BR112020015999A2 - Kir3dl3 como um receptor de hhla2, anticorpos anti-hhla2 e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

a presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que ligam especificamente a hhla2, bem como imunoglobulinas, polipeptídeos, ácidos nucleicos dos mesmos e métodos de uso desses anticorpos para diagnóstico, prognóstico e fins terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "KIR3DL3 COMO UM RECEPTOR DE HHLA2, ANTICORPOS ANTI-HHLA2 E USOS DOS MESMOS". Declaração de Direitos

[001] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o núme- ro de concessão P01 AI056299 concedido pelo The National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos sobre a invenção. Antecedentes da Invenção

[002] Pontos de verificação imunes, como CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, receptores da família KIR, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRPalpha (CD47), CD48, 2B4 (CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, butirofilinas e A2aR, e muitos mais, regulam negativamente a progressão da resposta imune com base em interações complexas e combinatórias entre numerosas entradas. Os inibidores de pontos de verificação imunes podem modular as respos- tas imunes em alguns indivíduos, mas a expressão de pontos de veri- ficação imunes e as interações com parceiros de ligação naturais vari- am entre os indivíduos e dentro dos tecidos de um indivíduo. Conse- quentemente, existe uma grande necessidade na técnica de identificar novos pontos de verificação imunes para uso em intervenções. HHLA2 é um membro da família B7 recentemente identificado que modula as funções das células T. HHLA2 foi identificada como um ligante especí- fico para TMIGD2 e a interação HHLA2/TMIGD2 seletivamente coes- timula o crescimento de células T humanas e a produção de citocinas através de uma cascata de sinalização dependente de AKT (Zhu et al. (2013) Nat. Comm. 4:2043; Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2359–2366). Um segundo receptor não caracterizado para HHLA2 em células T ativadas que exerce uma função coinibitória foi sugerido por vários estudos (Zhao et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

110:9879–9884; Xiao and Freeman et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201–2203; Wang et al. (2014) J. Immunol. 192:126.11).HHLA2 é expressa em uma variedade de cânceres humanos e sua função coi- nibitória o torna candidato à imunoterapia contra o câncer. Sumário da Invenção

[003] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que a HHLA2, um membro da família do gene B7, é amplamente expresso em uma variedade de tumores e células apre- sentadoras de antígenos e foi implicado como um ligante ativador e inibitório para as células T. O TMIGD2 expresso em células T ingênuas é um receptor ativador de HHLA2 e transduz sinais coestimulatórios após o envolvimento do receptor de antígeno das células T (TCR). TMIGD2 é infrarregulado após estimulação TCR repetida. É possível que um receptor inibitório putativo para HHLA2 seja suprarregulado nas células T ativadas para modular a ativação das células T. A pre- sente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que HHLA2 se liga a KIR3DL3, um receptor em células T e NK, e uma consequência da interação HHLA2:KIR3DL3 é a inibição da ativação de células T. Com base nas observações de que a HHLA2 é altamente expressa em tumores e pode servir como um ligante de ponto de veri- ficação, um painel de anticorpos monoclonais humanos anti-HHLA2 (mAbs) foi gerado como candidatos a agentes inibidores de ponto de verificação imune. mAbs anti-HHLA2 bloqueadores e não bloqueado- res foram identificados avaliando ligação de HHLA2-mIgG2a humana solúvel a células leucêmicas pré-B de camundongo 300.19 transfecta- das com TMIGD2 ou a células leucêmicas pré-B de camundongo

300.19 transfectadas com KIR3DL3. mAbs anti-HHLA2 que bloqueiam ligação de HHLA2 a ambos TMIGD2 e KIR3DL3 ou mais seletivamente bloqueiam KIR3DL3, mas não TMIGD2, mostraram ser anticorpos ini- bidores de ponto de verificação em ensaios de células T.

[004] Em um aspecto, um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclonal com- preende a) uma sequência de cadeia pesada com pelo menos cerca de 95% de identidade a uma sequência de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em sequências listadas na Tabela 2 ; e/ou b) uma sequência de cadeia leve com pelo menos cerca de 95% de iden- tidade com uma sequência de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências listadas na Tabela 2 é fornecida.

[005] Em outro aspecto, um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclonal compreende a) uma sequência de CDR da cadeia pesada com pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de CDR da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em sequências lis- tadas na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de CDR da cadeia leve com pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de CDR da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências lis- tadas na Tabela 2, é fornecida.

[006] Em ainda outro aspecto, um anticorpo monoclonal, ou fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo mono- clonal compreende a) uma sequência de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em sequências listadas na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências listadas na Tabela 2 é fornecida.

[007] Em ainda outro aspecto, um anticorpo monoclonal, ou fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo mono- clonal compreende a) uma sequência de CDR da cadeia pesada sele- cionada do grupo que consiste em sequências listadas na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de CDR da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências listadas na Tabela 2 é fornecida.

[008] São ainda fornecidas numerosas modalidades que podem ser aplicadas a qualquer aspecto da presente invenção descrito neste documento. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo monoclo- nal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é quimérico, hu- manizado, compósito, murino ou humano. Em outra modalidade, o an- ticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é marcado de forma detectável, compreende um domínio efetor, com- preende um domínio Fc e/ou é selecionado do grupo que consiste em Fv, Fav, F(ab’)2), Fab’, dsFv, scFv, sc(Fv)2 e fragmentos de diacorpos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, inibe a) a ligação de HHLA2 a TMIGD2, b) a ligação de HHLA2 a KIR3DL3, ou c) a ligação de HHLA2 a TMIGD2 e a ligação de HHLA2 a KIR3DL3.Os mAbs HHLA2 que bloqueiam a ligação de HHLA2 a KIR3DL3 em ensaios de ativação de células T mostraram ser bloqueadores do ponto de verificação. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, liga-se especificamente à HHLA2.

[009] Em outro aspecto, é fornecida uma cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em sequências de cadeia pesada e leve de imunoglobulina listadas na Tabela 2.

[0010] Em ainda outro aspecto, uma molécula de ácido nucleico isolada que hibrida, sob condições rigorosas, com o complemento de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em sequências de polipeptídeos listadas na Tabela 2 ou uma sequência com pelo menos cerca de 95% de homologia para um ácido nucleico codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em sequências de polipeptídeos listadas na Tabela 2 é forne- cida.

[0011] Ainda em outro aspecto, é fornecido um vetor compreen- dendo o ácido nucleico isolado descrito neste documento.

[0012] Em outro aspecto, é fornecida uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico isolado descrito neste documento, com- preende o vetor descrito neste documento, expressa o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documen- to.

[0013] Em ainda outro aspecto, um dispositivo ou kit compreen- dendo pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, o dispositivo ou kit opcionalmente compreendendo um marcador para detectar pelo me- nos um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um complexo compreendendo o anticorpo monoclonal,ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é fornecido.

[0014] Em ainda outro aspecto, um método para produzir pelo me- nos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, cujo método compreende as eta- pas de: (i) cultivar uma célula hospedeira transformada que foi trans- formada por um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica pelo menos um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 sob condições adequadas para permitir a expressão do referido anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e (ii) recuperar o anticorpo monoclonal ex- presso, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é fornecido.

[0015] Em outro aspecto, um método para detectar a presença ou o nível de um polipeptídeo de HHLA2 compreendendo obter uma amostra e detectar o referido polipeptídeo na amostra por uso de pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, aqui descrito.

[0016] Como descrito acima, certas modalidades são aplicáveis a qualquer método aqui descrito. Por exemplo, em uma modalidade, o pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo, forma um complexo com um polipeptídeo de HHLA2 e o complexo é detectado na forma de um ensaio imunossorvente li- gado a enzima (ELISA), ensaio radioimune (RIA), imunoquimicamente, Western blot ou usando um ensaio de fluxo intracelular.

[0017] Em outro aspecto, um método para monitorar a progressão de um distúrbio associado à expressão aberrante de HHLA2 em um indivíduo, o método compreendendo a) detectar em uma amostra de indivíduo em um primeiro ponto no tempo o nível de HHLA2 usando pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo, descrito neste documento; b) repetir a etapa a) em um ponto subsequente no tempo; e c) comparar o nível de HHLA2 de- tectado nas etapas a) e b) para monitorar a progressão do distúrbio no indivíduo, é fornecido.

[0018] Como descrito acima, certas modalidades são aplicáveis a qualquer método aqui descrito. Por exemplo, em uma modalidade, en- tre o primeiro ponto no tempo e o ponto subsequente no tempo, o indi- víduo foi submetido a um tratamento para melhorar o distúrbio.

[0019] Em outro aspecto, um método para predizer o resultado clí- nico de um indivíduo que sofre de um distúrbio associado à expressão aberrante de HHLA2, o método compreendendo a) determinar o nível de HHLA2 em uma amostra de indivíduo usando pelo menos um anti- corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo b) determinar o nível de HHLA2 em uma amostra de um indivíduo de controle com um bom resultado clínico usando pelo menos um anti- corpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e c) comparar o nível de HHLA2 na amostra do indivíduo e na amostra do indivíduo de controle; em que um nível significativamente mais alto de HHLA2 na amostra do indivíduo em comparação com o nível na amostra do indivíduo de controle é uma indicação de que o indivíduo tem um mau resultado clínico é fornecido.

[0020] Em ainda outro aspecto, um método para avaliar a eficácia de uma terapia para um distúrbio associado à expressão aberrante de HHLA2 em um indivíduo, o método compreendendo a) determinar o nível de HHLA2 usando pelo menos um anticorpo monoclonal ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo, aqui descrito, em uma pri- meira amostra obtida do indivíduo antes de fornecer pelo menos uma porção da terapia ao indivíduo e b) determinar o nível de HHLA2 em uma segunda amostra obtida do indivíduo após a provisão da porção da terapia, em que um nível significativamente mais baixo de HHLA2 na segunda amostra, em relação à primeira amostra, é uma indicação de que a terapia é eficaz para inibir o distúrbio no indivíduo, é forneci- do.

[0021] Em ainda outro aspecto, um método para avaliar a eficácia de um composto de teste para inibir um distúrbio associado à expres- são aberrante de HHLA2 em um indivíduo, o método compreendendo a) determinar o nível de HHLA2 usando pelo menos um anticorpo mo- noclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito nes- te documento, em uma primeira amostra obtida do indivíduo e exposta ao composto de teste; e b) determinar o nível de HHLA2 em uma se- gunda amostra obtida do indivíduo, em que a segunda amostra não é exposta ao composto de teste e um nível significativamente mais baixo de HHLA2, em relação à segunda amostra, é uma indicação de que o composto de teste é eficaz para inibir o distúrbio no indivíduo, é forne- cido.

[0022] Como descrito acima, certas modalidades são aplicáveis a qualquer método aqui descrito. Por exemplo, em uma modalidade, a primeira e a segunda amostras são porções de uma única amostra ob- tida do indivíduo ou porções de amostras reunidas obtidas do indiví- duo. Em outra modalidade, o distúrbio é um câncer. Em ainda outra modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, leuce-

mia mieloide aguda, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de fíga- do, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer uterino, gliomas, glioblastoma, neuroblastoma, câncer de mama, carcinoma ductal pan- creático, timoma, B-CLL, leucemia, linfoma de célula B e um câncer infiltrado com células imunes expressando um receptor para HHLA2.Em outra modalidade, a amostra compreende células, soro, tecido peritumoral e/ou tecido intratumoral obtido do indivíduo. Em ain- da outra modalidade, o nível significativamente mais alto de HHLA2 compreende um aumento de pelo menos vinte por cento entre o nível de HHLA2 na amostra do indivíduo em relação ao nível normal de HHLA2 na amostra do indivíduo de controle. Em outra modalidade, o nível significativamente mais baixo de HHLA2 compreende uma dimi- nuição de pelo menos vinte por cento do nível de HHLA2. Em ainda outra modalidade, o indivíduo é um ser humano.

[0023] Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de trata- mento de um indivíduo que sofre de câncer, compreendendo adminis- trar ao indivíduo de pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, aqui descrito.

[0024] Como descrito acima, certas modalidades são aplicáveis a qualquer método aqui descrito. Por exemplo, em uma modalidade, pe- lo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, é conjugado a um agente citotóxico. Em outra moda- lidade, o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste em um agente quimioterápico, um agente biológico, uma toxina e um isótopo radioativo. Em ainda outra modalidade, pelo menos um anticorpo mo- noclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, reduz o número de células em proliferação no câncer e/ou reduz o volume ou tamanho de um tumor do câncer. Em outra modalidade, pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é administrado em uma formulação farmaceuticamente acei-

tável. Em ainda outra modalidade, o método descrito neste documento compreende ainda administrar ao indivíduo um agente terapêutico ou regime para o tratamento do câncer. Em ainda outra modalidade, o método descrito neste documento compreende ainda administrar ao indivíduo de uma terapia adicional selecionada do grupo que consiste em imunoterapia, bloqueio de ponto de verificação, vacinas contra o câncer, receptores de antígenos quiméricos, quimioterapia, radiação, terapia alvo e cirurgia. Em outra modalidade, as células cancerígenas e/ou células de infiltração imunológica tumoral no indivíduo expressam HHLA2. Em ainda outra modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de próstata, cân- cer uterino, gliomas, glioblastoma, neuroblastoma, câncer de mama, carcinoma ductal pancreático, timoma, B-CLL, leucemia, linfoma de célula B e um câncer infiltrado com células imunes expressando um receptor para HHLA2. Em outra modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda (LMA), carci- noma de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de próstata e câncer uterino. Em ainda outra modalidade, o indivíduo é um modelo animal de câncer. Em ainda outra modalidade, o modelo animal é um modelo de camundongo, opcionalmente em que o modelo de camundongo é um modelo de camundongo humanizado. Em outra modalidade, o indivíduo é um mamífero. Em ainda outra modalidade, o mamífero é um camundongo humanizado ou um humano. Em ainda outra modalidade, o mamífero é um humano.

[0025] Em outro aspecto, é fornecido um método de modulação de uma resposta imune pela inibição da interação entre HHLA2 e seu re- ceptor inibidor de ligação, KIRDL3.

[0026] Em ainda outro aspecto, um método para modular uma resposta imune inibindo seletivamente a interação entre HHLA2 e seu receptor de inibidor de ligação, KIR3DL3, sem bloquear ou inibir signi- ficativamente a interação entre HHLA2 e seu receptor estimulador de ligação, TMIGD2, é fornecido.

[0027] Como descrito acima, certas modalidades são aplicáveis a qualquer método aqui descrito. Por exemplo, em uma modalidade, a interação entre HHLA2 e KIRDL3 é bloqueada para uso em imunote- rapia de câncer de bloqueio de ponto de verificação imune. Em outra modalidade, a interação entre HHLA2 e KIRDL3 é inibida ou bloquea- da usando um anticorpo anti-HHLA2. Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-HHLA2 é um inibidor de ponto de verificação da ativação de células T para imunoterapia contra o câncer.

[0028] Para qualquer figura que mostre um histograma de barra, curva ou outros dados associados a uma legenda, as barras, a curva ou outros dados apresentados da esquerda para a direita para cada indicação correspondem diretamente e em ordem às caixas de cima para baixo ou da esquerda à direita, da legenda. Breve descrição das figuras

[0029] Figura 1A mostra os dados de afinidade de ligação para a linhagem de células leucêmicas de células pré-B de camundongo

300.19 transfectadas com mAbson HHLA2 anti-HHLA2 por citometria de fluxo

[0030] Figura 1B mostra o bloqueio do mAb anti-HHLA2 da liga- ção de TMIGD2-IgG humana à linhagem de células leucêmicas de cé- lulas pré-B de camundongo 300.19 transfectadas com HHLA2 por ci- tometria de fluxo

[0031] Figura 2 mostra dados de Western blot de proteína de nove linhagens de células tumorais humanas sondadas com mAb 8D2 anti- HHLA2 (mAb IHC).

[0032] Figura 3 mostra a expressão de mRNA de HHLA2 em comparação com outros inibidores de ponto de verificação imune em rim normal versus carcinoma renal de células claras (ccRCC).

[0033] Figura 4 mostra a expressão de HHLA2 em vários cânce- res do banco de dados TCGA.

[0034] Figura 5A mostra resultados de imuno-histoquímica HHLA2 (IHC) em células de controle negativo (300.19), células 300.19 trans- fectadas com HHLA-2 (controle positivo), células OC1-Ly1 (tumor ne- gativo) e células HDLM2 (linhagem de células de linfoma de Hodgkon positiva) de controle HHLA2.

[0035] Figura 5B mostra a expressão de HHLA2 no rim normal.

[0036] Figura 5C mostra uma imagem representativa da expres- são de HHLA2 em um ccRCC de um microarranjo (TMA).

[0037] Figura 5D mostra uma imagem representativa da falta de expressão de HHLA2 em um ccRCC diferente de um microarranjo tu- moral (TMA).

[0038] Figura 6Amostra os resultados da triagem de um conjunto representativo de ~ 300 clones de membrana plasmática em duplicata, bem como uma triagem de confirmação mostrando ligação de HHLA2 a KIR3DL3. Um total de 5682 clones de membrana de receptor de su- perfície celular foram selecionados

[0039] Figura 6B mostra a ligação seletiva de HHLA2 a KIR3DL3

[0040] Figura 6C mostra a ID do gene e informações de acesso NCBI para biomarcadores relevantes.

[0041] Figura 7 mostra um esquema de um ensaio do gene do receptor Jurkat NFAT.

[0042] Figura 8 mostra um modelo de célula CAR-T.

[0043] Figura 9 mostra os membros da família B7 inibitórios que podem ser expressos por tumores.

[0044] Figura 10 mostra um modelo para a interação de HHLA2 com dois receptores (receptores estimulatórios e inibitórios de HHLA2) para regular as funções das células T. Concomitante à sinalização do receptor de células T (TCR), o TMIGD2 em células T ingênuas intera- ge com HHLA2 em APCs e coestimula a proliferação de células T e a produção de citocinas por uma via que envolve a fosforilação de AKT. Com a ativação repetitiva das células T, a expressão do receptor esti- mulador TMIGD2 é gradualmente perdida, permitindo que a expressão do receptor inibidor KIR3DL3 se torne dominante. HHLA2 em células APCs ou tumorais pode interagir com este segundo receptor e exercer uma função coinibitória. Esta figura foi adaptada de Xiao e Freeman et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201–2203.

[0045] Figura 11 mostra estratificação de paciente HHLA2 + ve (isto é, tecidos de câncer de pulmão que expressam HHLA2 com base em coloração imuno-histoquímica (IHC) com um mAb HHLA2) em câncer de pulmão de células não pequenas. A porcentagem da ex- pressão de HHLA2 em cânceres de pulmão de células não pequenas PD-L1 positivos e negativos foi calculada com base no estudo de imu- nocoloração de HHLA2 e PD-L1 (Cheng et al. (2018) Clin. Cancer Res. 24:1954-1964).

[0046] Figuras 12A e 12B mostram a expressão de TMIGD2 (Fi- gura 12A) ou KIR3DL3 (Figura 12B) em células 293T transfectadas. O cDNA de TMIGD2 ou KIR3DL3 no vetor de expressão pEF-Puro foi transitoriamente transfectado em células 293T e corado 48-72 horas depois com (1) mAb TMIGD2 (R&D systemscatalog #MAB83162; clone #953743) seguido por F(ab)2-PE de IgG de cabra anticamundongo (R&D Systems CatlaogF0102B ou (2) mAb conjugado KIR3DL3-PE (R&D Systems catalog#FAB8919R; clone #1136B), respectivamente,e detectado por citometria de fluxo.

[0047] Figuras 12C e 12D mostram HHLA2-Fc que se liga a célu- las 293T transfectadas TMIGD2 (Figura 12C) ou KIR3DL3 (Figura

12D). A ligação de HHLA2-mIgG2a a células 293T transitoriamente transfectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3 foi detectada usando um anti- corpo de IgG2a de cabra anticamundongo Fab2marcado com PE (ab- sorvido para reatividade cruzada com Ig humana, Southern Biotech Catalog # 1082-09 ) por citometria de fluxo.

[0048] Figuras 13A e 13B mostram a ligação do mAb HHLA2 a HHLA2 humano e de macaco cynomolgus. Diferentes concentrações de mAbs HHLA2 foram incubadas com células pré-B 300.19 transfec- tadas com HHLA2 humana ou de macaco cynomolgus durante 30 mi- nutos a 4C. A ligação do mAb HHLA2 a células 300.19 transfectadas foi detectada com uma IgG de cabra anticamundongo marcada com PE (H+L) por citometria de fluxo.

[0049] Figura 14 mostra um esquema do ensaio de coestimulação de células T TMIGD2/HHLA2. As células do gene repórter de NFAT- luciferase de célula T TMIGD2 Jurkat foram estimuladas com células CHO transfectadas com scFV anti-CD3 ou scFV anti-CD3 + HHLA2.

[0050] Figura 15 mostra a expressão de HHLA2 em células CHO- anti-CD3 scFV. A expressão de HHLA2 em células CHO (clone #28) transfectadas com scFV + HHLA2 anti-CD3 foi detectada com mAb 6F10 HHLA2 conjugado com PE por citometria de fluxo.

[0051] Figura 16 mostra a expressão de TMIGD2 em células re- pórter Jurkat NFAT. A expressão de TMIGD2 em células repórter Jur- kat NFAT transfectadas com TMIGD2 (clone #62) é mostrada.

[0052] Figura 17 mostra o bloqueio do mAb HHLA2 da coestimu- lação de células T mediada por TMIGD2. As células HHLA2-TCR-CHO foram semeadas a 2 x 104 células/densidade de poço em meio de crescimento CHOK1 em uma placa de 96 poços de fundo branco opa- co. Células fixadas à placa durante a noite a 37°C com 5% de CO 2. No dia seguinte, o meio foi cuidadosamente removido de cada poço, o anticorpo anti HHLA2 em 50 µl de meio de células Jurkat foi adiciona-

do e as células HHLA2-TCR-CHO foram incubadas por uma hora an- tes da adição da linhagem celular repórter MIGD2NFATJurkat a 4-5 x 104 células/poço em 50 µl de meio de células Jurkat. O poço da placa foi misturado e incubado durante aproximadamente 3-6 horas. Para desenvolver o sinal de luciferase, 100 µl do ONE-Step™ Luciferase Assay System (BPS Bioscience, Cat. #60690) foram adicionados a ca- da poço, de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. A luminescência foi lida com um luminômetro.

[0053] Figura 18 mostra um esquema do ensaio de células T do ponto de verificação KIR3DL3/HHLA2. As células do gene repórter de luciferase de promotor de IL-2 de célula T KIR3DL3 Jurkat foram esti- muladas com células CHO transfectadas com scFV anti-CD3 ou scFV anti-CD3 + HHLA2.

[0054] Figura 19 mostra a expressão de KIR3DL3 em clones re- pórter Jurkat-IL-2. A expressão de KIR3DL3 foi detectada em clones de células repórter Jurkat IL-2 transfectadas com KIR3DL3 1-6, 1-7 e 2-12.

[0055] Figuras 20A-20Cmostram o bloqueio do ponto de verifica- ção do mAb HHLA2 da inibição de células T mediada por KIR3DL3. As células HHLA2-TCR-CHO foram semeadas a 2 x 104 célu- las/densidade de poço em meio de crescimento CHOK1 em uma placa de 96 poços de fundo branco opaco. Células fixadas à placa durante a noite a 37°C com 5% de CO2. No dia seguinte, o meio foi cuidadosa- mente removido de cada poço, anticorpo anti HHLA2 em 50 µl de meio de células Jurkat foi adicionado, e células HHLA2-TCR-CHO foram incubadas por uma hora antes da adição da linhagem celular repórter KIR3DL3_IL2_Jurkat em 4-5 x 104 células/poço em 50 µl de meio de células Jurkat, mais 2 µg/mL de anticorpo anti-CD28 (BPS Bioscience #100186) (concentração final de 1 μg/mL em 100 μL de mistura de en- saio por poço. O poço da placa foi misturado e incubado durante apro-

ximadamente 5 horas. Para desenvolver o sinal de luciferase, 100 µl do ONE-Step™ Luciferase Assay System (BPS Bioscience, Cat. #60690) foram adicionados a cada poço, de acordo com o protocolo recomendado. A luminescência foi lida com um luminômetro.

[0056] Figuras 21A-21C mostrama titulação do mAb HHLA2 no ensaio de inibição de Jurkat KIR3DL3. Diferentes concentrações de mAbs HHLA2 2C4 e 6F10 foram avaliadas no ensaio de luciferase re- pórter Jurkat IL-2 usando os clones de luciferase Jurkat IL-2 1-6, 1-7 e 2-12.

[0057] Figura 22 mostra que o mAb 2C4 de HHLA2 seletivo para KIR3DL3 não bloqueia a coestimulação mediada por TMIGD2. O mAb 2C4 de HHLA2 a uma concentração de 30 µg/ml foi avaliado em célu- las repórter NFAT parentais de Jurkat. As células HHLA2-TCR-CHO foram semeadas a 2 x 104 células/densidade de poço em meio de crescimento CHOK1 em uma placa de 96 poços de fundo branco opa- co. Células fixadas à placa durante a noite a 37°C com 5% de CO 2. No dia seguinte, o meio foi cuidadosamente removido de cada poço, o anticorpo anti HHLA2 em 50 µl de meio de células Jurkat foi adiciona- do e as células HHLA2-TCR-CHO foram incubadas por uma hora an- tes da adição da linhagem de células repórter Jurkat paren- tal_NFAT_Jurkat a 4-5 x 104 células/poço em 50 µl de meio de células Jurkat. O poço da placa foi misturado e incubado durante aproxima- damente 3-6 horas. Para desenvolver o sinal de luciferase, 100 µl do ONE-Step™ Luciferase Assay System (BPS Bioscience, Cat. #60690) foram adicionados a cada poço, de acordo com o protocolo recomen- dado. A luminescência foi lida usando um luminômetro.

[0058] Figuras 23A-23C mostram como os mAbs HHLA2 em mo- delo de tumor de camundongo SRG-15 humanizado (tem células T e NK) podem ser avaliados. Os mAbs HHLA2 são administrados a ca- mundongos SRG-15 humanizados com células tumorais que expres-

sam HHLA2 e a inibição do crescimento tumoral é avaliada. As figuras são adaptadas de Herndler-Brandstetter D et al. (2017) 114:E9626- E9634.

[0059] Figuras 24A e 24B mostram como os mAbs HHLA2 em modelo de célula T de macaco cynomolgus podem ser avaliados. Ma- cacos Cynomolgus são administrados com mAbs HHLA2 e são imuni- zados com KLH, e são avaliados anticorpos dependentes de células T e respostas mediadas por células. A citotoxicidade de NK é avaliada ex vivo. Descrição Detalhada da Invenção

[0060] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que a HHLA2, um membro da família do gene B7, é amplamente expressa em uma variedade de tumores e células apre- sentadoras de antígenos e foi implicado como um ligante ativador e inibitório para as células T. O TMIGD2 expresso em células T ingênuas é um receptor ativador de HHLA2 e transduz sinais coestimulatórios após o envolvimento do receptor de antígeno das células T (TCR). TMIGD2 é infrarregulado após estimulação TCR repetida. Com base nas observações de que a HHLA2 é altamente expressa em tumores e pode servir como um ligante de ponto de verificação, um painel de an- ticorpos monoclonais humanos anti-HHLA2 (mAbs) foi gerado como candidatos a terapêuticos inibidores de ponto de verificação imune. Dado que os mesmos domínios de ligação de ligante dos membros da família B7 B7-1 e B7-2 são conhecidos por se ligarem a receptores ativadores e inibitórios (por exemplo, CD28 e CTLA-4), acredita-se que os anticorpos monoclonais anti-HHLA2 que bloqueiam a ligação TMIGD2 servem como bons candidatos para bloquear a ligação ao seu receptor inibitório putativo. Avaliando a ligação de hHHLA2- mIgG2a solúvel a células leucêmicas pré-B 300.19 de camundongo transfectadas com TMIGD2, ambos os mAbs anti-HHLA2 bloqueado-

res e não bloqueadores foram identificados. mAbs anti-HHLA2 listados na Tabela 2 (por exemplo, 6F10, 4D1,4E5 e 2G2) que bloquearam a ligação de TMIGD2 e também ligaram células 300.19 transfectadas com HHLA2 com afinidades de ligação EC50 relativas de 0,25, 0,44 e 0,21 ug/ml (faixa nanomolar), respectivamente. Os anticorpos não blo- queadores listados na Tabela 2 (por exemplo, 1C8 e 6D10) ligaram-se à HHLA2 com afinidades de ligação relativas de 0,63 e 22,49 ug/ml, respectivamente. As sequências de genes das cadeias pesada e leve da região variável para estes candidatos a anticorpos terapêuticos an- ti-HHLA2 são aqui descritas.

[0061] Os mAbs anti-HHLA2 1C8 e 6D10 foram identificados como bons para imuno-histoquímica fixada em formalina e embebida em pa- rafina ou reagentes de Western blotting. HHLA2 em tumores primários do banco de dados TCGA mostra alta expressão em câncer de pul- mão, renal, pancreático e colorretal e em AML e níveis intermediários em câncer de cabeça e pescoço, fígado, ovário, próstata e útero. A expressão do mRNA de HHLA2 no câncer é maior do que nos tecidos normais correspondentes.

[0062] A triagem de uma biblioteca de proteínas plasmáticas hu- manas expressa em superfície celular de > 4500 clones completos, cobrindo mais de 3.500 proteínas da membrana plasmática diferentes, com HHLA2-mIgG2a humano solúvel identificou KIR3DL3 (receptor tipo imunoglobulina de células assassinas, três domínios, cauda cito- plasmática longa, 3) como um novo receptor para HHLA2. A cauda citoplasmática de KIR3DL3 contém um motivo ITIM composto pela se- quência "VTYAQL" indicando um receptor inibitório para HHLA2 que pode servir como um receptor alvo de ponto de verificação imune para imunoterapia contra o câncer. A seletividade de ligação de HHLA2 a KIR3DL3 foi demonstrada porque nenhuma ligação contra outros re- ceptores de KIRs foi observada usando um painel de 14 receptores de

KIR (isto é, KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DS1, e KIR3DS1).

[0063] Uma vez que a HHLA2 é expressa em níveis elevados em vários tipos de tumores, a terapêutica do inibidor do ponto de verifica- ção do mAb anti-HHLA2 pode aumentar o pool de pacientes que res- pondem ao tratamento com o inibidor do ponto de verificação. Além disso, pacientes que desenvolvem resistência à terapia com PD-1 po- dem expressar HHLA2 como uma estratégia alternativa de evasão imune e o bloqueio de HHLA2 pode oferecer uma via para superar a resistência à imunoterapia com PD-1.

[0064] Consequentemente, a presente invenção fornece anticor- pos monoclonais e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que ligam especificamente a HHLA2, bem como imunoglobulinas, poli- peptídeos, ácidos nucleicos dos mesmos e métodos de uso desses anticorpos para fins diagnósticos, prognósticos e terapêuticos. I.Definições

[0065] Os artigos "um" e "uma" são usado para ser referir a um ou mais do que um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do arti- go. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

[0066] O termo "quantidade alterada" de um marcador refere-se ao aumento ou diminuição do número de cópias de um marcador e/ou aumento ou diminuição do nível de ácido nucleico de um determinado gene marcador ou genes em uma amostra, em comparação com aquele do marcador em uma amostra de controle. O termo "quantida- de alterada" de um marcador também inclui um nível de proteína au- mentado ou diminuído de um marcador em uma amostra, em compa- ração com o nível de proteína do marcador em uma amostra de con- trole normal.

[0067] O termo "atividade alterada" de um marcador se refere a uma atividade de um marcador que é aumentada ou diminuída em um estado de doença, por exemplo, em uma amostra biológica, em com- paração com a atividade do marcador em uma amostra de controle normal. A atividade alterada de um marcador pode ser o resultado de, por exemplo, expressão alterada do marcador, nível de proteína alte- rado do marcador, estrutura alterada do marcador ou, por exemplo, uma interação alterada com outras proteínas envolvidas na mesma via ou em diferentes vias como o marcador, ou interação alterada com ati- vadores ou inibidores da transcrição.

[0068] O termo "estrutura alterada" de um marcador se refere à presença de mutações ou variantes alélicas dentro do gene marcador ou proteína marcadora, por exemplo, mutações que afetam a expres- são ou atividade do marcador, em comparação com o gene ou proteí- na normal ou de tipo selvagem. Por exemplo, as mutações incluem, mas não estão limitadas a substituições, deleções ou mutações de adição. As mutações podem estar presentes na região codificadora ou não codificadora do marcador.

[0069] O termo "receptor de ativação" inclui receptores de células imunes que se ligam a antígenos, antígenos complexados (por exem- plo, no contexto de polipeptídeos de MHC) ou que se ligam a anticor- pos. Esses receptores ativadores incluem receptores de células T (TCR), receptores de células B (BCR), receptores de citocinas, recep- tores LPS, receptores de complemento e receptores Fc.

[0070] Os receptores de células T estão presentes nas células T e estão associados a polipeptídeos CD3. Os receptores de células T são estimulados por antígenos no contexto de polipeptídeos MHC (bem como por reagentes de ativação de células T policlonais). A ativação de células T por meio de TCR resulta em inúmeras alterações, por exemplo, fosforilação de proteínas, alterações de lipídeos de membra-

na, fluxos de íons, alterações de nucleotídeos cíclicos, alterações de transcrição de RNA, alterações de síntese de proteínas e alterações de volume celular.

[0071] O termo "receptor de antígeno quimérico" ou "CAR" refere- se a receptores de células T engenheiradas (TCR) com uma especifi- cidade de antígeno desejada. Os linfócitos T reconhecem antígenos específicos por meio da interação do receptor de células T (TCR) com peptídeos curtos apresentados por moléculas de classe I ou II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Para ativação inici- al e expansão clonal, as células T ingênuas são dependentes de célu- las apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) que fornecem sinais coestimulatórios adicionais. A ativação do TCR na ausência de coestimulação pode resultar em falta de resposta e anergia clonal. Pa- ra contornar a imunização, foram desenvolvidas diferentes abordagens para a derivação de células efetoras citotóxicas com especificidade de reconhecimento enxertada. CARs foram construídos que consistem em domínios de ligação derivados de ligandos naturais ou anticorpos específicos para componentes de superfície celular do complexo CD3 associado a TCR. Após a ligação do antígeno, tais receptores de antí- geno quiméricos se ligam às vias de sinalização endógena na célula efetora e geram sinais de ativação semelhantes aos iniciados pelo complexo TCR. Desde os primeiros relatórios sobre receptores de an- tígenos quiméricos, este conceito tem sido continuamente refinado e o projeto molecular dos receptores quiméricos foi otimizado e usa rotinei- ramente qualquer número de domínios de ligação bem conhecidos, como scFV, Fav e outros fragmentos de ligação de proteína aqui des- critos.

[0072] Geralmente, os CARs são um tipo de "terapia celular" (por exemplo, terapia com células T) contemplada para uso de acordo com a presente invenção. Embora numerosas modalidades representativas de agentes e métodos para modular a atividade de células imunes pe- la modulação da via HHLA2, como a modulação da interação entre HHLA2 e um parceiro de ligação natural de HHLA2, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, terapias e métodos baseados em células imunes tam- bém são englobados. Por exemplo, células T engenheiradas para ter knockout, knockdown ou expressão aumentada de TMIGD2 e/ou KIR3DL3 são contempladas. Da mesma forma, células imunes ou ou- tras células engenheiradas para ter um knockout, knockdown ou ex- pressão aumentada de um ligante HHLA2, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, também são contempladas.

[0073] Os receptores de células B estão presentes nas células B. Os receptores de antígenos de células B são um complexo entre a Ig de membrana (mIg) e outros polipeptídeos transmembranares (por exemplo, Igα e Igβ). A função de transdução de sinal de mIg é desen- cadeada pela reticulação de polipeptídeos receptores por antígenos oligoméricos ou multiméricos. As células B também podem ser ativa- das por anticorpos anti-imunoglobulina. Após a ativação do BCR, ocor- rem numerosas alterações nas células B, incluindo a fosforilação da tirosina.

[0074] Os receptores Fc são encontrados em muitas células que participam das respostas imunes. Os receptores Fc (FcRs) são recep- tores da superfície celular da porção Fc dos polipeptídeos de imuno- globulina (Igs). Entre os FcRs humanos que foram identificados até agora estão aqueles que reconhecem IgG (designado FcγR), IgE (FcԑR1), IgA (Fcα) e IgM/A polimerizado (FcµαR). Os FcRs são encon- trados nos seguintes tipos de células: FcԑRI (mastócitos), FcԑR.II (mui- tos leucócitos), FcαR (neutrófilos) e FcµαR (epitélio glandular, hepató- citos) (Hogg, N . (1988) Immunol. Today 9:185-86). Os FcγRs ampla- mente estudados são centrais nas defesas imunes celulares e são responsáveis por estimular a liberação de mediadores de inflamação e enzimas hidrolíticas envolvidas na patogênese de doenças autoimunes (Unkeless, JC et al. (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:251-81). Os FcγRs fornecem uma ligação crucial entre as células efetoras e os linfócitos que secretam Ig, uma vez que os FcγRs de macrófagos/monócitos, leucócitos polimorfonucleares e células assassinas naturais (NK) con- ferem um elemento de reconhecimento específico mediado por IgG. Os leucócitos humanos têm pelo menos três receptores diferentes pa- ra IgG: h FcγRI (encontrado em monócitos/macrófagos), hFcγRII (em monócitos, neutrófilos, eosinófilos, plaquetas, possivelmente células B e a linhagem celular K562) e FcγIII (em células NK, neutrófilos, eosinó- filos e macrófagos).

[0075] Com relação às células T, a transmissão de um sinal coes- timulatório para uma célula T envolve uma via de sinalização que não é inibida pela ciclosporina A. Além disso, um sinal coestimulatório po- de induzir a secreção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IL-10) em uma célula T e/ou pode prevenir a indução de insensibilidade ao antí- geno, a indução de anergia ou a indução de morte celular (deleção) na célula T.

[0076] O termo "atividade", quando usado em relação a um poli- peptídeo, por exemplo, HHLA2 e/ou um parceiro de ligação natural de HHLA2, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, inclui atividades que são ine- rentes à estrutura da proteína. Por exemplo, no que diz respeito a um ligante de HHLA2, o termo "atividade" inclui a capacidade de modular a inibição da célula imune modulando um sinal inibitório em uma célula imune (por exemplo, envolvendo um receptor natural em uma célula imune). Os versados na técnica reconhecerão que quando uma forma de ativação do ligante e do polipeptídeo de HHLA2 se liga a um recep- tor inibidor, um sinal inibitório é gerado na célula imune.

[0077] O termo "sinal inibitório" refere-se a um sinal transmitido por meio de um receptor inibitório (por exemplo, HHLA2, KLRB1, CTLA4,

PD-1 e semelhantes) para um polipeptídeo em uma célula imune. Tal sinal antagoniza um sinal por meio de um receptor de ativação (por exemplo, por meio de um polipeptídeo TCR, CD3, BCR, TMIGD2 ou Fc) e pode resultar em, por exemplo, inibição da geração do segundo mensageiro; uma inibição da proliferação; uma inibição da função efe- tora na célula imune, por exemplo, redução da fagocitose, redução da produção de anticorpos, redução da citotoxicidade celular, falha da cé- lula imune em produzir mediadores (como citocinas (por exemplo, IL-2) e/ou mediadores de respostas alérgicas); ou o desenvolvimento de anergia.

[0078] A quantidade de um biomarcador em um indivíduo é "signi- ficativamente" maior ou menor do que a quantidade normal do biomar- cador, se a quantidade do biomarcador for maior ou menor, respecti- vamente, do que o nível normal ou de controle por uma quantidade maior do que o erro padrão do ensaio usado para avaliar a quantidade, e de preferência pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 350% , 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou do que essa quantidade. Alternativamente, a quantidade do biomarcador no indivíduo pode ser considerada "signifi- cativamente" maior ou menor do que a quantidade normal e/ou de con- trole se a quantidade for pelo menos cerca de dois, e de preferência pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% , 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185 %, 190%, 195%, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou mais, ou qualquer fai- xa entre, como 5% -100%, superior ou inferior, respectivamente, do que a quantidade normal e/ou controle do biomarcador. Tais valores de modulação significativos podem ser aplicados a qualquer métrica aqui descrita, tal como nível alterado de expressão, atividade alterada,

mudanças no crescimento hiperproliferativo de células cancerígenas, mudanças na morte de células cancerígenas, mudanças na inibição de biomarcadores, mudanças na ligação do agente de teste e semelhan- tes.

[0079] A "quantidade" de um marcador, por exemplo, expressão ou número de cópias de um marcador ou MCR, ou nível de proteína de um marcador, em um indivíduo é "significativamente" maior ou me- nor do que a quantidade normal de um marcador, se a quantidade de marcador for maior ou menor, respectivamente, do que o nível normal por uma quantidade maior do que o erro padrão do ensaio usado para avaliar a quantidade e, de preferência, pelo menos duas vezes, e mais preferencialmente três, quatro, cinco, dez ou mais vezes essa quanti- dade. Alternativamente, a quantidade do marcador no indivíduo pode ser considerada "significativamente" maior ou menor do que a quanti- dade normal se a quantidade for pelo menos cerca de duas, e de pre- ferência pelo menos cerca de três, quatro ou cinco vezes, maior ou menor, respectivamente, do que a quantidade normal do marcador.

[0080] O termo "nível alterado de expressão" de um marcador se refere a um nível de expressão ou número de cópias de um marcador em uma amostra de teste por exemplo, uma amostra derivada de um indivíduo que sofre de câncer, que é maior ou menor que o erro pa- drão do ensaio usada para avaliar a expressão ou número de cópias, e é de preferência pelo menos duas vezes, e mais preferencialmente três, quatro, cinco ou dez ou mais vezes o nível de expressão ou nú- mero de cópias do marcador ou região cromossômica em uma amos- tra de controle (por exemplo, amostra de um indivíduo saudável sem a doença associada) e, de preferência, o nível de expressão médio ou número de cópias do marcador ou região cromossômica em várias amostras de controle. O nível de expressão alterado é maior ou menor do que o erro padrão do ensaio usado para avaliar a expressão ou número de cópias e é de preferência pelo menos duas vezes, e mais preferencialmente três, quatro, cinco ou dez ou mais vezes o nível de expressão ou número de cópias do marcador em uma amostra de con- trole (por exemplo, amostra de um indivíduo saudável sem a doença associada) e, de preferência, o nível de expressão médio ou número de cópias do marcador em várias amostras de controle.

[0081] O termo "imunoterapia" refere-se a uma forma de terapia direcionada que pode compreender, por exemplo, o uso de vacinas contra o câncer e/ou células apresentadoras de antígenos sensibiliza- das. Por exemplo, um vírus oncolítico é um vírus capaz de infectar e lisar células cancerosas, deixando as células normais ilesas, tornando- as potencialmente úteis na terapia imunomodulatória. A replicação de vírus oncolíticos facilita a destruição das células tumorais e também produz amplificação da dose no local do tumor. Eles também podem atuar como vetores para genes anticâncer, permitindo que eles sejam especificamente entregues ao local do tumor. A imunoterapia pode en- volver imunidade passiva para proteção de curto prazo de um hospe- deiro, alcançada pela administração de anticorpo pré-formado dirigido contra um antígeno de câncer ou antígeno de doença (por exemplo, administração de um anticorpo monoclonal, opcionalmente ligado a um agente quimioterápico ou toxina, a um antígeno tumoral). A imunotera- pia também pode se concentrar no uso de epítopos citotóxicos reco- nhecidos por linfócitos de linhagens celulares de câncer. Alternativa- mente, polinucleotídeos antissenso, ribozimas, moléculas de interfe- rência de RNA, polinucleotídeos de hélice tripla e semelhantes, podem ser usados para modular seletivamente biomoléculas que estão liga- das à iniciação, progressão e/ou patologia de um tumor ou câncer. Como descrito acima, a imunoterapia contra alvos de ponto de verifi- cação imune, tais como HHLA2, TMIGD2, KIR3DL3 e semelhantes são úteis.

[0082] A menos que especificado de outra forma aqui dentro, os termos "anticorpo" e "anticorpos" abrangem amplamente formas de anticorpos de ocorrência natural (por exemplo, IgG, IgA, IgM, IgE) e anticorpos recombinantes, como anticorpos de cadeia única, anticor- pos quiméricos e humanizados e multi- anticorpos específicos, bem como fragmentos e derivados de todos os anteriores, cujos fragmentos e derivados têm pelo menos um sítio de ligação antigênica. Os deriva- dos de anticorpos podem compreender uma proteína ou fração quími- ca conjugada a um anticorpo. Um "anticorpo" refere-se a uma glicopro- teína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto, ou uma por- ção de ligação a antígeno. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma re- gião constante de cadeia pesada. A região constante da cadeia pesa- da é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, desig- nadas regiões que determinam complementaridade (CDR), intercala- das com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões es- truturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carboxila na se- guinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. O termo "anticorpos inativadores" refe- re-se a anticorpos que não induzem o sistema complemento.

[0083] O termo "anticorpo", como utilizado neste documento, tam- bém inclui uma "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"). O termo "porção de ligação ao antígeno", como utilizado neste documento, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar espe- cificamente a um antígeno (por exemplo, polipeptídeo de HHLA2 ou fragmento do mesmo). Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total.

Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2 , um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consis- tindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de com- plementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um li- gante sintético que permite que sejam feitas como uma cadeia de pro- teína única, em que as regiões VL e VH se emparelham para formar polipeptídeos monovalentes (conhecidos como Fv de cadeia simples (scFv); ver,por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 85:5879-5883; and Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778). Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo.

Quaisquer sequên- cias VH e VL de scFv específico podem ser ligadas ao cDNA da região constante de imunoglobulina humana ou a sequências genômicas, a fim de gerar vetores de expressão que codificam polipeptídeos de IgG completos ou outros isótipos.

VH e VL também podem ser usadas na geração de Fab, Fv ou outros fragmentos de imunoglobulinas usando química de proteínas ou tecnologia de DNA recombinante. Outras for- mas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos, também es- tão incluídas. Diacorpos são anticorpos bivalentes biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia poli- peptídica, mas usando um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444- 6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

[0084] Além disso, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo pode ser parte de polipeptídeos de imunoadesão maiores, formados por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais polipeptídeos de imunoadesão incluem o uso da re- gião central da estreptavidina para fazer um polipeptídeo scFv tetra- mérico (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybri- domas 6:93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo mar- cador e um marcador de poli-histidina C-terminal para fazer polipeptí- deos scFv bivalentes e biotinilados, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). As porções de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2 , podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros usando técnicas convencionais, como digestão com papaína ou pepsina, res- pectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, os anticorpos, por- ções de anticorpo e polipeptídeos de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas de DNA recombinante padrão, como aqui descrito.

[0085] Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais; xeno- gênicos, alogênicos ou singênicos; ou formas modificadas dos mes- mos (por exemplo, humanizados, quiméricos, etc.). Os anticorpos tam-

bém podem ser totalmente humanos. Numa modalidade, os anticorpos da presente invenção se ligam específica ou substancialmente especi- ficamente aos polipeptídeos HHLA2 ou fragmentos dos mesmos. Os termos "anticorpos monoclonais" e "composição de anticorpos mono- clonais", como utilizados neste documento, referem-se a uma popula- ção de polipeptídeos de anticorpos que contêm apenas uma espécie de um sítio de ligação ao antígeno capaz de imunorreagir com um epí- topo específico de um antígeno, enquanto o termo "anticorpos policlo- nais" e "composição de anticorpo policlonal" referem-se a uma popula- ção de polipeptídeos de anticorpos que contêm múltiplas espécies de sítios de ligação ao antígeno capazes de interagir com um antígeno particular. Uma composição de anticorpo monoclonal tipicamente exi- be uma afinidade de ligação única para um antígeno particular com o qual imunorreage.

[0086] O termo "fluido corporal" refere-se a fluidos que são excre- tados ou secretados do corpo, bem como fluidos que normalmente não são (por exemplo , fluido amniótico, humor aquoso, bile, sangue e plasma sanguíneo, líquido cefalorraquidiano, cerúmen e cera de ouvi- do, fluido de cowper ou fluido pré-ejaculatório, quilo, quimo, fezes, eja- culação feminina, fluido intersticial, fluido intracelular, linfa, menstrua- ção, leite materno, muco, fluido pleural, pus, saliva, sebo, sêmen, soro, suor, fluido sinovial, lágrimas, urina, lubrificação vaginal, humor vítreo, vômito).

[0087] Os termos "câncer" ou "tumor" ou "distúrbio hiperproliferati- vo" referem-se à presença de células que possuem características tí- picas de células causadoras de câncer, como proliferação descontro- lada, imortalidade, potencial metastático, crescimento rápido e taxa de proliferação e certas características morfológicas. As células cancerí- genas estão frequentemente na forma de um tumor, mas tais células podem existir sozinhas dentro de um animal, ou podem ser uma célula cancerígena não tumorigênica, como uma célula de leucemia.

Os cân- ceres incluem, mas não estão limitados a, câncer de células B, por exemplo, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenström, as doenças da cadeia pesada, como, por exemplo, doença da cadeia al- fa, doença da cadeia gama e doença da cadeia mu, gamopatia mono- clonal benigna e amiloidose imunocítica, melanomas, câncer de ma- ma, câncer de pulmão, câncer de brônquio, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de ová- rio, câncer de bexiga urinária, câncer de cérebro ou sistema nervoso central, câncer de sistema nervoso periférico, câncer de esôfago, cân- cer cervical, câncer uterino ou endometrial, câncer da cavidade oral ou faringe, câncer de fígado, câncer de rim, câncer testicular, câncer do trato biliar, câncer de intestino delgado ou apêndice, câncer de glându- la salivar, câncer de glândula tireoide, câncer de glândula adrenal, os- teossarcoma, condrossarcoma, câncer de tecidos hematológicos e semelhantes.

Outros exemplos não limitativos de tipos de cânceres aplicáveis aos métodos abrangidos pela presente invenção incluem sarcomas e carcinomas humanos, por exemplo, fibrossarcoma, mixos- sarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cor- doma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfan- gioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, lei- omiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer color- retal, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcino- ma de glândula sebácea, carcinoma papilar de adenocarcinoma, ade- nocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carci- noma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcino- ma do ducto biliar, câncer de fígado, coriocarcinoma, seminoma, carci- noma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, câncer ósseo, tu-

mor cerebral, câncer testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de células pequenas, carcinoma de bexiga, carcinoma epiteli- al, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependi- moma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligoden- droglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por exemplo,leucemia linfocítica aguda e leucemia mielocí- tica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia); leucemia crônica (leucemia mielocítica crônica (gra- nulocítica) e leucemia linfocítica crônica); e policitemia vera, linfoma (doença de Hodgkin e doença não Hodgkin), mieloma múltiplo, macro- globulinemia de Waldenstrom e doença da cadeia pesada. Em algu- mas modalidades, os cânceres são de natureza epitelial e incluem, mas não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, cânceres ginecológicos, câncer renal, câncer de laringe, câncer de pulmão, câncer oral, câncer de cabeça e pesco- ço, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata ou câncer de pele. Em outras modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão ou câncer de cólon. Em ainda outras modalidades, o câncer epitelial é câncer de pulmão de células não pe- quenas, carcinoma de células renais não papilares, carcinoma cervi- cal, carcinoma de ovário (por exemplo, carcinoma de ovário seroso) ou carcinoma de mama. Os cânceres epiteliais podem ser caracterizados de várias outras maneiras, incluindo, mas não se limitando a, seroso, endometrioide, mucinoso, de células claras, Brenner ou indiferenciado.

[0088] Os termos "CDR", e seu plural "CDRs", se referem a uma região determinante de complementaridade (CDR) da qual três consti- tuem o caráter de ligação de uma região variável de cadeia leve (CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3) e três constituem o caráter de ligação de uma região variável de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3). As CDRs contribuem para a atividade funcional de uma molécula de anti-

corpo e são separadas por sequências de aminoácidos que compre- endem as regiões de andaime ou de estrutura. Os limites definidores de CDR exatos são submetidos a sistemas de clarificação e numera- ção diferentes. As CDRs podem, portanto, ser referidas por Kabat, Chothia, contato ou qualquer outra definição de limite. Apesar de limi- tes diferentes, cada um destes sistemas tem algum grau de sobreposi- ção que constitui as chamadas "regiões hipervariáveis" nas sequên- cias variáveis. Definições de CDR de acordo com estes sistemas po- dem, portanto, diferir em comprimento e áreas de limite em relação à região estrutural adjacente. Ver, por exemplo Kabat, Chothia, and/or MacCallum et al., (Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest," 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol.196, 901; and Mac- Callum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732, cada um dos quais é incor- porado por referência em sua totalidade).

[0089] Como utilizado neste documento, o termo "classificação" inclui "associar" ou "categorizar" uma amostra a um estado de doença. Em certos casos, "classificar" é baseado em evidências estatísticas, evidências empíricas ou ambas. Em certas modalidades, os métodos e sistemas de classificação usam um denominado conjunto de treina- mento de amostras com estados de doença conhecidos. Uma vez es- tabelecido, o conjunto de dados de treinamento serve como base, mo- delo ou gabarito contra o qual as características de uma amostra des- conhecida são comparadas, a fim de classificar o estado de doença desconhecido da amostra. Em certos casos, classificar a amostra é semelhante a diagnosticar o estado de doença da amostra. Em outros casos, classificar a amostra é semelhante à diferenciação do estado de doença da amostra de outro estado de doença.

[0090] Como utilizado neste documento, o termo "região de codifi- cação" refere-se a regiões de uma sequência de nucleotídeos com-

preendendo códons que são traduzidos em resíduos de aminoácidos, enquanto o termo "região de não codificação" se refere a regiões de uma sequência de nucleotídeos que não são traduzidas em aminoáci- dos (por exemplo, regiões não traduzidas 5' e 3').

[0091] "Complemento [para]" ou "complementar" refere-se ao am- plo conceito de complementaridade de sequência entre regiões de du- as fitas de ácido nucleico ou entre duas regiões da mesma fita de áci- do nucleico. É conhecido que um resíduo de adenina de uma primeira região de ácido nucleico é capaz de formar ligações de hidrogênio es- pecíficas ("pareamento de base") com um resíduo de uma segunda região de ácido nucleico que é antiparalela à primeira região se o resí- duo for timina ou uracil. Da mesma forma, sabe-se que um resíduo de citosina de uma primeira fita de ácido nucleico é capaz de emparelhar com um resíduo de uma segunda fita de ácido nucleico que é antipara- lela à primeira fita se o resíduo for guanina. Uma primeira região de um ácido nucleico é complementar a uma segunda região do mesmo ou de um ácido nucleico diferente se, quando as duas regiões estão dis- postas de uma forma antiparalela, pelo menos um resíduo de nucleotí- deo da primeira região é capaz de emparelhar bases com um resíduo da segunda região. Em uma modalidade, a primeira região compreen- de uma primeira porção e a segunda região compreende uma segunda porção, pelo que, quando a primeira e a segunda porções são dispos- tas de uma forma antiparalela, pelo menos cerca de 50%, e de prefe- rência pelo menos cerca de 75%, em pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% dos resíduos de nucleotídeos da primeira porção são capazes de emparelhar bases com resíduos de nucleotí- deos na segunda porção. Em outra modalidade, todos os resíduos de nucleotídeos da primeira porção são capazes de emparelhar com os resíduos de nucleotídeos da segunda porção.

[0092] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo com-

posto" refere-se a um anticorpo que tem regiões variáveis compreen- dendo sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa ou não germinativa de duas ou mais regiões variáveis não relacionadas. Além disso, o termo "anticorpo humano compósito" refere-se a um anticorpo que possui regiões constantes derivadas da linhagem germinativa hu- mana ou sequências de imunoglobulina não germinativas e regiões variáveis compreendendo sequências germinativas ou não germinati- vas humanas de duas ou mais regiões variáveis humanas não relacio- nadas. Um anticorpo humano compósito é útil como um componente eficaz em um agente terapêutico de acordo com a presente invenção , uma vez que a antigenicidade do anticorpo humano compósito no cor- po humano é reduzida.

[0093] O termo "controle" refere-se a qualquer padrão de referên- cia adequado para fornecer uma comparação com os produtos de ex- pressão na amostra de teste. Em uma modalidade, o controle compre- ende obter uma "amostra de controle" a partir da qual os níveis de produto de expressão são detectados e comparados com os níveis de produto de expressão da amostra de teste. Tal amostra de controle pode compreender qualquer amostra adequada, incluindo, mas não se limitando a uma amostra de um paciente com câncer de controle (pode ser amostra armazenada ou medição de amostra anterior) com um re- sultado conhecido; tecido normal ou células isoladas de um indivíduo, como um paciente normal ou o paciente com câncer, células/tecidos primários cultivados isolados de um indivíduo, como um indivíduo nor- mal ou o paciente com câncer, células/tecidos normais adjacentes ob- tidos do mesmo órgão ou localização do corpo do paciente com cân- cer, um tecido ou amostra de célula isolada de um indivíduo normal ou células/tecidos primários obtidos de um depósito. Em outra modalida- de preferida, o controle pode compreender um nível de produto de ex- pressão padrão de referência de qualquer fonte adequada, incluindo,

mas não se limitando a genes de manutenção, uma faixa de nível de produto de expressão de tecido normal (ou outra amostra de controle previamente analisada), uma faixa de nível de um produto de expres- são previamente determinada dentro de uma amostra de teste de um grupo de pacientes, ou um conjunto de pacientes com um determinado resultado (por exemplo, sobrevida por um, dois, três, quatro anos, etc.) ou recebendo um determinado tratamento (por exemplo, padrão de terapia de câncer). Será entendido pelos versados na técnica que tais amostras de controle e níveis de produto de expressão padrão de refe- rência podem ser usados em combinação como controles nos méto- dos da presente invenção.

Em uma modalidade, o controle pode com- preender uma amostra de célula/tecido normal ou não cancerígena.

Em outra modalidade preferida, o controle pode compreender um nível de expressão para um conjunto de pacientes, como um conjunto de pacientes com câncer, ou para um conjunto de pacientes com câncer recebendo um determinado tratamento, ou para um conjunto de paci- entes com um resultado versus outro resultado.

No primeiro caso, o nível específico do produto de expressão de cada paciente pode ser atribuído a um nível percentual de expressão ou expresso como maior ou menor que a média ou média do nível de expressão padrão de refe- rência.

Em outra modalidade preferida, o controle pode compreender células normais, células de pacientes tratados com quimioterapia de combinação e células de pacientes com câncer benigno.

Em outra modalidade, o controle também pode compreender um valor medido, por exemplo, o nível médio de expressão de um determinado gene em uma população em comparação com o nível de expressão de um gene de manutenção na mesma população.

Tal população pode compreen- der indivíduos normais, pacientes com câncer que não foram submeti- dos a qualquer tratamento (ou seja, ingênuos ao tratamento), pacien- tes com câncer submetidos a terapia padrão de tratamento ou pacien-

tes com câncer benigno. Em outra modalidade preferida, o controle compreende uma transformação de razão dos níveis do produto de expressão, incluindo, entre outros, a determinação de uma razão dos níveis do produto de expressão de dois genes na amostra de teste e comparando-a a qualquer razão adequada dos mesmos dois genes em uma referência padrão; determinar os níveis de produto de expres- são dos dois ou mais genes na amostra de teste e determinar uma di- ferença nos níveis de produto de expressão em qualquer controle adequado; e determinar os níveis de produto de expressão dos dois ou mais genes na amostra de teste, normalizando sua expressão para expressão de genes de limpeza na amostra de teste e comparando com qualquer controle adequado. Em modalidades particularmente preferidas, o controle compreende uma amostra de controle que é da mesma linhagem e/ou tipo da amostra de teste. Em outra modalidade, o controle pode compreender níveis de produto de expressão agrupa- dos como percentis dentro ou com base em um conjunto de amostras de pacientes, como todos os pacientes com câncer. Em uma modali- dade, um nível de produto de expressão de controle é estabelecido em que níveis mais altos ou mais baixos de produto de expressão em re- lação a, por exemplo, um percentil particular, são usados como base para predizer o resultado. Em outra modalidade preferida, um nível de produto de expressão de controle é estabelecido usando níveis de produto de expressão de pacientes com controle de câncer com um resultado conhecido, e os níveis de produto de expressão da amostra de teste são comparados com o nível de produto de expressão de con- trole como base para predizer o resultado. Como demonstrado pelos dados abaixo, os métodos da invenção não se limitam ao uso de um ponto de corte específico na comparação do nível de produto de ex- pressão na amostra de teste com o controle.

[0094] Como utilizado neste documento, o termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para se estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, ao seu terminal carbo- xil. As regiões Fc de sequência nativa adequadas para utilização nos anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 humana.

[0095] Como utilizado neste documento, "receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas de emenda desses recep- tores, receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor de ativação") e FcγRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoáci- dos semelhantes que diferem principalmente nos domínios citoplasmá- ticos dos mesmos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação à base de tirosina (ITAM) de imunorreceptor em seu domí- nio citoplasmático. O receptor de inibição FcγRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosina de imunorreceptor (ITIM) em seu domí- nio citoplasmático (ver M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). Os FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Ou- tros FcRs, incluindo os a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" neste documento.

[0096] Uma molécula é "fixada" ou "afixada" a um substrato se es- tiver covalentemente ou não covalentemente associada ao substrato,

de modo que o substrato possa ser enxaguado com um fluido (por exemplo , citrato salino padrão, pH 7,4) sem uma fração substancial da molécula dissociando-se do substrato.

[0097] Como utilizado neste documento, os resíduos de "estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não sejam os resíduos de HVR, como definido neste documento.

[0098] "Variantes conservadoras de função" são aquelas nas quais um determinado resíduo de aminoácido em uma proteína ou enzima foi alterado sem alterar a conformação e função gerais do polipeptí- deo, incluindo, mas não se limitando a, substituição de um aminoácido por um com propriedades similares (como, por exemplo, polaridade, potencial de ligação de hidrogênio, acídico, básico, hidrofóbico, aromá- tico e semelhantes). Aminoácidos diferentes daqueles indicados como conservados podem diferir em uma proteína de modo que a similari- dade porcentual de proteína ou de sequência de aminoácidos entre quaisquer duas proteínas de função semelhante possa variar e possa ser, por exemplo, de 70% a 99% conforme determinado de acordo com um esquema de alinhamento, tal como pelo Método de Cluster, em que a similaridade é baseada no algoritmo MEGALIGN. Uma "vari- ante conservativa de função" também inclui um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de aminoácidos conforme determinado pelos algoritmos BLAST ou FASTA, de preferência pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda preferencialmente pelo menos 90%, e mesmo mais preferencialmente pelo menos 95%, e que tem as mesmas propriedades ou funções ou propriedades substanci- almente similares às da proteína nativa ou parental com a qual é com- parada.

[0099] Como usado neste documento, o termo "anticorpo heteró- logo" é definido em relação ao organismo não humano transgênico que produz esse anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo pos-

suindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico codificante correspondente à encontrada em um organismo que não consiste no animal não humano transgênico e geralmente de uma espécie diferente da do animal não humano transgênico.

[00100] "Homólogo", como usado neste documento, refere-se à si- milaridade de sequência de nucleotídeos entre duas regiões da mes- ma fita de ácido nucleico ou entre regiões de duas fitas de ácido nu- cleico diferentes. Quando uma posição de resíduo de nucleotídeo em ambas as regiões é ocupada pelo mesmo resíduo de nucleotídeo, en- tão as regiões são homólogas nessa posição. Uma primeira região é homóloga a uma segunda região se pelo menos uma posição de resí- duo de nucleotídeo de cada região for ocupada pelo mesmo resíduo. A homologia entre duas regiões é expressa em termos da proporção das posições dos resíduos de nucleotídeos das duas regiões que são ocu- padas pelo mesmo resíduo de nucleotídeo. A título de exemplo, uma região com a sequência de nucleotídeos 5'-ATTGCC-3' e uma região com a sequência de nucleotídeos 5'-TATGGC-3' compartilham 50% de homologia. De preferência, a primeira região compreende uma primei- ra porção e a segunda região compreende uma segunda porção, em que, pelo menos cerca de 50%, e de preferência pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% das po- sições de resíduo de nucleotídeo de cada uma das porções são ocu- padas pelo mesmo resíduo de nucleotídeo. Mais preferencialmente, todas as posições de resíduo de nucleotídeo de cada uma das por- ções são ocupadas pelo mesmo resíduo de nucleotídeo.

