KR20230035332A - 항엽산제 링커-약물 및 항체-약물 접합체 - Google Patents

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로널드 크리스티안 엘저스마
티즐 후이브레그츠
데니스 크리스티안 요하네스 왈보어
요하네스 알베르투스 프레데리쿠스 주스텐
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비온디스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 신규한 항엽산제(antifolate) 링커-약물, 이러한 항엽산제 링커-약물을 포함하는 접합체, 및 임의로 다른 치료제와 조합된, 암, 자가면역 및 감염성 질환과 같은 질환의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항엽산제 링커-약물 및 항체-약물 접합체
본 발명은 신규한 항엽산제(antifolate) 링커-약물, 이러한 항엽산제 링커-약물을 포함하는 접합체, 및 임의로 다른 치료제와 조합된, 암, 자가면역 및 감염성 질환과 같은 질환의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
항엽산제는 폴산(비타민 B9)의 작용을 길항하는 일 부류의 항대사산물 화합물이다.
Figure pct00001
폴산은 세린, 메티오닌, 티미딘 및 퓨린 생합성에 관여하는 다양한 메틸트랜스퍼라제에 대한 보조인자로 작용한다. 결과적으로, 항엽산제는 세포 분열, DNA 및 RNA 합성 및 복구, 및 단백질 합성을 억제한다. 대부분의 항엽산제는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 억제하여 작용한다.
항엽산제 프로구아닐, 피리메타민 및 트리메토프림은 박테리아, 원생동물 및 진균과 같은 미생물 유기체에서 폴산의 작용을 선택적으로 억제한다. 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 프랄라트렉세이트 및 탈로트렉신과 같은 다른 항엽산제는 일부 유형의 암 및/또는 자가면역 질환 류마티스 관절염과 같은 염증 병태를 치료하는 데 사용된다.
이전에 아메토프테린으로 공지된 메토트렉세이트는 가장 오래되고 가장 널리 공지된 폴산 유사체이다. 이는 1950년대에 발견되었으며 화학치료제이고 면역계 억제제이다. 이는 원래는 단독으로 또는 다른 작용제와 병용하여 화학요법을 위해 개발되었으며, 예컨대 방광암, 유방암, 두경부암, 백혈병, 폐암, 림프종, 임신성 융모성 질환, 및 골육종의 치료에 여전히 사용되고 있다. 메토트렉세이트는 류마티스 관절염, 연소성 피부근육염, 건선, 건선성 관절염, 루푸스, 유육종증, 크론 질환, 습진, 및 혈관염을 포함한 일부 자가면역 질환에 대한 질환 변형 치료제로도 사용된다. 추가 사용은 자궁외 임신 치료 및 의학적 낙태 유도를 포함한다.
페메트렉세드는 중피종, 폐암, 두경부암을 포함한 다양한 암 적응증의 치료에 사용된다. 이는 폴산과 화학적으로 유사하며, 퓨린 및 피리미딘 합성에 사용되는 3가지 효소인 DHFR, 티미딜레이트 신타제(TS), 및 글리신아미드 리보뉴클레오티드 포르밀트랜스퍼라제(GARFT)를 억제하여 작용한다. 페메트렉세드는 전구체 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 형성을 억제함으로써 정상 세포 및 종양 세포 모두의 성장 및 생존에 필요한 DNA 및 RNA의 형성을 방지한다.
프랄라트렉세이트는 말초 T 세포 림프종 치료를 위해 승인되었다. 이는 감소된 폴레이트 캐리어 1(RFC-1) 뿐만 아니라 폴릴폴리글루타메이트 신테타제에 대해 증가된 친화성을 갖도록 설계되었으며 각각 세포내 흡수 및 세포독성 대사산물을 증가시킨다.
탈로트렉신은 폴산의 4-아미노 유도체인 아미노프테린의 항대사산물 유사체 및 프테린의 합성 유도체이다. 탈로트렉신은 항신생물 활성을 나타내며, DHFR에 결합하여 이의 기능을 억제한다. 수용성 탈로트렉신은 감소된 폴레이트 캐리어(RFC)에 의해 세포로 능동적으로 수송되므로 P-당단백질 매개된 다중약물 내성과 관련될 가능성이 낮다.
Figure pct00002
항엽산제는 특히 DNA 및 RNA 합성 동안 작용하므로 주로 세포 주기의 S기 동안 세포독성적이다. 따라서, 이들은 DNA를 더 자주 복제하는 빠르게 분열하는 세포(예컨데, 악성 및 골수성 세포)에 더 큰 독성 영향을 갖는다. 그러나, 이들은 종양 세포 뿐만 아니라, 골수 세포, 위장 및 구강 점막 세포와 같은 빠르게 분열하는 비암성 세포의 성장 및 증식을 억제하여, 예컨대 골수, 장, 구강 점막, 피부 및 모발에 유해 사례를 일으킨다.
항엽산제와 같은 세포독성 소분자 약물로 인한 전신 독성 부작용은 이러한 약물을 화학적 링커를 통해 표적 분자, 예컨대 항체, 항원 결합 항체 단편 또는 융합 단백질(예컨데, 항체 Fc에 융합된 수용체 리간드)에 접합시킴으로써 감소될 수 있다. 이러한 2가지 성분, 즉 세포독성 소분자 약물 및 표적화 분자를 단일한 새로운 분자 실체로 조합함으로써, 표적화 분자는 세포독성 소분자 약물을 표적 세포 또는 조직(세포독성 활성을 발휘할 수 있는 곳)에 특이적으로 전달할 수 있으므로 소분자에 대한 비표적 조직의 노출을 감소시킨다.
메토트렉세이트의 표적화를 개선하고 독성을 감소시키기 위해, 메토트렉세이트의 여러 항체-약물 접합체(ADC)가 1980년대 후반에 제조되었다. 이러한 리신-접합된 ADC의 약물 대 항체 비율(DAR)은 9.4 내지 45 범위였다. ADC 개념은 성공적이었지만, 이들 ADC를 사용하여 수득된 시험관내(Shen et al, Cancer Res. 1986, 46, 3912-3916; Umemoto et al, Int. J. Cancer 1989, 43, 677-684) and in vivo (Deguchi et al, Cancer Res. 1986, 46, 3751-3755; Rowland et al, Br. J. Cancer 1990, 61, 702-708) 효능 결과는 보통 내지 저조하였다. 높은 DAR에서도 메토트렉세이트는 ADC 독소로서 충분히 강력하지 않은 것으로 나타났다.
페메트렉세드의 짧은 종양 표적화 펩티드 접합체가 제조되고 시험되었지만(Miklan et al, J. Pept. Sci. 2011, 17, 805-811), 이 개념은 더 이상 탐구되지 않았다. 페메트렉세드, 프랄라트렉세이트 및 탈로트렉신과 같은 보다 강력한 항엽산제의 ADC는 보고된 적이 없다.
따라서, 암, 자가면역 및 감염성 질환의 치료에 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 사용하기에 적합한, 항엽산제 및 항체, 항원 결합 단편 또는 다른 표적화 분자를 포함하는 새롭고 개선된 표적 특이적 접합체가 필요하다.
본 발명은 신규한 항엽산제 링커-약물, 이러한 항엽산제 링커-약물을 포함하는 접합체, 및 임의로 다른 치료제와 조합된, 암, 자가면역 및 감염성 질환과 같은 질환의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 링커-약물 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00003
상기 식에서,
R1은 O, NH2 또는 OH이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2, CH(C1-5 알킬), CH(C2-4 알케닐), CH(C2-4 알키닐), 또는 CH(C1-4 알콕실)이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 벤질옥시, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되거나, R4는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 카르복실산 생물동배체이고:
Figure pct00004
Figure pct00005
,
여기서 Ra'는 H, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 각각의 Ra는 독립적으로 H, F, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 2개의 Ra 치환기는 임의로 연결되어 고리를 형성할 수 있고;
R5는 H, 할로겐, CF3, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕실, 또는 C1-4 알킬티오, 바람직하게는 H, F, CH3, CF3, CH2CH3, CH=CH2, CH2CF3, 또는 CF2CF3, 보다 바람직하게는 H 또는 F이고;
R6은 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C3-6 사이클로알킬, 바람직하게는 H이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
Q는 부재하거나 -N(R7)-(C=O)-, -(C=O)-N(R7)-, -CH2N(R7)-, -N(R7)CH2-, -N(R7)SO2-, 또는 -SO2N(R7)-이고, 여기서 R7은 H, C1-4 알킬, C1-4 알케닐, 또는 C1-4 알키닐, 바람직하게는 H이거나, Q는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미드 결합 생물동배체이고:
Figure pct00006
,
여기서 Rb는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, T1, T1' 및 T1''는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, W1, W1' 및 W1''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되고;
V는 하나 이상의 R4 기로 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 사이클로알칸이고, 독립적으로 하기로부터 선택되고:
Figure pct00007
,
여기서 U1, U1', U1'', U2, U2', U2'' 및 U2'''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되거나, V는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
Figure pct00008
,
여기서 Z는 O, S, NH 또는 NRc이고, Rc는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고;
s는 0 또는 1, 바람직하게는 1이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고;
k는 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 1이고;
L은 링커 모이어티이고;
Figure pct00009
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
제2 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (III)의 항체-약물 접합체에 관한 것이다:
Ab-(L-D)y (III)
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
L-D는 본 발명에 따른 링커-약물 화합물이고;
y는 1 내지 16의 평균적인 항체에 대한 약물의 비율을 나타내고;
본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 바람직하게는 항체 또는 항원 결합 단편의 시스테인 잔기를 통해 접합된다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 링커-약물 화합물 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 약학 조성물, 이의 합성 방법, 및 특히 암, 자가면역 또는 감염성 질환의 치료를 위한 약제로서의 이의 용도를 포함한다.
도 1. HER2 양성 SK-BR-3 세포에서 트라스투주맙-XT17 항엽산제 ADC 대 비결합 대조군 ADC의 시험관내 효능.
도 2. HER2 음성 SW-620 세포에서 트라스투주맙-XT17 항엽산제 ADC 대 비결합 대조군 ADC의 시험관내 효능.
도 3a. 마우스에서의 HER2 양성 BT-474 세포주 이종이식편에서 항엽산제 ADC1(5 mg/kg IV) 대 비히클 대조군의 생체내 효능.
도 3b. 마우스에서의 HER2 양성 BT-474 세포주 이종이식편에서 항엽산제 ADC1(5 mg/kg IV 또는 1.7 mg/kg Q1Wx3) 대 비히클 대조군의 생체내 효능.
도 4a. 마우스에서의 HER2 양성 BT-474 세포주 이종이식편에서 항엽산제 ADC1(5 mg/kg IV) 대 비히클 대조군의 체중에 대한 영향.
도 4b. 마우스에서의 HER2 양성 BT-474 세포주 이종이식편에서 항엽산제 ADC1(5 mg/kg IV 또는 1.7 mg/kg Q1Wx3) 대 비히클 대조군의 체중에 대한 영향.
도 5. 마우스에서의 HER2 2+ MAXF574 환자 유래된 이종이식편에서 항엽산제 ADC1(3 또는 10 mg/kg IV) 대 비히클 대조군의 생체내 효능.
본 발명자들은 화학식 (I)의 링커-약물 화합물이 항체, 항원 결합 단편 또는 융합 단백질(예컨대, 항체 Fc에 융합된 수용체 리간드)과 같은 또 다른 표적화 분자에 접합하는데 특히 적합하다는 것을 밝혀내었다. 이러한 링커-약물 접합체로부터 방출된 소분자 약물 화합물은 항엽산제 화합물로서 우수한 효능을 갖는다. 이들은 DHFR의 우수한 억제 활성을 나타내며 다양한 암 세포주에서 강력한 항증식 효과를 나타낸다.
링커-약물 화합물
제1 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 링커-약물 화합물을 제공한다:
Figure pct00010
상기 식에서,
R1은 O, NH2 또는 OH이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2, CH(C1-5 알킬), CH(C2-4 알케닐), CH(C2-4 알키닐), 또는 CH(C1-4 알콕실)이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 벤질옥시, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되거나, R4은 카르복실산 생물동배체이고;
R5는 H, 할로겐, CF3, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕실, 또는 C1-4 알킬티오, 바람직하게는 H, F, CH3, CF3, CH2CH3, CH=CH2, CH2CF3, 또는 CF2CF3, 보다 바람직하게는 H 또는 F이고;
R6은 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C3-6 사이클로알킬, 바람직하게는 H이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
Q는 부재하거나 -N(R7)-(C=O)-, -(C=O)-N(R7)-, -CH2N(R7)-, -N(R7)CH2-, -N(R7)SO2-, 또는 -SO2N(R7)-이고, 여기서 R7은 H, C1-4 알킬, C1-4 알케닐, 또는 C1-4 알키닐, 바람직하게는 H이거나, Q는 아미드 결합 생물동배체이고;
V는 하나 이상의 R4 기로 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 사이클로알칸이고, 독립적으로 하기로부터 선택되고:
Figure pct00011
,
여기서 U1, U1', U1'', U2, U2', U2'' 및 U2'''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되거나, V는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
Figure pct00012
,
여기서 Z는 O, S, NH 또는 NRc이고, Rc는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고;
s는 0 또는 1, 바람직하게는 1이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고;
k는 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 1이고;
L은 링커 모이어티이고;
Figure pct00013
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
이러한 링커-약물 화합물은 이후 본 발명에 따른 링커-약물 또는 링커-약물 화합물로 지칭된다.
본 발명의 맥락에서, 할로겐은 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)이다. 본 발명에 따른 링커-약물 화합물에 대한 바람직한 할로겐은 불소, 염소 및 브롬이고, 더 바람직한 할로겐은 불소 또는 염소이고, 가장 바람직한 할로겐은 염소이다.
본 발명의 맥락에서, 알킬, 알케닐, 알콕실, 알키닐, 사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴 또는 헤테로아릴과 같은 모이어티의 탄소 원자 수는, 예컨대 C1-6으로 표시되며, 이 비제한적인 경우에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자와 같이 1 내지 6개의 탄소 원자가 예상됨을 나타낸다. 유사하게, C2-4 알케닐은 2, 3 또는 4개의 탄소 원자를 갖는다. 탄소 원자 수는 추가 치환을 제외한 총 탄소 원자 수, 총 탄소 원자 수, 및 탄소 원자의 가장 긴 연속 내부 배열에서 찾아질 수 있는 탄소 원자 수로 표현될 수 있다. 바람직하게는, 탄소 원자 수는 추가 치환을 제외한 총 탄소 원자 수로 표현된다.
본 발명의 맥락에서, 비치환된 알킬기는 일반식 CnH2n+1을 가지며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 비치환된 알킬기는 또한 사이클릭 모이어티를 함유할 수 있으므로 동반되는 일반식 CnH2n-1을 갖는다. 임의로, 알킬기는 본 명세서에 추가로 명시된 하나 이상의 치환기로 치환된다. 적합한 알킬기의 예는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH2CH3, -C(CH3)3 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 알킬기는 선형 또는 분지형이고, 가장 바람직하게는 선형이다. 사이클릴기는 사이클릭 알킬기이고; 바람직한 사이클릴기는 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 사이클로펜틸이다. 헤테로사이클릴기는 적어도 하나의 CH2 모이어티가 헤테로원자로 대체된 사이클릴기이다. 바람직한 헤테로원자는 S, O, 및 N이다. 바람직한 헤테로사이클릴기는 피페리디닐, 옥시라닐 및 옥솔라닐이다. 바람직한 C1-4 알킬기는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH2CH3, -C(CH3)3, 사이클로프로필, 및 사이클로부틸, 보다 바람직하게는, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH2CH3, 및 -C(CH3)3이다.
본 발명의 맥락에서, 비치환된 알케닐기는 일반식 CnH2n-1을 가지며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 적합한 알케닐기의 예는 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐 및 펜테닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비치환된 알케닐기는 또한 사이클릭 모이어티를 함유할 수 있으므로 동반되는 일반식 CnH2n-3을 갖는다. 바람직한 알케닐기는 선형 또는 분지형이고, 가장 바람직하게는 선형이다.
본 발명의 맥락에서, 비치환된 알키닐기는 일반식 CnH2n-3을 가지며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 비치환된 알키닐기는 또한 사이클릭 모이어티를 함유할 수 있으므로 동반되는 일반식 CnH2n-5를 갖는다. 임의로, 알키닐기는 본 명세서에 추가로 명시된 하나 이상의 치환기로 치환된다. 적합한 알키닐기의 예는 에티닐, 프로파르길, n-부트-2-이닐 및 n-부트-3-이닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 알킬기는 선형 또는 분지형이고, 가장 바람직하게는 선형이다.
본 발명의 맥락에서, 아릴기는 방향족이고, 적어도 6개의 탄소 원자를 포함하고, 모노사이클릭, 바이사이클릭 및 폴리사이클릭 구조를 포함할 수 있다. 임의로, 아릴기는 본 명세서에 추가로 명시된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 안트라실 등과 같은 기를 포함한다. 헤테로아릴기는 방향족이며, S, O 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로원자로 인해 6개보다 작은 고리 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 알콕실 모이어티는 브릿징 산소 원자가 선행하는 알킬 모이어티이다. 적합한 알콕실 모이어티의 예는 -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -OCH(CH3)2, -OCH(CH3)CH2CH3, -OCH2CH2CH2CH3, 및 -OC(CH3)3이다.
본 발명에서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕실, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릴 및 헤테로사이클릴의 각각의 경우는 바람직하게는 할로겐, C1-4 알킬, 예컨대 CH3, OH, C1-4 알콕실, 예컨대 OCH3, 및 =O로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티로 임의로 치환되고, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐 및 알콕실의 각각의 경우는 O 또는 S와 같은 헤테로원자에 의해 중단될 수 있고, 여기서 알킬, 알콕실, 사이클릴 및 헤테로사이클릴의 각각의 경우는 임의로 불포화된다. 헤테로원자에 의한 중단은 하나 이상의 헤테로원자에 의한 중단을 의미한다. 이와 관련하여, 바람직하게는 20개 이하, 보다 바람직하게는 3, 4 또는 5개의 헤테로원자가 중단한다. 바람직하게는 모든 중단 헤테로원자는 동일한 원소이다. 비제한적 예로서, CH2-CH2-CH2-CH2-CH3은 헤테로원자에 의해 중단되는 경우 CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 분자는 임의로 치환될 수 있다. 적합한 임의적 치환은 -H를 할로겐으로 대체하는 것이다. 바람직한 할로겐은 F, Cl, Br 및 I, 가장 바람직하게는 F이다. 추가로 적합한 임의적 치환은 하나 이상의 -H를 -NH2, -OH, =O, 알킬, 알콕실, 할로알킬, 할로알콕실, 알켄, 할로알켄, 알킨, 할로알킨, 사이클로알킬로 치환하는 것이다. 알킬기는 일반식 CnH2n+1을 가지며, 교대로 선형 또는 분지형일 수 있다. 비치환된 알킬기는 또한 사이클릭 모이어티를 함유할 수 있으므로 동반되는 일반식 CnH2n-1을 갖는다. 임의로, 알킬기는 본 명세서에 추가로 명시된 하나 이상의 치환기로 치환된다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, t-부틸, 1-헥실, 1-도데실 등을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 생물동배체는 또 다른 화학적 화합물과 광범위하게 유사한 생물학적 특성을 야기하는 유사한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 화학적 치환기 또는 기이다. 하나의 생물동배체를 또 다른 것으로 교환하는 목적은 화학 구조를 크게 변화시키지 않고 화합물의 원하는 생물학적 또는 물리적 특성을 향상시키는 것이다. 생물동배체의 일반적인 개념은, 예컨대 문헌(Meanwell, J. Med. Chem. 2011, 54, 2529-2591 and Patani and LaVoie, Chem. Rev. 1996, 96, 3147-3176)에 기재되어 있다.
카르복실산 생물동배체는, 예컨대 문헌(Ballatore et al, ChemMedChem. 2013, 8, 385-395 and Lassalas et al, J. Med. Chem. 2016, 59, 3183-3203)에 기재되어 있다.
카르복실산 생물동배체의 바람직한 예는 하기와 같다:
Figure pct00014
Figure pct00015
상기 식에서, Ra'는 H, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 각각의 Ra는 독립적으로 H, F, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 2개의 Ra 치환기는 임의로 연결되어 고리를 형성할 수 있다.
아미드 결합 생물동배체는, 예컨대 문헌(Kumari et al, J. Med. Chem. 2020, 63, 12290-12358 and Recnik et al, Molecules 2020, 25, 3576)에 기재되어 있다.
아미드 결합 생물동배체의 바람직한 예는 하기와 같다:
Figure pct00016
Figure pct00017
상기 식에서, Rb는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, T1, T1' 및 T1''는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, W1, W1' 및 W1''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택된다.
문헌(Tse et al., J. Med. Chem. 2020, 63, 11585-11601), Mykhailiuk (Org. Biomol. Chem., 2019, 17, 2839-2849, Qiao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 4118-4123), and Stepan et al., J. Med. Chem. 2012, 55, 3414-3424)은 다양한 비고전적 및/또는 포화된 페닐 생물동배체를 기재한다.
이러한 페닐 생물동배체의 예는 하기와 같다:
Figure pct00018
.
상기 기재된 바와 같이, V는 하나 이상의 R4 기로 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 사이클로알칸이고, 독립적으로 하기로부터 선택된다:
Figure pct00019
.
한 실시양태에서, V는 하기이다:
Figure pct00020
.
바람직하게는, V는 하기이다:
Figure pct00021
.
보다 바람직하게는, V는 하기이다:
Figure pct00022
.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ia)의 링커-약물 화합물을 제공한다:
Figure pct00023
.
보다 바람직하게는, 본 발명은 화학식 (Ia)의 링커-약물 화합물을 제공하며, 여기서
R1은 O, NH2 또는 OH이고, 바람직하게는 R1은 NH2이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고, 바람직하게는 R2 및 R2'는 N이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2 또는 CH(C1-5 알킬)이고, 바람직하게는 R3은 NH, N(CH3), 또는 CH2이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, 바람직하게는 R4는 -COOH 또는 테트라졸이고;
Q는 부재하거나 -N(R7)-(C=O)-, -(C=O)-N(R7)-, -CH2N(R7)-, -N(R7)CH2-, -N(R7)SO2-, 또는 -SO2N(R7)-이고, 여기서 R7는 H, C1-4 알킬, C1-4 알케닐, 또는 C1-4 알키닐, 바람직하게는 H이거나, Q는 아미드 결합 생물동배체이고, 바람직하게는 Q는 -N(R7)-(C=O)- 또는 -(C=O)-N(R7)-, 보다 바람직하게는 -N(R7)-(C=O)-이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고, 바람직하게는 X는 NH이고;
L은 링커 모이어티이고;
Figure pct00024
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -COOH이고, Q는 -NH-(C=O)-이다.
또 다른 특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -COOH이고, Q는 트리아졸이다.
또 다른 특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 테트라졸이고, Q는 -NH-(C=O)-이다.
또 다른 특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -SO3H이고, Q는 -NH-(C=O)-이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ib)의 링커-약물 화합물을 제공한다:
Figure pct00025
.
보다 바람직하게는, 본 발명은 화학식 (Ib)의 링커-약물 화합물을 제공하며, 여기서
R1은 O, NH2 또는 OH이고, 바람직하게는 R1은 NH2이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고, 바람직하게는 R2 및 R2'는 N이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2 또는 CH(C1-5 알킬)이고, 바람직하게는 R3은 NH, N(CH3), 또는 CH2이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, 바람직하게는 R4는 -COOH 또는 테트라졸이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고, 바람직하게는 X는 NH이고;
L은 링커 모이어티이고;
Figure pct00026
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -COOH이고, n은 3이다.
또 다른 특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 테트라졸이고, R4는 -COOH이고, n은 3이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ic)의 링커-약물 화합물을 제공한다:
Figure pct00027
.
보다 바람직하게는, 본 발명은 화학식 (Ic)의 링커-약물 화합물을 제공하며, 여기서
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고, 바람직하게는 R2 및 R2'는 N이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2 또는 CH(C1-5 알킬)이고, 바람직하게는 R3은 NH, N(CH3), 또는 CH2이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, 바람직하게는 R4는 -COOH 또는 테트라졸이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고, 바람직하게는 X는 NH이고;
L은 링커 모이어티이다.
특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -COOH이다.
또 다른 특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 N이고, R4는 테트라졸이다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 C이고, R4는 H이다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 N이고, R4는 H이다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 N이고, R4는 OH이다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 N이고, R4는 Cl이다.
추가의 또 다른 특정 실시양태에서, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -SO3H이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Id)의 링커-약물 화합물을 제공한다:
Figure pct00028
.
보다 바람직하게는, 본 발명은 하기 화학식 (Id)의 링커-약물 화합물을 제공하며, 여기서
R1은 O, NH2 또는 OH이고, 바람직하게는 R1은 NH2이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고, 바람직하게는 R2 및 R2'는 N이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2 또는 CH(C1-5 알킬)이고, 바람직하게는 R3은 NH, N(CH3), 또는 CH2이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, 바람직하게는 R4는 -COOH 또는 테트라졸이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 4이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고, 바람직하게는 X는 NH이고;
L은 링커 모이어티이고;
Figure pct00029
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 -COOH이고, n은 4이다.
또 다른 특정 실시양태에서, R1은 NH2이고, R2 및 R2'는 N이고, R4는 H이고, n은 3이다.
본 발명에 따른 바람직한 링커-약물 화합물은 하기이다:
Figure pct00030
Figure pct00031
.
본 발명에 따른 보다 바람직한 링커-약물 화합물은 하기이다:
Figure pct00032
.
본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 링커 모이어티를 포함한다. 링커는 바람직하게는 합성 링커이다. 링커의 구조는 링커가 소분자 약물에 쉽게 화학적으로 부착될 수 있고 생성된 링커-약물 화합물이, 예컨대 폴리펩티드와 같은 추가 물질에 쉽게 접합되어 억제제 접합체를 형성할 수 있도록 하는 것이다. 링커의 선택은 순환 시 이러한 최종 접합체의 안정성에 영향을 미칠 수 있으며, 방출되는 경우 소분자 약물 화합물이 방출되는 방식에 영향을 미칠 수 있다. 적합한 링커는, 예컨대 문헌(Ducry et al, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13, King and Wagner, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 825-839, Gordon et al, Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215, Tsuchikama and An (DOI: 10.1007/s13238-016-0323-0), Polakis (DOI: 10.1124/pr.114.009373), Bargh et al. (DOI: 10.1039/c8cs00676h), WO 02/083180, WO　2004/043493, WO 2010/062171, WO　2011/133039, WO　2015/177360, and WO　2018/069375)에 기재되어 있다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않다. 절단 가능한 링커는, 예컨대 리소좀 프로테아제에 노출되거나 산성 pH 또는 더 높은 환원 전위를 갖는 환경에 노출될 때 절단될 수 있는 모이어티를 포함한다. 적합한 절단 가능한 링커는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 디-, 트리- 또는 테트라펩티드, 즉 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기로 구성된 펩티드를 포함한다. 추가로, 절단가능한 링커는 ω-아미노 아미노카르보닐 고리화 스페이서와 같은 자기희생 모이어티(문헌(Saari et al, J. Med. Chem., 1990, 33, 97-101) 참조) 또는 -NH-CH2-O- 모이어티를 포함할 수 있다. 링커의 절단은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물 내의 항엽산제 모이어티를 주변 환경에 이용 가능하게 만든다. 절단 가능하지 않은 링커는, 예컨대 접합된 폴리펩티드가 리소좀에서 분해될 때 본 발명에 따른 링커-약물 화합물로부터 항엽산제 모이어티(의 유도체)를 여전히 효과적으로 방출할 수 있다. 절단 가능하지 않은 링커는, 예컨대 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸(사이클로헥산)-1-카르복실레이트 및 말레이미도카프로산 및 이의 유사체를 포함한다.
링커 또는 링커-약물 모이어티를 폴리펩티드, 예컨대 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 또 다른 표적화 분자에 접합시킬 수 있도록, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 다른 표적화 분자에 (공유적으로) 결합될 링커의 측면은 전형적으로 비교적 온화한 조건 하에서 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 다른 표적화 분자의 아미노산 잔기와 반응할 수 있는 작용기를 함유한다. 이 작용기는 본원에서 반응성 모이어티(RM)로 지칭된다. 반응성 모이어티의 예는 카르바모일 할라이드, 아실 할라이드, 활성 에스테르, 무수물, α-할로 아세틸, α-할로 아세트아미드, 말레이미드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 디술파이드, 티올, 히드라진, 히드라지드, 술포닐 클로라이드, 알데하이드, 메틸 케톤, 비닐 술폰, 할로 메틸, 메틸 술포네이트, 및 사이클로옥틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 작용기가 반응하는 이러한 아미노산 잔기는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비천연 아미노산"은 (합성적으로) 변형된 아미노산 또는 자연 발생 아미노산의 D 입체이성질체를 나타내는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 작용기가 반응하는 아미노산 잔기는 천연 아미노산이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, RM은 하기이다:
Figure pct00033
Figure pct00034
상기 식에서,
X1은 -Cl, -Br, -I, -F, -OH, -O-N-숙신이미드, -O-(4-니트로페닐), -O-펜타플루오로페닐, -O-테트라플루오로페닐, -O-C(O)-R8, 및 -O-C(O)-OR8로부터 선택되거나, C(O)-X1은 활성 에스테르이고;
X2는 -Cl, -Br, -I, -O-메실, -O-트리플릴, 및 -O-토실로부터 선택되고;
R8은 임의로 치환된 분지형 또는 비분지형 C1-10 알킬, C1-10 헤테로알킬, C3-10 사이클로알킬, C1-10 헤테로사이클로알킬, C5-10 아릴 또는 C1-10 헤테로아릴로부터 선택되고;
U는 O 또는 NR9이고;
R9는 H, 분지형 또는 비분지형 C1-C12 알킬 또는 C4-C12 (헤테로)아릴기로부터 선택된다.
바람직하게는, RM은 하기이다:
Figure pct00035
.
보다 바람직하게는, RM은 하기이다:
Figure pct00036
.
링커는 하나 이상의 신장 스페이서, 예컨대 하기를 추가로 포함할 수 있다:
Figure pct00037
.
링커는 문헌(Alouane et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 7492-7509, Deng et al, Macromol. Rapid Commun. 2020, 41, e1900531 or Bargh et al, Chem. Soc. Rev. 2019, 48, 4361-4374)에 기재된 바와 같은 하나 이상의 제거 스페이서를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 링커 L은 하기이다:
Figure pct00038
상기 식에서,
m은 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 5이고;
AA는 아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산이고;
p는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
ES는 부재하거나 하기로부터 선택되는 신장 스페이서이고:
Figure pct00039
;
RL은 부재하거나 하기로부터 선택되는 제거 스페이서이고:
Figure pct00040
,
여기서 t는 1-10 범위의 정수이고, R10은 임의로 치환된 C1-4 알콕실이고, R11은 H, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C6-14 아릴 또는 임의로 치환된 C-연결된 C3-8 헤테로아릴이다.
바람직한 실시양태에서, m은 5이고, p는 0이고, ES 및 RL은 부재하고, L은 하기이다:
Figure pct00041
.
또 다른 바람직한 실시양태에서, AA는 알라닌, 글리신, 리신, 페닐알라닌, 발린, 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
제1의 특정 실시양태에서, p는 2이고, AA2는 페닐알라닐리신, 발릴알라닌, 발릴시트룰린 또는 발릴리신이다. 보다 바람직하게는, AA2는 발릴알라닌 또는 발릴시트룰린이다. 가장 바람직하게는, AA2는 발릴알라닌 또는 발릴시트룰린이고, m은 5이다.
제2의 특정 실시양태에서, p는 3이고, AA3은 알라닐페닐알라닐리신이다.
제3의 특정 실시양태에서, p는 4이고, AA4는 글리실글리실페닐알라닐글리신이다.
바람직한 실시양태에서, m은 5이고, p는 2이고, AA2는 발릴알라닌 또는 발릴시트룰린이다.
바람직하게는, m은 5이고, p는 2이고, AA2는 발릴알라닌이고, ES 및 RL은 부재하고, L은 하기이다:
Figure pct00042
.
또 다른 바람직한 실시양태에서, m은 5이고, p는 4이고, AA4는 글리실글리실페닐알라닐글리신이고, ES 및 RL은 부재하고, L은 하기이다:
Figure pct00043
.
한 실시양태에서, 링커 L은 하기이다:
Figure pct00044
상기 식에서,
q는 1 내지 12 범위의 정수, 바람직하게는 2이고;
AA는 아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산이고;
p는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
ES는 부재하거나 하기로부터 선택되는 신장 스페이서이고:
Figure pct00045
;
RL은 부재하거나 하기로부터 선택되는 제거 스페이서이고:
Figure pct00046
,
여기서 t는 1-10 범위의 정수이고, R10은 임의로 치환된 C1-4 알콕실이고, R11은 H, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C6-14 아릴 또는 임의로 치환된 C-연결된 C3-8 헤테로아릴이다.
바람직한 실시양태에서, AA는 알라닌, 글리신, 리신, 페닐알라닌, 발린, 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
제1의 특정 실시양태에서, p는 2이고, AA2는 페닐알라닐리신, 발릴알라닌, 발릴시트룰린 또는 발릴리신이다. 보다 바람직하게는, AA2는 발릴알라닌 또는 발릴시트룰린이다. 가장 바람직하게는, AA2는 발릴알라닌 또는 발릴시트룰린이고, q는 2이다.
제2의 특정 실시양태에서, p는 3이고, AA3은 알라닐페닐알라닐리신이다.
제3의 특정 실시양태에서, p는 4이고, AA4는 글리실글리실페닐알라닐글리신이다.
바람직한 실시양태에서, q는 2이고, p는 2이고, AA2는 발릴알라닌 또는 발릴시트룰린이다. 바람직하게는, q는 2이고, p는 2이고, AA2는 발릴시트룰린이고, RL은 부재하고, ES는 하기이고:
Figure pct00047
,
L은 하기이다:
Figure pct00048
.
또 다른 바람직한 실시양태에서, q는 2이고, p는 2이고, AA2는 발릴시트룰린이고, ES는 하기이고:
Figure pct00049
,
RL은 하기이고:
Figure pct00050
,
L은 하기이다:
Figure pct00051
.
한 실시양태에서, 링커 L은 하기이다:
Figure pct00052
.
하기는 본 발명에 따른 바람직한 링커-약물 화합물이다:
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
본 발명에 따른 보다 바람직한 링커-약물 화합물은 하기이다:
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
.
본 발명에 따른 보다 더 바람직한 링커-약물 화합물은 하기이다:
Figure pct00064
Figure pct00065
.
본 발명에 따른 보다 더 바람직한 링커-약물 화합물은 하기이다:
Figure pct00066
Figure pct00067
.
본 발명에 따른 가장 바람직한 링커-약물 화합물은 하기 화학식의 것이다:
Figure pct00068
.
본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 제조하는 방법
본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 실시예에 개시된 절차에 의해 또는 유사한 절차에 의해 또는 예컨대 문헌(Rosowsky et al (J. Med. Chem. 1988, 31 1332-1337; J. Med. Chem. 1998, 41 5310-5319; J. Med. Chem. 2000, 43 1620-1634) or Itoh et al ( Chem. Pharm. Bull. 2000, 48 1270-1280))에 의해 제조될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물의 제조 또는 본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 포함하는 접합체의 제조 공정에서 하기 화학식의 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00069
상기 식에서,
R1은 O, NH2 또는 OH이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2, CH(C1-5 알킬), CH(C2-4 알케닐), CH(C2-4 알키닐), 또는 CH(C1-4 알콕실)이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 벤질옥시, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고,여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되거나, R4은 카르복실산 생물동배체이고;
R5는 H, 할로겐, CF3, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕실, 또는 C1-4 알킬티오, 바람직하게는 H, F, CH3, CF3, CH2CH3, CH=CH2, CH2CF3, 또는 CF2CF3, 보다 바람직하게는 H 또는 F이고;
R6은 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C3-6 사이클로알킬, 바람직하게는 H이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
Q는 부재하거나 -N(R7)-(C=O)-, -(C=O)-N(R7)-, -CH2N(R7)-, -N(R7)CH2-, -N(R7)SO2-, 또는 -SO2N(R7)-이고, 여기서 R7은 H, C1-4 알킬, C1-4 알케닐, 또는 C1-4 알키닐, 바람직하게는 H이거나, Q는 아미드 결합 생물동배체이고;
