilmasi ile bilesik (20) üretilebilir. Bu, bilesigin (14) üretilmesine yönelik olarak karboksi grubunun korumasiz birakilmasina benzer gerçeklestirilebilir.
Bilesik (2), elde edilen bilesigin (20) aktif ester, karisik asit anhidrit ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bilesik (7) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir.
Reaksiyon için genellikle peptit sentezi için kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari da kullanilabilir ve reaksiyona yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent, bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. 6. Üretim yöntemi 6 L2"nin terminalin bir merkaptoalkanoil grubuna dönüstürüldügü bir yapiya sahip L22ye karsilik geldigi Üretim yöntemi 2`de açiklanan üretim ara ürünü (2a), asagidaki yöntem ile üretilebilir. 1 L on 21 L `L ***"'IÜJ'l 'L '- 'L "MÜ“ (î iÜ. rliliHi'lo ]n i' '›. 0+2 2.! 23 Bilesik (2a), bir terminal merkapto grubuna sahip karboksilik asidin (21) aktif ester, karisik asit anhidrit ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bilesik (10) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Reaksiyon için genellikle peptit sentezi için kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari da kullanilabilir ve reaksiyona yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent, bilesik (4) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir.
Ayrica bilesik (23), bilesigin (21) aktif ester, karisik asit anhidrit, asit halojenür ve ya benzeri halinde derive edilmesi, bunun bilesik (15) ile reakte edilmesi ve elde edilen bilesigin (22) karboksi grubuna yönelik olarak koruma grubun korumasiz birakilmasi yoluyla üretilebilir.
Bilesik (2a), bilesigin (23) aktif ester, karisik asit anhidrit, asit halojenür ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun bir baz varliginda bilesik (4) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Reaksiyon için genellikle peptit sentezi için kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari da kullanilabilir ve reaksiyona yönelik kullanilan reaksiyon kosullari, reaktifler, baz ve inert solvent bilesik (6) sentezine yönelik açiklananlardan uygun sekilde seçilebilir. 7. Üretim yöntemi 7 Buradan sonra Üretim yöntemi 4'te açiklanan üretim ara ürününde (10) n1 = 1, La = 0 ve Lb = CR2(-R3) denklemine sahip bilesigin (100) üretilmesine yönelik yöntem. detayli sekilde açiklanir. Formül (100), bir tuzu veya bir solvati ile gösterilen bilesik, örnegin asagidaki yönteme göre üretilebilir. f" `i' fr D_ › . . -b "m-mm( -uiz-:L'Äi iij-ip ::i-0:" * -i › m hL-'uii'ai ; kiram: i .-.uii.i 1.-i_i-i'ji›ii i: c'-i_' i"+- 1› :-iikHJ:- .aus *1 ,i ;.i_'i.i'ii.[\ ..41. i› 4:77 ;al Ri'il 'ra-:ucu i-.i `n Ligi_ US. :,'i-;i_g; i`- 'up _› v`i'.\v-~(i_..'.ii:*'-'-',iI'._r` PND” P H L **arama ~ i #iM'iýi iýiiç :\~ f..(i Formülde LP, R2 ve R3 yukarida tanimlandigi gibidir, L bir asetil grubu, bir hidrojen grubu veya benzerini temsil eder, X ve Y 1 ila 3 amino asitteri olusan bir oligopeptidi temsil eder, P5 ve P7lnin her biri bir amino grubuna yönelik bir koruma grubunu temsil eder ve P6 bir karboksi grubuna yönelik bir koruma grubunu temsil eder. veya uygulanarak ve gerekli olmasi halinde koruma gruplarinin uzaklastirilmasi veya fonksiyonel gruplarin modifiye edilmesi ile üretilebilir. Alternatif olarak bu ayrica bir amino asidin korunan amino terminal amino grubu ile veya oligopeptidin asit amidinin aldehit veya keton ile korunan amino grubu ile isleme tabi tutulmasi ile elde edilebilir.
Bilesigin (24) bir asit veya bir baz varliginda inert bir solvent içerisinde sogutma ila oda sicakligi araliginda bir sicaklikta bir hidroksil grubuna sahip bilesik (25) ile reakte edilmesi ile bilesik (26) üretilebilir. Kullanilabilen asit örnekleri inorganik asit örnegin hidroflorik asit, hidroklorik asit, sülfürik asit, nitrik asit, fosforik asit ve borik asit; bir organik asit örnegin asetik asit, sitrik asit, paratolüen sülfonik asit ve metan sülfonik asit; ve bir Lewis asidi örnegin tetrafloroborat, çinko klorid, tin klorid, alüminyum klorid ve demir klorid içerir. Paratolüen sülfonik asit özellikle tercih edilebilir. Kullanacak baz ile ilgili olarak yukarida açiklanan bazin herhangi biri uygun sekilde seçilebilir ve kullanilabilir. Tercih edilen örnekleri, bir alkali metal alkoksit örnegin potasyum tert- bütoksit, bir alkali metal hidroksit örnegin sodyum hidroksit ve potasyum hidroksit; alkali metal hidrit örnegin sodyum hidrit ve potasyum hidrit; Iityum diizopropilamid gibi dialkilamino Iityum ile temsil edilen organometalik baz ve Iityum bis(trimetilsilil)amid gibi bissililaminin organometalik bazini içerir. Reaksiyona yönelik kullanilacak solvent örnekleri bir eter solvent örnegin tetrahidrofuran ve 1,4-dioksan; ve bir aromatik hidrokarbon solvent örnegin benzen ve tolüen içerir. Bu solventler su ile bir karisim olarak hazirlanabilir. Ayrica P5 ile örneklendirildigi üzere bir amino grubuna yönelik koruma grubu, bunun bir amino grubunun korunmasina yönelik yaygin sekilde kullanilan bir grup olmasi halinde özellikle sinirlandirilmaz. Temsili örnekler, Üretim yöntemi 4'te açiklanan bir amino grubuna yönelik koruma gruplarini içerir. Ancak mevcut reaksiyonda P5 ile örneklendirildigi üzere bir amino grubuna yönelik koruma grubu klevaj edilebilir. Bu tür bir durumda bir reaksiyonun gerekli olabildigi üzere bir amino grubunun korunmasina yönelik uygun bir reaktif ile gerçeklestirilmesi gereklidir.
Bilesik (27), bilesigin (26) koruma grubunun (PG) uzaklastirilmasi ile üretilebilir. Burada Peile örneklendirildigi üzere bir karboksi grubuna yönelik koruma grubunun temsili örnekleri Üretim yöntemi 4'te açiklanmasina ragmen bu durumda bir amino grubuna yönelik koruma grubu (P5) ve bir karboksi grubuna yönelik koruma grubunun (PG) farkli bir yöntem veya farkli kosullar ile uzaklastirilabilen koruma gruplari olmasi istenir. Örnegin temsili bir örnek, P5'in bir 9-fluorenilmetiloksi karbonil grubu oldugu ve Pe'nin bir benzil grubu oldugu bir kombinasyonu içerir. Koruma gruplari, örnegin korunacak bir amino grubu ve bir karboksi grubuna sahip bir bilesigin özelliklerine bagli olarak seçilebilir. Koruma gruplarinin uzaklastirilmasina yönelik olarak reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilir.
Bilesik (29), karboksilik asidin (27) aktif ester, karisik asit anhidrit, asit halojenür ve ya benzeri halinde derive edilmesi ve bunun elde edilen bilesigin (28) koruma grubunun (PS) uzaklastirilmasini takiben bilesigi (28) üretmek üzere bilesik (4) ve farmakolojik olarak kabul edilebilir bir tuzu ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. Bilesik (4) ile karboksilik asit (27) arasindaki reaksiyona ve koruma grubunun (Pe) uzaklastirilmasina yönelik reaksiyona yönelik olarak Üretim yöntemi 4 için açiklananlar ile ayni reaktifler ve reaksiyon kosullari kullanilabilir.
Bilesik (100), bilesigin (29) korunan terminal amino grubuna sahip bir amino asit ile veya oligopeptidin (30) bilesigi (90) üretmek üzere korunan amino grubu ile reakte edilmesi ve elde edilen bilesigin (90) koruma grubunun (P7) uzaklastirilmasi yoluyla üretilebilir. P7 ile örneklendirildigi üzere bir amino grubuna yönelik koruma grubu, bunun bir amino grubunun korunmasina yönelik genellikle kullanilmasi halinde özellikle sinirlandirilmaz. Temsili örnekleri Üretim yöntemi 4'te açiklanan bir amino grubuna yönelik koruma gruplarini içerir. Koruma grubunun uzaklastirilmasina yönelik olarak reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilir. Bilesik (29) ile bilesik (30) arasindaki reaksiyona yönelik olarak peptit sentezi için yaygin sekilde kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullari kullanilabilir. Yukarida açiklanan yöntem ile üretilen bilesik (100), yukarida açiklanan yönteme göre mevcut bulus bilesigi (1) halinde derive edilebilir. 8. Üretim yöntemi 8 Buradan sonra Üretim yöntemi 4'te açiklanan üretim ara ürününde (2) n1 = 1, La = 0 ve Lb = CR2(-R3) denklemine sahip bilesigin (20) üretilmesine yönelik yöntem detayli sekilde açiklanir. Formül (20) ile temsil edilen bilesik, bir tuzu veya bir solvati, örnegin asagidaki yönteme göre üretilebilir. sonrasi.' ti #affa Ejiqi'iiaéi: (II'.:'II*`\:`1 n um iîii,-G~:P.`i' H"l :.:-::›:.;u~i [rizçi . _- -- i ' i ` i ip.” :'HirOrlîß i H'l-hî-rZZ-HNJ-l'iii Formülde L1', L2, LP, R2 ve R3 yukarida açiklanan sekildedir, Z 1 ila 3 amino asitten olusan bir ligopeptidi temsil eder, P8 bir amino grubuna yönelik bir koruma grubunu temsil eder ve Pg, bir karboksi grubuna yönelik bir koruma grubunu temsil eder.
Bilesik (33), bilesigi (32) üretmek üzere korunan terminal amino grubu ve karboksi grubu ile amino asit veya oligopeptidin (31) koruma grubunun (PS) uzaklastirilmasi ve elde edilen amin formunun (32) bilesik (11) ile reakte edilmesi ile üretilebilir. P8 ile örneklendirildigi üzere bir amino grubuna yönelik koruma grubu, bunun bir amino grubunun korunmasi için yaygin sekilde kullanilan bir grup olmasi halinde özellikle sinirlandirilmaz. Temsili örnekler Üretim yöntemi 4'te açiklanan bir amino grubuna yönelik koruma gruplarini içerir. Ayrica koruma grubunun (PS) uzaklastirilmasina yönelik olarak reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilebilir. Bilesik (32) ile karboksilik asit (11) arasindaki reaksiyona yönelik olarak Üretim yöntemi 4 için açiklananlar ile ayni reaktifler ve reaksiyon kosullari kullanilabilir. Ürün ara ürünü (20), bilesigi (34) üretmek üzere bilesigin (33) koruma grubunun (P9) uzaklastirilmasi ve elde edilen karboksilik asidin (34) bilesik (29) ile reakte edilmesi ile üretilebilir. P9 ile örneklendirildigi üzere bir karboksi grubuna yönelik koruma grubunun temsili örnekleri Üretim yöntemi 4'te açiklanir. Bunun korumasiz birakma reaksiyona yönelik olarak Üretim yöntemi 4 için açiklananlar ile ayni reaktifler ve reaksiyon kosullari kullanilabilir. Bilesik (29) ile karboksilik asit (34) arasindaki reaksiyona yönelik olarak genellikle peptit sentezi için kullanilan reaksiyon reaktifleri ve kosullar da kullanilabilir. Yukarida açiklanan yöntem ile üretilen bilesik (20), yukarida açiklanan yönteme göre mevcut bulus bilesigi (1) halinde derive edilebilir. 9. Üretim yöntemi 9 Burada asagida Üretim yöntemi 4'te açiklanan ürün ara ürününde (17) n1 = 1, La = 0 ve Lb = CR2(-R3) denklemine sahip bilesigin (170) üretilmesine yönelik yöntem, detayli sekilde açiklanir. Formül (170) ile temsil edilen bilesik, bir tuzu veya solvati ayrica örnegin asagidaki yönteme göre üretilebilir.
Asuman.' :mail-n V' i' n» 31”* U” 0 W". “ita-Oi ÜP°'_' '--I-Jii--igi- -iIi-iîuig-iz'L-Ii-<.i_~iJi~“"._`;.
P L' mi CH (3 ::M #i .::mi m* '”"i "`*' 'L' , r L ^H-'.H,-'J U" -R I-i. ,::_ii-i;ii- . i" i` i' NH iZH. «:'i 'Çr-:ü: I-"i L:.i;ii ÜH Formülde L1', L2, LP, R2, R3, X, Y, P5, P6 ve P7 yukarida tanimlanan sekildedir.
Bilesik (36), bilesigi (35) üretmek üzere korunan terminal amino grubu ve karboksi grubu ile bilesigin (26) amino grubuna yönelik koruma grubunun (P5) korumasiz birakilmasi ve korunan terminal amino grubu veya korunan amino grubu ile elde edilen amin formunun (35) oligopeptit (30) ile reakte edilmesi yoluyla üretilebilir. P5 ile örneklendirildigi üzere bir amino grubuna yönelik koruma grubu, bunun bir amino grubunun korunmasina yönelik yaygin sekilde kullanilan bir grup olmasi halinde özellikle sinirlandirilmaz. Temsili örnekler, Üretim yöntemi 4'te açiklanan bir amino grubuna yönelik koruma gruplarini içerir. Ayrica koruma grubunun (P5) uzaklastirilmasina yönelik olarak reaktifler ve kosullar, koruma grubuna bagli olarak seçilebilir. Burada, P8 ile örneklendirildigi üzere bir karboksi grubuna yönelik koruma grubunun ve P7 ile örneklendirildigi üzere bir amino grubuna yönelik koruma grubunun temsili örnekleri, Üretim yöntemi 4'te açiklanan bir karboksi grubu ve bir amino grubuna yönelik koruma gruplarini içermesine ragmen bir karboksi grubuna yönelik koruma grubu (PG) ve bir amino grubuna yönelik koruma grubunun (P7), ayni yöntem ve ayni kosullar ile uzaklastirilabilen koruma gruplari olmasi istenir. Örnegin temsili bir örnek, PG'nin bir benzil ester grubu oldugu ve P7'nin bir benziloksi karbonil grubu oldugu bir kombinasyonu içerir.
Bilesik (37), bilesigin (36) karboksi grubuna yönelik koruma grubu (PG) ve bilesigin (36) amino grubuna yönelik koruma grubunun (PT) uzaklastirilmasi ile üretilebilir. Bilesik (37) ayrica sirasiyla karboksi grubuna yönelik koruma grubu (Pe) ve amino grubuna yönelik koruma grubun (P7) uzaklastirilmasi ile üretilebilir veya bilesik (37), ayni yöntem veya ayni kosullar ile uzaklastirilabilen koruma gruplarinin (PG ve PT) her ikisinin uzaklastirilmasi ile üretilebilir.
Bilesik (170), elde edilen bilesigin (37) bilesik (11) ile reakte edilmesi ile üretilebilir.
Bilesik (37) ile bilesik (11) arasindaki reaksiyona yönelik olarak Üretim yöntemi 4'e yönelik açiklananlar ile ayni reaktifler ve reaksiyon kosullari kullanilabilir.
Yukarida, asagidaki formül ile temsil edilen bilesik: Antibody - CH I mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugatin üretilmesine yönelik faydali bir üretim ara ürünü olarak açiklanir. Ek olarak asagidaki formül ile temsil edilen bilesiklerin bir grubu: Q-(CH2)nQ-C(=O)-L29-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-L°-(NH-DX) ayrica mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugatin üretilmesine yönelik faydali üretim ara ürünleri olarak fonksiyon gösteren bilesiklerdir.
Spesifik olarak yukaridaki formülde Q (maleimid-N-iI)-'dir, nQ, 2 ila 5 arasinda bir tam sayidir, Lza, -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-“yu veya tek bir bagi temsil eder, burada n5 2 ila 4 arasinda bir tam sayidir, LP GGFG'nIn bir tetrapeptit kalintisini temsil n1 0 ila 6 arasinda bir tam sayisi temsil eder, Lêi -O-'yu veya tek bir bagi temsil eder, Lb -CR2(-R3)-“ü veya tek bir bagi temsil eder, burada R2 ve R3'ün her biri bagimsiz olarak bir hidrojen atomunu temsil eder, Lc -C(=O)-“yu temsil eder, (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahip bir gruptur: (formülde nitrojen atomu baglanti pozisyonudur) ve - (NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahip bir gruptur: (formülde amino grubunun 1. Pozisyonundaki nitrojen atomu baglanti pozisyonudur).
Ayrica -NH-(CH2)n1-La-Lb- ile ilgili olarak bir NH-CH20H2-, -NH-CHzCH20H2-, -NH- CH2- bilesigi bir üretim ara ürünü olarak tercih edilir. Bir NH-CH20H20H2-, -NH-CHz-O- CH2- ve ya -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)- bilesigi daha çok tercih edilir.
Lza'nin tek bir bag oldugu veya n5'in 2 ila 4 arasinda bir tam sayi oldugu bir bilesik bir üretim ara ürünü olarak tercih edilir. nQ'nun 2 ila 5 arasinda bir tam sayi oldugu, Lza'nin tek bir bag oldugu ve -NH-(CH2)n1- üretim ara ürünü olarak tercih edilir. -NH-(CH2)n1-La-Lb-'nin -NH-CH20H2-, -NH- CHzCHzCH2-, -NH-CH2-O-CH2- ve ya -NH-CH20H2-O-CH2- oldugu bir bilesik daha çok tercih edilir. nQ'nun 2 ila 5 arasinda bir tam sayi oldugu bir bilesik ayrica tercih edilir Ayrica nQ'nun 2 ila 5 arasinda bir tam sayi oldugu, Lza'nin -NH-(CHz-CH2-0)n5-CH2- CHz-C(:O)- oldugu, n5'in 2 ila 4 arasinda bir tamsayi oldugu ve -NH-(CH2)n1-La-L'°-'nin - NH-CH2-O-CH2- ve ya -NH-CH2CH2-O-CH2- oldugu bir bilesik bir üretim ara ürünü olarak tercih edilir. n5'in 2 ila 4 arasinda bir tam sayi oldugu bir bilesik daha çok tercih edilir. -NH-(CH2)n1-La-Lb-“nin -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CHz-O-CHz- ve ya -NH-CHzCHz- O-CH2- oldugu bir bilesik ayrica tercih edilir.
Daha spesifik olarak asagidakiler, üretim ara ürünü olarak tercih edilen bilesiklerdir. (maleimid-N-iI)-CHzCH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-iI)-CH2CH2-(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH20HzCH (maleimid-N-il)-CH (maIeImId-N-II)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHzCH2CH2CH2-C(=O)- (maleimid-N-il)-CHzCHzCHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHg-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CHzCHzCHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-iI)-CHzCHz-C(=O)-NH-CHzCHzO-CHzCH20-CH20H2-C(=O)-GGFG-NH- CHzcHZCHz-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH20H2-C(=O)-NH-CHzCHzO-CHzCHzO-CHzCHz-C(=O)-GGFG-NH- CHzCHz-C(=O)-(NH-DX) Bu sirada havada birakildiginda veya yeniden kristalize edildiginde mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati, absorpsiyon suyuna sahip olmak veya bir hidrata dönüsmek üzere nemi absorbe edebilir ve bu tür bir bilesik ve su içeren bir uz da mevcut bulusa dahil edilir. Çesitli radyoaktif veya radyoaktif olmayan izotoplar ile etiketlenen bir bilesik de mevcut bulusa dahil edilir. Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati olusturan bir veya daha fazla atom, dogal olmayan oranda atomik bir izotop içerebilir. Atomik izotop örnekleri ve ioydin-131 (mi) gibi radyoaktif bir izotop ile radyoaktif etiketlenmis olabilir. Bir radyoaktif izotop ile etiketlenen bilesik, bir terapötik veya profilaktik ajan, bir analiz reaktifi gibi arastirmaya yönelik bir reaktif ve bir in vivo tanisal görüntüleme ajani gibi teshise yönelik bir ajan olarak faydalidir. Radyoaktivite ile iliskili olmaksizin mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugatinin herhangi bir izotop varyanti, mevcut bulus kapsami içerisindedir.
Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati, kanser hücrelerine karsi sitotoksik bir aktivite sergiler ve dolayisiyla bir ilaç olarak, özellikle kansere yönelik terapötik bir ajan ve/veya profilaktik ajan olarak kullanilabilir.
Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugatinin uygulandigi kanser tipi örnekleri akciger kanseri, böbrek kanseri, üroteliyal kanser, kolorektal kanser, prostat kanseri, glioblastoma multiforme, yumurtalik kanseri, pankreatik kanser, meme kanseri, melanom, karaciger kanseri, mesane kanseri, mide kanseri veya özofagus kanserini içerir ancak bunun bir tedavi öznesi olarak bir kanser hücresinde antikor-ilaç konjugati içerisindeki antikorun taniyabildigi bir proteini ifade eden bir kanser hücresi oldugu sürece bunlarla sinirlandirilmaz.
Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati tercihen bir memeliye uygulanabilir ancak daha çok tercihen bir insana uygulanir.
Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati içeren farmasötik bir bilesimde kullanilan maddeler uygun sekilde seçilebilir ve dozaj veya uygulama konsantrasyonu bakiminda, teknikte genellikle kullanilan formülasyon katki maddeleri veya benzerinden uygulanabilir.
Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati, en az bir farmasötik olarak uygun bilesen içeren farmasötik bir bilesim olarak uygulanabilir. Örnegin yukaridaki farmasötik bilesim tipik olarak en az bir farmasötik tasiyici (örnegin sterilize sivi) örnegin su ve yag (petrol yagi ve hayvan kökenli, bitki kökenli veya sentetik kökenli yag (yag örnegin yerfistigi yagi, soya yagi, mineral yagi, susam yagi veya benzeri)) içerir. Su, yukaridaki farmasötik bilesimin intravenöz olarak uygulandiginda daha tipik bir tasiyicidir. Salin solüsyonu, aköz bir dekstroz solüsyonu ve aköz bir gliserol solüsyonu ayrica özellikle bir enjeksiyon solüsyonuna yönelik bir sivi tasiyici olarak kullanilabilir. Uygun farmasötik bir araç teknikte bilinir. istenmesi halinde yukaridaki bilesim ayrica iz miktarda bir nemlendirici ajan. bir emülsifiye edici ajan veya bir pH tamponlama ajani içerebilir. Uygun farmasötik tasiyicinin örnekleri E.
W. Martin tarafindan yazilan "Remington's Pharmaceutical Sciences" içerisinde açiklanir. Formülasyonlar bir uygulama moduna karsilik gelir. Çesitli dagitim sistemleri bilinir ve bunlar, mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugatinun uygulanmasi için kullanilabilir. Uygulama yolu örnekleri intradermal, intramüsküler, intraperitoneal, intravenöz ve subkütanöz yollari içerir, ancak bunlarla sinirli degildir.
Uygulama örnegin enjeksiyon veya bolus enjeksiyon yoluyla yapilabilir. Spesifik tercih edilen bir düzenlemeye göre antikor-ilaç konjugatinin uygulanmasi enjeksiyon yoluyla gerçeklestirilir. Parenteral uygulama tercih edilen bir uygulama yoludur.
Temsili bir düzenlemeye göre farmasötik bilesim, klasik prosedürlere göre insana intravenöz uygulama için uygun farmasötik bir bilesim olarak reçetelenir. Intravenöz uygulamaya yönelik bilesim tipik olarak steril ve izotonik aköz bir tampon solüsyonu içerisindeki bir solüsyondur. Gerekli olmasi halinde ilaç, bir çözme ajani ve enjeksiyon alanindaki agriyi hafifletmek üzere lokal anestetikleri (örnegin Iignokain) içerebilir.
Genellikle yukaridaki bilesen bir birim dozaj formunda bir karisim olarak veya bir aktif ajan miktarina sahip bir sase veya bir ampul halinde kapatilarak elde edilen bir kap içerisinde bulunan anhidröz bir konsantre veya Iiyofilize tozun herhangi biri olarak ayri ayri saglanir. Ilaç enjeksiyon yoluyla uygulandiginda steril farmasötik derecede su veya salin içeren bir enjeksiyon sisesinden uygulanabilir Ilaç enjeksiyon yoluyla uygulandiginda enjeksiyona yönelik bir steril su veya salin miktari, yukarida açiklanan bilesenler uygulama öncesinden birbiri ile karistirilacak sekilde saglanabilir.
Mevcut bulusa ait farmasötik bilesim, sadece mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati içeren farmasötik bir bilesim veya antikor-ilaç konjugati ve konjugattan baska en az bir kanseri tedavi edici ajan içeren farmasötik bir bilesim olabilir. Mevcut bulusa ait antikor- ilaç konjugati diger kanseri tedavi edici ajan ile uygulanabilir. Anti-kanser etkisi buna uygun sekilde arttirilabilir. Bu tür amaçlara yönelik kullanilan bir diger anti-kanser ajani, antikor-ilaç konjugati ile es zamanli olarak, bundan ayri olarak veya bunun ardindan bir bireye uygulanabilir ve her birine yönelik uygulama araligi degisirken uygulanabilir.
Kanseri tedavi edici ajanin örnekleri abraksan, karboplatin, sisplatin, gemsitabin, irinotekan (CPT-11), paklitaksel, pemetreksed, sorafenib, vinorelbin, Uluslararasi Yayin ya benzeri), estramustin fosfat, östrojen antagonist (tamoksifen, raloksifen ve ya benzeri) ve bir aromataz inhibitör (anastrozol, letrozol, eksemestan ve ya benzeri) içerir ancak bir antitümör aktiviteye sahip bir ilaç oldugu sürece sinirlandirilmaz.
Farmasötik bilesim, istenen bilesim ve gerekli safliga sahip olan bir formülasyon olarak bir Iiyofilizasyon formülasyonu veya sivi bir formülasyon halinde formüle edilebilir. Bir formülasyon katki maddelerini içeren bir formülasyon olabilir. Ayrica bir sivi formülasyon ile ilgili olarak bu, teknikte kullanilan çesitli formülasyon katki maddelerini içeren bir sivi formülasyon olarak formüle edilebilir.
Farmasötik bilesime ait bilesim ve konsantrasyon, uygulama yöntemine bagli olarak degiskenlik gösterebilir. Ancak mevcut bulusa ait farmasötik bilesimde bulunan antikor- ilaç konjugati, antikor-ilaç konjugati bir antijen için daha yüksek afiniteye, yani antijen yönelik ayrisma sabiti (yani Kd degeri) bakimindan daha yüksek afiniteye sahip oldugunda küçük bir dozda dahi farmasötik etki sergileyebilir. Dolayisiyla antikor-ilaç konjugatinin dozajinin belirlenmesine yönelik olarak dozaj, antikor-ilaç konjugati ile antijen arasindaki afiniteye iliskin bir durum göz önüne alinarak belirlenebilir. Mevcut bulusa ait antikor-ilaç konjugati bir insana uygulandiginda örnegin yaklasik 0.001 ila 100 mg/kg bir kez uygulanabilir veya 1 ila 180 günlük bir zaman araligi ile birkaç kez uygulanabilir. Örnekler Mevcut bulus spesifik olarak asagida gösterilen ömekler göz önünde tutularak açiklanir. Ancak mevcut bulus, bunlarla sinirlandirilmaz. Ayrica hiçbir sekilde sinirli anlamda yorumlanamaz. Ayrica spesifik olarak aksi açiklanmadikça spesifikasyonda açiklanan reaktif, solvent ve baslangiç materyali ticari bir tedarikçiden kolay bir sekilde elde edilebilir.
Referans Örnek 1 M30-H1-L4 antikoru Bir anti-BY-H3 antikorunun hümanize antikorlardan, SEQ ID NO: 9'daki amino asit pozisyonlari 20 ila 471'de açiklanan bir amino asit dizisinden olusan bir agir zincir ve SEO ID NO: 16'daki amino asit pozisyonlari 21 ila 2133'te açiklanan bir amino asit dizisinden olusan bir hafif zincirden olusan bir antikor, bir M30-H1-L4 antikoru olarak gösterilen (veya basit bir sekilde "M30-H1-L4" olarak refere edilen) hümanize B7-H3 antikorunu saglamak üzere teknikte bilinen bir yönteme göre üretilmistir.
Referans Örnek 2 M30-H1-L4P antikoru Yukarida elde edilen M30-H1-L4 antikoruna bagli bir glikan modifikasyonu, bir M30-H1- L4P antikoru olarak gösterilen (veya basit bir sekilde "M30-H1-L4P" olarak refere edilen) bir glikanin regüle edilmis modifikasyonu ile antikoru saglamak üzere teknikte bilinen bir yönteme göre defukosilasyon araciligiyla regüle edilmistir.
Referans Örnek 3 Anti-C030 antikoru Yayinina referans ile üretilmistir. Dizisi SEQ ID NO: 27 ve 28'de gösterilir.
Referans Örnek 4 Anti-CD33 antikoru Bir anti-CD33 antikoru, Japon Patent Bülten No. 8-48637'ye referans ile üretilmisi.
Dizisi, SEQ ID NO: 29 ve 30'da gösterilir.
Referans Örnek 5 Anti-CD70 antikoru Yayinina referans ile üretilmistir. Dizisi SEO ID NO: 31 ve 32'de gösterilir. b]kinolin-1-il]bütanamid Q Ni OKA/YO &MN/`r' M H 4 J ' ' C >Izr NC ,hi-i Proses:` 0 i; roscs1 I› “9" › N b]kinolin-1-iI]amin0l-4-oksobütil)arbamat dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorid (0.216 9, 1.13 mmol) eklenmistir ve 1 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, bilesik (4) (0.500 9, 0.94 mmol) mesilati ve trietilamin ( ile yüklenen bir N,N-dimetilformamid solüsyonuna damlatilarak eklenmistir ve oda sicakliginda 1 gün karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalinti, basliktaki bilesigi (0.595 9, kantitatif) saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol MS (APCI) m/z: * b]kinolin-1 -il]butanamid içinde çözünmüstür. Trifloroasetik asit (9 mL) eklenmistir ve 4 saat karistirilmistir.
Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, basliktaki bilesige (0.343 9, kantitatif) ait trifloroasetat saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol : su = 7 : 3 : 1'in (v/v/v) parçalara ayrilmis organik katmani ] yoluyla saflastirilmistir. Bu bilesik, antikor-ilaç konjugatini (13) veya (14) alan kanser tasiyan birfarenin tümöründe dogrulanmistir. 1H-NMR (, 2.10-2.17 3), 7.32 (1H, 3), .
MS (APCI) m/z: * Örnek 2 Antikor-ilaç konjugati (1) l . m m Ç'IY ru" "tipi" ll" i i..:_ i;.;” . 'Ü " l. I' 1' -`~'... " P.' -" _ :n- «. ._i L. __ . Prgses 2 mis.. Proses1 ' i:) (J Fl I“d`l ' lu.- i I I :i Proses 1: N-(tert-butoksikarbonil)glisilgIisiI-L-fenilalaniI-N-(4-{[(1S,9$)-9-etiI-5- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-il]amino}-4- oksobütil)glisinamid N-(tert-bütoksikarbonil)glisilglisiI-L-fenilalanilglisin (0.081 9, 0.19 mmol), diklorometan dimetilaminopropil)karb0diimid hidroklorid (0.036 9, 0.19 mmol) eklenmistir ve daha mmol) ile yüklenen bir N,N-dimetilf0rmamid solüsyonuna ( damlatilarak eklenmistir ve oda sicakliginda 4 saat karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, basliktaki bilesigi (0.106 9, %73) saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, MS (APCI) m/z: + Proses 2: GlisilglisiI-L-fenilalaniI-N-(4-{[(1S,9S)-9-etiI-5-floro-9-hidroksi-4-metil- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-4- oksobütil)glisinamid trifloroasetat Yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik (1.97 9, 2.10 mmol). diklorometan (7 mL) içinde çözünmüstür. Trifloroasetik asit (7 mL) eklendikten sonra 1 saat karistirilmistir.
Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve azeotropik damitma için tolüen ile yüklenmistir. Elde edilen kalintilar, basliktaki bilesigi (1.97 9, %99) saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol : su = 7 : 3 : 1'in parçalara ayrilmis organik katmani (v/v/v)] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 1.82-1.90 (2H, m).
MS (APCI) m/z: + Proses 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]glisilglisil-L- b]kinolin-1 -il]amino}-4-oksobütil)glisinamid Yukaridaki Proses 2'de elde edilen bilesige (337 mg, 0.353 mmol) ait bir N,N- dimetilformamid ( ve N- süksinimidil 6-maleimid hekzanoat (119.7 mg, 0.388 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati olarak basliktaki bilesigi (278.0 mg, %76) saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 5 : 1 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 1.40-1.51 MS (APCI) m/z: * Proses 4: Antikor-ilaç konjugati (1) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PB86.0/EDTA ile degistirilmesi ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'Iik bir polipropilen tüpüne yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, lnc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve yukaridaki Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesik içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik oda sicakliginda 40 dakika bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak karistirilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co. LLC) aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Bundan sonra solüsyon, Ortak prosedürA araciligiyla konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280 = 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 13.02 mg/mL, antikor verimi: 9.1 mg (%73) ve her antikor molekülü Için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 3 Antikor-ilaç konjugati (2) 0 L) Proses1 M 10 H 0 H 0 G H 9 H 0 HKVN-i 95").
M'JLLH1 _LLP N\/`*-~'\v)kN”\rN\)LN 'k/ikN/x./\ 7, 3 C H 0 H o “1 ..RNLH Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (2) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 15 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.: ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir. Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: yukaridaki solüsyonun 22°C'de 10 dakika inkübe edilmesinden sonra Örnek 2'ye ait Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.236 mL; her antikor molekülü için 9.2 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik 22°C'de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra aköz bir solüsyon ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C'de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 17.5 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, :A280: 235300 (ön görülen ortalama deger) ve &3,370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.80 mg/mL, antikor verimi: 26.1 mg (%65) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 4 Antikor-ilaç konjugati (3) 0 u "7 H 0 H ^~\N" Proses1 imo-Hiup »34V (IN ”2.3 4] 'Q Tik_` wma/_s 0 H 3 4 ,r :- f,. _JIH Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (3) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür 01 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSB.O/EDTA ile degistirilmesi ile 10 mgi'mL'lik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'Iik bir polipropilen tüpüne yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve Örnek 2'ye ait Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak oda sicakliginda 60 dakika bir tüp döndürücü (MTR- kullanilarak karistirilmistir. Daha eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'lik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen ortalama deger) ve &0,370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.67 mg/mL, antikor verimi: 10.02 mg (%80) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.3. Örnek 5 Antikor-ilaç konjugati (4) jrNV \,\/L RNriJNianVJLN. 0 6 I o 9 "s-N“ Proses1 ..»c...lN14.ýjç` Mi _4. JP .ATO 0 H 0 [Â:` 0 . f "n/A “'\/\)`N/YNV'U`N"1I'“ JNA/s L› Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (4) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm`de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSB.O/EDTA ile degistirilmesi ile 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'Iik bir polipropilen tüpüne yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, lnc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°Cde 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve Örnek 2'ye ait Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak oda sicakliginda 60 dakika bir tüp döndürücü (MTR- kullanilarak karistirilmistir. Daha sonra buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Bundan sonra solüsyon, Ortak prosedÜrA araciligiyla konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1”de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.19 mg/mL, antikor verimi: 7.14 mg (%57) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 6 Antikor-ilaç konjugati (5) MZiiH1-L4P .. -<_,NV,\,^V,U. N*"\n'N"v"u'NL .AN-«LN-N/YD Örnekler 4 ve 5'e ait antikor-ilaç konjugatlarinin hemen hemen bütün miktarlari karistirilmistir ve solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini saglamak üzere Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 15.37 mg ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.7. Örnek 7 Antikor-ilaç konjugati (6) o 33"/ 1› H 3 H . '44' Anli-CD30 antikoru - 1'i H H 14 ama hr y”«~'\/“ N .YNVJNJ TN`/JLN^ -""`~r"o Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (6) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 3'te üretilen anti-CD3 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, 1.75 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL”Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 2 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra, Örnek 2'ye ait Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 22°C`de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co. eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C'de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir. Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'lik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E ortalama deger) ve &0,370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.99 mg/mL, antikor verimi: 5.94 mg (%59) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.3. Örnek 8 Antikor-ilaç konjugati (7) Ü H 0 H 0 H TNH Proses1 Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (7) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 3'te üretilen anti-CD3 antikoru, Üretim yöntemi 1lde açiklanan Ortak prosedür B (280 nmlde absorpsiyon katsayisi olarak, 1.75 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL”Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 2 mL'lik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir solüsyon of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek 2”ye ait Proses 3'te elde edilen 30 mM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.0297 mL; her antikor molekülü için 13.8 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 22°C'de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma- Aldrich Co. LLC) aköz bir solüsyonu (0.0178 mL; her antikor molekülü için 27.6 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C`de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 270400 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.99 mg/mL, antikor verimi: 5.94 mg (%59) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 9 Antikor-ilaç konjugati (8) 96"? 0 H 0 H 9 Anti-CD33 antikor_u \ // Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (8) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 4'te üretilen anti-CD33 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, 1.66 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSB.0/EDTA ile 10 mg/mL*Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 2 mL'lik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, lnc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C`de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek 2'ye ait Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 22°C'de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co. eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C'de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir. Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'lik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, :A280: 256400 (ön görülen ortalama deger) ve &3370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.06 mg/mL, antikor verimi: 6.36 mg (%64) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 10 Antikor-ilaç konjugati (9) FÇkiý/t ` Anli-CDSS antikoru (Ç C C moment& N /_\ A," (IN/YM» îwkTNvJO "'"N\ `fc O i D H 0 H «ENH x3- 1' : Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (9) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 4'te üretilen ani-CD33 antikoru, Üretim yöntemi 1yde açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, 1.66 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBS6.0/EDTA ile 10 mg/mL'lik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 2 mL'lik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir solüsyon of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.: ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek 2'ye ait Proses 3'te elde edilen 30 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.0297 mL; her antikor molekülü için 13.8 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 22°C'de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma- Aldrich Co. LLC) aköz bir solüsyonu (0.0178 mL; her antikor molekülü için 27.6 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C'de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mLilik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi llde açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 256400 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.95 mg/mL, antikor verimi: 5.70 mg (%57) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 11 Antikor-ilaç konjugati (10) Anli-CD70 antikoru Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (10) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 5'te üretilen anti-CD7O antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, 1.69 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSö.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 2 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek 2`ye ait Proses 3'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 22°C'de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich C0. eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C'de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir. Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1”de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, :A230: 262400 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.2. Örnek 12 Antikor-ilaç konjugati (11) IT.“ 9 H 0 ' "ri C* 0 H 0 H 0 H ..xLNH Proses 1 Anti CD70 antikoru YN`_ßV\)LN,\{NQLNJ\I,N\)\N,\_,N30 .
F` 9/ mü: H Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (11) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 5'te üretilen anti-CD70 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, 1.69 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSö.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 2 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir solüsyon of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek ?ye ait Proses 3'te elde edilen 30 nm bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.0297 mL; her antikor molekülü için 13.8 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 22°C'de 40 dakika inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma- Aldrich C0. LLC) aköz bir solüsyonu (0.0178 mL; her antikor molekülü için 27.6 esdeger) buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere 22°C'de bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 262400 (ön görülen ortalama deger) ve &0,370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.96 mg/mL, antikor verimi: 5.76 mg (%58) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 13 Antikor-ilaç konjugati (12) ”IN "i/N V NÇU "u" `it-.Ã Ö "li"l-J'1`WÄNA`1 N\/J~.N - ,hk/14`” 'x, "f/L H'gaso MH( * V H U H 3 H .Il-i Proses 1: N-[3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)propanoiI]glisilglisiI-L- b]kinolin-1-il]amino}-4-oksobütil)glisinamid Örnek 2`ye ait Proses 2'de elde edilen bilesik (80 mg, 0.084 mmol). soluk sari bir kati olarak basliktaki bilesigi (60.0 mg, %73) saglamak üzere N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat yerine N-süksinimidil 3-maleimid propioat (24.6 mg, 0.0924 mmol) kullanilarak Örnek 22ye ait Proses 3 ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.81-194 ivis (APCI) m/Z: * Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (12) Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru be yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki bilesik, Örnek 2'ye ait proses 4 ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 12.16 mg/mL, antikor verimi: 8.5 mg (%68) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.4. Örnek 14 Antikor-ilaç konjugati (13) H 2 ›- 2.›1 . ' K " Prosesî i. ._ Proses: - _1: .A _- 9. [l: i: :1 [l: I; J . n il)propanoil]amino}etoksi)etoksi]propanoil}glisilglisil -L-fenilalaniI-N-(4-{[(18,98)- benzolde]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-il]aminoI-4- oksobütil)glisinamid Örnek Zye ait Proses 2'de elde edilen bilesik (100 mg, 0.119 mmol). soluk sari bir kati olarak basliktaki bilesigi (66.5 mg, %48) saglamak üzere trietilamin yerine diizopropiletilamin ( ve N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat yerine N-süksinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidpropanamid)et0ksi)etoksi)pr0panoat (50.7 mg, 0.119 mmol) kullanilarak Örnek 2'ye ait Proses 3 ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.77-1.90 MS (APCI) m/z: * Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (13) Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru be yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki bilesik, Örnek 2'ye ait proses 4 ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 12.76 mg/mL, antikor verimi: 8.9 mg (%71) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.4. Örnek 15 Antikor-ilaç konjugati (14) 0 %1 Proses1 0 3 D ;- 0 h 0 .i. _, - 'Ntv vu *ar-VA, Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (14) Referans Örnek 2“de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve Örnek 14'e ait Proses 1'de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 4'e ait Proses 1 ile ayni sekilde elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.60 mg/mL, antikor verimi: 9.60 mg (%77) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.1. Örnek 16 Antikor-ilaç konjugati (15) / *N'^`~'" `N'\/0=/`0^*-i' ..H/`TM`ij T,NWJL >1'^"'"^`YO M30-H1-L4P 'N' N^^°`/`J "'ßN \ir`*vun “-N-rw N* »'70 Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (15) Referans Örnek 2”de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve Örnek 14'e ait Proses 1'de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 5'e ait Proses 1 ile ayni sekilde elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.64 mg/mL, antikor verimi: 9.84 mg (%79) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.1. Örnek 17 Antikor-ilaç konjugati (16) Örnek 15 ve 16'ya ait antikor-ilaç konjugatlarinin hemen hemen bütün miktarlari karistirilmistir ve solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini saglamak üzere Ortak prosedürA ile konsantre edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 17.30 mg ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.5. Örnek 18 Antikor-ilaç konjugati (17) 3 I. _ _ x . ' i . i i 1 I l C } - > .. i Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (17) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSö.O/EDTA ile 10 mg/mLilik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 250 mL'Iik bir balona yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 mL; her antikor molekülü için 3.6 esdeger) ile ve ayrica aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (5 mL) ile yüklenmistir. Solüsyonun, bir PH ölçer kullanilarak 7.4'e yakin pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfit bagi 37°C”de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit ( ve Örnek 14'e ait Proses 1`de elde edilen 10 nm bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak °C`de 130 dakika bir su banyosu içinde bir karistirici ile karistirilmistir. Daha sonra buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, bir ultrafiltrasyon membrani (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), bir tüp pompasi (Cole-Parmer International, MasterFlex ultrafiltrasyon saflastirma islemine tabi tutulmustur. Spesifik olarak ABS, saflastirma islemine yönelik bir tampon solüsyonu olarak reaksiyon solüsyonuna damlatilarak (toplamda eklenirken ultrafiltrasyon saflastirma islemi, konjuge edilmemis Ilaç baglayicilar ve diger düsük moleküler agirlikli reaktiflerin uzaklastirilmasina, ayrica tampon solüsyonunun ABS ile degistirilmesi ve ek olarak solüsyonun konsantre edilmesine yönelik olarak basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren yaklasik 70 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere gerçeklestirilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 14.5 mg/mL, antikor verimi: 1.0 9 (yaklasik %100 ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.5. Örnek 19 Antikor-ilaç konjugati (18) Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (18) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.O/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (5 mL, 50 mg antikor), 15 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.135 mL; her antikor molekülü için 4 esdeger) ile yüklenmistir. Solüsyonun, bir Ph ölçer kullanilarak 7.4'e yakin Ph degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfit bagi 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit ( ve Örnek 14'e ait Proses 1lde elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 15°C`de 90 dakika bir su banyosu içinde inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC”nin aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 19 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 2.17 mg/mL, antikor verimi: 41 mg (%82) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 5.0. Örnek 20 Antikor-ilaç konjugati (19) i._sH,..__v_i~.. c Ot MM", .NquJNAv `T`o --.1.0 H H 0 H 5', H avm-i Proses'` 1 1 .I `H' 9 %1 o 2 ti' i: MJJ-Hî-Ui 3-', H H :1 H :5 i Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (19) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak kullanilarak PBSG.O/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir.
