JP2023532591A - 葉酸拮抗リンカー－薬物及び抗体－薬物複合体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規な葉酸拮抗リンカー－薬物、そのような葉酸拮抗リンカー－薬物を含む複合体、並びに、場合によって他の治療薬と組み合わせる、がん、自己免疫疾患及び感染症などの疾患の治療におけるその使用に関する。

Description

本発明は、新規な葉酸拮抗リンカー－薬物、そのような葉酸拮抗リンカー－薬物を含む複合体、並びに、場合によって他の治療薬と組み合わせる、がん、自己免疫疾患及び感染症などの疾患の治療におけるその使用に関する。
葉酸拮抗薬は、葉酸（ビタミンＢ９）の作用に拮抗する代謝拮抗化合物の一種である。
葉酸は、セリン、メチオニン、チミジン及びプリンの生合成に関与する種々のメチルトランスフェラーゼの補因子として作用する。その結果、葉酸拮抗薬は、細胞分裂、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成と修復、並びにタンパク質合成を阻害する。葉酸拮抗薬の大半は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を阻害することによって機能する。
葉酸拮抗薬であるプログアニル、ピリメタミン及びトリメトプリムは、細菌、原生動物、真菌といった微生物における葉酸の作用を選択的に阻害する。メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、タロトレキシンといった他の葉酸拮抗薬は、ある種のがん、及び／又は、自己免疫疾患である関節リウマチなどの炎症状態の治療に使用される。
以前はアメトプテリンとして知られていたメトトレキサートは、最も古く、最も知られた葉酸類似体である。それは1950年代に発見され、化学療法薬であり免疫抑制薬である。それは、元々は、単独で、又は他の薬剤と併用して使用する化学療法のために開発され、現在でも、膀胱がん、乳がん、頭頚部がん、白血病、肺がん、リンパ腫、妊娠性絨毛性疾患及び骨肉腫などの治療に使用される。メトトレキサートは、関節リウマチ、若年性皮膚筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、狼瘡、サルコイドーシス、クローン病、湿疹及び血管炎を含むいくつかの自己免疫疾患の疾患修飾治療薬としても使用される。その他の用途には、子宮外妊娠の治療や薬物による中絶の誘発が含まれる。
ペメトレキセドは、中皮腫、肺がん、頭頚部がんなど、さまざまながんの徴候の治療に使用される。これは、葉酸と化学的に類似し、プリン及びピリミジンの合成に使用される３つの酵素、ＤＨＦＲ、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ（ＧＡＲＦＴ）を阻害することによって機能する。ペメトレキセドは、前駆体であるプリン及びピリミジンヌクレオチドの形成を阻害することにより、正常細胞及び腫瘍細胞の両者の成長と生存に必要なＤＮＡとＲＮＡの形成を妨げる。
プララトレキサートは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の治療薬として承認されている。これは、細胞内取り込みを増加させる還元葉酸キャリア１（ＲＦＣ－１）、及び、細胞障害性の代謝産物を増加させるホリルポリグルタミン酸合成酵素に対する親和性を高めるように設計されている。
タロトレキシンは、葉酸の4-アミノ誘導体であってプテリンの合成誘導体であるアミノプテリンの代謝拮抗アナログである。タロトレキシンは抗腫瘍活性を示し、ＤＨＦＲと結合してその機能を阻害する。水溶性タロトレキシンは、還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）によって能動的に細胞内に輸送され、そのため、Ｐ糖タンパク質による多剤耐性と関連する可能性は低い。
葉酸拮抗薬はＤＮＡ及びＲＮＡの合成の間に特異的に作用し、主に細胞周期のＳ期に細胞毒性を示す。したがって、ＤＮＡを頻繁に複製する急速に分裂する細胞（悪性細胞や骨髄細胞など）に対して大きな毒性効果がある。しかし、葉酸拮抗薬は腫瘍細胞の成長と増殖を阻害するだけではなく、例えば、骨髄、腸、口腔粘膜、皮膚及び髪で有害事象を引き起こす、骨髄細胞、胃腸細胞及び口腔粘膜細胞などの急速に分裂するがん細胞以外の細胞の成長と増殖も阻害する。
葉酸拮抗薬などの細胞傷害性低分子薬物が引き起こす全身性の副作用は、化学リンカーを介して、そのような薬物を、抗体、抗体の抗原結合断片又は融合タンパク質（例．抗体のＦｃと融合した受容体リガンド）などの標的分子と結合させることで低減させてもよい。これらの２つの成分－細胞傷害性低分子薬物及び標的分子－を組み合わせて新しい一つの分子とすることで、標的分子を、細胞傷害性低分子薬物を標的とする細胞又は組織（細胞傷害活性を発揮する部位）に特異的に送達することができ、それにより、非標的組織の低分子への曝露を低減する。
メトトレキサートの標的化を改善し、毒性を軽減するために、メトトレキサートのいくつかの抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）が、1980年代後半に製造された。これらのリシン結合ＡＤＣの薬物抗体比（ＤＡＲ）は、９．４～４５であった。ＡＤＣの発想は成功したものの、これらのＡＤＣで得られたin vitro（Shen et al, Cancer Res. 1986, 46, 3912-3916；Umemoto et al, Int. J. Cancer 1989, 43, 677-684）及びin vivo（Deguchi et al, Cancer Res. 1986, 46, 3751-3755；Rowland et al, Br. J. Cancer 1990, 61, 702-708）での有効性は、中程度から不良であった。ＤＡＲが大きくても、メトトレキサートはＡＤＣの毒素として十分に強力ではないように思われた。
ペメトレキセドの腫瘍を標的とする短いペプチド複合体が作製され、試験された（Miklan et al, J. Pept. Sci. 2011, 17, 805-811）が、この発想はこれ以上探求されなかった。ペメトレキセド、プララトレキサート、タロトレキシンなどのより強力な葉酸拮抗薬のＡＤＣは報告されていない。
したがって、単独で、又は他の治療薬と組み合わせて、がん、自己免疫疾患及び感染症の治療で使用するのに適した、葉酸拮抗薬、及び、抗体、抗原結合断片又は他の標的分子を含む、新規で改良された標的特異的複合体に対する必要性がある。
本発明は、新規な葉酸拮抗リンカー－薬物、そのような葉酸拮抗リンカー－薬物を含む複合体、並びに、場合によって他の治療薬と組み合わせる、がん、自己免疫疾患及び感染症などの疾患の治療におけるその使用に関する。
第１の側面では、本発明は、式（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨであり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２、ＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルケニル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルキニル）又はＣＨ（Ｃ１－４アルコキシ）であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、ベンジルオキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ若しくはアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）であるか、又は、Ｒ４は、
（ここで、Ｒａ’は、Ｈ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、それぞれのＲａは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、かつ、場合によっては、２つのＲａは一緒になって環を形成できる）からなる群から選択されるカルボン酸生物学的等価体であり；
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ２－４アルキニル、Ｃ１－４アルコキシ又はＣ１－４アルキルチオ、好ましくは、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＦ３又はＣＦ２ＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ３－６シクロアルキル、好ましくはＨであり；
ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
Ｑは、単結合、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２－、－Ｎ（Ｒ７）ＳＯ２－若しくは－ＳＯ２Ｎ（Ｒ７）－（ここで、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルケニル又はＣ１－４アルキニル、好ましくはＨである）であるか、又は、Ｑは、
若しくは
（ここで、ＲｂはＨ及びＣ１－５アルキルから選択され、Ｔ１、Ｔ１’及びＴ１’’は、独立して、ＣＨ及びＮから選択され、Ｗ１、Ｗ１’及びＷ１’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）からなる群から選択されるアミド結合生物学的等価体であり；
Ｖは、場合によっては１つ以上のＲ４で置換され、独立して、
から選択される、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル若しくはシクロアルカン（ここで、Ｕ１、Ｕ１’、Ｕ１’’、Ｕ２、Ｕ２’、Ｕ２’’及びＵ２’’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）であるか、又は、Ｖは、
（ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲｃであり、ＲｃはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）からなる群から選択され；
ｓは０又は１、好ましくは１であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基であり；
ｋは、１、２、３又は４、好ましくは１であり；
Ｌはリンカーであり；
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する］
で表されるリンカー－薬物化合物に関する。
第２の側面では、本発明は、式（ＩＩＩ）
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｙ （ＩＩＩ）
［式中、
Ａｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
Ｌ－Ｄは、本発明のリンカー－薬物化合物であり；
ｙは、１～１６の平均薬物抗体比を示し；
前記本発明のリンカー－薬物化合物は、好ましくは前記抗体又はその抗原結合断片のシステイン残基を介して、前記抗体又はその抗原結合断片と結合している］
で表される抗体－薬物複合体に関する。
本発明の他の側面は、本発明のリンカー－薬物化合物又は抗体－薬物複合体を含む医薬組成物、それらの合成方法、及び、特にがん、自己免疫疾患又は感染症の治療のための医薬としてのそれらの使用を含む。
ＨＥＲ２陽性ＳＫ－ＢＲ－３細胞における、トラスツズマブ－ＸＴ１７葉酸拮抗ＡＤＣ及び結合していない対照ＡＤＣのin vitroでの有効性。 ＨＥＲ２陰性ＳＷ－６２０細胞における、トラスツズマブ－ＸＴ１７葉酸拮抗ＡＤＣ及び結合していない対照ＡＤＣのin vitroでの有効性。 マウスのＨＥＲ２陽性ＢＴ－４７４細胞株異種移植片における、葉酸拮抗ＡＤＣ１（５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）及びビヒクル対照のin vivoでの有効性。 マウスのＨＥＲ２陽性ＢＴ－４７４細胞株異種移植片における、葉酸拮抗ＡＤＣ１（５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ又は１．７ｍｇ／ｋｇ Ｑ１Ｗ×３）及びビヒクル対照のin vivoでの有効性。 マウスのＨＥＲ２陽性ＢＴ－４７４細胞株異種移植片における、葉酸拮抗ＡＤＣ１（５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）及びビヒクル対照の体重に対する効果。 マウスのＨＥＲ２陽性ＢＴ－４７４細胞株異種移植片における、葉酸拮抗ＡＤＣ１（５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ又は１．７ｍｇ／ｋｇ Ｑ１Ｗ×３）及びビヒクル対照の体重に対する効果。 マウスのＨＥＲ２ ２＋ ＭＡＸＦ５７４患者由来異種移植片における、葉酸拮抗ＡＤＣ１（３又は１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）及びビヒクル対照のin vivoでの有効性。
詳細な説明
本発明者らは、式（Ｉ）で表されるリンカー－薬物化合物が、抗体、抗原結合断片、又は融合タンパク質（例．抗体のＦｃと融合した受容体リガンド）などの別の標的化分子との結合に特に適していることを見いだした。これらのリンカー－薬物複合体から放出される低分子薬物は、葉酸拮抗化合物として良好な効力を有する。それらはＤＨＦＲの優れた阻害活性を示し、種々のがん細胞株において強力な抗増殖効果を示す。
リンカー－薬物化合物
第１の側面では、本発明は、式（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨであり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２、ＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルケニル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルキニル）又はＣＨ（Ｃ１－４アルコキシ）であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、ベンジルオキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ若しくはアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）であるか、又は、Ｒ４はカルボン酸生物学的等価体であり；
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ２－４アルキニル、Ｃ１－４アルコキシ又はＣ１－４アルキルチオ、好ましくは、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＦ３又はＣＦ２ＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ３－６シクロアルキル、好ましくはＨであり；
ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
Ｑは、単結合、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２－、－Ｎ（Ｒ７）ＳＯ２－若しくは－ＳＯ２Ｎ（Ｒ７）－（ここで、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルケニル又はＣ１－４アルキニル、好ましくはＨである）であるか、又は、Ｑはアミド結合生物学的等価体であり；
Ｖは、場合によっては１つ以上のＲ４で置換され、独立して、
から選択される、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル若しくはシクロアルカン（ここで、Ｕ１、Ｕ１’、Ｕ１’’、Ｕ２、Ｕ２’、Ｕ２’’及びＵ２’’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）であるか、又は、Ｖは、
（ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲｃであり、ＲｃはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）からなる群から選択され；
ｓは０又は１、好ましくは１であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基であり；
ｋは、１、２、３又は４、好ましくは１であり；
Ｌはリンカーであり；
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する］
で表されるリンカー－薬物化合物を提供する。
そのようなリンカー－薬物化合物は、以降、本発明のリンカー－薬物又はリンカー－薬物化合物という。
本発明では、ハロゲンは、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）又はヨウ素（Ｉ）である。本発明のリンカー－薬物化合物において好ましいハロゲンは、フッ素、塩素及び臭素であり、より好ましいハロゲンはフッ素又は塩素であり、最も好ましいハロゲンは塩素である。
この発明では、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキニル、シクリル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールにおける炭素原子の数は、例えばＣ１－６として示され、この限定的するものではない例では、１～６個の炭素原子（例．１、２、３、４、５又は６個の炭素原子）が想定されることを示す。同様に、Ｃ２－４アルケニルの炭素原子は、２、３又は４である。炭素原子の数は、さらなる置換基を数に入れない炭素原子の総数、炭素原子の総数、及び最も長い連続した炭素鎖の炭素原子の数として表すことができる。好ましくは、炭素原子の数は、さらなる置換基を数に入れない炭素原子の総数として表される。
この発明では、置換されていないアルキル基の一般式はＣｎＨ２ｎ＋１であり、直鎖状又は分岐鎖状であってもよい。置換されていないアルキル基は、環状部分を含んでいてもよく、したがって、一般式はＣｎＨ２ｎ－１であってもよい。場合によっては、アルキル基は、本明細書中で更に記載する１種以上の置換基で置換される。適当なアルキル基の例は、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－Ｃ（ＣＨ３）３等であるが、これらには限定されない。好ましいアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であり、最も好ましくは直鎖状である。シクリル基は環状アルキル基；好ましくは、シクリル基は、シクロプロピル、シクロブチル及びシクロペンチルである。ヘテロシクリル基は、少なくとも１つのＣＨ２がヘテロ原子で置換されたシクリル基である。好ましくは、ヘテロ原子は、Ｓ、Ｏ及びＮである。好ましくは、ヘテロシクリル基は、ピペリジニル、オキシラニル及びオキソラニルである。好ましくは、Ｃ１－４アルキル基は、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－Ｃ（ＣＨ３）３、シクロプロピル及びシクロブチル、より好ましくは、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３及び－Ｃ（ＣＨ３）３である。
この発明では、置換されていないアルキル基の一般式はＣｎＨ２ｎ－１であり、直鎖状又は分岐鎖状であってもよい。適当なアルケニル基の例は、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル及びペンテニル等であるが、これらには限定されない。置換されていないアルケニル基は、環状部分を含んでいてもよく、したがって、一般式はＣｎＨ２ｎ－３であってもよい。好ましいアルケニル基は、直鎖状又は分岐鎖状であり、最も好ましくは直鎖状である。
この発明では、置換されていないアルキニル基の一般式はＣｎＨ２ｎ―３であり、直鎖状又は分岐鎖状であってもよい。置換されていないアルキニル基は、環状部分を含んでいてもよく、したがって、一般式はＣｎＨ２ｎ－５であってもよい。場合によっては、アルキニル基は、本明細書中で更に記載する１種以上の置換基で置換される。適当なアルキニル基の例は、エチニル、プロパルギル、n-ブタン-2-イニル及びn-ブタン-3-イニル等であるが、これらには限定されない。好ましいアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であり、最も好ましくは直鎖状である。
この発明では、アリール基は芳香族であり、少なくとも６個の炭素原子を含み、単環、二環及び多環構造を含んでいてもよい。場合によっては、アリール基は、本明細書中で更に記載する１種以上の置換基で置換されてもよい。アリール基の例は、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基等である。ヘテロアリール基は芳香族であり、Ｓ、Ｏ及びＮからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子を含む。ヘテロ原子のために、環サイズが５以下のこともある。
この発明では、アルコキシは、アルキルの前に架橋酸素原子を有する。適当なアルコキシの例は、－ＯＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＣＨ（ＣＨ３）２、－ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３及び－ＯＣ（ＣＨ３）３である。
この発明では、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリル及びヘテロシクリルは、好ましくはハロゲン、ＣＨ３といったＣ１－４アルキル、ＯＨ、ＯＣＨ３といったＣ１－４アルコキシ及び＝Ｏから選択される１種以上で、場合によっては置換されおり、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシは、Ｏ又はＳといったヘテロ原子で中断されることもあり、アルキル、アルコキシ、シクリル及びヘテロシクリルは、場合によっては不飽和である。ヘテロ原子による中断は、１つ以上のヘテロ原子による中断を意味する。本願では、好ましくは２０個以下、より好ましくは３個、４個又は５個のヘテロ原子が中断する。好ましくは、中断する全てのヘテロ原子は同じ元素である。限定的するものではない例として、ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３は、ヘテロ原子で中断される場合、ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３のこともある。
本発明の分子は、場合によっては置換することもできる。任意の適当な置換は、－Ｈのハロゲンによる置換である。好ましくは、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩであり、最も好ましくはＦである。別の適当な任意の置換は、１つ以上の－Ｈの、－ＮＨ２、－ＯＨ、＝Ｏ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルケン、ハロアルケン、アルキン、ハロアルキン及びシクロアルキルによる置換である。アルキル基の一般式はＣｎＨ２ｎ＋１であり、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。置換されていないアルキル基は、環状部分を含んでいてもよく、したがって、一般式はＣｎＨ２ｎ－１であってもよい。場合によっては、アルキル基は、本明細書中で更に記載する１種以上の置換基で置換される。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、2-プロピル、t-ブチル、1-ヘキシル、1-ドデシル等が含まれる。
この発明では、生物学的等価体は、他の化合物と同等の生物学的特性を広く生み出す物理的又は化学的特性を有する置換基または原子団である。ある生物学的等価体を別のものと交換する目的は、化学構造を大きく変更することなく、化合物の所望の生物学的又は物理的特性を増強することである。生物学的等価体の一般的な概念は、例えば、Meanwell, J. Med. Chem. 2011, 54, 2529-2591及びPatani and LaVoie, Chem. Rev. 1996, 96, 3147-3176に記載されている。
カルボン酸生物学的等価体は、例えばBallatore et al, ChemMedChem. 2013, 8, 385-395及びLassalas et al, J. Med. Chem. 2016, 59, 3183-3203に記載されている。
カルボン酸生物学的等価体の好ましい例は、
（ここで、Ｒａ’は、Ｈ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、それぞれのＲａは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、かつ、場合によっては、２つのＲａは一緒になって環を形成できる）
である。
アミド結合生物学的等価体は、例えば、Kumari et al, J. Med. Chem. 2020, 63, 12290-12358及びRecnik et al, Molecules 2020, 25, 3576に記載されている。
アミド結合生物学的等価体の好ましい例は、
又は
（ここで、ＲｂはＨ及びＣ１－５アルキルから選択され、Ｔ１、Ｔ１’及びＴ１’’は、独立して、ＣＨ及びＮから選択され、Ｗ１、Ｗ１’及びＷ１’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）である。
Tse et al（J. Med. Chem. 2020, 63, 11585-11601）、Mykhailiuk（Org. Biomol. Chem., 2019, 17, 2839-2849）、Qiao et al（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 4118-4123）及びStepan et al（J. Med. Chem. 2012, 55, 3414-3424）は、さまざまな非古典的及び／又は飽和フェニル生物学的等価体について記載している。
そのようなフェニル生物学的等価体の例は、
である。
これまでに述べたように、Ｖは、場合によっては１つ以上のＲ４で置換され、独立して、
から選択される、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル又はシクロアルカンである。ある態様では、Ｖは、
である。
好ましくは、Ｖは、
である。
より好ましくは、Ｖは、
である。
好ましい態様では、本発明は、式（Ｉａ）
で表されるリンカー－薬物化合物を提供する。
より好ましくは、本発明は、式（Ｉａ）で表されるリンカー－薬物化合物を提供し、式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨ、好ましくはＲ１はＮＨ２であり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅ、好ましくはＲ２及びＲ２’はＮであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２又はＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、好ましくはＲ３は、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）又はＣＨ２であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ又はアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）、好ましくはＲ４は、－ＣＯＯＨ又はテトラゾールであり；
Ｑは、単結合、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２－、－Ｎ（Ｒ７）ＳＯ２－若しくは－ＳＯ２Ｎ（Ｒ７）－（ここで、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルケニル又はＣ１－４アルキニル、好ましくはＨである）であるか、又は、Ｑはアミド結合生物学的等価体であり、好ましくは、Ｑは、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－又は－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、より好ましくは－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基であり、好ましくはＸはＮＨであり；
Ｌはリンカーであり；
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する。
特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４は－ＣＯＯＨであり、Ｑは－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－である。
別の特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４は－ＣＯＯＨであり、Ｑはテトラゾールである。
別の特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はテトラゾールであり、Ｑは－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－である。
別の特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４は－ＳＯ３Ｈであり、Ｑは－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－である。
別の好ましい態様では、本発明は、式（Ｉｂ）
で表されるリンカー－薬物化合物を提供する。
より好ましくは、本発明は、式（Ｉｂ）で表されるリンカー－薬物化合物を提供し、式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨ、好ましくはＲ１はＮＨ２であり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅ、好ましくはＲ２及びＲ２’はＮであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２又はＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、好ましくはＲ３は、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）又はＣＨ２であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ又はアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）、好ましくはＲ４は、－ＣＯＯＨ又はテトラゾールであり；
ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基、好ましくはＸはＮＨであり；
Ｌはリンカーであり；
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する。
特定の態様では、Ｒ１であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４は－ＣＯＯＨであり、ｎは３である。
別の特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はテトラゾールであり、ｎは３である。
別の好ましい態様では、本発明は、式（Ｉｃ）
で表されるリンカー－薬物化合物を提供する。
より好ましくは、本発明は、式（Ｉｃ）で表されるリンカー－薬物化合物を提供し、式中、
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅ、好ましくはＲ２及びＲ２’はＮであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２又はＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、好ましくはＲ３は、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）又はＣＨ２であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ又はアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）、好ましくはＲ４は、－ＣＯＯＨ又はテトラゾールであり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基、好ましくはＸはＮＨであり；並びに
Ｌはリンカーである。
特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４は－ＣＯＯＨである。
別の特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はテトラゾールである。
更に別の特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＣであり、Ｒ４はＨである。
更に別の特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はである。
更に別の特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はＯＨである。
更に別の特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はＣｌである。
更に別の特定の態様では、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４は－ＳＯ３Ｈである。
別の好ましい態様では、本発明は、式（Ｉｄ）
で表されるリンカー－薬物化合物を提供する。より好ましくは、本発明は、式（Ｉｄ）で表されるリンカー－薬物化合物を提供し、式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨ、好ましくはＲ１はＮＨ２であり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅ、好ましくはＲ２及びＲ２’はＮであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２又はＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、好ましくはＲ３は、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）又はＣＨ２であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ又はアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）、好ましくはＲ４は、－ＣＯＯＨ又はテトラゾールであり；
ｎは、１、２、３又は４、好ましくは４であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基、好ましくはＸはＮＨであり；
Ｌはリンカーであり；
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する。
特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はＣＯＯＨであり、ｎは４である。
別の特定の態様では、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ２及びＲ２’はＮであり、Ｒ４はＨであり、ｎは３である。
好ましい本発明のリンカー－薬物化合物は、
である。
より好ましい本発明のリンカー－薬物化合物は、
である。
本発明のリンカー－薬物化合物は、リンカーを含む。リンカーは、好ましくは合成リンカーである。リンカーの構造は、リンカーが低分子薬物と化学的に容易に結合できるようなもので、得られたリンカー－薬物化合物が、別の物質（例．ポリペプチド）と容易に結合して、阻害剤複合体を形成できるようなものである。リンカーの選択は、最終的な複合体の血中での安定性に影響を与える可能性があり、また、低分子薬物の放出のされ方に影響を与える可能性がある。適切なリンカーは、例えば、Ducry et al, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13、King and Wagner, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 825-839、Gordon et al, Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215、Tsuchikama and An (DOI: 10.1007/s13238-016-0323-0)、Polakis (DOI: 10.1124/pr.114.009373)、Bargh et al. (DOI: 10.1039/c8cs00676h)、国際公開第02/083180号、同2004/043493号、同2010/062171号、同2011/133039号、同2015/177360号、同2018/069375号に記載されている。リンカーは、切断可能であっても可能でなくてもよい。切断可能なリンカーは、例えば、リソソームのプロテアーゼ、又は酸性ｐＨ若しくは高い還元電位の環境に曝露された場合に切断される部分を含む。適切な切断可能なリンカーは、当該技術分野で公知であって、例えば、ジ、トリ又はテトラペプチド、すなわち、２個、３個又は４個のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。さらに、切断可能なリンカーは、ω-アミノアミノカルボニル環化スペーサーなどの自壊部分（Saari et al, J. Med. Chem., 1990, 33, 97-101参照）又は－NH－CH2－O－結合を含んでいてもよい。リンカーの切断により、本発明のリンカー－薬物化合物中の葉酸拮抗部分が、周囲の環境で利用できるようになる。切断不可能なリンカーは、例えば、複合体のポリペプチドがリソソームで分解される場合、依然として、本発明のリンカー－薬物化合物から葉酸拮抗部分（の誘導体）をより効果的に放出できる。切断不可能なリンカーには、例えば、スクシンイミジル-4-N-マレイミドメチル(シクロヘキサン)-1-カルボキシラート及びマレイミドカプロン酸、並びにそれらの類似体が含まれる。
リンカー又はリンカー－薬物を、抗体、その抗原結合断片又は別の標的化分子などのポリペプチドと結合できるようにするために、抗体、その抗原結合断片又は別の標的化分子と（共有結合で）結合するリンカーの側は、通常、比較的穏やかな条件で、抗体、その抗原結合断片又は別の標的化分子のアミノ酸残基と反応できる官能基を有する。この官能基は、この明細書では反応性部分（ＲＭ）と呼ぶ。反応性部分の例には、ハロゲン化カルバモイル、ハロゲン化アシル、活性エステル、無水物、α-ハロアセチル、α-ハロアセトアミド、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネート、ジスルフィド、チオール、ヒドラジン、ヒドラジド、塩化スルホニル、アルデヒド、メチルケトン、ビニルスルホン、ハロメチル、メチルスルホネート及びシクロオクチンが含まれるが、これらに限定されるものではない。官能基と反応するアミノ酸残基は、天然又は非天然のアミノ酸残基であってもよい。この明細書における用語「非天然のアミノ酸」は、（合成によって）修飾されたアミノ酸、又は天然に存在するアミノ酸のｄ型立体異性体を表すことを意図している。好ましくは、官能基が反応するアミノ酸残基は天然のアミノ酸である。
本発明の好ましい態様では、ＲＭは、
（ここで、
Ｘ１は、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｎ－スクシンイミド、－Ｏ－（４－ニトロフェニル）、－Ｏ－ペンタフルオロフェニル、－Ｏ－テトラフルオロフェニル、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｒ８及び－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ８から選択されるか、Ｃ（Ｏ）－Ｘ１は活性エステルであり；
Ｘ２は、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｏ－メシル、－Ｏ－トリフリル及び－Ｏ－トシルから選択され；
Ｒ８は、場合によっては置換され、分岐又は非分岐の、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０ヘテロアルキル、Ｃ３－１０シクロアルキル、Ｃ１－１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ５－１０アリール又はＣ１－１０ヘテロアリールから選択され；
ＵはＯ又はＮＲ９であり；
Ｒ９は、Ｈ、分岐又は非分岐のＣ１－Ｃ１２アルキル又はＣ４－Ｃ１２（ヘテロ）アリールから選択される）
である。
好ましくは、ＲＭは、
である。
より好ましくは、ＲＭは、
である。
リンカーは、
といった、１つ以上の伸長スペーサーを更に含んでいてもよい。
リンカーは、例えば、Alouane et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 7492-7509、Deng et al, Macromol. Rapid Commun. 2020, 41, e1900531又はBargh et al, Chem. Soc. Rev. 2019, 48, 4361-4374に記載の１つ以上の脱離スペーサーを更に含んでいてもよい。
ある態様では、リンカーＬは、
［ここで、
ｍは１～１０の整数、好ましくは５であり；
ＡＡはアミノ酸、好ましくは中性アミノ酸であり；
ｐは、０、１、２、３又は４であり；
ｑは１～１２の整数、好ましくは２であり；
ＥＳは、単結合又は
から選択される伸長スペーサーであり；
ＲＬは、単結合又は
（ここで、ｔは１～１０の整数であり、Ｒ１０は、場合によっては置換されたＣ１－４アルコキシであり、Ｒ１１は、Ｈ、場合によっては置換されたＣ１－６アルキル、場合によっては置換されたＣ６－１４アリール、又は場合によっては置換されたＣ－結合Ｃ３－８ヘテロアリールである）から選択される脱離スペーサーである］
である。
好ましい態様では、ｍは５で、ｐは０で、ＥＳ及びＲＬは単結合であり、Ｌは
である。
別の好ましい態様では、ＡＡは、アラニン、グリシン、リシン、フェニルアラニン、バリン及びシトルリンからなる群から選択されるアミノ酸である。
第１の態様では、ｐは２で、ＡＡ２は、フェニルアラニルリシン、バリルアラニン、バリルシトルリン又はバリルリシンである。より好ましくは、ＡＡ２は、バリルアラニン又はバリルシトルリンである。最も好ましくは、ＡＡ２は、バリルアラニン又はバリルシトルリンで、ｍは５である。
第２の態様では、ｐは３で、ＡＡ３は、アラニルフェニルアラニルリシンである。
第３の態様では、ｐは４で、ＡＡ４は、グリシルグリシルフェニルアラニルグリシンである。
好ましい態様では、ｍは５で、ｐは２で、ＡＡ２は、バリルアラニン又はバリルシトルリンである。好ましくは、ｍは５で、ｐは２で、ＡＡ２は、バリルアラニンで、ＥＳ及びＲＬは結合で、Ｌは
である。
別の好ましい態様では、ｍは５で、ｐは４で、ＡＡ４は、グリシルグリシルフェニルアラニルグリシンで、ＥＳ及びＲＬは単結合で、Ｌは
である。
ある態様では、Ｌは、
（ここで、
ｑは１～１２の整数、好ましくは２であり；
ＡＡはアミノ酸、好ましくは中性アミノ酸であり；
ｐは、０、１、２、３又は４であり；
ＥＳは、単結合又
から選択される伸長スペーサーであり；
ＲＬは、単結合又は
（ここで、ｔは１～１０の整数であり、Ｒ１０は、場合によっては置換されたＣ１－４アルコキシであり、Ｒ１１は、Ｈ、場合によっては置換されたＣ１－６アルキル、場合によっては置換されたＣ６－１４アリール、又は場合によっては置換されたＣ－結合Ｃ３－８ヘテロアリールである）から選択される脱離スペーサーである）
である。
好ましい態様では、ＡＡは、アラニン、グリシン、リシン、フェニルアラニン、バリン、及びシトルリンからなる群から選択されるアミノ酸である。
第１の態様では、ｐは２で、ＡＡ２はフェニルアラニルリシン、バリルアラニン、バリルシトルリン又はバリルリシンである。より好ましくは、ＡＡ２は、バリルアラニン又はバリルシトルリンである。最も好ましくは、ＡＡ２は、バリルアラニンまたはバリルシトルリンで、ｑは２である。
第２の態様では、ｐは３で、ＡＡ３はアラニルフェニルアラニルリシンである。
第３の態様では、ｐは４で、ＡＡ４は、グリシルグリシルフェニルアラニルグリシンである。
好ましい態様では、ｑは２で、ｐは２で、ＡＡ２はバリルアラニン又はバリルシトルリンである。好ましくは、ｑは２で、ｐは２で、ＡＡ２はバリルシトルリンで、ＲＬは単結合で、ＥＳは
で、Ｌは
である。
別の好ましい態様では、ｑは２で、ｐは２で、ＡＡ２はバリルシトルリンで、ＥＳは
で、ＲＬは
で、Ｌは
である。
ある態様では、リンカーＬは
である。
以下は好ましい本発明のリンカー－薬物化合物である。
より好ましい本発明のリンカー－薬物化合物は、
である。
更により好ましい本発明のリンカー－薬物化合物は、
である。
更により好ましい本発明のリンカー－薬物化合物は、
である。
最も好ましくは、本発明のリンカー－薬物化合物は、式
で表される化合物である。
本発明のリンカー－薬物化合物の製造方法
本発明のリンカー－薬物化合物は、実施例若しくは、例えばRosowsky et al（J. Med. Chem. 1988, 31 1332-1337；J. Med. Chem. 1998, 41 5310-5319；J. Med. Chem. 2000, 43 1620-1634）若しくはItoh et al（Chem. Pharm. Bull. 2000, 48 1270-1280）に記載の方法又はこれと同様の方法で製造できる。
ある側面では、本発明は、本発明のリンカー－薬物化合物の製造又は本発明のリンカー－化合物を含有する複合体の製造における式
で表される化合物の使用に関し、式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨであり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２、ＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルケニル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルキニル）又はＣＨ（Ｃ１－４アルコキシ）であり；
Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、ベンジルオキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ若しくはアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）であるか、又は、Ｒ４はカルボン酸生物学的等価体であり；
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ２－４アルキニル、Ｃ１－４アルコキシ又はＣ１－４アルキルチオ、好ましくは、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＦ３又はＣＦ２ＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ３－６シクロアルキル、好ましくはＨであり；
ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
Ｑは、単結合、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２－、－Ｎ（Ｒ７）ＳＯ２－若しくは－ＳＯ２Ｎ（Ｒ７）－（ここで、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルケニル又はＣ１－４アルキニル、好ましくはＨである）であるか、又は、Ｑはアミド結合生物学的等価体であり；
Ｖは、場合によっては１つ以上のＲ４で置換され、独立して、
から選択される、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル若しくはシクロアルカン（ここで、Ｕ１、Ｕ１’、Ｕ１’’、Ｕ２、Ｕ２’、Ｕ２’’及びＵ２’’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）であるか、又は、Ｖは、
（ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲｃであり、ＲｃはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）からなる群から選択され；
ｓは０又は１、好ましくは１であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択され；並びに
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する。
ある態様では、本発明は、本発明のリンカー－薬物化合物の製造又は本発明のリンカー－化合物を含有する複合体の製造における式
で表される化合物の使用に関し、式中、
Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨであり；
Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅであり；
Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２又はＣＨ（Ｃ１－５アルキル）であり；
Ｒ４は、Ｈ，ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ，テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ又はアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）であり；
ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択され；
は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積していない、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する。
好ましい態様では、本発明は、本発明のリンカー－薬物化合物の製造又は本発明のリンカー－化合物を含有する複合体の製造における式
で表される化合物の使用に関する。より好ましくは、化合物は、式
で表される化合物である。
更により好ましくは、化合物は、式
で表される化合物である。
ポリペプチドと葉酸拮抗リンカー－薬物化合物の阻害剤複合体
本発明は、例えばポリペプチド又は（アプタマーを形成するための）ポリヌクレオチドなどの別の物質と結合した本発明のリンカー－薬物化合物を含む阻害剤複合体を更に提供する。好ましくは、別の物質はポリペプチドである。より好ましくは、ポリペプチドは、抗体、その抗原結合断片又は別の標的化分子である。このような阻害剤複合体は、以降、本発明の阻害剤複合体という。
ポリペプチドに結合している場合、用語「本発明の阻害剤複合体」は、この明細書全体を通して、１つ以上の本発明のリンカー－薬物化合物が結合したポリペプチド、すなわち、１つ以上の一般式（Ｉ）で表されるリンカー－薬物化合物が結合したポリペプチド、を指す。
通常、本発明の阻害剤複合体は、異常な又は悪性の細胞と関連するが、好ましくは健康な細胞とは関連しないか、ほとんど関連しない受容体、受容体複合体、抗原、酵素又は別の部分と結合するか、反応的に会合するか、又は複合体を形成するポリペプチドを含む。本発明の阻害剤複合体中のポリペプチドは、本発明のリンカー－薬物化合物を異常な又は悪性の細胞に向けるための手段として機能する。適切なポリペプチドには、抗体、その抗原結合断片、酵素阻害剤、酵素基質、受容体リガンド及び融合タンパク質が含まれる。
本発明のリンカー－薬物化合物は、ポリペプチド中に存在する反応性の天然アミノ酸残基（例．リシン又はシステイン）を介して、又はＮ末端若しくはＣ末端を介して、適切なポリペプチドと結合してもよい。あるいは、天然又は非天然の反応性のアミノ酸残基を、適切なポリペプチドで遺伝子操作してもよく、又は翻訳後修飾によって導入してもよい。さらに、適切なポリペプチドが糖タンパク質である場合、本発明のリンカー－薬物化合物は、グリカンを介して糖タンパク質と結合させてもよい。
本発明の阻害剤複合体に含まれる本発明のリンカー－薬物化合物は、阻害剤複合体に含まれない本発明の同じ化合物と比較して、特定の原子又は原子団を欠いていてもよく、例えば、水素原子を欠いていてもよいことが理解されるべきである。これは、例えば、本発明のリンカー－薬物化合物が、例えば、ヒドロキシル部分でのエステル化によりポリペプチドと結合するためである可能性がある。
好ましくは、この明細書で使用するポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片である。したがって、本発明は、好ましくは、本発明のリンカー－薬物化合物を含む抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。
ある態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｙ （ＩＩＩ）
［式中、
Ａｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
Ｌ－Ｄは、本発明のリンカー－薬物化合物であり；
ｙは、１～１６、好ましくは１～１０の平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を示す］
で表されるＡＤＣに関する。
当該技術分野において広く知られているように、ＤＡＲ及び薬物負荷分布は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）を用いて求めることができる。ＨＩＣは、平均ＤＡＲの決定に特に適している。
好ましい態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）で表されるＡＤＣに関し、式中、本発明のリンカー－薬物化合物は、抗体又はその抗原結合断片のシステイン残基を介して抗体又はその抗原結合断片と結合する。
更に好ましい態様では、本発明は式
［式中、
Ａｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
ｙは、１～１６、好ましくは１～１０の平均ＤＡＲを示す］
で表されるＡＤＣに関する。
最も好ましい態様では、本発明は、式
［式中、
Ａｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
ｙは、１～１６、好ましくは１～１０の平均ＤＡＲを示す］
で表されるＡＤＣに関する。
本発明では、上記ＡＤＣの式中のＡｂは、任意の抗体又はその抗原結合断片、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその抗原結合断片であってもよい。
この明細書における用語「抗体」は、好ましくは、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む抗体を指す。一般に、抗体又はその抗原結合断片は、治療活性を有するものであるが、ＡＤＣの技術分野で知られているように、このような独立した有効性は必ずしも必要ではない。本発明で使用する抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体などの任意のアイソタイプであってもよい。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体であり、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体であってもよい。好ましくは、抗体はヒト化又はヒト抗体である。更により好ましくは、抗体はヒト化又はヒトＩｇＧ抗体であり、より好ましくはヒト化又はヒトＩｇＧ１ｍＡｂである。抗体は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）軽鎖、好ましくはκ軽鎖、すなわちヒト化又はヒトＩｇＧ１-κ抗体を有していてもよい。
この明細書における用語「抗原結合断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は還元ＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖（ｓｃ）抗体、シングルドメイン（ｓｄ）抗体、ダイアボディ又はミニボディを含む。
非ヒト（例．げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する配列が最小の抗体（例．非ヒト－ヒトキメラ抗体）である。非ヒト抗体をヒト化するさまざまな方法が当該技術分野において知られている。例えば、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）における抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト種、通常、マウス、ラット又はウサギの抗体に由来する。これらの非ヒトＣＤＲは、結合親和性及び特異性といった抗体の機能が少なくとも部分的に保持されるように、ＨＣ及びＬＣの可変領域のヒトフレームワーク領域（ＦＲ、すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と、組み合わせることができる。ヒトＦＲの選択されたアミノ酸を、対応する元の非ヒト種のアミノ酸に置換して、低い免疫原性を維持しながら、結合親和性を改善するなど、抗体の特性を更に改善できる。このようにしてヒト化された可変領域は、通常、ヒトの定常領域と組み合わせる。非ヒト抗体のヒト化の代表的な方法は、Winterとその共同研究者（Jones et al, Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann et al, Nature 1988, 332, 323-327；Verhoeyen et al, Science 1988, 239, 1534-1536）の方法である。あるいは、非ヒト抗体は、アミノ酸配列を改変して、ヒトで天然に産生される抗体改変体との類似性を高めることによってヒト化できる。例えば、元の非ヒト種ＦＲの選択したアミノ酸を、抗体の結合親和性を維持しながら、免疫原性を低下させるために、対応するヒトのアミノ酸と置換する。詳細については、Jones et al, Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann et al, Nature 1988, 332, 323-327及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596を参照。以下の総説とそこで引用する参考文献も参照：Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1998, 1, 105-115；Harris, Biochem. Soc. Transactions 1995, 23, 1035-1038及びHurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 1994, 5, 428-433。
ＣＤＲは、Kabat（in Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)）、Chothia（ et al, Nature 1989, 342, 877883）又はIMGT（Lefranc, The Immunologist 1999, 7, 132-136）の方法を使用して決定できる。
通常、抗体は、標的抗原、好ましくは内在化するか内在化しない、好ましくは内在化する膜に結合した標的である抗原、に結合する、少なくとも１つのＨＣ及びＬＣ可変領域を含む単一特異性抗体（すなわち、１つの抗原に特異的である；そのような抗原は、種間で共通であってもよく、種間で類似のアミノ酸配列を有していてもよい）又は二重特異性抗体（すなわち、ある種の２つの異なる抗原に特異的である）である。