V는 하나 이상의 R4 기로 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 사이클로알칸이고, 독립적으로 하기로부터 선택되고:
Figure pct00070
,
여기서 U1, U1', U1'', U2, U2', U2'' 및 U2'''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되거나, V는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
Figure pct00071
,
여기서 Z는 O, S, NH 또는 NRc이고, Rc는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고;
s는 0 또는 1, 바람직하게는 1이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되고;
Figure pct00072
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물의 제조 또는 본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 포함하는 접합체의 제조 공정에서 하기 화학식의 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00073
상기 식에서,
R1은 O, NH2 또는 OH이고;
R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고;
R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2 또는 CH(C1-5 알킬)이고;
R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고;
n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되고;
Figure pct00074
는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물의 제조 또는 본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 포함하는 접합체의 제조 공정에서 하기 화학식의 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00075
Figure pct00076
.
보다 바람직하게는, 화합물은 하기 화학식의 것이다:
Figure pct00077
Figure pct00078
.
보다 더 바람직하게는, 화합물은 하기 화학식의 것이다:
Figure pct00079
Figure pct00080
.
폴리펩티드 및 항엽산제 링커-약물 화합물의 억제제 접합체
본 발명은 추가 물질, 예컨대 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드(압타머를 형성하기 위함)에 접합된 본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 포함하는 억제제 접합체를 추가로 제공한다. 바람직하게는 추가 물질은 폴리펩티드이다. 보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 또 다른 표적화 분자이다. 이러한 억제제 접합체는 이하에서 본 발명에 따른 억제제 접합체로 지칭된다.
폴리펩티드에 접합될 때, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "본 발명에 따른 억제제 접합체"는 본 발명에 따른 하나 이상의 링커-약물 화합물이 접합되는 폴리펩티드, 즉 일반식 (I)의 하나 이상의 링커-약물 화합물이 접합되는 폴리펩티드를 지칭한다.
전형적으로, 본 발명에 따른 억제제 접합체는 수용체, 수용체 복합체, 항원, 효소, 또는 비정상 또는 악성 세포 집단과 관련되지만 바람직하게는 건강한 세포 집단과 관련되지 않거나 거의 관련되지 않은 또 다른 모이어티와 결합하거나, 반응적으로 회합하거나, 복합체화하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 억제제 접합체 내의 폴리펩티드는 비정상 또는 악성 세포 집단에 본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 표적화하는 수단으로 작용한다. 적합한 폴리펩티드는 항체, 이의 항원 결합 단편, 효소 억제제, 효소 기질, 수용체 리간드 및 융합 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 적합한 폴리펩티드에 존재하는 반응성 천연 아미노산 잔기, 예컨대 리신 또는 시스테인을 통해 또는 N-말단 또는 C-말단을 통해 적합한 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 대안적으로, 천연 또는 비천연의 반응성 아미노산 잔기는 적합한 폴리펩티드로 유전자조작될 수 있거나 번역후 변형을 통해 도입될 수 있다. 추가로, 적합한 폴리펩티드가 당단백질인 경우, 본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 기존 글리칸을 통해 당단백질에 접합될 수 있다.
본 발명에 따른 억제제 접합체에 포함될 때의 본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 억제제 접합체에 포함되지 않을 때의 본 발명에 따른 동일한 화합물과 비교하여 특정 원자 또는 원자 그룹이 결여될 수 있고, 예컨대 수소 원자가 결여될 수 있음을 이해해야 한다. 이는, 예컨대 본 발명에 따른 링커-약물 화합물이 예컨대 하이드록실 모이어티에 대한 에스테르화를 통해 폴리펩티드에 접합되기 때문일 수 있다.
바람직하게는, 본원에 사용된 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 본 발명에 따른 링커-약물 화합물을 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (III)의 ADC에 관한 것이다:
Ab-(L-D)y (III)
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
L-D는 본 발명에 따른 링커-약물 화합물이고;
y는 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 10의 평균적인 항체에 대한 약물의 비율(DAR)을 나타낸다.
당업계에 널리 공지된 바와 같이, DAR 및 약물 부하 분포는, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 결정될 수 있다. HIC는 평균 DAR을 결정하는 데 특히 적합하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물이 항체 또는 항원 결합 단편의 시스테인 잔기를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된 화학식 (III)의 ADC에 관한 것이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 ADC에 관한 것이다:
Figure pct00081
Figure pct00082
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
y는 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 10의 평균 DAR을 나타낸다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 ADC에 관한 것이다:
Figure pct00083
상기 식에서,
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
y는 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 10의 평균 DAR을 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 상기 ADC 화학식에서 Ab는 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 바람직하게는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체를 지칭한다. 일반적으로, 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편은 치료 활성을 갖는 것이지만, ADC 분야에 공지된 바와 같이 이러한 독립적인 효능이 반드시 요구되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 사용되는 항체는 IgA, IgE, IgG 또는 IgM 항체와 같은 임의의 이소타입의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG 항체이고, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체이다. 항체는 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간화 또는 인간 항체이다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 인간화 또는 인간 IgG 항체, 보다 바람직하게는 인간화 또는 인간 IgG1 mAb이다. 항체는 κ(카파) 또는 λ(람다) 경쇄, 바람직하게는 κ(카파) 경쇄, 즉 인간화 또는 인간 IgG1-κ 항체를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 또는 환원된 IgG(rIgG) 단편, 단일 쇄(sc) 항체, 단일 도메인(sd) 항체, 디아바디 또는 미니바디를 포함한다.
비인간(예컨대, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래되는 최소 서열을 함유하는 항체(예컨대, 비인간-인간 키메라 항체)이다. 비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 가변 영역(VR)에 있는 항원 결합 상보성 결정 영역(CDR)은 비인간 종, 일반적으로 마우스, 래트 또는 토끼로부터의 항체로부터 유래된다. 이러한 비인간 CDR은 항체의 기능적 특성, 예컨대 결합 친화성 및 특이성은 적어도 부분적으로 유지되는 방식으로 HC 및 LC의 가변 영역의 인간 프레임워크 영역(FR, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4)과 조합된다. 인간 FR 내의 선택된 아미노산은 낮은 면역원성을 유지하면서 결합 친화성을 개선하는 것과 같이 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 상응하는 원래의 비인간 종 아미노산으로 교환될 수 있다. 따라서, 인간화 가변 영역은 전형적으로 인간 불변 영역과 조합된다. 비인간 항체의 인간화를 위한 예시적인 방법은 윈터(Winter) 및 동료들의 방법이다(Jones et al, Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al, Nature 1988, 332, 323-327; Verhoeyen et al, Science 1988, 239, 1534-1536). 대안적으로, 비인간 항체는 인간에서 자연적으로 생성되는 항체 변이체와의 유사성을 증가시키기 위해 아미노산 서열을 변형함으로써 인간화될 수 있다. 예컨대, 원래 비인간 종 FR의 선택된 아미노산은 항체의 결합 친화성을 유지하면서 면역원성을 줄이기 위해 상응하는 인간 아미노산으로 교환된다. 더 자세한 내용은 문헌(Jones et al, Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al, Nature 1988, 332, 323-327; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596)을 참조한다. 또한 하기 리뷰 기사 및 이에 인용된 참조문헌을 참조한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1998, 1, 105-115; Harris, Biochem. Soc. Transactions 1995, 23, 1035-1038; and Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 1994, 5, 428-433.
CDR은 카바트(Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)), 초티아(Chothia et al, Nature 1989, 342, 877-883) or IMGT(Lefranc, The Immunologist 1999, 7, 132-136)의 접근법을 이용하여 결정될 수 있다.
전형적으로, 항체는, 항원 표적, 바람직하게는 내재화되거나 내재화되지 않을 수 있는, 바람직하게는 내재화될 수 있는 막 결합 항원 표적에 결합하는 적어도 하나의 HC 및 LC 가변 영역을 포함하는, 단일특이적(즉, 하나의 항원에 특이적; 이러한 항원은 종 간에 공통적이거나 종 간에 유사한 아미노산 서열을 가질 수 있음) 또는 이중특이적(즉, 종의 2개의 상이한 항원에 대해 특이적) 항체이다.
하나의 특정 실시양태에서, 항원 표적은 아넥신 Al, B7H3, B7H4, BCMA, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242(암 항원 242), CAIX, CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30 (종양 괴사 인자 8), CD33, CD37, CD38(사이클릭 ADP 리보스 히드롤라제), CD40, CD44, CD47(인테그린 관련된 단백질), CD56(신경 세포 부착 분자), CD70, CD71, CD73, CD74, CD79, CD115(콜로니 자극 인자 1 수용체), CD123(인터류킨-3 수용체), CD138(신데칸 1), CD203c(ENPP3), CD303, CD333, CDCP1, CEA, CEACAM, 클라우딘 4, 클라우딘 7, CLCA-1(C형 렉틴-유사 분자-1), CLL 1, c-MET(간세포 성장 인자 수용체), 크립토, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EphA2, EPhB3, ETBR (엔도텔린 B형 수용체), FAP, FcRL5(Fc 수용체-유사 단백질 5, CD307), FGFR3, FOLR1(폴레이트 수용체 알파), FRbeta, GCC(구아닐릴 사이클라제 C), GD2, GITR, GLOBO H, GPA33, GPC3, GPNMB, HER2, p95HER2, HER3, HMW-MAA(고분자량 흑색종 관련된 항원), 인테그린 α(예컨데, αvβ3 및 αvβ5), IGF1R, TM4SF1(L6), 루이스 A 유사 탄수화물, 루이스 X, 루이스 Y(CD174), LGR5, LIV1, 메소텔린(MSLN), MN(CA9), MUC1, MUC16, NaPi2b, 넥틴-4, 노치3, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, 5T4 (또는 TPBG, 영양막 당단백질), TF(조직 인자, 트롬보플라스틴, CD142), TF-Ag, Tag72, TNF알파, TNFR, TROP2 (종양 관련된 칼슘 신호 변환기 2), uPAR, VEGFR 및 VLA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합한 항체의 예는 블리나투모맙(CD19), 에프라투주맙(CD22), 이라투무맙 및 브렌툭시맙(CD30), 바다스툭시맙(CD33), 테툴루맙(CD37), 이사툭시맙(CD38), 비바투주맙(CD44), 로르보투주맙(CD56), 보르세투주맙(CD70), 밀라투주맙(CD74), 폴라투주맙(CD79), 로발피투주맙(DLL3), 푸툭시맙(EGFR), 오포르투주맙(EPCAM), 파를레투주맙(FOLR1), 글렘바투무맙(GPNMB), 트라스투주맙, 페르투주맙 및 마르게툭시맙(HER2), 에타라시주맙(인테그린), 아네투맙(메소텔린), 판코맙(MUC1), 엔포르투맙(넥틴-4), 및 H8, A1 및 A3(5T4)을 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 적용 가능한 경우, (1) 조작된 불변 영역(즉, 하나 이상의 돌연변이가, 예컨대 반감기를 증가시키고/시키거나, 링커-약물에 대한 부착 부위를 제공하고/하거나, 이펙터 기능을 증가 또는 감소시키기 위해 도입될 수 있었음); 또는 (2) 조작된 가변 영역(즉, 하나 이상의 돌연변이가, 예컨대 링커-약물에 대한 부착 부위를 제공하기 위해 도입될 수 있었음)을 포함할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합적으로, 합성적으로, 또는 다른 공지된 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 ADC는 야생형 또는 부위 특이적 또는 이들의 조합일 수 있으며, 하기 예시된 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 ADC의 제조 방법
야생형 ADC는, 예컨대 항체의 리신 ε-아미노기를 통해, 바람직하게는 활성화된 에스테르와 같은 아민 반응기를 포함하는 링커-약물을 사용하여 링커-약물을 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합시킴으로써 생성될 수 있고; 활성화된 에스테르와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 접촉은 ADC를 생성할 것이다. 대안적으로, 야생형 ADC는 당업계에 공지된 방법 및 조건을 사용하여 쇄간 디술파이드 결합의 환원을 통해 생성되는 시스테인의 측쇄의 유리 티올을 통해 링커-약물을 접합시킴으로써 생성될 수 있다. 예컨대, 문헌(Doronina et al, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124)을 참조한다. 제조 공정은 용매 노출된 쇄간 디술파이드의 부분적 환원에 이어 말레이미드 함유 링커 약물, 알파-할로아세트산 아미드 또는 에스테르와 같은 마이클(Michael) 수용체 함유 링커-약물로 생성된 티올의 변형을 수반한다. 시스테인 부착 전략은 환원된 디술파이드당 최대 2개의 링커-약물을 생성한다. 대부분의 인간 IgG 분자는 4개의 용매 노출된 디술파이드 결합을 가지므로 항체당 0 내지 8개의 정수 범위의 링커-약물이 가능하다. 항체당 링커-약물의 정확한 수는 디술파이드 환원 정도 및 이어지는 접합 반응에 사용되는 링커-약물의 몰 당량 수에 의해 결정된다. 모든 4개의 디술파이드 결합의 완전한 환원은 항체당 8개의 링커-약물을 갖는 균질한 구조를 제공하는 반면, 부분적 환원은 전형적으로 항체당 0, 2, 4, 6 또는 8개의 링커-약물을 갖는 비균질 혼합물을 생성한다.
부위 특이적 ADC는 바람직하게는 돌연변이된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적합한 위치에서 조작된 시스테인 잔기의 측쇄를 통해 링커-약물을 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합시킴으로써 생성된다. 조작된 시스테인은 일반적으로 디술파이드를 형성하기 위해 시스테인 또는 글루타티온과 같은 다른 티올에 의해 캡핑된다. 이러한 캡핑된 잔기는 링커-약물 부착이 발생하기 전에 캡핑을 제거해야 한다. 조작된 잔기에 대한 링커-약물 부착은 (1) 천연 쇄간 및 돌연변이 디술파이드를 둘 다 환원시킨 다음, CuSO4 또는 데히드로아스코르브산과 같은 온화한 산화제를 사용하여 천연 쇄간 시스테인을 재산화시키고, 이어서 캡핑 제거된 시스테인을 링커-약물과 표준 접합시켜 달성되거나, (2) 쇄간 디술파이드 결합보다 높은 비율로 돌연변이 디술파이드를 환원시키는 온화한 환원제를 사용한 후, 캡핑 제거된 조작된 시스테인을 링커-약물과 표준 접합시켜 달성된다. 최적 조건 하에서, (하나의 시스테인이 항체 또는 단편의 HC 또는 LC로 조작되는 경우) 항체 또는 이의 항원 결합 단편당 2개의 링커-약물(즉, DAR은 2임)이 부착될 것이다. 링커-약물을 부위 특이적으로 접합시키기에 적합한 방법은, 예컨대 환원 및 재산화 공정을 기재하는 WO 2015/177360, 온화한 환원제를 사용하는 방법을 기재하는 WO 2017/137628 및 환원된 쇄간 시스테인 및 캡핑 제거된 조작된 시스테인 둘 다를 접합시키는 방법을 기재하는 WO 2018/215427에서 찾아질 수 있다.
약학 조성물
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물 또는 억제제 접합체를 포함하는 조성물을 제공하며, 바람직하게는 조성물은 약학 조성물이고, 보다 바람직하게는 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 이러한 조성물은 이하에서 본 발명에 따른 조성물로 지칭된다. 조성물은, 예컨대 액체 제형, 동결건조 제형, 또는 예컨대 캡슐 또는 정제의 형태일 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 링커-약물 화합물과 같은 캡슐 또는 정제 형태의 소분자를 포함하는 약학적 제형은 희석제를 포함한다. 적합한 수용성 희석제는 슈가, 슈가 알콜, 다당류 및 사이클로덱스트린을 포함한다. 적합한 비수용성 희석제는 인산칼슘, 황산칼슘, 전분, 변형된 전분 및 미정질 셀룰로스를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 링커-약물 화합물과 같은 소분자를 포함하는 약학적 제형은 결합제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제는 젤라틴, 셀룰로스 유도체, 가교된 폴리비닐피롤리돈(크로스포비돈) 또는 코폴리비돈과 같은 중합체, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 본 발명에 따른 링커-약물 화합물과 같은 소분자를 포함하는 약학적 제형은 붕해제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 붕해제는 크로스포비돈 및 가교된 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨(크로스카멜로스 나트륨) 및 나트륨 전분 글리콜레이트와 같은 가교된 중합체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 링커-약물 화합물과 같은 소분자를 포함하는 약학적 제형은 발연 실리카, 활석 및 탄산마그네슘과 같은 활택제; 활석 또는 실리카, 식물성 스테아린, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산과 같은 윤활제; 항산화제 또는 파라벤과 같은 보존제; 착색제; 감미제 및/또는 풍미제를 포함할 수 있다.
전형적으로, 본 발명에 따른 억제제 접합체, ADC 또는 링커-약물 화합물을 포함하는 약학 조성물은 정맥내 주입 전에 (수성) 용해(즉, 재구성)를 필요로 하는 동결건조된 케이크(동결건조된 분말) 또는 사용하기 전에 해동이 필요로 하는 냉동(수성) 용액의 형태를 취한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 링커-약물 화합물 또는 억제제 접합체를 포함하는 동결건조된 조성물을 제공하며, 바람직하게는 조성물은 약학 조성물이고, 보다 바람직하게는 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 물 및 본 발명에 따른 링커-약물 화합물 또는 억제제 접합체를 포함하는 냉동 조성물을 제공하며, 바람직하게는 조성물은 약학 조성물이고, 보다 바람직하게는 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 이와 관련하여, 냉동 용액은 바람직하게는 대기압 하에 있고, 냉동 용액은 바람직하게는 0℃ 미만의 온도에서 본 발명에 따른 액체 조성물을 동결함으로써 수득되었다. 본 발명에 따른 약학 조성물에 (동결 건조 전) 포함시키기에 적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 버퍼 용액(예컨대, 시트레이트, 히스티딘과 같은 아미노산, 또는 물에 염을 함유하는 숙시네이트), 동결보호제(예컨대, 수크로스, 트레할로스), 장성 개질제(예컨데, 염화나트륨과 같은 클로라이드 염), 계면활성제(예컨데, 폴리소르베이트) 및 증량제(예컨데, 만니톨, 글리신)를 포함한다. 동결 건조된 단백질 제형에 사용되는 부형제는 동결 건조 공정 뿐만 아니라 저장 동안 단백질 변성을 방지하는 능력에 따라 선택된다.
의학 용도
추가 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 암, 자가면역 또는 감염성 질환의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 링커-약물 화합물, 억제제 접합체(바람직하게는 항체-약물 접합체), 또는 조성물을 제공한다. 이들 링커-약물 화합물, 접합체 및 조성물은 이하에서 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물로 집합적으로 지칭된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양의 치료에 사용하기 위한 것이다.
제2 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
제3 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 다른 감염과 같은 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 맥락에서 암은 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물이 지시되는 항원을 발현하는 종양이다. 이러한 종양은 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양일 수 있다. 상기 정의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물로 치료될 수 있는 종양 또는 혈액학적 악성종양의 예는 유방암; 뇌암(예컨대, 교모세포종); 두경부암; 갑상선암; 이하선암; 부신암(예컨대, 신경모세포종, 부신경절종 또는 크롬친화세포종); 골암(예컨대, 골육종); 연조직 육종(STS); 안구암(예컨대, 포도막 흑색종); 식도암; 위암; 소장암; 대장암; 요로상피세포암(예컨대, 방광암, 음경암, 요관암 또는 신장암); 난소암; 자궁암; 질암, 외음부암 및 자궁경부암; 폐암(특히 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)); 흑색종; 중피종(특히 악성 흉막 및 복부 중피종); 간암(예컨대, 간세포 암종); 췌장암; 피부암(예컨대, 기저종, 편평 세포 암종 또는 융기성 피부섬유육종); 고환암; 전립선암; 급성 골수성 백혈병(AML); 만성 골수성 백혈병(CML); 만성 림프성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 골수이형성 증후군(MDS); 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN); 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종(NHL)(여포성 림프종(FL), CNS 림프종 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 포함); 경쇄 아밀로이드증; 형질 세포 백혈병; 및 다발성 골수종(MM)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 맥락에서 자가면역 질환은 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물이 지시되는 항원과 관련된 자가면역 질환이다. 자가면역 질환은 정상적인 체세포 및 조직에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 병태를 나타낸다. 자가면역 질환에는 적어도 80가지 유형의 다양한 종류가 있다. 일부 질환은 기관 특이적이며, 특정 조직에 영향을 미치는 것으로 제한되는 반면, 다른 질환은 전신의 많은 조직에 영향을 미치는 전신 염증성 질환과 유사하다. 이러한 징후 및 증상의 출현 및 중증도는 발생하는 염증 반응의 위치 및 유형에 따라 다르며 시간이 지남에 따라 변동될 수 있다. 상기 정의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물로 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예는 류마티스성 관절염; 연소성 피부근육염; 건선; 건선성 관절염; 루프스; 유육종증; 크론 질환; 습진; 신장염; 포도막염; 다발근염; 길랭-바레 증후군을 포함하는 신경염; 뇌염; 지주막염; 전신 경화증; 자가면역 매개된 근골격 및 결합 조직 질환; 알츠하이머 질환, 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 시신경척수염, 및 대, 중, 소혈관 가와사키 및 헤노흐 쇤라인 혈관염을 포함하는 신경근 퇴행성 질환; 한랭 및 온열 응집소 질환; 자가면역 용혈성 빈혈; 1형 진성 당뇨병; 하시모토 갑상선염; 그레이브스 질환; 그레이브스 눈병증; 부신염; 뇌하수체염; 심상성 천포창; 애디슨 질환; 강직성 척추염; 베체트 증후군; 복강 질환; 굿파스처 증후군; 중증 근무력증; 유육종증; 경피증; 원발성 경화성 담관염, 표피박리성 수포성 천포창, 및 수포성 유천포창을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 치료되는 자가면역 질환은 류마티스 관절염이다.
본 발명의 맥락에서 감염성 질환은 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물이 지시되는 항원과 관련된 감염성 질환이다. 이러한 감염성 질환은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 다른 감염일 수 있다. 상기 정의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물로 치료될 수 있는 감염성 질환의 예는 말라리아; 톡소플라스마증; 뉴모시스티스 지로베시이 멜리오이도시스(pneumocystis jirovecii melioidosis); 세균성 이질; 리스테리아; 사이클로스포라; 미코박테리움 나병; 결핵; 및 면역 손상된 개체, 예컨대 HIV 양성 개체, 면역억제 치료를 받는 개체, 또는 낭포성 섬유증 또는 양성 증식성 질환(예컨데, 포상기태 또는 자궁내막증)과 같은 선천성 오류를 갖는 개체의 감염 예방을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 본원에 기재된 바와 같은 약제의 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 바람직하게는 사용하기 위한 산물이 치료학적 유효량으로 대상체, 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 치료 방법을 위한 것이다. 따라서, 대안적으로 또는 임의의 다른 실시양태와 조합하여, 일 실시양태에서, 본 발명은 암, 자가면역 또는 감염성 질환의 치료, 특히 암 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 치료될 예시적이고 비제한적인 암 또는 다른 질환에 대해서는 상기를 참조한다.
대안적으로, 또는 임의의 다른 실시양태와 조합하여, 일 실시양태에서, 본 발명은 암, 자가면역 또는 감염성 질환, 특히 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 방법은 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 예시적이고 비제한적인 암 또는 다른 질환에 대해서는 상기를 참조한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 기재된 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유동물로 분류되는 모든 동물을 지칭하며, 영장류 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대상체는 바람직하게는 인간이다. 표현 "치료학적 유효량"은 원하는 반응을 일으키거나 증상 또는 징후를 완화시키기에 충분한 양을 의미한다. 특정 대상체에 대한 치료학적 유효량은 치료되는 병태, 대상체의 전반적인 건강, 투여 방법, 경로 및 용량 및 부작용의 중증도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물을 제공하며, 사용은 1종 이상의 다른 치료제와 조합된다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 산물은 1종 이상의 다른 치료제와 공동으로 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
적합한 화학치료제는 질소 머스타드, 히드록시우레아, 니트로소우레아, 테트라진(예컨데, 테모졸로마이드) 및 아지리딘(예컨데, 미토마이신)과 같은 알킬화제; PARP 억제제, ATR 및 ATM 억제제, CHK1 및 CHK2 억제제, DNA-PK 억제제, 및 WEE1 억제제와 같은 DNA 손상 반응을 방해하는 약물; 항엽산제(예컨데, 페메트렉세드), 플루오로피리미딘(예컨데, 젬시타빈), 데옥시뉴클레오시드 유사체 및 티오퓨린과 같은 항대사산물; 빈카 알칼로이드 및 탁산과 같은 항미소관제; 토포이소머라제 I 및 II 억제제; 안트라사이클린 및 블레오마이신과 같은 세포독성 항생제; 데시타빈 및 아자시티딘과 같은 저메틸화제; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 올트랜스 레티노산; 및 삼산화비소를 포함한다. 적합한 방사선 치료제는 131I-메타요오도벤질구아니딘(MIBG), 인산나트륨으로서의 32P, 223Ra 클로라이드, 89Sr 클로라이드 및 153Sm 디아민 테트라메틸렌 포스포네이트(EDTMP)와 같은 방사성 동위원소를 포함한다. 호르몬 치료제로 사용하기에 적합한 작용제는 아로마타제 억제제 및 GnRH 유사체와 같은 호르몬 합성 억제제; 선택적 에스트로겐 수용체 조정제(예컨데, 타목시펜 및 풀베스트란트)와 같은 호르몬 수용체 길항제 및 비칼루타미드, 엔잘루타미드 및 플루타미드와 같은 항안드로겐; 아비라테론과 같은 CYP17A1 억제제; 및 소마토스타틴 유사체를 포함한다.
표적 치료제는 종양형성 및 증식에 관여하는 특정 단백질을 방해하는 치료제이며 소분자 약물일 수 있다. 소분자 약물; 치료 항체와 같은 단백질; 펩티드 및 펩티드 유도체; 또는 ADC와 같은 단백질-소분자 하이브리드일 수 있다. 표적 소분자 약물의 예에는 에베롤리무스, 템시롤리무스 및 라파마이신과 같은 mTor 억제제; 이마티닙, 다사티닙 및 닐로티닙과 같은 키나제 억제제; 소라페닙 및 레고라페닙과 같은 VEGF 억제제; 게피티닙, 라파티닙 및 에를로티닙과 같은 EGFR/HER2 억제제; 및 팔보시클립, 리보시클립 및 아베마시클립과 같은 CDK4/6 억제제를 포함한다. 펩티드 또는 펩티드 유도체 표적 치료제의 예는 보르테조밉 및 카르필조밉과 같은 프로테아좀 억제제를 포함한다.
적합한 항염증 약물은 D-페니실라민, 아자티오프린 및 6-메르캅토퓨린, 사이클로스포린, 항-TNF 생물제제(예컨대, 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 골리무맙, 세르톨리주맙 또는 세르톨리주맙 페골), 렌플루노마이드, 아바타셉트, 토실리주맙, 아나킨라, 우스테키누맙, 리툭시맙, 다라투무맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 세쿠키누맙, 아프레밀라스트, 아세트레틴 및 JAK 억제제(예컨데, 토파시티닙, 바리시티닙 또는 우파다시티닙)을 포함한다.
면역치료제는 면역 반응을 유도, 향상 또는 억제하는 작용제, 예컨대 시토카인(IL-2 및 IFN-α); 면역 조정 이미드 약물, 예컨대 탈리도마이드, 레날리도마이드, 포말리도마이드 또는 이미퀴모드; 치료 암 백신, 예컨대 탈리모겐 라헤르파렙벡; 세포 기반 면역치료제, 예컨대 수지상 세포 백신, 입양 T 세포 또는 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포; 및 세포 상의 막 결합 리간드에 결합할 때 Fc 영역을 통해 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식세포작용(ADCP) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 유발할 수 있는 치료 항체를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 치료는 바람직하게는 암, 자가면역 또는 감염성 질환을 예방, 복귀, 치유, 개선 및/또는 지연시키는 것이다. 이는 암, 자가면역 또는 감염성 질환의 적어도 하나의 증상의 중증도가 감소되었고/되었거나 적어도 암, 자가면역 또는 감염성 질환과 관련된 파라미터가 개선되었음을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 파라미터는 폴레이트 활성과 관련된다.
본 발명의 맥락에서, 대상체는 생존할 수 있고/있거나 질환이 없는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 질환 또는 병태는 중지되었거나 지연되었을 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 삶의 질의 개선 및 관찰된 통증 완화는 대상체가 치료 시작 시보다 적은 통증 완화 약물을 필요로 할 수 있음을 의미할 수 있다. 이와 관련하여 "적은"은 5% 미만, 10% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 90% 미만을 의미할 수 있다. 대상체는 더 이상 완화 약물을 필요로 하지 않을 수 있다. 이러한 삶의 질 향상 및 관찰된 통증 완화는 대상체에서 치료한 지 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 초과 후에 나타나거나, 검출되거나, 평가되고, 상기 대상체의 치료 시작 시의 삶의 질 및 관찰된 통증 경감과 비교될 수 있다.
일반 정의
본 발명에 따른 링커-약물 화합물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 함유할 수 있으므로, 이중 결합 이성질체(즉, 기하 이성질체), 위치이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체와 같은 입체이성질체로 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 묘사된 화학 구조는 입체이성질체적으로 순수한 형태(예컨대, 기하학적으로 순수한, 거울상이성질체적으로 순수한, 또는 부분입체이성질체적으로 순수한 형태) 및 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물을 포함하는 예시되거나 확인된 화합물의 모든 가능한 거울상이성질체 및 입체이성질체를 포함한다. 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물은 당업자에게 널리 공지된 분리 기술 또는 키랄 합성 기술을 이용하여 이들의 성분 거울상이성질체 또는 입체이성질체로 분해될 수 있다. 화합물은 또한 에놀 형태, 케토 형태 및 이들의 혼합물을 포함하는 여러 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 묘사된 화학 구조는 예시되거나 확인된 화합물의 모든 가능한 호변이성질체 형태를 포함한다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 기하이성질체와 같은 일부 이성질체 형태는 당업자에 의해 물리적 및/또는 화학적 방법에 의해 분리될 수 있음이 또한 이해된다. 구조식 또는 화학명이 키랄 중심을 갖는 것으로 당업자에 의해 이해되지만 키랄성이 표시되지 않는 경우, 각각의 키랄 중심에 대해, 라세미 혼합물, 순수한 R 거울상이성질체 및 순수한 S 거울상이성질체의 세 가지 모두가 개별적으로 언급된다. 화합물의 구조가 특정 거울상이성질체로 묘사되는 경우, 본원의 발명은 특정 거울상이성질체로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 2개의 모이어티가 함께 결합을 형성한다고 말할 때, 이는 원자로서의 이러한 모이어티의 부재 및 대체 전자 결합에 의해 충족되는 원자가의 준수를 의미한다. 이 모든 것은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서 및 청구범위에 개시된 화합물은 엑소 및 엔도 위치이성질체로서 추가로 존재할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 임의의 화합물의 설명은 화합물의 개별 엑소 및 개별 엔도 위치이성질체 뿐만 아니라 이들의 혼합물을 모두 포함하는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서 및 청구범위에 개시된 화합물은 시스 및 트랜스 이성질체로 존재할 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 임의의 화합물의 설명은 화합물의 개별 시스 및 개별 트랜스 이성질체 뿐만 아니라 이들의 혼합물을 모두 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 화합물의 구조가 시스 이성질체로 묘사되는 경우, 상응하는 트랜스 이성질체 또는 시스와 트랜스 이성질체의 혼합물이 본원의 발명으로부터 배제되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 이의 활용형은 비제한적 의미로 단어 뒤에 오는 항목이 포함되고 구체적으로 언급되지 않은 항목이 제외되지 않는다는 것을 의미하도록 사용된다. 또한, 단수 형태의 요소에 대한 언급은 문맥 상 오직 하나의 요소가 존재하도록 명확하게 요구되지 않는 한 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수 형태는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
수치와 관련하여 사용될 때 단어 "약" 또는 "대략"(예컨대, 약 10)은 바람직하게는 그 값이 주어진 값의 1% 이상 또는 이하일 수 있음을 의미한다.
본 발명의 맥락에서 물질의 파라미터가 논의될 때마다, 달리 명시되지 않는 한 파라미터를 생리학적 조건 하에서 결정, 측정 또는 나타내는 것으로 가정된다. 생리학적 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 수성 용매 시스템, 대기압, 6 내지 8의 pH 값, 실온(RT) 내지 약 37℃ 범위의 온도(약 20℃ 내지 약 40℃), 및 버퍼 염 또는 다른 성분의 적절한 농도를 포함한다. 전하는 종종 평형과 관련이 있는 것으로 이해된다. 전하를 운반하거나 갖는다고 하는 모이어티는 이러한 전하를 갖거나 운반하지 않는 것보다 더 자주 이러한 전하를 갖거나 운반하는 상태에서 발견될 모이어티이다. 이와 같이, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에서 하전되는 것으로 표시된 원자는 특정 조건 하에서 하전되지 않을 수 있고, 중성 모이어티는 특정 조건 하에서 하전될 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참조문헌은 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
하기 실시예는 예시 목적으로만 제공되며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
일반
사용된 모든 용매는 다양한 공급업체의 시약 등급 또는 HPLC 등급이었다. NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) AVANCE400(1H의 경우 400 MHz; 13C의 경우 100 MHz)에서 기록되었다. 화학적 이동은 내부 표준으로서 테트라메틸실란 또는 중수소화되지 않은 잔류 용매에 대한 ppm으로 보고된다. 역상 C18 브릿징된 에틸실록산-실리카 하이브리드 컬럼(Waters ACQUITY UPLC® BEH C18 1.7 μm 입자 크기, 2.1x50 mm)을 갖는 워터스(Waters) UPLC-MS(ESI, SQ-검출기 3100이 장착됨)를 사용하여 0.4 mL/min(아세토니트릴(MeCN) / 물 x 0.1% 포름산(FA))의 유속으로 질량 스펙트럼을 기록하였다. 분취용 HPLC에 의한 정제는 워터스 선파이어 프렙(Waters SunFire Prep) C18 OBD 5 μm 컬럼 (19x150 mm)이 장착된 시마주 프로미넌스(Shimadzu Prominence) 20AP 시스템을 사용하여 17 mL/min(MeCN / 물 x 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA))의 유속으로 수행되었다. 마이크로웨이브 반응은 바이오테이지 이니시에이터+(Biotage Initiator+) 기구에서 수행되었다.
ADC의 특징규명을 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
분석용 HIC를 위해, 5-10 μL의 샘플(1 mg/mL)을 TSK겔 부틸-NPR(TSKgel Butyl) 컬럼(4.6 mm ID x 3.5cm L, Tosoh Bioscience, 카달로그 번호 14947)에 주입하였다. 용출 방법은 20분에 걸쳐 0.4 mL/min으로 100% 버퍼 A(25 mM 인산나트륨, 1.5 M 황산암모늄, pH 6.95)로부터 100% 버퍼 B(25 mM 인산나트륨, pH 6.95, 20% 이소프로판올)까지의 선형 구배로 이루어졌다. PDA 검출기 및 엠파워(Empower) 소프트웨어가 장착된 워터스 액퀴티 H-클래스(Waters Acquity H-Class) UPLC 시스템이 사용되었다. 214 nm에서 흡광도를 측정하고, ADC의 보유 시간을 결정하였다.
ADC 특징규명을 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
분석용 SEC를 위해, 5 μL의 샘플(1 mg/mL)을 TSK겔 SWXL 거드(TSKgel SWXL Guard) 컬럼(7 μm, 6.0 mm ID x 4.0 cm L, Tosoh Bioscience, 카달로그 번호 08543)이 장착된 TSK겔 G3000SWXL 컬럼(5 μm, 7.8 mm ID x 30 cm L, Tosoh Bioscience, 카달로그 번호 08541)에 주입하였다. 용출 방법은 30분 동안 0.6 mL/min으로 100% 50 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.5를 사용하여 용출하는 것으로 이루어졌다. 컬럼 온도는 25℃로 유지되었다. PDA 검출기 및 엠파워 소프트웨어가 장착된 워터스 액퀴티 H-클래스 UPLC 시스템이 사용되었다. HMW 종의 양을 정량화하기 위해 214 nm에서 흡광도를 측정하였다.
일반 절차 XXA: HATU 보조된 아미드 커플링
카르복실산(1.0 eq) 및 아민 (1.0-1.5 eq)을 디메틸포름아미드(DMF; 0.175 M)에 용해시켰다. 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(헥사플루오로포스페이트 아자벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄, HATU; 1.2 eq) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA; 6.0 eq)를 RT에서 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 농축시킨 후, 생성물을 지시된 바와 같이 메탄올(MeOH)로부터 재결정화시키거나 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다.
일반 절차 XXB: Pd/C 및 수소를 사용한 페닐 아지드의 환원
N2 하에 DMF(0.074 M) 중의 아지드(1.0 eq) 용액에 10 wt%의 "활성탄 상 10 wt%의 팔라듐"를 첨가하였다. 혼합물을 수소 기체로 퍼징하고, UPLC 분석이 완전한 전환을 나타낼 때까지(~45분) 격렬하게 교반하였다. 반응물을 N2로 퍼징하고, Celite® 상에서 여과시켰다. 여액을 지시된 바와 같이 진공 하에 농축시키고 정제하였다.
일반 절차 XXC: 포름아미드 탈보호 및/또는 에스테르 가수분해
