JP2018506526A - クリプティックポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

クリプティックポリペプチドおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、とりわけ、クリプティックポリペプチド、その機能性断片、または上記のうちのいずれかのバリアントを含むポリペプチドを特徴とする。ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドを生成するための方法、ならびにポリペプチドが有用である様々な診断および治療用途も特徴とする。例えば、ポリペプチドは、骨減少に関連した状態を有する被験体を処置するのに使用することができる。本発明は、例えば、（ｉ）配列番号１〜９、１９、もしくは２０のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列；（ｉｉ）１０個以下のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する配列番号１〜９、１９、もしくは２０のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列のバリアント；または（ｉｉｉ）配列番号１〜９、１９、もしくは２０に表されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。【選択図】図１

Description

関連出願
本願は、２０１５年１月２９日に出願された米国仮出願第６２／１０９，３７６号の優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
背景
骨減少は、閉経期後の女性において最も一般に診断されるが、すべての年齢ですべての集団において起こり得る深刻な臨床的問題である。Marx、（２００４年）Science、３０５巻：１４２０〜１４２２頁およびLotinunら、（２０１２年）Curr Mol Pharmacol、５巻：１９５〜２０４頁。疾患、例えば、がん、糖尿病、炎症性腸疾患、およびステロイド処置を必要とする炎症疾患は、骨形成を抑制し、骨折リスクを増大させ得る。骨減少に関連した骨折は、高齢者における入院、身体障害、および早死にの主要原因であり、毎年２００万人超の米国人に影響を与え、５００，０００人の入院に至っており、１８０，０００の個体がこのためにナーシングホームに入っている。Dempster、（２０１１年）Am J Manag Care、１７巻（補遺６）：Ｓ１６４〜Ｓ１６９頁およびDawson-Hughesら、（２０１２年）Osteoporos Int、２３巻：８１１〜８２０頁。骨粗鬆症性骨折に関連した米国医療費は、２００５年でほぼ１７０億ドルであったが、２０年に累積４７４０億ドル超にまで達すると推定されている。BlumeおよびCurtis、（２０１１年）Osteoporo Int、２２巻：１８３５〜１８４４頁。骨折リスクの増大以外に、骨格は、広範囲の生理的機能を果たし、よって骨減少は、グルコースおよびインスリン代謝、臓器および血管修復、ならびに免疫系機能に直接的に影響し得る。Ferronら、（２０１０年）Cell、１４２巻：２９６〜３０８頁；ClemensおよびKarsenty、（２０１１年）J Bone Miner Res、２６巻：６７７〜６８０頁；Capparielloら、（２０１４年）Arch Biochem Biophys、５５８巻：７０〜７８頁；ならびにCharlesおよびNakamura、（２０１４年）Curr Osteoporos Rep、１２巻：１〜８頁。
Marx、（２００４年）Science、３０５巻：１４２０〜１４２２頁 Lotinunら、（２０１２年）Curr Mol Pharmacol、５巻：１９５〜２０４頁 Dempster、（２０１１年）Am J Manag Care、１７巻（補遺６）：Ｓ１６４〜Ｓ１６９頁 Dawson-Hughesら、（２０１２年）Osteoporos Int、２３巻：８１１〜８２０頁 BlumeおよびCurtis、（２０１１年）Osteoporo Int、２２巻：１８３５〜１８４４頁 Ferronら、（２０１０年）Cell、１４２巻：２９６〜３０８頁 ClemensおよびKarsenty、（２０１１年）J Bone Miner Res、２６巻：６７７〜６８０頁 Capparielloら、（２０１４年）Arch Biochem Biophys、５５８巻：７０〜７８頁 CharlesおよびNakamura、（２０１４年）Curr Osteoporos Rep、１２巻：１〜８頁
この問題の規模が大きいため、バイオテクノロジー企業および製薬会社は、骨減少を減速、停止、または逆転する治療剤を探索してきた。残念なことに、１つのクラスの承認された薬剤（agent）のみが骨量を回復させ、すべての承認された薬剤は、重要な制約および副作用を有し、それらは、これらの薬剤の有効性および長期間投与に強い影響を与える。よって、依然として、耐容性良好であり、骨形成を有効に刺激して骨量を回復させる新規治療剤が緊急に必要とされている。
概要
本開示は、クリプティック（Cryptic）タンパク質が、アクチビンＡおよびアクチビンＢに結合し、アクチビンＡおよびＢの、これらの同族細胞受容体（複数可）に結合する能力だけでなく、これらの受容体（複数可）を通じてシグナル伝達する能力も阻害することができるという発見に少なくとも部分的に基づく。アクチビンＡを阻害すると、ｉｎ ｖｉｖｏで骨形成が促進されることが示されており、よってクリプティックならびにクリプティックを含むポリペプチド（またはそのバリアントおよび機能性断片）は、骨形成、骨量、骨密度、骨強度などを増大させるための様々な治療用途において有用である。例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、骨減少に関連した状態、例えば、骨粗鬆症またはパジェット病に罹患している被験体を処置するのに有用である。さらに、本発明者らは、クリプティックは、アクチビンＡに高い親和性で結合する一方、クリプティックは、トランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリータンパク質ＧＤＦ−１１またはミオスタチン（ＧＤＦ−８）により低い親和性で結合することを突き止めた（表１）。ｉｎ ｖｉｖｏでミオスタチンシグナル伝達を阻害すると、筋肉量が増やされることが示されており、一方、ＧＤＦ−１１を阻害すると赤血球生成が促進される。よって、本開示は、いずれの特定の理論または作用機序によっても束縛されないが、本明細書に記載のクリプティックポリペプチドは、骨障害を処置するのに有用であり、他のアクチビンＡ阻害剤、例えば、可溶性アクチビンＲＩＩＡおよびアクチビンＲＩＩＢ分子と比較して、筋成長および／または赤血球生成に対する二次的効果が低減されている（または二次的効果を有さない）。
したがって、一態様では、本開示は、クリプティックタンパク質を含むポリペプチド、その機能性断片、またはそのバリアントを特徴とする。一部の実施形態では、クリプティックタンパク質は、哺乳動物タンパク質である（または機能性断片もしくはバリアントは、哺乳動物クリプティックタンパク質に由来する）。一部の実施形態では、クリプティックタンパク質は、ヒトタンパク質である（または機能性断片もしくはバリアントは、ヒトクリプティックタンパク質に由来する）。別の態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１〜９、１９、もしくは２０のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列；（ｉｉ）４０個以下（例えば、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１個以下）のアミノ酸置換、欠失、挿入、もしくは上記のいずれかの組合せを有する配列番号１〜９、１９、もしくは２０のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列のバリアント；または（ｉｉｉ）配列番号１〜９、１９、もしくは２０に表されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも７０（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９）％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを特徴とする。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７、８、または９に表されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜９、１９、または２０に表されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０に表されたアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１９または２０に表されたアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４〜９のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は、配列番号１または２に表されたアミノ酸配列と少なくとも７０（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、または９９）％同一である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、１×１０−９Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、または１×１０−１２Ｍ未満のＫＤでヒトアクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２００ピコモル濃度〜約１ピコモル濃度の間（例えば、約２００ピコモル濃度から約１００ピコモル濃度の間、約１００ピコモル濃度から約５０ピコモル濃度の間、約５０ピコモル濃度から約１ピコモル濃度の間、約１５０ピコモル濃度から約１ピコモル濃度（1 about picomolar）の間）のＫＤでヒトアクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約５００ピコモル濃度から約５０ピコモル濃度の間のＫＤでヒトアクチビンＡに結合する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ヒトクリプティックがｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトアクチビンＡ依存性細胞シグナル伝達を阻害する能力の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９）％を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ヒトクリプティック（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃとの融合タンパク質の一部としてアッセイされる）より高いヒトアクチビンＡに対する親和性を有し、またはより高い程度にアクチビンＡを阻害する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、１×１０−９Ｍ未満、または５×１０−１０Ｍ未満もしくはそれに等しいＫＤでヒトアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約５００ピコモル濃度〜約１ナノモル濃度の間（例えば、約３００ピコモル濃度〜約１ナノモル濃度、約２００ピコモル濃度〜約７００ピコモル濃度、または約２５０ピコモル濃度〜約８００ピコモル濃度の間）のＫＤでヒトアクチビンＢに結合する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ヒトクリプティックがｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトアクチビンＢ依存性細胞シグナル伝達を阻害する能力の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９）％を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ヒトクリプティック（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃとの融合タンパク質の一部としてアッセイされる）より高いヒトアクチビンＢに対する親和性を有し、またはより高い程度にアクチビンＢを阻害する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、被験体におけるポリペプチドの血清半減期を増大させる異種部分を含む。異種部分は、一部の実施形態では、アルブミンタンパク質のすべてまたは一部を含み得る。一部の実施形態では、異種部分は、免疫グロブリンＦｃ定常領域（例えば、配列番号１７または２１）を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、２、１９、または２０に表されたアミノ酸配列、およびＦｃ定常領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号１７または２１）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４〜９のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列、およびＦｃ定常領域のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、リンカー（例えば、１つまたは複数のアミノ酸）が、異種部分からクリプティック、バリアント、またはその機能性断片を隔てることができる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１８に表されたアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態では、以下に記載するように、リンカーは、ＴＥＶプロテアーゼの切断部位などのプロテアーゼ切断部位を含有し得る。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、リンカー配列を含まない。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１０に表されたアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを骨に向ける（targets the polypeptide to bone）異種部分を含む。ポリペプチドを骨に向ける異種部分は、例えば、式Ｘｎを含むことができ、ここで、Ｘは、生理的ｐＨで負電荷を有するカノニカルまたは非カノニカルアミノ酸であり、ｎは、１〜４０の整数である。Ｘは、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり得る。ｎは、１から３０、例えば、１０から１６、２から２０、１から２０、５から２０、３から２０、５から１５、１０から１５、１０から２０、１０から３０、１０から２５、または１０から３０の間の整数であり得る。一部の実施形態では、ｎは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、ｎは、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０未満である。
一部の実施形態では、異種部分は、検出可能標識である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、モノマーであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの第２のコピーの存在下で、二量体または多量体を形成することができる。例えば、ポリペプチドが、ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したクリプティックポリペプチドのすべてまたは一部を含む融合タンパク質である実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｃ領域によって二量体化することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、二量体化または多量体化ドメイン、例えば、二量体化することができるＦｃ領域または任意の他のポリペプチド（またはその機能部分）を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種または複数種、および薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種を含むプレフィルドシリンジを特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種の医薬単位剤形、１種または複数種のポリペプチドを被験体に投与するための手段、および任意選択で、投与、例えば、自己投与のための指示（instruction）を含むキットを特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。核酸を含むベクター、例えば、発現ベクターも特徴とする。
別の態様では、本開示は、ベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞を特徴とする。宿主細胞は、真核生物（例えば、酵母、昆虫、哺乳動物、もしくは植物）細胞または原核生物細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、げっ歯類細胞（ＣＨＯ細胞）または非ヒト霊長類細胞（ＣＯＳ細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＮＳ０細胞である。
別の態様では、本開示は、ポリペプチドを生成するための方法を特徴とする。本方法は、核酸によってコードされるポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞（上記）を培養して、それによりポリペプチドを生成することを含む。本方法は、宿主細胞または宿主細胞が培養された培地からポリペプチドを単離することをさらに含み得る。このような方法を使用して生成されるポリペプチドも本明細書において特徴とされる。
さらに別の態様では、本開示は、骨減少、適切な骨成長の欠如、骨密度の欠如、骨強度の欠如などに関連した状態の処置において使用するための本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種を特徴とする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、筋成長および／または赤血球生成（erythropoeisis）に対して低減された、または無視できる二次的効果を有する（例えば、骨減少に関連した状態を処置するために治療レベルで使用されるポリペプチドは、筋肉量を感知できるほどに増大させない）。本開示は、被験体（例えば、ヒト）における骨成長、骨強度、または骨密度の増大において使用するための本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種または複数種も特徴とする。
別の態様では、本開示は、被験体（例えば、ヒト）における骨成長、骨強度、または骨密度を増大させるための方法を特徴とする。本方法は、被験体における骨成長、骨強度、または骨密度を増大させるのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種を、それを必要とする被験体に投与することを含む。被験体は、骨減少に関連した状態、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、関節リウマチ、歯周疾患（例えば、歯肉炎または歯周炎）、骨折、骨欠損、転移性骨疾患、変形性関節症、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進症、または溶骨性骨疾患を有し得る。状態はまた、本明細書に記載または当技術分野で公知のもののうちのいずれかであり得る。
本明細書に記載の方法または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与後に、組成物は、骨パラメータ、例えば、骨量密度（bone volume density）、全骨面（total bone surface）、骨面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離（trabecular spacing）、および全骨量（total volume）からなる群から選択されるものなどを改善する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および使用のうちのいずれかは、いくつかの骨パラメータ、例えば、骨量密度、全骨面、骨面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、または全骨量のうちのいずれか１つにおける改善について被験体を監視することをさらに含むことができる。
骨障害の処置の一部の実施形態では、骨に向かう（例えば、骨標的部分（bone-targeting moiety）を有する）ポリペプチドが被験体に投与される。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、被験体に静脈内投与される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、被験体に皮下投与される。
本明細書に記載の方法または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、被験体は、骨減少に関連した状態の別の処置に失敗した被験体である。処置は、ビスホスホネートまたは別のアクチビンＡ阻害剤（例えば、アクチビンＲＩＩＡ−ＩｇＧ Ｆｃ融合物またはアクチビンＲＩＩＢ−ＩｇＧ Ｆｃ融合物）であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法または使用のうちのいずれかは、骨成長を促進し、または骨吸収を阻害する少なくとも１種の追加の治療剤を被験体に投与することも含み得る。
さらに別の態様では、本開示は、筋肉量または筋力を増大させることを必要とする被験体における筋肉量または筋力を増大させるための方法であって、被験体における筋肉量または筋力を増大させるのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。一部の実施形態では、被験体は、筋障害（例えば、筋肉消耗障害）を有する被験体である。
さらに別の態様では、本開示は、筋肉消耗障害または筋萎縮を有する被験体を処置するための方法を特徴とする。本方法は、筋肉消耗障害または筋萎縮を処置するのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を被験体に投与することを含む。
一部の実施形態では、筋肉消耗状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、複数の型の肢帯型ＭＤ（ＬＧＭＤ）、他の先天型ＭＤ（ＣＭＤ）、筋肉減少症、がん悪液質、または糖尿病であり、またはそれに関連する。
別の態様では、本開示は、被験体における筋骨格障害を処置するための方法を特徴とする。本方法は、筋骨格障害を処置するのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を被験体に投与することを含む。一部の実施形態では、筋骨格障害は、例えば、悪性腫瘍、内分泌障害、関節炎、不動性、または廃用性に起因する骨粗鬆症、オステオペニア、筋肉減少症、関節炎、組織萎縮、歯周疾患、創傷治癒、または骨減少である。
さらに別の態様では、本開示は、代謝的状態を処置するための方法であって、代謝異常を処置するのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を被験体に投与することを含む方法を特徴とする。代謝障害は、例えば、２型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、および肥満であり得る。
別の態様では、本開示は、免疫障害（例えば、炎症疾患または自己免疫障害）を有する被験体を処置するための方法を特徴とする。本方法は、免疫障害を処置するのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を被験体に投与することを含む。一部の実施形態では、免疫障害は、異常な宿主防御応答に関連した免疫障害である。一部の実施形態では、免疫障害は、例えば、（ａ）感染、毒性物質または外傷、手術に応じた創傷治癒、重度のやけど（bum）、または他の組織傷害、髄膜炎、虫垂炎、腎尿細管壊死、外傷性脳傷害、および敗血症によって負わされた組織の急性傷害；（ｂ）それだけに限らないが、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、血管炎、抗リン脂質症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosous）、および変形性関節症を含めた自己免疫疾患；ならびに（ｃ）それだけに限らないが、肺炎、サルコイドーシス、閉塞性細気管支炎、肺高血圧症、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、それだけに限らないが、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１、コロナウイルスＳＡＲＳ、ならびにヒトライノウイルスＣおよびＤを含めた病原性ウイルスなどの感染因子に対する急性応答を含めた呼吸器疾患であり得る。
さらに別の態様では、本開示は、がんを有する被験体を処置するための方法を特徴とする。本方法は、がんを処置するのに十分な量で本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を被験体に投与することを含む。一部の実施形態では、がんは、アクチビンＡまたはアクチビンＢの１種または複数種の受容体を発現するがん細胞を含む。一部の実施形態では、がん細胞の増殖および／または生存能は、アクチビンＡまたはアクチビンＢによって正に調節される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、がんのがん細胞が受容体の１種もしくは複数種を発現し、またはアクチビンＡもしくはアクチビンＢに応答性であるかどうかを決定する試験の結果をリクエストすることを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、がんのがん細胞が受容体の１種もしくは複数種を発現し、またはアクチビンＡもしくはアクチビンＢに応答性であるかどうかを決定する試験を実施することを含み得る。
一部の実施形態では、がんは、肺がん、乳がん、結腸がん、膵がん、腎がん、胃がん、肝がん、骨がん、血液がん、神経組織がん、黒色腫、甲状腺がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膣がん、または膀胱がんである。
さらに別の態様では、本開示は、筋萎縮、筋肉消耗状態、代謝障害（本明細書に記載のもののうちのいずれかなど）、免疫障害、または筋骨格障害に苦しんでいる被験体（例えば、ヒト）の処置において使用するための本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種を特徴とする。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を意味する。
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。好適な方法および材料が以下に記載されているが、本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料も、現在開示されている方法および組成物の実践または試験において使用することができる。本明細書で述べるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
本開示の他の特徴および利点、例えば、骨減少に関連した状態を処置するための方法は、以下の記載、実施例から、かつ特許請求の範囲から明らかとなる。
配列の簡潔な説明