ある特定の態様では、標的抗原は、アネキシンＡｌ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７－２９、ＣＡ１２５、ＣＡ２４２（がん抗原２４２）、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０（腫瘍壊死因子８）、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７（インテグシン関連タンパク質）、ＣＤ５６、（神経細胞接着分子）、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５（コロニー刺激因子１受容体）、ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２０３ｃ（ＥＮＰＰ３）、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＤＣＰ１、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ、クローディン４、クローディン７、ＣＬＣＡ－１（Ｃ型レクチン様分子１）、ＣＬＬ１、ｃ－ＭＥＴ（肝細胞増殖因子受容体）、クリプト（Cripto）、ＤＬＬ３、ＥＧＦＬ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＰｈＢ３、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５（Ｆｃ受容体様タンパク質５、ＣＤ３０７）、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１（葉酸受容体α）、ＦＲβ、ＧＣＣ（グアニリルシクラーゼＣ）、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＯＢＯ Ｈ、ＧＰＡ３３、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ（高分子量メラノーマ関連抗原）、インテグリンα（例．αｖβ３及びαｖβ５）、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）、ルイスＡ様炭水化物、ルイスＸ、ルイスＹ（ＣＤ１７４）、ＬＧＲ５、ＬＩＶ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＮ（ＣＡ９）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、ノッチ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＥＡＰ-１、５Ｔ４（又はＴＰＢＧ、栄養芽細胞糖タンパク質）、ＴＦ（組織因子、トロンボプラスチン、ＣＤ１４２）、ＴＦ－Ａｇ、Ｔａｇ７２、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＯＰ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２）、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦＲ及びＶＬＡからなる群から選択される。
適切な抗体の例は、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、イラツムマブ及びブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、バダスツキシマブ（ＣＤ３３）、テツルマブ（ＣＤ３７）、イサツキシマブ（ＣＤ３８）、ビヴァツズマブ（ＣＤ４４）、ロルボツズマブ（ＣＤ５６）、ボルセツズマブ（ＣＤ７０）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ポラツズマブ（ＣＤ７９）、ロバルピツズマブ（ＤＬＬ３）、フツキシマブ（ＥＧＦＲ）、オポルツズマブ（ＥＰＣＡＭ）、ファルレツズマブ（ＦＯＬＲ１）、グレンバツムマブ（ＧＰＮＭＢ）、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルジェツキシマブ（ＨＥＲ２）、エタラシズマブ（インテグリン）、アネツマブ（メソテリン）、パンコマブ（ＭＵＣ１）、エンホルツマブ（ネクチン-４）並びにＨ８、Ａ１及びＡ３（５Ｔ４）である。
抗体又はその抗原結合断片は、該当する場合、(1) 改変された定常領域、すなわち、例えば、半減期を延長させるため、リンカー－薬物との結合部位を提供するため、及び／若しくはエフェクター機能を増加若しくは減少させるために、１つ以上の変異が導入された可能性がある定常領域；又は (2) 改変された可変領域、すなわち、例えば、リンカー－薬物との結合部位を提供するために、１つ以上の変異が導入された可能性がある可変領域、を含んでいてもよい。抗体又はその抗原結合断片は、組換えにより、合成により、又は他の公知の適切な方法により製造してもよい。
本発明のＡＤＣは、野生型、部位特異的又はそれらの組合せであってもよく、以下に示すような当該技術分野において公知の方法で製造できる。
本発明のＡＤＣの製造方法
野生型ＡＤＣは、例えば、抗体のリシンのε-アミノ基を介し、活性化エステルといったアミン反応性基を含むリンカー－薬物を好ましくは使用して、リンカー－薬物を抗体又はその抗原結合断片に結合させることで製造してもよく、活性化エステルを抗体又はその抗原結合断片と接触させることで、ＡＤＣが得られる。あるいは、野生型ＡＤＣは、当該技術分野において公知の方法及び条件を用い、鎖間ジスルフィド結合の還元で生成したシステインの側鎖の遊離チオールを介してリンカー－薬物を結合させることで製造できる。例えば、Doronina et al, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124を参照。この製造方法は、溶媒に曝露された鎖間ジスルフィドを部分的に還元し、生じたチオールを、マレイミド含有リンカー－薬物、α-ハロ酢酸アミド又はエステルなどのマイケル受容体含有リンカー－薬物で修飾することを含む。システイン結合戦略では、１つの還元されたジスルフィドあたり最大で２つのリンカー－薬物が生じる。ほとんどのヒトＩｇＧ分子は、４つの溶媒に露出されたジスルフィド結合を有し、したがって、１つの抗体あたり０～８個のリンカー－薬物が可能である。１抗体あたりのリンカー－薬物の正確な数は、ジスルフィドの還元の程度及びその後の結合反応で使用するリンカー－薬物のモル当量で決まる。４つ全てのジスルフィド結合を完全に還元すると、１抗体あたり８個のリンカー－薬物を有する均一な構築物が得られ、また、部分的な還元では、通常、１抗体あたり０個、２個、４個、６個又は８個のリンカー－薬物を有する不均一な混合物が得られる。
部位特異的ＡＤＣは、好ましくは、変異抗体又はその抗原結合断片の適切な位置における改変したシステイン残基の側鎖を介して、リンカー－薬物を抗体又はその抗原結合断片に結合させることで製造する。改変したシステインは、通常、システイン又はグルタチオンのような他のチオールによってキャップされ、ジスルフィドを形成する。これらのキャップされた残基は、リンカー－薬物結合が生じる可能性がある前にキャップをはずす必要がある。改変した残基へのリンカー－薬物結合は、(1) 天然の鎖間ジスルフィド及び変異ジスルフィドの両者を還元し、次いで、ＣｕＳＯ４若しくはデヒドロアスコルビン酸といった穏やかな酸化剤を用いて天然の鎖間システインを再酸化し、次いで、キャップされていない改変したシステインとリンカー－薬物の標準的な結合形成により、又は (2) 鎖間ジスルフィド結合よりも速く変異ジスルフィドを還元する穏やかな還元剤を使用し、キャップされていない改変したシステインとリンカー－薬物の標準的な結合形成により、達成される。最適な条件では、（抗体又は断片のＨＣ又はＬＣの１つのシステインを改変する場合）１つの抗体又はその抗原結合断片あたり２つのリンカー－薬物（すなわち、ＤＡＲは２）が結合する。部位特異的にリンカー－薬物を結合する適切な方法は、例えば、還元と再酸化の方法を説明する国際公開第2015/177360号、穏やかな還元剤の使用を説明する国際公開第2017/137628号、及び還元した鎖間システインとキャップされていない改変したシステインの結合方法を説明する国際公開第2018/215427号に見いだすことができる。
医薬組成物
別の側面では、本発明は、本発明のリンカー－薬物化合物又は阻害剤複合体を含有する組成物を提供し、好ましくは前記組成物は医薬組成物であり、より好ましくは、薬学的に許容される添加物を更に含む。このような組成物は、以降、本発明の組成物という。組成物は、例えば、液体製剤、凍結乾燥製剤、又は、例えばカプセル若しくは錠剤の形態であってもよい。通常、本発明のリンカー－薬物化合物のような低分子を含むカプセル又は錠剤の形態の医薬製剤は、賦形剤を含む。適切な水溶性賦形剤は、糖、糖アルコール、多糖類及びシクロデキストリンを含む。適切な非水溶性賦形剤は、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、デンプン、加工デンプン及び結晶セルロースを含む。さらに、本発明のリンカー－薬物化合物などの低分子を含む医薬製剤は、結合剤を含んでいてもよい。適切な結合剤は、ゼラチン、セルロース誘導体、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）又はコポリビドンなどのポリマー及びポリエチレングリコールを含む。本発明のリンカー－薬物化合物などの低分子を含む医薬製剤は、更に崩壊剤を含んでいてもよい。適切な崩壊剤は、クロスポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロースナトリウム）及びデンプングリコール酸ナトリウムなどの架橋ポリマーが含まれる。さらに、本発明のリンカー－薬物化合物などの低分子を含む医薬製剤は、ヒュームドシリカ、タルク及び炭酸マグネシウムなどの流動促進剤；タルク若しくはシリカ、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸などの滑沢剤；抗酸化剤若しくはパラベンなどの防腐剤；着色剤；甘味料並びに／又は香料を含んでいてもよい。
通常、本発明の阻害剤複合体、ＡＤＣ又はリンカー－薬物化合物を含む医薬組成物は、静脈内注入前に（水への）溶解（すなわち、再構成）が必要な凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥粉末）、又は使用前に解凍が必要な凍結（水）溶液の形態をとる。したがって、好ましい態様では、本発明は、本発明のリンカー－薬物化合物又は阻害剤複合体を含有する凍結乾燥組成物を提供し、好ましくは前記組成物は医薬組成物であり、より好ましくは、薬学的に許容される添加物を更に含む。更に好ましい態様では、本発明は、水と本発明のリンカー－薬物化合物又は本発明の阻害剤複合体を含有する凍結組成物を提供し、好ましくは前記組成物は医薬組成物であり、より好ましくは、薬学的に許容される添加物を更に含む。この明細書では、凍結溶液は好ましくは大気圧であり、凍結溶液は好ましくは本発明の液体組成物を０℃未満の温度で凍結することで得られた。本発明の（凍結乾燥前の）医薬組成物に配合するのに適した薬学的に許容される添加物には、緩衝溶液（例．クエン酸塩、ヒスチジンなどのアミノ酸又は水中の塩を含むコハク酸塩）、凍結保護剤（例．スクロース、トレハロース）、等張化剤（例．塩化ナトリウムなどの塩化物）、界面活性剤（例．ポリソルベート）及び増量剤（例．マンニトール、グリシン）が含まれる。凍結乾燥タンパク質製剤で使用する添加物は、凍結乾燥中及び保存中のタンパク質変性を防ぐ能力によって選択される。
医薬用途
別の側面では、本発明は医薬として使用するため、好ましくは、がん、自己免疫疾患又は感染症の治療に使用するための、本発明のリンカー－薬物化合物、阻害剤複合体（好ましくは抗体－薬物複合体）又は組成物を提供する。これらのリンカー－薬物化合物、複合体及び組成物は、以降、本発明の用途に用いる製品と総称する。
第１の態様では、本発明の用途に用いる製品は、固形がん又は血液がんの治療に使用するためのものである。
第２の態様では、本発明の用途に用いる製品は、自己免疫疾患の治療に使用するためのものである。
第３の態様では、本発明の用途に用いる製品は、細菌、ウイルス、寄生虫又は他の生物による感染の処置に使用するためのものである。
本発明におけるがんは、好ましくは、本発明の用途に用いる製品が対象とする抗原を発現する腫瘍である。そのようながんは、固形がん又は血液がんであってもよい。先に説明した本発明の用途に用いる製品で治療できる固形がん又は血液がんの例には、乳がん；脳のがん（例．膠芽腫）；頭頚部のがん；甲状腺がん；耳下腺がん；副腎がん（例．神経芽腫、傍神経節腫又は褐色細胞腫）；骨のがん（例．骨肉腫）；軟部肉腫（ＳＴＳ）；眼のがん（例．ブドウ膜黒色腫）；食道がん；胃がん；小腸がん；大腸がん；尿路上皮細胞がん（例．膀胱がん、陰茎がん、尿管がん又は腎がん）；卵巣がん；子宮がん；膣、外陰及び子宮頚部のがん；肺がん（特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺がん（ＳＣＬＣ））；黒色腫；中皮腫（特に悪性の胸膜及び腹部中皮腫）；肝臓がん（例．肝細胞がん）；すい臓がん；皮膚がん（例．基底細胞がん、扁平上皮がん又は隆起性皮膚線維肉腫）；精巣がん；前立腺がん；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（ろ胞性リンパ腫（ＦＬ）、ＣＮＳリンパ腫及びびまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む）；軽鎖アミロイドーシス；形質細胞白血病；並びに多発性骨髄腫（ＭＭ）が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明における自己免疫疾患は、好ましくは、本発明の用途に用いる製品が対象とする抗原に関連する自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、正常な体細胞及び組織に対する異常な免疫反応から生じる状態を表す。自己免疫疾患には少なくとも８０種類のものがある。一部の疾患は臓器特異的であり、特定の組織に限定されるが、他の疾患は全身の多くの組織に影響を及ぼす全身性の炎症性疾患に類似する。これらの徴候や症状の出現と重症度は、生じる炎症反応の部位と種類に依存し、経時的に変動してもよい。先に説明した本発明の用途に用いる製品で治療できる自己免疫疾患の例には、関節リウマチ；若年性皮膚筋炎；乾癬；乾癬性関節炎；狼瘡；サルコイドーシス；クローン病；湿疹；腎炎；ブドウ膜炎；多発性筋炎；ギラン－バレー症候群を含む神経炎；脳炎；くも膜炎；全身性強皮症；自己免疫による筋、骨格及び結合組織の疾患；アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、視神経脊髄炎、並びに、大型、中型、小血管の川崎病及びヘノッホ・シェーンライン血管炎を含む神経筋変性疾患；寒冷及び温式凝集素症；自己免疫性溶血性貧血；１型糖尿病；橋本甲状腺炎；バセドウ病；グレーブス眼症；副腎炎；下垂体炎；尋常性天疱瘡；アジソン病；強直性脊椎炎；ベーチェット症候群；セリアック病；グッドパスチャー症候群；重症筋無力症；サルコイドーシス；強皮症；原発性硬化性胆管炎、後天性表皮水疱症、並びに水疱性類天疱瘡が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、本発明で治療される自己免疫疾患は関節リウマチである。
本発明における感染症は、好ましくは、本発明の用途に用いる製品が対象とする抗原に関連する感染症である。そのような感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫又は他の生物による感染であってもよい。先に説明した本発明の用途に用いる製品で治療できる感染症の例には、マラリア；トキソプラズマ症；ニューモシスチス イロベチイ（pneumocystis jirovecii）による類鼻疽；細菌性赤痢；リステリア症；サイクロスポーラ症；ハンセン病；結核；及び、ＨＩＶ陽性の者、免疫抑制治療を受けている者、嚢胞性線維症や良性増殖性疾患（例．胞状奇胎、子宮内膜症）などの先天異常を有する者など、免疫力が低下した者における感染予防が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。
明細書に記載の本発明の用途に用いる製品は、本明細書に記載の医薬の製造に使用できる。明細書に記載の本発明の用途に用いる製品は、好ましくは治療方法のためのものであり、用途に用いる製品は、対象、好ましくはそれを必要とする対象に、治療有効量で投与される。したがって、ある態様では、代りの、又は他の態様と組み合わせて、本発明は、がん、自己免疫疾患又は感染症の治療、特にがんの治療のための医薬の製造における、本発明の用途に用いる製品に使用に関する。本発明で治療する例示的で非限定的ながん又は他の疾患は、これまでの記述を参照されたい。
ある態様では、代りの、又は他の態様と組み合わせて、本発明は、がん、自己免疫疾患又は感染症、特にがんを治療する方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明の用途に用いる製品を前記治療を必要とする対象に投与することを含む。本発明で治療する例示的で非限定的ながん又は他の疾患は、これまでの記述を参照されたい。
本発明の用途に用いる製品は、対象への投与のためのものである。本発明の用途に用いる製品は、有効量の組成物をそれを必要とする対象に投与することで、これまでに述べた治療方法で使用できる。この明細書における用語「対象」は、哺乳類として分類される全ての動物を指し、霊長類及びヒトを含むが、これらには限定されない。対象は好ましくはヒトである。「治療有効量」という表現は、所望の反応をもたらす、又は症状若しくは徴候を改善するのに十分な量を意味する。特定の対象における治療有効量は、症状、対象の全身状態、投与の方法、経路及び用量、並びに副作用の重篤度といった要因に応じて異なってもよい。
別の態様では、本発明は、本発明の用途に用いる製品を提供し、１つ以上の他の治療薬と組み合わせて使用する。本発明の用途に用いる製品は、１つ以上の他の治療薬と同時に、又は連続して使用できる。
適切な化学療法剤には、ナイトロジェンマスタード類、ヒドロキシ尿素、ニトロソ尿素類、テトラジン類（例．テモゾロミド）及びアジリジン類（例．マイトマイシン）などのアルキル化剤；ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＴＲ及びＡＴＭ阻害剤、ＣＨＫ１阻及びＣＨＫ２阻害剤、ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤及びＷＥＥ１阻害剤などのＤＮＡ損傷応答を阻害する薬剤；葉酸拮抗薬（例．ペメトレキセド）、フルオロピリミジン類（例．ゲムシタビン）、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン類などの代謝拮抗剤；ビンカアルカロイドやタキサンなどの抗微小管剤；トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤；アントラサイクリンやブレオマイシンなどの細胞傷害性抗生物質；デシタビンやアザシチジンなどのメチル化阻害剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；オールトランスレチノイン酸；並びに、三酸化ヒ素が含まれる。適切な放射線治療には１３１Ｉ-メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）、リン酸ナトリウムとしての３２Ｐ、塩化２２３ラジウム、塩化８９ストロンチウム及び１５３Ｓｍジアミンテトラメチレンホスホネート（ＥＤＴＭＰ）といったラジオアイソトープが含まれる。ホルモン治療薬として使用される適切な薬剤には、アロマターゼ阻害剤やＧｎＲＨ類似体などのホルモン合成阻害剤；選択的エストロゲン受容体調節剤（例．タモキシフェン及びフルベストラント）などのホルモン受容体拮抗薬及びビカルタミド、エンザルタミド、フルタミドなどの抗アンドロゲン；アビラテロンなどのＣＹＰ１７Ａ１阻害剤；並びにソマトスタチン類似体が含まれる。
標的治療薬は、腫瘍形成と増殖に関与する特定のタンパク質を妨害する治療薬であって、低分子薬；治療用抗体などのタンパク質；ペプチド及びペプチド誘導体；又はＡＤＣなどのタンパク質－低分子ハイブリッドであってもよい。低分子標的薬物の例は、エベロリムス、テムシロリムス及びラパマイシンなどのｍＴｏｒ阻害剤；イマチニブ、ダサチニブ及びニロチニブなどのキナーゼ阻害剤；ソラフェニブ及びレゴラフェニブなどのＶＥＧＦ阻害剤；ゲフィチニブ、ラパチニブ及びエルロチニブなどのＥＧＦＲ／ＨＥＲ２阻害剤；並びに、パルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブなどのＣＤＫ４／６阻害剤を含む。ペプチド又はペプチド誘導体標的治療薬の例は、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブなどのプロテアソーム阻害剤を含む。
適切な抗炎症薬は、D-ペニシラミン、アザチオプリン及び6-メルカプトプリン、シクロスポリン、抗ＴＮＦ生物学的製剤（例．インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ又はセルトリズマブペゴル）、レンフルノミド（lenflunomide）、アバタセプト、トシリズマブ、アナキンラ、ウステキヌマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、セクキヌマブ、アプレミラスト、アセトレチン（acetretin）並びにＪＡＫ阻害剤（例．トファシチニブ、バリシチニブ又はウパダシチニブ）を含む。
免疫療法剤は、サイトカイン類（ＩＬ－２及びＩＦＮα）；免疫調節イミド薬類（例．サリドマイド、レナリドミド、ポマリドマイド又はイミキモド）；がんワクチン類（例．タリモジンラヘルパレプベク）；細胞ベースの免疫療法剤（例．樹状細胞ワクチン、養子Ｔ細胞又はキメラ抗原受容体改変修飾Ｔ細胞）；及び細胞の膜に結合するリガンドに結合しＦｃ領域を介して、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こすことができる治療用抗体などの免疫応答を誘導し、増強し、又は抑制する薬剤を含む。
本発明では、治療は、好ましくは、がん、自己免疫疾患又は感染症を、予防し、回復させ、治癒し、改善し、及び／又は遅らせることである。これは、がん、自己免疫疾患若しくは感染症の少なくとも１つの症状の重症度が軽減されたこと、及び／又は、がん、自己免疫疾患若しくは感染症に関連する少なくとも１つのパラメーターが改善されたことを意味してもよい。好ましくは、そのようなパラメーターは葉酸活性に関連する。
本発明では、対象は生き延びてもよく、及び／又は無病であるとみなされてもよい。あるいは、疾患又は状態が停止又は遅延されてもよい。本発明では、生活の質の改善及び観察された疼痛緩和は、対象が必要とする鎮痛薬の量が、治療開始時より少なくてもよいことを意味してもよい。この明細書では、「より少ない」は、５％より少ない、１０％より少ない、２０％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、８０％より少ない、９０％より少ないことを意味してもよい。対象は、もはやいずれの鎮痛薬も必要としない。この生活の質の改善及び観察された疼痛緩和は、対象における少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月又はそれ以上の治療後に、見られ、検出され、又は評価されてもよく、そして、前記対象の治療開始時における生活の質及び観察された疼痛緩和と比較してもよい。
一般定義
本発明のリンカー－薬物化合物は、１以上のキラル中心及び／又は二重結合を含有していてもよく、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、位置異性体、エナンチオマー又はジアステレオマーといった立体異性体として存在してもよい。したがって、本明細書で示す化学構造は、立体的に純粋な形態（例．幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋又はジアステレオマー的に純粋）並びにエナンチオマーの混合物及び立体異性体の混合物を含む、図示し、又は特定した化合物の全ての可能なエナンチオマー及び立体異性体を包含する。エナンチオマーの混合物及び立体異性体の混合物は、当業者に周知の分離技術又はキラル合成技術を用いて、それらを構成するエナンチオマー又は立体異性体に分割できる。化合物は、エノール形、ケト形及びそれらの混合物を含むいくつかの互変異性の形態で存在してもよい。したがって、本明細書で示す化学構造は、図示し、又は特定した化合物の全ての可能な互変異性の形態を包含する。ジアステレオマー、エナンチオマー及び幾何異性体などのいくつかの異性体は、当業者によって物理的及び／又は化学的方法で分離できることも理解される。構造式又は化学物質名からキラル中心を有すると当業者が理解する場合、キラリティーが示されていなくても、各キラル中心は、ラセミ混合物、純粋なＲエナンチオマー及び純粋なＳエナンチオマーの３つ全てに対して、個別に参照される。化合物の構造が特定のエナンチオマーとして示される場合、本発明は、その特定のエナンチオマーに限定されないことが理解されるべきである。２つの部分が一緒になって結合を形成するという場合、これは、これらの部分が原子として存在しないこと、電子結合の置換によって原子価の規則が満たされることを意味する。これらは全て当該技術分野において知られている。
この明細書及び特許請求の範囲で開示した化合物は、さらに、エキソ及びエンド位置異性体として存在してもよい。他で説明しない限り、明細書及び特許請求の範囲における化合物の記載は、化合物の個々のエキソ位置異性体及び個々のエンド位置異性体の両者、並びにそれらの混合物を含むことを意味する。さらに、この明細書及び特許請求の範囲で開示した化合物は、シス及びトランス異性体として存在してもよい。他で説明しない限り、明細書及び特許請求の範囲における化合物の記載は、化合物の個々のシス異性体及び個々のトランス異性体の両者、並びにそれらの混合物を含むことを意味する。一例として、化合物の構造がシス異性体として示される場合、対応するトランス異性体又はシス及びトランス異性体の混合物は、本発明から除外されないことが理解されるべきである。
この明細書と特許請求の範囲において、動詞「含む（comprise）」とその活用は、この単語に続く項目が含まれることを意味する非限定的な意味で使用されるが、具体的に言及していない項目が除外されるものではない。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、要素が１つのみであることを文脈が明確に示さない限り、要素の２つ以上が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
「約」又は「およそ」という語は、数値で使用する場合（例．約１０）、好ましくは、その値が、その値の１％より大きいまたは小さい値の場合があることを意味する。
この明細書で物質のパラメーターについて述べる場合は常に、他で特定しない限り、パラメーターは、生理学的条件で決定され、測定され、又は明示されることを前提とする。生理学的条件は、当業者に公知であり、水性溶媒系、大気圧、ｐＨ６～８、室温～約３７℃（約２０℃～約４０℃）、及び緩衝塩又は他の成分の適切な濃度を含む。電荷はしばしば平衡と関連していることが理解される。電荷を有する又は担持すると言われる部分は、そのような電荷を有さない又は担持しない状態よりも、そのような電荷を有する又は担持する状態で見られることが多い部分である。したがって、当業者によって理解されるように、荷電されることがこの開示で示される原子は、特定の条件で非荷電であってもよく、中性部分は、特定の条件で荷電されてもよい。
明細書で引用する全ての特許及び参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、説明のためにのみ提供するもので、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
一般
使用した全ての溶媒は、さまざまなベンダーからの試薬グレード又はＨＰＬＣグレードであった。ＮＭＲスペクトルは、Bruker AVANCE400（1Hは400MHz；13Cは100MHz）で記録した。化学シフトは、内部標準としてのテトラメチルシラン又は残留非重水素化溶媒に対するｐｐｍで示す。質量スペクトルは、逆相Ｃ１８架橋エチルシロキサン－シリカハイブリッドカラム（Waters ACQUITY UPLC（登録商標）BEH C18 粒子径１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）を備えたWaters UPLC-MS（ＳＱ検出器3100付ＥＳＩ）を用い、流速０．４ｍＬ／分（アセトニトリル（ＭｅＣＮ）／水×０．１％ギ酸（ＦＡ））で記録した。分取ＨＰＬＣによる精製は、Waters SunFire Prep C18 OBD ５μｍカラム（１９×１５０ｍｍ）を装着したShimadzu Prominence 20AP systemを使用し、流速１７ｍＬ／分（ＭｅＣＮ／水×０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））で行った。マイクロ波反応は、Biotage Initiator+装置で行った。
ＡＤＣの特性を評価するための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＨＩＣによる分析では、５～１０μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬ）をTSKgelブチル-NPRカラム（4.6mm ID×3.5cm L、Tosoh Bioscience、Cat. no. 14947）に注入した。溶出は、１００％バッファーＡ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９５）から１００％バッファーＢ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２０％イソプロパノール）まで、０．４ｍＬ／分で２０分間の直線勾配で行った。ＰＤＡ検出器を備えたWaters Acquity H-Class UPLC systemとEmpowerソフトウェアを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定し、ＡＤＣの保持時間を決定した。
ＡＤＣの特性を評価するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣによる分析では、５μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、TSKgel SWXL Guardカラム（７μｍ、6.0 mm ID×4.0 cm L、Tosoh Bioscience、Cat. no. 08543）を備えたTSKgel G3000SWXLカラム（５μｍ、7.8mm ID×30cm L、Tosoh Bioscience、Cat. no. 08541）に注入した。溶出は、１００％の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を使用し、０．６ｍＬ／分で３０分間行った。カラム温度は２５℃に維持した。ＰＤＡ検出器を備えたWaters Acquity H-Class UPLC systemとEmpowerソフトウェアを使用した。吸光度を２１４ｎｍで測定して、ＨＭＷ種を定量した。
一般手順ＸＸＡ：ＨＡＴＵ支援アミドカップリング
カルボン酸（１．０当量）とアミン（１．０～１．５当量）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；０．１７５Ｍ）に溶解した。1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート（ヘキサフルオロホスファート アザベンゾトリアゾール テトラメチル ウロニウム、ＨＡＴＵ；１．２当量）及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；６．０当量）を室温で加え、混合物を３０分撹拌した。濃縮後、それぞれの例で示すように、生成物をメタノール（ＭｅＯＨ）から再結晶するか、又はフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
一般手順ＸＸＢ：Ｐｄ／Ｃと水素によるフェニルアジドの還元
ＤＭＦ（０．０７４Ｍ）中のアジド（１．０当量）の溶液に、Ｎ２雰囲気下で１０wt％の「活性炭に担持された１０wt％のパラジウム」を加えた。混合物を水素ガスでパージし、ＵＰＬＣが反応の完了を示すまで（約４５分）、激しく撹拌した。反応物をＮ２でパージし、Celite（登録商標）でろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、それぞれの例で示すように精製した。
一般手順ＸＸＣ：ホルムアミドの脱保護及び／又は加水分解
エステル（１．０当量）をメタノール／ジメチルスルホキシド（ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ；５：１、０．３６Ｍ）中に溶解／懸濁させ、０℃に冷却した。ＮａＯＨ水溶液（２．０Ｍ、３～２４当量）を滴下し、得られた溶液をＵＰＬＣ分析が完了するまで（１～６時間）、室温で撹拌した。反応混合物を水（約４×）で希釈し、０℃に冷却した後、ｐＨを塩酸（１．０Ｍ）で約８．５に調整した。沈殿が生じなければ、溶液を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ；３×）で洗浄した。懸濁液の場合、この工程は省略した。水相を水（約３×）で更に希釈し、ｐＨを酢酸（ＡｃＯＨ）水溶液（１．０Ｍ）で約４．７に調整した。得られた懸濁液を３０分激しく撹拌し、ろ過した。時折、ゼラチン状の混合物が得られ、次いで、ヒートガンで穏やかに加熱して懸濁液を得た。固体をＭｅＯＨ及びエーテルで洗浄し、真空中で乾燥した。
(S)-5-(4-アジドベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ５）及び(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ７）の製造
(S)-2-アミノ-5-(4-アジドベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ３）
塩化チオニル（３．７６ｍＬ、５１．５ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（５滴）を、窒素雰囲気下で、ジクロロメタン（ＤＣＭ；１５０ｍＬ）中の4-アジド安息香酸（７．００ｇ、４２．９ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。反応物を加熱して２時間穏やかに還流し、室温に冷却し、濃縮し、固体を穏やかに粉砕して粉末にした。別のフラスコ中で、室温において、L-オルニチン塩酸塩（L-Ｏｒｎ－ＯＨ・ＨＣｌ）（６．７０ｇ、３８．９ｍｍｏｌ）とＮａＯＨ（３．１１ｇ、７７．８ｍｍｏｌ）の水溶液（６７ｍＬ）を、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（４．８６ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）の水溶液（６７ｍＬ）で処理し、深青色の溶液を得た。この溶液に、ＮａＨＣＯ３（３．９３ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を加えた。溶解後、室温で、暗青色の溶液を精製していない固体4-アジド安息香酸クロリド（７．７８ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）に直接注ぎ、混合物を室温で１６時間激しく撹拌した。懸濁液をろ過し、固体を水（２×２０ｍＬ）、エタノール（２×２０ｍＬ）及びエーテル（３×４０ｍＬ）で洗浄し、４．９７ｇの固体を得た。材料をＭｅＯＨ（１４０ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下で、塩化チオニル（１３．０ｍＬ）を０°Ｃで４５分かけて加えた。次いで、反応物を室温で１８時間撹拌し、次いで、濃縮した。続けて、材料の一部を固相抽出（ＳＰＥ；Biotage, SCX-2）によって精製し、ＸＸ３を無色の蝋状の固体として得た（１．２０ｇ）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.37-3.31 (m, 1H), 3.24 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.13 (br s, 2H), 1.64-1.43 (m, 4H)。
MS (ESI+) C13H18N5O3 + [M+H]+ 計算値 292.14、実測値 292.20。
4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)安息香酸メチル（ＸＸ１）
ピリミジン-2,4,5,6-テトラアミン硫酸塩（６．００ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）、塩化バリウム二水和物（６．１６ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）及び水（１４５ｍＬ）の混合物を室温で９０分撹拌した。混合物を７０℃に温め、ろ過し、ろ液を室温に冷却し、ｐＨを１０％ＮａＯＨ（水溶液）で３．５に調整した。この溶液の一部（１１６ｍＬ）をＭｅＣＮ（４３．８ｍＬ）中の精製していない4-(3-ブロモ-4-オキソブチル)安息香酸メチル（６．０６ｇ、２１．２ｍｍｏｌ、Chen et al, J. Heterocycl. Chem. 2015, 52, 1565-1569に記載のとおりに製造）と混合し、次いで室温の水浴上で撹拌しながらＡｃＯＨ（３４．７ｍＬ）を加えた。５分後、ＭｎＯ２（１１．６ｇ）を加え、混合物を室温で１時間４５分撹拌した。反応物をCelite（登録商標）でろ過し、残留物をＭｅＣＮ／水（７：３）で洗浄した。ろ液を濃縮し、水（１２５ｍＬ）で洗浄した。残った水をＭｅＣＮで共沸除去した。次いで残留物を熱ＭｅＣＮ（１２５ｍＬ）で２回トリチュレートし、次いで固体をエーテルで洗浄し、真空中で乾燥してＸＸ１を褐色の固体として得た（１．３１ｇ、２０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.65 (s, 1H), 8.38 (br s, 1H), 8.31 (br s, 1H), 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.27 (br s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.19 (s, 4H)。
MS (ESI+) C16H17N6O2 + [M+H]+ 計算値 325.14、実測値 325.12。
4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)安息香酸（ＸＸ２）
エステル（ＸＸ１）（２４５ｍｇ、０．７５５ｍｍｏｌ）を2-メトキシエタノール（６ｍＬ）中に懸濁させ、０．５ＮのＮａＯＨ（水溶液、６ｍＬ）を室温で加えた。懸濁液を２４時間撹拌し、続けてろ過した。残留物を2-メトキシエタノール／水（１：１、１ｍＬ）で洗浄し、次いでろ液に氷酢酸（０．３２５ｍＬ）を加えｐＨを４．５にした。４℃で１６時間静置し、ろ過し、固体を水（２×３ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥してＸＸ２を褐色の固体として得た（１４０ｍｇ、６０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.78 (br s, 1H), 8.56 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.56 (br s, 2H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.54 (br s, 2H), 3.19-3.11 (s, 4H)。
MS (ESI+) C15H15N6O2 + [M+H]+ 計算値 311.13、実測値 311.34。
(S)-5-(4-アジドベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ４）
一般手順ＸＸＡに従い、酸ＸＸ２（２３５ｍｇ、０．７５７ｍｍｏｌ）とアミンＸＸ３（２４３ｍｇ、０．８３３ｍｍｏｌ）を反応させ、ＭｅＯＨからの再結晶によって精製し、エステルＸＸ４を褐色の固体として得た（３２１ｍｇ、７３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.66 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.90-7.86 (m, 2H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.59 (br s, 2H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.21-7.17 (m, 2H), 6.54 (br s, 2H), 4.47-4.42 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.17-3.12 (m, 4H), 1.91-1.75 (m, 2H), 1.70-1.52 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H30N11O4 + [M+H]+ 計算値 584.25、実測値 584.49。
(S)-5-(4-アジドベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ５）
ＮａＯＨ（３当量）によるエステルＸＸ４（３６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに従って行い、酸ＸＸ５を黄色の固体として得た（２７ｍｇ、７５％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.60 (br s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.52 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.65 (br s, 2H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.60 (s, 2H), 4.42-4.33 (m, 1H), 3.27 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.15 (s, 4H), 1.92-1.73 (m, 2H), 1.70-1.54 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.8, 166.4, 165.2, 162.8, 162.3, 154.2, 150.4, 148.4, 144.9, 142.1, 131.7, 131.2, 129.1, 128.3, 127.5, 121.4, 118.8, 52.4, 38.9, 35.3, 33.9, 28.2, 26.2。
MS (ESI+) C27H28N11O4 + [M+H]+ 計算値 570.23、実測値 570.54。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ６）
アジドＸＸ４（２５０ｍｇ、０．４８２ｍｍｏｌ）の還元を、一般手順ＸＸＢによって行った。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアニリンＸＸ６を黄色の固体として得た（１５１ｍｇ、６３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.68 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.63 (br s, 2H), 7.55 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.58 (br s, 2H), 6.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.59 (br s, 2H), 4.45-4.40 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.22 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 3.15 (s, 4H), 1.88-1.74 (m, 2H), 1.67-1.49 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H32N9O4 + [M+H]+ 計算値 558.26、実測値 558.51。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ７）
ＮａＯＨ（３当量）によるエステルＸＸ６（１５１ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに従って行い、酸ＸＸ７を黄色の固体として得た（１１２ｍｇ、７５％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.52 (br s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.53 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.65 (br s, 2H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.62 (br s, 2H), 6.52 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.58 (br s, 2H), 4.41-4.33 (m, 1H), 3.22 (td, J = 6.6, 6.0 Hz, 2H), 3.15 (s, 4H), 1.91-1.71 (m, 2H), 1.67-1.50 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.8, 166.4, 166.2, 162.8, 162.3, 154.2, 151.5, 150.4, 148.4, 144.9, 131.8, 128.6, 128.3, 127.6, 121.4, 112.5, 52.6, 38.6, 35.3, 33.9, 28.2, 26.5。
MS (ESI+) C27H30N9O4 + [M+H]+ 計算値 544.24、実測値 544.52。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)-ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ１２）の製造
4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)安息香酸（ＸＸ９）
(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メタノール塩酸塩（８．８０ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）を熱水（３００ｍＬ）に溶解した。室温に冷却した後、ｐＨが７を超えるまで、ＮａＯＨ水溶液（４０ｍＬ、１．０Ｍ）を加えた。ろ過し、水（２×２５ｍＬ）で洗浄し、真空中、室温で３時間乾燥した。残った水をエタノール（ＥｔＯＨ）で共沸除去した。残留物を熱ＥｔＯＨでトリチュレートし、室温に冷却した後、ろ過し、ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）及びエーテル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥して(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メタノールを遊離塩基として得た（６．４１ｇ）。別のフラスコ中で、冷却した（０°Ｃ）ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ；１３．５ｍＬ）中のＰＰｈ３（８．１９ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、臭素（１．６０ｍＬ、３１．２ｍｍｏｌ）を５０分以上かけて滴下した。添加速度は、液の温度が８℃を超えないようにした。濃厚なスラリーを室温で７５分間撹拌し、橙色のスラリーを得た。固体の遊離塩基である(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メタノール（２．００ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を加え、温度を３８℃に上昇させた。混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで4-(メチルアミノ)安息香酸（２．３６ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＰＥＡ（３．８１ｍＬ、２１．９ｍｍｏｌ）を加えた。５日間撹拌し、ＮａＯＨ水溶液（１３６ｍＬ、０．３３Ｍ）中に加え、ＤＭＡ（４ｍＬ）を使用して反応を完了させた。水（４０ｍＬ）を加え、沈殿物をろ別した。ろ液を１０％酢酸水溶液（約２５．０ｍＬ）でｐＨ４．５にした。沈殿物をろ取し、水で洗浄し、熱ＭｅＯＨ（１６ｍＬ）でトリチュレートし、ろ過し、残留物をジオキサン中に懸濁させ、凍結乾燥して酸ＸＸ９を黄色の固体として得た（３．５５ｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.15 (br s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.35 (br s, 1H), 8.12 (br s, 1H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.20 (br s, 2H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.83 (s, 2H), 3.24 (s, 3H)。
MS (ESI+) C15H16N7O2 + [M+H]+ 計算値 326.14、実測値 326.38。
(S)-5-(4-アジドベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)ベンズアミド)-ペンタン酸メチル（ＸＸ１０）
酸ＸＸ９（２５０ｍｇ、０．７６８ｍｍｏｌ）とアミンＸＸ３（３２３ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してエステルＸＸ１０を黄色の固体として得た（４３４ｍｇ、９４％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.66 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.59 (br s, 2H), 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.54 (br s, 2H), 4.47-4.42 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.12 (s, 4H), 1.91-1.75 (m, 2H), 1.69-1.53 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H30N11O4 + [M+H]+ 計算値 584.25、実測値 584.49。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)ベンズアミド)-ペンタン酸メチル（ＸＸ１１）
アジドＸＸ１０（１９５ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）の還元を、一般手順ＸＸＢによって行った。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアニリンＸＸ１１を黄色の固体として得た（１１１ｍｇ、６０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.56 (s, 1H), 8.34 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.96 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.67 (br s, 1H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.45 (br s, 1H), 6.81 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.62 (br s, 2H), 6.51 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.56 (br s, 2H), 4.78 (s, 2H), 4.41-4.35 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.24-3.18 (m, 2H), 3.21 (s, 3H), 1.85-1.70 (m, 2H), 1.64-1.46 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H33N10O4 + [M+H]+ 計算値 573.27、実測値 573.52。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ１２）
エステルＸＸ１１（１１１ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）の加水分解を一般手順ＸＸＣによって行い、酸ＸＸ１２を黄色の固体として得た（７２ｍｇ、６６％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm =12.43 (br s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.22 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.16 (br s, 1H), 7.97 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.94 (br s, 1H), 7.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.08 (br s, 2H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.04 (br s, 2H), 4.81 (s, 2H), 4.36-4.31 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 3.21-3.18 (m, 2H), 1.86-1.69 (m, 2H), 1.64-1.47 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 174.1, 166.2, 166.2, 162.7, 160.7, 152.2, 151.4, 150.8, 149.0, 147.6, 129.0, 128.6, 121.6, 121.4, 121.3, 112.5, 111.1, 54.9, 52.4, 39.2, 38.6, 28.3, 26.5。
MS (ESI+) C27H31N10O4 + [M+H]+ 計算値 559.25、実測値 559.53。
(S)-2-アミノ-5-(5-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)ペンタン酸メチル（ＸＴ６）の製造
5-アミノイソインドリン-1,3-ジオン（ＸＴ２）
水（２５ｍＬ）中のＮＨ４Ｃｌ（１１．１ｇ、２０８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ；７５ｍＬ）中の化合物ＸＴ１（１０．０ｇ、５２．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。次いで亜鉛粉末（１３．６ｇ、２０８ｍｍｏｌ）を慎重に少しずつ加え（発熱注意！）、得られた懸濁液を１時間撹拌した。黄色の反応混合物をCelite（登録商標）でろ過し、次いでメタノール（２５０ｍＬ）ですすぎ、減圧下で濃縮し、Ｃｒｏｐ１を得た。Celite（登録商標）ケーキをＤＭＦ（４０ｍＬ）中に懸濁させ、一晩撹拌し、次いでろ過し、減圧下で濃縮し、Ｃｒｏｐ２を得た。水（５０ｍＬ）中のＣｒｏｐ１を１５分間撹拌し、ろ過し、ケーキをエーテルで洗浄し、一晩風乾した。エーテル（１５０ｍＬ）中のＣｒｏｐ２を一晩撹拌し、ろ過し、固体を水（１００ｍＬ）中で１５分間撹拌した。ろ過した後、ケーキをエーテルで洗浄し、固体を風乾した。２つのバッチを合わせてＸＴ２を黄色の固体として得た（１２ｇ、定量）。
MS (ESI+) C8H7N2O2 + [M+H]+ 計算値 163.05、実測値 163.06。
N-(1,3-ジオキソイソインドリン-5-イル)ホルムアミド（ＸＴ３）
ＦＡ（２２．２ｍＬ、５７８ｍｍｏｌ）が入った２５０ｍＬの丸底フラスコに、Ａｃ２Ｏ（１０．９ｍＬ、１１６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、混合物を１０分間撹拌した。続けて、細砕したアニリンＸＴ２（３．７５ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１５分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、精製していない生成物に水（２５ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を１５分間撹拌した。ろ過した後、固体を一晩風乾してホルムアミドＸＴ３を黄色の固体として得た（２．７０ｇ、１４．２ｍｍｏｌ、６１％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 11.24 (br s, 1H), 10.80 (s, 1H), 8.42 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.2, 1.1 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H)。
MS (ESI+) C9H7N2O3 + [M+H]+ 計算値 191.05、実測値 191.13。
5-ホルムアミド-1,3-ジオキソイソインドリン-2-カルボン酸エチル（ＸＴ４）
冷却した（０℃）ＤＭＦ（２５ｍＬ）中のホルムアミドＸＴ３（２．５０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１．８３ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を加え、ＤＭＦ（１２．５ｍＬ）中のクロロギ酸エチル（１．２５ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。追加のＥｔ３Ｎ（１．８３ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１２．５ｍＬ）中のクロロギ酸エチル（１．２５ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を加え（後者は滴下）、０℃で３０分間撹拌した。最後に、Ｅｔ３Ｎ（０．９２ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（６ｍＬ）中のクロロギ酸エチル（０．６２５ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で最終的に３０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ０：１から１：０）で精製し、ホルムアミドＸＴ４を黄色の固体として得た（１．４ｇ、４１％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.90 (br s, 1H), 8.45 (br s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 7.95-7.90 (m, 2H), 4.36 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C12H11N2O5 + [M+H]+ 計算値 263.07、実測値 263.14。
(S)-2-アミノ-5-(5-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)ペンタン酸メチル（ＸＴ６）
L-Ｏｒｎ－ＯＨ塩酸塩（０．８３５ｇ、４．８５ｍｍｏｌ）とＮａＯＨ（０．３８８ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）の水溶液（９ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．６０６ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）の水溶液（９ｍＬ）を室温で加え、深青色の溶液を得た。溶液に、ＮａＨＣＯ３（０．４８９ｇ、５．８２ｍｍｏｌ）及びホルムアミドＸＴ４（１．４０ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を加え、淡青色の懸濁液を室温で４時間撹拌した。混合物をろ過し、固体を水（２×２．５ｍＬ）、エタノール（２×２．５ｍＬ）及びエーテル（２×２．５ｍＬ）で洗浄し、一晩風乾して黄／灰色の銅塩を得た（１．６ｇ）。材料をメタノール（４５ｍＬ）中に懸濁させ、－２０℃に冷却した。温度を０℃以下に維持しながら、塩化チオニル（４．２１ｍＬ、５７．７ｍｍｏｌ）を４５分かけて加えた。室温に温めたのち、１８時間撹拌し、反応混合物を減圧下で濃縮し、溶媒をトルエン（１２ｍＬ）共に蒸発させた。精製していない残留物を、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）／ＥｔＯＡｃ（３．６ｍＬ）／アセトン（３．６ｍＬ）の混合物でトリチュレートし、固体をろ過し、エーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥してスクシンイミドＸＴ６を黄色の固体として得た（１．５０ｇ、８７％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.57 (br s, 3H), 7.50 (d, J =8.1 Hz, 1H), 7.32 (br s, 3H), 6.98 (s, 1H), 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.05-3.97 (m, 1H), 3.71 (s, H), 3.55-3.47 (m, 2H), 1.83-1.54 (m, 4H)。