[00101] Como utilizado neste documento, o termo "célula hospedei- ra" destina-se a referir-se a uma célula na qual um ácido nucleico da presente invenção, tal como um vetor de expressão recombinante da presente invenção, foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados de forma intercambiável neste documento. Deve-se entender que tais termos se referem não apenas à célula em questão, mas também à descendência ou descen- dência potencial de tal célula. Como certas modificações podem ocor- rer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambien- tais, essa descendência não pode, de fato, ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo, como utilizado neste do- cumento.

[00102] O termo "anticorpo humanizado", como utilizado neste do- cumento, destina-se a incluir anticorpos feitos por uma célula não hu- mana com regiões variáveis e constantes que foram alteradas para se assemelhar mais a anticorpos que seriam feitos por uma célula huma- na. Por exemplo, alterando a sequência de aminoácidos do anticorpo não humano para incorporar aminoácidos encontrados nas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanizados podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou es- pecífica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, nas CDRs. O termo "anticorpo humaniza- do", como utilizado neste documento, também inclui anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas.

[00103] Um camundongo humanizado, como utilizado neste docu- mento, é um camundongo que carrega genes humanos em funciona- mento (por exemplo, HHLA2, TMIGD2 e/ou KIR3DL3), células, tecidos e/ou órgãos. Camundongos humanizados são comumente usados como modelos de pequenos animais em pesquisas biológicas e médi- cas para a terapêutica humana. O camundongo nude e o camundongo com imunodeficiência combinada severa (SCID) podem ser usados para este propósito. O camundongo NCG, o camundongo NOG e o camundongo NSG podem ser usados para enxertar células e tecidos humanos de forma mais eficiente do que outros modelos. Tais mode- los de camundongos humanizados podem ser usados para modelar o sistema imunológico humano em cenários de saúde e patologia e po- dem permitir a avaliação de candidatos terapêuticos em um cenário in vivo relevante para a fisiologia humana.

[00104] Como utilizado neste documento, o termo "região hipervari- ável,""HVR," ou "HV," se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam laços es- truturalmente definidos. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Em anticor- pos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3, em particular, desempenhe um papel único em conferir especificidade fina a anticorpos. Ver, por exemplo, Xu et al. (2000) Immunity 13, 37-45; Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248, 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). Na ver- dade, os anticorpos camelídeos de ocorrência natural consistindo em apenas uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve (ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448 (1993) and Sheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol. 3, 733- 736).

[00105] Como utilizado neste documento, o termo "célula imune" se refere a células que desempenham um papel na resposta imune. As células imunes são de origem hematopoiética e incluem linfócitos, co- mo células B e células T; células assassinas naturais; células mieloi- des, como monócitos, macrófagos, eosinófilos, mastócitos, basófilos e granulócitos.

[00106] Como utilizado neste documento, o termo "distúrbio imuno- lógico" inclui doenças imunológicas, condições e predisposições a, in-

cluindo, mas não se limitando a, câncer, doenças inflamatórias crôni- cas e distúrbios (incluindo, por exemplo, doença de Crohn, doença in- flamatória do intestino, artrite reativa e Doença de Lyme), diabetes in- sulino-dependente, autoimunidade específica de órgão (incluindo, por exemplo, esclerose múltipla, tireoidite de Hashimoto, uveíte autoimune e doença de Grave), dermatite de contato, psoríase, rejeição de enxer- to, doença de enxerto contra hospedeiro, sarcoidose, condições atópi- cas (incluindo , por exemplo, asma e alergia incluindo, mas não se limi- tando a, rinite alérgica e alergias gastrointestinais, como alergias ali- mentares), eosinofilia, conjuntivite, nefrite glomerular, lúpus eritemato- so sistêmico, esclerodermia, certas suscetibilidades a patógenos, co- mo helmintos (incluindo, por exemplo, leishmaniose) e certas infecções virais (incluindo, por exemplo, HIV e infecções bacterianas, como tu- berculose e lepra lepromatosa) e malária.

[00107] Como utilizado neste documento, o termo "resposta imune" inclui respostas imunes mediadas por células T e/ou mediadas por cé- lulas B. Respostas imunes exemplificativas incluem respostas de célu- las T, por exemplo, produção de citocinas e citotoxicidade celular. Além disso, o termo resposta imune inclui respostas imunes que são indiretamente afetadas pela ativação de células T, por exemplo, pro- dução de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células res- ponsivas a citocinas, por exemplo, macrófagos.

[00108] O termo "agente imunoterapêutico" pode incluir qualquer molécula, peptídeo, anticorpo ou outro agente que pode estimular um sistema imunológico do hospedeiro para gerar uma resposta imune a um tumor ou câncer no indivíduo. Vários agentes imunoterapêuticos são úteis nas composições e métodos aqui descritos.

[00109] O termo "ponto de verificação imune" refere-se a um grupo de moléculas na superfície celular de células CD4+ e/ou CD8+ que ajustam as respostas imunes modulando ou inibindo uma resposta imune antitumoral. As proteínas de ponto de verificação imune são bem conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, receptores da família KIR, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRPalpha (CD47), CD48, 2B4 (CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, butirofilinas e A2aR (ver, por exemplo, WO 2012/177624). O termo abrange ainda frag- mento de proteína biologicamente ativa, bem como ácidos nucleicos que codificam proteínas de ponto de verificação imune de comprimen- to total e fragmentos de proteína biologicamente ativos das mesmas. Em algumas modalidades, o termo abrange ainda qualquer fragmento de acordo com as descrições de homologia fornecidas neste docu- mento.

[00110] Pontos de verificação imune e suas sequências são bem conhecidos na técnica e modalidades representativas são descritas abaixo. Por exemplo, o termo "PD-1" refere-se a um membro da super- família de genes de imunoglobulina que funciona como um receptor coinibitório com PD-L1 e PD-L2 como ligandos conhecidos. PD-1 foi previamente identificado usando uma abordagem baseada em clona- gem de subtração para selecionar genes suprarregulados durante a morte de células T ativadas induzida por TCR. PD-1 é um membro da família de moléculas CD28/CTLA-4 com base na sua capacidade de se ligar a PD-L1. Como CTLA-4, PD-1 é rapidamente induzido na su- perfície das células T em resposta ao anti-CD3 (Agata et al. 25 (1996) Int. Immunol. 8:765). Em contraste com CTLA-4, no entanto, PD-1 também é induzido na superfície das células B (em resposta a anti- IgM). PD-1 também é expresso em um subconjunto de timócitos e cé- lulas mielóides (Agata et al.(1996) supra; Nishimura et al.(1996) Int.Immunol. 8:773).

[00111] Como utilizado neste documento, o termo "inibir" e equiva-

lentes gramaticais dos mesmos referem-se à diminuição, limitação e/ou bloqueio de uma ação, função ou interação particular. Em uma modalidade, o termo se refere à redução do nível de uma determinada saída ou parâmetro para uma quantidade (por exemplo, coloração de fundo, sinalização de HHLA2, função imunoinibitória de HHLA2 e se- melhantes) que é pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou menos que a quantidade em um controle correspondente. Um nível reduzido de uma determinada saída ou parâmetro não precisa, embo- ra possa significar uma ausência absoluta da saída ou parâmetro. A invenção não requer, e não está limitada a, métodos que eliminam to- talmente a saída ou parâmetro. A saída ou parâmetro fornecido pode ser determinado usando métodos bem conhecidos na técnica, incluin- do, sem limitação, ensaios imuno-histoquímicos, biológicos molecula- res, biológicos celulares, clínicos e bioquímicos, como discutido aqui e nos exemplos. Os termos opostos "promover", "aumentar" e seus equivalentes gramaticais referem-se ao aumento no nível de uma de- terminada saída ou parâmetro que é o reverso daquele descrito para inibição ou diminuição.

[00112] Como utilizado neste documento, o termo "interação", quando se refere a uma interação entre duas moléculas, refere-se ao contato físico (por exemplo, ligação) das moléculas uma com a outra (por exemplo, ligação de HHLA2 a TMIGD2 ou ligação de HHLA2 a KIR3DL3). Geralmente, tal interação resulta em uma atividade (que produz um efeito biológico) de uma ou ambas as referidas moléculas. A atividade pode ser uma atividade direta de uma ou ambas as molé- culas (por exemplo, transdução de sinal). Alternativamente, uma ou ambas as moléculas na interação podem ser impedidas de se ligar ao seu ligante e, assim, ser mantidas inativas em relação à atividade de ligação do ligante (por exemplo, ligar seu ligante e desencadear ou inibir uma resposta imune). A inibição de tal interação resulta na inter- rupção da atividade de uma ou mais moléculas envolvidas na intera- ção. Intensificar tal interação é prolongar ou aumentar a probabilidade do referido contato físico e prolongar ou aumentar a probabilidade da referida atividade.

[00113] O termo "terapia neoadjuvante" refere-se a um tratamento administrado antes do tratamento primário. Exemplos de terapia neo- adjuvante podem incluir quimioterapia, radioterapia e terapia hormonal.

[00114] Como utilizado neste documento, o termo um "anticorpo isolado" se destina a referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a HHLA2 e é substancialmente livre de anticorpos que não se ligam a HHLA2). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a aHHLA2 pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outras proteínas da fa- mília B7, respectivamente, de espécies diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo mantém afinidade de ligação espe- cífica para pelo menos duas espécies, como humanos e outros ani- mais, como animais não roedores, ou outras espécies de mamíferos ou não mamíferos. No entanto, em algumas modalidades, o anticorpo mantém uma afinidade e seletividade mais alta ou realmente específi- ca para HHLA2 humana. Além disso, um anticorpo isolado é tipica- mente substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma modalidade da presente invenção, uma combina- ção de anticorpos monoclonais "isolados" com diferentes especificida- des para HHLA2 humano são combinados em uma composição bem definida.

[00115] Como utilizado neste documento, uma "proteína isolada" refere-se a uma proteína que está substancialmente livre de outras proteínas, material celular, meio de separação e meio de cultura quan-

do isolada de células ou produzida por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sinteti- zados quimicamente. Uma proteína "isolada" ou "purificada" ou porção biologicamente ativa da mesma é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula ou tecido fonte da qual o anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou proteína de fusão é deriva- do, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros pro- dutos químicos quando sintetizados quimicamente. A linguagem "subs- tancialmente livre de material celular" inclui preparações de um poli- peptídeo alvo (por exemplo, imunoglobulina) ou fragmento do mesmo, em que a proteína é separada dos componentes celulares das células das quais é isolada ou produzida de forma recombinante. Em uma modalidade, a linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de proteína alvo ou fragmento da mesma, com me- nos de cerca de 30% (em peso seco) de proteína não alvo (também referida neste documento como uma "proteína contaminante"), mais preferencialmente menos que cerca de 20% da proteína não alvo, ain- da mais preferencialmente menos que cerca de 10% da proteína não alvo, e mais preferencialmente menos que cerca de 5% da proteína não alvo. Quando o anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou proteína de fusão ou fragmento do mesmo, por exemplo, um fragmento biologica- mente ativo do mesmo, é produzido de forma recombinante, é também de preferência substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, meio de cultura representa menos que cerca de 20%, mais preferencialmen- te menos que cerca de 10%, e mais preferencialmente menos que cerca de 5% do volume da preparação de proteína.

[00116] Como utilizado neste documento, o termo "isótipo" refere-se à classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada.

[00117] Como utilizado neste documento, o termo "KD"; se destina a se referir à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. A afinidade de ligação dos anticorpos da invenção divulgada pode ser medida ou determinada por ensaios pa- drão de anticorpo-antígeno, por exemplo, ensaios competitivos, ensai- os de saturação ou imunoensaios padrão, como ELISA ou RIA.

[00118] Como utilizado neste documento, um "kit" é qualquer manu- fatura (por exemplo , uma embalagem ou recipiente) compreendendo pelo menos um reagente, por exemplo , uma sonda, para detectar ou modular especificamente a expressão de um marcador da presente invenção. O kit pode ser promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para realizar os métodos da presente invenção.

[00119] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo mono- clonal" refere-se a um anticorpo que exibe uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo específico. Por conseguinte, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a um anticorpo que exibe uma especificidade de ligação única e que possui regiões cons- tantes e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina da li- nhagem germinativa ou não germinativa humana. Em uma modalida- de, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibri- doma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano trans- gênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um trans- gene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

[00120] Um "marcador" é um gene cujo nível de expressão alterado em um tecido ou célula do seu nível de expressão em tecido ou célula normal ou saudável está associado a um estado de doença, como câncer. Um "ácido nucleico marcador" é um ácido nucleico (por exem- plo, mRNA, cDNA) codificado por ou correspondendo a um marcador da presente invenção. Esses ácidos nucleicos marcadores incluem DNA (por exemplo, cDNA) compreendendo a sequência inteira ou par-

cial de qualquer uma das sequências de ácido nucleico apresentadas na Listagem de Sequências ou o complemento de tal sequência. Os ácidos nucleicos marcadores também incluem RNA compreendendo a sequência inteira ou parcial de qualquer uma das sequências de ácido nucleico estabelecidas na Listagem de Sequências ou o complemento de tal sequência, em que todos os resíduos de timidina são substituí- dos por resíduos de uridina. Uma "proteína marcadora" é uma proteína codificada por ou correspondente a um marcador da presente inven- ção. Uma proteína marcadora compreende a sequência inteira ou par- cial de qualquer uma das sequências apresentadas na Listagem de Sequências. Em algumas modalidades, a HHLA2 geral é usada como um marcador. Em outras modalidades, o fragmento de HHLA2 é usado como um marcador. Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável.

[00121] Como utilizado neste documento, o termo "modular" inclui a suprarregulação e a infrarregulação, por exemplo, intensificando ou inibindo uma resposta.

[00122] O nível "normal" de expressão de um marcador é o nível de expressão do marcador em células de um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, não afligido com uma doença ou distúrbio relacio- nado a níveis de marcadores aberrantes. Uma "superexpressão" ou "nível de expressão significativamente mais alto" de um marcador refe- re-se a um nível de expressão em uma amostra de teste que é maior do que o erro padrão do ensaio usado para avaliar a expressão e é de preferência pelo menos duas vezes, e mais de preferência três, quatro, cinco ou dez vezes o nível de expressão do marcador em uma amos- tra de controle (por exemplo, amostra de um indivíduo saudável sem a doença associada ao marcador) e, de preferência, o nível de expres- são médio do marcador em várias amostras de controle. Um "nível de expressão significativamente mais baixo" de um marcador se refere a um nível de expressão em uma amostra de teste que é pelo menos duas vezes, e mais preferencialmente três, quatro, cinco ou dez vezes menor do que o nível de expressão do marcador em uma amostra de controle (por exemplo, amostra de um indivíduo saudável sem a doen- ça associada ao marcador) e, de preferência, o nível de expressão médio do marcador em várias amostras de controle.

[00123] Esses níveis de "significância" também podem ser aplica- dos a qualquer outro parâmetro medido aqui descrito, tal como para expressão, inibição, citotoxicidade, crescimento celular e semelhantes.

[00124] O termo quantidade de biomarcador "predeterminada" e/ou medição(ões) de atividade pode ser uma quantidade de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade usada para, apenas a título de exem- plo, avaliar um indivíduo que pode ser selecionado para um tratamento específico, avaliar uma resposta a um tratamento, como um ou mais moduladores da via HHLA2, como um modulador de HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, so- zinhos ou em combinação com uma ou mais imunoterapias , e/ou ava- liar o estado da doença. Uma quantidade predeterminada de biomar- cador e/ou medição(ões) de atividade pode ser determinada em popu- lações de pacientes com ou sem câncer. A quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade pode ser um único número, igualmente aplicável a todos os pacientes, ou a quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade pode variar de acordo com subpopulações específicas de pacientes. Idade, peso, altura e outros fatores de um indivíduo podem afetar a quantida- de predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade do indivíduo. Além disso, a quantidade e/ou atividade de biomarcador predeterminada pode ser determinada para cada indivíduo individual- mente. Em uma modalidade, as quantidades determinadas e/ou com- paradas em um método aqui descrito são baseadas em medições ab-

solutas. Em outra modalidade, as quantidades determinadas e/ou comparadas em um método aqui descrito são baseadas em medições relativas, tais como razões (por exemplo, razões celulares ou biomar- cador sérico normalizado para a expressão de manutenção ou de ou- tro modo geralmente biomarcador constante). A quantidade predeter- minada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade pode ser qualquer padrão adequado. Por exemplo, a quantidade predetermina- da de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade podem ser obtidas do mesmo ou de um humano diferente para o qual uma seleção de paciente está sendo avaliada. Numa modalidade, a quantidade prede- terminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade podem ser obtidas a partir de uma avaliação anterior do mesmo paciente. Desta forma, o andamento da seleção do paciente pode ser monitorado ao longo do tempo. Além disso, o controle pode ser obtido a partir de uma avaliação de outro ser humano ou de vários humanos, por exemplo, grupos selecionados de humanos, se o indivíduo for um humano. Des- se modo, a extensão da seleção do humano para o qual a seleção es- tá sendo avaliada pode ser comparada a outros humanos adequados, por exemplo, outros humanos que estão em uma situação semelhante ao humano de interesse, como aqueles que sofrem de doenças seme- lhantes ou a(s) mesma(s) condição(ões) e/ou do mesmo grupo étnico.

[00125] O termo "preditivo" inclui o uso de um ácido nucleico bio- marcador e/ou estado de proteína, por exemplo, super ou subativida- de, emergência, expressão, crescimento, remissão, recorrência ou re- sistência de tumores antes, durante ou após a terapia, para determinar a probabilidade de resposta de um câncer à terapia imunomodulatória, como a terapia moduladora da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, isoladamente ou em combinação com uma imunoterapia , como uma terapia de inibição de ponto de verifica-

ção imune). Tal uso preditivo do biomarcador pode ser confirmado por, por exemplo, (1) número de cópias aumentado ou diminuído (por exemplo,por FISH, FISH mais SKY, sequenciamento de molécula úni- ca, por exemplo, conforme descrito na técnica pelo menos em J. Bio- technol., 86:289-301 ou qPCR), superexpressão ou subexpressão de um ácido nucleico de biomarcador (por exemplo, por ISH, Northern Blot ou qPCR), proteína de biomarcador aumentada ou diminuída (por exemplo, por IHC) e/ou alvo de biomarcador, ou aumento ou diminui- ção da atividade, por exemplo,em mais de cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ou mais dos tipos de câncer huma- no testados ou amostras de câncer; (2) sua presença ou ausência ab- soluta ou relativamente modulada em uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra contendo tecido, sangue total, soro, plasma, raspagem bucal, saliva, líquido cefalorraquidiano, urina, fezes ou me- dula óssea de um indivíduo, por exemplo , um ser humano que sofre de câncer; (3) sua presença ou ausência absoluta ou relativamente modulada no subconjunto clínico de pacientes com câncer (por exem- plo, aqueles que respondem a uma terapia imunomodulatória específi- ca (por exemplo, terapia moduladora da via HHLA2 (por exemplo, mo- dulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 AND/OR KIR3DL3, sozinho ou em combina- ção com uma imunoterapia) ou aqueles que desenvolvem resistência aos mesmos).

[00126] Os termos "prevenir", "prevenindo", "prevenção", "tratamen- to profilático" e semelhantes referem-se à redução da probabilidade de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição em um indivíduo, que não tem, mas está em risco de ou é suscetível a desenvolver uma do- ença, distúrbio ou condição.

[00127] O termo "prognóstico" inclui uma previsão do curso e resul-

tado provável do câncer ou a probabilidade de recuperação da doen- ça. Em algumas modalidades, o uso de algoritmos estatísticos fornece um prognóstico de câncer em um indivíduo. Por exemplo, o prognósti- co pode ser cirurgia, desenvolvimento de um subtipo clínico de câncer (por exemplo, tumores sólidos, como câncer de pulmão, melanoma e carcinoma de células renais), desenvolvimento de um ou mais fatores clínicos, desenvolvimento de câncer intestinal ou recuperação da do- ença.

[00128] O termo "resposta à terapia" (por exemplo, terapia modula- dora da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, sozinho ou em combinação com uma imunoterapia, como uma terapia de inibição de ponto de verificação imune) se refere a qualquer resposta à terapia (por exemplo, terapia moduladora da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, so- zinho ou em combinação com uma imunoterapia, tal como uma terapia de inibição de ponto de verificação imune) e, para o câncer, de prefe- rência para uma mudança no número de células cancerígenas, massa tumoral e/ou volume após o início da quimioterapia neoadjuvante ou adjuvante. A resposta do distúrbio hiperproliferativo pode ser avaliada, por exemplo, quanto à eficácia ou em uma situação neoadjuvante ou adjuvante, em que o tamanho de um tumor após intervenção sistêmica pode ser comparado ao tamanho e dimensões iniciais, medidos por tomografia computadorizada, PET, mamografia, ultrassom ou palpa- ção. As respostas também podem ser avaliadas por medição com compasso ou exame patológico do tumor após biópsia ou ressecção cirúrgica. A resposta pode ser registrada de forma quantitativa, como alteração porcentual no volume do tumor ou de forma qualitativa, como "resposta patológica completa" (pCR), "remissão clínica completa"

(cCR), "remissão clínica parcial" (cPR), "doença clínica estável" (cSD), "doença clínica progressiva" (cPD) ou outros critérios qualitativos.

A avaliação da resposta do transtorno hiperproliferativo pode ser feita logo após o início da terapia neoadjuvante ou adjuvante, por exemplo, após algumas horas, dias, semanas ou, de preferência, após alguns meses.

Um ponto final típico para avaliação de resposta é após o tér- mino da quimioterapia neoadjuvante ou após a remoção cirúrgica de células tumorais residuais e/ou do leito tumoral.

Isso geralmente ocorre três meses após o início da terapia neoadjuvante.

Em algumas moda- lidades, a eficácia clínica dos tratamentos terapêuticos aqui descritos pode ser determinada medindo a taxa de benefício clínico (CBR). A taxa de benefício clínico é medida determinando a soma da porcenta- gem de pacientes que estão em remissão completa (CR), o número de pacientes que estão em remissão parcial (PR) e o número de pacien- tes com doença estável (SD) em um ponto de tempo pelo menos 6 meses após o final da terapia.

A abreviação para esta fórmula é CBR=CR+PR+SD em 6 meses.

Em algumas modalidades, a CBR pa- ra um regime terapêutico específico para câncer é de pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou mais.

Critérios adicionais para avaliar a resposta às terapias contra o câncer estão relacionados à "sobrevida", que inclui todos os seguintes itens: sobrevida até a mortalidade, também conhecida como sobrevida global (em que a mortalidade pode ser independente da causa ou relacionada ao tumor); "sobrevida livre de recorrência" (em que o termo recorrência deve incluir recorrência localizada e distante); sobrevida livre de metástases; sobrevida livre de doença (em que o termo doença deve incluir câncer e doenças associadas a ele). A du- ração da referida sobrevida pode ser calculada por referência a um ponto de início definido (por exemplo, tempo de diagnóstico ou início do tratamento) e ponto final (por exemplo, morte, recorrência ou me-

tástase). Além disso, os critérios para eficácia do tratamento podem ser expandidos para incluir resposta à quimioterapia, probabilidade de sobrevida, probabilidade de metástase dentro de um determinado pe- ríodo de tempo e probabilidade de recorrência do tumor. Por exemplo, para determinar valores limiares apropriados, um regime terapêutico de câncer específico pode ser administrado a uma população de indi- víduos e o resultado pode ser correlacionado com medições de bio- marcadores que foram determinados antes da administração de qual- quer terapia imunomodulatória. A medição do resultado pode ser a resposta patológica à terapia administrada no ambiente neoadjuvante. Alternativamente, medições de resultados, como sobrevida geral e so- brevida livre de doença, podem ser monitoradas durante um período de tempo para indivíduos após terapia imunomodulatória para os quais os valores de medição de biomarcadores são conhecidos. Em certas modalidades, as doses administradas são doses padrão conhecidas na técnica para agentes terapêuticos contra o câncer. O período de tempo durante o qual os indivíduos são monitorados pode variar. Por exemplo, os indivíduos podem ser monitorados por pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 meses.

[00129] O termo "resistência" refere-se a uma resistência adquirida ou natural de uma amostra de câncer ou de um mamífero a uma tera- pia imunomodulatória (isto é, não responder ou ter resposta reduzida ou limitada ao tratamento terapêutico), tal como ter uma resposta re- duzida a um tratamento terapêutico tratamento em 5% ou mais, por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais, a 2 ve- zes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes ou mais. A redução na resposta pode ser medida comparando com a mesma amostra de câncer ou mamífero antes que a resistência seja adquirida, ou comparando com uma amostra de câncer diferente ou um mamífero que se sabe não ter resistência ao tratamento terapêutico. Uma resis- tência adquirida típica à quimioterapia é chamada de "resistência a múltiplas drogas". A resistência a múltiplas drogas pode ser mediada por P-glicoproteína ou pode ser mediada por outros mecanismos, ou pode ocorrer quando um mamífero é infectado com um micro- organismo resistente a múltiplas drogas ou uma combinação de micro- organismos. A determinação da resistência a um tratamento terapêuti- co é rotineira na técnica e dentro da habilidade de um clínico comum, por exemplo, pode ser medida por ensaios de proliferação celular e ensaios de morte celular, conforme descrito aqui como "sensibilizante". Em algumas modalidades, o termo "reverte a resistência" significa que o uso de um segundo agente em combinação com uma terapia de câncer primária (por exemplo, quimioterapia ou terapia de radiação) é capaz de produzir uma diminuição significativa no volume do tumor a um nível de significância estatística (por exemplo, p<0,05) quando comparado ao volume do tumor de tumor não tratado na circunstância em que a terapia de câncer primário (por exemplo, quimioterapia ou terapia de radiação) sozinha é incapaz de produzir uma diminuição estatisticamente significativa no volume do tumor em comparação com o volume do tumor não tratado. Isso geralmente se aplica às medições de volume do tumor feitas no momento em que o tumor não tratado está crescendo log ritmicamente.

[00130] Os termos "resposta" ou "capacidade de resposta" referem- se à resposta à terapia. Por exemplo, uma resposta anticâncer inclui redução do tamanho do tumor ou inibição do crescimento do tumor. Os termos também podem se referir a um prognóstico melhorado, por exemplo, conforme refletido por um aumento do tempo para recorrên- cia, que é o período para a censura da primeira recorrência para o se- gundo câncer primário como um primeiro evento ou morte sem evidên- cia de recorrência, ou um aumento da sobrevida geral, que é o período do tratamento até a morte por qualquer causa. Responder ou ter uma resposta significa que há um ponto final benéfico alcançado quando exposto a um estímulo. Alternativamente, um sintoma negativo ou pre- judicial é minimizado, mitigado ou atenuado pela exposição a um estí- mulo. Será apreciado que avaliar a probabilidade de que um tumor ou indivíduo exibirá uma resposta favorável é equivalente a avaliar a pro- babilidade de que o tumor ou indivíduo não exibirá uma resposta favo- rável (ou seja, exibirá uma falta de resposta ou será não responsivo).

[00131] O termo "tolerância" ou "falta de resposta" inclui a refrativi- dade das células, como células do sistema imunológico, à estimula- ção, por exemplo, estimulação por meio de um receptor de ativação ou uma citocina. Pode ocorrer falta de resposta, por exemplo, devido à exposição a imunossupressores ou exposição a altas doses de antí- geno. Vários métodos independentes podem induzir tolerância. Um mecanismo é conhecido como "anergia", que é definido como um es- tado em que as células persistem in vivo como células não responsi- vas, em vez de se diferenciarem em células com funções efetoras. Es- sa refratividade é geralmente específica do antígeno e persiste após a exposição ao antígeno tolerante ter cessado. Por exemplo, a anergia nas células T é caracterizada pela falta de produção de citocinas, por exemplo, IL-2. A anergia das células T ocorre quando as células T são expostas ao antígeno e recebem um primeiro sinal (um receptor de células T ou sinal mediado por CD-3) na ausência de um segundo si- nal (um sinal coestimulatório). Nessas condições, a reexposição das células ao mesmo antígeno (mesmo se a reexposição ocorrer na pre- sença de um polipeptídeo coestimulatório) resulta na falha na produ- ção de citocinas e, portanto, na proliferação. As células T anérgicas podem, no entanto, proliferar se cultivadas com citocinas (por exem- plo, IL-2). Por exemplo, a anergia das células T também pode ser ob- servada pela falta de produção de IL-2 por linfócitos T, conforme me-

dido por ELISA ou por um ensaio de proliferação usando uma linha- gem celular indicadora. Alternativamente, um construto de gene repór- ter pode ser usado. Por exemplo, as células T anérgicas não conse- guem iniciar a transcrição do gene IL-2 induzida por um promotor hete- rólogo sob o controle do intensificador do gene 5' IL-2 ou por um mul- tímero da sequência AP1 que pode ser encontrado dentro do intensifi- cador (Kang et al . (1992) Science 257:1134). Outro mecanismo é chamado de "exaustão". A exaustão das células T é um estado de dis- função das células T que surge durante muitas infecções crônicas e câncer. É definido pela função efetora pobre, expressão sustentada de receptores inibitórios e um estado transcricional distinto daquele de células T efetoras funcionais ou de memória.

[00132] Como utilizado neste documento, o termo "molécula de áci- do nucleico" se destina a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla. Como utilizado neste documento, o termo "molécula de ácido nucleico isolada" em referência a ácidos nucleicos que codificam anticorpos ou porções de anticorpo (por exemplo, VH, VL, CDR3) que e ligam a HHLA2 (por exemplo, mAbs2G2, 4D1, 8A12, 8D2, 1C8, 2C4, 6D10, 4E5, e 6F10 e anticorpos policlonais), destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico em que as sequências de nucleotídeos que codificam o anti- corpo ou porção de anticorpo estão livres de outras sequências de nu- cleotídeos que codificam anticorpos ou porções de anticorpo que se ligam a antígenos diferentes de HHLA2, cujas outras sequências po- dem flanquear naturalmente o ácido nucleico no DNA genômico hu- mano.

[00133] O ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nu- cleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacional-

mente ligado a uma sequência de codificação se isso afeta a transcri- ção da sequência. No que diz respeito às sequências regulatórias da transcrição, operacionalmente ligada significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e na es- trutura de leitura. Para sequências de comutação, operacionalmente ligado indica que as sequências são capazes de efetuar a recombina- ção de comutação.

[00134] Uma "superexpressão" ou "nível de expressão significati- vamente mais alto" de um marcador refere-se a um nível de expressão em uma amostra de teste que é maior do que o erro padrão do ensaio usado para avaliar a expressão e é de preferência pelo menos duas vezes, e mais de preferência 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 vezes ou mais superior à atividade de expressão ou nível do marcador em uma amostra de controle (por exemplo, amostra de um indivíduo saudável sem a doença associada ao marca- dor) e, de preferência, o nível de expressão médio do marcador em várias amostras de controle. Um "nível de expressão significativamen- te mais baixo" de um marcador refere-se a um nível de expressão em uma amostra de teste que é pelo menos duas vezes, e mais preferen- cialmente 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 vezes ou mais baixo do que o nível de expressão do marcador em uma amostra de controle (por exemplo, amostra de um indivíduo sau- dável sem a doença associada ao marcador) e, de preferência, o nível de expressão médio do marcador em várias amostras de controle.

[00135] Tais anticorpos, aqui descritos, podem ser usados em qual- quer uma das formas de imunoensaio bem conhecidas, incluindo, sem limitação, um radioimunoensaio, um ensaio de Western blot, um en-

saio de imunofluorescência, um imunoensaio enzimático, um ensaio de imunoprecipitação, um ensaio de quimioluminescência, um ensaio imuno-histoquímico, um ensaio dot blot ou um ensaio slot blot. Técni- cas gerais a serem utilizadas na realização dos vários imunoensaios observados acima e outras variações das técnicas, tais como ensaio de ligação de proximidade in situ (PLA), imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA), imunoensaio de fluorescência (FIA), imunoen- saio enzimático (EIA), imunoensaio de inibição nefelométrica (NIA), ensaio de imunossorvente ligado à enzima (ELISA) e radioimunoen- saio (RIA), ELISA, etc., sozinho ou em combinação ou alternativamen- te com NMR, MALDI-TOF, LC-MS/MS, são conhecidos por aqueles versados comuns na técnica.

[00136] Esses reagentes também podem ser usados para monitorar os níveis de proteína em uma célula ou tecido, por exemplo, glóbulos brancos ou linfócitos, como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, a fim de monitorar uma dosagem ideal de um agente ini- bitório. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento (por exemplo, ligante fisicamente) do anticorpo a uma substância detectável. Exem- plos de substâncias detectáveis incluem, várias enzimas, grupos pros- téticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bio- luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequa- das incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluores- ceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um mate- rial luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescen- tes incluem luciferase, luciferina e aequorina, e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

[00137] Esses reagentes também podem ser usados com qualquer número de amostras biológicas. As amostras biológicas podem ser coletadas de uma variedade de fontes de um paciente, incluindo uma amostra de fluido corporal, amostra de célula ou uma amostra de teci- do compreendendo ácidos nucleicos e/ou proteínas. Em uma modali- dade preferida, o indivíduo e/ou amostra de controle é selecionado do grupo que consiste em células, linhagens celulares, lâminas histológi- cas, tecidos embebidos em parafina, biópsias, sangue total, aspirado de mamilo, soro, plasma, raspagem bucal, saliva, líquido cefalorraqui- diano, urina, fezes e medula óssea. Em uma modalidade, a amostra é soro, plasma ou urina. Em outra modalidade, a amostra é soro.

[00138] As amostras podem ser coletadas de indivíduos repetida- mente ao longo de um período longitudinal de tempo (por exemplo, uma vez ou mais na ordem de dias, semanas, meses, anualmente, semestralmente, etc.). A obtenção de várias amostras de um indivíduo ao longo de um período de tempo pode ser usada para verificar os re- sultados de detecções anteriores e/ou para identificar uma alteração no padrão biológico como resultado de, por exemplo, progressão da doença, tratamento com drogas, etc. Por exemplo, amostras de indiví- duos podem ser colhidas e monitoradas todos os meses, a cada dois meses, ou combinações de intervalos de um, dois ou três meses, de acordo com a presente invenção. Além disso, a quantidade de biomar- cador e/ou medições de atividade do indivíduo obtidas ao longo do tempo podem ser convenientemente comparadas entre si, bem como com aquelas de controles normais durante o período de monitoramen- to, fornecendo assim os próprios valores do indivíduo, como um con- trole para monitoramento de longo prazo interno, ou pessoal.

[00139] As amostras podem conter células/tecidos vivos, células congeladas frescas, tecido fresco, biópsias, células/tecidos fixos, célu- las/tecidos embebidos em um meio, como parafina, lâminas histológi-

cas ou qualquer combinação dos mesmos.

[00140] A preparação e separação da amostra pode envolver qual- quer um dos procedimentos, dependendo do tipo de amostra coletada e/ou análise da(s) medição(ões) do biomarcador. Tais procedimentos incluem, apenas a título de exemplo, concentração, diluição, ajuste de pH, remoção de polipeptídeos de alta abundância (por exemplo, albu- mina, gamaglobulina e transferrina, etc.), adição de conservantes e calibrantes, adição de inibidores de protease, adição de desnaturan- tes, dessalinização de amostras, concentração de proteínas de amos- tra, extração e purificação de lipídeos.

[00141] A preparação da amostra também pode isolar moléculas que estão ligadas em complexos não covalentes a outras proteínas (por exemplo, proteínas transportadoras). Este processo pode isolar as moléculas ligadas a uma proteína transportadora específica (por exemplo, albumina), ou usar um processo mais geral, como a libera- ção de moléculas ligadas de todas as proteínas transportadoras via desnaturação de proteínas, por exemplo, usando um ácido, seguido pela remoção das proteínas transportadoras.

[00142] A remoção de proteínas indesejadas (por exemplo, proteí- nas de alta abundância, não informativas ou indetectáveis) de uma amostra pode ser alcançada usando reagentes de alta afinidade, filtros de alto peso molecular, ultracentrifugação e/ou eletrodiálise. Reagen- tes de alta afinidade incluem anticorpos ou outros reagentes (por exemplo, aptâmeros) que se ligam seletivamente a proteínas de alta abundância. A preparação da amostra também pode incluir cromato- grafia de troca iônica, cromatografia de afinidade de íon metálico, fil- tração em gel, cromatografia hidrofóbica, cromatofocalização, croma- tografia de adsorção, focalização isoelétrica e técnicas relacionadas. Os filtros de peso molecular incluem membranas que separam as mo- léculas com base no tamanho e no peso molecular. Esses filtros po-

dem ainda empregar osmose reversa, nanofiltração, ultrafiltração e microfiltração.

[00143] Os termos "fragmento de polipeptídeo" ou "fragmento", quando usados em referência a um polipeptídeo, referem-se a um po- lipeptídeo no qual os resíduos de aminoácidos são excluídos em com- paração com o próprio polipeptídeo de referência, mas onde a se- quência de aminoácidos remanescente é geralmente idêntica às posi- ções correspondentes no polipeptídeo de referência. Tais deleções podem ocorrer no terminal amino, internamente, ou no terminal carbo- xil do polipeptídeo de referência, ou alternativamente ambos. Os frag- mentos normalmente têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, pelo me- nos 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos de comprimento, pelo menos 75 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 100, 150, 200, 300, 500 ou mais aminoácidos de comprimento. Eles podem ser, por exemplo, pelo menos e/ou incluindo 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980, 1000, 1020, 1040, 1060, 1080, 1100, 1120, 1140, 1160, 1180, 1200, 1220, 1240, 1260, 1280, 1300, 1320, 1340 ou mais longos, desde que sejam menores que o compri- mento do polipeptídeo de comprimento total. Alternativamente, eles não podem exceder e/ou excluir essa faixa, desde que sejam menores que o comprimento do polipeptídeo de comprimento total.

[00144] O termo "sonda" refere-se a qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a uma molécula alvo especificamente pre- tendida, por exemplo, um transcrito de nucleotídeo ou proteína codifi- cada por ou correspondente a um marcador. As sondas podem ser sintetizadas por um versado na técnica ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. Para fins de detecção da molécula alvo, as sondas podem ser especificamente projetadas para serem marcadas, conforme descrito neste documento. Exemplos de moléculas que po- dem ser utilizadas como sondas incluem, mas não estão limitados a, RNA, DNA, proteínas, anticorpos e moléculas orgânicas.

[00145] Como utilizado neste documento, o termo "rearranjado" re- fere-se a uma configuração de um locus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve, em que um segmento V é posicionado imedia- tamente adjacente a um segmento D-J ou J em uma conformação que codifica essencialmente um domínio VH e VL completo, respectiva- mente. Um locus de gene de imunoglobulina reorganizado pode ser identificado por comparação com o DNA da linhagem germinativa; um locus reorganizado terá pelo menos um elemento de homologia hep- tâmero/nonâmero recombinado.

[00146] Como utilizado neste documento, o termo "célula hospedei- ra recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") pretende se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve-se entender que tais termos se referem não apenas à célula em questão, mas também à descendência de uma célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes de- vido a mutações ou influências ambientais, essa descendência não pode, de fato, ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", como utilizado neste documento.

[00147] Como utilizado neste documento, o termo "anticorpo huma- no recombinante" inclui todos os anticorpos humanos que são prepa- rados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobuli- na humana ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, descrito adicionalmente abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospe-

deira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm re- giões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobu- lina da linha germinativa ou não germinativa humana. Em certas mo- dalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são in- divíduos a mutagênese in vitro ou, quando é utilizado um animal trans- gênico para sequências de Ig humanas, mutagênese somática in vivo ) e assim as sequências de aminoácidos das regiões V H e VL dos anti- corpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências de linhagem germinativa humana VH e VL , pode não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[00148] O termo "coestimulado", conforme utilizado com referência a células imunes ativadas, inclui a capacidade de um polipeptídeo co- estimulatório de fornecer um segundo sinal mediado por receptor não ativador (um "sinal coestimulatório") que induz a proliferação ou a fun- ção efetora. Por exemplo, um sinal coestimulatório pode resultar na secreção de citocinas, por exemplo, em uma célula T que recebeu um sinal mediado por receptor de célula T. As células imunes que recebe- ram um sinal mediado por receptor de célula, por exemplo, por meio de um receptor de ativação, são aqui referidas como "células imunes ativadas".

[00149] O termo "receptor coestimulatório" inclui receptores que transmitem um sinal coestimulatório para uma célula imune, por exem- plo, CD28. Como utilizado neste documento, o termo "receptores inibi- tórios" inclui receptores que transmitem um sinal negativo para uma célula imune (por exemplo, CTLA4, KIR3DL3 ou PD-1). Um sinal inibi- tório como transduzido por um receptor inibitório pode ocorrer mesmo se um receptor coestimulatório (como CD28) não estiver presente na célula imune e, portanto, não é simplesmente uma função da competi- ção entre receptores inibitórios e receptores coestimulatórios para li- gação de polipeptídeos coestimulatórios (Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205). A transmissão de um sinal inibitório para uma célula imunológica pode resultar em falta de resposta ou anergia ou morte celular programada na célula imunológica. De preferência, a transmis- são de um sinal inibitório opera por meio de um mecanismo que não envolve apoptose. Como utilizado neste documento, o termo "apopto- se" inclui morte celular programada que pode ser caracterizada usan- do técnicas que são conhecidas na técnica. A morte celular apoptótica pode ser caracterizada, por exemplo, pelo encolhimento celular, for- mação de bolhas na membrana e condensação da cromatina culmi- nando na fragmentação celular. As células em apoptose também exi- bem um padrão característico de clivagem internucleossômica do DNA. Dependendo da forma do polipeptídeo que se liga a um receptor, um sinal pode ser transmitido (por exemplo, por uma forma multivalen- te de HHLA2 e/ou polipeptídeo KIR3DL3) ou um sinal pode ser inibido (por exemplo,, por uma forma solúvel monovalente de um HHLA2 e/ou KIR3DL3), por exemplo, competindo com formas de ativação de HHLA2 e/ou KIR3DL3 para a ligação a um ou mais parceiros de liga- ção naturais. No entanto, existem casos em que um polipeptídeo solú- vel pode ser estimulatório. Os efeitos de um agente modulatório po- dem ser facilmente demonstrados usando ensaios de triagem de roti- na, conforme descrito neste documento.

[00150] Os termos "alto", "baixo", "intermediário" e "negativo" em conexão com a expressão do biomarcador celular referem-se à quan- tidade do biomarcador expressa em relação à expressão celular do biomarcador por uma ou mais células de referência.

A expressão de biomarcador pode ser determinada de acordo com qualquer método aqui descrito, incluindo, sem limitação, uma análise do nível celular, atividade, estrutura e semelhantes, de um ou mais ácidos nucleicos genômicos de biomarcadores, ácidos ribonucleicos e/ou polipeptídeos.

Em uma modalidade, os termos se referem a uma porcentagem defini- da de uma população de células que expressa o biomarcador nos ní- veis mais alto, intermediário ou mais baixo, respectivamente.

Essas porcentagens podem ser definidas como os superiores 0,1%, 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% ou mais, ou qualquer faixa entre, inclusive, de uma popula- ção de células que expressam altamente ou fracamente o biomarca- dor.

O termo "baixo" exclui células que não expressam o biomarcador de maneira detectável, pois essas células são "negativas" para a ex- pressão do biomarcador.

O termo "intermediário" inclui células que ex- pressam o biomarcador, mas em níveis inferiores à população que o expressa no nível "alto". Em outra modalidade, os termos também po- dem se referir a, ou em alternativa referir-se a, populações de células de expressão de biomarcador identificadas por regiões de gráfico qua- litativas ou estatísticas.

Por exemplo, as populações de células classi- ficadas usando citometria de fluxo podem ser discriminadas com base no nível de expressão do biomarcador, identificando gráficos distintos com base na análise de fração detectável, tal como com base em in- tensidades médias de fluorescência e semelhantes, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Essas regiões de gráfico podem ser refinadas de acordo com o número, forma, sobreposição e seme- lhantes com base em métodos bem conhecidos na técnica para o bio- marcador de interesse.

Em ainda outra modalidade, os termos também podem ser determinados de acordo com a presença ou ausência de expressão para biomarcadores adicionais.

[00151] Conforme descrito acima, o termo "resposta" é geralmente relacionado a, por exemplo, determinar os efeitos na progressão, efi- cácia ou resultado de uma intervenção clínica. Em algumas modalida- des, as respostas se referem diretamente a uma mudança na massa e/ou volume tumoral após o início da intervenção clínica (por exemplo, administração de um anticorpo monoclonal anti-HHLA2, como 2G2, 4D1, 8A12, 8D2, 1C8, 2C4, 6D10, 4E5 ou 6F10 e anticorpos policlo- nais). Por exemplo, as respostas do distúrbio hiperproliferativo podem ser avaliadas de acordo com o tamanho de um tumor após a interven- ção sistêmica em comparação com o tamanho e as dimensões iniciais medidas por TC, PET, mamografia, ultrassom ou palpação. As respos- tas também podem ser avaliadas por medição com compasso ou exa- me patológico do tumor após biópsia ou ressecção cirúrgica. A respos- ta pode ser registrada de forma quantitativa, como alteração porcentu- al no volume do tumor ou de forma qualitativa, como "resposta patoló- gica completa" (pCR), "remissão clínica completa" (cCR), "remissão clínica parcial" (cPR), "doença clínica estável" (cSD), "doença clínica progressiva" (cPD) ou outros critérios qualitativos. A avaliação pode ser feita logo após o início da intervenção clínica, por exemplo, após algumas horas, dias, semanas ou preferencialmente após alguns me- ses. Um ponto final típico para avaliação da resposta é após o término da intervenção clínica ou após a remoção cirúrgica de células tumorais residuais e/ou do leito tumoral.

[00152] Como utilizado neste documento, o termo "ligação específi- ca" refere-se à ligação do anticorpo a um antígeno predeterminado. Normalmente, o anticorpo se liga com uma afinidade (KD) de aproxi- madamente menos que 10-7 M, tal como aproximadamente menos que 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor quando determinado por tec- nlogia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) em um instru-

mento de ensaio BIACORE® usando HHLA2 humano como analito e o anticorpo como o ligante e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade de pelo menos 1,1-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6 -, 1,7-, 1,8- , 1,9-, 2,0-, 2,5-, 3,0-, 3,5-, 4,0-, 4,5-, 5,0-, 6,0-, 7,0-, 8,0-, 9,0- ou 10,0 vezes ou maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno prede- terminado ou um antígeno intimamente relacionado. As frases "um an- ticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas indistintamente aqui com o termo "um anti- corpo que se liga especificamente a um antígeno".

[00153] Como utilizado neste documento, "indivíduo" refere-se a qualquer animal saudável, mamífero ou humano, ou qualquer animal, mamífero ou humano que sofre de uma doença ou distúrbio relaciona- do a níveis de marcadores aberrantes. O termo "indivíduo" é intercam- biável com "paciente". O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[00154] A linguagem "substancialmente livre de precursores quími- cos ou outros produtos químicos" inclui preparações de anticorpo, po- lipeptídeo, peptídeo ou proteína de fusão em que a proteína é separa- da de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Em uma modalidade, a linguagem "substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos" inclui preparações de anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou proteína de fusão com menos de cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou não anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou pro- dutos químicos de proteína de fusão, mais preferencialmente menos de cerca de 20% de precursores químicos ou não anticorpo, polipeptí- deo, peptídeo ou produtos químicos de proteína de fusão, ainda mais preferencialmente menos de cerca de 10% de precursores químicos ou não anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou produtos químicos de pro- teína de fusão, e mais preferencialmente menos que cerca de 5% de precursores químicos ou não anticorpo, polipeptídeos, peptídeos ou produtos químicos de proteínas de fusão.

[00155] Como utilizado neste documento, o termo "sobrevida" inclui todos os seguintes: sobrevida até a mortalidade, também conhecida como sobrevida global (em que a mortalidade pode ser independente da causa ou relacionada ao tumor); "sobrevida livre de recorrência" (em que o termo recorrência deve incluir recorrência localizada e dis- tante); sobrevida livre de metástases; sobrevida livre de doença (em que o termo doença deve incluir câncer e doenças associadas a ele). A duração da referida sobrevida pode ser calculada por referência a um ponto de início definido (por exemplo, tempo de diagnóstico ou iní- cio do tratamento) e ponto final (por exemplo, morte, recorrência ou metástase). Além disso, os critérios para eficácia do tratamento podem ser expandidos para incluir resposta à quimioterapia, probabilidade de sobrevida, probabilidade de metástase dentro de um determinado pe- ríodo de tempo e probabilidade de recorrência do tumor.

[00156] Um "polinucleotídeo transcrito" ou "transcrito de nucleotí- deo" é um polinucleotídeo (por exemplo , um mRNA, hnRNA, um cDNA ou um análogo de tal RNA ou cDNA) que é complementar ou homólogo com a totalidade ou uma porção de um mRNA maduro feito por transcrição de um marcador da presente invenção e processamen- to pós-transcricional normal (por exemplo , emenda), se houver, do transcrito de RNA e transcrição reversa do transcrito de RNA.

[00157] Como utilizado neste documento, o termo "célula T" inclui células T CD4+ e células T CD8+. O termo célula T também inclui cé- lulas T auxiliares T tipo 1 e células T auxiliares T tipo 2. O termo "célu- la de apresentação de antígeno" inclui células de apresentação de an- tígeno profissionais (por exemplo, linfócitos B, monócitos, células den-

dríticas, células de Langerhans), bem como outras células de apresen- tação de antígeno (por exemplo, queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos).

[00158] As células T convencionais, também conhecidas como Tconv ou Teffs, têm funções efetoras (por exemplo, secreção de cito- cinas, atividade citotóxica, anti-autorreconhecimento e semelhantes) para aumentar as respostas imunes em virtude de sua expressão de um ou mais receptores de células T. Tcons ou Teffs são geralmente definidos como qualquer população de células T que não é uma Treg e incluem, por exemplo, células T ingênuas, células T ativadas, células T de memória, Tcons em repouso ou Tcons que se diferenciaram em relação a, por exemplo, linhagens Th1 ou Th2. Em algumas modalida- des, Teffs são um subconjunto de células T não Treg. Em algumas modalidades, Teffs são Teffs CD4+ ou Teffs CD8+, como linfócitos T auxiliares CD4+ (por exemplo, Th0, Th1, Tfh ou Th17) e linfócitos T citotóxicos CD8+. Conforme descrito adicionalmente neste documento, as células T citotóxicas são linfócitos T CD8+. "Tcons ingênuos" são células T CD4+ que se diferenciaram na medula óssea e passaram por um processo positivo e negativo de seleção central em um timo, mas ainda não foram ativadas por exposição a um antígeno. Os Tcons in- gênuos são comumente caracterizados pela expressão de superfície de L-selectina (CD62L), ausência de marcadores de ativação, como CD25, CD44 ou CD69, e ausência de marcadores de memória, como CD45RO. Acredita-se, portanto, que os Tcons ingênuos sejam quies- centes e não se dividem, exigindo interleucina-7 (IL-7) e interleucina- 15 (IL-15) para a sobrevivência homeostática (ver, pelo menos, WO 2010/101870). A presença e atividade de tais células são indesejáveis no contexto de supressão de respostas imunes. Ao contrário das Tregs, os Tcons não são anérgicos e podem proliferar em resposta à ativação do receptor de células T à base de antígeno ( Lechler et al.

(2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637). Nos tumo- res, as células exauridas podem apresentar marcas de anergia.

[00159] Como utilizado neste documento, o termo "configuração não rearranjada" ou "linhagem germinativa" em referência a um seg- mento V refere-se à configuração em que o segmento V não é recom- binado de modo a ser imediatamente adjacente a um segmento D ou J.

[00160] Como utilizado neste documento, o termo "vetor" se refere a um ácido nucleico com capacidade para transportar outro ácido nu- cleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um laço de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamífero epis- sômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão liga- dos operativamente. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombi- nante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente re- latório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de veto- res de expressão, como vetores virais ( por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que ser-

vem funções equivalentes.

[00161] Para ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" in- dica que dois ácidos nucleicos, ou sequências designadas dos mes- mos, quando alinhados e comparados de maneira ideal, são idênticos, com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas, em pelo me- nos cerca de 80% dos nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% ou mais dos nucleotídeos, e mais preferencial- mente pelo menos cerca de 97%, 98%, 99% ou mais dos nucleotí- deos. Alternativamente, existe uma homologia substancial quando os segmentos hibridam sob condições de hibridação seletiva, para o complemento da cadeia.

[00162] A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas se- quências (isto é, % identidade = # de posições idênticas/# total de po- sições x 100), levando em consideração o número de folgas e o com- primento de cada folga, que precisa ser introduzida para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determi- nação da porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitativos abaixo.

[00163] A porcentagem de identidade entre duas sequências de nu- cleotídeos pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível na world wide web no site da empresa GCG), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e uma diferença de peso de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou

6. A porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotí- deos ou aminoácidos também pode ser determinada usando o algorit- mo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)), que foi incor- porado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resí-

duos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de folga 12 e uma penalidade de folga de 4. Além disso, a porcentagem de identida- de entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444 453 (1970)) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível na world wide web no site da empresa GCG), usando uma matriz Blosum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de folga de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou

6.

[00164] As sequências de ácido nucleico e proteína da presente invenção podem ainda ser usadas como uma "sequência de consulta" para executar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 10. Pesquisas de nu- cleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências nucleotídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da presente invenção. Para obter alinhamentos com folgas para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389 3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados (disponíveis na world wide web no site do NCBI).

[00165] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células in- teiras, em um lisado celular ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. )Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado para longe de outros com- ponentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros áci- dos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia em coluna, agarose eletroforese em gel e outros bem conhecidos na técnica. (ver, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)).

[00166] O termo "determinação de um regime de tratamento ade- quado para o indivíduo" significa a determinação de um regime de tra- tamento (ou seja, uma única terapia ou uma combinação de diferentes terapias que são usadas para a prevenção e/ou tratamento do câncer no indivíduo) para um indivíduo que é iniciado, modificado e/ou termi- nado com base ou essencialmente com base ou pelo menos parcial- mente com base nos resultados da análise de acordo com a presente invenção. Um exemplo é determinar se deve fornecer terapia direcio- nada contra um câncer para fornecer terapia imunomodulatória (por exemplo, terapia moduladora da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3)). Outro exemplo é o início de uma tera- pia adjuvante após a cirurgia cujo objetivo é diminuir o risco de recor- rência, outro seria modificar a dosagem de um determinado quimiote- rápico. A determinação pode, além dos resultados da análise de acor- do com a presente invenção, ser baseada nas características pessoais do indivíduo a ser tratado. Na maioria dos casos, a determinação real do regime de tratamento adequado para o indivíduo será realizada pe- lo médico ou médico assistente. II. Anticorpos monoclonais, imunoglobulinas e polipeptídeos

[00167] A presente invenção refere-se, em parte, a anticorpos mo- noclonais isolados ou fragmentos dos mesmos que são direcionados contra HHLA2 (tais como anticorpos monoclonais e anticorpos policlo-

nais listados aqui). Essas moléculas, em parte, são caracterizadas por exibirem a capacidade de reconhecer a proteína HHLA2 em ensaios de diagnóstico, como imuno-histoquímica (IHC), Western blot, fluxo intercelular, ELISA e semelhantes. Essas moléculas, em parte, são caracterizadas po exibirem a capacidade de inibir a ligação de HHLA2 a receptores, como os receptores expressos em células T (por exem- plo, TMIGD2 e KIR3DL3)

[00168] O termo "HHLA2", também conhecido como proteína 2 de associação de repetição de terminal longo de retrovírus-H humano en- dógeno, HERV-H LTR de associação 2, B7y, B7H7, B7-H5, B7-H7, refere-se a um membro da família B7. A proteína HHLA2 tem expres- são limitada em tecidos humanos normais, mas é amplamente expres- sa em cânceres humanos. A proteína HHLA2 é uma proteína de mem- brana com três domínios semelhantes a Ig (IgV-IgC-IgV), enquanto outros membros da família B7 geralmente têm apenas dois domínios Ig (IgV-IgC).A proteína HHLA2 em tecidos humanos normais é expres- sa no epitélio do rim, intestino, vesícula biliar e mama, bem como nas células do trofoblasto da placenta. No sistema imunológico, a proteína HHLA2 é expressa constitutivamente em monócitos/macrófagos hu- manos. HHLA2 regula funções de células T humanas, incluindo, por exemplo, HHLA2 inibe a proliferação de células T e a produção de ci- tocinas e aumenta a produção de células T e a produção de citocinas. HHLA2 é expressa em níveis mais elevados em uma ampla faixa de cânceres humanos do colorretal, renal, pulmonar, pâncreas, ovário e próstata. HHLA2 também é expressa em cânceres humanos de tireoi- de, melanoma, fígado, bexiga, cólon, rim, mama e esôfago.

[00169] As estruturas e funções de HHLA2 são bem conhecidas na técnica, conforme descrito acima (ver, por exemplo, Xiao et al. (2015) Clin. Cancer Res.21:2201-2203, Janakiram et al. (2015)Clin. Cancer Res.21:2359-2366, Mager et al. (1999) Genomics 21:2359-2366,

Flajnik et al. (2012) Immunogenet. 64:571-590, Zhao et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110:9879-9884, and Zhu et al.(2013) Nat. Commun. 4:2043).

[00170] O termo "HHLA2" se destina a incluir fragmentos, variantes (por exemplo, variantes alélicas) e derivados dos mesmos. As sequên- cias representativas de cDNA de HHLA2 humano e da proteína HHLA2 humana são bem conhecidas na técnica e estão disponíveis ao público no National Center for Biotechnology Information (NCBI). As variantes de HHLA2humana incluem variante 1 (NM_007072.3 e NP_009003.1, que representa o transcrito mais longo e codifica a iso- forma mais longa a), variante 2 (NM_001282556.1 e NP_001269485.1, que representa o uso de um promotor alternativo e difere no 5' UTR, em comparação com a variante 1), variante 3 (NM_001282557.1 e NP_001269486.1, que representa o uso de um promotor alternativo e difere na 5' UTR, em comparação com a variante 1), variante 4 (NM_001282558.1 e NP_001269487.1, que codifica a isoforma b, re- presenta o uso de um promotor alternativo, difere na 5 'UTR e carece de um éxon alternativo em estrutura na região de codificação 3', em comparação com a variante 1, resultando em uma isoforma mais curta do que a isoforma a) e variante 5 (NM_001282559.1 e NP_001269488.1, que codifica a isoforma c, representa o uso de um promotor alternativo e tem múltiplas diferenças em comparação com a variante 2, resultando em uma UTR 5' distinta e causando o início da tradução em um códon de início alternativo, em comparação com a variante 1, resultando em um N-terminal distinto e uma isoforma mais curta do que a isoforma a). As sequências de ácido nucleico e de poli- peptídeos de ortólogos de HHLA2 em organismos que não humanos são bem conhecidas e incluem, por exemplo, frogHHLA2 (NM_001128644.1 e NP_001122116.1). Sequências representativas de ortólogos de HHLA2 são apresentadas abaixo na Tabela 1.

[00171] Os anticorpos anti-HHLA2 adequados para detectar a pro- teína HHLA2 são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os anticorpos Cat #: ab107119 e ab214327 (abcam), anticorpos PA5- 24146 e PA5-6313 (ThermoFisher Scientific), anticorpos MAB80841, AF8084, FAB80841R , FAB80841T e MAB8084 (sistemas de R&D), anticorpo AP52042PU-N (Origene), anticorpos NBP2-49187, MAB80842, H00011148-B01P e NBP2-32420 (Novus Biologicals), an- ticorpo GTX51981 (GeneTex), anticorpo HPA055478 (Atlas Antibodi- es), anticorpos LS-C321945, LS-C308228, LS-C246742, LS-C246743, LS-C246744, LS-C236210 e LS-C249186 (LifeSpan Biosiences), etc.

Além disso, vários construtos siRNA, shRNA, CRISPR para reduzir a expressão de HHLA2 podem ser encontrados nas listas de produtos comerciais das empresas acima referenciadas, como produto de shR- NA #TL312462, TF312462, TR312462, TG312462 e TL312462V, pro- duto de siRNA #SR323358 da Origene Technologies, produto de SiR- NA #i009616, i009616a, i009616b, i009616c, i009616d, iV009616, iV009616a, iV009616b, iV009616c, iV009616d, iAAV00961600, iA- AV00961601, iAAV00961602, iAAV00961603, iAAV00961604, iA- AV00961605, iAAV00961606, iAAV00961607, iAAV00961608 e iA- AV00961609, produto de CRISPR #K0950321, K0950301 , K0950302, K0950303, K0950304, K0950305, K0950306, K0950307, K0950308 e K0950311 (abm), produto de siRNA #sc-78498, produto de shRNA #sc-78498-V e sc-78498-SH, produto de CRISPR #sc-411576 sc- 411576-HDR, sc-411576-NIC, sand c-411576-NIC-2 (Santa Cruz Bio- technology), etc.

Deve-se notar que o termo pode ainda ser usado pa- ra se referir a qualquer combinação de recursos aqui descritos em re- lação às moléculas de HHLA2. Por exemplo, qualquer combinação de composição de sequência, porcentagem de identificação, comprimento de sequência, estrutura de domínio, atividade funcional, etc. pode ser usada para descrever uma molécula de HHLA2 da presente invenção.

[00172] O termo "via de HHLA2" inclui HHLA2 e interações de HHLA2 com um ou mais de seus parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e KIR3DL3.

[00173] O termo "TMIGD2" refere-se ao domínio transmembranar e de imunoglobulina contendo 2, CD28H, IGPR1 e IGPR-1, que é a pro- teína amembranar com ~ 10% de identidade de aminoácidos com CD28, CTLA-4, ICOS e PD-1. TMIGD2 tem um domínio extracelular semelhante ao IgV, uma região transmembranar e um domínio cito- plasmático rico em prolina com dois motivos de sinalização de tirosina. A proteína TMIGD2 é expressa constitutivamente em todas as células T ingênuas e na maioria das células assassinas naturais (NK), mas não nas células regulatórias T ou nas células B. A expressão TMIGD2 é lentamente perdida com estímulo repetitivo das células T. Consisten- te com isso, a TMIGD2 é expressa em apenas cerca de metade das células T de memória, e as células T negativas para TMIGD2 têm um fenótipo senescente e terminalmente diferenciado. TMIGD2 também demonstrou ser expresso em células endoteliais e epiteliais e funciona para reduzir a migração celular e promover a formação do tubo capilar durante a angiogênese.

[00174] As estruturas e funções de TMIGD2 são bem conhecidas na técnica, conforme descrito acima (ver, por exemplo, Xiao et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201-2203, Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res.21:2359-2366, Zhu et al. (2013) Nat. Commun. 4:2043, and Rahimi (2012) Cell 23:1646-1656).