配列番号１は、ヒトクリプティックの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号２は、ヒトクリプティックの、そのシグナルペプチドの配列を伴わない例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号３は、ヒトクリプティックの、そのシグナルペプチドの配列またはＣ末端ＧＰＩアンカー配列を伴わない例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号４は、ヒトクリプティックの低相同性ドメインの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号５は、ヒトクリプティックの上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメインの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号６は、ヒトクリプティックのクリプト（Cripto）−ＦＲＬ−１−クリプティック（ＣＦＣ）ドメインの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号７は、ヒトクリプティックポリペプチドの断片の例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号８は、ＥＧＦおよびＣＦＣドメインを含有するヒトクリプティックの断片の例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号９は、ヒトクリプティックポリペプチドの断片の例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１０は、本明細書に記載の例示的な融合ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号１１は、Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅにおいて発現されるクリプティックポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１２は、マウスにおいて発現されるクリプティックポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１３は、ヒトインヒビンベータＡ鎖の例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１４は、ＦＬＡＧエピトープタグの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１５は、ポリヒスチジンエピトープタグの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１６は、インフルエンザ赤血球凝集素エピトープタグの例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１７は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ定常領域の例示的なアミノ酸配列を表す。
配列番号１８は、例示的なリンカーペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号１９および２０は、ヒトクリプティックの例示的な断片のアミノ酸配列を表す。
配列番号２１は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号２２は、例示的なクリプティック−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を表す。
図１は、構築物設計および融合タンパク質精製を表す３つのパネル：パネル（Ａ）、パネル（Ｂ）、およびパネル（Ｃ）からなる。パネルＡでは、ヒトおよびマウスクリプティックおよびクリプト−１の多重配列アラインメントが示されている。両分子は、分泌のためのシグナルペプチド（アラインメント中に示されていない）、低相同性ドメイン（青緑色）、ＥＧＦ様ドメイン（橙色）、ＣＦＣ−ドメイン（灰色）、およびＧＰＩシグナルペプチド（紫色ボックスによって表されている）を有する。クリプト−１ ＧＰＩシグナルペプチドは、Ｓｅｒ１６９（黄色ボックス中の残基）の後で切断される。霊長類起源のクリプティックは、大きい非カノニカルなＧＰＩシグナルペプチドを有し、そのＧＰＩ修飾アミノ酸は公知でない。発現構築物に関して、クリプト−１、およびクリプティックを「ＦＣ融合部位」（薄青色）でトランケートした。パネルＢは、クリプティックおよびクリプト−１構築物のドメイン構成を表し、これらは、Ａと同様に着色されている。両分子を、「ＦＣ融合部位」で２２アミノ酸リンカーを介してヒトＩｇｇ１−Ｆｃに融合させた。図１のパネルＣは、ＣＨＯ細胞内で発現されたクリプティック−Ｆｃおよびクリプト−１−Ｆｃに関するものであった。両分子は、サイズ排除クロマトグラフィーカラム中で単一の明確なピークとして移動する。各タンパク質の分子量は、二量体種に対応する。非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、それぞれ、ジスルフィド連結二量体種および還元された単量体種を示す。二量体化は、Ｆｃ領域内のシステインを介して起こる。
図２は、リガンド結合実験の結果を表し、パネルＡ〜Ｆからなる：（Ａ）アクチビンＡのクリプティックへの結合；（Ｂ）アクチビンＢのクリプティックへの結合；（Ｃ）ＧＤＦ−８のクリプティックへの結合；および（Ｄ）ＧＤＦ−１１のクリプティックへの結合。（Ａ〜Ｄ）クリプティック−Ｆｃをセンサーチップに固定し、示した様々な濃度のリガンドを注射した。速度論的分析の曲線フィットを橙色線として示す。パネルＥは、クリプティックへのリガンド結合の重ね合わせを表す。パネルＦは、クリプト−１へのリガンド結合の重ね合わせを表す。（Ｅ〜Ｆ）クリプティック−Ｆｃおよびクリプト−１−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、示したすべてのリガンドを８０ｎＭの濃度で注射した。試験したリガンドは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ノーダル（Nodal）、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＴＧＦβ−１、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３を含んでいた。商業購入したノーダル、ＧＤＦ−１１、およびＧＤＦ−３は、Ｅ．ｃｏｌｉからの再フォールディングによって生成されており、十分に機能的でない場合がある。例えば、ノーダルは、有意なロットばらつきを示す。
図３は、受容体相互作用実験の結果を表し、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤからなる。パネルＡは、クリプティックのＴＧＦ−βファミリー受容体への結合を表す。Ｉ型受容体ＡＬＫ４−ＦｃおよびＡＬＫ５−Ｆｃ、ならびにＩＩ型受容体ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃ、ＡＣＴＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ、およびＴＧＦ−βＲＩＩ−Ｆｃをセンサーチップに捕捉した。Ｆｃなしのクリプティックを２０μＭの濃度で注射した。パネルＢは、アクチビンＡのＡＬＫ４への結合を表す。ＡＬＫ４−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、示した異なる濃度のアクチビンＡを注射した。速度論的分析の曲線フィットを橙色線として示す。パネルＣは、アクチビンＡ／クリプティック複合体のＡＬＫ４への結合を表す。ＡＬＫ４−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、Ｆｃなしのクリプティック（０〜４０ｎＭ）とともにプレインキュベートした１０ｎＭアクチビンＡを注射した。クリプティックに結合しているときの応答単位の増大は、より高い分子量のアクチビンＡ−クリプティック複合体によって引き起こされる。飽和は、アクチビンＡの濃度にのみ依存する。パネルＤは、アクチビンＡ／クリプティック複合体のＡＬＫ４への結合を表す。ＡＬＫ４−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、一定量のＦｃなしのクリプティック（４００ｎＭ）とともにプレインキュベートした、示した異なる濃度のアクチビンＡを注射した。
図４は、競合的阻害研究の結果を表し、パネルＡ〜Ｈからなる。パネルＡは、クリプティックによるＡＣＴＲＩＩＡへのアクチビンＡ結合の阻害を表す。パネルＢは、クリプティックによるＡＣＴＲＩＩＢへのアクチビンＡ結合の阻害を表す。（Ａ〜Ｂ）ＡＣＴＲＩＩＡ−ＦｃまたはＡＣＴＲＩＩＢ−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、０ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、または４０ｎＭ Ｆｃなしのクリプティックとともにプレインキュベートした１ｎＭアクチビンＡを注射した。パネルＣは、クリプティックによるＡＣＴＲＩＩＡへのアクチビンＢ結合の阻害を表す。パネルＤは、クリプティックによるＡＣＴＲＩＩＢへのアクチビンＢ結合の阻害を表す。パネルＥは、ＡＣＴＲＩＩＡへのＧＤＦ−８結合のクリプティックによる阻害を表す。パネルＦは、クリプティックによるＡＣＴＲＩＩＢへのＧＤＦ−８結合の阻害を表す。（Ｃ〜Ｆ）ＡＣＴＲＩＩＡ−ＦｃまたはＡＣＴＲＩＩＢ−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、０ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ、または１６００ｎＭ Ｆｃなしのクリプティックとともにプレインキュベートした１０ｎＭのアクチビンＢまたはＧＤＦ−８を注射した。パネルＧは、ＢＭＰＲＩＩへのアクチビンＢ結合のクリプティックによる阻害を表す。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、０ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または４００ｎＭ Ｆｃなしのクリプティックとともにプレインキュベートした１０ｎＭアクチビンＢを注射した。小さい挿入図は、重ね合わせた曲線フィットを伴ったＢＭＰＲＩＩへのアクチビンＢ結合のセンソグラムを示す。パネルＨは、クリプティックへのアクチビンＡ結合のＡＣＴＲＩＩＡによる阻害を表す。クリプティック−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、０ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または４００ｎＭ Ｆｃなしのクリプティックとともにプレインキュベートした１０ｎＭアクチビンＡを注射した。
図５は、アクチビンシグナル伝達のクリプティック媒介調節に関したｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の結果を表し、パネルＡ〜Ｆからなる。パネルＡは、アクチビンＡ媒介遺伝子発現のクリプティック−Ｆｃの抑制を表す。１０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡは、Ｓｍａｄ−２／３−応答性レポーターの発現を誘導する。ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃおよびクリプティック−Ｆｃは、濃度依存様式で（ｎｇ／ｍｌで示した）アクチビンＡ依存ルシフェラーゼシグナルを同等に阻害する。パネルＢは、Ｓｍａｄ２リン酸化の検出を表すウエスタンブロットである。アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、Ｓｍａｄ２リン酸化を誘導する。ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃおよびクリプティック−Ｆｃは、濃度依存様式で（１：１０、２：５００、３：１０，０００ｎｇ／ｍｌ）同等にアクチビンＡ媒介Ｓｍａｄ−２リン酸化を防止する。パネルＣは、アクチビンＢ媒介遺伝子発現のクリプティック−Ｆｃ抑制を表す。１０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡは、Ｓｍａｄ−２／３−応答性レポーターの発現を誘導する。ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃおよびクリプティック−Ｆｃは、濃度依存様式で（ｎｇ／ｍｌで示した）アクチビンＢ依存ルシフェラーゼシグナルを同等に阻害する。パネルＤは、Ｓｍａｄ２リン酸化の検出を表すウエスタンブロットである。アクチビンＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、Ｓｍａｄ２リン酸化を誘導する。ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃおよびクリプティック−Ｆｃは、濃度依存様式で（１：１０、２：５００、３：１０，０００ｎｇ／ｍｌ）同等にアクチビンＢ媒介Ｓｍａｄ−２リン酸化を防止する。パネルＥは、骨芽細胞石灰化のアクチビンＡ阻害に対するクリプティックの効果を表す。ＨＯＳ細胞を、アクチビンＡおよびクリプティック−Ｆｃとともに、およびこれらを伴わないで骨形成培地の存在下で培養した。石灰化は、アリザリンレッドＳ染色によって可視化した。パネルＦは、石灰化の定量を表す。値は、対照ウェルにおける石灰化の％として表わす。
図６は、パネルＡ〜Ｄにおける分子モデルを表す。パネルＡは、ＢＭＰ−９−ＡＬＫ１−ＡＣＴＲＩＩＢ構造に基づくリガンド−受容体相互作用のモデルである。ジスルフィド連結ホモ二量体リガンド（中央、橙色）は、Ｉ型アクチビン受容体様キナーゼ（薄青色）ならびにＩＩ型アクチビンおよびＢＭＰ受容体（濃青色）の細胞外ドメインに結合する。パネルＢは、クリプト−１／クリプティックリガンド相互作用のモデルである。クリプト−１およびクリプティックは、ＩＩ型アクチビンおよびＢＭＰ受容体相互作用の競合性阻害剤であり、リガンド上のクリプト−１およびクリプティックの結合部位は、ＡＣＴＲＩＩＡ、ＡＣＴＲＩＩＢ、およびＢＭＰＲＩＩの結合部位と同じであることを示す。パネルＣは、ＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達の表面モデルである。Ｉ型およびＩＩ型受容体の両方にリガンドが同時に結合すると、リン酸化カスケードが開始され、このカスケードは、リン酸化Ｒ−ＳＭＡＤ（薄緑色）転写因子の核への転移および標的遺伝子の発現をもたらす。パネルＤは、クリプト−１／クリプティック機能の細胞表面モデルである。クリプト−１およびクリプティックは、ＩＩ型受容体のリガンドへの結合を防止し、カノニカルＴＧＦ−βファミリーシグナル伝達カスケードを遮断する。
図７は、骨リモデリングにおけるアクチビンＡのクリプティック−Ｆｃ（Ｉｇ Ｆｃ領域に融合したクリプティックポリペプチド）阻害のモデルを表す。アクチビンＡは、ＩＩ型アクチビン受容体（ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ）に結合することによってシグナル伝達する。クリプティック−Ｆｃは、アクチビンＡのＩＩ型アクチビン受容体への結合を防止し、よってアクチビンＡシグナル伝達を阻害し、アクチビンＡの骨阻害効果（osteoinhibitory effect）を解除し、他のＴＧＦβファミリーシグナル伝達分子による骨誘導を可能にする。
図８は、それぞれ、クリプティックタンパク質のすべてまたは一部を含み、クリプティックのドメイン構成を強調した一連の融合タンパク質構築物を表す。クリプティックは、分泌のためのシグナルペプチド（ＳＰ）、低相同性ドメイン（ＬＨ−Ｄ）、ＥＧＦドメイン（ＥＧＦ）、カノニカルＣＦＣドメイン（ＣＦＣ）、およびカルボキシ末端ＧＰＩシグナルからなる。クリプティック−Ｆｃに関しては、ＧＰＩシグナルペプチドを欠くクリプティックの細胞外ドメインが、２２アミノ酸リンカーを介してヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分に融合している。
詳細な説明
本開示は、とりわけ、診断法および治療法などの様々な用途におけるポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドの生成、およびポリペプチドの使用に関する。例えば、ポリペプチドは、骨減少に関連した状態、がん、代謝障害（例えば、不十分なインスリン産生に関連した障害）、免疫障害、筋肉消耗状態、または筋骨格障害を有する被験体を処置するのに有用である。限定的であるように決して意図していないが、例示的なポリペプチド、ポリペプチドを含有する組成物（例えば、医薬組成物および製剤）、ならびに上記のいずれかを作製および使用するための方法を、以下に詳しく述べる。
ポリペプチド
本明細書に記載のポリペプチドは、クリプティックポリペプチド（例えば、脊椎動物クリプティックポリペプチド）、その機能性断片、またはポリペプチドもしくは断片のバリアントを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ヒトクリプティックポリペプチドのすべてまたは一部、例えば、アミノ酸配列：
を含むものを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、任意の脊椎動物、例えば、爬虫類、トリ、または哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類（例えば、Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅまたはＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）などの非ヒト哺乳動物）由来のクリプティックポリペプチドのすべてまたは一部を含む。当業者は、このような配列は、当技術分野で公知であり、または日常の実験を使用して容易に入手可能であることを十分に理解するはずである（例えば、Sambrookら（以下）を参照）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列：
を有するＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ由来のクリプティックポリペプチドのすべてまたは一部を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、げっ歯類クリプティックポリペプチドのすべてまたは一部を含む。例えば、ポリペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列：
を有するネズミのクリプティックポリペプチドのすべてまたは一部を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
を含み、これは、アミノ末端リーダー配列を欠くヒトクリプティックポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
を含み、これは、アミノ末端リーダー配列またはカルボキシ末端プロペプチドドメインを含まないヒトクリプティックポリペプチドのアミノ酸配列に対応する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
を含み、これは、ヒトクリプティックポリペプチドの低相同性ドメインに対応する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、クリプティックポリペプチドのＥＧＦドメイン、例えば、ヒトクリプティックポリペプチドのＥＧＦドメインに対応する以下のアミノ酸配列
を含む、例えば、ヒトクリプティックポリペプチドのＥＧＦドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、クリプティックポリペプチドのクリプト−ＦＲＬ−１−クリプティック（ＣＦＣ）ドメイン、例えば、以下のアミノ酸配列：
を含む、例えば、ヒトクリプティックポリペプチドのＣＦＣドメインを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
のうちの１つまたは複数を含む。クリプティックの例示的な断片の略図を図８に示す。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、以下の配列：
のうちの一方または両方を含む。
本明細書では、バリアントクリプティックポリペプチド、またはバリアントクリプティックポリペプチドの断片を含むポリペプチドも特徴とする。このようなバリアントは、これらが由来した野生型クリプティックポリペプチドに対して、１個または複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、それが由来した野生型クリプティックポリペプチド（例えば、配列番号２または３に表されたアミノ酸配列を含む野生型ヒトクリプティックポリペプチド）に対して、少なくとも２個の（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または１００個超の）アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、それが由来した野生型クリプティックポリペプチド（例えば、配列番号２または３に表されたアミノ酸配列を含む野生型ヒトクリプティックポリペプチド）に対して、２０個以下の（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下の）アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。置換は、保存的、非保存的、または両方の混合であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」は、所与のポリペプチドにおける天然配列中に存在するアミノ酸の、同様の立体的性質を有する天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸での置き換えを指す。置き換えられる天然アミノ酸の側鎖が極性または疎水性である場合、保存的置換は、やはり極性または疎水性であり、任意選択で、置き換えられるアミノ酸の側鎖と同じまたは同様の立体的性質をもつ天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸で置き換えられるべきである。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニン；リシン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。一文字のアミノ酸の略語は、以下の通りである：アラニン（Ａ）；アルギニン（Ｒ）；アスパラギン（Ｎ）；アスパラギン酸（Ｄ）；システイン（Ｃ）；グリシン（Ｇ）；グルタミン（Ｑ）；グルタミン酸（Ｅ）；ヒスチジン（Ｈ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；リシン（Ｋ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｆ）；プロリン（Ｐ）；セリン（Ｓ）；トレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）；およびバリン（Ｖ）。
語句「非保存的置換」は、本明細書で使用される場合、親配列中に存在するアミノ酸の、異なる電気化学的および／または立体的性質を有する別の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸による置き換えを指す。よって、置換しているアミノ酸の側鎖は、置換されている天然アミノ酸の側鎖より有意に大きい（または小さい）場合があり、かつ／または置換されているアミノ酸と有意に異なる電子的性質をもつ官能基を有してよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、バリアントクリプティックポリペプチドであって、それが由来した野生型クリプティックポリペプチドと少なくとも７０（例えば、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９）％同一であるアミノ酸配列を有する、バリアントクリプティックポリペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のバリアントポリペプチド、またはその断片は、配列番号１〜１２に表されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０（例えば、少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９）％同一であるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
のうちのいずれか１つ（またはそれ超）を含む、アミノ酸配列を含み、ポリペプチドのアミノ酸配列は、他の点では、配列番号１または２に表されたアミノ酸配列と少なくとも７０（例えば、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９）％同一である。
パーセント（％）アミノ酸配列同一性は、最大パーセント配列同一性を実現するために配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後の参照配列中のアミノ酸と同一である候補配列中のアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェアまたはＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して実現することができる。比較されている配列の全長にわたる最大アラインメントを実現するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法によって決定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、クリプティックポリペプチドの機能性断片またはバリアントクリプティックポリペプチドを含む。このような機能性断片およびバリアントポリペプチドは、バリアントまたは断片が由来した対応する成熟クリプティックポリペプチドの活性の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）％を保持する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のバリアントまたは機能性断片は、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢに関して、バリアントまたは機能性断片が由来した成熟野生型クリプティックポリペプチドの親和性の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）％を保持する。
本明細書に記載のポリペプチドは、アクチビンＡ（例えば、ヒトアクチビンＡ）に特異的に結合することができる。用語「特異的結合」、「特異的に結合する」、および同様の文法的な用語は、本明細書で使用される場合、生理学的条件下で相対的に安定である複合体を形成する２つの分子を指す。典型的には、結合は、会合定数（ｋａ）が１０６Ｍ−１ｓ−１より高い場合、特異的であるとみなされる。よって、本明細書に記載のポリペプチドは、少なくとも１０６（またはそれ超）（例えば、少なくとも１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、もしくは１０１５、またはそれより高い、あるいはそれ超）Ｍ−１ｓ−１のｋａでアクチビンＡに特異的に結合することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１０−３ｓ−１未満、またはそれに等しい解離定数（ｋｄ）（例えば、８×１０−４、５×１０−４、２×１０−４、１０−４、または１０−５）ｓ−１を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２Ｍ、または１０−１３Ｍ未満のＫＤでアクチビンＡ（例えば、ヒトアクチビンＡ）に結合する。平衡定数ＫＤは、運動速度定数の比ｋｄ／ｋａである。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１×１０−９Ｍ未満のＫＤでアクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１００ピコモル濃度未満、５０ピコモル濃度未満、２５ピコモル濃度未満、１０ピコモル濃度未満、または５ピコモル濃度未満のＫＤでアクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約１ピコモル濃度から約１００ピコモル濃度、例えば、約１〜約５ピコモル濃度、約１〜約１０ピコモル濃度、約１〜約２０ピコモル濃度、または約１〜約５０ピコモル濃度の間であるＫＤでアクチビンＡに結合する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１０−８、１０−９、または５×１０−１０Ｍ未満のＫＤでアクチビンＢ（例えば、ヒトアクチビンＢ）に結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１×１０−９Ｍ未満のＫＤでアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、５００ピコモル濃度未満のＫＤでアクチビンＢに結合する。