MS (ESI+) C14H18N3O4 + [M+H]+ 計算値 292.13、実測値 292.17。
(S)-4-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-安息香酸（ＸＴ９）及び(S)-5-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)-アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ１０）の製造
(S)-5-(5-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)-ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ８）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の酸ＸＴ７（４７０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ；米国特許出願公開第2004/0072837号に記載のとおりに合成）及びＥｔ３Ｎ（２．３２ｍＬ、１６．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、クロロギ酸イソブチル（０．１８２ｍＬ、１．３８５ｍｍｏｌ）を室温で加えた。得られた混合物を１時間撹拌し、次いでスクシンイミドＸＴ６（４９９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。追加のクロロギ酸イソブチル（０．０９１ｍＬ、０．６９２ｍｍｏｌ）を加え、２０分後にスクシンイミドＸＴ６（２５０ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌した。最後に、追加のクロロギ酸イソブチル（０．０４５ｍＬ、０．３４７ｍｍｏｌ）を加え、２０分後にスクシンイミドＸＴ６（１２５ｍｇ、０．３８１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌した。濃縮後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から２０：８０）で精製した。生成物を水（６ｍＬ）中に懸濁させ、ろ過し、水（２ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（４ｍＬ）で洗浄してホルムアミドＸＴ８を黄色の固体として得た（５５２ｍｇ、６５％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.81 (s, 1H), 8.74 (br s, 1H), 8.69 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.01 (br s, 1H), 7.87 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.72 (br s, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.97 (br s, 2H), 6.91 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 6.45 (br s, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.46-4.37 (m, 1H), 3.61 (s, 3H), 3.51 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.83-1.46 (m, 4H)。
MS (ESI+) C29H29N10O6 + [M+H]+ 計算値 613.23、実測値 613.30。
(S)-4-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-安息香酸（ＸＴ９）及び(S)-5-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)-アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ１０）
ＮａＯＨ（６当量）によるホルムアミドＸＴ８（１２０ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに従い行った。固体を０．１％ＴＦＡを有する１０％ＭｅＣＮ水溶液に溶解し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配５％から３５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥して酸ＸＴ９（２５ｍｇ、２２％）及び酸ＸＴ１０（５ｍｇ、４％）を黄色の固体として得た。
ＸＴ９：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.44 (br s, 1H), 9.31 (br s, 1H), 9.26 (br s, 1H), 8.57 (br s, 1H), 8.14 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.80-7.63 (m, 2H) 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.90 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.91 (br s, 2H), 4.61 (s, 2H), 4.40-4.29 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 2.84-2.76 (m,2H), 1.94-1.70 (m, 2H), 1.67-1.47 (m, 2H)。
MS (ESI+) C27H29N10O6 + [M+H]+ 計算値 589.23、実測値 589.37。
ＸＴ１０：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.53 (br s, 2H), 9.34 (br s, 1H), 9.30 (br s , 1H), 8.84 (s, 1H), 8.62 (br s, 1H), 8.17 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.07 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.79 (br s, 1H), 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.07-6.70 (m, 1H) 6.82 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 8.3, 2.3 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 4.37-4.29 (m, 1H), 3.16 (q, J = 5.9 Hz 2H) 1.91-1.69 (m, 2H), 1.67-1.47 (m, 2H)。
MS (ESI+) C27H29N10O6 + [M+H]+ 計算値 589.23、実測値 589.47。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-ブチル)カルバモイル)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチル-ブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ１６）及び2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ１７）の製造
(S)-5-(5-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ１１）
０℃のピリジン（５ｍＬ）中のスクシンイミドＸＴ８（１７０ｍｇ、０．２７８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、(S)-(1-クロロ-1-オキソプロパン-2-イル)カルバミン酸 (9H-フルオレン-9-イル)メチル（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌ、３２０ｍｇ、０．９７１ｍｍｏｌ）（Unsworth et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 52, 15794-15798に従い製造）を６回に分けて加えた。反応混合物をＭｅＯＨ（６ｍＬ）でクエンチし、ＵＰＬＣが反応の完了を示したら、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から２０：８０）で精製し、アミドＸＴ１１を黄色の固体として得た（２９８ｍｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.71 (s, 1H), 9.07 (br s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.79 (br s, 1H), 8.71 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.93-7.84 (m, 4H), 7.83-7.78 (m, 2H), 7.74 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.45-7.38 (m, 2H), 7.37-7.30 (m, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.47-4.38 (m, 1H), 4.29 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.09 (br s, 4H), 3.64-3.52 (m, 5H), 1.86-1.60 (m, 4H), 1.34 (d, J = 7.1 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.2, 173.0, 168.2, 168.1, 166.2, 163.1, 156.4, 145.0, 144.3, 144.2, 144.0, 141.2, 133.6, 131.2, 129.2, 128.1, 127.5, 126.0, 125.8, 124.7, 123.8, 122.2, 120.6, 113.3, 89.8, 66.1, 52.8, 52.4, 51.1, 47.1, 37.5, 28.3, 25.4, 18.2。
MS (ESI+) C47H44N11O9 + [M+H]+ 計算値 906.33、実測値 906.40。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ１２）
２５ｍＬの丸底フラスコにアミドＸＴ１１（２５０ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）及びフッ化テトラブチルアンモニウム三水和物（ＴＢＡＦ・３Ｈ２Ｏ）（１７８ｍｇ、０．５５２ｍｍｏｌ）を入れ、フラスコをＮ２（Ｎ２１サイクルにつき最低３真空）で徹底的にパージした。ＤＭＦ（６ｍＬ）を加え、全て固体が溶解した後、デカンチオール（０．６０８ｍＬ、２．７６ｍｍｏｌ）をシリンジを使用して室温で溶液中に直接加え、混合物を９０分間撹拌した。次に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（１３０ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０９６ｍＬ、０．５５２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１．５時間撹拌した。Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（１３０ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ）を更に加え、混合物を更に３０分間撹拌した。続けて反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から２０：８０）で精製してテトラブチルアンモニウム塩を含むジペプチドＸＴ１２を得た。
MS (ESI+) C42H51N12O10 + [M+H]+ 計算値 883.38、実測値 883.71。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ１３）
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の不純物を含むジペプチドＸＴ１２（２４４ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＦＡ（３ｍＬ）を加えた。得られた混合物を、室温に温めながら１５分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させ、精製していない脱保護したアミンＸＴ１３を橙色のＴＦＡ塩として得、更に分析することなく直接使用した。
MS (ESI+) C37H43N12O8 + [M+H]+ 計算値 783.33、実測値 783.32。
4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ１４）及び5-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ１５）
ホルムアミドＸＴ１３（１９０ｍｇ、０．２４３ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに以下の変更を加えて行った：ホルムアミドＸＴ１３を最初にＮａＯＨ（１２当量）と０℃で１時間反応させ、次いで第２の量のＮａＯＨ（１２当量）の添加後、室温で６時間反応させた。固体のＭｅＯＨによる洗浄を、水（３ｍＬ）による洗浄に変更した。二酸ＸＴ１４及びＸＴ１５の混合物（約１：２）が得られた。必要に応じて、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から３５％）で精製して二酸ＸＴ１４（１５ｍｇ、８％、３工程）及びＸＴ１５（３０ｍｇ、１６％、３工程）を黄色の固体として得た。
ＸＴ１４：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.37-12.23 (m, 2H), 10.46 (s, 1H), 8.96 (br s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.75 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 8.22 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.08 (br s, 2H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.67 (dd, J = 8.5, 1.7 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.91-6.86 (m, 1H), 6.75 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.54 (s, 2H), 4.59 (s, 2H), 4.49 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.38-4.30 (m, 1H), 3.61 (s, 1H), 3.17 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.13-2.04 (m, 1H), 1.93-1.83 (m, 1H), 1.83-1.71 (m, 1H), 1.69-1.49 (m, 2H), 1.36 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.95 (t, J = 6.2 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C35H43N12O8 + [M+H]+ 計算値 759.33、実測値 759.50。
ＸＴ１５：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.20-12.32 (m, 2H), 10.38 (s, 1H), 9.01 (br s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.74 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.24 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.08 (br s, 2H), 7.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.77-7.69 (m, 3H), 7.39 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.91-6.86 (m, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.54 (br s, 2H), 4.60 (d, J = 3.4 Hz, 2H), 4.48 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 4.39-4.31 (m, 1H), 3.62 (s, 1H), 3.19 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.15-2.04 (m, 1H), 1.93-1.83 (m, 1H), 1.83-1.72 (m, 1H), 1.68-1.50 (m, 2H), 1.37 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.96 (t, J = 6.1 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C35H43N12O8 + [M+H]+ 計算値 759.33、実測値 759.68。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ１６）及び2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-ブチル)カルバモイル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチル-ブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ１７）
冷却した（０℃）ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の二酸ＸＴ１４及びＸＴ１５（０．２０９ｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）の混合物（約１：２）に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（０．０８５ｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＰＥＡ（０．２８９ｍＬ、１．６６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３時間撹拌し、続けて減圧下で濃縮した。粗製の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、ＸＴ１６とＸＴ１７の混合物（１：２）を黄色の固体として得た（６５ｍｇ、２５％、４工程）。異性体として純粋なＸＴ１４又はＸＴ１５と反応させることで、純粋なＸＴ１６又はＸＴ１７、それぞれの単離が可能となった。
ＸＴ１６：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.27-12.28 (m, 3H), 10.15 (s, 1H), 9.31 (br s, 1H), 9.27 (br s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.57 (br s, 1H), 8.26-8.18 (m, 2H), 8.16 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.76-7.71 (m, 3H), 7.60 (br s, 1H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.89 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.53 (br s, 1H), 4.62 (s, 2H), 4.41-4.30 (m, 2H), 4.17 (dd, J = 8.2, 7.2 Hz, 1H), 3.19 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 2.23-2.06 (m, 2H), 2.01-1.72 (m, 3H), 1.68-1.42 (m, 6H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.25-1.13 (m, 2H), 0.84 (dd, J = 16.7, 6.8 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C45H54N13O11 + [M+H]+ 計算値 952.41、実測値 952.75。
ＸＴ１７：（３１ｍｇ、８２％）黄色の固体として。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.31-12.29 (m, 2H), 10.25 (s, 1H), 9.29 (br s, 1H), 9.25 (br s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.56 (br s, 1H), 8.26-8.18 (m, 2H), 8.15 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.69 (dd, J = 8.7, 1.9 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.89 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.54 (br s, 1H), 4.62 (s, 2H), 4.40-4.30 (m, 2H), 4.17 (dd, J = 8.3, 7.3 Hz, 1H), 3.38 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.23-2.05 (m, 2H), 1.98-1.71 (m, 3H), 1.68 -1.41 (m, 6H), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.25-1.13 (m, 2H), 0.84 (dd, J = 17.7, 6.7 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C45H54N13O11 + [M+H]+ 計算値 952.41、実測値 952.82。
(S)-4-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)-ベンズアミド)ブチル)-カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２０）及び(S)-5-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２１）の製造
(S)-5-(5-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)-アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ１９）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の酸ＸＸ９（１５０ｍｇ、０．４６１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．１６ｍＬ、８．３０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、クロロギ酸イソブチル（０．０６１ｍＬ、０．４６１ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応物を１時間撹拌した。アミンＸＴ６（１６６ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１時間撹拌した。追加のクロロギ酸イソブチル（０．０３０ｍＬ、０．２３０ｍｍｏｌ）を加え、２０分後に追加のアミンＸＴ６（８３ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）を加えた。クロロギ酸イソブチル（０．０１５ｍＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を更に加え、２０分後に追加のＸＴ６（４２ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を加えた。クロロギ酸を複数回添加したにもかかわらず、反応は転化率３０％で停止した。ＨＡＴＵ（１７５ｍｇ、０．４６１ｍｍｏｌ）を室温で３０分間加え、続いてアミンＸＴ６（１６６ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から２５：７５）で精製してアニリンＸＴ１９を黄色の固体として得た（２９４ｍｇ、定量）。
MS (ESI+) C29H31N10O5 + [M+H]+ 計算値 599.25、実測値 599.29。
(S)-4-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)-カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２０）及び(S)-5-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)(メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２１）
ＮａＯＨ（１２当量）によるエステルＸＴ１９（２７６ｍｇ、０．４６１ｍｍｏｌ）の加水分解を、ろ過による固体回収時の洗浄工程ではエーテルのみを使用する点を除き、一般手順ＸＸＣに従い行った。粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から３５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、二酸ＸＴ２０（１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、４％）及びＸＴ２１（７６ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ、２７％）を黄色の固体として得た。
ＸＴ２０：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.35 (br s, 2H), 9.26 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.58 (br s, 1H), 8.19 (dd, J = 7.7 Hz, 1H), 7.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.75-7.67 (m, 1H), 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.63-6.53 (m, 1H), 6.52 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.40-4.27 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.14 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 1.93-1.70 (m, 2H), 1.67-1.46 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H31N10O6 + [M+H]+ 計算値 603.24、実測値 603.40。
ＸＴ２１：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.27 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.61 (br s, 1H), 8.21 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.07 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.86 (br s, 1H), 7.76 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.85-6.79 (m, 3H), 6.62 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.39-4.28 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.16 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 1.93-1.70 (m, 2H), 1.66-1.46 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H31N10O6 + [M+H]+ 計算値 603.24、実測値 603.27。
(S)-4-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２４）及び(S)-5-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)-カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２５）の製造
(S)-5-(5-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-ペンタン酸メチル（ＸＴ２３）
酸ＸＸ２（１４０ｍｇ、０．４５１ｍｍｏｌ）とアミンＸＴ６（２２２ｍｇ、０．６７７ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してエステルＸＴ２３を黄色の固体として得た（２６３ｍｇ、定量）。
MS (ESI+) C29H30N9O5 + [M+H]+ 計算値 584.24、実測値 584.24。
(S)-4-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２４）及び(S)-5-アミノ-2-((4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)-カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２５）
ＮａＯＨ（３当量）によるエステルＸＴ２３（２６３ｍｇ、０．４５１ｍｍｏｌ）の加水分解を、ろ過による固体回収時の洗浄工程ではエーテルのみを使用する点を除き、一般手順ＸＸＣに従い行った。粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から３５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、二酸ＸＴ２４（７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、３％）及びＸＴ２５（９３ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ、３５％）を無色の固体として得た。
ＸＴ２４：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.40-11.80 (m, 2H), 9.22 (br s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.61-8.47 (m, 1H), 8.50 (d, J =7.7 Hz, 1H), 8.01 (t, J =5.6 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.77-7.65 (m, 1H), 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.67-6.43 (m, 4H), 6.52 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.43-4.32 (m, 1H), 3.29-3.12 (m, 6H), 1.95-1.72 (m, 2H), 1.69-1.49 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H30N9O6 + [M+H]+ 計算値 588.23、実測値 588.46。
ＸＴ２５：1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.25 (br s, 1H), 9.16 (br s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.64-8.50 (m, 1H), 8.55 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.09 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.93 (br s, 1H), 7.83 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 8.3, 2.3 Hz, 1H), 4.41-4.33 (m, 1H), 3.30-3.12 (m, 6H), 1.95-1.72 (m, 2H), 1.67-1.49 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H30N9O6 + [M+H]+ 計算値 588.23、実測値 588.48。
(S)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)-ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-4-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)安息香酸（ＸＴ３１）及び(S)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)安息香酸（ＸＴ３２）の製造
(S)-5-(5-(6-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)ヘキサンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ２７）
ピリジン（３ｍＬ）中のアニリンＸＴ８（１００ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で、酸塩化物ＸＴ２６（１８２ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）（Unsworth et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 52, 15794-15798に従い製造）を少しずつ加え（１回３０ｍｇ）、反応をＵＰＬＣ-ＭＳで直ちに確認した。完了後、反応物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してアミドＸＴ２７（１６０ｍｇ、定量）を微量のピリジンと共に得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.52 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.69 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.98 (br s, 1H), 7.90-7.81 (m, 5H), 7.80-7.73 (m, 1H), 7.67 (d, J =, 7.4 Hz, 2H), 7.59 (d, J =8.3 Hz, 2H), 7.43-7.36 (m, 2H), 7.34-7.25 (m, 3H), 6.94 (br s, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.46-4.35 (m, 1H), 4.30-4.25 (m, 2H), 4.21-4.15 (m, 1H), 4.10 (q, J = 4.5 Hz, 2H), 3.60 (s, 3H), 3.60-3.52 (m, 2H), 2.99 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.42-2.34 (m, 2H), 1.85-1.56 (m, 6H), 1.48-1.38 (m, 2H), 1.35-1.25 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.0, 172.7, 168.2, 168.1, 166.3, 156.6, 145.2, 144.4, 144.1, 141.2, 133.6, 131.1, 129.2, 128.0, 127.7, 127.5, 125.6, 125.6, 124.6, 123.5, 122.1, 120.6, 113.1, 65.6, 52.8, 52.3, 47.2, 46.9, 40.4, 37.4, 36.9, 29.6, 28.3, 26.3, 25.4, 25.1。
MS (ESI+) C50H50N11O9 + [M+H]+ 計算値 948.38、実測値 948.45。
(S)-4-(6-アミノヘキサンアミド)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２８）及び(S)-5-(6-アミノヘキサンアミド)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ２９）
ＮａＯＨ（１２当量）によるエステルＸＴ２７（１４５ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）の加水分解を、ろ過による固体回収時の洗浄工程ではエーテルのみを使用する点を除き、一般手順ＸＸＣに従い行った。二酸ＸＴ２８及びＸＴ２９の精製していない混合物（８０ｍｇ、７５％、比１：２）を得、更に精製することなく次で使用した。
MS (ESI+) C33H40N11O7 + [M+H]+ 計算値 702.31、実測値 702.56。
(S)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-4-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)安息香酸（ＸＴ３１）及び(S)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)安息香酸（ＸＴ３２）
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の二酸ＸＴ２８及びＸＴ２９（６０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、比１：２）の懸濁液に、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２６０μＬ、１Ｍ）を室温で加え、次いでN-メトキシカルボニルマレイミドＸＴ３０（１３．３ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を加えた。追加のＮａ２ＣＯ３水溶液（０．１７０ｍＬ、１Ｍ）を２０分間隔で３回加え、最後のＮａ２ＣＯ３水溶液（０．０８５ｍＬ、１Ｍ）を加えた。２時間後、反応混合物を０℃に冷却し、ＡｃＯＨ水溶液（２．０６ｍＬ、１Ｍ）でクエンチし、得られた懸濁液を減圧下で濃縮した。粗製の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、アミドＸＴ３１及びＸＴ３２の混合物を１：２の比で黄色の固体として得た（１５ｍｇ、２２％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.41 (br s, 2H), 10.19 (s, 1H), 10,12 (s, 1H), 9.16 (d, J = 21.3 Hz, 2H), 8.83 (s, 1H), 8.27-8.12 (m, 2H), 7.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.80-7.62 (m, 4H), 7.57 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.89 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.55 (br s, 1H), 4.61 (s, 2H), 4.39-4.30 (m, 1H), 3.17 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.35-2.26 (m, 2H), 1.92-1.71 (m, 2H), 1.69-1.45 (m, 6H), 1.31-1.19 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 174.6, 172.2, 172.0, 171.6, 169.2, 168.5, 168.4, 167.3, 166.8, 163.3, 150.9, 150.7, 149.8, 142.6, 141.2, 140.3, 134.9, 133.1, 132.2,131.3, 129.6, 128.8, 123.8, 122.2, 121.9, 121.0, 119.6, 118.6, 117.9, 111.9, 52.9, 46.1, 37.4, 36.7, 36.6, 28.7, 28.2, 26.6, 26.2, 24.9。
MS (ESI+) C37H40N11O9 + [M+H]+ 計算値 782.30、実測値 782.52。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ３５）の製造
(S)-5-(4-アジドベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-ペンタン酸メチル（ＸＴ３３）
酸ＸＴ７（１５０ｍｇ、０．４４２ｍｍｏｌ）とアミンＸＸ３（１４２ｍｇ、０．４８６ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してエステルＸＴ３３を黄色の固体として得た（２７０ｍｇ、定量）。
MS (ESI+) C28H29N12O5 + [M+H]+ 計算値 613.24、実測値 613.50。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-ペンタン酸メチル（ＸＴ３４）
アジドＸＸ３３（２７０ｍｇ、０．４４１ｍｍｏｌ）の還元を、一般手順ＸＸＢによって行った。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアニリンＸＴ３４を黄灰色の固体として得た（１９０ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ、７４％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.80 (s, 1H), 8.75 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.68 (s, 1H), 7.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.87-7.80 (m, 1H), 7.59 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.57-7.48 (m, 1H), 6.81 (br s, 2H), 6.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.40-4.80 (m, 2H), 5.23 (s, 2H), 4.47-4.38 (m, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.22 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 1.89-1.71 (m, 2H), 1.66-1.48 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H31N10O5 + [M+H]+ 計算値 587.25、実測値 587.55。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ３５）
ＮａＯＨ（６当量）によるエステルＸＴ３４（１９０ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに以下の変更を加えて行った。ろ過及び固体の洗浄後、材料を２％アンモニア水溶液に溶解し、凍結乾燥し、ＸＴ３５を黄橙色の固体として得た（１４３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、８１％）。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 174.5, 166.6, 166.4, 163.4, 163.3, 155.7, 151.9, 151.1, 150.1, 146.0, 129.3, 129.1, 122.2, 121.9, 121.3, 113.0, 111.9, 53.3, 46.1, 40.9, 29.4, 26.7。
MS (ESI+) C26H29N10O4 + [M+H]+ 計算値 545.24、実測値 545.23。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ４１）の製造
(S)-5-(5-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ３６）
アニリンＸＴ２３（２８０ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌ（３９６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１１の場合と同様に反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してアミドＸＴ３６を黄色の固体として得た（３５０ｍｇ、８３％）。
MS (ESI+) C47H45N10O8 + [M+H]+ 計算値 877.34、実測値 877.44。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ３７）
Ｆｍｏｃで保護されたアミンＸＴ３６（３５０ｍｇ、０．３９９ｍｍｏｌ）を、ＴＢＡＦ・３Ｈ２Ｏとデカンチオールを使用して脱保護し、続けて、ＸＴ１２の場合と同様に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ及びＤＩＰＥＡと反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製して、テトラブチルアミン塩で汚染されたジペプチドＸＴ３７を得た（定量）。
MS (ESI+) C42H52N11O9 + [M+H]+ 計算値 854.39、実測値 854.49。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ３８）
ジペプチドＸＴ３７（３４０ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１３の場合と同様にして脱保護した。濃縮後、ＴＦＡ塩ＸＴ３８を次の工程で直接使用した。
MS (ESI+) C37H44N11O7 + [M+H]+ 計算値 754.34、実測値 754.47。
5-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ４０）
ホルムアミドＸＴ３８（３００ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに以下の変更を加えて行った。ホルムアミドＸＴ３８を、最初にＮａＯＨ（１２当量）と０℃で１時間反応させ、次いで、ＮａＯＨ（１２当量）を追加して室温で６時間反応させた。固体のＭｅＯＨによる洗浄を、水（３ｍＬ）による洗浄に変更した。フタルイミドの開環は適度な選択性で進行し、所望の位置異性体ＸＴ４０が優勢であった（約１：２）。材料を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から２５％）で精製してＸＴ４０を白色の固体として得た（５０ｍｇ、１６％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13-83-11.98 (m, 2H), 10.40 (s, 1H), 9.06 (br s, 1H), 8.96 (br s, 1H), 8.76 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.53 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.26 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.11 (br s, 3H), 7.98 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.72 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.58 (br s, 1H), 4.49 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 4.43-4.28 (m, 1H), 3.63 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 3.27-3.14 (m, 6H), 2.09 (sextet, J = 6.6 Hz, 1H), 1.96-1.86 (m, 1H), 1.86-1.73 (m, 1H), 1.70-1.51 (m, 2H), 1.37 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.96 (dd, J = 6.7, 4.8 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C36H44N11O8 + [M+H]+ 計算値 758.34、実測値 758.61。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチル-ブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ４１）
アミンＸＴ４０（４５ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（２８ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０６２ｍＬ、０．３６ｍｍｏｌ）と反応させた。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製してＸＴ４１を白色の固体として得た（３０ｍｇ、５３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.25-12.33 (m, 2H), 10.15 (s, 1H), 9.25 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.57 (br s, 1H), 8.52 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.24 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.85-7.78 (m, 3H), 7.74 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.72-7.54 (m, 1H), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.00 (s, 2H), 4.42-4.31 (m,2H), 4.17 (dd, J = 8.0, 7.4 Hz, 1H), 3.32-3.14 (m, 8H), 2.22-2.07 (m, 2H), 2.01-1.73 (m, 3H), 1.69-1.41 (m, 6H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.24-1.13 (m, 2H), 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C45H55N13O11 + [M+H]+ 計算値 951.41、実測値 951.91。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ４６）の製造
(S)-5-(4-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ４２）
アニリンＸＸ６（１５０ｍｇ、０．２６９ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌ（３１０ｍｇ、０．９４２ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１１の場合と同様に反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してアミドＸＴ４２をオフホワイト色の固体として得た（１８０ｍｇ、７９％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.25 (s, 1H), 9.07 (br s, 1H), 8.98 (br s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.58 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.38 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.86-7.77 (m, 4H), 7.76-7.70 (m, 3H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.59 (br s, 1H), 7.45-7.28 (m, 7H), 7.10 (br s, 1H), 4.49-4.41 (m, 1H), 4.31-4.25 (m, 2H), 4.25-4.16 (m, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.28-3.16 (m, 4H), 1.92-1.76 (m, 2H), 1.72-1.52 (m, 2H), 1.32 (d, J = 7.1 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C46H47N10O7 + [M+H]+ 計算値 851.36、実測値 851.82。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ４３）
ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＸＴ４２（１８０ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（０．４１９ｍＬ、４．２３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエンと共に蒸発させた。エーテル（５０ｍＬ）を加え、得られた懸濁液を室温で１０分撹拌した。ろ過した後、固体を回収し、精製していないアミンをＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。次に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（１００ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０７４ｍＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を４時間撹拌した。続けて反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してジペプチドＸＴ４３を得た（１７０ｍｇ、９７％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.45 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 8.85 (br s, 1H), 8.68 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.36 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.67 (br s, 1H), 7.65 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.60 (br s, 2H), 4.49-4.38 (m, 2H), 3.83 (dd, J = 8.0, 7.5 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.29-3.23 (m, 2H), 3.19-3.07 (m, 4H), 2.02-1.90 (m, 1H), 1.90-1.74 (m, 2H), 1.70-1.50 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.5 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C41H54N11O8 + [M+H]+ 計算値 828.42、実測値 828.81。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ４４）
ジペプチドＸＴ４３（３４０ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）をＸＴ１３の場合と同様にして脱保護した。濃縮後、ＴＦＡ塩ＸＴ４４を次の工程で直接使用した。
MS (ESI+) C36H46N11O6 + [M+H]+ 計算値 728.36、実測値 728.66。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ４５）
ＮａＯＨ（１２当量）によるエステルＸＴ４４（１４５ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）の加水分解を、生成物がＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ）による処理で固化しなかったため、ＭｅＯＨの蒸発後に得られた溶液を凍結乾燥させるという変更を一般手順ＸＸＣに加えて、行った。得られたケーキをＤＭＦ（５ｍＬ）と共に撹拌し、ろ過し、得られたＸＴ４５を含むＤＭＦ溶液を、次の工程で直接使用した。
MS (ESI+) C35H44N11O6 + [M+H]+ 計算値 714.35、実測値 714.71。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ４６）
アミンＸＴ４５を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（４９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１６８ｍＬ、０．９６０ｍｍｏｌ）と反応させた。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製してＸＴ４６を白色の固体として得た（６７ｍｇ、４６％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.13 (br s, 1H), 10.11 (s, 1H), 9.25 (s, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.57 (br s, 1H), 8.55 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.36 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.92-7.75 (m, 6H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 4.44-4.33 (m, 2H), 4.17 (dd, J = 7.9, 7.5 Hz, 1H), 3.37 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.31-3.16 (m, 6H), 2.23-2.06 (m, 2H), 2.01-1.73 (m, 3H), 1.71-1.54 (m, 2H), 1.53-1.41 (m, 4H), 1.32 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.23-1.13 (m, 2H), 0.86 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C45H55N12O9 + [M+H]+ 計算値 907.42、実測値 907.84。
