MX2011003195A

MX2011003195A - Anticuerpos anti-pd-1, pd-l1 y pd-l2 humanos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2011003195A
Application number: MX2011003195A
Authority: MX
Inventors: Rafi Ahmed; Francis J Carr; Gordon Freeman; Timothy D Jones; James P Gregson
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-08-12
Also published as: MX349463B; IL211830A; KR20180004288A; KR101924874B1; IL249829A0; BRPI0919377A2; AU2016222431A1; CN102264762B; JP6723273B2; KR102197527B1; US20160137731A1; CN102264762A; JP2018113969A; ES2592216T3; US11261251B2; WO2010036959A3; JP6663653B2; US20180371084A1; US20200172616A1; AU2009296392A1

Abstract

La presente invención está basada, en parte, en la identificación de nuevos anticuerpos anti-PD-1, PD-L2 y PD-L2 humanos. Así, la invención es concerniente con composiciones y métodos para diagnosis, prognosis y tratamiento de condiciones que se beneficiarían de modular la actividad de PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 (por ejemplo, enfermedades infecciosas persistentes, enfermedades autoinmunes, asma, rechazo de trasplante, alteraciones inflamatorias y tumores) usando los nuevos anticuerpos anti-PD-1, P-D-L1 y PD-L2 humanos descritos en la presente.

Description

ANTICUERPOS ANTI-PD-1, PD-Ll Y PD-L2 HUMANOS Y USOS DE LOS MISMOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para que las células T respondan a polipéptidos extraños, por lo menos dos señales deben ser provistas por células que presentan antígeno (APC) a linfocitos T en reposo (Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165:302-319; Mueller, D. L. et al. (1990) J. Immunol. 144:3701-3709). La primera señal, que confiere especificidad a la respuesta inmune, es transducida vía el receptor de célula T (TCR) en seguida del reconocimiento del péptido antigénico extraño presentado en el contexto del complejo de histocompatibilidad mayor (NHS) . La segunda señal, denominada co-estimulación, estimula a las células T a proliferar y a volverse funcionales (Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14:233). La coestimulación no es ni antígeno-específica, ni MHC-restringida y es provista por moléculas de superficie celular distintas expresadas por APC (Jenkins, M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140:3324-3330; Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc . Nati. Acad Sci . USA 88:6575-6579; Young, J. W. et al . (1992) J. Clin. Invest. 90:229-237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Reiser, H. et al. (1992) Proc. Nati. Acad Sci. USA 89:271-275; van-Seventer, G. A. et al. (1990) J. Immunol. 144:4579-4586; LaSalle, J. M. et al. (1991) J. Immunol. 147:774-80; Dustin, M.

I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:503; Armitage, R. J. et al . (1992) Nature 357:80-82; Liu, Y . et al . (1992) J. Exp. Med 175:437-445).

Las proteínas B7-1 (CD80) y BT-2 (CD86) son moléculas co-estimuladoras críticas (Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143:2714; Azuma et al. (1993) Nature 366:76; Freeman et al. (1993) Science 262:909). B7-2 juega un papel predominante durante respuestas inmunes primarias, mientras que B7-1, que es regulado ascendentemente más tarde durante una respuesta inmune, puede ser importante para prolongar respuestas células T primarias o co-estimular respuestas de células T secundarias (Bluestone (1995) Immunity 2:555) .

CD28 es un ligando tanto para B7-1 como B7-2 que es expresado constitutivamente por células T en reposo e incrementa en expresión en seguida de la activación de célula T. La ligación de CD28 en conjunción con una señal de TCR da como resultado la transducción de una señal co-estimulatoria que induce a las células a proliferar y secretar IL-2 (Linsley, P. S. et al. (1991) J. ' Exp. Med. 173:721-730; Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88:6575-6579; June, C. H. et al. (1990) Immunol. Today 11:211-6; Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607-609). Un segundo ligando de B7-1 y B7-2, CTLA4 (CD152), es homólogo a CD28 pero no expresado por células T en reposo. La expresión de CTLA4 ocurre en seguida de la activación de célula T (Brunet, J. F. et al. (1987) Nature 328:267-270) . La ligación de CTLA4 da como resultado la transducción de una señal inhibidora que incluye la proliferación de célula T y secreción de citosina. Así, CTLA4 es un regulador negativo crítico de respuestas de célula T (Waterhouse et al. (1995) Science 270:985) (Allison and Krummel (1995) Science 270:932). El tercer miembro de la familia de CD28 a ser descubierto es ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263; WO 98/38216). La ligación de ICOS por su ligando (ICOS-L ) da como resultado altos niveles de expresión de citosina, pero expansión de célula T limitada (Riley J. L. et al. (2001) J. Immunol. 166:4943-48; Aicher A. et al. (2000) J. Immunol. 164:4689-96; Mages H. W. et al. (2000) Eur. J Immunol. 30:1040-7; Brodie D. et al. (2000) Curr. Biol. 10:333-6; Ling V. et al. (2000) J. Immunol. 164:1653-7; Yoshinaga S. K. et al . (1999) Nature 402:827-32). Si las células T son estimuladas por medio del receptor de célula T en ausencia de una señal co-estimuladora, se vuelven insensibles, anérgicas o mueren.

La importancia de la ruta co-estimulatoria de B7 :CD28/CTLA4/ICOS ha sido demostrada in vitro y en varios sistemas de modelo in vivo. El bloqueo de esta ruta co-estimulatoria da como resultado el desarrollo de tolerancia específica de antxgeno en sistemas murinos y humanos (Harding, F. A. et al. (1992) Nature 356:607 609; Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257:789 792; Turka, L. A. et al. (1992) Proc .

Nati. Acad. Sci. USA 89:11102 11105; Gimmi, C. D. et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6586 6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1753 1763). Inversamente, la expresión de B7 mediante células de tumor murino B7-negativas induce la inmunidad específica moderada por célula T acompañada por rechazo de tumor y protección de larga duración al ataque de tumor (Chen, L. et al. (1992) Cell 71:1093 1102; Townsend, S. E. and Allison, J. P. (1993) Science 259:368 370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:5687 5690.). Por consiguiente, la manipulación de las rutas co-estimuladoras ofrece mayor potencial para estimular o suprimir respuestas inmunes en humanos .

El descubrimiento de más miembros de las familias de B7-1 y CD28 ha revelado rutas adicionales que proveen segundas señales co-estimuladoras e inhibidoras a células T. Una de las rutas más nuevas es representada por el receptor de muerte programada 1 (PD-1; también conocido como CD279) y sus ligandos PD-L1 (B7-H1; CD274) and PD-L2 (B7-DC; CD273) . PD-1 es un miembro de la familia de CD28-CTLA4 que es expresado sobre las células T activadas pero no en reposo (Nishimura et al . (1996) Int. Immunol. 8:773). La ligación de PD-1 por sus ligandos modera una señal inhibidora que da como resultado la producción de citocina reducida y supervivencia de célula T reducida (Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141; Nishimura et al. (2001) Science 291:319; Chemnitz et al. (2004) J. Immunol. 173:945) .

PD-L1 es un miembro de la familia de B7 que es expresado en muchos tipos de células, incluyendo APC y células T activadas (Yamazaki et al. (2002) J. Immunol. 169:5538). PD-Ll se enlaza tanto a PD-1 como B7-1. Tanto el enlace de B7-1 expresado por célula T mediante PD-L1 y el enlace de PD-L1 expresado por célula T mediante B7-1 da como resultado la inhibición de célula 7 (Butte et al. (2007) Immunity 27:111). También hay evidencia de que, como otros miembros de la familia B7, PD-Ll puede también proveer señales co-estimuladoras a células T (Subudhi et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:694; Tamura et al. (2001) Blood 97:1809).

PD-L2 es un miembro de la familia de B7 expresado en varios APC, incluyendo células dendríticas, macrófagos y células cebadas derivadas de médula ósea (Zhong et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37:2405). PD-L2 APC-expresado es apto tanto de inhibir la activación de célula T por medio de la ligación de PD-1 como co-estimular la activación de célula T, por medio de un mecanismo PD-1 independiente (Shin et al. (2005) J. Exp. ed. 201:1531). Además, la ligación de PD-L2 expresado por células dendríticas da como resultado expresión de citoquina de célula dendrítica mejorada y sobrevivencia (Radhakrishnan et al. (2003) J. Immunol. 37:1827; Nguyen et al. (2002) J. Exp. Med. 196:1393). La estructura y expresión de PD-1, PD-Ll y PD-L2, también como características de señalización y funciones de estas moléculas en el contexto de regulación de activación de célula T y tolerancia (por ejemplo, efectos terapéuticos) son revisados en mayor detalle en Kier et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:677, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. La manipulación de esta y otras rutas co-estimuladoras ofrece mayor potencial para estimular o suprimir respuestas inmunes en humanos y existe una necesidad de composiciones y métodos útiles para efectuar tales manipulaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en la generación y aislamiento de nuevos anticuerpos monoclonales humanos compuestos que se enlazan específicamente a PD-1 humano, PD-L1 humano y PD-L2 humano, también como la caracterización de tales nuevos anticuerpos y la demostración de su valor terapéutico en el tratamiento de una variedad de condicio'nes moderadas por PD-1, PD-Ll y/o PD-L2. Técnicas comunes usadas para humanizar anticuerpos murinos frecuentemente producen anticuerpos humanizados que tienen afinidades de enlace antígeno reducidas en comparación con los anticuerpos murinos originales (Almagro and Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13:1619-1633; Foote and inter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Hwang et al. (2005) Methods 36: 35-42). Sorprendentemente, los anticuerpos humanos compuestos de la presente invención han mostrado enlazarse a PD-1, PD-Ll o PD-L2 con afinidades que se aproximan estrechamente a aquellas de los anticuerpos murinos . Además, las técnicas de humanización convencionales producen anticuerpos humanizados que retienen alguna secuencia murina. Como ' resultado, tales anticuerpos pueden retener inmunogenicidad cuando son administrados a humanos. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado CAMPATH® produce inmunogenicidad en aproximadamente 50% de los pacientes. Los anticuerpos humanos compuestos de la presente invención, por otra parte, son derivados completamente de secuencias de origen humano. Por consiguiente, son probables que sean significativamente menos inmunógenos y más terapéuticamente efectivos y útiles cuando son administrados a pacientes humanos que otros anticuerpos PD-1, PD-Ll y/o PD-L2 anti-humanos . Así, los anticuerpos humanos compuestos de la presente invención proveen un medio mejorado para el tratamiento y prevención de alteraciones moderadas por PD-1, PD-Ll y/o PD-L2 , atribuibles en parte a su especificidad, afinidad, estructura, actividad funcional única y el hecho de que son derivados de secuencias de anticuerpo humanas. La presente invención también está basada en el descubrimiento de nuevas aplicaciones terapéuticas , que incluyen el tratamiento de enfermedades infecciosas persistentes, asma, enfermedades inflamatorias y cánceres, al administrar los anticuerpos humanos compuestos descritos en la presente.

Una modalidad de la invención es un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza a una proteina de PD-1, una proteína de PD-Ll o una proteína de PD-L2 (tal como proteína de PD-1, PD-Ll o PD-L2 humana) , en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es quimérico, humanizado, compuesto, humano o humano que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7-24.

La invención también provee un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza a una proteína de PD-1 (tal como una proteína de PD1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2), en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es quimérico, humanizado, humano compuesto o humano .y que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 7-9 (secuencia de CDRl de SEQ ID NO: 7, secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 8 y secuencia de CDR3 de SEQ ID NO: 9) y/o una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 10-12 (secuencia de CDRl de SEQ ID NO: 10, secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 11 y secuencia de CDR3 de SEQ ID NO: 12) .

La invención también provee un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza a una proteína de PD-Ll (tal como una proteína de PD-Ll que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4), en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto humano o humano y que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 13-15 (secuencia de CDR1 de SEQ ID NO: 13, secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 14 y secuencia de CDR3 de SEQ ID NO: 15) y/o una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 16-18 (secuencia de CDR1 de SEQ ID NO: 16, secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 17 y secuencia de CDR3 de SEQ ID NO: 18) .

La invención también provee un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-L2 (tal como una proteína de PD-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6), en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es quimérico, humanizado, humano compuesto o humano y que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19-21 (secuencia de CDR1 de SEQ ID NO: 19, secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 20 y secuencia de..CDR3 de SEQ ID NO: 21) y/o una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 22-24 (secuencia de CDRl de SEQ ID NO: 22, secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 23 y secuencia de CDR3 de SEQ ID NO:.24) .

La invención también incluye un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza a una proteína de PD-1, una proteína de PD-Ll o una proteína de PD-L2 (tal como una proteína de PD-1, PD-Ll o PD-L2 humana) en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es quimérico, humanizado, compuesto y/o humano y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-29, 34-38 o 43-47 o una secuencia" con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más homología idéntica a SEQ ID NO: 25-29, 34-38 o 43-47 o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 30-33, 39-42 O 48-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más de homología a SEQ ID NO: 30-33, 39-42 O 48-51.

La invención también provee un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto o humano y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-29 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más idéntico u homólogo a SEQ ID NO: 25-29 y/o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 30-33 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más idéntica u homologa a SEQ ID NO: 30-33. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 27 o 28 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32 o 33. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 28 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32.

La invención también provee un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto o humano y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste SEQ ID NO: 34-38 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más idéntica u homologa a SEQ ID NO: 34-38 y/o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39-42 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más idéntica u homologa a SEQ ID NO: 39-42. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno , del mismo comprende una secuencia de .región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35 o 37 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 39, 40 o 42. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42.

La invención también provee un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno del mismo que se enlaza a una prote na de PD-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto o humano y que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 43-47 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más idéntica u homologa a SEQ ID NO: 43-47 y/o una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 48-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o más idéntica u homologa a SEQ ID NO: 48-51. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 44 o 46 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 49, 50 o 51. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 46 y una secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51.

Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-1, en donde el anticuerpo aislado inhibe el enlace del anticuerpo EH12.2H7 biotinilado a Fe-PD-1 en un análisis de ELISA de competencia. Otra modalidad es un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-Ll, en donde el anticuerpo aislado inhibe el enlace del anticuerpo 29E2A3 biotinilado a Fc-PD-Ll en un análisis de ELISA de competencia. Otra modalidad es un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-L2 , en donde el anticuerpo aislado inhibe el enlace del anticuerpo 24F.10C12 biotinilado a Fc-PD-L2 en un análisis de ELISA de competencia.

Otra modalidad de la invención es un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-1, en donde el anticuerpo aislado inhibe una señal PD-1-moderada . Otra modalidad es un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a una proteína de PD-Ll, en donde el anticuerpo aislado inhibe una señal PD-Ll-moderada . Otra modalidad es un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza a una proteína de PD-L2 en donde el anticuerpo aislado inhibe una señal PD-L2-moderada .

En particular, una modalidad de la invención es un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica u homologa a SEQ ID NO: 25-51. Otra modalidad es un vector, célula huésped o animal que comprende uno o más de estos ácidos¦ nucleicos . Otro aspecto es un ácido nucleico que se hibridiza, bajo condiciones severas, con el complemento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntico u homólogo a SEQ ID NO: 25-51.

La invención también provee un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos descritos en la presente. En algunas modalidades, el ácido nucleico es un vector, tal como un vector de expresión. La invención también provee una célula huésped que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos en la presente. En algunas modalidades, la célula huésped produce los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno. La invención también provee métodos para producir el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno descritos en la presente, que comprenden cultivar una célula que produce el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno y recuperar el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del cultivo celular.

La invención incluye además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo y un portador aceptable farmacéuticamente.

La invención abarca un método para reactivar una célula T exhausta, que comprende poner en contacto una población de células T,' en donde por lo menos algunas células expresan PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 utilizando un anticuerpo descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo ya sea in vitro, ex vivo o in vivo.

La invención es concerniente además con un método de tratamiento de un sujeto que sufre de una infección persistente, incluyendo una infección viral, una infección bacteriana, una infección helmíntica, o una infección de protozoarios , que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

La invención abarca además un método de tratamiento de cáncer que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva y un anticuerpo aislado descrito en la presente o un fragmento de enlace de anticuerpo del mismo, en donde el anticuerpo aislado induce citotoxicidad moderada por anticuerpo o es modificado para inducir citotoxicidad moderada por anticuerpo o conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste de una toxina y un agente de formación de imagen. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno que se enlaza a PD-L1 es administrado al sujeto que tiene un cáncer que sobreexpresa PD-Ll . En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno que se enlaza a PD-L2 es administrado al sujeto que tiene un cáncer que sobreexpresa PD-L2.

La invención es concerniente además con un método de tratamiento de un sujeto que sufre de asma, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado que se enlaza a una proteína de PD-L2 descrita en la presente, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo .

La invención también abarca un método de tratamiento un sujeto que sufre de una enfermedad inflamatoria o rechazo de trasplante, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado descrito en la presente, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza una proteína de PD-L1 o una proteína de PD-L2.

La invención también abarca un anticuerpo, un fragmento de enlace de antígeno o un polipéptido descrito en la presente para uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente. La invención también abarca el uso de un anticuerpo, un fragmento de enlace de antígeno o un polipéptido descrito en la presente para la manufactura de un medicamento, tal como un medicamento para el tratamiento cualquiera de las enfermedades descritas en la presente en µ? sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de vectores de expresión para clonación las secuencias de inmunoglobulina humanas ensambladas de la presente invención.

Las Figuras 2A-2E muestran secuencias de región variable de cadena pesada humana compuesta (Figura 2A, VH1; Figura 2B, VH2 ; Figura 2C, VH3 ; y Figura 2D, VH4 ; Figura 2E, VH5) diseñadas para corresponder a aquellas del anticuerpo PD-1 anti-humano de ratón EH12.2H7.

Las Figuras 3A-3D muestran secuencias de región variable de cadena ligera humana compuestas (Figura 3A, V I; Figura 3B, VK2; Figura 3C, VK3; Fig ra 3D, VK4) diseñadas para corresponder a aquellas del anticuerpo PD-1 anti-humano de ratón, EH12.2H7.

Las Figuras 4A-4E muestran secuencias de región variable de cadena pesada humana compuesta (Figura 4A, VHl; Figura 4B, VH2; Figura 4C, VH3; Figura 4D, VH4; Figura 4E, VH5) diseñadas para corresponder a aquella del anticuerpo PD-Ll anti-humano de ratón, 29E.2A3.

Las Figuras 5A-5D muestran secuencias de región variable de cadena ligera humana compuestas (Figura 5A, VKI; Figura 5B, VK2 ; Figura 5C, VK3 ; Figura 5D, V 4) diseñadas para corresponder a aquella del anticuerpo PD-Ll anti-humano de ratón, 29E.2A3.

Las Figuras 6A-6E muestran secuencias de' región variable de cadena pasada humana compuesta (Figura 6A, VHl; Figura 6B, VH2 ; Figura 6C, VH3 ; Figura 6D, VH4 ; Figura 6E, VH5) diseñadas para corresponder a aquella del anticuerpo PD-L2 anti-humano de ratón, 24F.10C12.

Las Figuras 7A-7D muestran secuencias de región variable de cadena ligera humana compuesta (Figura 7A, VKI; Figura 7B, VK2 ; Figura 7C, VK3 ; Figura 7D, V 4) diseñadas para corresponder a aquella del anticuerpo PD-L2 anti-humano de ratón, 24F.10C12.

Las Figuras 8A-8C muestran resultados de SDS-PAGE de 1 \ig de anticuerpos humanos compuestos correspondientes a los anticuerpos anti-humanos de ratón, EH12.2H7, 29E.2A3, y 24F.10C12, respectivamente.

Las Figuras 9A-9C muestran resultados de competencia de ELISA de anticuerpos humanos correspondientes y relativos a los anticuerpos anti-humanos de ratón, EH12.2H7, 29E.2A3, y 24F.10C12, respectivamente. En la Figura 9A, el enlace de los anticuerpos purificados a PD-1 humano fue probado vía ELISA de competencia. Concentraciones variables de cada anticuerpo (0.06 yg/ml a 8 yg/ml) fueron mezcladas con una concentración fija de EH12.2H7 biotinilado (40 ng/ml) y enlazadas a una placa maxisorb de immunolon recubierta con PD-1. El enlace fue detectado vía estreptavidina-HRP y sustrato de OPD. La absorbancia a 490 nm fue medida sobre un lector de placas y esta fue graficada contra la concentración de anticuerpo de prueba. En la Figura 9B, el enlace de los anticuerpos purificados a PD-Ll humano fue probado vía ELISA de competencia. Concentraciones variables de cada anticuerpo (0.02 ug/ml a 8 yg/ml) fueron mezcladas con una concentración fija de 29E.2A3 biotinilado (40 ng/ml) y enlazada a una placa de maxisorb immulon recubierta con PD-Ll . El enlace fue detectado vía estreptavidina-HRP y sustrato de OPD. La absorbancia a 490 nm fue medida sobre un lector de placas y esta fue graficada contra la concentración de anticuerpo de prueba. En la Figura 9C, el enlace de los anticuerpos purificados a PD-L2 humano fue probado vía ELISA de competencia. Concentraciones variables de cada anticuerpo (0.02 µg/ml a 8 µg/ml) fueron mezcladas con una concentración fija de 24F.10C12 biotinilado (40 ng/ml) y enlazadas a una placa maxisorb immulon PD-L2 recubierta. El enlace fue detectado vía estreptavidina-HRP y sustrato de OPD. La absorbanc-ia a 490 nm fue medida sobre un lector de placas y esta fue graficada contra la concentración de anticuerpo de prueba .

Las Figuras 10A-10C muestra los datos de enlace de IC5o resultantes de análisis de competencia de ELISA de anticuerpos humanos compuestos formados de acuerdo con diferentes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras humanas compuestas diseñadas para corresponder a aquellas de los anticuerpos anti-humanos de ratón, EH12.2H7 (Figura 10A) , 29E.2A3 (Figura 10B) , y 24F.10C12 (Figura 10C) , respectivamente. El análisis fue efectuado como se describe en la Figura 3. La IC50 para cada combinación de cadena pesada y ligera fue normalizada contra la IC50 del anticuerpo de ratón. ND = Sin Datos .

La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos de PD-1, PD-L1 y PD-L2.

La Figura 12 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones de CDR de algunos de los anticuerpos humanos compuestos descritos en la presente.

La Figura 13 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de algunos de los anticuerpos humanos compuestos descritos en la presente.

Las Figuras 14A y 14B muestra el efecto de un anticuerpo anti-PD-1 humanizado y un anticuerpo anti-PD-Ll humanos en la capacidad proliferativa de células T CD8 Gag-específicas de SIV in vitro. Cada símbolo representa un macaco individual. Los números en paréntesis representan las veces de incremento en proliferación en presencia.de un Ab de bloqueo en comparación con un Ab sin bloqueo.

La Figura 15 muestra que el bloqueo de PD-Ll restaura la proliferación antígeno-impulsada de células T CD8 intra-hepáticas (datos representativos del animal 1564) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee nuevos terapéuticos a base de anticuerpo para el tratamiento y diagnosis de una variedad de alteraciones moderadas por PD-1, PD-Ll, y/o PD-L2 (por ejemplo, tratamiento de enfermedades infecciosas persistentes, asma, enfermedades inflamatorias, rechazos de trasplante y cánceres) .

Con el fin de que la presente invención pueda ser entendida más fácilmente, ciertos términos son definidos primero. Definiciones adicionales son resumidas en toda la descripción detallada.

Como se usan en la presente, los términos "PD-1", "PD-Ll", y "PD-L2" incluyen cualesquier variantes e isoformas que son expresadas naturalmente por células y/o fragmentos de las mismas que tienen por lo menos una actividad biológica del polipéptido de plena longitud, a no ser que es definan expresamente de otra manera. Además, el término "ligando PD-1" incluye ya sea uno u otro o ambos de PD-Ll (Freeman et al. (2000J J. Exp. Med. 192:1027) y PD-L2 (Latchman et al. (2001) Nat. Iwmunol. 2:261) y cualesquier variantes o isoformas que son expresadas naturalmente por células, y/o fragmentos de las mismas que tienen por lo menos una actividad biológica de los polipéptidos de plena longitud. Por ejemplo, secuencias de PD-1, PD-Ll, y PD-L2 de especies diferentes, incluyendo humanos, son bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo, incorporadas en la presente en su totalidad por referencia, Honjo et al., patente estadounidense No. 5,629,204, que revela secuencias PD-1 humanas y de ratón; Wood et al., patente estadounidense 7,105,328, que revela secuencias de PD-1 humanas; Chen et al., patente estadounidense 6,803,192, que revela secuencias de PD-Ll humanas y de ratón; Wood et al., patente estadounidense 7,105,328, que revela secuencias de PD-Ll humanas; Freeman et al., publicación de patente estadounidense 20020164600, que revela secuencias de PD-L2 humanas y de ratón) .

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de enlace de antígeno (esto es, "porción de enlace de antígeno") o una sola cadena del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas mediante enlaces de disulfuro, o una porción de enlace de antígeno del mismo.

Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CHl, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones que determinan la complementareidads (CDR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR) . Cada una' de VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de término amino a término carboxi en el siguiente orden: FRl, CDR1, FR2, CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. "Anticuerpos desactivantes" se refiere a anticuerpos que no inducen el sistema de complemento.

El término "región hipervariable" , nHVR" , o nHV" , cuando es usado en la presente se refiere a las regiones de un dominio de anticuerpo variable que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . En general", los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en las VH (Hl, H2, H3), y tres en la VL (Ll, L2, L3) . En los anticuerpos naturales, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis HVR, y H3 en particular se cree que juega un papel único en conferir especificidad fina a anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). Por supuesto, anticuerpos de camélido que se presentan naturalmente que consisten de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363 : 446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Un número de delineaciones de región hipervariable están en uso y son abarcados en la presente. Las regiones que determinan la complementareidad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequeríces of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en lugar de esto a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J". Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El extremo del bucle CDR-H1 de Chothia cuando es numerado utilizando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 (véase posteriormente) dependiendo de la longitud del bucle (esto es debido a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B está presente, el bucle termina en 32; si solamente 35A está presente, el bucle termina en 33; si ambos 35A y 35B están presentes, el bucle termina en 34 ) . Las regiones hipervariables de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y bucles estructurales de Chothia y son usados por el software o elementos de programación de modelado dé anticuerpos de AbM molécula de Oxford. Las regiones hipervariables de "contacto" están basadas en un análisis de las estructuras cristalinas complej as disponibles . Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables son indicados a continuación.

Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas " como sigue : 24-36 ó 24-34 (Ll ) , 46-56 ó 50-56 (L2 ) y 89-97 (L3 ) en la VL y 26-35B (Hl ) , 50-65 , 47-65 ó 49-65 (H2 ) y 93 -102 , 94-102 ó 95-102 (H3 ) en la VH . Estas regiones hipervariables extendidas son comúnmente combinaciones de las definiciones de Kabat y Chothia, que pueden incluir además opcionalmente residuos identificados utilizando la definición de contacto. Los residuos de dominio variable son numerados de acuerdo con Kabat et al., supra para cada una de estas definiciones.