[00175] O termo "TMIGD2" se destina a incluir fragmentos, varian- tes (por exemplo, variantes alélicas) e derivados dos mesmos. As se- quências representativas de cDNA de TMIGD2 humano e da proteína TMIGD2 humana são bem conhecidas na técnica e estão disponíveis ao público no National Center for Biotechnology Information (NCBI). As isoformas de TMIGD2humanas incluem a isoforma 1 (NM_144615.2 e

NP_653216.2), a isoforma 2 (NM_001169126.1 e NP_001162597.1; que usa um sítio de emenda alternativo em estrutura na região de co- dificação 3', em comparação com a variante 1, resultando em uma iso- forma mais curta , em comparação com a isoforma 1) e a isoforma 3 (NM_001308232.1 e NP_001295161.1, que carece de um éxon em estrutura alternativo na região de codificação 5' em comparação com a variante 1, resultando em uma isoforma mais curta, em comparação com a isoforma 1). As sequências de ácido nucléico e de polipeptídeos de ortólogos de TMIGD2em organismos que não humanos são bem conhecidas e incluem, por exemplo, chimpanzé TMIGD2(XM_009434393.2 e XP_009432668.2, e XM_001138228.4 e XP_001138228.3), e gadoTMIGD2(XM_005208980.3 e XP_005209037.1, XM_005208979.3 e XP_005209036.1 e XM_002688933.5 e XP_002688979.1). Sequências representativas de ortólogos de TMIGD2são apresentadas abaixo na Tabela 1.

[00176] Anticorpos anti-TMIGD2adequados para detectar a proteína TMIGD2são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, anti- corpos Cat #MAB8316, MAB83162, FAB8316R, FAB83162R, FAB83162G, FAB83162N, FAB83162S, FAB83162T, FAB83162U, e FAB83162V (R&D systems), antibody TA326695 (Origene), anticorpos PA5-52787, e PA5-38055 (ThermoFisher Scientific), anticorpos MAB83161, e NBP1-81164 (Novus Biologicals), etc..Além disso, vários construtos siRNA, shRNA, CRISPR para reduzir a expressão de TMIGD2podem ser encontrados nas listas de produtos comerciais das empresas acima referenciadas, como produto de shRNA #TF317829, TG317829, TL317829, TR317829 e TL317829V, produto de siRNA #SR314913 e produtos de CRISPR #KN204938, KN204938LP, KN204938RB e KN204938BN da Origene Technologies, produtos de siRNA #i024914, i024914a, i024914b, i024914c, i024914d, iV024914, iV024914a , iV024914b, iV024914c, iV024914d, iAAV02491400, iA-

AV02491401, iAAV02491402, iAAV02491403, iAAV02491404, iA- AV02491405, iAAV02491406, iAAV02491407, iAAV02491408 e iA- AV02491409 e produtos de CRISPR #K2409321, K2409301, K2409302, K2409303, K2409304, K2409305, K2409306, K2409307, K2409308, e K2409311 (Abm), produto de siRNA #sc-97757, produtos de shRNA #sc-97757-SH e sc-97757-V e produtos de CRISPR #sc- 414261, sc-414261-HDR, sc-414261-NIC, e sc-414261-NIC-2 (Santa Cruz Biotechnology), produtos de shRNA #SH888208 e SH874720 (Vigene Biosciences), etc.. Além disso, vários construtos de CRISPR para aumentar a expressão deTMIGD2 podem ser encontrados nas listas de produtos comerciais das empresas acima mencionadas, como produtos de CRISPR # K2409378, K2409377, K2409376, K2409375, K2409374, K2409373, K2409372, e K2409371 (Abm), produtos de CRISPR #sc-414261-ACT, sc-414261-ACT-2, sc-414261-LAC e sc- 414261-LAC-2 (Santa Cruz Biotechnology),etc. Deve-se notar que o termo pode ainda ser usado para se referir a qualquer combinação de recursos aqui descritos em relação às moléculas de TMIGD2. Por exemplo, qualquer combinação de composição de sequência, porcen- tagem de identificação, comprimento de sequência, estrutura de domí- nio, atividade funcional, etc. pode ser usada para descrever uma mo- lécula de TMIGD2da presente invenção.

[00177] As interações entre TMIGD2 e HHLA2bem como suas fun- ções, são bem conhecidas na técnica, conforme descrito acima (ver, por exemplo, Xiao et al. (2015) Clin. Cancer Res.21:2201-2203 and Janakiram et al. (2015)Clin. Cancer Res.21:2359-2366).

[00178] O termo "KIR3DL3", também conhecido como receptor se- melhante à imunoglobulina de célula assassina 3DL3, CD158Z, KIR3DL7, KIR44, KIRC1, KIR2DS2, receptor semelhante à imunoglo- bulina de célula assassina, três domínios Ig e cauda citoplasmática longa 3, refere-se a um membro de uma família de glicoproteína transmembranar expressa por células assassinas naturais e subcon- juntos de células T. Os genes do receptor semelhante à imunoglobuli- na de célula assassina (KIR) são polimórficos e altamente homólogos e são encontrados em um grupo no cromossomo 19q13.4 dentro do complexo de receptor de leucócito de 1 Mb (LRC). O conteúdo do ge- ne do agrupamento de genes KIR varia entre os haplótipos, embora vários genes de "estrutura" sejam encontrados em todos os haplótipos (KIR3DL3, KIR3DP1, KIR3DL4, KIR3DL2). As proteínas KIR são clas- sificadas pelo número de domínios extracelulares de imunoglobulina (2D ou 3D) e por terem um domínio citoplasmático longo (L) ou curto (S). As proteínas KIR com o domínio citoplasmático longo transduzem sinais inibitórios após a ligação do ligante por meio de um motivo inibi- tório à base de tirosina imune (ITIM), enquanto as proteínas KIR com o domínio citoplasmático curto não possuem o motivo ITIM e, em vez disso, associam-se à proteína de ligação à proteína tirosina quinase TYRO para transduzir sinais de ativação. Os ligandos para várias pro- teínas KIR são subconjuntos de moléculas HLA classe I; assim, acredi- ta-se que as proteínas KIR desempenhem um papel importante na re- gulação da resposta imune. Esse gene é um dos loci "estruturais" pre- sentes em todos os haplótipos. A proteína KIR3DL3 possui uma se- quência de sinal N-terminal, 3 domínios Ig, uma região transmembra- nar sem um resíduo carregado positivamente e uma cauda citoplasmá- tica longa contendo um motivo inibitório baseado em tirosina imunor- receptor (ITIM). KIR3DL3 não tem a região de pedúnculo encontrada em outros KIRs.

[00179] As estruturas e funções de KIR3DL3 são bem conhecidas na técnica, conforme descrito acima (ver, por exemplo, Hsuet al. (2002) Immunol Rev. 190:40-52,Trompeteret al. (2005) J. Immunol. 174:4135-4143, Trundleyet al. (2006) Immunogenet. 57:904-916, and Joneset al. (2006) Immunogenet. 58:614-627).

[00180] O termo "KIR3DL3" se destina a incluir fragmentos, varian- tes (por exemplo, variantes alélicas) e derivados dos mesmos. As se- quências representativas de cDNA de KIR3DL3 e proteína de KIR3DL3 humana são bem conhecidas na técnica e estão disponíveis ao público no National Center for Biotechnology Information (NCBI). Por exemplo, pelo menos uma isoforma de KIR3DL3 humana é co- nhecida: KIR3DL3 humana (NM_153443.4) é codificável pelo transcrito (NP_703144.3).As sequências de ácido nucleico e de polipeptídeos de ortólogos de KIR3DL3 em organismos que não humanos são bem co- nhecidas e incluem, por exemplo, chimpanzé KIR3DL3 (XM_003316679.3 e XP_003316727.3), macaco Rhesus KIR3DL3 (NM_001104552.2 e NP_001098022.1), camundongo KIR3DL3 (NM_001310690.1 e NP_001297619.1, NM_177749.4 e NP_808417.2, NM_177748.2 e NP_808416.1), e rato KIR3DL3 (NM_181479.2 e NP_852144.1). Sequências representativas de ortólogos de KIR3DL3 são apresentadas abaixo na Tabela 1.

[00181] Anticorpos anti-KIR3DL3 adequados para detectar a proteí- na KIR3DL3 são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, anticorpos Cat #: FAB8919R, MAB8919, FAB8919G, FAB8919N, FAB8919S, FAB8919T, FAB8919U, e FAB8919V(R&D systems), anti- corpo AP52374PU-N (Origene), anticorpo PA5-26178 (ThermoFisher Scientific), anticorpos OAAB05761, OAAF08125, OAAN04122, OA- CA09134, OACA09135, OACD04988, e OASG01190 (Aviva Systems Biology), etc..Além disso, vários construtos de siRNA, shRNA, CRISPR para reduzir a expressão de KIR3DL3 podem ser encontrados nas lis- tas de produtos comerciais das empresas acima referenciadas, tais como produtos de shRNA #TF303684, TR303684, TG303684, TL303684, TL303684V, produtos de siRNA #SR314516 e produtos de CRISPR #KN224383, KN224383BN, KN224383RB e KN224383LP da Origene Technologies, produtos de siRNA #i011627, i011627a,

i011627b, i011627c, i011627d, iV011627, iV011627a, iV011627b, iV011627c, iV011627d, iAAV01162700, iAAV01162701, iA- AV01162702, iAAV01162703, iAAV01162704, iAAV01162705, iA- AV01162706, iAAV01162707, iAAV01162708, e iAAV01162709, e produtos de CRISPR #K1151421, K1151401, K1151402, K1151403, K1151404, K1151405, K1151406, K1151407, K1151408, e K1151411 (Abm), produto de siRNA #sc-60892, produtos de shRNA #sc-60892- SH e sc-60892-V e produtos de CRISPR #sc-406227, sc-406227-KO- 2, sc-406227-HDR-2, sc-406227-NIC, e sc-406227-NIC-2 (Santa Cruz Biotechnology), etc.. Deve-se notar que o termo pode ainda ser usado para se referir a qualquer combinação de recursos aqui descritos em relação às moléculas de KIR3DL3. Por exemplo, qualquer combina- ção de composição de sequência, porcentagem de identificação, com- primento de sequência, estrutura de domínio, atividade funcional, etc. pode ser usada para descrever uma molécula de KIR3DL3 da presen- te invenção.

[00182] O termo "subtipos de células do sangue periférico" refere- se a tipos de células normalmente encontrados no sangue periférico, incluindo, mas não se limitando a, eosinófilos, neutrófilos, células T, monócitos, células NK, granulócitos e células B.

[00183] O termo "anticorpo humano recombinante" inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isola- dos por meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou trans- cromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibrido- ma preparado a partir do mesmo, descrito adicionalmente abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para ex- pressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos re- combinantes e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isola-

dos por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa ou não germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais an- ticorpos humanos recombinantes são indivíduos a mutagênese in vitro ou, quando é utilizado um animal transgênico para sequências de Ig humanas, mutagênese somática in vivo ) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequên- cias de linhagem germinativa humana VH e VL , pode não existir natu- ralmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[00184] O termo "amostra" usado para detectar ou determinar a presença ou nível de pelo menos um biomarcador é tipicamente san- gue total, plasma, soro, saliva, urina, pedaços de fezes (por exemplo, fezes), lágrimas e qualquer outro fluido corporal (por exemplo, como descrito acima sob a definição de "fluidos corporais"), ou uma amostra de tecido (por exemplo, biópsia), como um intestino delgado, amostra de cólon ou tecido de ressecção cirúrgica. Em certos casos, o método da presente invenção compreende ainda obter a amostra do indivíduo antes de detectar ou determinar a presença ou o nível de pelo menos um marcador na amostra.

[00185] Um "agente de interferência de RNA", como utilizado neste documento, é definido como qualquer agente que interfere ou inibe a expressão de um gene de biomarcador alvo por interferência de RNA (RNAi). Tais agentes de interferência de RNA incluem, mas não estão limitados a, moléculas de ácido nucleico incluindo moléculas de RNA que são homólogas ao gene biomarcador alvo da presente invenção, ou um fragmento das mesmas, RNA de interferência curto (siRNA) e pequenas moléculas que interferem na ou inibem a expressão de um ácido nucleico de biomarcador alvo por interferência de RNA (RNAi).

[00186] "Interferência de RNA (RNAi)" é um processo conservado evolutivamente em que a expressão ou introdução de RNA de uma sequência que é idêntica ou altamente semelhante a um ácido nuclei- co de biomarcador alvo resulta na degradação específica da sequên- cia ou silenciamento de gene pós-transcricional específico (PTGS) de RNA mensageiro (mRNA) transcrito desse gene direcionado (ver Co- burn, G. e Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225), inibindo assim a expressão do ácido nucleico do biomarcador alvo. Em uma modali- dade, o RNA é RNA de fita dupla (dsRNA). Este processo foi descrito em plantas, invertebrados e células de mamíferos. Na natureza, o RNAi é iniciado pela endonuclease específica de dsRNA Dicer, que promove a clivagem processiva de dsRNA longo em fragmentos de fita dupla denominados siRNAs. Os siRNAs são incorporados a um com- plexo de proteínas que reconhece e cliva os mRNAs alvo. O RNAi também pode ser iniciado pela introdução de moléculas de ácido nu- cleico, por exemplo , siRNAs sintéticos, shRNAs ou outros agentes interferentes de RNA, para inibir ou silenciar a expressão de ácidos nucleicos de biomarcadores alvo. Como utilizado neste documento, "inibição da expressão do ácido nucleico de biomarcador alvo" ou "ini- bição da expressão do gene marcador" inclui qualquer diminuição na expressão ou atividade da proteína ou nível do ácido nucleico de bio- marcador alvo ou proteína codificada pelo ácido nucleico de biomarca- dor alvo. A redução pode ser de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% ou mais em comparação com a expres- são de um ácido nucleico do biomarcador alvo ou a atividade ou nível da proteína codificada por um ácido nucleico do biomarcador alvo que não foi alvo de um agente interferente de RNA.

[00187] Além do RNAi, a edição do genoma pode ser usada para modular o número de cópias ou a sequência genética de um biomar- cador de interesse, como knockout constitutivo ou induzido ou muta- ção de um biomarcador de interesse, como um componente de via HHLA2 como HHLA2, TMIGD2 e/ou KIR3DL3. Por exemplo, o sistema CRISPR-Cas pode ser usado para a edição precisa de ácidos nuclei- cos genômicos (por exemplo, para criar mutações não funcionais ou nulas). Em tais modalidades, o RNA guia CRISPR e/ou a enzima Cas podem ser expressos. Por exemplo, um vetor contendo apenas o RNA guia pode ser administrado a um animal ou células transgênicas para a enzima Cas9. Estratégias semelhantes podem ser usadas (por exemplo, dedo de zinco projetado, efetores semelhantes a ativadores de transcrição (TALEs) ou meganucleases de homing). Tais sistemas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Pat. U.S.

8.697.359; Sander and Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov and Hannon (2010) Mol. Cell 37:7; Pat. U.S. Publ. 2014/0087426 and 2012/0178169; Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29:135-136; Boch et al. (2009) Science 326:1509- 1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:e19722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315- 6325; Zhang et al. (2011) Nat. Biotech. 29:149-153; Miller et al. (2011) Nat. Biotech. 29:143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47). Tais estratégias genéticas podem usar sistemas de expressão consti- tutivos ou sistemas de expressão induzíveis de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

[00188] "RNA de interação com Piwi (piRNA)" é a maior classe de pequenas moléculas de RNA não codificantes. Os piRNAs formam complexos RNA-proteína por meio de interações com as proteínas pi- wi. Esses complexos piRNA têm sido associados ao silenciamento de genes epigenéticos e pós-transcricionais de retrotransposons e outros elementos genéticos em células da linhagem germinativa, particular-

mente aqueles na espermatogênese. Eles são distintos do microRNA (miRNA) em tamanho (26-31 nt em vez de 21-24 nt), falta de conser- vação de sequência e complexidade aumentada. No entanto, como outros pequenos RNAs, acredita-se que os piRNAs estejam envolvidos no silenciamento de genes, especificamente no silenciamento de transposons. A maioria dos piRNAs é antissenso para as sequências do transposon, sugerindo que os transposons são o alvo do piRNA. Em mamíferos, parece que a atividade de piRNAs no silenciamento do transposon é mais importante durante o desenvolvimento do embrião, e em C. elegans e humanos, os piRNAs são necessários para a es- permatogênese. O piRNA tem um papel no silenciamento do RNA através da formação de um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC).

[00189] "Aptâmeros" são moléculas de oligonucleotídeos ou peptí- deos que se ligam a uma molécula alvo específica. "Aptâmeros de áci- do nucleico" são espécies de ácido nucleico que foram engenheiradas por meio de rodadas repetidas de seleção in vitro ou, de forma equiva- lente, SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial) para se ligar a vários alvos moleculares, como pequenas moléculas, proteínas, ácidos nucleicos e até mesmo células, tecidos e organismos. "Aptâmeros de peptídeos" são proteínas artificiais seleci- onadas ou projetadas para ligar moléculas alvo específicas. Essas pro- teínas consistem em um ou mais laços de peptídeo de sequência vari- ável exibida por uma espinha dorsal de proteína. Eles são tipicamente isolados de bibliotecas combinatórias e frequentemente melhorados subsequentemente por mutação direcionada ou ciclos de mutagênese e seleção de região variável. A "proteína de afímero", uma evolução de aptâmeros de peptídeo, é uma proteína pequena e altamente estável projetada para exibir laços de peptídeo que fornece uma superfície de ligação de alta afinidade para uma proteína alvo específica. É uma proteína de baixo peso molecular, 12–14 kDa, derivada da família dos inibidores de protease de cisteína das cistatinas. Os aptâmeros são úteis em aplicações biotecnológicas e terapêuticas, pois oferecem propriedades de reconhecimento molecular que rivalizam com as da biomolécula comumente usada, os anticorpos. Além de seu reconhe- cimento discriminado, os aptâmeros oferecem vantagens sobre os an- ticorpos, pois eles podem ser engenheirados completamente em um tubo de ensaio, são facilmente produzidos por síntese química, possu- em propriedades de armazenamento desejáveis e provocam pouca ou nenhuma imunogenicidade em aplicações terapêuticas.

[00190] "RNA de interferência curto" (siRNA), também referido aqui como "RNA de interferência pequeno" é definido como um agente que funciona para inibir a expressão de um ácido nucleico de biomarcador alvo, por exemplo, por RNAi. Um siRNA pode ser sintetizado quimica- mente, pode ser produzido por transcrição in vitro ou pode ser produ- zido dentro de uma célula hospedeira. Em uma modalidade, siRNA é uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA) de cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento, de preferência cerca de 15 a cer- ca de 28 nucleotídeos, mais preferencialmente cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente cerca de 19, 20 , 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento e pode conter uma sa- liência 3' e/ou 5' em cada fita com um comprimento de cerca de 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos. O comprimento da saliência é independente entre as duas fitas, ou seja, o comprimento da saliência em uma fita não depende do comprimento da saliência na segunda fita. De prefe- rência, o siRNA é capaz de promover a interferência de RNA através da degradação ou silenciamento de gene pós-transcricional específico (PTGS) do RNA mensageiro alvo (mRNA).

[00191] Em outra modalidade, um siRNA é um pequeno RNA hair- pin (também chamado de laço de haste) (shRNA). Em uma modalida-

de, esses shRNAs são compostos de uma fita antissenso curta (por exemplo, 19-25 nucleotídeos), seguida por um laço de 5-9 nucleotí- deos e a fita de sentido análoga. Alternativamente, a fita de sentido pode preceder a estrutura do laço de nucleotídeo e a fita antissenso pode seguir. Estes shRNAs podem estar contidos em plasmídeos, re- trovírus e lentivírus e expressos a partir, por exemplo, do promotor U6 pol III ou outro promotor (ver, por exemplo, Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501 aqui incorporado por referência).

[00192] Agentes de interferência de RNA, por exemplo , moléculas de siRNA, podem ser administrados a um paciente com ou em risco de ter câncer, para inibir a expressão de um gene biomarcador que é su- perexpresso no câncer e, assim, tratar, prevenir ou inibir o câncer no indivíduo.

[00193] O termo "molécula pequena" é um termo da técnica e inclui moléculas que são inferiores a cerca de 1000 pesos moleculares ou inferiores a cerca de 500 pesos moleculares. Em uma modalidade, pe- quenas moléculas não compreendem exclusivamente ligações peptídi- cas. Em outra modalidade, pequenas moléculas não são oligoméricas. Compostos moleculares pequenos exemplificativos que podem ser rastreados quanto à atividade incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, carboidratos, peque- nas moléculas orgânicas (por exemplo, policetídeos) (Cane et al. 1998. Science 282:63) e bibliotecas de extratos de produtos naturais. Em outra modalidade, os compostos são pequenos compostos orgânicos não peptídicos. Em outra modalidade, uma pequena molécula não é biossintética.

[00194] O termo "modulador seletivo" ou "modular seletivamente" conforme aplicado a um agente biologicamente ativo refere-se à capa- cidade do agente de modular o alvo, tal como uma população de célu- las, atividade de sinalização, etc. em comparação com a população de células fora do alvo, atividade de sinalização , etc. por meio de intera- ção direta ou de interação com o alvo. Por exemplo, um agente que inibe seletivamente a interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e KIR3DL3, sobre outra interação entre HHLA2 e outro parceiro de ligação e/ou tal(is) interação(ões) em uma população de células de interesse pode ter uma atividade contra a terapia moduladora da via HHLA2 (por exemplo, modulador da inte- ração entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e KIR3DL3, interação que é pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110% , 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 2x (vezes) ou mais do que a atividade do agente contra pelo menos um outro parceiro de ligação (por exemplo, pelo menos cerca de 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45x, 50x, 55x, 60x, 65x, 70x, 75x, 80x, 85x, 90x, 95x, 100x, 105x, 110x, 120x, 125x, 150x, 200x, 250x, 300x, 350x, 400x, 450x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x, 1500x, 2000x, 2500x, 3000x, 3500x, 4000x, 4500x, 5000x, 5500x, 6000x, 6500x, 7000x, 7500x, 8000x, 8500x, 9000x, 9500x, 10000x ou superior, ou qualquer faixa entre, in- clusive) Essas métricas são normalmente expressas em termos de quantidades relativas de agente necessárias para reduzir a intera- ção/atividade pela metade.

[00195] Mais geralmente, o termo "seletivo" refere-se a uma ação ou função preferencial. O termo "seletivo" pode ser quantificado em termos do efeito preferencial em um alvo específico de interesse em relação a outros alvos. Por exemplo, uma variável medida (por exem- plo, modulação de Tregs/Bregs versus outras células, como outras cé- lulas imunes como Tcons) pode ser 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes,

5 vezes, 5,5 vezes, 6 vezes, 6,5 vezes, 7 vezes, 7,5 vezes, 8 vezes, 8,5 vezes, 9 vezes, 9,5 vezes , 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 ve- zes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 45 vezes, 50 vezes, 55 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais ou qualquer faixa entre inclusive (por exemplo, 50% a 16 vezes), dife- rente em um alvo de interesse versus alvos não intencionais ou inde- sejados. A mesma análise de vezes pode ser usada para confirmar a magnitude de um efeito em um determinado tecido, população de célu- las, variável medida, efeito medido e semelhantes, como a razão Tregs:Tcons, razão Bregs:Tcons, taxa de crescimento celular hiperpro- liferativo ou volume, taxa ou número de proliferação de Tregs/Bregs e semelhantes.

[00196] Em contraste, o termo "específico" refere-se a uma ação ou função de exclusão. Por exemplo, a modulação específica das inte- rações HHLA2-TMIGD2 e HHLA2-KIR3DL3 se refere à modulação ex- clusiva das interações HHLA2/TMIDG2 e HHLA2/KIR3DL3, respecti- vamente, e não modulação de HHLA2 com outro ligante. Em outro exemplo, a ligação específica de um anticorpo a um antígeno prede- terminado refere-se à capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno de interesse sem se ligar a outros antígenos. Normalmente, o anticor- po se liga com uma afinidade (KD) de aproximadamente menos que 1 x 10-7 M, como aproximadamente menos que 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10- 11 M, ou ainda inferior quando determinado pela tecnologia de resso- nância de plasmon de superfície (SPR) em um instrumento de ensaio BIACORE® usando um antígeno de interesse como analito e o anti- corpo como o ligante e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade de pelo menos 1,1-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6 -, 1,7-, 1,8-, 1,9- , 2,0-, 2,5-, 3,0-, 3,5-, 4,0-, 4,5-, 5,0-, 6,0-, 7,0-, 8,0-, 9,0- ou 10,0 vezes ou maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não especí-

fico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predetermina- do ou um antígeno intimamente relacionado. Além disso, KD é o inver- so de KA. As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas indistintamente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um an- tígeno".

[00197] O termo "sensibilizar" significa alterar células, como células cancerígenas ou células tumorais, de uma forma que permite um tra- tamento mais eficaz com uma terapia (por exemplo, terapia modulado- ra da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e KIR3DL3), sozinhos ou em combinação com uma imunoterapia, como uma tera- pia de inibição de ponto de verificação imune). Em algumas modalida- des, as células normais não são afetadas a ponto de fazer com que as células normais sejam indevidamente lesadas pela terapia (por exem- plo, terapia moduladora da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e KIR3DL3), isoladamente ou em combinação com uma imunoterapia, como uma terapia de inibição do ponto de verificação imune). Uma sensibilidade aumentada ou uma sensibilidade reduzida a um tratamento terapêutico é medida de acordo com um método co- nhecido na técnica para o tratamento particular e métodos descritos aqui abaixo, incluindo, mas não se limitando a, ensaios de proliferação celular (Tanigawa N, Kern DH, Kikasa Y , Morton DL, Cancer Res 1982; 42:2159-2164), ensaios de morte celular (Weisenthal LM, Sho- emaker RH, Marsden JA, Dill PL, Baker JA, Moran EM, Cancer Res 1984; 94:161-173; Weisenthal LM, Lippman ME, Cancer Treat Rep 1985; 69: 615-632; Weisenthal LM, In: Kaspers GJL, Pieters R, Twentyman PR, Weisenthal LM, Veerman AJP, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic

Publishers, 1993: 415-432; Weisenthal L M, Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90). A sensibilidade ou resistência também pode ser medida em animais medindo a redução do tamanho do tumor durante um período de tempo, por exemplo, 6 meses para humanos e 4-6 se- manas para ratos. Uma composição ou método sensibiliza a resposta a um tratamento terapêutico se o aumento na sensibilidade ao trata- mento ou a redução na resistência for de 5% ou mais, por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais, para 2 vezes, 3 ve- zes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes ou mais, em comparação com a sensibilidade ao tratamento ou resistência na au- sência de tal composição ou método. A determinação da sensibilidade ou resistência a um tratamento terapêutico é rotineira na técnica e está dentro da habilidade de um versado comum. Deve ser entendido que qualquer método aqui descrito para aumentar a eficácia de um imu- nomodulatório pode ser igualmente aplicado a métodos para sensibili- zar células hiperproliferativas ou cancerígenas (por exemplo, células resistentes) à terapia.

[00198] O termo "efeito sinérgico" refere-se ao efeito combinado de dois ou mais agentes terapêuticos, como dois ou mais moduladores da via HHLA2, um modulador da via HHLA2 e uma imunoterapia, modu- ladores da via HHLA2 sozinhos ou em combinação com uma imunote- rapia, como uma terapia de inibição do ponto de verificação imune e semelhantes podem ser maiores do que a soma dos efeitos separados dos agentes anticâncer por si só.

[00199] O termo "indivíduo" refere-se a qualquer animal saudável, mamífero ou humano, ou qualquer animal, mamífero ou humano afe- tado com uma condição de interesse (por exemplo, câncer). O termo "indivíduo" é intercambiável com "paciente".

[00200] O termo "sobrevida" inclui todos os seguintes: sobrevida até a mortalidade, também conhecida como sobrevida global (em que a mortalidade pode ser independente da causa ou relacionada ao tu- mor); "sobrevida livre de recorrência" (em que o termo recorrência de- ve incluir recorrência localizada e distante); sobrevida livre de metásta- ses; sobrevida livre de doença (em que o termo doença deve incluir câncer e doenças associadas a ele). A duração da referida sobrevida pode ser calculada por referência a um ponto de início definido (por exemplo, tempo de diagnóstico ou início do tratamento) e ponto final (por exemplo, morte, recorrência ou metástase). Além disso, os crité- rios para eficácia do tratamento podem ser expandidos para incluir resposta à quimioterapia, probabilidade de sobrevida, probabilidade de metástase dentro de um determinado período de tempo e probabilida- de de recorrência do tumor.

[00201] O termo "efeito terapêutico" refere-se a um efeito local ou sistêmico em animais, particularmente mamíferos, e mais particular- mente humanos, causado por uma substância farmacologicamente ativa. O termo, portanto, significa qualquer substância destinada ao uso no diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de do- enças ou na melhoria do desenvolvimento físico ou mental desejável e condições em um animal ou humano. A frase "quantidade terapeuti- camente eficaz" significa aquela quantidade de tal substância que pro- duz algum efeito local ou sistêmico desejado em uma razão benefí- cio/risco razoável aplicável a qualquer tratamento. Em certas modali- dades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de- penderá de seu índice terapêutico, solubilidade e semelhantes. Por exemplo, certos compostos descobertos pelos métodos da presente invenção podem ser administrados em uma quantidade suficiente para produzir uma razão benefício/risco razoável aplicável a tal tratamento.

[00202] Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quanti- dade eficaz", como utilizados neste documento, significam a quantida-

de de um composto, material ou composição que compreende um composto da presente invenção que é eficaz para produzir algum efei- to terapêutico desejado em pelo menos uma subpopulação de células em um animal em uma razão risco/benefício razoável aplicável a qual- quer tratamento médico.

A toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostos em questão podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimen- tais, por exemplo, para determinar o LD50 e o ED50. Composições que exibem altos índices terapêuticos são preferidas.

Em algumas modali- dades, o LD50 (dosagem letal) pode ser medido e pode ser, por exem- plo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100 %, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais reduzido para o agente em relação a nenhuma administração do agente.

Da mesma forma, o ED50 (ou seja, a concentração que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) pode ser medido e pode ser, por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais aumentado para o agente em relação a nenhuma administração do agente.

Além disso, da mesma forma, o IC50 (ou seja, a concentração que atinge metade do máximo efeito ci- totóxico ou citostático em células cancerígenas) pode ser medido e pode ser, por exemplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% , 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais aumentado para o agente em relação a nenhuma administração do agente.

Em algumas modalidades, o cres- cimento de células cancerígenas em um ensaio pode ser inibido em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mesmo 100%. A morte de células cancerígenas pode ser promovida em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,

55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95% ou até mesmo 100%. Em outra modalidade, pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou até mesmo 100% de diminuição no número de cé- lulas cancerígenas e/ou uma malignidade sólida pode ser alcançada.

[00203] O termo "substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos" inclui preparações de anticorpo, polipep- tídeo, peptídeo ou proteína de fusão em que a proteína é separada de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvi- dos na síntese da proteína. Em uma modalidade, a linguagem "subs- tancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos quími- cos" inclui preparações de anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou proteí- na de fusão com menos de cerca de 30% (em peso seco) de precurso- res químicos ou não anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou produtos químicos de proteína de fusão, mais preferencialmente menos de cer- ca de 20% de precursores químicos ou não anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou produtos químicos de proteína de fusão, ainda mais prefe- rencialmente menos de cerca de 10% de precursores químicos ou não anticorpo, polipeptídeo, peptídeo ou produtos químicos de proteína de fusão, e mais preferencialmente menos que cerca de 5% de precurso- res químicos ou não anticorpo, polipeptídeos, peptídeos ou produtos químicos de proteínas de fusão.

[00204] Um "polinucleotídeo transcrito" ou "transcrito de nucleotí- deo" é um polinucleotídeo (por exemplo , um mRNA, hnRNA, cDNA, miRNA maduro, pré-miRNA, pri-miRNA, miRNA*, anti-miRNA, ou um sítio de ligação de miRNA, ou uma variante do mesmo ou um análogo de tal RNA ou cDNA) que é complementar ou homólogo com a totali- dade ou uma porção de um mRNA maduro feito por transcrição de um marcador da presente invenção e processamento pós-transcricional normal (por exemplo , emenda), se houver, do transcrito de RNA e transcrição reversa do transcrito de RNA.

[00205] O termo "vetor" refere-se a um ácido nucleico com capaci- dade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um laço de DNA de fita du- pla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adici- onais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma numa célula hospedeira na qual são introdu- zidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replica- ção bacteriana e vetores de mamífero epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente. Tais ve- tores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante estão frequente- mente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No en- tanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expres- são, como vetores virais ( por exemplo, retrovírus com defeito de repli- cação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.

[00206] Existe uma correspondência conhecida e definida entre a sequência de aminoácidos de uma proteína em particular e as se- quências de nucleotídeos que podem codificar para a proteína, con- forme definido pelo código genético (mostrado abaixo). Da mesma forma, existe uma correspondência conhecida e definida entre a se-

quência de nucleotídeos de um ácido nucleico particular e a sequência de aminoácidos codificada por aquele ácido nucleico, conforme defini- do pelo código genético.

CÓDIGO GENÉTICO Alanina (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT Arginina (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT Asparagina (Asn, N) AAC, AAT Ácido aspártico (Asp, D) GAC, GAT Cisteína (Cys, C) TGC, TGT Ácido glutâmico (Glu, E) GAA, GAG Glutamina (Gln, Q) CAA, CAG Glicina (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT Histidina (His, H) CAC, CAT Isoleucina (Ile, I) ATA, ATC, ATT Leucina (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG Lisina (Lys, K) AAA, AAG Metionina (Met, M) ATG Fenilalanina (Phe, F) TTC, TTT Prolina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT Serina (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT Treonina (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT Triptofano (Trp, W) TGG Tirosina (Tyr, Y) TAC, TAT Valina (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT Sinal de terminação (extremidade) TAA, TAG, TGA

[00207] Uma característica importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância, em que, para a maioria dos aminoáci- dos usados para fazer proteínas, mais de um tripleto de nucleotídeo codificador pode ser usado (ilustrado acima). Portanto, várias sequên- cias nucleotídicas diferentes podem codificar para uma dada sequên-

cia de aminoácidos. Tais sequências nucleotídicas são consideradas funcionalmente equivalentes, uma vez que resultam na produção da mesma sequência de aminoácidos em todos os organismos (embora certos organismos possam traduzir algumas sequências com mais efi- ciência do que outros). Além disso, ocasionalmente, uma variante me- tilada de uma purina ou pirimidina pode ser encontrada em uma dada sequência de nucleotídeos. Essas metilação não afetam a relação de codificação entre o códon trinucleotídeo e o aminoácido corresponden- te.

[00208] Em vista do exposto, a sequência de nucleotídeos de um DNA ou RNA que codifica um ácido nucleico de biomarcador (ou qual- quer porção do mesmo) pode ser usada para derivar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, usando o código genético para traduzir o DNA ou RNA em uma sequência de aminoácidos. Da mesma forma, para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, as sequências de nucleotídeos correspondentes que podem codificar o polipeptídeo po- dem ser deduzidas do código genético (que, devido à sua redundân- cia, produzirá várias sequências de ácido nucleico para qualquer se- quência de aminoácidos dada). Assim, a descrição e/ou divulgação aqui de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo deve ser considerada para incluir também a descrição e/ou divulgação da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotí- deos. Da mesma forma, a descrição e/ou divulgação de uma sequên- cia de aminoácidos polipeptídica neste documento deve ser conside- rada para incluir também a descrição e/ou divulgação de todas as se- quências de nucleotídeos possíveis que podem codificar a sequência de aminoácidos.

[00209] Finalmente, as informações de sequência de ácido nucleico e aminoácido para moléculas de ácido nucleico e polipeptídeo úteis na presente invenção são bem conhecidas na técnica e prontamente dis-

poníveis em bancos de dados disponíveis publicamente, tais como o National Center for Biotechnology Information (NCBI). Por exemplo, sequências de ácido nucleico e aminoácidos exemplificativas deriva- das de bancos de dados de sequência disponíveis publicamente são fornecidos na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 SEQ ID NO: 1 Sequência de cDNA de HHLA2 humana Variante 1 (NM_007072.3, região CDS da posição 415-1659) 1 agttctcttc aagtcatgta atcgactttt ttgaattagt tttcagtttc attttgtttt 61 ccctaattca agttgggaac acttcatttt ccccaattca agttgggaac acttccttgg 121 tatttccttg ctacatggac tttagcaaat gctactttac tctccttcca gctactcagg 181 aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggaggcggag gttacagtga gccttttcct 241 agttttactg ttggaagcct aactcacagg agagattatg caatacagtc ctgaagtcaa 301 gggaggagag catgtaggag aatactaacc ctgcacagat tgtgatggtg atgtggaata 361 tactaaagcc tagaacgcac ctcctctgca tgactaatat gttctgcaca agacatgaag 421 gcacagacag cactgtcttt cttcctcatt ctcataacat ctctgagtgg atctcaaggc 481 atattccctt tggctttctt catttatgtt cctatgaatg aacaaatcgt cattggaaga 541 cttgatgaag atataattct cccttcttca tttgagaggg gatccgaagt cgtaatacac 601 tggaagtatc aagatagcta taaggttcac agttactaca aaggcagtga ccatttggaa 661 agccaagatc ccagatatgc aaacaggaca tcccttttct ataatgagat tcaaaatggg 721 aatgcgtcgc tatttttcag aagagtaagc cttctggacg aaggaattta cacctgctat 781 gtaggaacag caattcaagt gattacaaac aaagtggtgc taaaggtggg agtttttctc 841 acacccgtga tgaagtatga aaagaggaac acaaacagct tcttaatatg cagcgtgtta 901 agtgtttatc ctcgtccaat tatcacgtgg aaaatggaca acacacctat ctctgaaaac 961 aacatggaag aaacagggtc tttggattct ttttctatta acagcccact gaatattaca 1021 ggatcaaatt catcttatga atgtacaatt gaaaattcac tgctgaagca aacatggaca 1081 gggcgctgga cgatgaaaga tggccttcat aaaatgcaaa gtgaacacgt ttcactctca 1141 tgtcaacctg taaatgatta tttttcacca aaccaagact tcaaagttac ttggtccaga 1201 atgaaaagtg ggactttctc tgtcctggct tactatctga gctcctcaca aaatacaatt 1261 atcaatgaat cccgattctc atggaacaaa gagctgataa accagagtga cttctctatg 1321 aatttgatgg atcttaatct ttcagacagt ggggaatatt tatgcaatat ttcttcggat 1381 gaatatactt tacttaccat ccacacagtg catgtagaac cgagccaaga aacagcttcc 1441 cataacaaag gcttatggat tttggtgccc tctgcgattt tggcagcttt tctgctgatt 1501 tggagcgtaa aatgttgcag agcccagcta gaagccagga ggagcagaca ccctgctgat 1561 ggagcccaac aagaaagatg ttgtgtccct cctggtgagc gctgtcccag tgcacccgat 1621 aatggcgaag aaaatgtgcc tctttcagga aaagtatagg aaatgagaga agactgtgac 1681 aactcatgac ctgcatcctt aatatccagt gacttcatct cccctttctt caccacaatt 1741 ccaggcaatg gcctgtcgga gcagacaatt ctaccactgc aaagagttgt aaccattttc 1801 tggtatcaca tttatttttc aagacatact tttcaagaca tcattcactg acccactacc 1861 tgcattgagt ataaatgcct ggatgttaag gattccaatt taactttgaa aagaactgtc 1921 tcattcattt acatttctgt tacagtcagc ccaggaggtt acagtgagct ctccactaag

1981 aatctggaag aaatgcatca ctaggggttg attcccaatc tgatcaactg ataatgggtg 2041 agagagcagg taagagccaa agtcacctta gtggaaaggt taaaaaccag agcctggaaa 2101 ccaagatgat tgatttgaca aggtatttta gtctagtttt atatgaacgg ttgtatcagg 2161 gtaaccaact cgatttggga tgaatcttag ggcaccaaag actaagacag tatctttaag 2221 attgctaggg aaaagggccc tatgtgtcag gcctctgagc ccaagccaag catcgcatcc 2281 cctgtgattt gcacgtatac atccagatgg cctaaagtaa ctgaagatcc acaaaagaag 2341 taaaaatagc cttaactgat gacattccac cattgtgatt tgttcctgcc ccaccctaac 2401 tgatcaatgt actttgtaat ctcccccacc cttaagaagg tactttgtaa tcttccccac 2461 ccttaagaag gttctttgta attctcccca cccttgagaa tgtactttgt gagatccacc 2521 ctgcccacaa aacattgctc ttaacttcac cgcctaaccc aaaacctata agaactaatg 2581 ataatccatc acccttcgct gactctcttt tcggactcag cccacctgca cccaggtgaa 2641 ataaacagct ttattgctca cacaaaaaaa aaaaaaaaa

SEQ ID NO: 2 Sequência de Aminoácidos de HHLA2 Humana Variante 1 (NP_009003.1) 1 mkaqtalsff lilitslsgs qgifplaffi yvpmneqivi grldediilp ssfergsevv 61 ihwkyqdsyk vhsyykgsdh lesqdpryan rtslfyneiq ngnaslffrr vslldegiyt 121 cyvgtaiqvi tnkvvlkvgv fltpvmkyek rntnsflics vlsvyprpii twkmdntpis 181 ennmeetgsl dsfsinspln itgsnssyec tiensllkqt wtgrwtmkdg lhkmqsehvs 241 lscqpvndyf spnqdfkvtw srmksgtfsv layylsssqn tiinesrfsw nkelinqsdf 301 smnlmdlnls dsgeylcnis sdeytlltih tvhvepsqet ashnkglwil vpsailaafl 361 liwsvkccra qlearrsrhp adgaqqercc vppgercpsa pdngeenvpl sgkv

SEQ ID NO: 3 Sequência de cDNA de HHLA2 humana Variante 2 (NM_001282556.1, região CDS da posição 224-1468) 1 aaatcaaacg taccttggac tttactctct gagaaactca tagctgaatt caatgtttat 61 tcttatggac tacttagcat ttgactagac ggtatgaatt tctaagtaag cacatataga 121 actggatgcc cttgtggtac atctcaaggc tgatttgaaa gcttgagaga ccatcaagaa 181 ttggatttgg ggaagagcat gactaatatg ttctgcacaa gacatgaagg cacagacagc 241 actgtctttc ttcctcattc tcataacatc tctgagtgga tctcaaggca tattcccttt 301 ggctttcttc atttatgttc ctatgaatga acaaatcgtc attggaagac ttgatgaaga 361 tataattctc ccttcttcat ttgagagggg atccgaagtc gtaatacact ggaagtatca 421 agatagctat aaggttcaca gttactacaa aggcagtgac catttggaaa gccaagatcc 481 cagatatgca aacaggacat cccttttcta taatgagatt caaaatggga atgcgtcgct 541 atttttcaga agagtaagcc ttctggacga aggaatttac acctgctatg taggaacagc 601 aattcaagtg attacaaaca aagtggtgct aaaggtggga gtttttctca cacccgtgat 661 gaagtatgaa aagaggaaca caaacagctt cttaatatgc agcgtgttaa gtgtttatcc 721 tcgtccaatt atcacgtgga aaatggacaa cacacctatc tctgaaaaca acatggaaga 781 aacagggtct ttggattctt tttctattaa cagcccactg aatattacag gatcaaattc 841 atcttatgaa tgtacaattg aaaattcact gctgaagcaa acatggacag ggcgctggac 901 gatgaaagat ggccttcata aaatgcaaag tgaacacgtt tcactctcat gtcaacctgt 961 aaatgattat ttttcaccaa accaagactt caaagttact tggtccagaa tgaaaagtgg

1021 gactttctct gtcctggctt actatctgag ctcctcacaa aatacaatta tcaatgaatc 1081 ccgattctca tggaacaaag agctgataaa ccagagtgac ttctctatga atttgatgga 1141 tcttaatctt tcagacagtg gggaatattt atgcaatatt tcttcggatg aatatacttt 1201 acttaccatc cacacagtgc atgtagaacc gagccaagaa acagcttccc ataacaaagg 1261 cttatggatt ttggtgccct ctgcgatttt ggcagctttt ctgctgattt ggagcgtaaa 1321 atgttgcaga gcccagctag aagccaggag gagcagacac cctgctgatg gagcccaaca 1381 agaaagatgt tgtgtccctc ctggtgagcg ctgtcccagt gcacccgata atggcgaaga 1441 aaatgtgcct ctttcaggaa aagtatagga aatgagagaa gactgtgaca actcatgacc 1501 tgcatcctta atatccagtg acttcatctc ccctttcttc accacaattc caggcaatgg 1561 cctgtcggag cagacaattc taccactgca aagagttgta accattttct ggtatcacat 1621 ttatttttca agacatactt ttcaagacat cattcactga cccactacct gcattgagta 1681 taaatgcctg gatgttaagg attccaattt aactttgaaa agaactgtct cattcattta 1741 catttctgtt acagtcagcc caggaggtta cagtgagctc tccactaaga atctggaaga 1801 aatgcatcac taggggttga ttcccaatct gatcaactga taatgggtga gagagcaggt 1861 aagagccaaa gtcaccttag tggaaaggtt aaaaaccaga gcctggaaac caagatgatt 1921 gatttgacaa ggtattttag tctagtttta tatgaacggt tgtatcaggg taaccaactc 1981 gatttgggat gaatcttagg gcaccaaaga ctaagacagt atctttaaga ttgctaggga 2041 aaagggccct atgtgtcagg cctctgagcc caagccaagc atcgcatccc ctgtgatttg 2101 cacgtataca tccagatggc ctaaagtaac tgaagatcca caaaagaagt aaaaatagcc 2161 ttaactgatg acattccacc attgtgattt gttcctgccc caccctaact gatcaatgta 2221 ctttgtaatc tcccccaccc ttaagaaggt actttgtaat cttccccacc cttaagaagg 2281 ttctttgtaa ttctccccac ccttgagaat gtactttgtg agatccaccc tgcccacaaa 2341 acattgctct taacttcacc gcctaaccca aaacctataa gaactaatga taatccatca 2401 cccttcgctg actctctttt cggactcagc ccacctgcac ccaggtgaaa taaacagctt 2461 tattgctcac acaaaaaaaa aaaaaaaa

SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácidos de HHLA2 humana Variante 2 (NP_001269485.1) 1 mkaqtalsff lilitslsgs qgifplaffi yvpmneqivi grldediilp ssfergsevv 61 ihwkyqdsyk vhsyykgsdh lesqdpryan rtslfyneiq ngnaslffrr vslldegiyt 121 cyvgtaiqvi tnkvvlkvgv fltpvmkyek rntnsflics vlsvyprpii twkmdntpis 181 ennmeetgsl dsfsinspln itgsnssyec tiensllkqt wtgrwtmkdg lhkmqsehvs 241 lscqpvndyf spnqdfkvtw srmksgtfsv layylsssqn tiinesrfsw nkelinqsdf 301 smnlmdlnls dsgeylcnis sdeytlltih tvhvepsqet ashnkglwil vpsailaafl 361 liwsvkccra qlearrsrhp adgaqqercc vppgercpsa pdngeenvpl sgkv

SEQ ID NO: 5 Sequência de cDNA de HHLA2 humana Variante 3 (NM_001282557.1, região CDS da posição 155-1399) 1 agtttactct acatcatagc agagaaaatg gacaaaacac agctgttttg catgtaggag 61 aatactaacc ctgcacagat tgtgatggtg atgtggaata tactaaagcc tagaacgcac 121 ctcctctgca tgactaatat gttctgcaca agacatgaag gcacagacag cactgtcttt 181 cttcctcatt ctcataacat ctctgagtgg atctcaaggc atattccctt tggctttctt

241 catttatgtt cctatgaatg aacaaatcgt cattggaaga cttgatgaag atataattct 301 cccttcttca tttgagaggg gatccgaagt cgtaatacac tggaagtatc aagatagcta 361 taaggttcac agttactaca aaggcagtga ccatttggaa agccaagatc ccagatatgc 421 aaacaggaca tcccttttct ataatgagat tcaaaatggg aatgcgtcgc tatttttcag 481 aagagtaagc cttctggacg aaggaattta cacctgctat gtaggaacag caattcaagt 541 gattacaaac aaagtggtgc taaaggtggg agtttttctc acacccgtga tgaagtatga 601 aaagaggaac acaaacagct tcttaatatg cagcgtgtta agtgtttatc ctcgtccaat 661 tatcacgtgg aaaatggaca acacacctat ctctgaaaac aacatggaag aaacagggtc 721 tttggattct ttttctatta acagcccact gaatattaca ggatcaaatt catcttatga 781 atgtacaatt gaaaattcac tgctgaagca aacatggaca gggcgctgga cgatgaaaga 841 tggccttcat aaaatgcaaa gtgaacacgt ttcactctca tgtcaacctg taaatgatta 901 tttttcacca aaccaagact tcaaagttac ttggtccaga atgaaaagtg ggactttctc 961 tgtcctggct tactatctga gctcctcaca aaatacaatt atcaatgaat cccgattctc 1021 atggaacaaa gagctgataa accagagtga cttctctatg aatttgatgg atcttaatct 1081 ttcagacagt ggggaatatt tatgcaatat ttcttcggat gaatatactt tacttaccat 1141 ccacacagtg catgtagaac cgagccaaga aacagcttcc cataacaaag gcttatggat 1201 tttggtgccc tctgcgattt tggcagcttt tctgctgatt tggagcgtaa aatgttgcag 1261 agcccagcta gaagccagga ggagcagaca ccctgctgat ggagcccaac aagaaagatg 1321 ttgtgtccct cctggtgagc gctgtcccag tgcacccgat aatggcgaag aaaatgtgcc 1381 tctttcagga aaagtatagg aaatgagaga agactgtgac aactcatgac ctgcatcctt 1441 aatatccagt gacttcatct cccctttctt caccacaatt ccaggcaatg gcctgtcgga 1501 gcagacaatt ctaccactgc aaagagttgt aaccattttc tggtatcaca tttatttttc 1561 aagacatact tttcaagaca tcattcactg acccactacc tgcattgagt ataaatgcct 1621 ggatgttaag gattccaatt taactttgaa aagaactgtc tcattcattt acatttctgt 1681 tacagtcagc ccaggaggtt acagtgagct ctccactaag aatctggaag aaatgcatca 1741 ctaggggttg attcccaatc tgatcaactg ataatgggtg agagagcagg taagagccaa 1801 agtcacctta gtggaaaggt taaaaaccag agcctggaaa ccaagatgat tgatttgaca 1861 aggtatttta gtctagtttt atatgaacgg ttgtatcagg gtaaccaact cgatttggga 1921 tgaatcttag ggcaccaaag actaagacag tatctttaag attgctaggg aaaagggccc 1981 tatgtgtcag gcctctgagc ccaagccaag catcgcatcc cctgtgattt gcacgtatac 2041 atccagatgg cctaaagtaa ctgaagatcc acaaaagaag taaaaatagc cttaactgat 2101 gacattccac cattgtgatt tgttcctgcc ccaccctaac tgatcaatgt actttgtaat 2161 ctcccccacc cttaagaagg tactttgtaa tcttccccac ccttaagaag gttctttgta 2221 attctcccca cccttgagaa tgtactttgt gagatccacc ctgcccacaa aacattgctc 2281 ttaacttcac cgcctaaccc aaaacctata agaactaatg ataatccatc acccttcgct 2341 gactctcttt tcggactcag cccacctgca cccaggtgaa ataaacagct ttattgctca 2401 cacaaaaaaa aaaaaaaaa

SEQ ID NO: 6 Sequência de aminoácidos de HHLA2 humana Variante 3 (NP_001269486.1) 1 mkaqtalsff lilitslsgs qgifplaffi yvpmneqivi grldediilp ssfergsevv 61 ihwkyqdsyk vhsyykgsdh lesqdpryan rtslfyneiq ngnaslffrr vslldegiyt 121 cyvgtaiqvi tnkvvlkvgv fltpvmkyek rntnsflics vlsvyprpii twkmdntpis

181 ennmeetgsl dsfsinspln itgsnssyec tiensllkqt wtgrwtmkdg lhkmqsehvs 241 lscqpvndyf spnqdfkvtw srmksgtfsv layylsssqn tiinesrfsw nkelinqsdf 301 smnlmdlnls dsgeylcnis sdeytlltih tvhvepsqet ashnkglwil vpsailaafl 361 liwsvkccra qlearrsrhp adgaqqercc vppgercpsa pdngeenvpl sgkv

SEQ ID NO: 7 Sequência de cDNA de HHLA2 humana Variante 4 (NM_001282558.1, região CDS da posição 302-1495) 1 aaatcaaacg taccttggac tttactctct gagaaactca tagctgaatt caatgtttat 61 tcttatggac tacttagcat ttgactagac ggtatgaatt tctaagtaag cacatataga 121 actggatgcc cttgtggtac atctcaaggc tgatttgaaa gcttgagaga ccatcaagaa 181 ttggatttgg ggaagagcat gtaggagaat actaaccctg cacagattgt gatggtgatg 241 tggaatatac taaagcctag aacgcacctc ctctgcatga ctaatatgtt ctgcacaaga 301 catgaaggca cagacagcac tgtctttctt cctcattctc ataacatctc tgagtggatc 361 tcaaggcata ttccctttgg ctttcttcat ttatgttcct atgaatgaac aaatcgtcat 421 tggaagactt gatgaagata taattctccc ttcttcattt gagaggggat ccgaagtcgt 481 aatacactgg aagtatcaag atagctataa ggttcacagt tactacaaag gcagtgacca 541 tttggaaagc caagatccca gatatgcaaa caggacatcc cttttctata atgagattca 601 aaatgggaat gcgtcgctat ttttcagaag agtaagcctt ctggacgaag gaatttacac 661 ctgctatgta ggaacagcaa ttcaagtgat tacaaacaaa gtggtgctaa aggtgggagt 721 ttttctcaca cccgtgatga agtatgaaaa gaggaacaca aacagcttct taatatgcag 781 cgtgttaagt gtttatcctc gtccaattat cacgtggaaa atggacaaca cacctatctc 841 tgaaaacaac atggaagaaa cagggtcttt ggattctttt tctattaaca gcccactgaa 901 tattacagga tcaaattcat cttatgaatg tacaattgaa aattcactgc tgaagcaaac 961 atggacaggg cgctggacga tgaaagatgg ccttcataaa atgcaaagtg aacacgtttc 1021 actctcatgt caacctgtaa atgattattt ttcaccaaac caagacttca aagttacttg 1081 gtccagaatg aaaagtggga ctttctctgt cctggcttac tatctgagct cctcacaaaa 1141 tacaattatc aatgaatccc gattctcatg gaacaaagag ctgataaacc agagtgactt 1201 ctctatgaat ttgatggatc ttaatctttc agacagtggg gaatatttat gcaatatttc 1261 ttcggatgaa tatactttac ttaccatcca cacagtgcat gtagaaccga gccaagaaac 1321 agcttcccat aacaaaggct tatggatttt ggtgccctct gcgattttgg cagcttttct 1381 gctgatttgg agcgtaaaat gttgcagaga aagatgttgt gtccctcctg gtgagcgctg 1441 tcccagtgca cccgataatg gcgaagaaaa tgtgcctctt tcaggaaaag tataggaaat 1501 gagagaagac tgtgacaact catgacctgc atccttaata tccagtgact tcatctcccc 1561 tttcttcacc acaattccag gcaatggcct gtcggagcag acaattctac cactgcaaag 1621 agttgtaacc attttctggt atcacattta tttttcaaga catacttttc aagacatcat 1681 tcactgaccc actacctgca ttgagtataa atgcctggat gttaaggatt ccaatttaac 1741 tttgaaaaga actgtctcat tcatttacat ttctgttaca gtcagcccag gaggttacag 1801 tgagctctcc actaagaatc tggaagaaat gcatcactag gggttgattc ccaatctgat 1861 caactgataa tgggtgagag agcaggtaag agccaaagtc accttagtgg aaaggttaaa 1921 aaccagagcc tggaaaccaa gatgattgat ttgacaaggt attttagtct agttttatat 1981 gaacggttgt atcagggtaa ccaactcgat ttgggatgaa tcttagggca ccaaagacta 2041 agacagtatc tttaagattg ctagggaaaa gggccctatg tgtcaggcct ctgagcccaa 2101 gccaagcatc gcatcccctg tgatttgcac gtatacatcc agatggccta aagtaactga

2161 agatccacaa aagaagtaaa aatagcctta actgatgaca ttccaccatt gtgatttgtt 2221 cctgccccac cctaactgat caatgtactt tgtaatctcc cccaccctta agaaggtact 2281 ttgtaatctt ccccaccctt aagaaggttc tttgtaattc tccccaccct tgagaatgta 2341 ctttgtgaga tccaccctgc ccacaaaaca ttgctcttaa cttcaccgcc taacccaaaa 2401 cctataagaa ctaatgataa tccatcaccc ttcgctgact ctcttttcgg actcagccca 2461 cctgcaccca ggtgaaataa acagctttat tgctcacaca aaaaaaaaaa aaaaa

SEQ ID NO: 8 Sequência de aminoácidos de HHLA2 humana Variante 4 (NP_001269487.1) 1 mkaqtalsff lilitslsgs qgifplaffi yvpmneqivi grldediilp ssfergsevv 61 ihwkyqdsyk vhsyykgsdh lesqdpryan rtslfyneiq ngnaslffrr vslldegiyt 121 cyvgtaiqvi tnkvvlkvgv fltpvmkyek rntnsflics vlsvyprpii twkmdntpis 181 ennmeetgsl dsfsinspln itgsnssyec tiensllkqt wtgrwtmkdg lhkmqsehvs 241 lscqpvndyf spnqdfkvtw srmksgtfsv layylsssqn tiinesrfsw nkelinqsdf 301 smnlmdlnls dsgeylcnis sdeytlltih tvhvepsqet ashnkglwil vpsailaafl 361 liwsvkccre rccvppgerc psapdngeen vplsgkv

SEQ ID NO: 9 Sequência de cDNA de HHLA2 humana Variante 5 (NM_001282559.1, região CDS da posição 232-1284) 1 aaatcaaacg taccttggac tttactctct gagaaactca tagctgaatt caatgtttat 61 tcttatggac tacttagcat ttgactagac ggtatgaatt tctaagtaag cacatataga 121 actggatgcc cttgtggtac atctcaaggc tgatttgaaa gcttgagaga ccatcaagaa 181 ttggatttgg ggaagagcat gtaggagaat actaaccctg cacagattgt gatggtgatg 241 tggaatatac taaagcctag aacgcacctc ctctgcatga ctaatatgtt ctgcacaaga 301 catgaaggca cagacagcac tgtctttctt cctcattctc ataacatctc tgagtggatc 361 tcaagaagag taagccttct ggacgaagga atttacacct gctatgtagg aacagcaatt 421 caagtgatta caaacaaagt ggtgctaaag gtgggagttt ttctcacacc cgtgatgaag 481 tatgaaaaga ggaacacaaa cagcttctta atatgcagcg tgttaagtgt ttatcctcgt 541 ccaattatca cgtggaaaat ggacaacaca cctatctctg aaaacaacat ggaagaaaca 601 gggtctttgg attctttttc tattaacagc ccactgaata ttacaggatc aaattcatct 661 tatgaatgta caattgaaaa ttcactgctg aagcaaacat ggacagggcg ctggacgatg 721 aaagatggcc ttcataaaat gcaaagtgaa cacgtttcac tctcatgtca acctgtaaat 781 gattattttt caccaaacca agacttcaaa gttacttggt ccagaatgaa aagtgggact 841 ttctctgtcc tggcttacta tctgagctcc tcacaaaata caattatcaa tgaatcccga 901 ttctcatgga acaaagagct gataaaccag agtgacttct ctatgaattt gatggatctt 961 aatctttcag acagtgggga atatttatgc aatatttctt cggatgaata tactttactt 1021 accatccaca cagtgcatgt agaaccgagc caagaaacag cttcccataa caaaggctta 1081 tggattttgg tgccctctgc gattttggca gcttttctgc tgatttggag cgtaaaatgt 1141 tgcagagccc agctagaagc caggaggagc agacaccctg ctgatggagc ccaacaagaa 1201 agatgttgtg tccctcctgg tgagcgctgt cccagtgcac ccgataatgg cgaagaaaat 1261 gtgcctcttt caggaaaagt ataggaaatg agagaagact gtgacaactc atgacctgca 1321 tccttaatat ccagtgactt catctcccct ttcttcacca caattccagg caatggcctg

1381 tcggagcaga caattctacc actgcaaaga gttgtaacca ttttctggta tcacatttat 1441 ttttcaagac atacttttca agacatcatt cactgaccca ctacctgcat tgagtataaa 1501 tgcctggatg ttaaggattc caatttaact ttgaaaagaa ctgtctcatt catttacatt 1561 tctgttacag tcagcccagg aggttacagt gagctctcca ctaagaatct ggaagaaatg 1621 catcactagg ggttgattcc caatctgatc aactgataat gggtgagaga gcaggtaaga 1681 gccaaagtca ccttagtgga aaggttaaaa accagagcct ggaaaccaag atgattgatt 1741 tgacaaggta ttttagtcta gttttatatg aacggttgta tcagggtaac caactcgatt 1801 tgggatgaat cttagggcac caaagactaa gacagtatct ttaagattgc tagggaaaag 1861 ggccctatgt gtcaggcctc tgagcccaag ccaagcatcg catcccctgt gatttgcacg 1921 tatacatcca gatggcctaa agtaactgaa gatccacaaa agaagtaaaa atagccttaa 1981 ctgatgacat tccaccattg tgatttgttc ctgccccacc ctaactgatc aatgtacttt 2041 gtaatctccc ccacccttaa gaaggtactt tgtaatcttc cccaccctta agaaggttct 2101 ttgtaattct ccccaccctt gagaatgtac tttgtgagat ccaccctgcc cacaaaacat 2161 tgctcttaac ttcaccgcct aacccaaaac ctataagaac taatgataat ccatcaccct 2221 tcgctgactc tcttttcgga ctcagcccac ctgcacccag gtgaaataaa cagctttatt 2281 gctcacacaa aaaaaaaaaa aaaa

SEQ ID NO: 10 Sequência de aminoácidos de HHLA2 humana Variante 5 (NP_001269488.1) 1 mvmwnilkpr thllcmtnmf ctrhegtdst vflphshnis ewisrrvsll degiytcyvg 61 taiqvitnkv vlkvgvfltp vmkyekrntn sflicsvlsv yprpiitwkm dntpisennm 121 eetgsldsfs insplnitgs nssyectien sllkqtwtgr wtmkdglhkm qsehvslscq 181 pvndyfspnq dfkvtwsrmk sgtfsvlayy lsssqntiin esrfswnkel inqsdfsmnl 241 mdlnlsdsge ylcnissdey tlltihtvhv epsqetashn kglwilvpsa ilaaflliws 301 vkccraqlea rrsrhpadga qqerccvppg ercpsapdng eenvplsgkv

SEQ ID NO: 11 Sequência de cDNA de TMIGD2 humana Isoforma 1 (NM_144615.2, região CDS da posição 47-895) 1 ggaagtctgt caactgggag ggggagaggg gggtgatggg ccaggaatgg ggtccccggg 61 catggtgctg ggcctcctgg tgcagatctg ggccctgcaa gaagcctcaa gcctgagcgt 121 gcagcagggg cccaacttgc tgcaggtgag gcagggcagt caggcgaccc tggtctgcca 181 ggtggaccag gccacagcct gggaacggct ccgtgttaag tggacaaagg atggggccat 241 cctgtgtcaa ccgtacatca ccaacggcag cctcagcctg ggggtctgcg ggccccaggg 301 acggctctcc tggcaggcac ccagccatct caccctgcag ctggaccctg tgagcctcaa 361 ccacagcggg gcgtacgtgt gctgggcggc cgtagagatt cctgagttgg aggaggctga 421 gggcaacata acaaggctct ttgtggaccc agatgacccc acacagaaca gaaaccggat 481 cgcaagcttc ccaggattcc tcttcgtgct gctgggggtg ggaagcatgg gtgtggctgc 541 gatcgtgtgg ggtgcctggt tctggggccg ccgcagctgc cagcaaaggg actcaggtaa 601 cagcccagga aatgcattct acagcaacgt cctataccgg ccccgggggg ccccaaagaa 661 gagtgaggac tgctctggag aggggaagga ccagaggggc cagagcattt attcaacctc 721 cttcccgcaa ccggcccccc gccagccgca cctggcgtca agaccctgcc ccagcccgag 781 accctgcccc agccccaggc ccggccaccc cgtctctatg gtcagggtct ctcctagacc