ポリペプチドが標的抗原に結合するかどうかおよび／または標的抗原に対するポリペプチドの親和性を決定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、１つのポリペプチドの標的ポリペプチドへの結合は、それだけに限らないが、ウエスタンブロット、ドットブロット、プラズモン表面共鳴法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの様々な技法を使用して検出および／または定量することができる。作用物質（agent）とアクチビンＡとの相互作用を評価するための例示的な方法は、例えば、Liら、（２０１０年）J Biol Chem、２８５巻（４７号）：３６６４５〜３６６５５頁；Harringtonら、（２００６年）EMBO J、２５巻：１０３５〜１０４５頁；およびFischerら、（２００３年）J Endocrinol、１７６巻：６１〜６８頁に記載されており、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
いくつかの種（ヒトを含む）由来の成熟アクチビンＡのアミノ酸配列が、当技術分野で周知である。ヒトアクチビンＡは、例えば、２つの１３ｋＤａインヒビンβＡサブユニットのホモ二量体であり、これは、アミノ末端プロペプチドがサブユニットのそれぞれから切断されるまで活性でない。ヒトインヒビンベータＡ鎖の例示的なアミノ酸配列は、以下の通りである：
シグナルペプチドに対応するアミノ酸は、太字にされており、プロペプチドに対応するアミノ酸に下線を引いてある。
アクチビンＡは、当技術分野において記載されており、アクチビンＡタンパク質は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおいて使用することができ、いくつかの供給元、例えば、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から市販されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のバリアントまたは機能性断片は、バリアントもしくは機能性断片が由来した成熟野生型クリプティックポリペプチドの、アクチビンＡのその同族細胞表面受容体（複数可）への結合を阻害する能力および／またはアクチビンＡの同族細胞表面受容体のうちの少なくとも１つを通じて細胞内シグナル伝達を誘導するアクチビンＡの能力の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）％を保持する。アクチビンＡシグナル伝達（またはその阻害）を評価するための細胞に基づく方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Harringtonら、上記、Schmiererら、（２００３年）J Biol Chem、２７８巻：２１１９７〜２１２０３頁；Chantryら、（２０１０年）J Bone Mineral Res、２５巻（１２号）：２６３３〜２６４６頁；および米国特許出願公開第２０１２０１４１４６９号に記載されている。例えば、培養された骨芽細胞を、クリプティックポリペプチドまたはそのバリアントもしくは機能性断片の存在または非存在下でアクチビンＡと接触させることができる。骨芽細胞石灰化の程度を測定することができる。さらに、破骨細胞の数または活性に対するアクチビンＡの試験阻害剤（例えば、本明細書に記載のクリプティックのバリアントまたは機能性断片）の効果も、例えば、Chantryら（上記）に記載されているように測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のバリアントまたは機能性断片は、バリアントもしくは機能性断片が由来した成熟野生型クリプティックポリペプチドの、アクチビンＢのその同族細胞表面受容体（複数可）への結合を阻害する能力および／またはアクチビンＢの同族細胞表面受容体のうちの少なくとも１つを通じて細胞内シグナル伝達を誘導するアクチビンＢの能力の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）％を保持する。アクチビンＢシグナル伝達（またはその阻害）を評価するための細胞に基づく方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Tsuchidaら、（２００４年）Mol Cell Endocrinol、２２０巻（１〜２号）：５９〜６５頁；Wackerら、（２０１４年）PLoS One、９巻（１０号）：ｅ１１１２７６頁；Frandsenら、（２００７年）Biochem Biophys Res Commun、３６２巻（３号）：５６８〜５７４頁；および米国特許第５，０７１，８３４号に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「阻害すること」およびその文法的な同義語は、特定の作用、機能、または相互作用を低下させること、制限すること、および／または遮断することを指す。一実施形態では、本用語は、所与の出力またはパラメータのレベルを、対応する対照における量の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ未満である量に低減することを指す。所与の出力またはパラメータのレベルの低減は、出力またはパラメータの絶対的な非存在を意味する必要はないが、それを意味する場合がある。本発明は、出力またはパラメータを完全に排除する方法を要求せず、その方法に限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載のバリアントまたは機能性断片は、バリアントまたは機能性断片が由来した成熟野生型クリプティックポリペプチドの、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのその同族細胞受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢ）との相互作用を阻害する親和性の少なくとも５（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）％を保持する。
本明細書で使用される場合、用語「相互作用」は、２つの分子間の相互作用に言及するとき、互いの分子の物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、このような相互作用は、前記分子の一方または両方の活性（これは、生物学的効果を生じさせる）をもたらす。このような相互作用を阻害すると、相互作用に関与する１種または複数種の分子の活性が混乱する。阻害は、完全であり得るが、その必要はない。
機能的に活性なバリアントまたは断片は、組換えで生成されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる（以下を参照）。さらに、断片は、当技術分野で周知の技法、例えば、固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学反応を使用して化学合成することができる。断片を生成し（組換えでまたは化学合成によって）、試験してアクチビンＡタンパク質もしくはアクチビンＡによって媒介されるシグナル伝達（および／またはアクチビンＢタンパク質もしくはアクチビンＢによって媒介されるシグナル伝達）のアンタゴニスト（阻害剤）として機能し得るペプチジル断片を同定することができる。ポリペプチドの機能的に活性なバリアントはまた、クリプティックポリペプチドをコードする対応する変異誘発させた核酸から組換えで生成された修飾ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。バリアントを生成および試験して、アクチビンＡタンパク質（もしくはアクチビンＢ）またはアクチビンＡ（もしくはアクチビンＢ）によって媒介されるシグナル伝達のアンタゴニスト（阻害剤）として機能し得るものを同定することができる。
コンビナトリアルライブラリーを、それぞれがクリプティックポリペプチド配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列中に酵素的にライゲーションすることができ、その結果、潜在的なクリプティックポリペプチドヌクレオチド配列の縮重したセットは、個々のポリペプチドとして、または代わりに一連のより大きい融合タンパク質として（例えば、ファージディスプレイのため）発現可能である。
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーで実行することができ、次いで合成遺伝子を発現のために適切なベクター中にライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である（例えば、Narang、（１９８３年）Tetrahedron、３９巻：３頁；Itakuraら、（１９８４年）Annu Rev Biochem、５３巻：３２３頁；Itakuraら、（１９８４年）Science、１９８巻：１０５６頁；およびIkeら、（１９８３年）Nucleic Acid Res、１１巻：４７７頁を参照）。このような技法は、他のタンパク質の指向進化において使用されている（例えば、Scottら、（１９９０年）Science、２４９巻：３８６〜３９０頁；Robertsら、（１９９２年）Proc Natl Acad Sci USA、８９巻：２４２９〜２４３３頁；Devlinら、（１９９０年）Science、２４９巻：４０４〜４０６頁；Cwirlaら、（１９９０年）Proc Natl Acad Sci USA、８７巻：６３７８〜６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，１９８，３４６号；および同第５，０９６，８１５号を参照）。
点変異およびトランケーションによって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、ならびにその事に関して、ある特定の性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範囲の技法が当技術分野で公知である。このような技法は一般に、クリプティックポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって作製される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応できる。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技法は、典型的には、複製可能な発現ベクター中への遺伝子ライブラリーのクローニング、ベクターの得られるライブラリーを用いた適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出が、生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの相対的に容易な単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。好適なアッセイとしては、アクチビン結合アッセイおよびアクチビン媒介細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、異種部分にコンジュゲートすることができる。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤（例えば、毒素または薬物）、あるいは検出可能標識、例えば、それだけに限らないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどの親和性タグであり得る。適当な異種ポリペプチドとしては、例えば、抗体または断片を精製するのに使用するための抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４））、ポリヒスチジン（６−Ｈｉｓ；ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）、赤血球凝集素（ＨＡ；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１６））、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））が挙げられる。異種ポリペプチドには、診断マーカーまたは検出可能マーカーとして有用であるポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も含まれる。適当な放射性標識としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが挙げられる。適当な蛍光標識としては、限定することなく、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、およびＣｙ７が挙げられる。発光標識には、例えば、様々な発光ランタニド（例えば、ユウロピウムまたはテルビウム）キレートのいずれかが含まれる。例えば、適当なユウロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）のユウロピウムキレートが挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、および西洋わさびペルオキシダーゼが挙げられる。
２つのタンパク質を、いくつかの公知の化学架橋剤のうちのいずれかを使用して架橋することができる。このような架橋剤の例は、「ヒンダード（hindered）」ジスルフィド結合を含む連結を介して２つのアミノ酸残基を連結する架橋剤である。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元グルタチオンまたは酵素ジスルフィド還元酵素の作用による還元から保護される（ジスルフィド結合のいずれかの側の基を妨げることによって）。１つの適当な試薬、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、タンパク質の一方の末端リシンおよび他方の末端システインを利用して２つのタンパク質間でこのような連結を形成する。それぞれのタンパク質の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬も使用することができる。他の有用な架橋剤としては、限定することなく、２つのアミノ基（例えば、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基とスルフヒドリル基（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基（例えば、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、およびアルギニンの側鎖に存在するアミノ基とグアニジウム基（例えば、ｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）を連結する試薬が挙げられる。
一部の実施形態では、放射性標識をタンパク質剤のアミノ酸骨格に直接コンジュゲートすることができる。代わりに、放射性標識を、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタ−ヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成する、より大きい分子（例えば、メタ−［１２５Ｉ］ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ）中の１２５Ｉ）（例えば、Rogersら、（１９９７年）J Nucl Med、３８巻：１２２１〜１２２９頁を参照）、またはひいてはタンパク質骨格に結合するキレート（例えば、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡ）の一部として含めることができる。放射性標識またはこれらを含有するより大きい分子／キレートを本明細書に記載の抗体または抗原結合断片にコンジュゲートする方法は、当技術分野で公知である。このような方法では、放射性標識またはキレートのタンパク質への結合を容易にする条件（例えば、ｐＨ、塩濃度、および／または温度）下でタンパク質を放射性標識とともにインキュベートすることを必要とする（例えば、米国特許第６，００１，３２９号を参照）。
蛍光標識（「フルオロフォア」と時に呼ばれる）をタンパク質（例えば、抗体）にコンジュゲートするための方法は、タンパク質化学の技術分野で公知である。例えば、フルオロフォアを、フルオロフォアに結合したスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用してタンパク質の遊離アミノ基（例えば、リシンの）またはスルフヒドリル基（例えば、システイン）にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、フルオロフォアをスルホ−ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤部分にコンジュゲートすることができる。適当なコンジュゲーション方法では、フルオロフォアのタンパク質への結合を容易にする条件下で抗体タンパク質またはその断片をフルオロフォアとともにインキュベートすることを必要とする。例えば、WelchおよびRedvanly（２００３年）「Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications」、John Wiley and Sons（ISBN0471495603）を参照。
一部の実施形態では、作用物質を、例えば、循環中、例えば、血液、血清、または他の組織中の抗体の安定化および／または保持を改善する部分で修飾することができる。例えば、クリプティックポリペプチド、またはそのバリアントもしくは機能性断片を含む作用物質を、例えば、Leeら、（１９９９年）Bioconjug Chem、１０巻（６号）：９７３〜８頁；Kinstlerら、（２００２年）Advanced Drug Deliveries Reviews、５４巻：４７７〜４８５頁；およびRobertsら、（２００２年）Advanced Drug Delivery Reviews、５４巻：４５９〜４７６頁に記載されているようにＰＥＧ化し、またはＨＥＳ化することができる（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、ドイツ；例えば、Pavisicら、（２０１０年）Int J Pharm、３８７巻（１〜２号）：１１０〜１１９頁を参照）。安定化部分は、ポリペプチドの安定性または保持を、少なくとも１．５（例えば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０、またはそれ超）倍改善することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、骨標的剤を含有し得る。骨に対する親和性または骨に向かう能力を有する作用物質は、当技術分野で公知である。本明細書で使用される場合、「骨標的剤」は、骨の主要な構成要素であるヒドロキシアパタイト中のカルシウムイオンに対して高い親和性を有する化学構造体またはリガンドを指す。ポリペプチドは、一実施形態では、骨以外の体の領域内のカルシウム沈着物、例えば、動脈、心臓、腎臓、または胆嚢内のカルシウム沈着物を標的とし得る。しかし、骨標的剤は、理想的には、骨組織に選択的に結合する。骨標的剤は、被験体の骨組織に付着され、好ましくは非骨組織より高い親和性で骨に結合し、ある特定の長さの時間にわたって結合したままであり、それによって骨環境に組成物を送達する。言い換えれば、骨標的剤は、好ましくは、非骨組織より少なくとも２倍大きい親和性（例えば、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍大きい親和性）で骨組織に結合する。骨標的剤は、好ましくは、骨組織に可逆的に結合し、それは、骨標的剤が最終的に骨から離れ、体から排出されることを意味する。
一部の実施形態では、骨標的剤は、望ましくは、ホスフェート、ホスホネート、ビスホスホネート、ヒドロキシビスホスホネート、アミノメチレンホスホン酸、酸性ペプチド、またはこれらの組合せからなる群から選択される。骨標的剤は、これらの基のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれ超を担持し得る。例えば、骨標的剤は、ホスホネートであり得、それは、骨標的剤が１つのホスホネート、２つのホスホネート、または３つもしくはそれ超のホスホネートを含み得ることを意味する。本発明において使用するのに適した１つの骨標的剤は、ＥＤＴＭＰ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（メチレンホスホン酸）であり、疼痛緩和のために骨転移部に選択的な放射線量を送達するための放射性１５３Ｓｍ複合体として現在ＦＤＡが承認している（Ｑｕａｄｒａｍｅｔ（商標））。ＥＤＴＭＰは、４つのホスホン酸基を含有するホスホネートであり、したがってテトラホスホネートである。１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰなどの化合物は、腫瘍が１０：１超の比で正常な骨に対して存在する骨中に選択的に局在化される。
一部の実施形態では、骨標的剤は、ポリホスホン酸である。ポリホスホン酸は、生物学的に活性な分子を骨組織への標的化に成功することが実証された。例えば、ＡＢＤＴＭＰなどのポリアミノホスホン酸を成長因子（骨形成を刺激するための）に（イソチオシアナト化学反応を介して）コンジュゲートすると、成長因子のラットの骨への標的化の成功がもたらされた（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９４／００１４５号を参照）。同様に、骨標的剤は、タンパク質にカップリングされた。例えば、ヒト血清アルブミンにコンジュゲートされたビスホスホネートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（Biotechnol Prog、１６巻：２５８頁（２０００年））およびｉｎ ｖｉｖｏで（Biotechnol Prog、１６巻：１１１６頁（２０００年））タンパク質を骨に送達することに成功した。骨標的剤の有用性は、タンパク質の骨への送達以外に及び、例えば、小さい治療用分子を含む。ＢＡＤなどの、骨標的ビスホスホネートおよびアルキル化剤を含むコンジュゲートが作製された（例えば、Wingenら、（１９８６年）J Cancer Res Clin Oncol、１１１巻：２０９頁を参照）。
一部の実施形態では、骨標的剤は、式：Ｘｎを含み、ここで、Ｘは、生理的ｐＨで負電荷を有するカノニカルまたは非カノニカルアミノ酸であり、ｎは、１〜２５の整数である。一部の実施形態では、Ｘは、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。一部の実施形態では、ｎは、５から１５の間の整数である。一部の実施形態では、ｎは、１０から１６の間の整数である。一部の実施形態では、ｎは、少なくとも４（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）である。一部の実施形態では、ｎは、２０未満（例えば、１９、１８、１７、１６、または１５未満）である。
他の実施形態では、骨標的剤は、（アスパラギン酸）ｎまたは（グルタミン酸）ｎである。骨および象牙質中に大量に見つかる糖タンパク質オステオネクチンの酸リッチペプチド配列は、ヒドロキシアパタイトに対して強い親和性を有する（Fujisawaら、（１９９６年）Biochimica et Biophysica Acta、５３巻：１２９２頁）。よって、酸性アミノ酸を含むペプチドリガンドは、骨標的剤の適当な候補である。実際に、（Ｇｌｕ）１０は、ビオチンに結合しているとき、標識ストレプトアビジンをヒドロキシアパタイトに動員することに成功した（国際特許出願公開第ＷＯ９８／３５７０３号にさらに記載されている）。骨に繋ぎ止められた（Ａｓｐ）６は、破骨細胞によって媒介される骨吸収プロセスの間に代謝されると考えられる。したがって、酸性ペプチドリガンドは、化合物を骨に動員する手段を提供するだけでなく、骨細胞および周囲組織に化合物を徐々に放出する機構も提供する。
骨標的剤の他の例としては、それだけに限らないが、アミノ−およびヒドロキシ−アルキルホスホン酸およびジホスホン酸；アレンドロネート、パミドロネート、４−アミノブチルホスホン酸、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、およびアミノメチレンビスホスホン酸を含めたヒドロキシビスホスホン酸；フィチン酸などのホスフェート；ならびにアミノメチレンホスホン酸、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（メチルホスホノ）−４−アミノ−安息香酸およびニトリロトリ（メチルホスホン酸）が挙げられる。
一部の実施形態、例えば、骨標的剤がタンパク質である実施形態では、作用物質は、融合タンパク質としての本明細書に記載のポリペプチドの一部であり得る（以下を参照）。
融合タンパク質
一部の実施形態では、ポリペプチドは、クリプティックポリペプチド（また、クリプティックペプチドのバリアントまたは機能性断片）の少なくとも一部および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質であり得る。このような融合ドメインの周知の例としては、それだけに限らないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられる。融合ドメインは、所望の性質を付与するように選択され得る。例えば、一部の融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的に関して、親和性クロマトグラフィーの関連したマトリックス、例えば、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂が使用される。別の例として、融合ドメインは、ポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）および「エピトープタグ」が挙げられ、エピトープタグは通常、特異的抗体が利用可能である短いペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、クリプティックポリペプチド（バリアントまたは機能性断片）部分および異種部分（例えば、Ｆｃ領域またはアルブミン分子）を隔てる１つまたは複数のアミノ酸のリンカー部分を含む。一部の実施形態では、リンカー部分は、
に表されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカー領域は、ポリグリシン配列またはポリ（ＧＳ）配列を含む。一部の場合では、融合ドメインは、第Ｘａ因子、トロンビン、またはタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼなどの、プロテアーゼによる切断部位を有し、これは、関連したプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによってこれらから組換えタンパク質を遊離することを可能にする。次いで遊離したタンパク質を、後続のクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。一部の実施形態では、クリプティックポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｖｏでクリプティックポリペプチドを安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合することができる。「安定化させること」とは、これが破壊の低下、腎臓によるクリアランスの低下、または他の薬物動態学的効果のためであるかどうかにかかわらず血清半減期を増大させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合物は、広範囲のタンパク質に望ましい薬物動態学的性質を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合物も望ましい性質を付与することができる。選択され得る他の型の融合ドメインとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能ドメイン（望まれる場合、骨成長のさらなる刺激などの追加の生物学的機能を付与する）が挙げられる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｆｃドメインに融合したクリプティックポリペプチド（またはそのバリアントもしくは機能性断片）を含み得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、以下のアミノ酸配列：