Residuos de "Estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de HVR como se define en la presente.

La expresión "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat" y variaciones de las mismas, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos correspondientes a un acortamiento de, o inserción a, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un solo inserto de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo de FR de cadena pesada 82. La numeración de Kabat dé residuos puede ser determinada para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat "estándar".

El término "región de Fe" en la presente es usado para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones de Fe de secuencia natural y regiones de Fe variantes . Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana es usualmente definida para estirarse desde un residuo de aminoácido en posición Cys226, o de Pro230, al término carboxilo del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o mediante diseño recombinantemente del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Así, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos de K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos de K447 removidos, y poblaciones de anticuerpo que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo de K447. Regiones de Fe de secuencia natural apropiadas para uso en los anticuerpos de la invención incluyen IgGl, IgG2 (IgG2A, IgG2B) , IgG3 y IgG4 humanos.

".Receptor de Fe" o nFcR" describe un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases de FcyRI, FCYRII, y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores, los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tiene secuencias de aminoácido similares que difieren principalmente en el dominio citoplásmico de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene una porción de activación a base de tirosina de inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina de inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (véase M. Daéron, Annu. Rev. Iimnunol . 15:203-234 (1997). Los FcR son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. .Rev. Immunol. j): 457-92 (1991); Capel et al., Iwmunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995) . Otros FcR, incluyendo aquellos a ser identificado en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente.

Los términos "CDR", y su plural "CDR" , se refieren a una región que determina la complementareidad (CDR) de los cuales tres componen el carácter de enlace de una región variable de cadena ligera (CDRLl, CDRL2 y CDRL3) y tres componen el carácter de enlace de una región variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3 ) . Las CDR contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo y son separadas por secuencias de aminoácidos que comprenden regiones de andamio o estructura. Las fronteras de CDR definicionales exactas y longitudes están sujetas a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por consiguiente, las ' CDR pueden ser denominadas como por abat, Chothia, contacto o cualesquier otras definiciones de frontera, incluyendo el sistema de numeración descrito en la presente. A pesar de fronteras diferentes, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de superposición en lo que constituye las llamadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas pueden por consiguiente diferir en longitud y áreas de frontera con respecto a la región de estructura adyacente. Véase por ejemplo Kabat, Chothia y/o MacCallum et al., (Kabat et al., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; and MacCallum et al., J. Mol. Biol., 1996, 262: 732, cada una de las cuales es incorporada por referencia en su totalidad) .

Como se usa en la presente, el término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la habilidad para enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, PD-1, PD-L1, y/o PD-L2). Se ha demostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo puede ser efectuada mediante fragmentos de un anticuerpo de plena longitud. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados en el término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios de VH, VL, CL y CH1; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos de Fab enlazados mediante un puente de disulfuro en la región de engozne; (iii) un fragmento dé Fd que consiste de los dominios de VH y CHl; (iv) un fragmento de Fv que consiste de los dominios VH y VL de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546), que consiste de un dominio de VH; y (vi) una región que determina la complementareidad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden opcionalmente estar unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento de Fv, VH y VL, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes , mediante un enlazador sintético que permite que sean hechos como una sola cadena de proteína en la cual las regiones de VH y VL se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv) ; véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423 426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879 5883). Tales anticuerpos de una sola cadena también pretenden ser abarcados en el término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo son obtenidos utilizando técnicas convencionales conocidas para aquellos con habilidad en el arte, y los fragmentos son seleccionados, en cuanto a utilidad en la misma manera como los anticuerpos intactos .

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales ; xenogénicos, alogénicos o singénicos o formas modificadas de los mismos (por ejemplo, humanizados, quiméricos, etc.). Los anticuerpos pueden también ser plenamente humanos. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan específica o sustancialmente de manera específica a polipéptidos de PD-1, PD-Ll o PD-L2. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que muestran una sola especificidad de enlace y afinidad por un epítopo particular. Así, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad de enlace y que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal o sin línea germinal humanas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada .

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo aislado" pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a PD-1, PD-Ll o PD-L2 está sustancialmente libre de anticuerpos que no se enlazan a PD-1, PD-Ll o PD-L2, respectivamente). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un epitopo de PD-1, PD-Ll, y/o PD-L2 puede sin embargo tener reactividad cruzada con otras proteínas de PD-1, PD-Ll, y/o proteína de PD-L2, de diferentes especies. Sin embargo, el anticuerpo siempre se enlaza preferiblemente a PD-1, PD-Ll, y/o PD-L2 humano. Además, un anticuerpo aislado está comúnmente libre sustancialmente de otro material celular y/o químicos . En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferente especificidades a PD-1, PD-Ll, y/o PD-L2 son combinados en una composición bien definida.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que consiste de las CDR de anticuerpos derivados de mamíferos diferentes al humano, y la región de FR y la región constante de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado es útil como un componente efectivo en un agente terapéutico de acuerdo con la presente invención puesto que la antigenicidad del anticuerpo humanizado en el cuerpo humano es disminuida.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo compuesto" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables que comprenden secuencias de inmunoglobulina de línea germinal o sin línea germinal de dos o más regiones variables no relacionadas. Adicionalmente, el término "anticuerpo humano compuesto" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal o sin línea germinal humana y regiones variables que comprenden secuencias de línea germinal o sin línea germinal humana de dos o más regiones variables humanas no relacionadas . Un anticuerpo humano compuesto es útil como un componente efectivo en un agente terapéutico de acuerdo con la presente invención puesto que se disminuye la antigenicidad del anticuerpo humano compuesto en el cuerpo humano.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo humano recombinante" incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes , tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humano o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito adicionalmente en la Sección. I, a continuación) , (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo de un transíectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humanar recombinante, combinatorial , y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualesquier otros medios que involucran el empalme de secuencias de gen de inmunoglobuli a humanas a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal y/o sin línea germinal. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vi tro (o cuando un animal transgénico para secuencias Ig humanas es usado, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones de VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras que son derivadas de y relacionadas con secuencias de VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo heterólogo" es definido en relación con el organismo no humanó transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico de codificación correspondiente a aquella encontrada en un organismo que no consiste del animal no humano transgénico, y en general de una especie diferente a aquella del animal no humano transgénico.

Como se usa en la presente, el término "KD" pretende referirse a la constante del equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.

Como se usa en la presente, el término "enlace específico" se refiere un anticuerpo que se enlaza a un antígeno predeterminado. Comúnmente, el anticuerpo se enlaza con una afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10"7 M, tal como aproximadamente menos de 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M o aún más baja cuando es determinada mediante tecnología de resonancia de plasmon superficial (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 utilizando · PD-1, PD-L1 o PD-L2 humano recombinante como el analito y el anticuerpo como el ligando, y se enlaza al antígeno predeterminado con una afinidad que es por lo menos 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2.0-, 2.5-, 3.0-, 3.5-, 4.0-, 4.5-, 5.0-, 6.0-, 7.0-, 8.0-, 9.0-, o 10.0 veces o mayor que su afinidad por el enlace a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente al antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico por un antígeno" son usados intercambiablemente en la presente con el término "un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno".

Como se usa en la presente, el término "isotipo" se refiere la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificada por genes de región constante de cadena pesada.

Como se usa en la presente, el 'término "patrón de glicosilación" es definido como el patrón de unidades de carbohidrato que son anexadas covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina . Un patrón de glicosilacion de un anticuerpo heterólogo puede ser caracterizado por ser sustancialmente similar a patrones de glicosilacion que ocurren naturalmente en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando aquel de habilidad ordinaria en el arte reconocería el patrón de glicosilacion del anticuerpo heterólogo como siendo más similar a dicho patrón de glicosilacion en la especie del animal transgénico no humano que a la especie de la cual los genes de CH del transgen fueron derivados .

Como se usa en la presente, el término "que ocurre naturalmente" como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede, ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio se presenta en la naturaleza.

Como se usa en la presente, el término "re-acomodado" se refiere a una configuración de un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en donde un segmento de V es colocado inmediatamente adyacente a un segmento de D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio de VH y VL completo, respectivamente. Un sitio de gen de inmunoglobulina rearreglado puede ser identificado por comparación con el ADN de línea germinal; un sitio rearreglado tendrá por lo menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado.

Como se usa en la presente, el término "no arreglado" o "configuración de línea germinal" en referencia a un segmento de V se refiere a la configuración en donde el segmento V no es recombinado para estar inmediatamente adyacente a un segmento de D o J.

Como se usa en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" se pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra.

Como se usa en la presente, el término "molécula de ácido nucleico aislada" en referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se enlazan a PD-1, PD-Ll o PD-L2 , pretende referirse a una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de nucleotidos que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleotidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se enlazan a antígenos diferente a PD-1, PD-Ll o PD-L2, respectivamente, tales otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en ADN genómico humano . Las Figuras 2-7 corresponden a las secuencias de nucleotidos y secuencias de aminoácidos que comprenden las regiones variables de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) de los anticuerpos anti-PD-1, PD-Ll o PD-L2 humanos de la presente invención, respectivamente .

La presente invención también abarca "modificaciones de secuencia conservadoras" de las secuencias resumidas en las figuras (por ejemplo, Figuras 2-7) , incluyendo modificaciones de secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de enlace del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones, adicionales y cancelaciones de nucleótidos y aminoácidos. Las modificaciones pueden ser introducidas a la secuencia resumida en las figuras (por ejemplo, Figuras 2-7) mediante técnicas estándar conocidas en el arte, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis PCR-moderada . Las sustituciones de aminoácido conservadoras incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin cargar (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-Ll o anti-PD-L2 humano es preferiblemente reemplazado con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral .

Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpo de anti-PD-1, PD-Ll o PD-L2 humano, tal como mediante mutagénesis de saturación y los anticuerpos anti-PD-1, anti-PD-Ll o anti-PD-L2 humanos modificados resultantes pueden ser seleccionados en cuanto a actividad de enlace.

Así, los anticuerpos codificados por las secuencias de nucleótidos de región variable de cadena pesada y cadena ligera revelados en la presente y/o que contienen las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera revelados en la presente (por ejemplo, Figuras 2-7) incluyen anticuerpos sustancialmente similares codificados por o que contienen secuencias similares que han sido modificadas conservadoramente . Una discusión adicional en cuanto a como tales anticuerpos sustancialmente similares pueden ser generados en base a las secuencias (por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y ligera) reveladas en la presente (por ejemplo, Figuras 2-7) es provista a continuación.

Además, hay una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de aminoácidos de una proteína particular y las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína, tal como es definido por el código genético (mostrado a continuación) . Asimismo, hay una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico particular y la secuencia de aminoácidos codificada por aquel ácido nucleico, como se define por el código genético.

CÓDIGO GENÉTICO Alanina (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT Arginina (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT Asparagina (Asn, N) AAC, AAT Ácido aspártico (Asp, D) GAC, GAT Cisteína (Cys, C) TGC, TGT Ácido glutámico (Glu, E) GAA, GAG Glutamina (Gln, Q) CAA, CAG Glicina (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT Histidina (His, H) CAC, CAT Isoleucina (lie, I) ATA, ATC, ATT Leucina (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG Lisina (Lys, K) AAA, AAG Metionina (Met, M) ATG Fenilalanina (Phe, F) TC, TTT Prolina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT Serina (Ser, S) AGC, AGT, TCA, CC, Treonina (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT Triptófano (Trp, W) TGG Tirosina (Tyr, Y) TAC, TAT Valina (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT Señal de terminación (fin) TAA, TAG, TGA Un elemento importante y bien conocido del código genético es su redundancia, mediante la cual, para la mayoría de los aminoácidos usados para hacer proteínas, más de un triplete de nucleótido de codificación puede ser empleado (ilustrado anteriormente) . Por consiguiente, un número de diferentes secuencias de nucleotidos pueden codificar para una secuencia de aminoácidos dada. Tales secuencias de nucleotidos son consideradas funcionalmente equivalentes puesto que dan como resultado la producción de la misma secuencia de aminoácidos en todos los organismos (aunque ciertos organismos pueden traducir algunas secuencias más eficientemente que otros). Además, ocasionalmente, una variante metilada de una purina o pirimidina puede ser encontrada en una secuencia de nucleotidos dada. Tales metilaciones no afectan la relación de codificación entre el codón de trinucleótidos y el aminoácido correspondiente .

Para ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando son alineadas y comparadas óptimamente, son idénticas con inserciones o cancelaciones de nucleotidos apropiadas, en por lo menos aproximadamente 80% de los nucleotidos, usualmente por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, o más de los nucleotidos, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 97%, 98%, 99% o más de los nucleotidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos es hibridizarán bajo condiciones de hibridización selectivas, al complemento de la hebra .

El por ciento de identidad entre dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias {esto es, % de identidad # de posiciones idénticas/! total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios o separaciones y la longitud de cada separación o espacio, que necesitan ser introducidos para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de por ciento de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes a continuació .

El por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede ser determinado utilizando el programa de GAP en el pagúete de elementos de programación de GCG (disponible en- el world wide web en el sitio web de la compañía GCG) , utilizando una matriz de NWSgapdna . CMP y un peso de' separación o espacio de 40, 50, 60, 70 ó 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede también ser determinado utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11 17 (1989)) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), y utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de separación de 12 y una penalidad de separación de 4. Además, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444 453 (1970)) que ha sido incorporado al programa de GAP en el paquete de elementos de programación de GCG (disponible en el world wide web en el sitio web de la compañía GCG) , utilizando ya sea una matriz de Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 0 6.

Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de proteína de la presente invención pueden además ser usadas como una "secuencia de interrogación" para efectuar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden ser efectuadas utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 10. Búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden ser efectuadas con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Búsquedas de proteína de BLAST pueden ser efectuadas con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con separaciones o alineaciones con espacios por propósitos de comparación, se puede utilizar BLAST con espacios como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17) :3389 3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con espacios, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden ser usados (disponible en el world wide web en el sitio web de NCBI) .

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en forma parcialmente purificada o forma sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "vuelto sustancialmente puro" cuando es purificado de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis de gel de agarosa y otras conocidas en el arte. Véase, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) .

Las composiciones de ácido nucleico de lá presente invención, en tanto que están frecuentemente en una secuencia natural (excepto para sitios de restricción modificados y los semejantes) , ya sea de cADN, genómico o mezclas de los mismos pueden ser mutados, de acuerdo con técnicas estándar para proveer secuencias genéticas. Para secuencias de codificación, estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoácidos como se desee. En particular, secuencias de ADN sustancialmente homologas a o derivadas de V, D, J, natural, constante, cambios y otras de tales secuencias descritas en la presente son contemplados (en donde "derivado" indica que una secuencia es idéntica o modificada de otra secuencia) .

Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o mej orador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a secuencias reguladoras transcripción, enlazado operativamente significa que las secuencias de ADN que son enlazadas son contiguas y en donde sea necesario para unir dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en cuadro de lectura. Para secuencias de cambio o conmutación, enlazado operativamente indica que las secuencias son aptas de efectuar la recombinación de cambio.

Como se usa en la presente, el término "vector" pretende referirse a una molécula de ácido nucleico apta de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazada. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular al cual segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados . Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN pueden ser ligados al genoma viral. Ciertos vectores son aptos de replicación autónoma en una célula huésped al cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados al genoma de una célula huésped después de introducción a la célula huésped, y mediante esto son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son aptos de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Tales vectores son denominados en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están frecuentemente en forma de plásmidos . En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser usados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuoso de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados ) , que sirve para funciones equivalentes .

Como se usa en la presente, el término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), pretende referirse a una célula a la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Se debe entender que tales términos pretenden referirse no solamente a la célula sujeto particular sino a la progenie de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido ya sea a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede no ser en efecto idéntica a la célula padre, pero son todavía incluidos dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier humano o animal no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser usados para tratar un sujeto con una enfermedad inflamatoria, tal como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en la presente, el término "modular" incluye regulación ascendente y regulación descendente, por ejemplo, mejorar o inhibir una respuesta.

Como se usa en la presente, el término "inhibir" incluye la disminución, limitación o bloqueo de por ejemplo una acción, función o interacción particular.

Como se usa en la presente, el término "célula inmune" se refiere a células que juegan un papel en la respuesta inmune. Las células inmune son de origen hematopoyético e incluyen linfocitos, tales como células B y células T; células asesinas naturales; células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, células cebadas, basófilos y granulocitos .

Como se usa en la presente, el término "célula T" incluye células T CD4+ y células T CD8+. El término célula T también incluye células T tipo T auxiliar 1, células T tipo T auxiliar 2, células T tipo T auxiliar 17 y células T inhibidoras. El término "célula que presenta antígeno" incluye células que presentan antígeno profesionales (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans) también como otras células que presentan antígeno (por ejemplo, queratinocitos , células endoteliales , astrocitos, fibroblastos, oligodendrocitos) .

Como se usa en la presente, el término "respuesta inmune" incluye respuestas inmune moderadas por célula T y/o respuestas inmune moderadas por célula B que son influeciadas por la modulación de co-estimulación de célula T. Respuestas inmune ejemplares incluyen respuestas de célula T, por ejemplo, producción de citocina y citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmune incluye respuestas inmunes que son afectadas indirectamente por la activación de célula T, por ejemplo, producción de anticuerpo (respuestas humorales) y activación de células sensibles a citocina, por ejemplo, macrófagos .

Como se usa en la presente, el término "coestimular", como se usa con referencia a células inmune activadas, incluye la habilidad de un polipéptido co-estimulatorio para proveer una segunda señal moderada por receptor no activante (una "señal co-estimulatoria" ) que induce la proliferación y/o función efectora. Por ejemplo, una señal co-estimulatoria puede dar como resultado secreción de citocina, por ejemplo, en una célula T que ha recibido una señal moderada por el receptor de célula T. Las células inmune que han recibido una señal moderada por receptor de célula, por ejemplo, vía un receptor de activación son denominadas en la presente como "células inmune activadas" .

Como se usa en la presente, el término "señal inhibidora" se refiere a una señal transmitida vía un receptor inhibidor (por ejemplo, CTLA4 o PD-1) para un polipéptido sobre una célula inmune.. Tal señal antagoniza una señal vía un receptor de activación (por ejemplo, vía un polipéptido CD3 o TCR) y puede dar como resultado en por ejemplo, inhibición de generación de segundo · mensajero; una inhibición de proliferación; una inhibición de función efectora en la célula inmune, por ejemplo, fagocitosis reducida, producción de anticuerpo reducida, citotoxicidad celular reducida, la falla de la célula inmune para producir mediadores, (tales como citocinas (por ejemplo, IL-2) y/o mediadores de respuestas alérgicas); o el desarrollo de anergia.

Como se usa en la presente, el término "sin sensibilidad" incluye refractividad de células inmune a estimulación, por ejemplo, estimulación vía un receptor de activación o una citocina. La insensibilidad puede ocurrir, por ejemplo, debido a la exposición a inmunosupresores o exposición a altas dosis de antígeno. Como se usa en la presente, el término "anergia" o "tolerancia" incluye refractividad a estimulación moderada por receptor de activación. Tal refractividad es en general específica de antígeno y persiste después que la exposición al antígeno tolerizante se ha detenido. Por ejemplo, la anergia en células T (en contraposición a insensibilidad) está caracterizada por carencia de producción de citocina, por ejemplo, IL-2. La anergia de célula T ocurre cuando células T son expuestas a antígeno y reciben una primera señal (una señal moderada por receptor de célula T o moderada por CD-3) en ausencia de una segunda señal (una señal co-estimuladora) . Bajo estas condiciones, la exposición de las células al mismo antígeno (aún si la re-exposición ocurre en presencia de un polipéptido co-estimulatorio) da como resultado falla en producir citocinas y asi, falla en proliferar. Las células T anérgicas pueden sin embargo, proliferar si son cultivadas con citocinas (por ejemplo, IL-2). Por ejemplo, también se puede observar la anergia de célula T por la carencia de producción de IL-2 por linfocitos T tal como es medido por ELISA o mediante un análisis de proliferación utilizando una línea de célula indicadora. Alternativamente, se puede usar un constructo de gen reportero. Por ejemplo, las células T anérgicas fallan en iniciar la transcripción del gen IL-2 inducida por un promotor heterologo bajo el control del mejorador crítico IL-2 5' o por un multímero de la secuencia de API que se puede ser encontrar dentro del mejorador (Kang eü al. (1992) Science 257:1134).

Como se usa en la presente, el término "actividad", cuando es usado con respecto a un polipéptido, por ejemplo, polipéptido de PD-1, PD-L1 o PD-L2, incluye actividades que son inherentes en la estructura de la proteína. Por ejemplo, con respecto al ligando de PD-1, el término "actividad" incluye la habilidad para modular la co-estimulación de célula inmune (por ejemplo, al modular una señal co-estimuladora en una célula inmune activada) o para modular la inhibición al modular una señal inhibidora en una célula inmune (por ejemplo, al acoplarse con un receptor natural sobre una célula inmune) . Aquellos de habilidad en el arte reconocerán que cuando un polipéptido de ligando de PD-1 se enlaza a un receptor co- estimulador, una señal co-estimulatoria puede ser generada en la célula inmune. Cuando un polipéptido de ligando de PD-1 se enlaza a un receptor inhibidor, una señal inhibidora es generada en la célula inmune. También, cuando un ligando de PD-1 se enlaza a un polipéptido de B7-1, una señal inhibidora puede ser generada (Butte et al. (2007) Imunity 27:111).

Con respecto a PD-1, el término "actividad" incluye la habilidad de un polipéptido de PD-1 a modular una señal inhibidora en una célula inmune, por ejemplo, al acoplarse con un ligando de PD-1 natural sobre una célula que presenta antígeno. PD-1 transmite una señal inhibidora a una célula inmune de manera similar a CTLA4. La modulación de una señal inhibidora en una célula inmune da como resultado modulación de proliferación de, y/o secreción de citocina por una célula inmune. Así, el término "actividad de PD-1" incluye la habilidad de un polipéptido de PD-1 a enlazares a su(s) ligando (s) natural (es), la habilidad para modular señales co-estimuladoras o inhibidoras de célula inmune, y la habilidad para modular la respuesta inmune.

Como se usa en la presente, el término "interacción", cuando es refiere a una interacción entre dos moléculas, se refiere al contacto físico (por ejemplo, enlace) de las moléculas entre sí. En general, tal interacción da como resultado una actividad (que produce un efecto biológico) de una o ambos de dichas moléculas. La actividad puede ser una actividad directa de una o ambas de las moléculas, (por ejemplo, transducción de señal) . Alternativamente, una o ambas moléculas en la interacción pueden estar impedidas de enlazarse a un ligando y así ser mantenidas inactivas con respecto a la actividad de enlace de ligando (por ejemplo, enlace a su ligando y disparo o inhibición de co-estimulación) . Inhibir tal interacción da como resultado la disrupción de la actividad de una o más moléculas involucradas en la interacción. Mejorar tal interacción es prolongar o incrementar la probabilidad de dicho contacto físico, y prolongar o incrementar la probabilidad de dicha actividad.

Como se usan en la presente las formas singulares "un", "uno", y "el" incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto lo determine claramente de otra manera.

Se comprenderá que aspectos y modalidades de la invención descritos en la presente incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente de" aspectos y modalidades.

Varios aspectos de la invención son descritos en detalle adicional en las siguientes sub-secciones .

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas Un aspecto de la invención es concerniente con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) o porciones biológicamente activas de los mismos, también como fragmentos de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridización para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos y fragmentos para uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de las moléculas de ácido nucleico. Como se usa en la presente, el término, "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, mARN) y análogos del ADN o ARN generado utilizando análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, preferiblemente es ADN de doble hebra.

El término "molécula de ácido nucleico aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto a ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el cual el ADN genómico está asociado naturalmente. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico "aislada" está libre de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (esto es, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' de la molécula de ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual el ácido nucleico es derivado. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cADN, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando es sintetizada químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) o una porción de la misma, puede ser aislada utilizando técnicas de biología molecular estándar y de información de secuencia provista en las mismas. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que abarca todas o una porción de las secuencias mostradas en las Figuras 2-7 puede ser aislada mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados en base a las secuencias mostradas en las Figuras 2-7.

Una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser amplificada utilizando cADN, mAR o alternativamente ADN genómico como plantilla y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con técnicas de administración de PCR estándar. La molécula de ácido nucleico así administrada puede ser clonada a un vector apropiado y caracterizada mediante análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a secuencias de ácido nucleico de la invención pueden ser preparados mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) o una porción de la misma, es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleotidos mostrada en las Figuras 2-7, de tal manera que se puede hibridizar a la secuencia de nucleotidos respectiva mostrada en las Figuras 2-7, formando mediante esto un dúplex estable.

En todavía otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una secuencia de nucleotidos que es por lo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a toda la longitud de la secuencia de nucleotidos mostrada en las Figuras 2-7 o una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleotidos.

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una porción de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquella de las Figuras 2-7) o una porción de la misma, por ejemplo, un fragmento que puede ser usado como una sola o cebador o un fragmento que codifica una porción de un polipéptido de la invención, por ejemplo aquellos de las Figuras 2-7. La sonda/cebador comprende comúnmente oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido comprende comúnmente una región de secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas a por lo menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente alrededor de 20 o 25, más preferiblemente alrededor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 75 nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) de una secuencia anti-sentido de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) o de un mutante de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) .

Las sondas basadas en una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) pueden ser usadas para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican los mismos polipéptidos o polipéptidos homólogos. En una modalidad, la sonda comprende además un grupo marcador anexado a la misma, por ejemplo el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de un polipéptido de la invención" puede ser preparado al aislar una porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2- 7) que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de un polipéptido de la invención (por ejemplo, la habilidad para enlazarse a su objetivo antigénico) , que expresa la porción codificada del polipéptido de la invención (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y determinar la actividad de la porción codificada del polipéptido de la invención.

La invención comprende además moléculas de ácido nucleico que difieren de la(s) secuencia(s) de nucleótido (s ) mostrada (s) en las Figuras 2-7 debido a degeneración del código genético y así codifican los mismos polipéptidos como aquellos codificados por la secuencia de nucleotidos respectiva mostrada en las Figuras 2-7. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleotidos que codifica un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) .

Moléculas de ácido nucleico correspondientes a homólogos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) pueden ser aisladas en base a su homología a los ácidos nucleicos revelados en la presente utilizando los cADN revelados en la presente o una porción de los mismos, como una sonda de hibridización de acuerdo con técnicas de hibridización estándar bajo condiciones de hibridización severas.

Así, en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención es de por lo menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud y se hibridiza bajo condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7).