841 aagccccacc cagcagccga ggccaaaagg gttccccaaa gtgggagagg agtgagagat 901 cccaggagac ctcaacagga ccccacccat aggtacacac aaaaaagggg ggatcgaggc 961 cagacacggt ggctcacgcc tgtaatccca gcagtttggg aagccgaggc gggtggaaca 1021 cttgaggtca ggggtttgag accagcctgg cttgaacctg ggaggcggag gttgcagtga 1081 gccgagattg cgccactgca ctccagcctg ggcgacagag tgagactccg tctcaaaaaa 1141 aacaaaaagc aggaggattg ggagcctgtc agccccatcc tgagaccccg tcctcatttc 1201 tgtaatgatg gatctcgctc ccactttccc ccaagaacct aataaaggct tgtgaagaaa 1261 aagcaaaaaa aaaaaaaaaa aa

SEQ ID NO: 12 Sequência de aminoácidos de TMIGD2 humana Isoforma 1 (NP_653216.2) 1 mgspgmvlgl lvqiwalqea sslsvqqgpn llqvrqgsqa tlvcqvdqat awerlrvkwt 61 kdgailcqpy itngslslgv cgpqgrlswq apshltlqld pvslnhsgay vcwaaveipe 121 leeaegnitr lfvdpddptq nrnriasfpg flfvllgvgs mgvaaivwga wfwgrrscqq 181 rdsgnspgna fysnvlyrpr gapkksedcs gegkdqrgqs iystsfpqpa prqphlasrp 241 cpsprpcpsp rpghpvsmvr vsprpsptqq prpkgfpkvg ee

SEQ ID NO: 13 Sequência de cDNA de TMIGD2 humana Isofor- ma 2 (NM_001169126.1, região CDS da posição 47-883) 1 ggaagtctgt caactgggag ggggagaggg gggtgatggg ccaggaatgg ggtccccggg 61 catggtgctg ggcctcctgg tgcagatctg ggccctgcaa gaagcctcaa gcctgagcgt 121 gcagcagggg cccaacttgc tgcaggtgag gcagggcagt caggcgaccc tggtctgcca 181 ggtggaccag gccacagcct gggaacggct ccgtgttaag tggacaaagg atggggccat 241 cctgtgtcaa ccgtacatca ccaacggcag cctcagcctg ggggtctgcg ggccccaggg 301 acggctctcc tggcaggcac ccagccatct caccctgcag ctggaccctg tgagcctcaa 361 ccacagcggg gcgtacgtgt gctgggcggc cgtagagatt cctgagttgg aggaggctga 421 gggcaacata acaaggctct ttgtggaccc agatgacccc acacagaaca gaaaccggat 481 cgcaagcttc ccaggattcc tcttcgtgct gctgggggtg ggaagcatgg gtgtggctgc 541 gatcgtgtgg ggtgcctggt tctggggccg ccgcagctgc cagcaaaggg actcaggaaa 601 tgcattctac agcaacgtcc tataccggcc ccggggggcc ccaaagaaga gtgaggactg 661 ctctggagag gggaaggacc agaggggcca gagcatttat tcaacctcct tcccgcaacc 721 ggccccccgc cagccgcacc tggcgtcaag accctgcccc agcccgagac cctgccccag 781 ccccaggccc ggccaccccg tctctatggt cagggtctct cctagaccaa gccccaccca 841 gcagccgagg ccaaaagggt tccccaaagt gggagaggag tgagagatcc caggagacct 901 caacaggacc ccacccatag gtacacacaa aaaagggggg atcgaggcca gacacggtgg 961 ctcacgcctg taatcccagc agtttgggaa gccgaggcgg gtggaacact tgaggtcagg 1021 ggtttgagac cagcctggct tgaacctggg aggcggaggt tgcagtgagc cgagattgcg 1081 ccactgcact ccagcctggg cgacagagtg agactccgtc tcaaaaaaaa caaaaagcag 1141 gaggattggg agcctgtcag ccccatcctg agaccccgtc ctcatttctg taatgatgga 1201 tctcgctccc actttccccc aagaacctaa taaaggcttg tgaagaaaaa gcaaaaaaaa 1261 aaaaaaaaaa

SEQ ID NO: 14 Sequência de aminoácidos de TMIGD2 humana Isoforma 2 (NP_001162597.1) 1 mgspgmvlgl lvqiwalqea sslsvqqgpn llqvrqgsqa tlvcqvdqat awerlrvkwt 61 kdgailcqpy itngslslgv cgpqgrlswq apshltlqld pvslnhsgay vcwaaveipe 121 leeaegnitr lfvdpddptq nrnriasfpg flfvllgvgs mgvaaivwga wfwgrrscqq 181 rdsgnafysn vlyrprgapk ksedcsgegk dqrgqsiyst sfpqpaprqp hlasrpcpsp 241 rpcpsprpgh pvsmvrvspr psptqqprpk gfpkvgee

SEQ ID NO: 15 Sequência de cDNA de TMIGD2 humana Isofor- ma 3 (NM_001308232.1, região CDS da posição 47-535) 1 ggaagtctgt caactgggag ggggagaggg gggtgatggg ccaggaatgg ggtccccggg 61 catggtgctg ggcctcctgg tgcagatctg ggatgacccc acacagaaca gaaaccggat 121 cgcaagcttc ccaggattcc tcttcgtgct gctgggggtg ggaagcatgg gtgtggctgc 181 gatcgtgtgg ggtgcctggt tctggggccg ccgcagctgc cagcaaaggg actcaggtaa 241 cagcccagga aatgcattct acagcaacgt cctataccgg ccccgggggg ccccaaagaa 301 gagtgaggac tgctctggag aggggaagga ccagaggggc cagagcattt attcaacctc 361 cttcccgcaa ccggcccccc gccagccgca cctggcgtca agaccctgcc ccagcccgag 421 accctgcccc agccccaggc ccggccaccc cgtctctatg gtcagggtct ctcctagacc 481 aagccccacc cagcagccga ggccaaaagg gttccccaaa gtgggagagg agtgagagat 541 cccaggagac ctcaacagga ccccacccat aggtacacac aaaaaagggg ggatcgaggc 601 cagacacggt ggctcacgcc tgtaatccca gcagtttggg aagccgaggc gggtggaaca 661 cttgaggtca ggggtttgag accagcctgg cttgaacctg ggaggcggag gttgcagtga 721 gccgagattg cgccactgca ctccagcctg ggcgacagag tgagactccg tctcaaaaaa 781 aacaaaaagc aggaggattg ggagcctgtc agccccatcc tgagaccccg tcctcatttc 841 tgtaatgatg gatctcgctc ccactttccc ccaagaacct aataaaggct tgtgaagaaa 901 aagcaaaaaa aaaaaaaa

SEQ ID NO: 16 Sequência de aminoácidos de TMIGD2 humana Isoforma 3 (NP_001295161.1) 1 mgspgmvlgl lvqiwddptq nrnriasfpg flfvllgvgs mgvaaivwga wfwgrrscqq 61 rdsgnspgna fysnvlyrpr gapkksedcs gegkdqrgqs iystsfpqpa prqphlasrp 121 cpsprpcpsp rpghpvsmvr vsprpsptqq prpkgfpkvg ee

SEQ ID NO: 17 Sequência de cDNA de KIR3DL3 humana (NM_153443.4, região CDS da posição 51-1283) 1 tgctgctgaa ctgagctggg gcgcagccgc ctgtctgcac cggcagcacc atgtcgctca 61 tggtcgtcag catggcgtgt gttgggttct tcttgctgga ggggccctgg ccacatgtgg 121 gtggtcagga caagcccttc ctctctgcct ggcccggcac tgtggtgtct gaaggacaac 181 atgtgactct tcagtgtcgc tctcgtcttg ggtttaatga attcagtctg tccaaagaag 241 acgggatgcc tgtccctgag ctctacaaca gaatattccg gaacagcttt ctcatgggcc

301 ctgtgacccc agcacatgca gggacctaca gatgttgcag ttcacaccca cactccccca 361 ctgggtggtc ggcacccagc aaccctgtgg tgatcatggt cacaggagtc cacagaaaac 421 cttccctcct ggcccaccca ggtcccctgg tgaaatcagg agagacggtc atcctgcaat 481 gttggtcaga tgtcaggttt gagcgcttcc ttctgcacag agaggggatc actgaggacc 541 ccttgcgcct cgttggacag ctccacgatg cgggttccca ggtcaactat tccatgggtc 601 ccatgacacc tgcccttgca gggacctaca gatgctttgg ttctgtcact cacttaccct 661 atgagttgtc ggctcccagt gaccctctgg acatcgtggt cgtaggtcta tatgggaaac 721 cttctctctc agcccagccg ggccccacgg ttcaggcagg agagaatgtg accttgtcct 781 gcagctcccg gagcttgttt gacatttacc atctatccag ggaggcggag gccggtgaac 841 ttaggctcac tgcagtgctg agggtcaatg gaacattcca ggccaacttc cctctgggcc 901 ctgtgaccca cggagggaac tacagatgct tcggctcttt ccgtgccctg ccccatgcgt 961 ggtcagaccc gagtgaccca ctgcccgttt ctgtcacagg taactccaga aacctgcacg 1021 ttctgattgg gacctcagtg gtcatcatcc cctttgctat cctcctcttc tttctccttc 1081 atcgctggtg tgccaacaaa aagaatgctg ttgtaatgga ccaagagcct gcagggaaca 1141 gaacagtgaa cagggaggac tctgatgaac aagaccctca ggaggtgaca tacgcacagt 1201 tgaatcactg cgttttcaca cagagaaaaa tcactcgccc ttctcagagg cccaagacac 1261 ccccaacaga taccagcgtg taacacggaa cttccaaatg ctgagcgcag atccaaagtt 1321 gtcttctgtc cactagcacc acagtcaggc cttgatggga tcttctaggg agacaatagc 1381 cctgtctcaa aaccgggttg ccagctccca tgtaccagca gctggactct gaaggcgtga 1441 gtctgcatct tagggcatcg ctcttcctca caccacgaat ctgaacatgc ctctctcttg 1501 cttacaaatg tctaaggtcc ccactgcctg ctggagagaa aacacacttg cttagcccac 1561 aattctccat ttcacttgac ccctgcccac ctctccaacc taactggctt acttcctagt 1621 ctacttgagg ctgcgatcac actgaggaac tcacaattcc aaacatataa gaggctccct 1681 cttaacacgg cacttagata cgtgctattc cacctttcct cag

SEQ ID NO: 18 Sequência de aminoácidos de KIR3DL3 humana (NP_703144.3) 1 mslmvvsmac vgffllegpw phvggqdkpf lsawpgtvvs egqhvtlqcr srlgfnefsl 61 skedgmpvpe lynrifrnsf lmgpvtpaha gtyrccsshp hsptgwsaps npvvimvtgv 121 hrkpsllahp gplvksgetv ilqcwsdvrf erfllhregi tedplrlvgq lhdagsqvny 181 smgpmtpala gtyrcfgsvt hlpyelsaps dpldivvvgl ygkpslsaqp gptvqagenv 241 tlscssrslf diyhlsreae agelrltavl rvngtfqanf plgpvthggn yrcfgsfral 301 phawsdpsdp lpvsvtgnsr nlhvligtsv viipfaillf fllhrwcank knavvmdqep 361 agnrtvnred sdeqdpqevt yaqlnhcvft qrkitrpsqr pktpptdtsv

* Incluídos na Tabela 1 estão moléculas de ácido nucleico de RNA (por exemplo, timinas substituídas por uridinas), moléculas de ácido nuclei- co que codificam ortólogos das proteínas codificadas, bem como se- quências de ácido nucleico de DNA ou RNA compreendendo uma se- quência de ácido nucleico com pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%,

84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de identidade em todo o seu comprimento com a sequência de ácido nucleico de qualquer SEQ ID NO listada na Tabela 1, ou uma porção das mesmas. Essas moléculas de ácido nucleico podem ter uma função do ácido nucleico de compri- mento total conforme descrito mais adiante neste documento.

* Incluídos na Tabela 1 estão os ortólogos das proteínas, bem como as moléculas de polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de identidade em todo o seu compri- mento total com uma sequência de aminoácidos de qualquer SEQ ID NO listado na Tabela 1 ou uma porção das mesmas. Esses polipeptí- deos podem ter uma função do polipeptídeo de comprimento total con- forme descrito mais adiante neste documento.

* Incluídos na Tabela 1 estão outras sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos HHLA2, TMIGD2 e KIR3DL3 conhecidas.

[00210] Além de serem receptores estimuladores (ou seja , transmi- tir um sinal coestimulatório para uma célula imune), os polipeptídeos HHLA2 são receptores inibitórios capazes de transmitir um sinal inibitó- rio para uma célula imune para assim inibir a função efetora da célula imune, ou são capazes de promover a coestimulação de células imu- nes , por exemplo, quando ligado a receptores inibitórios ou receptores estimulatórios. HHLA2 se liga a um ou mais receptores, por exemplo, TMIGD2, KIR3DL3 e/ou outros polipeptídeos em células T.

[00211] O termo "atividade de HHLA2" inclui a capacidade de um polipeptídeo de HHLA2 de modular um sinal inibitório em uma célula imune ativada, por exemplo, envolvendo um ligante de HHLA2 natural em uma célula T. A modulação de um sinal inibitório em uma célula imune resulta na modulação da proliferação e/ou secreção de citocinas por uma célula imune. Assim, o termo "atividade de HHLA2" inclui a capacidade de um polipeptídeo de HHLA2 de se ligar a seu(s) ligan- te(s) natural(is), a capacidade de modular os sinais coestimulatórios ou inibitórios das células imunes e a capacidade de modular a resposta imune.

[00212] Em algumas modalidades, uma condição como o câncer é responsiva ao bloqueio de HHLA2 sozinho. Em outras modalidades, uma condição como o câncer é responsiva ao bloqueio de HHLA2 so- zinho, mas é significativamente ou sinergicamente mais responsiva quando tratada com bloqueio de HHLA2 e outra terapia em combina- ção. Muitas condições responsivas ao bloqueio de HHLA2 sozinho ou em combinação incluem, sem limitação, melanoma (por exemplo, me- lanoma avançado ou metastático), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de pulmão de células pequenas), câncer de mama (por exemplo, câncer de mama negativo HER- 2, câncer de mama de receptor de estrogênio +/HER-2- e câncer de mama triplo negativo), câncer pancreático (por exemplo, adenocarcinoma pancreático) e linfoma de Hodgkin, bem como cânce- res de bexiga, estômago, cabeça e pescoço, renal, próstata, ginecoló- gico, colorretal, ovário e hematológico.

[00213] Os polipeptídeos B7 preferidos são capazes de fornecer sinais coestimulatórios ou inibitórios às células imunes para assim promover ou inibir as respostas das células imunes. Por exemplo, os membros da família B7 que se ligam a receptores coestimulatórios aumentam a ativação e proliferação de células T, enquanto os mem- bros da família B7 que se ligam a receptores inibitórios reduzem a co- estimulação. Além disso, o mesmo membro da família B7 pode au-

mentar ou diminuir a coestimulação de células T. Por exemplo, quando ligado a um receptor coestimulatório, a HHLA2 pode induzir a coesti- mulação de células imunes ou quando ligado a um receptor inibitório, a HHLA2 pode inibir as células imunes. Quando ligado a um receptor inibitório, a HHLA2 pode transmitir um sinal inibitório para uma célula imune. Os membros da família B7 preferidos incluem HHLA2, B7-1, B7-2, B7h, PD-L1 ou PD-L2 e fragmentos ou derivados solúveis dos mesmos. Em uma modalidade, os membros da família B7 se ligam a um ou mais receptores em uma célula imune, por exemplo, TMIGD2, KIR3DL3, CTLA4, CD28, ICOS, PD-1 e/ou outros receptores e, de- pendendo do receptor, têm a capacidade de transmitir um sinal inibitó- rio ou um sinal coestimulatório para uma célula imune, de preferência uma célula T.

[00214] A modulação de um sinal coestimulatório resulta na modu- lação da função efetora de uma célula imune. Assim, o termo "ativida- de do ligante de HHLA2" inclui a capacidade de um polipeptídeo do ligante de HHLA2 de se ligar ao(s) seu(s) receptor(es) natural(is)(por exemploHHLA2), a capacidade de modular os sinais coestimulatórios ou inibitórios das células imunes e a capacidade de modular a respos- ta imune.

[00215] É demonstrado aqui que a via HHLA2 é um regulador nega- tivo ou um regulador positivo da função imune, de modo que a modu- lação da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, pode modular a função imune. A ligação de HHLA2 a TMIGD2 pode ser um regulador positivo da fun- ção imune. A ligação de HHLA2 aos receptores inibitórios é um regu- lador negativo da função imune. Acredita-se que a ligação de HHLA2 a TMIGD2 seja semelhante à ligação de HHLA2 a receptores inibitórios. Portanto, acredita-se que inibir a ligação de HHLA2 a TMIGD2 inibe a ligação de HHLA2 a receptores inibitórios.Assim, os agentes da pre-

sente invenção aqui descritos que são moduladores da via HHLA2 (por exemplo, modulador da interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, tais como TMIGD2 e/ou KIR3DL3)modulam a inte- ração entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação naturais, seja direta ou indiretamente, pode suprarregular ou infrarregular o sistema imunológico e, assim, suprarregular ou infrarregular uma resposta imune. Os agentes que modulam essa interação podem fazer isso di- reta ou indiretamente.

[00216] A interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação natural de HHLA2, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, resulta na distribui- ção de um sinal imune coestimulatório ou coinibitório. Assim, em uma modalidade, os agentes que bloqueiam diretamente essa(s) intera- ção(ões) (por exemplo, anticorpos bloqueadores anti-HHLA2, anti- TMIGD2 e/ou anti-KIR3DL3) podem prevenir a sinalização inibitória ou estimulatória e suprarregular ou infrarregular uma resposta imune. Al- ternativamente, os agentes que bloqueiam indiretamente a(s) intera- ção(ões) podem prevenir a sinalização inibitória e suprarregular uma resposta imune. Agentes exemplificativos para a suprarregulação de uma resposta imune incluem anticorpos contra HHLA2 ou KIR3DL3 que bloqueiam a interação entre HHLA2 e KIR3DL3; uma forma não ativadora de HHLA2 ou KIR3DL3 (por exemplo, um polipeptídeo nega- tivo dominante), pequenas moléculas ou peptídeos que bloqueiam a interação entre HHLA2 e KIR3DL3; proteínas de fusão (por exemplo, a porção extracelular de HHLA2 ou KIR3DL3 fundida à porção Fc de um anticorpo ou imunoglobulina) que se ligam à HHLA2 ou KIR3DL3, res- pectivamente, e inibem a interação entre HHLA2 e KIR3DL3; molécu- las de ácido nucleico e/ou modificações genéticas que bloqueiam a transcrição ou tradução de HHLA2 e/ou KIR3DL3; uma forma não ati- vadora de um ligante de HHLA2 natural e uma forma solúvel de um ligante de KIR3DL3 natural.

[00217] Em outras modalidades exemplificativas, os agentes que promovem a ligação de um polipeptídeo de HHLA2 a um ou mais par- ceiros de ligação naturais, como o polipeptídeo de KIR3DL3, promo- vem um sinal inibitório para uma célula imune. Os agentes que modu- lam essa interação podem fazer isso direta ou indiretamente. Assim, em uma modalidade, os agentes que intensificam diretamente a inte- ração entre HHLA2 e KIR3DL3 (agonistas de HHLA2 e/ou agonistas de KIR3DL3) podem promover a sinalização inibitória e infrarregular uma resposta imune. Alternativamente, os agentes que bloqueiam a ligação de KIR3DL3 a outros alvos aumentam a concentração eficaz de KIR3DL3 disponível para se ligar à HHLA2. Agentes exemplificati- vos para infrarregular uma resposta imune incluem anticorpos contra HHLA2 ou KIR3DL3 que ativam ou promovem a interação entre HHLA2 e KIR3DL3; pequenas moléculas ou peptídeos que ativam ou promovem a interação entre HHLA2 e KIR3DL3; e anticorpos de blo- queio que se ligam a parceiros de ligação naturais de HHLA2 e KIR3DL3 diferentes de HHLA2 e KIR3DL3, respectivamente. Esses relacionamentos também se aplicam às interações HHLA2 e TMIGD2.

[00218] Agentes adicionais úteis nos métodos da presente invenção incluem anticorpos, moléculas pequenas, peptídeos, peptidomiméti- cos, ligantes naturais e derivados de ligantes naturais, que podem se ligar e/ou ativar ou inibir biomarcadores de proteínas da presente in- venção, incluindo os biomarcadores listados na Tabela 1, ou fragmen- tos dos mesmos; interferência de RNA, antissenso, aptâmeros de áci- dos nucleicos, etc. que podem infrarregular a expressão e/ou atividade dos biomarcadores da presente invenção, incluindo os biomarcadores listados na Tabela 1 ou fragmentos dos mesmos.

[00219] Anticorpos monoclonais isolados ou fragmentos dos mes- mos que são direcionados contra HHLA2 são fornecidos.

[00220] Uma vez que é bem conhecido na técnica que os domínios

CDR3 da cadeia pesada e leve do anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno, os anticorpos monoclonais recombi- nantes da presente invenção preparados como estabelecido acima compreendem preferencialmente as CDR3s da cadeia pesada e leve de regiões variáveis da presente invenção (por exemplo, incluindo as sequências da Tabela 2, ou porções das mesmas). Os anticorpos po- dem ainda compreender as CDR2s de regiões variáveis da presente invenção (por exemplo, incluindo as sequências da Tabela 2, ou por- ções das mesmas). Os anticorpos podem ainda compreender as CDR1s de regiões variáveis da presente invenção (por exemplo, inclu- indo as sequências da Tabela 2, ou porções das mesmas). Em outras modalidades, os anticorpos podem compreender quaisquer combina- ções das CDRs. As regiões CDR1, 2 e/ou 3 dos anticorpos engenheirados descritos acima podem compreender a(s) sequência(s) de aminoáci- dos exata(s) como as das regiões variáveis da presente invenção (por exemplo, incluindo as sequências da Tabela 2, ou porções das mes- mas) divulgadas aqui. No entanto, o versado na técnica apreciará que algum desvio das sequências exatas de CDR pode ser possível, em- bora ainda retenha a capacidade do anticorpo de se ligar à HHLA2 de forma eficaz (por exemplo, modificações de sequência conservativas). Por conseguinte, em outra modalidade, o anticorpo engenheirado pode ser composto por uma ou mais CDRs que são, por exemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idênticas a uma ou mais CDRs da presente in- venção (por exemplo, incluindo as sequências da Tabela 2, ou porções das mesmas).

[00221] As características estruturais de anticorpos conhecidos, não humanos ou humanos (por exemplo, um camundongo ou um anticorpo anti-HHLA2 humano não roedor) podem ser usadas para criar anticor- pos anti-HHLA2 humanos estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional do anticorpos da presente invenção, tais como ligação de HHLA2 (tais como mAb 8A12 e anticorpos poli- clonais 1.2 e 2.2). Outra propriedade funcional inclui a inibição da liga- ção dos anticorpos originais não humanos ou humanos conhecidos em um ensaio ELISA de competição.

[00222] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos mo- noclonais capazes de se ligar à HHLA2 humana (como mAb 8A12 e anticorpos policlonais 1.2 e 2.2), compreendendo uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR com uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica ao grupo de CDRs de domínio variável da cadeia pesada apresentadas na Ta- bela 2.

[00223] Da mesma forma, anticorpos monoclonais capazes de se ligar a HHLA2 humana (tal como mAb 8A12 e anticorpos policlonais

1.2 e 2.2), compreendendo uma cadeia leve em que o domínio variável compreende pelo menos um CDR tendo uma sequência que é de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica do grupo de CDRs de domínio variável da cadeia leve apresentadas na Tabela 2, também são fornecidos.

[00224] Anticorpos monoclonais capazes de se ligar à HHLA2 hu- mana (tal como mAb 8A12 e anticorpos policlonais 1.2 e 2.2), compre- endendo uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR tendo uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica do grupo de CDRs de domínio variável da cadeia pesada apresentadas na Tabela 2; e compreendendo uma cadeia leve em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR tendo uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica do grupo de CDRs de domínio variável da cadeia leve apresentadas na Tabela 2, também são fornecidos.

[00225] Um versado na técnica notará que essa homologia percen- tual é equivalente a e pode ser alcançada pela introdução de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em uma determinada CDR.

[00226] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem compreender uma cadeia pesada, em que o domínio variável compre- ende pelo menos uma CDR com uma sequência selecionada do grupo que consiste em CDRs de domínio variável da cadeia pesada apresen- tadas na Tabela 2 e uma cadeia leve, em que o domínio variável com- preende pelo menos uma CDR tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em CDRs de domínio variável da cadeia leve apre- sentadas na Tabela 2.

[00227] Tais anticorpos monoclonais podem compreender uma ca- deia leve, em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR com uma sequência selecionada do grupo que consiste em CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3, como aqui descrito; e/ou uma cadeia pesada , em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR com uma sequência selecionada do grupo que consiste em CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3, conforme descrito neste documento. Em algumas mo- dalidades, os anticorpos monoclonais capazes de se ligar à HHLA2 humana compreendem ou consistem em CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, conforme descrito neste documento.

[00228] O domínio variável da cadeia pesada dos anticorpos mono- clonais da presente invenção pode compreender ou consistir na se- quência de aminoácidos vH apresentada na Tabela 2 e/ou o domínio variável da cadeia leve dos anticorpos monoclonais da presente inven-

ção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos vκ apresentada na Tabela 2. Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser produzidos e modificados por qualquer técnica bem conhecida na técnica. Do mesmo modo, esses anticorpos monoclonais podem ser quiméricos, preferencialmente anticorpos quiméricos de camundon- gos/humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais são anticorpos humanizados de modo que o domínio variável compre- ende regiões de estruturas aceitadoras humanas e, opcionalmente, domínio constante humano quando presente, e CDRs de doadores não humanos, tais como CDRs de camundongo ou não roedores, con- forme definido acima.

[00229] A presente invenção fornece ainda fragmentos dos referi- dos anticorpos monoclonais que incluem, mas não estão limitados a, FFv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 e diacorpos; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Por exemplo, uma série de moléculas imunoinibitórias, tais como HHLA2, PD-L2, PD-L1, CTLA-4, KIR3DL3 e semelhantes, podem ser detecta- das de uma maneira biespecífica ou multiespecífica, a fim de caracte- rizar de forma eficiente a expressão de tais moléculas.

[00230] Outros fragmentos dos anticorpos monoclonais da presente invenção também são contemplados. Por exemplo, cadeias pesadas e/ou leves de imunoglobulina individuais são fornecidas, em que os domínios variáveis das mesmas compreendem pelo menos uma CDR apresentada na Tabela 2. Em uma modalidade, a cadeia pesada de imunoglobulina compreende pelo menos uma CDR com uma sequên- cia que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica do grupo de CDRs de domínio variável da cadeia pesada ou da cadeia leve apresentadas na Tabela 2. Em outra modalidade, uma cadeia leve de imunoglobulina compreende pelo menos uma CDR com uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica do grupo de CDRs de domínio variável da cadeia leve ou da cadeia pesada descritas aqui (por exemplo, apresentadas na Tabela 2).

[00231] Em algumas modalidades, a cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina compreende um domínio variável compreendendo pelo menos um de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 ou CDR- H3 aqui descritos. Essas cadeias pesadas de imunoglobulina podem compreender ou consistir em pelo menos um de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3. Tais cadeias leves de imunoglobulina podem compreender ou consistir em pelo menos uma de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3.

[00232] Em outras modalidades, uma cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma sequência de domínio variável vH ou vκ, respectiva- mente, fornecida na Tabela 2.

[00233] A presente invenção fornece ainda polipeptídeos que têm uma sequência selecionada do grupo que consiste em sequências de domínio variável vH, domínio variável vκ, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 descritas aqui.

[00234] Anticorpos, imunoglobulinas e polipeptídeos da invenção podem ser usados em uma forma isolada (por exemplo, purificada) ou contidos em um vetor, como uma membrana ou vesícula lipídica (por exemplo, um lipossoma).

Tabela 2: Identificação e sequenciamento das regiões líder e variável de anticorpos monoclonais anti-HHLA2, incluindo mAbs 8A12, 6D10, 6F10, 8D2, 2G2, 2C4, 4D1, 1C8 e 4E5 8A12 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2554HC.1;M13 499.5.8A12.11.10.5 Análise CDR

GFTFNTNV....___IRTKTNNYAT___VGAMDY Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2554HC.1\;M13F) > MHC2554HC.1\;M13F LOCUS 8A12_vH 402 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 370..402 /marcação=FWR4 V_segment 358..369 /marcação=CDR3 V_region 235..357 /marcação=FWR3 V_segment 211..234 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..402 /marcação=8A12_vH 8A12_vH /tradução="MLLGLKWIFFVVFYQGVHCEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNVMNWVRQAPGKGLE WVGRIRTKTNNYATYYADSVKGRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTATYFCVGAMDYWGQGTSVTVSS" (SEQ ID NO: 19) Sequência de nucleotídeos em formato FASTA (MHC2554HC.1\;M13F) > MHC2554HC.1\;M13F. 499.5.8A12.11.10.5

ORIGEM 1 ATGCTGTTGG GGCTGAAGTG GATTTTCTTT GTTGTTTTTT ATCAAGGTGT GCATTGTGAG 61 GTGCAACTTG TTGAGACTGG TGGAGGATTG GTGCAGCCTA AAGGGTCATT GAAACTCTCA 121 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAACACC AATGTCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 181 GGAAAGGGTT TGGAATGGGT TGGTCGCATA AGAACTAAAA CTAATAATTA TGCAACATAT 241 TATGCCGATT CAGTGAAAGG CAGGTTCACC ATCTCCAGAG ATGATTCACA AAGTATGCTC 301 TATCTGCAAA TGAACAACTT GAAAACTGAG GACACAGCCA CGTATTTCTG TGTGGGAGCT 361 ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CA (SEQ ID NO: 20) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGCTGTTGG GGCTGAAGTG GATTTTCTTT GTTGTTTTTT ATCAAGGTGT GCATTGT 57 (SEQ ID NO: 21) /tradução="MLLGLKWIFFVVFYQGVHC" (SEQ ID NO: 22)

Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 GAG GTGCAACTTG TTGAGACTGG TGGAGGATTG GTGCAGCCTA AAGGGTCATT GAAACTCTCA TGTGCAGCCT CT 132 (SEQ ID NO: 23) /tradução="EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAAS" (SEQ ID NO: 24)

CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGATTCAC CTTCAACACC AAT 153 (SEQ ID NO: 25) /tradução="GFTFNTN" (SEQ ID NO: 26)

Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154GTCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGAAAGGGTT TGGAATGGGT TGGTCGCATA210 (SEQ ID NO: 27) /tradução="VMNWVRQAPGKGLEWVGRI" (SEQ ID NO: 28)

CDR-H2 (pares de bases 211-234): 211AGAACTAAAA CTAATAATTA TGCA 234 (SEQ ID NO: 29) /tradução="RTKTNNYA" (SEQ ID NO: 30)

Estrutura 3 (pares de bases 235-357): 235ACATAT TATGCCGATT CAGTGAAAGG CAGGTTCACC ATCTCCAGAG ATGATTCACA AAGTATGCTC TATCTGCAAA TGAACAACTT GAAAACTGAG GACACAGCCA CGTATTTCTG TGTGGGA357 (SEQ ID NO: 31) /tradução="TYYADSVKGRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTATYFCVG" (SEQ ID NO: 32)

CDR-H3 (pares de bases 358-369): 358 GCT ATGGACTAC 369 (SEQ ID NO: 33) /tradução="AMDY" (SEQ ID NO: 34)

Estrutura 4 (pares de bases 370-402): 370T GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CA 402 (SEQ ID NO: 35) /tradução="WGQGTSVTVSS" (SEQ ID NO: 36)

MHC2554HC.1 499.5.8A12.11.10.5 Região Fragmento de Sequência Resíduos Compri- mento Líder MLLGLKWIFFVVFYQGVHC 1 -19 19 HFR1 EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAAS 20 - 44 25 CDR-H1 GFTFNTN 45 - 51 7 HFR2 VMNWVRQAPGKGLEWVGRI 52 - 70 19 CDR-H2 RTKTNNYA 71 - 78 8 HFR3 TYYADSVKGRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTATYFCVG 79 - 119 41 CDR-H3 AMDY 120 - 123 4 HFR4 WGQGTSVTVSS 124 - 134 11

8A12 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2554LC.2;M13. 499.5.8A12.11.10.5 Análise CDR ESVDNSGINF..___RAS.......___QQSYKDPPT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2554LC.2\;M13F) > MHC2554LC.2\;M13F LOCUS 8A12_vL393 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 364 ..393 /marcação=FWR4 V_segment 337..363 /marcação=CDR3 V_region 241..336 /marcação=FWR3 V_segment 220..240 /marcação=CDR2 V_region 175..219 /marcação=FWR2 V_segment 130..174 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..393 /marcação=8A12_vL 8A12_vL /tradução="METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATVSCRASESVDNSGINFIHWYQQKPG QSPKLLLYRASNLKSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYCQQSYKDPPTFGTGTKLELK" (SEQ ID NO: 37) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2554LC.2\;M13F) > MHC2554LC.2\;M13F. 499.5.8A12.11.10.5

ORIGEM 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACAGGT 61 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTGGGGCA GAGGGCCACC 121

GTCTCCTGCA GAGCCAGCGA AAGTGTTGAT AATTCTGGCA TAAATTTTAT ACACTGGTAC 181 CAGCAGAAAC CAGGACAGTC ACCCAAACTC CTCCTCTATC GTGCATCCAA CCTAAAATCT 241 GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT 301 CCTGTGGAGA CTGGTGATGT TGCAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTTATAA GGATCCTCCT 361 ACGTTCGGTA CTGGGACCAA GCTGGAGCTG AAG (SEQ ID NO: 38)

Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACAGGT60 (SEQ ID NO: 39) /tradução="METDTLLLWVLLLWVPGSTG" (SEQ ID NO: 40)

Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTGGGGCA GAGGGCCACC GTCTCCTGC129 (SEQ ID NO: 41) /tradução="DIVLTQSPASLAVSLGQRATVSC" (SEQ ID NO: 42)

CDR-L1 (pares de bases 130-174): 130A GAGCCAGCGA AAGTGTTGAT AATTCTGGCA TAAATTTTAT ACAC174 (SEQ ID NO: 43) /tradução="RASESVDNSGINFIH" (SEQ ID NO: 44)

Estrutura 2 (pares de bases 175-219): 175TGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGTC ACCCAAACTC CTCCTCTAT219 (SEQ ID NO: 45) /tradução="WYQQKPGQSPKLLLY" (SEQ ID NO: 46)

CDR-L2 (pares de bases 220-240): 220C GTGCATCCAA CCTAAAATCT240 (SEQ ID NO: 47) /tradução="RASNLKS" (SEQ ID NO: 48)

Estrutura 3 (pares de bases 241-336): 241 GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT CCTGTGGAGA CTGGTGATGT TGCAACCTAT TACTGT336 (SEQ ID NO: 49) /tradução="GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYC" (SEQ ID NO: 50)

CDR-L3 (pares de bases 337-363): 337CAGC AAAGTTATAA GGATCCTCCT ACG363 (SEQ ID NO: 51) /tradução="QQSYKDPPT" (SEQ ID NO: 52)

Estrutura 4 (pares de bases 364-393): 364TTCGGTA CTGGGACCAA GCTGGAGCTG AAG393 (SEQ ID NO: 53) /tradução="FGTGTKLELK" (SEQ ID NO: 54)

MHC2554LC.2. 499.5.8A12.11.10.5 Região Fragmento de Sequência Resíduos Compri- mento Líder METDTLLLWVLLLWVPGSTG 1-20 20 LFR1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATVSC 21 - 43 23 CDR-L1 RASESVDNSGINFIH 44 - 58 15 LFR2 WYQQKPGQSPKLLLY 59 - 73 15 CDR-L2 RASNLKS 74 - 80 7 LFR3 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYC 81 - 112 32

CDR-L3 QQSYKDPPT 113 - 121 9 LFR4 FGTGTKLELK 122 - 131 10 6D10 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2555HC.1;M13. 499.5.6D10.11.11.7 Análise CDR GFTFNTNV....___IRTKTNNYAT___VGAMDY Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2555HC.1\;M13F) > MHC2555HC.1\;M13F 499.5.6D10.11.11.7 LOCUS 6D10_vH 402 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 370..402 /marcação=FWR4 V_segment 358..369 /marcação=CDR3 V_region 235..357 /marcação=FWR3 V_segment 211..234 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..402 /rótulo=6D10_vH 6D10_vH /tradução="MLLGLKWIFFVVFYQGVHCEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNVMNWVRQAPGKGLE WVARIRTKTNNYATYYADSVKDRFTIFRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVGAMDYWGQGTSVTVSS" (SEQ ID NO: 55) Sequência de nucleotídeos em formato FASTA (MHC2555HC.1\;M13F) > MHC2555HC.1\;M13F. 499.5.6D10.11.11.7

ORIGEM 1 ATGCTGTTGG GGCTGAAGTG GATTTTCTTT GTTGTTTTTT ATCAAGGTGT GCATTGTGAG 61 GTGCAGCTTG TTGAGACTGG TGGAGGATTG GTGCAGCCTA AAGGGTCATT GAAACTCTCA 121 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAATACC AATGTCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 181 GGAAAGGGTT TGGAATGGGT TGCTCGCATA AGAACTAAAA CTAATAATTA TGCAACATAT 241 TATGCCGATT CAGTGAAAGA CAGGTTCACC ATCTTCAGAG ATGATTCACA AAGCATTCTC 301 TATCTGCAAA TGAACAACTT GAAAACTGAG GACACAGCCA TGTATTACTG TGTGGGAGCT

361 ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CA(SEQ ID NO: 56)

Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGCTGTTGG GGCTGAAGTG GATTTTCTTT GTTGTTTTTT ATCAAGGTGT GCATTGT57 (SEQ ID NO: 57) /tradução="MLLGLKWIFFVVFYQGVHC" (SEQ ID NO: 58)

Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 GAG GTGCAGCTTG TTGAGACTGG TGGAGGATTG GTGCAGCCTA AAGGGTCATT GAAACTCTCA TGTGCAGCCT CT132 (SEQ ID NO: 59) /tradução="EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAAS" (SEQ ID NO: 60)

CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGATTCAC CTTCAATACC AAT 153 (SEQ ID NO: 61) /tradução="GFTFNTN" (SEQ ID NO: 62)

Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154GTCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGAAAGGGTT TGGAATGGGT TGCTCGCATA 210 (SEQ ID NO: 63) /tradução="VMNWVRQAPGKGLEWVARI" (SEQ ID NO: 64)

CDR-H2 (pares de bases 211-234): 211AGAACTAAAA CTAATAATTA TGCA234 (SEQ ID NO: 65) /tradução="RTKTNNYA" (SEQ ID NO: 66)

Estrutura 3 (pares de bases 235-357): 235ACATAT TATGCCGATT CAGTGAAAGA CAGGTTCACC ATCTTCAGAG ATGATTCACA AAGCATTCTC TATCTGCAAA TGAACAACTT GAAAACTGAG GACACAGCCA TGTATTACTG TGTGGGA357 (SEQ ID NO: 67) /tradução="TYYADSVKDRFTIFRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVG" (SEQ ID NO: 68)

CDR-H3 (pares de bases 358-369): 358 GCT ATGGACTAC 369 (SEQ ID NO: 69) /tradução="AMDY" (SEQ ID NO: 70)

Estrutura 4 (pares de bases 370-402): 370T GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CA 402 (SEQ ID NO: 71) /tradução="WGQGTSVTVSS" (SEQ ID NO: 72)

MHC2555HC.1;M13. 499.5.6D10.11.11.7 Região Fragmento de Sequência Resíduos Compri- mento Líder MLLGLKWIFFVVFYQGVHC 1 - 19 19 HFR1 EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAAS 20 - 44 25

CDR-H1 GFTFNTN 45 - 51 7 HFR2 VMNWVRQAPGKGLEWVARI 52 - 70 19 CDR-H2 RTKTNNYA 71 - 78 8 HFR3 TYYADSVKDRFTIFRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYC 79 - 119 41

VG CDR-H3 AMDY 120 - 123 4 HFR4 WGQGTSVTVSS 124 - 134 11 6D10 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2555LC.1;M13. 499.5.6D10.11.11.7 Análise CDR ESVDNYGISF..___RAS.......___QQSSKDPPT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2555LC.1\;M13F) > MHC2555LC.1\;M13F. 499.5.6D10.11.11.7 LOCUS 6D10_vL 393 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 364 ..393 /marcação=FWR4 V_segment 337..363 /marcação=CDR3 V_region 241..336 /marcação=FWR3 V_segment 220..240 /marcação=CDR2 V_region 175..219 /marcação=FWR2 V_segment 130..174 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..393 /marcação=6D10_vL 6D10_vL /tradução="METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPG QPPKLLIYRASNLKSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYCQQSSKDPPTFGTGTKLELK" (SEQ ID NO: 73) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2555LC.1\;M13F) > MHC2555LC.1\;M13F. 499.5.6D10.11.11.7

ORIGEM 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACAGGT 61 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA GAGGGCCACC 121 ATCTCCTGCA GAGCCAGCGA GAGTGTTGAT AATTATGGCA TTAGTTTTAT GCACTGGTAC 181 CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC CTCATCTATC GTGCATCCAA CCTAAAATCT 241 GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT 301 CCTGTGGAGA CTGGTGATGT TGCTACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAGTAA GGATCCTCCT 361 ACGTTCGGTA CTGGGACCAA GCTAGAGCTG AAA (SEQ ID NO: 74)

Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACAGGT 60 (SEQ ID NO: 75) /tradução="METDTLLLWVLLLWVPGSTG" (SEQ ID NO: 76)

Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCTCCTGC129 (SEQ ID NO: 77) /tradução="DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC" (SEQ ID NO: 78)

CDR-L1 (pares de bases 130-174): 130A GAGCCAGCGA GAGTGTTGAT AATTATGGCA TTAGTTTTAT GCAC 174 (SEQ ID NO: 79) /tradução="RASESVDNYGISFMH" (SEQ ID NO: 80)

Estrutura 2 (pares de bases 175-219): 175TGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC CTCATCTAT 219 (SEQ ID NO: 81) /tradução="WYQQKPGQPPKLLIY" (SEQ ID NO: 82)

CDR-L2 (pares de bases 220-240): 220C GTGCATCCAA CCTAAAATCT 240 (SEQ ID NO: 83) /tradução="RASNLKS" (SEQ ID NO: 84)

Estrutura 3 (pares de bases 241-336): 241 GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT CCTGTGGAGA CTGGTGATGT TGCTACCTAT TACTGT 336 (SEQ ID NO: 85) /tradução="GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYC" (SEQ ID NO: 86)

CDR-L3 (pares de bases 337-363): 337CAGC AAAGTAGTAA GGATCCTCCT ACG 363 (SEQ ID NO: 87) /tradução="QQSSKDPPT" (SEQ ID NO: 88)

Estrutura 4 (pares de bases 364-393): 364TTCGGTA CTGGGACCAA GCTAGAGCTG AAA 393 (SEQ ID NO: 89) /tradução="FGTGTKLELK" (SEQ ID NO: 90)

MHC2555LC.1 499.5.6D10.11.11.7 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder METDTLLLWVLLLWVPGSTG 1-20 20 LFR1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC 21 - 43 23 CDR-L1 RASESVDNYGISFMH 44 - 58 15 LFR2 WYQQKPGQPPKLLIY 59 - 73 15 CDR-L2 RASNLKS 74 - 80 7 LFR3 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYC 81 - 112 32 CDR-L3 QQSSKDPPT 113 - 121 9 LFR4 FGTGTKLELK 122 - 131 10

6F10 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2557HCO.1;M13. 499.5.6F10.A4.10 Análise CDR GYTFTTYT....___INPSSGYT..___ARHPWDSDY Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2557HCO.1\;M13F) > MHC2557HCO.1\;M13F. 499.5.6F10.A4.10

LOCUS 6F10_vH 405 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 373..405 /marcação=FWR4 V_segment 352..372 /marcação=CDR3 V_region 229..351 /marcação=FWR3 V_segment 211..228 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..405 /marcação=6F10_vH

6F10_vH /tradução="MERHWIFLFLLSVTAGVHSQVHLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTMHWVKQRPGQGLE WIGHINPSSGYTDYNQKFKDKTTLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARHPWDSDYWGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 91)

Sequência de nucleotídeos em formato FASTA (MHC2557HCO.1\;M13F) > MHC2557HCO.1\;M13F. 499.5.6F10.A4.10

ORIGEM 1 ATGGAAAGGC ACTGGATCTT TCTCTTCCTG TTGTCAGTAA CTGCAGGTGT CCACTCCCAG 61 GTCCACCTGC AGCAGTCTGC AGCTGAACTG GCAAGACCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC 121 TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTTACTACC TACACGATGC ACTGGGTAAA ACAGAGGCCT 181 GGACAGGGTC TGGAATGGAT TGGACACATT AATCCTAGCA GTGGATATAC TGATTACAAT 241 CAGAAATTCA AGGACAAGAC CACATTGACT GCAGACAAAT CCTCCAGTAC AGCCTACATG 301 CAACTGAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG ACACCCCTGG 361 GACTCGGACT ACTGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA(SEQ ID NO: 92) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGGAAAGGC ACTGGATCTT TCTCTTCCTG TTGTCAGTAA CTGCAGGTGT CCACTCC57 (SEQ ID NO: 93) /tradução="MERHWIFLFLLSVTAGVHS" (SEQ ID NO: 94) Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 CAG GTCCACCTGC AGCAGTCTGC AGCTGAACTG GCAAGACCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CT132 (SEQ ID NO: 95) /tradução="QVHLQQSAAELARPGASVKMSCKAS" (SEQ ID NO: 96) CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGCTACAC CTTTACTACC TAC 153 (SEQ ID NO: 97) /tradução="GYTFTTY" (SEQ ID NO: 98) Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154ACGATGC ACTGGGTAAA ACAGAGGCCT 181 GGACAGGGTC TGGAATGGAT TGGACACATT210 (SEQ ID NO: 99) /tradução="TMHWVKQRPGQGLEWIGHI" (SEQ ID NO: 100) CDR-H2 (pares de bases 211-228): 211AATCCTAGCA GTGGATAT228 (SEQ ID NO: 101) /tradução="NPSSGY" (SEQ ID NO: 102) Estrutura 3 (pares de bases 229-351): 229AC TGATTACAAT CAGAAATTCA AGGACAAGAC CACATTGACT GCAGACAAAT CCTCCAGTAC AG- CCTACATG CAACTGAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG A 351 (SEQ ID NO: 103) /tradução="TDYNQKFKDKTTLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAR" (SEQ ID NO: 104) CDR-H3 (pares de bases 352-372): 352CACCCCTGG GACTCGGACT AC 372 (SEQ ID NO: 105) /tradução="HPWDSDY" (SEQ ID NO: 106)

Estrutura 4 (pares de bases 373-405): 373TGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA 405 (SEQ ID NO: 107) /tradução="WGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 108)

MHC2557HCO.1 499.5.6F10.A4.10 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MERHWIFLFLLSVTAGVHS 1 - 19 19 HFR1 QVHLQQSAAELARPGASVKMSCKAS 20 - 44 25 CDR-H1 GYTFTTY 45 - 51 7 HFR2 TMHWVKQRPGQGLEWIGHI 52 - 70 19 CDR-H2 NPSSGY 71 - 76 6 HFR3 TDYNQKFKDKTTLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAR 77 - 117 41 CDR-H3 HPWDSDY 118 - 124 7 HFR4 WGQGTTLTVSS 125 - 135 11

6F10 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2557LC.1;M13. Análise CDR ENIDSY......___AAT.......___QHYYITPFT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2557LC.1\;M13F) > MHC2557LC.1\;M13F. 499.5.6F10.A4.10

LOCUS 6F10_vL 381 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 352..381 /marcação=FWR4 V_segment 325..351 /marcação=CDR3 V_region 229..324 /marcação=FWR3 V_segment 208..228 /marcação=CDR2 V_region 163..207 /marcação=FWR2 V_segment 130..162 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..381 /marcação=6F10_vL

6F10_vL

/tradução="MSVPTQLLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGRSPQ LLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQFSLQINRLQSEDVARYYCQHYYITPFTFGSGTKLEIA" (SEQ ID NO: 109) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2557LC.1\;M13F) > MHC2557LC.1\;M13F. 499.5.6F10.A4.10

ORIGEM 1 ATGAGTGTGC CCACTCAGCT CCTGGGGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGA TGCCAGATGT 61 GACATCCAGA TGACTCAGTC TCCAGCTTCC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA AACTGTCACC 121 ATCACATGTC GAGCAAGTGA GAATATTGAC AGTTATTTAG CATGGTATCA GCAGAAACAG 181 GGAAGATCTC CTCAGCTCCT GGTCTATGCT GCAACAAACT TAGCAGATGG TGTGCCATCA 241 AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGCACACAG TTTTCTCTCC AGATCAACCG CCTGCAGTCT 301 GAAGATGTTG CGAGATATTA CTGTCAACAT TATTATATTA CTCCATTCAC GTTCGGCTCG 361 GGGACAAAAT TGGAAATAGC A (SEQ ID NO: 110) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGAGTGTGC CCACTCAGCT CCTGGGGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGA TGCCAGATGT 60 (SEQ ID NO: 111) /tradução="MSVPTQLLGLLLLWLTDARC" (SEQ ID NO: 112) Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATCCAGA TGACTCAGTC TCCAGCTTCC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA AACTGTCACC ATCACATGT 129 (SEQ ID NO: 113) /tradução="DIQMTQSPASLSASVGETVTITC" (SEQ ID NO: 114) CDR-L1 (pares de base 130-162): 130C GAGCAAGTGA GAATATTGAC AGTTATTTAG CA 162 (SEQ ID NO: 115) /tradução="RASENIDSYLA" (SEQ ID NO: 116) Estrutura 2 (pares de bases 163-207): 163TGGTATCA GCAGAAACAG GGAAGATCTC CTCAGCTCCT GGTCTAT 207 (SEQ ID NO: 117) /tradução="WYQQKQGRSPQLLVY" (SEQ ID NO: 118) CDR-L2 (pares de bases 208-228): 208GCT GCAACAAACT TAGCAGAT 228 (SEQ ID NO: 119) /tradução="AATNLAD" (SEQ ID NO: 120) Estrutura 3 (pares de bases 229-324): 229 GG TGTGCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGCACACAG TTTTCTCTCC AGATCAACCG CCTGCAGTCT GAAGATGTTG CGAGATATTA CTGT 324 (SEQ ID NO: 121) /tradução="GVPSRFSGSGSGTQFSLQINRLQSEDVARYYC" (SEQ ID NO: 122) CDR-L3 (pares de bases 325-351): 325CAACAT TATTATATTA CTCCATTCAC G 351 (SEQ ID NO: 123)

/tradução="QHYYITPFT" (SEQ ID NO: 124)

Estrutura 4 (pares de bases 352-381): 352TTCGGCTCG GGGACAAAAT TGGAAATAGC A 381 (SEQ ID NO: 125) /tradução="FGSGTKLEIA" (SEQ ID NO: 126)

MHC2557LC.1 499.5.6F10.A4.10 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MSVPTQLLGLLLLWLTDARC 1-20 20 LFR1 DIQMTQSPASLSASVGETVTITC 21 - 43 23 CDR-L1 RASENIDSYLA 44 - 54 11 LFR2 WYQQKQGRSPQLLVY 55 - 69 15 CDR-L2 AATNLAD 70 - 76 7 LFR3 GVPSRFSGSGSGTQFSLQINRLQSEDVARYYC 77 - 108 32 CDR-L3 QHYYITPFT 109 - 117 9 LFR4 FGSGTKLEIA 118 - 127 10

8D2 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2558HC.1;M13. 499.8D2.6.8 Análise CDR GFTFNTNV....___IRTKTNNYAT___VGAMDY Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2558HC.1\;M13F) > MHC2558HC.1\;M13F. 499.8D2.6.8

LOCUS 8D2_vH 402 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 370..402 /marcação=FWR4 V_segment 358..369 /marcação=CDR3 V_region 235..357 /marcação=FWR3 V_segment 211..234 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..402 /marcação=8D2_vH

8D2_vH /tradução="MLLGLKWIFFVVFYQGVHCEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNVMNWVRQAPGKGLE WVGRIRTKTNNYATYYADSVKGRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTATYFCVGAMDYWGQGTSVTVSS" (SEQ ID NO: 127) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2558HC.1\;M13F) > MHC2558HC.1\;M13F. 499.8D2.6.8

ORIGEM 1 ATGCTGTTGG GGCTGAAGTG GATTTTCTTT GTTGTTTTTT ATCAAGGTGT GCATTGTGAG 61 GTGCAACTTG TTGAGACTGG TGGAGGATTG GTGCAGCCTA AAGGGTCATT GAAACTCTCA 121 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAACACC AATGTCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 181 GGAAAGGGTT TGGAATGGGT TGGTCGCATA AGAACTAAAA CTAATAATTA TGCAACATAT 241 TATGCCGATT CAGTGAAAGG CAGGTTCACC ATCTCCAGAG ATGATTCACA AAGTATGCTC 301 TATCTGCAAA TGAACAACTT GAAAACTGAG GACACAGCCA CGTATTTCTG TGTGGGAGCT 361 ATGGACTACT GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CA (SEQ ID NO: 128) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGCTGTTGG GGCTGAAGTG GATTTTCTTT GTTGTTTTTT ATCAAGGTGT GCATTGT57 (SEQ ID NO: 129) /tradução="MLLGLKWIFFVVFYQGVHC" (SEQ ID NO: 130) Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 GAG GTGCAACTTG TTGAGACTGG TGGAGGATTG GTGCAGCCTA AAGGGTCATT GAAACTCTCA TGTGCAGCCT CT132 (SEQ ID NO: 131) /tradução="EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAAS" (SEQ ID NO: 132) CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGATTCAC CTTCAACACC AAT 153 (SEQ ID NO: 133) /tradução="GFTFNTN" (SEQ ID NO: 134) Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154GTCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGAAAGGGTT TGGAATGGGT TGGTCGCATA 210 (SEQ ID NO: 135) /tradução="VMNWVRQAPGKGLEWVGRI" (SEQ ID NO: 136) CDR-H2 (pares de bases 211-234): 211AGAACTAAAA CTAATAATTA TGCA234 (SEQ ID NO: 137) /tradução="RTKTNNYA" (SEQ ID NO: 138) Estrutura 3 (pares de bases 235-357): 235ACATAT TATGCCGATT CAGTGAAAGG CAGGTTCACC ATCTCCAGAG ATGATTCACA AAGTATGCTC TATCTGCAAA TGAACAACTT GAAAACTGAG GACACAGCCA CGTATTTCTG TGTGGGA357 (SEQ ID NO: 139)

/tradução="TYYADSVKGRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTATYFCVG" (SEQ ID NO: 140)

CDR-H3 (pares de bases 358-369): 358 GCT ATGGACTAC 369 (SEQ ID NO: 141) /tradução="AMDY" (SEQ ID NO: 142)

Estrutura 4 (pares de bases 370-402): 370T GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CA 402 (SEQ ID NO: 143) /tradução="WGQGTSVTVSS" (SEQ ID NO: 144)

MHC2558HC.1 499.8D2.6.8 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MLLGLKWIFFVVFYQGVHC 1 - 19 19 HFR1 EVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCAAS 20 - 44 25 CDR-H1 GFTFNTN 45 - 51 7 HFR2 VMNWVRQAPGKGLEWVGRI 52 - 70 19 CDR-H2 RTKTNNYA 71 - 78 8 HFR3 TYYADSVKGRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTATYFCVG 79 - 119 41 CDR-H3 AMDY 120 - 123 4 HFR4 WGQGTSVTVSS 124 - 134 11

8D2 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2558LC.2;M13. 499.8D2.6.8 Análise CDR ESVDNSGINF..___RAS.......___QQSYKDPPT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2558LC.2\;M13F) > MHC2558LC.2\;M13F. 499.8D2.6.8

LOCUS 8D2_vL 393 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 364 ..393 /marcação=FWR4 V_segment 337..363 /marcação=CDR3 V_region 241..336 /marcação=FWR3 V_segment 220..240 /marcação=CDR2 V_region 175..219 /marcação=FWR2 V_segment 130..174 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..393 /marcação=8D2_vL 8D2_vL /tradução="METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATVSCRASESVDNSGINFIHWYQQKPG QSPKLLLYRASNLKSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYCQQSYKDPPTFGTGTKLELK" (SEQ ID NO: 145) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2558LC.2\;M13F) > MHC2558LC.2\;M13F. 499.8D2.6.8

ORIGEM 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACAGGT 61 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTGGGGCA GAGGGCCACC 121 GTCTCCTGCA GAGCCAGCGA AAGTGTTGAT AATTCTGGCA TAAATTTTAT ACACTGGTAC 181 CAGCAGAAAC CAGGACAGTC ACCCAAACTC CTCCTCTATC GTGCATCCAA CCTAAAATCT 241 GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT 301 CCTGTGGAGA CTGGTGATGT TGCAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTTATAA GGATCCTCCT 361 ACGTTCGGTA CTGGGACCAA GCTGGAGCTG AAG (SEQ ID NO: 146) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACAGGT 60 (SEQ ID NO: 147) /tradução="METDTLLLWVLLLWVPGSTG" (SEQ ID NO: 148) Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTGGGGCA GAGGGCCACC GTCTCCTGC 129 (SEQ ID NO: 149) /tradução="DIVLTQSPASLAVSLGQRATVSC" (SEQ ID NO: 150) CDR-L1 (pares de bases 130-174): 130A GAGCCAGCGA AAGTGTTGAT AATTCTGGCA TAAATTTTAT ACAC 174 (SEQ ID NO: 151) /tradução="RASESVDNSGINFIH" (SEQ ID NO: 152) Estrutura 2 (pares de bases 175-219): 175CTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGTC ACCCAAACTC CTCCTCTAT219 (SEQ ID NO: 153) /tradução="WYQQKPGQSPKLLLY" (SEQ ID NO: 154) CDR-L2 (pares de bases 220-240): 220C GTGCATCCAA CCTAAAATCT240 (SEQ ID NO: 155) /tradução="RASNLKS" (SEQ ID NO: 156) Estrutura 3 (pares de bases 241-336):

241 GGGATCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT CCTGTGGAGA CTGGTGATGT TGCAACCTAT TACTGT 336 (SEQ ID NO: 157) /tradução="GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYC" (SEQ ID NO: 158)

CDR-L3 (pares de bases 337-363): 337CAGC AAAGTTATAA GGATCCTCCT ACG 363 (SEQ ID NO: 159) /tradução="QQSYKDPPT" (SEQ ID NO: 160)

Estrutura 4 (pares de bases 364-393): 364TTCGGTA CTGGGACCAA GCTGGAGCTG AAG 393 (SEQ ID NO: 161) /tradução="FGTGTKLELK" (SEQ ID NO: 162)

MHC2558LC.2 499.8D2.6.8 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder METDTLLLWVLLLWVPGSTG 1-20 20 LFR1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATVSC 21 - 43 23 CDR-L1 RASESVDNSGINFIH 44 - 58 15 LFR2 WYQQKPGQSPKLLLY 59 - 73 15 CDR-L2 RASNLKS 74 - 80 7 LFR3 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETGDVATYYC 81 - 112 32 CDR-L3 QQSYKDPPT 113 - 121 9 LFR4 FGTGTKLELK 122 - 131 10

2G2 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2561HC.1;M13. 499.5.2G2.13.3.10 Análise CDR GLTFSSYA....___ISSGGSHT..___TRLGRAFDY Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2561HC.1\;M13F) > MHC2561HC.1\;M13F. 499.5.2G2.13.3.10

LOCUS 2G2_vH 405 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 373..405 /marcação=FWR4 V_segment 352..372 /marcação=CDR3 V_region 229..351 /marcação=FWR3 V_segment 211..228 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1

V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..405 /marcação=2G2_vH 2G2_vH /tradução="MNFGLSLIFLVLVLKGVQCEVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGLTFSSYAMSWVRQTPEKRLE WVATISSGGSHTYYPDSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCTRLGRAFDYWGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 163) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2561HC.1\;M13F) > MHC2561HC.1\;M13F. 499.5.2G2.13.3.10

ORIGEM 1 ATGAACTTCG GGCTCAGCTT GATTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAA 61 GTGATGCTGG TGGAGTCAGG GGGAGGCTTA GTGAAGCCTG GAGGATCCCT GAAACTCTCC 121 TGTGCAGTCT CTGGATTAAC TTTTAGTAGT TATGCCATGT CTTGGGTTCG CCAGACTCCG 181 GAGAAGAGGC TGGAGTGGGT CGCAACCATT AGTAGTGGTG GTAGTCACAC CTACTATCCA 241 GACAGTGTGA AGGGGCGATT CATCATTTCT AGAGACAATG CCAAGAACAC CCTGTACCTG 301 CAAATGAACA GTCTGAGGTC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTACAAG ACTGGGACGG 361 GCCTTTGACT ACTGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA (SEQ ID NO: 164) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGAACTTCG GGCTCAGCTT GATTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT CCAGTGT57 (SEQ ID NO: 165) /tradução="MNFGLSLIFLVLVLKGVQC" (SEQ ID NO: 166) Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 GAA GTGATGCTGG TGGAGTCAGG GGGAGGCTTA GTGAAGCCTG GAGGATCCCT GAAACTCTCC TGTGCAGTCT CT132 (SEQ ID NO: 167) /tradução="EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVS" (SEQ ID NO: 168) CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGATTAAC TTTTAGTAGT TAT 153 (SEQ ID NO: 169) /tradução="GLTFSSY" (SEQ ID NO: 170) Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154GCCATGT CTTGGGTTCG CCAGACTCCG GAGAAGAGGC TGGAGTGGGT CGCAACCATT210 (SEQ ID NO: 171) /tradução="AMSWVRQTPEKRLEWVATI" (SEQ ID NO: 172) CDR-H2 (pares de bases 211-228): 211AGTAGTGGTG GTAGTCAC228 (SEQ ID NO: 173) /tradução="SSGGSH" (SEQ ID NO: 174)

Estrutura 3 (pares de bases 229-351): 229AC CTACTATCCA GACAGTGTGA AGGGGCGATT CATCATTTCT AGAGACAATG CCAAGAACAC CCTGTACCTG CAAATGAACA GTCTGAGGTC TGAGGACACG GCCATGTATT ACTGTACAAG A 351 (SEQ ID NO: 175) /tradução="TYYPDSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCTR" (SEQ ID NO: 176)

CDR-H3 (pares de bases 352-372): 352CTGGGACGG GCCTTTGACT AC 372 (SEQ ID NO: 177) /tradução="LGRAFDY" (SEQ ID NO: 178)

Estrutura 4 (pares de bases 373-405): 373TGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA 405 (SEQ ID NO: 179) /tradução="WGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 180)

MHC2561HC.1 499.5.2G2.13.3.10 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MNFGLSLIFLVLVLKGVQC 1 - 19 19 HFR1 EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVS 20 - 44 25 CDR-H1 GLTFSSY 45 - 51 7 HFR2 AMSWVRQTPEKRLEWVATI 52 - 70 19 CDR-H2 SSGGSH 71 - 76 6 HFR3 TYYPDSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCTR 77 - 117 41 CDR-H3 LGRAFDY 118 - 124 7 HFR4 WGQGTTLTVSS 125 - 135 11