を含み得、またはそれからなり得る。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、以下のアミノ酸配列：
を含み得、またはそれからなり得る。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
を含む。リンカー配列は、太字にされており、一方、融合タンパク質のＦｃ領域に下線が引かれている。残りの配列は、ヒトクリプティックの断片に対応する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
を含む。リンカー配列は、太字にされており、一方、融合タンパク質のＦｃ領域に下線が引かれている。残りの配列は、ヒトクリプティックの断片である。
一部の環境では、例えば、変異、欠失、もしくは遺伝子操作によって媒介される他の変更、または他の手法によって免疫グロブリン重鎖定常領域を修飾し、その結果、ある特定の活性、例えば、補体結合または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の刺激が低減または排除され、一方、好ましくは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃＲｎ）に結合するＦｃ領域の能力を保存することが有用であり得る。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域（本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のものを含む）は、その対応する変更されていない定常領域と比べてエフェクター機能が低減された（またはエフェクター機能を有さない）変更されたＦｃ定常領域であり得る。Ｆｃ定常領域が関与するエフェクター機能は、定常またはＦｃ領域の性質を変更することによってモジュレートすることができる。変更されたエフェクター機能としては、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つもしくは複数のＦｃ受容体への結合、および炎症促進性応答の活性のうちの１つまたは複数におけるモジュレーションが挙げられる。モジュレーションは、変更されていない形態の定常領域の活性と比較して、変更された定常領域を含有する対象抗体が呈するエフェクター機能活性の増大、低下、または排除を指す。特定の実施形態では、モジュレーションは、活性が無効にされ、または完全に存在しない状況を含む。例えば、モジュレートされたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を示す変更されたＦｃ定常領域は、変更されていない形態のＦｃ定常領域のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性のおよそ０〜５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）を呈し得る。本明細書に記載の変更されたＦｃ領域は、低減された、または測定可能でないＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を呈する場合がある。
ある特定の実施形態では、変更された定常領域は、天然配列定常領域または変更されていない定常領域と比較して、少なくとも１個のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失、例えば、天然配列定常領域または親ポリペプチドの定常領域中に約１〜約１００個のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する。一部の実施形態では、本明細書における変更された定常領域は、変更されていない定常領域と少なくとも約７０％の相同性（類似性）または同一性、ならびに変更されていない定常領域と一部の事例では少なくとも約７５％および他の事例では少なくとも約８０％の相同性または同一性、ならびに他の実施形態では、変更されていない定常領域と少なくとも約８５％、９０％、または９５％の相同性または同一性を有する。変更された定常領域は、１個または複数のアミノ酸欠失または挿入も含有し得る。その上、変更された定常領域は、例えば、変更されたグリコシル化パターン（例えば、変更されていない定常領域と比べて１つもしくは複数の糖コンポーネントの付加、１つもしくは複数の糖コンポーネントの喪失、または１つもしくは複数の糖コンポーネントの組成の変化）を含めた変更された翻訳後修飾をもたらす１個または複数のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有し得る。
変更されたＦｃ定常領域は、バリアント定常、Ｆｃ、または重鎖領域を有する抗体を操作または産生することによって生じさせることができ；組換えＤＮＡ技術ならびに／または細胞培養および発現条件を使用して、変更された機能ならびに／または活性を有する抗体を産生することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して、エフェクター機能を含めた抗体機能に影響する領域（例えば、Ｆｃまたは定常領域など）に１個または複数のアミノ酸置換、欠失、または挿入を操作することができる。代わりに、例えば、グリコシル化パターンなどの翻訳後修飾の変化は、抗体が産生される細胞培養および発現条件をマニピュレートすることによって実現することができる。抗体のＦｃ領域に１個または複数の置換、付加、または欠失を導入するための適当な方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、（１９８９年）「Molecular Cloning: A Laboratory Manual、２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.；ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／５３３０１号；および米国特許第７，７０４，４９７号に記載されている標準的なＤＮＡ変異誘発技法を含む。これらの文献のそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
エフェクター機能が低減された変更されたＦｃ定常領域は、抗体のある特定の領域のアミノ酸配列に他の型の変化を導入することによって生成することができる。このようなアミノ酸配列変化としては、それだけに限らないが、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２８０２７号および同第ＷＯ９８／４７５３１号；ならびにXuら、（２０００年）Cell Immunol、２００巻：１６〜２６頁に記載されているＡｌａ−Ａｌａ変異が挙げられる。これらの実施形態によれば、Ｆｃ定常領域は、２３４位におけるアラニンへの置換または２３５位におけるアラニンへの変異を含む。その上、変更された定常領域は、二重変異：２３４位におけるアラニンへの変異および２３５位におけるアラニンへの第２の変異を含有し得る。一実施形態では、Ｆｃ定常領域は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位におけるフェニルアラニンからアラニンへの変異（複数可）および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異を記述する。別の実施形態では、Ｆｃ定常領域は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位におけるロイシンからアラニンへの変異（複数可）および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異を記述する。Ｆｃ定常領域は、代替としてまたは加えて、ＣＨ２ドメイン内の点変異Ｋ３２２Ａを含めた他の変異を担持し得る（Hezarehら、（２００１年）J Virol、７５巻：１２１６１〜１２１６８頁）。
重鎖定常領域に導入されるとき、エフェクター機能を低下させる追加の置換は、例えば、Shieldsら、（２００１年）J Biol Chem、２７６巻（９号）：６５９１〜６６０４頁に示されている。特に、Shieldsらの表１（「Binding of human IgG1 variants to human FcRn and FcγR」）を参照。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡを含む）のパネルへの結合に関して、ライブラリーの各抗体が重鎖定常領域内の１個または複数の置換によって異なる抗ＩｇＥ抗体のライブラリーをスクリーニングすることによって、著者らは、特異的Ｆｃ−Ｆｃ受容体相互作用をモジュレートするいくつかの置換を同定した。例えば、ＣＨ２ドメインがＤ２６５Ａ置換（Kabatら（上記）による重鎖アミノ酸番号付け）を含有するバリアントＩｇＧ２ａ重鎖定常領域は、バリアント定常領域とＩｇＧ Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩ、およびＦｃγＲＩＶとの相互作用を完全に喪失させる。６５９５頁、表１におけるShieldsら（２００１年）。Baudinoら、（２００８年）J Immunol、１８１巻：６６６４〜６６６９頁（上記）も参照。
ヒンジ領域内の変化もエフェクター機能に影響する。例えば、ヒンジ領域の欠失は、Ｆｃ受容体に対する親和性を低減し得、補体活性化を低減し得る（Kleinら、（１９８１年）Proc Natl Acad Sci USA、７８巻：５２４〜５２８頁）。したがって、本開示はまた、ヒンジ領域内の変更を有する抗体に関する。
一部の実施形態では、変更されたＦｃ定常領域（例えば、変更されたヒトＦｃ定常領域）は、変更されたまたはバリアントＦｃ定常領域が由来した天然Ｆｃ定常領域のものより大きい親和性で胎児性Ｆｃ受容体（neonatal Fc receptor）（ＦｃＲｎ）に結合することができる。例えば、Ｆｃ定常領域は、バリアントヒトＦｃ定常領域が由来した天然ヒトＦｃ定常領域と比べて１個または複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ超の）アミノ酸置換を含み得る。置換は、相互作用のｐＨ依存性を維持しながらｐＨ６．０においてバリアントＦｃ定常領域を含有するＩｇＧ抗体のＦｃＲｎへの結合親和性を増大させることができる。例えば、Hintonら、（２００４年）J Biol Chem、２７９巻：６２１３〜６２１６頁、およびDatta-Mannanら、（２００７年）Drug Metab Dispos、３５巻：１〜９頁を参照。抗体のＦｃ定常領域内の１個または複数の置換が、（相互作用のｐＨ依存性を維持しながら）ｐＨ６．０においてＦｃＲｎに対するＦｃ定常領域の親和性を増大させるかどうかを試験するための方法は、当技術分野で公知であり、作業実施例に例示されている。例えば、Datta-Mannanら、（２００７年）J Biol Chem、２８２巻（３号）：１７０９〜１７１７頁；国際公開第ＷＯ９８／２３２８９号；国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照。これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ＦｃＲｎに対する抗体Ｆｃ定常領域の結合親和性を増強する置換は、当技術分野で公知であり、これらとしては、例えば、（１）Dall’Acquaら（２００６年）J Biol Chem、２８１巻：２３５１４〜２３５２４頁によって記載されたＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／ＴＴ２５６Ｅ三重置換；（２）Hintonら、（２００４年）J Biol Chem、２７９巻：６２１３〜６２１６頁およびHintonら、（２００６年）J Immunol、１７６巻：３４６〜３５６頁に記載されたＭ４２８ＬまたはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ置換；ならびに（３）Petkovaら、（２００６年）Int Immunol、１８巻（１２号）：１７５９〜６９頁に記載されたＮ４３４ＡまたはＴ３０７／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ置換が挙げられる。追加の置換ペアリング：Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、およびＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈは、例えば、Datta-Mannanら、（２００７年）J Biol Chem、２８２巻（３号）：１７０９〜１７１７頁に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
一部の実施形態では、バリアント定常領域は、バリンについてＥＵアミノ酸残基２５５における置換を有する。一部の実施形態では、バリアント定常領域は、アスパラギンについてＥＵアミノ酸残基３０９における置換を有する。一部の実施形態では、バリアント定常領域は、イソロイシンについてＥＵアミノ酸残基３１２における置換を有する。一部の実施形態では、バリアント定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３８６における置換を有する。
一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、それが由来した天然定常領域と比べて、３０個以下の（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下の）アミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、およびＶ３０８Ｆからなる群から選択される１個または複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、バリアントヒトＦｃ定常領域は、それぞれＥＵ番号付けで、４２８位におけるメチオニンおよび４３４位におけるアスパラギンを含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、例えば、米国特許第８，０８８，３７６号に記載されている通り、４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換を含む。
一部の実施形態では、変更されたまたはバリアントＦｃ定常領域は、天然ヒトＦｃ定常領域と比べて、アミノ酸位置２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４、または４３６（ＥＵ番号付け）において置換を含む。一部の実施形態では、置換は、すべてＥＵ番号付けで、２３７位におけるグリシンの代わりにメチオニン；２３８位におけるプロリンの代わりにアラニン；２３９位におけるセリンの代わりにリシン；２４８位におけるリシンの代わりにイソロイシン；２５０位におけるトレオニンの代わりにアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；２５２位におけるメチオニンの代わりにフェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン；２５４位におけるセリンの代わりにトレオニン；２５５位におけるアルギニンの代わりにグルタミン酸；２５６位におけるトレオニンの代わりにアスパラギン酸、グルタミン酸、またはグルタミン；２５７位におけるプロリンの代わりにアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、またはバリン；２５８位におけるグルタミン酸の代わりにヒスチジン；２６５位におけるアスパラギン酸の代わりにアラニン；２７０位におけるアスパラギン酸の代わりにフェニルアラニン；２８６位におけるアスパラギンの代わりにアラニンまたはグルタミン酸；２８９位におけるトレオニンの代わりにヒスチジン；２９７位におけるアスパラギンの代わりにアラニン；２９８位におけるセリンの代わりにグリシン；３０３位におけるバリンの代わりにアラニン；３０５位におけるバリンの代わりにアラニン；３０７位におけるトレオニンの代わりにアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；３０８位におけるバリンの代わりにアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、またはトレオニン；３０９位におけるロイシンまたはバリンの代わりにアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、またはアルギニン；３１１位におけるグルタミンの代わりにアラニン、ヒスチジン、またはイソロイシン；３１２位におけるアスパラギン酸の代わりにアラニンまたはヒスチジン；３１４位におけるロイシンの代わりにリシンまたはアルギニン；３１５位におけるアスパラギンの代わりにアラニンまたはヒスチジン；３１７位におけるリシンの代わりにアラニン；３２５位におけるアスパラギンの代わりにグリシン；３３２位におけるイソロイシンの代わりにバリン；３３４位におけるリシンの代わりにロイシン；３６０位におけるリシンの代わりにヒスチジン；３７６位におけるアスパラギン酸の代わりにアラニン；３８０位におけるグルタミン酸の代わりにアラニン；３８２位におけるグルタミン酸の代わりにアラニン；３８４位におけるアスパラギンまたはセリンの代わりにアラニン；３８５位におけるグリシンの代わりにアスパラギン酸またはヒスチジン；３８６位におけるグルタミンの代わりにプロリン；３８７位におけるプロリンの代わりにグルタミン酸；３８９位におけるアスパラギンの代わりにアラニンまたはセリン；４２４位におけるセリンの代わりにアラニン；４２８位におけるメチオニンの代わりにアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；４３３位におけるヒスチジンの代わりにリシン；４３４位におけるアスパラギンの代わりにアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、またはチロシン；および４３６位におけるチロシンまたはフェニルアラニンの代わりにヒスチジンからなる群から選択される。
融合タンパク質の異なるエレメントを所望の機能性と一致する任意の様式で配列することができることが理解される。例えば、クリプティックポリペプチドを異種ドメインのＣ末端に配置してもよく、または代わりに、異種ドメインをクリプティックポリペプチドのＣ末端に配置してもよい。クリプティックポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインの、またはドメイン同士間のＣ末端またはＮ末端に含めてもよい。
ポリペプチド発現
組換えポリペプチド（例えば、断片または融合タンパク質）は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野で公知の様々な技法を使用して生成することができる。例えば、融合タンパク質をコードする核酸を、転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクター中に挿入することができ、この調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられる。調節配列としては、プロモーターならびに転写開始および停止配列が挙げられる。さらに、発現ベクターは、１つを超える複製系を含むことができ、その結果これは、２種の異なる生物内で、例えば、発現について哺乳動物細胞または昆虫細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅について原核生物宿主内で維持され得る。
いくつかの可能なベクター系が、哺乳動物細胞内の核酸からの組換えポリペプチドの発現に利用可能である。１つのクラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノム内への組み込みに依拠する。安定して組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、薬物耐性遺伝子、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ（MulliganおよびBerg、（１９８１年）Proc Natl Acad Sci USA、７８巻：２０７２頁）またはＴｎ５ ｎｅｏ（SouthernおよびBerg、（１９８２年）Mol Appl Genet、１巻：３２７頁）を同時に導入することによって選択することができる。選択可能マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に連結し、または共トランスフェクションによって同じ細胞内に導入することができる（Wiglerら、（１９７９年）Cell、１６巻：７７頁）。第２のクラスのベクターは、染色体外プラスミドに自律複製能力を付与するＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス（Sarverら、（１９８２年）Proc Natl Acad Sci USA、７９巻：７１４７頁）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（Deansら、（１９８４年）Proc Natl Acad Sci USA、８１巻：１２９２頁）、またはＳＶ４０ウイルス（LuskyおよびBotchan、（１９８１年）Nature、２９３巻：７９頁）に由来し得る。
発現ベクターは、後続の核酸の発現に適した様式で細胞内に導入することができる。導入の方法は、以下に論じる標的細胞型によって概ね決定される（dictated）。例示的な方法としては、ＣａＰＯ４沈降、リポソーム融合、カチオン性リポソーム、電気穿孔、ウイルス感染、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接マイクロインジェクションが挙げられる。
組換えタンパク質の発現のための適切な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などのげっ歯類細胞株）が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）、ならびに初代細胞株が特に対象である。
一部の実施形態では、組換えタンパク質は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）において発現させ、この動物から精製することができる。例えば、組換えタンパク質は、例えば、Houdebine、（２００２年）Curr Opin Biotechnol、１３巻（６号）：６２５〜６２９頁；van Kuik-Romeijnら、（２０００年）Transgenic Res、９巻（２号）：１５５〜１５９頁；およびPollockら、（１９９９年）、J Immunol Methods、２３１巻（１〜２号）：１４７〜１５７頁に記載されているように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類）において産生させ、乳から単離することができる。
ポリペプチドは、タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下で、かつ時間の量にわたって、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変動し、日常の実験を通じて当業者によって容易に確認される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されるタンパク質は、封入体から再フォールディングすることができる（例えば、Houら、（１９９８年）Cytokine、１０巻：３１９〜３０頁を参照）。細菌発現系およびこれらを使用するための方法は、当技術分野で周知である（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley & Sons、およびMolecular Cloning--A Laboratory Manual --３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（２００１年）を参照）。コドン、適当な発現ベクター、および適当な宿主細胞の選択は、いくつかの要因に応じて様々であり、必要に応じ、容易に最適化することができる。本明細書に記載の融合タンパク質は、哺乳動物細胞において、またはそれだけに限らないが、酵母、バキュロウイルス、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を含めた他の発現系において発現させることができる（例えば、Kaszubskaら、（２０００年）Protein Expression and Purification、１８巻：２１３〜２２０頁を参照）。
発現後に、組換えタンパク質を単離することができる。用語「精製された」または「単離された」は、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかに適用する場合、ポリペプチドであって、それに天然に付随するコンポーネント（例えば、タンパク質または他の天然に存在する生物学的もしくは有機分子）、例えば、タンパク質を発現する原核生物細胞または真核生物細胞における他のタンパク質、脂質、および核酸から分離または精製されたポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドは、それが試料中の総タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、または９９）重量％を構成する場合、精製されている。
組換えタンパク質は、他のコンポーネントがどのように試料中に存在するかに応じて当業者に公知の様々な方法で単離または精製することができる。標準的な精製法としては、電気泳動技法、分子技法、免疫学的技法、ならびにイオン交換、疎水性、親和性、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含めたクロマトグラフィー技法が挙げられる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム）を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と併せた限外濾過技法および透析濾過技法も有用である。例えば、Scopes（１９９４年）「Protein Purification、３版」、Springer-Verlag、New York City、New Yorkを参照。必要な精製の程度は、所望の使用に応じて変動する。一部の事例では、発現タンパク質の精製は、必要ではない。
精製タンパク質の収率または純度を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、これらとしては、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ＵＶ分光法、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、およびゲル電気泳動法（例えば、クマシーブルーなどのタンパク質染色剤またはコロイド銀染色剤を使用する）が挙げられる。
一部の実施形態では、エンドトキシンをタンパク質調製物から除去することができる。タンパク質試料からエンドトキシンを除去するための方法は、当技術分野で公知であり、作業実施例に例示されている。例えば、エンドトキシンは、限定することなく、ＰｒｏｔｅｏＳｐｉｎ（商標）エンドトキシン除去キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌエンドトキシン除去ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＭｉｒａＣＬＥＡＮ（登録商標）エンドトキシン除去キット（Ｍｉｒｕｓ）、またはＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）−Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含めた様々な市販の試薬を使用してタンパク質試料から除去することができる。
試料中に存在するエンドトキシンの量（精製前後の両方）を検出および／または測定するための方法は、当技術分野で公知であり、市販のキットが利用可能である。例えば、タンパク質試料中のエンドトキシンの濃度は、ＱＣＬ−１０００発色キット（Chromogenic kit）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）に基づくキット、例えば、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能なＰｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標）、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬ、およびＣＳＥキットを使用して決定することができる。