Como se usa en la presente, el término "hibridiza bajo condiciones severas" pretende describir condiciones para hibridización y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que son significativamente idénticas u homologas entre sí permanecen hibridizadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son de tal manera que secuencias por lo menos aproximadamente 70%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85% o 90% idénticas entre sí permanecen hibridizadas entre sí. Tales condiciones severas son conocidas para aquellos experimentados en el arte y pueden ser encontradas en Current Protocols in Molecular Biology,. Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 and 6. Condiciones severas adicionales pueden ser encontradas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), chapters 7, 9 and 11. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridización severas incluyen hibridización en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 4x o 6x, a aproximadamente 65 SC-702C (o hibridización en SSC 4x más formamida a 50% a aproximadamente 42-502C) seguido por uno o más lavados en SSC lx a aproximadamente 65-70 SC. Un ejemplo no limitante adicional de condiciones de hibridización severas incluyen hibridización a SSC 3x a 452C, seguida por uno o más lavados en SSC 0.2x, SDS al 0.1% a 65SC. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridización altamente severas incluyen hibridización en SSC lx a aproximadamente 65-702C (o hibridización en SSC lx más formamida al 50% a aproximadamente 45-50aC) seguida por uno o más lavados en SSC 0.3x, a aproximadamente 65-702C. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridización de severidad reducida incluye hibridización en SSC 4x o 6x a aproximadamente 50-60 SC (o alternativamente hibridización en SSC 6x más formamida al 50% a aproximadamente 40-45aC) seguida por uno o más lavados en SSC 2x a aproximadamente 50-60aC. Intervalos intermedios a los valores citados anteriormente, por ejemplo a 65-702C o a 42-502C pretenden también ser abarcados por la presente invención. SSPE (SSPE lx es NaCl 0.15 M, aí^PO^ lOmM y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) puede ser sustituido por SSC (SSC lx es NaCl 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) en las soluciones reguladoras de hibridización y lavado; los lavados son efectuados por 15· minutos cada uno después de que la hibridización está completa. La temperatura de hibridización para híbridos anticipada a ser menor que 50 pares de bases de longitud debe de ser de 5-102C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm es determinada de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares de bases de longitud, Tm (°C) =2 ( # of A + T bases) + (# of G +C bases) . Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud Tm (°C) =81.5+16.6 (logio [Na+] ) +0.41 (%G+C) - (600/N) , en donde N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones de sodio en la solución reguladora del pH de hibridización ( [Na+] para SSC lx = 0.165 M) . También se reconocerá por el técnico experimentado que reactivos adicionales pueden ser agregados a las soluciones reguladores de pH de hibridización y/o lavado para disminuir la hibridización no específica de moléculas de ácido nucleico a membranas, por ejemplo membranas de nitrocululosa o nylon, en los que se incluyen pero no limitados a agentes de bloqueo (por ejemplo BSA o ADN portador de esperma de salmón o arenque) , detergentes (por ejemplo, SDS) , agentes quelantes (por ejemplo, EDTA) , Ficol, PVP y los semejantes. Cuando se usan membranas de nylon, en particular, un ejemplo no limitante adicional de condiciones de hibridización severas es hibridización en NaH2P0 0.25-0.5 , SDS al 7% a aproximadamente 65°C, seguida por uno o más lavados a NaH 0.02M, SDS al 1% a 65°C, véase por ejmplo Church and Gilbert (1984) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:1991-1995 (o alternativamente SSC 0.2x, SDS al 1%).

El técnico experimentado apreciará adicionalmente que se pueden introducir cambios mediante mutación a una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7), conduciendo mediante esto a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados de la presente invención, sin alterar la habilidad funcional de . los polipéptidos. Por ejemplo, sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácido en residuos de aminoácidos "no esenciales" se pueden hacer en una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) . Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es requerido para actividad biológica. Por ejemplo, residuos de aminoácidos que son conservados entre los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo aquellos requeridos para enlace de los polipéptidos a su antígeno objetivó, se predice que son particularmente no propensos a alteración.

Así, otro aspecto de la presente invención es concerniente con moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Tales polipéptidos difieren en secuencias de aminoácidos dé aquellos de las Figuras 2-7, todavía retienen actividad biológica. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a aquellas de las Figuras 2-7.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido idéntico a los polipéptidos de aquellos de las Figuras 2-7 puede ser creada al introducir una o más sustituciones, adiciones o cancelaciones de nucleótidos a la secuencia de nucleótidos de aquellas de las Figuras 2-7, de tal manera que una o más sustituciones, adiciones o cancelaciones de aminoácidos son introducidas al poliipéptido codificado. Se pueden introducir mutaciones a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis moderada por PCR. En una modalidad, sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos . Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido espártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, ciste na) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, . metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) puede ser reemplazado con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una(s) molécula(s) de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) , tal como mediante mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados en cuanto a actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad. En seguida de la mutagénesis de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7), el polipéptido codificado puede ser expresado recombinantemente y se puede determinar la actividad del polipéptido.

En una modalidad, un polipéptido mutante de la invención puede ser analizado en cuanto a la habilidad para enlazarse a y/o modular la actividad de un PD-1 natural (por ejemplo, ligandos PD-1) o socio de ligando de PD-1 (por ejemplo, PD-1 y B7-1), modular la señalización intra- o intercelular, modular la activación de linfocito T y/o modular la respuesta inmune de un organismo.

Todavía otro aspecto de la invención es concerniente con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas de fusión. Tales moléculas de ácido nucleico, que comprenden por lo menos una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) enlazadas operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención (aquellas de las Figuras 2-7) puede ser preparada mediante técnicas de ADN recombinante estándar.

Las características de expresión de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) dentro de una línea celular o microorganismo pueden ser modificadas al insertar un elemento regulador de ADN heterólogo al genoma de una línea de célula estable o microorganismo clonado, de tal manera que el elemento regulador insertado es enlazado operativamente con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7) . Por ejemplo, un elemento regulador heterólogo puede ser insertado a una línea celular estable o microorganismo clonado, de tal manera que es enlazado operativamente con moléculas de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, aquellas de las Figuras 2-7), utilizando técnicas tales como recombinación homologa apuntada que son bien conocidas para aquellos de habilidad en el arte y descritas por ejemplo en Chappel, patente estadounidense No. 5,272,071; publicación de PCT No. WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991.

II. Moléculas de polipéptido aisladas Un aspecto de la invención es concerniente con polipéptidos aislados de la presente invención (en los que se incluyen anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos descritos en la presente y aquellos de las Figuras 2-7) y porciones biológicamente activas de los mismos. En una modalidad, los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) y porciones biológicamente activas de los mismos pueden ser aislados de células o fuentes de tejido mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteína estándar. En otra modalidad, los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) y porciones biológicamente activas de los mismos son producidos mediante técnicas de ADN recombinantes . Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) y porciones biológicamente activas de los mismos pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptidos estándar.

Un polipéptido "aislado" o "purificado" o porción, biológicamente activa del mismo está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o fuente de tejido de la cual los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) es derivado o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando es sintetizado químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) y porciones biológicamente activas del mismo, en las cuales el polipéptido está separado de los componentes celulares de las células de las cuales es aislado y producido recombinantemente . En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) y porciones biológicamente activas de los mismos que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no de la presente invención (también denominadas en la presente como una "proteína contaminante" ) , más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de proteínas no de la presente invención, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de proteínas no de la presente invención y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de proteínas no de la presente invención. Cuando polipéptidos de la presente invención (aquellos de las Figuras 2-7) o porción biológicamente activa de los mismos son producidos recombinantemente también están de preferencia sustancialmente libres de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) o porción biológicamente activa de los ' mismos en los cuales el polipéptido está separado de precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis del polipéptido. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) o porción biológicamente activa de los mismos que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o de proteínas no de la presente invención, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o de proteínas no de presente invención, todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o de proteínas no de la presente invención y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o de proteínas no de la presente invención.

Como se usa en la presente, una "porción biológicamente activa" de polipéptido (s ) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) incluyen * polipéptidos que participan en una interacción entre una molécula de PD-1 y una molécula sin PD-1, una molécula de PD-L1 y una molécula sin PD-Ll o una molécula de PD-L2 y una molécula sin PD-L2, por ejemplo, un ligando natural de PD-1, por ejemplo, ligando de PD-1 o un ligando natural de ligando de PD- 1, por ejemplo PD-1 o B7-1, respectivamente. Porciones biológicamente activas de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7), que incluyen menos aminoácidos que el (los) respectivo (s ) polipéptido (s) de plena longitud de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) y exhiben por lo menos una actividad del (los) respectivo (s ) polipéptido (s ) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) . En una modalidad, porciones biológicamente activas comprenden un dominio o porción con la habilidad para enlazarse específicamente a PD-1 o un ligando de PD-1 de acuerdo con el antígeno, respectivamente, al cual fue criado o diseñado para enlazarse. Porciones biológicamente activas de polipéptido(s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) pueden ser usados como objetivos para desarrollar agentes que modulan una actividad moderada por PD-1, PD-L1 o PD-L2, por ejemplo, activación o supresión de célula inmune.

En otra modalidad, el (los) polipéptido (s ) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) tiene (n) una secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 2-7. En otras modalidades, el polipéptido es sustancialmente idéntico al (los) polipéptido (s) mostrado (s) en las Figuras 2-7 y retiene (n) la actividad funcional del (los) polipéptido (s) respectivo (s ) mostrado (s) en las Figuras 2-7 y todavía difiere (n) en secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis, como se describe en detalle en la subsección I anterior. Así, en otra modalidad, un (os) polipéptido (s ) de la presente invención es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 71% ,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% o más idéntica a un (os) polipéptido (s) mostrado (s) en las Figuras 2-7.

Para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias son alineadas por propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se puede introducir separaciones o espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para alineación óptima y las secuencias no idénticas pueden ser descartadas por propósitos de comparación) . En una modalidad, la longitud de una secuencia alineada por propósitos de comparación es por lo menos 30%, preferiblemente por lo menos 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, aun más preferiblemente por. lo menos 60% y aun más preferiblemente por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes son luego comparados. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleotido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en aquella posición (como se usa en la presente, la ' "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico) . El por ciento de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuanto el número de separaciones o espacios y la longitud de cada separación o espacio, que necesitan ser introducidos para alineación óptima de las dos secuencias .

La invención también provee proteínas quiméricas o proteínas de fusión. Como se usa en la presente, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende un (os) polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) enlazados operativamente a un polipéptido no de la presente invención. Un "polipéptido ( s ) de la presente invención" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido mostrado en las Figuras 2-7, mientras que un "polipéptido no de la presente invención" se refiere a un polipéptido que no tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente homogéneo a un polipéptido mostrado en las Figuras 2-7, por ejemplo, un polipéptido que es diferente de un polipéptido mostrado en las Figuras 2-7 y que es derivado del mismo organismo o un organismo diferente-. En la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" pretende indicar que el (los) polipéptido (s) de la presente invención y el (los) polipéptido (s) no de la presente invención están fusionados en cuadro entre sí. El (los) polipéptido (s) no de la presente invención puede (n) ser fusionado (s) al término N o término C del (los) polipéptido (s) de la presente invención y corresponde a una porción que altera la solubilidad, afinidad de enlace, estabilidad o valencia del (los) polipéptido (s) de la presente invención .

Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión de GST con un (os) polipéptido (s ) de la presente invención. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de polipéptidos recombinantes de la invención. En otra modalidad, la proteína de fusión contiene una secuencia de señal heteróloga en su término N. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped mamíferas) , la expresión y/o secreción de polipéptido (s) de la presente invención puede ser incrementada por medio del uso de una secuencia de señal heteróloga.

Un polipéptido (s ) quimérico o de fusión de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) puede ser producido mediante técnicas de ADN recombinantes estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptido son ligados conjuntamente en cuadro de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo al emplear términos de extremos escalonados o de extremos embotados para ligación, digestión de enzimas de restricción para proveer términos apropiados, relleno de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede ser sintetizado mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación de PCR de fragmentos genéticos se puede llevar a cabo utilizando cebadores de afianzamiento que dan surgimiento a colgantes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden subsecuentemente ser recocidos y re-amplificados para generar una secuencia genética quimérica (véase, por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente que ya codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST) .

Las secuencias de aminoácidos de polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) identificadas en la presente permitirán a aquellos experimentados en el arte producir polipéptidos correspondientes a polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) . Tales polipéptidos pueden ser producidos en células huésped procariónticas o eucariónticas mediante expresión de polinucleótidos que codifican un (os) polipéptido (s) de la presente invención (por ejemplo, aquellos de las Figuras 2-7) . Alternativamente, tales péptidos pueden ser sintetizados mediante métodos químicos. Métodos para expresión de polipéptidos heterologos en huéspedes recombinantes, síntesis química de polipéptidos y traducción in vitro son bien conocidos en el arte, y son descritos adicionalmente en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed. , Cold Spring Harbor, N. Y. ; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987). Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu . Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, que son incorporadas en la presente por referencia) .

III. Anticuerpos a PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 Anticuerpos para PD-1, PD-Ll o PD-L2 descritos en la presente pueden ser producidos utilizando cualesquier métodos descritos en la presente o conocidos en el arte. Anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos humanos) de la invención pueden ser producidos utilizando una variedad de técnicas conocidas, tales como la técnica de hibridización de célula somática estándar descrita por Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975) . Aunque los procedimientos de hibridización de células somáticas son preferidos, en principio, también se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B, técnica de despliegue de fago utilizando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos.

Un método para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de la invención es el sistema murino. La producción de hibridoma en ratón es bien conocida en el arte, incluyendo protocolos de inmunización y técnicas para aislar y fusionar esplenocitos inmunizados.

Anticuerpos policlonales pueden ser preparados como se describe anteriormente al inmunizar un sujeto apropiado con un inmunógeno de polipéptido. El título de anticuerpo del polipéptido en el sujeto inmunizado puede ser monitoreado con el paso del tiempo mediante técnicas estándar, tales como con un análisis inmunoabsorbente enzima enlazado (ELISA) utilizando el polipéptido inmovilizado. Si se desea, el anticuerpo dirigido contra el antígeno puede ser aislado del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificado adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción de IgG.. A un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo son más altos, células que producen anticuerpo pueden ser obtenidas del sujeto y usadas para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, tales como la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) (véase también Brown et al. (1981) J. Imunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol . Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Nati. Acad. Sci . 76:2927-31; and Yeh et al. (1982) Int. J. Cáncer 29:269-75), la técnica de hibridoma de célula B humana más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpo monoclonales es bien conocida (véase en general Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies : A New Dimensión In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet . 3:231-36). Brevemente, una línea de célula inmortal (comúnmente un mieloma) es fusionada a linfocitos (comúnmente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno como se describe anteriormente y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes son seleccionados para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza al antígeno de polipéptido, de preferencia específicamente.

Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas pueden ser aplicados por el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-PD-1, PD-Ll o PD-L2 (véase, por ejemplo Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) supra; Lerner (1981) supra; Kenneth (1980) supra) . Además, el técnico de habilidad ordinaria, apreciará que hay muchas variaciones de tales métodos que también serían útiles . Comúnmente, la línea de célula inmortal (por ejemplo, una línea de célula de mieloma) es derivada de la misma especie de mamífero como los linfocitos. Por ejemplo, hibridomas murinos pueden ser elaborados al fusionar linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunógena de la presente invención con una línea de células de ratón inmortalizada. Las líneas de célula inmortal preferidas son líneas de. células de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Cualquiera de un número de líneas de células de mieloma pueden ser usadas como socio de fusión de acuerdo con técnicas estándar, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l , P3-x63-Ag8.653 o Sp2/0-Agl4. Estas líneas de mieloma están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, Md. Comúnmente, las células de mieloma de ratón HAT-sensibles son fusionadas a esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión son luego seleccionadas utilizando el medio de HAT, que asesina a las células de mieloma sin fusionar y células de mieloma fusionadas improductivamente (los esplenocitos sin fusionar mueren después de varios días debido a que no son transformados) . Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención son detectadas al seleccionar los sobrenadantes de cultivo de hibridoma en cuanto a anticuerpos que se enlazan a un polipéptido dado, por ejemplo utilizando un análisis de ELISA estándar.

Como una alternativa a preparar hibridomas que segregan anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal específico para uno de los polipéptidos descritos anteriormente puede ser identificado y aislado al seleccionar una biblioteca de inmunoglobulina combinatorial recombinante (por e emplo, una biblioteca de despliegue de fago de anticuerpo) con el polipéptido apropiado para aislar mediante esto los miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se enlazan al polipéptido. Kits para generar y seleccionar bibliotecas de despliegue de fago están disponibles comercialmente (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612) . Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente propensos para uso en la generación y selección de una biblioteca de despliegue de anticuerpo se pueden encontrar por ejemplo en Ladner et al. Patente estadounidense No. 5,223,409; Kang et al. publicación internacional No. WO 92/18619; Dower et al. publicación internacional No. WO 91/17271; Winter et al. publicación internacional WO 92/20791; Markland et al. publicación internacional No. WO 92/15679; Breitling et al. publicación internacional WO 93/01288; McCafferty' et al. publicación internacional No. WO 92/01047; Garrard et al. publicación internacional' No. WO 92/09690; Ladner et al. publicación internacional No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J". Mol. Biol . 226:889-896; Clarkson' et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; and McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.

Adicionalmente, se pueden generar anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 o PD-L2 recombinantes , tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, compuestos y humanizados, que pueden ser elaborados utilizando técnicas de ADN recombinantes estándar. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos, compuestos y humanizados pueden ser producidos mediante técnicas de ADN recombinantes conocidas en el arte, por ejemplo utilizando métodos descritos en Robinson et al. publicación de patente internacional PCT/US86/02269 ; Akira et al. solicitud de patente europea 184,187; Taniguchi, M. solicitud de patente europea 171,496; Morrison et al. solicitud de patente europea 173,494; Neuberger et al. solicitud de PCT WO 86/01533; Cabilly et al. patente estadounidense No. 4,816,567; Cabilly et al. solicitud de patente europea 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J\ Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cáncer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter patente estadounidense 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Además, anticuerpos humanizados pueden ser elaborados de acuerdo con protocolos estándar tales como aquellos revelados en la patente estadounidense 5,565,332. En otra modalidad, cadenas de anticuerpo o elementos de pares de enlace específicos pueden ser producidos mediante recombinación entre vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican una fusión de una cadena de polipéptido de un miembro de partícula de enlace específico y un componente de un paquete de despliegue genérico replicable y vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican una segunda cadena de polipéptido de un solo elemento de. par de enlace utilizando técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, como se describe en las patentes estadounidenses 5,565,332, 5,871,907 ó 5,733,743. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función de proteína en una célula es también conocido en el arte (véase por ejemplo, Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gen Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. ' 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys . Res. Co nun. 204:666-672; hashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; publicación de PCT No. WO 94/02610 por Marasco et al.; y publicación de PCT No. WO 95/03832 por Duan et al.).

En otra modalidad, anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PD-1, PD-L1 o PD-L2 pueden ser generados utilizando ratones transgénicos o transcromosomales que portan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. En una modalidad, ratones transgénicos, denominados en la presente como "ratones HuMAb" que contienen un minisitio genético de inmunoglobulina humano que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ? ligera humana sin arreglar, junto con mutaciones apuntadas que desactivan los sitios de cadena µ y ? endógenos (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859). Así, los ratones exhiben expresión reducida Ig de ratón o ?, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos sufren conmutación de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgGK humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93, y Harding, F . y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536 546). La preparación de ratones HuMAb es descrita en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647 656; Tuaillon et al. (1993) Proc . Nati. Acad. Sci USA 90:3720 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856 859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579 591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536 546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851. Véase además puntos estadounidenses Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; expedidas a Lonberg y Kay, y GenPharm International; patente estadounidense No. 5,545,807 expedida a Surani et al.; International Publication Nos. WO 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645, publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992.

En otra modalidad, un anticuerpo para uso en la invención es un anticuerpo bisespecífico . Un anticuerpo bisespecífico tiene sitios de enlace para dos antígenos diferentes dentro de un solo polipéptido de anticuerpo. El enlace de antígeno puede ser simultáneo o secuencial. Los triomas e hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos bisespecíficos . Ejemplos de anticuerpos . bisespecíficos producidos por un hibridoma híbrido o un trioma son revelados en la patente estadounidense 4,474,893. Anticuerpos bisespecíficos han sido construidos mediante medios químicos (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, y Pérez et al. (1985) Nature 316:354) y tecnología de hibridoma (Staerz y Bevan (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:1453, y Staerz y Bevan (1986) Irnmunol. Today 7:241) . Anticuerpos bisespecíficos son también descritos en la patente estadounidense. 5,959,084. Fragmentos de anticuerpos bisespecíficos son descritos en la patente estadounidense 5,798,229. Agentes biespecíficos pueden también ser generados al elaborar heterohibridomas al fusionar hibridomas u otras células que elaboran diferentes anticuerpos, seguido por identificación de clones que producen y co-ensamblan ambos anticuerpos. También pueden ser generados mediante conjugación química o conjugación genética de cadenas de inmunoglobulina completas o porciones de las mismas tales como secuencias de Fab y Fv. El componente de anticuerpo se puede enlazar al polipéptido de PD-1, PD-L1, y/o un polipeptido de PD-L2. En una modalidad, el anticuerpo bisespecífico se podría enlazar específicamente tanto a un ligando de PD-1 como un polipéptido de PD-1.

Todavía otro aspecto de la invención es concerniente con anticuerpos de polipéptido anti-PD-1, PD-L1 o PD-L2 que son obtenibles mediante un proceso que comprende, inmunizar un animal con un polipéptido de PD-1, PD-L1 o PD-L2 inmunogénico, respectivamente, o una porción inmunógena del mismo; y luego aislar de los anticuerpos del animal que se enlacen específicamente al polipéptido.

En todavía otro aspecto de la invención, secuencias de anticuerpo parciales o conocidas pueden ser usadas para generar y/o expresar nuevos anticuerpos . Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivos predominantemente por medio de residuos de aminoácidos que están ubicados en las seis regiones que determinan la complementareidad de cadena pesada y ligera (CDR) . Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables por la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos que se presentan naturalmente específicos al construir vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del antígeno que se presenta naturalmente específico injertadas sobre secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Náture 332:323 327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522 525; y Queen, C. eü al., 1989, Proc . Nati. Acad. Véase. U.S.A. 86:10029 10033). Tales secuencias de estructura pueden ser obtenidas a partir de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias genéticas de anticuerpo de línea germinal o secuencias genéticas de anticuerpo sin línea germinal. Estas secuencias de línea germinal diferirán de las secuencias genéticas de anticuerpo maduras debido a que no incluirán genes variables completamente ensamblados, que son formados mediante la unión de V(D)J durante la maduración de célula B. Las secuencias genéticas de línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad e individual igualmente a través de la región variable. Por ejemplo, mutaciones somáticas son relativamente no frecuentes en la porción amino-terminal de la región de estructura 1 en la porción carboxi-terminal de la región de estructura 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de enlace del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener toda la secuencia de ADN de un anticuerpo particular con el fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de enlace similares a aquellas del anticuerpo original (véase PCT/US99/05535 presentada el 12 de marzo de 1999) . La extensión de secuencia de cadena pesada y ligera parcial de las regiones de CDR es comúnmente suficiente para este propósito. La secuencia parcial es usada para determinar cuales segmentos genéticos variables y de unión de linea germinal y/o sin linea germinal contribuyeron a los genes variables de anticuerpo recombinados . La secuencia de línea germinal y/o secuencia sin línea germinal es luego usada para llenar porciones faltantes de las regiones variables. Secuencias líderes de cadena pesada y ligera son escindidas durante la maduración de proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para agregar secuencias faltantes, secuencias de cADN clonadas pueden ser combinadas con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación de PCR. Alternativamente, toda la región variable puede ser sintetizada como un conjunto de oligonucleótidos corto, traslapantes y combinados mediante amplificación de PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventaj'as tales como eliminación o inclusión o sitios de restricción particulares u optimización de codones particulares. El proceso puede también ser usado para seleccionar bibliotecas de secuencias que codifican inmunoglobulina particulares en una especie (por ejemplo, humano) para diseñar secuencias de codificación de inmunoglobulina cognatas de secuencia de anticuerpo conocida en otra especie (por ejemplo, ratón) (véase, por ejemplo, la sección de ejemplos a continuación) .

Las secuencias de nucleótidos de transcriptos de cadena pesada y ligera de un hibridoma son usadas para diseñar un conjunto traslapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias de V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácido sintéticas como las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: cadenas de bases de nucleotido repetidas son interrumpidas para facilitar la síntesis de oligonucleótido y amplificación de PCR; sitios de inicio de traducción óptimos son incorporados de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870) ,- y, sitios HindIII son diseñados corriente arriba de los sitios de inicio de traducción.

Para ambas de las regiones variables de cadena pesada y ligera, las secuencias de hebra de codificación optimizada y sin codificación correspondiente son descompuestas en 30-50 nucleótidos aproximadamente el punto medio del oligonucleótido de- codificación correspondiente. Así, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ser ensamblados en conjuntos de doble hebra traslapantes que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Los fondos son luego usados como plantillas para producir productos de amplificación de PCR de 150-400 nucleótidos. Comúnmente, un solo conjunto de oligonucleótidos de región variables será descompuesto en dos fondos que son amplificados separadamente para generar dos productos de PCR traslapantes. Estos productos traslapantes son luego combinados mediante amplificación de PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento de superposición o fragmento traslapante de la región constante de cadena pesada o ligera en la amplificación de PCR para generar fragmentos que pueden fácilmente ser clonados a los constructos del vector de expresión.

Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas son luego combinadas con secuencias de promotor clonadas, secuencia líder, de inicio de traducción, secuencia líder, región constante, 3' sin traducir, poliádenilación y terminación de transcripción, para formar constructos del vector de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera pueden ser combinados a un solo vector, co-transfectado , transfectado serialmente o transfectado separadamente a células huésped que son luego fusionadas para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas .

Los plásmidos para este uso son conocidos en el arte e incluyen los plásmidos provistos en la sección de ejemplos posteriormente en la presente. Anticuerpos plenamente humanos y quiméricos de la presente invención también incluyen anticuerpos IgG2 , IgG3 , IgE, IgA, IgM, e IgD. Plásmidos similares pueden ser construidos para expresión de otros isotipos de cadena pesada o para expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

Así, en otro aspecto de la invención, los elementos estructurales de anticuerpos no humanos o humanos conocidos (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1, PD-Ll o PD-L2 antihumano de ratón, tales como anticuerpos EH12.2H7, 29E.2A3, y 24F.10C12 respectivamente) son usados para crear anticuerpos PD-1, PD-Ll o PD-L2 anti-humanos humanos estructuralmente relacionados que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como enlace a PD-1, PD-Ll o PD-L2. Otra propiedad funcional incluye inhibir el enlace de EH12.2H7 a PD-1, 29E.2A3 a PD-Ll ó 24F.10C12 a PD-L2 en un análisis de ELISA de competencia. En algunas modalidades, los anticuerpos PD-1, PD-Ll o PD-L2 anti-humanos estructuralmente relacionados tienen una afinidad de enlace más baja al antígeno en comparación con el anticuerpo EH12.2H7, 29E.2A3 ó 24F.10C12 tal como es medido por el valor de IC50 como se describe en él Ejemplo 2 (por ejemplo, la afinidad del anticuerpo de referencia murino no es mayor que cualquiera de 3.0, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 ó 1.1 veces del anticuerpo estructuralmente relacionado) . En algunas modalidades, los anticuerpos PD-1, PD-Ll o PD-L2 anti-humanos estructuralmente relacionados tienen una afinidad más alta al antígeno en comparación con el anticuerpo EH12.2H7, 29E.2A3 ó 24F.10C12 tal como es medida por el valor de IC50 como se describe en el Ejemplo 2 (tal como la afinidad del anticuerpo estructuralmente relacionado es por lo menos 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 ó 2.0 veces del anticuerpo de referencia). Además, una o más regiones de CDR o regiones variables de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) pueden ser combinadas recombinantemente con regiones de estructura humanas conocidas y CDR para crear anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 o PD-L2 humanos diseñados recombinantemente adicionales de la invención.

Puesto que es bien conocido en el arte que los dominios de CDR3 de cadena pesada y ligera de anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de enlace de un anticuerpo por un antígeno, los anticuerpo recombinantes de la invención preparados como se resume anteriormente comprenden preferiblemente las CDR3 de cadena pesada y ligera de regiones variables de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7). Los anticuerpos comprenden además las CDR2 de regiones variables de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7). Los anticuerpos pueden comprender además las CDRl de regiones variables de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7). Los anticuerpos pueden comprender además cualesquier combinaciones de las CDR.

Las CDRl, 2 y/o 3 regiones de los anticuerpos diseñados descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia (s) de aminoácidos exacta (s) como aquellas de las regiones variables de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) revelada en la presente. Sin embargo, el técnico ordinariamente experimentado apreciará que alguna desviación de las secuencias de CDR exactas puede ser posible en tanto que todavía retiene la habilidad del anticuerpo para enlazarse a PD-1, PD-Ll o PD-L2 efectivamente (por ejemplo, modificaciones de secuencia conservadoras). Así, en otra modalidad, el anticuerpo diseñado puede estar compuesto de una o más CDR que son, por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96·%, 97%, 98%, 99% o 99.5% idénticas a una o más CDR de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) .

Además de simplemente el enlace de PD-1, PD-Ll o PD-L2, anticuerpos diseñados tales como aquellos descritos anteriormente pueden ser seleccionados por su retención de otras propiedades funcionales de anticuerpos de la invención, tales como: (1) enlace a PD-1, PD-Ll o PD-L2 humano; (2) inhibición de enlace de EH12.2H7 a PD-1, 29E.2A3 a PD-Ll o 24F.10C12 a PD-L2 ; (3) enlace a PD-1 humano e inhibición de la habilidad del PD-1 enlazado para enlazarse a ligandos de PD-1 (por ejemplo, PD-Ll y/o PD-L2) ; (4) enlace a PD-Ll humano e inhibición de la habilidad del PD-Ll enlazado para enlazarse a ligandos de PD-Ll (por ejemplo, PD-1 y/o B7-1) ; (5) enlace a PD-L2 humano e inhibición de la habilidad del PD-L2 enlazado para enlazarse a ligandos de PD-L2 (por ejemplo, PD-1) .

Secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera para el anticuerpo EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 son mostradas a continuación.

Región variable de cadena pesada de EH12.2H7 QVQLQQSGAELAKPGASVQMSCKASGYSFTSSWIHWVKQRPGQGLEWIGYIYPSTGFTEY QK FKDKATLTAD SSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWRDSSGYHA DYWGQGTSV VSS ( SEQ ID NO: 76) Región variable de cadena ligera de EH12.2H7 DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKFGSNLESGIP ARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 77) Región variable de cadena pesada de 29E.2A3 EVQLQQSGPELWPGASViaíSCKASGYTFTSYvMH WQKPGQGLEWIGYVNPFNDGTKYNEM FKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARQAWGYPWGQGTLWVSA (SEQ ID NO: 78) Región variable de cadena ligera de 29E.2A3 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRATESVEYYGTSLVQWYQQKPGQPPKLLIYAASSVDSGVP ARFSGSGSGTDFSLTIHPVEEDDIAMYFCQQSRRVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 79) Región variable de cadena pesada de 24F.10C12 QVQLQQSAAELARPGASVWiSCKASGYTFTGYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPRSGYTEYNQK FKDKTTLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARPWFAYWGQGTLVVSA (SEQ ID NO: 80) Región variable de cadena ligera de 24F.10C12 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQ YLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESG VPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQ DYSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 81) La actividad de los anticuerpos para inhibir el enlace de PD-1, PD-Ll o PD-L2 a su(s) ligando (s) puede ser determinada al probar la habilidad del anticuerpo para bloquear el enlace entre PD-1, PD-Ll o PD-L2 y su ligando. Un análisis de ELISA de competencia en presencia de un ligando marcado y el anticuerpo puede ser usado. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo anti-PD-Ll podría bloquear la interacción entre PD-1 y PD-Ll, se efectúa un experimento de enlace competitivo. Células que expresan PD-Ll son preincubadas con el anticuerpo anti-PD-Ll seguido por la adición de la proteína de fusión de PD-l-Ig biotinilada. Si el anticuerpo anti-PD-Ll bloquea el enlace de PD-l-Ig de manera dependiente de la dosis y con alta avidez, se considera que el anticuerpo anti-PD-Ll es efectivo para inhibir la interacción entre PD-1 y PD-Ll . Pruebas similares se pueden llevar a cabo para probar anticuerpos que son efectivos para inhibir la interacción de PD-1 y PD-L2.

IV. vectores de Expresión Recombinantes y Células Huésped Otro aspecto de la invención es concerniente con vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen una, dos o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) (b una porción de los mismos) . Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazada. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular al cual segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados al genoma viral . Ciertos vectores son aptos de replicación autónoma en una célula huésped a la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) son integrados al genoma de una célula huésped después de introducción a la célula huésped y mediante esto son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son aptos de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Tales vectores son denominados en la presente como "vectores de expresión" . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes están frecuentemente en forma de plásmidos . En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser usados intercambiablemente ya que el plásmido es la¦ forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuoso de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados ) , que sirven para funciones equivalentes .

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma apropiada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huéspedes a ser usadas para expresión, que son enlazadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico a ser expresada. En un vector de expresión recombinante, "enlazado operativamente" pretende dar a entender que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector es introducido a la célula huésped) . El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, me oradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7. Secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido) . Se apreciará por aquellos experimentados en el arte que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado y los semejantes. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos a células huésped para producir mediante esto proteínas o péptidos, que incluyen proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden ser diseñados para expresión de polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) en células procariónticas o eucariónticas . Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser expresados en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o células mamíferas . Células huésped apropiadas son discutidas adicionalmente en Goeddel (1990) supra. Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor de T7 y T7 polimerasa.

La expresión de polipéptidos en procariontes es efectuada más frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión ya sea de proteínas de fusión o proteínas sin fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, usualmente al término amino del polipéptido recombinante . Tales vectores de fusión sirven comúnmente para tres propósitos: 1) incrementar la expresión del polipéptido recombinante; 2) incrementar la solubilidad del polipéptido recombinante; y 3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante al actuar como ligando en la purificación de afinidad. Frecuentemente, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de escisión proteolítico es introducido en la unión de la porción de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante de la porción de fusión subsecuente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas y sus secuencias de reconocimiento cognatas, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gen 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Masa.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST) , proteína de enlace de maltosa E o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante objetivo.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli sin fusión inducibles apropiados incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Gen 69:301-315) y ET 1 Id (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185:60-89). La expresión genética objetivo del vector de pTrc vector depende de la transcripción de la AKN polimerasa huésped de un promotor de fusión de trp-lac híbrido. La expresión genética objetivo del vector de pET 11 d depende de la transcripción de un promotor de fusión de T7 gnlO-lac moderado por una AR polimerasa viral co-expresada (T7 gnl) . Esta polimerasa viral es suministrada por cepas huéspedes BL2KDE3) o HMS174(DE3) de un profago residente que alberga un gen T7 gnl bajo el control transcripcional del promotor de lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante en E. coli es expresar el polipéptido en bacterias huéspedes con capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol. 185:119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico a ser insertado a un vector de expresión, de tal manera que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos utilizados preferiblemente en E. coli (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN estándar.

En otra modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gen 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) pueden ser expresados en células de insectos utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para expresión de polipéptidos en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

En todavía otra modalidad, un ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo. Figuras 2-7) es expresado en células mamíferas utilizando un vector de expresión mamífero. Ejemplos de vectores de expresión mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa en células mamíferas, las funciones de control del vector de expresión son frecuentemente provistas por elementos regulatorios virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente son derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus simio 40. Para otros sistemas de expresión apropiados tanto para células procariónticas como eucariónticas, véanse capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 'Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

En otra modalidad, el vector de expresión mamífero recombinante es apto de dirigir la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, elementos regulatorios específicos de tejido son usados para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores tejido-específicos son conocidos en el arte. Ejemplos no limitantes de promotores tejido-específicos apropiados incluyen el promotor de albúmina (hígado-específico; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores linfoide-específicos (Caíame y Eaton (1988) Adv. Immunol . 43:235-275), promotores particulares de receptores de célula T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores neurona-específicos (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores páncreas-específicos (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores glándula mamaria-específieos (por ejemplo, promotores de suero de leche; patente estadounidense No. 4,873,316 y publicación de solicitud europea No. 264,166). Promotores regulados por desarrollo son también abarcados, por ejemplo, por los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor .alfa. -fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546) .

Otro aspecto de la invención es concerniente con células huésped a las cuales una molécula de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) es introducida dentro de un vector de expresión recombinante o molécula de ácido nucleico que contiene secuencias que le permiten recombinarse homologamente a un sitio específico del genoma de la célula huésped. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" son usados intercambiablemente en la presente. Se comprenderá que tales términos se refieren no solamente a las células sujeto particular sino a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido ya sea a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede no ser en efecto idéntica a la célula padre, pero todavía incluida dentro del alcance del término como se usa en la presente.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procarióntica o eucarióntica . Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) puede ser expresado en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o mamíferas (tal como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS) . Otras células huésped apropiadas son conocidas para aquellos experimentados en el arte.

El ADN vector puede ser introducido a células procariónticas o eucariónticas vía técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usan en la presente, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) a una célula huésped, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección moderada por DEAE-dextrana, lipofección o electroporación . Métodos apropiados para transformar o transíectar células huésped se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para transfección estable de células mamíferas, es conocido que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usada, solamente una pequeña fracción de células pueden integrar el ADN extraño a su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) es en general introducido a las células huésped junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede ser introducido a una célula huésped en el mismo vector como aquel que codifica un polipéptido de PD-L2 o puede ser introducido en un vector separado. Células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas mediante selección de fármaco (por ejemplo, células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirá, mientras que las otras células mueren) .

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procarióntica o eucarióntica en cultivo, puede ser usada para producir (esto es, expresar) un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) . Así, la invención provee además métodos para producir un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) utilizando las células huésped de la presente invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (a la cual un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) ha sido introducido) en un medio apropiado, de tal manera que un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) es producido. En otra modalidad, el método comprende además aislar un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, Figuras 2-7) del medio o la célula huésped.

Las células huésped de la invención pueden también ser usadas para producir animales transgénicos no humanos, como se describe posteriormente en la presente.

V. Producción de Animales No Humanos Transgénicos y Transcromosomales Que Generan Anticuerpos PD-1, PD-Ll o PD-L2 Humanos Compuestos En todavía otro aspecto, la invención provee animales no humanos transgénicos y transcromosomales, tales como ratones transgénicos o transcromosomales , que son aptos de expresar anticuerpos monoclonales humanos que se enlazan específicamente a PD-1, PD-Ll o PD-L2. En una modalidad particular, la invención provee un ratón transgénico o transcromosomal que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana, de tal manera que el ratón produce anticuerpos anti-PD-1, PD-Ll o PD-L2 humanos cuando es inmunizado con antígeno de PD-1, PD-Ll o PD-L2 y/o células que expresan PD-1, PD-Ll o PD-L2. El trangen de cadena pesada humano puede ser integrado al ADN cromosomal del ratón, como es el caso para ratones transgénicos, por ejemplo HuMAb, de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Alternativamente, el trangen de cadena pesada humana puede ser mantenido extracromosomalmente, como es el caso para ratones transcromosomales (por ejemplo, KM) como se describe en WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosomales son aptos de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos' a PD-1, PD-Ll o PD-L2 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al sufrir recombinación de V-D-J y conmutación de isotipo. La conmutación de isotipo puede ocurrir, por ejemplo mediante conmutación de isotipo clásica o no clásica.

El diseño de un animal no humano transgénico o transcromosomal que responde a estimulación de antígeno extraño con un repertorio de anticuerpo heterólogo, requiere que los transgenes de inmunoglobulina heterologos contenidos dentro del animal transgénico funcionen correctamente en toda la ruta del desarrollo de célula B. Esto incluye, por ejemplo, conmutación o cambio de isotipo del transgen de cadena pesada heterólogo. Así, transgenes son construidos para producir conmutación o cambio o isotipo y uno o más de los siguientes anticuerpos: (1) expresión específica del tipo de célula y de alto nivel, (2) rearreglo genético funcional, (3) activación de y respuesta a exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señal, (6) hipermutación somática y (7) dominación del sitio de anticuerpo de transgen durante la respuesta inmune.

No todos los criterios anteriores necesitan ser satisfechos. Por ejemplo, en aquellas modalidades en donde los sitios de inmunoglobulina endógenos del animal transgénico están disrumpidos funcionalmente, el transgen no necesita activar la exclusión alélica. Además, en aquellas modalidades en donde el transgen comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera funcionalmente rearreglado, los segundos criterios de rearreglo de gen funcional no son necesarios, por lo menos para aquel transgen que ya está rearreglado. Para antecedentes en cuanto a inmunología molecular, véase, Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.

En ciertas modalidades, los animales no humanos transgénicos transcromosomales usados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina heterólogos rearreglados , sin rearreglar o una combinación de rearreglados y sin arreglar en la línea germinal del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de cadena pesada comprende por lo menos un gen de CH. Además, el transgen de cadena pesada puede contener secuencias de conmutación o cambio de isotipo funcionales que son aptas de soportar el cambio o conmutación de isotipo de un transgen heterólogo que codifica múltiples genes de CH en las células B del animal transgénico. Tales secuencias de conmutación o secuencias de cambio pueden ser aquellas que ocurren naturalmente en el sitio de inmunoglobulina de línea germinal de la especie que sirve como la fuente de los genes de CH de transgen o tales secuencias de conmutación pueden ser derivadas de aquellas que ocurren en las especies que van a recibir el constructo de transgen (el animal transgénico) . Por ejemplo, un constructo de transgen humano que es usado para producir un ratón transgénico puede producir una frecuencia más alta de eventos de conmutación de isotipo si incorpora secuencias de conmutación similares a aquellas que ocurren naturalmente en el sitio de cadena pesada de ratón, ya que supuestamente las secuencias de conmutación de ratón están optimizadas para funcionar con el sistema de enzima de recombinasa de conmutación de ratón, mientras que las secuencias de conmutación humanas no. Secuencias de conmutación pueden ser aisladas y clonadas mediante métodos de clonación convencionales o pueden ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos traslapantes diseñados en base a información de secuencia publicada concerniente con secuencias de región de conmutación de inmunoglobulina (Mills et al., Nucí. Acids Res. 15:7305 7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631 642 (1989)). Para cada uno de los animales transgénicos anteriores, transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera heterologos rearreglados funcionalmente son encontrados en una fracción significativa de las células B del animal transgénico (por lo menos 10 por ciento) .

Los transgenes usados para generar los animales transgénicos de la invención incluyen un transgen de cadena pesada que comprende ADN que codifica por lo menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de diversidad, un segmento de gen de unión y por lo menos un segmento de gen de región constante. El transgen de cadena ligera de inmunoglobulina comprende ADN que codifica por lo menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de unión y por lo menos un segmento de gen de región constante. Los segmentos genéticos que codifican los segmentos de gen de cadena ligera y pesada son heterólogos al animal no humano transgénico en que son derivados de, o corresponden a ADN que codifica segmentos de gen de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de una especie que no consiste del animal no humano transgénico. En un aspecto de la invención, el transgen es construido de tal manera que los segmentos de gen individuales están sin arreglar, esto es, no rearreglados para codificar una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina funcional. Tales transgenes sin arreglar soportan la recombinación de los segmentos de gen V, D y J (rearreglo funcional) y preferiblemente soportan la incorporación de todo o una porción de un segmento de gen de región D en la cadena pesada de inmunoglobulina rearreglada resultante dentro del animal no humano transgénico cuando es expuesto al antígeno de PD-1, PD-L1 o PD-L2.

En una modalidad alternativa, los transgenes comprenden un "mini-sitio" sin arreglar. Tales transgenes comprenden comúnmente una porción sustancial de los segmentos de C, D, y J, también como un subcon unto de los segmentos de gen de V. En tales constructos de transgen, las varias secuencias reguladoras, por ejemplo, secuencias de promotores, mej oradores, regiones de conmutación de clase, empalme-donador y empalme-aceptor para procesamiento de ARN, señales de recombinación y los semejantes, comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden ser incorporadas al transgen de · la misma especie o una especie relacionada del animal no humano usado en la invención. Por ejemplo, segmentos de gen de inmunoglobulina humana pueden ser combinados en un transgen con una secuencia de mej orador de inmunoglobulina de roedor para uso en un ratón transgénico. Alternativamente, secuencias reguladoras sintéticas pueden ser incorporadas al transgen, en donde tales secuencias reguladoras sintéticas no son homologas a una secuencia de ADN funcional que se sabe que ocurre naturalmente en los genomas de mamíferos . Secuencias reguladoras sintéticas son diseñadas de acuerdo con reglas de consenso, tales como, por ejemplo, aquellas que especifican las secuencias permisibles de un sitio de empalme-aceptor o una porción de promotor/me orador . Por ejemplo, un minisitio comprende una porción del sitio de inmunoglobulina genómico que tiene por lo menos una cancelación interna (esto es, no en un término de la porción) de una porción de ADN no esencial (por ejemplo, secuencia intermedia; intron o porción del mismo) en comparación con el sitio de Ig de línea germinal que se presenta naturalmente.

Los ratones transgénicos y transcromosomales empleados en la presente invención' pueden exhibir producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, idealmente similar sustancialmente a aquel de un ratón natural. Así, por ejemplo, en modalidades en donde los genes de Ig endógenos han sido desactivados, los niveles de inmunoglobulina total pueden fluctuar de aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml de suero o de aproximadamente 0.5 a 5 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 1.0 mg/ml. Cuando un transgen apto de efectuar una conmutación de IgG a partir de IgM ha sido introducido al ratón transgénico, la proporción en ratón adulto de IgG a IgM en el suero puede ser de aproximadamente 10:1. La proporción de IgG a IgM será mucho más baja en el ratón inmaduro. En general, mayor de aproximadamente 10%, preferiblemente 40 a 80% de las células B de bazo y nodo linfático expresan exclusivamente proteína de IgG humana.

El repertorio se aproximará idealmente a aquel mostrado en un ratón natural, usualmente por lo menos aproximadamente 10% tan alta o 25 a 50% o más. En general, por lo menos aproximadamente mil inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), por ejemplo, preferiblemente 104 a 106 o más, serán producidas, dependiendo principalmente del número de diferentes regiones de V, J y D introducidas al genoma del ratón. Estas inmunoglobulinas reconocerán comúnmente alrededor de la mitad o más de proteínas altamente antigénicas, por ejemplo, proteína de staphylococcus A. Comúnmente, las inmunoglobulinas exhibirán una afinidad (KD) por antígenos ' preseleccionados de menos de 10"7 M, tal como menor de 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M o aún más baja.

En algunas modalidades, puede ser preferible generar ratones con repertorios predeterminados para limitar la selección de genes V representados en la respuesta de anticuerpo a un tipo de antígeno predeterminado. Un transgen de cadena pesada que tiene un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes de VH humanos que son preferiblemente usados en respuestas de anticuerpo al tipo de antígeno predeterminado en humanos. Alternativamente, algunos genes de VH pueden ser excluidos de un repertorio definido por varias razones (por ejemplo, tener una baja probabilidad de codificar regiones de V de alta afinidad por antígeno predeterminado; tener una baja propensión a sufrir mutación somática y afilamiento de afinidad; o son inmunógenos a ciertos humanos) . Así, antes del rearreglo de un transgen que contiene varios segmentos de gen de cadena pesada o ligera, tales segmentos de gen pueden ser identificados fácilmente, por ejemplo mediante hibridización o secuencia.cion de ADN, por ser de una especie de organismo diferente al animal transgénico.

Los ratones transgénicos y transcromosomales como se describen anteriormente pueden ser inmunizados con, por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida de antígenos de PD-1, PD-L1 o PD-L2 y/o células que expresan PD-1, PD-L1 o PD-L2. Alternativamente, los ratones transgénicos pueden ser inmunizados con ADN que codifica PD-1, PD-Ll o PD-L2 humanos.

Los ratones producirán luego células B que sufren conmutación de clase vía recombinación de conmutación de intratransgen (cis-conmutación) y expresan inmunoglobulinas reactivas con PD-1, PD-Ll o PD-L2. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos humanos (también denominados como "anticuerpos de secuencia humana"), en donde los polipéptidos de cadena pesada y ligera son codificados por secuencias transgénicas humanas, que pueden incluir secuencias derivadas mediante mutación somática y uniones recombinatoriales de región V, también como secuencias línea germinal-codificadas; estos anticuerpos humanos pueden ser denominados por ser sustancialmente idénticos a una secuencia de polipéptido codificada por un segmento de gen de VL o VH humano y un. segmento de JL o JH y JH humano, aunque otras secuencias sin línea germinal pueden estar presentes como resultado de mutación somática y juntas de recombinación V-J y V-D-J diferenciales . Las regiones variables de cada cadena de anticuerpo son comúnmente por lo menos 80 por ciento codificadas por V, J de línea germinal humana y en el caso de cadenas pesadas, D, segmentos genéticos; frecuentemente por lo menos 85 por ciento de las regiones variables son codificadas por secuencias de línea germinal humanas presentes en el transgén; frecuentemente 90 o 95 por ciento o más de las secuencias de región variables son codificadas por secuencias de línea germinal humanas presentes en el transgen. Sin embargo, puesto que secuencias sin línea germinal son introducidas mediante mutación somática y unión de VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia humana frecuentemente tendrán algunas secuencias de región variable (y menos frecuentemente secuencias de región constante) que no son codificadas por segmentos de gen V, D, o J humanos, como se encuentra en el (los) transgen(es) humano (s) en la línea germinal de los ratones. Comúnmente, tales secuencias sin línea germinal (o posiciones de nucleótidos individuales) se agruparán en o cerca de CDR o en regiones en donde se sabe que las mutaciones somáticas se agrupan.

Los anticuerpos humanos que se enlazan al antígeno predeterminado pueden resultar de conmutación de isotipo, de tal manera que anticuerpos humanos que comprenden una cadena ? de secuencia humana (tal como ??, y2a, ?2?, o ?3) o una cadena ligera de secuencia humana (tal como kappa) son producidas. Tales anticuerpos humanos isotipo-conmutados frecuentemente contienen una o más mutación (es) somática (s), comúnmente en la región variable y frecuentemente en o dentro de aproximadamente 10 residuos de una CDR) como resultado de maduración de afinidad y selección de células B mediante antígeno, particularmente subsecuente a ataque de antígeno secundario (o subsecuente) . Estos anticuerpos humanos de alta afinidad pueden tener afinidades de enlace (KD)' de menos de 10'1 , tal como menor de 10~8 M, 10"9 M, 10~10 M, 10"10 M o aún más baja.

Otro aspecto de la invención incluye células B derivadas de ratones transgénicos o transcromosórnales como se describe en la presente. Las células B pueden ser usadas para generar hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales humanos que se enlazan con alta afinidad (por ejemplo, menor de 10"7 M) a PD-1, PD-L1 o PD-L2 humanos.

El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad contra PD-1, PD-L1 o PD-L2 puede ser facilitado mediante un método para expandir el repertorio de segmentos de gen de región variable humanos en un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de inmunoglobulina humano integrado, dicho método comprende introducir al genoma un transgen de gen V que comprende segmentos de gen de región V que no están presentes en dicho transgen de inmunoglobulina humano integrado.- Frecuentemente, el transgen de región V es un cromosoma artificial de levadura que comprende una porción de un arreglo de segmento genético de VH o VL (VK) humano, como se puede presentar naturalmente en un genoma humano o como puede ser empalmado conjuntamente de manera separada mediante métodos recombinantes , que pueden incluir segundos de gen V fuera de orden u omitidos . Frecuentemente por lo menos cinco o más segmentos de gen V funcionales están contenidos en el YAC. En esta variación, es posible elaborar un ratón transgénico producido mediante el método de expansión de repertorio V, en donde el ratón expresa una cadena de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable codificada por un segmento de gen de región V presente en el transgen de región V y una región C codificada en el transgen de Ig humano. Por medio del método de expansión de repertorio V, ratones transgénicos que tienen por lo menos 5 genes V distintos pueden ser generados; como lo pueden los ratones que contienen por lo menos aproximadamente 24 genes V o más. Algunos segmentos de gen V pueden ser no funcionales (por ejemplo, pseudogenes y los semejantes); estos segmentos pueden ser retenidos o pueden ser cancelados selectivamente mediante métodos recombinantes disponibles para el técnico experimentado, si se desea.