Solüsyon (4 mL, 40 mg antikor), 15 mLtlik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun pH degerinin, bir pH metre ile 7.4 civarinda oldugunun dogrulanmasindan sonra antikordaki mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir. Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 14`ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla15°C'de su banyosunda 90 dakika boyunca inkübe edilmistir. Akabinde buna eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 13 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &A230 = 235300 (tahmin edilen hesaplama degeri), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 2.36 mg/mL, antikor verimi:: 31 mg (%77) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin sayisi (n): 5.9. Örnek 21 Antikor-ilaç konjugati (20) -._.l.c H › i H 0 H (Nu Pioses1 1 l 1.) Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (20) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm`de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSB.O/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; her antikor molekülü için 3.4 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, lnc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun pH degerinin 7.4 ± 0.1 oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit ( ve Örnek 14'ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( yukaridaki solüsyona oda sicakliginda eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla 15°C'de su banyosunda 1 saat inkübe edilmistir. Akabinde 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) aköz solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika daha inkübe edilmistir.
Saflastirma: yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1`de açiklanan Ortak prosedür D-1 (tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Akabinde solüsyon, Ortak prosedürA ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA,280 = 235300 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 8.7 mg (%70) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.5. Örnek 22 Antikor-ilaç konjugati (21) f'h"""-""l'N""'-'U'--'"`Ci""~i`h""":i*h'-- Âh'l"1'N"- .kp - __ __fi M»HiL4-î_.h± H H Ki_i H (13 Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (21) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru. Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSGD/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical industry Co., Ltd.) (0.0439 mL; her antikor molekülü için 5.2 esdeger) ( aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan bir pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 14'ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun (0.0726 mL; her antikor molekülü için 8.6 esdeger) oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla 15°C'de su banyosunda 1 saat inkübe edilmistir. Akabinde aköz solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika daha inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA,280 = 235300 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 8.3 mg (%66) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 5.5. Örnek 23 Antikor-ilaç konjugati (22) 9 î 0 H 0 iki::.
Anti-CDSD antikoru _ , "f“ '3' o 0 [i ”r" " 'N' 'H'- Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (22) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 3'te üretilen anti-CD3O antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür 0-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSB.O/EDTA ile 10 mg/mLilik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; her antikor molekülü için 2.5 esdeger) aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit ( ve Örnek 14lün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla bir tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Akabinde 100 mM NAC (Sigma- Aldrich Co. LLC) aköz solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA,280 = 270400 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.86 mg/mL, antikor verimi: 2.2 mg (%54) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 2.5. Örnek 24 Antikor-ilaç konjugati (23) C! 1 “1 H S" 17' ? . .fikir-3 I.N4.__._IO_. C _ __ N/ ..ri__N___, 'N "n"N"" ”N”'n' "T/`O .::`70 H H 0 t" 0 H [ya] NH Proses 1 - . -ervývorn n Antl-CDSO anlikoru __JO H H C') H CE) H :prim Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (23) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 3'te üretilen anti-CDBO antikoru, Üretim yöntemi 1tde açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm”de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSB.0/EDTA ile 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0113 mL; her antikor molekülü için 5esdeger) aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 14'ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun (0.0204 mL; her antikor molekülü için 9 esdeger) ve propilen glikolün (Kanto Chemical Co., Inc., oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra antikor baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Akabinde buna 100 mM NAC (Sigma-Aldrich C0. LLC) aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA,280 = 270400 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.41 mg/mL, antikor verimi: 1.0 mg (%29) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.1. Örnek 25 Antikor-ilaç konjugati (24) .3 o 9 N 3) II› H 0 Anli-CD33 antikoru I.' S ' 0 ::to ' H i ' _1 Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (24) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 4'te üretilen anti-CD33 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSBO/EDTA ile 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; her antikor molekülü için 2.5 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, lnc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.0 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: dimetil sülfoksit ( ve Örnek 14tün Proses 1`inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Akabinde buna 100 mM NAC (Sigma-Aldrich C0.
LLC) aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &A280 = 256400 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.25 mg/mL, antikor verimi: 3.1 mg (%78) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.7. Örnek 26 Antikor-ilaç konjugati (25) 131-711 o 9 0 .4 0 1' H n Anli-CD33 anlikoiu -__ ;” `4 " N “ " 0 N h " ”1" N “(0 V 1" -i- v_ ('i Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (25) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 4'te üretilen anti-CD33 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür 0-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSGO/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; her antikor molekülü için 5 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.: aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.0 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 14'ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun (0.0233 mL; her antikor molekülü için 9 esdeger) oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Akabinde buna aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi iide açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA_280 = 256400 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.17 mg/mL, antikor verimi: 2.9 mg (%73) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.3. Örnek 27 Antikor-ilaç konjugati (26) -.in H 4 i" 0 '1 _._ .hi-l Proses '1 .L 1 "1 W F" **w-Nbü'w ,î- «. o. 9 r ~ “3 r H '3 Anti-CDTO antikoru :'31 1; D ,'g 3 ,'_j 1 ;j ' ;w 1 ..5 o Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (26) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 5'te üretilen anti-CD7O antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSB.O/EDTA ile 10 mg/mLtlik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; her antikor molekülü için 2.5 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.0 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit ( ve Örnek 14'ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Akabinde buna 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &A280 = 262400 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.14 mg/mL, antikor verimi: 2.9 mg (%71) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.8. Örnek 28 Antikor-ilaç konjugati (27) Ç ;ANF V,U..H..r..v_. :1 `WH-...12V-.....Nt. -J MJ.. .N.._..J N .....D Anti-CDYO anlikoru] *' 14" ... ' H ,5 H S. H ç Nil Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (27) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 5'te üretilen anti-CD7O antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSG.O/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; her antikor molekülü için 5 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.: 0. aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.0 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 14'ün Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun (0.0233 mL; her antikor molekülü için 9 esdeger) oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Akabinde buna aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1ide açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA_280 = 262400 (tahmin edilen hesaplama deger), 18982 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.13 mg/mL, antikor verimi: 2.8 mg (%71) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.4. Örnek 29 Antikor-ilaç konjugati (28) 16-azanonadekan-1-oil]glisilglisiI-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9$)-9-etiI-5-floro-9- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-4- oksobütil)glisinamid mg, %37) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere trietilamin yerine diizopropiletilamin ( ve N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat yerine N-süksinimidil 1- mmol) kullanilarak Örnek 2'nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR MS (APCI) m/z: + Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (28) Antikorun indirgenmesi: Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1- L4P antikoru, Üretim yöntemi 1`de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nmide absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSGD/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik polipropilen tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; her antikor molekülü için 3.0 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve yukaridaki Proses 1'de elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan Üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 40 dakika karistirilmistir. Akabinde buna eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &A280 = 235300 (tahmin edilen hesaplama deger), karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 13.60 mg/mL, antikor verimi: 9.5 mg (%76) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 30 Antikor-ilaç konjugati (29) Proses 1: N-(tert-bütoksikarbonil)ß-alanilglisilgIisiI-L-feniIalanil-N-(4-{[(1S,9$)-9- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-il]amino}-4- oksobütil)glisinamid bütoksikarbonilamino)bütanoik asit yerine N-(tert-bütoksikarboniI)-ß-alanin kullanilarak Örnek 1'in Proses 1'i ile ayni sekilde reakte edilmistir. Elde edilen ham ürün, bir sonraki proseste saflastirma yapilmadan kullanilmistir.
Proses 2: ß-AlanilglisilglisiI-L-fenilalaniI-N-(4-{[(1S,98)-9-etiI-5-floro-9-hidroksi-4-metil- Yukaridaki Proses 1'de elde edilen ham ürün, soluk sari kati (0.610 9, %67) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere Örnek 2`nin Proses 2`si ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.79-1.92 Proses 3: N-(bromoasetiI)-ß-alanilgIisilgIisiI-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etiI-5- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-4- oksobütil)glisinamid 2-bromoasetik asidin (96.3 mg, 0.693 mmol) diklorometan ( solüsyonuna N- 0.693 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, 0°C'de yukaridaki Proses 2'de elde edilen bilesik (473 mg, 0.462 mmol) ve trietilaminin ( solüsyonuna eklenmistir ve oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, silika jel kolon kromatografisi Elde edilen kati, soluk sari kati (191 mg, %40) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere kloroform : metanol : dietil eter karisik solventi ile yikanmistir. 1H-NMR (, 1.79-1.92 MS (ESI) m/z: 1030, * Proses 4: Antikor-ilaç konjugati (29) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSGD/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'lik polipropilen tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co.. Ltd.) (0.025 mL; her antikor molekülü için 3.0 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve Proses 3'te elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 40 dakika karistirilmistir. Akabinde buna 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1”de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &A230 = 235300 (tahmin edilen hesaplama deger), karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 13.9 mg/mL, antikor verimi: 9.7 mg (%78) ve her antikor molekülü Için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 31 Antikor-ilaç. konjugati (30) Proses 1 : tert-Bütil 4-({N°-(tert-bütoksikarbonil)-N2-[(9H-floren-9- ilmetoksi)karbonil]-L-lizil}amino)bütanoat NE-(tert-bütoksikarbonil)-N°-[(9H-roren-9-ilmetoksi)karboniI]-L-Iizin (1.00 9, 2.14 mmol), (3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorid (0.610 9, 3.20 mmol) ve N,N- diizopropiletilamin (0.410 ml, 2.35 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda 3 gün karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, etil asetat ile seyreltilmistir ve %10 sitrik asit aköz solüsyonu ve sodyum hidrojen karbonatin ve doymus tuzlu suyun doymus aköz solüsyonu ile yikanmistir ve organik katman akabinde, anhidröz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur. Solvent, renksiz kati (1.35 9, nicel) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. 1H-NMR (. 1.48- Proses 2: Tert-bütil 4-{[N6-(tert-bütoksikarboniI)-L-IiziI]amino}bütanoat Yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesigin (1.35 9, 2.22 mmol) N,N-dimetilformamid ( eklenmistir ve oda sicakliginda 1.5 saat karistirilmistir. Solvent, basliktaki bilesigi içeren karisimi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Karisim, saflastirma yapilmadan bir sonraki reaksiyon için kullanilmistir.
Proses 3: N-[(9H-floren-9-ilmetoksi)karboniI]-L-vaIiI-NG-(tert-bütoksikarboriil)-N-(4- tert-bütoksi-4-oksobütiI)-L-Iizinamid Yukaridaki Proses 27de elde edilen karisimin (2.22 mmol) N,N-dimetilformamid (, N- Reaksiyon solüsyonu, etil asetat ile seyreltilmistir ve sodyum hidrojen karbonat ve doymus tuzlu suyun doymus aköz solüsyonu ile yikanmistir ve akabinde organik katman, anhidröz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, renksiz kati (0.363 9, %23) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] ile saflastirilmistir. 1H-NMR (, 1.34 (9H, MS (ESI) m/z: + Proses 4: N-[(9H-floren-9-ilmetoksi)karbonil]-L-valiI-N-(3-karboksipropiI)-L- lizinamid format ml) eklenmistir ve oda sicakliginda 4 saat karistirilmistir. Solvent, basliktaki bilesigi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Bilesik, bir sonraki reaksiyon için saflastirma yapilmadan kullanilmistir.
Proses 5: N-[(9H-floren-9-ilmetoksi)karboniI]-L-valil-NG-(tert-bütoksikarboniI)-N-(3- karboksipropiI)-L-lizinamid Yukaridaki Proses 4'te elde edilen bilesigin (0.512 mmol) 1,4-di0ksan ( süspansiyonuna sodyum hidrojen karbonatin (20.0 ml) doymus aköz solüsyonu ve di- tert-bütil dikarbonat (0.178 ml, 0.769 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda 3 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu etil asetat ile seyreltilmistir ve %10 sitrik asit aköz solüsyonu ve doymus tuzlu su ile yikanmistir ve organik katman akabinde, anhidröz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur. Solvent, renksiz kati (0.295 9, %88) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. 1H-NMR (, 1.35 (9H, MS (ESI) m/z: + Proses 6: N-[(9H-floren-9-ilmetoksi)karboniI]-L-valil-Ne-(tert-bütoksikarboniI)-N-(4- L-Iizinamid basliktaki bilesigi saglamak üzere 4-(tert-bütoksikarbonilamino)bütanoik asit yerine Proses 1'i ile ayni sekilde reakte edilmistir.
MS (ESI) m/z: + Proses 7: L-VaIil-Ns-(tert-bütoksikarbonil)-N-(4-{[(1S,98)-9-etil-5-floro-9-hidroksi- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-4-oksobütil)-L- lizinamid içeren bir karisimi saglamak üzere Proses 2 ile ayni sekilde reakte edilmistir. Karisim, bir sonraki reaksiyon için saflastirma yapilmadan kullanilmistir.
Proses 8: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-pirol-1 -il)hekzanoil]-L-valiI-NG-(tert- b]kinolin-1-il]amin0}-4-oksobütil)-L-Iizinamid reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.14- MS (ESI) m/z: + Proses 9: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1 -iI)hekzanoiI]-L-valiI-N-(4- L-Iizinamid trifloroasetat Yukaridaki Proses 8'de elde edilen bilesigin (0.110 mg, 0.106 mmol) diklorometan (10.0 ml) solüsyonuna trifloroasetik asit (4.00 ml) eklenmistir ve oda sicakliginda 5 saat karistirilmistir. Solvent, soluk sari kati (70.0 mg, %64) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. 1H-NMR (, 1.12-1.31 ivis (ESI) m/z: * Proses 10: Antikor-ilaç konjugati (33) Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve yukaridaki Proses 9'da elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 29'un Proses 2'si ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 12.0 mg/mL, antikor verimi: 8.4 mg (%67) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.2. Örnek 35 Antikor-ilaç konjugati (34) Proses 1: N-(3-süIfanilpropanoiI)gIisilgIisiI-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9$)-9-etiI-5- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-4- oksobütil)glisinamid Örnek 2'nin Proses 2'sinde elde edilen bilesik (84.0 mg, 0.100 mmol), soluk sari kati (61.2 mg, %66) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat yerine N-süksinimidil 3-merkaptopropiy0nat kullanilarak Örnek 2'nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir.
MS (ESI) m/z: + Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (34) Antikorun SMCC türevlendirmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Ortak prosedür C-2 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSS.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik tüpe yerlestirilmistir ve oda sicakliginda 27.6 mM süksinimidiI-4- (N-maleimidometil)siklohekzan-1-karboksilat (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) içeren DMSO solüsyonu (0.0063 mL; her antikor molekülü için yaklasik 2.55 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve oda sicakliginda 2 saat reakte edilmistir. Bu reaksiyon solüsyonu, yaklasik 5 mg SMCC derive antikor içeren 0.7 ml solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-2 kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: DMSO ( ve Proses 1'de elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonunun (0.015 mL; her antikor molekülü için yaklasik 2.4 esdegere karsilik gelir) oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 16 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 3.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 3.85 mg/mL, antikor verimi: 0.8 mg (%16) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 2.9. Örnek 36 Antikor-ilaç konjugati (35) H S^/U`N/YNVlN/ÇN\JLMO M30+l1±4P Proses 1 g Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (35) Antikorun SMCC türevlendirmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Ortak prosedür C-2 ve Ortak prosedür B (280 nm`de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSG.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik tüpe yerlestirilmistir, oda sicakliginda 27.6 mM süksinimidil-4-(N- maleimidometil)siklohekzan-1-karboksilat (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) içeren DMSO solüsyonu (0.0125 mL; her antikor molekülü için yaklasik 5.1 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve oda sicakliginda 2 saat reakte edilmistir. Bu reaksiyon solüsyonu, yaklasik 5 mg SMCC derive antikor içeren 0.7 ml solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-2 kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: DMSO ( ve Örnek 35'in Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonunun (0.03 mL; her antikor molekülü için yaklasik 4.8 esdegere karsilik gelir) oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 16 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 3.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 2.43 mg/mL, antikor verimi: 0.5 mg (%10) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 4.2. Örnek 37 Antikor-ilaç konjugati (36) H 0 HÂMO &NOÄ/VVYQi/S PJISO-H1-l.4p _ Proses 1: N-{8-[(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi]-8-oksooktanoil}glisiIinsiI-L- b]kinolin-1-iI]amino}-4-oksobütil)gIisinamid Örnek 2'nin Proses 2'sinde elde edilen bilesik (84.0 mg, 0.100 mmol), soluk sari kati (77.1 mg, %71) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat yerine di(N-süksinimidil) suberat kullanilarak Örnek 2'nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: * Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (36) Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Referans Örnek 2'de üretilen M30- H1-L4P antikoru, Ortak prosedür C-2 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSG.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 20 mg/mL*lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik tüpe yerlestirilmistir, oda sicakliginda yukaridaki Proses 1'de elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonu (0.025 mL; her antikor molekülü için yaklasik 3.7 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 16 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 3.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 6.25 mg/mL, antikor verimi: 1.3 mg (%26) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 32. Örnek 38 Antikor-ilaç konjugati (37) Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (37) Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Referans Örnek 2'de üretilen M30- H1-L4P antikoru, Ortak prosedür C-2 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSG.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 20 mg/mLilik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'lik tüpe yerlestirilmistir, oda sicakliginda DMSO ( ve Örnek 3Tnin Proses 1'inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonu (0.025 mL; her antikor molekülü için yaklasik 7.4 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 16 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 3.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 4.36 mg/mL, antikor verimi: 0.9 mg (%18) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 4.1. Örnek 39 Antikor-ilaç konjugati (38) Anti-0030 antikoru __MN/YNJ Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (38) Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Referans Örnek 3”te üretilen anti- CD30 antikoru, Ortak prosedür 0-2 ve Ortak prosedür B (280 nmide absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSö.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/leik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik tüpe yerlestirilmistir, oda sicakliginda DMSO ( ve Örnek 37'nin Proses 1`inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonu (0.023 mL; her antikor molekülü için 9 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve Ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 4 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak :A280 = 270400 (tahmin edilen hesaplama deger), &(370 = 0 (tahmin edilen hesaplama deger), :0230 = asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.55 mg/mL, antikor verimi: 1.4 mg (%34) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 2.7. Örnek 40 Antikor-ilaç konjugati (39) Anti-CD33 antikoru. __u/VW N/Hr `Âli JM Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (39) Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Referans Örnek 4'te üretilen anti- CD33 antikoru, Ortak prosedür C-2 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSö.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik tüpe yerlestirilmistir, oda sicakliginda DMSO ( ve Örnek 37'nin Proses 1`inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonu (0.023 mL; her antikor molekülü için 9 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve ilaç baglayioinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 4 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak EA,2BO = 256400 (tahmin edilen hesaplama deger), SA,370 = 0 (tahmin edilen hesaplama deger), 80,280 = asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.93 mg/mL, antikor verimi: 2.3 mg (%58) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 4.0. Örnek 41 Antikor-ilaç konjugati (40) Anti-(3070 .antikoru M Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (40) Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Referans Örnek 5'te üretilen anti- CD70 antikoru, Ortak prosedür 0-2 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSG.5/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik tüpe yerlestirilmistir, oda sicakliginda DMSO ( ve Örnek 37'nin Proses 1`inde elde edilen 10 mM bilesigi içeren DMSO solüsyonu (0.023 mL; her antikor molekülü için 9 esdegere karsilik gelir) ile yüklenmistir ve ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 4 saat karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 2.5 mL solüsyonu saglamak üzere Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Fizikokimyasal karakterizasyon: Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &Mao = 262400 (tahmin edilen hesaplama deger), EA_370 = 0 (tahmin edilen hesaplama deger), &3280 = asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.04 mg/mL, antikor verimi: 2.6 mg (%65) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 4.1. b]kinolin-1-il]asetamid mk) N H.,!*J (:i MsOH \.,- SI:: b]kinolin-1-iI]amino}-2-oksoetoksi)etil]karbamat bilesigi saglamak üzere 4-(tert-bütoksikarbonilamin0)bütanoik asit yerine {2-[(tert- 9, 6.01 mmol) kullanilarak Örnek 1'in Proses 1'i ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 181-191 (2H, MS (APCI) m/z: * b]kinolin-1-il]asetamid nicel) olarak basliktaki bilesigin triflorohidrokloridini saglamak üzere Örnek 12In Proses 2'si ile ayni sekilde reakte edilmistir. Bu bilesik, antikor-ilaç konjugatini (41) alan kanser tasiyan farenin tümöründe dogrulanmistir. 1H-NMR (, 2.15-2.23 MS (APCI) m/z: * Örnek 43 Antikor-ilaç konjugati (41) H 9 H 3' H?” 3 ,1,0 rm O'I'N""`q"“f 'n`N“:"l'N""'ii0" h (E H 9 H 1 \-.-' .; 1. I i ni r“ " N a,, _ Proses o Ü i' "i Proses 4 ii1:›C«H1-L-IP_ h "i 1: N x 0 3- 0 H 9_ H 0 NH .Ä- IÜ. \ i-î-.J'Li-v,, 0 Proses 1: N-(tert-bütoksikarbonil)glisiIglisil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etiI-5- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-il]aminoI-2- oksoetoksi)etiIlglisinamid üzere Örnek 2'nin Proses 11 ile ayni sekilde reakte edilmistir.