에스테르(1.0 eq)를 메탄올/디메틸 술폭사이드(MeOH/DMSO; 5:1, 0.36 M)에 용해/현탁시키고, 0℃로 냉각시켰다. 수성 NaOH(2.0 M, 3-24 eq)를 적가하고, 생성된 용액을 UPLC 분석에 의해 완료될 때까지(1-6시간) RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고(~4x), 0℃로 냉각시킨 후, pH를 수성 HCl(1.0 M)로 pH ~8.5로 조정하였다. 침전이 발생하지 않으면, 용액을 에틸 아세테이트(EtOAc; 3x)로 세척하였다. 현탁액의 경우, 이 단계가 생략되었다. 수상을 물(~3x)로 추가로 희석시키고, pH를 수성 아세트산(AcOH; 1.0 M)으로 대략 pH 4.7로 조정하였다. 생성된 현탁액을 30분 동안 격렬하게 교반하고 여과시켰다. 때때로, 젤라틴성 혼합물이 수득되고, 히트 건으로 완만하게 가열한 다음, 현탁액을 수득하였다. 고체를 MeOH 및 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켰다.
(S)-5-(4-아지도벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜탄산 ( XX5 ) 및 (S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 ( XX7 )의 제조
Figure pct00084
메틸 (S)-2-아미노-5-(4-아지도벤즈아미도)펜타노에이트 (XX3)
Figure pct00085
티오닐 클로라이드(3.76 mL, 51.5 mmol) 및 DMF(5 방울)을 N2 하에 디클로로메탄(DCM; 150 mL) 중의 4-아지도벤조산(7.00 g, 42.9 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 완만한 환류로 가열하고, RT로 냉각시키고, 농축시키고, 고체를 부드럽게 분말로 분해하였다. 분리 플라스크에서, 물(67 mL) 중의 L-오르니틴 히드로클로라이드(L-Orn-OH·HCl) (6.70 g, 38.9 mmol) 및 NaOH(3.11 g, 77.8 mmol)의 용액을 RT에서 물(67 mL) 중의 CuSO4·5H2O(4.86 g, 19.5 mmol)의 용액으로 처리하여 짙은 청색 용액을 생성하였다. 이 용액에 NaHCO3(3.93 g, 46.7 mmol)를 첨가하였다. 일단 용해되면, 암청색 용액을 RT에서 미정제(crude) 고체 4-아지도벤조일 클로라이드(7.78 g, 42.8 mmol)에 직접적으로 붓고, 혼합물을 16시간 동안 RT에서 격렬하게 교반하였다. 현탁액을 여과시키고, 고체를 물(2 x 20 mL), 에탄올(2 x 20 mL) 및 에테르(3 x 40 mL)로 세척하여 4.97 g의 고체를 수득하였다. 물질을 MeOH(140 mL)에 취하고, 티오닐 클로라이드(13.0 mL)를 N2 하에 45분에 걸쳐 0℃에서 첨가하였다. 이어서, 반응물을 18시간 동안 RT에서 교반한 후, 농축시켰다. 이어서, 물질의 일부를 고체상 추출(SPE; Biotage, SCX-2)로 정제하여 XX3(1.20 g)을 왁스성 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00086
MS (ESI+) C13H18N5O3 + [M+H]+에 대한 계산치 292.14, 실측치 292.20.
메틸 4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤조에이트 (XX1)
피리미딘-2,4,5,6-테트라아민 술페이트(6.00 g, 25.2 mmol), 염화바륨 이수화물(6.16 g, 25.2 mmol), 및 물(145 mL)의 혼합물을 90분 동안 RT에서 교반하였다. 혼합물을 70℃로 가온하고, 여과시키고, 여액을 RT로 냉각시키고, pH를 10% NaOH(수성)로 pH 3.5로 조정하였다. 이 용액의 일부(116 mL)를 MeCN(43.8 mL) 중의 미정제 메틸 4-(3-브로모-4-옥소부틸)벤조에이트(6.06 g, 21.2 mmol) (문헌(Chen et al, J. Heterocycl. Chem. 2015, 52, 1565-1569)에 기재된 바와 같이 제조됨)와 혼합하고, 이어서 AcOH(34.7 mL)를 RT 수조를 사용하여 교반하면서 첨가하였다. 5분 후, MnO2(11.6 g)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 45분 동안 RT에서 교반하였다. 반응물을 Celite® 상에서 여과시키고, 잔류물을 MeCN/물(7:3)로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 물(125 mL)로 세척하였다. 잔여 물을 MeCN으로 공비적으로 제거시켰다. 이어서, 잔류물을 뜨거운 MeCN(125 mL)으로 2회 분쇄시킨 후, 고체를 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 XX1(1.31 g, 20%)을 갈색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00087
MS (ESI+) C16H17N6O2 + [M+H]+에 대한 계산치 325.14, 실측치 325.12.
4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤조산 (XX2)
에스테르 (XX1)(245 mg, 0.755 mmol)를 2-메톡시에탄올(6 mL)에 현탁시키고, 0.5 N NaOH(수성) (6 mL)를 RT에서 첨가하였다. 현탁액을 24시간 동안 교반한 후, 여과시켰다. 잔류물을 2-메톡시에탄올/물(1:1, 1 mL)로 세척한 후, 여액을 빙 AcOH(0.325 mL)로 pH 4.5로 산성화하였다. 4℃에서 16시간 동안 저장하고, 여과시키고, 고체를 물(2 x 3 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 XX2(140 mg, 60%)를 갈색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00088
MS (ESI+) C15H15N6O2 + [M+H]+에 대한 계산치 311.13, 실측치 311.34.
메틸 (S)-5-(4-아지도벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XX4)
일반 절차 XXA에 따라, 산 XX2(235 mg, 0.757 mmol)를 아민 XX3(243 mg, 0.833 mmol)과 반응시키고, MeOH로부터의 재결정화로 정제하여 에스테르 XX4(321 mg, 73%)를 갈색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00089
MS (ESI+) C28H30N11O4 + [M+H]+에 대한 계산치 584.25, 실측치 584.49.
(S)-5-(4-아지도벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜탄산 (XX5)
NaOH(3 eq)를 사용한 에스테르 XX4(36 mg, 0.062 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하여 산 XX5(27 mg, 75%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00090
MS (ESI+) C27H28N11O4 + [M+H]+에 대한 계산치 570.23, 실측치 570.54.
메틸 (S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XX6)
아지드 XX4(250 mg, 0.482 mmol)의 환원을 일반 절차 XXB에 따라 수행하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 아닐린 XX6(151 mg, 63%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00091
MS (ESI+) C28H32N9O4 + [M+H]+에 대한 계산치558.26, 실측치 558.51.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜탄산 (XX7)
NaOH(3 eq)를 사용한 에스테르 XX6(151 mg, 0.271 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하여 산 XX7(112 mg, 75%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00092
MS (ESI+) C27H30N9O4 + [M+H]+에 대한 계산치 544.24, 실측치 544.52.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) (메틸)아미노)-벤즈아미도)펜탄산 ( XX12 )의 제조
Figure pct00093
4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸)아미노)벤조산 (XX9)
(2,4-디아미노프테리딘-6-일)메탄올 히드로클로라이드(8.80 g, 38.5 mmol)를 뜨거운 물(300 mL)에 용해시켰다. RT로 냉각시킨 후, 수성 NaOH(40 mL, 1.0 M)를 pH >7이 될 때까지 첨가하였다. 여과시키고, 물(2 x 25 mL)로 세척하고, 진공 하에 3시간 동안 RT에서 건조시켰다. 잔여 물을 에탄올(EtOH)로 공비적으로 제거시켰다. 잔류물을 뜨거운 EtOH로 분쇄시키고, RT로 냉각시킨 후, 여과시키고, EtOH(50 mL) 및 에테르(2 x 50 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 (2,4-디아미노프테리딘-6-일)메탄올(6.41 g)을 유리 염기로서 수득하였다. 분리 플라스크에서, 브롬(1.60 mL, 31.2 mmol)을 디메틸아세트아미드(DMA; 13.5 mL) 중의 PPh3(8.19 g, 31.2 mmol)의 냉각된(0℃) 현탁액에 50분에 걸쳐 적가시켰다. 첨가 속도는 내부 온도가 8℃를 초과하지 않는 정도였다. 진한 슬러리를 75분 동안 RT에서 교반하여 오렌지색 슬러리를 수득하였다. 고체 유리 염기 (2,4-디아미노프테리딘-6-일)메탄올(2.00 g, 10.4 mmol)을 첨가하고, 온도를 38℃로 상승시켰다. 혼합물을 24시간 동안 RT에서 교반하고, 이어서 4-(메틸아미노)벤조산(2.36 g, 15.6 mmol)를 첨가한 다음, DIPEA(3.81 mL, 21.9 mmol)를 첨가하였다. 5일 동안 교반하고, 수성 NaOH(136 mL, 0.33 M)에 붓고, DMA(4 mL)를 사용하여 이송을 완료하였다. 물(40 mL)를 첨가하고, 침전물을 여과시켰다. 여액을 물(ca. 25.0 mL) 중의 10% AcOH를 사용하여 pH 4.5로 산성화하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 뜨거운 MeOH(16 mL)로 분쇄시키고, 여과시키고, 잔류물을 디옥산에 현탁시키고, 동결건조시켜 산 XX9(3.55 g, quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00094
MS (ESI+) C15H16N7O2 + [M+H]+에 대한 계산치 326.14, 실측치 326.38.
메틸 (S)-5-(4-아지도벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸) 아미노)벤즈아미도)-펜타노에이트 (XX10)
산 XX9(250 mg, 0.768 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 아민 XX3(323 mg, 1.11 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 에스테르 XX10(434 mg, 94%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00095
MS (ESI+) C28H30N11O4 + [M+H]+에 대한 계산치 584.25, 실측치 584.49.
메틸 (S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸) 아미노)벤즈아미도)-펜타노에이트 (XX11)
아지드 XX10(195 mg, 0.326 mmol)의 환원을 일반 절차 XXB에 따라 수행하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 아닐린 XX11(111 mg, 60%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00096
MS (ESI+) C28H33N10O4 + [M+H]+에 대한 계산치 573.27, 실측치 573.52.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸)아미노) 벤즈아미도)펜탄산 (XX12)
에스테르 XX11(111 mg, 0.194 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하여 산 XX12(72 mg, 66%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00097
MS (ESI+) C27H31N10O4 + [M+H]+에 대한 계산치 559.25, 실측치 559.53.
메틸 (S)-2-아미노-5-(5-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)펜타노에이트 ( XT6 )의 제조
Figure pct00098
5-아미노이소인돌린-1,3-디온 (XT2)
물(25 mL) 중의 NH4Cl(11.1 g, 208 mmol)을 테트라히드로푸란(THF; 75 mL) 중의 화합물 XT1(10.0 g, 52.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 아연 분말(13.6 g, 208 mmol)를 조심스럽게 나누어(발열 주의) 첨가하고, 생성된 현탁액을 1시간 동안 교반하였다. 황색 반응 혼합물을 Celite® 상에서 여과시킨 다음, 메탄올(250 mL)로 세정하고, 진공 하에 농축시켜 크롭 1을 수득하였다. Celite® 케이크를 DMF(40 mL)에 현탁시키고, 밤새 교반한 다음, 여과시키고, 진공 하에 농축시켜 크롭 2를 수득하였다. 크롭 1을 물(50 mL)에서 15분 동안 교반하고, 여과시키고, 케이크를 에테르로 세척하고, 밤새 공기 중에서 건조시켰다. 크롭 2를 에테르(150 mL)에서 밤새 교반하고, 여과시키고, 고체를 물(100 mL)에서 15분 동안 교반하였다. 여과시킨 후, 케이크를 에테르로 세척하고, 고체를 공기 중에서 건조시켰다. 두 배치를 합하여 XT2(12 g, quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C8H7N2O2 + [M+H]+에 대한 계산치 163.05, 실측치 163.06.
N-(1,3-디옥소이소인돌린-5-일)포름아미드 (XT3)
FA(22.2 mL, 578 mmol)를 넣은 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 Ac2O(10.9 mL, 116 mmol)를 천천히 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 이어서, 미세하게 분쇄된 아닐린 XT2(3.75 g, 23.1 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 15분 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 물(25 mL)를 미정제 생성물에 첨가하고, 생성된 현탁액을 15분 동안 교반하였다. 여과시킨 후, 고체를 밤새 공기 중에서 건조시켜 포름아미드 XT3(2.70 g, 14.2 mmol, 61%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00099
MS (ESI+) C9H7N2O3 + [M+H]+에 대한 계산치 191.05, 실측치 191.13.
에틸 5-포름아미도-1,3-디옥소이소인돌린-2-카르복실레이트 (XT4)
DMF(25 mL) 중의 포름아미드 XT3(2.50 g, 13.2 mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 Et3N(1.83 mL, 13.2 mmol)를 첨가한 후, DMF(12.5 mL) 중의 에틸 클로로포르메이트(1.25 mL, 13.2 mmol)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반하였다. DMF(12.5 mL) 중의 추가의 Et3N(1.83 mL, 13.2 mmol) 및 에틸 클로로포르메이트(1.25 mL, 13.2 mmol)를 첨가하고(후자에 대해서는 적가), 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 마지막으로, DMF(6 mL) 중의 Et3N (0.92 mL, 6.6 mmol) 및 에틸 클로로포르메이트(0.625 mL, 6.6 mmol)를 첨가하고, 마지막 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:DCM 0:1 내지 1:0)로 정제하여 포름아미드 XT4(1.4 g, 41%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00100
MS (ESI+) C12H11N2O5 + [M+H]+에 대한 계산치 263.07, 실측치 263.14.
메틸 (S)-2-아미노-5-(5-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)펜타노에이트 ( XT6 )
RT에서 물(9 mL) 중의 L-Orn-OH·HCl(0.835 g, 4.85 mmol) 및 NaOH(0.388 g, 9.71 mmol)의 용액에 물(9 mL) 중의 CuSO4·5H2O(0.606 g, 2.43 mmol)를 첨가하여 짙은 청색 용액을 생성하였다. 이 용액에 NaHCO3(0.489 g, 5.82 mmol) 및 분쇄된 포름아미드 XT4(1.40 g, 5.34 mmol)를 첨가하고, 담청색 현탁액을 4시간 동안 RT에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 고체를 물(2 x 2.5 mL), 에탄올(2 x 2.5 mL) 및 에테르(2 x 2.5 mL)로 세척하고, 밤새 공기 건조시켜 황색/회색 구리 염(1.6 g)을 수득하였다. 물질을 메탄올(45 mL)에 현탁시키고, -20℃로 냉각시켰다. 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 티오닐 클로라이드(4.21 mL, 57.7 mmol)를 45분에 걸쳐 첨가하였다. RT로 가온하고 18시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 톨루엔(12mL)과 함께 공증발시켰다. 미정제 잔류물을 MeOH(4 mL)/EtOAc(3.6 mL)/아세톤(3.6 mL)의 혼합물로 분쇄시키고, 고체를 여과시키고, 에테르(20 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 숙신이미드 XT6(1.50 g, 87%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00101
MS (ESI+) C14H18N3O4 + [M+H]+에 대한 계산치 292.13, 실측치 292.17.
(S)-4-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)-벤조산 ( XT9 ) 및 (S)-5-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)-아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 ( XT10 )의 제조
Figure pct00102
메틸 (S)-5-(5-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)-포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT8)
DMF(10 mL) 중의 산 XT7(470 mg, 1.39 mmol; US　2004/0072837에 기재된 바와 같이 합성됨) 및 Et3N(2.32 mL, 16.6 mmol)의 현탁액에 RT에서 이소부틸 클로로포르메이트(0.182 mL, 1.385 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, 숙신이미드 XT6(499 mg, 1.52 mmol)을 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 추가의 이소부틸 클로로포르메이트(0.091 mL, 0.692 mmol)를 첨가한 다음, 20분 후 숙신이미드 XT6(250 mg, 0.762 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 마지막으로, 추가의 이소부틸 클로로포르메이트(0.045 mL, 0.347 mmol)를 첨가하고, 20분 후 숙신이미드 XT6(125 mg, 0.381 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 농축시킨 후, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 20:80)로 정제하였다. 생성물을 물(6 mL)에 현탁시키고, 여과시키고, 물(2 mL) 및 Et2O(4 mL)로 세척하여 포름아미드 XT8(552 mg, 65%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00103
MS (ESI+) C29H29N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 613.23, 실측치 613.30.
(S)-4-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도) 부틸)카르바모일)-벤조산 (XT9) 및 (S)-5-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)-아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT10)
NaOH(6 eq)를 사용한 포름아미드 XT8(120 mg, 0.196 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 고체를 0.1% TFA를 함유하는 10% 수성 MeCN에 취하고, 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 산 XT9(25 mg, 22%) 및 산 XT10(5 mg, 4% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00104
MS (ESI+) C27H29N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 589.23, 실측치 589.37.
Figure pct00105
MS (ESI+) C27H29N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 589.23, 실측치 589.47.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)-부틸)카르바모일)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸-부탄아미도)프로판아미도)벤조산 ( XT16 ) 및 2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)벤조산 ( XT17 )의 제조
Figure pct00106
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XT11)
0℃에서 피리딘 (5 mL) 중의 숙신이미드 XT8(170 mg, 0.278 mmol)의 현탁액에 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (S)-(1-클로로-1-옥소프로판-2-일)카르바메이트(Fmoc-Ala-Cl, 320 mg, 0.971 mmol) (문헌(Unsworth et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 52, 15794-15798)에 따라 제조됨)를 6개 부분으로 나누어 첨가하였다. MeOH ??칭된 샘플의 UPLC 분석이 완전한 전환을 나타내면, 반응 혼합물을 MeOH(6 mL)로 ??칭시키고, 진공 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 20:80)로 정제하여 아미드 XT11(298 mg, quant)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00107
MS (ESI+) C47H44N11O9 + [M+H]+에 대한 계산치 906.33, 실측치 906.40.
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT12)
25 mL 둥근 바닥 플라스크를 아미드 XT11(250 mg, 0.276 mmol) 및 테트라부틸암모늄플루오라이드 삼수화물(TBAF·3H2O)(178 mg, 0.552 mmol)로 채우고, 플라스크를 N2(최소 3 진공/N2 사이클)로 철저히 퍼징하였다. DMF(6 mL)를 첨가하고, 모든 고체가 용해되면, 데칸티올(0.608 mL, 2.76 mmol)을 RT에서 주사기를 통해 용액에 직접적으로 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 이어서, Boc-Val-OSu(130 mg, 0.414 mmol) 및 DIPEA(0.096 mL, 0.552 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 1.5시간 동안 교반하였다. 제2 부분의 Boc-Val-OSu(130 mg, 0.414 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 추가의 30분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 20:80)로 정제하고, 테트라부틸암모늄 염으로 오염된 디펩티드 XT12를 수득하였다.
MS (ESI+) C42H51N12O10 + [M+H]+에 대한 계산치 883.38, 실측치 883.71.
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도) 펜타노에이트( XT13)
0℃에서 DCM(3 mL) 중의 불순한 디펩티드 XT12(244 mg, 0.276 mmol)의 용액에 TFA(3 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 RT로 가온하면서 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켜 미정제 탈보호된 아민 XT13을 오렌지색 TFA 염으로서 수득하고, 추가 분석 없이 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C37H43N12O8 + [M+H]+에 대한 계산치 783.33, 실측치 783.32
4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT14) 및 5-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT15)
포름아미드 XT13(190 mg, 0.243 mmol)의 가수분해를 하기의 변형과 함께 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다: 포름아미드 XT13을 먼저 0℃에서 1시간 동안 NaOH(12 eq)와 반응시키고, 이어서 제2 부분의 NaOH(12 eq)를 첨가한 후, 6시간 동안 RT에서 반응시켰다. 고체를 MeOH로 세척하는 것을 물(3 mL)로 세척하는 것으로 대체하였다. 이산 XT14 및 XT15의 혼합물(~1:2 비율)을 수득하였다. 임의로, 이들은 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하여 이산 XT14(15 mg, 8%, 3 단계) 및 XT15(30 mg, 16%, 3 단계)를 황색 고체로서 수득할 수 있다.
Figure pct00108
MS (ESI+) C35H43N12O8 + [M+H]+에 대한 계산치 759.33, 실측치 759.50.
Figure pct00109
MS (ESI+) C35H43N12O8 + [M+H]+에 대한 계산치 759.33, 실측치 759.68.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도) 부틸)카르바모일)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XT16) 및 2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-부틸)카르바모일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸-부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XT17)
DMF(10 mL) 중의 이산 XT14 및 XT15(0.209 g, 0.276 mmol)의 냉각된(0℃) 혼합물(~1:2)에 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(0.085 g, 0.276 mmol)를 첨가하고, 이어서 DIPEA(0.289 mL, 1.66 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3시간 동안 RT에서 교반하고, 이어서 진공 하에 농축시켰다. 미정제 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 XT16 및 XT17의 혼합물(1:2)(65 mg, 25%, 4 단계)을 황색 고체로서 수득하였다. 이성질체적으로 순수한 XT14 또는 XT15로 반응을 수행하여 각각 순수한 XT16 또는 XT17을 단리하였다.
Figure pct00110
MS (ESI+) C45H54N13O11 + [M+H]+에 대한 계산치 952.41, 실측치 952.75.
Figure pct00111
MS (ESI+) C45H54N13O11 + [M+H]+에 대한 계산치 952.41, 실측치 952.82.
(S)-4-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) (메틸)아미노)-벤즈아미도)부틸)-카르바모일)벤조산 ( XT20 ) 및 (S)-5-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸)아미노)벤즈아미도)부틸) 카르바모일)벤조산 ( XT21 )의 제조
Figure pct00112
메틸 (S)-5-(5-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸)-아미노)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT19)
RT에서 DMF(5 mL) 중의 산 XX9(150 mg, 0.461 mmol) 및 트리에틸아민(1.16 mL, 8.30 mmol)의 현탁액에 이소부틸 클로로포르메이트(0.061 mL, 0.461 mmol)를 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 아민 XT6(166 mg, 0.507 mmol)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 추가의 이소부틸 클로로포르메이트(0.030 mL, 0.230 mmol)를 첨가하고, 20분 후 추가의 아민 XT6(83 mg, 0.254 mmol)을 첨가하였다. 제3 부분의 이소부틸 클로로포르메이트(0.015 mL, 0.115 mmol)를 첨가한 다음, 20분 후 추가의 XT6(42 mg, 0.127 mmol)를 첨가하였다. 클로로포르메이트의 다수회 첨가에도 불구하고, 반응은 30% 전환율에서 정체되었다. HATU(175 mg, 0.461 mmol)를 RT에서 30분 동안 첨가한 후, 아민 XT6(166 mg, 0.507 mmol)을 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 25:75)로 정제하여 XT19(294 mg, quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C29H31N10O5 + [M+H]+에 대한 계산치 599.25, 실측치 599.29.
(S)-4-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸)아미노) 벤즈아미도)부틸)-카르바모일)벤조산 (XT20) 및 (S)-5-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)(메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT21)
NaOH(12 eq)를 사용한 에스테르 XT19(276 mg, 0.461 mmol)의 가수분해를, 여과로 고체를 수집할 때 고체를 세척하기 위해 에테르만을 사용하는 변형과 함께, 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 미정제물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 이산 XT20(10 mg, 0.017 mmol, 4%) 및 XT21 (76 mg, 0.126 mmol, 27%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00113
MS (ESI+) C28H31N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 603.24, 실측치 603.40.
Figure pct00114
MS (ESI+) C28H31N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 603.24, 실측치 603.27.
(S)-4-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸) 벤즈아미도)-부틸)카르바모일)벤조산 ( XT24 ) 및 (S)-5-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)부틸)-카르바모일)벤조산 ( XT25 )의 제조
Figure pct00115
메틸 (S)-5-(5-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-펜타노에이트 (XT23)
산 XX2(140 mg, 0.451 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 아민 XT6(222 mg, 0.677 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 에스테르 XT23(263 mg, quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C29H30N9O5 + [M+H]+에 대한 계산치 584.24, 실측치 584.24.
(S)-4-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)부틸) 카르바모일)벤조산 (XT24) 및 (S)-5-아미노-2-((4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)부틸)-카르바모일)벤조산 (XT25)
NaOH(3 eq)를 사용한 에스테르 XT23(263 mg, 0.451 mmol)의 가수분해를, 여과로 고체를 수집할 때 고체를 세척하기 위해 에테르만을 사용하는 변형과 함께, 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 미정제물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 이산 XT24(7 mg, 0.012 mmol, 3%) 및 XT25(93 mg, 0.158 mmol, 35%)를 무색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00116
MS (ESI+) C28H30N9O6 + [M+H]+에 대한 계산치 588.23, 실측치 588.46.
Figure pct00117
MS (ESI+) C28H30N9O6 + [M+H]+에 대한 계산치 588.23, 실측치 588.48.
(S)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)-벤즈아미도)부틸)카르바모일)-4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도) 벤조산 ( XT31 ) 및 (S)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)부틸)카르바모일)-5-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도) 벤조산 ( XT32 )의 제조
Figure pct00118
메틸 (S)-5-(5-(6-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)헥산아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XT27)
0℃에서 피리딘(3 mL) 중의 아닐린 XT8(100 mg, 0.163 mmol)의 현탁액에 산 클로라이드 XT26(182 mg, 0.490 mmol) (문헌(Unsworth et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 52, 15794-15798)에 따라 제조됨)를 나누어(부분당 30 mg) 첨가하고, 전환을 단속적으로 UPLC-MS로 확인하였다. 완료되면, 반응물을 MeOH(2 mL)로 ??칭시키고, 진공 하에 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 미량의 피리딘과 함께 아미드 XT27(160 mg, quant)을 수득하였다.
Figure pct00119
Figure pct00120
MS (ESI+) C50H50N11O9 + [M+H]+에 대한 계산치 948.38, 실측치 948.45.
(S)-4-(6-아미노헥산아미도)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 아미노)벤즈아미도)-부틸)카르바모일)벤조산 (XT28) 및 (S)-5-(6-아미노헥산아미도)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일) 벤조산 (XT29)
NaOH(12 eq)를 사용한 에스테르 XT27(145 mg, 0.153 mmol)의 가수분해를, 여과로 고체를 수집할 때 고체를 세척하기 위해 에테르만을 사용하는 변형과 함께, 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 이렇게 수득된 이산 XT28 및 XT29의 미정제 혼합물(80 mg, 75%, 비율 1:2)을 추가의 정제 없이 이월하였다.
MS (ESI+) C33H40N11O7 + [M+H]+에 대한 계산치 702.31, 실측치 702.56.
(S)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸) 카르바모일)-4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)벤조산 (XT31) 및 (S)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸) 카르바모일)-5-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)벤조산 (XT32)
RT에서 DMF(3 mL) 중의 이산 XT28 및 XT29(60 mg, 0.086 mmol, 1:2 비율)의 현탁액에 수성 Na2CO3(260 μl, 1 M)을 첨가하고, 이어서 N-메톡시카르보닐말레이미드 XT30(13.3 mg, 0.086 mmol)을 첨가하였다. 추가의 수성 Na2CO3(0.170 mL, 1 M)를 20분 간격으로 3x 첨가한 후, 수성 Na2CO3(0.085 mL, 1 M)를 최종 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 수성 AcOH(2.06 mL, 1 M.)로 ??칭시키고, 생성된 현탁액을 진공 하에 농축시켰다. 미정제 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 1:2 비율의 아미드 XT31 및 XT32의 혼합물(15 mg, 22%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00121
Figure pct00122
MS (ESI+) C37H40N11O9 + [M+H]+에 대한 계산치 782.30, 실측치 782.52.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 아미노)벤즈아미도)펜탄산 ( XT35 )의 제조
Figure pct00123
메틸 (S)-5-(4-아지도벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)벤즈아미도)-펜타노에이트 (XT33)
산 XT7(150 mg, 0.442 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 아민 XX3(142 mg, 0.486 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 에스테르 XT33(270 mg, quant)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C28H29N12O5 + [M+H]+에 대한 계산치 613.24, 실측치 613.50.
메틸 (S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)벤즈아미도)-펜타노에이트 (XT34)
아지드 XX33(270 mg, 0.441 mmol)의 환원을 일반 절차 XXB에 따라 수행하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 아닐린 XT34(190 mg, 0.324 mmol, 74% 수율)를 황색-회색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00124
MS (ESI+) C28H31N10O5 + [M+H]+에 대한 계산치 587.25, 실측치 587.55.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도) 펜탄산 (XT35)
NaOH(6 eq)를 사용한 에스테르 XT34(190 mg, 0.324 mmol)의 가수분해를 하기의 변형과 함께 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 고체를 여과시키고 세척한 후, 물질을 2% 수성 암모니아 용액에 용해시키고, 동결건조시켜 XT35(143 mg, 0.26 mmol, 81%)를 황색-오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00125
MS (ESI+) C26H29N10O4 + [M+H]+에 대한 계산치 545.24, 실측치 545.23.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 부틸)카르바모일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산( XT41 )의 제조
Figure pct00126
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT36)
아닐린 XT23(280 mg, 0.480 mmol)을 XT11에 대한 절차에 따라 Fmoc-Ala-Cl(396 mg, 1.20 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 아미드 XT36(350 mg, 83%)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C47H45N10O8 + [M+H]+에 대한 계산치 877.34, 실측치 877.44.
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XT37)
Fmoc-보호된 아민 XT36(350 mg, 0.399 mmol)을 TBAF·3H2O 및 데칸티올로 탈보호시킨 후, XT12에 대한 절차에 따라 Boc-Val-OSu 및 DIPEA와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 테트라부틸아민 염으로 오염된 디펩티드 XT37(quant)을 수득하였다.
MS (ESI+) C42H52N11O9 + [M+H]+에 대한 계산치 854.39, 실측치 854.49.
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT38)
디펩티드 XT37(340 mg, 0.400 mmol)을 XT13에 대한 절차에 따라 탈보호시켰다. 농축 후, TFA 염 XT38을 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C37H44N11O7 + [M+H]+에 대한 계산치 754.34, 실측치 754.47.
5-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT40)
포름아미드 XT38(300 mg, 0.400 mmol)의 가수분해를 하기의 변형과 함께 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 포름아미드 XT38를 먼저 0℃에서 NaOH(12 eq)와 1시간 동안 반응시킨 다음, 제2 부분의 NaOH(12　eq)를 첨가한 후, RT에서 6시간 동안 반응시켰다. 고체를 MeOH로 세척하는 것을 물(3 mL)로 세척하는 것으로 대체하였다. 프탈이미드의 개환은 원하는 위치이성질체 XT40(~1:2 비율)을 선호하는 적당한 선택성으로 진행하였다. 물질을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 25%)로 정제하여 XT40(50 mg, 16%, 3 단계)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00127
MS (ESI+) C36H44N11O8 + [M+H]+에 대한 계산치 758.34, 실측치 758.61.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸) 카르바모일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸-부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XT41)
아민 XT40(45 mg, 0.059 mmol)을 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(28 mg, 0.089 mmol) 및 DIPEA(0.062 mL, 0.36 mmol)와 반응시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하여 XT41(30 mg, 53%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00128
Figure pct00129
MS (ESI+) C45H55N13O11 + [M+H]+에 대한 계산치 951.41, 실측치 951.91.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)벤즈아미도)펜탄산 ( XT46 )의 제조
Figure pct00130
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도) 벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT42)
아닐린 XX6(150 mg, 0.269 mmol)을 XT11에 대한 절차에 따라 Fmoc-Ala-Cl(310 mg, 0.942 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 아미드 XT42(180 mg, 79%)를 황백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00131
MS (ESI+) C46H47N10O7 + [M+H]+에 대한 계산치 851.36, 실측치 851.82.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT43)