2G2 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2561LC.1;M13. 499.5.2G2.13.3.10 Análise CDR QDVSTA......___WAS.......___QQDYSTPWT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2561LC.1\;M13F) > MHC2561LC.1\;M13F. 499.5.2G2.13.3.10

LOCUS 2G2_vL 381 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 352..381 /marcação=FWR4 V_segment 325..351 /marcação=CDR3 V_region 229..324 /marcação=FWR3 V_segment 208..228 /marcação=CDR2 V_region 163..207

/marcação=FWR2 V_segment 130..162 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..381 /marcação=2G2_vL 2G2_vL /tradução="MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPK VLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLALYYCQQDYSTPWTFGGGTKLEIK" (SEQ ID NO: 181) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2561LC.1\;M13F) > MHC2561LC.1\;M13F. 499.5.2G2.13.3.10

ORIGEM 1 ATGGAGTCAC AGATTCAGGT CTTTGTATTC GTGTTTCTCT GGTTGTCTGG TGTTGACGGA 61 GACATTGTGA TGACCCAGTC TCACAAATTC ATGTCCACAT CAGTAGGAGA CAGGGTCAGC 121 ATCACCTGCA AGGCCAGTCA GGATGTGAGT ACTGCTGTAG CCTGGTATCA ACAAAAGCCA 181 GGGCAATCTC CTAAAGTTCT GATTTACTGG GCATCCACCC GGCACACTGG AGTCCCTGAT 241 CGCTTCACAG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TGTGCAGGCT 301 GAAGACCTGG CACTTTATTA CTGTCAGCAA GATTATAGCA CTCCGTGGAC GTTCGGTGGA 361 GGCACCAAGC TGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 182) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGGAGTCAC AGATTCAGGT CTTTGTATTC GTGTTTCTCT GGTTGTCTGG TGTTGACGGA 60 (SEQ ID NO: 183) /tradução="MESQIQVFVFVFLWLSGVDG" (SEQ ID NO: 184) Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATTGTGA TGACCCAGTC TCACAAATTC ATGTCCACAT CAGTAGGAGA CAGGGTCAGC ATCACCTGC 129 (SEQ ID NO: 185) /tradução="DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC" (SEQ ID NO: 186) CDR-L1 (pares de base 130-162): 130A AGGCCAGTCA GGATGTGAGT ACTGCTGTAG CC 162 (SEQ ID NO: 187) /tradução="KASQDVSTAVA" (SEQ ID NO: 188) Estrutura 2 (pares de bases 163-207): 163TGGTATCA ACAAAAGCCA GGGCAATCTC CTAAAGTTCT GATTTAC 207 (SEQ ID NO: 189) /tradução="WYQQKPGQSPKVLIY" (SEQ ID NO: 190)

CDR-L2 (pares de bases 208-228): 208TGG GCATCCACCC GGCACACT228 (SEQ ID NO: 191) /tradução="WASTRHT" (SEQ ID NO: 192)

Estrutura 3 (pares de bases 229-324): 229 GG AGTCCCTGAT CGCTTCACAG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TGTGCAGGCT GAAGACCTGG CACTTTATTA CTGT 324 (SEQ ID NO: 193) /tradução="GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLALYYC" (SEQ ID NO: 194)

CDR-L3 (pares de bases 325-351): 325CAGCAA GATTATAGCA CTCCGTGGAC G 351 (SEQ ID NO: 195) /tradução="QQDYSTPWT" (SEQ ID NO: 196)

Estrutura 4 (pares de bases 352-381): 352 TTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA A381 (SEQ ID NO: 197) /tradução="FGGGTKLEIK" (SEQ ID NO: 198)

MHC2561LC.1 499.5.2G2.13.3.10 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MESQIQVFVFVFLWLSGVDG 1 - 20 20 LFR1 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC 21 - 43 23 CDR-L1 KASQDVSTAVA 44 - 54 11 LFR2 WYQQKPGQSPKVLIY 55 - 69 15 CDR-L2 WASTRHT 70 - 76 7 LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLALYYC 77 - 108 32 CDR-L3 QQDYSTPWT 109 - 117 9 LFR4 FGGGTKLEIK 118 - 127 10

2C4 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2562HC.1;M13. 499.5.2C4.E6.6.8.1 Análise CDR GFSFTDYN....___IDPYYGRI..___ATGAYTSGYSWFAY Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2562HC.1\;M13F) > MHC2562HC.1\;M13F. 499.5.2C4.E6.6.8.1

LOCUS 2C4_vH 420 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 388..420 /marcação=FWR4 V_segment 352..387 /marcação=CDR3 V_region 229..351 /marcação=FWR3 V_segment 211..228

/marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..420 /marcação=2C4_vH 2C4_vH /tradução="MGWTWIFILILSVTTGVHSEVHLQQSGPELEKPGVSVKISCKASGFSFTDYNMNWVKQSSGKSLE WIGNIDPYYGRINYNQKFKGKATLSVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCATGAYTSGYSWFAYWGQGTLVTVSA" (SEQ ID NO: 199) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2562HC.1\;M13F) > MHC2562HC.1\;M13F. 499.5.2C4.E6.6.8.1

ORIGEM 1 ATGGGATGGA CCTGGATCTT TATTTTAATC CTGTCAGTAA CTACAGGTGT CCACTCTGAG 61 GTCCACCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GAGAAGCCTG GCGTTTCAGT GAAGATATCC 121 TGCAAGGCTT CTGGTTTCTC ATTCACTGAC TACAACATGA ACTGGGTGAA ACAGAGCAGT 181 GGAAAGAGCC TTGAGTGGAT TGGAAATATT GATCCTTACT ATGGACGTAT TAACTATAAC 241 CAGAAATTCA AGGGCAAGGC CACATTGAGT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG 301 CACCTCAAGA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAC TGGGGCCTAC 361 ACCTCGGGCT ACTCCTGGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 200) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGGGATGGA CCTGGATCTT TATTTTAATC CTGTCAGTAA CTACAGGTGT CCACTCT57 (SEQ ID NO: 201) /tradução="MGWTWIFILILSVTTGVHS" (SEQ ID NO: 202) Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 GAG GTCCACCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GAGAAGCCTG GCGTTTCAGT GAAGATATCC TGCAAGGCTT CT132 (SEQ ID NO: 203) /tradução="EVHLQQSGPELEKPGVSVKISCKAS" (SEQ ID NO: 204) CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGTTTCTC ATTCACTGAC TAC 153 (SEQ ID NO: 205) /tradução="GFSFTDY" (SEQ ID NO: 206) Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154AACATGA ACTGGGTGAA ACAGAGCAGT GGAAAGAGCC TTGAGTGGAT TGGAAATATT 210 (SEQ

ID NO: 207) /tradução="NMNWVKQSSGKSLEWIGNI" (SEQ ID NO: 208)

CDR-H2 (pares de bases 211-228): 211GATCCTTACT ATGGACGT 228 (SEQ ID NO: 209) /tradução="DPYYGR" (SEQ ID NO: 210)

Estrutura 3 (pares de bases 229-351): 229AT TAACTATAAC CAGAAATTCA AGGGCAAGGC CACATTGAGT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AG- CCTACATG CACCTCAAGA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAC T 351 (SEQ ID NO: 211) /tradução="INYNQKFKGKATLSVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCAT" (SEQ ID NO: 212)

CDR-H3 (pares de bases 352-387): 352GGGGCCTAC ACCTCGGGCT ACTCCTGGTT TGCTTAC 387 (SEQ ID NO: 213) /tradução="GAYTSGYSWFAY" (SEQ ID NO: 214)

Estrutura 4 (pares de bases 388-420): 388TGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA 420 (SEQ ID NO: 215) /tradução="WGQGTLVTVSA" (SEQ ID NO: 216)

MHC2562HC.1 499.5.2C4.E6.6.8.1 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MGWTWIFILILSVTTGVHS 1 - 19 19 HFR1 EVHLQQSGPELEKPGVSVKISCKAS 20 - 44 25 CDR-H1 GFSFTDY 45 - 51 7 HFR2 NMNWVKQSSGKSLEWIGNI 52 - 70 19 CDR-H2 DPYYGR 71 - 76 6 HFR3 INYNQKFKGKATLSVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCAT 77 - 117 41 CDR-H3 GAYTSGYSWFAY 118 - 129 12 HFR4 WGQGTLVTVSA 130 - 140 11

2C4 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2562LC.2;M13. 499.5.2C4.E6.6.8.1 Análise CDR SSVSSSY.....___RTS.......___QQWSGYPFT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2562LC.2\;M13F) > MHC2562LC.2\;M13F. 499.5.2C4.E6.6.8.1

LOCUS 2C4_vL 390 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 361..390 /marcação=FWR4 V_segment 334..360

/marcação=CDR3 V_region 238..333 /marcação=FWR3 V_segment 217..237 /marcação=CDR2 V_region 172..216 /marcação=FWR2 V_segment 136..171 /marcação=CDR1 V_region 67..135 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..66 /marcação=LS CDS 1..390 /marcação=2C4_vL 2C4_vL /tradução="MGLQVQVISFLLISVTVIMSRGENVLTQSPGIMAASLGEKVTMTCSASSSVSSSYLHWYQQRSGA SPKPLIHRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPFTFGSGTKLEIK" (SEQ ID NO: 217) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2562LC.2\;M13F) > MHC2562LC.2\;M13F. 499.5.2C4.E6.6.8.1

ORIGEM 1 ATGGGTTTAC AGGTGCAGGT TATCAGCTTC CTGTTAATCA GTGTCACAGT CATAATGTCC 61 AGAGGAGAAA ATGTGCTCAC CCAGTCTCCA GGAATAATGG CTGCCTCTCT GGGGGAGAAG 121 GTCACCATGA CCTGCAGTGC CAGCTCAAGT GTAAGTTCCA GTTACTTGCA CTGGTACCAG 181 CAGAGGTCAG GCGCTTCCCC CAAACCCTTG ATTCATAGGA CATCCAACCT GGCTTCTGGT 241 GTCCCAGCTC GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGC 301 GTGGAGGCTG AAGATGATGC AACTTATTAC TGCCAGCAGT GGAGTGGTTA CCCATTCACG 361 TTCGGCTCGG GGACAAAGTT GGAAATAAAA (SEQ ID NO: 218) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-66): 1 ATGGGTTTAC AGGTGCAGGT TATCAGCTTC CTGTTAATCA GTGTCACAGT CATAATGTCC AGAGGA 66 (SEQ ID NO: 219) /tradução="MGLQVQVISFLLISVTVIMSRG" (SEQ ID NO: 220) Estrutura 1 (pares de bases 67-135): 67 GAAA ATGTGCTCAC CCAGTCTCCA GGAATAATGG CTGCCTCTCT GGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGC135 (SEQ ID NO: 221) /tradução="ENVLTQSPGIMAASLGEKVTMTC" (SEQ ID NO: 222) CDR-L1 (pares de bases 136-171): 136AGTGC CAGCTCAAGT GTAAGTTCCA GTTACTTGCA C 171 (SEQ ID NO: 223) /tradução="SASSSVSSSYLH" (SEQ ID NO: 224)

Estrutura 2 (pares de bases 172-216): 172TGGTACCAG CAGAGGTCAG GCGCTTCCCC CAAACCCTTG ATTCAT 216 (SEQ ID NO: 225)

/tradução="WYQQRSGASPKPLIH" (SEQ ID NO: 226)

CDR-L2 (pares de bases 217-237): 217AGGA CATCCAACCT GGCTTCT 237 (SEQ ID NO: 227) /tradução="RTSNLAS" (SEQ ID NO: 228)

Estrutura 3 (pares de bases 238-333): 238 GGT GTCCCAGCTC GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGC GTGGAGGCTG AAGATGATGC AACTTATTAC TGC 333 (SEQ ID NO: 229) /tradução="GVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYC" (SEQ ID NO: 230)

CDR-L3 (pares de bases 334-360): 334CAGCAGT GGAGTGGTTA CCCATTCACG 360 (SEQ ID NO: 231) /tradução="QQWSGYPFT" (SEQ ID NO: 232)

Estrutura 4 (pares de bases 361-390): 361TTCGGCTCGG GGACAAAGTT GGAAATAAAA 390 (SEQ ID NO: 233) /tradução="FGSGTKLEIK" (SEQ ID NO: 234)

MHC2562LC.2 499.5.2C4.E6.6.8.1 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MGLQVQVISFLLISVTVIMSRG 1 - 22 22 LFR1 ENVLTQSPGIMAASLGEKVTMTC 23 - 45 23 CDR-L1 SASSSVSSSYLH 46 - 57 12 LFR2 WYQQRSGASPKPLIH 58 - 72 15 CDR-L2 RTSNLAS 73 - 79 7 LFR3 GVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYC 80 - 111 32 CDR-L3 QQWSGYPFT 112 - 120 9 LFR4 FGSGTKLEIK 121 - 130 10

4D1 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2563HC.1;M13. 499.5.4D1.5.16 Análise CDR GYTFTDYA....___ISTYYGDT..___ARGNYDDWYFNV Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2563HC.1\;M13F) > MHC2563HC.1\;M13F. 499.5.4D1.5.16

LOCUS 4D1_vH 414 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 382..414

/marcação=FWR4 V_segment 352..381 /marcação=CDR3 V_region 229..351 /marcação=FWR3 V_segment 211..228 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..414 /marcação=4D1_vH 4D1_vH /tradução="MDWSCIIFFLVATATGVHSQVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMHWVKQSHAKSLE WIGSISTYYGDTNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARGNYDDWYFNVWGAGTTVTVSS" (SEQ ID NO: 235) Sequência de nucleotídeos em formato FASTA (MHC2563HC.1\;M13F) > MHC2563HC.1\;M13F. 499.5.4D1.5.16

ORIGEM 1 ATGGATTGGA GCTGTATCAT CTTCTTTCTG GTAGCAACAG CTACAGGTGT GCACTCCCAG 61 GTCCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTG GTGAGGCCTG GGGTCTCAGT GAAGATTTCC 121 TGCAAGGGTT CTGGCTACAC ATTCACTGAT TATGCTATGC ACTGGGTGAA GCAGAGTCAT 181 GCAAAGAGTC TAGAGTGGAT TGGAAGTATT AGTACTTACT ATGGTGATAC TAATTACAAC 241 CAGAAATTCA AGGGCAAGGC CACAATGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTATATG 301 GAACTTGCCA GACTGACATC TGAGGATTCT GCCATCTATT ACTGTGCAAG AGGTAATTAC 361 GACGACTGGT ACTTCAATGT CTGGGGCGCA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 236) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGGATTGGA GCTGTATCAT CTTCTTTCTG GTAGCAACAG CTACAGGTGT GCACTCC57 (SEQ ID NO: 237) /tradução="MDWSCIIFFLVATATGVHS" (SEQ ID NO: 238) Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 CAG GTCCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTG GTGAGGCCTG GGGTCTCAGT GAAGATTTCC TGCAAGGGTT CT132 (SEQ ID NO: 239) /tradução="QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGS" (SEQ ID NO: 240)

CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGCTACAC ATTCACTGAT TAT 153 (SEQ ID NO: 241) /tradução="GYTFTDY" (SEQ ID NO: 242)

Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154GCTATGC ACTGGGTGAA GCAGAGTCAT GCAAAGAGTC TAGAGTGGAT TGGAAGTATT 210 (SEQ ID NO: 243) /tradução="AMHWVKQSHAKSLEWIGSI" (SEQ ID NO: 244)

CDR-H2 (pares de bases 211-228): 211AGTACTTACT ATGGTGAT 228 (SEQ ID NO: 245) /tradução="STYYGD" (SEQ ID NO: 246)

Estrutura 3 (pares de bases 229-351): 229AC TAATTACAAC CAGAAATTCA AGGGCAAGGC CACAATGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AG- CCTATATG GAACTTGCCA GACTGACATC TGAGGATTCT GCCATCTATT ACTGTGCAAG A 351 (SEQ ID NO: 247) /tradução="TNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCAR" (SEQ ID NO: 248)

CDR-H3 (pares de bases 352-381): 352GGTAATTAC GACGACTGGT ACTTCAATGT C 381 (SEQ ID NO: 249) /tradução="GNYDDWYFNV" (SEQ ID NO: 250)

Estrutura 4 (pares de bases 382-414): 382TGGGGCGCA GGGACCACGG TCACCGTCTC CTCA 414 (SEQ ID NO: 251) /tradução="WGAGTTVTVSS" (SEQ ID NO: 252)

MHC2563HC.1 499.5.4D1.5.16 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MDWSCIIFFLVATATGVHS 1 - 19 19 HFR1 QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKGS 20 - 44 25 CDR-H1 GYTFTDY 45 - 51 7 HFR2 AMHWVKQSHAKSLEWIGSI 52 - 70 19 CDR-H2 STYYGD 71 - 76 6 HFR3 TNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCAR 77 - 117 41 CDR-H3 GNYDDWYFNV 118 - 127 10 HFR4 WGAGTTVTVSS 128 - 138 11

4D1 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2563LC.1;M13. 499.5.4D1.5.16 Análise CDR QDISGY......___STS.......___LQYASSPYT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2563LC.1\;M13F) > MHC2563LC.1\;M13F. 499.5.4D1.5.16

LOCUS 4D1_vL 381 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 352..381 /marcação=FWR4 V_segment 325..351 /marcação=CDR3 V_region 229..324 /marcação=FWR3 V_segment 208..228 /marcação=CDR2 V_region 163..207 /marcação=FWR2 V_segment 130..162 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..381 /marcação=4D1_vL 4D1_vL /tradução="MRIPAHVFGFLLLWFPGARCDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDISGYLSWLQQKPDGTIK RLIYSTSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASSPYTFGGGAKLEIKR" (SEQ ID NO: 253) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2563LC.1\;M13F) > MHC2563LC.1\;M13F. 499.5.4D1.5.16

ORIGEM 1 ATGAGGATTC CTGCTCACGT TTTTGGCTTC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG TGCCAGATGT 61 GACATCCAAA TGACCCAGTC TCCATCTTCC TTATCTGCCT CTCTGGGAGA AAGAGTCAGT 121 CTCACTTGTC GGGCAAGTCA GGATATTAGT GGTTACTTAA GCTGGCTTCA GCAGAAACCA 181 GATGGAACTA TTAAACGTCT GATTTATAGC ACATCCACTT TAGATTCTGG TGTCCCAAAA 241 AGGTTCAGTG GCAGTAGGTC TGGGTCAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGTCT 301 GAAGATTTTG CAGACTATTA CTGTCTACAA TATGCTAGTT CTCCGTACAC GTTCGGAGGG 361 GGGGCCAAGC TGGAAATAAA A (SEQ ID NO: 254) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGAGGATTC CTGCTCACGT TTTTGGCTTC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG TGCCAGATGT 60 (SEQ ID NO: 255) /tradução="MRIPAHVFGFLLLWFPGARC" (SEQ ID NO: 256) Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATCCAAA TGACCCAGTC TCCATCTTCC TTATCTGCCT CTCTGGGAGA AAGAGTCAGT

CTCACTTGT 129 (SEQ ID NO: 257) /tradução="DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC" (SEQ ID NO: 258)

CDR-L1 (pares de base 130-162): 130C GGGCAAGTCA GGATATTAGT GGTTACTTAA GC 162 (SEQ ID NO: 259) /tradução="RASQDISGYLS" (SEQ ID NO: 260)

Estrutura 2 (pares de bases 163-207): 163TGGCTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTA TTAAACGTCT GATTTAT 207 (SEQ ID NO: 261)

/tradução="WLQQKPDGTIKRLIY" (SEQ ID NO: 262)

CDR-L2 (pares de bases 208-228): 208AGC ACATCCACTT TAGATTCT228 (SEQ ID NO: 263) /tradução="STSTLDS" (SEQ ID NO: 264)

Estrutura 3 (pares de bases 229-324): 229 GG TGTCCCAAAA AGGTTCAGTG GCAGTAGGTC TGGGTCAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGTCT GAAGATTTTG CAGACTATTA CTGT 324 (SEQ ID NO: 265) /tradução="GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYC" (SEQ ID NO: 266)

CDR-L3 (pares de bases 325-351): 325CTACAA TATGCTAGTT CTCCGTACAC G 351 (SEQ ID NO: 267) /tradução="LQYASSPYT" (SEQ ID NO: 268)

Estrutura 4 (pares de bases 352-381): 352TTCGGAGGG GGGGCCAAGC TGGAAATAAA A 381 (SEQ ID NO: 269) /tradução="FGGGAKLEIK" (SEQ ID NO: 270)

MHC2563LC.1 499.5.4D1.5.16 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MRIPAHVFGFLLLWFPGARC 1 - 20 20 LFR1 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC 21 - 43 23 CDR-L1 RASQDISGYLS 44 - 54 11 LFR2 WLQQKPDGTIKRLIY 55 - 69 15 CDR-L2 STSTLDS 70 - 76 7 LFR3 GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYC 77 - 108 32 CDR-L3 LQYASSPYT 109 - 117 9 LFR4 FGGGAKLEIK 118 - 127 10

1C8 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2564HC.1;M13. 499.5.1C8.9.12.2 Análise CDR GFNIKDTY....___IDPANGKT..___AWLLPYYFDY

Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2564HC.1\;M13F) > MHC2564HC.1\;M13F. 499.5.1C8.9.12.2 LOCUS 1C8_vH 408 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 376..408 /marcação=FWR4 V_segment 352..375 /marcação=CDR3 V_region 229..351 /marcação=FWR3 V_segment 211..228 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..408 /marcação=1C8_vH 1C8_vH /tradução="MKCSWIIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVQPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLE WIGRIDPANGKTIFDPKFQVKATITADTSSNTVYLHLSSLTSEDTAIYYCAWLLPYYFDYWGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 271) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2564HC.1\;M13F) > MHC2564HC.1\;M13F. 499.5.1C8.9.12.2

ORIGEM 1 ATGAAATGCA GCTGGATTAT CTTCTTCCTG ATGGCTGTGG TTACAGGGGT CAATTCAGAG 61 GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAACTT GTGCAGCCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC 121 TGTACAGCTT CTGGCTTCAA TATTAAAGAC ACCTATATGC ACTGGGTAAA ACAGAGGCCT 181 GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGAAGGATT GATCCTGCGA ATGGTAAAAC TATTTTTGAC 241 CCGAAGTTCC AGGTCAAGGC CACTATAACT GCCGACACAT CCTCCAACAC AGTCTACCTG 301 CATCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ACTGTGCTTG GTTACTTCCT 361 TACTACTTTG ACTACTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCA (SEQ ID NO: 272) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGAAATGCA GCTGGATTAT CTTCTTCCTG ATGGCTGTGG TTACAGGGGT CAATTCA57 (SEQ ID NO: 273) /tradução="MKCSWIIFFLMAVVTGVNS" (SEQ ID NO: 274)

Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 GAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAACTT GTGCAGCCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGTACAGCTT CT132 (SEQ ID NO: 275) /tradução="EVQLQQSGAELVQPGASVKLSCTAS" (SEQ ID NO: 276)

CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGCTTCAA TATTAAAGAC ACC 153 (SEQ ID NO: 277) /tradução="GFNIKDT" (SEQ ID NO: 278)

Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154TATATGC ACTGGGTAAA ACAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGAAGGATT 210 (SEQ ID NO: 279) /tradução="YMHWVKQRPEQGLEWIGRI" (SEQ ID NO: 280)

CDR-H2 (pares de bases 211-228): 211GATCCTGCGA ATGGTAAA 228 (SEQ ID NO: 281) /tradução="DPANGK" (SEQ ID NO: 282)

Estrutura 3 (pares de bases 229-351): 229AC TATTTTTGAC CCGAAGTTCC AGGTCAAGGC CACTATAACT GCCGACACAT CCTCCAACAC AG- TCTACCTG CATCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ACTGTGCTTG G351 (SEQ ID NO: 283) /tradução="TIFDPKFQVKATITADTSSNTVYLHLSSLTSEDTAIYYCAW" (SEQ ID NO: 284)

CDR-H3 (pares de bases 352-375): 352TTACTTCCT TACTACTTTG ACTAC 375 (SEQ ID NO: 285) /tradução="LLPYYFDY" (SEQ ID NO: 286)

Estrutura 4 (pares de bases 376-408): 376TGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCA 408 (SEQ ID NO: 287) /tradução="WGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 288)

MHC2564HC.1 499.5.1C8.9.12.2 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MKCSWIIFFLMAVVTGVNS 1 - 19 19 HFR1 EVQLQQSGAELVQPGASVKLSCTAS 20 - 44 25 CDR-H1 GFNIKDT 45 - 51 7 HFR2 YMHWVKQRPEQGLEWIGRI 52 - 70 19 CDR-H2 DPANGK 71 - 76 6 HFR3 TIFDPKFQVKATITADTSSNTVYLHLSSLTSEDTAIYYCAW 77 - 117 41 CDR-H3 LLPYYFDY 118 - 125 8 HFR4 WGQGTTLTVSS 126 - 136 11

1C8 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos*

MHC2564LCB.4;M13. 499.5.1C8.9.12.2 Análise CDR SSISSSN.....___GTS.......___QKWSHYPLT Sequência de aminoácidos no formato FASTA (MHC2564LCB.4\;M13F) > MHC2564LCB.4 \; M13F. 499.5.1C8.9.12.2 LOCUS 1C8_vL 390 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 361..390 /marcação=FWR4 V_segment 334..360 /marcação=CDR3 V_region 238..333 /marcação=FWR3 V_segment 217..237 /marcação=CDR2 V_region 172..216 /marcação=FWR2 V_segment 136..171 /marcação=CDR1 V_region 67..135 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..66 /marcação=LS CDS 1..390 /marcação=1C8_vL 1C8_vL /tradução="MDFHVQIFSFMLISVTVMLSSGEIVLTQSPAVMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSGT SPKLWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQKWSHYPLTFGAGTKLELK" (SEQ ID NO: 289) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2564LCB.4\;M13F) > MHC2564LCB.4 \; M13F. 499.5.1C8.9.12.2

ORIGEM 1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT CATGTTGTCC 61 AGTGGGGAAA TTGTACTCAC CCAGTCTCCA GCAGTCATGG CTGCATCTCC AGGGGAGAAG 121 GTCACCATCA CCTGCAGCGT CAGTTCAAGT ATAAGTTCCA GCAACTTGCA CTGGTACCAG 181 CAGAAGTCAG GAACCTCGCC CAAACTCTGG ATTTATGGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA 241 GTCCCTGTTC GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTCTCAC AATCAGCAGC 301 ATGGAGGCTG AAGATGCTGC CACTTATTAC TGTCAAAAGT GGAGTCATTA CCCGCTCACG 361 TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 290) Peptídeo de sinal (pares de bases 1-66): 1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT CATGTTGTCC

AGTGGG 66 (SEQ ID NO: 291) /tradução="MDFHVQIFSFMLISVTVMLSSG" (SEQ ID NO: 292)

Estrutura 1 (pares de bases 67-135): 67 GAAA TTGTACTCAC CCAGTCTCCA GCAGTCATGG CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATCA CCTGC 135 (SEQ ID NO: 293) /tradução="EIVLTQSPAVMAASPGEKVTITC" (SEQ ID NO: 294)

CDR-L1 (pares de bases 136-171): 136AGCGT CAGTTCAAGT ATAAGTTCCA GCAACTTGCA C 171 (SEQ ID NO: 295) /tradução="SVSSSISSSNLH" (SEQ ID NO: 296)

Estrutura 2 (pares de bases 172-216): 172TGGTACCAG CAGAAGTCAG GAACCTCGCC CAAACTCTGG ATTTAT 216 (SEQ ID NO: 297)

/tradução="WYQQKSGTSPKLWIY" (SEQ ID NO: 298)

CDR-L2 (pares de bases 217-237): 217GGCA CATCCAACCT GGCTTCT 237 (SEQ ID NO: 299) /tradução="GTSNLAS" (SEQ ID NO: 300)

Estrutura 3 (pares de bases 238-333): 238 GGA GTCCCTGTTC GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTCTCAC AATCAGCAGC ATGGAGGCTG AAGATGCTGC CACTTATTAC TGT 333 (SEQ ID NO: 301) /tradução="GVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC" (SEQ ID NO: 302)

CDR-L3 (pares de bases 334-360): 334CAAAAGT GGAGTCATTA CCCGCTCACG 360 (SEQ ID NO: 303) /tradução="QKWSHYPLT" (SEQ ID NO: 304)

Estrutura 4 (pares de bases 361-390): 361TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAA 390 (SEQ ID NO: 305) /tradução="FGAGTKLELK" (SEQ ID NO: 306)

MHC2564LCB.4 499.5.1C8.9.12.2 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MDFHVQIFSFMLISVTVMLSSG 1 - 22 22 LFR1 EIVLTQSPAVMAASPGEKVTITC 23 - 45 23 CDR-L1 SVSSSISSSNLH 46 - 57 12 LFR2 WYQQKSGTSPKLWIY 58 - 72 15 CDR-L2 GTSNLAS 73 - 79 7 LFR3 GVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC 80 - 111 32 CDR-L3 QKWSHYPLT 112 - 120 9 LFR4 FGAGTKLELK 121 - 130 10

4E5 DNA Variável da Cadeia Pesada (vH) e Sequências de Aminoácidos* MHC2556HCN.1;M13. 499.5.4E5.20.22 Análise de CDR GYTFTTYT....___INPSSGYT..___ARHPWDSNY Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2556HCN.1\;M13F) >MHC2556HCN.1\;M13F LOCUS 4E5_vH 405 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 373..405 /marcação=FWR4 V_segment 352..372 /marcação=CDR3 V_region 229..351 /marcação=FWR3 V_segment 211..228 /marcação=CDR2 V_region 154..210 /marcação=FWR2 V_segment 133..153 /marcação=CDR1 V_region 58..132 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..57 /marcação=LS CDS 1..405 /marcação=4E5_vH 4E5_vH /tradução="MERHWIFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTMHWVKQRPGQGLE WIGHINPSSGYTEYNQKFKDKTTLTADKSSSTAHMQLSSLTSEDSAVYYCARHPWDSNYWGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 307) Sequência de nucleotídeos em formato FASTA (MHC2556HCN.1\;M13F) >MHC2556HCN.1\;M13F

ORIGEM 1 ATGGAAAGGC ACTGGATCTT TCTCTTCCTG TTGTCAGTAA CTGCAGGTGT CCACTCCCAG 61 GTCCAGCTGC AGCAGTCTGC AGCTGAACTG GCAAGACCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC 121 TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTTACTACC TACACGATGC ACTGGGTAAA ACAGAGGCCT 181 GGACAGGGTC TGGAGTGGAT TGGACACATT AATCCTAGCA GTGGATATAC TGAGTACAAT 241 CAGAAATTCA AGGACAAGAC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCCACATG 301 CAACTGAGCA GCCTAACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG ACACCCCTGG 361 GACTCGAACT ACTGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA (SEQ ID NO: 308)

Peptídeo de sinal (pares de bases 1-57): 1 ATGGAAAGGC ACTGGATCTT TCTCTTCCTG TTGTCAGTAA CTGCAGGTGT CCACTCC57 (SEQ ID NO: 309) /tradução="MERHWIFLFLLSVTAGVHS" (SEQ ID NO: 310)

Estrutura 1 (pares de bases 58-132): 58 CAG GTCCAGCTGC AGCAGTCTGC AGCTGAACTG GCAAGACCTG GGGCCTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CT132 (SEQ ID NO: 311) /tradução="QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKAS" (SEQ ID NO: 312)

CDR-H1 (pares de bases 133-153): 133GGCTACAC CTTTACTACC TAC 153 (SEQ ID NO: 313) /tradução="GYTFTTY" (SEQ ID NO: 314)

Estrutura 2 (pares de bases 154-210): 154ACGATGC ACTGGGTAAA ACAGAGGCCT GGACAGGGTC TGGAGTGGAT TGGACACATT 210 (SEQ ID NO: 315) /tradução="TMHWVKQRPGQGLEWIGHI" (SEQ ID NO: 316)

CDR-H2 (pares de bases 211-228): 211AATCCTAGCA GTGGATAT 228 (SEQ ID NO: 317) /tradução="NPSSGY" (SEQ ID NO: 318)

Estrutura 3 (pares de bases 229-351): 229AC TGAGTACAAT CAGAAATTCA AGGACAAGAC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAGCAC AG- CCCACATG CAACTGAGCA GCCTAACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG A 351 (SEQ ID NO: 319) /tradução="TEYNQKFKDKTTLTADKSSSTAHMQLSSLTSEDSAVYYCAR" (SEQ ID NO: 320)

CDR-H3 (pares de bases 352-372): 352CACCCCTGG GACTCGAACT AC 372 (SEQ ID NO: 321) /tradução="HPWDSNY" (SEQ ID NO: 322)

Estrutura 4 (pares de bases 373-405): 373TGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA 405 (SEQ ID NO: 323) /tradução="WGQGTTLTVSS" (SEQ ID NO: 324)

MHC2556HCN.1 499.5.4E5.20.22 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MERHWIFLFLLSVTAGVHS 1 - 19 19 HFR1 QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKAS 20 - 44 25 CDR-H1 GYTFTTY 45 - 51 7 HFR2 TMHWVKQRPGQGLEWIGHI 52 - 70 19 CDR-H2 NPSSGY 71 - 76 6

HFR3 TEYNQKFKDKTTLTADKSSSTAHMQLSSLTSEDSAVYYCAR 77 - 117 41 CDR-H3 HPWDSNY 118 - 124 7 HFR4 WGQGTTLTVSS 125 - 135 11 4E5 DNA Variável da Cadeia Leve (vL) e Sequências de Aminoácidos* MHC2556LCN.2;M13. 499.5.4E5.20.22 Análise CDR ENIDSY......___AAT.......___QHYYITPFT Sequência de aminoácidos em formato FASTA (MHC2556LCN.2\;M13F) > MHC2556LCN.2\;M13F LOCUS 4E5_vL 381 bp DNA linear CARACTERÍSTICAS Localização/Qualificadores J_segment 352..381 /marcação=FWR4 V_segment 325..351 /marcação=CDR3 V_region 229..324 /marcação=FWR3 V_segment 208..229 /marcação=CDR2 V_region 163..207 /marcação=FWR2 V_segment 130..162 /marcação=CDR1 V_region 61..129 /marcação=FWR1 sig_peptide 1..60 /marcação=LS CDS 1..381 /marcação=4E5_vL 4E5_vL /tradução="MSVPTQLLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGRSPQ LLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYCQHYYITPFTFGSGTKLEIK" (SEQ ID NO: 325) Sequência de nucleotídeos no formato FASTA (MHC2556LCN.2\;M13F) > MHC2556LCN.2\;M13F

ORIGEM 1 ATGAGTGTGC CCACTCAGCT CCTGGGGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGA TGCCAGATGT 61 GACATCCAGA TGACTCAGTC TCCAGCTTCC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA AACTGTCACC 121 ATCACATGTC GAGCAAGTGA GAATATTGAC AGTTATTTAG CATGGTATCA GCAGAAACAG 181 GGAAGATCTC CTCAGCTCCT GGTCTATGCT GCAACAAACT TAGCAGATGG TGTGCCATCA

241 AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGCACACAG TATTCTCTCA AGATCAACAG CCTGCAGTCT 301 GAAGATGTTG CGAGATATTA CTGTCAACAT TATTATATTA CTCCATTCAC GTTCGGCTCG 361 GGGACAAAGT TGGAAATAAA A (SEQ ID NO: 326)

Peptídeo de sinal (pares de bases 1-60): 1 ATGAGTGTGC CCACTCAGCT CCTGGGGTTG CTGCTGCTGT GGCTTACAGA TGCCAGATGT 60 (SEQ ID NO: 327) /tradução="MSVPTQLLGLLLLWLTDARC" (SEQ ID NO: 328)

Estrutura 1 (pares de bases 61-129): 61 GACATCCAGA TGACTCAGTC TCCAGCTTCC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA AACTGTCACC ATCACA- TGT129 (SEQ ID NO: 329) /tradução="DIQMTQSPASLSASVGETVTITC" (SEQ ID NO: 330)

CDR-L1 (pares de base 130-162): 130C GAGCAAGTGA GAATATTGAC AGTTATTTAG CA162 (SEQ ID NO: 331) /tradução="RASENIDSYLA" (SEQ ID NO: 332)

Estrutura 2 (pares de bases 163-207): 163TGGTATCA GCAGAAACAG GGAAGATCTC CTCAGCTCCT GGTCTAT207 (SEQ ID NO: 333) /tradução="WYQQKQGRSPQLLVY" (SEQ ID NO: 334)

CDR-L2 (pares de bases 208-228): 208GCT GCAACAAACT TAGCAGAT228 (SEQ ID NO: 335) /tradução="AATNLAD" (SEQ ID NO: 336)

Estrutura 3 (pares de bases 229-324): 229 GG TGTGCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGCACACAG TATTCTCTCA AGATCAACAG CCTGCAGTCT GAAGATGTTG CGAGATATTA CTGT324 (SEQ ID NO: 337) /tradução="GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYC" (SEQ ID NO: 338)

CDR-L3 (pares de bases 325-351): 325CAACAT TATTATATTA CTCCATTCAC G351 (SEQ ID NO: 339) /tradução="QHYYITPFT" (SEQ ID NO: 340)

Estrutura 4 (pares de bases 352-381): 352TTCGGCTCG GGGACAAAGT TGGAAATAAA A381 (SEQ ID NO: 341) /tradução="FGSGTKLEIK" (SEQ ID NO: 342)

MHC2556LCN.2 499.5.4E5.20.22 Região Fragmento de Sequência Resíduos Comprimento Líder MSVPTQLLGLLLLWLTDARC 1 - 20 20 LFR1 DIQMTQSPASLSASVGETVTITC 21 - 43 23 CDR-L1 RASENIDSYLA 44 - 54 11

LFR2 WYQQKQGRSPQLLVY 55 - 69 15 CDR-L2 AATNLAD 70 - 76 7 LFR3 GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYC 77 - 108 32 CDR-L3 QHYYITPFT 109 - 117 9 LFR4 FGSGTKLEIK 118 - 127 10 * Definições de CDR e numeração de sequência de proteínas de acordo com Ka- bat. As sequências de aminoácidos CDR estão sublinhadas na ordem de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente.

Tabela 3: Sumário das características de ligação do mAb anti-HHLA2 e bloqueio do ligante mAb 8A12 6D10 6F10 8D2 2G2 2C4 4D1 1C8 4E5 HHLA2 (IgG2a) (IgG1) (IgG1) (IgG2a) (IgG1) (IgG1) (IgG1) (IgG2a) (IgG1) (Isótipo) 1 3 3 3 Ligação a 22,49 0,25 a 0,21 0,24 0,44 0,63 a EC50 (ug/ml) 2 Função IHC, Não Blo- IHC, Blo- Aumen- Blo- Não Blo- WB Blo- quea- WB quea- tos de quea- Blo- quea- quea- dor dor Ligação dor quea- dor dor Fraco dor 1 : Ligação à linhagem de células leucêmicas de células pré-B de ca- mundongo 300.19 transfectadas com HHLA2 por citometria de fluxo 2 : Bloqueio de ligação de HHLA2-mIgG2a à linhagem de células leu- cêmicas de células pré-B de camundongo 300.19 transfectadas com TMIGD2 por citometria de fluxo 3: não determinado: 8A12 - não mensurável devido à baixa ligação; 4E5 - sobrenadantes de cultura III. Ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras recombinantes

[00235] Um outro objetivo da invenção refere-se a sequências de ácidos nucleicos que codificam anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos, imunoglobulinas e polipeptídeos da presente invenção.

[00236] Por exemplo, em uma modalidade particular, a presente invenção se refere, em parte, a uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio vH do mAb 8A12 ou o domínio vL do mAb 8A12.Em outra modalidade particular, a presente invenção se refere, em parte, a uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio vH ou o do- mínio vL de pelo menos um mAb anti-HHLA2 eficaz isolado dos anti- corpos policlonais 1.2 e/ou 2.2.

[00237] Normalmente, o referido ácido nucleico é uma molécula de DNA ou RNA, que pode ser incluída em qualquer vetor adequado, co- mo um plasmídeo, cosmídeo, epissoma, cromossomo artificial, fago ou um vetor viral.

[00238] Os termos "vetor", "vetor de clonagem" e "vetor de expres- são" significam o veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo , um gene estranho) pode ser introduzida em uma célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover a ex- pressão (por exemplo transcrição e tradução) da sequência introduzi- da. Assim, um outro objeto da invenção se refere a um vetor que com- preende um ácido nucleico da presente invenção.

[00239] Tais vetores podem compreender elementos regulatórios, tais como um promotor, intensificador, terminador e semelhantes, para causar ou dirigir a expressão do referido polipeptídeo após administra- ção a um indivíduo. Exemplos de promotores e intensificadores utiliza- dos no vetor de expressão para células animais incluem promotor ini- cial e intensificador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), promotor de LTR e intensificador do vírus da leucemia de camundongo Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason JO et al. 1985) e intensifica- dor (Gillies SD et al. 1983) de cadeia H de imunoglobulina e semelhan- tes.

[00240] Qualquer vetor de expressão para célula animal pode ser usado. Exemplos de vetores adequados incluem pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4- (Miyaji H et al. 1990) e semelhantes. Outros exemplos representativos de plasmídeos incluem plasmídeos de replicação compreendendo uma origem de re- plicação, ou plasmídeos integrativos, tais como, por exemplo, pUC, pcDNA, pBR e semelhantes. Exemplos representativos de vetor viral incluem vetores adenovirais, retrovirais, herpes vírus e AAV. Esses vírus recombinantes podem ser produzidos por técnicas conhecidas na técnica, tais como por transfecção de células de empacotamento ou por transfecção transitória com plasmídeos auxiliares ou vírus. Exem- plos típicos de células de empacotamento de vírus incluem células PA317, células PsiCRIP, células GPenv-positivas, células 293, etc. Protocolos detalhados para a produção de tais vírus recombinantes defeituosos na replicação podem ser encontrados, por exemplo, nos documentos WO 95/14785, WO 96/22378, Pat. U.S. 5.882,877, Pat. U.S. 6.013.516, Pat. U.S. 4.861.719, Pat. U.S. 5.278.056 e WO 94/19478.

[00241] Um outro objeto da presente invenção refere-se a uma cé- lula que foi transfectada, infectada ou transformada por um ácido nu- cleico e/ou um vetor de acordo com a invenção. O termo "transforma- ção" significa a introdução de um gene, sequência de DNA ou RNA "estranho" (ou seja , extrínseco ou extracelular) a uma célula hospe- deira, de modo que a célula hospedeira expresse o gene introduzido ou sequência para produzir uma substância desejada, tipicamente um proteína ou enzima codificada pelo gene ou sequência introduzida. Uma célula hospedeira que recebe e expressa DNA ou RNA introduzi- do foi "transformada".

[00242] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser utili- zados para produzir um polipeptídeo recombinante da invenção em um sistema de expressão adequado. O termo "sistema de expressão" sig- nifica uma célula hospedeira e vetor compatível sob condições ade- quadas, por exemplo , para a expressão de uma proteína codificada por DNA estranho transportado pelo vetor e introduzido na célula hos-

pedeira.

[00243] Os sistemas de expressão comuns incluem células hospe- deiras de E. coli e vetores plasmídicos, células hospedeiras de inseto e vetores de baculovírus, e células hospedeiras e vetores de mamífe- ros. Outros exemplos de células hospedeiras incluem, sem limitação, células procarióticas (como bactérias) e células eucarióticas (como cé- lulas de levedura, células de mamíferos, células de insetos, células de plantas, etc.). Exemplos específicos incluem E. coli, Kluyveromyces ou leveduras Saccharomyces , linhagens de células de mamíferos (por exemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.), bem como culturas de células de mamíferos primárias ou estabeleci- das (por exemplo, produzidas a partir de linfoblastos, fibroblastos, cé- lulas embrionárias, células epiteliais, células nervosas, adipócitos, etc.). Os exemplos também incluem célula SP2/0-Ag14 de camundon- go (ATCC CRL1581), célula P3X63-Ag8.653 de camundongo (ATCC CRL1580), célula CHO em que um gene de di-hidrofolato redutase (doravante referido como "gene DHFR") é defeituoso (Urlaub G et al; 1980), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rato (ATCC CRL 1662, do- ravante referida como "célula YB2/0") e semelhantes. A célula YB2/0 é preferida, uma vez que a atividade ADCC de anticorpos quiméricos ou humanizados é aumentada quando expressa nesta célula.

[00244] A presente invenção também se refere a um método de produção de uma célula hospedeira recombinante que expressa um anticorpo ou um polipeptídeo da invenção de acordo com a invenção, o referido método compreendendo as etapas que consistem em (i) in- troduzir in vitro ou ex vivo um ácido nucleico recombinante ou um vetor como descrito acima em uma célula hospedeira competente, (ii) culti- var in vitro ou ex vivo da célula hospedeira recombinante obtida e (iii), opcionalmente, selecionar as células que expressam e/ou secretam o referido anticorpo ou polipeptídeo. Essas células hospedeiras recom-

binantes podem ser usadas para a produção de anticorpos e polipeptí- deos da invenção.

[00245] Em outro aspecto, a presente invenção fornece ácidos nu- cleicos isolados que hibridam sob condições de hibridação seletiva pa- ra um polinucleotídeo aqui divulgado. Assim, os polinucleotídeos desta modalidade podem ser usados para isolar, detectar e/ou quantificar ácidos nucleicos compreendendo tais polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser utilizados para identificar, isolar ou amplificar clones parciais ou completos em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são sequências genômicas ou de cDNA isoladas, ou de outra forma complementares a, um cDNA de uma biblioteca de ácido nucleico de humano ou mamífero. De preferência, a biblioteca de cDNA compre- ende pelo menos 80% de sequências de comprimento total, de prefe- rência, pelo menos 85% ou 90% de sequências de comprimento total e, mais preferencialmente, pelo menos 95% de sequências de com- primento total. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas para aumentar a representação de sequências raras. Condições de hibrida- ção de rigor baixo ou moderado são tipicamente, mas não exclusiva- mente, usadas com sequências com uma identidade de sequência re- duzida em relação às sequências complementares. Condições de rigor moderado e alto podem ser opcionalmente usadas para sequências de maior identidade. As condições de baixo rigor permitem a hibridação seletiva de sequências com cerca de 70% de identidade de sequência e podem ser usadas para identificar sequências ortólogas ou parálo- gas. Opcionalmente, os polinucleotídeos desta invenção irão codificar pelo menos uma porção de um anticorpo codificado pelos polinucleotí- deos aqui descritos. Os polinucleotídeos desta invenção abrangem sequências de ácidos nucleicos que podem ser usadas para hibrida- ção seletiva com um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da pre-

sente invenção. Ver, por exemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, ca- da um inteiramente incorporado aqui por referência. IV. Métodos de Produção de Anticorpos

[00246] Os anticorpos e fragmentos dos mesmos, imunoglobulinas e polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos por qual- quer técnica conhecida na técnica, tal como, sem limitação, qualquer técnica química, biológica, genética ou enzimática, sozinha ou em combinação.

[00247] Conhecendo a sequência de aminoácidos da sequência desejada, um versado na técnica pode produzir prontamente os referi- dos anticorpos ou polipeptídeos, por técnicas padrão para produção de polipeptídeos. Por exemplo, eles podem ser sintetizados usando um método de fase sólida bem conhecido, de preferência usando um apa- relho de síntese de peptídeos comercialmente disponível (tal como aquele feito por Applied Biosystems, Foster City, Calif.) e seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, os anticorpos e outros poli- peptídeos da presente invenção podem ser sintetizados por técnicas de DNA recombinante como é bem conhecido na técnica. Por exem- plo, estes fragmentos podem ser obtidos como produtos de expressão de DNA após incorporação de sequências de DNA que codificam o (poli)peptídeo desejado em vetores de expressão e introdução de tais vetores em hospedeiros eucarióticos ou procarióticos adequados que irão expressar o polipeptídeo desejado, a partir do qual eles podem ser mais tarde isolado usando técnicas bem conhecidas.

[00248] Em particular, a presente invenção refere-se ainda a um método de produção de um anticorpo ou polipeptídeo da invenção, cu- jo método compreende as etapas que consistem em: (i) cultivar uma célula hospedeira transformada de acordo com a invenção sob condi- ções adequadas para permitir a expressão do referido anticorpo ou polipeptídeo; e (ii) recuperar o anticorpo ou polipeptídeo expresso.

[00249] Os anticorpos e outros polipeptídeos da presente invenção são adequadamente separados do meio de cultura por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exem- plo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletrofore- se em gel, diálise, cromatografia de afinidade, sulfato de amônio ou precipitação com etanol, extração de ácido, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") tam- bém pode ser empregada para purificação. Ver, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Sci- ence, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um inteiramente aqui incorporado por referência.

[00250] Os anticorpos quiméricos (por exemplo, quimeras camun- dongo-humano ou quimeras humano-não roedor) da presente inven- ção podem ser produzidos através da obtenção de sequências nuclei- cas que codificam os domínios VL e VH conforme descrito anterior- mente, construindo um vetor de expressão de anticorpo quimérico hu- mano inserindo-os em uma expressão vetor para célula animal tendo genes que codificam o anticorpo humano CH e o anticorpo humano CL, e expressando a sequência de codificação através da introdução do vetor de expressão em uma célula animal. O domínio CH de um anticorpo quimérico humano pode ser qualquer região que pertença à imunoglobulina humana, como a classe IgG ou uma subclasse da mesma, como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Da mesma forma, o CL de um anticorpo quimérico humano pode ser qualquer região que pertence a Ig, como os anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados classe kapa ou classe lambda, compreendendo porções humanas e não hu- manas, que podem ser produzidos usando técnicas padrão de DNA recombinante, estão dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, usando métodos descritos em Robinson et al.International Patent Pu- blication PCT/US86/02269; Akira et al. Pedido de Patente Europeia

184.187; Taniguchi, M. European Patent Application 171,496; Morrison et al. Pedido de Patente Europeia 173.494; Neuberger et al. Pedido PCT WO 86/01533; Cabilly et al. Patente U.S. 4.816.567; Cabilly et al. Pedido de Patente Europeia 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439- 3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al.(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Ve- rhoeyan et al.(1988) Science 239:1534; and Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

[00251] Além disso, os anticorpos humanizados podem ser produ- zidos de acordo com protocolos padrão, tais como aqueles divulgados na Patente U.S. 5.565.332. Em outra modalidade, as cadeias de anti- corpos ou membros do par de ligação específica podem ser produzi- dos por recombinação entre vetores compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam uma fusão de uma cadeia polipeptídica de um membro do par de ligação específica e um componente de um pacote de exibição genérico replicável e vetores contendo moléculas de ácido nucleico codificando uma segunda cadeia polipeptídica de um único membro do par de ligação usando técnicas conhecidas na técni- ca, por exemplo, conforme descrito nas Patentes U.S. 5.565.332,

5.871.907 ou 5.733.743. Os anticorpos humanizados da presente in- venção podem ser produzidos através da obtenção de sequências de ácido nucleico que codificam domínios CDR, conforme descrito anteri- ormente, construindo um vetor de expressão de anticorpo humanizado inserindo-os em um vetor de expressão para células animais com ge- nes que codificam (i) uma região constante da cadeia pesada idêntica àquela de um anticorpo humano e (ii) uma região constante da cadeia leve idêntica à de um anticorpo humano, e expressando os genes através da introdução do vetor de expressão em uma célula animal. O vetor de expressão de anticorpo humanizado pode ser de um tipo em que um gene que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e um gene que codifica uma cadeia leve de anticorpo existe em vetores se- parados ou de um tipo em que ambos os genes existem no mesmo vetor (tipo tandem).

[00252] Métodos para a produção de anticorpos humanizados ba- seados em DNA recombinante convencional e técnicas de transfecção de genes são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Riech- mann L. et al. 1988; Neuberger M S. et al. 1985). Os anticorpos po- dem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400; publi- cação PCT WO91/09967; Pat. U.S. 5.225.539; 5.530.101; e

5.585.089), estratificação ou recapeamento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska M A. et al. (1994)) e embaralhamento de cadeias (Pat. U.S. 5.565.332). A tecno- logia geral de DNA recombinante para a preparação de tais anticorpos também é conhecida (ver Pedido de Patente Europeia EP 125023 e Pedido de Patente Internacional WO 96/02576).

[00253] Da mesma forma, os anticorpos biespecíficos ou multiespe- cíficos aqui descritos podem ser feitos de acordo com procedimentos padrão. Por exemplo, triomas e hibridomas híbridos são dois exemplos de linhagens celulares que podem secretar anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos. Exemplos de anticorpos biespecíficos e multiespecífi-

cos produzidos por um hibridoma híbrido ou um trioma são divulgados na Patente U.S. 4.474.893. Esses anticorpos também podem ser cons- truídos por meios químicos (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, and Perez et al. (1985) Nature 316:354) and hybridoma technology (Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, and Staerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241). Alternativamente, esses anti- corpos também podem ser gerados produzindo hetero-hibridomas fun- dindo hibridomas ou outras células produzindo anticorpos diferentes, seguidos pela identificação de clones que produzem e co-montam os anticorpos desejados. Eles também podem ser gerados por conjuga- ção química ou genética de cadeias de imunoglobulina completas ou porções das mesmas, como sequências Fab e Fv. O componente de anticorpo pode se ligar a um polipeptídeo ou a um fragmento do mes- mo de um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo um ou mais biomarcadores imunoinibitórios aqui descritos.

[00254] Além disso, os métodos para a produção de fragmentos de anticorpos são bem conhecidos. Por exemplo, os fragmentos Fab da presente invenção podem ser obtidos tratando um anticorpo que reage especificamente com HHLA2 humano (tal como mAb 8A12 e anticor- pos policlonais 1.2 e 2.2) com uma protease, tal como papaína. Além disso, Fabs podem ser produzidos inserindo DNA que codifica Fabs do anticorpo em um vetor para o sistema de expressão procariótica ou para o sistema de expressão eucariótica e introduzindo o vetor em um procariota ou eucariota (conforme apropriado) para expressar os Fabs.

[00255] Da mesma forma, os fragmentos F(ab')2 da presente inven- ção podem ser obtidos tratando um anticorpo que reage especifica- mente com HHLA2 com uma protease, pepsina. Além disso, um frag- mento F(ab')2 também pode ser produzido ao ligar Fab' descrito abai- xo por meio de uma ligação de tioéter ou uma ligação de dissulfeto.

[00256] Os fragmentos Fab' da presente invenção podem ser obti-

dos tratando F(ab')2 que reage especificamente com HHLA2 humana com um agente redutor, ditiotreitol. Além disso, os fragmentos Fab' podem ser produzidos pela inserção de DNA que codifica um fragmen- to Fab' do anticorpo em um vetor de expressão para procarioto, ou um vetor de expressão para eucarioto, e introdução do vetor em um proca- rioto ou eucarioto (conforme apropriado) para realizar sua expressão.

[00257] Além disso, os scFvs da presente invenção podem ser pro- duzidos pela obtenção de cDNA que codifica os domínios VH e VL conforme descrito anteriormente, construção de DNA que codifica scFv, inserção do DNA em um vetor de expressão para procarioto ou um vetor de expressão para eucarioto e, em seguida, introdução do vetor de expressão em um procarioto ou eucarioto (conforme apropri- ado) para expressar o scFv. Para gerar um fragmento scFv humaniza- do, uma tecnologia bem conhecida chamada enxerto de CDR pode ser usada, que envolve selecionar as regiões determinantes complemen- tares (CDRs) de um fragmento scFv doador e enxertá-los em uma es- trutura de fragmento de scFv humano de estrutura tridimensional co- nhecida ( ver, por exemplo, WO98/45322; WO 87/02671; Pat. U.S.

5.859.205; Pat. U.S. 5.585.089; Pat. U.S. 4.816.567; EP0173494). V. Modificação de anticorpos, imunoglobulinas e polipeptídeos

[00258] A(s) modificação(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos aqui descritos é(são) contemplada(s). Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Sabe-se que quando um anticorpo humaniza- do é produzido simplesmente enxertando apenas CDRs em VH e VL de um anticorpo derivado de um animal não humano em FRs de VH e VL de um anticorpo humano, a atividade de ligação ao antígeno é re- duzida em comparação com a do anticorpo original derivado de um animal não humano. Considera-se que vários resíduos de aminoácidos de VH e VL do anticorpo não humano, não apenas em CDRs, mas também em FRs, estão direta ou indiretamente associados à atividade de ligação ao antígeno. Portanto, a substituição desses resíduos de aminoácidos por diferentes resíduos de aminoácidos derivados de FRs de VH e VL do anticorpo humano reduziria a atividade de ligação e pode ser corrigida substituindo os aminoácidos pelos resíduos de ami- noácidos do anticorpo original derivado de um animal não humano.

[00259] Modificações e mudanças podem ser feitas na estrutura dos anticorpos da presente invenção, e nas sequências de DNA que os codificam, e ainda obter uma molécula funcional que codifica um anticorpo e polipeptídeo com características desejáveis. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável de atividade. Uma vez que a capacidade interativa e a natureza de uma proteína definem a atividade funcional biológica da proteína, certas substituições de ami- noácidos podem ser feitas em uma sequência de proteína e, claro, em sua sequência de codificação de DNA, embora, no entanto, obtenha uma proteína com propriedades semelhantes. É assim contemplado que várias alterações podem ser feitas nas sequências de anticorpos da invenção, ou sequências de DNA correspondentes que codificam os referidos polipeptídeos, sem perda apreciável da sua atividade bio- lógica.

[00260] Em uma modalidade, as alterações de aminoácidos podem ser alcançadas alterando códons na sequência de DNA para codificar substituições conservativas com base na conservação do código gené- tico. Especificamente, existe uma correspondência conhecida e defini- da entre a sequência de aminoácidos de uma proteína em particular e as sequências de nucleotídeos que podem codificar para a proteína, conforme definido pelo código genético (mostrado abaixo). Da mesma forma, existe uma correspondência conhecida e definida entre a se- quência de nucleotídeos de um ácido nucleico particular e a sequência de aminoácidos codificada por aquele ácido nucleico, conforme defini- do pelo código genético (ver gráfico de código genético acima).

[00261] Como descrito acima, uma característica importante e bem conhecida do código genético é a sua redundância, em que, para a maioria dos aminoácidos usados para fazer proteínas, mais de um tri- pleto de nucleotídeo codificador pode ser empregado (ilustrado acima). Portanto, várias sequências nucleotídicas diferentes podem codificar para uma dada sequência de aminoácidos. Tais sequências nucleotí- dicas são consideradas funcionalmente equivalentes, uma vez que re- sultam na produção da mesma sequência de aminoácidos em todos os organismos (embora certos organismos possam traduzir algumas se- quências com mais eficiência do que outros). Além disso, ocasional- mente, uma variante metilada de uma purina ou pirimidina pode ser encontrada em uma dada sequência de nucleotídeos. Essas metilação não afetam a relação de codificação entre o códon trinucleotídeo e o aminoácido correspondente.

[00262] Ao fazer as alterações nas sequências de aminoácidos do polipeptídeo, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considera- do. A importância do índice de aminoácidos hidropáticos em conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica. É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido con- tribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e seme- lhantes Cada aminoácido foi atribuído a um índice hidropático com ba- se em sua hidrofobicidade e características de carga, que são: isoleu- cina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteí- na/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treoni- na (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (&lt;RTI

3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

[00263] É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou pontuação hidropática semelhante e ainda resultar em uma proteína com ativida- de biológica semelhante, isto é, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente.

[00264] Conforme descrito acima, as substituições de aminoácidos geralmente são baseadas, portanto, na similaridade relativa dos subs- tituintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobi- cidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e semelhantes. Substituições exemplificativas que levam em consideração várias das características anteriores são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e in- cluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glu- tamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

[00265] Outro tipo de modificação de aminoácido do anticorpo da invenção pode ser útil para alterar o padrão de glicosilação original do anticorpo para, por exemplo, aumentar a estabilidade. "Alterar" signifi- ca deletar uma ou mais frações de carboidrato encontradas no anti- corpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente li- gada a N. "Ligada a N" se refere à ligação da fração carboidrato a uma cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptí- deo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da fração carboidrato à cadeia lateral de aspara- gina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências de tri- peptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em poten- cial. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemen- te realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que contenha uma ou mais das sequências de tri-peptídeo descritas acima

(para sítios de glicosilação ligados a N). Outro tipo de modificação co- valente envolve acoplamento químico ou enzimático dos glicosídeos ao anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos visto que não exi- gem a produção do anticorpo numa célula hospedeira que tem capaci- dades de glicosilação para glicosilação ligada a N ou O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o açúcar (ou açúcares) pode ser fi- xado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxil livres, (c) grupos sul- fidril livres como aqueles de cisteína, (d) grupo hidroxil livres como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo ami- da de glutamina. Por exemplo, tais métodos são descritos em WO87/05330.

[00266] Da mesma forma, a remoção de quaisquer porções de car- boidrato presentes no anticorpo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A deglicosilação química exige a exposição do anti- corpo ao composto ácido trifluorometano sulfônico ou a um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maior parte ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o anticorpo intacto. A desgli- cosilação química é descrita por Sojahr H. et al. (1987) and by Edge, A S. et al. (1981). A clivagem enzimática de partes de carboidrato em anticorpos pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo e exo-glicosidases conforme descrito por Thotakura, N R. et al. (1987).

[00267] Outras modificações podem envolver a formação de imu- noconjugados. Por exemplo, em um tipo de modificação covalente, anticorpos ou proteínas são covalentemente ligados a um de uma va- riedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira estabelecida na Pat. U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; ou

4.179.337.

[00268] A conjugação de anticorpos ou outras proteínas da presen- te invenção com agentes heterólogos pode ser feita usando uma vari- edade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais incluindo, mas não se limitando a N-succinimidil (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil (N-maleimidometil)ciclo-hexano- 1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (como dissuccinimidil suberato), alde- ídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis (p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p- diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (como tolueno 2,6di- isocianato) e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, o ácido 1- isotiocianatobenzilmetildietileno triaminapenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo (WO 94/11026).

[00269] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta anticor- pos que se ligam especificamente a HHLA2 conjugado a uma fração terapêutica, como uma citotoxina, uma droga e/ou um radioisótopo. Quando conjugados a uma citotoxina, esses conjugados de anticorpos são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxi- co inclui qualquer agente que é prejudicial para (por exemplo, mata) células. Os exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vin- cristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di- hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antimetabóli- tos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citara- bina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo,

mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estrep- tozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cispla- tina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente dau- nomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Um anticorpo da presente invenção pode ser conjugado a um radioisó- topo, por exemplo, iodo radioativo, para gerar radiofármacos citotóxi- cos para o tratamento de um distúrbio relacionado, como um câncer.

[00270] Os anticorpos anti-HHLA2 conjugados podem ser usados de forma diagnóstica ou prognóstica para monitorar os níveis de poli- peptídeos no tecido como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento ou para selecionar os pacientes com maior probabilidade de resposta a uma imunoterapia. Por exemplo, as células podem ser permeabilizadas em um ensaio de citometria de fluxo para permitir que anticorpos que se ligam à HHLA2 (como mAb 8A12 e anticorpos poli- clonais 1.2 e 2.2) direcionem seu epítopo intracelular reconhecido e permitam a detecção da ligação por meio da análise de sinais proveni- entes das moléculas conjugadas. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento (ou seja, ligando fisicamente) do anticorpo a uma subs- tância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem, vá- rias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fos- fatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidi- na/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes ade- quados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresce-

ína (FITC), rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansil ou ficoeritrina (PE); um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem lucife- rase, luciferina e aequorina, e exemplos de material radioativo ade- quado incluem 125I, 131I, 35S, ou 3H. Como utilizado neste documento, o termo "marcado", em relação ao anticorpo, destina-se a abranger a marcação direta do anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) de uma substância detectável, como um agente radioativo ou um fluo- róforo (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE) ou indocianina (Cy5)) ao anticorpo, bem como marcação indireta do anticorpo por reatividade com uma substância detectável.