MS (APCI) m/z: * benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-2- oksoetoksi)etil]glisinamid trifloroasetat Yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik (630 mg, 0.659 mmol), basliktaki bilesigi (588 mg, %92) saglamak üzere Örnek 2'nin Proses 2”si ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 213-222 (2H, m), 8.46-8.55 (2H, m).
MS (APCI) m/z: + Proses 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidr0-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]glisilglisil-L- b]kinolin-1-iI]amino}-2-oksoetoksi)etil]gIisinamid Yukaridaki Proses 2'de elde edilen bilesik (240 mg, 0.247 mmol), basliktaki bilesigi (162 mg, %62) saglamak üzere Örnek 2'nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.40-1.51 MS (APCl) m/z: + Proses 4: Antikor-ilaç konjugati (41) Referans 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve yukaridaki Proses 3'te elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 29'un Proses 2'si ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 12.0 mg/mL, antikor verimi: 8.4 mg (%67) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.5. Örnek 44 Antikor-ilaç konjugati (42) Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (42) Referans 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve Örnek 43'ün Proses 3'ünde elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 5'in Proses 1'i ile ayni sekilde elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.83 mg/mL, antikor verimi: 4.98 mg (%40) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.2. Örnek 45 Antikor-ilaç konjugati (43) 3' Il. l .N-«r' Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (43) Referans 2lde üretilen M30-H1-L4P antikoru ve Örnek 43'ün Proses 3'ünde elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 4'ün Proses 1'i ile ayni sekilde elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.06 mg/mL, antikor verimi: 6.36 mg (%51) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.3. Örnek 46 Antikor-ilaç konjugati (44) MBO-H1-L4P #IM/`g &ku/EU Örnekler 44 ve 45'teki antikor-ilaç konjugatlarinin neredeyse tüm miktarlari karistirilmistir ve solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini saglamak üzere Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 10.21 mg ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.6. Örnek 47 Antikor-ilaç konjugati (45) C ,is-'s' 1 J Proses 1 ."1' ,C- mann L4 (940 0 H (2 H 3 ,num- . 5? r( _fl_ 71,11 o Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (45) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de PBSSO/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde absorpsiyon katsayisi olarak, mLmg'1cm'1 kullanilmistir) kullanilarak hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; her antikor molekülü için 3.4 esdeger) aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit ( ve Örnek 43,ün Proses 3'ünde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla 15°C”de su banyosunda 1 saat inkübe edilmistir. Akabinde buna 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika daha inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &(280 = 235300 (tahmin edilen hesaplama deger), 20347 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 9.3 mg (%74) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.7. Örnek 48 Antikor-ilaç konjugati (46) *i [ i... 0 Proses .1 1› 'Nî'w 23.' t..." v.“»mNAltLM NVIlN_ N_ Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (46) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür 0-1 ve Ortak prosedür B (280 nm`de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak PBSGD/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'lik bir tüpe yerlestirilmistir ve 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 mL; her antikor molekülü için 5.2 esdeger) ( aköz solüsyonu ve 1 M dipotasyum hidrojen fosfat (Nacalai Tesque, Inc.; aköz solüsyonu ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan bir pH degerine sahip oldugunun dogrulanmasindan sonra antikorda mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 43`ün Proses 3'ünde elde edilen 10 mM bilesigi içeren dimetil sülfoksit solüsyonunun (0.0726 mL; her antikor molekülü için 8.6 esdeger) oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklenmesinden sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesi amaciyla 15°C'de su banyosunda 1 saat inkübe edilmistir. Akabinde buna aköz solüsyonu ( eklenmistir ve ilaç baglayici reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika daha inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (Tampon solüsyonu olarak ABS kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Akabinde solüsyon, Ortak prosedür A ile konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1”de açiklanan Ortak prosedür E (molar absorpsiyon katsayisi olarak &A280 = 235300 (tahmin edilen hesaplama deger), 20347 (ölçülen deger) kullanilmistir) kullanilarak asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 7.8 mg (%62) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 5.2. alaninamid b]kinolin-1 -il]aminol-3-oksopropiI)karbamat basliktaki bilesigi saglamak üzere 4-(tert-büt0ksikarbonilamino)bütan0ik asit yerine N- (tert-bütoksikarbonil)-ß-alanin kullanilarak Örnek 1'in Proses 1'i ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.86 (2H, dt, MS (ESI) m/z: + alaninamid Yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik, sari kati (499 mg, %86) olarak basliktaki bilesigin trifloroasetatini saglamak üzere Örnek 1'in Proses 2'si ile ayni sekilde reakte edilmistir.
MS (ESI) m/z: + Örnek 50 Antikor-ilaç konjugati (47) ..kim 1;." ;TC-"IN __J `q, “:'N' un... r. OH i .:1 I I:: n` "T F- `anne o." '71_ l :' `Nu`, Proses 2 t (1 o Proses l j -.,. 0 '1 C ,1 0 .I 0 H -U M 4 H M): ..'».N "i'N"' L› ru ..7..ch "vw Ün: ice", i N ,1 u N. i_N "rh 1: o - ' r) mom-u.: :7' ~ ' Ã: ' II CiJ __ `I If .. i'm Proses 4 O ..“5' l, i' ' ,1. - Proses 1: N-(tert-bütoksikarbonil)gIisiIglisil-L-fenilaIanilglisil-N-[(1S,9$)-9-etiI-5- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]-ß-alaninamid basliktaki bilesigi saglamak üzere Örnek 2'nin Proses 1`i ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.77-1.93 Proses 2: GlisilglisiI-L-feniIalanilglisiI-N-[(1S,9$)-9-etiI-5-floro-9-hidroksi-4-metil- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-iI]-ß-alaninamid trifloroasetat reakte edilmistir. 1H-NMR (, MS (ESI) m/z: + Proses 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1 -iI)hekzanoil]glisilglisil-L- b]kinolin-1-iI]-ß-alaninamid olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere Örnek 2'nin Proses 3`ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 1.39-1.51 MS (ESI) m/z: * Proses 4: Antikor-ilaç konjugati (47) Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve yukaridaki Proses 3'te elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 2'nin Proses 4'ü ile ayni sekilde elde edilmistir.. Antikor konsantrasyonu: 12.27 mg/mL, antikor verimi: 8.6 mg (%69) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): Örnek 51 Antikor-ilaç konjugati (48) ”Ni" '" 'r' N 1:' “ `FL run. .û-NJ' IN" " “N” `N'“r“'v"'N'* 11"" f-C 4- ` "'T W ,33 **T- '-.~ U W r u 31”›_i roses F' '5."N` ..1 ,_I -7 r " `4 i . h 'i ` 1 Proses 2 c o -0 9 V 0! .m1 Proses 1: N-[3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-il)propanoil]glisilg|isil-L- b]kinolin-1-iI]-ß-alaninamid (36.0 mg, %57) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat yerine N-süksinimidil 3-maleimid propiyonat kullanilarak Örnek 2'nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, MS (ESI) m/z: + Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (48) Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 2'nin Proses 4'ü ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 11.59 mg/mL. antikor verimi: 8.1 mg (%65) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.7. Örnek 52 Antikor-ilaç konjugati (49) 9 H H *n'io ' \ H,N._r_.›'i.N `”is llNFTN: ?o CIN` ;Q ""0 o _Houfs H 0 ,s h' of ..__NH 0 5 g (j ir 0 '~ 5 u E! ' a _0) , "IM Proses 2 F 11- ~ _F. il)propanoil]amino})etoksi]propanoil}gIisilgIisiI-L-feniIalanilglisiI-N-[(1S,98)-9-etil- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-il]-ß-alaninamid yerine N-süksinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidpropanamid)etoksi)etoksi)propanoat kullanilarak Örnek 2'nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, 2.07-2.21 MS (ESI) m/z: * Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (49)Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 29'un Proses 2'si ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 14.50 mg/mL, antikor verimi: 10.2 mg (%82) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.8. Örnek 53 Antikor-ilaç konjugati (50) 0 H S -l .-fu I r` Him . (11...,_Ivhl`litr'j J naif.' "Y” N , ,i .~_(_` i_, form› 7:& \` I N !J - +2› :2) 7. __ r Ü N `J ,g !1 .. iJ 1::-"1 '1 T i..;:-' 16-azanonadekan-1-oil]glisilglisiI-L-fenilalanilglisil-N-[(1S,98)-9-etil-5-floro-9- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]-ß-alaninamid kullanilarak Örnek 27nin Proses 3'ü ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (, MS (ESI) m/z: + Proses 2: Antikor-ilaç konjugati (50) Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru ve yukaridaki Proses 1`de elde edilen bilesik kullanilarak basliktaki antikor-ilaç konjugati, Örnek 2'nin Proses 4'ü ile ayni sekilde elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 13.47 mg/mL, antikor verimi: 9.4 mg (%75) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): Örnek 54 Antikor-ilaç konjugati (51) Proses 1 F» :ww '= ' N ;i-. 1.,” -' .dir 0 H ç. H 0 , H 0 - C4 H _...._Lir proses 4 1; _i_ :fî O '1 5. .“H " < II **I-2,__G Proses 5 1:: N L | Ci 1 l. 'i f! 4 LÜJHE.LêP-~v--~" _r_ _ _ i`, _ _1 0 i' -r ,1 i _ 3 H 7. I- 0 k “-4 b]kinolin-1-iI]aminol-6-oksohekzil)karbamat üzere 4-(tert-bütoksikarbonilamin0)bütanoik asit yerine 6-(tert- bütoksikarbonilamin0)hekzanoik asit kullanilarak Örnek 1'in Proses 11 ile ayni sekilde reakte edilmistir. 1H-NMR (DMSO-da) 6: , 1.47- 8.39 (1H, d, J=9.0 Hz). b]kinolin-1-il]hekzanamid trifloroasetat (0.342 9, %84) saglamak üzere Örnek 1lin Proses 2'si ile ayni sekilde reakte edilmistir.
Proses 3: N-(tert-bütoksikarbonil)glisilgIisiI-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,98)-9-etiI-5- benzolde]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1-il]amino}-6- oksohekzil)glisinamid (0.225 9, %91) saplamak üzere Örnek 2'ye ait Proses 1 ile ayni sekilde reakte edilmistir. b]kinolin-1 -il]amino}-6-oksohekzil)gIisinamid Yukaridaki Proses 3'te elde edilen bilesik (0.105 g, 0.108 mmol), basliktaki bilesigi (0.068 mg, %65) saglamak üzere Örnek 2'ye ait Proses 2 ile ayni sekilde reakte edilmistir.
Proses 5: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1 -iI)hekzanoil]gIisilglisiI-L- 6-oksohekzil)glisinamid Yukaridaki Proses 4`te elde edilen bilesik (58 mg, 0.060 mmol), basliktaki bilesigi (39 mg, %62) saglamak üzere Örnek 2'ye ait Proses 3 ile ayni sekilde reakte edilmistir. (1H, t, J=5.7 Hz).
MS (ESI) m/z: + Proses 6: Antikor-ilaç konjugati (51) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1ide açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak 1.61 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik bir antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; 0. ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi 37°C`de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra yukaridaki Proses 5'te elde edilen 10 nM bilesik içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( buna eklenmistir ve 22°Clde 40 dakika ilaç baglayioinin antikora konjuge edilmesine yönelik inkübe edilmistir. Daha sonra aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve 22°C'de bir baska 20 dakika ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (PBS7.4, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1”de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.97 mg/mL, antikor verimi: 5.82 mg (%58) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 55 Antikor-ilaç konjugati (52) Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (52) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak 1.61 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSö.0/EDTA ile 10 mg/mL'iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; 0. ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyonun 22°C'de 10 dakika inkübe edilmesinden sonra Örnek 54'e ait Prosedür S'te elde edilen 10 nM biiesigi içeren bir dimetii süifoksit solüsyonu (0.0590 mL; her antikor molekülü için 9.2 esdeger) buna eklenmistir ve 22°C'de 40 dakika ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co. eklenmistir ve 22°C'de bir baska 20 dakika ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati Içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (PBST.4, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasai karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (moiar absorpsiyon katsayisi olarak, amac): 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.94 mg/mL, antikor verimi: 5.64 mg (%56) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.1. Örnek 56 Antikor-ilaç konjugati (53) (5 t'HITi.. Utij Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (53) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak 1.61 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSö.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.: 0. ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilmesi ile indirgenmistir. Antikor ile Ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek 54'e ait Prosedür 5”te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.0295 mL; her antikor molekülü için 4.6 esdeger) buna eklenmistir ve 22°C'de 40 dakika ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co. eklenmistir ve 22°C'de bir baska 20 dakika ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (PBS7.4, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak. :A280: 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.22 mg/mL, antikor verimi: 7.32 mg (%73) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 57 Antikor-ilaç konjugati (54) .:74 0 H 0 H 0 r” / ,2 `21`N.WN ,miyim-"k/IKN x/'x APO V l Proses1 FkLNr'Ifîi-î- . f'i' 3 H Ç N o Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (54) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru. Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak 1.61 kullanilmistir) ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSö.0/EDTA ile 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'lik bir tüp içine toplanmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; 0. ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C2de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyon 22°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra Örnek 54`e ait Prosedür 5'te elde edilen 10 nM bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( buna eklenmistir ve 22°C'de 40 dakika ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik inkübe edilmistir. Daha sonra aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve 22°C'de bir baska 20 dakika ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1ide açiklanan Ortak prosedür D-1 (PBS7.4, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.06 mg/mL, antikor verimi: 6.36 mg (%64) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 58 Antikor-ilaç konjugati (55) Proses 1: ({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glisiI}amino)metil asetat tolüen (40.0 ml) içeren bir karisima piridin (1.16 ml, 14.7 mmol) ve kursun tetraasetat (6.84 9, 14.7 mmol) eklenmistir ve 5 saat isitma islemi altinda reflükse edilmistir.
Reaksiyon solüsyonu oda sicakligina sogutulduktan sonra çözünmez maddeler, Selit yoluyla filtrasyon araciligiyla uzaklastirilmistir ve düsük basinç altinda konsantre edilmistir. Elde edilen kalintilar etil asetat içinde çözünmüstür ve su ve doymus tuzlu su ile yikanmistir ve daha sonra organik katman, anhidröz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirildiktan sonra elde edilen kalintilar, renksiz bir kati (3.00 9, %67) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [hekzan : etil asetat = 9 : 1 (v/v) - etil asetat] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 4.23 (1H, t, J=7.0 Proses 2: Benzil [({N-[(9H-fluoren-9- ilmetoksi)karbonil]gIisiI}amino)metoksi]asetat Yukaridaki Proses 1'de elde edilen bilesigin (3.68 9, 10.0 mmol) bir tetrahidrofuran ( O°C`de potasyum tert- bütoksit (2.24 9, 20.0 mmol) eklenmistir ve 15 dakika oda sicakliginda karistirilmistir.
Reaksiyon solüsyonu, 0°C'de etil asetat ve su ile yüklenmistir ve etil asetat ve kloroform ile özütlenmistir. Elde edilen organik katman sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve filtrelenmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Elde edilen kalintilar dioksan ( içinde çözünmüstür, sodyum mmol) ile yüklenmistir ve oda sicakliginda 2 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu su ile yüklenmistir ve etil asetat ile özütlenmistir. Elde edilen organik katman sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve filtrelenmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, renksiz yagli maddede (1.88 9, %40) basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [hekzan : etil asetat = 100 : O (v/v) - 0 : 100] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 4.49 (2H, Proses 3: [({N-[(9H-fluoren-9-iImetoksi)karbonil]gIisil}amino)metoksi]asetik asit Yukaridaki Proses 2'de elde edilen bilesik (1.88 9, 3.96 mmol), etanol ( ve etil asetat (20.0 ml) içerisinde çözünmüstür. Paladyum karbon katalizörü (376 mg) eklendikten sonra bu, oda sicakliginda 2 saat hidrojen atmosferi altinda karistirilmistir. Çözünmez maddeler Selit yoluyla filtrasyon araciligiyla uzaklastirilmistir ve solvent, renksiz bir kati (1.52 9, kantitatif) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. 1H-NMR (, 4.123-432 (3H, benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-2- oksoetoksi)metiI]amino}-2-oksoetil)karbamat dimetilformamid (, diizopropiletilamin ( ve N,N'-disiklohekzilkarbodiimid (0.143 9, 0.693 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda 3 saat karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk kahverengi bir kati (0.352 9, %82) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi katmani] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 2.06-2.20 MS (ESI) m/z: + b]kinolin-1-iI]amino}-2-oksoetoksi)metiI]glisinamid Yukaridaki Proses 4'te elde edilen bilesigin (0.881 9, 1.10 mmol) bir N,N- dimetilformamid ( eklenmistir ve oda sicakliginda 2 saat karistirilmistir. Solvent, basliktaki bilesigi içeren bir karisim saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Karisim, ilave saflastirma olmaksizin sonraki reaksiyona yönelik kullanilmistir.
Proses 6: N-[(9H-fluoren-9-iImetoksi)karbonil]glisiIglisiI-L-feniIalanil-N-[(2- oksoetoksi)metiI]glisinamid Buz ile sogutma altinda yukaridaki Proses 5'te elde edilen karisimin (0.439 mmol) bir mmol) ve N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karb0nil]glisilglisil-L-fenilalanin (Japon Patent karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk turuncu bir kati (0.269 9, %58) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol 9 : 1 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir.
MS (ESI) m/z: + Proses 7: GIisilglisil-L-fenilalaniI-N-[(2-{[(1S,9$)-9-etiI-5-floro-9-hidroksi-4-metil- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]kinolin-1 -il]amino}-2- oksoetoksi)metiI]glisinamid dimetilformamid ( eklenmistir ve oda sicakliginda 2 saat karistirilmistir. Solvent, basliktaki bilesigi içeren bir karisim saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Karisim, ilave saflastirma olmaksizin sonraki reaksiyon için kullanilmistir.
Proses 8: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]gIisilglisiI-L- b]kinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metiI]glisinamid Yukaridaki Proses 7'de elde edilen bilesigin (0.253 mmol) bir N,N-dimetilf0rmamid eklenmistir ve oda sicakliginda 3 gün karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati (0.100 9, %38) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 1.33-1.47 MS (ESl) m/z: + Proses 9: Antikor-ilaç konjugati (55) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nmide absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PB86.0/EDTA ile degistirilmesi ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, bir 1.5 mL polipropilen tüpüne yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve Proses 8`de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, oda sicakliginda 40 dakika ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) yoluyla karistirilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich C0. LLC) aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonu sonlandirmak üzere bir diger 20 dakika oda sicakliginda karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'lik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Bundan sonra solüsyon, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür A Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280 = 235300 (Ön görülen ortalama deger) ve :0370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 12.57 mg/mL. antikor verimi: 8.8 mg (%70) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 59 Antikor-ilaç konjugati (56) Proses 1 L\-"rl r"”"\/"0 "70 Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (56) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBS6.0/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir propilen tüpüne yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilecek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve Örnek 58`e ait Proses 8'de edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 60 dakika karistirilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co. LLC) aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak. EA,280= 235300 (ön görülen ortalama deger) ve &0,370 = 19000 (ölçülen ortalama deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 1.33 mg/mL, antikor verimi: 7.98 mg (%64) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 60 Antikor-ilaç konjugati (57) 4 ' 9' H ._ I (ÃIAC'K O Proses1 4_ *f ”V .i' Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (57) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 2'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür C-1 ve Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, kullanilarak ortamin PBSG.O/EDTA ile degistirilmesi yoluyla 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir propilen tüpüne yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir.
Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Dimetil sülfoksit (Sigma-Aldrich Co.
LLC; ve Örnek 58'e ait proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesik içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 60 dakika karistirilmistir. Daha sonra buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika karistirilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Bundan sonra solüsyon, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür A Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, 8A,2so= 235300 (ön görülen karakteristik degerler elde edilmistir. Antikor konsantrasyonu: 0.91 mg/mL, antikor verimi: 5.46 mg (%44) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama Örnek 61 Antikor-ilaç konjugati (58) M30H'i_LP (1 HT 0 ` /[^l o Örnekler 59 ve 608 ait antikor-ilaç konjugatlarinin hemen hemen tüm miktarlari karistirilmistir ve solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedürA araciligiyla konsantre edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 12.30 mg ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 5.4. Örnek 62 Antikor-ilaç konjugati (59) Lil" r 'n`i "of ii. L'I'IF* L: (r-o t' Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (59) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1lde açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.O/EDTA ile 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (100 mL, 1 g antikor), 250 mL'Iik bir balona yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 mL; her antikor molekülü için 3.6 esdeger) ve ayrica aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (5 mL) ile yüklenmistir. Solüsyonun bir pH ölçer kullanilarak 7.4'e yakin pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (3.51 mL; her antikor molekülü için 5.2 esdeger) ve dimetil sülfoksit ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir karistirici ile 15°C'de 130 dakika bir su banyosunda karistirilmistir. Daha sonra buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, bir ultrafiltrasyon membrani (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), bir tüp pompasi (Cole-Parmer international, MasterFlex ultrafiltrasyon saflastirma islemine tabi tutulmustur. Spesifik olarak ABS, saflastirma yönelik bir tampon solüsyonu olarak reaksiyon solüsyonuna damlatilarak (toplamda eklenirken ultrafiltrasyon saflastirma islemi, konjuge edilmemis ilaç baglayicilar ve diger düsük moleküler agirlikli reaktiflerin uzaklastirilmasina, ayrica tampon solüsyonunun ABS ile degistirilmesi ve ek olarak solüsyonun konsantre edilmesine yönelik olarak basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren yaklasik 70 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere gerçeklestirilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen deger) ve &0370 = 20217 (ölçülen deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 14.2 mg/mL, antikor verimi: 1.0 9 (yaklasik %100) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.2. Örnek 63 Antikor-ilaç konjugati (60) l 1' -'1`* yikar" j."= `î 3-; "I TT ` 1...), .' , n 1:, ...,.. - , Ü' *:1 Am› ” ait** Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (60) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (5 mL, 50 mg antikor) 15 mLilik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.075 mL; her antikor molekülü için 4 esdeger) ile yüklenmistir. Solüsyonun, bir pH ölçer kullanilarak 7.0'a yakin pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.219 mL; her antikor molekülü için 6.5 esdeger) ve dimetil sülfoksit ( yukaridaki solüsyona eklendikten sonra nu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak °C'de 90 dakika bir su banyosunda inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin aköz bir solüsyon u( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika inkübe edilmistir. Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 19 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen elde edilmistir. molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 4.7. Örnek 64 Antikor-ilaç konjugati (61) -6 im' w,- -' '- * ii rh"*'r" ,L_.›I:,'.I-.,vi`* Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (61) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4P antikoru, Üretim yöntemi 1'de Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, 1.61 mLmg' 1cm'1 kullanilmistir) ve açiklanan Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSGD/EDTA ile 10 mg/mL'lik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (4 mL, 40 mg antikor) 15 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.14 mL; her antikor molekülü için 5.2 esdeger) ile yüklenmistir. Solüsyonun, bir pH ölçer kullanilarak 7.0'a yakin pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir. Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 58'e ait Proses 8lde elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( yukaridaki solüsyona eklendikten sonra ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 15°C'de 60 dakika bir su banyosu içinde inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 10 mL'lik bir solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (Ön görülen deger) ve &0,370 = 20217 (ölçülen deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 2.03 mg/mL, antikor verimi: 26 mg (%66) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 5.7. Örnek 65 Antikor-ilaç konjugati (62) 4:" ;`: Y: 1 I_ - I I H 4 1)!” Y - 9' R çivi.` .
Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (62) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, lnc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgermistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Örnek 58'e ait Proses 81de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu (0.0439 mL; 5.2 her antikor molekülü için esdeger) ve dimetil sülfoksit ( oda sicakliginda yukaridaki solüsyona eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 15°C`de 1 saat bir su banyosu içinde inkübe edilmistir. Daha sonra buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika inkübe edilmistir. Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor- ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Bundan sonra solüsyon, Ortak prosedür A araciligiyla konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, :A280: 235300 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 7.8 mg (%62) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.4. Örnek 66 Antikor-ilaç konjugati (63) Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (63) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 1'de üretilen M30-H1-L4 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm“de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PB86.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 lelik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 mL; 5.2 her antikor molekülü için esdeger) ( ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, lnc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun, 7.4 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona oda sicakliginda Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'lik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak 15°C'de 1 saat bir su banyosunda inkübe edilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich Co.
LLC) aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda bir baska 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugatini içeren 6 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur. Bundan sonra solüsyon Ortak prosedür A araciligiyla konsantre edilmistir.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 235300 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 10.0 mg/mL, antikor verimi: 7.3 mg (%58) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 5.4. Örnek 67 Antikor-ilaç konjugati (64) i .1 Hii " i" .\1 . l __WH ;wp-x.: _4. Â_ . 4' l" i 4.1.* Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (64) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 3'te üretilen anti-CD30 antikoru. Üretim yöntemi 1tde açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSB.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'lik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona Örnek 58'e ait Proses 8“de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich C0.
LLC) aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 2.5 mL'Iik bir solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 270400 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.96 mg/mL, antikor verimi: 2.4 mg (%60) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.7. Örnek 68 Antikor-ilaç konjugati (65) 1 1,` f - 4' .21 i 3 c .- ?. ` 1 m \I 1 _.._. 1 L 'I - 'L ;If-i Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (65) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 3'te üretilen anti-CD30 antikoru. Üretim yöntemi 1,de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm`de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSB.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon (, 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun pH 7.0 ± 0.1 degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi. 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona oda sicakliginda Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Daha sonra aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 2.5 mL'IIk bir solüsyonu saglamak üzere Üretim yöntemi 1`de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 270400 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 0.39 mg/mL, antikor verimi: 1.0 mg (%24) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 6.8. Örnek 69 Antikor-ilaç konjugati (66) L, 10 .1. v" ..Ja 'Ç,- Ivl ` G I `u' T ` I `kil' Al› [f IN' ."NFJII lnii Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (66) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 4'te üretilen anti-CD33 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm”de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona oda sicakliginda Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nMilik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( ve dimetil sülfoksit ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Daha sonra 100 mM NAC'nin (Sigma-Aldrich C0. LLC) aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 2.5 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1ide açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 256400 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.19 mg/mL, antikor verimi: 3.0 mg (%74) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.8. Örnek 70 Antikor-ilaç konjugati (67) 1 1 i "{ Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (67) Antikorun indirgenmesi: Reference Örnek 4ite üretilen anti-CD33 antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSG.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL”lik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, Inc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun 7.0 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki mentese parçasindaki disülfit bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona oda sicakliginda Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR-i 03, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Daha sonra aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 2.5 mL”Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 256400 (ön görülen elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.24 mg/mL, antikor verimi: 3.1 mg (%78) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.0. Örnek 71 Antikor-ilaç konjugati (68) 3 'i'rri_l iii'g Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (68) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 5'te üretilen anti-CD70 antikoru. Üretim yöntemi 1ide açiklanan Ortak prosedür B (280 nm`de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSB.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi. 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona oda sicakliginda Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( ve dimetil sülfoksit ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR-103, AS ONE Corporation tarafindan üretilmistir) kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Daha sonra aköz buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 2.5 mL'Iik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 262400 (ön görülen deger) ve &0370 = 20217 (ölçülen deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.10 mg/mL, antikor verimi: 2.8 mg (%69) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 3.8. Örnek 72 Antikor-ilaç konjugati (69) Er." 1 n'Lvr izi"- i .7' 4, _›__ ri-1 " ..._ ,Nli } 1 v 1 . . iii If` riii -Lia Iq" 'I' ..4 'f 5 ~ n 'i . -.
Proses 1: Antikor-ilaç konjugati (69) Antikorun indirgenmesi: Referans Örnek 5'te üretilen anti-CD7O antikoru, Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür B (280 nm'de absorpsiyon katsayisi olarak, ve Ortak prosedür C-1 kullanilarak PBSB.0/EDTA ile 10 mg/mL'Iik antikor konsantrasyonuna sahip olacak sekilde hazirlanmistir. Solüsyon ( 1.5 mL'Iik bir tüpe yerlestirilmistir ve aköz bir 10 mM TCEP solüsyonu (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 her antikor molekülü için esdeger) ve aköz bir 1 M dipotasyum hidrojen fosfat solüsyonu (Nacalai Tesque, lnc.; ile yüklenmistir. Solüsyonun 7.0 ± 0.1 olan pH degerine sahip oldugu dogrulandiktan sonra antikordaki bir mentese parçasindaki disülfid bagi, 37°C'de 1 saat inkübe edilerek indirgenmistir.
Antikor ile ilaç baglayici arasindaki konjugasyon: Yukaridaki solüsyona oda sicakliginda Örnek 58'e ait Proses 8'de elde edilen 10 nM'Iik bilesigi içeren bir dimetil sülfoksit solüsyonu ( eklendikten sonra bu, ilaç baglayicinin antikora konjuge edilmesine yönelik olarak bir tüp döndürücü (MTR- kullanilarak oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Daha sonra aköz bir solüsyonu ( buna eklenmistir ve ayrica ilaç baglayicinin reaksiyonunu sonlandirmak üzere oda sicakliginda 20 dakika inkübe edilmistir.
Saflastirma: Yukaridaki solüsyon, basliktaki antikor-ilaç konjugati içeren 2.5 mL'lik bir solüsyon saglamak üzere Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür D-1 (ABS, tampon solüsyonu olarak kullanilmistir) kullanilarak saflastirma islemine tabi tutulmustur.
Fizikokimyasal karakterizasyon: Üretim yöntemi 1'de açiklanan Ortak prosedür E kullanilarak (molar absorpsiyon katsayisi olarak, EA,280= 262400 (ön görülen deger) ve &3,370 = 20217 (ölçülen deger) kullanilmistir), asagidaki karakteristik degerler elde edilmistir.
Antikor konsantrasyonu: 1.16 mg/mL, antikor verimi: 2.9 mg (%73) ve her antikor molekülü için konjuge ilaç moleküllerinin ortalama sayisi (n): 7.0. Örnek 73 (Örnek 58'e ait Proses 8 bilesiginin sentezlenmesine yönelik bir diger yöntem) J` .ANK/L J: 0./ Prosest. _U ,(Ü ProsesZ i*/`l\` 'xc MYO G [J '141540 3 \J\[ (lg/`O YO ”N 3 KOJLH_ 7“ “NY /El gr \/\/\, N/xr / 3 g ProsesS &NL Oakio \ .IIvN /p 0 o HN,~Y~H F g `N `_,\ Proses 1: tert-Bütil N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]glisilglisil- L-fenil alaninat Buz ile sogutma altinda tert-bütil N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]gIisilglisiI-L-fenil alaninatin (J. Pept. Res., sicakliginda 4 gün karistirilmistir ve daha sonra ayrica N-süksinimidil 6-maleimid solüsyonu etil asetat ile seyreltilmistir ve aköz bir %10 sitrik asit solüsyonu, aköz bir sodyum hidrojen karbonat solüsyonu ve doymus tuzlu su ile yikanmistir ve daha sonra organik katman, anhidröz magnezyum sülfat üzerinde kurutulmustur. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirildiktan senra, elde edilen kalintilar soluk sari bir kati (0.295 9, - kloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 2.23 MS (ESI) m/z: * Proses 2: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]glisilglisil-L- fenilalanin (8.00 ml) solüsyonuna trifloroasetik asit ( eklenmistir ve oda sicakliginda 18 saat karistirilmistir. Solvent, soluk sari bir kati (0.240 9, %91) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. 1H-NMR (, 2.10 (2H, t, Proses 3: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]glisilglisiI-L- b]kinolin-1 -il]amino}-2-oksoetoksi)metiI]glisinamid dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid (0.253 9, 1.32 mmol) ile yüklenmistir ve 1 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu Örnek 58'e ait Proses 5”te elde edilen karisimin (1.10 mmol) bir N,N-dimetilformamid ( solüsyonuna eklenmistir ve oda sicakliginda 3 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, aköz bir %10 sitrik asit solüsyonu ile yüklenmistir ve kloroform ile özütlenmistir. Elde edilen organik katman sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve filtrelenmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati (0.351 9, %31) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi verileri, Örnek 858'e ait Proses 8 bilesigininki ile aynidir. Örnek 74 (Örnek 58'e ait Proses 8 bilesiginin sentezlenmesine yönelik bir diger yöntem) 1: r..! :in - mi _ -. i', _.~ H. “H J.: 0 n.
F' ;ru-z ! "ini-1_ Proses 1: Benzil [({N-[(9H-fluoren-9- ilmetoksi)karbonil]gIisiI}amino)metoksi]asetat dakika karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, doymus bir aköz sodyum hidrojen karbonat solüsyonu ile yüklenmistir ve etil asetat ile özütlenmistir. Elde edilen organik katman sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve filtrelenmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, renksiz bir kati (6.75 9. %71) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [hekzan : etil asetat = Proses 2 bilesigininki ile aynidir.
Proses 2: N-[(benziIoksi)karbonil]glisilgIisiI-L-fenilalanin-N-{[(2-(benziloksi)-2- oksoetoksi]metiI}glisinamid Yukaridaki Proses 1`de elde edilen bilesigin (6.60 9, 13.9 mmol) bir an N,N- 9, 14.6 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda 15 dakika karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, N-[(benziloksi)karb0nil]glisiIglisiI-L-fenilalanin (6.33 9, 15.3 mmol), N- hidroksisüksinimidin (1.92 9, 16.7 mmol) bir N,N-dimetilf0rmamid ( solüsyonu ve oda sicakliginda önceden 1 saat karistirilan 1-(3-dimetilaminopropiI)-3- etilkarbodiimid hidroklorid (3.20 9, 16.7 mmol) ile yüklenmistir ve oda sicakliginda 4 saat karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, 0.1 N hidroklorik asit ile yüklenmistir ve kloroform ile özütlenmistir. Elde edilen organik katman sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve filtrelenmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, renksiz bir kati (7.10 9, %79) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir.
Proses 3: GIisilglisil-L-fenilalaniI-N-[(karboksimetoksi)metil]glisinamid Yukaridaki Proses ?de elde edilen bilesigin bilesik (7.00 9, 10.8 mmol) bir N,N- dimetilformamid ( eklenmistir ve oda sicakliginda 24 saat hidrojen atmosferi altinda karistirilmistir ve solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Elde edilen kalintilar su içinde çözünmüstür, çözünmez materyal Selit yoluyla filtrasyon araciligiyla uzaklastirilmistir ve solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Bu prosedür, renksiz bir kati (3.77 9, %82) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere iki kez tekrar edilmistir.
Proses 4: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1-iI)hekzanoil]gIisilglisil-L- fenilalaniI-N-[(karboksimetoksi)metil]glisinamid Yukaridaki Proses 3”te elde edilen bilesigin (3.59 9, 8.48 mmol) bir N,N- dimetilformamid ( solüsyonuna N-süksinimidil 6-maleimid hekzanoat (2.88 9, karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu 0.1 N hidroklorik asit ile yüklenmistir ve kloroform ve karistirilmis bir kloroform ve metanol [kloroform : metanol = 4 : 1 (v/v)] solventi ile yüklenmistir. Elde edilen organik katman sodyum sülfat üzerinde kurutulmustur ve filtrelenmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, renksiz bir kati olarak (3.70 9, %71) basliktaki bilesigi saglamak üzere by silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol : su = 7 : 3: 1'in (v/v/v) parçalara ayrilmis organik katmani] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (DMSO-Ds) ö: 1.13-1.24 Proses 5: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-piroI-1 -iI)hekzanoil]glisilglisil-L- b]kinolin-1 -il]amino}-2-oksoetoksi)metiI]glisinamid Bilesigin (4) (1.14 g, 2.00 mmol) bir mesilat N,N-dimetilformamid ( solüsyonu, Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati (1.69 9, %82) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir.
Bilesigin yararli verisi, Örnek 58`e ait Proses 8 bilesigininki ile aynidir. hidroksiasetamid /ILO'YO NCAZH ÜLN{OPmseS1'(\l PFOSGSZ Â ,L 'x (0 2-oksoetilasetat dimetilformamid ( süspansiyonuna N,N-diizopropiletilamin (0.492 mL, 2.82 mmol) ve asetoksiasetil klorid (0.121 ml, 1.13 mmol) eklenmistir ve oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati (0.505 9, kantitatif) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol : su = 7 : 3: 1'in (v/v/v) parçalara ayrilmis organik katmani] yoluyla saflastirilmistir. 1H-NMR (, 2.08 (SH, MS (ESI) m/z: + hidroksiasetamid ml, 4.00 mmol) solüsyonu eklenmistir ve oda sicakliginda 1 saat karistirilmistir.
Reaksiyon, 1 N hidroklorik asit (5.00 ml, 5.00 mmol) ilavesi ile sonlandirilmistir ve solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir. Elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati (0.412 9, %89) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi katmani] yoluyla saflastirilmistir. Bu bilesik, antikor-ilaç konjugati (55) veya (56) alan kanser tasiyan bir fare tümöründe dogrulanmistir. 1H-NMR (, 209-228 Örnek 76 (Örnek 75,e ait bilesigin sentezlenmesine yönelik bir diger yöntem) hidroksiasetamid Glikolik asit (0.0201 9, 0.27 mmol), N,N-dimetilformamid ( içerisinde karistirilmistir. Reaksiyon solüsyonu, bilesik (4) (0.1 9, 0.176 mmol) mesilati ve trietilamin ( ile yüklenen bir N,N-dimetilformamid süspansiyonuna ( eklenmistir ve oda sicakliginda 24 saat karistirilmistir. Solvent, düsük basinç altinda uzaklastirilmistir ve elde edilen kalintilar, soluk sari bir kati (0.080 9, %92) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere silika jel kolon kromatografisi [kloroform - kloroform : metanol = 10 : 1 (v/v)] yoluyla saflastirilmistir. Bilesigin yararli verisi, Örnek 75'e ait Proses 2'de elde edilen bilesiginki ile aynidir.
(Test Örnegi 1) Tam uzunlukta insan B7-H3 varyant 1 ifade vektörünün üretimi Insan BY-H3 varyanti 1*i kodlayan cDNA, bir sablon olarak LNCaP hücresi (American Type Culture Collection: ATCC) toplam RNA'dan sentezlenen cDNA ve asagidaki primer seti kullanilarak PCR reaksiyonu yoluyla çogaltilmistir: '-Ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 22) ve Daha sonra elde edilen PCR ürünü, MagExtractor PCR & Gel temizleme islemi (Toyobo Co., Ltd.) kullanilarak saflastirilmistir. Saflastirilan ürün ayrica restriksiyon enzimleri (NheI/Notl) ile parçalanmistir ve daha sonra MagExtractor PCR & Gel temizleme islemi (Toyobo Co., Ltd.) kullanilarak saflastirilmistir. pcDNA3.1 (+) plazmid DNA (Life Technologies), yukarida (NheI/Notl) ile ayni restriksiyon enzimleri ile parçalanmistir ve daha sonra MagExtractor PCR & Gel temizleme islemi (Toyobo Co., Ltd.) kullanilarak saflastirilmistir.
Bu saflastirilan DNA solüsyonlari karistirilmistir, yüksek Ligasyon (Toyobo Co., Ltd.) ile ayrica yüklenmistir ve 16°C”de 8 saat Iigasyona yönelik inkübe edilmistir.
Escheri'chia coli DH50i kompetan hücreler (Life Technologies), elde edilen reaksiyon ürününün eklenmesi ile transforme edilmistir.
Bu sekilde elde edilen koloniler, aday klonlari seçmek üzere PCR primerleri ve BGH revers primer kullanilarak koloni direkt PCR'ye tabi tutulmustur.
Elde edilen aday klonlar, sivi bir ortamda (LB/Amp) kültürlenmistir ve plazmid DNA, MagExtractor-Plasmid- (Toyobo Co., Ltd.) ile özütlenmistir.
Elde edilen her bir klon, bir sablon olarak elde edilen plazmid DNA ile primer 3 (CMV promotör primer) arasinda dizileme analizi yoluyla saglanan CDS dizisi ile karsilastirilir: '-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) ve primer 4 (BGH revers primer): '-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25).
Dizi dogrulandiktan sonra elde edilen klon 200 mL LB/Amp ortaminda kültürlenmistir ve plazmid DNA, VioGene Plasmid Midi V-100 kiti kullanilarak özütlenmistir.