DMF(4 mL) 중의 XT42(180 mg, 0.212 mmol)의 용액에 피페리딘(0.419 mL, 4.23 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 15분 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 에테르(50 mL)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 RT에서 10분 동안 교반하였다. 여과시킨 후, 고체를 수집하고, 미정제 아민을 DMF(4 mL)에 취하였다. 이어서, Boc-Val-OSu(100 mg, 0.317 mmol) 및 DIPEA(0.074 mL, 0.42 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 4 시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 디펩티드 XT43(170 mg, 97%)을 수득하였다.
Figure pct00132
MS (ESI+) C41H54N11O8 + [M+H]+에 대한 계산치 828.42, 실측치 828.81.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT44)
디펩티드 XT43(340 mg, 0.400 mmol)을 XT13에 대한 절차에 따라 탈보호시켰다. 농축 후, TFA 염 XT44를 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C36H46N11O6 + [M+H]+에 대한 계산치 728.36, 실측치 728.66.
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XT45)
NaOH(12 eq)를 사용한 에스테르 XT44(145 mg, 0.153 mmol)의 가수분해를, 수성 AcOH(1 M)로 처리 시 생성물이 고화되지 않는 변형과 함께, 일반 절차 XXC에 따라 수행하였으며, 따라서 MeOH를 증발시킨 후 생성된 용액을 동결건조시켰다. 생성된 케이크를 DMF(5 mL)와 함께 교반하고, 여과시키고, XT45를 함유하는 수득된 DMF 용액을 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C35H44N11O6 + [M+H]+에 대한 계산치 714.35, 실측치 714.71.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 벤즈아미도) 펜탄산 (XT46)
아민 XT45를 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(49 mg, 0.16 mmol) 및 DIPEA(0.168 mL, 0.960 mmol)와 반응시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하여 XT46(67 mg, 46%, 3 단계)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00133
MS (ESI+) C45H55N12O9 + [M+H]+에 대한 계산치 907.42, 실측치 907.84.
메틸 (S)-5-아미노-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)-벤즈아미도)펜타노에이트 히드로클로라이드 ( XT48 )의 제조
Figure pct00134
메틸 (S)-5-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)-벤즈아미도)펜타노에이트 (XT47)
산 XT7(1.30 g, 3.83 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 H-Orn(Boc)-OMe(1.30 g, 4.60 mmol)와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 에스테르 XT47(1.80 g, 83%)을 오렌지색/적색 고체 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00135
MS (ESI+) C26H34N9O6 + [M+H]+에 대한 계산치 568.26, 실측치 568.56.
메틸 (S)-5-아미노-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도) 펜타노에이트 히드로클로라이드 (XT48)
에스테르 XT47(1.60 g, 2.82 mmol)을 디옥산(16 mL)에서 용해될 때까지 가열하였다. RT로 냉각시킨 후, 용액을 격렬하게 교반하면서 디옥산(4 M, 30 mL) 중의 HCl에 적가하였다. 생성된 황색 현탁액을 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 잔류물을 에테르(50 mL)로 세척하고, 물(30 mL)에 취하고, 동결건조시켜 XT48(1.42 g, 100%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00136
MS (ESI+) C21H26N9O4 + [M+H]+에 대한 계산치 468.21, 실측치 468.52.
5-((S)-5-벤질-18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10,13-테트라옥소-3,6,9,12-테트라아자옥타데칸아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 ( XT54 )의 제조
Figure pct00137
(2,2,2-플루오로아세틸)글리시노일 클로라이드 (XT49)
MeOH(33 mL) 및 Et3N(6.96 mL, 50.0 mmol) 중의 글리신(2.50 g, 33.3 mmol) 용액에 에틸 트리프루오로아세테이트(5.17 mL, 43.3 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 18시간 동안 RT에서 교반하였다. 용액을 농축시키고, 잔류물을 EtOAc(75 mL)에 취하고, 유기 용액을 수성 HCl(1 M, 150 mL)로 세척하고, 수성 층을 EtOAc(2 x 75 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 추출물을 식염수(50 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 여액을 농축시켜 (2,2,2-플루오로아세틸)글리신(5.3 g, 93%)을 백색 고체로서 수득하였다. 생성물의 일부(1.00 g, 5.85 mmol)를 DCM(30 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, 옥살릴 클로라이드(1.54 mL, 17.54 mmol)를 적가한 다음, 2 방울의 DMF를 적가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 RT에서 교반하고, 이어서 농축시키고, 톨루엔(2x)과 함께 공증발시켜 XT49(quant)를 수득하였다. MeOH로 생성물을 ??칭시켜 상응하는 메틸 에스테르를 수득하였다.
MS (ESI+) C5H7F3NO3 + [M+H]+에 대한 계산치 186.04, 실측치 186.36.
메틸 (S)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-(1,3-디옥소-5-(2-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)아세트아미도)이소인돌린-2-일)펜타노에이트 (XT50)
피리딘(2.5 mL) 중의 XT8(90.0 mg, 0.147 mmol)의 현탁액을 0℃로 냉각시키고, XT49(167 mg, 0.88 mmol)를 1시간에 걸쳐 6회 부분으로 첨가하였다. UPLC-MS가 완전한 전환을 나타내면, 반응물을 MeOH(3 mL)로 ??칭시키고, 진공 하에 농축시켰다. 미정제 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 XT50(118 mg, quant)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C33H31F3N11O8 + [M+H]+에 대한 계산치 766.23, 실측치 766.61.
(S)-5-(2-아미노아세트아미도)-2-((4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT52)
포름아미드 XT50(107 mg, 0.14 mmol)의 가수분해를 하기의 변형과 함께 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 포름아미드 XT50을 먼저 0℃에서 1시간 동안 NaOH(12 eq)와 반응시킨 다음, 제2 부분의 NaOH(12　eq)를 3시간 동안 RT에서 첨가하였다. 고체를 MeOH로 세척하는 것을 물(3 mL)로 세척하는 것으로 대체하였다. 프탈이미드의 개환은 원하는 위치이성질체 XT52(~1:2 비율)를 선호하는 적당한 선택성으로 진행하였다. 미정제물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하여, 이산 XT52(36　mg, 40%, 2 단계)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00138
MS (ESI+) C29H32N11O7 + [M+H]+에 대한 계산치 646.25, 실측치 646.67.
5-((S)-5-벤질-18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10,13-테트라옥소-3,6,9,12-테트라아자옥타데칸아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일) 메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤조산 (XT54)
THF(4 mL) 중의 트리펩티드 XT53(EP 2907824에 기재된 바와 같이 합성됨) (105 mg, 0.22 mmol)의 현탁액에 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC; 46 mg, 0.22　mmol) 및 N-히드록시숙신이미드(26 mg, 0.22 mmol)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 18 시간 동안 교반하였다. 수득된 현탁액을 여과시키고, 여액의 일부(1.0 mL)를 DMF(0.5 mL) 중의 이산 XT52(32 mg, 0.05 mmol)의 용액에 첨가하였다. DIPEA(0.052　mL, 0.30 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 30분 동안 RT에서 교반하였다. 농축 후, 미정제 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 XT54(22　mg, 40%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00139
MS (ESI+) C52H58N15O13 + [M+H]+에 대한 계산치 1100.43, 실측치 1100.85.
2-(((S)-5-카르복시-5-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)-펜틸)아미노)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 ( XT63 )의 제조
Figure pct00140
메틸 (S)-2-((5-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)-5-니트로벤조에이트 (XT57)
MeCN(15 mL) 중의 XT55(1.42 g, 7.13 mmol), XT56(2.0 g, 7.13 mmol) 및 K2CO3(1.48 g, 10.7 mmol)의 현탁액을 2시간 동안 밀봉된 튜브에서 90℃로 가열하였다. 농축된 HCl(0.89 mL, 11 mmol)을 RT에서 첨가하고, 미정제 반응 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 카르복실산 중간산물을 0℃로 냉각된 MeOH(100 mL)에 취하고, 티오닐 클로라이드(5.8 mL, 79 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 1시간에 걸쳐 RT로 서서히 가온하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과시키고, 여액을 진공 하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:9)로 정제하여 아닐린 XT57(2.8 g, 83%)을 황색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00141
MS (ESI+) C23H28N3O8 + [M+H]+에 대한 계산치 474.19, 실측치 474.31.
메틸 (S)-2-((5-아미노-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)-5-니트로벤조에이트 히드로브로마이드 (XT58)
DCM(8 mL) 중의 XT57(750 mg, 1.58 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. AcOH(33%, 10 mL) 중의 얼음-냉각된 HBr을 첨가하고, 생성된 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켜 아민 XT58(660 mg, 99%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00142
MS (ESI+) C15H22N3O6 + [M+H]+에 대한 계산치 340.15, 실측치 340.44.
메틸 (S)-2-((5-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)-5-니트로벤조에이트 (XT59)
아민 XT58(310 mg, 0.74 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 산 XT7(150 mg, 0.74 mmol)과 반응시켰다. 생성물을 MeOH(8 mL)로부터 재결정화시켜 XT59(390 mg, 80%)를 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00143
MS (ESI+) C30H33N10O8 + [M+H]+에 대한 계산치 661.25, 실측치 661.65.
메틸 (S)-5-아미노-2-((5-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)벤조에이트 (XT60)
DMF(1.5 mL) 중의 XT59(150 mg, 0.23 mmol)의 용액에 포화 수성 NH4Cl(0.375 mL) 및 아연 분말(445 mg, 6.81 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DMF(4 mL)로 희석시키고, 셀라이트 상에서 여과시켰다. 여액을 18시간 동안 RT에서 공기 하에 교반하였다. 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 MeOH(6 mL)에 현탁시키고, 여과시키고, 잔류물을 에테르(4 mL)로 세척하여 아닐린 XT60(145 mg, quant)을 회색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00144
MS (ESI+) C30H35N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 631.27, 실측치 631.15.
메틸 5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-(((S)-5-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)벤조에이트 (XT61)
아닐린 XT60(140 mg, 0.22 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 Fmoc-Ala-OH(70 mg, 0.22　mmol)와 반응시켰다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 생성된 아미드(60 mg, 82%)를 수득하였다. 생성물의 일부(40 mg, 0.04 mmol)를 피페리딘으로 탈보호시키고, XT43에 대한 절차에 따라 Boc-Val-OSu와 반응시켰다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 XT61(30 mg, 77%)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C43H57N12O10 + [M+H]+에 대한 계산치 901.43, 실측치 901.54
5-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(((S)-5-카르복시-5-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜틸)아미노)벤조산 (XT62)
카르바메이트 XT61(15 mg, 0.02 mmol)을 DCM(1.5 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, TFA(1.5 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 15분 동안 0℃에서 교반하고, 이어서 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켰다. 이어서, 미정제물을 하기의 변형과 함께 일반 절차 XXC에 따라 NaOH(24 eq)로 가수분해시켰다. 1 M AcOH로 처리 시, 생성물은 쉽게 침전되지 않았다. 메탄올을 진공 하에 증발에 의해 제거시키고, 수용액을 동결건조시켰다. 생성된 케이크를 DMF(5 mL)와 함께 교반하고, 여과시키고, XT62를 함유하는 수득된 DMF 용액을 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C35H45N12O7 + [M+H]+에 대한 계산치 745.35, 실측치 745.52.
2-(((S)-5-카르복시-5-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜틸) 아미노)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XT63)
아민 XT62(25 mg, 0.034 mmol)를 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(10 mg, 0.034 mmol) 및 DIPEA(0.06 mL, 0.34 mmol)와 반응시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 30%)로 정제하여 XT63(8 mg, 25%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00145
MS (ESI+) C45H56N13O10 + [M+H]+에 대한 계산치 938.43, 실측치 938.70.
5-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)-아미노)-2-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 ( XT723 )의 제조
Figure pct00146
메틸 (S)-5-((4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)아미노)-2-니트로벤조에이트 (XT66)
XT64(1.50 g, 7.51 mmol)를 XT57에 대한 절차에 따라 XT65(2.00 g, 7.51 mmol)와 반응시켰다. 제1 단계의 반응 시간은 7일로 연장되었다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:9)로 정제하여 XT66(2.00 g, 58%)을 황색/오렌지색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00147
MS (ESI+) C22H26N3O8 + [M+H]+에 대한 계산치 460.17, 실측치 460.33.
메틸 (S)-5-((4-(((벤질옥시)카르보닐)(tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)(tert-부톡시카르보닐)아미노)-2-니트로벤조에이트 (XT67)
THF(25 mL) 중의 아닐린 XT66(2.00 g, 4.35 mmol)의 용액에 Boc2O(3.03 mL, 13.06 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP; 53 mg, 0.44 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 18시간 동안 RT에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 비스-Boc 보호된 생성물 XT67(1.90 g, 66%)을 황색 오일로서 수득하였다.
MS (ESI+) C22H26N3O8 + [M-2xBoc+H]+에 대한 계산치 460.17, 실측치 460.30.
메틸 (S)-2-아미노-5-((4-(((벤질옥시)카르보닐)(tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)(tert-부톡시카르보닐)아미노)벤조에이트 (XT68)
화합물 XT67(1.70 g, 2.58 mmol)을, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:DCM 0:1 내지 1:1)로 정제하는 변형과 함께, XT60에 대한 절차에 따라 아연 분말(2.50 g, 38.7 mmol)과 반응시켜 아닐린 XT68(1.5 g, 92%)을 오렌지색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00148
MS (ESI+) C32H44N3O10 + [M+H]+에 대한 계산치 630.30, 실측치 630.40.
메틸 2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-5-(((S)-4-(((벤질옥시)카르보닐)(tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)(tert-부톡시-카르보닐)아미노)벤조에이트 (XT69)
아닐린 XT68(1.43 g, 2.27 mmol)을 XT11에 대한 절차에 따라 Fmoc-Ala-Cl(824 mg, 2.50 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 아미드 XT69(2.1 g, quant)를 황색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00149
MS (ESI+) C50H59N4O13 + [M+H]+에 대한 계산치 923.41, 실측치 923.39.
메틸 2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-5-(((S)-4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)아미노)벤조에이트 (XT70)
디옥산(2 mL) 중의 비스-Boc 보호된 XT69(2.10 g, 2.28 mmol)의 용액에 디옥산(4 M, 12 mL) 중의 HCl을 첨가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:9)로 정제하여 아닐린 XT70(1.45 g, 88%)을 황색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00150
MS (ESI+) C40H43N4O9 + [M+H]+에 대한 계산치 723.30, 실측치 723.51.
메틸 5-(((S)-4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)아미노)-2-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조에이트 (XT71)
Fmoc-보호된 아민 XT70(1.45 g, 2.00 mmol)을 피페리딘으로 탈보호시키고, 이어서 XT43에 대한 절차에 따라 Boc-Val-OSu와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 디펩티드 XT71(600 mg, 43%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00151
MS (ESI+) C35H50N5O10 + [M+H]+에 대한 계산치 700.36, 실측치 700.56.
메틸 5-(((S)-4-아미노-5-메톡시-5-옥소펜틸)아미노)-2-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조에이트 (XT72)
화합물 XT71(600 mg, 0.86 mmol)을 N2 분위기 하에 DMF(8.5 mL)에 용해시켰다. Pd/C(91 mg, 활성탄 상 10 mol%)를 첨가하고, 생성된 블랙 현탁액을 90분 동안 수소 분위기 하에 RT에서 격렬하게 교반하였다. 플라스크를 N2로 퍼징하고, 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과시켰다. 여액을 농축시켜 XT71(quant)을 암녹색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C27H44N5O8 + [M+H]+에 대한 계산치 566.32, 실측치 566.43.
메틸 2-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-5-(((S)-4-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-메톡시-5-옥소펜틸)아미노)벤조에이트 (XT721)
아민 XT72(167 mg, 0.295 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 산 XT7(100 mg, 0.295 mmol)과 반응시켰다. 생성물을 MeOH(5 mL)로부터 재결정화시켜 XT721(216 mg, 83%)을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00152
MS (ESI+) C42H55N12O10 + [M+H]+에 대한 계산치 887.42, 실측치 887.90.
2-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-5-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)아미노)벤조산 (XT722)
THF(1.5 mL) 중의 에스테르 XT721(210 mg, 0.24 mmol)의 용액에 물(1.5 mL) 중의 LiOH(28 mg, 1.2 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 72시간 동안 교반하고, -78℃에서 밤새 저장하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 수성 AcOH(1.0 M, 2.5 mL)로 산성화하고, 생성된 현탁액을 60분 동안 RT에서 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 잔류물을 물(10 mL), MeOH(4 mL) 및 에테르(10 mL)로 세척하였다. 수득된 고체를 밤새 공기 중에서 건조시켜 황색 고체(150 mg)를 수득하였다. 이어서, 물질을 DCM(3 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, TFA(3 mL)를 첨가하였다. 생성된 용액을 RT로 가온하는 동안 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켜 TFA 염 XT722(quant)를 수득하고 다음 반응에 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C34H43N12O7 + [M+H]+에 대한 계산치 731.34, 실측치 731.52.
5-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸) 아미노)-2-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸-부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XT723)
아민 XT722(132 mg, 0.18 mmol)를 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(56 mg, 0.18 mmol) 및 DIPEA(0.314 mL, 1.80 mmol)와 반응시켰다. 잔류물을 MeOH에서의 분쇄에 이어 여과 및 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)에 의하여 XT723(72 mg, 43%, 3 단계)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00153
MS (ESI+) C44H54N13O10 + [M+H]+에 대한 계산치 924.41, 실측치 924.45.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)페닐)아미노)펜탄산 ( XT80 )의 제조
Figure pct00154
메틸 (S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-((4-니트로페닐)아미노)펜타노에이트 (XT74)
밀봉된 튜브에서 물(10 mL)/EtOH(6 mL) 중의 XT73(795 mg, 5.63 mmol), XT65(500 mg, 1.88 mmol), NaOH(75 mg, 1.88 mmol) 및 NaHCO3(473 mg, 5.63 mmol)의 혼합물을 5일 동안 90℃로 가열하였다. RT로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 물(20 mL)로 희석시키고, 에테르(40 mL)로 세척하였다. 이어서, 수용액을 6 M HCl로 pH ~3으로 산성화하고, 생성된 혼합물을 DCM(2 x 75　mL) 중의 5% MeOH로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 중간산물 카르복실산(610 mg, 84%)을 황색 폼으로서 수득하였다. 물질을 MeOH(50 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, 티오닐 클로라이드(1.26　mL, 17.3 mmol)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 45분 동안 0℃에서 교반하고, 이어서 1시간에 걸쳐 RT에 도달하게 하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:9)로 정제하여 에스테르 XT74(670 mg, quant)를 황색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00155
MS (ESI+) C20H24N3O6 + [M+H]+에 대한 계산치 402.17, 실측치 402.33.
메틸 (S)-2-아미노-5-((4-니트로페닐)아미노)펜타노에이트 히드로브로마이드 (XT75)
에스테르 XT74(480 mg, 1.20 mmol)를 XT58에 대한 절차에 따라 탈보호시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 물에 취하고, 동결건조시켜 점착성 검을 수득하였다. 물질은 현탁액을 수득할 때까지 에테르 중에서 교반하고, 이어서 여과시켰다. 잔류물을 MeOH와 함께 공증발시켜 아민 XT75(550 mg quant)를 황색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00156
MS (ESI+) C12H18N3O4 + [M+H]+에 대한 계산치 268.13, 실측치 268.27.
메틸 (S)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-((4-니트로페닐)-아미노)펜타노에이트 (XT76)
아민 XT75(250 mg, 0.718 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 산 XT7(244 mg, 0.718 mmol)과 반응시켰다. 생성물을 MeOH(8 mL)로부터 재결정화시켜 XT76(310 mg, 73%)을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00157
MS (ESI+) C27H29N10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 589.23, 실측치 589.59.
메틸 (S)-5-((4-아미노페닐)아미노)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)-벤즈아미도)펜타노에이트 (XT77)
니트로아닐린 XT76(340 mg, 0.578 mmol)을 XT60에 대한 절차에 따라 아연 분말(1133 mg, 17.3 mmol)을 사용하여 환원시켜 아닐린 XT77(305 mg, 95%)을 회색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C27H31N10O4 + [M+H]+에 대한 계산치 559.25, 실측치 559.14.
메틸 (S)-5-((4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-페닐)아미노)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XT78)
아닐린 XT77(300 mg, 0.54 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 Boc-ValAla-OH(170 mg, 0.59 mmol)와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 XT78(240 mg, 54%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00158
MS (ESI+) C40H53N12O8 + [M+H]+에 대한 계산치 829.41, 실측치 829.58.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 페닐)아미노)펜탄산 (XT80)
카르바메이트 XT78(240 mg, 0.29 mmol)을 DCM(3 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, TFA(3 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 15분 동안 0℃에서 교반하고, 이어서 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켰다. NaOH(36 eq)를 사용한 중간산물 에스테르의 가수분해를, 1 M AcOH으로 처리 시 생성물이 충분히 고형화되지 않아 생성된 용액이 MeOH의 증발 후 동결건조되는 변형과 함께, 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 생성된 케이크를 DMF(4 mL)와 함께 교반하고, 여과시켰다. 이어서, 탈보호된 생성물을 함유하는 여액을 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(31 mg, 0.100 mmol) 및 DIPEA(0.105 mL, 0.600 mmol)와 반응시켰다. 미정제물을 MeOH로 분쇄시키고, 여과시킨 후 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하여 XT80(37 mg, 15%, 3 단계)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00159
MS (ESI+) C43H54N13O8 + [M+H]+에 대한 계산치 880.42, 실측치 880.52.
2-(((S)-5-카르복시-5-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)-펜틸)아미노)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)니코틴산 ( XT89 )의 제조
Figure pct00160
메틸 (S)-2-((5-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)-5-니트로니코티네이트 (XT83)
아민 XT82(500 mg, 1.78 mmol)을 XT57에 대한 절차에 따라 XT81(386 mg, 1.78 mmol)과 반응시켰다. 생성물을 MeOH(8 mL)로부터 재결정화시켜 XT83(370 mg, 44%)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C22H27N4O8 + [M+H]+에 대한 계산치 475.18, 실측치 475.34.
메틸 (S)-2-((5-아미노-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)-5-니트로니코티네이트 히드로브로마이드 (XT84)
Cbz-보호된 아민 XT83(370 mg, 0.78 mmol)을 XT58에 대한 절차에 따라 탈보호시켰다. 생성물을 물에 취하고, 이어서 동결건조시켰다. 잔류물을 에테르에 현탁시키고, 여과시켜 XT84(quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00161
MS (ESI+) C14H21N4O6 + [M+H]+에 대한 계산치 341.15, 실측치 341.22.
메틸 (S)-2-((5-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)-5-니트로니코티네이트 (XT85)
아민 XT84(360 mg, 0.86 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 산 XT7(264 mg, 0.78 mmol)과 반응시켰다. 생성물을 MeOH(5 mL)로부터 재결정화시켜 XT85(280 mg, 55%)를 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00162
MS (ESI+) C29H32N11O8 + [M+H]+에 대한 계산치 662.24, 실측치 662.44
메틸 (S)-5-아미노-2-((5-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)니코티네이트 (XT86)
화합물 XT85(280 mg, 0.42 mmol)를 XT60에 대한 절차에 따라 아연 분말(830 mg, 12.7　mmol)을 사용하여 환원시켜 아닐린 XT86(240 mg, 90%)을 회색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00163
MS (ESI+) C29H34N11O6 + [M+H]+에 대한 계산치 632.27, 실측치 632.42.
메틸 5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-(((S)-5-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-6-메톡시-6-옥소헥실)아미노)니코티네이트 (XT87)
아닐린 XT86(120 mg, 0.19 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 Boc-ValAla-OH(60 mg, 0.21　mmol)와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 XT87(100 mg, 58%)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C42H56N13O10 + [M+H]+에 대한 계산치 902.43, 실측치 902.49.
2-(((S)-5-카르복시-5-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜틸) 아미노)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸 부탄아미도)프로판아미도)니코틴산 (XT89)
카르바메이트 XT87(100 mg, 0.11 mmol)을 DCM(3 mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, TFA(3 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 15분 동안 0℃에서 교반하고, 이어서 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켰다. NaOH(18 eq)를 사용한 중간산물 에스테르의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 잔류 케이크를 DMF(3 mL)와 함께 교반하고, 여과시켰다. 여액을 절차 XT17에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(31 mg, 0.10 mmol) 및 DIPEA(0.105 mL, 0.600 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 농축시키고, 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 30%)로 정제하여 XT89(12 mg, 13%, 3 단계)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00164
MS (ESI+) C44H55N14O10 + [M+H]+에 대한 계산치 939.42, 실측치 939.37.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)펜탄산 ( XT94 )의 제조
Figure pct00165
메틸 (S)-5-(4-아미노-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT90)
DMF(1 mL) 중의 미정제 테트라졸 XX21(55 mg, 0.271 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 아민 XX29(150 mg, 0.271 mmol)와 반응시켰다. 생성물을 MeOH(5 mL)로부터 재결정화시키고, 에테르(5 mL)로 세척하여 XT90(quant)을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C29H32N13O4 + [M+H]+에 대한 계산치 626.27, 실측치 626.38.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT91)
아닐린 XT90(150 mg, 0.240 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 Fmoc-Ala-OH(112 mg, 0.360　mmol)와 반응시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM x 1% Et3N 0:1 내지 1:1)로 정제하였다. 단리된 생성물을 MeOH에 용해시키고, 에테르로 침전시켯다. 생성된 현탁액을 여과시키고, 고체를 에테르로 세척하고, 밤새 공기 중에서 건조시켜 아미드 XT91(75 mg, 34%)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C47H47N14O7 + [M+H]+에 대한 계산치 919.37, 실측치 919.79.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XT92)
Fmoc 보호된 아민 XT91(75 mg, 0.08 mmol)을 피페리딘(0.16　mL, 1.6 mmol)으로 탈보호시키고, 이어서 XT43에 대한 절차에 따라 Boc-Val-OSu(34 mg, 0.11 mmol)와 반응시켰다. 최소량의 메탄올로부터 에티르로 침전시켜 정제한 후, 여과시키고, 잔류물을 공기 중에서 건조시켜 디펩티드 XT92(75 mg, 78%)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C42H54N15O8 + [M+H]+에 대한 계산치 896.43, 실측치 896.54.
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XT93)
THF(1 mL) 중의 에스테르 XT92(75 mg, 0.084 mmol)의 용액에 물(1 mL) 중의 LiOH(10　mg, 0.419 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 RT에서 교반하고, 0℃로 냉각시키고, AcOH(0.05 mL, 0.84 mmol)로 처리하였다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 농축시키고, 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 DCM(1　mL)에 현탁시키고, 0℃로 냉각시키고, TFA(1 mL)를 첨가하였다. 생성된 용액을 RT로 서서히 가온하면서 60분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM과 함께 공증발시켜 미정제 아민 XT93(quant)을 수득하였다.
MS (ESI+) C36H44N15O6 + [M+H]+에 대한 계산치 782.36, 실측치 782.73.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)펜탄산 (XT94)
미정제 아민 XT93(62.5 mg)을 절차 XT17에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(25 mg, 0.080 mmol) 및 DIPEA(0.140 mL, 0.800 mmol)와 반응시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 30%)로 정제하여 XT94(22 mg, 28%, 3 단계)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00166
MS (ESI+) C46H55N16O9 + [M+H]+에 대한 계산치 975.43, 실측치 976.02.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)티오펜-2-카르복스아미도)펜탄산 ( XT97 )의 제조
Figure pct00167
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)티오펜-2-카르복스아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XT95)
아민 XX29(334 mg, 0.61 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 산 XR23(250 mg, 0.61 mmol)와 반응시켰다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 XT95(quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C39H52N11O8S+ [M+H]+에 대한 계산치 834.37, 실측치 834.53.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 티오펜-2-카르복스아미도)펜탄산 ( XT97 )
에스테르 XT95의 가수분해 및 탈보호를 XT93에 대한 절차에 따라 수행하였다. 미정제 아민을 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(92 mg, 0.3 mmol) 및 DIPEA(388 mg, 3.00 mmol)와 반응시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 30%)로 정제하여 XT97(43 mg, 16%, 3 단계)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00168
MS (ESI+) C43H53N12O9S+ [M+H]+에 대한 계산치 913.38, 실측치 913.83.
(2S,2'S)-5,5'-((5,5'-(((14S,14'S,17S,17'S)-1,1'-(((((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)펜타네디오일)비스(아자네디일))비스(메틸렌))비스(1H-1,2,3-트리아졸-4,1-디일))비스(14-이소프로필-17-메틸-12,15-디옥소-3,6,9-트리옥사-13,16-디아자 옥타데칸-18-오일))비스(아자네디일))비스(티오펜-5,2-디일-2-카르보닐))비스(아자네디일))비스(2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산) ( XT100 )의 제조
Figure pct00169
메틸 (S)-5-(5-((14S,17S)-1-아지도-14-이소프로필-17-메틸-12,15-디옥소-3,6,9-트리옥사-13,16-디아자옥타데칸-18-아미도)티오펜-2-카르복스아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XT98)