医薬組成物および製剤
本明細書に記載の組成物は、例えば、抗原に対する免疫応答を増強するのに被験体に投与するための医薬液剤として製剤化することができる。医薬組成物は一般に、薬学的に許容されるキャリアを含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」は、生理学的に適合性である任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Bergeら、（１９７７年）J Pharm Sci、６６巻：１〜１９頁を参照）。
組成物は、標準方法によって製剤化することができる。医薬製剤は、十分に確立した技術分野であり、例えば、Gennaro、（２０００年）「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、２０版、Lippincott、Williams & Wilkins（ISBN:0683306472）；Anselら、（１９９９年）「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」、７版、Lippincott Williams & Wilkins Publishers（ISBN:0683305727）；およびKibbe、（２０００年）「Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association」、３版（ISBN:091733096X）にさらに記載されている。一部の実施形態では、組成物は、例えば、適当な濃度の、かつ２〜８℃（例えば、４℃）で貯蔵するのに適した緩衝液として製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物は、０℃未満の温度（例えば、−２０℃または−８０℃）で貯蔵するために製剤化され得る。一部の実施形態では、組成物は、２〜８℃（例えば、４℃）で最大で２年（例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１年半、または２年）にわたって貯蔵するために製剤化され得る。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、２〜８℃（例えば、４℃）で少なくとも１年にわたる貯蔵で安定である。
医薬組成物は、様々な形態で存在し得る。これらの形態としては、例えば、液体、半固体、および固形剤形、例えば、液体液剤（liquid solution）（例えば、注射用および注入用液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤・散剤（powder）、リポソーム剤、ならびに坐剤が挙げられる。好適な形態は、意図される投与モードおよび治療用途に部分的に依存する。例えば、全身または局所送達を意図された組成物を含有する組成物は、注射用または注入用液剤の形態で存在し得る。したがって、組成物は、非経口モード（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）による投与のために製剤化することができる。「非経口投与」、「非経口的に投与される」、および他の文法的に等価な語句は、本明細書で使用される場合、通常注射による、経腸および局部投与以外の投与モードを指し、限定することなく、静脈内、鼻腔内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、および胸骨内注射および注入を含む（以下を参照）。
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度で安定に貯蔵するのに適した他の規則構造物（ordered structure）として製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組合せを有する適切な溶媒中に必要量の本明細書に記載の組成物を組み込み、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、基本分散媒および上記に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に本明細書に記載の組成物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌粉末の場合では、調製のための方法は、真空乾燥および凍結乾燥を含み、これらは、本明細書に記載の組成物と、任意の追加の望まれる成分（以下を参照）であって、先に滅菌濾過しておいたその溶液からの成分との粉末を生じる。液剤の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合では要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸塩、およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
本明細書に記載の組成物は、免疫リポゾーム組成物で製剤化することもできる。このような製剤は、当技術分野で公知の方法、例えば、Epsteinら、（１９８５年）Proc Natl Acad Sci USA、８２巻：３６８８頁；Hwangら、（１９８０年）Proc Natl Acad Sci USA、７７巻：４０３０頁；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載された方法などによって調製することができる。循環時間が増強されたリポソームは、例えば、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
ある特定の実施形態では、組成物は、埋め込み体およびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出製剤など、迅速放出に対して化合物を保護するキャリアとともに製剤化することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法が、当技術分野で公知である。例えば、J.R. Robinson、（１９７８年）「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」、Marcel Dekker,Inc.、New Yorkを参照。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、非経口注射によって水溶液で投与される。本開示は、有効量の薬剤（または１種を超える薬剤）を含み、ならびに薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはキャリアを任意選択で含む医薬組成物を特徴とする。このような組成物は、滅菌水、緩衝食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度；ならびに任意選択で添加剤、例えば、洗浄剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、チメロサール（thimersol）、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。製剤は、例えば、濾過を使用して、滅菌剤を組成物中に組み込んで、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによって滅菌することができる。
上述の通り、相対的に高濃度の組成物を作製することができる。例えば、組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの間（例えば、約９ｍｇ／ｍＬから９０ｍｇ／ｍＬの間；約９ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間；約１０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間；約１５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間；約１５ｍｇ／ｍＬから１１０ｍｇ／ｍＬの間；約１５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間；約２０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間；約２０ｍｇ／ｍＬから８０ｍｇ／ｍＬの間；約２５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間；約２５ｍｇ／ｍＬから８５ｍｇ／ｍＬの間；約２０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間；約２５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間；約３０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間；約３０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間；約４０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間；約５０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間；または約２０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間）の濃度で製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物は、５ｍｇ／ｍＬ超かつ５０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で製剤化することができる。水溶液中のタンパク質を製剤化するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７，３９０，７８６号；McNallyおよびHastedt（２００７年）、「Protein Formulation and Delivery」、２版、Drugs and the Pharmaceutical Sciences、１７５巻、CRC Press；ならびにBanga、（１９９５年）、「Therapeutic peptides and proteins: formulation, processing, and delivery systems」、CRC Pressに記載されている。一部の実施形態では、水溶液は、中性ｐＨ、例えば、６．５から８の間（例えば、７から８の間かつ７と８とを含む）のｐＨを有する。一部の実施形態では、水溶液は、約６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、水溶液は、６超（または６に等しい）（例えば、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９超のまたはそれに等しい）の、しかしｐＨ８未満のｐＨを有する。
本明細書で使用される場合、「約」および同様の文法的な用語は、測定の特質または精度を考慮して測定される量についての誤差の許容される程度を指す。誤差の例示的な程度には、最大で２０％（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％以下、または１％未満）が含まれる。一部の実施形態では、例えば、生物系では、約は、１桁以内、例えば、４倍、３倍、または２倍以内である値を含む。一部の実施形態では、「約」は、述べた参照値の１００％以下の値を指す。
治療用ポリペプチドをコードする核酸を、細胞内で薬剤を発現および産生させるのに使用され得る核酸を送達するための遺伝子療法プロトコールの一部として使用される遺伝子構築物中に組み込むことができる。このようなコンポーネントの発現構築物は、任意の治療上有効なキャリア、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞にコンポーネント遺伝子を有効に送達することができる任意の製剤または組成物で投与することができる。手法は、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）を含めたウイルスベクター、または組換え細菌もしくは真核生物プラスミド中に対象遺伝子を挿入することを含む。ウイルスベクターは、直接的に細胞をトランスフェクトすることができ；プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体化ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたは他のこのような細胞内キャリア、およびｉｎ ｖｉｖｏで実行される遺伝子構築物の直接注射またはＣａＰＯ４沈降（例えば、ＷＯ０４／０６０４０７を参照）の助けを借りて送達され得る。適当なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられ、これらは、当業者に公知である（例えば、Eglitisら、（１９８５年）Science、２３０巻：１３９５〜１３９８頁；DanosおよびMulligan、（１９８８年）Proc Natl Acad Sci USA、８５巻：６４６０〜６４６４頁；Wilsonら、（１９８８年）Proc Natl Acad Sci USA、８５巻：３０１４〜３０１８頁；Armentanoら、（１９９０年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８７巻：６１４１〜６１４５頁；Huberら、（１９９１年）Proc Natl Acad Sci USA、８８巻：８０３９〜８０４３頁；Ferryら、（１９９１年）Proc Natl Acad Sci USA、８８巻：８３７７〜８３８１頁；Chowdhuryら、（１９９１年）Science、２５４巻：１８０２〜１８０５頁；van Beusechemら、（１９９２年）Proc Natl Acad Sci USA、８９巻：７６４０〜７６４４頁；Kayら、（１９９２年）Human Gene Therapy、３巻：６４１〜６４７頁；Daiら、（１９９２年）Proc Natl Acad Sci USA、８９巻：１０８９２〜１０８９５頁；Hwuら、（１９９３年）J Immunol、１５０巻：４１０４〜４１１５頁；米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１３６号、同第ＷＯ８９／０２４６８号、同第ＷＯ８９／０５３４５号、および同第ＷＯ９２／０７５７３号を参照）。別のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来ベクターを利用する（例えば、Berknerら、（１９８８年）BioTechniques、６巻：６１６頁；Rosenfeldら、（１９９１年）Science、２５２巻：４３１〜４３４頁；およびRosenfeldら、（１９９２年）Cell、６８巻：１４３〜１５５頁を参照）。アデノウイルス株Ａｄ ５型ｄｌ３２４、またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適当なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。対象遺伝子の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。例えば、Flotteら、（１９９２年）Am J Respir Cell Mol Biol、７巻：３４９〜３５６頁；Samulskiら、（１９８９年）J Virol、６３巻：３８２２〜３８２８頁；およびMcLaughlinら、（１９８９年）J Virol、６２巻：１９６３〜１９７３頁を参照。
一部の実施形態では、組成物は、１種または複数種の追加の治療剤、例えば、骨形成、骨密度、または骨量を増大させるための追加の薬剤とともに製剤化することができる。
組成物が第２の活性剤と組み合わせて使用される予定の場合、組成物を、第２の薬剤とともに共製剤化することができ、または組成物を、第２の薬剤製剤と別個に製剤化することができる。例えば、それぞれの医薬組成物を、例えば、投与の直前に混合し、一緒に投与することができ、または例えば、同じまたは異なる時点で、別個に投与することができる（以下を参照）。
キット
本開示はまた、例えば、骨減少に関連した状態、または本明細書に記載の任意の他の状態（例えば、がん、代謝障害、筋肉消耗障害、筋骨格障害、もしくは免疫障害）を処置するために、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種または複数種を投与するための梱包された医薬組成物またはキットに関係する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種および状態の処置用ポリペプチド（複数可）を投与するための指示を含む。指示には、どのように、例えば、皮下にまたは静脈内に、およびいつ、例えば、０週目、２週目、４週目などに、異なる用量の１種または複数種のポリペプチドが、処置のために被験体に投与されるべきであるかを記述することができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物、ならびにそれぞれ、骨減少に関連した状態を処置するのに有用な追加の治療剤、および薬学的に許容されるキャリアを含む１種または複数種の医薬組成物を含有するキットに関係する。代わりに、キットは、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種、それを必要とする被験体（例えば、骨減少に関連した状態を有する被験体）を処置するのに有用な１種または複数種の薬物、および薬学的に許容されるキャリアを含む単一医薬組成物を含む。指示には、どのように、例えば、皮下に、およびいつ、例えば、０週目、２週目、４週目などに、異なる用量の１種または複数種のポリペプチドおよび／または追加の治療剤が、処置のために被験体に投与されるべきであるかを記述することができる。キットは、本明細書に記載の状態、例えば、骨減少に関連した状態を処置するための医薬組成物の投薬についての指示を含有し得る。
一部の実施形態では、キットは、骨成長、骨密度、骨強度、骨形成などのうちの少なくとも１つの徴候の改善について試験するための１種もしくは複数種の試薬および／または指示を含む。
治療用途
本明細書に記載のポリペプチドは、いくつかの治療用途で使用することができる。例えば、ポリペプチドは、骨形成、骨量、骨密度、骨強度などを増大させることができる。したがって、ポリペプチドは、様々な治療用途において、例えば、骨の減少、不足、または損傷に関連した疾患または状態を処置または防止するのに有用である。例えば、本明細書に記載のクリプティックポリペプチドは、骨減少に関連した状態、例えば、骨粗鬆症またはパジェット病に罹患している被験体を処置するのに有用である。一部の実施形態では、本開示は、個体に治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドを投与することによって、骨損傷を処置または防止することをを必要とする個体における骨損傷を処置または防止する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、個体に治療有効量の本明細書に記載のポリペプチドを投与することによって、骨成長または石灰化を促進することをを必要とする個体における骨成長または石灰化を促進する方法を提供する。これらの方法は、好ましくは、動物、より好ましくは、ヒトの治療的および予防的処置を目的としている。一部の実施形態では、本開示は、低骨密度または骨強度の低下に関連した障害を処置するための本明細書に記載のポリペプチドの使用を提供する。
本明細書に記載の組成物は、投与経路に部分的に依存する様々な方法を使用して被験体、例えば、ヒト被験体に投与することができる。経路は、例えば、静脈内注射もしくは注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）注射、または筋肉内注射（ＩＭ）であり得る。
投与は、例えば、局所的な注入、注射によって、または埋め込み体の手段によって実現することができる。埋め込み体は、サイラスティック膜（sialastic membrane）などの膜、または繊維を含めた多孔質、非多孔質、またはゼラチン状材料のものであり得る。埋め込み体は、被験体に組成物を持続的または周期的放出するように構成することができる。例えば、米国特許出願公開第２００８０２４１２２３号；米国特許第５，５０１，８５６号；同第４，８６３，４５７号；および同第３，７１０，７９５号；ＥＰ４８８４０１；ならびにＥＰ４３０５３９号を参照。これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。組成物は、例えば、拡散性、侵食性、または対流性システム、例えば、浸透圧ポンプ、生分解性埋め込み体、電気拡散システム、電気浸透システム、蒸気圧ポンプ、電解ポンプ、発泡ポンプ、圧電ポンプ、侵食に基づくシステム、または電気機械システムに基づく埋め込み型デバイスによって被験体に送達することができる。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療有効量」は、ｉｎ ｖｉｖｏ設定において、処置されている障害の１つもしくは複数の症状を処置し、阻害し、もしくは和らげるのに、または他の方法で所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果をもたらす（例えば、骨減少に関連した状態を処置する）のに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、様々な要因、例えば、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、および行われている処置によって変動する。治療有効量の本明細書に開示の薬剤は、１つもしくは複数の症状を処置し、改善し、または本明細書に記載の状態、例えば、骨減少に関連した状態を防止する（例えば、発症を遅延させ、または症状の発症の重症度を低減する）。
本明細書に記載の抗体またはこれらの断片のうちのいずれかの適当なヒト用量は、例えば、第Ｉ相用量漸増研究においてさらに評価することができる。例えば、van Gurpら、（２００８年）Am J Transplantation、８巻（８号）：１７１１〜１７１８頁；Hanouskaら、（２００７年）Clin Cancer Res、１３巻（２号、第１部）：５２３〜５３１頁；およびHetheringtonら、（２００６年）Antimicrobial Agents and Chemotherapy、５０巻（１０号）：３４９９〜３５００頁を参照。
このような組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物（例えば、骨障害の動物モデル）における公知の薬学的手順によって決定することができる。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するのに使用することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。高い治療指数を呈する薬剤が好適である。毒性副作用を呈する組成物を使用してもよいが、このような化合物を患部組織の部位に向ける送達システムを設計し、正常細胞の潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減するように注意が払われるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトに使用するための投与量の範囲を処方するのに使用することができる。このような抗体またはその抗原結合断片の投与量は、一般に、ほとんどまたはまったく毒性を伴わないＥＤ５０を含むポリペプチドの、循環中の濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害（half-maximal inhibition）を実現する抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するように動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。一部の実施形態では、例えば、局所投与が望まれる場合、細胞培養または動物モデリングを使用して、局所部位内の治療有効濃度を実現するのに要求される用量を決定することができる。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、薬剤を、１種または複数種の追加の治療剤（例えば、骨疾患を処置するための治療剤）と併せて哺乳動物に投与することができる。
本明細書で使用される場合、被験体は、好ましくはヒトであるが、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、もしくはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスであってもよい。一部の実施形態では、被験体は、飼いならされた動物または農場動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、乳仔（例えば、ヒト乳児）である。
本明細書で使用される場合、「防止の必要のある」、「処置の必要のある」、または「その必要のある」被験体は、適切な医療従事者（例えば、ヒトの場合における医者、看護師、またはナースプラクティショナー；非ヒト哺乳動物の場合における獣医）の判断によって、所与の処置（例えば、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種を用いた処置）から適度に利益を得る被験体を指す。一部の実施形態では、その被験体は、骨減少に関連した状態などの本明細書に記載の状態を有すると診断されている被験体である。
用語「防止すること」は、当技術分野で認識されており、状態に関して使用される場合、当技術分野においてよく理解されており、組成物を受けない被験体と比べて、被験体における医学的状態の症状の頻度を低減し、またはその症状の発症を遅延させる組成物の投与を含む。
骨および／もしくは軟骨形成を誘導する、骨減少を防止する、骨石灰化を増大させる、または骨の無機質脱落を防止するための方法も本明細書で提供されている。例えば、本明細書に記載のポリペプチドを使用して、ヒトおよび他の動物における骨粗鬆症を処置し、骨折および軟骨欠損を修復することができる。ポリペプチドは、骨粗鬆症の発生に対する保護対策として無症候性低骨密度と診断されている患者において有用であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損を治癒させるのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、閉鎖および開放骨折低減において、ならびにまた、人工関節の固定の改善において使用することができる。骨形成剤によって誘導される新規骨形成は、先天性、外傷誘導、または腫瘍切除誘導頭蓋顔面欠損の修復に寄与し、美容形成手術においても有用である。一部の実施形態では、ポリペプチドのうちの１種または複数種を使用して骨粗鬆症を処置することができる。
骨減少に関連した状態としては、限定することなく、骨粗鬆症（続発性骨粗鬆症を含む）、副甲状腺機能亢進症、クッシング病、パジェット病、甲状腺中毒症、慢性下痢体質もしくは吸収不良、尿細管性アシドーシス、または神経性食欲不振症が挙げられる。骨粗鬆症は、様々な要因によって引き起こされ、またはそれに関連する場合がある。女性（female）、特に閉経期後の女性であること、低体重を有すること、および座りがちな生活様式に至ることはすべて、骨粗鬆症（骨ミネラル密度の減少、骨折リスクに至る）のリスクファクターである。以下のプロファイルのうちのいずれかを有する人は、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種を用いた処置の候補であり得る：閉経期後の、エストロゲンまたは他のホルモン補充療法を受けていない女性（woman）；股関節部骨折または喫煙の個人歴または母親の既往歴を有する人；背が高い（５フィート７インチ超）または痩せている（１２５ポンド未満）閉経期後の女性；骨減少に関連した臨床状態を有する男性；Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ（商標）などのコルチコステロイド、Ｄｉｌａｎｔｉｎ（商標）およびある特定のバルビツレートなどの様々な抗発作医薬、または高用量甲状腺補充薬を含めた骨減少を引き起こすことが知られている医薬を使用している人；１型糖尿病、肝疾患、腎疾患を有し、または骨粗鬆症の家族歴を有する人；高い骨代謝回転（例えば、尿試料中の過剰なコラーゲン）を有する人；甲状腺機能亢進症などの甲状腺状態を有する人；単に軽度の外傷後に骨折を経験したことがある人；椎骨骨折のＸ線証拠または骨粗鬆症の他の徴候を有していたことがある人。