Una vez que la línea germinal de ratón ha sido . diseñada para contener un YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido, sustancialmente no presente en el transgen de Ig humano que contiene los segmentos de gen J y C, el rasgo puede ser propagado y cruzado a otros fondos genéticos, incluyendo fondos en donde el YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido es cruzado a una línea germinal de ratón que tiene un transgen de Ig humano diferente. Múltiples YAC funcionales que tienen un repertorio de segmento V expandido pueden ser cruzados a una línea germinal para trabajar con un transgen de Ig humano (o múltiples transgenes de Ig humanos) . Aunque se hace referencia en la presente como transgenes de YAC, tales transgenes cuando son integrados al genoma pueden carecer sustancialmente de secuencias de levadura, tales como secuencias requeridas para replicación autónoma en levadura; tales secuencias pueden opcionalmente ser removidas mediante diseño genético (por ejemplo, digestión de restricción y electroforesis de gel de campo cruzado u otro método apropiado) después de replicación en levadura ya no es necesario (esto es, antes de la introducción a una célula de ES de ratón o procigoto de ratón) . Métodos de . propagación del rasgo de expresión de inmunoglobulina de secuencia humana, incluyen cría de un ratón transgénico que tiene el (los) transgen (es) de Ig humanos, y opcionalmente también tiene un YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido. Ambos segmentos de VH y VL pueden estar presentes en el YAC. El ratón transgénico puede ser criado a cualquier fondo deseado por el técnico, incluyendo fondos que albergan otros transgenes humanos, en los que se incluyen transgenes de Ig humanos y/o transgenes que codifican otras proteínas de linfocito humanas . La invención también provee una inmunoglobulina de secuencia humana de alta afinidad producida por un ratón transgénico que tiene un transgen de YAC de repertorio de región V expandido . Aunque lo anterior describe una modalidad preferida del animal transgénico de la invención, otras modalidades son contempladas que han sido clasificadas en cuatro categorías: (1) Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesado sin arreglar y ligero rearreglado ; (2) Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesado sin arreglar y ligero sin arreglar; (3) Animal transgénico que contiene un transgen de inmunoglobulina pesado rearreglado y ligero sin arreglar; y (4) Animales transgéhicos que contienen transgenes de inmunoglobulina pesados rearreglados y ligeros rearreglados .

VI. Conjugados de anticuerpo/inmunotoxinas En otro aspecto, la presente invención comprende anticuerpos PD-1, PD-Ll o PD-L2 humanos conjugados a una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor ) o un radioisótopo. Cuando están conjugados a una citotoxina, estos conjugados de anticuerpos son denominados, "inmunotoxinas" . Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial a (por ejemplo, asesina) células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mixantrona, mitorramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen pero no están limitados ,a antimetaboiitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalana, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfana, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Un anticuerpo de la presente invención puede ser conjugado a un radioisótopo, por ejemplo yodo radiactivo, para generar radiofarmacéuticos citotóxicos para tratamiento de una alteración relacionada tal como cáncer.

Los anticuerpos PD-1, PD-L1 o PD-Ll humanos conjugados pueden ser usados diagnostica o prognósticamente para monitorear niveles de polipéptidos en tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede ser facilitada mediante acoplamiento (esto es, enlace físicamente) del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales biolumminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa o acetilcolinestarasa; ejemplos de complejos de grupo prostético apropiados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen • umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina y ejemplos de material de reactivo apropiado incluyen 125I/ i3iI, .3sS o 3H.

Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden ser usados para modificar una respuesta biológica dada. La porción terapéutica no será interpretada como limitada a agentes terapéuticos clínicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria,- una proteína tal como factor de necrosis de tumor o interferón- . gamma . o modificadores de respuesta biológica tales como por ejemplo linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina- 6 ("IL-6"), factor estimulador, de colonia de macrófago de granulocito ("GM-CSF"), factor estimulador de colonia de granolucito ("G-CSF") u otras citocinas o factores de crecimiento .

Técnicas para conjugación de tal porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo Arnon et al . , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" , in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future ' Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy" , in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev. , 62:119 58 (1982) .

VII. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención provee una composición, por ejemplo , una composición farmacéutica que contiene o uno o una combinación de anticuerpos monoclonales o porción (es) de enlace de antígeno de los mismos (tales como fragmentos de enlace de antígeno) de la presente invención, formulados conjuntamente con un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, las composiciones incluyen una combinación de múltiples anticuerpos humanos aislados (por ejemplo, dos o más) de la invención. Preferiblemente, cada uno de los anticuerpos de la composición se enlaza a un ep topo distinto preseleccionado de PD-1, PD-L1 y/o PD-L2.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser administradas en terapia de combinación, esto es combinados con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente invención con por lo menos uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes anti-inflamatorios , DMARD (fármacos anti-reumáticos que modifican la enfermedad) , agentes inmunosupresores , quimioterapéuticos y agentes de psoriasis. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden también ser administradas en conjunción con terapia de radiación. La co-administración con otros anticuerpos, tales como anticuerpos CD4 específicos IL-2 específicos es también contemplada por la invención .

Como se usa en la presente, "portador aceptable farmacéuticamente" incluye cualesguier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes isotónicos y agentes que retardan la absorción y los semejantes . que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es apropiado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión) . Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto .activo, esto es, anticuerpo, molécula bisespecífica y multiespecífica, puede ser recubierto de un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos u otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto .

Una "sal aceptable farmacéuticamente" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte cualesquier efectos toxicológicos indeseables (véase, por ejemplo Berge, S. M. , et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1 19) . Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y los semejantes, también como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y di-carboxílieos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos , ácidos hidroxialcanoicos , ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y los semejantes. Sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalino térreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y los semejantes, también como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N, N'-dibencil etilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y los semejantes.

Una composición de la presente invención puede ser administrada mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Como se apreciará por el técnico experimentado, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden ser preparados con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos · y sistemas de administración microencapsulados . Polímeros biodegradables , biocompatibles pueden ser usados, tales como etileno, acetato de vinilo, polianhídridos , ácido pliglicólico , colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son en general conocidos para aquellos experimentados en el arte. Véase, por ejemplo Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Para administrar un compuesto de la invención mediante ciertas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con o co-administrar el compuesto con un material para impedir su desactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas o un diluyente. Diluyentes aceptables farmacéuticamente incluyen solución salina y soluciones acuosas de pH regulado. Liposomas incluyen emulsiones dé CGF de agua en aceite en agua también como liposomas convencionales (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol . 7:27).

Portadores aceptables farmacéuticamente incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de tales medios y agentes por sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el arte. Excepto que ya que cualesquier. medios o agentes convencionales es incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención es contemplado. Compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados a las composiciones.

Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, micro-emulsión, liposoma u otra estructura ordenada apropiada a una alta concentración de fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inestables puede ser efectuada l incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo sales de monoesterato y gelatina.

Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por micro-filtración de esterilización. En general, dispersiones son preparadas al incorporar el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente.- En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación . ( liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril de la misma.

Los regímenes de dosificación son ajustados para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un solo bolo puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas con el tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos humanos de la invención pueden ser administrados una vez o dos veces a la semana mediante inyección subcutánea o una vez o dos veces mensualmente mediante inyección subcutánea. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación por facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Formas de dosificación unitarias como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para los efectos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención son determinadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser obtenido y (b) las limitaciones inherentes en el arte de composición tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos .

En una modalidad, un agente de la invención es un anticuerpo. Como se define en la presente, Una cantidad terapéuticamente efectiva ' de anticuerpo (esto es, una dosificación efectiva) fluctúa de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg o 5 a 6 mg/kg de péso corporal. El experimentado en el arte apreciará que ciertos factores pueden influenciar la dosificación requerida para tratar efectivamente un sujeto, en los que se incluyen pero no limitados a la severidad de la enfermedad o alteración, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo puede incluir un solo tratamiento o preferiblemente puede incluir una serie de tratamientos. También se apreciará que la dosificación efectiva de anticuerpo usada para el tratamiento se puede incrementar o disminuir en el curso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar de resultados de los análisis de diagnóstico.

Ejemplos de antioxidantes aceptables farmacéuticamente incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisterna, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y los semejantes; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y los semejantes y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamin tetracético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y los semejantes .

Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas apropiadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden conveniente ser presentadas en forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas mediante cualesquier métodos conocidos en el arte de farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con un material portador para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que es tratado y el modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con un material portador para producir una sola forma de dosificación será en general aquella cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un 100%, esta cantidad fluctuará de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 90% de ingrediente activo, alternativamente de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 70% o alternativamente de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 30%.

Las formulaciones de la presente invención que son apropiadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de atomización que contienen tales portadores como son conocidos en el arte como apropiados . Formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de composiciones de esta invención incluyen polvos, atomizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede ser mezclado bajo condiciones estériles con un portador aceptable farmacéuticamente y con cualesguier conservadores, soluciones reguladoras del pH o propelentes que pueden ser requeridos.

Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usan en la presente significan modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección y incluye, s-in limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular , intraorbinal , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal, subcutánea, subcuticular , intraarticular , subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e intraestemal e infusión.

Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos apropiados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes .

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede ser asegurada tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales , por ejemplo paraben, clorobutanol , fenol ácido sórbico y los semejantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y los semejantes a las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser efectuada mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoesterato de aluminio y gelatina.

Cuando los compuestos de la presente invención son administrados como farmacéuticos a humanos y animales, pueden ser dados solos o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo 0.001 a 90% (por ejemplo, 0.005 a 70%, tal como 0.01 a 30%) de ingrediente activo en combinación con un portador aceptable farmacéuticamente.

Sin consideración de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden ser usados en una forma hidratada apropiada y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, son formuladas en formas de dosificación aceptables farmacéuticamente mediante métodos convencionales conocidos para aquellos de habilidad en el arte.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser variados para obtener una cantidad de ingrediente activo que es efectiva para obtener la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular sin ser tóxica al paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores fármaco-cinéticos en los que se incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas o el éster, sal o amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de expresión del compuesto particular que es empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que es tratado y factores semejantes bien conocidos en las artes médicas. El médico o veterinario que tenga habilidad ordinaria en el arte puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida.

Por ejemplo, *el médico o veterinario podría iniciar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que .aquel requerido con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se obtiene el efecto deseado. En general, una dosis diaria apropiada de una composición de la invención será aquella cantidad del compuesto que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva dependerá en general de los factores descritos anteriormente. Es preferido que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, administrada preferiblemente próxima al sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede ser administrada como 2, 3, 4, 5, 6 o más sub-dosis administradas separadamente a intervalos apropiados en todo el día, opcionalmente en formas de dosificación unitarias. Mientras que es posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación (composición) farmacéutica.

Composiciones terapéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en el arte. Por ejemplo, en una modalidad, una composición terapéutica de la invención puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmico sin agujas, tales como los dispositivos revelados en las patentes estadounidenses Nos. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, o 4,596,556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: patente estadounidense No. 4,487,603, que revela una bomba de micro-infusión implantable para surtir medicación a una velocidad controlada; patente estadounidense No. 4,486,194 que revela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; patente estadounidense No. 4,447,233, que revela una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una velocidad de infusión precisa; patente estadounidense No. 4,447,224, que revela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración de fármaco continua; patente estadounidense No. 4,439,196, que revela un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimiento de multicámaras y patente estadounidense 4,475,196, que revela un sistema de administración de fármaco osmótico. Muchos otros de tales implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos para aquellos experimentados en el arte.

En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden ser formulados para asegurar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos . Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea) pueden ser formulados por ejemplo en liposomas. Para métodos de manufactura de liposomas, véase, por ejemplo patentes estadounidenses Nos. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que son transportadas selectivamente a células u órganos específicos, así mejoran la administración de fármaco apuntada (véase, por ejemplo V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol . 29:685). Porciones de apuntamiento ejemplares incluyen foliato o biotina (véase, por ejemplo patente estadounidense No. 5,416,016 expedida a Low et al. ); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys . Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); un receptor de proteína A surfactante (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes especies de los cuales pueden comprender las formulaciones de la invención, también como componentes de las moléculas de la invención; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención son formulados en liposomas; en otra modalidad, los liposomas incluyen una porción de apuntamiento. En todavía otra modalidad, los compuestos terapéuticos en los liposomas son administrados mediante inyección de bolo a un sitio próximo al tumor o infección. La composición debe ser fluida a la extensión que existe la fácil aplicación en jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Las composiciones deben ser estériles y fluidas a la extensión de que la composición es administrable mediante jeringa. Además del agua, el portador puede ser una solución salina de pH regulado isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos, es · preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede ser efectuada al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo monoesterato de aluminio o gelatina.

Cuando el compuesto activo está protegido apropiadamente, como se describe anteriormente, el compuesto puede ser administrado oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. viii. Usos y métodos de la invención Los anticuerpos descritos en la presente (incluyendo derivados y conjugados de los anticuerpos) y composiciones que contienen los anticuerpos pueden ser usados en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo (por ejemplo, mediante modulación ascendente o modulación descendente de la respuesta inmune) . Por ejemplo, el ligando de PD-1 que se enlaza a PD-1 o B7-1 transmite una señal inhibidora. Así, la modulación de la interacción entre PD-1 y un ligando de PD-1 o entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7 , da como resultado la modulación de la respuesta inmune. Los ligandos de PD-1 pueden también co-estimular células T. Así, en una modalidad, los anticuerpos que bloquean la interacción entre un ligando de PD-1 y PD-1 o B7 pueden impedir la señalización inhibidora. En una modalidad, los anticuerpos que bloquean la señal co-estimuladora del ligando de PD-1 bloquean una señal co-estimuladora a una célula inmune. Además, la ligación de PD-L2 puede inducir secreción de citocina y sobrevivencia de células dendríticas . Así, los anticuerpos que bloquean la ligación de PD-L2 pueden inhibir la sobrevivencia de célula dendrítica y reducir la expresión de citocina mediante células dendríticas y por medio de estos mecanismos inhiben una respuesta inmune. En particular, los anticuerpos descritos en la presente son útiles para aplicaciones de diagnóstico, prognóstico, prevención y terapéuticas relacionadas con las condiciones particulares moderadas por PD-1, PD-L1 y/6 PD-L2 como se discute, por ejemplo en Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol . 26:677; Sharpe et al.,. (2007) Nat. Immunol. 8:239; Freeman et al. (2007) J. Exp. Med. 10:2223; cada una de las cuales es incorporada por referencia en su totalidad.

En una modalidad, los anticuerpos y los fragmentos de enlace de antígeno de la presente invención son útiles para aplicaciones de diagnóstico, prognóstico, prevención y terapéuticas concernientes con enfermedades neurodegenerativas (geriopsicosis , enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-jakob, neuropatía diabética, síndrome de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis lateral amiotrópica, neuropatía diabética y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob) .

En otra modalidad, los anticuerpos y los fragmentos de enlace de antígeno de la presente invención son útiles en aplicaciones de diagnóstico, prognóstico, prevención y terapéuticas (tales como el tratamiento y retardo del inicio u avance de las enfermedades) para enfermedades que aceleran la reacción inmune, por ejemplo asma, enfermedades autoinmunes (nefritis glomerular, artritis, enfermedad semejante a cardiomiopatía dilatada, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedad de Cro n, eritematodes sistémica, artritis reumatoide crónica, esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis de contacto alérgica, polimiosis, paquiderma, periarteritis nodosa, fiebre reumática, vitíligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis , miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad de Grave, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, enfermedad de esterilidad, hepatitis activa crónica, pénfigo, púrpura trombofénica autoinmune y anemia hemolítica autoinmune, hepatitis crónica activa, enfermedad de Addison, síndroma de anti-fosfolípido, alergia atópica, gastritis atrófica autoinmune, aclorhidra autoinmune, enfermedad celiaca, síndrome de Cushing, dermatomiositis, lupus discoide, eritematosis , síndrome de Goodpasture, tiroiditis de Hashimoto, atrofia adrenal idiopática, trombocitopenia idiopática, diabetes dependiente de insulina, síndrome de Lambert-Eaton, hepatitis lupoide, algunos casos de linfopenia, enfermedad de tejido conectivo mezclado, penfigoide, pénfigo vulgaris, anemia perniciosa, uveítis pacogénica, poliarteritis nodosa, autosíndromes poligranulares, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Raynaud, policondritis de recaída, síndrome de Schmidt, escleroderma limitado (o síndrome de cresta), oftalmía simpatética, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, tirotoxicosis, resistencia a insulina tipo b, colitis ulcerativa y granulomatosis de Wegener) .

En todavía otra modalidad, los anticuerpos y los fragmentos de enlace de antígeno de la presente invención son útiles en aplicaciones de diagnóstico, prognóstico, prevención y terapéuticas (tales como tratamiento y retardo del inicio o avance de las enfermedades) para terapia y/o prevención de enfermedad infecciosa persistente (por ejemplo, enfermedades infecciosas virales en las que se incluyen HPV, HBV, virus de hepatitis C (HCV) , retrovirus tales como virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) virus de herpes tales como virus de Epstein Barr - (EBV) , citomegalovirus (CMV) , HSV-l y HSV-2 y virus de influenza) . Otros antígenos asociados con patógenos que pueden ser utilizados como se describe en la presente son antígenos de varios parásitos, en los que se incluyen malaria, preferiblemente péptido de malaria basado en repeticiones de NA P. Además, enfermedades bacterianas, fúngales y otras enfermedades patógenas son incluidas , tales como Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus , Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus , Pneumocystis , Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus , Streptococcus , Toxoplasma and Vibriocholerae . Exemplary species include Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vaginalis, Haemophilus vaginalis, Group B Streptococcus sp., Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus . Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis , Leptospira pomona, Listeria monocytogenes , Brucella ovis, Chlamydia psittaci, . Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis , Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; o un hongo, tal como por ejemplo Paracoccidioides brasiliensis u otro patógeno, por ejemplo Plasmodium falciparum. También incluidos están los patógenos de prioridad del National Institute of Allergy ' and Infectious Diseases (NIAID) . Estos incluyen agentes de categoría A, tales como varióla mayor (viruela) , Bacillus anthracis (anthrax) , Yersinia pestis (plaga) , toxina de Clostridium botulinum (botulismo) , Francisella tularensis (tularemia) , filovirus (fiebre hemorrágica de Ebola, fiebre hemorrágica de Marburg) , arenavirus (Lassa (fiebre de Lassa) , junina (fiebre hemorrágica de Argentina) y virus relacionados) ; agentes de categoría B, tales como Coxiella burnetti (fiebre Q) , especie de Brucella species (brucelosis) , Burkholderia mallei (glanders) , alfavirus (encefalomielitis de Venezuela, encefalomielitis equino del este y oeste) , toxina ricina de Ricinus communis (bayas de ricino) , toxina épsilon de Clostridium perfringens ; Staphylococcus enterotoxin B, Salmonella species, Shigella dysenteriae,. Escherichia coli strain 0157 :H7, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum. Agentes de categoría C tales como virus de nipah, hantavirus, virus de fiebre hemorrágica transportados por garrapata, virus de encefalitis transportados por garrapata, fiebre amarilla y tuberculosis resistente a multifármacos , helmínticos, tales como Schistosoma y Taenia; y protozoarios tales como Leishmania (por ejemplo L. mexicana) y Plasmodium .

En todavía otra modalidad, los anticuerpos o los fragmentos de enlace de antígeno de la presente invención son útiles para aplicaciones de diagnóstico, prognóstico, prevención y terapéuticas para rechazo de injerto de órgano, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , enfermedad alérgica y enfermedades provocadas por atenuación de reacción inmune, en los cuales PD-1, PD-Ll y/o PD-L2 participa, por ejemplo cáncer y enfermedad infecciosa.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos en la presente son administrados a un sujeto de acuerdo con métodos conocidos, tales como mediante administración intravenosa (por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua en un periodo de tiempo, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , intra- articular, intrasinovial, intratecal o rutas de administración de inhalación) .

Un sujeto es tratado si se tienen uno o más resultados benéficos o deseados, incluyendo resultados clínicamente deseables. Para los propósitos de esta invención, resultados clínicos benéficos o deseados incluyen pero no están limitados a uno o más de los siguientes: disminuir uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, incrementar la calidad de vida de aquellos que sufren de la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones requeridas .para tratar la enfermedad, retardar el avance de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos . 1. Métodos de selección Un aspecto de la presente invención es concerniente con métodos de uso de anticuerpos de la presente invención para modular una respuesta inmune al modular · la coestimulación (tales como anticuerpos que modulan la función de PD-1, PD-Ll o PD-L2 ) . Tales métodos utilizan análisis de selección, en los que se incluyen análisis a base de célula y análisis no basados en células. En una modalidad, los análisis proveen un método para identificar anticuerpos que modulan la interacción de un ligando de PD-1 y PD-1. En otra modalidad, los análisis proveen un método para identificar anticuerpos que modulan la interacción entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7.

En una modalidad, la invención es concerniente con análisis para seleccionar anticuerpos candidatos o de prueba que se enlazan a o modulan la actividad de PD-1, PD-L1 o PD-L2, por ejemplo modulan la habilidad del polipéptido para interactuar con (por ejemplo, enlazarse a) su socio de enlace cognato. En una modalidad, un método para identificar un anticuerpo para modular una respuesta inmune abarca determinar la habilidad del anticuerpo para modular, por ejemplo mejorar o inhibir la interacción entre PD-1 y un ligando de PD-1 y determinar además la habilidad del anticuerpo para modular la interacción entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7. En una modalidad, un anticuerpo que modula la interacción entre el ligando de PD-1 y PD-1 (por ejemplo, sin modular la interacción entre el ligando de PD-1 y el polipéptido de B7 es seleccionado) . En otra modalidad, un anticuerpo que modula la interacción entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7 (por ejemplo, sin modular la interacción entre el ligando de PD-1 y PD-1) es seleccionado.

En otra modalidad, un método para identificar un anticuerpo para disminuir una respuesta inmune abarca determinar la habilidad de un anticuerpo candidato por mejorar la interacción entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7 y seleccionar un anticuerpo que inhibe la interacción entre el ligando de PD-1 y el polipéptido de B7. En otra modalidad, un método para identificar un anticuerpo para disminuir una respuesta inmune abarca determinar la habilidad del anticuerpo candidato por mejorar la interacción entre un ligando de PD-1 y PD-1 y seleccionar un anticuerpo que mejora la interacción entre el ligando de PD-1 y PD-1.

En una modalidad, un análisis a base de células, que comprende poner en contacto una célula que expresa PD-1, PD-L1 0 PD-L2, con un anticuerpo de prueba y determinar la habilidad del anticuerpo de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) el enlace de PD-1 o el ligando de PD-1 objetivo a su socio de enlace. La determinación de la habilidad del PD-1, ligando de PD-1 o polipéptido de B7 para enlazarse a, o interactuar con su socio de enlace se puede llevar a cabo, por ejemplo al medir el enlace directo o al . medir un parámetro de activación de célula inmune.

Por ejemplo, en un análisis de enlace directo, el PD- 1 o proteína ligando de PD-1 (o sus polipéptidos objetivos respectivos) puede ser acoplada con un radioisótopo o marcador enzimático de tal manera que el enlace de ligando de PD-1 a PD-1 o al polipéptido de B7 puede ser determinado al detectar la proteína marcada en un complejo. Por ejemplo, PD-1 o PD-1 puede ser marcado con 12I, 35S, 1C o 3H, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo detectado mediante conteo directo de radioemisión o mediante conteo de centelleo. Alternativamente, el PD-1 o ligando de PD-1 puede ser marcado enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o luciferasa, y el marcador enzimático detectado mediante determinación de la conversión de un sustrato apropiado al producto.

También está dentro del alcance de esta invención determinar la habilidad de un compuesto para modular la interacción entre PD-1 y un ligando de PD-1 o entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7, sin la marcación de cualquiera de los interactuantes . Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para detectar la interacción de PD-1 y un ligando de PD-1, o entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7 , con su polipéptido objetivo, sin la marcación ya sea PD-1, ligando de PD-1, polipéptido de B7, o el polipéptido objetivo (McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912). Como se usa en la presente, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la cual una célula acidifica su medio ambiente utilizando un detector potenciométrico direccionable por luz (LAPS) . Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden ser usados como indicador de la interacción entre el compuesto y receptor.

En otra modalidad, la determinación de la habilidad del anticuerpo para antagonizar la interacción entre un conjunto dado de polipéptidos se puede llevar a cabo al determinar la actividad de uno o más miembros del conjunto de polipéptidos. Por ejemplo, la actividad de PD-1 o un ligando de PD-1 puede ser determinada al detectar la inducción de un segmento mensajero celular (por ejemplo, actividad de cinasa de tirosina) , detectar la actividad catalítica/enzimática de un sustrato apropiado, detectar la inducción de un gen reportero (que comprende un elemento regulador objetivo-sensible enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, cloranfenicol acetil transferasa) , o detectar una respuesta celular regulada por PD-1 o el ligando de PD-1. La determinación de la habilidad del anticuerpo para enlazarse a o interactuar con dicho polipéptido se puede llevar a cabo, por ejemplo, al medir la habilidad de un compuesto para modular la co-estimulación de célula inmune o inhibición en un análisis de proliferación o al interferir con la habilidad de dicho polipéptido para enlazarse a anticuerpos que reconocen una porción del mismo.

Los anticuerpos que bloquean o inhiben la interacción de un ligando de PD-1 con un receptor co-estimulador también como anticuerpos que promueven una señal inhibidora moderada por el ligando de PD-1 pueden ser identificados por su habilidad para inhibir la proliferación de célula inmune y/o función efectora, o para inducir anergia cuando son agregados a un análisis in vi tro. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas en presencia de ' un agente que estimula la transduccion de señal vía un receptor de activación. Un número de lecturas reconocidas de activación celular pueden ser empleadas para medir la proliferación celular o función efectora (por ejemplo, producción de anticuerpo, producción de citocina, fagocitosis) en presencia del agente de activación. La habilidad de un anticuerpo de prueba para bloquear esta activación puede ser determinada fácilmente al medir la habilidad del anticuerpo para afectar una disminución en proliferación o función efectora que es medida, utilizando técnicas conocidas en el arte.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser probados en cuanto a la habilidad para inhibir o mejorar la co-estimulación en un análisis de célula T, como se describe en Freeman et al. (2000) J". Exp. Med. 192:1027 y Latchman et al. (2001) Nat. Imunol . 2:261. Células T CD4+ pueden ser aisladas de PBMC humanas y estimuladas con anticuerpo anti-CD3 activante. La proliferación de células T puede ser medida mediante incorporación de 3H timidina. Se puede efectuar un análisis con o sin co-estimulación de CD28 en el análisis. Análisis similares pueden ser efectuados con células T de Jurkat T y PHA-ráfagas de PBMC.

En todavía otra modalidad, un análisis de la presente invención es un análisis libre de células en el cual PD-1 o un ligando de PD-1 o una porción biológicamente activa del mismo es puesta en contacto con un anticuerpo de prueba, y se determina la habilidad del anticuerpo de prueba para enlazarse al polipéptido, o porción biológicamente activa del mismo. El enlace del anticuerpo de prueba al PD-1 o polipéptido de ligando de PD-1 pueden ser determinado ya sea directa o indirectamente como se describe anteriormente. En todavía otra modalidad, el análisis incluye poner en contacto el polipéptido 0 porción biológicamente activa del mismo, con su socio de enlace para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un anticuerpo de prueba, y determinar la habilidad del anticuerpo de prueba para interactuar con el polipéptido en la mezcla de análisis, en donde la determinación de la habilidad del anticuerpo de prueba para interactuar con el polipéptido comprende determinar la habilidad del anticuerpo de prueba para enlazarse preferiblemente al polipéptido o porción biológicamente activa del mismo, en comparación con el socio de enlace.