디펩티드 XT95(250 mg, 0.30 mmol)를 DCM(1 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, TFA(1 mL)를 첨가하였다. 생성된 용액을 RT로 서서히 가온하면서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 농축시키고, DCM과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 에테르(4 mL)에 현탁시키고, 여과시키고, 에테르로 세척하고, 공기 중에서 건조시켜 중간산물 아민을 TFA 염으로서 수득하였다. 이어서, 아민은 DMF에 용해시키고, 3-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)프로판산(74 mg, 0.30　mmol)을 첨가하고, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, HATU(137　mg, 0.36 mmol) 및 DIPEA(0.31 mL, 1.80 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 RT에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 아지드 XT98(quant)을 황색 유리로서 수득하였다.
MS (ESI+) C43H59N14O10S+ [M+H]+에 대한 계산치 963.43, 실측치 963.56.
(S)-5-(5-((14S,17S)-1-아지도-14-이소프로필-17-메틸-12,15-디옥소-3,6,9-트리옥사-13,16-디아자옥타데칸-18-아미도)티오펜-2-카르복스아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일) 에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XT99)
에스테르 XT98(290 mg, 0.30 mmol)을 XT93에 대한 절차에 따라 LiOH로 가수분해하였다. (TFA를 사용한 Boc-탈보호 단계는 생략되었다.) 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 30%)로 정제하여 XT99(27 mg, 9%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00170
MS (ESI+) C42H57N14O10S+ [M+H]+에 대한 계산치 949.41, 실측치 949.88.
(2S,2'S)-5,5'-((5,5'-(((14S,14'S,17S,17'S)-1,1'-(((((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)펜타네디오일)비스(아자네디일))비스(메틸렌))비스(1H-1,2,3-트리아졸-4,1-디일))비스(14-이소프로필-17-메틸-12,15-디옥소-3,6,9-트리옥사-13,16-디아자옥타데칸-18-오일))비스(아자네디일))비스(티오펜-5,2-디일-2-카르보닐))비스(아자네디일))비스(2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산) (XT100)
DMF(2.5 mL) 중의 XT99(22 mg, 0.019 mmol) 및 XS2(3.1 mg, 7.5 μmol)의 용액을 5분 동안 N2로 퍼징하였다. 이어서, 물(60 μl) 중의 Cu(II)SO4(1.44 mg, 5.8 μmol) 및 물(60 μl) 중의 나트륨 아스코르베이트(2.22 mg, 0.011 mmol)를 연속적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 24시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 30%)로 정제하여 XT100(12.1 mg, 70%)을 수득하였다.
MS (ESI+) C105H140N32O25S2 2+ [M+2H]2+에 대한 계산치 1156.5, 실측치 [M+2H]2+ 1157.10.
(S)-5-아미노-2-(N-(4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 아미노)벤즈아미도)-부틸)-술파모일)벤조산 ( XT101 )의 제조
Figure pct00171
메틸 (S)-2-(N-(4-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-메톡시-5-옥소펜틸)술파모일)-5-니트로벤조에이트 (XJ22)
메틸 2-(클로로술포닐)-5-니트로벤조에이트(0.25 g, 0.894 mmol)를 0.5시간 동안 DIPEA(0.33　mL, 1.92 mmol)의 존재 하에 DMF(5 mL) 중의 아민 XT48(0.416 g, 0.770 mmol)과 RT에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH 1:0 내지 95:5)로 정제하여 술폰아미드 XJ22(0.159 g, 29%)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C29H31N10O10S+ [M+H]+에 대한 계산치 711.7, 실측치 711.6.
(S)-5-아미노-2-(N-(4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)부틸)-술파모일)벤조산 (XT101)
아닐린 XT101을 술폰아미드 XJ22(160 mg, 0.225 mmol)로부터 출발하여 XR22의 제조와 유사하게 제조하였다. 환원을 DMF(1.5 mL) 중의 아연 가루(442　mg, 6.75 mmol) 및 수성 포화 NH4Cl(0.375 mL)로 수행하고, THF(2.5 mL) 및 물(2.5 mL) 중의 LiOH(54 mg, 2.25 mmol)로 가수분해하였다. 미정제 생성물의 일부를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하여 XT101(13 mg)을 수득하였다.
Figure pct00172
MS (ESI+) C26H29N10O7S+ [M+H]+에 대한 계산치 625.19, 실측치 625.32.
(S)-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-메톡시-5-옥소펜탄-1-아미늄 트리프루오로아세테이트 ( XX29 )의 제조
Figure pct00173
(E)-4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)비닐)벤조산 (XT103)
N2 하에 DMA(120 mL) 중의 PPh3(31.5 g, 120 mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 브롬(6.17 mL, 120 mmol)을 적가하였다. 첨가가 완료되면, XT102(7 g, 36.4 mmol)를 얼음 냉각된 용액에 한번에 첨가하였다. (유리 염기 XT102는 XX9에 대해 기재된 바와 같이 제조됨). 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간, 및 RT에서 90분 동안 교반하였다. 에탄올(2.4 mL)을 적가하고, 혼합물을 RT에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 격렬한 교반 하에 톨루엔(380 mL)에 부었다. 여과시킨 후, 고체를 미세 현탁액이 형성될 때까지 에테르(400 mL)에서 교반하였다. 현탁액을 여과시키고, 잔류물을 밤새 공기 중에서 건조시켰다. 생성된 담갈색 분말을 질소 분위기 하에 DMA(500 mL)에 재용해시키고, PPh3(9.55 g, 36.4　mmol)을 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 75분 동안 65℃에서 가열하고, 0℃로 냉각시키고, KOtBu(18.4 g, 164 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 10분 동안 교반한 후, 메틸 4-포르밀벤조에이트(5.98 g, 36.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 45분 동안 교반하고, 이때 추가의 KOtBu(12.3 g, 109 mmol)를 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 얼음조로 냉각시키고, AcOH(25 mL, 437 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 이어서, 이 용액을 얼음 냉각된 물(2.1 L)에 부었다. 생성된 현탁액을 여과시키고, 잔류물을 MeCN(2 x 180 mL), 톨루엔(2 x 180 mL) 및 에테르(2 x 180 mL)로 연속적으로 세척하고, 밤새 공기 하에 건조시켜 카르복실산 XT103(10.4 g, 93%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00174
MS (ESI+) C15H13N6O2 + [M+H]+에 대한 계산치 309.11, 실측치 309.21.
메틸 (S,E)-5-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)비닐) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XT104)
산 XT103(9.2 g, 29.8 mmol)을 10 eq의 DIPEA를 사용하여 일반 절차 XXA에 따라 H-Orn(Boc)-OMe(9.3 g, 32.8 mmol)와 반응시켰다. 미정제 반응 혼합물을 물(2.4 L)에 붓고, 15분 동안 교반하고, 이어서 여과시켰다. 수득된 고체 잔류물을 에테르(3 x 250 mL)로 세척하고, 2일 동안 공기 중에서 건조시켜 에스테르 XT104(1.8 g, 83%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00175
MS (ESI+) C26H33N8O5 + [M+H]+에 대한 계산치 537.26, 실측치 537.67.
메틸 (S)-5-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XT105)
AcOH(450 mL) 중의 XT104(11.2 g, 20.9 mmol)의 용액을 함유하는 질소 퍼징된 플라스크에 Pd/C(5 g, 활성탄 상 10%)를 첨가하였다. 수소 기체를 도입하고, 혼합물을 RT에서 수소 분위기 하에 교반하였다. Pd/C(2.5 g)의 3개의 추가 부분을 3시간 간격으로 첨가하였다. 24시간 후, 플라스크를 N2로 퍼징하고, 이어서 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과시켰다. MnO2(18.2 g, 209 mmol)를 여액에 첨가하고, 현탁액을 30분 동안 교반하였다. 셀라이트 상에서 여과시킨 후, 여액을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 15:85)로 정제하여 XT105(6.9 g, 61%)를 모래색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00176
MS (ESI+) C26H35N8O5 + [M+H]+에 대한 계산치 539.27, 실측치 539.62.
(S)-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-메톡시-5-옥소펜탄-1-아미늄 트리프루오로아세테이트 (XX29)
화합물 XT105(1.10 g, 2.04 mmol)를 DCM(10 mL)에 현탁시키고, TFA(10　mL)를 RT에서 첨가하였다. RT에서 20분 동안 교반한 후, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 iPrOH(2x)와 함께 공증발시키고, 이어서 iPrOH(10　mL)에 현탁시켰다. 현탁액을 에테르(60 mL)로 희석시키고, 고체를 여과시키고, 진공 하에 건조시켜 TFA 염 XX29(1.03 g, 88%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00177
MS (ESI+) C21H27N8O3 + [M+H]+에 대한 계산치 439.22, 실측치 439.56.
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 (6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥사노일)글리실글리실-L-페닐알라니네이트 ( XX30 )의 제조
Figure pct00178
DCC(459 mg, 2.222 mmol)를 RT에서 THF(40 mL) 중의 XT53(1.05 mg, 2.22 mmol) 및 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온 (256 mg, 2.222 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 3.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과시키고, DCM을 사용하여 잔류물을 철저히 세척하였다. 여액을 EtOAc로 희석시키고, 이어서 농축시켰다. 백색 고체를 적은 부피의 EtOAc에 현탁시키고, 이어서 여과시켜 OSu-에스테르 XX30(612　mg, 48%)을 백색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C27H32N5O9 + [M+H]+에 대한 계산치 570.22, 실측치 570.43.
나트륨 5-((S)-5-벤질-18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10,13-테트라옥소-3,6,9,12-테트라아자옥타데칸아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤젠술포네이트 ( XX19 )의 제조
Figure pct00179
메틸 2-(클로로술포닐)-4-니트로벤조에이트 (XX14)
EtOAc(21 mL) 및 진한 HCl(22 mL) 중의 아닐린 XX13(2.47 g, 12.6 mmol)에 0℃에서 물(5.7 mL) 중의 NaNO2(0.912 g, 13.2 mmol)의 용액을 적가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후, Cu(II)Cl2 이수화물(0.966 g, 5.67 mmol), NaHSO3(13.1 g, 126 mmol), AcOH(16 mL) 및 진한 HCl(5.7 mL)의 현탁액을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, 침전된 술포닐 클로라이드를 여과시키고, 물로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 생성물 XX14(2.58 g, 73%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00180
2-(이소부톡시술포닐)-4-니트로벤조산 (XX15)
술포닐 클로라이드 XX14(0.971 g, 3.47 mmol)를 DCM(20 mL)에 용해시키고, 황색 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이소부탄올(1.61 mL, 17.4 mmol) 및 Et3N(0.726 mL, 5.21 mmol)를 첨가하고, 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 농축시키고, EtOAc에 용해시키고, KHSO4(0.5 M, 2x), 포화 NaHCO3 및 식염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:DCM 1:0 내지 0:1)로 정제하여 생성물 XX15(911 mg, 83%)를 담황색 오일로서 수득하였다. 이 물질의 일부(791 mg, 2.49 mmol)를 디옥산(25 mL) 및 물(16 mL)에 용해시켰다. LiOH(2M, 4.99 mL, 9.97 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 20분 후, 반응물을 물로 희석시키고, 1 M HCl로 pH 3으로 산성화하였다. EtOAc(3x)로 추출하였다. 합한 유기층을 식염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 산 XX15(756 mg, quant)를 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00181
MS (ESI-) C11H12NO7S- [M-H]-에 대한 계산치 302.03, 실측치 302.35.
4-아미노-2-(이소부톡시술포닐)벤조산 (XX16)
팔라듐(42 mg, 활성탄 상 10%)을 N2 분위기 하에 RT에서 MeOH(4 mL) 중의 산 XX15(104 mg, 0.342　mmol)에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 30분 동안 수소 분위기 하에 교반하였다. 플라스크를 N2로 퍼징하고, 혼합물을 셀라이트 상에서 여과시켰다. 이어서, 농축시켜 아닐린 XX16(83 mg, 89%)을 백색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI-) C11H14NO5S- [M-H]-에 대한 계산치 272.06, 실측치 272.34.
메틸 (S)-5-(4-아미노-2-(이소부톡시술포닐)벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XX17)
산 XX16(83 mg, 0.304 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 HATU(121 mg, 0.319 mmol) 및 아민 XT48(153 mg, 0.304 mmol)과 반응시켰다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 잔류물을 MeCN(2x)과 함께 공증발시키고, MeCN에 재현탁시키고, 여과시켰다. 고체를 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH 1:0 내지 4:1)로 정제하여 아닐린 XX17(136 mg, 62%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00182
Figure pct00183
MS (ESI+) C32H39N10O8S+ [M+H]+에 대한 계산치 723.27, 실측치 723.45.
메틸 (S)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-(2-(이소부톡시술포닐)-4-(2-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)아세트아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XX18)
THF(0.5 mL) 중의 미정제 XT49(205 mg, 1.08 mmol)의 스톡 용액을 N2 하에 제조하였다. 분리 바이알에서 아닐린 XX17(130 mg, 0.180 mmol) 및 DIPEA(0.094 mL, 0.540 mmol)를 N2 하에 DMF(2 mL)에 용해시켰다. 스톡 용액의 일부(285　 μL)를 RT에서 아닐린에 첨가하였다. 5분 후, 제2 부분(285 μL)을 첨가하고, 5분 동안 계속 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 실리카겔 상에 건조로딩하였다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH 1:0 내지 4:1)로 정제하여 아미드 XX18(106 mg, 67%)을 수득하였다.
Figure pct00184
MS (ESI+) C36H41F3N11O10S+ [M+H]+에 대한 계산치 876.27, 실측치 876.21.
나트륨 5-((S)-5-벤질-18-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10,13-테트라옥소-3,6,9,12-테트라아자옥타데칸아미도)-2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일) 메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)카르바모일)벤젠술포네이트 (XX19)
에스테르 XX18(79.2 mg, 0.090 mmol)을 하기의 변형과 함께 일반 절차 XXC에 따라 가수분해하였다: i) 반응물을 RT로 가온하지는 않았지만 0℃를 유지하였고, ii) NaOH(12 eq)를 20분 간격으로 2 부분으로 첨가하였고, iii) MeOH 및 에테르를 사용한 고체의 세척을 생략하였다. 밤새 진공 하에 고체를 건조시켜 미정제 산(68 mg)을 수득하였다. 이어서, DMF(1.0　mL) 중의 활성화된 에스테르 XX30(52.5 mg, 0.092 mmol)을 RT에서 황색 고체에 첨가하고, 이어서 DIPEA(0.097 mL, 0.553　mmol)를 첨가하였다. 20분 동안 교반한 후, 추가의 XX30(10.5 mg, 0.018 mmol)을 첨가하였다. 교반을 2분 동안 계속하였고, 이때 반응물을 농축시켰다. 잔류물을 MeCN(5 mL)에 현탁시키고, 1시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과시키고, 고체를 MeCN 및 에테르로 세척하였다. 황색 고체(107 mg)를 아세톤(11　mL)에 현탁시키고, NaI(207 mg, 1.384 mmol)를 첨가하였다. 바이알을 캡핑하고, 90분 동안 60℃에서 가열하였다. RT로 냉각시킨 후, 현탁액을 여과시키고, 고체를 아세톤(1 mL)으로 세척하였다. 미정제 생성물의 일부를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하여 XX19(4.8 mg)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C51H58N15O14S+ [M+H]+에 대한 계산치 1136.40, 실측치 1136.95.
(S)-5-(4-아미노-2-술포벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일) 메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 ( XX37 )의 제조
Figure pct00185
(S)-5-(4-아미노-2-(이소부톡시술포닐)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일) 메틸)아미노)-벤즈아미도)펜탄산 (XX36)
미정제 에스테르 XX17(128 mg, 0.177 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하여 XX36을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C30H37N10O7S+ [M+H]+에 대한 계산치 681.26, 실측치 681.46.
(S)-5-(4-아미노-2-술포벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)펜탄산 (XX37)
아세톤(6 mL) 중의 알킬 술포네이트 XX36(35.7 mg, 0.052 mmol) 및 NaI(118 mg, 0.787 mmol)를 8시간 동안 60℃에서 밀봉된 바이알에서 가열하였다. 반응물을 농축시키고, 미정제 생성물의 일부를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1%　TFA　/ MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 20%)로 정제하여 XX37(4.0 mg)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00186
MS (ESI+) C26H29N10O7S+ [M+H]+에 대한 계산치 625.19, 실측치 625.20.
(S)-5-(4-아미노-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 ( XX35 )의 제조
Figure pct00187
4-아미노-2-(2H-테트라졸-5-일)벤조산 (XX21)
DMF(4 mL) 중의 4-아미노-2-시아노벤조산(XX20; 250 mg, 1.542 mmol) 및 NaN3(203 mg, 3.13 mmol)의 용액을 N2 하에 밀봉된 바이알에서 16시간 동안 110℃에서 가열하였다. RT로 냉각시킨 후, 용액을 여과시키고, 여액을 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
MS (ESI+) C8H8N5O2 + [M+H]+에 대한 계산치 206.07, 실측치 206.22.
메틸 (S)-5-(4-아미노-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XX34)
XX21(0.5 mL 미정제 여액, DMF 중)의 분취량을 DMF(1.0 mL) 중의 XT48(100 mg, 0.185 mmol) 및 DIPEA(0.194 mL, 1.110 mmol)의 용액에 첨가하였다. HATU(70.4　mg, 0.185 mmol)를 RT에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 추가의 XT48(20 mg, 0.037 mmol) 및 HATU(14.07 mg, 0.037 mmol)를 첨가하고, 15분 후 반응물을 농축시키고, MeCN(6 mL)에 현탁시켰다. 45분 동안 교반한 후, 현탁액을 여과시키고, 고체를 MeCN 및 에테르로 세척하여 미정제 XX34(126 mg)를 크림 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C29H31N14O5 + [M+H]+에 대한 계산치 655.26, 실측치 655.42.
(S)-5-(4-아미노-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XX35)
미정제 에스테르 XX34(58 mg, 0.089 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 미정제 생성물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 10% - 25%)로 정제하여 XX35(14.8 mg)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00188
MS (ESI+) C27H29N14O4 + [M+H]+에 대한 계산치 613.25, 실측치 613.34.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)펜탄산 ( XX23 )의 제조
Figure pct00189
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-아미노프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XX22)
DMF(1.8 mL) 중의 미정제 XX34(245 mg, 0.374 mmol)의 용액에 N2 하에 RT에서 Fmoc-Ala-OH(175 mg, 0.561 mmol), HATU(213 mg, 0.561 mmol) 및 DIPEA(0.392 mL, 2.25 mmol)를 첨가하였다. 30분 후, 추가의 Fmoc-Ala-OH(23.3 mg, 0.075 mmol) 및 HATU(28.5 mg, 0.075 mmol)를 첨가하고, 30분 동안 계속해서 교반하였다. 반응물을 농축시키고, MeCN(6 mL)에 현탁시키고, RT에서 45분 동안 교반하였다. 여과시킨 후, 황색 고체(355 mg)를 DMF(6 mL)에 용해시키고, 피페리딘(0.593 mL, 5.99　mmol)을 RT에서 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, 반응물을 농축시키고, 에테르(10 mL)에 현탁시키고, RT에서 1시간 동안 교반하였다. 고체를 여과시키고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 미정제 아민 XX22(270 mg)를 담황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C32H36N15O6 + [M+H]+에 대한 계산치 726.30, 실측치 726.27.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-아미노프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XX31 )
미정제 아민 XX22(169 mg)를 DMF(0.5 mL)에 용해시켰다. Boc-Val-OSu(72.1 mg, 0.229 mmol) 및 DIPEA(0.073 mL, 0.417 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 2시간 후, 추가의 Boc-Val-OSu(10 mg, 0.032 mmol) 및 DIPEA(0.025 mL, 0.146 mmol)를 RT에서 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 농축 후, 잔류물을 MeCN(275 mL)에 현탁시키고, 환류 가열하였다. 현탁액을 뜨겁게 여과시키고, 이어서 RT로 냉각시켰다. 용액을 대략 15 mL 부피로 농축시키고, 이어서 여과시켜 미정제 디펩티드(59 mg)를 크림 고체로서 수득하였다. 고체를 DCM(2 mL)에 현탁시키고, TFA(2 mL)를 RT에서 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 반응물을 농축시키고, 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 10% - 25%)로 정제하였다. MeCN을 회전 증발에 의해 생성물 분획으로부터 제거시키고, 수상을 동결건조시켜 아민 XX31(22.2 mg)을 백색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C37H45N16O7 + [M+H]+에 대한 계산치 825.37, 실측치 825.50.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-(2H-테트라졸-5-일)벤즈아미도)펜탄산 (XX23)
아민 XX31(22.2 mg, 0.021 mmol)을 THF(0.6 mL)/물(0.15 mL)에 용해시켰다. 수산화리튬 수화물(6.19 mg, 0.148 mmol)을 RT에서 첨가하고, 혼합물을 90분 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, AcOH(0.014 mL, 0.253 mmol)를 첨가하고, 이어서 톨루엔(5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 DMF(0.5 mL)에 재용해시키고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(6.8 mg, 0.022 mmol) 및 DIPEA(0.015 mL, 0.084 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 90분 동안 교반하고, 이어서 농축시켰다. 잔류물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. MeCN을 회전 증발에 의해 생성물 분획으로부터 제거시키고, 수상을 동결건조시켜 테트라졸 XX23(9.9 mg)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C45H54N17O9 + [M+H]+에 대한 계산치 976.43, 실측치 976.48.
(S)-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 ( XX41 )의 제조
Figure pct00190
5-아미노-2-((트리메틸실릴)에티닐)벤조니트릴 (XX39)
EtOH(40 mL) 중의 요오다이드 XX38(5.13 g, 18.7 mmol, 문헌(Ozaki et al, Tetrahedron, 2017, 73, 7177-7184)에 따라 제조됨)의 현탁액을 N2 하에 RT에서 SnCl2 이수화물(21.1 g, 93.5 mmol)에 첨가하였다. 20분 후, 현탁액은 짙은 오렌지색 적색 용액으로 변하였다. 플라스크를 RT 수조로 냉각시켜 시간이 지남에 따라 발생한 일부 발열을 소멸시켰다. 2시간 동안 교반한 후, 새로운 현탁액을 형성하였다. 이어서, 반응물을 물(120 mL) 중의 NaOH(15.0 g)의 냉각된(0℃) 용액에 부었다. 혼합물을 5분 동안 교반하고, 이어서 여과사켰다. 고체를 냉각된 수성 NaOH(2 M), 및 물로 세척하였다. 진공 하에 건조시킨 후, 아닐린(3.94 g, 86%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
아닐린(3.94 g, 16.2 mmol)을 50 mL 3구 플라스크에 넣고, CuI(61.5　mg, 0.323 mmol) 및 PdCl2(PPh3)2(227 mg, 0.323 mmol)를 첨가하였다. 플라스크를 N2로 퍼징하고, Et3N(17.7 mL, 127 mmol) 및 에티닐트리메틸실란(2.457 mL, 17.76　mmol)을 RT에서 첨가하고, 현탁액을 4시간 동안 격렬하게 교반하였다. 현탁액은 이 시간 동안 서서히 용해되었다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:DCM 1:0 내지 0:1)로 정제하였다. 생성물 분획 농축 시, 백색 플레이크가 침전되었다. 이때 추가의 헵탄(30 mL)을 첨가하고, 현탁액을 ~35 mL의 부피로 농축시켰다. 고체를 여과시키고, 진공 하에 건조시켜 알킨 XX39(3.06 g, 76% 2 단계)를 황백색 플레이크로서 수득하였다.
MS (ESI+) C12H15N2Si+ [M+H]+에 대한 계산치 215.10, 실측치 215.15.
5-아미노-2-에티닐벤조니트릴 (XX40)
MeOH(50 mL) 중의 XX39(2.45 g, 11.43 mmol)의 용액을 15분 동안 RT에서 K2CO3(3.16 g, 22.9 mmol)로 처리하였다. 반응물을 농축시키고, EtOAc 및 물에 취하였다. 층을 분리시키고, 수층을 EtOAc(1x)로 추출하였다. 합한 유기층을 식염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 알킨 XX40(1.64 g, quant)을 크림 고체로서 수득하였다.
Figure pct00191
MS (ESI+) C9H7N2 + [M+H]+에 대한 계산치 143.06, 실측치 143.05.
(S)-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XX41)
DMF(1.7 mL) 중의 알킨 XX40(29.7 mg, 0.209 mmol) 및 아지드 XS21(94 mg, 0.209　mmol)의 용액을 5분 동안 N2로 퍼징하였다. 물(1.1 mL) 중의 CuSO4·5H2O (39.1 mg, 0.157　mmol) 및 물(1.1　mL) 중의 나트륨 아스코르베이트(62.0 mg, 0.313 mmol)를 연속적으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 40시간 동안 RT에서 교반하였다. 추가의 DMF(1 mL)를 첨가하고, 이어서 물(0.5　mL) 중의 CuSO4·5H2O (19.54 mg, 0.078 mmol) 및 물(0.5 mL) 중의 나트륨 아스코르베이트(31.0 mg, 0.157 mmol)를 첨가하고, 반응물을 추가 3일 동안 RT에서 교반하였다. 이어서, 반응물을 물(25　mL)에 붓고, 수성 AcOH(1 M, 1 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 히트건으로 가열하여 미세 현탁액을 분해하였다. RT로 냉각 후, 현탁액을 여과시킬 수 있었고, 고체를 MeCN(1 mL)로 세척하였다. 고체의 일부를 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 10% - 35%)로 정제하여 산 XX41을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00192
MS (ESI+) C29H29N12O3 + [M+H]+에 대한 계산치 593.25, 실측치 593.49.
(S)-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 ( XX47 )의 제조
Figure pct00193
메틸 (S)-5-아지도-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)펜타노에이트 (XX43)
SOCl2(1.73 mL, 23.9 mmol)를 0℃에서 MeOH(50 mL) 중의 아지드 XR19(3.49 g, 11.9 mmol)에 첨가하였다. 용액을 15분 동안 60℃로 가열하였다. RT로 냉각 후, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 톨루엔(2x)과 함께 공증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc 1:0 내지 2:1)로 정제하여 메틸 에스테르 XX43(3.52 g, 96%)을 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00194
MS (ESI+) C14H19N4O4 + [M+H]+에 대한 계산치 307.14, 실측치 307.21.
메틸 (S)-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(((벤질옥시) 카르보닐)아미노)-펜타노에이트 (XX44)
물(52 mL) 중의 CuSO4·5H2O(1.05 g, 4.22 mmol)를 RT에서 THF(280 mL) 중의 아지드 XX43(1.70 g, 5.55 mmol) 및 알킨 XX40(0.789 g, 5.55 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 20분 동안 N2로 퍼징하고, 이어서 물(52 mL) 중의 나트륨 아스코르베이트(1.649 g, 8.32 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, DMF(40.0 mL)를 첨가하고, RT에서 88시간 동안 계속해서 교반하였다. 물/식염수(1:1, 220 mL) 혼합물을 첨가하고, 이어서 생성물을 EtOAc/헵탄(1:1, 2 x 200 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 식염수(2 x 100 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc 1:0 내지 0:1)로 정제하여 트리아졸 XX44(2.09 g, 84%)를 황색의 끈적한 오일로서 수득하였다.
Figure pct00195
Figure pct00196
MS (ESI+) C23H25N6O4 + [M+H]+에 대한 계산치 449.19, 실측치 449.31.
메틸 (S)-2-아미노-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)펜타노에이트 (XX45)
트리아졸 XX44(1.12 g, 2.497 mmol)를 RT에서 H2-분위기 하에 EtOAc(22 mL) 중의 Pd/C(활성탄 상 10% 팔라듐, 0.133 g, 0.125 mmol)와 반응시켰다. 16시간 후, 플라스크를 N2로 퍼징하고, 추가의 Pd/C(활성탄 상 10% 팔라듐, 0.200　g, 0.188 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 수소 기체를 재도입하고, 혼합물을 RT에서 추가의 4.5시간 동안 교반하였다. 플라스크를 N2로 퍼징하고, 셀라이트 상에서 여과시켰다. 이어서, 디옥산(4.0 N, 2.0 mL) 중의 HCl을 여액에 첨가하였다. 여액의 부피를 회전 증발에 의해 대략 50 mL로 감소시키고, 이어서 현탁액을 여과시키고, 고체를 EtOAc 및 에테르로 세척하였다. 백색 고체를 진공 하에 건조시켜 아민 XX45(849 mg, 88%)를 디히드로클로라이드 염으로서 수득하였다.
Figure pct00197
MS (ESI+) C15H19N6O2 + [M+H]+에 대한 계산치 315.16, 실측치 315.25.
메틸 (S)-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)펜타노에이트 (XX46)
DMF(10 mL) 중의 아민 XX45(498 mg, 1.29 mmol)의 디히드로클로라이드 염을 일반 절차 XXA에 따라 아민 XT48(397 mg, 1.17 mmol)과 반응시켰다. 농축 후, 미정제 생성물을 RT에서 3일 동안 MeCN(10 mL)에서 교반하고, 이어서 여과시켰다. 고체를 MeCN 및 에테르로 세척하고, 마지막으로 진공 하에 건조시켜 아미드 XX46(688 mg, 93%)을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C30H30N13O4 + [M+H]+에 대한 계산치 636.25, 실측치 636.45.
(S)-5-(4-(4-아미노-2-시아노페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XX47)
에스테르 XX46(330 mg, 0.519 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 미정제 생성물의 일부를 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 10% - 30%)로 정제하여 산 XX47을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00198
Figure pct00199
MS (ESI+) C28H28N13O3 + [M+H]+에 대한 계산치 594.24, 실측치 594.39.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-히드록시벤즈아미도)펜탄산 ( XX28 )의 제조
Figure pct00200
벤질 (S)-4-(2-아미노프로판아미도)-2-(벤질옥시)벤조에이트 (XX25)
DMF(150 mL) 중의 4-아미노-2-히드록시벤조산(XX24; 5.00 g, 32.7 mmol)의 교반 용액에 KOtBu(4.03 g, 35.9 mmol)를 첨가하였다. 15분 후, BnBr(4.27　mL, 35.9 mmol)을 적가하고, 현탁액을 추가 4시간 동안 RT에서 교반하고, 반응 용기를 0℃로 다시 냉각시켰다. 이때 추가의 KOtBu(4.03 g, 35.9　mmol) 및 BnBr(4.27 mL, 35.9 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하고, 이어서 물로 ??칭시키고, EtOAc(3x)로 추출하였다. 합한 유기층을 헵탄으로 2:1로 희석시키고, 이어서 물(2x) 및 식염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 실리카겔 상에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄 중 0-60% EtOAc)로 정제하여 벤질 에스테르(5.30 g)를 수득하였다.
생성물을 XT11에 대한 절차에 따라 Fmoc-Ala-Cl과 반응시켰다. 반응 혼합물 농축 후, 미정제물을 EtOAc에 용해시키고, 수층이 산성일 때까지 HCl(0.1 M)로 세척하였다. 합한 수층을 EtOAc로 역추출하고, 합한 유기층을 포화 수성 NaHCO3 및 식염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 끈적한 담황색 검(11.08 g)을 수득하였다.
MS (ESI+) C39H34N2NaO6 [M+Na]+에 대한 계산치 649.23, 실측치 649.44.
미정제물을 DMF(122 mL)에 용해시키고, 피페리딘(49 mL)을 RT에서 첨가하였다. 3분 후, 반응물을 농축시키고, 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM 중의 0-20% MeOH)로 정제하여 아민 XX25(4.45 g, 34%, 3 단계)를 수득하였다.
Figure pct00201
MS (ESI+) C24H25N2O4 [M+H]+에 대한 계산치 405.18, 실측치 405.29.
2-(벤질옥시)-4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)벤조산 (XX26)
DIPEA(4.81 mL, 27.5 mmol) 및 Boc-Val-OSu(3.81 g, 12.1 mmol)를 RT에서 DMF(50 mL) 중의 아민 XX25(4.45 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 5시간 동안 교반하고, 이어서 물에 부었다. 혼합물을 EtOAc / 헵탄(1:1, 3x)로 추출하였다. 합한 유기층을 물(2x) 및 식염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(헵탄 중 0-100% EtOAc))로 정제하여 디펩티드(6.57 g)를 수득하였다.
미정제 생성물을 THF(39 mL)/MeOH(8 mL)에 취하고, 물(15.7 mL) 중의 수산화리튬 수화물(1.69 g, 40.3 mmol)을 RT에서 첨가하였다. 혼합물을 19시간 동안 교반한 후, 유기물을 회전 증발로 제거시켰다. 물(300 mL)을 첨가하고, 혼합물을 여과시키고, 물(100 mL)로 세척하고, 고체를 에테르(2 x 150 mL)로 세척하였다. 두 에테를 분획을 별도로 사용하여 수층을 세척하였다. EtOAc(250 mL)를 수층에 첨가하고, HCl(1.0 M, 41 mL)을 첨가하고, 고체를 첨가하였다. 혼합 후, 생성물을 유기상에 용해시켰다. 수층을 EtOAc(2 x 100 mL)로 세척하고, 에테르 분획을 포함한 합한 유기층을 식염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 이어서, 형성된 백색 고체를 ~1:1 EtOAc/헵탄(~20 mL)에 현탁시키고, 여과시켜 산 XX26(3.78 g, 67%, 2 단계)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00202
MS (ESI+) C27H36N3O7 [M+H]+에 대한 계산치 514.26, 실측치 514.61.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-히드록시벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XX27)
산 XX26(421 mg, 0.820 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 HATU(374 mg, 0.983 mmol) 및 XT48(413 mg, 0.820 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH 1:0 내지 4:1)로 정제하여 황색 고체를 수득하고 뜨거운 MeCN(6 mL)에 현탁시켰다. RT로 냉각 후, 고체를 여과시키고, 10분 동안 물에서 교반하였다. 여과 및 건조 후, 미정제 벤질 에테르(200 mg, 0.208 mmol)를 2시간 및 20분 동안 RT에서 H2 분위기 하에 AcOH(2.0 mL) 중의 Pd(OH)2/C(활성탄 상 20%, 100 mg)와 반응시켰다. 이어서, 반응물을 N2로 퍼징하고, 셀라이트 상에서 여과시켰다. 농축 후, 물질을 톨루엔과 함께 공증발시켰다. 고체를 DMF(1 mL)/DCM(3 mL)에 용해시키고, MnO2(300 mg)를 RT에서 첨가하였다. 3시간 교반한 후, 반응물을 여과시키고, 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM 중의 0-20% MeOH)로 정제하여 페놀 XX27(79 mg, 11%, 2 단계)을 수득하였다.
MS (ESI+) C41H53N12O10 [M+H]+에 대한 계산치 873.40, 실측치 873.90.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-히드록시벤즈아미도)펜탄산 (XX28)
페놀 XX27(79 mg, 0.090 mmol)을 일반 절차 XXC에 기재된 바와 같이 NaOH와 반응시켜 산(75 mg)을 녹색/회색 고체로서 수득하였다. 물질을 DCM(2.0 mL)에 현탁시키고, TFA(2.0 mL)를 0℃에서 첨가하였다. 30분 후, 반응물을 농축시켰다. 갈색 오일을 DMF(3 mL)에 용해시키고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(29.1 mg, 0.094 mmol) 및 DIPEA(0.063 mL, 0.360 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 추가의 DIPEA(0.031 mL, 0.180 mmol) 및 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(5.55 mg, 0.018 mmol)를 각각 20분 및 90분 후 첨가하고, 반응을 2시간 후 정지시켰다. 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 유기 용매를 회전 증발로 제거시키고, 이어서 수용액을 동결건조시켰다. 고체를 상이한 용출제(물 x 0.1% TFA / MeOH:MeCN(1:1) x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)를 사용하여 분취용 RP-HPLC로 한번 더 정제하였다. 유기 용매를 회전 증발로 제거시키고, 이어서 수용액을 동결건조시켜 페놀 XX28(3.1 mg)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C44H54N13O10 [M+H]+에 대한 계산치 924.41, 실측치 924.91.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜탄산 ( XJ4 )의 제조