上述したように、骨粗鬆症は、別の障害に関連した状態として、またはある特定の医薬の使用からも起き得る。薬物または別の医学的状態から生じる骨粗鬆症は、続発性骨粗鬆症として公知である。クッシング病として公知の状態では、体が産生する過剰量のコルチゾールが骨粗鬆症および骨折をもたらす。続発性骨粗鬆症に関連した最も一般的な医薬は、コルチコステロイドであり、それは、副腎によって天然に産生されるホルモンであるコルチゾールのように作用する薬物のクラスである。十分なレベルの甲状腺ホルモン（甲状腺によって産生される）が骨格の発達に必要とされるが、過剰の甲状腺ホルモンは、経時的に骨量を低下させ得る。アルミニウムを含有する制酸剤は、腎臓問題を有する人、特に透析を受けているヒトが高用量で服用するとき骨減少に至り得る。続発性骨粗鬆症を引き起こし得る他の医薬としては、発作を防止するのに使用されるフェニトイン（phenyloin）（ジランチン）およびバルビツレート；一部の形態の関節炎、がん、および免疫障害用薬物である、メトトレキセート（リウマトレックス、イムネックス、フォレックスＰＦＳ）；一部の自己免疫疾患を処置し、臓器移植患者における免疫系を抑制するのに使用される薬物である、シクロスポリン（サンディミュン、ネオーラル）；前立腺がんおよび子宮内膜症を処置するのに使用される黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ルプロン、ゾラデックス）；抗凝固医薬であるヘパリン（カルシパリン、リクエミン（Liquaemin））；ならびに高コレステロールを処置するのに使用されるコレスチラミン（クエストラン）およびコレスチポール（コレスチド（Colestid））が挙げられる。がん療法から生じる骨減少は、広く認識されており、がん療法誘導骨減少（cancer therapy induced Bone loss）（ＣＴＩＢＬ）と呼ばれる。骨転移は、骨の中に空洞を作る場合があり、それは、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種を用いた処置によって矯正され得る。よって、本明細書に記載のポリペプチドは、がんに関連した骨減少を処置するのにも有用である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、筋肉量または筋肉強度を増大させることをを必要とする被験体における筋肉量または筋肉強度を増大させるのに使用することができる。例えば、ポリペプチドは、筋肉消耗障害を有する被験体を処置するのに有用である。一部の実施形態では、処置される被験体（例えば、ヒト）は、筋肉消耗障害を有し、または筋萎縮に罹患している。筋肉消耗障害は、本明細書で使用される場合、筋肉消耗が、原発性症状、例えば、筋ジストロフィー、脊髄損傷、神経変性疾患、食欲不振症、筋肉減少症、悪液質や、拘束、長期床上安静、または無重力に起因する筋萎縮症などのうちの１つである障害または状態、および異常に高い脂肪対筋肉比が疾患または疾患前状況において関係する障害、例えば、ＩＩ型糖尿病またはシンドロームＸを包含する。
骨格筋の委縮は、使用の欠如、老化、飢餓の結果として、ならびに様々な疾患、障害、および状態、例えば、敗血症、筋ジストロフィー、ＡＩＤＳ、老化、およびがんの帰結として成体動物の筋肉に起こる。筋肉の喪失は一般に、タンパク質含有量、力の生成、疲労抵抗、および筋線維径の低下によって特徴付けられる。これらの低下は、タンパク質合成の低下およびタンパク質分解の増大の両方に帰され得る。本発明の組成物および方法が対象とする筋肉消耗および関連状態には、筋成長の増強または筋肉消耗の減少が、治療上、または別の方法で、望ましい結果を生じさせる任意の状態が含まれる。状態としては、筋ジストロフィー、筋肉減少症、悪液質、糖尿病、および筋肉量の改善であって、例えば、食用動物においてこのような改善が倫理的で望ましい場合の筋肉量の改善が挙げられる。
１つのクラスの筋肉消耗障害は、上述したように、筋ジストロフィーである。これらは、神経筋障害の異種グループであり、これらとしては、最も一般的な型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、複数の型の肢帯型ＭＤ（ＬＧＭＤ）、および他の先天型ＭＤ（ＣＭＤ）が挙げられる。進行性の筋損傷および筋肉喪失、組織炎症、ならびに健康な筋肉の繊維性および脂肪性組織での置き換えは、筋ジストロフィーにおいて筋肉消耗をもたらす。極端な筋肉喪失は、その疾患の最も顕著な徴候の１つであり、死を含めた合併症および症状に至る。
筋肉減少症は、筋肉量、強度、および機能の年齢関連性の喪失である。これは、生涯のうちの４０代に始まり、およそ７５歳の年齢後に加速する。身体不活動、運動単位リモデリング、ホルモンレベルの低下、およびタンパク質合成の低下を含めた多くの要因は、すべて筋肉減少症の一因となり得る。身体不活動を例外として、これらのすべては、遺伝子制御の対象となり得、この場合、遺伝子モジュレーションが有用であり得る。例えば、筋タンパク質合成およびタンパク質破壊の速度が筋肉減少症に影響する。タンパク質合成および破壊のバランスが体内のタンパク質含有量を決定する。調査により、筋タンパク質合成速度は、より若い成人と比較した場合、高齢者においてより低いことが一貫して報告されている。例えば、遺伝子モジュレーションによって生じる筋タンパク質異化作用の低下は、筋肉量の喪失の減速または逆転をもたらし得る。
悪液質は、がん、ＡＩＤＳ、敗血症、およびうっ血性心不全を含めた様々な深刻な疾患に関連した状態である。その主要な作用は、栄養不良によって引き起こされない、脂肪組織および骨格筋の両方の大量の喪失である。悪液質は、すべてのがん死のほぼ３分の１の一因となる。まだ十分に理解されていないプロセスでは、サイトカインおよび腫瘍因子が、筋肉遺伝子産物を抑制することによって消耗を媒介する。悪液質因子は、ミオシン重鎖を標的にすることにおいて選択的であることが示された。悪液質は、いくつかのシステムの複雑な混乱に関与し、それは、貧血、インスリン抵抗性、免疫抑制、および急性期応答の活性化ももたらす。生じる進行性衰弱は、がんを有する患者を放射線および化学療法の毒性効果により影響されやすくする場合があり；多くのこのような患者は、自身の腫瘍でではなく、悪液質関連症候群で死亡する。
上述したように、本明細書に記載のポリペプチドは、アクチビンＡおよびアクチビンＢに結合し、これらの活性を阻害する。アクチビンは、膵島によるインスリン産生を調節することが示されている。Tsuchidaら、（２００４年）Mol Cell Endocrinol、２２０巻（１〜２０号）：５９〜６５頁およびWuら、（２０１４年）Diabetologia、５７巻（１号）：１４８〜１５６頁。よって、本開示は、いずれの特定の理論または作用機序にも束縛されないが、本明細書に記載のポリペプチドはまた、代謝障害、例えば、不十分なインスリン産生に関連した障害を処置するのに有用であり得る。代謝障害は、例えば、２型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、および肥満であり得る。
別の態様では、本開示は、免疫障害（例えば、炎症疾患または自己免疫障害）を有する被験体を処置するための方法を特徴とする。本方法は、被験体に、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を、免疫障害を処置するのに十分な量で投与することを含む。一部の実施形態では、免疫障害は、異常な宿主防御応答に関連する免疫障害である。一部の実施形態では、免疫障害は、例えば、（ａ）感染、毒性物質または外傷、手術に応じた創傷治癒、重度のやけど、または他の組織傷害、髄膜炎、虫垂炎、腎尿細管壊死、外傷性脳傷害、および敗血症によって負わされた組織の急性傷害；（ｂ）それだけに限らないが、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、血管炎、抗リン脂質症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス、および変形性関節症を含めた自己免疫疾患；ならびに（ｃ）それだけに限らないが、肺炎、サルコイドーシス、閉塞性細気管支炎、肺高血圧症、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、それだけに限らないが、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１、コロナウイルスＳＡＲＳ、ならびにヒトライノウイルスＣおよびＤを含めた病原性ウイルスなどの感染因子に対する急性応答を含めた呼吸器疾患であり得る。例えば、欧州特許出願公開第２５９４２８０号を参照。
ポリペプチドは、がんなどの増殖性障害に苦しんでいる被験体を処置するのにも有用である。一部の実施形態では、哺乳動物は、がんまたは感染症を有する、それを有すると疑われる、またはそれを発症するリスクがある哺乳動物である。がんは、細胞の制御されない分裂、および浸潤を通じた隣接組織への直接増殖によって、または転移による遠位部位への移植（この場合、がん細胞は、血流もしくはリンパ系を通じて輸送される）によって拡散する細胞の能力によって特徴付けられる疾患または障害のクラスである。がんは、すべての年齢の人に影響し得るが、リスクは、年齢とともに増大する傾向がある。がんの型として、例えば、肺がん、乳がん、結腸がん、膵がん、腎がん、胃がん、肝がん、骨がん、血液がん、神経組織がん（例えば、神経芽細胞腫）、黒色腫、甲状腺がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膣がん、または膀胱がんを挙げることができる。血液がん（液性腫瘍）としては、例えば、白血病（例えば、慢性リンパ球性白血病、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞型慢性リンパ球性白血病）および多発性骨髄腫が挙げられる。骨がんとしては、限定することなく、骨肉腫および骨癌が挙げられる。
一部の実施形態では、がんは、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢの１種または複数種の受容体を発現するがん細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、その増殖（例えば、増殖の速度もしくは規模）および／または生存能がアクチビンＡまたはアクチビンＢによって正に影響されるがん細胞を含む。例えば、Togashiら、（２０１５年）Cancer Lett、３５６巻（２号Ｂ部）：８１９〜８２７頁；Marinoら、（２０１４年）Mol Hum Reprod、２０巻（１２号）：１２２３〜１２３７頁；Kangら、（２００９年）J Bone Miner Res、２４巻（７号）：１１８０〜１１９３頁；Hodaら、（２０１２年）Br J Cancer、１０７巻：１９７８〜１９８６頁；およびWildiら、（２００１年）Gut、４９巻（３号）：４０９〜４１７頁を参照。がん細胞によるアクチビン受容体の存在または発現レベルを検出するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Wildiら、上記に記載されている。
遺伝子発現は、例えば、目的のタンパク質またはタンパク質のｍＲＮＡ発現として検出することができる。すなわち、タンパク質の存在または発現レベル（量）は、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルを検出および／または測定することによって決定することができる。
様々な適当な方法を使用して、タンパク質のｍＲＮＡ発現のレベルを検出および／または測定することができる。例えば、ｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットもしくはドットブロット分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ；例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、定量的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、または核酸アレイ（例えば、オリゴヌクレオチドアレイもしくは遺伝子チップ）分析を使用して決定され得る。このような方法の詳細は、以下に、かつ例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、２版、１、２、および３巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor、N.Y.、USA、１９８９年１１月；Gibsonら、（１９９９年）Genome Res、６巻（１０号）：９９５〜１００１頁；ならびにZhangら、（２００５年）Environ Sci Technol、３９巻（８号）：２７７７〜２７８５頁；米国特許出願公開第２００４０８６９１５号；欧州特許第０５４３９４２号；ならびに米国特許第７，１０１，６６３号に記載されている。これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
一例では、生体試料中の１種または複数種の個別のｍＲＮＡ集団の存在または量は、生体試料から全ｍＲＮＡを単離すること（例えば、Sambrookら（上記）および米国特許第６，８１２，３４１号を参照）、および、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動に付してサイズによってｍＲＮＡを分離することによって決定することができる。次いでサイズで分離されたｍＲＮＡは、ニトロセルロース膜などの固体支持体に移される（例えば、拡散によって）。次いで、生体試料中の１種または複数種のｍＲＮＡ集団の存在または量は、目的のｍＲＮＡ配列に相補的な、１種または複数種の検出可能に標識されたポリヌクレオチドプローブであって、これらの対応するｍＲＮＡ集団に結合し、よってこのｍＲＮＡ集団を検出可能にする、オリゴヌクレオチドプローブを使用して決定することができる。検出可能標識としては、例えば、蛍光（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、またはフィコエリトリン）、発光（例えば、ユウロピウム、テルビウム、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡによって供給されているＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）、放射線（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、または３Ｈ）、および酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ）標識が挙げられる。
別の例では、生体試料中のｍＲＮＡの個別の集団の存在または量は、核酸（またはオリゴヌクレオチド）アレイを使用して決定することができる。例えば、生体試料から単離されたｍＲＮＡは、ランダムヘキサマーまたはオリゴ（ｄＴ）−プライマー媒介第１鎖合成を用いるＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＲＴ−ＰＣＲステップを使用してアンプリコンを検出可能に標識することができ、または任意選択で、アンプリコンをＲＴ−ＰＣＲステップの後で検出可能に標識することができる。例えば、検出可能標識を、様々な適当な技法のうちのいずれかを使用してアンプリコンに酵素的に（例えば、ニックトランスレーションもしくはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどのキナーゼによって）または化学的にコンジュゲートすることができる（例えば、Sambrookら、上記を参照）。次いで、検出可能に標識されたアンプリコンは、複数のポリヌクレオチドプローブセットに接触させられる。それぞれのセットは、対応するアンプリコンに特異的な（かつそれに結合することができる）ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）プローブのうちの１種または複数種を含有し、この場合、その複数が異なるアンプリコンにそれぞれ対応する多くのプローブセットを含有する。一般に、プローブセットは、固体支持体に結合しており、それぞれのプローブセットの位置は、固体支持体上で予め決められている。検出可能に標識されたアンプリコンの、プローブセットの対応するプローブへの結合は、生体試料中の標的ｍＲＮＡの存在または量を示す。核酸アレイを使用してｍＲＮＡ発現を検出するための追加の方法は、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号；同第６，０２７，８８０号；同第６，０５７，１００号；同第６，１５６，５０１号；同第６，２６１，７７６号；および同第６，５７６，４２４号に記載されている。これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
検出可能標識を検出および／または定量する方法は、標識の特質に依存する。適切な酵素によって触媒される反応の生成物は（この場合検出可能標識は酵素である；上記を参照）、限定することなく、蛍光、発光、もしくは放射性であり得、またはこれらは、可視光もしくは紫外光を吸収し得る。このような検出可能標識を検出するのに適した検出器の例としては、限定することなく、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーター、およびデンシトメーターが挙げられる。
様々な方法、例えば、チオシアン酸グアニジウム溶解、その後のＣｓＣｌ遠心分離によって組織試料からＲＮＡを抽出することができる（Chirgwinら、１９７９年、Biochemistry、１８巻：５２９４〜５２９９頁）。単一細胞由来のＲＮＡは、Dulac、（１９９８年）Curr Top Dev Biol、３６巻：２４５頁、およびJenaら、（１９９６年）J Immunol Methods、１９０巻：１９９頁に記載されている方法など、単一細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法に記載されているように得ることができる。例えば、ＲＮＡｓｉｎを含めることによって、ＲＮＡ分解を回避する注意が払われなければならない。
次いでＲＮＡ試料は、特定の種を富化することができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＲＮＡ試料から単離される。一般に、このような精製は、ｍＲＮＡのポリＡテールを利用する。特に、かつ上述したように、ポリＴオリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡの親和性リガンドとして機能を果たすように固定支持体上内に固定することができる。この目的のためのキットは、市販されており、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）である。
本明細書に記載の方法で使用され得るプローブの型としては、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、およびゲノムプローブが挙げられる。使用されるプローブの型は一般に、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのリボプローブ、およびノーザンブロッティングのためのｃＤＮＡなどの特定の状況によって決定される。一実施形態では、プローブは、そのＲＮＡに固有のヌクレオチド領域に向けられる。プローブは、マーカーｍＲＮＡ転写物を区別して認識するのに要求されるのと同じ程度に短くてよく、例えば、１５塩基程度の短さであってよいが、少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０、またはそれ超の塩基のプローブも使用することができる。一実施形態では、プライマーおよびプローブは、マーカーに対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、ヌクレオチド配列中に少なくとも９５％の同一性が存在する場合にのみ起こることを意味する。別の実施形態では、「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションは、配列同士間で少なくとも９７％の同一性が存在するとき起こる。
プローブの標識の形態は、放射性同位体、例えば、３２Ｐおよび３５Ｓの使用などの、適切である任意のものであり得る。放射性同位体を用いた標識は、プローブが化学的または生物学的に合成されるかどうかにかかわらず、適切に標識された塩基の使用によって実現され得る。
ある特定の実施形態では、生体試料は、試験被験体由来のポリペプチド分子を含有する。代わりに、生体試料は、試験被験体由来のｍＲＮＡ分子または試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。
他の実施形態では、方法は、対照被験体から対照生体試料を得ること、マーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの断片の存在が生体試料中で検出されるように、マーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの断片を検出することができる化合物または薬剤と対照試料とを接触させること、および対照試料中のマーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの断片の存在を、試験試料中のマーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの断片の存在と比較することにさらに関与する。
融合タンパク質の発現も、タンパク質（例えば、融合タンパク質）の発現を検出および／または測定することによって決定することができる。タンパク質発現を決定する方法では一般に、目的の標的タンパク質に特異的な抗体を使用することに関与する。例えば、タンパク質発現を決定する方法としては、それだけに限らないが、ウエスタンブロットもしくはドットブロット分析、免疫組織化学検査（例えば、定量的免疫組織化学検査）、免疫細胞化学検査、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ；Coliganら編、（１９９５年）Current Protocols in Immunology、Wiley、New York）、または抗体アレイ分析（例えば、米国特許出願公開第２００３００１３２０８号および同第２００４１７１０６８号を参照、これらのそれぞれの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれている）が挙げられる。タンパク質発現を検出するための上記方法および追加の方法のうちの多くのさらなる記載は、例えば、Sambrookら（上記）に見出すことができる。
一例では、タンパク質発現の存在または量は、ウエスタンブロッティング法を使用して決定することができる。例えば、ライセートは生体試料から調製することができる、または生体試料自体をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と接触させ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付すことができる。次いでサイズによって分離された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質をフィルター膜（例えば、ニトロセルロース）に移し、目的のタンパク質に特異的な検出可能に標識された抗体を使用してイムノブロッティング技法に付すことができる。結合した検出可能に標識された抗体の存在または量は、生体試料中のタンパク質の存在または量を示す。
別の例では、イムノアッセイを、タンパク質のタンパク質発現を検出および／または測定するのに使用することができる。上記の通り、検出の目的に関して、イムノアッセイは、検出部分（例えば、蛍光剤または酵素）を持つ抗体を用いて実施することができる。生体試料由来のタンパク質は、固相マトリックス（例えば、マルチウェルアッセイプレート、ニトロセルロース、アガロース、セファロース、コード化粒子、もしくは磁気ビーズ）に直接的にコンジュゲートさせることができ、またはこれは、特異的結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジンもしくはビオチン）に結合すると固相マトリックスに結合する特異的結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチンもしくはストレプトアビジン）にコンジュゲートさせることができる。固相マトリックスへのこのような結合は、タンパク質を、検出抗体と接触させる前に生体試料の他の妨害または無関係コンポーネントから精製することを可能にし、また、後続の非結合抗体の洗浄を可能にする。ここで、上記の通り、結合した検出可能に標識された抗体の存在または量は、生体試料中のタンパク質の存在または量を示す。
タンパク質に特異的な抗体または抗体断片を生成させるための方法は、例えば、動物を使用して免疫によって、またはファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって生成させることができる。標的タンパク質のすべてまたは一部を含むポリペプチドを、抗体または抗体断片を生成させるのに使用することができる。抗体は、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の調製物であり得る。
遺伝子発現を検出または測定するための方法は、任意選択で、複数の試料の迅速な調製、処理、および分析を可能にするフォーマットで実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルもしくは３８６ウェル）またはアレイ（例えば、核酸チップもしくはタンパク質チップ）においてであり得る。様々な試薬の原液を手作業またはロボット制御で提供することができ、後続の試料調製（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、標識、または細胞固定）、ピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベート（例えば、ハイブリダイゼーション）、試料読み出し、データ収集（光学データ）、および／または分析（コンピューター支援画像分析）を、市販の分析ソフトウェア、ロボティクス、およびアッセイから生じるシグナルを検出することができる検出計測装置を使用してロボット制御で行うことができる。このような検出器の例としては、それだけに限らないが、分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計、および放射性同位体減衰を測定するデバイスが挙げられる。例示的なハイスループット細胞ベースアッセイ（例えば、細胞内の標的タンパク質の存在またはレベルを検出する）は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩ ＨＣＳリーダーまたはＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ技術（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）を利用することができる。
本明細書で使用される場合、がんを「発症するリスクにある」被験体は、がんを発症する１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、もしくは８、またはそれ超の）リスクファクターを有する被験体である。例えば、がんを発症するリスクにある被験体は、がんを発症する素因（すなわち、腫瘍抑制遺伝子における変異（例えば、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ＲＢ、もしくはＡＰＣにおける変異）などのがんを発症する遺伝性素因）を有し得、または状態をもたらし得るその状態に曝露されている。よって、被験体が、変異誘発性または発癌性レベルのある特定の化合物（例えば、タバコの煙中の発癌性化合物、例えば、アクロレイン、ヒ素、ベンゼン、ベンゾ［ａ］アントラセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ポロニウム−２１０（ラドン）、ウレタン、または塩化ビニル）に曝露されているとき、被験体は、「がんを発症するリスクにある」被験体であり得る。さらに、被験体が、例えば、大線量の紫外光もしくはＸ線照射に曝露され、または腫瘍を引き起こす／腫瘍に関連したウイルス、例えば、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、もしくはヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルスに曝露されている（例えば、感染している）とき、被験体は、「がんを発症するリスクに」あり得る。がんは、細胞の制御されない分裂、および浸潤を通じた隣接組織への直接の成長によって、または転移による遠位部位への移植（この場合、がん細胞は、血流もしくはリンパ系を通じて輸送される）によって拡散する細胞の能力によって特徴付けられる疾患または障害のクラスである。がんは、すべての年齢の人に影響し得るが、リスクは、年齢とともに増大する傾向がある。がんの型として、例えば、肺がん、乳がん、結腸がん、膵がん、腎がん、胃がん、肝がん、骨がん、血液がん、神経組織がん（例えば、多形性神経膠芽腫などの神経膠芽腫）、黒色腫、甲状腺がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膣がん、または膀胱がんを挙げることができる。