(S)-5-アミノ-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-ベンズアミド)ペンタン酸メチル塩酸塩（ＸＴ４８）の製造
(S)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ４７）
酸ＸＴ７（１．３０ｇ、３．８３ｍｍｏｌ）とＨ－Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅ（１．３０ｇ、４．６０ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してエステルＸＴ４７を橙／赤色の固い泡状物として得た（１．８０ｇ、８３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.81 (s, 1H), 8.72-8.67 (m, 1H), 8.70 (s, 1H), 7.99 (br s, 1H), 7.90 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.68 (br s, 1H), 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.96 (br s, 2H), 6.79 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.44-4.35 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.99-2.88 (m, 2H), 1.86-1.76 (m, 2H), 1.55-1.38 (m, 2H), 1.36 (s, 9H)。
MS (ESI+) C26H34N9O6 + [M+H]+ 計算値 568.26、実測値 568.56。
(S)-5-アミノ-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル塩酸塩（ＸＴ４８）
エステルＸＴ４７（１．６０ｇ、２．８２ｍｍｏｌ）をジオキサン（１６ｍＬ）中で溶解するまで加熱した。室温に冷却した後、溶液を激しく撹拌しているジオキサン（４Ｍ、３０ｍＬ）中のＨＣｌに滴下した。得られた黄色の懸濁液を２時間撹拌した。次いで反応混合物をろ過し、残留物をエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、水（３０ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥し、ＸＴ４８を黄色の固体として得た（１．４２ｇ、１００％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.21 (br s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.87 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.83 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.68 (br s, 1H), 8.01 (br s, 4H), 7.95 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.33 (s, 2H), 4.46-4.38 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.85-2.71 (m, 2H), 1.95-1.79 (m, 2H), 1.75-1.57 (m, 2H)。
MS (ESI+) C21H26N9O4 + [M+H]+ 計算値 468.21、実測値 468.52。
5-((S)-5-ベンジル-18-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザオクタデカンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ５４）の製造
塩化(2,2,2-トリフルオロアセチル)グリシノイル クロリド（ＸＴ４９）
ＭｅＯＨ（３３ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（６．９６ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）中のグリシン（２．５０ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（５．１７ｍＬ、４３．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。溶液を濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）に溶解し、有機溶液を塩酸（１Ｍ、１５０ｍＬ）で洗浄し、水相をＥｔＯＡｃ（２×７５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機相をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、ろ液を濃縮し、(2,2,2-トリフルオロアセチル)グリシン（５．３ｇ、９３％）を白色の固体として得た。生成物の一部（１．００ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、塩化オキサリル（１．５４ｍＬ、１７．５４ｍｍｏｌ）、続いて２滴のＤＭＦを滴下した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、続けて濃縮し、溶媒をトルエン（２×）と共に蒸発させ、ＸＴ４９を得た（定量）。生成物をＭｅＯＨでクエンチして対応するメチルエステルを得た。
MS (ESI+) C5H7F3NO3 + [M+H]+ 計算値 186.04、実測値 186.36。
(S)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-(1,3-ジオキソ-5-(2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)アセトアミド)イソインドリン-2-イル)ペンタン酸メチル（ＸＴ５０）
ピリジン（２．５ｍＬ）中のＸＴ８（９０．０ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却し、ＸＴ４９（１６７ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を６回に分け、１時間かけて加えた。ＵＰＬＣ-ＭＳが反応の完了を示した後、反応物をＭｅＯＨ（３ｍＬ）でクエンチし、減圧下で濃縮した。粗製の残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してＸＴ５０を黄色の固体として得た（１１８ｍｇ、定量）。
MS (ESI+) C33H31F3N11O8 + [M+H]+ 計算値 766.23、実測値 766.61。
(S)-5-(2-アミノアセトアミド)-2-((4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ５２）
ホルムアミドＸＴ５０（１０７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに以下の変更を加えて行った。ホルムアミドＸＴ５０を、最初にＮａＯＨ（１２当量）と０℃で１時間反応させ、次いで、ＮａＯＨ（１２当量）を追加して室温で３時間反応させた。固体のＭｅＯＨによる洗浄を、水（３ｍＬ）による洗浄に変更した。フタルイミドの開環は適度な選択性で進行し、所望の位置異性体ＸＴ５２が優勢であった（約１：２）。粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配５％から３５％）で精製して二酸ＸＴ５２を黄色の固体として得た（３６ｍｇ、４０％、２工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.79-12.05 (m, 2H), 10.67 (s, 1H), 9.17 (br s, 1H), 9.13 (br s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.37 (br s, 1H), 8.28 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.19-8.05 (m, 3H), 7.96 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.77-7.69 (m, 4H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.63 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 8.7, 2H), 6.54 (br s, 1H), 4.61 (s, 2H), 4.39-4.30 (m, 1H), 3.81 (s, 2H), 3.19 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 1.94-1.83 (m, 1H), 1.83-1.71 (m, 1H), 1.69-1.49 (m, 2H)。
MS (ESI+) C29H32N11O7 + [M+H]+ 計算値 646.25、実測値 646.67。
5-((S)-5-ベンジル-18-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザオクタデカンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)安息香酸（ＸＴ５４）
ＴＨＦ（４ｍＬ）中のトリペプチドＸＴ５３（欧州特許出願公開第2907824号に記載のとおりに合成）（１０５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、N,N′-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；４６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（２６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、得られた懸濁液を１８時間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、ろ液の一部（１．０ｍＬ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の二酸ＸＴ５２（３２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。ＤＩＰＥＡ（０．０５２ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。濃縮後、粗製の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、ＸＴ５４を黄色の固体として得た（２２ｍｇ、４０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.28-12.29 (m, 2H), 10.12 (s, 1H), 9.20 (br s, 1H), 9.15 (br s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.40 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.25 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.18-8.12 (m, 2H), 8.07 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.02 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.77-7.71 (m, 3H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.28-7.15 (m, 6H), 6.99 (s, 2H), 6.89 (br s, 1H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.53 (br s, 1H), 4.61 (d, J = 3.2 Hz, 2H), 4.46-4.48 (m, 1H), 4.39-4.29 (m, 1H), 3.90 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.80-3.55 (m, 6H), 3.19 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 3.08 (dd, J = 13.9, 4.5 Hz, 1H), 2.83 (dd, J = 13.8, 9.8 Hz, 1H), 2.10 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.94-1.70 (m, 2H), 1.69-1.39 (m, 6H), 1.26-1.14 (m, 2H)。
MS (ESI+) C52H58N15O13 + [M+H]+ 計算値 1100.43、実測値 1100.85。
2-(((S)-5-カルボキシ-5-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-ペンチル)アミノ)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ６３）の製造
(S)-2-((5-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＴ５７）
ＭｅＣＮ（１５ｍＬ）中のＸＴ５５（１．４２ｇ、７．１３ｍｍｏｌ）、ＸＴ５６（２．０ｇ、７．１３ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１．４８ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）の懸濁液を密閉チューブに入れ、９０℃で２時間加熱した。濃塩酸（０．８９ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を室温で加え、精製していない反応混合物を濃縮した。次に、カルボン酸中間体をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、塩化チオニル（５．８ｍＬ、７９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃で１時間撹拌し、次いで１時間かけて徐々に室温に温めた。完了後、反応混合物をCelite（登録商標）でろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：９）で精製してアニリンＸＴ５７を黄色の泡状物として得た（２．８ｇ、８３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.64 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.54 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.19 (dd, J = 9.5, 1.7 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.8 hz, 1H), 7.42-7.25 (m, 5H), 6.93 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.08-4.00 (m, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.34 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 1.79-1.52 (m, 4H), 1.50-1.34 (m, 2H)。
MS (ESI+) C23H28N3O8 + [M+H]+ 計算値 474.19、実測値 474.31。
(S)-2-((5-アミノ-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)-5-ニトロ安息香酸メチル臭化水素酸塩（ＸＴ５８）
ＤＣＭ（８ｍＬ）中のＸＴ５７（７５０ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。氷冷したＡｃＯＨ（３３％、１０ｍＬ）中のＨＢｒを加え、得られた溶液を０℃で２時間撹拌した。続けて反応混合物を減圧下で濃縮し、溶媒をトルエンと共に蒸発させ、アミンＸＴ５８を黄色の固体として得た（６６０ｍｇ、９９％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.66 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.55 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.34 (br s, 2H), 8.21 (dd, J = 9.5, 2.7 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.13-4.05 (m, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.37 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 1.89-1.75 (m, 2H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.56-1.32 (m, 2H)。
MS (ESI+) C15H22N3O6 + [M+H]+ 計算値 340.15、実測値 340.44。
(S)-2-((5-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＴ５９）
アミンＸＴ５８（３１０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）と酸ＸＴ７（１５０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をＭｅＯＨ（８ｍＬ）から再結晶してＸＴ５９を橙色の固体として得た（３９０ｍｇ、８０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.80 (s, 1H), 8.71-8.67 (m, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.60 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.54 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 8.15 (dd, J = 9.5, 2.8 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.65 (br s, 1H), 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.33 (br s, 1H), 6.92 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.63 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.46-4.38 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.40-3.27 (m, 2H), 1.90-1.78 (m, 2H), 1.71-1.55 (m, 2H), 1.54-1.37 (m, 2H)。
MS (ESI+) C30H33N10O8 + [M+H]+ 計算値 661.25、実測値 661.65。
(S)-5-アミノ-2-((5-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)安息香酸メチル（ＸＴ６０）
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＸＴ５９（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（０．３７５ｍＬ）及び亜鉛粉末（４４５ｍｇ、６．８１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を室温で２時間撹拌した。次に、反応混合物をＤＭＦ（４ｍＬ）で希釈し、Celite（登録商標）でろ過した。ろ液を大気中、室温で１８時間撹拌した。１６時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、粗生成物をＭｅＯＨ（６ｍＬ）中に懸濁させ、ろ過し、残留物をエーテル（４ｍＬ）で洗浄して、アニリンＸＴ６０を灰色の固体として得た（１４５ｍｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.80 (s, 1H), 8.70 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.88(d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.73 (br s, 1H), 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.54 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.92 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H), 6.72 (bs s, 2H), 6.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 4.58 (s, 2H), 4.40 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.07 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.66-1.35 (m, 4H)。
MS (ESI+) C30H35N10O6 + [M+H]+ 計算値 631.27、実測値 631.15。
5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(((S)-5-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)安息香酸メチル（ＸＴ６１）
アニリンＸＴ６０（１４０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（７０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアミドを得た（６０ｍｇ、８２％）。生成物の一部（４０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、ピペリジンを使用して脱保護し、ＸＴ４３の場合と同様に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕと反応させた。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してＸＴ６１を黄色の固体として得た（３０ｍｇ、７７％）。
MS (ESI+) C43H57N12O10 + [M+H]+ 計算値 901.43、実測値 901.54。
5-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(((S)-5-カルボキシ-5-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンチル)アミノ)安息香酸（ＸＴ６２）
カルバメートＸＴ６１（１５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．５ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、ＴＦＡ（１．５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を０℃で１５分間撹拌し、次いで、濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させた。続けて、ＮａＯＨ（２４当量）による粗生成物の加水分解を、一般手順ＸＸＣに以下の変更を加えて行った。１ＭのＡｃＯＨによる処理で、生成物は容易く沈殿しなかった。メタノールを真空蒸発により除去し、水溶液を凍結乾燥した。得られたケーキをＤＭＦ（５ｍＬ）と共に撹拌し、ろ過し、得られたＸＴ６２を含むＤＭＦ溶液を、次の工程で直接使用した。
MS (ESI+) C35H45N12O7 + [M+H]+ 計算値 745.35、実測値 745.52。
2-(((S)-5-カルボキシ-5-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンチル)アミノ)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ６３）
アミンＸＴ６２（２５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（１０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０６ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ）と反応させた。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から３０％）で精製してＸＴ６３を黄色の固体として得た（８ｍｇ、２５％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.25 (br s, 1H), 12.43 (br s, 1H), 9.67 (s, 1H), 9.38-9.13 (m, 3H), 8.84 (s, 1H), 8.17 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.57 (dd, J = 9.1, 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.95 (br s, 1H), 6.76 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.53 (br s, 2H), 4.61 (s, 2H), 4.38-4.28 (m, 2H), 4.18-4.12 (m, 1H), 3.17-3.07 (m, 4H), 2.22-2.06 (m, 2H), 2.01-1.90 (m, 1H), 1.88-1.75 (m, 2H), 1.68-1.36 (m, 8H), 1.34-1.23 (m, 3H), 1.23-1.12 (m, 2H), 0.86 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C45H56N13O10 + [M+H]+ 計算値 938.43、実測値 938.70。
5-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)-アミノ)-2-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ７２３）の製造
(S)-5-((4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)アミノ)-2-ニトロ安息香酸メチル（ＸＴ６６）
ＸＴ６４（１．５０ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）とＸＴ６５（２．００ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）を、ＸＴ５７の場合と同様に反応させた。最初の工程の反応時間を７日間に延長した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：９）で精製してＸＴ６６を黄／橙色の油状物として得た（２．００ｇ、５８％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 7.95 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.40-7.26 (m, 5H), 6.70 (dd, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.85 (br s, 1H), 4.12-4.05 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.18-3.11 (m, 2H), 1.86-1.74 (m, 1H), 1.73-1.54 (m, 3H)。
MS (ESI+) C22H26N3O8 + [M+H]+ 計算値 460.17、実測値 460.33。
(S)-5-((4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-ニトロ安息香酸メチル（ＸＴ６７）
ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のアニリンＸＴ６６（２．００ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ２Ｏ（３．０３ｍＬ、１３．０６ｍｍｏｌ）及び4-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；５３ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。続けて反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製して２つのＢｏｃで保護されたＸＴ６７を黄色の油状物として得た（１．９０ｇ、６６％）。
MS (ESI+) C22H26N3O8 + [M-2xBoc+H]+ 計算値 460.17、実測値 460.30。
(S)-2-アミノ-5-((4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)安息香酸メチル（ＸＴ６８）
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ０：１から１：１）で精製すること以外はＸＴ６０の手順と同様に、化合物ＸＴ６７（１．７０ｇ、２．５８ｍｍｏｌ）と亜鉛粉末（２．５０ｇ、３８．７ｍｍｏｌ）を反応させ、アニリンＸＴ６８を橙色の泡状物として得た（１．５ｇ、９２％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 7.44 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.39-7.31 (m, 5H), 7.03 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.67 (br s , 2H), 5.18 (s, 2H), 4.93 (dd, J = 10.0, 4.7 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.50-3.50 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 3.44-3.34 (m, 1H), 2.04-1.94 (m, 1H), 1.86-1.73 (m,1H), 1.47-1.28 (m, 2H), 1.34 (s, 18H)。
MS (ESI+) C32H44N3O10 + [M+H]+ 計算値 630.30、実測値 630.40。
2-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-5-(((S)-4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)(tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)(tert-ブトキシ-カルボニル)アミノ)安息香酸メチル（ＸＴ６９）
アニリンＸＴ６８（１．４３ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌ（８２４ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１１の場合と同様に反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアミドＸＴ６９を黄色の泡状物として得た（２．１ｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 11.19 (s, 1H), 8.61-8.56 (m, 1H), 8.48 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.83-7.69 (m, 3H), 7.48-7.27 (m, 9H), 5.17 (s, 2H), 4.92 (dd, J = 9.8, 4.8 Hz, 1H), 4.47-4.40 (m, 1H), 4.36-4.22 (m, 2H), 4.19-4.09 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.30-3.63 (m, 1H), 3.59-3.50 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.06-1.96 (m, 1H), 1.86-1.74 (m, 1H), 1.43-1.29 (m, 5H), 1.36 (s, 9H), 1.32 (s, 9H)。
MS (ESI+) C50H59N4O13 + [M+H]+ 計算値 923.41、実測値 923.39。
2-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-5-(((S)-4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)アミノ)安息香酸メチル（ＸＴ７０）
ジオキサン（２ｍＬ）中の２つのＢｏｃで保護されたＸＴ６９（２．１０ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン（４Ｍ、１２ｍＬ）中のＨＣｌを加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：９）で精製してアニリンＸＴ７０を黄色の泡状物として得た（１．４５ｇ、８８％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.69 (s, 1H), 8.13 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.82-7.72 (m, 3H), 7.45-7.25 (m, 10H), 7.10 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.9, 2.7 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.44-4.35 (m, 1H), 4.31-4.23 (m, 2H), 4.14-4.02 (m, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.03-2.93 (m, 2H) 1.86-1.75 (m, 1H), 1.72-1.54 (m, 3H), 1.34 (d, J = 7.2 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C40H43N4O9 + [M+H]+ 計算値 723.30、実測値 723.51。
5-(((S)-4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)アミノ)-2-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸メチル（ＸＴ７１）
Ｆｍｏｃで保護されたアミンＸＴ７０（１．４５ｇ、２．００ｍｍｏｌ）をピペリジンを使用して脱保護し、続けて、ＸＴ４３の場合と同様にＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕと反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してジペプチドＸＴ７１を黄色の固体として得た（６００ｍｇ、４３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.23 (s, 1H), 8.20 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.42-7.26 (m, 5H), 7.04 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.77 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.43 (p, J = 6.9 Hz, 1H), 4.10-4.01 (m, 1H), 3.94-3.88 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 2.97 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.09-1.97 (m, 1H), 1.86-1.75 (m, 1H), 1.72-1.52 (m, 3H), 1.38 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.77 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.3, 171.9, 170.8, 168.0, 156.6, 156.0, 145.6, 137.4, 128.8, 128.3, 128.2, 123.8, 120.3, 117.3, 112.9, 78.5, 66.0, 59.7, 54.2, 52.6, 52.3, 50.0, 30.9, 28.8, 25.5, 19.8, 18.2, 18.1。
MS (ESI+) C35H50N5O10 + [M+H]+ 計算値 700.36、実測値 700.56。
5-(((S)-4-アミノ-5-メトキシ-5-オキソペンチル)アミノ)-2-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸メチル（ＸＴ７２）
化合物ＸＴ７１（６００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でＤＭＦ（８．５ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（９１ｍｇ、活性炭上に１０ｍｏｌ％）を加え、得られた黒色の懸濁液を、水素雰囲気下、室温で９０分間激しく撹拌した。フラスコをＮ２でパージし、反応混合物をCelite（登録商標）でろ過した。ろ液を濃縮してＸＴ７１を濃緑色の固体として得た（定量）。
MS (ESI+) C27H44N5O8 + [M+H]+ 計算値 566.32、実測値 566.43。
2-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-5-(((S)-4-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)アミノ)安息香酸メチル（ＸＴ７２１）
アミンＸＴ７２（１６７ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）と酸ＸＴ７（１００ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）から再結晶してＸＴ７２１を橙色の固体として得た（２１６ｍｇ、８３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.23 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.72 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.20 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.47 (br s, 1H), 7.04 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 9.0, 2.7 Hz, 1H), 6.74 (br s, 2H), 6.67 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.78 (br s, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.47-4.39 (m, 1H), 4.33 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 3.94-3.89 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.04-2.95 (m, 2H), 2.09-1.98 (m, 1H), 1.98-1.88 (m, 1H), 1.88-1.77 (m, 1H), 1.69-1.55 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.77 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C42H55N12O10 + [M+H]+ 計算値 887.42、実測値 887.90。
2-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-5-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)アミノ)安息香酸（ＸＴ７２２）
ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中のエステルＸＴ７２１（２１０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＯＨ（２８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）水溶液（１．５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を７２時間撹拌し、－７８℃で一晩保存した。完了後、反応混合物をＡｃＯＨ水溶液（１．０Ｍ、２．５ｍＬ）で酸性化し、得られた懸濁液を室温で６０分間撹拌した。混合物をろ過し、残留物を水（１０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）及びエーテル（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体を一晩風乾し、黄色の固体を得た（１５０ｍｇ）。次に、材料をＤＣＭ（３ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、ＴＦＡ（３ｍＬ）を加えた。得られた溶液を、室温に温めながら１５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させ、ＴＦＡ塩ＸＴ７２２を得（定量）、次の反応で直接使用した。
MS (ESI+) C34H43N12O7 + [M+H]+ 計算値 731.34、実測値 731.52。
5-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)アミノ)-2-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチル-ブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＴ７２３）
アミンＸＴ７２２（１３２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（５６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．３１４ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）と反応させた。残留物をＭｅＯＨ中でトリチュレートして精製し、ろ過し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製してＸＴ７２３を黄色の固体として得た（７２ｍｇ、４３％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.67-12.00 (m, 2H), 10.77 (s, 1H), 9.35 (br s, 1H), 9.31 (br s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.64 (br s 1H), 8.34 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 8.21-8.13 (m, 2H), 7.79-7.69 (m, 3H), 7.62 (br s, 1H), 7.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.83 (dd, J = 9.0, 2.3 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.63 (s, 2H), 4.39-4.32 (m, 1H), 4.31-4.20 (m, 2H), 3.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.01 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.23-2.02 (m, 3H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.87-1.74 (m, 1H), 1.70-1.56 (m, 2H), 1.53-1.41 (m, 4H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.23-1.13 (m, 2H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.76 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C44H54N13O10 + [M+H]+ 計算値 924.41、実測値 924.45。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)フェニル)アミノ)ペンタン酸（ＸＴ８０）の製造
(S)-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-5-((4-ニトロフェニル)アミノ)ペンタン酸メチル（ＸＴ７４）
水（１０ｍＬ）／ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中のＸＴ７３（７９５ｍｇ、５．６３ｍｍｏｌ）、ＸＴ６５（５００ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（７５ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（４７３ｍｇ、５．６３ｍｍｏｌ）の混合物を密閉チューブに入れ、９０℃で５日間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、エーテル（４０ｍＬ）で洗浄した。次いで水溶液を６Ｍの塩酸でｐＨ約３にし、得られた混合物をＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨ（２×７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、中間体のカルボン酸を黄色の泡状物として得た（６１０ｍｇ、８４％）。材料をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、塩化チオニル（１．２６ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を０℃で４５分間撹拌し、次いで、１時間かけて室温にした。完了後、反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：９）で精製してエステルＸＴ７４を黄色の泡状物として得た（６７０ｍｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 7.98 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.39-7.25 (m, 6H), 6.62 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 5.04 (s, 2H), 4.12-.4.04 (m, 1H), 3.10 (s, 3H), 3.17-3.08 (m, 2H), 1.87-1.74 (m, 1H), 1.72-1.56 (m, 3H)。
MS (ESI+) C20H24N3O6 + [M+H]+ 計算値 402.17、実測値 402.33。
(S)-2-アミノ-5-((4-ニトロフェニル)アミノ)ペンタン酸メチル臭化水素酸塩（ＸＴ７５）
エステルＸＴ７４（４８０ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）をＸＴ５８の場合と同様にして脱保護した。続けて反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエンと共に蒸発させた。残留物を水に溶解し、凍結乾燥して粘着性のガム状物として得た。物質を、懸濁液が得られるまでエーテル中で撹拌し、次いでろ過した。残留物の溶媒をＭｅＯＨと共に蒸発させ、アミンＸＴ７５を黄色の泡状物として得た（５５０ｍｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.41 (br s, 3H), 8.00 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 4.13 (sextet, J = 5.5 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.19 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.96-1.79 (m, 2H), 1.77-1.53 (m, 2H)。
MS (ESI+) C12H18N3O4 + [M+H]+ 計算値 268.13、実測値 268.27。
(S)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-((4-ニトロフェニル)-アミノ)ペンタン酸メチル（ＸＴ７６）
アミンＸＴ７５（２５０ｍｇ、０．７１８ｍｍｏｌ）と酸ＸＴ７（２４４ｍｇ、０．７１８ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をＭｅＯＨ（８ｍＬ）から再結晶してＸＴ７６を橙色の固体として得た（３１０ｍｇ、７３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.80 (s, 1H), 8.74 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.65 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66 (br s, 1H), 7.59 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.34 (br s, 1H), 7.29 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 6.62 (br s, 2H), 6.61 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 5.21 (s, 2H), 4.51-4.41 (m, 1H), 3.63 (s, 3H) 3.20-3.12 (m, 2H), 1.99-1.75 (m, 2H), 1.73-1.57 (m, 2H)。
MS (ESI+) C27H29N10O6 + [M+H]+ 計算値 589.23、実測値 589.59。
(S)-5-((4-アミノフェニル)アミノ)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ７７）
ニトロアニリンＸＴ７６（３４０ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）を、ＸＴ６０の場合と同様に亜鉛粉末（１１３３ｍｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を使用して還元し、アニリンＸＴ７７を灰色の固体として得た（３０５ｍｇ、９５％）。
MS (ESI+) C27H31N10O4 + [M+H]+ 計算値 559.25、実測値 559.14。
(S)-5-((4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-フェニル)アミノ)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ７８）
アニリンＸＴ７７（３００ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）とＢｏｃ－ＶａｌＡｌａ－ＯＨ（１７０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してＸＴ７８を黄色の固体として得た（２４０ｍｇ、５４％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.55 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.78-8.68 (m, 3H), 8.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.43 (br s, 1H), 8.12 (br s, 2H), 7.95 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.27 (s, 2H), 4.48-4.34 (m, 2H), 3.89-3.78 (m, 1H), 3.63 (s, 3H) 2.97 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.03-1.74 (m, 3H), 1.69-1.51 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.31-1.19 (m, 3H), 0.90-0.78 (m, 6H)。
MS (ESI+) C40H53N12O8 + [M+H]+ 計算値 829.41、実測値 829.58。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)フェニル)アミノ)ペンタン酸（ＸＴ８０）
カルバメートＸＴ７８（２４０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、ＴＦＡ（３ｍＬ）を加えた。得られた混合物を０℃で１５分間撹拌し、次いで濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させた。ＮａＯＨ（３６当量）による中間体エステルの加水分解を、生成物が１ＭのＡｃＯＨによる処理では十分に固化しなかったため、ＭｅＯＨの蒸発後に得られた溶液を凍結乾燥させるという変更を一般手順ＸＸＣに加えて、行った。得られたケーキをＤＭＦ（４ｍＬ）中で撹拌し、ろ過した。次いで、脱保護した生成物を含むろ液を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（３１ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１０５ｍＬ、０．６００ｍｍｏｌ）と反応させた。粗生成物をＭｅＯＨでトリチュレートし、ろ過した後、固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製してＸＴ８０を黄色の固体として得た（３７ｍｇ、１５％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.53-11.98 (m, 2H), 9.63 (br s, 1H), 9.36 (br s, 1H), 9.31 (br s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.62 (br s, 1H), 8.19 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.69 (br s, 1H), 7.38 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 6.88 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.70 (br s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.41-4.30 (m, 2H), 4.18-4.11 (m, 1H), 3.41-3.31 (m, 2H), 3.11-2.98 (m, 2H), 2.22-2.06 (m, 2H), 2.01-1.86 (m, 2H), 1.86-1.74 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 2H), 1.54-1.40 (m, 4H), 1.28 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.22-1.13 (m, 2H), 0.85 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C43H54N13O8 + [M+H]+ 計算値 880.42、実測値 880.52。
2-(((S)-5-カルボキシ-5-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-ペンチル)アミノ)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ニコチン酸（ＸＴ８９）の製造
(S)-2-((5-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)-5-ニトロニコチン酸メチル（ＸＴ８３）
アミンＸＴ８２（５００ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）とＸＴ８１（３８６ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を、ＸＴ５７の場合と同様に反応させた。生成物をＭｅＯＨ（８ｍＬ）から再結晶してＸＴ８３を黄色の固体として得た（３７０ｍｇ、４４％）。
MS (ESI+) C22H27N4O8 + [M+H]+ 計算値 475.18、実測値 475.34。
(S)-2-((5-アミノ-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)-5-ニトロニコチン酸メチル臭化水素酸塩（ＸＴ８４）
Ｃｂｚで保護されたアミンＸＴ８３（３７０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を、ＸＴ５８の場合と同様にして脱保護した。生成物を水に溶解し、次いで凍結乾燥した。残留物をエーテル中に懸濁させ、ろ過し、ＸＴ８４を黄色の固体として得た（定量）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.12 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.70 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.40 (br s, 2H), 4.12-4.02 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.60 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 1.88-1.75 (m, 2H), 1.62 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.52-1.28 (m, 2H)。