[00271] Os conjugados de anticorpos da presente invenção podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica. A fra- ção terapêutica não deve ser interpretada como limitada a agentes te- rapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração da droga pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina en- zimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteí- na, tal como fator de necrose tumoral ou interferon-gama; ou modifica- dores de resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, inter- leucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colônias de granulócitos macrófagos ("GM-CSF"), fator de estimulaçã de colônias de granulócitos ("G-CSF") ou outras citoci- nas ou fatores de crescimento.

[00272] As técnicas para conjugar tal porção terapêutica a anticor- pos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Mo- noclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Deli-

very", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cyto- toxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Thera- peutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclo- nal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119 58 (1982).

[00273] Em algumas modalidades, as conjugações podem ser feitas usando um "ligante clivável", facilitando a liberação do agente citotóxi- co ou do agente inibitório de crescimento em uma célula. Por exemplo, um ligante lábil a ácido, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante contendo dissulfeto (Ver, por exemplo, Pat. U.S. 5.208.020) pode ser usado. Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e o agente citotóxico ou agente ini- bidor de crescimento pode ser feita, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento do DNA pode compreender re- giões respectivas que codificam as duas porções do conjugado, adja- centes uma à outra ou separadas por uma região que codifica um pep- tídeo ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado. VI. Usos e métodos da presente invenção

[00274] Os anticorpos anti-HHLA2, imunoglobulinas, polipeptídeos e ácidos nucleicos da presente invenção aqui descritos podem ser usados em numerosos ensaios de medicina preditiva (por exemplo, ensaios de diagnóstico, ensaios de prognóstico e ensaios clínicos de monitoramento) com base na detecção de níveis de HHLA2 e, em al- gumas modalidades e pode ser útil para fins terapêuticos (por exem- plo, terapêutico e profilático), tanto sozinho ou quando conjugado a compostos tóxicos ou outras terapêuticas. O termo "detecção", con- forme usado neste documento, inclui detecção qualitativa e/ou quanti- tativa (níveis de medição) com ou sem referência a um controle. Con- forme descrito neste documento, um polipeptídeo de HHLA2 ou frag- mento do mesmo da presente invenção tem uma ou mais das seguin- tes atividades: 1) se liga a e/ou modula a atividade de seu(s) parcei- ro(s) de ligação natural, tal como TMIGD2 e/ou KIR3DL3; 2) modula a sinalização intra ou intercelular, como a sinalização coimunoinibitória; 3) modula a ativação e/ou proliferação de linfócitos; 4) modula a res- posta imune de um organismo, por exemplo, um organismo mamífero, como um camundongo, um animal não roedor ou humano; e 5) modula a anergia das células imunes.

[00275] Assim, um aspecto da presente invenção se refere a ensai- os de diagnóstico para determinar os níveis de polipeptídeo de HHLA2 no contexto de uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, cé- lulas ou tecido) para determinar, assim, o nível de polipeptídeo de HHLA2 na amostra, para determinar se um indivíduo sofre de um dis- túrbio e/ou para determinar o estado de tal distúrbio, indicado por tais níveis de HHLA2. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção são úteis para o estagiamento de doenças cancerígenas associadas à HHLA2.

[00276] A presente invenção também fornece ensaios prognósticos (ou preditivos) para determinar se um indivíduo está em risco de de- senvolver tal distúrbio. Outro aspecto da presente invenção refere-se ao monitoramento da influência de agentes (por exemplo, drogas, compostos) na expressão ou atividade de HHLA2 em ensaios clínicos.

[00277] A presente invenção também fornece a detecção de HHLA2 como um meio para identificar agentes que transduzem um sinal de HHLA2. Os agentes que transduzem um sinal de HHLA2 atenuariam as respostas imunes e podem ser úteis em doenças autoimunes, asma e para o estabelecimento de tolerância.

[00278] Em qualquer método aqui descrito, o HHLA2 pode ser de- tectado sozinho ou em combinação com a expressão de outras molé- culas, tais como outro ponto de verificação imune e/ou moléculas co- estimulatórias. A detecção combinatória (por exemplo, sequencialmen- te ou simultaneamente) de várias moléculas pode fornecer informa- ções úteis sobre sinergias de intervenção terapêutica e/ou diagnósti- cos personalizados de alta resolução de subtipos de distúrbios. Em algumas modalidades, o HHLA2 é detectado combinatoriamente com mais um marcador.

1. Ensaios de diagnóstico

[00279] A presente invenção fornece, em parte, métodos, sistemas e código para classificar com precisão se uma amostra biológica ex- pressa HHLA2 restrita a células e/ou se os níveis de HHLA2 restrita a células são modulados (por exemplo, suprarregulada ou infrarregula- do), portanto, indicativo do estado de um distúrbio de interesse, como câncer. Em algumas modalidades, a presente invenção é útil para classificar uma amostra (por exemplo, de um indivíduo) como associa- da ou em risco de câncer ou um subtipo do mesmo, mediado por HHLA2 usando um algoritmo estatístico e/ou dados empíricos (por exemplo, a presença , ausência ou nível de HHLA2).

[00280] Um método exemplificativo para detectar o nível de HHLA2 ou fragmentos do mesmo e, portanto, útil para classificar se uma amostra está associada a uma doença ou distúrbio mediado por uma expressão aberrante (por exemplo, suprarregulação ou infrarregula- ção) de HHLA2 ou um subtipo clínico deste envolve obter uma amos- tra biológica de um indivíduo de teste e contatar a amostra biológica com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção capaz de detectar HHLA2 de forma que o nível de HHLA2 seja detectado na amostra biológica. Em algumas modalida-

des, pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é usado, em que dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de tais anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser usados em combinação (por exemplo, em sanduíche ELISAs) ou em série. Em certos casos, o algoritmo estatístico é um sistema de classi- ficação estatístico de aprendizagem único. Por exemplo, um único sis- tema de classificação estatístico de aprendizagem pode ser usado pa- ra classificar uma amostra como uma amostra de HHLA2 com base em um valor de previsão ou probabilidade e na presença ou nível de HHLA2. O uso de um único sistema de classificação estatístico de aprendizagem normalmente classifica a amostra como uma amostra de HHLA2 com uma sensibilidade, especificidade, valor preditivo posi- tivo, valor preditivo negativo e/ou precisão geral de pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

[00281] Outros algoritmos estatísticos adequados são bem conhe- cidos dos versados na técnica. Por exemplo, sistema de classificação estatístico de aprendizagem inclui uma técnica algorítmica de aprendi- zagem de máquina capaz de se adaptar a conjuntos de dados com- plexos (por exemplo, painel de marcadores de interesse) e tomar deci- sões com base em tais conjuntos de dados. Em algumas modalidades, um sistema de classificação estatístico de aprendizagem único, como uma árvore de classificação (por exemplo, floresta aleatória) é usado. Em outras modalidades, uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sistemas de classificação estatística de aprendizagem é usa- da, preferencialmente em tandem. Exemplos de sistemas de classifi- cação estatística de aprendizagem incluem, mas não estão limitados a, aqueles que usam aprendizagem indutiva (por exemplo, árvores de decisão/classificação, como florestas aleatórias, árvores de classifica-

ção e regressão (C&RT), árvores reforçadas, etc.),Aprendizagem pro- vavelmente aproximadamente correta (PAC), aprendizagem conexio- nista (por exemplo, redes neurais (NN), redes neurais artificiais (ANN), redes neuro fuzzy (NFN), estruturas de rede, perceptrons como per- ceptrons multicamadas, redes feed-forward multicamadas, aplicações de redes neurais, aprendizagem bayesiana em redes de crenças, etc.), aprendizagem por reforço (por exemplo, aprendizagem passiva em um ambiente conhecido, como aprendizagem ingênua, aprendizagem di- nâmica adaptativa e aprendizagem de diferença temporal, aprendiza- gem passiva em um ambiente desconhecido, aprendizagem ativa em um ambiente desconhecido, funções de valor de ação de aprendiza- gem, aplicações de aprendizagem por reforço, etc.), e algoritmos ge- néticos e programação evolutiva. Outros sistemas de classificação estatística de aprendizagem incluem máquinas de vetor de suporte (por exemplo, métodos de Kernel), splines de regressão adaptativa multivariada (MARS), algoritmos de Levenberg-Marquardt, algoritmos de Gauss-Newton, misturas de gaussianas, algoritmos de descida gradiente e quantização de vetor de aprendizagem (LVQ). Em certas modalidades, o método da presente invenção compreende ainda envi- ar os resultados da classificação da amostra de HLA2 a um clínico, por exemplo, um histopatologista ou um oncologista.

[00282] Em outra modalidade, o método da presente invenção for- nece ainda um diagnóstico na forma de uma probabilidade de que o indivíduo tenha uma condição ou distúrbio associado à HHLA2. Por exemplo, o indivíduo pode ter cerca de 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou maior probabilidade de ter a condição ou distúrbio. Em ainda outra modalidade, o método da presente invenção fornece ainda um prognóstico da condição ou distúrbio no indivíduo. Em alguns ca- sos, o método de classificação de uma amostra como uma amostra

HHLA2 é ainda baseado nos sintomas (por exemplo, fatores clínicos) do indivíduo do qual a amostra é obtida. Os sintomas ou grupo de sin- tomas podem ser, por exemplo, contagem de linfócitos, contagem de leucócitos, taxa de sedimentação de eritrócitos, diarreia, dor abdomi- nal, cólicas, febre, anemia, perda de peso, ansiedade, depressão e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o diagnóstico de um indivíduo como tendo uma condição ou distúrbio associado à HHLA2 é seguido pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma droga útil para o tratamento de um ou mais sintomas associados à condição ou distúrbio (por exemplo, agen- tes quimioterápicos).

[00283] Em uma modalidade, os métodos envolvem ainda obter uma amostra biológica de controle (por exemplo, amostra biológica de um indivíduo que não tem uma condição ou distúrbio mediado por HHLA2), uma amostra biológica do indivíduo durante a remissão ou antes de desenvolver uma condição ou distúrbio mediado por HHLA2, ou uma amostra biológica do indivíduo durante o tratamento para o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio mediado por HHLA2.

[00284] Um método exemplificativo para detectar a presença ou au- sência de polipeptídeo de HHLA2 ou fragmentos do mesmo é um anti- corpo da presente invenção, ou fragmento do mesmo, capaz de se li- gar a um polipeptídeo de HHLA2, de preferência um anticorpo com um marcador detectável. Os anticorpos podem ser policlonais ou, mais preferencialmente, monoclonais. Esses agentes podem ser marcados. O termo "marcado", em relação ao anticorpo, destina-se a abranger a marcação direta da sonda ou anticorpo por acoplamento (ou seja, liga- ção física) de uma substância detectável à sonda ou anticorpo, bem como marcação indireta da sonda ou anticorpo por reatividade com outro reagente que é diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem detectar um anticorpo primário usando um anticorpo secundário marcado com fluorescência. O termo "amostra biológica" se destina a incluir tecidos, células e fluidos biológicos isolados de um indivíduo, como soro, bem como tecidos, células e fluidos presentes dentro de um indivíduo. Ou seja, o método de detecção da presente invenção pode ser usado para detectar HHLA2, ou fragmentos dos mesmos, em uma amostra biológica in vitro , bem como in vivo. As técnicasin vitro para a detecção do polipeptídeo de HHLA2 incluem ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipitações, imuno-histoquímica (IHC), citometria de fluxo in- tracelular e técnicas relacionadas e imunofluorescência. Além disso, as técnicas in vivo para a detecção de um polipeptídeo de HHLA2 ou um fragmento do mesmo incluem introduzir em um indivíduo um anti- corpo anti-HHLA2 marcado. Por exemplo, o anticorpo pode ser marca- do com um marcador radioativo, luminescente, fluorescente ou outro marcador semelhante, cuja presença e localização em um indivíduo podem ser detectadas por técnicas de imageamento padrão, isolada- mente ou em combinação com o imageamento de outras moléculas, tais como marcadores de tipo de célula (por exemplo, marcadores de células T CD8+).

[00285] Em uma modalidade, a amostra biológica contém molécu- las de polipeptídeo do indivíduo de teste. Uma amostra biológica prefe- rida é um soro, microambiente tumoral, peritumoral ou intratumoral, isolado por meios convencionais de um indivíduo.

[00286] Em outra modalidade, os métodos envolvem ainda obter uma amostra biológica de controle de um indivíduo de controle, o con- tato da amostra de controle com um composto ou agente capaz de de- tectar o polipeptídeo de HHLA2, ou fragmentos do mesmo, de modo que a presença do polipeptídeo de HHLA2, ou fragmentos do mesmo, seja detectado na amostra biológica e comparando a presença do po- lipeptídeo de HHLA2, ou fragmentos do mesmo, na amostra de contro-

le com a presença do polipeptídeo de HHLA2, ou fragmentos do mes- mo na amostra de teste.

[00287] Em ainda outras modalidades, os anticorpos podem ser as- sociados a um componente ou dispositivo para o uso dos anticorpos em um ELISA ou RIA. Exemplos não limitativos incluem anticorpos imobilizados em superfícies sólidas para uso nestes ensaios (por exemplo, ligados e/ou conjugados a um marcador detectável com base na emissão de luz ou radiação conforme descrito acima). Em outras modalidades, os anticorpos são associados a um dispositivo ou tira para detecção de HHLA2 pelo uso de um ensaio imunocromatográfico ou imunoquímico, como em um "sanduíche" ou ensaio competitivo, imuno-histoquímica, microscopia de imunofluorescência e semelhan- tes. Exemplos adicionais de tais dispositivos ou tiras são aqueles pro- jetados para testes caseiros ou testes de ponto rápido de atendimento. Outros exemplos incluem aqueles que são projetados para a análise simultânea de vários analitos em uma única amostra. Por exemplo, um anticorpo não marcado da invenção pode ser aplicado a um polipeptí- deo de HHLA2 de "captura" em uma amostra biológica e os polipeptí- deos HHLA2 capturados (ou imobilizados) podem ser ligados a uma forma marcada de um anticorpo anti-HHLA2 da invenção para detec- ção. Outras modalidades padrão de imunoensaios são bem conheci- das do versado na técnica, incluindo ensaios baseados em, por exem- plo, imunodifusão, imunoeletroforese, imuno-histopatologia, imuno- histoquímica e histopatologia.

2. Ensaios Prognósticos

[00288] Os métodos de diagnóstico aqui descritos podem, além dis- so, ser utilizados para identificar indivíduos com ou em risco de desen- volver um distúrbio associado à HHLA2. Como utilizado neste docu- mento, o termo "aberrante" inclui uma suprarregulada ou infrarregulada de HHLA2 que se desvia dos níveis normais de HHLA2. A expressão ou atividade aberrante inclui expressão ou atividade aumentada ou diminuída, bem como expressão ou atividade que não segue o padrão de desenvolvimento normal de expressão ou o padrão de expressão subcelular. Por exemplo, níveis aberrantes de HHLA2 destinam-se a incluir os casos em que uma mutação no gene HHLA2 ou sequência regulatória, ou amplificação do gene HHLA2 cromossômico, causa a suprarregulação ou infrarregulação de HHLA2. Como utilizado neste documento, o termo "indesejado" inclui um fenômeno indesejado en- volvido em uma resposta biológica, como a ativação de células imu- nes. Por exemplo, o termo indesejado inclui uma HHLA2 que é indese- jável em um indivíduo.

[00289] Muitos distúrbios associados à HHLA2 são conhecidos do versado na técnica, conforme explicado mais adiante nos Exemplos. A HHLA2 é expressa por vários tipos de tumor, incluindo malignidades linfoides selecionadas, cânceres induzidos por vírus e muitos tumores sólidos. Geralmente, a HHLA2 é um marcador prognóstico adverso porque ativa os reguladores de ponto de verificação imune que inibem fortes respostas imunes contra as condições que necessitam dos mesmos. No entanto, a imunoinibição é desejada para infrarregular as respostas imunes no tratamento de uma série de distúrbios, tais como doenças autoimunes, doenças inflamatórias e semelhantes.

[00290] Os ensaios aqui descritos, como os ensaios de diagnóstico anteriores ou os seguintes, podem ser utilizados para identificar um indivíduo que tem ou corre o risco de desenvolver um distúrbio associ- ado a uma regulação incorreta da ativação do HHLA2. Assim, a pre- sente invenção fornece um método para identificar um distúrbio asso- ciado à ativação de HHLA2 aberrante ou indesejada, em que uma amostra de teste é obtida de um indivíduo e a HHLA2 é detectada, em que a presença do polipeptídeo de HHLA2 é diagnóstica para um indi- víduo com ou em risco de desenvolver o distúrbio associado à ativida-

de de HHLA2 aberrante ou indesejada. Como utilizado neste docu- mento, uma "amostra de teste" refere-se a uma amostra biológica obti- da de um indivíduo de interesse. Por exemplo, uma amostra de teste pode ser um fluido biológico (por exemplo, líquido cefalorraquidiano ou soro), amostra de célula ou tecido, como uma lâmina histopatológica do microambiente tumoral, área peritumoral e/ou área intratumoral. Em uma modalidade preferida, a amostra compreende células que expres- sam fragmentos de HHLA2 e/ou HHLA2 maduros ligados à membrana.

[00291] Além disso, os ensaios prognósticos descritos neste docu- mento podem ser usados para determinar se um indivíduo pode ser administrado com um agente (por exemplo, um agonista, antagonista, peptidomimético, polipeptídeo, peptídeo, ácido nucleico, molécula pe- quena ou outro candidato à droga) para tratar tal distúrbio associado com a atividade de HHLA2 aberrante ou indesejada. Por exemplo, es- ses métodos podem ser usados para determinar se um indivíduo pode ser efetivamente tratado com um ou uma combinação de agentes. As- sim, a presente invenção fornece métodos para determinar se um indi- víduo pode ser efetivamente tratado com um ou mais agentes para o tratamento de um distúrbio associado com ativação de HHLA2 aber- rante ou indesejada em que uma amostra de teste é obtida e a HHLA2 é detectada (por exemplo, em que a abundância de polipeptídeo de HHLA2 é diagnóstica para um indivíduo ao qual pode ser administrado o agente para tratar o distúrbio associado à ativação aberrante ou in- desejada de HHLA2).

[00292] Os métodos descritos neste documento podem ser realiza- dos, por exemplo, utilizando kits de diagnóstico pré-empacotados compreendendo pelo menos um reagente de anticorpo aqui descrito, que pode ser convenientemente usado, por exemplo, em ambientes clínicos para diagnosticar pacientes que exibem sintomas ou histórico familiar de uma doença ou doença envolvendo HHLA2.

[00293] Além disso, qualquer tipo de célula ou tecido no qual a HHLA2 é expressa pode ser utilizado nos ensaios de prognóstico aqui descritos.

[00294] Outro aspecto da presente invenção inclui utilizar composi- ções e métodos descritos neste documento para análises de associa- ção e/ou estratificação em que a HHLA2 em amostras biológicas de indivíduos com um distúrbio associado à ativação aberrante de HHLA2 é analisada e as informações são comparadas às dos controles (por exemplo, indivíduos que não têm o transtorno; os controles também podem ser referidos como indivíduos "saudáveis" ou "normais" ou em momentos iniciais em um determinado estudo de lapso de tempo) que são preferencialmente da mesma idade e raça. A seleção adequada de pacientes e controles é importante para o sucesso dos estudos de associação e/ou estratificação. Portanto, um pool de indivíduos com fenótipos bem caracterizados é extremamente desejável. Critérios para diagnóstico de doenças, triagem de predisposição de doenças, prog- nóstico de doenças, determinação da capacidade de resposta a dro- gas (farmacogenômica), triagem de toxicidade de drogas, etc. são descritos neste documento.

[00295] Diferentes projetos de estudo podem ser usados para estu- dos de associação e/ou estratificação genética (Modern Epidemiology, Lippincott Williams & Wilkins (1998), 609-622). Os estudos observaci- onais são mais frequentemente realizados nos quais a resposta dos pacientes não é interferida. O primeiro tipo de estudo observacional identifica uma amostra de pessoas em que a causa suspeita da doen- ça está presente e outra amostra de pessoas em que a causa suspeita está ausente, e então a frequência de desenvolvimento da doença nas duas amostras é comparada. Essas populações amostradas são cha- madas de coortes, e o estudo é um estudo prospectivo. O outro tipo de estudo observacional é o caso-controle ou um estudo retrospectivo.

Em estudos de caso-controle típicos, as amostras são coletadas de indivíduos com o fenótipo de interesse (casos), como certas manifes- tações de uma doença, e de indivíduos sem o fenótipo (controles) em uma população (população-alvo) cujas conclusões devem ser tiradas. Em seguida, as possíveis causas da doença são investigadas retros- pectivamente. Como o tempo e os custos de coleta de amostras em estudos de caso-controle são consideravelmente menores do que para estudos prospectivos, os estudos de caso-controle são o projeto de estudo mais comumente usado em estudos de associação genética, pelo menos durante o estágio de exploração e descoberta.

[00296] Após todas as informações fenotípicas e/ou genotípicas re- levantes terem sido obtidas, análises estatísticas são realizadas para determinar se há alguma correlação significativa entre a presença de um alelo ou genótipo com as características fenotípicas de um indiví- duo. De preferência, a inspeção e limpeza dos dados são realizadas primeiro antes da realização de testes estatísticos para associação genética. Os dados epidemiológicos e clínicos das amostras podem ser resumidos por estatísticas descritivas com tabelas e gráficos bem conhecidos na técnica. A validação de dados é preferencialmente rea- lizada para verificar a conclusão de dados, entradas inconsistentes e pontos fora da curva. Testes de qui-quadrado e testes t (testes de so- ma de postos de Wilcoxon se as distribuições não forem normais) po- dem então ser usados para verificar diferenças significativas entre ca- sos e controles para variáveis distintas e contínuas, respectivamente.

[00297] Uma decisão importante na realização de testes de associ- ação genética é a determinação do nível de significância em que a as- sociação significativa pode ser declarada quando o valor p dos testes atinge aquele nível. Em uma análise exploratória em que acertos posi- tivos serão acompanhados em testes de confirmação subsequentes, um valor p não ajustado <0,2 (um nível de significância no lado lenien-

te), por exemplo, pode ser usado para gerar hipóteses de associação significativa de um nível de HHLA2 com certas características fenotípi- cas de uma doença. É preferido que um valor de p <0,05 (um nível de significância tradicionalmente usado na técnica) seja alcançado para que o nível seja considerado como tendo uma associação com uma doença. Quando os acertos são acompanhados em análises de con- firmação em mais amostras da mesma fonte ou em amostras diferen- tes de fontes diferentes, o ajuste para múltiplos testes será realizado para evitar o número excessivo de acertos, mantendo as taxas de erro do experimento em 0,05. Embora existam diferentes métodos de ajus- te para múltiplos testes para controlar diferentes tipos de taxas de erro, um método comumente usado, mas bastante conservador, é a corre- ção de Bonferroni para controlar a taxa de erro do experimento ou da família (Multiple comparisons and multiple tests, Westfall et al, SAS Institute (1999)). Os testes de permutação para controlar as taxas de descoberta falsa, FDR, podem ser mais poderosos (Benjamini and Ho- chberg, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 57, 1289- 1300, 1995, Resampling-based Multiple Testing, Westfall and Young, Wiley (1993)). Tais métodos para controlar a multiplicidade seriam preferidos quando os testes são dependentes e controlar as taxas de descoberta falsa é suficiente em oposição ao controle das taxas de erro do experimento.

[00298] Uma vez que fatores de risco individuais, genéticos ou não genéticos, foram encontrados para a predisposição à doença, um es- quema de classificação/previsão pode ser estabelecido para predizer a categoria (por exemplo, doença ou não doença) em que um indivíduo estará dependendo no seu fenótipo e/ou genótipo e outros fatores de risco não genéticos. A regressão logística para traço distinto e regres- são linear para traço contínuo são técnicas padrão para tais tarefas (Applied Regression Analysis, Draper and Smith, Wiley (1998)). Além disso, outras técnicas também podem ser usadas para definir a classi- ficação. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a, MART, CART, rede neural e análises discriminantes adequadas para uso na comparação do desempenho de diferentes métodos (The Elements of Statistical Learning, Hastie, Tibshirani & Friedman, Springer (2002)).

3. Monitoramento dos efeitos durante os ensaios clínicos

[00299] O monitoramento da influência de agentes (por exemplo, compostos, drogas ou pequenas moléculas) no polipeptídeo de HHLA2 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, a modulação da proliferação e/ou migração celular) pode ser aplicado não apenas na triagem básica de drogas, mas também nos ensaios clínicos. Por exemplo, a eficácia de um agente determinado por um ensaio de tria- gem, como descrito aqui, para diminuir a expressão do gene de HHLA2, os níveis de polipeptídeo ou regular a atividade de HHLA2, pode ser monitorada em ensaios clínicos de indivíduos que exibem expressão do gene de HHLA2 diminuída, níveis de polipeptídeo ou ati- vidade de HHLA2 infrarregulada, ou pode ser monitorada em trilhas clínicas de indivíduos que exibem expressão reduzida de HHLA2, de- tectável pelos anticorpos ou fragmentos anti-HHLA2 aqui descritos. Em tais ensaios clínicos, a expressão ou atividade de um gene HHLA2 e/ou sintomas ou marcadores do distúrbio de interesse podem ser usados como uma "leitura" ou marcador do fenótipo de uma célula, tecido ou sistema específico. Da mesma forma, a eficácia de um agen- te determinada por um ensaio de triagem, conforme descrito neste do- cumento, para aumentar a expressão do gene de HHLA2, níveis de polipeptídeo ou aumentar a atividade de HHLA2, pode ser monitorada em ensaios clínicos de indivíduos que exibem expressão do gene de HHLA2 aumentada, níveis de polipeptídeo ou atividade de HHLA2 au- mentada, ou pode ser monitorada em trilhas clínicas de indivíduos que exibem aumento de HHLA2, detectável pelos anticorpos anti-HHLA2 ou fragmentos aqui descritos. Nesses ensaios clínicos, a expressão ou atividade de um gene de HHLA2 e/ou sintomas ou marcadores do dis- túrbio de interesse podem ser usadas como uma "leitura" ou marcador do fenótipo de uma célula, tecido ou sistema específico, como para um distúrbio autoimune.

[00300] Por exemplo, e não como limitação, genes, incluindo HHLA2, que são modulados em células por tratamento com um agente (por exemplo, composto, droga ou molécula pequena) que modula a atividade de HHLA2 (por exemplo, identificada em um ensaio de tria- gem como aqui descrito) podem ser identificados. Assim, para estudar o efeito de agentes em um distúrbio associado à ativação aberrante de HHLA2, por exemplo, em um ensaio clínico, as células podem ser iso- ladas e ácidos nucleicos e/ou proteínas preparados e analisados quan- to aos níveis de HHLA2 e/ou outros genes implicados no distúrbio as- sociado à ativação aberrante de HHLA2. Os níveis de expressão gené- tica (por exemplo, um padrão de expressão genética) analisados me- dindo a quantidade de polipeptídeo produzido, por um dos métodos aqui descritos, ou medindo os níveis de HHLA2 ou outros genes. Des- sa forma, o padrão de expressão genética pode servir de marcador, indicativo da resposta fisiológica das células ao agente. Consequen- temente, este estado de resposta pode ser determinado antes e em vários pontos durante o tratamento do indivíduo com o agente.

[00301] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um método para monitorar a eficácia do tratamento de um indivíduo com um agente (por exemplo, um agonista, antagonista, peptidomimé- tico, polipeptídeo, peptídeo, ácido nucleico, molécula pequena ou outro candidato à droga identificado pelo ensaios de triagem aqui descritos) incluindo as etapas de (i) obter uma amostra de pré-administração de um indivíduo antes da administração do agente; (ii) detectar o nível de polipeptídeos HHLA2, ou fragmentos dos mesmos, na amostra de pré-

administração; (iii) obter uma ou mais amostras pós-administração do indivíduo; (iv) detectar o nível de polipeptídeos de HHLA2, ou fragmen- tos dos mesmos, nas amostras pós-administração; (v) comparar o ní- vel do polipeptídeo de HHLA2, ou fragmentos do mesmo, na amostra pré-administração com o polipeptídeo de HHLA2 na amostra ou amos- tras pós-administração; e (vi) alterar a administração do agente ao in- divíduo em conformidade. Por exemplo, o aumento da administração do agente pode ser desejável para diminuir a HHLA2 para níveis mais baixos do que os detectados, isto é, para aumentar a eficácia do agen- te. De acordo com tal modalidade, a HHLA2 pode ser usada como um indicador da eficácia de um agente, mesmo na ausência de uma res- posta fenotípica observável. Da mesma forma, a análise de HHLA2, como por imuno-histoquímica (IHC), também pode ser usada para se- lecionar pacientes que receberão imunoterapia com HHLA2 para inibir um ou mais pontos de verificação imune. Pacientes cujos tumores com ativação de HHLA2 são mais propensos a responder à imunoterapia com mAb HHLA2, conforme descrito neste documento. A imunoterapia resultará inicialmente em ativação imune e as células T ativadas ex- pressarão IFN-gama que, por sua vez, irá suprarregular a ativação de HHLA2. Normalmente, isso resultaria no envolvimento de HHLA2 e na infrarregulação da resposta imune, mas como a HHLA2 pode ser blo- queada pelo mAb anti-HHLA2, conforme descrito aqui, a resposta imune continua até que uma condição desejada, como um tumor, seja eliminada. Por outro lado, os mAbs que sinalizam ativamente por meio de HHLA2 infrarregulam diretamente uma resposta imune.

4. Métodos e usos terapêuticos

[00302] Em algumas modalidades, os anticorpos, fragmentos ou imunoconjugados da presente invenção (por exemplo, anticorpos anti- HHLA2 sozinhos ou conjugados a frações terapêuticas) são úteis para o tratamento de qualquer distúrbio (por exemplo, um câncer) associa-

do à ativação aberrante ou indesejada de HHLA2. Em certas modali- dades, o tratamento é de um mamífero, como um ser humano. Tais anticorpos da invenção podem ser usados sozinhos ou em combina- ção com qualquer agente adequado ou terapia apropriada para tratar o distúrbio de interesse. Por exemplo, acredita-se que sinergias terapêu- ticas se manifestam ao tratar uma célula que compreende HHLA2 e outro ponto de verificação imune ou molécula coestimulatória.

[00303] É bem conhecido que os anticorpos monoclonais terapêuti- cos podem levar ao esgotamento de células extracelularmente porta- doras do antígeno especificamente reconhecido pelo anticorpo. Esta depleção pode ser mediada por pelo menos três mecanismos: citotoxi- cidade celular mediada por anticorpos (ADCC), lise dependente do complemento e inibição antitumoral direta do crescimento do tumor por meio de sinais fornecidos através do antígeno direcionado pelo anti- corpo.

[00304] "Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" re- fere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ati- vação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do pri- meiro componente do sistema do complemento aos anticorpos que estão ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al. (1997) pode ser realizado.

[00305] "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticor- pos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que anti- corpos secretados ligados a receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Assassinas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que essas células efetoras citotó- xicas se liguem especificamente a uma célula-alvo portadora de antí- geno e, subsequentemente, matam a célula-alvo. Para avaliar a ativi- dade ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCCin vi-

tro, tal como descrito na Pat. U.S. 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Como é bem conhecido na técnica, as porções Fc podem ser projetadas para efetuar uma interação desejada ou a falta dela com os receptores Fc.

[00306] Para ligação, neutralização e/ou modulação de alvos intra- celulares mediada por anticorpos, certas modificações devem ser fei- tas. Conforme descrito neste documento, certos formatos de anticor- pos, como sFvs e Fabs, são passíveis de expressão intracelular de moléculas semelhantes a anticorpos. Métodos de fabricar e utilizar tais moléculas semelhantes a anticorpos adaptados para direcionar a ex- pressão em diferentes compartimentos da célula, incluindo o núcleo, ER, citoplasma, golgi, membrana plasmática, mitocôndria, onde eles neutralizam antígenos ou moléculas em uma via específica, são bem conhecidos (ver, pelo menos, Pat. U.S. Publs. 2008-0233110 e 2003- 0104402; Marasco et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7889- 7893; Chen et al. (1994) Human Gene Therapy 5:595-601; Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5932-5936; Mhashilkar et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Marasco et al. (1997) Gene Therapy 4:11-15; Richardson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:3137-3141; and Duan et al. (1994) Human Gene Therapy 5:1315- 1324).

[00307] Como utilizado neste documento, o termo "molécula de imunoglobulina intracelular" é uma imunoglobulina completa que é a mesma que uma imunoglobulina secretada de ocorrência natural, mas que permanece dentro da célula após a síntese. Um "fragmento de imunoglobulina intracelular" refere-se a qualquer fragmento, incluindo fragmentos de cadeia única de uma molécula de imunoglobulina intra- celular. Assim, uma molécula de imunoglobulina intracelular ou frag- mento da mesma não é secretada ou expressa na superfície externa da célula. Os fragmentos de imunoglobulina intracelular de cadeia úni-

ca são referidos neste documento como "imunoglobulinas de cadeia única". Como utilizado neste documento, o termo "molécula de imuno- globulina intracelular ou fragmento da mesma" é entendido como abrangendo uma "imunoglobulina intracelular", uma "imunoglobulina intracelular de cadeia única" (ou fragmento da mesma), um "fragmento de imunoglobulina intracelular", um "anticorpo intracelular" (ou frag- mento da mesma) e um "intracorpo" (ou fragmento da mesma). Como tal, os termos "imunoglobulina intracelular", "Ig intracelular", "anticorpo intracelular" e "intracorpo" podem ser usados indistintamente neste documento e são todos abrangidos pela definição genérica de uma "molécula de imunoglobulina intracelular ou fragmento da mes- ma."Uma molécula de imunoglobulina intracelular, ou fragmento da mesma da presente invenção pode, em algumas modalidades, com- preender dois ou mais polipeptídeos de subunidade, por exemplo, um "primeiro polipeptídeo de subunidade de imunoglobulina intracelular" e um "segundo polipeptídeo de subunidade de imunoglobulina intracelu- lar". No entanto, em outras modalidades, uma imunoglobulina intrace- lular pode ser uma "imunoglobulina intracelular de cadeia única" inclu- indo apenas um único polipeptídeo.

Como utilizado neste documento, uma "imunoglobulina intracelular de cadeia única" é definida como qualquer fragmento unitário que tem uma atividade desejada, por exemplo, ligação intracelular a um antígeno.

Assim, as imunoglobuli- nas intracelulares de cadeia única abrangem aquelas que compreen- dem regiões variáveis da cadeia pesada e leve que atuam juntas para se ligar ao antígeno, bem como imunoglobulinas intracelulares de ca- deia única que têm apenas uma única região variável que se liga ao antígeno, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada "cameli- zada", conforme descrito neste documento.

Uma imunoglobulina intra- celular ou fragmento de Ig pode ser expressa em qualquer lugar subs- tancialmente dentro da célula, como no citoplasma, na superfície inter-

na da membrana celular ou em um compartimento subcelular (também referido como subcompartimento celular ou compartimento celular), como o núcleo, golgi, retículo endoplasmático, endossoma, mitocôn- dria, etc. Subcompartimentos celulares adicionais incluem aqueles que são aqui descritos e bem conhecidos na técnica.

[00308] Essas imunoglobulinas intracelulares são expressas em uma célula receptora ou célula hospedeira contendo o antígeno a ser direcionado. Uma célula hospedeira da presente invenção é preferen- cialmente uma célula eucariótica ou linhagem celular, preferencialmen- te uma planta, animal, vertebrado, mamífero, roedor, camundongo, primata ou célula ou linhagem celular humana.

[00309] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a expressão intracelular dos polipeptídeos de imunoglobulina aqui descritos permite o direcionamento intracelular e a ligação à HHLA2 para, desse modo, modular estericamente a capacidade da molécula de sinalizar, por exemplo, modulando sua capacidade de propagar sinalização median- te ativação por ligação a receptores inibitórios e semelhantes e/ou pa- ra modular a sinalização ao aumentar a concentração local eficaz de moléculas múltiplas de HHLA2.

[00310] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente in- venção podem ser conjugados a uma fração terapêutica, como um agente inibitório de crescimento, agente citotóxico ou uma enzima de ativação de pró-droga, conforme descrito anteriormente. Os anticorpos da invenção podem ser úteis para direcionar o referido agente inibitório do crescimento, agente citotóxico ou uma pró-droga para uma célula que expressa ou superexpressa a quantidade desejada de HHLA2.

[00311] Assim, um objeto da invenção refere-se a um método para tratar um distúrbio associado à ativação aberrante de HHLA2, compre- endendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento ou imunoconjugado da presente invenção.

[00312] Alternativamente, em algumas modalidades, os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis para aplicações terapêuticas, além de aplicações de diagnóstico, prognóstico e prevenção em relação à suprarregulação de uma res- posta imune. A suprarregulação das respostas imunes pode ser na forma de aumentar uma resposta imune existente ou provocar uma resposta imune inicial. Por exemplo, aumentar uma resposta imune usando as composições e métodos em questão é útil nos casos de melhorar uma defesa imunológica contra o câncer e infecções com micróbios (por exemplo, bactérias, vírus ou parasitas). Por exemplo, a suprarregulação ou intensificação de uma função de resposta imune, como aqui descrito, é útil na indução da imunidade tumoral.

[00313] Em outra modalidade, a resposta imune pode ser estimula- da pelos métodos descritos neste documento, de modo que a tolerân- cia preexistente, deleção clonal e/ou exaustão (por exemplo, exaustão de células T) seja superada. Por exemplo, as respostas imunes contra antígenos aos quais um indivíduo não pode montar uma resposta imu- ne significativa, por exemplo, a um antígeno autólogo, tal como antí- genos específicos de tumor, podem ser induzidas pela administração de agentes apropriados aqui descritos que suprarregulam a resposta imune. Numa modalidade, um antígeno autólogo, como um antígeno específico de um tumor, pode ser coadministrado. Em outra modalida- de, uma resposta imune pode ser estimulada contra um antígeno (por exemplo, um antígeno autólogo) para tratar um distúrbio neurológico. Em outra modalidade, os agentes indivíduos podem ser usados como adjuvantes para reforçar as respostas a antígenos estranhos no pro- cesso de imunização ativa.

[00314] Em certos casos, pode ser desejável administrar ainda ou- tros agentes que suprarregulam as respostas imunes, por exemplo,

formas de outros membros da família B7 que transduzem sinais atra- vés de receptores coestimulatórios, a fim de aumentar ainda mais a resposta imune. Além disso, os agentes que suprarregulam uma res- posta imune podem ser usados profilaticamente em vacinas contra vá- rios polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos derivados de patóge- nos). A imunidade contra um patógeno (por exemplo, um vírus) pode ser induzida pela vacinação com uma proteína viral junto com um agente que suprarregula uma resposta imune, em um adjuvante apro- priado.

[00315] Alternativamente, em algumas modalidades, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis para aplicações terapêuticas, além de aplicações de diagnóstico, prognóstico e prevenção (tais como tratamento e retardamento do iní- cio ou progressão das doenças), para inibir doenças que suprarregu- lam a reação imune, por exemplo, asma, doenças autoimunes (nefrite glomerular, artrite, doença semelhante à cardiomiopatia dilatada, colite ulcosa, síndrome de Sjögren, doença de Crohn, eritematoides sistêmi- cos, artrite reumatoide crônica, esclerose múltipla, psoríase, dermatite alérgica de contato, polimiosite, paquiderma, periarterite nodosa, febre reumática, vitiligo vulgar, diabetes mellitus insulino-dependente, doen- ça de Behçet, doença de Hashimoto, doença de Addison, dermatomio- site, miastenia gravis, síndrome de Reiter, doença de Graves, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, hepatite crônica ativa, pênfigo, púrpura trombopênica autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepa- tite crônica ativa, doença de Addison, síndrome antifosfolipídeo, aler- gia atópica, gastrite atrófica autoimune, acloridrina autoimune, doença celíaca, síndrome de Cushing, dermatomiosite, lúpus discoide, erite- matosa, síndrome de Goodpasture, tireoidite de Hashimoto, atrofia adrenal idiopática, trombocitopenia idiopática, diabetes insulino- dependente, síndrome de Lambert-Eaton, hepatite lupoide, alguns ca-

sos de linfopenia, doença mista do tecido conjuntivo, penfigoide, pênfi- go vulgar, anema pernicioso, uveíte facogênica, poliarterite nodosa, autossindromes poliglandulares, cirrose biliar primária, colangite escle- rosante primária, síndrome de Raynaud, policondrite recidivante, sín- drome de Schmidt, esclerodermia limitada (ou síndrome da crista), of- talmia simpática, lúpus eritematose sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal, tireotoxicose, resistência à insulina tipo B, colite ulce- rativa e granulomatose de Wegener).

[00316] Da mesma forma, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis para aplicações terapêuti- cas, além de aplicações de diagnóstico, prognóstico e prevenção (tais como tratamento e retardamento do início ou progressão das doenças) para doenças infecciosas persistentes (por exemplo, doenças infeccio- sas virais, incluindo HPV, HBV, vírus da hepatite C (HCV), retrovírus como o vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2), vírus do herpes, como o vírus Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), HSV-1 e HSV-2 e vírus influenza. Outros antígenos associados a pa- tógenos que podem ser usados conforme descrito neste documento são antígenos de vários parasitas, incluindo a malária, de preferência o peptídeo da malária baseado em repetições de NANP. Além disso, estão incluídas doenças bacterianas, fúngicas e outras doenças pato- gênicas, como Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Sta- phylococcus, Streptococcus, Toxoplasma e Vibriocholerae. As espé- cies exemplificativas incluem Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tu- berculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vagina- lis, Haemophilus vaginalis, Streptococcus sp. Grupo B, Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinal, Linfopatia vene-

reum, Treponema pallidum, Brucella abortus. Brucella melitensis, Bru- cella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escheri- chia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bo- vigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; ou um fungo, como, por exemplo, Paracoccidioides brasiliensis; ou ou- tro patógeno, por exemplo, Plasmodium falciparum. Também estão incluídos os patógenos prioritários do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID). Isso inclui agentes da Categoria A, como varíola maior (varíola), Bacillus anthracis (antraz), Yersinia pestis (pes- te), toxina botulínica de Clostridium (botulismo), Francisella tularensis (tularemia), filovírus (febre hemorrágica de Ebola, febre hemorrágica de Marburg), arenavírus (Lassa (febre de Lassa), Junin (febre hemor- rágica argentina) e vírus relacionados); agentes da Categoria B, como Coxiella burnetti (febre Q), espécies de Brucella (brucelose), Burkhol- deria mallei (mormo), alfavírus (encefalomielite venezuelana, encefa- lomielite equina oriental e ocidental), toxina ricina de Ricinus commu- nis (mamona), toxina épsilon de Clostridium perfringens; Staphylococ- cus enterotoxina B, espécie Salmonella, Shigella dysenteriae, Escheri- chia coli cepa O157:H7, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum; agentes da Categoria C, como vírus nipah, hantavírus, vírus da febre hemorrágica transmitidos por carrapatos, vírus da encefalite transmiti- da por carrapatos, febre amarela e tuberculose multirresistente; hel- mintos, como Schistosoma e Taenia; e protozoários, como Leishmania (por exemplo, L. mexicana) e Plasmodium.

[00317] Em ainda outra modalidade, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis para aplicações terapêuticas, além de aplicações de diagnóstico, prognóstico e pre- venção em relação à indução de tolerância imunológica, rejeição de enxerto de órgão, doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD), do- ença alérgica e doenças causadas pela atenuação de reações imuno- lógicas mediadas por HHLA2.

[00318] No contexto da invenção, o termo "tratar" ou "tratamento", como utilizado neste documento, significa reverter, aliviar, inibir o pro- gresso ou impedir o distúrbio ou condição à qual esse termo se aplica, ou um ou mais sintomas de tal distúrbio ou condição. Pelo termo "tra- tamento de câncer", como utilizado neste documento, entende-se a inibição do crescimento e/ou proliferação de células cancerígenas. De preferência, esse tratamento também leva à regressão do crescimento do tumor (isto é, a diminuição do tamanho de um tumor mensurável). Mais preferencialmente, esse tratamento leva à regressão completa do tumor.

[00319] Em algumas modalidades, o termo "paciente" ou "paciente em necessidade do mesmo" se destina a um mamífero humano ou não humano afetado ou com probabilidade de ser afetado por um cân- cer associado à ativação aberrante de HHLA2.

[00320] Por uma "quantidade terapeuticamente eficaz" do polipeptí- deo da invenção, entende-se uma quantidade suficiente do anticorpo para tratar o distúrbio de interesse, como o câncer, a uma razão bene- fício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Será com- preendido, no entanto, que o uso diário total dos anticorpos e compo- sições da presente invenção será decidido pelo médico atendente den- tro do escopo do bom julgamento médico. O nível de dose terapeuti- camente eficaz específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; atividade do anticorpo específico empregado; a composição específica empregada, a idade, peso corporal, saúde ge- ral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de admi- nistração e taxa de excreção do anticorpo específico empregado; a duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou coinciden- tes com o polipeptídeo específico utilizado; e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas. Por exemplo, é bem conhecido na pe- rícia da técnica iniciar doses do composto em níveis mais baixos do que aqueles necessários para atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja al- cançado.

[00321] As formulações terapêuticas compreendendo um ou mais anticorpos da invenção são preparadas para armazenamento mistu- rando o anticorpo com o grau de pureza desejado com transportado- res, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcio- nais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. A composição do anticorpo será formulada, dosada e administrada de maneira consistente com as boas práticas médicas. Fatores para a consideração neste contexto incluem distúrbio particular sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, o quadro clínico do paciente in- dividual, a causa do distúrbio, o local de distribuição do agente, o mé- todo de administração, a programação da administração, e outros fato- res conhecidos de médicos praticantes.

[00322] A dose terapêutica pode ser pelo menos cerca de 0,01 µg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 0,05 µg/kg de peso cor- poral; pelo menos cerca de 0,1 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 0,5 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 1 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 2,5 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 5 μg/kg de peso corporal, e não mais do que cerca de 100 μg/kg de peso corporal. Será entendido por um versado na técnica que tais diretrizes serão ajustadas para o peso molecular do agente ativo, por exemplo, no uso de fragmentos de anticorpos ou no uso de conjugados de anticorpos. A dosagem também pode ser variada para administração localizada, por exemplo , intranasal, inalação, etc., ou para administração sistêmica, por exemplo, i.m., i.p., i.v., e semelhan- tes.

[00323] A composição não precisa ser, mas é opcionalmente formu- lada com um ou mais agentes que potenciam a atividade ou que de outra forma aumentam o efeito terapêutico. Estes são geralmente usa- dos nas mesmas dosagens e com as vias de administração usadas anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagens até agora usadas.

[00324] Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos recebedores nas dosagens e concentrações usa- das, e incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgâni- cos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservan- tes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexame- tônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butí- lico ou benzílico; alquil parabenos, como metil ou propil parabeno; ca- tecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofí- licos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarí- deos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; açúcares, como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, como sódio; com- plexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tenso- ativos não iônicos, como TWEEN™,PLURONICS™ ou polietileno gli- col (PEG). As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido, por exemplo, por fil-

tração através de membranas de filtração estéreis.

[00325] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em umas microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas da albumina, microemulsões, na- nopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[00326] As composições aqui descritas podem ser administradas por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, subcutâneo, intra- peritoneal, intrapulmonar e intranasal. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, as composições podem ser administradas adequadamente por infusão de pulso, particularmente com doses de- crescentes do anticorpo.

[00327] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da gravidade e do curso da doença, se o an- ticorpo é administrado para fins preventivos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e da resposta ao anticorpo, e do critério do médico assistente. O anticorpo é devidamente administrado ao pacien- te em um momento ou ao longo de uma série de tratamentos.

[00328] Os agentes terapêuticos da presente invenção podem ser usados sozinhos ou podem ser administrados em terapia de combina- ção com, por exemplo, agentes quimioterápicos, hormônios, antian- giogênicos, radiomarcados, compostos ou com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. Os métodos de tratamento anteriores podem ser administrados em conjunto com outras formas de terapia convencional

(por exemplo, tratamentos padrão para o câncer bem conhecidos do versado), tanto consecutivamente com terapia pré ou pós- convencional. Por exemplo, os agentes da presente invenção podem ser administrados com uma dose terapeuticamente eficaz de agente quimioterápico. Em outra modalidade, os agentes da presente inven- ção são administrados em conjunto com a quimioterapia para aumen- tar a atividade e eficácia do agente quimioterápico. O Physicians' Desk Reference (PDR) divulga dosagens de agentes quimioterápicos que têm sido usados no tratamento de vários cânceres. O regime de dosa- gem e as dosagens dessas drogas quimioterápicas acima menciona- das que são terapeuticamente eficazes dependerão do câncer especí- fico a ser tratado, da extensão da doença e de outros fatores familiares ao médico versado na técnica e podem ser determinados pelo médico.

[00329] A vacina contra o câncer também pode ser administrada em combinação com terapia direcionada, por exemplo, imunoterapia. O termo "terapia direcionada" refere-se à administração de agentes que interagem seletivamente com uma biomolécula escolhida para, assim, tratar o câncer. Por exemplo, a terapia direcionada em relação à inibição do inibidor do ponto de verificação imune é útil em combina- ção com os métodos da presente invenção. O termo "inibidor do ponto de verificação imune" significa um grupo de moléculas na superfície celular de células CD4+ e/ou CD8+ que ajustam as respostas imunes inframodulando ou inibindo uma resposta imune antitumoral. As prote- ínas de ponto de verificação imune são bem conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, 2B4, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, re- ceptores da família KIR, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRPal- pha (CD47), CD48, 2B4 (CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, TMIDG2, KIR3DL3 e A2aR (ver, por exemplo, WO 2012/177624). A inibição de um ou mais inibidores do ponto de verifi-

cação imune pode bloquear ou neutralizar a sinalização inibitória para assim suprarregular uma resposta imune a fim de tratar de maneira mais eficaz o câncer. Em algumas modalidades, a vacina contra o câncer é administrada em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imune, como inibidores de PD1, PD-L1 e/ou CD47.

[00330] A imunoterapia é uma forma de terapia direcionada que po- de compreender, por exemplo, o uso de vacinas contra o câncer adici- onais e/ou células de apresentação de antígeno sensibilizadas. Por exemplo, um vírus oncolítico é um vírus capaz de infectar e lisar célu- las cancerosas, deixando as células normais ilesas, tornando-as po- tencialmente úteis na terapia contra o câncer. A replicação de vírus oncolíticos facilita a destruição das células tumorais e também produz amplificação da dose no local do tumor. Eles também podem atuar como vetores para genes anticâncer, permitindo que eles sejam espe- cificamente entregues ao local do tumor. A imunoterapia pode envolver imunidade passiva para proteção de curto prazo de um hospedeiro, alcançada pela administração de anticorpo pré-formado dirigido contra um antígeno de câncer ou antígeno de doença (por exemplo, adminis- tração de um anticorpo monoclonal, opcionalmente ligado a um agente quimioterápico ou toxina, a um antígeno tumoral). Por exemplo, os ini- bidores anti-VEGF e mTOR são conhecidos por serem eficazes no tra- tamento do carcinoma de células renais. A imunoterapia também pode se concentrar no uso de epítopos citotóxicos reconhecidos por linfóci- tos de linhagens celulares de câncer. Alternativamente, polinucleotí- deos antissenso, ribozimas, moléculas de interferência de RNA, poli- nucleotídeos de hélice tripla e semelhantes, podem ser usados para modular seletivamente biomoléculas que estão ligadas à iniciação, progressão e/ou patologia de um tumor ou câncer.

[00331] O termo "terapia não direcionada" refere-se à administração de agentes que não interagem seletivamente com uma biomolécula escolhida, mas tratam o câncer. Exemplos representativos de terapias não direcionadas incluem, sem limitação, quimioterapia, terapia gené- tica e radioterapia.

[00332] Em uma modalidade, a quimioterapia é usada. A quimiote- rapia inclui a administração de um agente quimioterápico. Tal agente quimioterápico pode ser, mas não está limitado a, aqueles seleciona- dos entre os seguintes grupos de compostos: compostos de platina, antibióticos citotóxicos, antimetabolidades, agentes antimitóticos, agentes alquilantes, compostos arsênicos, inibidores de topoisomera- se de DNA, taxanos, análogos de nucleosídeos, alcaloides vegetais e toxinas; e derivados sintéticos dos mesmos. Compostos exemplificati- vos incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes: cisplati- na, treossulfano e trofosfamida; alcaloides vegetais: vinblastina, pacli- taxel, docetaxol; inibidores da topoisomerase do DNA: teniposídeo, crisnatol e mitomicina; anti-folatos: metotrexato, ácido micofenólico e hidroxiureia; análogos de pirimidina: 5-fluorouracil, doxifluridina e cito- sina arabinosídeo; análogos de purina: mercaptopurina e tioguanina; antimetabólitos de DNA: 2'-desóxi-5-fluorouridina, glicinato de afidicoli- na e pirazoloimidazol; e agentes antimitóticos: halicondrina, colchicina e rizoxina. As composições compreendendo um ou mais agentes qui- mioterápicos (por exemplo, FLAG, CHOP) também podem ser usadas. FLAG compreende fludarabina, citosina arabinosídeo (Ara-C) e G- CSF. CHOP inclui ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina e predni- sona. Os exemplos anteriores de agentes quimioterápicos são ilustra- tivos e não pretendem ser limitativos.

[00333] Em outra modalidade, a terapia de radiação é usada. A ra- diação usada na terapia de radiação pode ser radiação ionizante. A radioterapia também pode ser raios gama, raios X ou feixes de pró- tons. Exemplos de radioterapia incluem, mas não estão limitados a,

radioterapia de feixe externo, implantação intersticial de radioisótopos (I-125, paládio, irídio), radioisótopos como estrôncio-89, radioterapia torácica, radioterapia intraperitoneal P-32, e/ou radioterapia abdominal e pélvica total. Para uma visão geral da terapia de radiação, consulte Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Com- pany, Philadelphia. A radioterapia pode ser administrada como radia- ção de feixe externo ou teleterapia, em que a radiação é direcionada de uma fonte remota. O tratamento com radiação também pode ser administrado como terapia interna ou braquiterapia, em que uma fonte radioativa é colocada dentro do corpo perto de células cancerígenas ou de uma massa tumoral. Também é abrangido o uso de terapia foto- dinâmica compreendendo a administração de fotossensibilizantes, como hematoporfirina e seus derivados, Vertoporfina (BPD-MA), ftalo- cianina, fotossensibilizador Pc4, desmetóxi-hipocrelina A; e 2BA-2- DMHA.

[00334] Em outra modalidade, a terapia hormonal é usada. Os tra- tamentos terapêuticos hormonais podem compreender, por exemplo, agonistas hormonais, antagonistas hormonais (por exemplo, flutamida, bicalutamida, tamoxifeno, raloxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON), antagonistas de LH-RH), inibidores da biossíntese e processamento de hormônios e esteroides (por exemplo, dexametasona , retinoides, deltoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, desidrotestos- terona, glicocorticoides, mineralocorticoides, estrogênio, testosterona, progestinas), derivados da vitamina A (por exemplo, ácido all-trans re- tinoico (ATRA)); análogos da vitamina D3; antigestágenos (por exem- plo, mifepristona, onapristona) ou antiandrógenos (por exemplo, aceta- to de ciproterona).

5. Ensaios e Métodos de triagem

[00335] Outro aspecto da presente invenção refere-se a ensaios de triagem, incluindo ensaios não baseados em células e ensaios de mo- delo animal de xenoenxerto. Em uma modalidade, os ensaios forne- cem um método para identificar agentes que modulam a sinalização de HHLA2, como em um ensaio de modelo humano ou animal, a fim de identificar agentes que reduzem a sinalização de HHLA2, aumen- tando assim as respostas imunes e/ou identificar agentes que aumen- tam a sinalização de HHLA2 diminuindo assim as respostas imunes.

[00336] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a en- saios para a triagem de agentes de teste que se ligam a, ou modulam a atividade biológica de, pelo menos, um biomarcador aqui descrito (por exemplo, nas tabelas, figuras, exemplos ou de outra forma no re- latório descritivo), como HHLA2, TMIGD2 e KIR3DL3. Em uma modali- dade, um método para identificar tal agente envolve determinar a ca- pacidade do agente para modular, por exemplo, inibir, o pelo menos um biomarcador aqui descrito.

[00337] Em uma modalidade, um ensaio é um ensaio isento de cé- lulas ou baseado em células, compreendendo contatar pelo menos um biomarcador aqui descrito, com um agente de teste e determinar a ca- pacidade do agente de teste de modular (por exemplo, inibir) a ativida- de enzimática do biomarcador, como medindo a ligação direta de substratos ou medindo parâmetros indiretos conforme descrito abaixo.

[00338] Por exemplo, em um ensaio de ligação direta, o biomarca- dor de proteína (ou seus respectivos polipeptídeos ou moléculas alvo) pode ser acoplado a um radioisótopo ou marcador enzimático de modo que a ligação possa ser determinada pela detecção da proteína ou molécula marcada em um complexo. Por exemplo, os alvos podem ser 125 35 14 marcados com I, S, C, ou 3H, direta ou indiretamente, e o radioi- sótopo detectado por contagem direta de radioemissão ou por conta- gem de cintilação. Alternativamente, os alvos podem ser marcados enzimaticamente com, por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou luciferase, e o marcador enzimático detectado por determi- nação da conversão de um substrato apropriado em produto. A deter- minação da interação entre o biomarcador e o substrato também pode ser realizada usando a ligação padrão ou ensaios de análise enzimáti- ca. Em uma ou mais modalidades dos métodos de ensaio descritos acima, pode ser desejável imobilizar polipeptídeos ou moléculas para facilitar a separação de formas complexadas de não complexadas de uma ou ambas as proteínas ou moléculas, bem como para acomodar a automação do ensaio.

[00339] A ligação de um agente de teste a um alvo pode ser reali- zada em qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Exemplos não limitativos de tais recipientes incluem placas de microti- tulação, tubos de ensaio e tubos de microcentrífuga. As formas imobi- lizadas dos anticorpos descritos neste documento também podem in- cluir anticorpos ligados a uma fase sólida como um material poroso, microporoso (com um diâmetro médio de poro menor que cerca de um mícron) ou macroporoso (com um diâmetro médio de poro de mais de cerca de 10 mícrons), tal como uma membrana, celulose, nitrocelulose ou fibras de vidro; uma esfera, tal como aquela feita de agarose ou po- liacrilamida ou látex; ou a superfície de um prato, placa ou poço, como um feito de poliestireno.

[00340] Em uma modalidade alternativa, a determinação da capaci- dade do agente de modular a interação entre o biomarcador e um substrato ou um biomarcador e seu parceiro de ligação natural pode ser realizada determinando a capacidade do agente de teste de modu- lar a atividade de um polipeptídeo ou outro produto que funciona a ju- sante ou a montante de sua posição dentro da via de sinalização (por exemplo, loops de feedback). Esses loops de feedback são bem co- nhecidos na técnica (ver, por exemplo, Chen e Guillemin (2009) Int. J. Tryptophan Res. 2:1-19).

[00341] O status de HHLA2 pode ser medido usando os anticorpos anti-HHLA2 aqui descritos. Uma redução na expressão de HHLA2 in- dica que o agente inibe a atividade/sinalização de HHLA2 e identifica um agente como útil para inibir a atividade/sinalização de HHLA2 e para aumentar as respostas imunes. Uma redução na ligação de HHLA2 a TMIGD2, KIR3DL3 e/ou receptores inibitórios indica que o agente inibe a atividade/sinalização de HHLA2 e identifica um agente como útil para inibir a atividade/sinalização de HHLA2 e para aumentar as respostas imunes. Por outro lado, um aumento na expressão do HHLA2 indica que o agente promove a atividade/sinalização de HHLA2 e identifica um agente como útil para promover a ativida- de/sinalização de HHLA2 e reduzir as respostas imunes. Um aumento na ligação de HHLA2 à TMIGD2, KIR3DL3 e/ou receptores inibitórios indica que o agente promove a atividade/sinalização de HHLA2 e iden- tifica um agente como útil para promover a atividade/sinalização de HHLA2 e para reduzir as respostas imunes.

[00342] A presente invenção refere-se ainda a novos agentes iden- tificados pelos ensaios de triagem descritos acima. Por conseguinte, está dentro do escopo desta invenção o uso adicional de um agente identificado como aqui descrito, tal como em um modelo animal apro- priado. Por exemplo, um agente identificado como descrito aqui pode ser utilizado um agente num modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos colaterais do tratamento com tal agente. Alterna- tivamente, um anticorpo identificado como descrito aqui pode ser utili- zado em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de tal agente.

[00343] Um aspecto da presente invenção refere-se a ensaios de triagem, incluindo ensaios não baseados em células e ensaios de mo- delo animal de xenoenxerto. Em uma modalidade, os ensaios forne- cem um método para identificar se é provável que um câncer responda à terapia com anticorpo anti-HHLA2, tal como em um ser humano, usando um ensaio de modelo animal de xenoenxerto e/ou se um agen- te pode inibir o crescimento ou matar uma célula cancerígenas que provavelmente não responderá à terapia com anticorpos anti-HHLA2.

6. Métodos profiláticos

[00344] Num aspecto, a presente invenção fornece um método para prevenir em um indivíduo, uma doença ou condição associada a uma resposta imune indesejável ou menos do que desejável. Os indivíduos em risco de uma doença que se beneficiariam do tratamento com os agentes ou métodos reivindicados podem ser identificados, por exem- plo, por qualquer ou uma combinação de ensaios de diagnóstico ou prognóstico conhecidos na técnica. A administração de um agente pro- filático pode ocorrer antes da manifestação dos sintomas associados a uma resposta imune indesejada ou menos do que desejável. O agente apropriado usado para o tratamento (por exemplo, anticorpos, peptí- deos, proteínas de fusão ou pequenas moléculas) pode ser determi- nado com base em indicações clínicas e pode ser identificado, por exemplo, usando ensaios de triagem aqui descritos. VII. Composições farmacêuticas

[00345] Os agentes que modulam (por exemplo, inibem ou promo- vem) a interação entre HHLA2 e um ou mais parceiros de ligação natu- rais, como TMIGD2 e/ou KIR3DL3, incluindo, por exemplo, anticorpos bloqueadores, peptídeos, proteínas de fusão ou moléculas pequenas, podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Essas composições tipicamente compreendem o anticorpo, peptídeo, proteína de fusão ou molécula pequena e um transportador farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, a linguagem "transportador farmaceuticamente aceitável" pretende incluir qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotô-

nicos e de retardamento da absorção e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização de tais meios e agentes pa- ra substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições é contemplada. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[00346] Uma composição farmacêutica da presente invenção é for- mulada para ser compatível com a sua via de administração pretendi- da. Exemplos de vias de administração incluem administração paren- teral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica), transmucosa e retal. Solu- ções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietile- noglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabe- nos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como o ácido etilenodiaminotetracético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da to- nicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. o pH pode ser ajusta- do com ácidos ou bases, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de só- dio. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plásti- co.

[00347] As composições farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração in- travenosa, os transportadores adequados incluem soro fisiológico,

água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou so- lução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deveria ser estéril e deveria ser fluida na medida em que exista uma fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deveria ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), e misturas apropriadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário em caso de dispersão e pelo uso de tensoati- vos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser garantida por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabe- nos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açú- cares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na com- posição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absor- ção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00348] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um sol- vente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enume- rados anteriormente, como requerido, seguido de esterilização por fil- tração. Geralmente, as dispersões são preparadas ao incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de disper- são básico e os outros ingredientes necessários a partir dos enumera- dos anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de so- luções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são de secagem a vácuo e secagem por congelamento, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril da mesma.