Por ejemplo, un ligando de PD-1 y un polipéptido de PD-1 puede ser usado para formar una mezcla de análisis y la habilidad de un anticuerpo de prueba para bloquear esta interacción puede ser probada al determinar la habilidad de PD- 1 para enlazarse al ligando de PD-1 y determinar la habilidad del ligando de PD-1 para enlazarse al polipéptido de PD-1, mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar el enlace. La determinación de la habilidad de un polipéptido de PD-1 para enlazarse a un ligando de PD-1 y determinar la habilidad de un ligando de PD-1 para enlazarse a un polipéptido de B7 también se puede llevar a cabo utilizando una tecnología tal como Análisis de Interacción Biomolecular en Tiempo Real (BIA) (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Como se usa en la presente, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real sin marcación de ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore) . Los cambios en el fenómeno óptico de resonancia de plasmó superficial (SPR) pueden ser usados como indicación de reacciones en tiempo real entre polipéptidos biológicos. PD-1, ligando de PD-1 y polipéptido de B7 pueden ser inmovilizados sobre un chip de BIAcore y los anticuerpos pueden ser probados en cuanto al enlace al PD-1, ligando de PD-1, y polipéptido de B7. Un ejemplo de uso de la tecnología de BIA es descrito en Fitz et al. (1997) Oncogene 15:613.

Los análisis libres de células de la presente invención son propensas al uso tanto de formas solubles y/o formas membrana-enlazadas de proteínas (por ejemplo, un ligando det PD-1 o proteínas de PD-1 o porciones biológicamente activas de los mismos, o socios de enlace a los cuales un ligando de PD-1 o PD-1 se enlazan) . En el caso de análisis libre de células en los cuales se usa una proteína en forma de membrana-enlazada (por ejemplo, un ligando de PD-1 de superficie celular o receptor de PD-1) puede ser deseable utilizar un agente de solubilización de tal manera que la forma membrana-enlazada de la proteína es mantenida en solución. Ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n- octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Tritón® X-100, Tritón® .X-114, Thesit®, isodecipoli (etilenglicoléter) n, sulfonato de 3- [ (3-colamidopropil) dimetilamino] -1-propano (CHAPS) , sulfonato de 3- [ (3-colamidopropil)dimetilaminio] -2-hidroxi-1-propano (CHAPSO) , o sulfonato de N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-l-propano.

En una o más modalidades de los métodos de análisis descritos anteriormente, puede ser deseable inmovilizar ya sea PD-1, un ligando de PD-1, y un polipéptido de B7, o un polipéptido objetivo apropiado, para facilitar la separación de las formas acomplejadas de las formas sin acomple ar de una o ambas de las proteínas, también como acomodar la automatÍ2ación del análisis. El enlace de un anticuerpo de prueba a PD-1 o un ligando de PD-1 se puede efectuar en cualquier recipiente apropiado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtítulo, tubos de ensayo y tubos de micro-centrífuga. En una modalidad, se puede proveer una proteína de fusión que agrega un dominio que permite que una o ambas de las proteínas sean enlazadas a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/PD-1, ligando de PD-1 o proteínas de fusión de polipéptido de B7 o proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/ob etivo pueden ser absorbidas sobre perlas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, O) o placas de microtítulo derivados de glutationa, que son luego combinados con el compuesto de prueba, y la mezcla incubada bajo condiciones conducentes a la formación del complejo (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para sal y pH) . Enseguida de la incubación, las perlas o cavidades de placas de microtítulo son lavadas para remover cualesquier componentes sin enlazar, la matriz inmovilizada en el caso de perlas, el complejo determinado ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, como se describe anteriormente. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz, y el nivel de enlace de PD-1, ligando de PD-1, o polipéptido de B7 o actividad determinados utilizando técnicas estándar.

En una modalidad alternativa, la determinación de la habilidad del compuesto de prueba para modular la actividad de PD-1 o un ligando de PD-1 se puede llevar a cabo al determinar la habilidad del anticuerpo de prueba para modular la actividad de un polipéptido que funciona corriente abajo de PD-1 o el ligando de PD-1, por ejemplo, un polipéptido que interactúa con el ligando de PD-1, o un polipéptido que funciona corriente abajo de PD-1, por ejemplo, al interactuar con el dominio citoplásmico de PD-1. Por ejemplo, niveles de segundos mensajeros pueden ser determinados, la actividad del polipéptido interactor sobre un objetivo apropiado puede ser determinada, o el enlace del interactor a un objetivo apropiado puede ser determinada como se describe previamente.

La invención es concerniente además con nuevos anticuerpos identificados por los análisis de selección descritos anteriormente. Así, está dentro del alcance de esta invención usar adicionalmente un anticuerpo identificado como se describe en la presente en un modelo de animal apropiado. Por ejemplo, un anticuerpo identificado como se describe en la presente puede ser usado en un modelo de animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios de tratamiento con tal anticuerpo. Alternativamente, un anticuerpo identificado como se describe en la presente puede ser usado en un modelo de animal para determinar el mecanismo de acción de tal anticuerpo. Además, la presente invención es concerniente con usos de los nuevos anticuerpos identificados por los análisis de selección descritos anteriormente, para tratamientos como se describe en la presente. 2. Métodos Profilácticos En un aspecto, la invención es concerniente con un método para impedir en un sujeto, una enfermedad o condición asociada con una respuesta inmune indeseable o menos que deseable. Los sujetos en riesgo por una enfermedad que se beneficiarían del tratamiento con los anticuerpos o métodos reivindicados pueden ser identificados, por ejemplo, mediante cualquiera o una combinación de análisis de diagnóstico o prognóstico conocidos en el arte. La administración de un anticuerpo profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de síntomas asociados con una respuesta inmune indeseable o menos que deseable. El anticuerpo apropiado usado para tratamiento puede ser determinado en base a indicaciones clínicas y puede ser identificado, por ejemplo, utilizando análisis de selección descritos en la presente. 3. Métodos Terapéuticos Otro aspecto de la invención es concerniente con métodos terapéuticos para modular una respuesta inmune, por ejemplo, al modular la interacción entre PD-1 y un ligando de PD-1 y/o un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7. Por ejemplo, la modulación de la interacción entre PD-1 y un ligando de PD-1, o entre un ligando de PD-1 y un polipéptido de B7, da como resultado la modulación de la respuesta inmune. Así, en una modalidad, anticuerpos que bloquean la interacción entre PD-1 y el ligando de PD-1 pueden impedir lá señalización inhibidora. Los ligandos de PD-1 pueden también mejorar señales coestimuladoras en células T. Así, en otra modalidad, los anticuerpos que impiden que el ligando de PD-1 provea una señal coestimuladora pueden inhibir la coestimulación de célula T.

Estos anticuerpos moduladores pueden ser administrados in vitro (por ejemplo, al poner en contacto la célula con un anticuerpo) o alternativamente, in vivo (por ejemplo, al administrar el agente a un sujeto) . Como tal, la presente invención es concerniente con métodos de tratamiento de un individuo afligido con una enfermedad o alteración que se beneficiaría de la modulación de una respuesta inmune, por ejemplo, mediante modulación de la interacción entre un ligando de PD-1 y PD-1 o un polipéptido de B7.

. Regulación Descendente de Respuestas Inmune Hay numerosas modalidades de la invención para regular ascendentemente la función inhibidora o regular descendentemente la función coestimuladora de un ligando de PD-1 para regular descendentemente mediante esto respuestas inmune. La regulación descendente puede estar en forma de inhibición o bloqueo de una respuesta inmune ya en marcha o puede involucrar impedir la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de células inmune activadas pueden ser inhibidas al regular descendentemente respuestas de célula inmune, o al inducir anergia específica en células inmune, o ambas.

Por ejemplo, la respuesta inmune puede ser modulada descendentemente utilizando: anticuerpos de ligando de anti-PD-1 que bloquean la co-estimulación mediante el ligando de PD-1 (por ejemplo, mientras que no afectan o incrementan la interacción entre PD-L1 y PD-1) o que promueven el enlace de un ligando de PD-1 con PD-1, (por ejemplo, mientras que no afectan o mientras que inhiben la co-estimulación por el ligando de PD-1) .

En una modalidad de la invención, la tolerancia es inducida contra antígenos específicos al co-administrar un antígeno con un anticuerpo que bloquea la coestimulación de ligando de PD-1. Por ejemplo, la tolerancia puede ser inducida a proteínas específicas. En una modalidad, respuestas inmunes a alérgenos o a proteínas extrañas a las cuales una respuesta inmune es indeseable, pueden ser inhibidas. Por ejemplo, pacientes que reciben Factor VIII frecuentemente generan anticuerpos contra este factor de coagulación. La co-administración de un anticuerpo que bloquea una señal coestimuladora moderada por el ligando de PD-1 o un anticuerpo que estimula una señal inhibidora moderada por PD-1 en combinación con el factor VIII recombinante (o enlazado físicamente al Factor VIII, por ejemplo, mediante reticulación) puede dar como resultado la modulación descendente.

En una modalidad, dos agentes separados que modulan descendentemente respuestas inmune pueden ser combinados como una sola composición o administrados separadamente (simultánea o secuencialmente) para regular de manera descendente más efectivamente respuestas inmune moderadas por célula inmune en un sujeto. Además, una cantidad terapéuticamente activa de uno o más de los anticuerpos sujetos puede ser usada en conjunción con otros reactivos de modulación descendente para influenciar respuestas inmunes. Ejemplos de otros reactivos inmunomoduladores incluyen, sin limitación, anticuerpos que bloquean una señal coestimuladora (por ejemplo, contra CD28 o ICOS), anticuerpos que actúan como agonistas de CTLA , y/o anticuerpos contra otros marcadores de célula inmune (por ejemplo, contra CD40, contra ligando de CD40 o contra , citocinas), proteínas de fusión (por ejemplo, CTLA4-Fc) , y fármacos inmunosupresores (por ejemplo, rapamicina, ciclosporina A o FK506) .

La regulación descendente o prevención de una coestimulación de ligando de PD-1 o promoción de una interacción entre un ligando de PD-1 y PD-1 es útil para modular descendentemente la respuesta inmune, por ejemplo, en situaciones de trasplante de tejido, piel y órganos en enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , o en enfermedades inflamatorias tales como lupus eritematoso sistémico, y esclerosis múltiple. Por ejemplo, el bloqueo de la función de célula inmune da como resultado destrucción de tejido reducido en trasplante de tejido. Comúnmente, en trasplantes de tejido, el rechazo del trasplante es iniciado por medio de su reconocimiento como extraño por células inmune, seguido por una reacción inmune que destruye el trasplante. La administración de un anticuerpo que inhibe la co-estimulación de ligando de PD-1 solo o en conjunción con otro agente modulado descendente, antes de o al tiempo de transplante puede promover la generación de una señal inhibidora. Además, la inhibición de señales coestimuladoras de ligando de PD-1 o promoción de un ligando de PD-1 o señales inhibidoras de PD-1, pueden también ser suficientes para anergizar las células inmune, induciendo mediante esto tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo mediante bloqueo de una señal coestimuladora moderada por ligando de PD-1 puede evitar la necesidad de administración repetida de estos reactivos de bloqueo .

Para obtener inmunosupresión o tolerancia suficiente en un sujeto, también puede ser deseable bloquear la función coestimuladora de otros polipéptidos . Por ejemplo, puede ser deseable bloquear la función de B7-1, B7-2 ó B7-1 y B7-2 al administrar una forma soluble de una combinación de péptidos que tienen una actividad de cada uno de estos antígenos, bloquear anticuerpos contra estos antígenos o bloquear moléculas pequeñas (separada o conjuntamente en una sola composición) antes de o al tiempo del transplante. Alternativamente, puede ser deseable promover la actividad inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1 e inhibir una actividad coestimuladora de B7-1 y/o B7-2. Otros agentes moduladores descendentes que pueden ser usados en relación con los métodos moduladores descendentes de la invención incluyen, por ejemplo, agentes que transmiten una señal inhibidora vía CTLA4, formas solubles de CTLA4, anticuerpos que activan una señal inhibidora vía CTLA4, bloquear anticuerpos contra otros marcadores de célula inmunes o formas solubles de otros pares de ligando receptor (por ejemplo, agentes que disrumpen la interacción entre CD40 y ligando de CD40 (por ejemplo, anticuerpos de ligando anti-CD40) ) , anticuerpos contra citocinas o fármacos inmunosupresores .

La modulación descendente de respuestas inmune son también útiles en el tratamiento de enfermedad autoinmune. Muchas alteraciones autoinmunes son el resultado de la activación inapropiada de células inmune que son reactivas contra el propio tejido y que promueven la producción de citocinas y autoanticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células inmune autoreactivas puede reducir o eliminar síntomas de enfermedades . La administración de reactivos que bloquean la co-estimulación de células inmunes al disrumpir las interacciones entre el ligando de PD-1 y polipéptido de B7, o al promover la interacción entre el ligando de PD-1 y PD-1, sin modular o mientras que se modula descendentemente la interacción entre el ligando de PD-1 y un polipéptido de B7, son útiles para inhibir la activación de célula inmune e impedir la producción de autoanticuerpos o citocinas que pueden estar involucradas en el proceso de enfermedad. Adicionalmente, agentes que promueven una función inhibidora una función inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1 pueden inducir tolerancia antígeno-específica de células inmunes autoreactivas, lo que podría conducir a alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de reactivos en la prevención o alivio de alteraciones autoinmunes puede ser determinada utilizando un número de modelos de animales bien caracterizados de enfermedad autoinmunes humanas. Ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimental murina, lupus eritematoso sistémico en ratones MRL/lpr/lpr o ratones híbridos NZB, artritis de colágeno autoinmune murina, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia gravis experimental murina (véase, por ejemplo, Paul ed. , Fundamental Immunology, Raven Press, New York, Tercera Edición 1993, capítulo 30).

La inhibición de activación de célula inmune es útil terapéuticamente en el tratamiento de alergia y reacciones alérgicas, por ejemplo, al inhibir la producción de IgE. Un anticuerpo que promueve un ligando de PD-1 o función inhibidora de PD-1 puede ser administrado a un sujeto alérgico para inhibir respuestas alérgicas moderadas por célula inmune en el sujeto. La inhibición de coestimulación de ligando de PD-1 de células inmunes o estimulación de un ligando de PD-1 o ruta inhibidora de PD-1 puede ser acompañada por exposición a alérgeno en conjunción con polipéptidos de MHC apropiados. Las reacciones alérgicas pueden ser sistémicas o locales por naturaleza, dependiendo de la ruta de entrada del alérgeno y el patrón de deposición de IgE en células cebadas o basófilos. Así, la inhibición de respuestas alérgicas moderadas por células inmune local o sistémicamente mediante administración de una forma inhibidora de un agente que inhibe la interacción de un ligando de PD-1 con un receptor co-estimulador , o un anticuerpo que promueve una función inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1.

La inhibición de activación de célula inmune por medio del bloqueo de la coestimulación de ligando de PD-1 o por medio de la promoción de la interacción entre un ligando de PD-1 y PD-1, puede también ser importante terapéuticamente en infecciones virales de células inmunes. Por ejemplo, en el síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA) , la replicación viral es estimulada por la activación de célula inmune. La modulación de estas . interacciones puede dar como resultado la inhibición de replicación viral y mediante esto mejorar el curso del SIDA. La modulación de estas interacciones puede también ser útil en promover el mantenimiento de embarazo. El ligando de PD-1 es normalmente expresado altamente en trofoblastos placentales, la capá de células que forma la ínterfase entre la madre y feto y puede jugar un papel en prevenir rechazo maternal del feto. Las mujeres en riesgo de aborto espontáneo (por ejemplo, aquellas que han tenido previamente un aborto espontáneo o aquellas que han tenido dificultad para concebir) debido al rechazo inmunológico del embrión o feto pueden ser tratadas con agentes que modulan estas interacciones .

La regulación descendente de una respuesta inmune mediante modulación de coestimulación de ligando de PD-1 o mediante modulación del enlace de ligando de PD-l/PD-1 puede también ser útil en el tratamiento de un ataque autoinmune de tejidos autólogos. Por ejemplo, el ligando de PD-1 es normalmente expresado altamente en el corazón y puede proteger el corazón de ataque autoinmune. Esto es evidenciado por el hecho de que el ratón knockout de Balb/c PD-1 exhibe ataque autoinmune masivo sobre el corazón con trombosis. Así, condiciones que son provocadas o exacerbadas por el ataque autoinmune (por ejemplo, en este ejemplo, enfermedad del corazón, infarto al miocardio o aterosclerosis ) puede ser mejorada o aliviada mediante modulación de estas interacciones. Por consiguiente, está dentro del alcance de la invención modular condiciones exacerbadas por ataque autoinmune, tales como alteraciones autoinmunes (también como condiciones tales como ataque al corazón, infarto al miocardio, y aterosclerosis) . 5. Regulación Ascendente de Respuestas Inmune También útil terapéuticamente es el bloqueo de la interacción de un ligando de PD-1 con PD-1 o B7-1 como medio de regulación ascendente de una respuesta inmune. La regulación ascendente de respuestas inmunes puede estar en forma de mejorar una respuesta inmune existente o producir una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, la mejora de una respuesta inmune utilizando las composiciones y métodos presentes es útil en casos de infecciones con microbios (por ejemplo, bacteria, virus o parásitos) . En una modalidad, un anticuerpo que bloquea la interacción de un ligando de PD-1 con PD-1 es usado para mejorar la respuesta inmune. Tal anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo sin activación que bloquea el enlace de PD-Ll a PD-1) es terapéuticamente útil en situaciones en donde la regulación ascendente del anticuerpo y respuestas moderadas por célula serian benéficas. Alteraciones ejemplares incluyen enfermedades de la piel virales, tales como Herpes o herpes zoster, en cuyo caso tal agente puede ser administrado tópicamente a la piel. Además, enfermedades virales sistémicas tales como influenza, la gripe común, y encefalitis podrían ser aliviadas mediante la administración sistémica de tales agentes .

Alternativamente, las respuestas inmunes pueden ser mejoradas en un paciente infectado por medio de un procedimiento ex vivo, por ejemplo, al remover células inmunes del paciente, poner en contacto las células inmune in vitro con un anticuerpo que bloquea la interacción de un ligando de PD-1 con PD-1 y reintroducir las células inmune estimuladas in vitro al paciente.

En ciertas instancias, puede ser deseable administrar adicionalmente otros agentes que regulan ascendentemente respuestas inmune, por ejemplo, formas de otros miembros de la familia de B7 que transducen señales vía receptores co-estimuladores , con el fin de alimentar adicionalmente la respuesta inmune.

Un anticuerpo que bloquea la interacción de un ligando de PD-1 con PD-1 o B7-1 puede ser usado profilácticamente en vacunas contra varios polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos derivados de patógenos) . La inmunidad contra un patógeno (por ejemplo, un' virus) puede ser inducida mediante vacunación con una proteína viral junto con un anticuerpo que bloquea la interacción de un ligando de PD-1 con PD-1 o B7-1 en un adyuvante apropiado.

En otra modalidad, la regulación ascendente o mejora de una función de respuesta inmune, como se describe en la presente, es útil en la inducción de inmunidad de tumor.

En otra modalidad, la respuesta inmune puede ser estimulada mediante los métodos descritos en la presente, de tal manera que la tolerancia preexistente es superada. Por ejemplo, respuestas inmune contra antígenos a los cuales un sujeto no puede montar una respuesta inmune significativa, por ejemplo, a un antígeno autólogo, tal como antígenos específicos de tumor pueden ser inducidas al administrar un anticuerpo que bloquea la interacción de un ligando de PD-1 con PD-1. En una modalidad, un antígeno autólogo, tal como un antígeno tumor-específico puede ser co-administrado . En otra modalidad, una respuesta inmune puede ser estimulada contra un antígeno (por ejemplo, un antígeno autólogo) para tratar una alteración neurológica. En otra modalidad, Los agentes presentes pueden ser usados como adyuvantes para reforzar respuestas a antígenos extraños en el proceso de inmunización activa.

En una modalidad, células inmunes son obtenidas de un sujeto y cultivadas ex vivo en presencia de un anticuerpo como se describe en la presente, para expandir la población de células inmune y/o para mejorar la activación de célula inmune. En una modalidad adicional las células inmune son luego administradas a un sujeto. Las células inmune pueden ser estimuladas in vi tro al por ejemplo proveer a las células inmune una señal de activación primaria y una señal co-estimuladora como es conocido en el arte. Varios agentes pueden también ser usados para coestimular la proliferación de células inmune. En una modalidad, células inmune son cultivadas ex vivo de acuerdo con el método descrito en la solicitud de PCT No. WO 94/29436. El polipéptido coestimulador puede ser soluble, anexado a una membrana celular o anexado a una superficie sólida, tal como una perla.

Otras modalidades de la presente invención son descritas en los siguientes ejemplos. La presente invención es ilustrada adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deben ser interpretados como limitantes adicionales . El contenido del listado de secuencias, figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en toda esta solicitud son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

EJEMPLOS Los ejemplos a continuación describen la generación de anticuerpos monoclonales apropiados para propósitos terapéuticos que apuntan a PD-1, PD-L1 y PD-L2 humano. Anticuerpos PD-1, PD-Ll y PD-L2 anti-humanos humanos compuestos fueron generados a partir de anticuerpos EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 anti-humanos de ratón, respectivamente. Segmentos de secuencia de región de V humana fueron provistos de bases de datos de secuencias de anticuerpo humanos no relacionados (de línea germinal y sin línea germinal) . Cada segmento de secuencia seleccionado (también como las uniones entre segmentos) fue probado en cuanto al potencial para enlazarse a clase II de MHC utilizando algoritmos de predicción de enlace. Todas las variantes de secuencia de anticuerpo humanas compuestas finales fueron diseñadas para evitar epítopos de célula T. Genes de región V de anticuerpo humano compuestos fueron generados utilizando oligonucleótidos sintéticos que codifican combinaciones de los segmentos de secuencia humanos. Estos fueron luego clonados en vectores que contienen regiones constantes humanas y se producieron anticuerpos y fueron probados en cuanto a enlace a antígenos objetivo mediante ELISA de competencia.

Ejemplo 1; Diseño de Secuencias de Región Variable de Anticuerpo Humano Compuesto Modelos estructurales de las regiones V EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 de ratón fueron producidas utilizando Swiss Pdb y analizados con el fin de identificar aminoácidos de "restricción" importantes en las regiones V de ratón que podrían ser esenciales para las propiedades de enlace de los anticuerpos. Solamente los residuos contenidos dentro de las CDR fueron considerados importantes, incluyendo residuos de CDR definidos bajo las definiciones tanto de Kabat como de Chothia.

A partir del análisis anterior, se consideró que las formas humanas compuestas de EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 podrían ser creadas con amplia libertad de secuencias fuera de CDR péro con un menú estrecho de residuos alternativos posibles dentro de las secuencias de CDR. El análisis preliminar indicó que segmentos de secuencia correspondientes de varios anticuerpos humanos podrían ser combinadas para crear CDR similares o idénticas a aquellas en las secuencias de ratón. Para regiones fuera de y que flanquean las CDR, una amplia selección de segmentos de secuencia humana fueron identificadas como componentes posibles de las nuevas regiones variables de anticuerpo humano compuestas .

En base al análisis anterior, un conjunto preliminar grande de segmentos de secuencia que podrían ser usados para crear variantes de anticuerpo humano compuestas EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12, fueron seleccionados y analizados vía algoritmos de predicción de enlace de MHC clase II y BLAST buscados a través de una base de datos patentada de epítopos de célula *T relacionados de secuencia de anticuerpo conocida. Segmentos de secuencia en donde péptidos de enlace clase II de MHC fueron identificados o tuvieron puntuación de aciertos significativos contra la base de datos de epítopos de célula T conocidos fueron descartados. Esto dio como resultado un conjunto reducido de segmentos y combinaciones de estos fueron otra vez analizados como anteriormente, para asegurar que las uniones entre los segmentos no contenían epítopos de célula T potenciales. Segmentos seleccionados fueron luego combinados para producir secuencias de región variable de cadena pesada y ligera para síntesis. Para todos los tres anticuerpos, cinco cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras fueron construidas con secuencias detalladas como sigue.: Segmentos de secuencia usados para producir estas secuencias de anticuerpo humano compuestos son detallados en las Tablas 1 , 2 y 3 para anticuerpos contra PD- 1 , PD-L1 y PD-L2 respectivamente .