Vektör, pcDNA3.1-B7-H3 olarak tasarlanmistir. Vektörde klonlanan B7-H3 varyant 1 genine ait bir ORF alaninin dizisi, Dizi Listesinde SEQ ID NO: 26'ya (Sekil 16) ait nükleotid pozisyonlari 1 ila 1602'de gösterilir. Ayrica B7-H3 varyanti 1'in amino asit dizisi, Dizi Listesinde SEQ ID NO: 1'de gösterilir.
(Test Örnegi 2) BY-H3 varyant 1 genini stabil olarak ifade eden CCRF-CEM hücresinin hazirlanmasi Test Örnegi 1'de üretilen pcDNA3.1-B7-H3, Nucleofector II (Lonza Group Ltd. tarafindan üretilmistir) kullanilarak elektroporasyon yoluyla CCRF-CEM hücrelerine (ATCC) transfekte edilmistir. Daha sonra hücreler, 37°C ve %5 002 kosullari altinda edilecektir) içeren RPMI1640 ortaminda (Life Technologies) iki gece ayrica kültürlenmistir. 2 günlük kültürleme isleminden sonra kültür, pcDNA3.1-B7-H3'ün stabil olarak entegre edildigi CCRF-CEM hücrelerini seçmek amaciyla ?'50 ug/mL G içeren %10FBS-RPMI1640'da baslatilmistir. 1 aylik kültürleme isleminden sonra klonlama, tek bir hücre klonu saglamak amaciyla sinirlandirici dilüsyon yöntemi yoluyla gerçeklestirilmistir. Spesifik olarak G418'e dirence sahip hücreler, 10 hücre/mL'de seyreltilmistir, bir 100 uL/göz konsantrasyonunda 96 gözlü bir plakaya inoküle edilmistir ve kültürlenmistir ve çogalmasina olanak taninan hücreler, ayri ayri gözlerden geri kazanilmistir.
Akis sitometrisi, geri kazanilan her bir klonda B7-H3 ifadesinin dogrulanmasina yönelik kullanilmistir. Spesifik olarak geri kazanilan her bir klon, %5 FBS içeren PBS ile iki kez yikanmistir, daha sonra %5 FBS ve 10 ug/mL M3O içeren PBS ilavesi süspanse edilmistir ve 4°C`de 30 dakika beklemeye birakilmistir. Klon, %5 FBS içeren PBS ile iki kez yikanmistir, daha sonra %5 FBS içeren PBS ile 1000 kat seyreltilen fare IgG”sine konjuge keçi IgG fraksiyonunun ilavesi ile süspanse edilmistir ve 4°C'de 30 dakika beklemeye birakilmistir. Klon, %5 FBS içeren PBS ile iki kez yikanmistir, daha sonra Beckman Coulter, Inc.) kullanilarak algilanmistir.
Bu prosedürler ile elde edilen B7-H3 varyant 1 genini stabil olarak ifade eden CCRF- CEM hücreleri, CEM_V1_3.1_2 hücreleri olarak tasarlanmistir. Parent hat CCRF-CEM hücreleri, B7-H3 ifadesinden yoksun bir hücre hatti olarak kullanilmistir.
(Test Örnegi 3) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksisite testi (1) Test Örnegi 22de üretilen CEM_V1_3.1_2 hücreleri veya CCRF-CEM hücreleri (ATCC), %10 fötal bovin serumu (MOREGATE) içeren RPMI (buradan sonra bir ortam olarak refere edilecektir) içinde kültürlenmistir. CEM_V1_3.1_2 hücreleri veya CCRF-CEM hücreleri, bir ortam kullanilarak 8 x 104 hücre/mL'Iik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir, 25 uL/göz olan bir konsantrasyonda 65 uL/göz ile yüklenen hücre kültürüne yönelik 98 gözlü bir mikro plakaya eklenmistir ve bir gece kültürlenmistir. Sonraki gün bir ortam kullanilarak her H1-L4 antikoru, M30-H1-L4P antikoru ve antikor-ilaç konjugati, 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda mikro plakaya eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir. Hücreler, 37°C'de 3 gün %5 C02 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir. Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinElmer) kullanilarak ölçülmüstür. IC50 degeri, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: a: Test maddesi konsantrasyonu (a) b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani d: Konsantrasyona (b) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a / b x 100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = CEM_V1_3.1_2 hücrelerine karsi lC50 < 0.1 (nM) olan sitotoksik bir aktivite 1 < |Cso < 100 (nM) olan sitotoksik bir aktivite sergilemistir. Öte yandan bu antikor-ilaç konjugatlarinin hiç biri, CCRF-CEM hücrelerine (> 100 (nM)) karsi sitotoksik bir aktivite sergilememistir. Ne M30-H1-L4 antikoru ne de M30-H1-L4P antikoru, hücrelerin her ikisine (> 100 (nM)) karsi sitotoksik bir aktivite sergilememistir.
(Test Örnegi 4) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksisite testi (2) Antijen pozitif hücreler SR hücreleri veya antijen negatif hücreleri Daudi hücreleri (ATCC), %10 fötal bovin serumu (MOREGATE) içeren RPMl (buradan sonra bir ortam olarak refere edilecektir) içinde kültürlenmistir. SR hücreleri veya Daudi hücreleri, bir ortam kullanilarak 2.8 x 104 hücre/mL olan bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir ve hücre kültürü için 96 gözlü bir mikro plakaya 90 uL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. Iki saat sonra her biri bir ortam kullanilarak 40 ve antikor-ilaç konjugatlari (6) ve (7), 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda mikro plakaya eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 pL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir. Hücreler, 37°C'de 3 gün %5 002 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir. Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CeIITiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinEImer) kullanilarak ölçülmüstür. lC5o degeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a / b x 100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = Antikor-ilaç konjugatlari (6) ve (7), SR hücrelerine karsi IC50< 0.01 (nM) olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Öte yandan antikor-ilaç konjugatlari (6) ve (7), Daudi hücrelerine (> 4.0 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik aktivite sergilememistir. Anti-CD30 antikoru, hücrelerin her ikisine (> 4.0 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik aktivite sergilememistir.
(Test Örnegi 5) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksisite testi (3) Antijen pozitif hücreler SR hücreleri (ATCC), %10 fötal bovin serumu (MOREGATE) içeren RPMI içinde kültürlenmistir. SR hücreleri, bir ortam kullanilarak 2.8 X 104 hücre/mL olan bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir ve hücre kültürü için 96 gözlü bir mikro plakaya 90 uL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. Iki saat sonra her biri bir uL/göz olan bir konsantrasyonda mikro plakaya eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir.
Hücreler, 37°C'de 6 gün %5 C02 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir.
Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinEImer) kullanilarak ölçülmüstür. The leodegeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani d: Konsantrasyona (b) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a I b X100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Antikor-ilaç konjugati (22), SR hücrelerine karsi hücrelerine (> 4.0 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik aktivite sergilememistir.
(Test Örnegi 6) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksik testi (4) Antijen pozitif hücreler HL-60 hücreleri (ATCC) veya antijen negatif hücreleri Raji hücreleri (ATCC) %10 fötal bovin serumu (MOREGATE) içeren RPMI (buradan sonra bir ortam olarak refere edilecektir) içinde kültürlenmistir. HL-GO hücreleri veya Raji hücreleri, bir ortam kullanilarak 8 x 104 hücre/mL'lik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir ve 65 pL/göz olan bir ortam ile yüklenen hücre kültürü için 96 gözlü mikro plakaya 25pL/göz olan bir konsantrasyonda mikro plakaya 10 pL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 pL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir.
Hücreler, 37°C'de 3 gün %5 C02 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir.
Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinEImer) kullanilarak ölçülmüstür. The IC50 degeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: a: Test maddesi konsantrasyonu (a) b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani d: Konsantrasyona (b) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a / b X100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = Antikor-ilaç konjugatlari (8) ve (9), HL-BO hücrelerine karsi leo< 0.1 (nM) olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Öte yandan antikor-ilaç konjugatlari (8) ve (9), Raji hücrelerine (> 100 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik aktivite sergilememistir. Anti- CD33 antikoru, hücrelerin her ikisine (> 100 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik aktivite sergilememistir.
(Test Örnegi 7) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksik testi (5) Antijen pozitif hücreler NOMO-1 hücreleri (HSRRB), %10 fötal bovin serumu (MOREGATE) içeren RPMI (buradan sonra bir ortam olarak refere edilecektir) içinde kültürlenmistir. NOMO-1 hücreleri, bir ortam kullanilarak 2.8 x 104 hücre/mL'Iik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir ve hücre kültürüne yönelik 96 gözlü bir mikro plakaya 90 pL/göz olan bir konsantrasyonda konjugatlari (24), (25) ve (67), 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda mikro plakaya eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir. Hücreler, 37°C'de 6 gün %5 002 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir. Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CeIITiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinEImer) kullanilarak ölçülmüstür. The leo degeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: a: Test maddesi konsantrasyonu (a) b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani d: Konsantrasyona (b) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a / b X100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = Antikor-ilaç konjugati (25), NOMO-1 hücrelerine karsi IC50 < 0.1 (nM) olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Antikor-ilaç konjugatlari (24) ve (67), hücrelere karsi 1 < IC50< 100 (nM) olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Anti-CD33 antikoru, NOMO-1 hücrelerine (> 100 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik aktivite sergilememistir.
(Test Örnegi 8) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksik testi (6) Antijen pozitif hücreler U veya antijen negatif hücreler MCP-7 hücreleri (ATCC), %10 fötal bovin serumu (MOREGATE) içeren RPMI (buradan sonra bir ortam olarak refere edilecektir) içinde kültürlenmistir. U251 hücreleri veya MCP-7 hücreleri, bir ortam kullanilarak 2.8 x 104 hücre/mL'Iik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir, hücre kültürü için 96 gözlü bir mikro plakaya 90 pL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir ve bir gece kültürlenmistir. Sonraki gün pL/göz olan bir konsantrasyonda mikro plakaya eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir.
Hücreler, 37°C'de 6 gün %5 C02 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir.
Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CeIITiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinElmer) kullanilarak ölçülmüstür. The ICsodegeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a I b x 100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = Antikor-ilaç konjugatlari (10) ve (11), U251 hücrelerine karsi ICso< 1 (nM) olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Öte yandan antikor-ilaç konjugatlari (10) ve (11), MCF-7 hücrelerine (2 90 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksik bir aktivite sergilememistir. Anti- CD70 antikoru, hücrelerin her ikisine (> 100 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksisite sergilememistir.
(Test Örnegi 9) Antikor-ilaç konjugatinin sitotoksisite testi (7) Antijen pozitif hücreler U içeren RPMI içinde kültürlenmistir. U251 hücreleri, bir ortam kullanilarak 2.8 x 104 hücre/mL'Iik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir ve hücre kültürü için 96 gözlü mikro plakaya 90 uL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. Iki yil sonra her biri bir ortam mikro plakaya 10 pL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlere 10 uL/göz olan bir konsantrasyonda bir ortam eklenmistir.
Hücreler, 37°C'de 6 gün %5 002 altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir.
Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari, bir plaka okuyucu (PerkinElmer) kullanilarak ölçülmüstür. The leodegeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: a: Test maddesi konsantrasyonu (a) b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani d: Konsantrasyona (b) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin her bir konsantrasyondaki sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a I b x 100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = Antikor-ilaç konjugatlari (26), (27), (40) ve (69), U olan sitotoksik bir aktiviteye sergilemistir. Antikor-ilaç konjugati (68), hücrelere karsi 10 < IC50< 100 (nM) olan bir sitotoksik aktivite sergilemistir. Anti-CD7O antikor, U251 hücrelerine (> 100 (nM)) karsi herhangi bir sitotoksisite aktivite sergilemistir.
(Test Örnegi 10) Salgilanan ilacin sitotoksisite testi (8) A içeren DMEM (GIBCO) (buradan sonra bir ortam olarak refere edilecektir) içerisinde kültürlenmistir.
A375 hücreleri, bir ortam kullanilarak 4 x 104 hücre/mL'lik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde hazirlanmistir, 65 uL/göz olan bir ortam ile yüklenen hücre kültürü (CORNING) için 96 gözlü mikro plakaya 25 uL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir ve bir gece kültürlenmistir. Sonraki gün, DMSO kullanilarak 1000 nM, 200 mikro plakaya 0.5 uL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. DMSO, test maddesi ile takviye yapilmamis gözlere 0.5 uL/göz olan bir konsantrasyonda eklenmistir. Her bir gözdeki ortam hacmi, 10 uL/göz olan bir ortamin eklenmesi ile 100 uL'ye ayarlanmistir ve hücreler, 37°C'de 6 gün %5 COz altinda kültürlenmistir. Kültürden sonra mikro plaka, inkübatörden disari alinmistir ve oda sicakliginda 30 dakika beklemeye birakilmistir. Kültür solüsyonu, esit bir miktarda CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Yasayabilirligi Analizi (Promega) ile yüklenmistir ve karistirilmistir. Mikro plaka oda sicakliginda 10 dakika beklemeye birakildiktan sonra isik emisyon miktari. bir plaka okuyucusu kullanilarak ölçülmüstür. leo degeri asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: a: Test maddesi konsantrasyonu (a) b: Test maddesi konsantrasyonu (b) c: Konsantrasyona (a) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani d: Konsantrasyona (b) sahip test maddesi ile takviye yapilan canli hücrelerin orani Konsantrasyonlar (a ve b), canli hücrelerin %50 oraninin çaprazlanmasi yoluyla a > b iliskisini belirler.
Hücrelerin sag kalim orani, asagidaki denkleme göre hesaplanmistir: Hücrelerin sag kalim oran (%) = a / b x 100 a: Test maddesi ile takviye yapilan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = 2) b: Test maddesi ile takviye yapilmayan gözlerden ortalama isik emisyonun miktari (n = sitotoksik aktiviteye sergilemistir. Örnek (42) bilesigi, hücrelere karsi 1 < IC50< 10 (nM)'ye karsi bir sitotoksik aktiviteye sergilemistir. Örnek (1) bilesigii hücrelere karsi 10 < ICso < 100 (nM)'ye karsi bir sitotoksik aktiviteye sergilemistir.
(Test Örnegi 11) Antitümör testi (1) Fare: 5- ila 6-haftalik disi BALB/c çiplak fareler (Charles River Laboratories Japan, alistirilmislardir. Fareler, sterilize kati besin (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) ile beslenmistir ve musluk suyu (5 ila 15 ppm sodyum hipoklorit solüsyonu ilavesi ile hazirlanmistir) verilmistir.
Analiz ve hesaplama ifadesi: Tüm çalismalarda tümörün majör ekseni ve minör ekseni, bir elektronik dijital kaliper (CD-150, Mitutoyo Corp.) kullanilarak bir haftada iki kez ölçülmüstür ve tümör hacmi (mm3) hesaplanmistir. Hesaplama ifadesi asagida gösterildigi gibidir.
Antikor-ilaç konjugatlarinin tümü, fizyolojik salin (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) ile seyreltilmistir ve her bir farenin kuyruguna intravenöz uygulama için 10 mL/kg”lik bir hacimde kullanilmistir. Insan melanom hatti A375 hücreleri, ATCCiden (American Type Culture Collection) alinmistir. Fizyolojik salin içinde süspanse edilen 8 x 106 hücre her bir disi çiplak farenin sag abdomenine subkütanöz olarak transplante edilmistir (Gün 0) ve fareler Gün 11'de rastgele sekilde gruplandirilmistir. M30-H1-L4P antikoru ve antikor-ilaç konjugati (2), Gün 11, 18 ve 25'te her bir farenin kuyruguna 10 mg/kg'lik bir dozda intravenöz olarak uygulanmistir.
Sonuçlar Sekil 17'de gösterilir. Sekilde, açik es alti yüzlü hat, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, açik üçgenli hat, M30-H1-L4P antikorunun etkisini gösterir ve açik daireleri olan hat, antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir.
Bu sonuçlardan görüldügü üzere antikor-ilaç konjugatinin (2) uygulanmasi, tümör hacmini önemli biçimde azaltmistir ve nihai uygulama sonrasinda herhangi bir tümör büyümesi gözlenmemistir. Bunun aksine M30-H1-L4P antikorunun uygulanmasi, tümör büyümesinin ilerlemesi ile sonuçlanmistir.
Ek olarak antikor-ilaç konjugatini (2) alan fareler, antikor-ilaç konjugatinin (2) düsük sekilde toksik ve yüksek derecede güvenli oldugu belirtilerek, kilo kaybi gibi fark edilebilir belirtileri içermez.
(Test Örnegi 12) Antitümör testi (2) Insan melanom hatti A alinmistir. Fizyolojik salin içinde süspanse edilen 6 x 106 hücre, her bir disi çiplak farenin sag abdomenine subkütanöz olarak transplante edilmistir (Gün 0) ve fareler, Gün 187de rastgele sekilde gruplandirilmistir. Antikor-ilaç konjugati (2), bir qw X 3 1,3 mg/kg) intravenöz olarak uygulanmistir.
Sonuçlar, Sekil 18'de gösterilir. Sekilde, açik es alti yüzlü hat, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, dolu kareleri olan hat 0.1 mg/kg'de uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir, X isareti olan hat 0.3 mg/kg”de uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir, dolu üçgenleri olan hat 1 mg/kg'de uygulanan antikor- ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir ve açik daireleri olan hat, 3 mg/kg'de antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir. Antikor-ilaç konjugati (2), doza bagimli bir sekilde tümörün daraltilmasi için etkilidir.
(Test Örnegi 13) Antitümör test, (3) inden küçük hücreli olamayan akciger kanser hatti CaIu-6 hücreleri, ATCC'den (American Type Culture Collection) alinmistir. Fizyolojik salin içinde süspanse edilen 5 x 106 hücreleri, her bir disi çiplak farenin sag abdomenine subkütanöz olarak transplante edilmistir (Gün 0) ve fareler, Gün 11'de rastgele gruplandirilmistir. M30-H1- L4P antikoru ve antikor-ilaç konjugati (2) bir qw X 3 programinda Gün 11. 18 ve 25'te her bir farenin kuyruguna 10 mg/kg'lik bir dozda intravenöz olarak uygulanmistir.
Sonuçlar Sekil 19'da gösterilir. Sekilde açik es alti yüzlü hat, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, açik üçgenleri olan hat M30-H1-L4P antikorunun etkisini gösterir ve açik daireleri olan hat, antikor-ilaç konjugatinin (2) etkisini gösterir. Antikor-ilaç konjugatinin (2) uygulanmasi, tümör hacmini önemli biçimde azaltmistir ve nihai uygulamadan sonra herhangi bir tümör büyümesi gözlenmemistir. Bunun aksine M30- H1-L4P antikorunun uygulanmasi, tümör büyümesinin ilerlemesi ile sonuçlanmistir.
Ek olarak antikor-ilaç konjugatini (2) alan fareler, antikor-ilaç konjugatinin (2) düsük sekilde toksik ve yüksek derecede güvenli oldugu belirtilerek, kilo kaybi gibi fark edilebilir belirtileri içermez.
(Test örnegi 14) Antitümör testi (4) Insan melanom hatti A alinmistir. Fizyolojik salin içinde süspanse edilen 8 X 106 hücre, her bir disi çiplak farenin sag abdomenine subkütanöz olarak transplante edilmistir (Gün 0) ve fareler Gün 11'de rastgele gruplandirilmistir. Antikor-ilaç konjugatlari (1), (13), (41) ve (55), Gün 21'de her bir farenin kuyruguna 10 mg/kg'lik bir dozda intravenöz olarak uygulanmistir.
Sonuçlar Sekil 20'de gösterilir. Sekilde açik es alti yüzlü hat tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, açik daireleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (1) etkisini gösterir, açik üçgenleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (13) etkisini gösterir, X isareti olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (41) etkisini gösterir ve açik kareleri olan hat, uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (55) etkisini gösterir. Antikor- ilaç konjugatinin (1), (13), (41) ve ya (55) uygulanmasi tümör hacmini önemli biçimde azaltmistir ve bu antikor-ilaç konjugatlarinin tümü, bir tümör büyümesini inhibe edici etki sergilemistir.
Ek olarak antikor-ilaç konjugatini (1), (13), (41) ve ya (55) alan fareler, antikor-ilaç konjugatlarinin (1), (13), (41) ve (55) düsük sekilde toksik ve yüksek derecede güvenli oldugu belirtilerek, kilo kaybi gibi fark edilebilir belirtileri içermez.
(Test Örnegi 1 5) Antitümör testi (5) Insan küçük hücreli olamayan akciger kanser hatti CaIu-6 hücreleri, ATCC'den (American Type Culture Collection) alinmistir. Fizyolojik salin içinde süspanse edilen 5 X 106 hücre, her bir disi çiplak farenin sag abdomenine subkütanöz olarak transplante edilmistir (Gün 0) ve fareler, Gün 12”de rastgele sekilde gruplandirilmistir. Antikor-ilaç dozda intravenöz olarak uygulanmistir. Karsilastirmali bir kontrol olarak DE-310, Gün 12'de her bir farenin kuyruguna 0.1 mg/kg'lik bir dozda intravenöz olarak uygulanmistir.
Burada antikor-ilaç konjugatinin yukarida açiklanan dozu, antikorun konjugattaki miktarina dayanir ve DE-310'nun yukarida açiklanan dozu, burada bulunan ilaç miktarina dayanir. Bu baglamda sirasiyla antikor-ilaç konjugati ve DE-31O içinde bulunan ilaçlarin miktari yaklasik 1 : 100 olmustur. Bu, antikor-ilaç konjugati ve DE- 310'na ait dozlarin burada bulunan ilaçlarin miktarlari bakimindan esittir.