Figure pct00203
메틸 (S)-5-(4-아지도벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XJ2)
산 XJ1(514 mg, 1.67 mmol, US 2005/0020833 및 US　2009/0253719에 기재된 바와 같이 합성됨)을 일반 절차 XXA에 따라 아민 XX3(534 mg, 1.83 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 에스테르 XJ2(474 mg, 49%)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C30H32N9O4 + [M+H]+에 대한 계산치 582.25, 실측치 582.62.
메틸 (S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XJ3)
아지드 XJ2(474 mg, 0.815 mmol)의 환원을 일반 절차 XXB에 따라 수행하여 아닐린 XJ3(453 mg, quant)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C30H34N7O4 + [M+H]+에 대한 계산치 556.26, 실측치 556.62.
(S)-5-(4-아미노벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜탄산 (XJ4)
에스테르 XJ3(45 mg, 0.081 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하여 산 XJ4(9 mg, 20%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00204
MS (ESI+) C29H32N7O4 + [M+H]+에 대한 계산치 542.24, 실측치 542.62.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도) 펜탄산 ( XJ9 )의 제조
Figure pct00205
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸)벤즈아미도)펜타노에이트 (XJ6)
아닐린 XJ3(405 mg, 0.729 mmol)을 XT11에 대한 절차에 따라 반응시켜 아미드 XJ5(quant)를 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C48H49N8O7 + [M+H]+에 대한 계산치 849.36, 실측치 849.49.
Fmoc-보호된 아민 XJ5(619 mg, 0.729 mmol)를 TBAF·3H2O 및 데칸티올로 탈보호시키고, 이어서 XT11의 XT12로의 전환과 유사하게 Boc-Val-OSu와 반응시켰다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 테트라부틸아민 염으로 오염된 디펩티드 XJ6(317 mg, 52%)을 수득하였다.
MS (ESI+) C43H56N9O8 + [M+H]+에 대한 계산치 826.42, 실측치 826.83.
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XJ8)
디펩티드 XJ6(310 mg, 0.375 mmol)을 XT13에 대한 절차에 따라 탈보호시켰다. 미정제 생성물(272 mg)을 일반 절차 XXC에 따라 NaOH로 가수분해하여 XJ8(84 mg, 32%)을 황백색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C37H46N9O6 + [M+H]+에 대한 계산치 712.35, 실측치 712.80.
(S)-2-(4-(2-(2,4-디아미노퀴나졸린-6-일)에틸)벤즈아미도)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 펜탄산 (XJ9)
아민 XJ8(76 mg, 0.107 mmol)을 XT17에 대한 절차에 따라 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(32.9 mg, 0.107 mmol) 및 DIPEA(0.112 mL, 0.64 mmol)와 반응시켰다. 미정제 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 95%)로 정제하였다. 생성물 분획은 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 XJ9(21.6 mg, 22%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00206
MS (ESI+) C47H57N10O9 + [M+H]+에 대한 계산치 905.42, 실측치 905.94.
(S)-5-아미노)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)펜탄산 ( XJ11 ) 및 (S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)-5-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질)옥시)카르보닐)아미노) 펜탄산 ( XJ13 )의 제조
Figure pct00207
(S)-5-아미노)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XJ11)
NaOH(12 eq)를 사용한 포름아미드 XT47(270 mg, 0.476 mmol)의 가수분해를 일반 절차 XXC에 따라 수행하였다. 이어서, 생성물(178 mg)을 XT13에 대한 절차에 따라 TFA로 탈보호시켰다. 미정제 생성물(40 mg)의 일부를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 5% - 35%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 XJ11(6.7 mg)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00208
MS (ESI+) C19H24N9O3 + [M+H]+에 대한 계산치 426.19, 실측치 426.31.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질)옥시)카르보닐)아미노)펜탄산 ( XJ13)
아민 XJ11(234 mg, 0.358 mmol)을 1.5시간 동안 Et3N(0.150 mL, 1.07 mmol)의 존재 하에 0℃에서 DMF(4 mL) 중의 XJ12(271 mg, 0.358 mmol) (Elgersma et al, Mol. Pharm. 2015, 12, 1813-35)와 반응시키고, 이 시간 동안 온도는 서서히 RT에 도달하도록 하였다. 농축 후, 미정제 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 25% - 75%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 XJ13(99 mg, 27%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00209
MS (ESI+) C47H60N15O13 + [M+H]+에 대한 계산치 1042.44, 실측치 1042.92.
(S)-2-(5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜탄아미도)-N1,N5-디(프로프-2-인-1-일)펜탄디아미드 ( XS2 )의 제조
Figure pct00210
tert-부틸 (S)-(1,5-디옥소-1,5-비스(프로프-2-인-1-일아미노)펜탄-2-일)카르바메이트 (XS1)
DCM(15 mL) 중의 Boc-Glu-OH(769 mg, 3.11 mmol) 및 프로파르길아민(438 μL, 6.85 mmol)의 현탁액에 0℃에서 Et3N (1.74 mL, 12.5 mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) (1.49 g, 7.78 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에 도달하게 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, EtOAc(30 mL)에 취하고, 물(30 mL)로 세척하였다. 수층을 EtOAc(2 x 30 mL)로 추출하고, 합한 유기층을 포화 수성 NaHCO3(2 x 30 mL) 및 식염수(30 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. UPLC-MS 분석에 따른 생성물을 여전히 함유하는 수층을 DCM(2 x 20 mL)으로 추출하고, 합한 DCM 층을 식염수(30 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조키고, EtOAc 추출 단계의 미정제 생성물과 합하고, 진공 하에 증발시켰다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 디알킨 XS1(440 mg, 44%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00211
MS (ESI+) C16H24N3O4 + [M+H]+에 대한 계산치 322.18, 실측치 322.44.
(S)-2-(5-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)펜탄아미도)-N1,N5-디(프로프-2-인-1-일)펜탄디아미드 (XS2)
디알킬 XS1(430 mg, 1.34 mmol)을 DCM(5.0 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. TFA(5.0 mL)를 첨가하고, 반응 혼함물을 RT에 도달하게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 톨루엔(5.0 mL) 및 톨루엔:DCM(6　mL, 5:1)과 함께 공증발시키고, 고진공에서 건조시켜 아민을 적갈색 오일로서 수득하였다. 물질을 DMF(10 mL)에 용해시키고, 이어서 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(495　mg, 1.61 mmol) 및 DIPEA(1.40 mL, 8.03 mmol)를 RT에서 첨가하였다. 18시간 후, 반응 혼합물을 농축시키고, DCM:톨루엔(15 mL, 2:1)과 함께 공증발시켰다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 말레이미드 XS2(307 mg, 55%, 2 단계)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00212
MS (ESI+) C21H27N4O5 + [M+H]+에 대한 계산치 415.20, 실측치 415.34.
(S)-5-(2-클로로-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 ( XS6 )의 제조
Figure pct00213
메틸 (S)-4-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-2-클로로벤조에이트 (XS3)
메틸 4-아미노-2-클로로벤조에이트(1.00 g, 5.39 mmol)를 XT11에 대한 절차에 따라 Fmoc-Ala-Cl과 반응시켰다. ??칭된 반응 혼합물을 농축시키고 톨루엔(20 mL)과 함께 공증발시킨 후, 혼합물을 EtOAc(40 mL)에 부분적으로 용해시키고, 0.1 M HCl(2 x 15 mL)로 추출하였다. 수층을 EtOAc(20　mL)로 추출하고, 합한 유기층을 수성 NaHCO3(2 x 15 mL) 및 식염수(2 x 15 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 아미드 XS3(2.63 g, quant, 2 단계)을 담황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C26H24ClN2O5 + [M+H]+에 대한 계산치 479.14, 실측치 479.30.
메틸 4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-클로로벤조에이트 (XS4)
카르바메이트 XS3(2.63 g, 5.49 mmol)에 피페리딘(39.0 mL, 395 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 탈보호된 생성물(1.17 g, 83%)을 담갈색 오일로서 수득하였다. 물질의 일부(1.15 g, 4.48 mmol)를 DMF(20 mL)에 용해시켰다. 이어서, DIPEA(1.96 mL, 11.2 mmol) 및 Boc-Val-OSu(1.55 g, 4.93　mmol)를 RT에서 첨가하고, 생성된 용액을 3시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(240 mL)에 붓고, 수층을 EtOAc:헵탄(1:1, 3 x 80 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(100　mL) 및 식염수(2 x 50 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:헵탄 0:1 내지 1:1)로 정제하여 아미드 XS4(1.51 g, 74%)를 황백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00214
MS (ESI+) C21H31ClN3O6 + [M+H]+에 대한 계산치 456.19, 실측치 456.56.
메틸 (S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-클로로벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XS5)
에스테르 XS4(0.750 g, 1.65 mmol)를 디옥산(17 mL) 및 물(10 mL)에 현탁시켰다. 수성 LiOH(2.0 M, 3.29 mL, 6.58 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 4시간 동안 RT에서 교반하였다. 추가의 디옥산(10 mL)을 첨가하고, 1시간 동안 계속해서 교반하였다. 물(25　mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1 M HCl로 pH 3으로 산성화하였다. 생성물을 EtOAc(3 x 35 mL)로 추출하고, 합한 유기층을 식염수(2 x 50 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 미정제 산(0.125　g, 0.284 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 아민 XT48(0.146 g, 0.270 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 아미드 XS5(0.159 g, 66%, 2 단계)를 황색의 끈적한 고체로서 수득하였다.
Figure pct00215
Figure pct00216
MS (ESI+) C41H52ClN12O9 + [M+H]+에 대한 계산치 891.37, 실측치 891.83.
(S)-5-(2-클로로-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XS6)
DMSO(0.16 mL) 및 MeOH(0.80 mL) 중의 메틸 에스테르 XS5(0.159 g, 0.178 mmol)의 현탁액에 10℃에서 NaOH(2.0 M, 0.535 mL, 1.07 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 RT에 도달하게 하고, 15분 동안 교반하였다. 추가의 NaOH(2.0 M, 0.535 mL, 1.07 mmol)를 첨가하고, 2시간 후 반응 혼합물을 DMSO(0.32 mL) 및 MeOH(1.6 mL)로 희석시켰다. 반응물을 2시간 동안 교반하고, 이어서 NaOH(2.0 M, 0.535 mL, 1.07 mmol)를 최종적으로 첨가하고, 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성물을 AcOH(1.0 M, 6.0 mL)를 첨가하여 침전시키고, 여과시키고, 물(2.0　mL), MeCN(2.0 mL) 및 Et2O(2.0 mL)로 세척하였다. 미정제 물질을 DCM(5.0 mL)에 현탁시키고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. TFA(5.0 mL)를 적가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 이어서 톨루엔(10 mL)과 함께 공증발시켜 미정제 아민을 황색 오일로서 수득하였다. 물질을 DMF(6.0 mL)에 용해시키고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(55.1 mg, 0.179 mmol) 및 DIPEA(0.125 mL, 0.715 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 15분 후, 추가의 DIPEA(0.125 mL, 0.715 mmol)를 첨가하고, 이어서 2.5시간 후 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(11.0 mg, 0.036 mmol)를 첨가하였다. 3.5시간의 총 반응 시간 후 반응 혼합물을 농축시키고, 이어서 톨루엔(5 mL)과 함께 공증발시켰다. 미정제물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 말레이미드 XS6(22.3 mg, 13%, 3 단계)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C44H53ClN13O9 + [M+H]+에 대한 계산치 942.38, 실측치 942.90.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)-2-플루오로벤즈아미도)부틸)카르바모일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 ( XS12 )의 제조
Figure pct00217
4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)-2-플루오로벤조산 (XS7)
브롬(0.804 mL, 15.6 mmol)을 10분에 걸쳐 0℃에서 DMA(14 mL) 중의 PPh3(4.09 g, 15.6 mmol)의 현탁액에 적가하였다. 30분 동안 교반 후, (2,4-디아미노프테리딘-6-일)메탄올(1.00 g, 5.20 mmol, XX9에 대해 기재된 바와 같이 제조됨)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반하였다. 마지막으로, 4-아미노-2-플루오로벤조산(1.07 g, 6.90 mmol) 및 BaO(1.11 g, 6.50 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 24시간 동안 55℃에서 가열하였다. RT로 냉각 후, 반응 혼합물을 DCM:MeOH(150 mL, 29:1)에 붓고, 고체를 여과로 수집하였다. 잔류물을 물(50 mL)에서 교반하고, 여과시키고, 뜨거운 MeCN(60 mL)에서 교반하고, RT로 냉각시킨 후 여과시켜 아닐린 XS7(1.30 g, 76%)을 갈색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C14H13FN7O2 + [M+H]+에 대한 계산치 330.11, 실측치 330.35.
4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)-2-플루오로벤조산 (XS8)
포름산(48.3 mL, 1.26 mol) 중의 아세트산 무수물(11.1 mL, 118 mmol)의 용액을 RT에서 40분 동안 교반하고, 이후 아닐린 XS7(1.30 g, 3.94 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 환류 하에 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 RT로 냉각시키고, 농축시켰다. 잔류물을 물(88 mL)/수성 NH4OH(35%, 12.6 mL)에 용해시키고, 이어서 30분 동안 70℃로 가열하였다. 혼합물을 여과시키고, 여액을 AcOH로 pH~5.5로 산성화하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 이어서 45분 동안 50℃에서 물/AcOH(55 mL, 10:1)에서 교반하였다. 여과시킨 후, 고체를 물(2 x 10 mL), EtOH(2 x 5 mL) 및 Et2O(2 x 5 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 포름아미드 XS8(0.788 g, 55%)을 담갈색 분말로서 수득하였다.
Figure pct00218
MS (ESI+) C15H13FN7O3 + [M+H]+에 대한 계산치 358.11, 실측치 358.38.
메틸 (S)-5-(5-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)-2-플루오로벤즈아미도)펜타노에이트 (XS9)
산 XS8(760 mg, 2.13 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 아민 XT6(871 mg, 2.66 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:3)로 정제하여 아미드 XS9(406 mg, 30%)를 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00219
MS (ESI+) C29H28FN10O6 + [M+H]+에 대한 계산치 631.22, 실측치 631.66.
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)-2-플루오로벤즈아미도)펜타노에이트 (XS10)
아닐린 XS9(315 mg, 0.500 mmol)를 XT11에 대한 절차에 따라 Fmoc-Ala-Cl과 반응시켰다. ??칭된 반응 혼합물을 농축시키고, MeOH:톨루엔(30 mL, 1:2)과 함께 공증발시킨 후, 물질을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 아미드 XS10(0.352 g, 76%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00220
Figure pct00221
MS (ESI+) C47H43FN11O9 + [M+H]+에 대한 계산치 924.32, 실측치 924.86.
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)-2-플루오로벤즈아미도)펜타노에이트 (XS11)
Fmoc-보호된 아민 XS10(0.150 g, 0.162 mmol)을 TBAF·3H2O 및 데칸티올로 탈보호시키고, 이어서 XT11의 XT12로의 전환과 유사하게 Boc-Val-OSu와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하여 아미드 XS11(85 mg, 46%, 2 단계)을 황색 필름으로서 수득하였다.
MS (ESI+) C42H50FN12O10 + [M+H]+에 대한 계산치 901.38, 실측치 901.90.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)-2-플루오로벤즈아미도) 부틸)카르바모일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XS12)
0℃에서 DCM(3.0 mL) 중의 카르바메이트 XS11(85 mg, 0.094 mmol)의 현탁액에 TFA(3.0 mL)를 적가하였다. 반응 혼합물을 RT에 도달하게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 용액을 농축시키고, DCM:톨루엔(7 mL, 2:5) 및 톨루엔(5 mL)과 함께 공증발시켜 미정제 아민을 암황색 필름으로서 수득하였다. 물질을 MeOH/DMSO(0.60 mL, 5:1)에 용해시키고, 수성 NaOH(2.0 M, 0.285 mL, 0.569 mmol)를 10℃에서 적가하였다. 냉각조를 제거시키고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 추가의 수성 NaOH(0.285 mL, 0.569 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, 수성 AcOH(1.0 M, 1.0 mL)를 첨가하고, 이어서 물(2.0 mL)을 첨가하였다. 고체를 여과시키고, 이어서 물(2 mL) 및 MeCN(2 mL)으로 세척하고, DMF(15 mL)에 용해시켰다. 이어서, 이 용액에 RT에서 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(0.035 g, 0.11 mmol) 및 DIPEA(0.100 mL, 0.572 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 4시간 동안 교반하고, 이어서 농축시키고, DCM:톨루엔(10 mL, 1:4)과 함께 공증발시키고, 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 말레이미드 XS12(19.6 mg, 21%, 3 단계)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00222
Figure pct00223
MS (ESI+) C45H53FN13O11 + [M+H]+에 대한 계산치 970.40, 실측치 971.00.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-히드록시벤즈아미도)펜탄산 ( XS14 )의 제조
Figure pct00224
메틸 (S)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-(4-히드록시벤즈아미도)펜타노에이트 (XS13)
아민 XT48(97 mg, 0.18 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 4-히드록시벤조산과 반응시켰다. 반응 혼합물 농축 후, 미정제물을 DCM/톨루엔(4 mL, 1:1), 톨루엔(5 mL) 및 MeCN 2 x 2 mL과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 5분 동안 MeOH/MeCN(3 mL, 1:1)에서 교반하고, 이어서 여과시켰다. 고체를 MeCN(2 mL) 및 Et2O(2 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시킨 후, 아미드 XS13(44 mg, 44%)을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C28H30N9O6 + [M+H]+에 대한 계산치 588.23, 실측치 588.66.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-히드록시벤즈아미도)펜탄산 (XS14)
MeOH/DMSO(0.48 mL, 5:1) 중의 에스테르 XS13(44 mg, 0.074 mmol)의 현탁액을 10℃로 냉각시키고, 이어서 수성 NaOH(2.0 M, 0.223 mL, 0.446 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 RT에서 교반하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 수성 AcOH(1.0 M, 0.6 mL)를 첨가하고, 이어서 물(1.3 mL)을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반하였다. 고체를 여과로 수집하고, 물(1 mL), MeCN(1.0 mL) 및 Et2O(2 x 1 mL)로 세척하고, 고진공에서 건조시켰다. 잔류물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 10% - 55%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 산 XS14(21.2 mg, 52%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00225
MS (ESI+) C26H28N9O5 + [M+H]+에 대한 계산치 546.22, 실측치 546.63.
(S)-5-(5-아미노티오펜-2-카르복스아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XS16)의 제조
Figure pct00226
메틸 (S)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-(5-니트로티오펜-2-카르복스아미도)펜타노에이트 (XS15)
티오닐 클로라이드(0.621 mL, 8.51 mmol) 중의 5-니트로티오펜-2-카르복실산(67 mg, 0.389 mmol)의 용액을 4시간 동안 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 RT로 냉각시키고, 헵탄(2 x 1 mL)과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 DMF(0.48 mL)에 용해시키고, 0℃에서 DMF(0.48 mL) 중의 아민 XT48(0.200 g, 0.370 mmol) 및 Et3N(0.103 mL, 0.740 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 RT에서 교반하고, 이어서 MeOH(5 mL)로 ??칭시켰다. 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(2 x 5 mL)과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 MeOH(10 mL)에 용해시키고, MeCN(20 mL)을 첨가하여 침전을 유도하였다. MeOH를 부분적으로 증발시키고, 나머지 용액을 밤새 4℃에서 저장하였다. 고체를 여과로 수집하고, MeCN(1 mL) 및 Et2O (2 mL)로 세척하였다. 여액을 농축시키고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 1:4)로 정제하였다. 단리된 생성물을 잔류물과 합하여 아미드 XS15(0.122 g, 53%)를 수득하였다.
Figure pct00227
MS (ESI+) C26H27N10O7S+ [M+H]+에 대한 계산치 623.18, 실측치 623.52.
(S)-5-(5-아미노티오펜-2-카르복스아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XS16)
아미드 XS15(0.122 g, 0.196 mmol)를 DMF(2.0 mL)/수성 NH4Cl(7.2　M, 0.383 mL, 2.74 mmol)에 용해시켰다. 아연 분말(0.128 g, 1.96 mmol)을 RT에서 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과시키고, 여액을 18시간 동안 공기 하에 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, MeCN(2 mL)과 함께 공증발시켰다. 잔류물을 MeCN(10 mL)에 현탁시키고, 고체를 여과로 수집하였다. 고체를 MeCN(1 mL) 및 Et2O(2 mL)로 세척하고 이어서 진공 하에 건조시켜 갈색 고체를 수득하였다. 물질을 MeOH/DMSO(0.48　mL, 5:1)에 현탁시키고, NaOH(2.0 M, 0.187 mL, 0.375 mmol)를 적가하고, 반응 혼합물을 RT에서 5시간 동안 교반하였다. 수성 AcOH(1.0 M, 0.40 mL)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 물(1.6 mL)을 첨가하고, 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 밤새 4℃에서 저장하였다. 침전물을 여과로 수집하고, 고체를 물(0.5 mL), MeCN(0.5 mL) 및 Et2O (1 mL)로 세척하였다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 10% - 25%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 산 XS16(4.7 mg, 4%, 2 단계)을 담황색 성긴(fluffy) 고체로서 수득하였다.
Figure pct00228
MS (ESI+) C24H27N10O4S+ [M+H]+에 대한 계산치 551.19, 실측치 551.37.
메틸 5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)-2-에티닐벤조에이트 ( XS19 )의 제조
Figure pct00229
메틸 (S)-5-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)-2-요오도벤조에이트 (XS17)
아민 XS99(0.800 g, 2.89 mmol, 문헌(Ozaki et al, Tetrahedron, 2017, 73, 7177-7184)에 기재된 바와 같이 제조됨) 및 Fmoc-Ala-OH(0.944 g, 3.03 mmol)를 DMF(9.6　mL)에 용해시켰다. DIPEA(2.02 mL, 11.6 mmol)를 첨가하고, 이어서 1시간 동안 HATU(1.59 g, 4.18 mmol)를 나누어 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, EtOAc(50 mL)에 취하였다. 유기층을 수성 KHSO4 (0.5 M, 2 x 25 mL), 포화 수성 NaHCO3 (25 mL) 및 식염수(100　mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:DCM 0:1 내지 30:70)로 정제하여 아미드 XS17(1.17 g, 71%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00230
MS (ESI+) C26H24IN2O5 + [M+H]+에 대한 계산치 571.07, 실측치 571.27.
메틸 5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-요오도벤조에이트 (XS18)
피페리딘(0.989 mL, 9.99 mmol)을 DMF(10 mL) 중의 아미드 XS17(1.14　g, 2.00 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 15분 동안 교반 후, 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(2 x 20 mL)과 함께 공증발시키고, 진공 하에 건조시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, MeOH:DCM 0:1 내지 20:80)로 정제하여 탈보호된 생성물(0.740 g, quant)을 수득하였다. 생성물 및 Boc-Val-OSu(0.735 g, 2.34　mmol)을 DMF(9.7 mL)에 용해시켰다. DIPEA(0.928 mL, 5.31 mmol)를 RT에서 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)에 첨가하고, 수층을 EtOAc:헵탄(1:1, 3 x 50 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 물(2 x 75 mL) 및 얼음-냉각된 식염수(2 x 100　mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:헵탄 20:80 내지 70:30)로 정제하여 아미드 XS18(0.790 g, 68%)을 황백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00231
MS (ESI+) C21H31IN3O6 + [M+H]+에 대한 계산치 548.13, 실측치 548.32.
메틸 5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-에티닐벤조에이트 (XS19)
마이크로웨이브 바이알을 요오도아렌 XS18(0.720 g, 1.32 mmol), Pd(PPh3)2Cl2(18 mg, 0.026 mmol) 및 Cu(I)I(13 mg, 0.066 mmol)로 충전시켰다. 바이알을 N2로 퍼징하고, DMF(4.5 mL), 에티닐트리메틸실란 (0.273 mL, 1.97 mmol) 및 Et3N (0.183　mL, 1.32 mmol)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3.5시간 동안 80℃에서 마이크로웨이브에서 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(10 mL)과 함께 공증발시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, EtOAc:DCM 0:1 내지 1:1)로 정제하여 보호된 알킨(0.466, 68%)을 황색 고체로서 수득하였다. 중간산물의 일부(0.450 g, 0.869 mmol)를 MeOH(4.4 mL)에 용해시키고, K2CO3(12 mg, 0.087 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 RT에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 EtOAc(25 mL)로 희석시키고, 이어서 포화 수성 NaHCO3 (2 x 20 mL), 물(20 mL) 및 식염수(20 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 알킨 XS19(0.365 g, 94%)를 황색 필름으로서 수득하였다.
Figure pct00232
Figure pct00233
MS (ESI+) C23H32N3O6 + [M+H]+에 대한 계산치 446.23, 실측치 446.35.
2-(1-((S)-4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 ( XS23 )의 제조
Figure pct00234
(S)-5-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도) 펜탄산 (XS20)
에스테르 XT105(0.300 g, 0.557 mmol)를 DMSO(0.33 mL) 및 MeOH(1.65 mL)에 현탁시켰다. 혼합물을 10℃로 냉각시키고, 2 M NaOH(2.23 mL, 4.46 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 RT에 도달하게 하고, 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 1 M 수성 AcOH(6 mL)로 ??칭시키고, 물(10 mL)로 희석시켰다. 혼합물을 RT로 가온하고, 이어서 여과시켰다. 잔류물을 MeCN(5 mL) 및 Et2O(2 x 5 mL)로 세척하여 미정제 산을 수득하였다. 물질을 얼음-냉각된 DCM(5 mL)에 용해시켰다. TFA(5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(2 x 10　mL)과 함께 공증발시켜 아민 XS20(0.292 g, quant, 2 단계)을 갈색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00235
Figure pct00236
MS (ESI+) C20H25N8O3 + [M+H]+에 대한 계산치 425.20, 실측치 425.41.
(S)-5-아지도-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XS21)
물(0.95 mL)/DCM(1.6　mL) 중의 NaN3(0.361 g, 5.56 mmol)의 얼음-냉각된 용액에 트리플릭 무수물(0.188 mL, 1.11 mmol)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 유기층을 분리시키고, 수성 상을 DCM(2 x 1 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 1 M Na2CO3(1 mL)로 세척하고, 물(1.8 mL)/MeOH(3.7 mL) 중의 K2CO3(0.123 g, 0.890 mmol) 및 CuSO4·5H2O(2.8 mg, 0.011　mmol) 및 아민 XS20(0.236 g, 0.556 mmol)의 RT 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고, AcOH(1.0 M)로 pH ~5로 산성화하였다. 혼합물을 완만하게 가열하여 침전시키고, RT로 냉각시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 물(1 mL), MeCN(1 mL) 및 Et2O(5 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 아지드 XS21(0.103 g, 41%)을 녹갈색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00237
MS (ESI+) C20H23N10O3 + [M+H]+에 대한 계산치 451.19, 실측치 451.50.
(S)-5-(4-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)-2-(메톡시카르보닐)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)펜탄산 (XS22)
DMF(1.7 mL) 중의 알킨 XS19(0.070 g, 0.16 mmol) 및 아지드 XS21(0.078 g, 0.17 mmol)의 용액을 5분 동안 N2로 퍼징하였다. 이어서, 물(889　μl) 중의 Cu(II)SO4(33 mg, 0.13 mmol) 및 물(942 μl) 중의 나트륨 아스코르베이트(51 mg, 0.26 mmol)를 연속적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 18시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물(25 mL)에 첨가하였다. 수성 AcOH(1.0 M, 0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 완만하게 가열하여 침전시키고, RT로 냉각시켰다. 고체를 여과로 수집하고, MeCN(20 mL), EtOAc(2 x 20 mL) 및 Et2O (10 mL)로 세척하고, EtOAc(15 mL)에서 교반하고, 여과로 수집하고, Et2O(10 mL)로 세척하였다. 이어서, 고체를 진공 하에 건조시켜 트리아졸 XS22(0.103 g, 66%)를 갈색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C43H54N13O9 + [M+H]+에 대한 계산치 896.42, 실측치 896.65.
2-(1-((S)-4-카르복시-4-(4-(2-(2,4-디아미노프테리딘-6-일)에틸)벤즈아미도)부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤조산 (XS23)
에스테르 XS22(0.100 g, 0.112 mmol)를 THF(2.0 mL)에 현탁시키고, 10℃로 냉각시켰다. LiOH(0.4 M, 1.40 mL, 0.558 mmol)를 적가하고, 반응 혼합물을 4.5시간 동안 교반하였다. 추가의 LiOH(0.4 M, 0.698 mL, 0.279 mmol)를 첨가하고, 1시간 동안 계속해서 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, AcOH(96 μL, 1.67 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 톨루엔(2 x 5 mL)과 함께 공증발시켰다. 이어서, 미정제 물질을 DCM(3.0 mL) 중의 TFA(3.0 mL)의 0℃ 용액에 용해시켰다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하고, 이어서 농축시키고, 톨루엔(2 x 5 mL)과 함께 공증발시키고, 진공 하에 건조시켜 미정제 아민을 갈색 오일로서 수득하였다. 물질을 DMF(5.0 mL)에 용해시키고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(38 mg, 0.12 mmol) 및 DIPEA(0.117 mL, 0.668 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. DIPEA(0.117 mL, 0.668 mmol)를 첨가하고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(15 mg, 0.049 mmol)를 각각 15분 및 3시간 후에 첨가하였다. 24시간 후, 반응 혼합물을 1 mL로 농축시키고, 192시간 동안 계속해서 교반하였다. 추가의 DIPEA(0.117 mL, 0.668 mmol)를 첨가하고, 240시간의 총 반응 시간 후, 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(5 mL)과 함께 공증발시켰다. 미정제물의 일부를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 40%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 말레이미드 XS23(13.9 mg, 13%, 3 단계)을 담황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00238
MS (ESI+) C47H55N14O10 + [M+H]+에 대한 계산치 975.42, 실측치 975.60.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-메틸-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질)옥시)카르보닐)(메틸)아미노) 에틸)(메틸)카르바모일)옥시) 벤즈아미도)펜탄산 ( XR4 )의 제조
Figure pct00239
메틸 4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일)옥시) 벤조에이트 (XR1)
THF(25 mL) 중의 메틸 4-히드록시벤조에이트(1.00 g, 6.57 mmol)의 용액에 0℃에서 Et3N(2 mL, 14.5 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 4-니트로페닐 클로로포르메이트(1.46 g, 7.23　mmol)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 THF(30 mL)로 희석시키고, 혼합물을 RT로 가온되게 하였다. 1시간 후, tert-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)-카르바메이트(1.24 g, 6.57 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, EtOAc에 취하였다. EtOAc 층을 KHSO4(0.5 M, 2x), 포화 수성 NaHCO3(2x), 수성 Na2CO3(1 M) 및 식염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 3:7)로 정제하여 카르바메이트 XR1(2.07 g, 85%)을 수득하였다.
Figure pct00240
MS (ESI+) C18H27N2O6 + [M+H]+에 대한 계산치 367.19, 실측치 367.35.
4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일)옥시)벤조산 (XR2)
카르바메이트 XR1(2.07 g, 5.66 mmol)을 THF/물(1:1, 30 mL)에 용해시키고, NaOH(0.293 g, 7.33 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 45℃에서 가열하고, RT로 냉각시키고, 수성 KHSO4(0.5 M, ~50 mL)로 산성화하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(3x)로 추출하고, 합한 유기층을 식염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 산 XR2를 수득하였다.
MS (ESI+) C17H25N2O6 + [M+H]+에 대한 계산치 353.17, 실측치 353.27.
메틸 (S)-5-(4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일) 옥시)벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XR3)