がんまたは感染症を「有すると疑われる」被験体は、がんまたは感染症の１つまたは複数の症状を有する被験体である。がんまたは感染症を発症するリスクにある、またはそれを有すると疑われる哺乳動物は、目的の種内のすべての哺乳動物を含むわけではないことが理解されるべきである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、目的の適応症についての１つまたは複数の追加の療法を含めてより広い治療レジメンの一部として投与することができる。すなわち、本明細書に記載のポリペプチドは、他の医薬品と共同で投与され得る。共同投与は、単一共製剤（co-formulation）の投与によって、同時投与によって、または別個の時点における投与によって達成され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、他の骨活性剤とともに投与される場合、特に有利であり得る。患者は、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１種または複数種を共同で受け、カルシウムサプリメント、ビタミンＤ、適切なエクササイズ、および／または一部の場合では、他の医薬を受けることにより利益を得ることができる。他の医薬の例としては、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、イバンドロネート、およびリセドロネート）、カルシトニン、エストロゲン、副甲状腺ホルモン、ならびにラロキシフェンが挙げられる（上記を参照）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１種または複数種の抗がん療法とともに投与することができる。適当な抗がん療法としては、例えば、化学療法剤、イオン化放射線、免疫療法剤、または温熱療法が挙げられる。化学療法剤としては、それだけに限らないが、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
これらの化学療法抗腫瘍化合物は、これらの作用機序によって、例えば、以下：代謝拮抗物質／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、およびシタラビン）ならびにプリン類似体、葉酸塩アンタゴニストおよび関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；天然産物、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテル、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびエトポシド（ＶＰ１６））を含めた抗増殖剤／抗有糸分裂剤；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身性に代謝し、自己自体のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を取り除くＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（trazenes-dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体（メトトレキセート）などの抗増殖性／抗有糸分裂性代謝拮抗物質；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、およびトロンビンの他の阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤（antimigratory agent）；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；免疫調節剤（サリドマイドおよびその類似体、例えば、レナリドミド（レブリミド、ＣＣ−５０１３）およびＣＣ−４０４７（アクチミド））、シクロホスファミド；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンギオテンシン受容体ブロッカー；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導因子（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、およびプレドニゾロン）；成長因子シグナルトランスダクションキナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導因子およびカスパーゼアクチベーター；ならびにクロマチン破壊剤（chromatin disruptor）を含む群に分類することができる。
用語「免疫療法剤」は、被験体において宿主免疫系を刺激して腫瘍またはがんに対する免疫応答を生じさせることができる任意の分子、ペプチド、抗体、または他の薬剤を含み得る。様々な免疫療法剤が組成物において有用であり当技術分野で公知であり、これらとしては、例えば、ＰＤ−１および／またはＰＤ−１Ｌ阻害剤、ＣＤ２００阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤が挙げられる。例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、当技術分野で公知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１００３６９５９号および同第ＷＯ２０１３／０７９１７４号、ならびに米国特許第８，５５２，１５４号および同第７，５２１，０５１号に記載されている。これらのそれぞれの開示は、これらが抗体の記載に関する場合、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。例示的なＣＤ２００阻害剤も当技術分野で公知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００７０８４３２１号に記載されている。適当な抗ＣＴＬＡ４アンタゴニスト剤は、国際特許出願公開第ＷＯ２００１／０１４４２４号および同第ＷＯ２００４／０３５６０７号；米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号；および欧州特許第ＥＰ１２１２４２２号に記載されている。追加のＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、および同第６，９８４，７２０号に記載されている。
別の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法で使用される放射線は、イオン化放射線であり得る。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、またはプロトンビームであることもできる。放射線療法の例としては、それだけに限らないが、外部ビーム照射療法、放射性同位体（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ストロンチウム−８９などの放射線同位体、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、ならびに／または全腹部および骨盤放射線療法が挙げられる。放射線療法の一般的な概要については、Hellman、１６章：Principles of Cancer Management: Radiation Therapy、６版、２００１年、DeVitaら編、J. B. Lippencott Company、Philadelphiaを参照。放射線療法は、放射線が離れた線源から向けられる外部ビーム放射線または遠隔放射線療法として投与することができる。放射線処置は、放射能源ががん細胞または腫瘍塊に近い体の内部に配置される内部療法または近接照射療法としても投与することもできる。光増感物質（photosensitizer）、例えば、ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルテポルフィン（Vertoporfin）（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感物質Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ；ならびに２ＢＡ−２−ＤＭＨＡの投与を含む光線力学的療法の使用も包含される。
一部の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン治療剤処置は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、ロイプロリド酢酸塩（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセシングの阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、鉱質コルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗ゲスタゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。
一部の実施形態では、体組織が高温（最大で１０６°Ｆ）に曝露される手順である温熱（hyperthermia）が、がんを処置するのに使用され、または対象の療法として選択される。熱は、細胞に損傷を与え、または細胞が生きるのに必要とする物質を細胞から取り除くことによって腫瘍を縮小するのに役立ち得る。温熱療法は、外部および内部加熱デバイスを使用する局所的、局部的、および全身温熱であり得る。温熱は、これらの有効性を増大させることを試みるために他の形態の療法（例えば、放射線療法、化学療法、および生物学的療法）とともにほとんど常に使用される。局所的温熱は、腫瘍などの非常に小さいエリアに施される熱を指す。エリアは、体外のデバイスから腫瘍に向けられた高周波数波で外部から加熱することができる。内部加熱を実現するために、薄い加熱されたワイヤーまたは温水で満たされた中空管；移植されたマイクロ波アンテナ；および無線周波数電極を含めたいくつかの型の滅菌したプローブのうちの１つが使用され得る。局部的温熱では、臓器または肢が加熱される。高エネルギーを生じさせる磁石およびデバイスが加熱される領域にわたって配置される。灌流と呼ばれる別の手法では、患者の血液の一部が取り出され、加熱され、次いで内部で加熱されるべき領域にポンプ搬送（灌流）される。全身加熱は、体全体にわたって拡散した転移性がんを処置するのに使用される。これは、温水毛布、ホットワックス、誘導コイル（電気毛布におけるもののような）、またはサーマルチャンバー（大きいインキュベーターと同様）を使用して達成することができる。温熱は、放射線副作用または合併症のいずれの顕著な増大も引き起こさない。しかし、皮膚に直接的に施される熱は、処置される患者の約半分において不快またはさらにはかなりの局所的疼痛を引き起こし得る。熱は、水疱も引き起こし得、水疱は一般に、急速に治癒する。
一部の実施形態では、光線力学的療法（ＰＤＴ、光放射療法、光線療法、または光化学療法とも呼ばれる）が、一部の型のがんを処置するのに使用される。これは、光増感剤（photosensitizing agent）として公知のある特定の化学物質が、生物が特定の型の光に曝露されるとき、単細胞生物を殺すことができるという発見に基づく。ＰＤＴは、光増感剤と組み合わせて固定周波数レーザー光を使用することによってがん細胞を破壊する。ＰＤＴでは、光増感剤は、血流中に注射され、体全体にわたって細胞によって吸収される。この作用物質は、それが正常細胞内に残るより長い時間にわたってがん細胞内に残る。処置されるがん細胞がレーザー光に曝露されるとき、光増感剤は、光を吸収し、処置されたがん細胞を破壊する活性型の酸素を生じさせる。光曝露は、光増感剤の大部分が健康な細胞を離れたが、依然としてがん細胞内に存在するときに行われるように、慎重に時間を計らなければならない。ＰＤＴで使用されるレーザー光は、光ファイバー（fiber-optic）（非常に細いガラスストランド）によって誘導することができる。光ファイバーは、適切な量の光を送達するようにがんの近くに配置される。光ファイバーは、肺がんの処置のために気管支鏡によって肺に、または食道がんの処置のために内視鏡によって食道に誘導することができる。ＰＤＴの利点は、それが健康な組織に引き起こす損傷が最小限であることである。しかし、現在使用されているレーザー光は、組織の約３センチメートル（（１＋１／８）インチ余り）を超えて通過することができないので、ＰＤＴは、皮膚上もしくは皮膚直下または内部器官の裏層上の腫瘍を処置するのに主に使用されている。光線力学的療法は、処置後６週間またはそれ超にわたって皮膚および眼を光に対して感受性にする。患者は、少なくとも６週間、直射日光および明るい室内光を回避するようにアドバイスされる。患者が屋外に行かなければならない場合、彼らは、サングラスを含めた保護衣を着用する必要がある。ＰＤＴの他の一時的な副作用は、具体的なエリアの処置に関連し、これらとして、咳嗽、嚥下困難、腹痛、および呼吸に伴う痛み、または息切れを挙げることができる。１９９５年１２月に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、閉塞を引き起こしている食道がんの症状を緩和するための、およびレーザー単独で満足に処置することができない食道がんのための、ポルフィマーナトリウムと呼ばれる光増感剤、またはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）を承認した。１９９８年１月に、ＦＤＡは、肺がんの通常の処置が適切でない患者における早期非小細胞肺がんの処置についてポルフィマーナトリウムを承認した。国立がん研究所および他の施設は、膀胱、脳、喉頭、および口腔のがんを含めたいくつかの型のがんに対する光線力学的療法の使用を評価する臨床試験（調査研究）をサポートしている。
一部の実施形態では、レーザー療法は、高強度光を利用してがん細胞を破壊するのに使用される。この技法は、特に、がんを他の処置によって治すことができないとき、出血または閉塞などのがんの症状を緩和するのに使用されることが多い。これは、腫瘍を縮小させ、または破壊することによってがんを処置するのにも使用され得る。用語「レーザー」は、輻射の誘導放出による光増幅を意味する。電球からの光などの常光は、多くの波長を有し、すべての方向に広がる。一方、レーザー光は、特定の波長を有し、狭いビームに集束される。この型の高強度光は、たくさんのエネルギーを含有する。レーザーは、非常に強力であり、鋼をカットし、またはダイヤモンドを成形するのに使用することができる。レーザーはまた、非常に正確な手術作業、例えば、眼の損傷した網膜の修復または組織のカット（メスの代わりに）に使用することができる。いくつかの異なる種類のレーザーが存在するが、わずか３種類が医学において広い使用を獲得している：二酸化炭素（ＣＯ２）レーザー：この型のレーザーは、より深い層に貫入することなく皮膚の表面から薄層を除去することができる。この技法は、皮膚内に深く広がっていない腫瘍およびある特定の前がん状態を処置するのに特に有用である。伝統的なメス手術の代替として、ＣＯ２レーザーは、皮膚をカットすることもできる。レーザーは、このように使用されて皮膚がんを除去する。ネオジム：イットリウム−アルミニウム−ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザー：このレーザーからの光は、他の型のレーザーからの光より組織内に深く貫入することができ、これは、血液を急速に凝固させることができる。これは、光ファイバー（optical fiber）によって体のあまりアクセス可能でない部分に運ぶことができる。この型のレーザーは時に、咽喉がんを処置するのに使用される。アルゴンレーザー：このレーザーは、組織の表層のみを通過することができ、したがって皮膚科において、および眼の手術において有用である。これはまた、光線力学的療法（ＰＤＴ）として公知の手順において腫瘍を処置するのに感光色素とともに使用される。レーザーは、レーザーがメスより正確であることを含めて、標準的な手術道具に対していくつかの利点を有する。周囲の皮膚または他の組織との接触がわずかであるので、切開部付近の組織が保護される。レーザーによって生じる熱は、手術部位を滅菌し、よって感染症のリスクを低減する。レーザーの精度がより小さい切開部を可能にするので、必要とされ得る手術時間はより少ない。治癒時間は、短縮されることが多く、その理由は、レーザーが血管を熱融着させ、出血、腫大、または瘢痕がより少ないためである。レーザー手術は、あまり複雑でない場合がある。例えば、光ファイバーを用いて、レーザー光を、大きい切開部を作ることなく体の部分に向けることができる。より多くの手順を外来患者ベースで行うことができる。レーザーは、がんを処置するのに２つの方法で、すなわち、熱で腫瘍を縮小させ、もしくは破壊することによって、またはがん細胞を破壊する光増感剤として公知の化学物質を活性化させることによって使用することができる。ＰＤＴでは、光増感剤は、がん細胞内に保持され、光によって刺激されてがん細胞を殺す反応を引き起こすことができる。ＣＯ２およびＮｄ：ＹＡＧレーザーは、腫瘍を縮小させ、または破壊するのに使用される。これらは、医師が膀胱などの体のある特定のエリアを見ることを可能にするチューブである内視鏡とともに使用され得る。一部のレーザーからの光は、光ファイバーを備えたフレキシブル内視鏡によって伝送することができる。これは、医師が手術を除いて他の方法では到達することのできない体の部分において見ることおよび作業することを可能にし、したがってレーザービームの非常に正確な照準化を可能にする。レーザーは、低出力顕微鏡とともに使用することもでき、処置されている部位の明らかな視界を医者に与える。他の機器とともに使用されて、レーザーシステムは、直径が２００ミクロン、非常に微細なスレッドの幅未満という小さいカットエリアをもたらすことができる。レーザーは、多くの型のがんを処置するのに使用される。レーザー手術は、ある特定のステージの声門（声帯）がん、頚部がん、皮膚がん、肺がん、膣がん、外陰がん、および陰茎がんの標準的な処置である。がんを破壊するためのその使用に加えて、レーザー手術は、がんによって引き起こされる症状を緩和するのを助けるのにも使用される（緩和ケア）。例えば、レーザーは、患者の気管（ウインドパイプ）を遮断している腫瘍を縮小させ、または破壊し、呼吸するのをより容易にするのに使用され得る。これはまた、結腸直腸がんおよび肛門がんの緩和のために時に使用される。レーザー誘導組織内温熱療法（ＬＩＴＴ）は、レーザー療法におけるつい最近の発展のうちの１つである。ＬＩＴＴは、熱が、細胞に損傷を与え、または細胞が生きるのに必要とする物質を細胞から取り除くことによって腫瘍を縮小するのに役立ち得るという、温熱と呼ばれるがん処置と同じアイデアを使用する。この処置では、レーザーは、体内の組織内エリア（臓器同士間のエリア）に向けられる。次いでレーザー光が腫瘍の温度を上昇させ、それによりがん細胞が損傷し、または破壊される。
以下の実施例は、本開示を限定するのではなく、例示するように意図されている。
（実施例１）
材料および方法
ＴＧＦ−βファミリーリガンド。組換えアクチビンＡ、アクチビンＢ、ノーダル（３２１８−ＮＤ−０２５／ＣＦ）、ＧＤＦ−１（６９３７−ＧＤ−０１０／ＣＦ）、ＧＤＦ−３（９５８−Ｇ３−０１０）、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１（１９５８−ＧＤ−０１０／ＣＦ）、ＴＧＦ−β−１、ＢＭＰ−２（３５５−ＢＭ−０１０／ＣＦ）、ＢＭＰ−４（３１４−ＢＰ−０１０／ＣＦ）、およびＢＭＰ−９（３２０９−ＢＰ−０１０／ＣＦ）は、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから得た。ノーダル、ＧＤＦ−３、およびＧＤＦ−１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で産生される一方、すべての他のリガンドは、哺乳動物細胞を使用して発現させた。（一部の事例では、Ｅ．ｃｏｌｉ内で産生される材料の異なるロットは、異なる活性を有した。）
発現プラスミド。合成ヒトＡＣＴＲＩＩＡ−ｈＩｇＧ−Ｆｃ、ＡＣＴＲＩＩＢ−ｈＩｇＧ−Ｆｃ、ＡＬＫ４−ｈＩｇｇ−Ｆｃ、およびクリプティック−ｈＩｇＧ−Ｆｃ遺伝子は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標））から得た。融合構築物は、ヒトＡＣＴＲＩＩＡ（アミノ酸１〜１２０）、ＡＣＴＲＩＩＢ（アミノ酸１〜１２０）、ＡＬＫ４（アミノ酸１〜１１０）、およびクリプティック（アミノ酸１〜１５５）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含んでいた。機能ドメインを、ＴＥＶ切断部位、グリシン／セリンリッチ領域、およびＦＬＡＧ−タグを含有する２２アミノ酸長リンカー（配列番号１８）を介してヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号２１）に連結した。クリプト−１およびＢＭＰＲＩＩは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより得たｃＤＮＡからクローニングした。クリプト１（１〜１６１）およびＢＭＰＲＩＩ（１〜１２０）を包含するアンプリコンを、ＰＣＲを使用してｈＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合させた。
タンパク質精製。ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃ、ＡＣＴＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＡＬＫ４−Ｆｃ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ、クリプティック−Ｆｃ、およびクリプト−１−Ｆｃ、ならびにアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＴＧＦ−β−１は、プロテインＡ捕捉を使用して馴化培地（condition medium）（ＣＨＯ細胞培養物）から精製した。タンパク質を１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０で直ちに中和した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを、馴化培地からノーダルを捕捉するのに使用した。タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製または分析して単分散であることを確認した。精製タンパク質をリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．５中に透析し、−２０℃または−８０℃で貯蔵した。タンパク質の純度は、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウエスタンブロットにより調べた。阻害アッセイに関しては、Ｆｃ融合タンパク質由来のＦｃ部分をタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、その後プロテインＡ親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。
細胞株。Ａ２０４細胞（ＨＴＢ−８２）およびＨＯＳ細胞（ＣＲＬ−１５４３）は、ＡＴＣＣから得た。細胞は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）培養条件（１０％ ＦＢＳ、０．２ユニット／ｍｌウシインスリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、１１０７０−７３−８）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）混合物を補充したＲＰＭＩ培地）によって維持した。骨芽細胞研究に関しては、ＨＯＳ細胞を１０％ ＦＢＳおよび１％ Ｐ／Ｓを含むアルファ−ＭＥＭ中で維持した。細胞を加湿した５％ ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて成長させた。新たに解凍した細胞を少なくとも３回継代させた後、アッセイを実施した。
イムノブロッティング。２．０×１０５細胞を２４ウェルプレートに蒔き、完全培地中で８０％コンフルエンスまで成長させ、１×ＰＢＳで洗浄し、一晩飢餓状態にし、３９ｎＭアクチビンＡまたはアクチビンＢを含む、または含まない無血清培地中で追加の２４時間成長させた。細胞を１７．８または１７８ｎＭクリプティック−１−ＦｃまたはＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃで処理した。タンパク質ライセートは、氷冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ４０、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１×「Ｒｅｃｏｍ ＰｒｏｔｅａｓｅＡｒｒｅｓｔ」プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７８６−４３６）、および２×「ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＡｒｒｅｓｔ」ホスファターゼ（phosphastase）阻害剤カクテル（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７８６−４５０））を使用することによって調製した。細胞ライセートは、−８０℃で貯蔵した。ライセートのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄを使用して決定した。ウエスタンブロッティングについては、等量のタンパク質を、還元条件下で、「ＡｎｙｋＤ」ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４５６−９０３５）で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ２０２０Ｆ）に移した。膜を５％ ＢＳＡでブロッキングし、１：１０００希釈の一次抗ホスホ−Ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３１０８Ｓ）抗体、抗Ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５３３９Ｓ）抗体、または抗アクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３１０８Ｓ）抗体とともにインキュベートし、その後１：２０００希釈の西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ ＥＣＬ ＨＲＰ基質を検出に使用した（Ａｄｖａｎｓｔａ、Ｋ−１２０４３−Ｄ２０）。ウエスタンブロットは、ゲルをオートラジオグラフィーフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ、Ｅ３０１８）に曝露することによって可視化した。免疫ブロットは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量した。