Tabla 1. Derivación de Segmentos de Secuencia Humana que Comprenden los Anticuerpos Humanos Compuestos Anti-PD-1 Número de Secuencia de VH3 . Acceso Genbank BAA75018 QVQLVQSGHEVKQPGASVK (SEQ ID NO: 82) AAG00910 MSCKASGYSFTS (SEQ ID NO: 83) AAY18543 SGYSFTSSWI (SEQ ID NO: 84) AAY57105 WIHWV (SEQ ID NO: 85) AAG00910 KQ AAD16517 QAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 86) AAD53797 GLEWIGYIYPS (SEQ ID NO: 87) CAA08742 STGF (SEQ ID NO: 88) CAC87219 TEYN (SEQ ID NO: 89) AAT96419 QKF AAA17939 KDR AAR02530 DRAT (SEQ ID NO: 90) Número de Secuencia de VH3 Acceso Genbank AAA17939 TLT AAM87977 TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 91) CAA78534 STAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRD (SEQ ID NO: 92) AAV40096 DSSGY (SEQ ID NO: 93) AAR38557 YHA AAW29142 AMD IGHJ4 DYWGQGTLVTVSS (SEQ ?) NO: 94) Número de Secuencia de VH4 Acceso Genbank BAA75018 QVQLVQSGHEVKQPGASVK (SEQ ID NO: 82) AAG00910 MSCKASGYSFTS (SEQ ID NO: 83) AAY18543 SGYSFTSSWI (SEQ ID NO: 84) AAA02616 HWVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 95) AAD53797 GLEWIGYIYPS (SEQ ID NO: 87) CAA08742 STGF (SEQ ID NO: 88) Número de Secuencia de VH4 Acceso Genbank CAC87219 TEYN (SEQ ID NO: 89) AAT96419 QKF AAA17939 KDR AAR02530 DRAT (SEQ ID NO: 90) AAA17939 TLT AAM87977 TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 91) CAA78534 . STAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRD (SEQ ID NO: 92) AAV40096 DSSGY (SEQ ID NO: 93) AAR38557 YHA AAW29142 AMD IGHJ4 DYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 94) AAY16615 EIVLTQSPATLSLSPGQR (SEQ ID NO: 96) AAD09377 RLTISCRASQ (SEQ ID NO: 97) AAA99362 TISCRASQSVST (SEQ ID NO: 98) AAL04518 SVSTSGYSYMHW (SEQ ID NO: 99) AAA58912 WYQQKPDQSPKLLIK (SEQ ID NO: 100) AAD 16648 FGS Número de Secuencia de VK3 Acceso Genbank AAD 19478 SNLESG (SEQ ID NO: 101) AAL10884 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFA (SEQ ID NO: 102) AAD16559 PEDF ATYYCQH S (SEQ ID NO: 103) AAA99326 SW AAC1681 1 EIP J2 humano YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) Número de Secuencia de VK4 Acceso Genbank AAB53267 DrVLTQSP (SEQ ID NO: 105) AAY16615 rVLTQSPATLSLSPGQR (SEQ ID NO: 106) AAD09377 RLTISCRASQ (SEQ ID NO: 97) AAA99362 TISCRASQSVST (SEQ ID NO: 98) AAL04518 SVSTSGYSYMHW (SEQ ID NO: 99) AAA58912 WYQQKPDQSPKLLIK (SEQ ID NO: 100) AAD 16648 FGS AAD 19478 SNLESG (SEQ ID NO: 101) AAL10884 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFA (SEQ ID NO: 102) AAD16559 PEDFATYYCQHS (SEQ ID NO: 103) AAA99326 SW AAC16811 EIP J2 humano YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) Tabla 2. Derivación de Segmentos de Secuencia Humana que Comprenden los Anticuerpos Humanos Compuestos Anti-PD-Ll Número de Secuencia de VH2 Acceso Genbank ABI50688 EVQLVQSGAEVKKPGASVK (SEQ ID NO: 107) AAG00910 MSCKASGY (SEQ ID NO: 108) ABI50688 SCKASGYTFTSY (SEQ ID NO: 109) AAC50839 SYVMHWV (SEQ ID NO: 1 10) AAA18267 WVRQAPGQRLEWIG (SEQ ID NO: 121) ABF20472 GY AAD30737 VNPF (SEQ ID NO: 113) CAL06274 NDGT (SEQ ID NO: 114) CAC43212 KYN CAC87219 YNE CAD31770 EM AAR32413 FKGR (SEQ ID NO: 115) AAG30515 GRAT (SEQ ID NO: 1 16) ABA62048 TLT ABI50549 TSD AAR32572 DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 117) AAC 18225 AVYYCARQA (SEQ ID NO: 1 18) AAV39747 AWGY (SEQ ID NO: 1 19) IGHJ5*02 PWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 120) Número de Secuencia de VH4 Acceso Genbank ABI50688 EVQLVQSGAEVKKPGASVK (SEQ ID NO: 107) AAG00910 MSCKASGY (SEQ ID NO: 108) ABI50688 SCKASGYTFTSY (SEQ ID NO: 109) AAC50839 SYVMHWV (SEQ ID NO: 1 10) CAC43594 WVKQ (SEQ ID NO: 11 1) AAA18267 QAPGQRLEWIG (SEQ ID NO: 1 12) ABF20472 GY AAD30737 VNPF (SEQ ID NO: 113) CAL06274 NDGT (SEQ ID NO: 114) CAC43212 KYN CAC87219 YNE CAD31770 EM AAR32413 FKGR (SEQ ID NO: 1 15) AAG30515 GRAT (SEQ ID NO: 116) ABA62048 TLT ABI50549 TSD AAR32572 DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 1 17) AAC 18225 AVYYCARQA (SEQ ID NO: 1 18) AAV39747 AWGY (SEQ ID NO: 1 19) IGHJ5*02 PWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 120) Número de Secuencia de VKI Acceso Genbank CAA31193 DIVLTQSPASLALS (SEQ ID NO: 122) CAE54363 IVLTQSPATLSLSPGE (SEQ ID NO: 134) ABA26115 LSPGERAT (SEQ ID NO: 123) AAQ21828 ESV CAA51101 VE AAA58691 YYGTSL (SEQ ID NO: 124) AAY33369 VQWYQQKPGQ (SEQ ID NO: 125) ABI74051 WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 126) CAC39383 PKLLIYAASS (SEQ ID NO: 127) CAA38592 SVDS (SEQ ID NO: 128) AAK26833 DSGVPSRFSGSGSGT (SEQ ID NO: 129) AAM46660 RFSGSGSGTDFTLTINSLE (SEQ ID NO: 130) AAA58912 TINSLEAEDAA (SEQ ID NO: 135) AAK68016 AMYFCQQ (SEQ ID NO: 132) CAK50767 SR AAP23227 RVPYTFG (SEQ ID NO: 133) J2 humano YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) Número de Secuencia de VK2 Acceso Genbank CAA31 193 DIVLTQSPASLALS (SEQ ID NO: 122) ABA261 15 LSPGERAT (SEQ ID NO: 123) AAQ21828 ESV CAA51 101 VE AAA58691 YYGTSL (SEQ ID NO: 124) AAY33369 VQWYQQKPGQ (SEQ ID NO: 125) ABI74051 WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 126) CAC39383 PKLLIYAASS (SEQ ID NO: 127) CAA38592 SVDS (SEQ ID NO: 128) AAK26833 DSGVPSRFSGSGSGT (SEQ ID NO: 129) AAM46660 RFSGSGSGTDFTLTINSLE (SEQ ID NO: 130) AAL04518 EEEDAA (SEQ ID NO: 131) AAK68016 AMYFCQQ (SEQ ID NO: 132) CAK50767 SR AAP23227 RVPYTFG (SEQ ID NO: 133) 32 humano YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) Número de Secuencia de VK4 Acceso Genbank CAA3 1 193 DIVLTQSPASLALS (SEQ ID NO: 122) CAE54363 IVLTQSPATLSLSPGE (SEQ ID NO: 134) ABA261 15 LSPGERAT (SEQ ID NO: 123) AAQ21828 ESV CAA51 101 VE AAA58691 YYGTSL (SEQ ID NO: 124) AAY33369 VQWYQQKPGQ (SEQ ID NO: 125) ABI74051 WYQQKPGQPP LLIY (SEQ ID NO: 126) CAC39383 PKLLIYAASS (SEQ ID NO: 127) CAA38592 SVDS (SEQ ID NO: 128) AAK26833 DSGVPSRFSGSGSGT (SEQ ID NO: 129) AAM46660 RFSGSGSGTDFTLTINSLE (SEQ ID NO: 130) AAA58912 TINSLEAEDAATYFC (SEQ ID NO: 136) AAK68016 AMYFCQQ (SEQ ID NO: 132) CAK50767 SR AAP23227 RVPYTFG (SEQ ID NO: 133) J2 humano YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) Tabla 3. Derivación de Segmentos de Secuencia Humana que Comprenden los Anticuerpos Humanos Compuestos Anti-PD-L2 Número de Secuencia de VH2 Acceso Genbank ABF83419 QVQLVQSGAEVKKPGASVK (SEQ ID NO: 137) AAG00910 MSCKASGY (SEQ ID NO: 108) ABF83419 SCKASGYTFTGY (SEQ ID NO: 138) AAL17955 TMHWV (SEQ ID NO: 139) CAC43594 WVKQ (SEQ ID NO: 111) AAL17955 QAPG (SEQ ID NO: 140) AAF40162 GQGLEWIG (SEQ ID NO: 141) AAR02558 GYINP (SEQ ID NO: 142) AAR32283 INPRSG (SEQ ID NO: 143) AAR02553 GYT CAC87219 TEYN (SEQ ID NO: 89) AAT96419 QKF AAA17939 KDR AAB06403 RTT AAA17939 TLT AAG30529 TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 91) ABE66740 DTAVYYCARPW (SEQ ID NO: 144) ABK81281 WFAY GQGT (SEQ ID NO: 145) IGHJ4 YWGQGTLVTVSS (SEQ ? NO: 146) Número de Secuencia de VH4 Acceso Genbank ABF83419 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGY (SEQ ID NO: 147) AAL17955 TMHWVRQAPG (SEQ ID NO: 148) AAF40162 GQGLEWIG (SEQ ID NO: 141) AAR02558 GYINP (SEQ ID NO: 142) AAR32283 INPRSG (SEQ ID NO: 143) AAR02553 GYT CAC87219 TEYN (SEQ ID NO: 89) AAT96419 QKF AAA17939 KDR AAB06403 RTT AAA17939 TLT AAG30529 TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 91) ABE66740 DTAVYYCARPW (SEQ ID NO: 144) ABK81281 WFAYWGQGT (SEQ ID NO: 145) IGHJ4 YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146) Número de Secuencia de VK2 Acceso Genbank AAD 16249 DIVMTQSP (SEQ ID NO: 149) CAA31193 PASL (SEQ ID NO: 150) AAA58913 LSVTPGEKVTITC (SEQ ID NO: 151) AAQ99244 CKSSQSLL (SEQ ID NO: 152) ABA71421 LNS AAD19451 GN AAS86065 QK AAD14073 KNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRF (SEQ ID NO: 153) AAZ09126 RFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ (SEQ ID NO: 154) CAA31484 NDY CAC87582 YSYPL (SEQ ID NO: 155) Jl humano TFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 156) Número de Secuencia de VK3 Acceso Genbank AAD 16249 DIVMTQSP (SEQ ID NO: 149) AAA58913 VMTQSPAFLSVTPGEKVTITC (SEQ ID NO: 157) AAQ99244 CKSSQSLL (SEQ ID NO: 152) ABA71421 LNS AAD19451 GN AAS86065 QK AAD14073 KNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRF (SEQ ID NO: 153) AAZ09126 RFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ (SEQ ID NO: 154) CAA31484 NDY CAC87582 YSYPL (SEQ ID NO: 155) Jl humano TFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 156) Número de Secuencia de VK4 Acceso Genbank AAD 16249 DIVMTQSP (SEQ ID NO: 149) AAA58913 VMTQSPAFLSVTPGEKVTITC (SEQ ID NO: 157) AAQ99244 CKSSQSLL (SEQ ID NO: 152) ABA71421 LNS AAD19451 GN AAS86065 QK AAD14073 KNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRF (SEQ ID NO: 153) CAD44754 RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQ (SEQ ID NO: 158) CAD44754 NDY CAC87582 YSYPL (SEQ ID NO: 155) Jl humano TFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 156) Ejemplo 2; Generación y Prueba de Anticuerpos Humanos Compuestos Genes de región de VH y V de anticuerpo humano compuesto de variante inicial 1 fueron sintetizados para EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 utilizando una serie de oligonucleótidos traslapantes que fueron recocidos, ligados y amplificados por PCR para dar regiones de V sintéticas de plena longitud (Figura 2A, Figura 3A, Figura 4A, Figura 5A, Figura 6A y Figura 7A) . Para cada anticuerpo humano compuesto, variantes de secuencias subsecuentes fueron construidas utilizando oligonucleótidos traslapantes largos y PCR, utilizando la variante 1 inicial como la plantilla. Las variantes ensambladas fueron luego clonadas directamente a vectores de expresión (Figura 1) y sus secuencias fueron verificadas.

Todas las combinaciones . de cadenas pesadas y ligeras quiméricas y compuestas (esto es, un total de 20 apareamientos para cada anticuerpo) fueron transíectadas establemente a células NSO mediante electroporacion y seleccionados en medios (DMM de alto contenido de glucosa con L-glutamina y piruvato de Na, IgG FCS ultra-bajo al 5%, pen/strep-todos de Invitrogen) que contienen metotrexato 200 nM. Varias colonias resistentes a fármaco para cada constructo fueron probadas en cuanto a niveles de expresión y las líneas que expresan mejor fueron seleccionadas y congeladas bajo nitrógeno líquido.

Los sobrenadantes de las líneas que expresan mejor para cada combinación fueron cuantificados utilizando un análisis de ELISA de sección de cadena ligera kappa de captura de Fe en comparación con un estándar de IgGl/kappa. Los sobrenadantes cuantificados fueron luego probados en un análisis de ELISA de competencia en cuanto a enlace a su antígeno objetivo. Placas Maxisorb™ (Nunc) de 96 cavidades fueron recubiertas durante toda la noche a 4°C con 50 µ?/cavidad de 1 µg de Fc-PD-1, Fc-PD-1, Fc-PD-Ll o Fc-PD-L2 humano (R&D Systems) en solución reguladora del pH de carbonato H 9.6. Titulaciones por duplicado de anticuerpos de referencia de ratón y muestras de anticuerpo humano compuestas fueron generadas (en el intervalo 0.0078 g/ml a 8 g/ml) y mezcladas con una constante concentración (40 ng/ml) de anticuerpo de referencia de ratón biotinilado en PBS pH 7.4/BSA al 2%. Las titulaciones, 100 µ?/cavidad, fueron agregados a placas de análisis lavadas (4x con PBS pH 7.4/Tween 20 al 0.05%) e incubadas a temperatura ambiente por 1 hora. Las placas fueron lavadas como anteriormente y se agregaron 100 µ?/cavidad de una dilución 1/1000 de estreptavidina HRP (Sigma) en PBS pH 7.4/BSA al 2% e incubadas por 1 hora adicional a temperatura ambiente. Después de un lavado adicional, el anticuerpo de referencia biotinilado enlazado fue detectado con 100 µ?/cavidad de sustrato de OPD. La absorbancia fue medida a 490 nm y las curvas de enlace de los anticuerpos de prueba fueron comparadas con el estándar de referencia de ratón. La absorbancia fue graficada contra la concentración de muestra y líneas rectas fueron ajustadas por medio de cada uno de los conjuntos de datos. Las ecuaciones de las líneas fueron usadas para calcular la concentración requerida para inhibir el enlace de biotina-EH12.2H7 a PD-1, enlace de biotina-29E.2A3 a PD-Ll y enlace de biotina-24F.10C12 a PD-L2 humanos al 50% (IC50).

Los anticuerpos con las mejores IC50 fueron seleccionados y líneas celulares para todas estas variantes de anticuerpos EH12.2H7, 29E.2A3 y 24F.10C12 fueron acumuladas a 100 mi y cultivados a saturación. Los anticuerpos fueron purificados de cada cultivo vía cromatografía de afinidad de proteína A. Brevemente, los sobrénadantes fueron ajustados en pH con 0.1 volúmenes de PBS lOx pH 7.4 y se hicieron pasar sobre columnas de proteína A mAb Select Sure de 1 mi (GE Healthcare) . Las columnas fueron lavadas con 10 volúmenes de PBS, pH' 7.4 antes de la elución con solución reguladora del pH de citrato 50 mM, pH 3.0. Fracciones de 1 mi fueron recolectadas e inmediatamente neutralizadas con 0.1 mi de Tris- HC1 1 m pH 9.0. Las fracciones que contienen proteína (tal como se determina por la absorbancia a 280 nm) fueron acumuladas, intercambiadas en solución del pH regulado a PBS pH 7.4 y los anticuerpos purificados fueron almacenados a +4°C. Las Figuras 8A-C muestran un gen de SDS-PAGE de 1 µg de cada anticuerpo, teñido con azul de Coomassie. Las concentraciones de los anticuerpos fueron calculadas mediante absorción UV en base a los coeficientes de extinción molar calculados de tal manera que Eo.i% a 280nm = 1.61 para EH12.2H7, E0.i% a 280 nm = 1.46 para 29E.2A3 y E0.i% a 280 nm = 1.57 para 24F.10C12.

Los anticuerpos purificados fueron probados en cuanto • a enlace a Fc-PD-1, Fc-PD-Ll o FC-PD-L2 humanos vía ELISA de competencia como se describe anteriormente. Se hicieron titulaciones de los anticuerpos de prueba de 0.0625 pg/ml a 8.0 g/ml por duplicado. La absorbancia a 490 nm fue medida y esta fue graficada contra la concentración de anticuerpo de prueba (Figuras 9A-C, 10A-C) .

La Tabla 4 resume los resultados para las combinaciones de las secuencias variantes de VH y VK compuestas para los anticuerpos anti-PD-1, PD-L1 y PD-L2. Para EH12.2H7 todos los anticuerpos humanizados tienen una IC5o que es mejorada en comparación la referencia de ratón, particularmente VH4/VK3 que tiene un incremento de dos veces en enlace. En el caso de 29E.2A3, las variantes VH2/VK1 y VH2/VK4 tienen enlace equivalente a la referencia de ratón mientras que las variantes VH2/VK2 y VH4/VK2 tienen enlace reducido por 1.75 y 1.36 veces respectivamente. Para 24F.10C12, todas las variantes seleccionadas tienen enlace similar pero ligeramente reducido, en comparación con la referencia de ratón (1.13 veces) .

Tabla 4: Valores de IC50 para Variantes de Secuencia de Anticuerpo Humano Compuesto PD-1, PD-Ll y PD-L2 Como resultado de estos experimentos, anticuerpos humanos compuestos específicos para PD-1, PD-Ll y PD-L2 humanos han sido construidos a partir de segmentos de secuencia de aminoácidos derivados completamente de regiones variables de anticuerpo humano no relacionadas . Todas las CDR y regiones de estructura en las variantes de anticuerpo humano compuestos consistía además de un segmento de secuencia humano no relacionado (provisto de la base de datos de secuencia humana) y todos los anticuerpos humanos compuestos fueron diseñados específicamente para evitar epítopos de célula T. Cuatro candidatos principales fueron seleccionados inicialmente para enlace a PD-1, PD-Ll o PD-L2 humano y en el análisis subsecuente, se demostró que tienen enlace dentro de dos veces del anticuerpo murino .

Ejemplo 5: Estimulación mejorada de activación de célula T mediante inhibición de interacción de PD-1; ligando de PD-1 La ruta de señalización de PD-1 inhibe señales coestimuladoras de TCR/CD28 moderadas con la producción de citocina que es reducida primero sin una disminución en proliferación de célula T. A medida que las señales coestimuladoras de TCR/CD28 se debilitan, la ruta de PD-1 domina, con una mayor reducción en producción de citocina acompañada por una reducción en proliferación. Así, con el fin de confirmar que la inhibición de la ruta de PD-1 vía inhibición de la interacción con PD-L1 o PD-L2 utilizando anticuerpos humanos compuestos de la invención mejora la activación de célula T, se efectúan reacciones de linfocito mezclado (MLR) .

Células dendríticas mieloides inmaduras son aisladas al cultivar monocitos de sangre periférica humana en IL-4 y GM-CSF. La exposición de células dendríticas inmaduras a un cóctel inflamatorio de IL-?ß, TNF-OÍ, IL-6 y PGE2 produce el desarrollo de células dendríticas maduras que funcionan como APC. Sin embargo, la adición de IL-10 a las citocinas inflamatorias dadas durante la fase de maduración da como resultado en APC que funcionan solo 1/6 a 1/3 también.

Análisis de activación de célula T (MLR) son efectuados, utilizando células dendríticas tratadas con IL-10 como APC, en presencia de anticuerpos humanos compuestos a anticuerpos PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 o de referencia. La adición de los mAb anti-PD-1, anti-PD-Ll y/o PD-L2 a cultivos de células dendríticas tratadas con IL-10 más células T alogénicas se predice que dan como resultado un incremento en proliferación de célula T y expresión de citocina, en comparación con cultivos tratados con IgG testigos. Una combinación de anticuerpos anti-PD-1 con anticuerpos anti-PD-Ll, anticuerpos anti-PD-L2, puede también dar como resultado un incremento en estimulación mayor que aquella vista ya sea con uno u otro anticuerpo solo.

Ejemplo 6; Inhibición de la Ruta de PD-1 en Ratones Infectados Crónicamente . Ratones infectados con varias cepas del virus coriomeningitis linfoc tico (LCMV) son usados para estudiar el efecto de infección viral crónica en la función de célula T CD8. La cepa de Armstrong LCMV provoca una infección aguda que es despejada en el transcurso de 8 días, dejando atrás una población de larga vida de células T CD8 de memoria de reposo altamente funcionales, la cepa de Cl—13 de LCMV, en contraste, establece una infección persistente en el huésped, caracterizada por una viremia que dura hasta 3 meses.

Para confirmar que el bloqueo de la señalización de PD-1 restaura la función de célula T y mejora el control viral durante la infección de LCMV crónica, la señalización de PD-1 es disrumpida durante la infección de LCMV crónica utilizando anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos compuestos de la invención. Los anticuerpos son administrados cada tercer día a ratones infectados con LCMV Cl-13 del día 23 al día 37 post-infección . Se espera que al día 37 habrá varias veces más células T CD8 LCMV específicas en ratones tratados en relación con los testigos sin tratar. También se espera que la inducción de proliferación será específica a células T CD8 desde entonces y el número de células T CD4 en el bazo probablemente será el mismo tanto en ratones tratados como ratones sin tratar.

Además de un incremento en proliferación de célula T CD8, se espera que la inhibición de la señalización de PD-1 también dará como resultado una producción incrementada de citocinas anti-virales en células T CD8 virus-específicas. La producción de IFN-gamma y TNF-alfa por células T CD8 probablemente será varias veces más alta en los ratones tratados en comparación con los ratones sin tratar. El despeje viral debe también ser acelerado y títulos virales reducidos deben ser observados en el pulmón y riñon por el día 37 post-infección en ratones tratados, mientras que los ratones sin tratar probablemente exhibirán niveles significativos de virus en todos estos tejidos.

Las células T CD4 juegan un papel clave en la generación y mantenimiento de respuestas de célula T CD8. A este respecto, células T CD8 cebadas en ausencia de células T CD4 son incapaces de montar respuestas inmune normales, y son así frecuentemente denominadas como "células T indefensas". Además, la infección LCMV crónica es más severa en ausencia de células T CD4. Así, las células T indefensas generadas durante la infección de LCMV-C1-13 muestran un deterioro funcional aún más profundo que las células T generadas en presencia de células T.CD4.

Las células T CD4 son agotadas al tiempo de la infección con LCMV-Cl-13 y los ratones son tratados con anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-PD-Ll humanos compuestos de la presente invención del día 46 al día 60 post-infección. Se espera que enseguida del tratamiento, los ratones tratados probablemente tendrán varias veces más células T CD8 LCMV-específicas en su bazo que los ratones testigo sin tratar. Este incremento en células T CD8 virus-específicas en ratones tratados probablemente será el resultado a un incremento en proliferación, tal como es detectada mediante incorporación de BrdU. El análisis de BrdU es efectuado al introducir 1 mg/ml de BrdU en el agua para beber durante el tratamiento y el teñido es efectuado de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Diego, Calif . ) .

Para confirmar que la inhibición de las señales de PD-1 incrementa la actividad lítica de células T CD8 virus-específicas, exhaustas, indefensas, la actividad lítica ex vivo de células T CD8 virus-específicas, es detectada enseguida de tratamiento utilizando un análisis de blrc de 51Cr (Wherry et al., 2003. J. Virol. 77:4911-27) . Se espera que los títulos virales sean reducidos por varias veces en el bazo, hígado, pulmón y suero después de 2 semanas de tratamiento en relación con los ratones sin tratar.

Ejemplo 7; Administración de una vacuna con un inhibidor de señalización de PD-1 Un procedimiento para reforzar respuestas de célula T durante una infección persistente es vacunación terapéutica. El razonamiento para este procedimiento es que los antígenos endógenos pueden no ser presentados de manera óptima u inmunogénica durante la infección viral crónica y que la provisión del antígeno en forma de una vacuna puede proveer un estímulo más efectivo para células T y B virus-específicas. Utilizando el modelo de - LCMV crónico, se administra a los ratones un virus de vacuna recombinante que expresa el epítopo GP33 de LCMV como una vacuna terapéutica (WGP33) que da como resultado una mejora modesta de respuesta de célula T CD8 en algunos ratones infectados crónicamente. Esta vacunación terapéutica es combinada con anticuerpos anti-PD-1 humanos compuestos, anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-PD-L2 de la invención. Se . espera que las respuestas de célula T LCMV específicas serán reforzadas a jan nivel mayor que en comparación ya sea con el tratamiento solo y el efecto de tratamiento combinado probablemente será más que aditivo.

Ejemplo 8; Chimpancés como modelo para inmunoterapia de infección de HCV persistente Los chimpancés proveen un modelo de persistencia de. HCV en humanos . Los defectos en inmunidad de célula T que conducen a persistencia de virus de larga vida incluyen tanto un déficit en células T auxiliares CD4 HCV-específicas y actividad de célula T efectora CD8 deteriorada o alterada. Chimpancés infectados persistentemente son tratados con anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos compuestos de la invención. La eficacia del bloqueo de las rutas inhibidoras, combinada con vacunación utilizando proteínas de HCV estructurales y no estructurales recombinantes y si tales estrategias pueden mejorar la frecuencia y longevidad de células T de memoria virus-específicas son determinadas. El defecto en inmunidad de célula T es exclusivamente HCV-específico en humanos y chimpancés infectados persistentemente. La actividad antiviral puede luego ser restaurada al administrar a los chimpancés anticuerpos monoclonales humanizados que bloquean la señalización por medio de estas moléculas.

Chimpancés infectados persistentemente son tratados con anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos compuestos de la invención. Después del tratamiento con anticuerpos, las respuestas humorales y respuestas inmunes celulares también como la carga de AR de HCV son determinados. Las muestras son recolectadas a las semanas 1, 2, 3, 5 y 8 y luego a intervalos mensuales. Las muestras incluyen: 1) suero para análisis de transaminasas, autoanticuerpos , anticuerpos neutralizantes a HCV y respuestas de citoquina, 2) plasma para la carga viral y evolución de genoma, 3) PBMC para medidas in vitro de inmunidad, expresión de receptor coestimuladora/inhibidora y función, 4) hígado nuevo (sin fijar) para aislamiento de linfocitos intrahepáticos y ARN y 5) hígado fijo (formalina/parafina embebido) para histología y análisis inmunohistoquímicos . Nodos linfáticos regionales son también recolectados a 2 o 3 puntos en el tiempo para determinar la expresión de moléculas co-inhibidoras y variantes de empalme mediante técnicas de inmunohistoquímica y técnicas moleculares.

Para determinar si la vacunación con antígenos de HCV potencia el efecto terapéutico de los anticuerpos, los chimpancés son tratados como sigue: 1) inmunización intramuscular con glicoproteínas de envolvente recombinantes El y E2 (en adyuvante MF59) y otras proteínas (núcleo más NS 3 , 4 y 5 formulados con ISCOMS) a las semanas 0, 4 y 24, 2) inmunización intramuscular con la vacuna utilizada en, pero coadministrada con anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-PD-L2 humanos compuestos de la invención. Respuestas de célula T y B HCV-específicas son monitoreadas a intervalos mensuales después de inmunización por un periodo de un año .