아민 XT48(40 mg, 0.079 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 산 XR2(28.0 mg, 0.079 mmol)과 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH, 1:0 내지 1:1)로 정제하여 아미드 XR3(quant)을 수득하였다.
MS (ESI+) C38H48N11O9 + [M+H]+에 대한 계산치 802.36, 실측치 802.80.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-메틸-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질)옥시)카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸) 카르바모일)옥시)벤즈아미도)펜탄산 (XR4)
에스테르 XR3(38 mg, 0.047 mmol)을 물/THF(1:1, 1 mL)에 용해시키고, 3시간 동안 LiOH(5.7 mg, 0.238 mmol)로 처리하고, 이어서 반응물을 AcOH(10 eq)로 ??칭시켰다. 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(2x)와 함께 공증발시키고, 진공 하에 건조시켰다.
MS (ESI+) C36H46N11O8 + [M+H]+에 대한 계산치 760.35, 실측치 760.77.
수득된 중간산물은 HCl/디옥산(2 mL, 4 M)에 현탁시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 클로로포름와 함께 공증발시키고, 진공 하에 건조시켰다. 이어서, Boc-탈보호된 중간산물 및 XJ12(45 mg, 0.06 mmol)를 DMF(1 mL)에 용해시키고, 빙조에서 냉각시키고, DIPEA(0.082 mL, 0.47 mmol)를 첨가하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 RT로 가온되게 하고, 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1%　TFA / MeCN x 0.1% TFA)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고, 아세토니트릴을 증발시키고, 나머지 용액을 동결건조시켜 XR4(25 mg, 42%)를 수득하였다.
MS (ESI+) C59H75N17O16 + [M+H]+에 대한 계산치 1277.56, 실측치 1277.12.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)부틸) 카르바모일)-5-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질) 옥시)카르보닐)(메틸)아미노)에틸) (메틸)카르바모일)옥시)벤조산 ( XR8-p 및 XR8-m )의 제조
Figure pct00241
디메틸 4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일)옥시) 프탈레이트 (XR6)
DCM(20 mL) 중의 디메틸 4-히드록시프탈레이트(XR5; 500 mg, 2.38 mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 4-니트로페닐 클로로포르메이트(527 mg, 2.62 mmol)를 첨가하고, Et3N(0.66 mL, 4.76 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, DCM(2 mL) 중의 tert-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카르바메이트(537 mg, 2.85 mmol)를 한번에 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 3:7)로 정제하여 카르바메이트 XR6(57%, 580 mg)을 수득하였다.
Figure pct00242
(명확히 하기 위해, 카르바메이트 로타머(rotamer)로부터 유래하는 분할되지만 부분적으로 겹치는 일중선은 일중선으로 보고됨).
MS (ESI+) C20H28N2NaO8 + [M+Na]+에 대한 계산치 447.17, 실측치 447.50.
메틸 (S)-5-(5-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일) 옥시)-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XR7)
물(4 mL) 중의 NaOH(269 mg, 6.71 mmol)를 RT에서 THF(5 mL) 중의 카르바메이트 XR6(570 mg, 1.34 mmol)의 용액에 첨가하였다. 20시간 후, 반응 혼합물을 수성 KHSO4(0.5 M)를 사용하여 산성화하고, 이어서 반응 혼합물을 EtOAc(2 x 25　mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 수득된 미정제 이산의 일부(34.7 mg, 0.087 mmol)를 DMF(0.5 mL) 중의 HATU(83 mg, 0.219　mmol) 및 DIPEA(0.061 mL, 0.350 mmol) 및 20시간의 반응 시간을 이용하여 일반 절차 XXA에 기재된 바와 같이 아민 XT48(52 mg, 0.096 mmol)과 반응시켰다. 농축 후, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH, 1:0 내지 1:1)로 정제하여 프탈이미드 XR7(58.2 mg, 80%)을 수득하였다.
MS (ESI+) C39H46N11O10 + [M+H]+에 대한 계산치 828.34, 실측치 828.83.
2-(((S)-4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸) 카르바모일)-5-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질)옥시)카르보닐) (메틸) 아미노)에틸)(메틸) 카르바모일)옥시)벤조산 (XR8-p 및 XR8-m)
프탈이미드 XR7(58.2 mg, 0.070 mmol)을 물/THF(1:1, 1 mL)에 용해시키고, RT에서 3시간 동안 LiOH(13.5 mg, 0.56 mmol)로 처리하였다. 생성물을 AcOH를 첨가하여 침전시키고, 이어서 고체를 여과로 단리하였다. 미정제 물질 (18 mg, 32%).
MS (ESI+) C37H46N11O10 + [M+H]+에 대한 계산치 804.34, 실측치 804.48.
비누화된 중간산물(18 mg)을 HCl/디옥산(4 M, 0.5 mL)에 현탁시키고, 오렌지색 현탁액을 30분 동안 교반하고, 이어서 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. Boc-탈보호된 중간산물 및 XJ12(16.9 mg, 0.022 mmol)를 DMF(0.5 mL)에 용해시키고, 이어서 DIPEA(0.023 mL, 0.134 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 농축시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA)로 정제하여 파라- 및 메타-개방된 프탈이미드 링커-약물 XR8-p 및 XR8-m을 황색 고체로서 수득하였다.
MS (ESI+) C60H74N17O18 + [M+H]+에 대한 계산치 1320.54, 실측치 1320.74.
(S)-5-(2-(벤질옥시)-4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-메틸-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도) 벤질)옥시)카르보닐) (메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일)옥시)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 ( XR12 )의 제조
Figure pct00243
메틸 4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일)옥시)-2-히드록시벤조에이트 (XR9)
Et3N(1.71 mL, 12.3 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트(1.36 g, 6.74 mmol)를 THF(50 mL) 중의 메틸 2,4-디히드록시벤조에이트(1.03 g, 6.13　mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 연속적으로 첨가하였다. 0℃에서 1시간 후, THF(10 mL) 중의 tert-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)-카르바메이트(1.27 g, 6.74 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 1:1)로 정제하여 카르바메이트 XR9(1.64 g, 70%)를 수득하였다.
Figure pct00244
(명확히 하기 위해, 카르바메이트 로타머로부터 유래하는 분할되지만 부분적으로 겹치는 일중선은 일중선으로 보고됨).
MS (ESI+) C18H27N2O7 + [M+H]+에 대한 계산치 383.18, 실측치 383.27.
메틸 2-(벤질옥시)-4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸) 카르바모일)옥시) 벤조에이트 (XR10)
BnBr(0.253 mL, 2.13 mmol) 및 K2CO3(321 mg, 2.32 mmol)를 RT에서 DMF(10 mL) 중의 카르바메이트 XR9(740 mg, 1.935 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 농축시키고, EtOAc(~75 mL)에 취하였다. 유기층을 물, 수성 KHSO4 (0.5 M) 및 식염수로 세척하였다. EtOAc 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(1; 실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 1:1, 2; DCM:MeOH, 1:0 내지 4:1)로 2회 정제하여 벤질 에테르 XR10(585 mg, 64%)를 수득하였다.
MS (ESI+) C25H32N2NaO7 + [M+Na]+에 대한 계산치 495.21, 실측치 495.55.
메틸 (S)-5-(2-(벤질옥시)-4-(((2-((tert-부톡시카르보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸) 카르바모일)옥시) 벤즈아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도) 벤즈아미도)펜타노에이트 (XR11)
LiOH(148 mg, 6.2 mmol)를 RT에서 THF(10 mL) 중의 XR10(585 mg, 1.24 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 추가의 LiOH(59.4 mg, 2.48 mmol)를 첨가하고, 반응을 24시간 동안 계속하였다. 반응물을 수성 KHSO4(0.5 M)로 산성화하고, EtOAc(2 x 25 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 미정제 산(518 mg)을 수득하였다.
Figure pct00245
(명확히 하기 위해, 카르바메이트 로타머로부터 유래하는 분할되지만 부분적으로 겹치는 일중선은 일중선으로 보고됨).
이 물질의 일부(52.5 mg, 0.115 mmol)를 일반 절차 XXA에 따라 DMF(1 mL) 중의 아민 XT48(57.7　mg, 0.115 mmol), HATU(52.2 mg, 0.137 mmol) 및 DIPEA(0.123 mL, 0.687 mmol)와 반응시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH, 1:0 내지 1:1)로 정제하여 아미드 XR11(100 mg, 87%)를 수득하였다.
MS (ESI+) C45H54N11O10 + [M+H]+에 대한 계산치 908.40, 실측치 908.55.
(S)-5-(2-(벤질옥시)-4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5-메틸-4,7-디옥소-2-(3-우레이도프로필)-8,11-디옥사-3,6-디아자트리데칸아미도)벤질)옥시) 카르보닐) (메틸)아미노)에틸)(메틸)카르바모일)옥시)벤즈아미도)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)펜탄산 (XR12)
말레이미드 XR12를 XR3의 XR4로의 전환을 기재하는 절차와 유사하게 합성하였다. 생성물을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00246
MS (ESI+) C66H80N17O17 + [M+H]+에 대한 계산치 1382.59, 실측치 1382.81.
5-((R)-2-((R)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-프로판아미도)티오펜-2-카르복실산 ( XR23 )의 제조
Figure pct00247
벤질 5-아미노티오펜-2-카르복실레이트 (XJ16)
MeOH(50 mL) 중의 벤질 5-니트로티오펜-2-카르복실레이트(XJ15) (1.55 g, 5.89 mmol, WO 2007/018508에 기재된 바와 같이 제조됨)의 현탁액에 포화 수성 NH4Cl(7 mL) 및 아연 분말(3.8 g)을 첨가하였다. 현탁액을 2.5시간 동안 RT에서 교반하고, 이어서 셀라이트 상에서 여과시켰다. 고체를 MeOH로 세척하고, 여액을 농축시켰다. EtOAc를 첨가하고, 유기 용액을 식염수로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:EtOAc 1:0 내지 4:1)를 이용하여 정제하여 XJ16(0.90 g, 66%)을 보라색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00248
Figure pct00249
MS (ESI+) C12H12NO2S+ [M+H]+에 대한 계산치 234.05, 실측치 234.06.
벤질 (S)-5-(2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)티오펜-2-카르복실레이트 (XJ17)
DCM(18 mL) 중의 Fmoc-Ala-OH(1.82 g, 5.84 mmol)의 현탁액에 0℃에서 옥살릴 클로라이드(1.0 mL, 11.7 mmol) 및 10 방울의 DMF를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 RT에서 교반하고, 이어서 농축시켰다. 미정제 산 클로라이드를 DCM(8 mL)에 취하고, 이어서 DCM(8 mL) 중의 XJ16(0.90 g, 3.90 mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 첨가하였다. Et3N(1.6 mL, 11.7 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:EtOAc 1:0 내지 1:1)로 정제하여 XJ17(0.66 g, 32%)을 황색 폼으로서 수득하였다.
MS (ESI+) C30H27N2O5S+ [M+H]+에 대한 계산치 527.16, 실측치 527.36.
벤질 5-((R)-2-((R)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)티오펜-2-카르복실레이트 (XJ18)
Fmoc-보호된 아민 XJ17(0.66 g, 1.25 mmol)을 DMF(10 mL)에 용해시켰다. 피페리딘(0.62 mL, 6.2 mmol)을 RT에서 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔/DCM과 함께 공증발시켜 탈보호된 아민을 황색 고체로서 수득하였다. 물질을 DCM(10 mL)에 재용해시키고, DCM(10 mL) 중의 Boc-L-Val-OSu (0.55 g, 1.75 mmol) 및 DIPEA(0.54 mL, 3.1 mmol)를 0℃에서 첨가하고, 이어서 혼합물을 2.5시간 동안 RT에서 교반하였다. 농축 후, 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:EtOAc 1:0 내지 4:1)로 정제하여 아미드 XJ18(0.48 g, 77%)을 무색 시럽으로서 수득하였다.
Figure pct00250
MS (ESI+) C25H34N3O6S+ [M+H]+에 대한 계산치 504.21, 실측치 504.31.
5-((R)-2-((R)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 티오펜-2-카르복실산 (XR23)
N2 분위기 하에 EtOAc(10 mL) 중의 아미드 XJ18(0.48 g, 0.95 mmol)의 용액에 팔라듐(0.3 g, 활성탄 상 10%)을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 2일 동안 수소 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 N2로 퍼징하고, 셀라이트 상에서 여과시켰다. 잔류물을 EtOAc로 세척하고, 여액을 농축시켜 XR23(0.28 g, 72%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00251
MS (ESI+) C18H28N3O6S+ [M+H]+에 대한 계산치 414.16, 실측치 414.29.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도)티오펜-2-카르복스아미도)펜탄산 ( XR16 )의 제조
Figure pct00252
메틸 (S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도) 프로판아미도) 티오펜-2-카르복스아미도)-2-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸) 포름아미도)벤즈아미도) 펜타노에이트 (XR15)
아민 XT48(50 mg, 0.1 mmol)을 일반 절차 XXA에 따라 DMF(1.0 mL) 중의 XR23(41.0 mg, 0.099 mmol), HATU(45.3 mg, 0.119 mmol) 및 DIPEA(0.104 mL, 0.595 mmol)와 반응시켰다. 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH, 1:0 내지 4:1)로 정제하여 어떠한 추가의 정제도 없이 이월되는 불순한 XR15(105 mg)를 수득하였다.
MS (ESI+) C39H51N12O9S+ [M+H]+에 대한 계산치 863.36, 실측치 863.83.
(S)-2-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 티오펜-2-카르복스아미도)펜탄산 (XR16)
THF/물(1:1, 1 mL) 중의 아미드 XR15(43 mg, 0.050 mmol)의 용액을 90분 동안 RT에서 LiOH(6 mg, 0.25 mmol)로 처리하였다. AcOH(0.03 mL, 0.5 mmol) 및 톨루엔(5　mL)을 첨가하고, 혼합물을 농축시켰다. 미정제물을 DCM(2　mL)에 용해시키고, TFA(1 mL)를 0℃에서 첨가하였다. 40분 후, 혼합물을 농축시키고, DCM과 함께 공증발시키고, 진공 하에 건조시켰다. 탈보호된 중간산물을 DMF(0.5 mL)에 용해시키고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(18.43 mg, 0.060　mmol)를 RT에서 첨가하고, 이어서 DIPEA(0.017 mL, 0.100 mmol)를 첨가하였다. 추가의 DIPEA(>5 당량)를 첨가하여 반응 혼합물을 충분히 염기성이 되게 하고, 잔류 산을 보충하였다. 혼합물을 RT에서 3시간 동안 교반하고, 이어서 농축시켰다. 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1%　TFA, 구배)로 정제하여 XR16(11.6 mg, 26%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00253
MS (ESI+) C42H52N13O9S+ [M+H]+에 대한 계산치 914.37, 실측치 914.49.
메틸 (R)-2-(4-(((2,5-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)-5-(5-((R)-2-((R)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸-부탄아미도)프로판아미도)티오펜-2-카르복스아미도)펜타노에이트 ( XJ21 )의 제조
Figure pct00254
XR15(83 mg, 0.096 mmol)를 MeOH(1.5 mL)에 용해시키고, 수성 HCl(6 N, 0.9　mL, 5.51 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 50℃에서 교반하고, 이어서 RT로 냉각시키고, MeOH로 희석시키고, 톨루엔(2x)으로 공증발시키고, 진공 하에 건조시켰다. 생성물을 DMF(1 mL)에 용해시키고, 6-말레이미도헥산산 N-히드록실숙신이미드 에스테르(0.029 g, 0.095 mmol) 및 DIPEA(0.1 mL, 0.57 mmol)를 0℃에서 연속적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 RT에서 교반하고, 이어서 농축시켰다. 미정제 고체를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배 20% - 50%)로 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, MeCN을 회전 증발로 제거시키고, 수용액을 동결건조시켜 XJ21(25 mg, 28%)을 황색 폼으로서 수득하였다.
Figure pct00255
MS (ESI+) C43H54N13O9S+ [M+H]+에 대한 계산치 928.38, 실측치 928.60.
메틸 2-에티닐-5-니트로벤조에이트 ( XR18 )의 제조
Figure pct00256
메틸 5-니트로-2-((트리메틸실릴)에티닐)벤조에이트 (XR17)
마이크로웨이브 바이알을 에티닐트리메틸실란(0.71 mL, 5.2 mmol), 메틸 2-요오도-5-니트로벤조에이트(1.06 g, 3.44 mmol) 및 Cu(I)I(33 mg, 0.17 mmol) 및 DMF(15 mL)로 채우고, 용액을 N2로 퍼징하였다. Pd(PPh3)2Cl2(48 mg, 0.069 mmol) 및 Et3N(0.48 mL, 3.4 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 N2로 다시 퍼징하였다. 바이알을 캡핑하고, 마이크로웨이브에서 3.5시간 동안 80℃에서 가열하였다. 이어서, 혼합물을 농축시키고, 미정제 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 0:1)로 정제하여 TMS-알킨 XR17(620 mg, 65%)을 수득하였다.
Figure pct00257
메틸 2-에티닐-5-니트로벤조에이트 (XR18)
알킨 XR17(822 mg, 2.96 mmol) 및 K2CO3(41.0 mg, 0.296 mmol)을 RT에서 MeOH(15 mL)에 용해시키고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. EtOAc(50 mL)를 첨가하고, 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 (2x), 물 및 식염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 XR18(quant. 수율)을 수득하였다.
Figure pct00258
(S)-5-아지도-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)펜탄산 ( XR19 )의 제조
Figure pct00259
물(25 mL)/DCM(44 mL) 중의 NaN3(10 g, 154 mmol)의 얼음 냉각된 용액에 트리플릭 무수물(5.2 mL, 30.8 mmol)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 유기층을 분리시키고, 수성 상을 DCM(2 x 20 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 수성 Na2CO3(1 M)로 세척하고, 물/MeOH(1:2, 150 mL) 혼합물 중의 Z-Orn-OH(4.10 g, 15.4 mmol), K2CO3(3.40 g, 24.6 mmol) 및 CuSO4·5H2O(0.077 g, 0.308 mmol)의 RT 용액에 첨가하였다. RT에서 18시간 동안 교반한 후, 유기 용매를 증발시키고, 수성 슬러리를 물(150 mL)로 희석시키고, 진한 HCl로 pH 2로 산성화하였다. 수성 층을 EtOAc(3x)로 추출하고, 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켜 추가의 정제 없이 이월되는 미정제 XR19(4.5 g)를 수득하였다.
Figure pct00260
MS (ESI+) C13H17N4O4 + [M+H]+에 대한 계산치 293.12, 실측치 293.39.
(S)-5-아미노-2-(1-(4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노)벤즈아미도)부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)벤조산 ( XR22 )의 제조
Figure pct00261
메틸 (S)-2-(1-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-니트로벤조에이트 (XR20)
THF(7 mL) 중의 아지드 XR19(533 mg, 0.912 mmol), 알킨 XR18(187 mg, 0.912　mmol의 용액에 RT에서 물(1.5　mL) 중의 CuSO4·5H2O(175 mg, 0.702 mmol)를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 N2로 퍼징하고, 이후 물(1.5 mL) 중의 나트륨 아스코르베이트(271 mg, 1.39 mmol)를 첨가하였다. 황색 용액을 5분 동안 교반하였으며, 이때 UPLC-MS 분석은 완전한 전환을 나타내었다. EtOAc(20 mL) 및 물/식염수(1:1, 10 mL)를 첨가하고, 층을 분리시키고, 수성 상을 EtOAc(2x)로 추출하였다. 합한 유기층을 식염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 0:1)로 정제하여 트리아졸 생성물을 수득하였다. 단리된 생성물을 DMF(10　mL)에 용해시키고, Cs2CO3(163 mg, 0.500 mmol) 및 MeI(60 μl, 0.964 mmol)를 RT에서 첨가하고, 반응물을 16시간 동안 교반하였다. 농축 후, 미정제물을 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 헵탄:EtOAc, 1:0 내지 0:1)로 정제하여 에스테르 XR20(380 mg, 81%, 2 단계)을 수득하였다.
Figure pct00262
MS (ESI+) C24H26N5O8 + [M+H]+에 대한 계산치 512.18, 실측치 512.33.
메틸 (S)-2-(1-(4-(4-(N-((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)포름아미도)벤즈아미도)-5-메톡시-5-옥소펜틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-5-니트로벤조에이트 (XR21)
아세트산(33%, 5 mL) 중의 HBr을 0℃에서 에스테르 XR20(300 mg, 0.587　mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 0℃에서 75분 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 톨루엔(2x), 클로로포름 및 에테르와 함께 공증발시켰다.
MS (ESI+) C16H20N5O6 + [M+H]+에 대한 계산치 378.14, 실측치 378.19.
미정제 생성물을 일반 절차 XXA에 따라 DMF(5 mL) 중의 XT7(166 mg, 0.489 mmol), HATU(223 mg, 0.59　mmol) 및 DIPEA(0.513 mL, 2.93 mmol)와 반응시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, DCM:MeOH, 1:0 내지 4:1)로 정제하여 아미드 XR21(240 mg, 70%)를 수득하였다.
MS (ESI+) C31H31N12O8 + [M+H]+에 대한 계산치 699.24, 실측치 699.62.
(S)-5-아미노-2-(1-(4-카르복시-4-(4-(((2,4-디아미노프테리딘-6-일)메틸)아미노) 벤즈아미도)부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)벤조산 (XR22)
DMF(3 mL) 중의 아미드 XR21(280 mg, 0.423 mmol)의 용액에 포화 수성 NH4Cl(600 μl) 및 아연 분말(830 mg, 12.7 mmol)을 첨가하였다. 일단 UPLC 분석이 완전한 전환을 나타내면(~3 h), 반응 혼합물을 DMF(6 mL)로 희석시키고, 셀라이트 상에서 여과시켰다. 여액을 밤새 공기 하에 교반하고, 이어서 농축시키고, MeOH(6 mL)에 현탁시키고, 30분 동안 교반하고, 여과시켰다. 고체를 수집하고, 에테르로 세척하고, 공기 중에서 건조시키고, 다음 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다. 미정제 중간산물(109 mg)을 THF/물(1:1 2 mL)에 용해시켰다. LiOH(36 mg, 0.85　mmol)를 첨가하고, 혼합물을 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 AcOH(0.100 mL, 1.7 mmol)로 산성화하고, 톨루엔(2x)과 함께 공증발시켰다. 미정제 생성물의 일부를 분취용 RP-HPLC(물 x 0.1% TFA / MeCN x 0.1% TFA, 구배)로 정제하여 XR22(11 mg)를 수득하였다.
Figure pct00263
MS (ESI+) C28H29N12O5 + [M+H]+에 대한 계산치 613.24, 실측치 613.37.
화합물의 용도
암 세포주
인간 종양 세포주 SK-BR-3, SW-620, A-549, BT-474, AU-565, 및 SK-OV-3은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA))로부터 구입되었다. 저캇 누클라이트 레드 세포(Jurkat NucLight Red)는 에센 바이오사이언스 인크.(Essen BioScience Inc. (Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입되었다. SK-BR-3 및 SK-OV-3 세포는 10% v/w 태아 소 혈청(FBS), 열 불활성화된(HI) (Gibco-Life Technologies; Carlsbad, CA) 및 80 U/mL Pen/Strep이 보충된 McCoys 5A 배지(Lonza; Walkersville, MD, USA)에서 37℃에서 가습 인큐베이터에서 5% CO2 분위기 하에 배양되었다. SW-620 세포는 10% v/w FBS HI 및 80 U/mL Pen/Strep을 함유하는 RPMI 1640 배지(Lonza)에서 유사하게 유지되었다. A-549 세포는 80 U/mL Pen/Strep 및 적격(Q) (Gibco-Life Technologies)인 5% v/w FBS가 보충된 F-12K 영양 혼합물(1x) (Gibco-Life Technologies) 배지에서 유사하게 유지되었다. BT-474 및 AU-565 세포는 적격(Q) (Gibco-Life Technologies)인 10% v/w FBS 및 80 U/mL Pen/Strep을 함유하는 RPMI 1640 배지(Lonza)에서 유사하게 유지되었다. 저캇 누클라이트 레드 세포는 10% v/w FBS HI, 80 U/mL Pen/Strep 및 0.5 μg/mL 푸로마이신(Gibco-Life Technologies)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Lonza)에서 유사하게 유지되었다.
시험관내 세포 생존능 검정
완전 성장 배지 중의 세포를 96 웰 플레이트(90 μL/웰)에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 하기 세포 밀도로 인큐베이션하였다: 6500개 SK-BR-3, 4000개 SW-620, 2500개 A-549, 10000개 BT-474, 5000개 AU-565, 3000개 저캇 누클라이트 레드, 및 4000개 SK-OV-3/웰. 밤새 인큐베이션 후, 유리 약물의 10개의 연속 log 10 희석액을 DMSO(Sigma-Aldrich)에서 제조하였다. 이러한 유리 약물 용량-반응 곡선은 완전 성장 배지에서 10배 더 희석되었다. 본 발명에 따른 ADC의 경우, 10개의 연속 log 10 희석액을 완전 성장 배지에서 제조하였다. 유리 약물 또는 본 발명에 따른 ADC를 포함하는 10 μL의 조성물을 검정 플레이트에 첨가하였다(유리 약물에 대한 최종 DMSO 함량은 1%이었음). 세포 생존능을 6일 후에 제조업체의 지침에 따라 발광 검정 키트(CellTiter-GloTM(CTG), Promega Corporation)를 사용하여 평가하였다. 세포 생존 백분율은 농도에 따라 각각의 유리 약물 또는 ADC에 대해 측정된 발광을 비처리된 세포의 평균 평균(average mean) (1% DMSO 대조군(유리 약물의 경우) 또는 100% 완전 성장 배지(ADC의 경우))으로 나누고 100을 곱하여 계산되었다.
곡선은 곡선 피팅 소프트웨어(GraphPad Prism, 윈도우용 버전 8.4.0, GraphPad(San Diego, CA) 또는 Electronic Laboratory Notebook(ELN) add-in BioAssay, 버전 12.1.8.11, Perkin Elmer(Waltham, MA))를 사용하여 가변 기울기(4개의 파라미터)를 갖는 S자형 용량-반응 방정식으로 비선형 회귀에 의해 피팅되었다. 상대적 IC50 값은 4-파라미터 로지스틱 핏을 사용하는 경우 곡선의 하단과 상단 사이 중간에 반응을 제공하는 농도로 계산되었다. 데이터는 이중으로 수행된 적어도 하나의 실험의 평균 IC50 값으로 보고되었다.
유리 항엽산제 약물로의 실험
결과
Figure pct00264
비교 화합물 1
Figure pct00265
비교 화합물 1은 문헌(Rosowsky et al, J. Med. Chem. 1998, 41, 5310-5319)의 절차에 따라 합성되었다.
페닐 고리에 COOH 치환기를 갖지 않는 화합물 XJ4, XX5, XX7, XX12 및 XT35는 탈로트렉신 및 COOH 치환기를 갖는 다른 항엽산제 화합물보다 덜 활성이다. COOH 치환기를 SO3H 또는 테트라졸로 대체하는 것은 항엽산제 활성에 거의 영향을 미치지 않는 반면, COOH 치환기를 .CN으로 대체하는 것은 SK-BR-3 세포에서 활성을 감소시키는 것으로 보였다. 아미드 결합(Q)을 아미드 결합 생물동배체인 트리아졸로 대체해도 항엽산제 활성에 거의 영향을 미치지 않았다. 파라 위치의 페닐 고리에 NH2 또는 OH 치환기를 도입하면 탈로트렉신과 비슷한 항엽산제 활성을 갖는 화합물이 생성된다. 메타 위치에 NH2 치환기를 갖는 화합물의 항엽산제 활성은 상응하는 파라-화합물 및 탈로트렉신(NH2 치환기를 갖지 않음)과 비교할 때 대략 10배 낮다.
항체-약물 접합체로의 실험
DAR2 부위 특이적 접합체의 제조
HC41C 조작된 트라스투주맙의 용액(10 mg/mL, 100 mM 히스티딘, pH 5)에 2-(디페닐포스피노)벤젠술폰산(diPPBS) (조작된 항체의 몰당량당 16-32 몰당량, 물(MilliQ®) 중 10 mM)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 16-24시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 diPPBS를 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6을 사용하는 원심분리 농축기(비바스핀(Vivaspin) 필터, 30 kDa 컷오프, PES) 또는 탄소 여과에 의해 제거시켰다. DMA를 첨가한 후 링커-약물 용액(DMA 중 10 mM, 3.5 eq)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 10%였다. 생성된 혼합물을 RT에서 빛의 부재 하에 3시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 링커-약물을 제거시키기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 적어도 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 0.2 μm PES 또는 PVDF 필터를 사용하여 활성탄을 제거시키고, 생성된 ADC를 비바스핀 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에 포뮬레이팅하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.2 μm PVDF 필터를 사용하여 멸균 여과시켰다.
DAR2 및 DAR4 야생형 접합체의 제조
트라스투주맙의 용액(4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6 중 12 mg/mL)에 EDTA(물 중 25 mM, 4% v/v) 및 TRIS(물 중 1 M, pH 8, 1% v/v)를 첨가하였다. TCEP(물 중 10 mM, DAR2의 경우 1.1 eq 및 DAR4의 경우 2.2 eq)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 밤새 인큐베이션하였다. 반응물을 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6을 사용하여 원심분리 농축기(비바스핀 필터, 30 kDa 컷오프, PES)로 제거시켰다. DMA를 첨가한 다음 링커-약물 용액(DMA 중 10 mM, DAR2의 경우 4 eq, DAR4의 경우 8 eq)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 10%였다. 생성된 혼합물을 RT에서 빛의 부재 하에 3시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 링커-약물을 제거시키기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 활성탄을 0.2 μm PES 또는 PVDF 필터를 사용하여 제거시키고, 생성된 ADC를 비바스핀 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에 포뮬레이팅하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.2 μm PVDF 필터를 사용하여 멸균 여과시켰다.
DAR8 야생형 접합체의 제조
트라스투주맙 또는 비결합 대조군 항체 리툭시맙의 용액(4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6 중 12 mg/mL)에 EDTA(물 중 25 mM, 4% v/v) 및 TRIS(물 중 1 M, pH 8, 2% v/v)를 첨가하였다. TCEP(물 중 10 mM, 30 eq)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 밤새 인큐베이션하였다. 반응물을 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6을 사용하여 원심분리 농축기(비바스핀 필터, 30 kDa 컷오프, PES)로 제거시켰다. DMA를 첨가한 다음 링커-약물 용액(DMA 중 10 mM, 14 eq)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 10%였다. 생성된 혼합물을 RT에서 빛의 부재 하에 3시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 링커-약물을 제거시키기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 활성탄을 0.2 μm PES 또는 PVDF 필터를 사용하여 제거시키고, 생성된 ADC를 비바스핀 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에 포뮬레이팅하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.2 μm PVDF 필터를 사용하여 멸균 여과시켰다.
DAR10 부위 특이적 및 야생형 접합체의 제조
항-5T4 항체 825a의 용액(4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6 중 12 mg/mL)에 EDTA(물 중 25 mM, 4% v/v) 및 TRIS(물 중 1 M, pH 8, 2% v/v)를 첨가하였다. TCEP(물 중 10 mM, 30 eq 초과)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 RT에서 밤새 인큐베이션하였다. 과량의 TCEP의 결과로 야생형 및 조작된 시스테인 둘 다 감소되었다. 반응물을 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6을 사용하여 원심분리 농축기(비바스핀 필터, 30 kDa 컷오프, PES)로 제거시켰다. DMA를 첨가한 다음 링커-약물 용액(DMA 중 10 mM, 14 eq)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 10%였다. 생성된 혼합물을 RT에서 빛의 부재 하에 3시간 동안 인큐베이션하였다. 과량의 링커-약물을 제거시키기 위해, 활성탄을 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 활성탄을 0.2 μm PES 또는 PVDF 필터를 사용하여 제거시키고, 생성된 ADC를 비바스핀 원심분리 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 사용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로스, pH 6에 포뮬레이팅하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.2 μm PVDF 필터를 사용하여 멸균 여과시켰다.
Figure pct00266
Figure pct00267
Figure pct00268
결과
Figure pct00269
Figure pct00270
Figure pct00271
Figure pct00272
Figure pct00273
HER2 양성 SK-BR-3 인간 종양 세포주에서, (부위 특이적) 트라스투주맙-XT17 항엽산제 ADC의 세포독성은 DAR과 함께 증가하였다(도 1). 트라스투주맙-XT17 DAR8 및 다른 트라스투주맙 DAR8-접합체의 세포독성은, XT41, XX19, XR16, XX23 및 XT94를 갖는 트라스투주맙 접합체는 더 활성인 것으로 나타난 반면 다소 덜 활성인 것으로 나타난 트라스투주맙-XT46 및 트라스투주맙-XR12를 제외하고 대부분 필적하는 것으로 나타났다. DAR10 825a 접합체는 각각의 상응하는 DAR8 트라스투주맙 접합체보다 SK-BR-3 세포에서 더 낮은 활성을 나타내었다. 예상대로, 비결합 대조군 ADC(리툭시맙-XT17)는 고농도에서만 HER2 발현 종양 세포의 성장에 영향을 미쳤다. 모든 트라스투주맙-XT17 항엽산제 ADC는 HER2 음성 인간 종양 세포주인 SW 620에서 불활성(IC50 > 10 nM)이었다(도 2).
생체내 효능 실험
생체내 절차
트라스투주맙 항엽산제 ADC1(표 2 및 3의 DAR8 - XT17 야생형 접합된 트라스투주맙 ADC)의 생체내 효능은 CByJ.Cg-Foxn1nu/J 마우스에서의 BT-474 세포주(60세 백인 여성 환자로부터의 침윤성 유방 관 암종; Lasfargues et al, J. Natl. Cancer Inst. 1978, 61(4), 967-978) 이종이식편 모델 및 암컷 NMRI 누드 마우스(Crl:NMRI-Foxn1nu)에서의 MAXF574 환자 유래된 이종이식편 모델(침윤성 유방 관 암종; 삼중 음성 유방암)에서 평가되었다.
BT-474 모델
부착성 BT-474 세포를 10% FBS가 보충된 4 mM L-글루타민을 함유하는 듈베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 배양 배지에서 가습 분위기(5% CO2, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 사용하기 전에, 종양 세포를 트립신-EDTA로 5분간 처리하여 배양 플라스크로부터 탈착시키고, 완전 배양 배지를 첨가하여 중화시켰다. 세포를 계수하고, 0.25% 트립판 블루 배제 검정을 이용하여 생존능을 평가하였다.
γ-소스(2 Gy(누드 마우스), 60Co, BioMep, France)로의 전신 조사 후 24 내지 72시간에 건강한 암컷 BalB/c Nude ByJ(CByJ.Cg-Foxn1nu/J) 마우스의 오른쪽 옆구리에 50% (v/v) 마트리겔(356237, BD Biosciences, France)을 함유하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 1640 배지 200 μL 중의 2x107개의 BT-474 세포를 피하 주사하여 종양을 유도하였다.
Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, France)를 사용하여 값이 평균 150 - 250 mm3에 도달했을 때 개별 종양 부피에 따라 동물을 처리 그룹에 걸쳐 무작위로 분류하였다(n=3/처리 그룹; 마우스 임상 시험 포맷). 그룹 간의 균질성은 분산 분석(ANOVA)으로 시험되었다. 무작위화 후, 꼬리 정맥에 정맥내 주사(IV)로 치료제를 투여하였다.
MAXF574 모델
종양 단편은 누드 마우스에서의 연속 계대에서 이종이식편으로부터 수득되었다. 종양을 공여자 마우스로부터 떼어낸 후, 단편(가장자리 길이 3-4 mm)으로 자르고, 옆구리에 SC로 일방적으로 이식하였다. 종양 이식 부피가 80 내지 250 mm3의 목표 범위에 도달했을 때, 마우스를 비교 가능한 중앙값 및 평균 그룹 종양 부피를 목표로 하여 처리 그룹에 걸쳐 무작위로 분류하였다. 마우스(n=3/처리 그룹; 마우스 임상 시험 포맷)의 꼬리 정맥에 3 또는 10 mg/kg 항엽산제 ADC1의 단일 IV 용량 주사로 같은 날 또는 다음 날 투여하였다.
체중 및 종양 크기를 1주일에 2 또는 3회 측정하였다. 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼스로 측정한 후, 종양 부피를 하기 수학식을 사용하여 추정하였다: 종양 부피 = 0.5 x 길이 x 폭2(Simpson-Herren et al, Cancer Chemother. Rep. 1970, 54, 143-174).
결과
도 3a는 5 mg/kg IV의 단일 용량에서 항엽산제 ADC1(트라스투주맙-XT17; DAR8)이 마우스 BT-474 세포주 이종이식편 모델에서 종양 부피를 감소시켰음을 나타낸다. 종양 감소 효과는 항엽산제 ADC1을 1주 간격으로 1.7 mg/kg IV의 3회 개별 용량으로 제공했을 때 유사하였다(Q1Wx3; 도 3b).
BT-474 종양을 갖는 마우스는 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이 악액질을 발생시켰다. 이러한 체중 감소는 종종 효과적인 치료제를 투여한 후 회복되며, 민감한 효능 바이오마커로 간주된다. 항엽산제 ADC1(5 mg/kg IV 또는 1.7 mg/kg IV Q1Wx3)로의 처리는 체중을 회복시켰으며(도 4b), 두 투여 요법 모두 유사하였다.
도 5는 3 또는 10 mg/kg IV의 단일 용량에서 항엽산제 ADC1(트라스투주맙-XT17; DAR8)이 마우스 MAXF574 환자 유래된 이종이식편 모델에서 종양 부피를 감소시켰음을 나타낸다. 종양 감소 효과는 용량 의존적이었고, 10 mg/kg의 단일 IV 주사 후 20일까지 거의 완전한 완화가 관찰되었다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 (I)의 링커-약물 화합물:
    Figure pct00274