Sonuçlar Sekil 21'de gösterilir. Sekilde açik es alti yüzlü hat tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, açik daireleri olan hat DE-310 etkisini gösterir, açik üçgenleri olan hat antikor-ilaç konjugatinin (13) etkisini gösterir, X isaretleri olan hat antikor-ilaç konjugatinin (41) etkisini gösterir ve açik daireleri olan hat, antikor-ilaç konjugatinin (55) etkisini gösterir. Antikor-ilaç konjugatinin (13), (41) veya (55) uygulanmasi, tümör hacmini önemli biçimde azaltirken DE-310 uygulanmasi, tümör hacminde herhangi bir azalma göstermemistir.
Ek olarak antikor-ilaç konjugatini (13), (41) ve ya (55) alan fareler, bu antikor-ilaç konjugatlarinin düsük sekilde toksik ve yüksek derecede güvenli oldugu belirtilerek, kilo kaybi gibi fark edilebilir belirtileri içermez.
(Test Örnegi 16) Antitümör testi (6) Insan melanom hatti A alinmistir. Fizyolojik salin içinde süspanse edilen 1 x 1O7hücre, her bir disi çiplak farenin sag abdomenine subkütanöz olarak transplante edilmistir (Gün 0) ve fareler, Gün 11'de rastgele sekilde gruplandirilmistir. Antikor-ilaç` konjugatlari (17), (18), (19), mg/kg'lik bir dozda intravenöz olarak uygulanmistir.
Sonuçlar, Sekil 22'de gösterilir. Sekilde dolu es alti yüzlü hat, tedavi edilmemis tümör ile ilgili sonuçlari gösterir, dolu daireleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (17) etkisini gösterir, açik üçgenleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (18) etkisini gösterir, açik daireleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (19) etkisini gösterir, dolu üçgenleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (59) etkisini gösterir, açik kareleri olan hat uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (60) etkisini gösterir ve X isaretleri olan hat, uygulanan antikor-ilaç konjugatinin (61) etkisini gösterir. hacmini önemli biçimce azaltmistir ve bu antikor-ilaç konjugatlarinin tümü bir tümör büyümesini inhibe edici etki sergilemistir.

Claims (1)

  1. ISTEMLER Bir antikor-ilaç konjugati olup, özelligi asagidaki formül ile temsil edilen antitümör bilesik: asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayici ile antikora konjuge edilmesidir: burada antikor, L1'in terminaline baglanir, antitümör bilesik, baglanti pozisyonu olarak 1. pozisyonda amino grubunun nitrojen atomu ile Lc'nin terminaline baglanir, nl, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, L1, -(Süksinimid-3-iI-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CHz-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiksuS)- ve ya -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-*yu temsil eder, n?, 2 ila 8 arasindaki bir tamsayiyi temsil eder, n3, 1 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, n4, 1 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, -S-(CH2)n6-C(=O)- veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, ne, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan tetrapeptit kalintisini temsil eder, La, -0- veya tekli bir bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bir bagi temsil eder, burada her R2 ve R3 bagimsiz olarak, bir hidrojen atomunu temsil eder, LC, -C(=O)-'yu temsil eder, -(Süksinimid-3-iI-N)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda antikora baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayici yapisindaki metilen grubuna baglanir, -(N-Ii-3-diminiksuS)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda L2'ye baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayici yapisindaki metilen grubuna baglanir, sik.Hekz(1,4), 1,4-siklohekzilen grubunu temsil eder ve L2, -S-(CH2)n6-C(=O)- oldugunda L1, -C(=O)-sik.Hekz(1,4)-CH2-(N-Ii-3-diminiksuS)-'dir. . istem 1'e göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi baglayici yapisinin, asagidaki gruptan seçilen bir yapi olmasidir: -(SÜ kSI nImId-3-II-N )-CH2CH2-C(=O)-GG FG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(SÜkSInimid-3-iI-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- -(SüksinImId-3-iI-N)-CH2CH2CH20H2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Süksinimid-3-II-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-N H- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Sü kSI nimid-3-Il-N )-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-G G FG-N H- CHzCHzCHzCHzCHz-C(=O)-(NH-DX) -(SÜ kSI nimid-3-iI-N )-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-G G FG-N H-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Sü kSI nimid-3-il-N )-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-G G FG-N H-CH2CH2-O- CHz-C(=O)-(N H-DX) -(SÜ kSI nimid-3-il-N )-CH2CH2-C(=O)-N H-CHzCHzO-C H2CH20-CH2C HzO- -C(=O)-Sik.HekZ( GGFG- 15 NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) burada -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir grubu temsil burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -GGFG-, -GIy-GIy-Phe-Gly- olan peptit kalintisini temsil eder. 25 3. istem 1,e göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi asagidaki formül ile temsil edilen antitümör bilesigin: asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahip baglayici ile antikora konjuge edilmesidir: burada antikor, Ll'in terminaline baglanir, antitümör bilesik, baglanti pozisyonu olarak 1. pozisyonda amino grubunun nitrojen atomu ile Lc'nin terminaline baglanir, nl, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, L1, -(Süksinimid-3-iI-N)-(CH2)n2-C(=O)-'yu temsil eder, burada n2, 2 ila 5 olan bir tamsayiyi temsil eder, L2, -NH- (CHz-CHz-O) n5-CH2-CH2-C(=O)- veya tekli bir bagi temsil eder, burada n5, 2 veya 4 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan tetrapeptit kalintisini temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3, bir hidrojen atomunu temsil eder, L“, -C(=O)-“yu temsil eder ve -(Süksinimid-3-iI-N)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. Pozisyonunda antikora baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayicidaki metilen grubuna baglanir. 4. istem 3'e göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi -NH-(CH2)n1-La-L'°-L°- yapisinin, asagidakiler olmasidir: -NH-CHz-O-CHz-C(=O)- veya 5. istem 4'e göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi -NH-(CH2)n1-La-Lb-L°- yapisinin, -NH-CHz-O-CHz-C(=O)- olmasidir. 6. Istemler 3 ila 5'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi baglayici yapisinin, asagidaki gruptan seçilen bir yapi olmasidir: -(SÜkSInImId-3-II-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz- C(=O)-(NH-DX) CHz-C(=O)-(NH-DX) -(Süksinimid-3-iI-N)-CHzCH2-C(=O)-NH-CH20H20-CHzCHzO-CHzCHz- burada -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir grubu temsil burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur. 7. istem 6'ya göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi baglayici yapisinin asagidaki sekilde olmasidir: -(Süksinimid-3-il-N)-CHzCH2CH20H20H2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX). Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi her antikor için konjuge edilen seçilmis bir ilaç-baglayici yapisina ait birimlerin ortalama sayisinin, 2 ila 8 araliginda olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi her antikor için konjuge edilen seçilmis bir ilaç-baglayici yapisina ait birimlerin ortalama sayisinin, 3 ila 8 araliginda olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi antikor-ilaç konjugati tarafindan hedeflenen bir hücrenin, tümör hücresi olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi antikorun, anti-A33 antikoru, anti-B7-H3 antikoru, anti-CanAg antikoru, anti- CD20 antikoru, anti-CD22 antikoru, anti-CD30 antikoru, anti-CD33 antikoru, anti-0056 antikoru, anti-CD70 antikoru, anti-CEA antikoru, anti-Cripto antikoru, anti-EphA2 antikoru, anti-G250 antikoru, anti-MUCl antikoru, anti-GPNMB antikoru, anti-integrin antikoru, anti-PSMA antikoru, anti-tenaskin-C antikoru, anti-SLC44A4 antikoru veya anti-mezotelin antikoru olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi antikorun, anti-BY-HS antikoru, anti-CD30 antikoru, anti-CD33 antikoru veya anti-CD70 antikoru olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugati olup, özelligi antikorun, anti-B7-H3 antikoru olmasidir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugatini veya tuzunu içeren bir ilaçtir. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugatini veya tuzunu içeren antitümör ilaç ve/veya antikanser ilaçtir. 16.Akciger kanseri, böbrek kanseri, üroteliyal kanser, kolorektal kanser, prostat kanseri, glioblastom multiforme, yumurtalik kanseri. pankreas kanseri, gögüs kanseri, melanom, karaciger kanseri. mesane kanseri, mide kanseri veya özofagus kanserine karsi kullanima yönelik istemler 1 ila 4'ten herhangi birinde tanimlanan antitümör ilaç ve/veya antikanser ilaçtir. 17.Aktif bilesen olarak istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre antikor-ilaç konjugatini veya tuzunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyon bilesenini içeren farmasötik bir bilesimdir. 18.Asagidaki formül ile temsil edilen bir ilaç-baglayici ara bilesigi olup: Q-(CH2)nQ-C(=O)-L28-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) özelligi Q, (maleimid-N-iI)-'i temsil etmesidir, no, 2 ila 8 olan birtamsayiyi temsil eder, Lza, -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan bir tetrapeptit kalintisini temsil eder, n1, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3 bagimsiz olarak, bir hidrojen atomunu temsil eder, L°, -C(=O)-'yu temsil eder, (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu. baglanti pozisyonudur. Istem 18'e göre ilaç-baglayici ara bilesigi olup, özelligi n5, 2 veya 4 olan bir tamsayi olmasidir, -NH-(CH2)n1-La-Lb-, -NH-CH2-O-CH2- veya -NH-CH2CH2-O-CH2-'dir. 20.Asagidakilerin bir bilesigi olup: (maleimid-N-iI)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CHzO-CH2CH20-CHzCH2-C(=O)-GGFG- NH-CH20H20H2-C(=O)-(NH-DX), (maleimId-N-II)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) veya (maleimid-N-il)-CHzCHzCHzCHzCHz-C(=O)-GGFG-NH-CHzCHz-O-CHz-C(=O)- özelligi (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir grup olmasidir: burada nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu. baglanti pozisyonudur. Istem 20'ye göre bilesik 0Iup,özelligi asagidakileri içermesidir: (maleimid-N-iI)-CHzCHzCHzCH-(NH- Bir ilacin, baglayici ile bir antikora konjuge edildigi bir antikor-ilaç konjugatinin elde edilmesine yönelik olarak asagidaki formül ile temsil edilen bir baglayici özelligi L1, antikora yönelik baglanti pozisyonu olmasidir, LC, antitümör bilesige nl, 0 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, L1, -(Süksinimid-3-iI-N)-(CH2)n2'C(=O)- burada n2, 2 ila 8 olan bir tamsayiyi temsil eder, L2, -NH-(CHg-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- veya tekli bagi temsil eder, burada n5, 1 ila 6 olan bir tamsayiyi temsil eder, LP, GGFG olan tetrapeptit kalintisini temsil eder, La, -0- veya tekli bagi temsil eder, Lb, -CR2(-R3)- veya tekli bagi temsil eder, burada her R2 ve R3 bagimsiz olarak, bir hidrojen atomunu temsil eder, LC, -C(=O)-'yu temsil eder, -(Süksinimid-3-iI-N)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir yapiya sahiptir: bu yapi, 3. pozisyonunda antikora baglanir ve 1. pozisyonda nitrojen atomu üzerinde bu yapiyi içeren baglayici yapisindaki metilen grubuna baglanir. 23. Sol terminalin, antikor ile baglanti pozisyonu olmasi ve sag terminalin, antitümör bilesik ile baglanti pozisyonu olmasi kosuluyla asagidaki gruptan seçilen istem 22'ye göre baglayicidir: -(Sü kSI nImId-3-iI-N )-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-G G FG-N H-CH2-O-CH2- -(SÜ ksi nimId-3-II-N )-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-G G FG-N H-CH2CH2-O- 24. Sol terminalin, antikor ile baglanti pozisyonu olmasi ve sag terminalin, antitümör bilesik ile baglanti pozisyonu olmasi kosuluyla asagidaki yapi olan istem 23'e göre baglayicidir: -(Süksinimid-3-iI-N)-CH2CHzCHzCHzCH2-C(=O)-GGFG-NH-CHz-O-CHz- 25. Bir antikor-ilaç konjugatinin hazirlanmasina yönelik bir yöntem olup, özelligi antikorun, indirgeyici bir kosulda islenmesi ve akabinde asagida gösterilen bilesik grubundan seçilen bir bilesik ile reakte edilmesidir: (maleImId-N-II)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH20-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)- (maleimid-N-iI)-CH- (N H-DX) veya (maleimId-N-II)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), yukarida (maleimid-N-iI)-, asagidaki formül ile temsil edilen bir gruptur: burada nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur ve -(NH-DX), asagidaki formül burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu, baglanti pozisyonudur. 26. Istem 25'e göre yöntem olup, özelligi antikorun, indirgeyici kosulda islenmesi ve akabinde asagida gösterilen bilesik ile reakte edilmesidir: (maleimid-N-iI)-CH- 27.Asagidakilerden olusan bir gruptan seçilen bir bilesik olup: NH2-CH20H2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) veya HO-CHz-C(=O)-(NH-DX), özelligi -(NH-DX), asagidaki formül ile temsil edilen bir grup olmasidir: burada 1. pozisyondaki amino grubunun nitrojen atomu. baglanti pozisyonudur. 28. HO-CHz-C(=O)-(NH-DX) olan istem 27'ye göre bilesiktir.
TR2018/09636T 2012-10-11 2013-10-10 Antikor-ilaç konjugatı. TR201809636T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012225887 2012-10-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809636T4 true TR201809636T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=50477169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09636T TR201809636T4 (tr) 2012-10-11 2013-10-10 Antikor-ilaç konjugatı.

Country Status (30)

Country Link
US (5) US10195288B2 (tr)
EP (3) EP3342785B1 (tr)
JP (8) JP5953378B2 (tr)
KR (13) KR102584005B1 (tr)
CN (4) CN115960111A (tr)
AU (4) AU2013328111B2 (tr)
BR (3) BR122021014396B1 (tr)
CA (2) CA2885800C (tr)
CY (2) CY1120363T1 (tr)
DK (2) DK3342785T3 (tr)
ES (2) ES2671644T3 (tr)
HK (2) HK1210477A1 (tr)
HR (2) HRP20180870T1 (tr)
HU (2) HUE039000T2 (tr)
IL (4) IL294622B2 (tr)
LT (2) LT2907824T (tr)
MX (3) MX364484B (tr)
MY (1) MY170251A (tr)
NZ (4) NZ705394A (tr)
PH (2) PH12015500667A1 (tr)
PL (2) PL3342785T3 (tr)
PT (2) PT2907824T (tr)
RS (2) RS60000B1 (tr)
RU (1) RU2664465C2 (tr)
SG (2) SG11201502887WA (tr)
SI (2) SI2907824T1 (tr)
TR (1) TR201809636T4 (tr)
TW (5) TWI696611B (tr)
WO (1) WO2014057687A1 (tr)
ZA (2) ZA201501825B (tr)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102584005B1 (ko) 2012-10-11 2023-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 글리신아미드 화합물의 제조 방법
JP6272230B2 (ja) * 2012-10-19 2018-01-31 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体−薬物コンジュゲート
RU2743077C2 (ru) * 2013-12-25 2021-02-15 Дайити Санкио Компани, Лимитед Конъюгат анти-trop2 антитело-лекарственное средство
CN105829346B (zh) * 2014-01-31 2019-08-23 第一三共株式会社 抗her2抗体－药物偶联物
JP2017114763A (ja) * 2014-03-26 2017-06-29 第一三共株式会社 抗ｃｄ９８抗体−薬物コンジュゲート
ES2859648T3 (es) * 2014-04-10 2021-10-04 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticuerpo-fármaco anti-HER3
WO2015155976A1 (ja) * 2014-04-10 2015-10-15 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲート
ES2938186T3 (es) 2015-06-29 2023-04-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco
KR20180095828A (ko) * 2015-12-24 2018-08-28 에이지씨 가부시키가이샤 수지 조성물, 기재 및 세포 배양 방법
KR102514317B1 (ko) 2016-04-15 2023-03-27 마크로제닉스, 인크. 신규 b7-h3-결합 분자, 그것의 항체 약물 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법
JP2019526529A (ja) * 2016-06-08 2019-09-19 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ３抗体及び抗体薬物コンジュゲート
DK3458479T3 (da) * 2016-06-08 2021-02-08 Abbvie Inc Anti-b7-h3-antistoffer og antistof-lægemiddelkonjugater
TW201825524A (zh) * 2016-09-20 2018-07-16 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 新型抗-pcsk9抗體
CA3046293A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
EP3572428A4 (en) 2017-01-17 2020-12-30 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-GPR20 ANTIBODY AND ANTI-GPR20 ANTIBODY MEDICINAL CONJUGATE
TW201834696A (zh) 2017-02-28 2018-10-01 學校法人近畿大學 藉由投予抗her3抗體－藥物複合體之egfr－tki抗性之非小細胞肺癌的治療方法
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
TW201909926A (zh) * 2017-08-04 2019-03-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Ｂ７ｈ３抗體－藥物偶聯物及其醫藥用途
CN109106951A (zh) * 2017-08-18 2019-01-01 四川百利药业有限责任公司 一种喜树碱-抗体偶联物
EP3673918A4 (en) 2017-08-23 2021-05-19 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PREPARATION AND ASSOCIATED LYOPHILIZATION
WO2019044947A1 (ja) * 2017-08-31 2019-03-07 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの改良製造方法
CN117838881A (zh) 2017-08-31 2024-04-09 第一三共株式会社 制备抗体-药物缀合物的新方法
TWI820044B (zh) 2017-09-29 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
CN111542324B (zh) * 2018-02-11 2023-09-12 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 细胞毒性剂及其偶联物、其制备方法及用途
EP4257611A3 (en) 2018-05-18 2024-03-06 Glycotope GmbH Anti-muc1 antibody
US20210251994A1 (en) 2018-06-15 2021-08-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
AU2019311557A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
EP3831853A4 (en) 2018-07-27 2022-06-01 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PROTEIN-RECOGNIZING DRUG UNIT
BR112021001509A2 (pt) 2018-07-31 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited agente terapêutico para um tumor de cérebro metastásico
CN112512587A (zh) * 2018-08-06 2021-03-16 第一三共株式会社 抗体药物缀合物和微管蛋白抑制剂的组合
EP3842546A4 (en) 2018-08-23 2022-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
JP7254818B2 (ja) 2018-09-06 2023-04-10 第一三共株式会社 新規環状ジヌクレオチド誘導体及びその抗体薬物コンジュゲート
KR20210062005A (ko) 2018-09-20 2021-05-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her3 항체-약물 콘쥬게이트 투여에 의한 her3 변이암의 치료
CN112512591A (zh) * 2018-09-26 2021-03-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 依喜替康类似物的配体-药物偶联物及其制备方法和应用
JP7408646B2 (ja) * 2018-09-30 2024-01-05 ジエンス ハンソー ファーマスーティカル グループ カンパニー リミテッド 抗－ｂ７ｈ３抗体－エキサテカンアナログコンジュゲート及びその医薬用途
SG11202104993SA (en) 2018-11-14 2021-06-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cdh6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
KR20210102341A (ko) 2018-12-11 2021-08-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
US20220040324A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
CA3134055A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Claudin-6 antibodies and drug conjugates
WO2020191344A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Claudin-6 bispecific antibodies
PT3946464T (pt) 2019-03-29 2022-11-16 Medimmune Ltd Compostos e seus conjugados
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
CN111689980A (zh) * 2019-05-26 2020-09-22 四川百利药业有限责任公司 一种喜树碱药物及其抗体偶联物
CA3144790A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugate, intermediate thereof, preparation method therefor and application thereof
CN112138171A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 上海复旦张江生物医药股份有限公司 抗体偶联药物、其中间体、制备方法及应用
KR20220052918A (ko) 2019-07-10 2022-04-28 싸이브렉사 2, 인크. 치료제로서의 사이토톡신의 펩티드 접합체
JP2022541747A (ja) 2019-07-10 2022-09-27 サイブレクサ ３，インコーポレイテッド 治療薬としての微小管標的化剤のペプチドコンジュゲート
WO2021052402A1 (zh) * 2019-09-18 2021-03-25 四川百利药业有限责任公司 一种喜树碱衍生物及其偶联物
WO2021115426A1 (zh) * 2019-12-12 2021-06-17 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗密蛋白抗体药物偶联物及其医药用途
WO2021121204A1 (zh) * 2019-12-16 2021-06-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cea抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
TW202140078A (zh) 2020-01-22 2021-11-01 大陸商上海森輝醫藥有限公司 艾日布林衍生物的藥物偶聯物、其製備方法及其在醫藥上的應用
EP4095148A4 (en) 2020-01-22 2023-07-26 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ANTI-TROP-2 ANTIBODY EXATECAN ANALOGUE CONJUGATE AND MEDICAL USE THEREOF
EP4115909A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate including novel cyclic dinucleotide derivative
WO2021190480A1 (zh) * 2020-03-24 2021-09-30 上海翰森生物医药科技有限公司 抗体-药物偶联物及其医药用途
TW202144016A (zh) * 2020-03-25 2021-12-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗ｐｓｍａ抗體－依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途
MX2022011769A (es) * 2020-03-25 2022-10-18 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Metodo de preparacion de medicamento de conjugado de anticuerpo.