MS (ESI+) C14H21N4O6 + [M+H]+ 計算値 341.15、実測値 341.22。
(S)-2-((5-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)-5-ニトロニコチン酸メチル（ＸＴ８５）
アミンＸＴ８４（３６０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）と酸ＸＴ７（２６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）から再結晶してＸＴ８５を橙色の固体として得た（２８０ｍｇ、５５％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.07 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.84 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.69-8.64 (m, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.63 (d, J = 2. Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.67 (br s, 1H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.35 (br s, 1H), 6.64 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.45-4.35 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.66-3.50 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 1.89-1.75 (m, 2H), 1.69-1.51 (m, 2H), 1.50-1.32 (m, 2H)。
MS (ESI+) C29H32N11O8 + [M+H]+ 計算値 662.24、実測値 662.44。
(S)-5-アミノ-2-((5-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)ニコチン酸メチル（ＸＴ８６）
化合物ＸＴ８５（２８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をＸＴ６０の場合と同様に亜鉛粉末（８３０ｍｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を使用して還元し、アニリンＸＴ８６を灰色の固体として得た（２４０ｍｇ、９０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.80 (s, 1H), 8.68 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.81 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.68 (br s, 1H), 7.59 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.37 (br s, 1H), 7.22 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.66 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.47 (s, 2H), 4.42-4.34 (m, 1H), 3.77-3.57 (m, 2H) 3.74 (s, 3H), 3.61 (s, 3H), 1.86-1.75 (m, 2H), 1.59-1.48 (m, 2H), 1.47-1.32 (m, 2H)。
MS (ESI+) C29H34N11O6 + [M+H]+ 計算値 632.27、実測値 632.42。
5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(((S)-5-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-6-メトキシ-6-オキソヘキシル)アミノ)ニコチン酸メチル（ＸＴ８７）
アニリンＸＴ８６（１２０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）とＢｏｃ－ＶａｌＡｌａ－ＯＨ（６０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製し、ＸＴ８７を黄色の固体として得た（１００ｍｇ、５８％）。
MS (ESI+) C42H56N13O10 + [M+H]+ 計算値 902.43、実測値 902.49。
2-(((S)-5-カルボキシ-5-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンチル)アミノ)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチル ブタンアミド)プロパンアミド)ニコチン酸（ＸＴ８９）
カルバメートＸＴ８７（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、ＴＦＡ（３ｍＬ）を加えた。得られた混合物を０℃で１５分間撹拌し、次いで濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させた。ＮａＯＨ（１８当量）による中間体エステルの加水分解を、一般手順ＸＸＣに従い行った。残留ケーキをＤＭＦ（３ｍＬ）共に撹拌し、ろ過した。ろ液を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（３１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１０５ｍＬ、０．６００ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を濃縮し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から３０％）で精製してＸＴ８９を黄色の固体として得た（１２ｍｇ、１３％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.60-12.03 (m, 2H), 9.79 (s, 1H), 9.35 (br s, 1H), 9.31 (br s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.62 (br s, 1H), 8.38 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.19-8.10 (m, 2H), 8.06-7.64 (m, 2H) 7.82 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 6.87 (br s, 1H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.37-4.28 (m, 2H), 4.18-4.11 (m, 1H), 3.43-3.30 (m, 4H), 2.23-2.06 (m, 2H), 2.01-1.90 (m, 1H), 1.87-1.73 (m, 2H), 1.63-1.52 (m, 2H), 1.52-1.35 (m, 6H), 1.29 (d, J = 7.1 Hz, 3H),1.22-1.13 (m, 2H), 0.86 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C44H55N14O10 + [M+H]+ 計算値 939.42、実測値 939.37。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ９４）の製造
(S)-5-(4-アミノ-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ９０）
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の精製していないテトラゾールＸＸ２１（５５ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）とアミンＸＸ２９（１５０ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）から再結晶し、エーテル（５ｍＬ）で洗浄してＸＴ９０を橙色の固体として得た（定量）。
MS (ESI+) C29H32N13O4 + [M+H]+ 計算値 626.27、実測値 626.38。
(S)-5-(4-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ９１）
アニリンＸＴ９０（１５０ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（１１２ｍｇ、０．３６０ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ×１％Ｅｔ３Ｎ ０：１から１：１）で精製した。単離した生成物をＭｅＯＨに溶解し、エーテルで沈殿させた。得られた懸濁液をろ過し、固体をエーテルで洗浄し、一晩風乾してアミドＸＴ９１を黄色の固体として得た（７５ｍｇ、３４％）。
MS (ESI+) C47H47N14O7 + [M+H]+ 計算値 919.37、実測値 919.79。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ９２）
Ｆｍｏｃで保護されたアミンＸＴ９１（７５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をピペリジン（０．１６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を使用して脱保護し、続けて、ＸＴ４３の場合と同様に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（３４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と反応させた。エーテルを使用して最小量のメタノールから沈殿させることで精製し、次いでろ過し、残留物を風乾し、ジペプチドＸＴ９２を黄色の固体として得た（７５ｍｇ、７８％）。
MS (ESI+) C42H54N15O8 + [M+H]+ 計算値 896.43、実測値 896.54。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ９３）
ＴＨＦ（１ｍＬ）中のエステルＸＴ９２（７５ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１ｍＬ）中のＬｉＯＨ（１０ｍｇ、０．４１９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌し、０℃に冷却し、ＡｃＯＨ（０．０５ｍＬ、０．８４ｍｍｏｌ）で処理した。５分間撹拌した後、懸濁液を濃縮し、溶媒をトルエンと共に蒸発させた。残留物をＤＣＭ（１ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却し、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。得られた溶液を、徐々に室温に温めながら６０分間撹拌した。反応混合物の溶媒をＤＣＭと共に蒸発させ、精製していないアミンＸＴ９３を得た（定量）。
MS (ESI+) C36H44N15O6 + [M+H]+ 計算値 782.36、実測値 782.73。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ９４）
精製していないアミンＸＴ９３（６２．５ｍｇ）を、ＸＴ１７の場合と同様にして、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（２５ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１４０ｍＬ、０．８００ｍｍｏｌ）と反応させた。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から３０％）で精製してＸＴ９４を白色の固体として得た（２２ｍｇ、２８％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.13-12.34 (m, 2H), 10.28 (s, 1H), 9.25 (br s , 1H), 9.16 (br s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.58 (br s, 1H), 8.50 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.42 (br s, 1H), 8.23 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.94 (br s, 1H), 7.84-7.76 (m, 4H), 7.67-7.61 (m, 1H), 7.49 (br s, 1H) 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 4.42-4.32 (m, 2H), 4.19-4.13 (m, 1H), 3.27-3.10 (m, 8H), 2.22-2.07 (m, 2H), 2.00-1.89 (m, 1H), 1.89-1.70 (m, 2H), 1.68-1.41 (m, 6H), 1.32 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.22-1.12 (m, 2H), 0.88-0.79 (m, 6H)。
MS (ESI+) C46H55N16O9 + [M+H]+ 計算値 975.43、実測値 976.02。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)ペンタン酸（ＸＴ９７）の製造
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ９５）
アミンＸＸ２９（３３４ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）と酸ＸＲ２３（２５０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してＸＴ９５を黄色の固体として得た（定量）。
MS (ESI+) C39H52N11O8S+ [M+H]+ 計算値 834.37、実測値 834.53。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)ペンタン酸（ＸＴ９７）
エステルＸＴ９５の加水分解と脱保護をＸＴ９３の場合と同様にして行った。精製していないアミンを、ＸＴ１７の場合と同様にして、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（９２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３８８ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）と反応させた。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から３０％）で精製してＸＴ９７を白色の固体として得た（４３ｍｇ、１６％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.36-12.86 (br s, 1H (TFA)), 12.83-12.26 (br s, 1H), 11.34 (s, 1H), 9.25 (br s, 1H), 9.16 (br s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.60 (br s, 1H), 8.55 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.34-8.25 (m, 2H), 7.91-7.75 (m, 4H), 7.50 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 6.66 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.43-4.33 (m, 2H), 4.19-4.12 (m, 1H), 3.29-3.15 (m, 8H) 2.23-2.06 (m, 2H), 2.01-1.71 (m, 3H), 1.69-1.41 (m, 6H), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.23-1.12 (m, 2H), 0.85 (dd, J = 16.1, 6.7 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C43H53N12O9S+ [M+H]+ 計算値 913.38、実測値 913.83。
(2S,2'S)-5,5'-((5,5'-(((14S,14'S,17S,17'S)-1,1'-(((((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)ペンタジノイル)ビス(アザンジイル))ビス(メチレン))ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(14-イソプロピル-17-メチル-12,15-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,16-ジアザオクタデカン-18-ノイル))ビス(アザンジイル))ビス(チオフェン-5,2-ジイル-2-カルボニル))ビス(アザンジイル))ビス(2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸）（ＸＴ１００）の製造
(S)-5-(5-((14S,17S)-1-アジド-14-イソプロピル-17-メチル-12,15-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,16-ジアザオクタデカン-18-アミド)チオフェン-2-カルボキサミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ９８）
ジペプチドＸＴ９５（２５０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。得られた溶液を、徐々に室温に温めながら１５分間撹拌した。次いで、反応混合物をＤＣＭで希釈し、濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させた。残留物をエーテル（４ｍＬ）中に懸濁させ、ろ過し、エーテルで洗浄し、風乾して中間体アミンをＴＦＡ塩として得た。次に、アミンをＤＭＦに溶解し、3-(2-(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)プロパン酸（７４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃に冷却し、ＨＡＴＵ（１３７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．３１ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。続けて反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアジドＸＴ９８を黄色のガラス状物として得た（定量）。
MS (ESI+) C43H59N14O10S+ [M+H]+ 計算値 963.43、実測値 963.56。
(S)-5-(5-((14S,17S)-1-アジド-14-イソプロピル-17-メチル-12,15-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,16-ジアザオクタデカン-18-アミド)チオフェン-2-カルボキサミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＴ９９）
エステルＸＴ９８（２９０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をＸＴ９３の場合と同様にＬｉＯＨで加水分解した（ＴＨＡによるＢｏｃの脱保護工程は省略）。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から３０％）で精製してＸＴ９９を白色の固体として得た（２７ｍｇ、９％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.08-12.39 (m, 2H (TFA)), 11.33 (s, 1H), 9.21 (br s, 1H), 9.12 (br s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.55 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.52 (br s, 1H), 8.31 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 8.28 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.43-4.34 (m, 2H), 4.23-4.17 (m, 1H), 3.63-4.45 (m, 14H), 3.27-3.14 (m, 6H), 2.49-2.35 (m, 2H), 2.01-1.70 (m, 3H), 1.68-1.51 (m, 2H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 15.9, 6.7 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C42H57N14O10S+ [M+H]+ 計算値 949.41、実測値 949.88。
(2S,2'S)-5,5'-((5,5'-(((14S,14'S,17S,17'S)-1,1'-(((((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)ペンタジノイル)ビス(アザンジイル))ビス(メチレン))ビス(1H-1,2,3-トリアゾール-4,1-ジイル))ビス(14-イソプロピル-17-メチル-12,15-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-13,16-ジアザオクタデカン-18-ノイル))ビス(アザンジイル))ビス(チオフェン-5,2-ジイル-2-カルボニル))ビス(アザンジイル))ビス(2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸）（ＸＴ１００）
ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中のＸＴ９９（２２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）とＸＳ２（３．１ｍｇ、７．５μｍｏｌ）の溶液を、Ｎ２で５分間パージした。次いで、水（６０μＬ）中の硫酸銅（ＩＩ）（１．４４ｍｇ、５．８μｍｏｌ）と水（６０μＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（２．２２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から３０％）で精製してＸＴ１００を得た（１２．１ｍｇ、７０％）。
MS (ESI+) C105H140N32O25S2 2+ [M+2H]2+ 1156.5、実測値 [M+2H]2+ 1157.10。
(S)-5-アミノ-2-(N-(4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-ブチル)-スルファモイル)安息香酸（ＸＴ１０１）の製造
(S)-2-(N-(4-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)スルファモイル)-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＪ２２）
2-(クロロスルホニル)-5-ニトロ安息香酸メチル（０．２５ｇ、０．８９４ｍｍｏｌ）とアミンＸＴ４８（０．４１６ｇ、０．７７０ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（０．３３ｍＬ、１．９２ｍｍｏｌ）の存在下、ＤＭＦ（５ｍＬ）中、室温で０．５時間、反応させた。反応混合物の濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ １：０から９５：５）で精製してスルホンアミドＸＪ２２を黄色の固体として得た（０．１５９ｇ、２９％）。
MS (ESI+) C29H31N10O10S+ [M+H]+ 計算値 711.7、実測値 711.6。
(S)-5-アミノ-2-(N-(4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)-スルファモイル)安息香酸（ＸＴ１０１）
アニリンＸＴ１０１は、スルホンアミドＸＪ２２（１６０ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）から、ＸＲ２２の製造と同様に製造した。亜鉛粉末（４４２ｍｇ、６．７５ｍｍｏｌ）と飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（０．３７５ｍＬ）を使用してＤＭＦ（１．５ｍＬ）中で還元を行い、ＬｉＯＨ（５４ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を使用してＴＨＦ（２．５ｍＬ）と水（２．５ｍＬ）中で加水分解した。粗生成物の一部を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から３５％）で精製してＸＴ１０１を得た（１３ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.46 (br s, 1H), 9.22 (br s, 1H), 9.18 (br s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.59-8.32 (m, 1H), 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.64-7.42 (m, 1H), 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.88 (br s, 1H), 6.78-6.71 (m, 3H), 6.64 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.59-6.38 (m, 1H), 6.46 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 6.13 (br s, 2H), 4.61 (s, 2H), 4.30-4.21 (m, 1H), 2.82-2.70 (m, 2H), 1.85-1.62 (m, 2H), 1.48-1.40 (m, 2H)。
MS (ESI+) C26H29N10O7S+ [M+H]+ 計算値 625.19、実測値 625.32。
(S)-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-メトキシ-5-オキソペンタン-1-アミニウム トリフルオロ酢酸塩（ＸＸ２９）の製造
(E)-4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)ビニル)安息香酸（ＸＴ１０３）
冷却した（０℃）ＤＭＡ（１２０ｍＬ）中のＰＰｈ３（３１．５ｇ、１２０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で、臭素（６．１７ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下の完了後、ＸＴ１０２（７ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を氷冷溶液に一度に加えた（遊離塩基ＸＴ１０２は、ＸＸ９で説明のとおりに製造）。得られた混合物を０℃で１時間、室温で９０分間撹拌した。エタノール（２．４ｍＬ）を滴下し、混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、溶液を激しく撹拌しているトルエン（３８０ｍＬ）に注いだ。ろ過した後、固体を、細かい懸濁液が形成されるまでエーテル（４００ｍＬ）中で撹拌した。懸濁液をろ過し、残留物を一晩風乾した。得られた薄褐色の粉末を窒素雰囲気下でＤＭＡ（５００ｍＬ）に再溶解し、ＰＰｈ３（９．５５ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。得られた混合物を６５℃で７５分間加熱し、０℃に冷却し、ＫＯｔＢｕ（１８．４ｇ、１６４ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で１０分間撹拌した後、4-ホルミル安息香酸メチル（５．９８ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４５分間撹拌し、その時点で追加のＫＯｔＢｕ（１２．３ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、反応混合物を冷浴中で冷却し、ＡｃＯＨ（２５ｍＬ、４３７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間撹拌した。次いでこの溶液を氷冷水（２．１Ｌ）に注いだ。得られた懸濁液をろ過し、続けて残留物をＭｅＣＮ（２×１８０ｍＬ）、トルエン（２×１８０ｍＬ）及びエーテル（２×１８０ｍＬ）で洗浄し、風乾してカルボン酸ＸＴ１０３を黄色の固体として得た（１０．４ｇ、９３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.96 (br s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.14 (br s, 1H), 8.10 (br s, 1H), 8.03-7.95 (m, 3H), 7.76 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.02 (br s, 2H)。
MS (ESI+) C15H13N6O2 + [M+H]+ 計算値 309.11、実測値 309.21。
(S,E)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)ビニル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ１０４）
酸ＸＴ１０３（９．２ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）とＨ－Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅ（９．３ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）を、１０当量のＤＩＰＥＡを使用し、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。精製していない反応混合物を水（２．４Ｌ）に注ぎ、１５分間撹拌し、次いでろ過した。得られた固体の残留物をエーテル（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、２日間風乾してエステルＸＴ１０４を黄色の固体として得た（１．８ｇ、８３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.87 (s, 1H), 8.74 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.97-7.90 (m, 3H), 7.88-7.77 (m, 2H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 6.85-6.69 (m, 3H), 4.48-4.38 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.00-2.89 (m, 2H), 1.88-1.69 (m, 2H), 1.57-1.43 (m, 2H), 1.37 (s, 9H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.2, 166.6, 163.4, 163.3, 156.0, 155.5, 150.6, 143.2, 104.1, 133.5, 131.6, 128.6, 127.1, 126.5, 122.6, 77.9, 53.0, 52.3, 39.7, 28.7, 28.3, 26.7。
MS (ESI+) C26H33N8O5 + [M+H]+ 計算値 537.26、実測値 537.67。
(S)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＴ１０５）
ＡｃＯＨ（４５０ｍＬ）中のＸＴ１０４（１１．２ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）の溶液が入った窒素ガスでパージしたフラスコに、Ｐｄ／Ｃ（５ｇ、活性炭上に１０％）を加えた。水素ガスを加え、混合物を水素雰囲気下、室温で撹拌した。追加の３回のＰｄ／Ｃ（２．５ｇ）を、３時間間隔で加えた。２４時間後、フラスコをＮ２でパージし、次いで反応混合物をCelite（登録商標）でろ過した。ＭｎＯ２（１８．２ｇ、２０９ｍｍｏｌ）をろ液に加え、懸濁液を３０分間撹拌した。Celite（登録商標）でろ過した後、ろ液を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１５：８５）で精製してＸＴ１０５を砂色の固体として得た（６．９ｇ、６１％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.61 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.59 (br s, 2H), 7.35 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.54 (br s, 2H), 4.43-4.33 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.19-3.09 (m, 4H), 2.97-2.88 (m, 2H), 1.86-1.67 (m, 2H), 1.55-1.39 (m, 2H), 1.36 (s, 9H)。
MS (ESI+) C26H35N8O5 + [M+H]+ 539.27、実測値 539.62。
(S)-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-メトキシ-5-オキソペンタン-1-アミニウム トリフルオロ酢酸塩（ＸＸ２９）
化合物ＸＴ１０５（１．１０ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に懸濁させ、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を室温で加えた。室温で２０分間撹拌した後、混合物を濃縮した。残留物の溶媒をｉＰｒＯＨ（２×）と共に蒸発させ、続けて、ｉＰｒＯＨ（１０ｍＬ）中に懸濁させた。懸濁液をエーテル（６０ｍＬ）で希釈し、固体をろ別し、真空中で乾燥してＴＦＡ塩ＸＸ２９を黄色の固体として得た（１．０３ｇ、８８％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 9.24 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.54 (br s, 1H), 8.23 (br s, 1H), 7.82 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.78 (br s, 3H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.46 (ddd, J = 9.5, 7.7, 5.1 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.28-3.19 (m, 4H), 2.85-2.77 (m, 2H), 1.96-1.74 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 2H)。
MS (ESI+) C21H27N8O3 + [M+H]+ 439.22、実測値 439.56。
(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル)グリシルグリシル-L-フェニルアラニン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル（ＸＸ３０）の製造
ＤＣＣ（４５９ｍｇ、２．２２２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＸＴ５３（１．０５ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）と1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン（２５６ｍｇ、２．２２２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温で加えた。３．５時間撹拌した後、混合物をろ過し、ＤＣＭを使用して残留物を徹底的に洗浄した。ろ液をＥｔＯＡｃで希釈し、次いで濃縮した。白色の固体を少量のＥｔＯＡｃ中に懸濁させ、次いでろ過してＯＳｕ－エステルＸＸ３０を白色の固体として得た（６１２ｍｇ、４８％）。
MS (ESI+) C27H32N5O9 + [M+H]+ 570.22、実測値 570.43。
5-((S)-5-ベンジル-18-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザオクタデカンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)ベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＸＸ１９）の製造
2-(クロロスルホニル)-4-ニトロ安息香酸メチル（ＸＸ１４）
ＥｔＯＡｃ（２１ｍＬ）及び濃ＨＣｌ（２２ｍＬ）中のアニリンＸＸ１３（２．４７ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）に、ＮａＮＯ２（０．９１２ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）水溶液（５．７ｍＬ）を０℃で滴下した。０℃で３０分間撹拌した後、塩化銅（ＩＩ）二水和物（０．９６６ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）、ＮａＨＳＯ３（１３．１ｇ、１２６ｍｍｏｌ）、ＡｃＯＨ（１６ｍＬ）及び濃ＨＣｌ（５．７ｍＬ）の懸濁液を加え、反応物を室温で３０分撹拌した。反応混合物を氷上に注ぎ、沈殿した塩化スルホニルをろ別し、水で洗浄した。固体を真空中で乾燥してＸＸ１４を黄色の固体として得た（２．５８ｇ、７３％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.99 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.64-8.62 (dd, J = 8.3 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.05 (s, 3H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 164.6, 148.7, 142.9, 137.3, 131.6, 129.5, 124.5, 54.0。
2-(イソブトキシスルホニル)-4-ニトロ安息香酸（ＸＸ１５）
塩化スルホニルＸＸ１４（０．９７１ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、黄色の溶液を０℃に冷却した。イソブタノール（１．６１ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（０．７２６ｍＬ、５．２１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を０℃で１時間撹拌した。溶液を濃縮し、ＥｔＯＡｃに再溶解し、ＫＨＳＯ４（０．５Ｍ、２×）、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＤＣＭ １：０から０：１）で精製して生成物ＸＸ１５を薄黄色の油状物として得た（９１１ｍｇ、８３％）。この材料の一部（７９１ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）をジオキサン（２５ｍＬ）と水（１６ｍＬ）に溶解した。ＬｉＯＨ（２Ｍ、４．９９ｍＬ、９．９７ｍｍｏｌ）を室温で加えた。２０分後、反応物を水で希釈し、１Ｍの塩酸でｐＨを３にした。ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、酸ＸＸ１５を黄色の油状物として得た（７５６ｍｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.89 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.55 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 8.0 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.05 (sept, J = 6.7 Hz, 1H), 0.96 (d, J = 6.7 Hz, 6H)。
MS (ESI-) C11H12NO7S- [M-H]- 302.03、実測値 302.35。
4-アミノ-2-(イソブトキシスルホニル)安息香酸（ＸＸ１６）
パラジウム（４２ｍｇ、活性炭上に１０％）を、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中の酸ＸＸ１５（１０４ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）に、窒素雰囲気下、室温で加えた。次いで、混合物を水素雰囲気下で３０分間撹拌した。フラスコをＮ２でパージし、混合物をCelite（登録商標）でろ過した。次いで濃縮し、アニリンＸＸ１６を白色の固体として得た（８３ｍｇ、８９％）。
MS (ESI-) C11H14NO5S- [M-H]- 272.06、実測値 272.34。
(S)-5-(4-アミノ-2-(イソブトキシスルホニル)ベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ１７）
酸ＸＸ１６（８３ｍｇ、０．３０４ｍｍｏｌ）とＨＡＴＵ（１２１ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ）及びアミンＸＴ４８（１５３ｍｇ、０．３０４ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。反応混合物の濃縮後、残留物の溶媒をＭｅＣＮ（２×）と共に蒸発させ、ＭｅＣＮ中に再懸濁させ、ろ過した。固体をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ １：０から４：１）で精製してアニリンＸＸ１７を黄色の固体として得た（１３６ｍｇ、６２％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.80 (s, 1H), 8.70 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.03 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.74 (br s, 1H), 7.59 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.43 (br s, 1H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.80 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 6.70 (br s, 2H), 5.88 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.44-4.37 (m, 1H), 3.83 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.19-3.13 (m, 2H), 1.93-1.75 (m, 3H), 1.65-1.48 (m, 2H), 0.80 (d, 6.7 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C32H39N10O8S+ [M+H]+ 計算値 723.27、実測値 723.45。
(S)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-(2-(イソブトキシスルホニル)-4-(2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)アセトアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ１８）
ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中の精製していないＸＴ４９（２０５ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）のストック溶液を窒素雰囲気下で製造した。別のバイアル中で、アニリンＸＸ１７（１３０ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０９４ｍＬ、０．５４０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。ストック溶液の一部（２８５μＬ）を前記アニリンに室温で加えた。５分後、残りの部分（２８５μＬ）を加え、５分間撹拌を続けた。反応物を濃縮し、シリカゲルにドライロードした。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ １：０から４：１）で精製してアミドＸＸ１８を得た（１０６ｍｇ、６７％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.67 (s, 1H), 9.83 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.34 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.87 (dd, J = 8.6, 6.6 Hz, 1H), 7.64 (br s, 1H), 7.59 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.33 (br s, 1H), 6.61 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.45-4.38 (m, 1H), 4.06 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.87 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.20 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 1.94-1.75 (m, 3H), 1.66-1.545 (m, 2H), 0.79 (d, J = 6.6 Hz, 6H)。
MS (ESI+) C36H41F3N11O10S+ [M+H]+ 計算値 876.27、実測値 876.21。
5-((S)-5-ベンジル-18-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザオクタデカンアミド)-2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)ベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＸＸ１９）
エステルＸＸ１８（７９．２ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＣに以下の変更を加えて加水分解した：i) 反応物を室温に加温せず、０℃に保つ、ii) ＮａＯＨを２０分間隔で２回に分けて添加、iii) ＭｅＯＨ及びエーテルによる固体の洗浄は省略。固体を真空で一晩乾燥し、精製していない酸を得た（６８ｍｇ）。次いで、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の活性化エステルＸＸ３０（５２．５ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を、黄色の固体に室温で加え、続いてＤＩＰＥＡ（０．０９７ｍＬ、０．５５３ｍｍｏｌ）を加えた。２０分間撹拌した後、追加のＸＸ３０（１０．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌を２分間続け、その時点で反応物を濃縮した。残留物をＭｅＣＮ（５ｍＬ）中に懸濁させ、１時間撹拌した。懸濁液をろ過し、固体をＭｅＣＮ及びエーテルで洗浄した。黄色の固体（１０７ｍｇ）をアセトン（１１ｍＬ）中に懸濁させ、ＮａＩ（２０７ｍｇ、１．３８４ｍｍｏｌ）を加えた。バイアルに栓をして、６０℃で９０分間加熱した。室温に冷却した後、懸濁液をろ過し、固体をアセトン（１ｍＬ）で洗浄した。粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製してＸＸ１９を黄色の固体として得た（４．８ｍｇ）。
MS (ESI+) C51H58N15O14S+ [M+H]+ 計算値 1136.40、実測値 1136.95。
(S)-5-(4-アミノ-2-スルホベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ３７）の製造
(S)-5-(4-アミノ-2-(イソブトキシスルホニル)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)-ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ３６）
精製していないエステルＸＸ１７（１２８ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＣに従い加水分解して、ＸＸ３６を黄色の固体として得た。
MS (ESI+) C30H37N10O7S+ [M+H]+ 計算値 681.26、実測値 681.46。
(S)-5-(4-アミノ-2-スルホベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ３７）
アセトン（６ｍＬ）中のアルキルスルホン酸ＸＸ３６（３５．７ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（１１８ｍｇ、０．７８７ｍｍｏｌ）を密封バイアルに入れ、６０℃で８時間加熱した。反応物を濃縮し、粗生成物の一部を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から２０％）で精製して、ＸＸ３７を黄色の固体として得た（４．０ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.24 (br s, 1H), 9.28 (s, 1H), 9.22 (s, 1H), 9.20 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.55 (br s, 1H), 8.07 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.50 (br s, 1H), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.80 (br s, 1H), 6.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.46 (dd, J = 8.3, 2.2 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.17-4.12 (m, 1H), 3.22-3.06 (m, 2H), 1.97-1.84 (m, 1H), 1.78-1.70 (m, 1H), 1.59-1.42 (m, 2H)。
MS (ESI+) C26H29N10O7S+ [M+H]+ 計算値 625.19、実測値 625.20。
(S)-5-(4-アミノ-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ３５）の製造
4-アミノ-2-(2H-トリアゾール-5-イル)安息香酸（ＸＸ２１）
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の4-アミノ-2-シアノ安息香酸（ＸＸ２０；２５０ｍｇ、１．５４２ｍｍｏｌ）とＮａＮ３（２０３ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気の密封バイアルに入れ、１１０℃で１６時間加熱した。室温に冷却した後、溶液をろ過し、ろ液を次の工程で直接使用した。
MS (ESI+) C8H8N5O2 + [M+H]+ 計算値 206.07、実測値 206.22。
(S)-5-(4-アミノ-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ３４）
ＸＸ２１（ＤＭＦ中の未精製のろ液０．５ｍＬ）のアリコートを、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中のＸＴ４８（１００ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．１９４ｍＬ、１．１１０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。ＨＡＴＵ（７０．４ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を室温で加え、得られた混合物を３０分間撹拌した。追加のＸＴ４８（２０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１４．０７ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を加え、１５分後に反応物を濃縮し、ＭｅＣＮ（６ｍＬ）中に懸濁させた。４５分間撹拌した後、懸濁液をろ過し、固体をＭｅＣＮとエーテルで洗浄し、精製していないＸＸ３４をクリーム状の固体として得た（１２６ｍｇ）。
MS (ESI+) C29H31N14O5 + [M+H]+ 計算値 655.26、実測値 655.42。
(S)-5-(4-アミノ-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ３５）
精製していないエステルＸＸ３４（５８ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＣに従い加水分解した。粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 １０％から２５％）で精製してＸＸ３５を黄色の固体として得た（１４．８ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.40 (br s, 1H), 9.24 (br s, 1H), 9.20 (br s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.50 (br s, 1H), 8.11-8.06 (m, 2H), 7.69-7.62 (m, 3H), 7.40-7.36 (m, 1H), 6.84 (br s, 1H), 6.67 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.65-6.62 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.28-4.22 (m, 1H), 3.04 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.80-1.60 (m, 2H), 1.53-1.36 (m, 2H)。
MS (ESI+) C27H29N14O4 + [M+H]+ 計算値 613.25、実測値 613.34。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ２３）の製造
(S)-5-(4-((S)-2-アミノプロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ２２）
ＤＭＦ（１．８ｍＬ）中の精製していないＸＸ３４（２４５ｍｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（１７５ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２１３ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．３９２ｍＬ、２．２５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、室温で加えた。３０分後、追加のＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（２３．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（２８．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌を続けた。反応物を濃縮し、ＭｅＣＮ（６ｍＬ）中に懸濁させ、室温で４５分間撹拌した。ろ過した後、黄色の固体（３５５ｍｇ）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．５９３ｍＬ、５．９９ｍｍｏｌ）を室温で加えた。５分間撹拌した後、反応物を濃縮し、エーテル（１０ｍＬ）中に懸濁させ、室温で１時間撹拌した。固体をろ別し、エーテルで洗浄し、真空中で乾燥して精製していないアミンＸＸ２２を薄黄色の固体として得た（２７０ｍｇ）。
MS (ESI+) C32H36N15O6 + [M+H]+ 計算値 726.30、実測値 726.27。
(S)-5-(4-((S)-2-アミノプロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ３１）
精製していないアミンＸＸ２２の一部（１６９ｍｇ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（７２．１ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０７３ｍＬ、０．４１７ｍｍｏｌ）を室温で加えた。２時間後、追加のＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（１０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．１４６ｍｍｏｌ）を室温で加え、混合物を一晩撹拌した。濃縮後、残留物をＭｅＣＮ（２７５ｍＬ）中に懸濁させ、加熱還流した。懸濁液を熱ろ過し、次いで室温に冷却した。溶液を約１５ｍＬまで濃縮し、次いでろ過し、精製していないジペプチドをクリーム色の固体として得た（５９ｍｇ）。固体をＤＣＭ（２ｍＬ）中に懸濁させ、ＴＦＡ（２ｍＬ）を室温で加えた。１０分間撹拌した後、反応物を濃縮し、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 １０％から２５％）で精製した。ＭｅＣＮを生成物画分からロータリーエバポレーターで除去し、水相を凍結乾燥してアミンＸＸ３１を白色の固体として得た（２２．２ｍｇ）。
MS (ESI+) C37H45N16O7 + [M+H]+ 計算値 825.37、実測値 825.50。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(2H-トリアゾール-5-イル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ２３）
アミンＸＸ３１（２２．２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．６ｍＬ）／水（０．１５ｍＬ）に溶解した。水酸化リチウム水和物（６．１９ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を室温で加え、混合物を９０分間撹拌した。０℃に冷却後、ＡｃＯＨ（０．０１４ｍＬ、０．２５３ｍｍｏｌ）、続いてトルエン（５ｍＬ）を加え、混合物を濃縮した。残留物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に再溶解し、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（６．８ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０１５ｍＬ、０．０８４ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を室温で９０分間撹拌し、次いで、濃縮した。残留物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０から５０％）で精製した。ＭｅＣＮを生成物画分からロータリーエバポレーターで除去し、水相を凍結乾燥してトリアゾールＸＸ２３を黄色の固体として得た（９．９ｍｇ）。