    상기 식에서,
    R1은 O, NH2 또는 OH이고;
    R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고;
    R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2, CH(C1-5 알킬), CH(C2-4 알케닐), CH(C2-4 알키닐), 또는 CH(C1-4 알콕실)이고;
    R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 벤질옥시, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고, 여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되거나, R4는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 카르복실산 생물동배체(bioisostere)이고:
    Figure pct00275

    Figure pct00276

    여기서, Ra'는 H, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 각각의 Ra는 독립적으로 H, F, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 2개의 Ra 치환기는 임의로 연결되어 고리를 형성할 수 있고;
    R5는 H, 할로겐, CF3, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕실, 또는 C1-4 알킬티오, 바람직하게는 H, F, CH3, CF3, CH2CH3, CH=CH2, CH2CF3, 또는 CF2CF3, 보다 바람직하게는 H 또는 F이고;
    R6은 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C3-6 사이클로알킬, 바람직하게는 H이고;
    n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
    Q는 부재하거나 -N(R7)-(C=O)-, -(C=O)-N(R7)-, -CH2N(R7)-, -N(R7)CH2-, -N(R7)SO2-, 또는 -SO2N(R7)-이고, 여기서 R7은 H, C1-4 알킬, C1-4 알케닐, 또는 C1-4 알키닐, 바람직하게는 H이거나, Q는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미드 결합 생물동배체이고:
    Figure pct00277

    여기서 Rb는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, T1, T1' 및 T1''는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, W1, W1' 및 W1''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되고;
    V는 하나 이상의 R4 기로 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 사이클로알칸이고, 독립적으로 하기로부터 선택되고:
    Figure pct00278

    여기서 U1, U1', U1'', U2, U2', U2'' 및 U2'''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되거나, V는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    Figure pct00279

    여기서 Z는 O, S, NH 또는 NRc이고, Rc는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고;
    s는 0 또는 1, 바람직하게는 1이고;
    X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되는 연결기이고;
    k는 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 1이고;
    L은 링커 모이어티이고;
    Figure pct00280
    는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ia)의 것인 링커-약물 화합물:
    Figure pct00281
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 화학식 (Ic)의 것인 링커-약물 화합물:
    Figure pct00282
    .
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L이 하기이고:
    Figure pct00283

    여기서 m은 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 5이고;
    AA는 아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산이고;
    p는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
    q는 1 내지 12 범위의 정수, 바람직하게는 2이고;
    ES는 부재하거나 하기로부터 선택되는 신장 스페이서(elongation spacer)이고:
    Figure pct00284
    ;
    RL은 부재하거나 하기로부터 선택되는 제거 스페이서이고:
    Figure pct00285

    여기서 t는 1-10 범위의 정수이고, R10은 임의로 치환된 C1-4 알콕실이고, R11은 H, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 임의로 치환된 C6-14 아릴 또는 임의로 치환된 C-연결된 C3-8 헤테로아릴이고;
    바람직하게는 L이 하기인 링커-약물 화합물:
    Figure pct00286
    .
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L이 하기인 링커-약물 화합물:
    Figure pct00287
    .
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커-약물 화합물이 하기 화학식의 것인 링커-약물 화합물:
    Figure pct00288

    Figure pct00289
    .
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커-약물 화합물이 하기 화학식의 것인 링커-약물 화합물:
    Figure pct00290
    .
  8. 하기 화학식 (III)의 항체-약물 접합체:
    Ab-(L-D)y (III)
    상기 식에서,
    Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L-D는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 링커-약물 화합물이고;
    y는 1 내지 16의 평균적인 항체에 대한 약물의 비율을 나타내고;
    링커-약물 화합물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 바람직하게는 항체 또는 항원 결합 단편의 시스테인 잔기를 통해 접합된다.
  9. 제8항에 있어서, 항체-약물 접합체가 하기 화학식의 것인 항체-약물 접합체:
    Figure pct00291

    Figure pct00292

    상기 식에서,
    Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    y는 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 10의 평균적인 항체에 대한 약물의 비율을 나타낸다.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 아넥신 Al, B7H3, B7H4, BCMA, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242, CAIX, CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD56, CD70, CD71, CD73, CD74, CD79, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CDCP1, CEA, CEACAM, 클라우딘 4, 클라우딘 7, CLCA-1, CLL 1, c-MET, 크립토, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EphA2, EPhB3, ETBR, FAP, FcRL5, FGFR3, FOLR1, FRbeta, GCC, GD2, GITR, GLOBO H, GPA33, GPC3, GPNMB, HER2, p95HER2, HER3, HMW-MAA, 인테그린 α, IGF1R, TM4SF1, 루이스 A 유사 탄수화물, 루이스 X, 루이스 Y, LGR5, LIV1, 메소텔린, MN, MUC1, MUC16, NaPi2b, 넥틴-4, 노치3, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, 5T4, TF, TF-Ag, Tag72, TNF알파, TNFR, TROP2, uPAR, VEGFR 및 VLA로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 표적에 결합하는 것인 항체-약물 접합체.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 링커-약물 화합물 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 링커-약물 화합물, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 종양 또는 혈액학적 악성종양의 치료에 사용하기 위한, 링커-약물 화합물, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 질환, 바람직하게는 류마티스 관절염의 치료에 사용하기 위한, 링커-약물 화합물, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 다른 감염의 치료에 사용하기 위한, 링커-약물 화합물, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 다른 치료제와의 조합 요법에 사용하기 위한, 링커-약물 화합물, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 링커-약물 화합물 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체의 제조 공정에서의, 하기 화학식의 화합물의 용도:
    Figure pct00293

    상기 식에서,
    R1은 O, NH2 또는 OH이고;
    R2 및 R2'는 독립적으로 N, CH 또는 CMe이고;
    R3은 NH, N(C1-5 알킬), CH2, CH(C1-5 알킬), CH(C2-4 알케닐), CH(C2-4 알키닐), 또는 CH(C1-4 알콕실)이고;
    R4는 H, 할로겐, -COOH, OH, NH2, -CONH2, -CONHR, -CONHR2, C1-4 알킬, C1-4 알콕실, 벤질옥시, 테트라졸, -SO3H, -OSO3H, -PO3H2, -OPO3H2, -CN, 또는 아지도이고,여기서 R은 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되거나, R4는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 카르복실산 생물동배체이고:
    Figure pct00294

    여기서, Ra'는 H, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 각각의 Ra는 독립적으로 H, F, CH2F, CHF2, CF3, 및 C1-6 알킬로부터 선택되고, 2개의 Ra 치환기는 임의로 연결되어 고리를 형성할 수 있고;
    R5는 H, 할로겐, CF3, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕실, 또는 C1-4 알킬티오, 바람직하게는 H, F, CH3, CF3, CH2CH3, CH=CH2, CH2CF3, 또는 CF2CF3, 보다 바람직하게는 H 또는 F이고;
    R6은 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C3-6 사이클로알킬, 바람직하게는 H이고;
    n은 1, 2, 3, 또는 4, 바람직하게는 3이고;
    Q는 부재하거나 -N(R7)-(C=O)-, -(C=O)-N(R7)-, -CH2N(R7)-, -N(R7)CH2-, -N(R7)SO2-, 또는 -SO2N(R7)-이고, 여기서 R7은 H, C1-4 알킬, C1-4 알케닐, 또는 C1-4 알키닐, 바람직하게는 H이거나, Q는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미드 결합 생물동배체이고:
    Figure pct00295

    여기서 Rb는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고, T1, T1' 및 T1''는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, W1, W1' 및 W1''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되고;
    V는 하나 이상의 R4 기로 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 또는 사이클로알칸이고, 독립적으로 하기로부터 선택되고:
    Figure pct00296

    여기서 U1, U1', U1'', U2, U2', U2'' 및 U2'''는 독립적으로 C, CH, S, N, NH, N(C1-5 알킬) 및 O로부터 선택되거나, V는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    Figure pct00297

    여기서 Z는 O, S, NH 또는 NRc이고, Rc는 H 및 C1-5 알킬로부터 선택되고;
    s는 0 또는 1, 바람직하게는 1이고;
    X는 O, NH, S, C1-5 알킬렌, C1-5 알케닐렌 및 C1-5 알키닐렌으로부터 선택되고;
    Figure pct00298
    는 표시된 결합이 단일 결합 또는 비누적된, 임의로 비국재화된 이중 결합일 수 있음을 의미한다.
  18. 제17항에 있어서, 화합물이 하기인 용도:
    Figure pct00299
    ,
    Figure pct00300
    .
KR1020237003006A 2020-07-06 2021-07-05 항엽산제 링커-약물 및 항체-약물 접합체 KR20230035332A (ko)

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