[00349] As composições orais incluem geralmente um diluente iner- te ou um transportador comestível. Eles podem ser incluídos em cáp- sulas de gelatina ou comprimidos na forma de comprimidos. Para fins de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorpo- rado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, trociscos ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas usando um transportador fluido para uso como enxaguatório bucal, em que o composto no transportador fluido é aplicado por via oral e aspi- rado e expectorado ou engolido. Agentes de ligação farmaceuticamen- te compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza semelhante: um ligante, tal como celulose mi- crocristalina, goma adragante ou gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose, um agente desintegrante, tal como ido algico, Pri- mogel ou amido de milho; um lubrificante, tal como estearato de mag- nésio ou Estirotes; um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante, tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, salicilato de metil ou aromati- zante de laranja.

[00350] Para administração por inalação, os compostos são distri- buídos na forma de um jato de aerossol de um recipiente ou distribui- dor pressurizado que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás, tal como dióxido de carbono ou um nebulizador.

[00351] A administração sistêmica também pode ser por via trans- mucosa ou transdérmica. Para administração transmucosa ou trans- dérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. A administra- ção transmucosa pode ser realizada através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes, como é ge- ralmente conhecido na técnica.

[00352] Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório convencionais, como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para administração retal.

[00353] Em uma modalidade, os agentes modulatórios são prepa- rados com transportadores que protegerão o composto contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controla- da, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais co- mo acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, polior- toésteres e ácido polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações seriam evidentes para os versados na técnica. Os materi- ais também podem ser obtidos comercialmente na Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossômicas (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos mo- noclonais para antígenos virais) também podem ser utilizadas como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser pre- parados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. 4.522.811

[00354] É especialmente vantajoso formular composições orais ou parenterais na forma de unidade de dosagem para facilitar a adminis- tração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, como utilizado neste documento, refere-se a unidades fisicamente dis- tintas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tra-

tado; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do com- posto terapêutico calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especi- ficação para as formas de unidade de dosagem da presente invenção são ditadas por e diretamente dependentes das características únicas do composto ativo, do efeito terapêutico específico a ser alcançado e das limitações inerentes na técnica da composição, tal como um com- posto ativo para o tratamento de indivíduos.

[00355] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos po- dem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para de- terminar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a do- se terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Compostos que exibem altos ín- dices terapêuticos são preferidos. Enquanto compostos que apresen- tam efeitos colaterais tóxicos podem ser usados, deve-se tomar cuida- do para projetar um sistema de distribuição que almeje tais compostos ao local do tecido afetado a fim de minimizar possíveis danos às célu- las não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais.

[00356] Os dados obtidos de ensaios da cultura de células e estu- dos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos en- contra-se preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circu- lantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A do- sagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosa- gem empregada e a via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da presente invenção, a dose terapeuti- camente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração no plasma circulante que inclua a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição meio-máxima) conforme determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medi- dos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.

[00357] Os agentes moduladores descritos acima podem ser admi- nistrados na forma de ácidos nucleicos expressáveis que codificam os referidos agentes. Esses ácidos nucleicos e composições em que es- tão contidos também estão incluídos na presente invenção. Por exem- plo, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser inseridas em vetores e usadas como vetores de terapia genética. Os vetores de terapia genética podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, por injeção intravenosa, administração local (ver Patente U.S. 5.328.470) ou por injeção estereotáxica (ver, por exemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). A preparação farmacêutica do vetor de terapia genética pode incluir o vetor de tera- pia genética num diluente aceitável ou pode compreender uma matriz de liberação lenta na qual o veículo de distribuição de genes está in- cluído. Alternativamente, quando o vetor de distribuição de genes completo pode ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode inclu- ir uma ou mais células que produzem o sistema de distribuição de ge- nes.

[00358] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor, juntamente com instruções para administração. VIII. Administração de agentes

[00359] Os agentes imunomoduladores da presente invenção são administrados a indivíduos em uma forma biologicamente compatível adequada para administração farmacêutica in vivo, para intensificar ou suprimir respostas imunes mediadas por células imunes. Por "forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo" en- tende-se uma forma da proteína a ser administrada na qual quaisquer efeitos tóxicos são superados pelos efeitos terapêuticos da proteína. O termo "indivíduo" se destina a incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune pode ser desencadeada, por exemplo, mamíferos. Exemplos de indivíduos incluem humanos, cães, gatos, camundongos, ratos e espécies transgênicas dos mesmos. A administração de um agente como aqui descrito pode estar em qualquer forma farmacológi- ca, incluindo uma quantidade terapeuticamente ativa de um agente sozinho ou em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

[00360] A administração de uma quantidade terapeuticamente ativa da composição terapêutica da presente invenção é definida como uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado desejado. Por exemplo, uma quantidade tera- peuticamente ativa de um agente também pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do peptídeo de provocar uma resposta desejada no indiví- duo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, várias doses divididas po- dem ser administradas diariamente ou a dose pode ser reduzida pro- porcionalmente conforme indicado pelas exigências da situação tera- pêutica.

[00361] Os agentes ou a invenção aqui descritos podem ser admi- nistrados de maneira conveniente, como por injeção (subcutânea, in- travenosa, etc.), administração oral, inalação, aplicação transdérmica ou administração retal. Dependendo da via de administração, os com- postos ativos podem ser revestidos em um material para proteger o composto da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto. Por exemplo, para a administração de agentes, por outra administração que não a parenteral, pode ser dese- jável revestir o agente com, ou coadministrar o agente com, um mate- rial para prevenir a sua inativação.

[00362] Um agente pode ser administrado a um indivíduo em um transportador, diluente ou adjuvante apropriado, coadministrado com inibidores de enzima ou em um transportador apropriado, como lipos- somas. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. O adjuvante é usado em seu sentido mais amplo e inclui qualquer composto estimulador da imunidade, como o interferon. Os adjuvantes aqui contemplados incluem resorcinóis, ten- soativos não iônicos, tais como éter de polioxietileno oleil e éter de n- hexadecil polietileno. Os inibidores de enzimas incluem inibidor de trip- sina pancreática, di-isopropilfluorofosfato (DEEP) e trasilol. Os lipos- somas incluem emulsões água-em-óleo-em-água, bem como liposso- mas convencionais (Sterna et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

[00363] O agente também pode ser administrado por parenteral ou intraperitonealmente. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações podem conter um conservante para evitar o crescimento de micro-organismos.

[00364] As composições farmacêuticas de agentes adequados para utilização injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solú- veis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extem- porânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a composição será preferivelmente estéril e deve ser fluida na medida em que exista uma fácil seringabilidade. Será preferivelmente estável sob as condições de fabricação e armazenamento e preser-

vada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bac- térias e fungos. O transportador pode ser solvente ou meio de disper- são contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), e misturas apropriadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manu- tenção do tamanho de partícula necessário em caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser garantida por diversos agentes antibacterianos e antifúngi- cos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, time- rosal e semelhantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes iso- tônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composi- ções injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alu- mínio e gelatina.

[00365] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorpo- rando um agente da presente invenção (por exemplo, um anticorpo, peptídeo, proteína de fusão ou molécula pequena) na quantidade ne- cessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas ao incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir dos enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a prepa- ração de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são de secagem a vácuo e secagem por congelamento, que produz um pó do agente mais qualquer ingrediente adicional dese- jado a partir de uma solução previamente filtrada estéril da mesma.

[00366] Quando o agente está adequadamente protegido, como descrito acima, a proteína pode ser administrada oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível as- similável. Como utilizado neste documento, "transportador farmaceuti- camente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dis- persão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento de absorção e isotônico e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições terapêuticas é contemplada. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composi- ções.

[00367] É especialmente vantajoso formular composições parente- rais na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. "Forma de unidade de dosagem", como utilizado neste documento, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto terapêutico calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da presente invenção são ditadas por e diretamente dependentes (a) das caracte- rísticas únicas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes na técnica da composi- ção, tal como um composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

[00368] Numa modalidade, um agente da presente invenção é um anticorpo. Conforme definido neste documento, uma quantidade tera- peuticamente eficaz de anticorpo (ou seja, uma dosagem eficaz) varia de cerca de 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, de preferência cerca de 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, e ainda mais preferencialmente cerca de 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg ou 5 a 6 mg/kg de peso corporal. Versados entenderão que certos fatores podem in- fluenciar a dosagem necessária para tratar um indivíduo de forma efi- caz, incluindo mas não limitado a, gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, estado geral de saúde e/ou idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo pode incluir um único tratamento ou, preferivelmente, pode incluir uma série de tratamentos. Em um exemplo preferido, um indivíduo é tratado com anticorpo na faixa de entre cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana entre cerca de 1 a 10 semanas, de preferência entre 2 a 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 a 7 se- manas, e ainda mais preferencialmente por cerca de 4, 5 ou 6 sema- nas. Será também apreciado que a dosagem eficaz de anticorpo usa- da para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo do curso de um tratamento particular. As alterações na dosagem podem resultar dos resultados dos ensaios de diagnóstico.

[00369] Conforme descrito acima, em algumas modalidades, os agentes para administração são baseados em células. Os agentes ba- seados em células têm uma relação de imunocompatibilidade com um indivíduo hospedeiro e qualquer uma dessas relações é contemplada para uso de acordo com a presente invenção. Por exemplo, as células, como células T adotivas, podem ser singênicas. O termo "singênico" pode se referir ao estado de derivar, se originar em ou ser membros da mesma espécie que são geneticamente idênticos, particularmente no que diz respeito a antígenos ou reações imunológicas. Isso inclui gêmeos idênticos com tipos MHC correspondentes. Assim, um "trans- plante singênico" refere-se à transferência de células de um doador para um receptor que é geneticamente idêntico ao doador ou é sufici- entemente compatível imunologicamente para permitir o transplante sem uma resposta imunogênica adversa indesejada (por exemplo, como uma que funcionaria contra a interpretação dos resultados da triagem imunológica aqui descritos).

[00370] Um transplante singênico pode ser "autólogo" se as células transferidas forem obtidas e transplantadas para o mesmo indivíduo. Um "transplante autólogo" refere-se à colheita e reinfusão ou trans- plante das próprias células ou órgãos de um indivíduo. O uso exclusivo ou suplementar de células autólogas pode eliminar ou reduzir muitos efeitos adversos da administração das células de volta ao hospedeiro, particularmente reação de enxerto versus hospedeiro.

[00371] Um transplante singênico pode ser "alogênico compatível" se as células transferidas forem obtidas e transplantadas para diferen- tes membros da mesma espécie, ainda que tenham antígenos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) suficientemente compatíveis para evitar uma resposta imunogênica adversa. A deter- minação do grau de incompatibilidade de MHC pode ser realizada de acordo com testes padrão conhecidos e usados na técnica. Por exem- plo, existem pelo menos seis categorias principais de genes do MHC em humanos, identificadas como importantes na biologia dos trans- plantes. HLA-A, HLA-B, HLA-C codificam as proteínas HLA classe I, enquanto HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP codificam as proteínas HLA classe II. Os genes dentro de cada um desses grupos são altamente polimórficos, como refletido nos numerosos alelos ou variantes do HLA encontrados na população humana, e as diferenças nesses grupos entre indivíduos estão associadas à força da resposta imune contra células transplantadas. Os métodos padrão para determinar o grau de compatibilidade de MHC examinam os alelos dentro dos grupos HLA-B e HLA-DR ou HLA-A, HLA-B e HLA-DR. Assim, podem ser feitos tes-

tes de pelo menos 4, e até 5 ou 6 antígenos MHC dentro dos dois ou três grupos HLA, respectivamente.

Em testes sorológicos de MHC, os anticorpos dirigidos contra cada tipo de antígeno HLA reagem com cé- lulas de um indivíduo (por exemplo, doador) para determinar a presen- ça ou ausência de certos antígenos MHC que reagem com os anticor- pos.

Isso é comparado ao perfil de reatividade do outro indivíduo (por exemplo, receptor). A reação do anticorpo com um antígeno MHC é tipicamente determinada incubando o anticorpo com células e, em se- guida, adicionando complemento para induzir a lise celular (ou seja, teste de linfocitotoxicidade). A reação é examinada e graduada de acordo com a quantidade de células lisadas na reação (ver, por exem- plo, Mickelson and Petersdorf (1999) Hematopoietic Cell Transplanta- tion, Thomas, E.

D. et al. eds., pg 28-37, Blackwell Scientific, Malden, Mass.). Outros ensaios baseados em células incluem citometria de fluxo usando anticorpos marcados ou imunoensaios ligados à enzima (ELISA). Os métodos moleculares para determinar o tipo de MHC são bem conhecidos e geralmente empregam sondas e/ou iniciadores sin- téticos para detectar sequências de genes específicos que codificam a proteína HLA.

Os oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados como sondas de hibridação para detectar polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição associados a tipos de HLA particulares (Vau- ghn (2002) Method.

Mol.

Biol.

MHC Protocol. 210:45-60). Alternativa- mente, os iniciadores podem ser usados para amplificar as sequências HLA (por exemplo, por reação em cadeia da polimerase ou reação em cadeia de ligação), os produtos dos quais podem ser examinados por sequenciamento direto de DNA, análise de polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) ou hibridação com uma série de iniciadores oligo- nucleotídicos específicos de sequência (SSOP) (Petersdorf et al. (1998) Blood 92:3515-3520; Morishima et al. (2002) Blood 99:4200- 4206; and Middleton and Williams (2002) Method.

Mol.

Biol.

MHC Pro-

tocol. 210:67-112).

[00372] Um transplante singênico pode ser "congênico" se as célu- las transferidas e as células do indivíduo diferem em loci definidos, como um único locus, normalmente por endogamia. O termo "congêni- to" refere-se a derivar, se originar ou ser membros da mesma espécie, em que os membros são geneticamente idênticos, exceto por uma pe- quena região genética, normalmente um único locus genético (ou seja, um único gene). Um "transplante congênico" refere-se à transferência de células ou órgãos de um doador para um receptor, onde o receptor é geneticamente idêntico ao doador, exceto por um único locus genéti- co. Por exemplo, o CD45 existe em várias formas alélicas e existem linhas congênicas do camundongo nas quais as linhas do camundon- go diferem em relação a se as versões alélicas CD45.1 ou CD45.2 são expressas.

[00373] Em contraste, "alogênico incompatível" refere-se a derivar de, se originar em ou ser membros da mesma espécie com antígenos de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) não idênticos (isto é, proteínas), conforme determinado normalmente por ensaios padrão usados na técnica, tais como análise sorológica ou molecular de um número definido de antígenos MHC, suficiente para eliciar res- postas imunogênicas adversas. Uma "incompatibilidade parcial" refere- se à correspondência parcial dos antígenos MHC testados entre os membros, normalmente entre um doador e um receptor. Por exemplo, uma "meia incompatibilidade" refere-se a 50% dos antígenos do MHC testados como mostrando diferentes tipos de antígenos do MHC entre dois membros. Uma incompatibilidade "total" ou "completa" refere-se a todos os antígenos MHC testados como sendo diferentes entre dois membros.

[00374] Da mesma forma, em contraste, "xenogênico" refere-se a derivar de, se originar em ou ser membros de diferentes espécies, por exemplo, humano e roedor, humano e suíno, humano e chimpanzé, etc. Um "transplante xenogênico" refere-se à transferência de células ou órgãos de um doador para um receptor, onde o receptor é uma es- pécie diferente daquela do doador.

[00375] Além disso, as células podem ser obtidas de uma única fon- te ou de uma pluralidade de fontes (por exemplo, um único indivíduo ou uma pluralidade de indivíduos). Uma pluralidade se refere a pelo menos dois (por exemplo, mais de um). Em ainda outra modalidade, o mamífero não humano é um camundongo. Os animais dos quais os tipos de células de interesse são obtidos podem ser adultos, recém- nascidos (por exemplo, com menos de 48 horas de idade), imaturos ou in utero. Os tipos de células de interesse podem ser células cancerí- genas primárias, células-tronco cancerígenas, linhagens de células cancerígenas estabelecidas, células cancerígenas primárias imortali- zadas e semelhantes. Em certas modalidades, os sistemas imunológi- cos de indivíduos hospedeiros podem ser engenheirados ou, de outra forma, eleitos para serem imunologicamente compatíveis com células cancerígenas transplantadas. Por exemplo, em uma modalidade, o indivíduo pode ser "humanizado" para ser compatível com células can- cerígenas humanas. O termo "sistema imunológico humanizado" refe- re-se a um animal, como um camundongo, compreendendo células da linhagem HSC humana e células imunes adquiridas e inatas, sobrevi- vem sem serem rejeitadas do animal hospedeiro, permitindo assim que a hematopoiese humana e a imunidade adquirida e inata sejam re- constituídas no animal hospedeiro. As células imunes adquiridas inclu- em células T e células B. As células imunes inatas incluem macrófa- gos, granulócitos (basófilos, eosinófilos, neutrófilos), DCs, células NK e mastócitos. Exemplos representativos e não limitativos incluem SCID- hu, Hu-PBL-SCID, Hu-SRC-SCID, NSG (NOD-SCID IL2r-gama (nulo) não possui um sistema imunológico inato, células B, células T e sinali-

zação de citocinas), NOG (NOD-SCID IL2r-gama (truncado)), BRG (BALB/c-Rag2 (nulo) IL2r-gama (nulo)) e H2dRG (Stock-H2d-Rag2 (nulo) IL2r-gama (nulo)) ratos (ver, por exemplo, Shultz et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:118; Pearson et al. (2008) Curr. Protocol. Immu- nol. 15:21; Brehm et al. (2010) Clin. Immunol. 135:84-98; McCune et al. (1988) Science 241:1632-1639, U.S. Pat. 7,960,175, e Pat. U.S. Publ. 2006/0161996), bem como mutantes nulos relacionados de ge- nes relacionados ao sistema imunológico como Rag1 (falta de células B e T), Rag2 (falta de células B e T), TCR alfa (falta de células T), per- forina (falta de função citotóxica decélulas T cD8+), FoxP3 (falta de células regulatórias T CD4+ funcionais), IL2rg ou Prfl, bem como mu- tantes ou knockouts de HHLA2, KIR3DL3, TMIGD2, PD-1, PD-L1, Tim3 e/ou 2B4, permitem um enxerto eficiente de células imunes hu- manas em e/ou fornecem modelos específicos de compartimento de animais imunocomprometidos como camundongos (ver, por exemplo, Publicação de PCT WO2013/062134). Além disso, camundongos hu- manizados NSG-CD34+ (NOD-SCID IL2r-gama (nulo) CD34+) são úteis para estudar gene humano e atividade tumoral em modelos ani- mais como camundongos.

[00376] Como utilizado neste documento, "obtido" de uma fonte de material biológico significa qualquer método convencional de colheita ou partição de uma fonte de material biológico de um doador. Por exemplo, o material biológico pode ser obtido a partir de um tumor só- lido, uma amostra de sangue, como uma amostra de sangue periférico ou do cordão umbilical, ou colhida de outro fluido corporal, como me- dula óssea ou líquido amniótico. Os métodos para obter essas amos- tras são bem conhecidos do versado. Na presente invenção, as amos- tras podem ser frescas (ou seja, obtidas de um doador sem congela- mento). Além disso, as amostras podem ser ainda manipuladas para remover componentes estranhos ou indesejados antes da expansão.

As amostras também podem ser obtidas de um estoque preservado. Por exemplo, no caso de linhagens celulares ou fluidos, como sangue periférico ou do cordão umbilical, as amostras podem ser retiradas de um banco criogênico ou de outro modo preservado de tais linhagens celulares ou fluidos. Essas amostras podem ser obtidas de qualquer doador adequado.

[00377] As populações de células obtidas podem ser usadas dire- tamente ou congeladas para uso em uma data posterior. Uma varie- dade de meios e protocolos para criopreservação são conhecidos na técnica. Geralmente, o meio de congelamento compreenderá DMSO de cerca de 5-10%, albumina de soro de 10-90% e meio de cultura de 50-90%. Outros aditivos úteis para a preservação de células incluem, a título de exemplo e não de limitação, dissacarídeos como a trealose (Scheinkoniget al. (2004) Bone Marrow Transplant. 34: 531-536), ou um expansor de volume de plasma, como heta-amido (isto é, hidroxie- tilamido). Em algumas modalidades, soluções tampão isotônicas, co- mo solução salina tamponada com fosfato, podem ser usadas. Uma composição criopreservativa exemplificativa tem meio de cultura de células com 4% de HSA, 7,5% de dimetil sulfóxido (DMSO) e 2% de heta-amido. Outras composições e métodos para criopreservação são bem conhecidos e descritos na técnica (ver, por exemplo, Broxmeyer et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:645-650). As células são preservadas a uma temperatura final inferior a cerca de -135°C.

[00378] As células podem ser administradas em 0,1 x 106, 0,2 x 106, 0,3 x 106, 0,4 x 106, 0,5 x 106, 0,6 x 106, 0,7 x 106, 0,8 x 106, 0,9 x 106, 1,0 x 106, 5,0 x 106, 1,0 x 107, 5,0 x 107, 1,0 x 108, 5,0 x 108, ou mais, ou qualquer faixa entre ou qualquer valor entre, células por quilograma de peso corporal do indivíduo. O número de células transplantadas pode ser ajustado com base no nível desejado de enxerto em um de- terminado período de tempo. Geralmente, 1×105 a cerca de 1×109 célu-

las/kg do peso corporal, de cerca de 1×106 a cerca de 1×108 células/kg de peso corporal, ou cerca de 1×107 células/kg de peso corporal, ou mais células, conforme necessário, podem ser transplantadas. Em al- gumas modalidades, o transplante de pelo menos cerca de 0,1x106, 0,5x106, 1,0×106, 2,0×106, 3,0×106, 4,0×106, ou 5,0×106 o total de célu- las em relação a um camundongo de tamanho médio é eficaz.

[00379] As células podem ser administradas em qualquer via ade- quada, conforme descrito neste documento, como por infusão. As cé- lulas também podem ser administradas antes, simultaneamente ou depois de outros agentes anticâncer.

[00380] A administração pode ser realizada usando métodos geral- mente conhecidos na técnica. Os agentes, incluindo células, podem ser introduzidos no sítio desejado por injeção direta ou por qualquer outro meio usado na técnica incluindo, mas não estão limitados a, ad- ministração intravascular, intracerebral, parenteral, intraperitoneal, in- travenoso, epidural, intraespinhal, intraesternal, intra-articular, intra- sinovial, intratecal, intra-arterial, intracardíaca ou intramuscular. Por exemplo, os indivíduos de interesse podem ser enxertados com as cé- lulas transplantadas por várias rotas. Essas vias incluem, mas não es- tão limitadas a, administração intravenosa, administração subcutânea, administração a um tecido específico (por exemplo, transplante focal), injeção na cavidade da medula óssea do fêmur, injeção no baço, ad- ministração sob a cápsula renal do fígado fetal, e semelhantes. Em certa modalidade, a vacina contra o câncer da presente invenção é injetada no indivíduo intratumoralmente ou subcutaneamente. As célu- las podem ser administradas em uma infusão ou por meio de infusões sucessivas ao longo de um período de tempo definido suficiente para gerar um efeito desejado. Métodos exemplificativos para transplante, avaliação de enxerto e análise de fenotipagem de marcador de células transplantadas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Pe-

arson et al. (2008) Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21; Ito et al. (2002) Blood 100:3175-3182; Traggiai et al. (2004) Science 304:104-107; Ishikawa et al.Blood (2005) 106:1565-1573; Shultz et al. (2005)J. Immunol. 174:6477-6489; and Holyoake et al. (1999) Exp. Hematol. 27:1418-1427).

[00381] Dois ou mais tipos de células podem ser combinados e ad- ministrados, como terapia baseada em células e transferência adotiva de células-tronco, vacinas contra câncer e terapia baseada em células, e semelhantes. Por exemplo, imunoterapias adotivas baseadas em células podem ser combinadas com as terapias baseadas em células da presente invenção. Modalidades imunoterapêuticas baseadas em células adotivas bem conhecidas, incluindo, sem limitação, células tu- morais autólogas ou alogênicas irradiadas, lisados tumorais ou células tumorais apoptóticas, imunoterapia baseada em células de apresenta- ção de antígeno, imunoterapia baseada em células dendríticas, trans- ferência de células T adotivas, terapia adotiva com células T CAR, te- rapia de intensificação imunológica autóloga (AIET), vacinas contra o câncer e/ou células de apresentação de antígeno. Essas imunoterapi- as baseadas em células podem ser modificadas ainda mais para ex- pressar um ou mais produtos de genes para modular ainda mais as respostas imunes, como expressar citocinas como GM-CSF e/ou ex- pressar antígenos associados a tumores (TAA), como Mage-1, gp-100 e semelhantes. A razão de células cancerígenas na vacina contra o câncer aqui descrita para outros tipos de células pode ser de 1:1, mas pode ser modulada em qualquer quantidade desejada (por exemplo, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1, ou maior).

[00382] O enxerto de células transplantadas pode ser avaliado por qualquer um dos vários métodos, tais como, mas não se limitando a, volume do tumor, níveis de citocinas, tempo de administração, análise de citocinas de fluxo de células de interesse obtidas do indivíduo em um ou mais pontos de tempo após o transplante, e semelhantes. Por exemplo, uma análise baseada no tempo de espera 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 dias ou pode sinalizar o tempo para a colheita do tumor. Quais- quer dessas métricas são variáveis que podem ser ajustadas de acor- do com parâmetros bem conhecidos, a fim de determinar o efeito da variável em uma resposta à imunoterapia anticâncer. Além disso, as células transplantadas podem ser cotransplantadas com outros agen- tes, tais como citocinas, matrizes extracelulares, suportes de cultura celular e semelhantes.

[00383] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitativos. O conte- údo de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publica- dos citados ao longo deste pedido, bem como as Figuras, são incorpo- rados neste documento por referência. IX. Indivíduos

[00384] Em uma modalidade, o indivíduo para o qual a probabilida- de predita de eficácia de uma terapia de anticorpos HHLA2 é determi- nada é um mamífero (por exemplo, camundongo, camundongo huma- nizado, rato, primata, mamífero não humano, animal doméstico, como um cão, gato, vaca, cavalo e semelhantes) e é de preferência um ser humano. Em outra modalidade, o indivíduo é um modelo animal de câncer. Por exemplo, o modelo animal pode ser um modelo animal de xenoenxerto ortotópico de um câncer de origem humana.

[00385] Em outra modalidade dos métodos da presente invenção, o indivíduo não foi submetido a tratamento, como quimioterapia, radiote- rapia, terapia direcionada e/ou terapia de ponto de verificação anti- imune. Em ainda outra modalidade, o indivíduo foi submetido a trata- mento, como quimioterapia, radioterapia, terapia direcionada e/ou te-

rapia de ponto de verificação anti-imune.

[00386] Em certas modalidades, o indivíduo passou por uma cirur- gia para remover tecido cancerígeno ou pré-cancerígeno. Em outras modalidades, o tecido cancerígeno não foi removido, por exemplo, o tecido cancerígeno pode estar localizado em uma região inoperável do corpo, como em um tecido que é essencial para a vida, ou em uma região onde um procedimento cirúrgico causaria considerável risco de dano ao paciente.

[00387] Os métodos da presente invenção podem ser usados para determinar a capacidade de resposta a terapias com inibidores de HHLA2 de muitos cânceres diferentes em indivíduos como os aqui descritos. X. Coleta, Preparação e Separaçãode Amostras

[00388] Em algumas modalidades, a quantidade de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade em uma amostra de um indivíduo é comparada a uma amostra de controle predeterminada (padrão). A amostra do indivíduo é tipicamente de um tecido doente, como células ou tecidos cancerígenos. A amostra de controle pode ser do mesmo indivíduo ou de um indivíduo diferente. A amostra de controle é nor- malmente uma amostra normal não doente. No entanto, em algumas modalidades, como para o estagiamento da doença ou para avaliar a eficácia do tratamento, a amostra de controle pode ser de um tecido doente. A amostra de controle pode ser uma combinação de amostras de vários indivíduos diferentes. Em algumas modalidades, a quantida- de de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade de um indivíduo é comparada a um nível predeterminado. Este nível predeterminado é normalmente obtido a partir de amostras normais. Conforme descrito neste documento, uma quantidade de biomarcador "predeterminada" e/ou medição(ões) de atividade pode ser uma quantidade de biomar- cador e/ou medição(ões) de atividade usada para, a título de exemplo apenas, avaliar um indivíduo que pode ser selecionado para tratamen- to (por exemplo, com base no número de mutações genômicas e/ou o número de mutações genômicas que causam proteínas não funcionais para genes de reparo de DNA), avaliar uma resposta a uma terapia de anticorpo anti-HHLA2 e/ou avaliar uma resposta a uma terapia de anti- corpo anti-HHLA2 com uma ou mais terapias anticâncer adicionais. Uma quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade pode ser determinada em populações de pacientes com ou sem câncer. A quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade pode ser um único número, igualmente aplicável a todos os pacientes, ou a quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade pode variar de acordo com subpopulações específicas de pacientes. Idade, peso, altura e outros fatores de um indivíduo podem afetar a quantidade predetermi- nada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade do indivíduo. Além disso, a quantidade e/ou atividade de biomarcador predetermi- nada pode ser determinada para cada indivíduo individualmente. Em uma modalidade, as quantidades determinadas e/ou comparadas em um método aqui descrito são baseadas em medições absolutas.

[00389] Em outra modalidade, as quantidades determinadas e/ou comparadas em um método descrito neste documento são baseadas em medições relativas, tais como razões (por exemplo, números de cópias de biomarcadores, nível e/ou atividade antes de um tratamento vs. após um tratamento, tais medições de biomarcadores em relação a um controle incrementado ou feito pelo homem, tais medições de bio- marcadores em relação à expressão de um gene de manutenção e semelhantes). Por exemplo, a análise relativa pode ser baseada na razão da medição do biomarcador pré-tratamento em comparação com a medição do biomarcador pós-tratamento. A medição do biomarcador pré-tratamento pode ser feita a qualquer momento antes do início da terapia anticâncer. A medição do biomarcador pós-tratamento pode ser feita a qualquer momento após o início da terapia anticâncer. Em algumas modalidades, as medições de biomarcadores pós-tratamento são feitas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas ou mais após o início da terapia anticâncer e ainda mais por tempo indeterminado para monitoramento contínuo. O tratamento pode compreender terapia anticâncer, como um regime terapêutico compreendendo um ou mais anticorpos anti-HHLA2 sozinhos ou em combinação com outros agentes anticâncer, como com inibidores de ponto de verificação imune.

[00390] A quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medi- ção(ões) de atividade pode ser qualquer padrão adequado. Por exem- plo, a quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medição(ões) de atividade podem ser obtidas do mesmo ou de um humano diferente para o qual uma seleção de paciente está sendo avaliada. Numa mo- dalidade, a quantidade predeterminada de biomarcador e/ou medi- ção(ões) de atividade podem ser obtidas a partir de uma avaliação an- terior do mesmo paciente. Desta forma, o andamento da seleção do paciente pode ser monitorado ao longo do tempo. Além disso, o con- trole pode ser obtido a partir de uma avaliação de outro ser humano ou de vários humanos, por exemplo, grupos selecionados de humanos, se o indivíduo for um humano. Desse modo, a extensão da seleção do humano para o qual a seleção está sendo avaliada pode ser compara- da a outros humanos adequados, por exemplo, outros humanos que estão em uma situação semelhante ao humano de interesse, como aqueles que sofrem de doenças semelhantes ou a(s) mesma(s) condi- ção(ões) e/ou do mesmo grupo étnico.

[00391] Em algumas modalidades da presente invenção, a altera- ção da quantidade do biomarcador e/ou da(s) medição(ões) de ativi- dade do nível predeterminado é de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6,

0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 ou 5,0 vezes ou mais, ou qualquer faixa intermediária, inclusive. Esses valores de corte se aplicam igualmente quando a medição é baseada em alterações relati- vas, como com base na razão da medição do biomarcador pré- tratamento em comparação com a medição do biomarcador pós- tratamento.

[00392] As amostras biológicas podem ser coletadas de uma varie- dade de fontes de um paciente, incluindo uma amostra de fluido corpo- ral, amostra de célula ou uma amostra de tecido compreendendo áci- dos nucleicos e/ou proteínas. "Fluidos corporais" referem-se a fluidos que são excretados ou secretados do corpo, bem como fluidos que normalmente não são (por exemplo , fluido amniótico, humor aquoso, bile, sangue e plasma sanguíneo, líquido cefalorraquidiano, cerúmen e cera de ouvido, fluido de cowper ou fluido pré-ejaculatório, quilo, qui- mo, fezes, ejaculação feminina, fluido intersticial, fluido intracelular, linfa, menstruação, leite materno, muco, fluido pleural, pus, saliva, se- bo, sêmen, soro, suor, fluido sinovial, lágrimas, urina, lubrificação vagi- nal, humor vítreo, vômito). Em uma modalidade preferida, o indivíduo e/ou amostra de controle é selecionado do grupo que consiste em cé- lulas, linhagens celulares, lâminas histológicas, tecidos embebidos em parafina, biópsias, sangue total, aspirado de mamilo, soro, plasma, raspagem bucal, saliva, líquido cefalorraquidiano, urina, fezes e medu- la óssea. Em uma modalidade, a amostra é soro, plasma ou urina. Em outra modalidade, a amostra é soro.

[00393] As amostras podem ser coletadas de indivíduos repetida- mente ao longo de um período longitudinal de tempo (por exemplo, uma vez ou mais na ordem de dias, semanas, meses, anualmente, semestralmente, etc.). A obtenção de várias amostras de um indivíduo ao longo de um período de tempo pode ser usada para verificar os re- sultados de detecções anteriores e/ou para identificar uma alteração no padrão biológico como resultado de, por exemplo, progressão da doença, tratamento com drogas, etc. Por exemplo, amostras de indiví- duos podem ser colhidas e monitoradas todos os meses, a cada dois meses, ou combinações de intervalos de um, dois ou três meses, de acordo com a presente invenção. Além disso, a quantidade de biomar- cador e/ou medições de atividade do indivíduo obtidas ao longo do tempo podem ser convenientemente comparadas entre si, bem como com aquelas de controles normais durante o período de monitoramen- to, fornecendo assim os próprios valores do indivíduo, como um con- trole para monitoramento de longo prazo interno, ou pessoal.

[00394] A preparação e separação da amostra pode envolver qual- quer um dos procedimentos, dependendo do tipo de amostra coletada e/ou análise da(s) medição(ões) do biomarcador. Tais procedimentos incluem, apenas a título de exemplo, concentração, diluição, ajuste de pH, remoção de polipeptídeos de alta abundância (por exemplo, albu- mina, gamaglobulina e transferrina, etc.), adição de conservantes e calibrantes, adição de inibidores de protease, adição de desnaturan- tes, dessalinização de amostras, concentração de proteínas de amos- tra, extração e purificação de lipídeos.

[00395] A preparação da amostra também pode isolar moléculas que estão ligadas em complexos não covalentes a outras proteínas (por exemplo, proteínas transportadoras). Este processo pode isolar as moléculas ligadas a uma proteína transportadora específica (por exemplo, albumina), ou usar um processo mais geral, como a libera- ção de moléculas ligadas de todas as proteínas transportadoras via desnaturação de proteínas, por exemplo, usando um ácido, seguido pela remoção das proteínas transportadoras.

[00396] A remoção de proteínas indesejadas (por exemplo, proteí- nas de alta abundância, não informativas ou indetectáveis) de uma amostra pode ser alcançada usando reagentes de alta afinidade, filtros de alto peso molecular, ultracentrifugação e/ou eletrodiálise. Reagen- tes de alta afinidade incluem anticorpos ou outros reagentes (por exemplo, aptâmeros) que se ligam seletivamente a proteínas de alta abundância. A preparação da amostra também pode incluir cromato- grafia de troca iônica, cromatografia de afinidade de íon metálico, fil- tração em gel, cromatografia hidrofóbica, cromatofocalização, croma- tografia de adsorção, focalização isoelétrica e técnicas relacionadas. Os filtros de peso molecular incluem membranas que separam as mo- léculas com base no tamanho e no peso molecular. Esses filtros po- dem ainda empregar osmose reversa, nanofiltração, ultrafiltração e microfiltração.

[00397] Ultracentrifugação é um método para remover polipeptídeos indesejáveis de uma amostra. Ultracentrifugação é a centrifugação de uma amostra a cerca de 15.000-60.000 rpm enquanto monitora com um sistema óptico a sedimentação (ou falta dela) de partículas. A ele- trodiálise é um procedimento que utiliza uma eletromembrana ou membrana semiperável em um processo no qual os íons são transpor- tados através de membranas semipermeáveis de uma solução para outra sob a influência de um gradiente de potencial. Uma vez que as membranas usadas na eletrodiálise podem ter a capacidade de trans- portar seletivamente íons com carga positiva ou negativa, rejeitar íons de carga oposta ou permitir que as espécies migrem através de uma membrana semipermeável com base no tamanho e carga, torna a ele- trodiálise útil para concentração, remoção ou separação de eletrólitos.

[00398] A separação e purificação na presente invenção podem in- cluir qualquer procedimento conhecido na técnica, tal como eletrofore- se capilar (por exemplo, em capilar ou em chip) ou cromatografia (por exemplo, em capilar, coluna ou em um chip). A eletroforese é um mé- todo que pode ser usado para separar moléculas iônicas sob a in- fluência de um campo elétrico. A eletroforese pode ser realizada em gel, capilar ou microcanal em um chip. Exemplos de géis usados para eletroforese incluem amido, acrilamida, óxidos de polietileno, agarose ou combinações dos mesmos. Um gel pode ser modificado por sua reticulação, adição de detergentes ou desnaturantes, imobilização de enzimas ou anticorpos (eletroforese de afinidade) ou substratos (zimo- grafia) e incorporação de um gradiente de pH. Exemplos de capilares usados para eletroforese incluem capilares que fazem interface com um eletropulverização.

[00399] A eletroforese capilar (CE) é preferida para separar molécu- las hidrofílicas complexas e solutos altamente carregados. A tecnolo- gia CE também pode ser implementada em chips microfluídicos. De- pendendo dos tipos de capilares e tampões utilizados, o CE pode ser ainda mais segmentado em técnicas de separação, como eletroforese da zona capilar (CZE), foco isoelétrico capilar (CIEF), isotacoforese capilar (cITP) e eletrocromatografia capilar (CEC). Uma modalidade para acoplar técnicas CE à ionização por eletropulverização envolve usar soluções voláteis, por exemplo, misturas aquosas contendo um ácido e/ou base volátil e um orgânico, como um álcool ou acetonitrila.

[00400] A isotacoforese capilar (cITP) é uma técnica na qual os analitos se movem através do capilar a uma velocidade constante, mas, no entanto, são separados por suas respectivas mobilidades. A eletroforese de zona capilar (CZE), também conhecida como CE de solução livre (FSCE), é baseada nas diferenças na mobilidade ele- troforética das espécies, determinada pela carga na molécula e na re- sistência ao atrito que a molécula encontra durante a migração, que muitas vezes é diretamente proporcional ao tamanho da molécula. A focalização isoelétrica capilar (CIEF) permite que moléculas anfotéri- cas fracamente ionizáveis sejam separadas por eletroforese em um gradiente de pH. CEC é uma técnica híbrida entre a tradicional croma- tografia líquida de alta performance (HPLC) e CE.

[00401] As técnicas de separação e purificação usadas na presente invenção incluem quaisquer procedimentos de cromatografia conheci- dos na técnica. A cromatografia pode ser baseada na adsorção e elui- ção diferencial de certos analitos ou na partição de analitos entre as fases móvel e estacionária. Diferentes exemplos de cromatografia in- cluem, mas não se limitam a, cromatografia líquida (LC), cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), etc. XI. Polipeptídeos biomarcadores

[00402] Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de proteínas de biomarcador e suas biologicamente ativas das mesmas. Em uma modalidade, o polipeptídeo nativo correspondente a um mar- cador pode ser isolado de células ou fontes de tecido por um esquema de purificação apropriado usando técnicas de purificação de proteína padrão. Em outra modalidade, os polipeptídeos correspondentes a um marcador da presente invenção são produzidos por técnicas de DNA recombinante. Alternativamente à expressão recombinante, um poli- peptídeo correspondente a um marcador da presente invenção pode ser sintetizado quimicamente usando técnicas padrão de síntese de peptídeos.

[00403] As porções biologicamente ativas de um polipeptídeo de biomarcador incluem polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas de uma sequência de aminoácidos de proteína de biomarcador aqui descrita, mas que incluem menos aminoácidos que a proteína de comprimento total e exibem pelo menos uma atividade da proteína de comprimento total correspondente. Normalmente, as porções biologicamente ativas com- preendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade da proteína correspondente. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína da presente invenção pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Além disso, outras porções biologicamente ativas, nas quais outras regiões da proteína são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recom- binantes e avaliadas para uma ou mais das atividades funcionais da forma nativa de um polipeptídeo da presente invenção.

[00404] Os polipeptídeos preferidos têm uma sequência de aminoá- cidos de uma proteína de biomarcador codificada por uma molécula de ácido nucleico aqui descrita. Outras proteínas úteis são substancial- mente idênticas (por exemplo, pelo menos cerca de 40%, de preferên- cia 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) para uma dessas sequências e retém a atividade funcional da proteína da proteína de ocorrência natural correspondente, embora difira na sequência de aminoácidos devido à variação alélica ou mutagênese natural.

[00405] Para determinar a porcentagem de identidade de duas se- quências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, folgas po- dem ser introduzidas na sequência de um primeiro aminoácido ou se- quência de ácido nucleico para alinhamento ideal com um segundo amino ou sequência de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou os nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou nas posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A porcen- tagem de identidade entre as duas sequências é uma função do núme- ro de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % identidade = # de posições idênticas/# total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x100). Em uma modalidade, as duas sequên- cias têm o mesmo comprimento.

[00406] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático.

Um exemplo preferido e não limitativo de um algoritmo matemático utiliza- do para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Al- tschul, et al. (1990) J.

Mol.

Biol. 215:403-410. Pesquisas de nucleotí- deos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontua- ção = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências nu- cleotídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico da presente in- venção.

Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da presente invenção.

Para obter alinhamentos com folgas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternati- vamente, o PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa ite- rada que detecta relações distantes entre as moléculas.

Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST and NBLAST) po- dem ser usados.

Consulte http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Outro exemplo preferido e não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers and Miller, (1988) Comput Appl Biosci, 4:11-7. Esse algoritmo é incorporado ao progra- ma ALIGN (versão 2.0), que faz parte do pacote de software de ali- nhamento de sequência GCG.

Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de pe- so PAM120, uma penalidade de comprimento de folga de 12 e uma penalidade de folga de 4 podem ser usadas.

Ainda outro algoritmo útil para identificar regiões de similaridade e alinhamento de sequência local é o algoritmo FASTA conforme descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448. Ao usar o algoritmo FASTA para comparar sequências de nucleotídeos ou aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAM120 pode, por exemplo, ser usa- da com um valor de tupla kde 2.

[00407] A porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas semelhantes às descritas acima, com ou sem permitir folgas. No cálculo da porcentagem de identidade, apenas as correspondências exatas são contadas.

[00408] A presente invenção também fornece proteínas quiméricas ou de fusão correspondentes a uma proteína de biomarcador. Como utilizado neste documento, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão" compreende a totalidade ou parte (de preferência uma parte biologicamente ativa) de um polipeptídeo correspondente a um marca- dor da presente invenção operacionalmente ligado a um polipeptídeo heterólogo (ou seja, um polipeptídeo diferente do polipeptídeo corres- pondente ao marcador). Dentro da proteína de fusão, o termo "opera- cionalmente ligado" pretende indicar que o polipeptídeo da presente invenção e o polipeptídeo heterólogo estão fundidos na estrutura um com o outro. O polipeptídeo heterólogo pode ser fundido ao terminal amino ou terminal carboxil do polipeptídeo da presente invenção.

[00409] Uma proteína de fusão útil é uma proteína de fusão GST na qual um polipeptídeo correspondente a um marcador da presente in- venção é fundido ao terminal carboxil das sequências GST. Essas pro- teínas de fusão podem facilitar a purificação de um polipeptídeo re- combinante da presente invenção.

[00410] Em outra modalidade, a proteína de fusão contém uma se- quência de sinal heteróloga, proteína de fusão de imunoglobulina, to- xina ou outra sequência de proteína útil. As proteínas quiméricas e de fusão da presente invenção podem ser produzidas por técnicas de

DNA recombinante padrão. Em outra modalidade, o gene de fusão po- de ser sintetizado por técnicas convencionais, incluindo sintetizadores automatizados de DNA. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada utilizando iniciadores de ân- cora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmen- tos de genes consecutivos que podem ser subsequentemente recozi- dos e reamplificados para gerar uma sequência de gene quimérica (ver, por exemplo, Ausubel et al., supra). Além disso, muitos vetores de expressão estão comercialmente disponíveis que já codificam uma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser clonado em tal vetor de expressão de modo que a porção de fusão se- ja ligada em estrutura ao polipeptídeo da presente invenção.

[00411] Uma sequência de sinal pode ser usada para facilitar a se- creção e isolamento da proteína secretada ou outras proteínas de inte- resse. As sequências de sinal são tipicamente caracterizadas por um núcleo de aminoácidos hidrofóbicos que geralmente são clivados da proteína madura durante a secreção em um ou mais eventos de cliva- gem. Esses peptídeos de sinal contêm sítios de processamento que permitem a clivagem da sequência de sinal das proteínas maduras à medida que passam pela via secretora. Assim, a presente invenção refere-se aos polipeptídeos descritos possuindo uma sequência de si- nal, bem como a polipeptídeos dos quais a sequência de sinal foi cli- vada proteoliticamente (ou seja, os produtos de clivagem). Numa mo- dalidade, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequên- cia de sinal pode ser operacionalmente ligada em um vetor de expres- são a uma proteína de interesse, tal como uma proteína que normal- mente não é secretada ou é difícil de isolar. A sequência de sinal dirige a secreção da proteína, tal como de um hospedeiro eucariótico no qual o vetor de expressão é transformado, e a sequência de sinal é subse-

quentemente ou simultaneamente clivada. A proteína pode então ser facilmente purificada a partir do meio extracelular por métodos reco- nhecidos na técnica. Alternativamente, a sequência de sinal pode ser ligada à proteína de interesse usando uma sequência que facilita a pu- rificação, tal como com um domínio GST.

[00412] A presente invenção também se refere a variantes dos poli- peptídeos biomarcadores aqui descritos. Tais variantes têm uma se- quência de aminoácidos alterada que pode funcionar como agonistas (miméticos) ou como antagonistas. As variantes podem ser geradas por mutagênese, por exemplo, mutação pontual distinta ou truncamen- to. Um agonista pode reter substancialmente as mesmas, ou um sub- conjunto, das atividades biológicas da forma natural da proteína. Um antagonista de uma proteína pode inibir uma ou mais das atividades da forma de ocorrência natural da proteína, por exemplo, ligando-se competitivamente a um membro a jusante ou a montante de uma cas- cata de sinalização celular que inclui a proteína de interesse. Assim, efeitos biológicos específicos podem ser provocados por tratamento com uma variante de função limitada. O tratamento de um indivíduo com uma variante com um subconjunto das atividades biológicas da forma natural da proteína pode ter menos efeitos colaterais em um in- divíduo em relação ao tratamento com a forma natural da proteína.

[00413] Variantes de um biomarcador de proteína que funcionam como agonistas (miméticos) ou como antagonistas podem ser identifi- cados por triagem de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, mutantes de truncamento, da proteína da presente invenção para atividade agonista ou antagonista. Em uma modalidade, uma bi- blioteca variegada de variantes é gerada por mutagênese combinatória no nível do ácido nucleico e é codificada por uma biblioteca de genes variegados. Uma biblioteca variegada de variantes pode ser produzida, por exemplo, ligando enzimaticamente uma mistura de oligonucleotí-

deos sintéticos em sequências de genes de modo que um conjunto degenerado de sequências de proteínas potenciais seja expresso co- mo polipeptídeos individuais ou, alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fago). Há uma variedade de métodos que podem ser utilizados para produzir bibliotecas de variantes potenciais dos polipeptídeos da presente in- venção a partir de uma sequência de oligonucleotídeos degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleotídeos degenerados são conheci- dos na técnica (ver, por exemplo, Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Ita- kura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477).

[00414] Além disso, as bibliotecas de fragmentos da sequência de codificação de um polipeptídeo correspondente a um marcador da presente invenção podem ser usadas para gerar uma população vari- egada de polipeptídeos para triagem e subsequente seleção de varian- tes. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos de sequência de codi- ficação pode ser gerada tratando um fragmento de PCR de fita dupla da sequência de codificação de interesse com uma nuclease sob con- dições em que o corte ocorre apenas cerca de uma vez por molécula, desnaturando o DNA de fita dupla, renaturando o DNA para formar DNA de fita dupla que pode incluir pares de sentido/antissenso de dife- rentes produtos cortados, removendo porções de fita simples de du- plexes reformados por tratamento com S1 nuclease e ligando a biblio- teca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por este mé- todo, uma biblioteca de expressão pode ser derivada, o que codifica o terminal amino e fragmentos internos de vários tamanhos da proteína de interesse.

[00415] Várias técnicas são conhecidas na técnica para rastrear produtos de genes de bibliotecas combinatórias feitas por mutações pontuais ou truncamento, e para rastrear bibliotecas de cDNA para produtos de genes tendo uma propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente utilizadas, que são passíveis de análise de alto ren- dimento, para a triagem de grandes bibliotecas de genes incluem a clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, transformação de células apropriadas com a biblioteca de vetores re- sultante e expressão dos genes combinatórios sob condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. A mutagênese de con- junto recursiva (REM), uma técnica que aumenta a frequência de mu- tantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de triagem para identificar variantes de uma proteína da presente invenção (Arkin e Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327- 331).

[00416] Um polipeptídeo isolado ou um fragmento do mesmo (ou um ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo) correspondendo a um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo os biomarcadores lista- dos na Tabela 1 ou fragmentos dos mesmos, pode ser usado como um imunógeno para gerar anticorpos que se ligam a o referido imunó- geno, usando técnicas padrão para preparação de anticorpos policlo- nais e monoclonais de acordo com métodos bem conhecidos na técni- ca. Um peptídeo antigênico compreende pelo menos 8 resíduos de aminoácidos e engloba um epítopo presente na respectiva molécula de comprimento total, de modo que um anticorpo criado contra o pep- tídeo forme um complexo imune específico com a respectiva molécula de comprimento total. De preferência, o peptídeo antigênico compre- ende pelo menos 10 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, tais epítopos podem ser específicos para uma determinada molécula de polipeptídeo de uma espécie, como camundongo ou humano (ou seja, um peptídeo antigênico que abrange uma região da molécula de polipeptídeo que não é conservada entre as espécies é usado como imunógeno; tais resíduos não conservados podem ser determinados usando um alinhamento tal como aquele aqui fornecido).

[00417] Em uma modalidade, um anticorpo se liga substancialmen- te especificamente à HHLA2 e inibe ou bloqueia sua função, como por meio da interrupção de sua interação com o receptor aHHLA2 (por exemplo, TMIGD2 e/ou KIR3DL3). Em outra modalidade, um anticorpo se liga substancialmente especificamente a um ou mais receptores de HHLA2 e inibe ou bloqueia sua função, como por meio da interrupção de sua interação com HHLA2 e pelo menos um de seus receptores.

[00418] Por exemplo, um imunógeno polipeptídico é tipicamente usado para preparar anticorpos por imunização de um indivíduo ade- quado (por exemplo, coelho, cabra, camundongo, camundongo huma- nizado ou outro mamífero) com o imunógeno. Uma preparação imuno- gênica apropriada pode conter, por exemplo, uma molécula recombi- nantemente expressa ou sintetizada quimicamente ou fragmento da mesma à qual a resposta imune deve ser gerada. A preparação pode ainda incluir um adjuvante, tal como o adjuvante completo ou incom- pleto de Freund, ou agente imunoestimulatório semelhante. A imuniza- ção de um indivíduo adequado com uma preparação imunogênica in- duz uma resposta de anticorpo policlonal ao peptídeo antigênico nele contido.

[00419] Os anticorpos policlonais podem ser preparados como des- crito acima imunizando um indivíduo adequado com um imunógeno polipeptídico. O título de anticorpo polipeptídico no indivíduo imunizado pode ser monitorado ao longo do tempo por técnicas padrão, como com um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) usando poli- peptídeo imobilizado. Se desejado, o anticorpo dirigido contra o antí- geno pode ser isolado do mamífero (por exemplo, do sangue) e poste- riormente purificado por técnicas bem conhecidas, como cromatografia de proteína A, para obter a fração de IgG. Em um momento apropriado após a imunização, por exemplo, quando os títulos de anticorpos são mais altos, as células produtoras de anticorpos podem ser obtidas do indivíduo e usadas para preparar anticorpos monoclonais por técnicas padrão, como a técnica de hibridoma (originalmente descrita por Koh- ler e Milstein (1975 ) Nature 256:495-497) (ver também Brown et al.(1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al.(1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), a técnica de hibridoma de célula B humana mais recente (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), a técnica de hibridoma EBV (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) ou técnicas de tri- oma. A tecnologia para a produção de hibridomas de anticorpos mo- noclonais é bem conhecida (ver geralmente Kenneth, R. H. in Mono- clonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36). Resumidamente, uma linhagem celular imortal (tipi- camente um mieloma) é fundida a linfócitos (tipicamente esplenócitos) de um mamífero imunizado com um imunógeno como descrito acima, e os sobrenadantes da cultura das células de hibridoma resultantes são rastreados para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga ao antígeno polipeptídico, de preferência espe- cificamente. Em algumas modalidades, a imunização é realizada em uma célula ou animal hospedeiro que tem um knockout de um antíge- no alvo de interesse (por exemplo, não produz o antígeno antes da imunização).

[00420] Qualquer um dos muitos protocolos bem conhecidos usa- dos para fundir linfócitos e linhagens celulares imortalizadas pode ser aplicado com a finalidade de gerar um anticorpo monoclonal contra um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo os biomarcadores lista- dos na Tabela 1, ou um fragmento dos mesmos (ver, por exemplo, Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) supra; Lerner (1981) supra; Kenneth (1980) supra). Além disso, o trabalhador versado comum apreciará que existem muitas variações de tais méto- dos que também seriam úteis. Normalmente, a linhagem celular imortal (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma) é derivada da mesma espécie de mamífero que os linfócitos. Por exemplo, os hibridomas murinos podem ser feitos fundindo linfócitos de um camundongo imu- nizado com uma preparação imunogênica da presente invenção com uma linhagem celular de camundongo imortalizada. Linhagens celula- res imortais preferidas são linhagens celulares de mieloma de camun- dongo que são sensíveis ao meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"). Qualquer uma de várias linha- gens celulares de mieloma pode ser usada como um parceiro de fusão de acordo com técnicas padrão, por exemplo, as linhagens de mielo- ma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 ou Sp2/O-Ag14. Estas linhagens de mieloma estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Normalmente, células de mieloma de camun- dongo sensíveis a HAT são fundidas a esplenócitos de camundongo usando polietileno glicol ("PEG"). As células de hibridoma resultantes da fusão são então selecionadas usando meio HAT, que mata células de mieloma não fundidas e improdutivas (esplenócitos não fundidos morrem após vários dias porque não são transformados). As células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal da invenção são detectadas rastreando os sobrenadantes da cultura de hibridoma para anticorpos que se ligam a um determinado polipeptídeo, por exemplo, usando um ensaio ELISA padrão.

[00421] Como uma alternativa à preparação de hibridomas secreto- res de anticorpos monoclonais, um monoclonal específico para um dos polipeptídeos descritos acima pode ser identificado e isolado por tria- gem de uma biblioteca de imunoglobulina combinatória recombinante (por exemplo, uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo) com o polipeptídeo apropriado para assim isolar os membros da biblioteca de imunoglobulina que se ligam ao polipeptídeo. Os kits para gerar e ras- trear bibliotecas de exibição de fago estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Cata- log No. 27-9400-01; and the Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Além disso, exemplos de métodos e reagentes particularmente adequados para uso na geração e triagem de uma bi- blioteca de exibição de anticorpos podem ser encontrados em, por exemplo, Ladner et al. Patente U.S. 5.223.409; Kang et al. Publicação Internacional WO 92/18619; Dower et al. Publicação Internacional WO 91/17271; Winter et al. Publicação Internacional WO 92/20791; Markland et al. Publicação Internacional WO 92/15679; Breitling et al. Publicação Internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação Internacional WO 92/01047; Garrard et al. Publicação Internacional WO 92/09690; Ladner et al. Publicação Internacional WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al.(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576- 3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogen- boom et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; and McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.

[00422] As características estruturais de anticorpos não humanos ou humanos (por exemplo, um anticorpo de rato anticamundongo/anti- humano) podem ser usadas para criar anticorpos humanos estrutural-

mente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da presente invenção, tal como ligação a um ou mais de HHLA2, um receptor de HHLA2, TMIGD2 e/ou KIR3DL3. Outra pro- priedade funcional inclui a inibição da ligação dos anticorpos originais não humanos ou humanos conhecidos em um ensaio ELISA de com- petição.

[00423] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos mo- noclonais capazes de se ligar e inibir/bloquear um ou mais de HHLA2, um receptor de HHLA2, TMIGD2 e/ou KIR3DL3, compreendendo uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR tendo uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica ao grupo das CDRs de domínio variável da cadeia pesada aqui apresentadas ou disponíveis publicamente.

[00424] Da mesma forma, são também fornecidos anticorpos mo- noclonais que se ligam e inibem/bloqueiam um ou mais de HHLA2, um receptor de HHLA2, TMIGD2 e/ou KIR3DL3, compreendendo uma ca- deia leve em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR tendo uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica ao grupo das CDRs de domínio variável da cadeia leve aqui apresen- tadas ou disponíveis publicamente.

[00425] Anticorpos monoclonais capazes de se ligar e ini- bir/bloquear um ou mais de HHLA2, um receptor de HHLA2, TMIGD2 e/ou KIR3DL3, compreendendo uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende pelo menos uma CDR tendo uma sequência de pelo menos 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica ao grupo de CDRs de domínio va- riável da cadeia pesada aqui apresentadas ou de outra forma disponí- vel publicamente; e compreendendo uma cadeia leve em que o domí-

nio variável compreende pelo menos uma CDR tendo uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica ao grupo de CDRs de do- mínio variável da cadeia leve aqui apresentadas ou de outra forma disponíveis publicamente, também são fornecidos.

[00426] Um versado na técnica notará que essa homologia percen- tual é equivalente a e pode ser alcançada pela introdução de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos conservadoras em uma determinada CDR.

[00427] Além disso, anticorpos totalmente humanos podem ser fei- tos contra biomarcadores da invenção, incluindo os biomarcadores lis- tados na Tabela 1, ou fragmentos dos mesmos. Anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos em camundongos que são transgêni- cos para genes de imunoglobulina humana, por exemplo, de acordo com Hogan, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Ma- nuel," Cold Spring Harbor Laboratory. Resumidamente, camundongos transgênicos são imunizados com imunógeno purificado. As células do baço são colhidas e fundidas às células do mieloma para produzir hi- bridomas. Os hibridomas são selecionados com base em sua capaci- dade de produzir anticorpos que se ligam ao imunógeno. Anticorpos totalmente humanos reduziriam a imunogenicidade de tais anticorpos em um ser humano.

[00428] Numa modalidade, um anticorpo para uso na presente in- venção é um anticorpo biespecífico ou multiespecífico. Um anticorpo biespecífico tem sítios de ligação para dois antígenos diferentes em um único polipeptídeo de anticorpo. A ligação ao antígeno pode ser simultânea ou sequencial. Triomas e hibridomas híbridos são dois exemplos de linhagens celulares que podem secretar anticorpos bies- pecíficos ou multiespecíficos. Exemplos de anticorpos biespecíficos produzidos por um hibridoma híbrido ou um trioma são divulgados na

Patente U.S. 4.474.893. Os anticorpos biespecíficos foram construídos por meios químicos (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, and Perez et al. (1985) Nature 316:354) and hybridoma technology (Staerz and Be- van (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, and Staerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241). Os anticorpos biespecíficos também são descritos na Patente U.S. 5.959.084. Fragmentos de anticorpos biespecíficos são descritos na Patente U.S. 5.798.229.

[00429] Os agentes biespecíficos também podem ser gerados pela produção de hetero-hibridomas por fusão de hibridomas ou outras cé- lulas que produzem anticorpos diferentes, seguido pela identificação de clones que produzem e comontam ambos os anticorpos. Eles tam- bém podem ser gerados por conjugação química ou genética de ca- deias de imunoglobulina completas ou porções das mesmas, como sequências Fab e Fv. O componente anticorpo pode se ligar a um po- lipeptídeo ou um fragmento do mesmo de um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo um ou mais biomarcadores listados na Tabela 1, ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo bies- pecífico pode se ligar especificamente a um polipeptídeo ou um frag- mento do mesmo e seu(s) parceiro(s) de ligação natural ou um frag- mento(s) do mesmo.

[00430] Em outro aspecto desta invenção, os peptídeos ou miméti- cos de peptídeos podem ser usados para antagonizar a atividade de um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo um ou mais biomar- cadores listados na Tabela 1, ou um fragmento(s) dos mesmos. Em uma modalidade, as variantes de um ou mais biomarcadores listados na Tabela 1 que funcionam como um agente modulador para a respec- tiva proteína de comprimento total, podem ser identificadas por triagem de bibliotecas combinatórias de mutantes, por exemplo, mutantes de truncamento, para atividade antagonista. Em uma modalidade, uma biblioteca variegada de variantes é gerada por mutagênese combinató-

ria no nível do ácido nucleico e é codificada por uma biblioteca de ge- nes variegados. Uma biblioteca variegada de variantes pode ser pro- duzida, por exemplo, ligando enzimaticamente uma mistura de oligo- nucleotídeos sintéticos em sequências de genes de modo que um con- junto degenerado de sequências de polipeptídeos potenciais seja ex- presso como polipeptídeos individuais contendo o conjunto de se- quências de polipeptídeos nele. Existem vários métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes de polipeptídeos a partir de uma sequência de oligonucleotídeo degenerada. A síntese química de uma sequência de genes degenerada pode ser realizada em um sintetizador automático de DNA, e o gene sintético então ligado a um vetor de expressão apropriado. A utilização de um conjunto de- generado de genes permite o fornecimento, numa mistura, de todas as sequências que codificam o conjunto desejado de sequências de poli- peptídeo potenciais. Métodos para sintetizar oligonucleotídeos dege- nerados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nu- cleic Acid Res. 11:477.

[00431] Além disso, bibliotecas de fragmentos de uma sequência de codificação de polipeptídeo podem ser usadas para gerar uma popula- ção variada de fragmentos de polipeptídeo para rastreamento e sele- ção subsequente de variantes de um dado polipeptídeo. Em uma mo- dalidade, uma biblioteca de fragmentos de sequência de codificação pode ser gerada tratando um fragmento de PCR de fita dupla da se- quência de codificação de polipeptídeo com uma nuclease sob condi- ções em que o corte ocorre apenas cerca de uma vez por polipeptí- deo, desnaturando o DNA de fita dupla, renaturando o DNA para for- mar DNA de fita dupla que pode incluir pares de sentido/antissenso de diferentes produtos cortados, removendo porções de fita simples de duplexes reformados por tratamento com S1 nuclease e ligando a bi- blioteca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por este método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada, o que codifi- ca fragmentos N-terminal, C-terminal e internos de vários tamanhos do polipeptídeo.