MS (ESI+) C45H54N17O9 + [M+H]+ 計算値 976.43、実測値 976.48。
(S)-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ４１）の製造
5-アミノ-2-((トリメチルシリル)エチニル)ベンゾニトリル（ＸＸ３９）
ＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中のヨウ化物ＸＸ３８（５．１３ｇ、１８．７ｍｍｏｌ、Ozaki et al, Tetrahedron, 2017, 73, 7177-7184に従い製造）の懸濁液に、ＳｎＣｌ２二水和物（２１．１ｇ、９３．５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、室温で加えた。２０分後、懸濁液は暗橙赤色の溶液に変化した。フラスコを室温の水浴で冷却して、経時的に発生する熱の一部を奪った。２時間撹拌した後、新たに懸濁液が形成された。次いで反応物を冷却した（０℃）ＮａＯＨ（１５．０ｇ）水溶液（１２０ｍＬ）に注いだ。混合物を５分間撹拌し、次いで、ろ過した。固体を冷ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ）及び水で洗浄した。真空で乾燥後、アニリン（３．９４ｇ、８６％）を薄黄色の固体として得た。
アニリン（３．９４ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの三口フラスコに入れ、ＣｕＩ（６１．５ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ）とＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（２２７ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコをＮ２でパージし、Ｅｔ３Ｎ（１７．７ｍＬ、１２７ｍｍｏｌ）、エチニルトリメチルシラン（２．４５７ｍＬ、１７．７６ｍｍｏｌ）を室温で加え、懸濁液を４時間激しく撹拌した。この間、懸濁液はゆっくりと溶解した。次いで、反応物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＤＣＭ １：０から０：１）で精製した。生成物画分を濃縮すると、白色の薄片が沈殿した。追加のヘプタン（３０ｍＬ）をこの時点で加え、懸濁液を約３５ｍＬに濃縮した。固体をろ別し、真空中で乾燥してアルキンＸＸ３９をオフホワイト色の薄片として得た（３．０６ｇ、７６％、２工程）。
MS (ESI+) C12H15N2Si+ [M+H]+ 計算値 215.10、実測値 215.15。
5-アミノ-2-エチニルベンゾニトリル（ＸＸ４０）
ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中のＸＸ３９（２．４５ｇ、１１．４３ｍｍｏｌ）溶液をＫ２ＣＯ３（３．１６ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）により１５分間、室温で処理した。反応物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ及び水に溶解した。層を分離させ、水相をＥｔＯＡｃ（１×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、アルキンＸＸ４０をクリーム色の固体として得た（１．６４ｇ、定量）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.5, 2.5 Hz, 1H), 4.04 (br s, 2H), 3.30 ppm (s, 1H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 147.0, 134.2, 118.4, 117.7, 117.5, 116.8, 114.9, 80.9, 80.2。
MS (ESI+) C9H7N2 + [M+H]+ 計算値 143.06、実測値 143.05。
(S)-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ４１）
ＤＭＦ（１．７ｍＬ）中のアルキンＸＸ４０（２９．７ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）とアジドＸＳ２１（９４ｍｇ、０．２０９ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ２で５分間パージした。水（１．１ｍＬ）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（３９．１ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）と水（１．１ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（６２．０ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）を順次加え、得られた混合物を室温で４０時間撹拌した。追加のＤＭＦ（１ｍＬ）、続いて水（０．５ｍＬ）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１９．５４ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）を加え、水（０．５ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（３１．０ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で更に３日間撹拌した。次いで反応物を水（２５ｍＬ）に注ぎ、ＡｃＯＨ水溶液（１Ｍ、１ｍＬ）を加えた。混合物をヒートガンで加熱して細かい懸濁液を破壊した。室温に冷却した後、懸濁液をろ過し、固体をＭｅＣＮ（１ｍＬ）で洗浄した。固体の一部をＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 １０％から３５％）で精製して酸ＸＸ４１を黄色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.53 (br s, 1H), 9.09 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.50 (d, J = 7.8 H, 1H), 8.40 (br s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.59 (br s, 1H), 7.28 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.87 (s, 1H), 6.86 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 4.39 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.38-4.32 (m, 1H), 3.20-3.11 (m, 4H), 1.96-1.83 (m, 2H), 1.80-1.66 (m, 2H)。
MS (ESI+) C29H29N12O3 + [M+H]+ 計算値 593.25、実測値 593.49。
(S)-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ４７）の製造
(S)-5-アジド-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)ペンタン酸メチル（ＸＸ４３）
ＳＯＣｌ２（１．７３ｍＬ、２３．９ｍｍｏｌ）を、アジドＸＲ１９（３．４９ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（５０ｍＬ）に０℃で加えた。溶液を、６０℃で１５分間加熱した。室温に冷却した後、混合物を濃縮し、残留物の溶媒をトルエン（２×）と共に蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ １：０から２：１）で精製してメチルエステルＸＸ４３を無色の油状物として得た（３．５２ｇ、９６％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.39-7.29 (m, 5H), 5.32 (br d, J = 7.3 Hz, 1 H), 5.11 (s, 2H), 4.45-4.37 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.35-3.27 (m, 2H), 2.00-1.90 (m, 1H), 1.78-1.54 (m, 3H)。
MS (ESI+) C14H19N4O4 + [M+H]+ 計算値 307.14、実測値 307.21。
(S)-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(((ベンジルオキシ）カルボニル)アミノ)-ペンタン酸メチル（ＸＸ４４）
水（５２ｍＬ）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１．０５ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２８０ｍＬ）中のアジドＸＸ４３（１．７０ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）及びアルケンＸＸ４０（０．７８９ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。溶液をＮ２で２０分間パージし、次いで、水（５２ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（１．６４９ｇ、８．３２ｍｍｏｌ）を室温で加えた。３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（４０．０ｍＬ）を加え、室温で８８時間撹拌を続けた。水／ブライン（１：１、２２０ｍＬ）混合物を加え、次いで、生成物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：１、２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ １：０から０：１）で精製してトリアゾールＸＸ４４を黄色の粘着性の油状物として得た（２．０９ｇ、８４％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.18 (s, 1H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.38-7.28 (m, 5H), 6.98-6.93 (m, 2H), 5.40 (br d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.47-4.40 (m, 3H), 3.98 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.10-1.89 (m, 3H), 1.76-1.66 (m, 1H)。
MS (ESI+) C23H25N6O4 + [M+H]+ 計算値 449.19、実測値 449.31。
(S)-2-アミノ-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)ペンタン酸メチル（ＸＸ４５）
トリアゾールＸＸ４４（１．１２ｇ、２．４９７ｍｍｏｌ）とＰｄ／Ｃ（活性炭上に１０％のパラジウム、０．１３３ｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＡｃ（２２ｍＬ）中、水素雰囲気下、室温で反応させた。１６時間後、フラスコをＮ２でパージし、追加のＰｄ／Ｃ（活性炭上に１０％のパラジウム、０．２００ｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）を室温で加えた。水素ガスを再び加えて、混合物を室温で更に４．５時間撹拌した。フラスコをＮ２でパージし、Celite（登録商標）でろ過した。次いで、ジオキサン中のＨＣｌ（４．０Ｎ、２．０ｍＬ）をろ液に加えた。ろ液の体積をロータリーエバポレーターを使用して約５０ｍＬに減らし、次いで懸濁液をろ過し、固体をＥｔＯＡｃ及びエーテルで洗浄した。白色の固体を真空中で乾燥してアミンＸＸ４５を二塩酸塩として得た（８４９ｍｇ、８８％）。
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) ppm = 8.66 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H), 4.63 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.16 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 2.27-1.91 (m, 4H)。
MS (ESI+) C15H19N6O2 + [M+H]+ 計算値 315.16、実測値 315.25。
(S)-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ４６）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のアミンＸＸ４５の二塩酸塩（４９８ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）とアミンＸＴ４８（３９７ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。濃縮後、粗生成物をＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中、室温で３日間撹拌し、次いでろ過した。固体をＭｅＣＮ及びエーテルで洗浄し、最終的に真空中で乾燥してアミドＸＸ４６を橙色の固体として得た（６８８ｍｇ、９３％）。
MS (ESI+) C30H30N13O4 + [M+H]+ 計算値 636.25、実測値 636.45。
(S)-5-(4-(4-アミノ-2-シアノフェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ４７）
エステルＸＸ４６（３３０ｍｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＣに従い加水分解した。粗生成物の一部をＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 １０％から３０％）で精製して酸ＸＸ４７を黄色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.42 (br s, 1H), 9.22 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.51 (br s, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.15 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.81 (br s, 1H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.84 (br s, 1H), 6.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.39 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.36-4.30 (m, 1H), 1.96-1.81 (m, 2H), 1.79-1.65 (m, 2H)。
MS (ESI+) C28H28N13O3 + [M+H]+ 計算値 594.24、実測値 594.39。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-ヒドロキシベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ２８）の製造
(S)-4-(2-アミノプロパンアミド)-2-(ベンジルオキシ)安息香酸ベンジル（ＸＸ２５）
ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の4-アミノ-2-ヒドロキシ安息香酸（ＸＸ２４；５．００ｇ、３２．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃で、ＫＯｔＢｕ（４．０３ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、ＢｎＢｒ（４．２７ｍＬ、３５．９ｍｍｏｌ）を滴下し、懸濁液を室温で更に４時間撹拌し、反応容器を再び０℃に冷却した。この時点で、追加のＫＯｔＢｕ（４．０３ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）及びＢｎＢｒ（４．２７ｍＬ、３５．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、続けて水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。合わせた有機相をヘプタンで２：１に希釈し、次いで、水（２×）及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、シリカゲルを使用して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の０～６０％ＥｔＯＡｃ）で精製してベンジルエステルを得た（５．３０ｇ）。
この生成物とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌを、ＸＴ１１の場合と同様に反応させた。反応混合物の濃縮後、粗生成物をＥｔＯＡｃに溶解し、水相が酸性になるまでＨＣｌ（０．１Ｍ）で洗浄した。合わせた水相をＥｔＯＡｃで逆抽出し、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、薄黄色の粘着性のガム状物として得た（１１．０８ｇ）。
MS (ESI+) C39H34N2NaO6 [M+Na]+ 649.23、実測値 649.44。
粗生成物をＤＭＦ（１２２ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（４９ｍＬ）を室温で加えた。３分後、反応物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０～２０％ＤＣＭ中のＭｅＯＨ）で精製して、アミンＸＸ２５を得た（４．４５ｇ、３４％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 9.73 (br s , 1H), 7.89 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.41-7.37 (m, 2H), 7.36-7.28 (m, 6H), 6.90 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 3.63 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.65 (br s, 2H), 1.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C24H25N2O4 [M+H]+ 計算値 405.18、実測値 405.29。
2-(ベンジルオキシ)-4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＸ２６）
ＤＩＰＥＡ（４．８１ｍＬ、２７．５ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（３．８１ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のアミンＸＸ２５（４．４５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。混合物を５時間撹拌し、次いで水中に注いだ。混合物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：１、３×）で抽出した。合わせた有機相を水（２×）及びブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の０～１００％ＥｔＯＡｃ）で精製してジペプチドを得た（６．５７ｇ）。
粗生成物をＴＨＦ（３９ｍＬ）／ＭｅＯＨ（８ｍＬ）に溶解し、水（１５．７ｍＬ）中の水酸化リチウム水和物（１．６９ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を１９時間撹拌し、その後、有機物をロータリーエバポレーターで除去した。水（３００ｍＬ）を加え、混合物をろ過し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、固体をエーテル（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。これらの２つのエーテル画分を使用して、別々に水相を洗浄した。水相にＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）を加え、ＨＣｌ（１．０Ｍ、４１ｍＬ）、続いて固体を加えた。混合後、生成物を有機相に溶解した。水相をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、エーテル画分を含む合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。白色の固体が形成され、これを約１：１のＥｔＯＡｃ／ヘプタン（約２０ｍＬ）中に懸濁させ、ろ別して、酸ＸＸ２６を白色の固体として得た（３．７８ｇ、６７％、２工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.35 (br s, 1H), 10.23 (s, 1H), 8.12 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.34-7.30 (m, 1H), 7.23 (dd, J = 8.5, 1.4 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.42 (quint, J = 7.0 Hz, 1H), 3.85 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 2.00-1.90 (m, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C27H36N3O7 [M+H]+ 計算値 514.26、実測値 514.61。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-ヒドロキシベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＸ２７）
酸ＸＸ２６（４２１ｍｇ、０．８２０ｍｍｏｌ）を、ＨＡＴＵ（３７４ｍｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）及びＸＴ４８（４１３ｍｇ、０．８２０ｍｍｏｌ）と、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ １：０から４：１）で精製して黄色の固体を得、これを熱ＭｅＣＮ（６ｍＬ）中に懸濁させた。室温に冷却した後、固体をろ別し、水中で１０分間撹拌した。ろ過及び乾燥後、精製していないベンジルエーテル（２００ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）をＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（活性炭上に２０％、１００ｍｇ）と、ＡｃＯＨ（２．０ｍＬ）中、水素雰囲気下、室温で２時間２０分反応させた。次いで溶液をＮ２でパージし、Celite（登録商標）でろ過した。濃縮後、材料中の溶媒をトルエンと共に蒸発させた。固体をＤＭＦ（１ｍＬ）／ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、ＭｎＯ２（３００ｍｇ）を室温で加えた。３時間撹拌した後、反応物をろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中の０～２０％ＭｅＯＨ）で精製してフェノールＸＸ２７を得た（７９ｍｇ、１１％、２工程）。
MS (ESI+) C41H53N12O10 [M+H]+ 計算値 873.40、実測値 873.90。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-ヒドロキシベンズアミド)ペンタン酸（ＸＸ２８）
フェノールＸＸ２７（７９ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）を一般手順ＸＸＣのとおりＮａＯＨと反応させて、酸（７５ｍｇ）を緑／灰色の固体として得た。材料をＤＣＭ（２．０ｍＬ）中に懸濁させ、ＴＦＡ（２．０ｍＬ）を０℃で加えた。３０分後、反応物を濃縮した。褐色の油状物をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（２９．１ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０６３ｍＬ、０．３６０ｍｍｏｌ）を室温で加えた。追加のＤＩＰＥＡ（０．０３１ｍＬ、０．１８０ｍｍｏｌ）及び6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（５．５５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を、それぞれ、２０分及び９０分後に加え、２時間後に反応を停止した。混合物を濃縮し、残留物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、次いで水溶液を凍結乾燥した。固体を異なる溶出液を使用する分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＯＨ：ＭｅＣＮ（１：１）×０．１％ＴＦＡ、勾配２０％から５０％）で再度精製した。有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、次いで水溶液を凍結乾燥してフェノールＸＸ２８を黄色の固体として得た（３．１ｍｇ）。
MS (ESI+) C44H54N13O10 [M+H]+ 計算値 924.41、実測値 924.91。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＪ４）の製造
(S)-5-(4-アジドベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＪ２）
酸ＸＪ１（５１４ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、米国特許出願公開第2005/0020833号及び米国特許出願公開第2009/0253719号に記載のとおりに合成）を、アミンＸＸ３（５３４ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）と一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してエステルＸＪ２を黄色の固体として得た（４７４ｍｇ、４９％）。
MS (ESI+) C30H32N9O4 + [M+H]+ 計算値 582.25、実測値 582.62。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＪ３）
アジドＸＪ２（４７４ｍｇ、０．８１５ｍｍｏｌ）の還元を、一般手順ＸＸＢによって行い、アニリンＸＪ３を黄色の固体として得た（４５３ｍｇ、定量）。
MS (ESI+) C30H34N7O4 + [M+H]+ 計算値 556.26、実測値 556.62。
(S)-5-(4-アミノベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＪ４）
エステルＸＪ３（４５ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を一般手順ＸＸＣに従い加水分解して、酸ＸＪ４を黄色の固体として得た（９ｍｇ、２０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.40 (br d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.00 (br t, J = 5.4 Hz, 1H), 7,91 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.55 (br s, 2H), 7.43 (br d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.51 (br s, 2H), 5.56 (br s, 2H), 4.35-4.29 (m, 1H), 3.24-3.19 (m, 2H), 3.00-2.93 (m, 4H), 1.88-1.71 (m, 2H), 1.62-1.53 (m, 2H)。
MS (ESI+) C29H32N7O4 + [M+H]+ 計算値 542.24、実測値 542.62。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ペンタン酸（ＸＪ９）の製造
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＪ６）
アニリンＸＪ３（４０５ｍｇ、０．７２９ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌ（４８１ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）をＸＴ１１の場合と同様に反応させて、アミドＸＪ５（定量）を黄色の固体として得た。
MS (ESI+) C48H49N8O7 + [M+H]+ 計算値 849.36、実測値 849.49。
Ｆｍｏｃで保護されたアミンＸＪ５（６１９ｍｇ、０．７２９ｍｍｏｌ）を、ＴＢＡＦ・３Ｈ２Ｏとデカンチオールを使用して脱保護し、続けて、ＸＴ１１からＸＴ１２への変換と同様に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕと反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してテトラブチルアミン塩を含むジペプチドＸＪ６を得た（３１７ｍｇ、５２％）。
MS (ESI+) C43H56N9O8 + [M+H]+ 計算値 826.42、実測値 826.83。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＪ８）
ジペプチドＸＪ６（３１０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１３の場合と同様にして脱保護した。粗生成物（２７２ｍｇ）を一般手順ＸＸＣに従いＮａＯＨで加水分解して、ＸＪ８をオフホワイト色の固体として得た（８４ｍｇ、３２％）。
MS (ESI+) C37H46N9O6 + [M+H]+ 計算値 712.35、実測値 712.80。
(S)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノキナゾリン-6-イル)エチル)ベンズアミド)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ペンタン酸（ＸＪ９）
アミンＸＪ８（７６ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）を、ＸＴ１７の場合と同様に、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（３２．９ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１１２ｍＬ、０．６４ｍｍｏｌ）と反応させた。粗製の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から９５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、ＸＪ９を白色の固体として得た（２１．６ｍｇ、２２％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.36 (br s, 1H), 10.10 (br s, 1H), 8.88 (br s, 1H), 8.75 (br s, 1H), 8.54 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.35 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.82-7.78 (m, 7H), 7.68-7.64 (m, 3H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.31 (br d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.99 (s, 2H), 4.42-4.35 (m, 2H), 4.17 (dd, J = 8.5, 7.0 Hz, 1H), 3.29-3.25 (m, 4H), 3.01 (br s, 4H), 2.22-2.07 (m, 2H), 2.00-1,89 (m, 1H), 1.89-1.74 (m, 2H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.51-1.44 (m, 4H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.22-1.14 (m, 2H), 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C47H57N10O9 + [M+H]+ 計算値 905.42、実測値 905.94。
(S)-5-アミノ)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＪ１１）及び(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-イソプロピル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)ペンタン酸（ＸＪ１３）の製造
(S)-5-アミノ-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＪ１１）
ＮａＯＨ（１２当量）によるホルムアミドＸＴ４７（２７０ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）の加水分解を、一般手順ＸＸＣに従い行った。次いで、生成物（１７８ｍｇ）をＴＦＡを使用してＸＴ１３の場合と同様に脱保護した。粗生成物の一部（４０ｍｇ）を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ５％から３５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥してＸＪ１１を黄色の固体として得た（６．７ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.6 (br s, 1H), 9.19 (br s, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.45 (br s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.90 (br s, 1H),7.78-7.73 (m, 4H), 6.95 (br s, 1H), 6.79 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.65 (s, 2H), 4.44-4.38 (m, 1H), 2.88-2.79 (m, 2H), 1.95-1.88 (m, 2H), 1.84-1.76 (m, 2H), 1.71-1.61 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 174.2, 166.7, 163.3, 151.0, 129.5, 122.0, 121.9, 111.8, 62.4, 52.2, 46.0, 28.1, 25.9, 24.6。
MS (ESI+) C19H24N9O3 + [M+H]+ 計算値 426.19、実測値 426.31。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-イソプロピル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)ペンタン酸（ＸＪ１３）
アミンＸＪ１１（２３４ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）とＸＪ１２（２７１ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ３Ｎ（０．１５０ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ）の存在下、０℃、ＤＭＦ（４ｍＬ）中で、１．５時間反応させ（Elgersma et al, Mol. Pharm. 2015, 12, 1813-35参照）、その間、温度を徐々に室温に到達させた。濃縮後、粗製の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２５％から７５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、ＸＪ１３を黄色の固体として得た（９９ｍｇ、２７％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.1, (br s, 1H), 12.49 (br s, 1H), 10.02 (s, 1H), 9.35 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.63 (br s, 1H), 8.15 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.21-7.17 (m, 2H), 7.02 (s, 2H), 6.75 (m, 3H), 6.00 (br s, 2H), 4.93 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.43-4.39 (m, 1H), 4.34-4.28 (m, 1H), 4.06-3.97 (m, 2H), 3.90-3.87 (m, 1H), 3.57-2.52 (m, 6H), 3.03-2.93 (m, 4H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.83-1.78 (m, 1H), 1.73-1.66 (m, 1H), 1.63-1.34 (m, 5H), 0.86 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C47H60N15O13 + [M+H]+ 計算値 1042.44、実測値 1042.92。
(S)-2-(5-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ペンタンアミド)-N1,N5-ジ(プロパ-2-イン-1-イル)ペンタンジアミド（ＸＳ２）の製造
(S)-(1,5-ジオキソ-1,5-ビス(プロパ-2-イン-1-イルアミノ)ペンタン-2-イル)カルバミン酸tert-ブチル（ＸＳ１）
ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のＢｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ（７６９ｍｇ、３．１１ｍｍｏｌ）及びプロパルギルアミン（４３８μＬ、６．８５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｅｔ３Ｎ（１．７４ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）（１．４９ｇ、７．７８ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。反応混合物を室温にし、一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に溶解し、水（３０ｍＬ）で洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。ＵＰＬＣ-ＭＳでは依然として生成物を有する水相をＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出し、合わせたＤＣＭ相をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ＥｔＯＡｃ抽出工程の粗生成物と合わせて、減圧下で蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してジアルキンＸＳ１を薄黄色の固体として得た（４４０ｍｇ、４４％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.05 (br s, 1H), 6.40 (br s, 1H), 5.67 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.25-4.13 (m, 1H), 4.12-3.99 (m, 4H), 2.45-2.29 (m, 2H), 2.24 (dt, J = 7.5, 2.6 Hz, 2H), 2.16-2.05 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 172.4, 171.4, 79.4, 79.3, 71.7, 53.5, 32.4, 29.3, 29.1, 28.3。
MS (ESI+) C16H24N3O4 + [M+H]+ 計算値 322.18、実測値 322.44。
(S)-2-(5-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ペンタンアミド)-N1,N5-ジ(プロパ-2-イン-1-イル)ペンタンジアミド（ＸＳ２）
ジアルキンＸＳ１（４３０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＴＦＡ（５．０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温にし、１時間撹拌した。反応混合物中の溶媒をトルエン（５．０ｍＬ）及びトルエン：ＤＣＭ（６ｍＬ、５：１）と共に蒸発させ、高真空で乾燥してアミンを赤褐色の油状物として得た。材料をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、次いで、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（４９５ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．４０ｍＬ、８．０３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。１８時間後、反応混合物を濃縮し、溶媒をＤＣＭ：トルエン（１５ｍＬ、２：１）と共に蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してマレイミドＸＳ２を白色の固体として得た（３０７ｍｇ、５５％、２工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.30 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.24 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.96-7.88 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 4.23-4.14 (m, 1H), 3.83 (td, J = 2.8, 2.4 Hz, 4H), 3.41-3.35 (m, 2H), 3.08 (dt, J = 7.1, 2.5 Hz, 2H), 2.16-2.01 (m, 4H), 1.90-1.79 (m, 1H), 1.74-1.62 (m, 1H), 1.48 (quint, J = 7.4 Hz, 4H), 1.27-1.13 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 172.6, 171.7, 171.6, 171.6, 134.9, 81.7, 81.5, 73.4, 73.3, 52.4, 37.5, 35.4, 32.0, 28.4, 28.3, 28.2, 26.3, 25.7, 25.1。
MS (ESI+) C21H27N4O5 + [M+H]+ 計算値 415.20、実測値 415.34。
(S)-5-(2-クロロ-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ６）の製造
(S)-4-(2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-2-クロロ安息香酸メチル（ＸＳ３）
4-アミノ-2-クロロ安息香酸メチル（１．００ｇ、５．３９ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌを、ＸＴ１１の場合と同様に反応させた。クエンチした反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２０ｍＬ）と共に蒸発させた後、混合物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）に部分的に溶解させ、０．１Ｍの塩酸（２×１５ｍＬ）で抽出した。水相をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａＨＣＯ３水溶液（２×１５ｍＬ）及びブライン（２×１５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮してアミドＸＳ３を薄黄色の固体として得た（２．６３ｇ、定量、２工程）。
MS (ESI+) C26H24ClN2O5 + [M+H]+ 計算値 479.14、実測値 479.30。
4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-クロロ安息香酸メチル（ＸＳ４）
カルバメートＸＳ３（２．６３ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）にピペリジン（３９．０ｍＬ、３９５ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を１５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製して脱保護された生成物を薄褐色の油状物として得た（１．１７ｇ、８３％）。材料の一部（１．１５ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した。次いで、ＤＩＰＥＡ（１．９６ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（１．５５ｇ、４．９３ｍｍｏｌ）を室温で加え、得られた溶液を室温で３時間撹拌した。反応混合物を水（２４０ｍＬ）に注ぎ、水相をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（１：１、３×８０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水（１００ｍＬ）及びブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン ０：１から１：１）で精製してアミドＸＳ４をオフホワイト色の固体として得た（１．５１ｇ、７４％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 9.16 (br s, 1H), 7.86-7.80 (m, 2H), 7.73-7.55 (m, 1H), 6.65 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.67 (quint, J = 7.2 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.27-2.17 (m, 1H), 1.49-1.46 (m, 3H), 1.44 (s, 9H), 1.01 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.96 (d, J = 6.9 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 172.1, 170.5, 165.5, 156.5, 142.0, 134.9, 132.6, 124.4, 121.6, 117.2, 81.2, 60.8, 52.2, 49.8, 30.2, 28.3, 24.8, 19.3, 17.7, 17.3。
MS (ESI+) C21H31ClN3O6 + [M+H]+ 計算値 456.19、実測値 456.56。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-クロロベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＳ５）
エステルＸＳ４（０．７５０ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）をジオキサン（１７ｍＬ）と水（１０ｍＬ）中に懸濁させた。ＬｉＯＨ水溶液（２．０Ｍ、３．２９ｍＬ、６．５８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。追加のジオキサン（１０ｍＬ）を加え、１時間撹拌を続けた。水（２５ｍＬ）を加え、反応混合物に１Ｍの塩酸を加えｐＨを３にした。生成物をＥｔＯＡｃ（３×３５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。精製していない酸（０．１２５ｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）とアミンＸＴ４８（０．１４６ｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）を一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してアミドＸＳ５を黄色の粘着性の固体として得た（０．１５９ｇ、６６％、２工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.30 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.74 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.61-8.58 (m, 1H), 8.44-8.36 (m, 1H), 8.36-8.29 (m, 1H), 8.16 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.86-7.76 (m, 1H), 7.74-7.62 (m, 1H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.42-7.34 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.68-6.63 (m, 1H), 5.25-5.18 (m, 2H), 4.46-4.36 (m, 2H), 3.90-3.78 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.27-3.19 (m, 2H), 3.15-3.07 (m, 2H), 1.96-1.78 (m, 2H), 1.68-1.49 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.26 (d, J = 7.1 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C41H52ClN12O9 + [M+H]+ 計算値 891.37、実測値 891.83。
(S)-5-(2-クロロ-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ６）
ＤＭＳＯ（０．１６ｍＬ）及びＭｅＯＨ（０．８０ｍＬ）中のメチルエステルＸＳ５（０．１５９ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＮａＯＨ（２．０Ｍ、０．５３５ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を１０℃で滴下した。反応混合物を室温にし、１５分間撹拌した。追加のＮａＯＨ（２．０Ｍ、０．５３５ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を加え、２時間後、反応混合物をＤＭＳＯ（０．３２ｍＬ）及びＭｅＯＨ（１．６ｍＬ）で希釈した。反応物を２時間撹拌し、最後のＮａＯＨ（２．０Ｍ、０．５３５ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を加え、４時間撹拌した。次いで生成物にＡｃＯＨ（１．０Ｍ、６．０ｍＬ）を加えて沈殿させ、ろ過し、水（２．０ｍＬ）、ＭｅＣＮ（２．０ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２．０ｍＬ）で洗浄した。精製していない材料をＤＣＭ（５．０ｍＬ）中に懸濁させ、混合物を０℃に冷却した。ＴＦＡ（５．０ｍＬ）を滴下し、反応混合物を３０分間撹拌した。反応物を濃縮し、続けて溶媒をトルエン（１０ｍＬ）と共に蒸発させ、精製していないアミンを黄色の油状物として得た。材料をＤＭＦ（６．０ｍＬ）に溶解し、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（５５．１ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１２５ｍＬ、０．７１５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。１５分後、追加のＤＩＰＥＡ（０．１２５ｍＬ、０．７１５ｍｍｏｌ）を加え、続けて２．５時間後に6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（１１．０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を加えた。合計３．５時間反応させた後、反応混合物を濃縮し、続けて溶媒をトルエン（５ｍＬ）と共に蒸発させた。粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥してマレイミドＸＳ６を黄色の固体として得た（２２．３ｍｇ、１３％、３工程）。
MS (ESI+) C44H53ClN13O9 + [M+H]+ 計算値 942.38、実測値 942.90。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)-2-フルオロベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＳ１２）の製造
4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)-2-フルオロ安息香酸（ＸＳ７）
臭素（０．８０４ｍＬ、１５．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡ（１４ｍＬ）中のＰＰｈ３（４．０９ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で１０分間かけて滴下した。３０分間撹拌した後、(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メタノール（１．００ｇ、５．２０ｍｍｏｌ、ＸＸ９で説明のとおりに製造）を加え、得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。最後に、4-アミノ-2-フルオロ安息香酸（１．０７ｇ、６．９０ｍｍｏｌ）及びＢａＯ（１．１１ｇ、６．５０ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を５５℃で２４時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物をＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ、２９：１）中に注ぎ、固体をろ取した。残留物を水（５０ｍＬ）中で撹拌し、ろ過し、熱ＭｅＣＮ（６０ｍＬ）中で撹拌し、室温まで冷却後にろ過して、アニリンＸＳ７（１．３０ｇ、７６％）を茶色の固体として得た。
MS (ESI+) C14H13FN7O2 + [M+H]+ 計算値 330.11、実測値 330.35。
4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-2-フルオロ安息香酸（ＸＳ８）
ギ酸（４８．３ｍＬ、１．２６ｍｏｌ）中の無水酢酸（１１．１ｍＬ、１１８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で４０分間撹拌し、その後、アニリンＸＳ７（１．３０ｇ、３．９４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を還流温度で２．５時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濃縮した。残留物を水（８８ｍＬ）／ＮＨ４ＯＨ水溶液（３５％、１２．６ｍＬ）に溶解し、次いで７０℃で３０分間加熱した。混合物をろ過し、ろ液に酢酸を加えｐＨを約５．５にした。沈殿物をろ取し、続けて水／ＡｃＯＨ（５５ｍＬ、１０：１）中、５０℃で４５分間撹拌した。ろ過した後、固体を水（２×１０ｍＬ）、ＥｔＯＨ（２×５ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２×５ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥してホルムアミドＸＳ８を薄茶色の粉末として得た（０．７８８ｇ、５５％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.90 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 7.86 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.72 (br s, 1H), 7.55 (dd, J = 12.6, 2.0 Hz, 1H), 7.47-7.36 (m, 2H), 6.75 (br s, 2H), 5.23 (s, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 165.1, 163.2, 163.1, 160.8, 155.3, 150.0, 146.8, 143.8, 133.3, 121.6, 117.3, 116.3, 110.2, 109.9, 46.5。
MS (ESI+) C15H13FN7O3 + [M+H]+ 計算値 358.11、実測値 358.38。
(S)-5-(5-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-2-フルオロベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＳ９）
酸ＸＳ８（７６０ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）とアミンＸＴ６（８７１ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：３）で精製してアミドＸＳ９を黄色の固体として得た（４０６ｍｇ、３０％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.83 (s, 1H), 8.69 (br s, 1H), 8.59 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.72 (br s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.57-7.53 (m, 1H), 7.46 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 8.4, 1.8Hz, 1H), 6.91 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 2H), 6.70 (br s, 1H), 6.45 (br s, 2H), 5.23 (s, 2H), 4.44-4.37 (m, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.50 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.80-1.68 (m, 2H), 1.66-1.57 (m, 2H)。