JP2023518583A (ja) 2020-03-25 2023-05-02 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗体薬物複合体を含む医薬組成物及びその使用 本願は、２０２０年３月２５日に提出された中国特許出願（出願番号ｃｎ ２０２０１０２１９６０１．７）及び２０２１年３月１７日に提出された中国特許出願（出願番号ｃｎ ２０２１１０２８７０１２．７）の優先権を主張する。
EP4130036A4 (en) 2020-03-30 2024-05-15 National Cancer Center ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
CA3186295A1 (en) * 2020-06-08 2021-12-16 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. Camptothecin drug having high-stability hydrophilic connecting unit and conjugate thereof
KR20230043109A (ko) 2020-06-24 2023-03-30 아스트라제네카 유케이 리미티드 항체-약물 접합체 및 atr 억제제의 조합
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
WO2021260578A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
JP2023539715A (ja) 2020-06-24 2023-09-19 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲートとａｔｍ阻害剤との組合わせ
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
US10997243B1 (en) 2020-06-30 2021-05-04 Snowflake Inc. Supporting unstructured, semi-structured, and structured files
US11423081B1 (en) 2020-06-30 2022-08-23 Snowflake Inc. Accessing files in a database stage using a user defined function
US11361026B2 (en) 2020-06-30 2022-06-14 Snowflake Inc. Accessing files in a database stage using a user defined function
EP4175672A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Byondis B.V. Antifolate linker-drugs and antibody-drug conjugates
EP4178559A1 (en) * 2020-07-10 2023-05-17 Velosbio Inc. Novel ror1 antibody immunoconjugates
JP2023534437A (ja) 2020-07-13 2023-08-09 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インク． タンパク質中のグルタミン残基にコンジュゲートされたカンプトテシンアナログおよびその使用
KR20230041023A (ko) 2020-07-17 2023-03-23 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법
KR20230051214A (ko) 2020-08-13 2023-04-17 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사 항체 약물 접합체
KR20230050378A (ko) 2020-08-13 2023-04-14 이나뜨 파르마 에스.에이. 항-cd73 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법
EP4209506A1 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel endo-?-n-acetylglucosaminidase
CN116239601B (zh) 2020-09-30 2023-10-13 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种抗肿瘤化合物及其制备方法和应用
US20230372527A1 (en) 2020-10-09 2023-11-23 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
AU2021359457A1 (en) * 2020-10-12 2023-05-11 Baili-Bio (Chengdu) Pharmaceutical Co., Ltd. Camptothecin derivative and its ligand-drug conjugate
WO2022102634A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと抗ＳＩＲＰα抗体の組み合わせ
WO2022099762A1 (zh) * 2020-11-12 2022-05-19 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 一种抗体偶联物中间体及其制备方法
EP4245322A1 (en) 2020-11-12 2023-09-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment for mesothelioma through administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
CA3202303A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Qingsong GUO Trop2 targeting antibody-drug conjugate, and preparation method and use therefor
JP2023550533A (ja) * 2020-12-18 2023-12-01 シャンハイ フダン－チャンジャン バイオ－ファーマシューティカル カンパニー リミテッド Ｂ７－ｈ３を標的とする抗体薬物複合体、その製造方法と使用
US20240066138A1 (en) * 2020-12-23 2024-02-29 Shanghai Ruotuo Biosciences Co., Ltd. Antibody-drug conjugates, pharmaceutical compositions, and therapeutic applications
MX2023008285A (es) 2021-01-13 2023-09-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Conjugado de anticuerpo anti-dll3-farmaco.
CN114805377A (zh) * 2021-01-29 2022-07-29 明慧医药（杭州）有限公司 适用于抗体-药物偶联物的毒素分子
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
JP2024508081A (ja) 2021-02-09 2024-02-22 メディリンク セラピューティクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド 生物活性物質コンジュゲート、その調製方法及びその使用
JPWO2022191313A1 (tr) 2021-03-12 2022-09-15
TW202300148A (zh) * 2021-03-17 2023-01-01 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 喜樹鹼衍生物的製備方法
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
CA3215049A1 (en) 2021-04-10 2022-10-13 Baiteng ZHAO Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
EP4323009A1 (en) * 2021-04-14 2024-02-21 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Linkers, conjugates and applications thereof
EP4079327A1 (en) 2021-04-22 2022-10-26 Centaurus Polytherapeutics Payloads for drug-conjugates and their use for treating cancer
TW202308699A (zh) 2021-04-23 2023-03-01 美商普方生物製藥美國公司 Ｃｄ７０結合劑、其結合物及其使用方法
AU2022266934A1 (en) * 2021-04-26 2023-10-26 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-nectin-4 antibody and anti-nectin-4 antibody-drug conjugate, and medicinal user thereof
CN113816969B (zh) * 2021-04-30 2024-01-16 联宁（苏州）生物制药有限公司 依喜替康类化合物、其抗体药物偶联物及其应用
US11645243B2 (en) 2021-06-07 2023-05-09 Snowflake Inc. Accessing files in a database stage using a user defined function
TW202313125A (zh) * 2021-06-17 2023-04-01 大陸商明慧醫藥(杭州)有限公司 一種抗腫瘤化合物及其應用
BR112023026735A2 (pt) 2021-06-28 2024-03-12 Byondis Bv Conjugado, composto de conector-fármaco, uso de um composto de conector-fármaco, e, composição farmacêutica
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CN113402584A (zh) * 2021-07-06 2021-09-17 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种抗体偶联药物连接子的中间体lnd1067-l1的合成方法
TW202320857A (zh) 2021-07-06 2023-06-01 美商普方生物製藥美國公司 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
CN113527418B (zh) * 2021-07-16 2022-05-03 成都普康唯新生物科技有限公司 一种ADC linker的制备方法
US20230123041A1 (en) * 2021-07-19 2023-04-20 Recurium Ip Holdings, Llc Immunoconjugates and methods
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
AU2022314086A1 (en) 2021-07-21 2024-02-22 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing anti-trop2 antibody drug conjugate and use thereof
WO2023042097A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
WO2023054706A1 (ja) 2021-09-30 2023-04-06 味の素株式会社 抗体および機能性物質のコンジュゲートまたはその塩、ならびにその製造に用いられる抗体誘導体および化合物またはそれらの塩
AU2022386505A1 (en) 2021-11-15 2024-05-23 Systimmune, Inc. Bispecific antibody-camptothecin drug conjugate and pharmaceutical use thereof
US11814394B2 (en) 2021-11-16 2023-11-14 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Exatecan derivatives, linker-payloads, and conjugates and thereof
CA3238116A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Matthew Simon SUNG Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
CA3238167A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Maria Leia Smith Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
CN116333135A (zh) * 2021-12-24 2023-06-27 百奥泰生物制药股份有限公司 抗FRα抗体及其抗体药物偶联物和用途
TW202333800A (zh) 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
TW202339805A (zh) 2021-12-28 2023-10-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atr抑制劑之組合
WO2023126297A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Byondis B.V. Antifolate linker-drugs and antibody-drug conjugates
WO2023138635A1 (zh) * 2022-01-18 2023-07-27 甘李药业股份有限公司 一种依喜替康衍生物-抗体偶联物及其医药用途
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
TW202400140A (zh) 2022-04-27 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與ezh1及/或ezh2抑制劑之組合
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
WO2023237050A1 (en) * 2022-06-09 2023-12-14 Beigene, Ltd. Antibody drug conjugates
CN116789733A (zh) * 2022-07-05 2023-09-22 上海药明合联生物技术有限公司 偶联连接子
CN115160403A (zh) * 2022-07-05 2022-10-11 上海彩迩文生化科技有限公司 特异性拓扑异构酶抑制剂和可用于抗体药物偶联物及其制备方法
WO2024012566A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Antibody, linkers, payload, conjugates and applications thereof
WO2024020536A1 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Nj Bio, Inc. Hexacyclic topoisomerase inhibitors having cytotoxic activity on cancer cells
WO2024022372A1 (zh) * 2022-07-27 2024-02-01 明慧医药（杭州）有限公司 抗体药物偶联物及其应用
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
CN117510515A (zh) * 2022-07-28 2024-02-06 明慧医药（杭州）有限公司 适用于抗体-药物偶联物的毒素分子
US20240116945A1 (en) 2022-09-02 2024-04-11 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived topoisomerase-1 inhibitors pharmaceutical compositions, and uses thereof
WO2024073436A2 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Solve Therapeutics, Inc. Compositions and uses thereof
WO2024067811A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Beigene, Ltd. Ligand-drug conjugate of exatecan analogue, and medical use thereof
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024091437A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived adc linker-payloads, pharmaceutical compositions, and uses thereof
WO2024110905A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Beigene, Ltd. Anti-cea antibody drug conjugates and methods of use
WO2024109949A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗肿瘤化合物及其应用
WO2024114318A1 (zh) * 2022-11-29 2024-06-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 药物连接子化合物及其制备方法和用途
WO2024116094A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugates and dnmt inhibitors
CN116621927B (zh) * 2023-01-09 2024-03-26 联宁（苏州）生物制药有限公司 带有伊喜替康和C-lock定点偶联基团的抗体偶联中间体、偶联方法及抗体偶联药物

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP3008226B2 (ja) 1991-01-16 2000-02-14 第一製薬株式会社 六環性化合物
US5637770A (en) 1991-01-16 1997-06-10 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Hexa-cyclic compound
JPH0559061U (ja) 1991-04-18 1993-08-03 株式会社ケイヴイシー ボールバルブ
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JP3359955B2 (ja) 1992-07-16 2002-12-24 第一製薬株式会社 抗腫瘍剤
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
JPH0687746U (ja) 1993-06-02 1994-12-22 株式会社ユニシアジェックス 液圧緩衝器のリザーバチューブ構造
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
US6504029B1 (en) 1995-04-10 2003-01-07 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Condensed-hexacyclic compounds and a process therefor
SG50747A1 (en) 1995-08-02 1998-07-20 Tanabe Seiyaku Co Comptothecin derivatives
JPH1095802A (ja) * 1995-12-28 1998-04-14 Tanabe Seiyaku Co Ltd カンプトテシン誘導体
CA2192725C (en) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Camptothecin derivatives
TW527183B (en) 1996-06-06 2003-04-11 Daiichi Seiyaku Co Drug complex
TW409058B (en) 1996-06-06 2000-10-21 Daiichi Seiyaku Co Method for preparation of a drug complex
JPH1171280A (ja) 1997-06-26 1999-03-16 Tanabe Seiyaku Co Ltd 医薬組成物
JPH1192405A (ja) * 1997-09-19 1999-04-06 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 薬物複合体
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
EA003398B1 (ru) * 1998-05-22 2003-04-24 Дайити Фармасьютикал Ко., Лтд. Лекарственный комплекс c полимерным носителем
WO2000025825A1 (fr) 1998-10-30 2000-05-11 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Composes dds et procede de dosage de ces composes
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
JP2002060351A (ja) 2000-03-22 2002-02-26 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 水酸基を有する薬物を含むｄｄｓ化合物
AU2001267831A1 (en) 2000-06-29 2002-01-08 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. DDS compound and process for the preparation thereof
AU2001271037A1 (en) 2000-07-13 2002-01-30 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions containing dds compounds
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US7090843B1 (en) 2000-11-28 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
TWI313609B (en) * 2001-08-21 2009-08-21 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Pharmaceutical composition for inhibiting the metastasis or preventing the recurrence of malignant tumor
HU230378B1 (hu) 2001-11-01 2016-03-29 Uab Research Foundation Anti-DR5 ellenanyagok és anti-DR4 ellenanyagok és más terápiás ágensek kombinációi
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
EP1572242B1 (en) 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
KR20060125909A (ko) 2004-02-26 2006-12-06 이노텍 파마슈티컬스 코포레이션 이소퀴놀린 유도체 및 이의 사용 방법
WO2005084390A2 (en) 2004-03-02 2005-09-15 Seattle Genetics, Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
US7517903B2 (en) * 2004-05-19 2009-04-14 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates
KR101200133B1 (ko) 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
EP1817341A2 (en) * 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
DE102005009084A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Anthrazyklin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
DE102005009099A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
AU2006236225C1 (en) 2005-04-19 2013-05-02 Seagen Inc. Humanized anti-CD70 binding agents and uses thereof
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
BRPI0711249A2 (pt) 2006-05-30 2012-03-13 Genentech, Inc. Anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeira, métodos para fabricar um anticorpo, para detectar a presença de cd2 em uma amostra biológica, para tratar uma disfunção proliferativa de células b, para inibir proliferaçõa de células b, para tratar câncer, para fabricar um composto conjugado anti-corpo-droga. imunoconjugados,composições farmacêuticas, formulações farmacêuticas, conjugado anticorpo-droga, compostos conjugados anti-corpo-droga, teste para detectar células b e artigo de fabricação
UA95958C2 (en) * 2006-05-30 2011-09-26 Дженентек, Инк. Antibody that binds to cd22, immunoconjugates and uses therefor
ITMI20061473A1 (it) * 2006-07-26 2008-01-27 Indena Spa Derivati della camptotecina ad attivita antitumorale
US20100068181A1 (en) 2006-12-21 2010-03-18 Schering Corporation Pyrrolo [3, 2-a] pyridine derivatives for inhibiting ksp kinesin activity
CN101687021B (zh) * 2007-03-22 2013-04-17 斯隆-凯特琳癌症研究院 单克隆抗体8h9的应用
SI2281006T1 (sl) 2008-04-30 2017-12-29 Immunogen, Inc. Premreževalci in njihova uporaba
CN102448494B (zh) 2009-02-13 2016-02-03 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物
JP5829520B2 (ja) 2009-08-20 2015-12-09 国立大学法人 千葉大学 コルヒチン誘導体
WO2011038159A2 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
EP2569000B1 (en) 2010-05-13 2017-09-27 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
AU2011255647A1 (en) 2010-05-18 2012-11-15 Cerulean Pharma Inc. Compositions and methods for treatment of autoimmune and other diseases
RU2012157167A (ru) 2010-07-12 2014-08-20 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Полифункциональные антительные конъюгаты
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
MX2014007121A (es) 2011-12-14 2014-09-04 Seattle Genetics Inc Nuevos conjugados de principio activo-ligante (adc) y su uso.
US20130280282A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
CN104619350A (zh) 2012-06-14 2015-05-13 Ambrx公司 结合到核受体配体多肽的抗psma抗体
US9517522B2 (en) * 2012-09-05 2016-12-13 Illinois Tool Works Inc. Self-aligning wire feeder assembly
KR102584005B1 (ko) * 2012-10-11 2023-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 글리신아미드 화합물의 제조 방법
JP6272230B2 (ja) 2012-10-19 2018-01-31 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体−薬物コンジュゲート
JP6262768B2 (ja) 2013-01-03 2018-01-17 セルトリオン， インク． 抗体−リンカー−薬物結合体、その製造方法およびそれを含む抗癌剤組成物
CN103313390B (zh) 2013-07-05 2016-01-20 江苏大学 一种基于双移动信标的wsn定位方法
CN105829346B (zh) * 2014-01-31 2019-08-23 第一三共株式会社 抗her2抗体－药物偶联物
WO2015155976A1 (ja) 2014-04-10 2015-10-15 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲート
KR102199434B1 (ko) 2017-02-24 2021-01-06 장길훈 대화형 애플리케이션의 메시지 공유 시스템과 방법

Also Published As

Publication number Publication date
TWI696611B (zh) 2020-06-21
JP2020180124A (ja) 2020-11-05
MY170251A (en) 2019-07-13
JP7170812B2 (ja) 2022-11-14
AU2022203560A1 (en) 2022-06-16
KR102417310B1 (ko) 2022-07-05
DK2907824T3 (en) 2018-07-23
KR20180105271A (ko) 2018-09-27
CA2885800A1 (en) 2014-04-17
JP2018008982A (ja) 2018-01-18
KR20220029776A (ko) 2022-03-08
LT3342785T (lt) 2020-02-10
CN113929738A (zh) 2022-01-14
NZ746439A (en) 2019-11-29
AU2018200308B2 (en) 2019-11-07
PH12018501433A1 (en) 2019-02-27
PH12015500667B1 (en) 2015-05-18
JP6952835B2 (ja) 2021-10-27
KR20210132240A (ko) 2021-11-03
PH12015500667A1 (en) 2015-05-18
ZA201501825B (en) 2022-05-25
TWI615152B (zh) 2018-02-21
IL271760B (en) 2022-08-01
AU2013328111A1 (en) 2015-03-12
RU2015113767A (ru) 2016-12-10
TW201811746A (zh) 2018-04-01
US20200282073A1 (en) 2020-09-10
HRP20200353T1 (hr) 2020-06-12
MX2015003903A (es) 2015-07-17
CN113929738B (zh) 2024-05-17
JP2022008581A (ja) 2022-01-13
CY1120363T1 (el) 2019-07-10
KR20150067149A (ko) 2015-06-17
IL294622B2 (en) 2023-10-01
SG11201502887WA (en) 2015-05-28
JP2018188455A (ja) 2018-11-29
NZ740948A (en) 2019-11-29
JP6715888B2 (ja) 2020-07-01
TW202033499A (zh) 2020-09-16
US10973924B2 (en) 2021-04-13
SI3342785T1 (sl) 2020-02-28
KR102087017B1 (ko) 2020-03-10
PT3342785T (pt) 2020-02-25
US20160279259A1 (en) 2016-09-29
JP5953378B2 (ja) 2016-07-20
CN109081871B (zh) 2023-07-14
JP2017036274A (ja) 2017-02-16
TWI650312B (zh) 2019-02-11
EP3342785B1 (en) 2019-12-25
KR20200026323A (ko) 2020-03-10
SI2907824T1 (en) 2018-06-29
LT2907824T (lt) 2018-06-11
ES2671644T3 (es) 2018-06-07
US20190008981A1 (en) 2019-01-10
ES2773710T3 (es) 2020-07-14
EP2907824A4 (en) 2016-06-08
IL294622A (en) 2022-09-01
IL294622B1 (en) 2023-06-01
HUE048748T2 (hu) 2020-08-28
TW201920098A (zh) 2019-06-01
RU2664465C2 (ru) 2018-08-17
US20150297748A1 (en) 2015-10-22
KR102369419B1 (ko) 2022-03-02
RS60000B1 (sr) 2020-04-30
AU2013328111B2 (en) 2017-11-02
KR20220146669A (ko) 2022-11-01
JP6186045B2 (ja) 2017-08-23
PL2907824T3 (pl) 2018-08-31
IL302494A (en) 2023-06-01
JP6371452B2 (ja) 2018-08-08
BR112015006521B1 (pt) 2022-03-03
KR20190135559A (ko) 2019-12-06
EP2907824A1 (en) 2015-08-19
KR20220100727A (ko) 2022-07-15
WO2014057687A1 (ja) 2014-04-17
AU2020200548A1 (en) 2020-02-13
KR102052319B1 (ko) 2019-12-05
EP2907824B1 (en) 2018-04-11
KR102584005B1 (ko) 2023-09-27
TWI757740B (zh) 2022-03-11
KR20230142808A (ko) 2023-10-11
CN104755494A (zh) 2015-07-01
KR20230086800A (ko) 2023-06-15
US10195288B2 (en) 2019-02-05
CN115960111A (zh) 2023-04-14
SG10201804788XA (en) 2018-07-30
KR20230024433A (ko) 2023-02-20
NZ705394A (en) 2018-10-26
US9808537B2 (en) 2017-11-07
US11633493B2 (en) 2023-04-25
EP3342785A1 (en) 2018-07-04
IL271760A (en) 2020-02-27
RS57278B1 (sr) 2018-08-31
BR112015006521A2 (tr) 2017-09-05
IL238143A0 (en) 2015-05-31
KR101841818B1 (ko) 2018-03-26
EP3632471A1 (en) 2020-04-08
JPWO2014057687A1 (ja) 2016-09-05
KR102320907B1 (ko) 2021-11-02
HUE039000T2 (hu) 2018-12-28
CA3021435C (en) 2021-10-12
CA2885800C (en) 2018-12-04
KR101901558B1 (ko) 2018-09-21
AU2020200548B2 (en) 2022-08-25
MX364484B (es) 2019-04-29
CN104755494B (zh) 2018-09-07
KR102237639B1 (ko) 2021-04-07
IL238143B (en) 2020-01-30
RU2018128384A3 (tr) 2021-12-20
HK1256631A1 (zh) 2019-09-27
CY1122789T1 (el) 2021-05-05
KR102498405B1 (ko) 2023-02-09
CA3021435A1 (en) 2014-04-17
TW202233186A (zh) 2022-09-01
AU2018200308A1 (en) 2018-02-01
HK1210477A1 (en) 2016-04-22
HRP20180870T1 (hr) 2018-07-13
TW201420117A (zh) 2014-06-01
PL3342785T3 (pl) 2020-09-07
KR20180030734A (ko) 2018-03-23
JP6030267B1 (ja) 2016-11-24
RU2018128384A (ru) 2018-10-02
US20240082413A1 (en) 2024-03-14
KR102540419B1 (ko) 2023-06-05
MX2019004502A (es) 2019-08-21
KR20210038728A (ko) 2021-04-07
JP2023011799A (ja) 2023-01-24
DK3342785T3 (da) 2020-03-23
KR102456726B1 (ko) 2022-10-20
PT2907824T (pt) 2018-06-07
BR122021014396B1 (pt) 2022-07-05
MX2020010964A (es) 2020-11-09
JP2016196484A (ja) 2016-11-24
BR122021014365B1 (pt) 2022-07-05
CN109081871A (zh) 2018-12-25
ZA201900820B (en) 2022-08-31
NZ746440A (en) 2019-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201809636T4 (tr) Antikor-ilaç konjugatı.
WO2014061277A1 (ja) 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
BR122020012304B1 (pt) Composto ligante para conjugados anticorpo-fármaco, método e intermediários de produção do mesmo