表面プラズモン共鳴。受容体−リガンド結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を使用してＳＰＲによって決定した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を、アミンカップリング化学反応を使用してＣＭ５チップの４つのチャネルに固定した。精製したクリプト−１−Ｆｃ、クリプティック−Ｆｃ、ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃ、ＡＣＴＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ、またはＡＬＫ４−Ｆｃを実験フローチャネルに捕捉した。参照チャネルを監視して非特異的結合、ドリフト、およびバルクシフトを明らかにした。リガンド結合の速度論的分析に関して、リガンド（ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ＴＧＦ−β−１、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−９）の濃度シリーズを５０μｌ／分の流量で実験および対照フローチャネル上に注射した。受容体へのクリプト−１またはクリプティック結合の分析に関して、５μＭの濃度のＦｃなしのクリプト−１またはクリプティックを５０μｌ／分の流量で実験および対照フローチャネル上に注射した。クリプト−１またはクリプティックの存在下でのリガンド結合の速度論的分析に関して、過剰のクリプト−１またはクリプティック（２００ｎＭ）と組み合わせたリガンド（ノーダル、アクチビンＡ）の濃度シリーズを５０μｌ／分の流量で実験および対照フローチャネル上に注射した。阻害分析に関して、１ｎＭ ノーダル、アクチビンＡ、またはアクチビンＢを、０ｎＭ、０．５、５、１０、４０、５０、１００、または４００ｎＭ Ｆｃなしのクリプト−１またはクリプティックと組み合わせた。予めアセンブルしたリガンド−クリプティック複合体を、５０μｌ／分の流量で実験および対照フローチャネル上に注射した。各結合サイクル後に、抗体表面をベースラインに再生させた。すべての実験は、２５℃で実施した。０．１％ ＢＳＡを含有するＨＢＳ−ＥＰＳ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）をランニング緩衝液として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉノーダル含有試料は、ＢＳＡ無しで保存した。その理由は、ＢＳＡの存在が組換えノーダルを急速に不活化させるためである。センソグラムは、２重参照することによって分析した。運動速度定数を得るために、処理したデータを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ、Ｃｌａｍｐ、またはＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用し、マストランスポートリミテーションを用いて１：１ラングミュア相互作用モデルにフィッティングした。平衡結合定数Ｋｄは、結合速度定数の比ｋｄ／ｋａを計算することによって決定した。結果を表１（以下）に要約する。
レポーターアッセイ。完全培地（１０％ウシ胎児血清を補充したマッコイ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中の約５０，０００ Ａ２０４細胞（ＡＴＣＣ）を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩成長させた。次の日、ｐＮＬ［ＮｌｕｃＰ／ＳＢＥ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（実験ルシフェラーゼレポータープラスミド、ホタルルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）２００ｎｇ、ｐＮＬ［ＮＬｕｃＰ／ｍｉｎＰ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（対照ルシフェラーゼレポータープラスミド、ウミシイタケルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）２ｎｇ、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２４μｌ、および マッコイ５Ａ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）９６０μｌを含有する溶液を調製し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、マッコイ５Ａ培地３８４０μｌをトランスフェクション溶液に添加し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、トランスフェクション溶液５０μｌを各ウェルに添加した。トランスフェクション試薬含有培地を翌日除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、培地を、試験タンパク質を含有する無血清マッコイ５Ａ培地で置き換えた。３７℃で１６時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で検出した。化学発光を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダーを使用して測定した。相対ルシフェラーゼ単位は、ホタルルシフェラーゼ単位（ＦＬＵ）をウミシイタケルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で除すことによって計算した。
骨芽細胞石灰化分析。ＨＯＳ細胞を１２ウェルプレートの１ウェル当たり１００，０００細胞で蒔いた。コンフルエンシーに到達した際、培地を２ｍＭホスフェートおよび２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸で補充した。ビヒクル、２０μｇ／ｍｌクリプティック、または５０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを単独または一緒に２週間それぞれフィーディングして（２〜３日毎）細胞を処理した。細胞をＰＢＳですすぎ、室温で３０分間１０％ホルマリン中に固定した。細胞を新たに作製した２０ｍＭアリザリンレッド染色液とともに１時間インキュベートし、すすぎ、デジタル写真を撮った。染色剤を１０％塩化セチルピリジニウム（cetylpyridinum chloride）で除去し、５７０ｎｍの波長で定量した。
統計。細胞ベースアッセイは、四連で実施し、少なくとも２つの異なる時点で繰り返した。統計的有意性は、両側ｔ−検定を使用して決定した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
（実施例２）
クリプティックおよびクリプト−１の発現および精製
クリプティックおよびクリプト−１は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して膜に結合している分泌タンパク質である（図１、パネルＡ）。可溶型のヒトクリプティックおよびクリプト−１を、可溶型をコードする核酸を安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現させた。可溶型は、タバコエッチモザイクウイルス（ＴＥＶ）切断部位を含有する２２アミノ酸リンカーを介して互いに連結されたタンパク質の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分を含んでいた（図１、パネルＢ）。クリプティックに関して、Ｎ末端シグナルペプチドを含み、アラニン１６７で終わる構築物を作製した。クリプト−１に関して、クリプティックのシグナルペプチドを使用し、クリプティック残基アラニン１６７に類似して、トレオニン１６３を構築物の終端とした（図１、パネルＡ）。クリプティック−Ｆｃおよびクリプト−１−Ｆｃタンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、その後サイズ排除クロマトグラフィーによって馴化培地から精製した。１リットル当たりおよそ精製クリプティック−Ｆｃ １００ｍｇおよびクリプト−１−Ｆｃ ３０ｍｇを培養細胞から得た。分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、クリプティックを凝集していない形態で得ることができることを示した（図１、パネルＣ）。精製タンパク質のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、予期されたように、還元条件下でおよそ５０ｋＤａ、および非還元条件下でおよそ１００ｋＤａのバンドを示した（図１、パネルＣ）。
（実施例３）
クリプティックおよびクリプト−１は、別個のリガンドに結合する
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒトクリプティックおよびクリプト−１のリガンド結合特異性を特徴付けた。精製Ｆｃ融合タンパク質を、抗ｈＦｃ抗体と架橋したＣＭ５センサーチップに捕捉し、血清レベルをはるかに上回った濃度（４５〜４７）を含む様々な濃度で捕捉したクリプティックおよびクリプト−１に異なるＴＦＧβファミリーリガンドを引き続いて注射した（図２、表１）。クリプティックは、非常に高い親和性（それぞれ、ｋａ＝３．１×１０５（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ＝４．６×１０−５（ｓ−１）、Ｋｄ＝０．１５ｎＭおよびｋａ＝３．１×１０５（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ＝４．６×１０−５（ｓ−１）、Ｋｄ＝０．１５ｎＭ）でアクチビンＡおよびアクチビンＢに結合することが示された（図２、パネルＡおよびＢ）。さらに、クリプティックは、アクチビンＡおよびアクチビンＢよりはるかに低い親和性ではあるがＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１にも結合した（図２、パネルＣおよびＤ）。それでもやはり、クリプティックとＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１との相互作用は、遅い解離速度（それぞれ、ｋｄ＝４．６×１０−４および４．６×１０−４（ｓ−１））によって示されるように、相対的に安定である。クリプティックは、ノーダルにも結合したが、クリプティック−ノーダル相互作用は、ノーダル−クリプト−１相互作用より数桁弱かった（図２、パネルＥおよびＦ）。クリプティックは、任意の他の試験したＴＧＦ−βファミリーリガンド、例えば、ＴＧＦ−β−１、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−９に感知できるほどに結合しなかった（図２、パネルＥ）。これらの知見は、アクチビンＡおよびアクチビンＢは、ヒトにおいてクリプティックによって調節される主要なリガンドであり、クリプティックは、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１シグナル伝達の調節においても役割を果たし得ることを示す。
同様の実験をヒトクリプト−１で実施し、それにより、そのリガンド結合特異性は、クリプティックのものと明確に別個の結合特異性であることが明らかになった。すべての試験したリガンドのうち、ノーダルのみが、感知できる親和性でヒトクリプト−１に結合した（図２、パネルＦ）。アクチビンＢは、クリプト−１にも結合したが、この相互作用は、その速い解離速度（ｋｄ＝４．６×１０−５（ｓ−１））によって反映されるように不安定である。クリプト−１の、アクチビンＡを含む任意の他の試験したＴＧＦ−βファミリーリガンドへの結合は観察されなかった。したがって、これらの知見は、クリプト−１がノーダルに非常に特異的であることを示す。
（実施例４）
クリプティックは、ＡＬＫ４へのリガンド結合を調節しない
リガンド−ＡＬＫ４相互作用におけるクリプティックの役割を確立するために、ヒトＡＬＫ４−Ｆｃをセンサーチップに捕捉した。クリプティックがＡＬＫ４に結合するかどうかを決定するために、Ｆｃなしのクリプティックを様々な濃度で注射した。リガンドおよび他の因子の非存在下で、クリプティックのＡＬＫ４への結合は、生理的レベルをはるかに上回る濃度（例えば、２０μＭ）でさえ、検出されなかった（図３、パネルＡ）。これらの知見は、クリプティックが他の因子の非存在下でＡＬＫ４と相互作用しないことを実証する。
クリプティックがＩ型受容体へのリガンド結合を増強または促進するかどうかを決定するために、アクチビンＡとＡＬＫ４との相互作用に対するクリプティックの効果を研究した（図３、パネルＢ、Ｃ、およびＤ）。ヒトＡＬＫ４−Ｆｃをセンサーチップに捕捉し、クリプティック（０〜４０ｎＭ）で滴定した一定量のアクチビンＡ（１ｎＭ）（図３、パネルＢ）または過剰のクリプティック（４００ｎＭ）存在下の滴定したアクチビンＡ（０〜４０ｎＭ）と接触させた（図３、パネルＤ）。ヒトクリプティックは、アクチビンＡとＡＬＫ４との相互作用を変更しなかった。実際に、ＡＬＫ４への遊離アクチビンＡ結合の動態モデルは、過剰のヒトクリプティックの存在下でのＡＬＫ４へのアクチビンＡ結合の動態モデルと実質的に区別不能である（ｋａ＝３．１×１０５（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ＝４．６×１０−５（ｓ−１）、Ｋｄ＝０．１５ｎＭ）（表１）。総合すると、これらの知見は、クリプティックは、ＡＬＫ４へのアクチビンＡ結合において役割を果たさないことを実証する。
（実施例５）
クリプティックは、ＩＩ型受容体へのリガンド結合を阻害する
次に、ＩＩ型受容体へのリガンド結合に対するクリプティックの効果を研究した（図４）。リガンドアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ−８をこれらの研究のために選択した（図２）。クリプティックがＩＩ型受容体と相互作用するかどうかを決定するために、ヒトＡＣＴＲＩＩＡ、ＡＣＴＲＩＩＢ、またはＢＭＰＲＩＩをセンサーチップに捕捉し、その後捕捉した受容体上にクリプティックを通過させた。リガンドの非存在下では、クリプティックは、生理的レベルをはるかに上回る濃度（例えば、２０μＭ）において、ＡＣＴＲＩＩＡ、ＡＣＴＲＩＩＢ、またはＢＭＰＲＩＩに結合しなかった（図３、パネルＡ）。
クリプティックがＡＣＴＲＩＩＡ、ＡＣＴＲＩＩＢ、またはＢＭＰＲＩＩへのリガンド結合に対する効果を有するかどうかを決定するために、これらの受容体をセンサーチップに捕捉し、０から１６００ｎＭの間の濃度のクリプティックとともにプレインキュベートしたアクチビンＡ（１ｎＭ）、アクチビンＢ（１０ｎＭ）、またはＧＤＦ−８（４０ｎＭ）をセンサーチップ上に通過させた。クリプティックは、濃度依存様式で高親和性受容体へのリガンド結合を阻害した。阻害は、逆の幾何学的配置、すなわち、センサーチップに捕捉したクリプティック−Ｆｃ、および様々な量のＡＣＴＲＩＩＡの存在下でセンサーチップ上に通過させたアクチビンＡで観察された（図４、パネルＨ）。クリプティックは、リガンド−ＩＩ型受容体相互作用を競合的に阻害することがさらに判明した。これらの知見は、ヒトクリプティックは、ＩＩ型受容体ＡＣＴＲＩＩＡ、ＡＣＴＲＩＩＢ、およびＢＭＰＲＩＩによる結合を受けるのと同じ部位でアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ−８に結合するという結論を支持する。
（実施例６）
クリプティックは、アクチビンシグナル伝達を阻害する
上述したように、本明細書に提供したデータは、クリプティックがリガンド−ＩＩ型受容体相互作用を競合的に阻害することを示す。本開示は、いずれの特定の理論または作用機序によっても限定されないが、クリプティックは、リガンド媒介シグナルトランスダクションおよび遺伝子発現も阻害し得る。リガンド依存遺伝子発現に対するクリプティックの潜在的効果を調べるために、Ａ−２０４横紋筋肉腫細胞にｐＳＢＥ４−ｌｕｃ、Ｓｍａｄ−２／３−応答性レポーター、および対照としてｐＲＬ−ＣＭＶ−ｌｕｃをトランスフェクトした（Zawalら、（１９９８年）Mol Cell、１巻：６１１〜６１７頁）。トランスフェクトした細胞を、１０ｎＭアクチビンＡまたはアクチビンＢ、および異なる濃度のクリプティック−Ｆｃで処理した（図５、パネルＡおよびＣ）。両リガンドは、ルシフェラーゼレポーター活性を強く誘導し（対照と比べておよそ８倍）、そのクリプティック−Ｆｃは、濃度依存様式でリガンド依存ルシフェラーゼシグナルを阻害した（図５、パネルＡおよびＣ）。実際に、クリプティック−Ｆｃは、アクチビンＡおよびアクチビンＢ誘導ルシフェラーゼレポーター活性を、真正アクチビン阻害剤ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃと同様に阻害した（図５、パネルＢおよびＤ）。シグナルトランスダクションに関して、ホスホ−Ｓｍａｄ２ウエスタンブロットを実施した（図５、パネルＢおよびＤ）。Ａ−２０４細胞を、１０ｎＭリガンドおよび滴定したクリプティック−Ｆｃでも処理した。アクチビンＡおよびアクチビンＢは、Ｓｍａｄ−２リン酸化を誘導し、クリプティック−Ｆｃは、Ｓｍａｄ−２リン酸化を阻害した。実際に、クリプティック−Ｆｃは、ＡＣＴＲＩＩＡ−Ｆｃと同様の効力でＳｍａｄ−２リン酸化を阻害した（図５、パネルＢおよびＤ）。
アクチビンＡは、骨芽細胞石灰化を阻害し、アクチビンＡ阻害剤は、骨芽細胞石灰化を促進することを考慮すると（例えば、Pearを参照）、クリプティック−Ｆｃは、アクチビンＡの存在下で骨芽細胞石灰化に対する効果を有する。ヒトＨＯＳ細胞をコンフルエンスまで成長させ、クリプティックとともに、またはクリプティック無しで、アクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で分化するように誘導した（ホスフェートおよびビタミンＣの添加によって）。予期されたように、アクチビンＡの添加は骨芽細胞石灰化を防止する（図５、パネルＥおよびＦ）。驚くべきことに、１０μｇ／ｍｌクリプティック−Ｆｃは、アクチビンＡによる石灰化抑制を防止した（図５、パネルＥおよびＦ）。要約すると、３つの異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験からの本発明者らの結果は、クリプティック−Ｆｃは、骨芽細胞石灰化の修復を含む生理学的に妥当な転帰を伴ってアクチビンＡ媒介シグナル伝達を効率的に阻害することを実証する（図５）。
本開示を、その具体的な実施形態を参照して記載してきたが、本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物を代用することができることが当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の局面、材料、物質の組成、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップを、本開示の目的、趣旨、および範囲に適応させるように、多くの改変を行うことができる。すべてのこのような改変は、本開示の範囲内であるように意図されている。

Claims (47)

  1. （ｉ）配列番号１〜９、１９、もしくは２０のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列；（ｉｉ）１０個以下のアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を有する配列番号１〜９、１９、もしくは２０のうちのいずれか１つに表されたアミノ酸配列のバリアント；または（ｉｉｉ）配列番号１〜９、１９、もしくは２０に表されたアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  2. 配列番号７〜９、１９、または２０に表されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号４〜９のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列であって、配列番号１または２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. １×１０−９Ｍ未満のＫＤでヒトアクチビンＡに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. １×１０−１０Ｍ未満のＫＤでヒトアクチビンＡに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. １×１０−１１Ｍ未満のＫＤでヒトアクチビンＡに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 野生型ヒトクリプティックがｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトアクチビンＡ依存細胞シグナル伝達を阻害する能力の、少なくとも３０％を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. １×１０−９Ｍ未満のＫＤでヒトアクチビンＢに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. ５×１０−１０Ｍ未満またはそれに等しいＫＤでヒトアクチビンＢに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 野生型ヒトクリプティックがｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトアクチビンＢ依存細胞シグナル伝達を阻害する能力の少なくとも３０％を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、被験体における該ペプチドの血清半減期を増大させる異種部分を含む、ポリペプチド。
  12. 前記異種部分が、免疫グロブリンＦｃ定常領域を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. 配列番号２１に表されたアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
  14. 配列番号１０に表されたアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
  15. 配列番号１９または２０に表されたアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
  16. 前記異種部分が、アルブミンタンパク質のすべてまたは一部を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
  17. 前記異種部分が、ポリエチレングリコールを含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
  18. 前記ポリペプチドを骨に向ける異種部分を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. 前記ポリペプチドを骨に向ける前記異種部分が、式：Ｘｎを含み、ここで、Ｘは、生理的ｐＨで負電荷を有するカノニカルまたは非カノニカルアミノ酸であり、ｎは、１〜２５の整数である、請求項１８に記載のポリペプチド。
  20. Ｘが、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項１９に記載のポリペプチド。
  21. ｎが、５から１５の間の整数である、請求項１９または２０に記載のポリペプチド。
  22. ｎが、１０から１６の間の整数である、請求項１９または２０に記載のポリペプチド。
  23. 検出可能標識を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 骨成長、骨強度、または骨密度を増大させることをを必要とする被験体における骨成長、骨強度、または骨密度を増大させるための方法であって、該被験体における骨成長、骨強度、または骨密度を増大させるのに十分な量で請求項１から２３に記載のポリペプチドのうちのいずれか１種のうちの１種または複数種を該被験体に投与することを含む方法。
  25. 前記被験体が骨減少に関連した状態を有する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記状態が、骨粗鬆症である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記状態が、パジェット病または関節リウマチである、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記状態が、歯周疾患、骨折、骨欠損、転移性骨疾患、変形性関節症、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進症、または溶骨性骨疾患である、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記歯周疾患が、歯肉炎または歯周炎である、請求項２８に記載の方法。
  30. 投与後に、組成物が、骨量密度、全骨面、骨面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、および全骨量からなる群から選択される骨パラメータを改善する、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 骨量密度、全骨面、骨面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、または全骨量の骨パラメータのうちのいずれか１つにおける改善について前記被験体を監視することをさらに含む、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 骨成長を促進し、または骨吸収を阻害する少なくとも１種の追加の治療剤を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 筋肉量または筋力を増大させることをを必要とする被験体における筋肉量または筋力を増大させるための方法であって、該被験体における筋肉量または筋力を増大させるのに十分な量で請求項１から２３に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を該被験体に投与することを含む方法。
  34. 前記被験体が、筋肉消耗障害を有する、請求項３３に記載の方法。
  35. 筋肉消耗障害または筋萎縮を有する被験体を処置するための方法であって、該筋肉消耗障害または筋萎縮を処置するのに十分な量で請求項１から２３に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を該被験体に投与することを含む方法。
  36. 前記筋肉消耗状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、複数の型の肢帯型ＭＤ（ＬＧＭＤ）、他の先天型ＭＤ（ＣＭＤ）、筋肉減少症、がん悪液質、または糖尿病であり、またはそれに関連する、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 被験体における筋骨格障害を処置するための方法であって、該筋骨格障害を処置するのに十分な量で請求項１から２３に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を該被験体に投与することを含む方法。
  38. 前記筋骨格障害が、悪性腫瘍、内分泌障害、関節炎、不動性、または廃用性に起因する（ｉ）骨粗鬆症、（ｉｉ）オステオペニア、（ｉｉｉ）筋肉減少症、（ｉｖ）関節炎、（ｖ）組織萎縮、（ｖｉ）歯周疾患、（ｖｉｉ）創傷治癒、または（ｖｉｉｉ）骨減少である、請求項３７に記載の方法。
  39. 代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、該代謝障害を処置するのに十分な量で請求項１から２３に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を該被験体に投与することを含む方法。
  40. 前記代謝障害が、２型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、および肥満である、請求項３９に記載の方法。
  41. がんを有する被験体を処置するための方法であって、該がんを処置するのに十分な量で請求項１から２３に記載のポリペプチドのうちのいずれかの１種または複数種を該被験体に投与することを含む方法。
  42. 前記がんが、アクチビンＡまたはアクチビンＢの１種または複数種の受容体を発現するがん細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記がん細胞の増殖および生存能のうちの一方または両方が、アクチビンＡまたはアクチビンＢによって正に調節される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記がんが、肺がん、乳がん、結腸がん、膵がん、腎がん、胃がん、肝がん、骨がん、血液がん、神経組織がん、黒色腫、甲状腺がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膣がん、または膀胱がんである、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ポリペプチドが、前記被験体に静脈内投与される、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ポリペプチドが、前記被験体に皮下投与される、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記被験体がヒトである、請求項２４から４６のいずれか一項に記載の方法。
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