MS (ESI+) C29H28FN10O6 + [M+H]+ 計算値 631.22、実測値 631.66。
(S)-5-(5-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-2-フルオロベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＳ１０）
アニリンＸＳ９（３１５ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－Ｃｌを、ＸＴ１１の場合と同様に反応させた。クエンチした反応混合物を濃縮し、溶媒をＭｅＯＨ：トルエン（３０ｍＬ、１：２）と共に蒸発させた後、材料をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してアミドＸＳ１０を黄色の固体として得た（０．３５２ｇ、７６％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 10.68 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.59 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.93-7.88 (m, 3H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.74 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.70-7.64 (m, 1H), 7.60-7.57 (m, 1H), 7.56-7.53 (m, 1H), 7.45-7.37 (m, 4H), 7.37-7.31 (m, 2H), 6.67 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.46-4.37 (m, 1H), 4.34-4.27 (m, 3H), 4.23 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.59-3.54 (m, 2H), 1.83-1.72 (m, 2H), 1.72-1.61 (m, J = 8.5 Hz, 2H), 1.35 (d, J = 7.1 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C47H43FN11O9 + [M+H]+ 計算値 924.32、実測値 924.86。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)-2-フルオロベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＳ１１）
Ｆｍｏｃで保護されたアミンＸＳ１０（０．１５０ｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）をＴＢＡＦ・３Ｈ２Ｏとデカンチオールを使用して脱保護し、続けて、ＸＴ１１からＸＴ１２への変換と同様に、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕと反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製してアミドＸＳ１１を黄色のフィルム状物として得た（８５ｍｇ、４６％、２工程）。
MS (ESI+) C42H50FN12O10 + [M+H]+ 計算値 901.38、実測値 901.90。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)-2-フルオロベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＳ１２）
ＤＣＭ（３．０ｍＬ）中のカルバメートＸＳ１１（８５ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＴＦＡ（３．０ｍＬ）を０℃で滴下した。反応混合物を室温にし、１時間撹拌した。溶液を濃縮し、溶媒をＤＣＭ：トルエン（７ｍＬ、２：５）及びトルエン（５ｍＬ）と共に蒸発させ、精製していないアミンを暗黄色のフィルム状物として得た。材料をＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ（０．６０ｍＬ、５：１）に溶解し、ＮａＯＨ水溶液（２．０Ｍ、０．２８５ｍＬ、０．５６９ｍｍｏｌ）を１０℃で滴下した。冷浴から取り出し、混合物を室温で１時間撹拌した。追加のＮａＯＨ水溶液（０．２８５ｍＬ、０．５６９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５時間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、ＡｃＯＨ水溶液（１．０Ｍ、１．０ｍＬ）、続けて水（２．０ｍＬ）を加えた。固体をろ別し、次いで水（２ｍＬ）及びＭｅＣＮ（２ｍＬ）で洗浄し、ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解させた。次いで、この溶液に6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（０．０３５ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１００ｍＬ、０．５７２ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応物を４時間撹拌し、次いで反応物を濃縮し、溶媒をＤＣＭ：トルエン（１０ｍＬ、１：４）と共に蒸発させ、分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥してマレイミドＸＳ１２を薄黄色の固体として得た（１９．６ｍｇ、２１％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.50-12.42 (m, 2H), 9.29 (br s, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.59 (br s, 1H), 8.27-8.18 (m, 2H), 7.97 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.86-7.65 (m, 4H), 7.63-7.51 (m, 1H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.16 (br s, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.63 (dd, J = 2.0, 8.6 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 1.8, 14.4 Hz, 1H), 4.62 (br s, 2H), 4.43-4.32 (m, 2H), 4.20-4.13 (m, 1H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.21-3.14 (m, 2H), 2.23-2.06 (m, 2H), 2.01-1.89 (m, 2H), 1.88 (br s, 1H), 1.84-1.71 (m, 1H), 1.64-1.53 (m, 2H), 1.53-1.43 (m, 4H), 1.33-1.30 (m, 2H), 1.24-1.13 (m, 3H), 0.87 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C45H53FN13O11 + [M+H]+ 計算値 970.40、実測値 971.00。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-ヒドロキシベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ１４）の製造
(S)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-(4-ヒドロキシベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＳ１３）
アミンＸＴ４８（９７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）と4-ヒドロキシ安息香酸を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。反応混合物の濃縮後、粗生成物中の溶媒をＤＣＭ／トルエン（４ｍＬ、１：１）、トルエン（５ｍＬ）及びＭｅＣＮ（２×２ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＭｅＯＨ／ＭｅＣＮ（３ｍＬ、１：１）中で５分間撹拌し、次いでろ過した。固体をＭｅＣＮ（２ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥後、アミドＸＳ１３を黄色の固体として得た（４４ｍｇ、４４％）。
MS (ESI+) C28H30N9O6 + [M+H]+ 計算値 588.23、実測値 588.66。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-ヒドロキシベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ１４）
ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ（０．４８ｍＬ、５：１）中のエステルＸＳ１３（４４ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）の懸濁液を１０℃に冷却し、次いでＮａＯＨ水溶液（２．０Ｍ、０．２２３ｍＬ、０．４４６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で５時間撹拌した。次いで、混合物を０℃に冷却し、ＡｃＯＨ水溶液（１．０Ｍ、０．６ｍＬ）、続けて水（１．３ｍＬ）を加えた。懸濁液を２０分間撹拌した。固体をろ取し、水（１ｍＬ）、ＭｅＣＮ（１．０ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２×１ｍＬ）で洗浄し、高真空で乾燥した。残留物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 １０％から５５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥して酸ＸＳ１４を薄黄色の固体として得た（２１．２ｍｇ、５２％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.51-12.76 (m, 1H), 12.57-12.27 (m, 1H), 9.87 (s, 1H), 9.07-8.92 (m, 2H), 8.75 (s, 1H), 8.16-8.09 (m, 2H), 7.65 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 7.59-7.37 (m, 1H), 6.82 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 6.73-6.64 (m, 4H), 4.58-4.48 (m, 2H), 4.33-4.23 (m, 1H), 3.20-3.14 (m, 2H), 1.82-1.63 (m, 2H), 1.62-1.40 (m, 2H)。
MS (ESI+) C26H28N9O5 + [M+H]+ 計算値 546.22、実測値 546.63。
(S)-5-(5-アミノチオフェン-2-カルボキサミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ１６）の製造
(S)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-(5-ニトロチオフェン-2-カルボキサミド)ペンタン酸メチル（ＸＳ１５）
塩化チオニル（０．６２１ｍＬ、８．５１ｍｍｏｌ）中の5-ニトロチオフェン-2-カルボン酸（６７ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）の溶液を４時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒をヘプタン（２×１ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＤＭＦ（０．４８ｍＬ）に溶解し、ＤＭＦ（０．４８ｍＬ）中のアミンＸＴ４８（０．２００ｇ、０．３７０ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（０．１０３ｍＬ、０．７４０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃で加えた。反応混合物を室温で２０分撹拌し、次いでＭｅＯＨ（５ｍＬ）でクエンチした。混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２×５ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）を加えて沈殿を誘発した。ＭｅＯＨの一部を蒸発させ、残った溶液を４℃で一晩静置した。固体をろ取し、ＭｅＣＮ（１ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から１：４）で精製した。単離した生成物を残留物と組み合わせ、アミドＸＳ１５を得た（０．１２２ｇ、５３％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.98 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.76-8.70 (m, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.13 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.64 (br s, 1H), 7.59 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.32 (br s, 1H), 6.61 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.49-4.42 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.30-3.26 (m, 2H), 1.89-1.74 (m, 2H), 1.71-1.53 (m, 2H)。
MS (ESI+) C26H27N10O7S+ [M+H]+ 計算値 623.18、実測値 623.52。
(S)-5-(5-アミノチオフェン-2-カルボキサミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ１６）
アミドＸＳ１５（０．１２２ｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）／ＮＨ４Ｃｌ水溶液（７．２Ｍ、０．３８３ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）に溶解した。亜鉛粉末（０．１２８ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を３時間撹拌した。反応混合物をCelite（登録商標）でろ過し、ろ液を大気中で１８時間撹拌した。混合物を濃縮し、溶媒をＭｅＣＮ（２ｍＬ）と共に蒸発させた。残留物をＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中に懸濁させ、沈殿物をろ取した。固体をＭｅＣＮ（１ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥し、褐色の固体として得た。材料をＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ（０．４８ｍＬ、５：１）中に懸濁させ、ＮａＯＨ（２．０Ｍ、０．１８７ｍＬ、０．３７５ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を５時間撹拌した。ＡｃＯＨ水溶液（１．０Ｍ、０．４０ｍＬ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。水（１．６ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した後、混合物を４℃で一晩静置した。沈殿物をろ取し、固体を水（０．５ｍＬ）、ＭｅＣＮ（０．５ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（１ｍＬ）で洗浄した。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 １０％から２５％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥し、酸ＸＳ１６を薄黄色の綿毛状物として得た（４．７ｍｇ、４％、２工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.46 (br s, 1H), 9.29-9.00 (m, 2H), 8.83 (s, 1H), 8.18 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.87 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.70 (br s, 1H), 7.64-7.45 (m, 1H), 7.25 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.89 (br s, 1H), 6.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.53 (br s, 1H), 6.29-6.01 (m, 1H), 5.79 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.61 (br s, 2H), 4.38-4.29 (m, 1H), 3.23-3.10 (m, 2H), 1.87-1.66 (m, 2H), 1.63-1.44 (m, 2H)。
MS (ESI+) C24H27N10O4S+ [M+H]+ 計算値 551.19、実測値 551.37。
5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-エチニル安息香酸メチル（ＸＳ１９）の製造
(S)-5-(2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)-2-ヨード安息香酸メチル（ＸＳ１７）
アミンＸＳ９９（０．８００ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、Ozaki et al, Tetrahedron, 2017, 73, 7177-7184に記載のとおりに製造）とＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（０．９４４ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９．６ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（２．０２ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）を加え、続けてＨＡＴＵ（１．５９ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）を１時間かけて加えた。次いで、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解した。有機相をＫＨＳＯ４水溶液（０．５Ｍ、２×２５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２５ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ０：１から３０：７０）で精製してアミドＸＳ１７を薄黄色の固体として得た（１．１７ｇ、７１％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.48 (br s, 1H), 7.99-7.91 (m, 1H), 7.86 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.60-7.51 (m, 2H), 7.43-7.32 (m, 3H), 7.30-7.23 (m, 2H), 5.30 (br s, 1H), 4.49 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 4.36 (br s, 1H), 4.21 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 1.45 (d, J = 6.9 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 170.4, 166.4, 143.5, 143.4, 141.7, 141.3, 137.8, 135.3, 127.9, 127.2, 127.1, 124.9, 124.0, 122.2, 120.1, 87.3, 67.4, 52.6, 47.1, 17.5。
MS (ESI+) C26H24IN2O5 + [M+H]+ 計算値 571.07、実測値 571.27。
5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-ヨード安息香酸メチル（ＸＳ１８）
ピペリジン（０．９８９ｍＬ、９．９９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のアミドＸＳ１７（１．１４ｇ、２．００ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。１５分間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２×２０ｍＬ）と共に蒸発させ、真空中で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ０：１から２０：８０）で精製して脱保護された生成物を得た（０．７４０ｇ、定量）。生成物とＢｏｃ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（０．７３５ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９．７ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（０．９２８ｍＬ、５．３１ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物に水（１００ｍＬ）を加え、水相をＥｔＯＡｃ：ヘプタン（１：１、３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水（２×７５ｍＬ）及び氷冷ブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン ２０：８０から７０：３０）で精製してアミドＸＳ１８をオフホワイト色の固体として得た（０．７９０ｇ、６８％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 9.02 (br s, 1H), 8.09 (br s, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.07-4.92 (m, 1H), 4.67 (quint, J = 7.2 Hz, 1H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 2.27-2.16 (m, 1H), 1.48 (d, J = 8.1 Hz, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.96 (d, J = 6.9 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 171.9, 170.3, 166.5, 141.6, 138.3, 135.1, 124.0, 122.2, 87.0, 81.1, 60.9, 52.5, 49.7, 30.1, 28.2, 19.4, 17.7, 17.5。
MS (ESI+) C21H31IN3O6 + [M+H]+ 計算値 548.13、実測値 548.32。
5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-エチニル安息香酸メチル（ＸＳ１９）
マイクロ波用バイアルにヨードアレーンＸＳ１８（０．７２０ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１８ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（１３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を入れた。バイアルをＮ２でパージし、ＤＭＦ（４．５ｍＬ）、エチニルトリメチルシラン（０．２７３ｍＬ、１．９７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（０．１８３ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応混合物をマイクロ波中、８０℃で３．５時間加熱した。反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（１０ｍＬ）と共に蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ０：１から１：１）で精製して保護されたアルキンを黄色の固体として得た（０．４６６、６８％）。中間体の一部（０．４５０ｇ、０．８６９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４．４ｍＬ）に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（１２ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次いで反応混合物ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で希釈し、続けて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、アルキンＸＳ１９を黄色のフィルムとして得た（０．３６５ｇ、９４％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 9.06 (br s, 1H), 8.16 (br s, 1H), 7.94 (br d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.00 (br s, 1H), 4.69 (quint, J = 7.2 Hz, 1H), 3.98-3.92 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.34 (s, 1H), 2.28-2.18 (m, 1H), 1.49 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.96 (d, J = 6.9 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 170.3, 166.0, 138.4, 135.8, 133.0, 122.7, 121.2, 117.9, 81.4, 60.9, 52.2, 49.6, 30.1, 28.2, 19.4, 17.7, 17.5。
MS (ESI+) C23H32N3O6 + [M+H]+ 計算値 446.23、実測値 446.35。
2-(1-((S)-4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＳ２３）の製造
(S)-5-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ２０）
エステルＸＴ１０５（０．３００ｇ、０．５５７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．３３ｍＬ）とＭｅＯＨ（１．６５ｍＬ）中に懸濁させた。混合物を１０℃に冷却し、２ＭのＮａＯＨ（２．２３ｍＬ、４．４６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温にし、５時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、１ＭのＡｃＯＨ水溶液（６ｍＬ）でクエンチし、水（１０ｍＬ）で希釈した。混合物を室温に温め、続けてろ過した。残留物をＭｅＣＮ（５ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（２×５ｍＬ）で洗浄して精製していない酸を得た。材料を氷冷ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。ＴＦＡ（５ｍＬ）を加え、混合物を０℃で１５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２×１０ｍＬ）と共に蒸発させ、アミンＸＳ２０を褐色の油状物として得た（０．２９２ｇ、定量、２工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.99-12.41 (m, 1H), 9.14-8.89 (m, 2H), 8.71 (s, 1H), 8.56 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.46-7.90 (m, 2H), 7.82 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.76-7.67 (m, 2H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.47-4.33 (m, 1H), 3.28-3.17 (m, 4H), 2.89-2.74 (m, 2H), 1.96-1.85 (m, 1H), 1.85-1.71 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 2H)。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm = 173.9, 166.8, 163.3, 158.9, 158.6, 153.1, 150.6, 145.1, 132.2, 128.8, 128.1, 122.3, 52.4, 39.0, 35.8, 34.0, 28.0, 24.6。
MS (ESI+) C20H25N8O3 + [M+H]+ 計算値 425.20、実測値 425.41。
(S)-5-アジド-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ２１）
氷冷した水（０．９５ｍＬ）／ＤＣＭ（１．６ｍＬ）中のＮａＮ３（０．３６１ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフル酸無水物（０．１８８ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を０℃で４時間撹拌した。有機相を分離して、水相をＤＣＭ（２×１ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を１ＭのＮａ２ＣＯ３（１ｍＬ）で洗浄し、室温の水（１．８ｍＬ）／ＭｅＯＨ（３．７ｍＬ）中のＫ２ＣＯ３（０．１２３ｇ、０．８９０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２．８ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）及びアミンＸＳ２０（０．２３６ｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸（１．０Ｍ）でｐＨを約５にした。混合物を穏やかに加熱して沈殿を生じさせ、室温に冷却した。固体をろ取し、水（１ｍＬ）、ＭｅＣＮ（１ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（５ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥してアジドＸＳ２１を緑褐色の固体として得た（０．１０３ｇ、４１％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.60-11.50 (m, 1H), 8.56 (br s, 1H), 8.54-8.49 (m, 1H), 7.79 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.68-7.48 (m, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.53 (br s, 2H), 4.45-4.28 (m, 1H), 3.38-3.33 (m, 2H), 3.15 (br s, 4H), 1.94-1.71 (m, 2H), 1.71-1.54 (m, 2H)。
MS (ESI+) C20H23N10O3 + [M+H]+ 計算値 451.19、実測値 451.50。
(S)-5-(4-(4-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)-2-(メトキシカルボニル)フェニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＳ２２）
ＤＭＦ（１．７ｍＬ）中のアルキンＸＳ１９（０．０７０ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）とアジドＸＳ２１（０．０７８ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液をＮ２で５分間パージした。次いで、水（８８９μＬ）中の硫酸銅（ＩＩ）（３３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及び水（９４２μＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（５１ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を水（２５ｍＬ）に加えた。ＡｃＯＨ水溶液（１．０Ｍ、０．５ｍＬ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。混合物を穏やかに加熱して沈殿を生じさせ、室温に冷却した。固体をろ取し、ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）中で撹拌し、ろ取し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄した。次いで固体を真空中で乾燥してトリアゾールＸＳ２２を褐色の固体として得た（０．１０３ｇ、６６％）。
MS (ESI+) C43H54N13O9 + [M+H]+ 計算値 896.42、実測値 896.65。
2-(1-((S)-4-カルボキシ-4-(4-(2-(2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)エチル)ベンズアミド)ブチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)安息香酸（ＸＳ２３）
エステルＸＳ２２（０．１００ｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．０ｍＬ）中に懸濁させ、１０℃に冷却した。ＬｉＯＨ（０．４Ｍ、１．４０ｍＬ、０．５５８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を４．５時間撹拌した。追加のＬｉＯＨ（０．４Ｍ、０．６９８ｍＬ、０．２７９ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌を続けた。反応混合物を０℃に冷却し、ＡｃＯＨ（９６μＬ、１．６７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２×５ｍＬ）と共に蒸発させた。次いで、精製していない材料を０℃のＤＣＭ（３．０ｍＬ）中のＴＦＡ（３．０ｍＬ）の溶液に溶解した。反応混合物を０℃で１５分間撹拌し、続けて濃縮し、溶媒をトルエン（２×５ｍＬ）と共に蒸発させ、真空中で乾燥して精製していないアミンを褐色の油状物として得た。材料をＤＭＦ（５．０ｍＬ）に溶解し、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（３８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１１７ｍＬ、０．６６８ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。１５分後にＤＩＰＥＡ（０．１１７ｍＬ、０．６６８ｍｍｏｌ）を、３時間後に6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（１５ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を加えた。２４時間後、反応混合物を１ｍＬに濃縮し、１９２時間撹拌を続けた。追加のＤＩＰＥＡ（０．１１７ｍＬ、０．６６８ｍｍｏｌ）を加え、全反応時間が２４０時間となった後で、反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（５ｍＬ）と共に蒸発させた。粗生成物の一部を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から４０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥してマレイミドＸＳ２３を薄黄色の固体として得た（１３．９ｍｇ、１３％、３工程）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.99-12.41 (m, 1H), 9.14-8.89 (m, 2H), 8.71 (s, 1H), 8.56 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.46-7.90 (m, 2H), 7.82 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.76-7.67 (m, 2H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.47-4.33 (m, 1H), 3.28-3.17 (m, 4H), 2.89-2.74 (m, 2H), 1.96-1.85 (m, 1H), 1.85-1.71 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 2H)。
MS (ESI+) C47H55N14O10 + [M+H]+ 計算値 975.42、実測値 975.60。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-メチル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＲ４）の製造
4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)安息香酸メチル（ＸＲ１）
ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の4-ヒドロキシ安息香酸メチル（１．００ｇ、６．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＥｔ３Ｎ（２ｍＬ、１４．５ｍｍｏｌ）を加えた。4-ニトロフェニル クロロギ酸（１．４６ｇ、７．２３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液をＴＨＦ（３０ｍＬ）で希釈し、混合物を室温に温めた。１時間後、メチル(2-(メチルアミノ)エチル)-カルバミン酸tert-ブチル（１．２４ｇ、６．５７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌した。混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶解した。ＥｔＯＡｃ相をＫＨＳＯ４（０．５Ｍ、２×）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１Ｍ）及びブラインで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から３：７）で精製してカルバメートＸＲ１を得た（２．０７ｇ、８５％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.62-3.42 (m, 4H), 3.13-3.05 (s, 3H), 2.93 (m, 3H), 1.44 (m, 9H)。
MS (ESI+) C18H27N2O6 + [M+H]+ 計算値 367.19、実測値 367.35。
4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)安息香酸（ＸＲ２）
カルバメートＸＲ１（２．０７ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／水（１：１、３０ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＨ（０．２９３ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４５℃で２時間加熱し、室温に冷却し、ＫＨＳＯ４水溶液（０．５Ｍ、約５０ｍＬ）で酸性化した。反応混合物をＥｔＯＡｃで３回抽出し、合わせた有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して酸ＸＲ２を得た。
MS (ESI+) C17H25N2O6 + [M+H]+ 計算値 353.17、実測値 353.27。
(S)-5-(4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)ベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＲ３）
アミンＸＴ４８（４０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）と酸ＸＲ２（２８．０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）を、一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１：０から１：１）で精製してアミドＸＲ３を得た（定量）。
MS (ESI+) C38H48N11O9 + [M+H]+ 計算値 802.36、実測値 802.80。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-メチル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＲ４）
エステルＸＲ３（３８ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を水／ＴＨＦ（１：１、１ｍＬ）に溶解し、ＬｉＯＨ（５．７ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）で３時間処理し、ＡｃＯＨ（１０当量）で反応をクエンチした。混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２×）と共に蒸発させ、減圧下で乾燥した。
MS (ESI+) C36H46N11O8 + [M+H]+ 計算値 760.35、実測値 760.77。
得られた中間体をＨＣｌ／ジオキサン（２ｍＬ、４Ｍ）中に懸濁させ、３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶媒をクロロホルムと共に蒸発させ、減圧下で乾燥した。次に、Ｂｏｃを脱保護した中間体とＸＪ１２（４５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、氷浴上で冷却し、ＤＩＰＥＡ（０．０８２ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、反応混合物を室温に温め、２時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ）で精製した。生成物を含む画分を集め、アセトニトリルを蒸発させ、残った溶液を凍結乾燥してＸＲ４を得た（２５ｍｇ、４２％）。
MS (ESI+) C59H75N17O16 + [M+H]+ 計算値 1277.56、実測値 1277.12。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-イソプロピル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)安息香酸（ＸＲ８－ｐ及びＸＲ８－ｍ）の製造
4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ）フタル酸ジメチル（ＸＲ６）
冷却した（０℃）ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の4-ヒドロキシフタル酸ジメチル（ＸＲ５；５００ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロギ酸4-ニトロフェニル（５２７ｍｇ、２．６２ｍｍｏｌ）を加え、次いでＥｔ３Ｎ（０．６６ｍＬ、４．７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を０℃で２時間撹拌した。次いで、ＤＣＭ（２ｍＬ）中のメチル(2-(メチルアミノ)エチル)カルバミン酸tert-ブチル（５３７ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から３：７）で精製してカルバメートＸＲ６を得た（５７％、５８０ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.46 (m, 1H), 7.32 (dd, J = 8.5 Hz, 1.9 Hz, 1H), 3.90 (s, 6H), 3.62-3.41 (m, 4H), 3.12 (s, 1.5H, 回転異性体), 3.05 (s, 1.5H, 回転異性体), 2.92 (s, 3H), 1.44 (m, 9H)。
（明確にするために、カルバメート回転異性体に由来する分割されているが部分的に重複しているシングレットはシングレットとして示している。）
MS (ESI+) C20H28N2NaO8 + [M+Na]+ 447.17、実測値 447.50。
(S)-5-(5-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチルホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＲ７）
水（４ｍＬ）中のＮａＯＨ（２６９ｍｇ、６．７１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のカルバメートＸＲ６（５７０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。２０時間後、反応混合物ＫＨＳＯ４水溶液（０．５Ｍ）を使用して酸性化し、次いで反応混合物をＥｔＯＡｃ（２×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた精製していない二酸の一部（３４．７ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）とアミンＸＴ４８（５２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を、ＨＡＴＵ（８３ｍｇ、０．２１９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０６１ｍＬ、０．３５０ｍｍｏｌ）を用い、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中、２０時間の反応時間で、一般手順ＸＸＡに記載のとおり反応させた。濃縮後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１：０から１：１）で精製してフタルイミドＸＲ７を得た（５８．２ｍｇ、８０％）。
MS (ESI+) C39H46N11O10 + [M+H]+ 計算値 828.34、実測値 828.83。
2-(((S)-4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)カルバモイル)-5-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-イソプロピル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)安息香酸（ＸＲ８－ｐ及びＸＲ８－ｍ）
フタルイミドＸＲ７（５８．２ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を水／ＴＨＦ（１：１、１ｍＬ）に溶解し、ＬｉＯＨ（１３．５ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）により３時間、室温で処理した。生成物にＡｃＯＨを加えて沈殿させ、続けて固体をろ過により単離し、精製されていない材料を得た（１８ｍｇ、３２％）。
MS (ESI+) C37H46N11O10 + [M+H]+ 計算値 804.34、実測値 804.48。
ケン化した中間体（１８ｍｇ）をＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、０．５ｍＬ）中に懸濁させ、橙色の懸濁液を３０分間撹拌し、次いで濃縮し、減圧下で乾燥した。Ｂｏｃを脱保護した中間体とＸＪ１２（１６．９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、続いてＤＩＰＥＡ（０．０２３ｍＬ、０．１３４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで濃縮した。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ）で精製して、パラ及びメタ開環フタルイミドリンカー－薬物、ＸＲ８－ｐ及びＸＲ８－ｍの混合物を黄色の固体として得た。
MS (ESI+) C60H74N17O18 + [M+H]+ 計算値 1320.54、実測値 1320.74。
(S)-5-(2-(ベンジルオキシ)-4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-メチル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＲ１２）の製造
4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)-2-ヒドロキシ安息香酸メチル（ＸＲ９）
Ｅｔ３Ｎ（１．７１ｍＬ、１２．３ｍｍｏｌ）、クロロギ酸4-ニトロフェニル（１．３６ｇ、６．７４ｍｍｏｌ）を、冷却した（０℃）ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の2,4-ジヒドロキシ安息香酸メチル（１．０３ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）の溶液に順次加えた。１時間後、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のメチル(2-(メチルアミノ)エチル)-カルバミン酸tert-ブチル（１．２７ｇ、６．７４ｍｍｏｌ）を０℃で加え、混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物の濃縮後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から１：１）で精製してカルバメートＸＲ９を得た（１．６４ｇ、７０％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 10.85 (s, 1H), 7.82 (dd, J = 8.8 Hz, J = 1.8 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.61-3.42 (m, 4H), 3.11 (s, 1.5H, 回転異性体), 3.04 (s, 1.5H, 回転異性体), 2.92 (s, 3H), 1.45 (s, 9H)。
（明確にするために、カルバメート回転異性体に由来する分割されているが部分的に重複しているシングレットはシングレットとして示している。）
MS (ESI+) C18H27N2O7 + [M+H]+ 計算値 383.18、実測値 383.27。
2-(ベンジルオキシ)-4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)安息香酸メチル（ＸＲ１０）
ＢｎＢｒ（０．２５３ｍＬ、２．１３ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（３２１ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のカルバメートＸＲ９（７４０ｍｇ、１．９３５ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加え、混合物を１６時間撹拌した。次に、混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（約７５ｍＬ）に溶解した。有機相を水、ＫＨＳＯ４水溶液（０．５Ｍ）及びブラインで洗浄した。ＥｔＯＡｃ相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（２回、１；シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から１：１、２；ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１：０から４：１）で精製してベンジルエーテルＸＲ１０を得た（５８５ｍｇ、６４％）。
MS (ESI+) C25H32N2NaO7 + [M+Na]+ 495.21、実測値 495.55。
(S)-5-(2-(ベンジルオキシ)-4-(((2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)ベンズアミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＲ１１）
ＬｉＯＨ（１４８ｍｇ、６．２ｍｍｏｌ）を室温でＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＸＲ１０（５８５ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、混合物を一晩撹拌した。追加のＬｉＯＨ（５９．４ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）を加え、反応を２４時間続けた。反応物をＫＨＳＯ４水溶液（０．５Ｍ）で酸性化し、ＥｔＯＡｃ（２×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、精製していない酸を得た（５１８ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 10.55 (br s, 1H), 8.18 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.48-7.37 (m, 5H), 7.15-7.05 (m, 1H), 6.95-6.86 (m, 1H), 5.25 (s, 2H), 3.59-3.54 (m, 1H), 3.52-3.44 (m, 3H), 3.13 (s, 1.3H, 回転異性体), 3.06 (s, 1.7H, 回転異性体), 2.92 (s, 3H), 1.45 (s, 9H)。
（明確にするために、カルバメート回転異性体に由来する分割されているが部分的に重複しているシングレットはシングレットとして示している）。
この材料の一部（５２．５ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）を、アミンＸＴ４８（５７．７ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５２．２ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１２３ｍＬ、０．６８７ｍｍｏｌ）と、ＤＭＦ（１ｍＬ）中で一般手順ＸＸＡに従って反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１：０から１：１）で精製してアミドＸＲ１１を得た（１００ｍｇ、８７％）。
MS (ESI+) C45H54N11O10 + [M+H]+ 計算値 908.40、実測値 908.55。
(S)-5-(2-(ベンジルオキシ)-4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-5-メチル-4,7-ジオキソ-2-(3-ウレイドプロピル)-8,11-ジオキサ-3,6-ジアザトリデカンアミド)ベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)エチル)(メチル)カルバモイル)オキシ)ベンズアミド)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ペンタン酸（ＸＲ１２）
マレイミドＸＲ１２を、ＸＲ３からＸＲ４への変換と同様にして合成した。生成物を黄色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 13.10 (br s, 1H), 12.41 (br s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.96 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 9.14 (s, 1H),8.77 (s, 1H), 8.14-7.96 (m, 5H), 7.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50 (m, 2H), 7.39 (m, 2H), 7.29-7.08 (m, 6H), 6.94 (s, 2H), 6.92-6.80 (m, 4H), 6.69 (m, 3H), 5.91 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.35 (br s, 2H), 5.09 (m, 2H), 4.94 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.39-4.20 (m, 2H), 3.94 (m, 2H), 3.82 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.52-3.36 (m, 11H), 3.17 (m, 2H), 3.00-2.75 (m, 8H), 1.90 (m, 1H), 1.79-1.22 (m, 8H), 0.79 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.75 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C66H80N17O17 + [M+H]+ 計算値 1382.5、実測値 1382.81。
5-((R)-2-((R)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)-プロパンアミド)チオフェン-2-カルボン酸（ＸＲ２３）の製造
5-アミノチオフェン-2-カルボン酸ベンジル（ＸＪ１６）
ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の5-ニトロチオフェン-2-カルボン酸ベンジル（ＸＪ１５）（１．５５ｇ、５．８９ｍｍｏｌ、国際公開第2007/018508号に記載のとおりに製造）の懸濁液に、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（７ｍＬ）及び亜鉛粉末（３．８ｇ）を加えた。懸濁液を室温で２．５時間撹拌し、次いでCelite（登録商標）でろ過した。固体をＭｅＯＨで洗浄し、ろ液を濃縮した。ＥｔＯＡｃを加え、有機相をブラインで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、ろ過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ １：０から４：１）で精製して、ＸＪ１６を紫色の固体として得た（０．９０ｇ、６６％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.45 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.40-7.29 (m, 5H), 6.03 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 1.52 (br s, 2H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 162.5, 159.5, 136.4, 135.3, 128.5, 128.0, 117.1, 107.8, 66.1。
MS (ESI+) C12H12NO2S+ [M+H]+ 計算値 234.05、実測値 234.06。
(S)-5-(2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボン酸ベンジル（ＸＪ１７）
ＤＣＭ（１８ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（１．８２ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、塩化オキサリル（１．０ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）と１０滴のＤＭＦを０℃で加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで濃縮した。精製していない酸塩化物をＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解し、続けて冷却した（０℃）ＤＣＭ（８ｍＬ）中のＸＪ１６（０．９０ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。Ｅｔ３Ｎ（１．６ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ １：０から１：１）で精製して、ＸＪ１７を黄色の泡状物として得た（０．６６ｇ、３２％）。
MS (ESI+) C30H27N2O5S+ [M+H]+ 計算値 527.16、実測値 527.36。
5-((R)-2-((R)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボン酸ベンジル（ＸＪ１８）
Ｆｍｏｃで保護されたアミンＸＪ１７（０．６６ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（０．６２ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）を室温で加え、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶媒をトルエン／ＤＣＭと共に蒸発させ、脱保護したアミンを黄色の固体として得た。材料をＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＢｏｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＯＳｕ（０．５５ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．５４ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）を０℃で加え、次いで、混合物を室温で２．５時間撹拌した。濃縮後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ １：０から４：１）で精製してアミドＸＪ１８を無色のシロップ状物として得た（０．４８ｇ、７７％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 10.76 (br s, 1H), 7.61 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42-7.28 (m, 5H), 6.72 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 5.59 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 5.29 (s, 2H), 4.71 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.02 (br t, J = 5.6 Hz, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.45 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.42 (s, 9H), 0.96 (dd, J = 17.3, 6.8 Hz, 6H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 172.1, 169.6, 162.7, 146.0, 136.0, 131.9, 128.4, 128.0, 127.9, 123.5, 112.4, 80.0, 66,1, 60.4, 48.8, 30.6, 28.2, 19.2, 17.7, 17.5。
MS (ESI+) C25H34N3O6S+ [M+H]+ 計算値 504.21、実測値 504.31。
5-((R)-2-((R)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボン酸（ＸＲ２３）
ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中のアミドＸＪ１８（０．４８ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で、パラジウム（０．３ｇ、活性炭上に１０％）を加え、混合物を、水素雰囲気下、室温で２日間撹拌した。反応混合物をＮ２でパージし、Celite（登録商標）でろ過した。残留物をＥｔＯＡｃで洗浄し、ろ液を濃縮してＸＲ２３を白色の固体として得た（０．２８ｇ、７２％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.59 (br s, 1H), 11.62 (s, 1H), 8.24 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.69-6.68 (m, 1H), 4.45-4.38 (m, 1H), 3.84 (br t, J = 7.75 Hz, 1H), 1.99-1.91 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 171.8, 170.5, 164.0, 156.0, 146.1, 131.9, 124.2, 112.3, 78.5, 59.8, 48.8, 30.9, 28.6, 19.6, 18.5, 18.1。
MS (ESI+) C18H28N3O6S+ [M+H]+ 計算値 414.16、実測値 414.29。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)ペンタン酸（ＸＲ１６）の製造
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)-2-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)ペンタン酸メチル（ＸＲ１５）
アミンＸＴ４８（５０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ＸＲ２３（４１．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４５．３ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１０４ｍＬ、０．５９５ｍｍｏｌ）と、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中で一般手順ＸＸＡに従って反応させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１：０から４：１）で精製して、純粋ではないＸＲ１５（１０５ｍｇ）を得、更に精製することなく次で使用した。
MS (ESI+) C39H51N12O9S+ [M+H]+ 計算値 863.36、実測値 863.83。
(S)-2-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)ペンタン酸（ＸＲ１６）
ＴＨＦ／水（１：１、１ｍＬ）中のアミドＸＲ１５（４３ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）の溶液をＬｉＯＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）により９０分間、室温で処理した。ＡｃＯＨ（０．０３ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）及びトルエン（５ｍＬ）を加え、混合物を濃縮した。粗生成物をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（１ｍＬ）を０℃で加えた。４０分後、混合物を濃縮し、溶媒をＤＣＭと共に蒸発させ、減圧下で乾燥した。脱保護した中間体をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（１８．４３ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）を室温で加え、続いてＤＩＰＥＡ（０．０１７ｍＬ、０．１００ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＩＰＥＡ（＞５当量）を更に加えて、反応混合物を十分に塩基性にし、残った酸を塩基性にした。混合物を室温で３時間撹拌し、続けて濃縮した。分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配）で精製してＸＲ１６を黄色の固体として得た（１１．６ｍｇ、２６％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.95 (br s, 1H), 12.47 (m, 1H), 11.3 (s, 1H), 9.12 (br s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.29 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 8.26 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.19 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.88 (m, 1H), 6.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 4.36 (m, 2H), 4.15 (m, 1H), 3.21 (m, 3H), 2.23-1.89 (m, 4H), 1.89-1.68 (m, 2H), 1.65-1.42 (m, 6H), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.26-1.13 (m, 4H), 0.86 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C42H52N13O9S+ [M+H]+ 計算値 914.37、実測値 914.49。
(R)-2-(4-(((2,5-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)-5-(5-((R)-2-((R)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチル-ブタンアミド)プロパンアミド)チオフェン-2-カルボキサミド)ペンタン酸メチル（ＸＪ２１）の製造
ＸＲ１５（８３ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）に溶解し、塩酸（６Ｎ、０．９ｍＬ、５．５１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃で１時間撹拌し、次いで室温に冷却し、ＭｅＯＨで希釈し、溶媒をトルエン（２×）と共に蒸発させ、減圧下で乾燥した。生成物をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、6-マレイミドヘキサン酸 N-ヒドロキシスクシンイミド エステル（０．０２９ｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥ（０．１ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を順次０℃で加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、続けて濃縮した。粗製の固体を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配 ２０％から５０％）で精製した。生成物の画分を集め、ＭｅＣＮをロータリーエバポレーターで除去し、水溶液を凍結乾燥してＸＪ２１を黄色の泡状物として得た（２５ｍｇ、２８％）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 11.32 (s, 1H), 9.30 (bs, 1H), 9.26 (bs, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.32 (dd, J = 15.5, 7.0 Hz, 2H), 8.27-8.24 (m, 1H), 7.81 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.61 (br d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.0 (s, 2H), 6.91 (br s, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 4 Hz, 1H), 4.62 (br s, 2H), 4.43-4.34 (m, 2H), 4.15 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.24-3.19 (m, 2H), 2.22-2.07 (m, 2H), 1.99-1.90 (m, 1H), 1.86-1.76 (m, 2H), 1.65-1.42 (m, 7H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.22-1.14 (m, 2H), 1.04 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 0.86 (br d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (br d, J = 6.7 Hz, 3H)。
MS (ESI+) C43H54N13O9S+ [M+H]+ 計算値 928.38、実測値 928.60。
2-エチニル-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＲ１８）の製造
5-ニトロ-2-((トリメチルシリル)エチニル)安息香酸メチル（ＸＲ１７）
マイクロ波用バイアルにエチニルトリメチルシラン（０．７１ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）、2-ヨード-5-ニトロ安息香酸メチル（１．０６ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１５ｍＬ）を入れ、溶液をＮ２でパージした。Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（４８ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（０．４８ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を再度Ｎ２でパージした。バイアルに栓をして、マイクロ波中、８０℃で３．５時間加熱した。次いで、混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から０：１）で精製して、ＴＭＳ－アルキンＸＲ１７を得た（６２０ｍｇ、６５％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.77 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.28 (dd, J = 8.6 Hz, 2.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 0.31 (s, 9H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 164.7, 146.6, 135.5, 133.6, 129.7, 125.8, 125.6, 106.9, 101.3, 52.6, -0.4。
2-エチニル-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＲ１８）
アルキンＸＲ１７（８２２ｍｇ、２．９６ｍｍｏｌ）とＫ２ＣＯ３（４１．０ｍｇ、０．２９６ｍｍｏｌ）を室温でＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に溶解し、混合物を３０分間撹拌した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を加え、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×）及びブラインで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮してＸＲ１８を得た（定量）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.81 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.32 (dd, J = 8.6 Hz, 2.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.72 (s, 1H)。
13C NMR (100 MHz, CDCl3) ppm = 164.3, 147.0, 136.0, 133.8, 129.0, 126.1, 125.5, 87.9, 80.4, 52.8。
(S)-5-アジド-2-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)ペンタン酸（ＸＲ１９）の製造
氷冷した水（２５ｍＬ）／ＤＣＭ（４４ｍＬ）中のＮａＮ３（１０ｇ、１５４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフル酸無水物（５．２ｍＬ、３０．８ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を０℃で２時間撹拌した。有機相を分離して、水相をＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＣＯ３水溶液（１Ｍ）で洗浄し、室温の水／ＭｅＯＨ（１：２、１５０ｍＬ）混合物中のＺ－Ｏｒｎ－ＯＨ（４．１０ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（３．４０ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０７７ｇ、０．３０８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。室温で１８時間撹拌した後、有機溶媒を蒸発させ、水性スラリーを水（１５０ｍＬ）で希釈し、濃塩酸でｐＨを２にした。水相をＥｔＯＡｃで３回抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮し、粗製のＸＲ１９を得（４．５ｇ）、更に精製することなく次で使用した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 7.36 (m, 5H), 5.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.43 (m, 1H), 3.34 (m, 2H), 1.99 (m, 1H), 1.84-1.61 (m, 3H)。
MS (ESI+) C13H17N4O4 + [M+H]+ 計算値 293.12、実測値 293.39。
(S)-5-アミノ-2-(1-(4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)安息香酸（ＸＲ２２）の製造
(S)-2-(1-(4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＲ２０）
ＴＨＦ（７ｍＬ）中のアジドＸＲ１９（５３３ｍｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）、アルキンＸＲ１８（１８７ｍｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１．５ｍＬ）中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１７５ｍｇ、０．７０２ｍｍｏｌ）を室温で加えた。溶液をＮ２で５分間パージした後、水（１．５ｍＬ）中のアスコルビン酸ナトリウム（２７１ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を加えた。黄色の溶液を５分間撹拌し、その時点でＵＰＬＣ-ＭＳが反応の完了を示した。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）及び水／ブライン（１：１、１０ｍＬ）を加え、層を分離させ、水相をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から０：１）で精製してトリアゾールを得た。単離した生成物をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、Ｃｓ２ＣＯ３（１６３ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）及びＭｅＩ（６０μＬ、０．９６４ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応物を１６時間撹拌した。濃縮後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、１：０から０：１）で精製してエステルＸＲ２０を得た（３８０ｍｇ、８１％、２工程）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) ppm = 8.76 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.39 (dd, J = 8.7 Hz, 2.4 Hz, 1H), 8.19 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.34 (m, 5H), 5.43 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.47 (m, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 2.11-1.91 (m, 2H), 1.71 (m, 2H)。
MS (ESI+) C24H26N5O8 + [M+H]+ 計算値 512.18、実測値 512.33。
(S)-2-(1-(4-(4-(N-((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)ホルムアミド)ベンズアミド)-5-メトキシ-5-オキソペンチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)-5-ニトロ安息香酸メチル（ＸＲ２１）
酢酸中のＨＢｒ（３３％、５ｍＬ）を、エステルＸＲ２０（３００ｍｇ、０．５８７ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加え、反応物を０℃で７５分間撹拌した。混合物を濃縮し、溶媒をトルエン（２×）、クロロホルム及びエーテルと共に蒸発させた。
MS (ESI+) C16H20N5O6 + [M+H]+ 計算値 378.14、実測値 378.19。
粗生成物を、ＸＴ７（１６６ｍｇ、０．４８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２２３ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．５１３ｍＬ、２．９３ｍｍｏｌ）と、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で一般手順ＸＸＡに従って反応させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１：０から４：１）で精製してアミドＸＲ２１を得た（２４０ｍｇ、７０％）。
MS (ESI+) C31H31N12O8 + [M+H]+ 計算値 699.24、実測値 699.62。
(S)-5-アミノ-2-(1-(4-カルボキシ-4-(4-(((2,4-ジアミノプテリジン-6-イル)メチル)アミノ)ベンズアミド)ブチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)安息香酸（ＸＲ２２）
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のアミドＸＲ２１（２８０ｍｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）の溶液に、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（６００μＬ）及び亜鉛粉末（８３０ｍｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を加えた。ＵＰＬＣが反応の完了を示した後（約３時間）、反応混合物をＤＭＦ（６ｍＬ）で希釈し、Celite（登録商標）でろ過した。ろ液を大気中で一晩撹拌し、続けて濃縮し、ＭｅＯＨ（６ｍＬ）中に懸濁させ、３０分間撹拌し、ろ過した。固体を集め、エーテルで洗浄し、風乾し、更に精製することなく次の工程で使用した。精製していない中間体（１０９ｍｇ）をＴＨＦ／水（１：１ ２ｍＬ）に溶解した。ＬｉＯＨ（３６ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６時間撹拌した。反応混合物をＡｃＯＨ（０．１００ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）で酸性化し、濃縮し、溶媒をトルエン（２×）と共に蒸発させた。粗生成物の一部を分取ＲＰ-ＨＰＬＣ（水×０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ×０．１％ＴＦＡ、勾配）で精製してＸＲ２２を得た（１１ｍｇ）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 12.57 (br s, 2H), 9.32 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.61 (br s, 1H), 8.22 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.90 (br s, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.74 (m, 3H), 4.62 (s, 2H), 4.38 (m, 3H), 2.00-1.71 (m, 4H)。
MS (ESI+) C28H29N12O5 + [M+H]+ 計算値 613.24、実測値 613.37。
化合物の用途
がん細胞株
ヒト腫瘍細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＳＷ－６２０、Ａ－５４９、ＢＴ－４７４、ＡＵ－５６５及びＳＫ－ＯＶ－３は、American Type Culture Collection（Rockville, MD, USA）から入手した。Jurkat NucLight Red細胞は、Essen BioScience Inc.（Ann Arbor, MI, USA）から入手した。ＳＫ－ＢＲ－３細胞及びＳＫ－ＯＶ－３細胞は、１０％v/wウシ胎児血清（ＦＢＳ）、熱不活化品（ＨＩ）（Gibco-Life Technologies; Carlsbad, CA）及び８０Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Gibco-Life Technologies）を添加したMcCoys 5A培地（Lonza; Walkersville, MD, USA）中、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで培養した。ＳＷ－６２０細胞は、１０％v/w ＦＢＳ ＨＩ及び８０Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ１６４０培地（Lonza）中で、同様に培養した。Ａ－５４９細胞は、８０Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ及び５％v/w認定済（Ｑ）ＦＢＳ（Gibco-Life Technologies）を添加したF-12K Nutrient Mixture（１×）（Gibco-Life Technologies）培地中で、同様に培養した。ＢＴ－４７４細胞及びＡＵ－５６５細胞は、１０％v/w認定済（Ｑ）ＦＢＳ（Gibco-Life Technologies）及び８０Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ含むＲＰＭＩ１６４０培地（Lonza）中で、同様に培養した。Jurkat NucLight Red細胞は、１０％v/w ＦＢＳ ＨＩ、８０Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ及び０．５μｇ／ｍＬ ピューロマイシン（Gibco-Life Technologies）を有するＲＰＭＩ１６４０培地（Lonza）中で、同様に培養した。
in vitro細胞生存アッセイ
完全増殖培地中の細胞を９６ウェルプレート（９０μＬ／ウェル）に入れ、３７°Ｃ、５％ＣＯ２、以下の細胞密度：ＳＫ－ＢＲ－３；１ウェルにつき６５００細胞（以下同様）、ＳＷ－６２０；４０００、Ａ－５４９；２５００、ＢＴ－４７４；１００００、ＡＵ－５６５；５０００、Jurkat NucLight Red；３０００、ＳＫ－ＯＶ－３；４０００、でインキュベートした。一晩インキュベートした後、遊離薬物の１０段階のｌｏｇ１０希釈を、ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich）を用いて行った。これらの遊離薬物用量－応答曲線を、完全増殖培地で更に１０倍希釈した。本発明のＡＤＣでは、１０段階のｌｏｇ１０希釈を、完全増殖培地を用いて行った。遊離薬物又は本発明のＡＤＣを含む組成物１０μＬをアッセイプレートに添加した（遊離薬物の最終ＤＭＳＯ含量は１％）。６日後に、発光アッセイキット（CellTiter-Glo（登録商標）（ＣＴＧ）, Promega Corporation）を用い製造業者の指示に従って細胞生存率を評価した。細胞生存率を、濃度に応じた各遊離薬物又はＡＤＣの測定された発光を未処理細胞の平均値（１％ＤＭＳＯ（遊離薬物）又は１００％完全増殖培地（ＡＤＣ））で割り、１００を掛けることで計算した。
曲線を、カーブフィッティングソフトウェア（GraphPad Prism, version 8.4.0 for Windows（登録商標）, GraphPad, San Diego, CA又はElectronic Laboratory Notebook (ELN) add-in BioAssay, version 12.1.8.11, Perkin Elmer, Waltham, MA）を用い、可変勾配（４変数）のシグモイド用量－応答式を使用する非線形回帰によってフィッティングさせた。相対的ＩＣ５０の値を、４変数のロジスティックフィットを使用した際の曲線の下部と上部の中間の濃度として計算した。データを、２回行った実験の少なくとも１回の平均ＩＣ５０値として報告した。
遊離の葉酸拮抗薬についての実験
結果
比較化合物１
比較化合物１はRosowsky et al, J. Med. Chem. 1998, 41, 5310-5319に記載の手順に従って合成した。
フェニル環にＣＯＯＨを有さない化合物ＸＪ４、ＸＸ５、ＸＸ７、ＸＸ１２及びＸＴ３５は、ＣＯＯＨを有するタロトレキシンや他の葉酸拮抗化合物よりも活性が低い。ＣＯＯＨをＳＯ３Ｈ又はテトラゾールに置換しても、葉酸拮抗活性にはほとんど影響を及ぼさなかったが、ＣＯＯＨをＣＮに置換すると、ＳＫ－ＢＲ－３細胞での活性が低下したようである。アミド結合生物学的等価体について、アミド結合（Ｑ）をトリアゾールに置換しても、葉酸拮抗活性にほとんど影響を及ぼさなかった。フェニル環のパラ位にＮＨ２又はＯＨを導入すると、タロトレキシンに匹敵する葉酸拮抗活性を有する化合物が得られる。メタ位にＮＨ２を有する化合物の葉酸拮抗活性は、対応するパラ化合物及び（ＮＨ２を有さない）タロトレキシンと比較して、約１０倍低下する。
抗体－薬物複合体についての実験
ＤＡＲ２部位特異的複合体の製造
ＨＣ４１Ｃ改変トラスツズマブ（１００ｍＭヒスチジン中に１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５）の溶液に、2-(ジフェニルホスフィノ)ベンゼンスルホン酸（ｄｉＰＰＢＳ）（改変抗体のモル当量あたり１６～３２モル当量、水（MilliQ（登録商標））中に１０ｍＭ）を加え、得られた混合物を室温で１６～２４時間インキュベートした。過剰なｄｉＰＰＢＳを、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用する遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）により、又は活性炭ろ過によって除去した。ＤＭＡを加え、続いてリンカー－薬物溶液（ＤＭＡ中の１０ｍＭ、３．５当量）を加えた。ＤＭＡの最終濃度は１０％であった。得られた混合物を、室温、暗室中で３時間インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で少なくとも０．５時間インキュベートした。活性炭を０．２μｍのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルターを使用して除去し、得られたＡＤＣをVivaspin遠心濃縮器（カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に調製した。最後に、ＡＤＣ溶液を、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて滅菌ろ過した。
ＤＡＲ２及びＤＡＲ４野生型複合体の製造
トラスツズマブ（４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に１２ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＥＤＴＡ（水中に２５ｍＭ、４％v/v）とＴＲＩＳ（水中に１Ｍ、ｐＨ８、１％v/v）を加えた。ＴＣＥＰ（水中に１０ｍＭ、ＤＡＲ２では１．１当量、ＤＡＲ４では２．２当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。反応物を、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用する遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）によって除去した。ＤＭＡを加え、続いてリンカー－薬物溶液（ＤＭＡ中に１０ｍＭ、ＤＡＲ２では４当量、ＤＡＲ４では８当量）を加えた。ＤＭＡの最終濃度は１０％であった。得られた混合物を、室温、暗室中で３時間インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。活性炭を０．２μｍのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルターを使用して除去し、得られたＡＤＣをVivaspin遠心濃縮器（カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に調製した。最後に、ＡＤＣ溶液を、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて滅菌ろ過した。
ＤＡＲ８野生型複合体の製造
トラスツズマブ又は結合していない対照抗体であるリツキシマブ（４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に１２ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＥＤＴＡ（水中に２５ｍＭ、４％v/v）とＴＲＩＳ（水中に１Ｍ、ｐＨ８、２％v/v）を加えた。ＴＣＥＰ（水中に１０ｍＭ、３０当量）を加え、得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。反応物を、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用する遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）によって除去した。ＤＭＡを加え、続いてリンカー－薬物溶液（ＤＭＡ中に１０ｍＭ、１４当量）を加えた。ＤＭＡの最終濃度は１０％であった。得られた混合物を、室温、暗室中で一晩インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。活性炭を０．２μｍのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルターを使用して除去し、得られたＡＤＣをVivaspin遠心濃縮器（カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に調製した。最後に、ＡＤＣ溶液を、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて滅菌ろ過した。
ＤＡＲ１０部位特異的及び野生型複合体の製造
抗５Ｔ４抗体８２５ａ（４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に１２ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＥＤＴＡ（水中に２５ｍＭ、４％v/v）とＴＲＩＳ（水中に１Ｍ、ｐＨ８、２％v/v）を加えた。ＴＣＥＰ（水中に１０ｍＭ、３０当量を超える）を加え、得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。過剰なＴＣＥＰにより、野生型と改変体の両者が還元された。反応物を、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６を使用する遠心濃縮器（Vivaspinフィルター、カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）によって除去した。ＤＭＡを加え、続いてリンカー－薬物溶液（ＤＭＡ中に１０ｍＭ、１４当量）を加えた。ＤＭＡの最終濃度は１０％であった。得られた混合物を、室温、暗室中で一晩インキュベートした。過剰のリンカー－薬物を除去するために、活性炭を加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。活性炭を０．２μｍのＰＥＳ又はＰＶＤＦフィルターを使用して除去し、得られたＡＤＣをVivaspin遠心濃縮器（カットオフ３０ｋＤａ、ＰＥＳ）を使用して、４．２ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのトレハロース、ｐＨ６中に調製した。最後に、ＡＤＣ溶液を、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターを用いて滅菌ろ過した。
結果
ＨＥＲ２陽性ＳＫ－ＢＲ－３ヒト腫瘍細胞株では、（部位特異的）トラスツズマブ－ＸＴ１７葉酸拮抗ＡＤＣの細胞毒性は、ＤＡＲとともに増加した（図１）。トラスツズマブ－ＸＴ１７ ＤＡＲ８及び他のトラスツズマブＤＡＲ８複合体の細胞毒性は、幾分活性が低いようであるトラスツズマブ－ＸＴ４６及びトラスツズマブ－ＸＲ１２を除き、ほぼ同等であることが示され、トラスツズマブとＸＴ４１、ＸＸ１９、ＸＲ１６、ＸＸ２３及びＸＴ９４の複合体は、より活性が高いことが示された。ＤＡＲ１０ ８２５ａ複合体は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞において、対応するＤＡＲ８トラスツズマブ複合体よりも活性が低いことが示された。予測されたように、結合していない対照のＡＤＣ（リツキシマブ－ＸＴ１７）は、高濃度においてのみＨＥＲ２発現腫瘍細胞の増殖に効果があった。全てのトラスツズマブ－ＸＴ１７葉酸拮抗ＡＤＣは、ＨＥＲ２陰性のヒト腫瘍細胞株であるＳＷ－６２０では活性がなかった（ＩＣ５０＞１０ｎＭ、図２）。
in vivoでの有効性の実験
in vivo手順
トラスツズマブ葉酸拮抗ＡＤＣ１（表２及び３におけるＤＡＲ８－ＸＴ１７野生型結合トラスツズマブＡＤＣ）のin vivoでの有効性を、CByJ.Cg-Foxn1nu/JマウスにおけるＢＴ－４７４細胞株異種移植片モデル（６０歳白人女性患者の浸潤性乳管がん；Lasfargues et al, J. Natl. Cancer Inst. 1978, 61(4), 967-978）、及び、雌ＮＭＲＩヌードマウス（Crl:NMRI-Foxn1nu）におけるＭＡＸＦ５７４患者由来異種移植片モデル（浸潤性乳管がん；トリプルネガティブ乳がん）で検討した。
ＢＴ－４７４モデル
接着性のＢＴ－４７４細胞を、１０％ＦＢＳを添加した４ｍＭのL-グルタミンを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、加湿雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）、３７℃で単層として増殖させた。使用前に、トリプシン－ＥＤＴＡで５分間処理して、腫瘍細胞を培養フラスコから分離し、完全培地を添加して中和した。細胞を計数し、０．２５％トリパンブルー排除アッセイにより生存率を評価した。
健康な雌BalB/c Nude ByJ（CByJ.Cg-Foxn1nu/J）マウスにγ線（２Ｇｙ（ヌードマウス）, 60Co, BioMep, France）を全身照射した２４～７２時間後、その右側腹部に、２００μＬの５０％(v/v)マトリゲルを含有するRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０培地（356237, BD Biosciences, France）中の２×１０７個のＢＴ－４７４細胞を、皮下注射して腫瘍を誘発した。
腫瘍体積が平均１５０～２５０ｍｍ３に達した時点で、Vivo Manager（登録商標）ソフトウェア（Biosystemes, France）を用いて、動物を治療群（各群3例、マウス臨床試験形式）全体にわたって、個々の腫瘍体積により無作為に割り付けた。群間の均一性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）で検定した。無作為化後、治療薬を尾静脈に静脈内注射（ＩＶ）した。
ＭＡＸＦ５７４モデル
腫瘍断片を、ヌードマウス中で連続継代した異種移植片から得た。ドナーマウスから摘出後、腫瘍を断片（エッジ長３～４ｍｍ）に切断し、側腹部の片側にＳＣ移植した。腫瘍移植片の体積が目標範囲の８０～２５０ｍｍ３に達した時点で、各群の腫瘍体積の中央値と平均値を同程度にすることを目的として、マウスを治療群全体にわたって無作為に割り付けた。同日又は翌日に、３又は１０ｍｇ／ｋｇの葉酸拮抗ＡＤＣ１をマウス（各群３例、マウス臨床試験形式）の尾静脈に単回ＩＶ投与した。
体重及び腫瘍のサイズを週に２～３回測定した。腫瘍の長さと幅をノギスで測定し、以下の式を用いて腫瘍の体積を推定した：
腫瘍体積＝０．５×長さ×幅２（Simpson-Herren et al, Cancer Chemother. Rep. 1970, 54, 143-174）。
結果
図３Ａは、マウスＢＴ－４７４細胞株異種移植片モデルにおいて、５ｍｇ／ｋｇの葉酸拮抗ＡＤＣ１（トラスツズマブ－ＸＴ１７；ＤＡＲ８）のＩＶ単回投与により腫瘍体積が減少したことを示す。腫瘍縮小効果は、１．７ｍｇ／ｋｇの葉酸拮抗ＡＤＣ１を１週間間隔で３回ＩＶ投与した場合と同様であった（Ｑ１Ｗ×３；図３Ｂ）。
ＢＴ－４７４腫瘍を有するマウスは、図４Ａ及び４Ｂに示すように悪液質を発症する。この体重減少は、有効な治療薬を投与した後に回復することが多く、高感度の有効性バイオマーカーと考えられている。葉酸拮抗ＡＤＣ１（５ｍｇ／ｋｇ ＩＶ又は１．７ｍｇ／ｋｇ ＩＶ Ｑ１Ｗ×３）による治療では、２つの投薬方法において体重が同様に回復した（図４）。
図５は、マウスＸＦ５７４患者由来異種移植片モデルにおいて、３又は１０ｍｇ／ｋｇの葉酸拮抗ＡＤＣ１（トラスツズマブ－ＸＴ１７；ＤＡＲ８）のＩＶ単回投与により腫瘍体積が減少したことを示す。腫瘍縮小効果は用量依存的で、１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後２０日まで、ほぼ完全な寛解が観察された。

Claims (18)

  1. 式（Ｉ）
    ［式中、
    Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨであり；
    Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅであり；
    Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２、ＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルケニル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルキニル）又はＣＨ（Ｃ１－４アルコキシ）であり；
    Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、ベンジルオキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ若しくはアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）であるか、又は、Ｒ４は、
    （ここで、Ｒａ’は、Ｈ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、それぞれのＲａは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、かつ、場合によっては、２つのＲａは一緒になって環を形成できる）からなる群から選択されるカルボン酸生物学的等価体であり；
    Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ２－４アルキニル、Ｃ１－４アルコキシ又はＣ１－４アルキルチオ、好ましくは、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＦ３又はＣＦ２ＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；
    Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ３－６シクロアルキル、好ましくはＨであり；
    ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
    Ｑは、単結合、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２－、－Ｎ（Ｒ７）ＳＯ２－若しくは－ＳＯ２Ｎ（Ｒ７）－（ここで、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルケニル又はＣ１－４アルキニル、好ましくはＨである）であるか、又は、Ｑは、
    （ここで、ＲｂはＨ及びＣ１－５アルキルから選択され、Ｔ１、Ｔ１’及びＴ１’’は、独立して、ＣＨ及びＮから選択され、Ｗ１、Ｗ１’及びＷ１’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）からなる群から選択されるアミド結合生物学的等価体であり；
    Ｖは、場合によっては１つ以上のＲ４で置換され、独立して、
    から選択される、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル若しくはシクロアルカン（ここで、Ｕ１、Ｕ１’、Ｕ１’’、Ｕ２、Ｕ２’、Ｕ２’’及びＵ２’’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）であるか、又は、Ｖは、
    （ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲｃであり、ＲｃはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）からなる群から選択され；
    ｓは０又は１、好ましくは１であり；
    Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択される連結基であり；
    ｋは、１、２、３又は４、好ましくは１であり；
    Ｌはリンカーであり；
    は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する］
    で表されるリンカー－薬物化合物。
  2. 式（Ｉａ）で表される、請求項１に記載のリンカー－薬物化合物。
  3. 式（Ｉｃ）で表される、請求項１又は２に記載のリンカー－薬物化合物。
  4. Ｌが
    ［ここで、
    ｍは１～１０の整数、好ましくは５であり；
    ＡＡはアミノ酸、好ましくは中性アミノ酸であり；
    ｐは、０、１、２、３又は４であり；
    ｑは１～１２の整数、好ましくは２であり；
    ＥＳは、単結合又は
    から選択される伸長スペーサーであり；
    ＲＬは、単結合又は
    （ここで、ｔは１～１０の整数であり、Ｒ１０は、場合によっては置換されたＣ１－４アルコキシであり、Ｒ１１は、Ｈ、場合によっては置換されたＣ１－６アルキル、場合によっては置換されたＣ６－１４アリール、又は場合によっては置換されたＣ－結合Ｃ３－８ヘテロアリールである）
    から選択される脱離スペーサーである］
    であり；
    好ましくはＬが、
    である、請求項１～３のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  5. Ｌが
    である、請求項１～３のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  6. 前記リンカー－薬物化合物が
    である、請求項１～４のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  7. 前記リンカー－薬物化合物が
    である、請求項１～４のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物。
  8. 式（ＩＩＩ）
    Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｙ （ＩＩＩ）
    ［式中、
    Ａｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
    Ｌ－Ｄは、請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物であり；
    ｙは、１～１６の平均薬物抗体比を示し；
    前記リンカー－薬物化合物は、好ましくは前記抗体又はその抗原結合断片のシステイン残基を介して、前記抗体又はその抗原結合断片と結合している］
    で表される抗体－薬物複合体。
  9. 前記抗体－薬物複合体が
    （ここで、
    Ａｂは、抗体又はその抗原結合断片であり；
    ｙは、１～１６、好ましくは１～１０の平均薬物抗体比を示す）
    である、請求項８に記載の抗体－薬物複合体。
  10. 前記抗体又は前記抗原結合断片が、アネキシンＡｌ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＭＡ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ２７－２９、ＣＡ１２５、ＣＡ２４２、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＤＣＰ１、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ、クローディン４、クローディン７、ＣＬＣＡ－１、ＣＬＬ１、ｃ－ＭＥＴ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＬ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＰｈＢ３、ＥＴＢＲ、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５、ＦＧＦＲ３、ＦＯＬＲ１、ＦＲβ、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＯＢＯ Ｈ、ＧＰＡ３３、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、インテグリンα、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＭ４ＳＦ１、ルイスＡ様炭水化物、ルイスＸ、ルイスＹ、ＬＧＲ５、ＬＩＶ１、メソテリン、ＭＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、ノッチ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＥＡＰ－１、５Ｔ４、ＴＦ、ＴＦ－Ａｇ、Ｔａｇ７２、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＲＯＰ２、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦＲ及びＶＬＡ
    からなる群より選択される標的抗原に結合する、請求項８又は９に記載の抗体－薬物複合体。
  11. 請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物又は請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体、及び、１種以上の薬学的に許容される添加物を含有する医薬組成物。
  12. 医薬として使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体又は請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 固形がん又は血液がんの治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体又は請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 自己免疫疾患、特に関節リウマチの治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体又は請求項１１に記載の医薬組成物。
  15. 細菌、ウイルス、寄生虫又は他の生物による感染の処置に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体又は請求項１１に記載の医薬組成物。
  16. １種以上の他の治療薬との併用療法で使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物、請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体又は請求項１１に記載の医薬組成物。
  17. 請求項１～７のいずれか一項に記載のリンカー－薬物化合物又は請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体の製造における式
    ［式中、
    Ｒ１は、Ｏ、ＮＨ２又はＯＨであり；
    Ｒ２及びＲ２’は、独立して、Ｎ、ＣＨ又はＣＭｅであり；
    Ｒ３は、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ２、ＣＨ（Ｃ１－５アルキル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルケニル）、ＣＨ（Ｃ２－４アルキニル）又はＣＨ（Ｃ１－４アルコキシ）であり；
    Ｒ４は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ、－ＣＯＮＨＲ２、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルコキシ、ベンジルオキシ、テトラゾール、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＳＯ３Ｈ、－ＰＯ３Ｈ２、－ＯＰＯ３Ｈ２、－ＣＮ若しくはアジド（ここで、ＲはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）であるか、又は、Ｒ４は、
    （ここで、Ｒａ’は、Ｈ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、それぞれのＲａは、独立して、Ｈ、Ｆ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３及びＣ１－６アルキルから選択され、かつ、場合によっては、２つのＲａは一緒になって環を形成できる）からなる群から選択されるカルボン酸生物学的等価体であり；
    Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ２－４アルキニル、Ｃ１－４アルコキシ又はＣ１－４アルキルチオ、好ましくは、Ｈ、Ｆ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＦ３又はＣＦ２ＣＦ３、より好ましくはＨ又はＦであり；
    Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ２－４アルケニル、Ｃ３－６シクロアルキル、好ましくはＨであり；
    ｎは、１、２、３又は４、好ましくは３であり；
    Ｑは、単結合、－Ｎ（Ｒ７）－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ７）－、－ＣＨ２Ｎ（Ｒ７）－、－Ｎ（Ｒ７）ＣＨ２－、－Ｎ（Ｒ７）ＳＯ２－若しくは－ＳＯ２Ｎ（Ｒ７）－（ここで、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－４アルケニル又はＣ１－４アルキニル、好ましくはＨである）であるか、又は、Ｑは、
    （ここで、ＲｂはＨ及びＣ１－５アルキルから選択され、Ｔ１、Ｔ１’及びＴ１’’は、独立して、ＣＨ及びＮから選択され、Ｗ１、Ｗ１’及びＷ１’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）からなる群から選択されるアミド結合生物学的等価体であり；
    Ｖは、場合によっては１つ以上のＲ４で置換され、独立して、
    から選択される、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル若しくはシクロアルカン（ここで、Ｕ１、Ｕ１’、Ｕ１’’、Ｕ２、Ｕ２’、Ｕ２’’及びＵ２’’’は、独立して、Ｃ、ＣＨ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１－５アルキル）及びＯから選択される）であるか、又は、Ｖは、
    （ここで、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲｃであり、ＲｃはＨ及びＣ１－５アルキルから選択される）からなる群から選択され；
    ｓは０又は１、好ましくは１であり；
    Ｘは、Ｏ、ＮＨ、Ｓ、Ｃ１－５アルキレン、Ｃ１－５アルケニレン及びＣ１－５アルキニレンから選択され；
    は、結合が、単結合であってもよいか、又は、累積しておらず、場合によっては局在化していない二重結合であってもよいことを意味する］
    で表される化合物の使用。
  18. 前記化合物が
    である、請求項１７に記載の使用。
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