Los marcadores examinados en cuanto a HCV-tetrámero positivos y células T totales en este análisis incluyen marcadores de diferenciación (por ejemplo CD45RA/RO, CD62L, CCR7 y CD27) activación (por ejemplo CD25, CD69, CD38 y HLA-DR) , supervivencia/proliferación (por ejemplo bcl-2 y Ki67), potencial citotóxico (por ejemplo, granzimas y perforina) y receptores de citoquina (CD122 y CD127) . Existe una correlación interesante entre los niveles de pre-terapia de la quimiocina IP-10 y respuesta a IFN- .gamma. /ribavirina de PEG. Los niveles de IP-10 son medidos para investigar una correlación potencial entre rutas reguladoras negativas o repuestas de célula T HCV-específicas y niveles de IP-10. La expresión de receptores inhibidores y ligandos sobre PBMC son efectuadas mediante citometría de flujo.

Ejemplo 9: Mejora de inmunidad SlV-específica in vivo mediante bloqueo de PD-1 El potencial de restauración inmune de bloqueo de PD- 1 durante la infección por virus de inmunodeficiencia simio (SIV) crónico fue probado en macacos. Catorce macacos rhesus de la India (Macaca mulatta) infectados con SIV fueron estudiados. Ocho macacos fueron usados para la fase crónica prematura y fueron infectados intravenosamente con 200 dosis infecciosas de cultivo de tejido al 50% (TCID50) de SIV251. Seis macacos fueron usados para la fase crónica tardía, tres fueron infectados con SIV251 intrarrectalmente y tres fueron infectados con SIV239 intravenosamente. Todos los macacos, excepto RDbll, fueron negativos para los alelos Mamu B08 y Mamu B17. RDbll fue positivo para el alelo Mamu B17.

Tratamiento de anticuerpo in vivo: Los macacos fueron infusionados ya sea con anticuerpo PD-1 anti-humano de ratón parcialmente humanizado (clon EH12-1540) (Dorfman et al., Am. J. Surg. Pathol. 30:802-810, 2006) o un anticuerpo testigo (SY AGIS) . El 3?^?µ?G?? anti-PD-1 tiene un dominio de cadena pesada variable enlazada a igGl humana (mutada para reducir FcR y enlace de complemento) y dominio de cadena ligera variable de ratón enlazado a ? humano. El clon EH122 que enlaza PD-1 de macaco y bloquea interacciones entre PD-1 y sus ligandos in vitro. SYNAGIS es un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado (IgGlK) específico a proteína F de virus sincitial respiratorio. Los anticuerpos fueron administrados intravenosamente a 3 mg kg"1 de peso corporal en los días 0, 3, 7 y 10.

Respuestas inmune: Células mononucleares de sangre periférica de sangre y linfocitos de biopsias de perforación rectal fueron aisladas como se describe previamente (Velu et al., J. Virol. 81:5819-5828, 2007). El teñido de tetrámero, producción de citoquina intracelular y mediciones de anticuerpo de enlace anti-SIV Env fueron efectuados como se describe previamente (Amara et al, Science 292:69-74, 2001; Kannanganat et al., J. Virol. 81 :'8468-8476 , 2007; Lai et al., Virology 369:153-167, 2007).

El bloqueo de PD-1 fue efectuado durante las fases prematuras (10 semanas) también como tardías (aproximadamente 90 semanas) de infección de SIV crónica. Nueve macacos (cinco durante la fase temprana y cuatro durante la fase tardía) recibieron el anticuerpo anti-PD-1 y cinco macacos (tres durante la fase prematura y dos durante la fase tardía) recibieron un anticuerpo testigo de isotipo (Synagis, específico de virus sincitial anti-respiratorio (RSV) ) .

El bloqueo de PD-1 durante la infección de SIV crónica dio como resultado una expansión rápido de células T CD8 SIV-específicas en la sangre de todos los macacos. Las respuestas de célula T de CD8 a dos epítopos inmunodominantes Gag CM9 (Alien et al., J. Immunol. 160:6062-6071, 1998) y Tat SL8/TL8 (Alien et al., Nature 407:386-390, 2000), fueron estudiadas utilizando complejos tetraméricos del complejo de histocompatibilidad mayor I (MHC) en siete de los macacos tratados con anticuerpo anti-PDl y tres de los macacos tratados con anticuerpo testigo que expresaron la molécula de histocompatibilidad Mamu A*01. La mayoría (>98%) de las células T CD8 tetrámero de Gag-CM9 específicas expresaron PD-1 antes del bloqueo. Después del bloqueo de PD-1, las células T CD8 tetrámero de Gag-CM9-específicas se expandieron rápidamente y se y se proyectaron a los días 7-21. En la respuesta pico, estos niveles fueron aproximadamente 2.5 a 11 veces más altas que sus niveles respectivos en el día 0 (P = 0.007) y permanecieron elevadas hasta 28-45 días. Resultados similares fueron observados con el bloqueo durante las fases tempranas también como las fases tardías de infección de SIV crónica. Un incremento de 3-4 veces en la frecuencia de células T CD8 (IFN) interferón-y-positivas Gag-específicas fue también observado por el día 14 después del bloqueo en los dos animales mamu A*01-negativos (RTdll y RDbll) , demostrando que el bloqueo de PD-1 puede mejorar la frecuencia de células T CD8 virus-específicas que son restringidas por alelos sin Mamu A*01. La expansión de células T CD8 SIV-específicas no fue observada en los macacos tratados con anticuerpo testigo.

El bloqueo de PD-1 fue también asociado con un incremento significativo en la frecuencia de células T CD8 virus-específicas que estaban sufriendo división celular activa in vivo con calidad funcional mejorada. Consistente con la expansión rápida de células T CD8 SIV-específicas, la frecuencia de células CD8 tetrámero de Gag-CM9-específicas que co-expresaron Ki67 (marcador para células proliferantes) también se incrementó tan tempranamente como por el día 7 después del bloqueo (P = 0.01). Similarmente, se observó incremento en las frecuencias de células T CD8 tetrámero de Gag-CM9-específicas que co-expresan perforina y granzima B (potencial citolítica; P = 0.001 y P = 0.03, respectivamente), CD28 (potencial de co-estimulación; P = 0.001), CD127 (potencial proliferativo; P = 0.003) y CCR7 (potencial de guía de nodo linfático; 0.001). Un incremento de 1.5 a 2 veces transitorio en la frecuencia de células T de CD8 tetrámero-negativas y Ki67-positivas después del bloqueo fue observado. Esto podría ser debido a la expansión de células T CD8 específicas a otros epítopos en Gag también como otras proteínas de SIV y otras infecciones virales crónicas en estos animales. Ninguna mejora significativa fue observada para estos marcadores en los tres macacos tratados con anticuerpo testigo.

Ninguna expansión fue observada para células T CD8 Tat-TL8-específicas después del bloqueo. Esto podría ser debido al- escape viral del reconocimiento por células T CD8 Tat-TL8-específicas, ya que se sabe que el bloqueo de PD-1 da como resultado expansión de células T solamente cuando reciben simultáneamente señales por medio del receptor de célula T. Para probar esta posibilidad, los genomas virales presentes en el plasma justo antes del inicio del bloqueo de todos los tres macacos Mamu A*01-positivos que fueron infectados con SIV251 y recibieron el anticuerpo de bloqueo durante la fase prematura desinfección fueron secuenciados . Por supuesto, se encontraron mutaciones en el genoma viral correspondientes a la reacción de epítopo de Tat TL8. Todas estas mutaciones han sido mostradas o predichas que reducen el enlace del péptido de Tat SL8/TL8 a la molécula de MHC de Mamu A*01 y dan como resultado el escape de reconocimiento por las células T CD8 Tat-SL8/TL8-específicas . Estos resultados sugieren que el bloqueo in vivo de PD-1 puede no dar como resultado la expansión de células T que son específicas a mutantes de escape de epítopos virales.

El bloqueo de PD-1 también dio como resultado la expansión de células T CD8 Gag-CM9-específicas en el tejido mucosal colorrectal (intestino) , un sitio preferencial para replicación de SIV/VIH. La expansión no fue observada para dos de los siete macacos, aunque la expansión fue evidente para uno de ellos en sangre. En contraste con la sangre, la expansión en intestino se proyectó mucho más tarde por el día 42 y fluctuó de 2 a 3 veces en comparación con sus niveles al día 0 respectivos (P = 0.003), similar a la sangre, las células específicas del tetrámero de Gag-CM9 que co-expresaron Ki67 (P = 0.01), perforina (P = 0.03), granzima B (P = 0.01) y CD28 (P = 0.01) también se incrementó en. el intestino después del bloqueo .

Más importantemente, el bloqueo de PD-1 también mejoró la calidad funcional de células T CD8 anti-virales y dio como resultado la generación de células polifuncionales aptas de co-producir las citoquinas IFN-y, factor a de necrosis de tumor (TNF) e interleucina (IL)-2. En el día de inicio del bloqueo de PD-1 durante la fase crónica tardía de infección, la frecuencia de células IFN-y-positivas Gag-específicas fue baja y fallaron en co-expresar TNF-a e IL-2. Sin embargo, después del bloqueo, la frecuencia de células IFN-y-positivas se incrementó en todos los cuatro macacos tratados con anticuerpo PD-1 (P = 0.03) y adquirieron la habilidad para co-expresar TNF-OÍ e IL-2. La expansión de células IFN-? positivas se proyectó por 14-21 días y los niveles pico fueron 2-10 veces más altos que los niveles- del día 0 respectivos. En el día 21, aproximadamente 16% del total de células Gag-específicas co-expresaron todas las tres citoquinas y aproximadamente 30% coexpresaron IFN-? TNF-o¡ . Esto es en contraste a <1% de las células Gag-específicas totales que co-expresan todas las tres citoquinas (P - 0.01) y aproximadamente 14% que co-expresan IFN-? y TNF-a en el día 0 (P = 0.04). Resultados similares fueron también observados después del bloqueo durante la fase crónica prematura de infección.

Para aprobar el papel de PD-1 en regular la función de célula B durante infecciones de virus de inmunodeficiencia crónica, las respuestas de célula B después del bloqueo de PD-1 en macacos SIV-infectados fueron caracterizadas. El análisis de la expresión de PD-1 en diferentes subconjuntos de célula B antes del bloqueo de PD-1 revelaron la expresión preferencial de PD-1 por células B de memoria (CD20+CD27+CD21~) en comparación con células B naturales (CD20+CD27"CD21+ ; P < 0.001). El bloqueo in vivo de PD-1 dio como resultado un incremento de 2 a 8 veces en el título del anticuerpo de enlace SIV-específico por el día 28 antes del bloqueo (P < 0.001). Para entender esto adicionalmente, se llevaron a cabo experimentos a la proliferación de células B de memoria en macacos SIV-infectados que fueron tratados simultáneamente con anticuerpo anti-PD-1 y terapia anti-retroviral y observaron un incremento significativo en memoria de KÍ67+ (proliferante) pero no células B naturales tan temprano como el día 3. Estos resultados demuestran que la ruta de PD-l-PDL podría tener un papel en regular la disfunción de célula B durante la infección de SIV crónica.

Análisis de neutralización revelaron un incremento de dos veces en títulos contra el SIV251 adaptado en laboratorio fácilmente neutralizable y ningún incremento en títulos contra el SIV251 tipo silvestre difícil de neutralizar o SIV239. En dos de los nueve animales tratados con anticuerpo anti-PD-1, solamente una expansión mínima (< 2 veces) de anticuerpo SIV-específico después del bloqueo. Notablemente, la frecuencia de células B de memoria totales en estos dos animales fue más baja (-40% de las células B totales) en comparación con los siete animales restantes (60-90% de células B totales) antes del bloqueo, indicando que el nivel de células B de memoria SIV-específicas antes del bloqueo puede determinar el nivel de expansión del anticuerpo SlV-específico después del bloqueo.

El bloqueo de PD-1 dio como resultado reducciones significativas en viremia de plasma (P = 0.03) y también prolongó la supervivencia de macacos SW- infectados (P = 0.001) . En dos de los cinco macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 durante la fase crónica prematura, la carga viral declinó por el día 10 y persistió en o debajo de este nivel hasta el día 90. En un macaco la carga viral declinó transitoriamente y en los dos macacos restantes se incrementó transitoriamente y retornó a los niveles de pre-bloqueo. En contraste con la fase crónica prematura, todos los cuatro macacos tratados con el anticuerpo anti-PD-1 durante la fase crónica tardía mostraron un incremento transitorio en viremia por el día 7, pero redujeron rápidamente la carga de virus por el día 21 a niveles que fueron menores que sus niveles del día 0 respectivos. Sin embargo, los niveles de ARN virales regresaron a los niveles de pre-bloqueo por el día 43. Como se esperaba, ninguna reducción significativa en las cargas virales de plasma fue observada en cualquiera de los cinco macacos tratados -con el anticuerpo testigo. A los días 21-28 después del bloqueo, los niveles de ARN virales en los animales tratados con anticuerpo anti-PD-1 fueron 2-10 veces más bajos que sus niveles del día 0 respectivos (P = 0.03). Por el día 150 después del bloqueo, cuatro de los cinco macacos en el grupo de testigo fueron exterminados debido a síntomas SlDA-relacionados (por ejemplo, pérdida de apetito, diarrea, pérdida de peso), mientras que todos los nueve animales en el grupo tratado con anticuerpo anti-PD-1 habían sobrevivido (P = 0.001).

La elevación inicial observada en los niveles de viremia en el plasma en todos los animales tratados de fase tardía y algunos de los animales tratados de fase prematura podría ser debido a un incremento en la frecuencia de células T CD4 activadas. Para determinar esto, el porcentaje de células T CD4 totales Ki67-positivas también como la frecuencia de células T CD4 que producen IFN-y Gag SIV específicas (objetivos preferenciales para replicación de virus) después del bloqueo fueron medidos. Estos análisis revelaron un incremento transitorio en el porcentaje de células T CD4 Ki67-positivas por el día 7-14 después del bloqueo (P = 0.002) y este incremento fue más alto en animales tratados durante la fase tardía que la fase prematura de infección (P = 0.015). Similarmente, un incremento en la frecuencia de células T CD4 Gag-específicas fue también observado pero solamente en animales tratados durante la fase tardía de infección. No se observó ningún incremento significativo para estas células T CD4 activadas en los macacos tratados con anticuerpo testigo. Estos resultados sugieren que las células T CD4 activadas podrían haber contribuido a la elevación inicial observada en niveles de viremia de plasma después del bloqueo .

Antes del inicio del bloqueo de PD-1, la carga viral de punto de ajuste en el plasma y células T CD4 totales en sangre e intestino fueron similares entre los grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1 y tratados con anticuerpo testigo. Sin embargo, las frecuencias de células Gag CM9+ y células Gag CM9+ que co-expresan perforina, granzima B o CD28 no fueron similares entre los dos grupos de tratamiento antes del bloqueo in vivo. Esto hace surgir la posibilidad de que estas diferencias podrían haber contribuido a la expansión de células Gag CM9+ después del bloqueo de PD-1. Para estudiar la influencia de la frecuencia de células CM+ Gag antes del bloqueo en su expansión después del bloqueo, el grupo tratado con anticuerpo anti-PD-1 fue dividido en dos subgrupos en base a la frecuencia de células CM9+ Gag antes del inicio del bloqueo, de tal manera que un grupo tiene niveles similares y el otro grupo tiene niveles más altos de células Gag CM9+ en comparación con el grupo tratado con anticuerpo testigo. Estos subgrupos fueron luego analizados en cuanto a expansión de células Gag CM9+ después del bloqueo. La expansión de células Gag CM9+ fue evidente en ambos subgrupos de animales después del bloqueo de PD-1, sin consideración de si estuvieron a bajos o altos niveles antes del bloqueo. Resultados similares fueron también observados con análisis de subgrupos basados en la frecuencia de células Gag CM9+ que co-expresan moléculas asociadas con la mejor función de célula T tal como perforina, granzima B, CCR7, CD127 o CD28. Sin embargo, se observó una tendencia hacia la expansión mejor de células Gag CM9+CD28+ en animales con niveles más altos de células Gag CM9+CD28+ antes del bloqueo, sugiriendo que la expresión de CD28 puede servir como biomarcador para predecir resultado de bloqueo de PD-1 in vivo .

Los experimentos descritos anteriormente demuestran que el bloqueo de PD-1 utilizando un anticuerpo a PD-1 da como resultado expansión rápida de células T CD8 virus-específicas con calidad funcional mejoradá. Eta inmunidad de células T mejorada fue observada en la sangre y también en el intestino, un depósito mayor de infección de SIV. El bloqueo de PD-1 también dio como resultado proliferación de células B de memoria e incrementos en anticuerpo específicos de envolvente de SIV. Estas respuestas inmune mejoradas fueron asociadas con reducciones significativas en la carga viral de plasma y también prolongó la supervivencia de macacos SIV-infectados . El bloqueo fue efectivo durante las fases prematuras (semana 10) también como tardía (-semana 90) de infección crónica aun bajo condiciones de linfopenia severa. Estos resultados demuestran la mejora tanto de respuestas celulares como respuestas inmune humorales durante una infección de virus de inmunodeficiencia patógena al bloquear una sola ruta inhibidora e identificar un nuevo procedimiento terapéutica para el control de infecciones de virus de inmunodeficiencia humana.

Ejemplo 10: Proliferación mejorada de células T CD8 SIV-específicas en seguida del bloqueo in vitro de la ruta PD-1; PPL mediante un anticuerpo PD-1 humanizado y un anticuerpo PD-Ll humanizado El efecto de un anticuerpo anti-PD-1 humanizado derivado de EH-12.2H7 y un anticuerpo anti-PD-Ll derivado de 29E.2A3 sobre la capacidad proliferativa de células T CD8 SIV Gag-específicas fue probada in vitro. El anticuerpo anti-PD-1 humanizado tiene la secuencia de región variable de cadena pesada de SE ID NO: 28 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32. El anticuerpo anti-PD-Ll humanizado tiene la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42. La región constante de cadena pesada de los anticuerpos humanizados es de IgG4 humana con mutación de Ser 228 a Pro (de CPSCP a CPPCP) de tal manera que el anticuerpo forma d meros y la región constante de cadena ligera es región constante de cadena ligera ? humana. La numeración de aminoácidos para Ser 228 está de acuerdo con el sistema de numeración de EU. Véase Aalberse et al., . Immunology 105:9-19, 2002. PBMC obtenidas de macacos SIV-infectados (entre 3 meses a 1.5 años después de la infección) fueron teñidas con diacetato succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) y estimuladas ya sea con un fondo de péptido de SIV Gag o medio de cultivo por 6 días en presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo. Al final de la estimulación, las células fueron teñidas por CD3 de superficie y CD8 y Ki-67 intracelular . Las células fueron luego adquiridas sobre un dispositivo FACS Calibur y analizadas utilizando los elementos de programación Flowjo. Los linfocitos fueron identificados en base a la dispersión, luego las células T CD8 (CD3+, CD8+) fueron analizadas en cuanto al co-teñido para Ki-67 y CFSE. Las células Ki-67 positivas, de bajo contenido de CFSE fueron identificadas como células proliferantes.

Como se muestra en la Figura 14A, el bloqueo in vitro de la ruta de PD-1: ligando de PD-1 utilizando el Ab anti-PD-1 da como resultado un incremento significativo en proliferación de respuestas de células T CD8 SIV-específicas . El bloqueo in vitro utilizando el Ab anti-PD-Ll da como resultado un incremento moderado en proliferación de respuestas de células T CD8 SIV-específicas (Figura 14B) .

Ejemplo 11; Restauración de proliferación de célula T HCV-específicas por células mononucleares intrahepáticas de un chimpancé infectado persistentemente Linfocitos intrahepáticos CFSE-marcados (2xl06) fueron aislados del chimpancé 1564 que había sido infectado crónicamente con la cepa de genotipo la H77 de HCV por más de 10 años. Los linfocitos intrahepáticos fueron co-cultivados por 6 días con 4xl06 PBMC CD8-agotadas autólogas irradiadas que estuvieron ya sea sin manipular o pulsadas con péptidos traslapantes que abarcan toda la poliproteína de HCV (cepa genotipo la H77) . Las células fueron cultivadas en medio RPMI complementado con L-glutamina y FCS al 10%, con y sin anticuerpo de bloqueo anti-PD-Ll (10 µg/ l, agregado en el día 0 y día 2). El anticuerpo anti-PD-Ll humanizado tiene la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 35, y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 42. La región constante de cadena pesada de los anticuerpos humanos es de IgG4 humana con mutación de Ser 228 a Pro (de CPSCP a CPPCP) de tal manera que el anticuerpo forma dimeros, y la región constante de cadena ligera es región constante de cadena ligera kappa humana. La numeración de aminoácidos para Ser 228 está de acuerdo con el sistema de numeración de EU. Véase Aalberse et al., Immunology 105:9-19, 2002. En el día 6, las células fueron teñidas con CD8-PerCP, tetrámero de A0701/P7 (758) -PE, PD-l-Alexa 647, CD4-Alexa 700, CD14-Alexa 700, CD16-Alexa 700, CD19-Alexa 700, y Live/Dead Blue. Las muestras fueron adquiridas en un citómetro de flujo BD LSR-II y los datos fueron analizados utilizando los elementos de programación FlowJo.

Como se muestra en la Figura 15, el tratamiento con anticuerpo anti-PD-Ll restauró la proliferación de célula T HCV-específica por células mononucleares intrahepáticas de un chimpancé infectado persistentemente.

Incorporación por referencia Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia. En el caso de conflicto, la presente solicitud, incluyendo cualesquier definiciones en la presente prevalecerán.

También incorporadas por referencia en su totalidad están cuelesquier secuencias de polinucleótidos o polipéptidos que hacen referencia a un número de acceso que se correlaciona con una entrada en una base de datos pública, tal como aquella mantenida por el Institute for Genomic Research (TIGR) en el world wide web y/o el National Center for Biotechnology Information (NCBI) en el world wide web.

Equivalentes Aquellos experimentados en el arte reconocerán o serán aptos de indagar utilizando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades especificas de la invención descrita en la presente. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno del mismo, caracterizado porque comprende: a) una secuencia de CDR de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7-9; o b) una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10-12, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antigeno del mismo, se enlaza a una prote na de PD-1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO; 2 y el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto o humano.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 7-9; y/o b) una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 10-12.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-29 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-29; y/o b) una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 30-33 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 30-33.

4. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 27 ó 28 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 27 ó 28; y b) una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 32· ó 33 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 32 ó 33.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno inhibe el enlace del anticuerpo EH12.2H7 a Fc-PD-1.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno inhibe una señal PD-1-moderada .

7. Un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende: a) una secuencia de CDR de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 13-15; o b) una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 16-18, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo se enlaza a una proteína de PD-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto o humano.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 13-15; y/o b) una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 16-18.

9. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 34-38 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 34-38; y/o b) una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39-42 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 39-42.

10. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 ó 37 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 35 ó 37; y b) una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 39, 40 ó 42 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 39, 40 ó 42.

11. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo inhibe el enlace del anticuerpo 29E2A3 a Fc-PD-Ll.

12. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo inhibe una señal PD-Ll-moderada.

13. Un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende: a) una secuencia de CDR de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 19-21; o b) una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 22-24, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo se enlaza a una proteína de PD-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto o humano.

14. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19-21; y/o b) una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 22-24.

15. El anticuerpo aislado . o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: a) una secuencia variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 43-47 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 43-47; y/o b) una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 48-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 48-51.

16. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo aislado comprende: a) una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 44 ó 46 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 44 ó 46; y b) una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49-51.

17. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno inhibe el enlace del anticuerpo 24F.10C12 a FC-PD-L2.

18. El anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno inhibe una señal PD-L2-moderada.

19. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-51.

20. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

21. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 19 ó 20.

22. Una célula huésped caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19 ó 20.

23. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque produce el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno codificado por el ácido nucleico.

24. Un animal transgénico caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19 ó 20.

25. Un ácido nucleico caracterizado porque se hibridiza, bajo condiciones severas, con el complemento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-51 o una secuencia con por lo menos aproximadamente 95% de homología a un ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25-51.

26. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y un portador aceptable farmacéuticamente.

27. Un método para reactivar células T exhaustas, caracterizado porque comprende poner en contacto una población de células T, en donde por lo menos algunas células T expresan PD-1, con una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

28. Un método para reactivar células T exhaustas, caracterizado porque comprende poner en contacto una población de células en donde por lo menos algunas células expresan PD-Ll, con una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-12.

29. Un método para reactivar células T exhaustas, caracterizado porque comprende poner en contacto una población de células en · donde por lo menos algunas de las células expresan PD-L2 , con una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizado porque la etapa de poner en contacto es efectuada in vitro.

31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizado porque la etapa de poner en contacto es efectuada ex vivo.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizado porque la etapa de poner en contacto es efectuada in vivo.

33.' Un método para tratamiento un sujeto que sufre de una infección persistente, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

34. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de una infección viral, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la infección viral es seleccionada del grupo que consiste de citomegalovirus , virus de Epstein-Barr , hepatitis B, virus de hepatitis C, virus herpes, virus de inmunodeficiencia humana, virus linfotrópico T humano, virus de coriomeningitis linfocítica, virus sincitial respiratorio y/o rinovirus .

36. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de una infección bacteriana, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la infección bacteriana es seleccionada del grupo que consiste de Helicobacter, Mycobacteriu , Porphyromonas y Chlamydia.

38. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de una infección helmíntica, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38,. caracterizado porque el helmíntico es seleccionado del grupo que consiste de Schistosoma y Taenia.

40. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de una infección de protozoario, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la infección de protozoario es seleccionado del grupo que consiste de Leishmania mexicana y Plasmodium.

42. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de cáncer, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de un tumor sólido, un cáncer hematológico, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer gástrico, glioma, cáncer de cabeza, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, mieloma, cáncer de cuello, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer salival, cáncer de estómago, cáncer tímico epitelial y cáncer tiroideo.

44. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de un cáncer que sobreexpresa PD-L1, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-12.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo aislado induce citotoxicidad anticuerpo-moderada .

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el anticuerpo es modificado para incrementar la citotoxicidad anticuerpo-inducida.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el anticuerpo es conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste de una toxina y un agente de formación de imagen.

48. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de un cáncer que sobreexpresa PD-L2 , caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el anticuerpo aislado induce citotoxicidad anticuerpo-moderada.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el anticuerpo es modificado para incrementar la citotoxicidad anticuerpo-inducida.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el anticuerpo es conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste de una toxina y un agente de formación de imagen.

52. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de asma, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18.

53. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-18.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es seleccionada del grupo que consiste de encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, artritis, enfermedad de Behcet, penfigoide buloso, enfermedad celiaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, Dermatomiositis , Diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, síndrome de hyper IgE, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis , cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, arteritis temporal, vasculitis y granulomatosis de Wegener.

55. Un método para el tratamiento de un sujeto que sufre de rechazo de trasplante, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-18.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el rechazo de trasplante es seleccionado del grupo que consiste de rechazo de órgano, rechazo 'de trasplante de médula ósea y/o rechazo de trasplante de médula ósea no mieloablativa .

57. Un método para producir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque comprende cultivar una célula que produce el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno y recuperar el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del cultivo celular.