[00432] Várias técnicas são conhecidas na técnica para rastrear produtos de genes de bibliotecas combinatórias feitas por mutações pontuais ou truncamento, e para rastrear bibliotecas de cDNA para produtos de genes tendo uma propriedade selecionada. Tais técnicas são adaptáveis para o rastreamento rápido das bibliotecas de genes geradas pela mutagênese combinatória de polipeptídeos. As técnicas mais amplamente utilizadas, que são passíveis de análise de alto ren- dimento, para a triagem de grandes bibliotecas de genes incluem a clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, transformação de células apropriadas com a biblioteca de vetores re- sultante e expressão dos genes combinatórios sob condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. A mutagênese de con- junto recursiva (REM), uma técnica que aumenta a frequência de mu- tantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de triagem para identificar variantes de interesse (Arkin e Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331). Em uma modalidade, os ensai- os baseados em células podem ser explorados para analisar uma bi- blioteca de polipeptídeos variegados. Por exemplo, uma biblioteca de vetores de expressão pode ser transfectada em uma linhagem celular que normalmente sintetiza um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo um ou mais biomarcadores listados na Tabela 1, ou um fra- gmento dos mesmos. As células transfectadas são então cultivadas de modo que o polipeptídeo de comprimento total e um polipeptídeo mu-

tante particular sejam produzidos e o efeito da expressão do mutante na atividade do polipeptídeo de comprimento total em sobrenadantes celulares possa ser detectado, por exemplo, por qualquer um de uma série de ensaios funcionais. O DNA de plasmídeo pode então ser re- cuperado das células que pontuam para a inibição, ou alternativamen- te, potenciação da atividade polipeptídica de comprimento total, e os clones individuais ainda caracterizados.

[00433] A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de aminoácidos polipeptídica por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em vez de L-lisina) pode ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, os peptídeos restritos compreendendo uma sequência de aminoácidos polipeptídica de inte- resse ou uma variação de sequência substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387, aqui incorporado por referência); por exemplo, adicionando resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares que ciclam o peptídeo.

[00434] As sequências de aminoácidos aqui divulgadas permitirão aos versados na técnica produzir polipeptídeos correspondentes às sequências de peptídeos e variantes de sequência dos mesmos. Tais polipeptídeos podem ser produzidos em células hospedeiras procarió- ticas ou eucarióticas por expressão de polinucleotídeos que codificam a sequência peptídica, frequentemente como parte de um polipeptídeo maior. Alternativamente, tais peptídeos podem ser sintetizados por mé- todos químicos. Métodos para a expressão de proteínas heterólogas em hospedeiros recombinantes, síntese química de polipeptídeos e tradução in vitro são bem conhecidos na técnica e são descritos poste- riormente em Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Me- thods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techni-

ques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publis- hing, que são aqui incorporados por referência).

[00435] Os peptídeos podem ser produzidos, normalmente por sín- tese química direta. Os peptídeos podem ser produzidos como peptí- deos modificados, com frações não peptídicas ligadas por ligação co- valente ao N-terminal e/ou C-terminal. Em certas modalidades preferi- das, o terminal carbóxi ou o terminal amino, ou ambos, são quimica- mente modificados. As modificações mais comuns dos grupos amino e carboxil terminais são acetilação e amidação, respectivamente. Modifi- cações amino-terminais, como acilação (por exemplo, acetilação) ou alquilação (por exemplo, metilação) e modificações carbóxi-terminais, como amidação, bem como outras modificações terminais, incluindo ciclização, podem ser incorporadas em várias modalidades da inven- ção. Certas modificações amino-terminais e/ou carbóxi-terminais e/ou extensões de peptídeos para a sequência central podem fornecer pro- priedades físicas, químicas, bioquímicas e farmacológicas vantajosas, tais como: estabilidade intensificada, potência e/ou eficácia aumenta- das, resistência a proteases séricas, propriedades farmacocinéticas desejáveis e outras. Os peptídeos aqui divulgados podem ser usados terapeuticamente para tratar doenças, por exemplo, alterando a coes- timulação em um paciente.

[00436] Peptidomimetics (Fauchere (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS p.392; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229, que são incorporados neste documento por refe- rência) são geralmente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Os miméticos de peptídeo que são estru-

turalmente semelhantes aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalen- te.

Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo paradigma (ou seja, um polipeptídeo que tem uma atividade biológica ou farmacológica), mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada do grupo que consiste em: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, por métodos conhecidos na técnica e ainda descritos nas seguintes referências: Spatola, A.

F. em "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Pro- teins" Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A.

F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (general review); Morley, J.

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J. (1982) Life Sci. (1982) 31:189-199 (- CH2-S-); cada um dos quais é incorporado aqui por referência.

Uma ligação não peptídica particularmente preferida é -CH2NH-. Tais mimé- ticos de peptídeos podem ter vantagens significativas sobre as moda- lidades de polipeptídeos, incluindo, por exemplo: produção mais eco- nômica, maior estabilidade química, propriedades farmacológicas in- tensificadas (meia-vida, absorção, potência, eficácia, etc.), especifici- dade alterada (por exemplo, um amplo espectro de atividades biológi- cas), antigenicidade reduzida e outros.

A marcação de peptidomiméti-

cos geralmente envolve a fixação covalente de um ou mais marcado- res, diretamente ou através de um espaçador (por exemplo, um grupo amida), a posições não interferentes no peptidomimético que são pre- ditas por dados quantitativos de estrutura-atividade e/ou modelagem molecular. Tais posições não interferentes são geralmente posições que não formam contatos diretos com os macropolipeptídeos aos quais o peptidomimético se liga para produzir o efeito terapêutico. A derivatização (por exemplo, marcação) de peptidomiméticos não deve interferir substancialmente com a atividade biológica ou farmacológica desejada do peptidomimético.

[00437] Também abrangidos pela presente invenção estão peque- nas moléculas que podem modular (intensificar ou inibir) as interações, por exemplo, entre os biomarcadores aqui descritos ou listados na Ta- bela 1 e seus parceiros de ligação naturais. As pequenas moléculas da presente invenção podem ser obtidos utilizando qualquer uma das inúmeras abordagens em métodos de bibliotecas combinatórias co- nhecidas na técnica, incluindo: bibliotecas de fase sólida ou fase de solução paralelas espacialmente endereçáveis; métodos de biblioteca sintética que requerem deconvolução; o método de biblioteca "uma esfera, um composto"; e métodos de biblioteca sintética utilizando se- leção por cromatografia de afinidade. (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

[00438] Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas mole- culares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) An- gew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; e em Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.

[00439] As bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), ou em esferas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bactérias (Ladner USP 5,223,409), esporos (Ladner USP ‘409), plasmídeos (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) ou no fago (Scott and Smith (1990) Science 249:386- 390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirlaet al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner supra.). Os compostos podem ser rastreados em ensaios baseados em células ou não baseados em células. Os compostos podem ser selecionados em pools (por exemplo, vários compostos em cada amostra de teste) ou como compostos individuais.

[00440] A invenção também se refere a proteínas quiméricas ou de fusão dos biomarcadores da invenção, incluindo os biomarcadores lis- tados na Tabela 1, ou fragmentos dos mesmos. Como utilizado neste documento, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão" compre- ende um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo um ou mais biomarcadores listados na Tabela 1, ou um fragmento do mesmo, ope- racionalmente ligado a outro polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína que não é substancial- mente homóloga ao respectivo biomarcador. Em uma modalidade pre- ferida, a proteína de fusão compreende pelo menos uma porção biolo- gicamente ativa de um ou mais biomarcadores da invenção, incluindo um ou mais biomarcadores listados na Tabela 1, ou fragmentos dos mesmos. Dentro da proteína de fusão, o termo "operacionalmente li- gado" se destina a indicar que as sequências de biomarcadores e as sequências de não biomarcadores são fundidas em estrutura entre si de modo a preservar as funções exibidas quando expressas indepen- dentemente da fusão. As "outras" sequências podem ser fundidas ao N-terminal ou C-terminal das sequências de biomarcadores, respecti-

vamente.

[00441] Uma tal proteína de fusão pode ser produzida por expres- são recombinante de uma sequência nucleotídica que codifica o pri- meiro peptídeo e uma sequência nucleotídica que codifica o segundo peptídeo. O segundo peptídeo pode corresponder opcionalmente a uma porção que altera a solubilidade, afinidade, estabilidade ou valên- cia do primeiro peptídeo, por exemplo, uma região constante de imu- noglobulina. Em outra modalidade preferida, o primeiro peptídeo con- siste em uma porção de uma molécula biologicamente ativa (por exemplo, a porção extracelular do polipeptídeo ou a porção de ligação ao ligando). O segundo peptídeo pode incluir uma região constante de imunoglobulina, por exemplo, um domínio C1 humano ou domínio C 4 (por exemplo, a dobradiça, regiões CH2 e CH3 de IgC1 humana, ou IgC4 humana, ver por exemplo, Capon et al. Patentes U.S. 5.116.964;

5.580.756; 5.844.095 e semelhantes, aqui incorporados por referên- cia). Essas regiões constantes podem reter regiões que medeiam a função efetora (por exemplo, ligação ao receptor Fc) ou podem ser al- teradas para reduzir a função efetora. Uma proteína de fusão resultan- te pode ter solubilidade alterada, afinidade de ligação, estabilidade e/ou valência (ou seja, o número de sítios de ligação disponíveis por polipeptídeo) em comparação com o primeiro peptídeo expresso inde- pendentemente e pode aumentar a eficiência da purificação da proteí- na. Proteínas de fusão e peptídeos produzidos por técnicas recombi- nantes podem ser segregados e isolados de uma mistura de células e meio contendo a proteína ou peptídeo. Alternativamente, a proteína ou peptídeo pode ser retido citoplasmicamente e as células colhidas, lisa- das e a proteína isolada. Uma cultura de células normalmente inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Os meios adequados para cultura de células são bem conhecidos na técnica. A proteína e os peptídeos podem ser isolados a partir de meios de cultura de célu-

las, células hospedeiras ou ambos, utilizando técnicas conhecidas na técnica para purificar proteínas e peptídeos. As técnicas para transfec- tar células hospedeiras e purificar proteínas e peptídeos são conheci- das na técnica.

[00442] De preferência, uma proteína de fusão da invenção é pro- duzida por técnicas padrão de DNA recombinante. Por exemplo, os fragmentos de DNA que codificam para as diferentes sequências poli- peptídicas são ligados entre si na estrutura de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, utilizando terminais de extremidades ce- gas ou escalonadas para ligação, digestão com enzimas de restrição para fornecer terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas conforme apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junções indesejáveis e ligação enzimática. Em outra modalida- de, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais, incluindo sintetizadores automatizados de DNA. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada utili- zando iniciadores de âncora que dão origem a saliências complemen- tares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem ser subsequentemente recozidos e reamplificados para gerar uma se- quência de gene quimérica (ver, por exemplo, Current Protocols in Mo- lecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).

[00443] Proteínas de fusão de Ig particularmente preferidas incluem a porção de domínio extracelular ou domínio semelhante a região vari- ável de um ou mais biomarcadores listados na Tabela 1, acoplados a uma região constante de imunoglobulina (por exemplo, a região Fc). A região constante da imunoglobulina pode conter modificações genéti- cas que reduzem ou eliminam a atividade efetora inerente à estrutura da imunoglobulina. Por exemplo, o DNA que codifica a porção extrace- lular de um polipeptídeo de interesse pode ser unido ao DNA que codi- fica a dobradiça, regiões CH2 e CH3 de IgG1 e/ou IgG4 humana modificada por mutagênese dirigida ao sítio, por exemplo, como ensi- nado em WO 97/28267.

[00444] Em outra modalidade, a proteína de fusão contém uma se- quência de sinal heteróloga em seu N-terminal. Em certas células hos- pedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamíferos), a expres- são e/ou secreção de um polipeptídeo pode ser aumentada através do uso de uma sequência de sinal heteróloga.

[00445] As proteínas de fusão da invenção podem ser usadas como imunógenos para produzir anticorpos em um indivíduo. Tais anticorpos podem ser usados para purificar os respectivos polipeptídeos naturais a partir dos quais as proteínas de fusão foram geradas, ou em ensaios de triagem para identificar polipeptídeos que inibem as interações en- tre um ou mais polipeptídeos de biomarcadores ou um fragmento do mesmo e seu(s) parceiro(s) de ligação natural ou um fragmento(s) do(s) mesmo(s).

[00446] Os agentes modulatórios descritos neste documento (por exemplo, anticorpos, pequenas moléculas, peptídeos, proteínas de fusão ou pequenos ácidos nucleicos) podem ser incorporados em composições farmacêuticas e administrados a um indivíduo in vivo. As composições podem conter uma única molécula ou agente ou qual- quer combinação de agentes aqui descritos. Os "agentes ativos úni- cos" aqui descritos podem ser combinados com outros compostos farmacologicamente ativos ("segundos agentes ativos") conhecidos na técnica de acordo com os métodos e composições aqui fornecidos.

[00447] A produção e utilização de moléculas de ácido nucleico de biomarcador e/ou polipeptídeo de biomarcador aqui descritas podem ser facilitadas usando técnicas recombinantes padrão. Em algumas modalidades, essas técnicas usam vetores, preferencialmente vetores de expressão, contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptí- deo de biomarcador ou uma porção desse polipeptídeo. Como utiliza-

do neste documento, o termo "vetor" se refere a uma molécula de áci- do nucleico com capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um laço de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicio- nais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma numa célula hos- pedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamífero epis- sômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores, nomeadamente vetores de expressão, são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais são ligados de modo operacional. Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinan- te estão frequentemente na forma de plasmídeos (vetores). No entan- to, a presente invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.

[00448] Os vetores de expressão recombinantes da presente inven- ção compreendem um ácido nucleico da presente invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Isto significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para expressão, que estão operacionalmente ligadas à sequência de ácido nucleico a ser expres- sa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operacionalmen- te ligados" destina-se a dizer que a sequência de nucleotídeos de inte-

resse está relacionada com as sequências regulatórias de uma forma que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição e tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O ter- mo "sequência regulatória" se destina a incluir promotores, intensifica- dores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, si- nais de poliadenilação). Essas sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Methods in Enzymology:Gene Expression Technology vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1991). As se- quências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão consti- tutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão da sequência de nu- cleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, se- quências regulatórias específicas de tecido). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser trans- formada, o nível de expressão da proteína desejada e semelhantes. Os vetores de expressão da presente invenção podem ser introduzi- dos nas células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptí- deos, incluindo proteínas de fusão ou peptídeos, codificados por áci- dos nucleicos como aqui descrito.

[00449] Os vetores de expressão recombinantes para uso na pre- sente invenção podem ser projetados para a expressão de um polipep- tídeo correspondente a um marcador da presente invenção em células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou eucarióticas (por exemplo, célu- las de inseto {usando vetores de expressão de baculovírus}, células de levedura ou células de mamíferos). As células hospedeiras adequadas são discutidas posteriormente em Goeddel, supra. Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vi- tro, por exemplo, usando sequências regulatórias do promotor T7 e T7 polimerase.

[00450] A expressão de proteínas em procariotos é mais frequen- temente realizada em E. coli com vetores contendo promotores consti- tutivos ou indutíveis que direcionam a expressão de proteínas de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão adicionam uma série de aminoáci- dos a uma proteína codificada, geralmente ao terminal amino da prote- ína recombinante. Esses vectores de fusão têm tipicamente três finali- dades: 1) aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) aumen- tar a solubilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar na purificação da proteína recombinante agindo como um ligando na purificação por afinidade. Frequentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção da fração de fu- são e a proteína recombinante para permitir a separação da proteína recombinante da fração de fusão subsequente à purificação da proteí- na de fusão. Essas enzimas, e suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina e enteroquinase. Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Bio- labs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)) que fundem glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação à maltose E ou proteína A, respectivamente, à proteína recombinante alvo.

[00451] Exemplos de vetores de expressão de E. coli de não fusão indutíveis adequados incluem pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:301- 315) e pET 11d (Studier et al., p. 60-89, In Gene Expression Techno- logy: Methods in Enzymology vol.185, Academic Press, San Diego, CA, 1991). A expressão de ácido nucleico do biomarcador alvo a par- tir do vetor pTrc depende da transcrição da polimerase de RNA do hospedeiro a partir de um promotor de fusão trp-lac híbrido. A expres- são do ácido nucleico do biomarcador alvo a partir do vetor pET 11d depende da transcrição de um promotor de fusão T7 gn10-lac mediado por uma RNA polimerase viral coexpressa (T7 gn1). Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas hospedeiras BL21 (DE3) ou HMS174 (DE3) de um profago residente que abriga um gene T7 gn1 sob o con- trole transcricional do promotor lacUV 5.

[00452] Uma estratégia para maximizar a expressão da proteína recombinante em E. coli é expressar a proteína em uma bactéria hos- pedeira com capacidade prejudicada de clivar proteoliticamente a pro- teína recombinante (Gottesman, p. 119-128, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Outra estratégia é alterar a sequência de ácido nu- cleico do ácido nucleico a ser inserido em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácido sejam aqueles preferencialmente utilizados em E. coli (Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteração das sequências de ácido nu- cleico da presente invenção pode ser realizada por técnicas de síntese de DNA padrão.

[00453] Em outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em leve- dura S. cerevisiae incluem pYepSec1 (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), e pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA).

[00454] Alternativamente, o vetor de expressão é um vetor de ex- pressão de baculovírus. Os vetores de baculovírus disponíveis para a expressão de proteínas em células de insetos cultivadas (por exemplo, células Sf 9) incluem a série pAc (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39).

[00455] Em ainda outra modalidade, um ácido nucleico da presente invenção é expresso em células de mamífero usando um vetor de ex- pressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840) e pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195). Quando utilizadas em células de ma- míferos, as funções de controle do vetor de expressão são frequente- mente fornecidas por elementos regulatórios virais. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de polioma, Adenovírus 2, citomegalovírus e Vírus Simian 40. Para outros sistemas de expres- são adequados para células procarióticas e eucarióticas, consulte os capítulos 16 e 17 de Sambrook et al., supra.

[00456] Em outra modalidade, o vetor de expressão de mamífero recombinante é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico prefe- rencialmente em um tipo de célula particular (por exemplo, elementos regulatórios específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Os elementos regulatórios específicos de tecido são conhe- cidos na técnica. Exemplos não limitativos de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor de albumina (específico do fígado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores espe- cíficos de linfoides (Calame e Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235- 275), em particular promotores de receptores de células T (Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) e imunoglobulinas (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), promotores específicos de neurônios (por exemplo, o promotor do neu- rofilamento; Byrne and Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916) e promotores específicos da glândula mamária (por exemplo, promotor do soro de leite; Patente U.S.

4.873.316 e Publicação do Pedido Europeu 264.166). Os promotores regulados pelo desenvolvimento também estão incluídos, por exemplo, os promotores hox murinos (Kessel and Gruss, 1990, Science

249:374-379) e o promotor de -fetoproteína (Camper and Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546).

[00457] A presente invenção fornece ainda um vetor de expressão recombinante compreendendo uma molécula de DNA clonada no vetor de expressão em uma orientação antissenso. Isto é, a molécula de DNA está operacionalmente ligada a uma sequência regulatória de um modo que permite a expressão (por transcrição da molécula de DNA) de uma molécula de RNA que é antissenso para o mRNA que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Podem ser escolhidas sequên- cias regulatórias operativamente ligadas a um ácido nucleico clonado na orientação antissenso que direcionam a expressão contínua da mo- lécula de RNA antissenso em uma variedade de tipos de células, por exemplo, promotores e/ou intensificadores virais ou sequências regula- tórias que podem ser escolhidas e dirigem a expressão constitutiva, específica de tecido ou específica de tipo celular de RNA antissenso. O vetor de expressão antissenso pode estar na forma de um plasmí- deo recombinante, fagemídeo ou vírus atenuado no qual os ácidos nu- cleicos antissenso são produzidos sob o controle de uma região regu- latórias de alta eficiência, a atividade da qual pode ser determinada pelo tipo de célula em que o vetor é introduzido. Para uma discussão sobre a regulação da expressão gênica usando genes antisense (ver Weintraub et al., 1986, Trends in Genetics, Vol. 1 (1)).

[00458] Outro aspecto da presente invenção refere-se a células hospedeiras nas quais um vetor de expressão recombinante da pre- sente invenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados de forma intercambiável neste documento. É entendido que tais termos se referem não apenas à cé- lula em questão, mas também à descendência ou descendência po- tencial de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas ge- rações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, essa descendência não pode, de fato, ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo, como utilizado neste documento.

[00459] Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procarióti- ca (por exemplo, E. coli) ou eucariótica (por exemplo, células de inse- to, levedura ou células de mamífero).

[00460] O DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióti- cas ou eucarióticas por meio de técnicas convencionais de transfor- mação ou transfecção. Como utilizado neste documento, os termos "transformação" e "transfecção" destinam-se a se referir a uma varie- dade de técnicas reconhecidas na técnica para a introdução de ácido nucleico estranho em uma célula hospedeira, incluindo coprecipita- ção de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção ou eletroporação. Métodos adequados pa- ra transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encontra- dos em Sambrook, et al. (supra) e outros manuais de laboratório.

[00461] Para a transfecção estável de células de mamífero, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. Para identificar e selecionar esses integran- tes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, para resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecioná- veis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a drogas, como G418, higromicina e metotrexato. As células transfectadas de forma estável com o ácido nucleico introduzido podem ser identifica- das por seleção de drogas (por exemplo, as células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras célu- las morrem). XII. Analisando ácidos nucleicos e polipeptídeos de biomarcador

[00462] Os ácidos nucleicos de biomarcador e/ou polipeptídeos de biomarcador podem ser analisados de acordo com os métodos aqui descritos e técnicas conhecidas pelo versado na técnica para identifi- car essas alterações genéticas ou de expressão úteis para a presente invenção, incluindo, mas não se limitando a: 1) uma alteração no nível de um transcrito ou polipeptídeo de biomarcador, 2) uma deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos de um gene de biomarcador, 4) uma substituição de um ou mais nucleotídeos de um gene de biomar- cador, 5) modificação aberrante de um gene de biomarcador, como uma região regulatória de expressão e semelhantes. a. Métodos para detecção de número de cópia

[00463] Os métodos de avaliação do número de cópias de um ácido nucleico de biomarcador são bem conhecidos pelos versados na téc- nica. A presença ou ausência de ganho ou perda cromossômica pode ser avaliada simplesmente por uma determinação do número de có- pias das regiões ou marcadores aqui identificados.

[00464] Em uma modalidade, uma amostra biológica é testada quanto à presença de alterações no número de cópias em loci genô- micos contendo o marcador genômico. Um número de cópias de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 é preditivo de pior resultado de uma te- rapia com anticorpos anti-HHLA2.

[00465] Os métodos de avaliação do número de cópias de um locus de biomarcador incluem, mas não estão limitados a, ensaios baseados em hibridação. Os ensaios baseados em hibridação incluem, mas não estão limitados a, métodos tradicionais de "sonda direta", como Southern blots, métodos de hibridação in situ (por exemplo, FISH e FISH mais SKY) e métodos de "sonda comparativa", como hibridação genômica comparativa (CGH), por exemplo, CGH baseado em cDNA ou baseado em oligonucleotídeo. Os métodos podem ser usados em uma ampla variedade de formatos, incluindo, mas não se limitando a, métodos ligados a substrato (por exemplo, membrana ou vidro) ou abordagens baseadas em arranjo.

[00466] Numa modalidade, a avaliação do número de cópias do ge- ne de biomarcador em uma amostra envolve um Southern Blot. Em um Southern Blot, o DNA genômico (normalmente fragmentado e separa- do em um gel eletroforético) é hibridado para uma sonda específica para a região alvo. A comparação da intensidade do sinal de hibrida- ção da sonda para a região alvo com o sinal da sonda de controle da análise de DNA genômico normal (por exemplo, uma porção não am- plificada da mesma célula ou célula relacionada, tecido, órgão, etc.) fornece uma estimativa do número de cópias relativas do ácido nuclei- co alvo. Alternativamente, um Northern blot pode ser utilizado para avaliar o número de cópias do ácido nucleico de codificação em uma amostra. Em um Northern blot, o mRNA é hibridado com uma sonda específica para a região alvo. Comparação da intensidade do sinal de hibridação da sonda para a região alvo com o sinal da sonda de con- trole da análise de RNA normal (por exemplo, uma porção não amplifi- cada da mesma célula, tecido ou órgão relacionado, etc.) fornece uma estimativa do número de cópias relativas do ácido nucleico alvo. Alter- nativamente, outros métodos bem conhecidos na técnica para detectar RNA podem ser usados, de modo que a expressão superior ou inferior em relação a um controle apropriado (por exemplo, uma porção não amplificada do mesmo tecido celular ou relacionado, órgão, etc.) for- neça uma estimativa do número de cópias relativas do ácido nucleico alvo.

[00467] Um meio alternativo para determinar o número de cópias genômicas é a hibridação in situ (por exemplo, Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649). Geralmente, a hibridação in situ compreende as seguintes etapas: (1) fixação do tecido ou estrutura biológica a ser analisada; (2) tratamento de pré-hibridação da estrutura biológica para aumentar a acessibilidade do DNA alvo e para reduzir a ligação não específica; (3) hibridar a mistura de ácidos nucleicos com o ácido nu- cleico na estrutura biológica ou tecido; (4) lavagens pós-hibridação pa- ra remover fragmentos de ácido nucleico não ligados na hibridação e (5) detecção dos fragmentos de ácido nucleico hibridados. O reagente usado em cada uma dessas etapas e as condições de uso variam de- pendendo da aplicação específica. Em um ensaio típico de hibridação in situ, as células são fixadas a um suporte sólido, normalmente uma lâmina de vidro. Se um ácido nucleico deve ser sondado, as células são normalmente desnaturadas com calor ou álcalis. As células são então colocadas em contato com uma solução de hibridação a uma temperatura moderada para permitir o emparelhamento de sondas marcadas específicas para a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína. Os alvos (por exemplo, células) são então tipicamente la- vados com um rigor predeterminado ou com um rigor crescente até que uma razão sinal/ruído apropriada seja obtida. As sondas são tipi- camente marcadas, por exemplo, com radioisótopos ou repórteres flu- orescentes. Em uma modalidade, as sondas são suficientemente lon- gas para hibridar especificamente com o(s) ácido(s) nucleico(s) alvo sob condições rigorosas. As sondas geralmente variam em compri- mento de cerca de 200 bases a cerca de 1000 bases. Em algumas aplicações, é necessário bloquear a capacidade de hibridação de se- quências repetitivas. Assim, em algumas modalidades, tRNA, DNA ge- nômico humano ou DNA Cot-I é usado para bloquear a hibridação não específica.

[00468] Um meio alternativo para determinar o número de cópias genômicas é a hibridação genômica comparativa. Em geral, o DNA genômico é isolado de células de referência normais, bem como de células de teste (por exemplo, células tumorais) e amplificado, se ne- cessário. Os dois ácidos nucleicos são marcados diferencialmente e, em seguida, hibridados in situ com cromossomos metafásicos de uma célula de referência.

As sequências repetitivas em ambos os DNAs de referência e teste são removidas ou sua capacidade de hibridação é reduzida por alguns meios, por exemplo, por pré-hibridação com áci- dos nucleicos de bloqueio apropriados e/ou incluindo tais sequências de ácido nucleico de bloqueio para as referidas sequências repetitivas durante a referida hibridação.

As sequências de DNA marcadas e liga- das são então renderizadas em uma forma visualizável, se necessário.

As regiões cromossômicas nas células de teste que estão com um número de cópias aumentado ou diminuído podem ser identificadas detectando as regiões onde a razão do sinal dos dois DNAs é alterada.

Por exemplo, aquelas regiões que diminuíram no número de cópias nas células de teste mostrarão um sinal relativamente mais baixo do DNA de teste do que a referência em comparação com outras regiões do genoma.

As regiões que aumentaram em número de cópias nas células de teste mostrarão um sinal relativamente mais alto do DNA de teste.

Onde houver deleções ou multiplicações cromossômicas, as di- ferenças na razão dos sinais dos dois marcadores serão detectadas e a razão fornecerá uma medida do número de cópias.

Em outra moda- lidade de CGH, o arranjo de CGH (aCGH), o elemento cromossômico imobilizado é substituído por uma coleção de ácidos nucleicos alvo ligados a um suporte sólido em um arranjo, permitindo que uma por- centagem grande ou completa do genoma seja representada na cole- ção de alvos ligados ao suporte sólido.

Os ácidos nucleicos alvo po- dem compreender cDNAs, DNAs genômicos, oligonucleotídeos (por exemplo, para detectar polimorfismos de nucleotídeo único) e seme- lhantes.

CGH baseado em arranjo também pode ser realizado com marcação de cor única (em oposição a marcar o controle e a possível amostra de tumor com dois corantes diferentes e misturá-los antes da hibridação, o que produzirá uma razão devido à hibridação competitiva de sondas nos arranjos). Em CGH de cor única, o controle é marcado e hibridado em um arranjo e os sinais absolutos são lidos, e a possível amostra de tumor é marcada e hibridada em um segundo arranjo (com conteúdo idêntico) e os sinais absolutos são lidos. A diferença do nú- mero de cópias é calculada com base nos sinais absolutos dos dois arranjos. Métodos de preparação de cromossomos ou arranjos imobili- zados e realização de hibridação genômica comparativa são bem co- nhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. 6.335.167;

6.197.501; 5.830.645; e 5,665,549 e Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; Pub. EPO 430.402; Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994), etc.) Em outra modalidade, o protocolo de hibridação de Pin- kel, et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211, or of Kallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992) é utilizado.

[00469] Ainda em outra modalidade, ensaios baseados em amplifi- cação podem ser usados para medir o número de cópias. Em tais en- saios baseados em amplificação, as sequências de ácido nucleico atuam como um modelo em uma reação de amplificação (por exemplo, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Em uma amplificação quan- titativa, a quantidade de produto de amplificação será proporcional à quantidade de modelo na amostra original. A comparação com contro- les apropriados, por exemplo, tecido saudável, fornece uma medição do número de cópias.

[00470] Os métodos de amplificação "quantitativa" são bem conhe- cidos pelos versados na técnica. Por exemplo, PCR quantitativa envol- ve simultaneamente coamplificar uma quantidade conhecida de uma sequência de controle usando os mesmos iniciadores. Isso fornece um padrão interno que pode ser usado para calibrar a reação de PCR. Protocolos detalhados para PCR quantitativo são fornecidos em Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications,

Academic Press, Inc. N.Y.). A medição do número de cópias de DNA em loci de microssatélite usando análise de PCR quantitativa é descri- ta em Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60:5405-5409. A se- quência de ácido nucleico conhecida para os genes é suficiente para permitir que um versado na técnica selecione rotineiramente iniciado- res para amplificar qualquer porção do gene. A PCR quantitativa fluo- rogênica também pode ser usada nos métodos da presente invenção. Na PCR quantitativa fluorogênica, a quantificação é baseada na quan- tidade de sinais de fluorescência, por exemplo, TaqMan e SYBR green.

[00471] Outros métodos de amplificação adequados incluem, mas não estão limitados a, reação em cadeia da ligase (LCR) (ver Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077, and Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), amplificação da transcrição (Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), replicação de sequência autossustentada (Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874), PCR dot e PCR de adaptador de ligan- te, etc.

[00472] Perda de heterozigosidade (LOH) e mapeamento da pro- porção de cópias principais (MCP) (Wang, ZC, et al. (2004) Cancer Res 64(1):64-71; Seymour, A. B., et al. (1994) Cancer Res 54, 2761-4; Hahn, S. A., et al. (1995) Cancer Res 55, 4670-5; Kimura, M., et al. (1996) Genes Chromosomes Cancer 17, 88-93; Li et al., (2008) MBC Bioinform. 9, 204-219) também pode ser usado para identificar regiões de amplificação ou deleção. b. Métodos para detecção de expressão de ácido nucleico de biomar- cador

[00473] A expressão do biomarcador pode ser avaliada por qual- quer um de uma ampla variedade de métodos bem conhecidos para detectar a expressão de uma molécula ou proteína transcrita. Exem-

plos não limitativos de tais métodos incluem métodos imunológicos para detecção de proteínas secretadas, de superfície celular, cito- plasmáticas ou nucleares, métodos de purificação de proteínas, ensai- os de função ou atividade de proteínas, métodos de hibridação de áci- dos nucleicos, métodos de transcrição reversa de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de ácidos nucleicos.

[00474] Em modalidades preferidas, a atividade de um determinado gene é caracterizada por uma medição de transcrição do gene (por exemplo, mRNA), por uma medição da quantidade de proteína tradu- zida ou por uma medição da atividade do produto de gene. A expres- são do marcador pode ser monitorada de várias maneiras, incluindo a detecção de níveis de mRNA, níveis de proteína ou atividade de prote- ína, qualquer uma das quais pode ser medida usando técnicas padrão. A detecção pode envolver a quantificação do nível de expressão do gene (por exemplo, DNA genômico, cDNA, mRNA, proteína ou ativida- de enzimática), ou, alternativamente, pode ser uma avaliação qualitati- va do nível de expressão do gene, em particular em comparação com um nível de controle. O tipo de nível detectado ficará claro no contexto.

[00475] Em outra modalidade, detectar ou determinar os níveis de expressão de um biomarcador e homólogos funcionalmente semelhan- tes do mesmo, incluindo um fragmento ou alteração genética do mes- mo (por exemplo, em regiões regulatórias ou promotoras do mesmo) compreende detectar ou determinar os níveis de RNA para o marcador de interesse. Em uma modalidade, uma ou mais células do indivíduo a ser testado são obtidas e o RNA é isolado das células. Numa modali- dade preferida, é obtida uma amostra de células do tecido mamário do indivíduo.

[00476] Em uma modalidade, o RNA é obtido a partir de uma única célula. Por exemplo, uma célula pode ser isolada de uma amostra de tecido por microdissecção de captura a laser (LCM). Usando esta téc-

nica, uma célula pode ser isolada de uma seção de tecido, incluindo uma seção de tecido corado, garantindo assim que a célula desejada seja isolada (ver, por exemplo, Bonner et al. (1997) Science 278: 1481; Emmert-Buck et al. (1996) Science 274:998; Fend et al. (1999) Am. J. Path. 154: 61 and Murakami et al. (2000) Kidney Int. 58:1346). Por exemplo, Murakami et al., supra, descrevem o isolamento de uma cé- lula de uma seção de tecido previamente imunomarcada.

[00477] Também é possível obter células de um indivíduo e cultivar as células in vitro, de modo a obter uma população maior de células das quais o RNA pode ser extraído. Métodos para estabelecer culturas de células não transformadas, isto é, culturas de células primárias, são conhecidos na técnica.

[00478] Ao isolar o RNA de amostras de tecido ou células de indiví- duos, pode ser importante prevenir quaisquer outras alterações na ex- pressão do gene após o tecido ou células terem sido removidos do in- divíduo. Mudanças nos níveis de expressão são conhecidos por mudar rapidamente após perturbações, por exemplo, choque térmico ou ati- vação com lipopolissacarídeo (LPS) ou outros reagentes. Além disso, o RNA no tecido e nas células pode se degradar rapidamente. Conse- quentemente, numa modalidade preferida, o tecido ou células obtidos de um indivíduo são congelados o mais rapidamente possível.

[00479] O RNA pode ser extraído da amostra de tecido por uma va- riedade de métodos, por exemplo, a lise de tiocianato de guanídio se- guida por centrifugação de CsCl (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299). O RNA de células individuais pode ser obtido confor- me descrito em métodos para a preparação de bibliotecas de cDNA de células individuais, tais como aqueles descritos em Dulac, C. (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36, 245 and Jena et al. (1996) J. Immunol. Me- thods 190:199. Deve-se tomar cuidado para evitar a degradação do RNA, por exemplo, pela inclusão de RNAsina.

[00480] A amostra de RNA pode então ser enriquecida em espécies particulares. Em uma modalidade, pol(A)+ RNA é isolado da amostra de RNA. Em geral, essa purificação tira vantagem das caudas poli-A do mRNA. Em particular e como observado acima, os oligonucleotí- deos poli-T podem ser imobilizados em um suporte sólido para servir como ligandos de afinidade para mRNA. Kits para esse fim estão dis- poníveis comercialmente, por exemplo, o kit MessageMaker (Life Technologies, Grand Island, NY).

[00481] Numa modalidade preferida, a população de RNA é enri- quecida em sequências de marcador. O enriquecimento pode ser rea- lizado, por exemplo, por síntese de cDNA específica de iniciador ou múltiplas rodadas de amplificação linear com base na síntese de cDNA e transcrição in vitro dirigida por modelo (ver, por exemplo, Wang et al. (1989) PNAS 86, 9717; Dulac et al., supra, and Jena et al., supra).

[00482] A população de RNA, enriquecida ou não em espécies ou sequências particulares, pode ser posteriormente amplificada. Con- forme definido neste documento, um "processo de amplificação" é pro- jetado para fortalecer, aumentar ou ampliar uma molécula dentro do RNA. Por exemplo, onde o RNA é mRNA, um processo de amplifica- ção como RT-PCR pode ser utilizado para amplificar o mRNA, de mo- do que um sinal seja detectável ou a detecção seja intensificada. Tal processo de amplificação é benéfico, particularmente quando a amos- tra biológica, de tecido ou de tumor é de um tamanho ou volume pe- queno.

[00483] Vários métodos de amplificação e detecção podem ser usados. Por exemplo, está dentro do âmbito da presente invenção transcrever reversamente o mRNA em cDNA seguido pela reação em cadeia da polimerase (RT-PCR); ou, para usar uma única enzima para ambas as etapas, conforme descrito na Pat. U.S. 5.322.770, ou trans- crever reversamente mRNA em cDNA seguido por reação em cadeia da ligase gap simétrica (RT-AGLCR) como descrito por R. L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994). PCR em tempo real também pode ser usada.

[00484] Outros métodos de amplificação conhecidos que podem ser utilizados neste documento incluem, mas não estão limitados à técnica denominada "NASBA" ou "3SR" descrita em PNAS USA 87:1874-1878 (1990) e também descrita em Nature 350 (No. 6313): 91-92 (1991); Amplificação de Q-beta amplification as described in published Euro- pean Patent Application (EPA) No. 4544610; amplificação por deslo- camento de fita (conforme descrito em GT Walker et al., Clin. Chem. 42:9-13 (1996) e Pedido de Patente Europeia 684315; amplificação mediada por alvo, conforme descrito pela Publicação PCT WO9322461; PCR; reação em cadeia da ligase (LCR) (ver, por exem- plo, Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Sci- ence 241, 1077 (1988)); replicação de sequência autossustentada (SSR) (ver, por exemplo, Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)); e amplificação da transcrição (ver, por exemplo, Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)).

[00485] Muitas técnicas são conhecidas no estado da técnica para determinar os níveis absolutos e relativos de expressão de genes, téc- nicas comumente usadas adequadas para uso na presente invenção incluem análise de Northern, ensaios de proteção de RNase (RPA), microarranjos e técnicas baseadas em PCR, tais como PCR quantitati- va e PCR de exibição diferencial. Por exemplo, Northern blotting en- volve executar uma preparação de RNA em um gel de agarose desna- turante e sua transferência para um suporte adequado, como celulose ativada, nitrocelulose ou vidro ou membranas de nylon. O cDNA ou RNA radiomarcado é então hibridado com a preparação, lavado e ana- lisado por autorradiografia.

[00486] A visualização de hibridaçãoin situ também pode ser em-

pregada, em que uma sonda de RNA antissenso marcada radioativa- mente é hibridada com uma seção fina de uma amostra de biópsia, lavada, clivada com RNase e exposta a uma emulsão sensível para autorradiografia. As amostras podem ser coradas com hematoxilina para demonstrar a composição histológica da amostra, e o imagea- mento em campo escuro com um filtro de luz adequado mostra a emulsão desenvolvida. Marcadores não radioativos, como digoxigeni- na, também podem ser usados.

[00487] Alternativamente, a expressão de mRNA pode ser detecta- da em um arranjo de DNA, chip ou microarranjo. Os ácidos nucleicos marcados de uma amostra de teste obtida de um indivíduo podem ser hibridados com uma superfície sólida compreendendo biomarcador de DNA. O sinal de hibridação positivo é obtido com a amostra contendo transcritos de biomarcadores. Os métodos de preparação de arranjos de DNA e seu uso são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. 6.618.6796; 6.379.897; 6.664.377; 6.451.536; 548.257; US 20030157485 e Schena et al. (1995) Science 20, 467-470; Gerhold et al. (1999) Trends In Biochem. Sci. 24, 168-173; and Lennon et al. (2000) Drug Discovery Today 5, 59-65, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade). A análise em série da expressão de ge- nes (SAGE) também pode ser realizada (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US 20030215858).

[00488] Para monitorar os níveis de mRNA, por exemplo, o mRNA é extraído da amostra biológica a ser testada, transcrita reversamente e sondas de cDNA marcadas com fluorescência são geradas. Os micro- arranjos capazes de hibridar com o cDNA marcador são então sonda- dos com as sondas de cDNA marcadas, as lâminas escaneadas e a intensidade de fluorescência medida. Esta intensidade se correlaciona com a intensidade de hibridação e níveis de expressão.

[00489] Os tipos de sondas que podem ser utilizados nos métodos aqui descritos incluem cDNA, ribossondas, oligonucleotídeos sintéticos e sondas genômicas. O tipo de sonda utilizada será geralmente ditado pela situação particular, tal como ribossondas para hibridação in situ e cDNA para Northern blotting, por exemplo. Em uma modalidade, a sonda é direcionada para regiões de nucleotídeos únicas para o RNA. As sondas podem ser tão curtas quanto necessário para reconhecer diferencialmente os transcritos de marcadores de mRNA, e podem ser tão curtas quanto, por exemplo, 15 bases; no entanto, podem ser utili- zadas sondas de pelo menos 17, 18, 19 ou 20 ou mais bases. Em uma modalidade, os iniciadores e as sondas hibridam especificamente sob condições rigorosas com um fragmento de DNA possuindo a sequên- cia de nucleotídeos correspondente ao marcador. Como utilizado nes- te documento, o termo "condições rigorosas" significa que a hibridação ocorrerá apenas se houver pelo menos 95% de identidade nas se- quências de nucleotídeos. Em outra modalidade, a hibridação em "condições rigorosas" ocorre quando há pelo menos 97% de identida- de entre as sequências.

[00490] A forma de marcação das sondas pode ser qualquer que 32 35 seja apropriada, como o uso de radioisótopos, por exemplo, Pe S. A marcação com radioisótopos pode ser alcançada, seja a sonda sin- tetizada quimicamente ou biologicamente, pelo uso de bases adequa- damente marcadas.

[00491] Em uma modalidade, a amostra biológica contém molécu- las de polipeptídeo do indivíduo de teste. Alternativamente, a amostra biológica pode conter moléculas de mRNA do indivíduo de teste ou moléculas de DNA genômico do indivíduo de teste.

[00492] Em outra modalidade, os métodos envolvem ainda obter uma amostra biológica de controle de um indivíduo de controle, conta- tando a amostra de controle com um composto ou agente capaz de detectar polipeptídeo de marcador, mRNA, DNA genômico ou frag-

mentos dos mesmos, de modo que a presença do polipeptídeo de marcador, mRNA, DNA genômico ou fragmentos dos mesmos, é de- tectado na amostra biológica e comparando a presença do polipeptí- deo de marcador, mRNA, DNA genômico ou fragmentos dos mesmos, na amostra de controle com a presença do polipeptídeo de marcador, mRNA, genômico DNA, ou fragmentos dos mesmos na amostra de teste. c. Métodos para detecção da expressão de proteínas de biomarcadores

[00493] A atividade ou nível de uma proteína de biomarcador pode ser detectada e/ou quantificada pela detecção ou quantificação do po- lipeptídeo expresso. O polipeptídeo pode ser detectado e quantificado por qualquer um de vários meios bem conhecidos pelos versados na técnica. Níveis aberrantes de expressão de polipeptídeo dos polipeptí- deos codificados por um ácido nucleico de biomarcador e homólogos funcionalmente semelhantes dos mesmos, incluindo um fragmento ou alteração genética do mesmo (por exemplo, em regiões regulatórias ou promotoras dos mesmos) estão associados com a probabilidade de resposta de um câncer para a terapia de anticorpo anti-HHLA2. Qual- quer método conhecido na técnica para detectar polipeptídeos pode ser usado. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, imunodi- fusão, imunoeletroforese, radioimunoensaio (RIA), ensaios imunossor- ventes ligados à enzima (ELISAs), ensaios de imunofluorescência, Western blotting, ensaios de aglutinante-ligante, técnicas de imuno- histoquímica, aglutinação, ensaios de complemento, cromatografia lí- quida de alta performance (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão e semelhantes (por exemplo, Ba- sic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991 que é incorporado por referência). São preferidos os métodos de imunoensaio de aglutinante-ligante in-

cluindo a reação de anticorpos com um epítopo ou epítopos e o deslo- camento competitivo de um polipeptídeo marcado ou derivado dos mesmos. Em certas modalidades, os anticorpos listados na tabela 2 são usados para detectar e/ou quantificar os biomarcadores listados na tabela 1.

[00494] Por exemplo, os procedimentos de ELISA e RIA podem ser realizados de modo que um padrão de proteína de biomarcador dese- 125 35 jado seja marcado (com um radioisótopo, como I ou S, ou uma en- zima testável, como peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) e, jun- tamente com a amostra não marcada, colocado em contato com o an- ticorpo correspondente, em que um segundo anticorpo é usado para ligar o primeiro e a radioatividade ou a enzima imobilizada testada (teste competitivo). Alternativamente, a proteína de biomarcador na amostra pode reagir com o anticorpo imobilizado correspondente, o anticorpo antibiomarcador da proteína marcado com radioisótopo ou enzima pode reagir com o sistema e a radioatividade ou a enzima tes- tada (ensaio ELISA-sanduíche). Outros métodos convencionais tam- bém podem ser usados conforme adequado. As técnicas acima podem ser conduzidas essencialmente como um ensaio de "uma etapa" ou "duas etapas". Um ensaio de "uma etapa" envolve contatar o antígeno com o anticorpo imobilizado e, sem lavagem, contatar a mistura com o anticorpo marcado. Um ensaio de "duas etapas" envolve a lavagem antes do contato da mistura com o anticorpo marcado. Outros métodos convencionais também podem ser usados conforme adequado.

[00495] Em uma modalidade, um método para medir os níveis de proteína de biomarcador compreende as etapas de: contatar uma amostra biológica com um anticorpo ou variante (por exemplo, frag- mento) do mesmo que se liga seletivamente à proteína de biomarca- dor e detectar se o referido anticorpo ou variante do mesmo está liga-

do à referida amostra e, assim, medir os níveis da proteína de biomar- cador.

[00496] Enzimática e radiomarcação de proteína de biomarcador e/ou os anticorpos podem ser efetuadas por meios convencionais. Es- ses meios geralmente incluirão a ligação covalente da enzima ao antí- geno ou ao anticorpo em questão, como por glutaraldeído, especifica- mente de modo a não afetar adversamente a atividade da enzima, o que significa que a enzima ainda deve ser capaz de interagir com seu substrato, embora não seja necessário que toda a enzima seja ativa, desde que o suficiente permaneça ativo para permitir que o ensaio se- ja realizado. De fato, algumas técnicas de ligação da enzima são ines- pecíficas (como o uso de formaldeído) e só produzirão uma proporção da enzima ativa.

[00497] Normalmente é desejável imobilizar um componente do sis- tema de ensaio em um suporte, permitindo assim que outros compo- nentes do sistema sejam colocados em contato com o componente e prontamente removidos sem trabalho laborioso e demorado. É possí- vel que uma segunda fase seja imobilizada longe da primeira, mas ge- ralmente uma fase é suficiente.

[00498] É possível imobilizar a enzima propriamente dita em um suporte, mas se for necessária uma enzima em fase sólida, isso ge- ralmente é melhor alcançado através da ligação ao anticorpo e da fi- xação do anticorpo em um suporte, modelos e sistemas pelos quais são bem conhecidos na técnica. O polietileno simples pode fornecer um suporte adequado.

[00499] As enzimas utilizáveis para marcação não são particular- mente limitadas, mas podem ser selecionadas dos membros do grupo oxidase, por exemplo. Estes catalisam a produção de peróxido de hi- drogênio por reação com seus substratos, e a glicose oxidase é fre- quentemente utilizada por sua boa estabilidade, facilidade de disponi-

bilidade e baixo custo, bem como disponibilidade imediata de seu substrato (glicose). A atividade da oxidase pode ser avaliada medindo a concentração de peróxido de hidrogênio formado após a reação do anticorpo marcado com enzima com o substrato sob condições contro- ladas bem conhecidas na técnica.

[00500] Outras técnicas podem ser usadas para detectar a proteína do biomarcador de acordo com a preferência do médico com base na presente divulgação. Uma dessas técnicas é Western blotting (Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)), em que uma amostra tra- tada adequadamente é passada em um gel de SDS-PAGE antes de ser transferida para um suporte sólido, como um filtro de nitrocelulose. Os anticorpos de proteína antibiomarcador (não marcados) são então colocados em contato com o suporte e testados por um reagente imu- nológico secundário, como proteína A marcada ou anti-imunoglobulina 125 (marcadores adequados incluindo I, peroxidase de rábano e fosfa- tase alcalina). A detecção cromatográfica também pode ser usada.

[00501] A imuno-histoquímica pode ser usada para detectar a ex- pressão de proteína de biomarcador, por exemplo, em uma amostra de biópsia. Um anticorpo adequado é colocado em contato com, por exemplo, uma fina camada de células, lavado e depois contatado com um segundo anticorpo marcado. A marcação pode ser por marcadores fluorescentes, enzimas, como peroxidase, avidina ou radiomarcação. O ensaio é pontuado visualmente, usando microscopia.

[00502] Anticorpos de proteína antibiomarcador (por exemplo, lista- dos na tabela 2), como intracorpos, também podem ser usados para fins de imageamento, por exemplo, para detectar a presença de prote- ína de biomarcador em células e tecidos de um indivíduo. Os marca- dores adequados incluem radioisótopos, iodo (125I, 121 I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (112In), e tecnécio (99mTc), marcadores fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, e biotina.

[00503] Para fins de imageamento in vivo, os anticorpos não são detectáveis, como tal, de fora do corpo e, portanto, devem ser marca- dos ou modificados de outra forma para permitir a detecção. Marcado- res para este fim podem ser aqueles que não interferem substancial- mente na ligação do anticorpo, mas que permitem a detecção externa. Os marcadores adequados podem incluir aqueles que podem ser de- tectados por radiografia X, NMR ou MRI. Para técnicas radiográficas, os marcadores adequados incluem qualquer radioisótopo que emita radiação detectável, mas que não seja abertamente prejudicial ao indi- víduo, como bário ou césio, por exemplo. Os marcadores adequados para NMR e MRI geralmente incluem aqueles com um spin caracterís- tico detectável, como deutério, que pode ser incorporado no anticorpo por marcação adequada de nutrientes para o hibridoma relevante, por exemplo.

[00504] O tamanho do indivíduo e o sistema de imageamento utili- zado determinarão a quantidade de fração de imageamento necessá- ria para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma fração de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioativida- de injetada irá normalmente variar de cerca de 5 a 20 milicuries de tecnécio-99. O anticorpo ou fragmento de anticorpo marcado irá então se acumular preferencialmente na localização das células que contêm proteína de biomarcador. O anticorpo ou fragmento de anticorpo mar- cado pode então ser detectado usando técnicas conhecidas.

[00505] Os anticorpos que podem ser usados para detectar a prote- ína de biomarcador incluem qualquer anticorpo (por exemplo, listado na tabela 2), seja natural ou sintético, de comprimento total ou um fra- gmento do mesmo, monoclonal ou policlonal, que se liga suficiente- mente forte e especificamente à proteína de biomarcador a ser detec- tada. Um anticorpo pode ter uma Kd de no máximo cerca de 10-6M, 10- 7 M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M. A frase "liga especificamente"

refere-se à ligação de, por exemplo, um anticorpo a um epítopo ou an- tígeno ou determinante antigênico de tal maneira que a ligação possa ser deslocada ou competir com uma segunda preparação de epítopo, antígeno ou determinante antigênico idêntico ou semelhante. Um anti- corpo pode se ligar preferencialmente à proteína de biomarcador em relação a outras proteínas, tais como proteínas relacionadas.

[00506] Os anticorpos estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00507] Os anticorpos e derivados dos mesmos que podem ser usados abrangem anticorpos policlonais ou monoclonais, quiméricos, humanos, humanizados, primatizados (enxertados com CDR), folhea- dos ou de cadeia simples, bem como fragmentos funcionais, isto é, fragmentos de ligação de proteínas de biomarcador, de anticorpos. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de se ligar a uma proteína de biomarcador ou porções das mesmas, incluindo, mas não se limi- tando a, fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2 podem ser usados. Esses fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por téc- nicas recombinantes. Por exemplo, a clivagem com papaína ou pepsi- na pode gerar fragmentos Fab ou F(ab')2, respectivamente. Outras proteases com a especificidade de substrato necessária também po- dem ser usadas para gerar fragmentos Fab ou F(ab')2. Os anticorpos também podem ser produzidos em uma variedade de formas trunca- das usando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons de pa- rada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção da cadeia pe- sada F(ab')2 pode ser projetado para incluir sequências de DNA que codificam o CH, domínio e região de dobradiça da cadeia pesada.

[00508] Anticorpos sintéticos e projetados são descritos em, por exemplo, Cabilly et al., Pat. U.S. 4.816.567 Cabilly et al., Patente Eu- ropeia 0.125.023 B1; Boss et al., Pat. U.S. 4.816.397; Boss et al., Pa-

tente Europeia 0.120.694 B1; Neuberger, MS et al., WO 86/01533; Neuberger, MS et al., Patente Europeia 0.194.276 B1; Winter, Pat. U.S. 5.225.539; Winter, Patente Europeia 0.239.400 B1; Queen et al., Patente Europeia 0451216 B1; e Padlan, EA et al., EP 0519596 A1. Ver também Newman, R. et al., BioTechnology, 10:1455-1460 (1992), a respeito do anticorpo primatizado, e Ladner et al., Pat. U.S.

4.946.778 e Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426 (1988)) sobre anti- corpos de cadeia simples. Também podem ser usados anticorpos pro- duzidos a partir de uma biblioteca, por exemplo, biblioteca de exibição de fago.

[00509] Em algumas modalidades, são usados agentes que se li- gam especificamente a uma proteína de biomarcador diferente de an- ticorpos, como os peptídeos. Os peptídeos que se ligam especifica- mente a uma proteína de biomarcador podem ser identificados por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, aglutinantes de peptídeo específicos de uma proteína de biomarcador podem ser ras- treados para o uso de bibliotecas de exibição de fago de peptídeo. d. Métodos para detecção de alterações estruturais de biomarcadores

[00510] Os seguintes métodos ilustrativos podem ser usados para identificar a presença de uma alteração estrutural em um ácido nuclei- co de biomarcador e/ou molécula de polipeptídeo de biomarcador a fim de, por exemplo, identificar HHLA2, TMIGD2, KIR3DL3 que são supe- rexpressos, superfuncionais e semelhantes.

[00511] Em certas modalidades, a detecção da alteração envolve utilizar uma sonda/iniciador em uma reação em cadeia da polimerase (PCR) (ver, por exemplo, Patente U.S. 4.683.195 e 4.683.202), como PCR âncora ou PCR RACE, ou, alternativamente, em uma reação em cadeia da ligação (LCR) (ver, por exemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), o último dos quais pode ser particularmente útil para a detecção de mutações pontuais em um ácido nucleico de bio- marcador, como um gene de biomarcador (ver Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Este método pode incluir as etapas de coletar uma amostra de células de um indivíduo, isolar ácido nu- cleico (por exemplo, genômico, mRNA ou ambos) das células da amostra, contatar a amostra de ácido nucleico com um ou mais inicia- dores que hibridam especificamente com um gene do biomarcador sob condições tais que a hibridação e amplificação do gene de biomarca- dor (se presente) ocorram, e detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, ou detectar o tamanho do produto de amplifi- cação e comparar o comprimento com uma amostra de controle. Ante- cipa-se que PCR e/ou LCR pode ser desejável para uso como uma etapa de amplificação preliminar em conjunto com qualquer uma das técnicas utilizadas para detectar mutações aqui descritas.

[00512] Métodos de amplificação alternativos incluem: replicação de sequência autossustentada (Guatelli, JC et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh, D.Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi, P. M. et al. (1988) Bio-Technology 6:1197), ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conheci- das dos versados na técnica. Estes esquemas de detecção são espe- cialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estiverem presentes em números muito baixos.

[00513] Numa modalidade alternativa, mutações em um ácido nu- cleico de biomarcador de uma célula de amostra podem ser identifica- das por alterações nos padrões de clivagem da enzima de restrição. Por exemplo, o DNA da amostra e do controle é isolado, amplificado (opcionalmente), digerido com uma ou mais endonucleases de restri- ção e os tamanhos dos fragmentos são determinados por eletroforese em gel e comparados. As diferenças nos tamanhos de comprimento dos fragmentos entre a amostra e o DNA de controle indicam muta- ções no DNA da amostra. Além disso, o uso de ribozimas específicas de sequência (ver, por exemplo, Pat. U.S. 5.498.531) pode ser usado para pontuar quanto à presença de mutações específicas por desen- volvimento ou perda de um sítio de clivagem de ribozima.

[00514] Em outras modalidades, as mutações genéticas no ácido nucleico de biomarcador podem ser identificadas pela hibridação de uma amostra e ácidos nucleicos de controle, por exemplo, DNA ou RNA, para arranjos de alta densidade contendo centenas ou milhares de sondas de oligonucleotídeo (Cronin, M.T. et al. (1996) Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nat. Med. 2:753-759). Por exem- plo, mutações genéticas de biomarcadores podem ser identificadas em arranjos bidimensionais contendo sondas de DNA geradas por luz, conforme descrito em Cronin et al. (1996) supra. Resumidamente, um primeiro arranjo de hibridação de sondas pode ser usada para fazer a varredura através de longos trechos de DNA em uma amostra e con- trole para identificar mudanças de base entre as sequências, criando arranjos lineares de sondas sequenciais sobrepostas. Esta etapa per- mite a identificação de mutações pontuais. Esta etapa é seguida por um segundo arranjo de hibridação que permite a caracterização de mutações específicas usando arranjos de sondas especializadas me- nores, complementares a todas as variantes ou mutações detectadas. Cada arranjo de mutação é composto por conjuntos de sondas parale- las, uma complementar ao gene do tipo selvagem e outra complemen- tar ao gene mutante. Essas mutações genéticas de biomarcadores podem ser identificadas em uma variedade de contextos, incluindo, por exemplo, linhagem germinativa e mutações somáticas.

[00515] Em ainda outra modalidade, qualquer uma de uma varieda- de de reações de sequenciamento conhecidas na técnica pode ser usada para sequenciar diretamente um gene de biomarcador e detec- tar mutações comparando a sequência do biomarcador de amostra com a sequência do tipo selvagem (controle) correspondente. Exem- plos de reações de sequenciamento incluem aquelas baseadas em técnicas desenvolvidas por Maxam e Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560 ou Sanger (1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74:5463. Também é contemplado que qualquer um de uma variedade de proce- dimentos de sequenciamento automatizado pode ser utilizado ao reali- zar os ensaios de diagnóstico (Naeve (1995) Biotechniques 19:448- 53), incluindo sequenciamento por espectrometria de massa (ver, por exemplo, Publicação Internacional PCT WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; and Griffin et al. (1993) Appl. Bi- ochem. Biotechnol. 38:147-159).

[00516] Outros métodos para detectar mutações em um gene de biomarcador incluem métodos em que a proteção de agentes de cliva- gem é usada para detectar bases incompatíveis em heteroduplexes de RNA/RNA ou RNA/DNA (Myers et al. (1985) Science 230:1242). Em geral, a técnica da técnica de "clivagem de incompatibilidade" começa fornecendo heteroduplexes formados por RNA ou DNA hibridado (marcado) contendo a sequência de biomarcadores do tipo selvagem com RNA ou DNA potencialmente mutante obtido a partir de uma amostra de tecido. Os duplexes de fita dupla são tratados com um agente que cliva regiões de fita simples do duplex, como as que existi- rão devido a incompatibilidades de pares de bases entre as fitas de controle e de amostra. Por exemplo, duplex de RNA/DNA podem ser tratados com RNase e híbridos de DNA/DNA tratados com nuclease SI para digerir enzimaticamente as regiões incompatíveis. Em outras mo- dalidades, os duplexes de DNA/DNA ou RNA/DNA podem ser tratados com hidroxilamina ou tetróxido de ósmio e com piperidina a fim de di- gerir regiões incompatíveis. Após a digestão das regiões incompatí-

veis, o material resultante é então separado por tamanho em géis de poliacrilamida desnaturante para determinar o sítio da mutação. Ver, por exemplo, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397 and Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. Em uma modalidade preferida, o DNA ou RNA de controle pode ser marcado para detecção.

[00517] Em ainda outra modalidade, a reação de clivagem de in- compatibilidade emprega uma ou mais proteínas que reconhecem pa- res de bases incompatíveis em DNA de fita dupla (as chamadas enzi- mas de "reparo de incompatibilidade de DNA") em sistemas definidos para detectar e mapear mutações pontuais em cDNAs de biomarcado- res obtidos de amostras de células. Por exemplo, a enzima mutY de E. coli cliva A em incompatibilidades G/A e a timidina DNA glicosilase de células HeLa cliva T em incompatibilidades G/T (Hsu et al. (1994) Car- cinogenesis 15:1657-1662). De acordo com uma modalidade exempli- ficativa, uma sonda com base em uma sequência de biomarcador, por exemplo, um biomarcador de tipo selvagem tratado com uma enzima de reparo de incompatibilidade de DNA, e os produtos de clivagem, se houver, podem ser detectados a partir de protocolos de eletroforese ou semelhantes (por exemplo, Pat. U.S. 5.459.039.)

[00518] Em outras modalidades, alterações na mobilidade eletrofo- rética podem ser usadas para identificar mutações nos genes de bio- marcadores. Por exemplo, o polimorfismo de conformação de fita sim- ples (SSCP) pode ser usado para detectar diferenças na mobilidade eletroforética entre ácidos nucleicos mutantes e de tipo selvagem (Ori- ta et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766; ver também Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144 e Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Fragmentos de DNA de fita simples de ácidos nuclei- cos de biomarcadores de amostra e controle serão desnaturados e renaturados. A estrutura secundária dos ácidos nucleicos de fita sim-

ples varia de acordo com a sequência, a alteração resultante na mobi- lidade eletroforética permite a detecção de até mesmo uma única mu- dança de base. Os fragmentos de DNA podem ser marcados ou detec- tados com sondas marcadas. A sensibilidade do ensaio pode ser in- tensificada usando RNA (em vez de DNA), em que a estrutura secun- dária é mais sensível a uma mudança na sequência. Em uma modali- dade preferida, o método em questão utiliza a análise de heteroduplex para separar moléculas de heteroduplex de fita dupla com base em mudanças na mobilidade eletroforética (Keen et al. (1991) Trends Ge- net. 7:5).

[00519] Em ainda outra modalidade, o movimento de fragmentos mutantes ou de tipo selvagem em géis de poliacrilamida contendo um gradiente de desnaturante é testado usando eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Quando a DGGE é usada como método de análise, o DNA será modi- ficado para garantir que não desnature completamente, por exemplo, adicionando um grampo de GC de aproximadamente 40 pb de DNA rico em GC de alta fusão por PCR. Em uma outra modalidade, um gradiente de temperatura é usado no lugar de um gradiente de desna- turação para identificar diferenças na mobilidade do controle e da amostra de DNA (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753).

[00520] Exemplos de outras técnicas para detectar mutações pon- tuais incluem, mas não estão limitados a, hibridação de oligonucleotí- deo seletiva, amplificação seletiva ou extensão de iniciador seletivo. Por exemplo, os iniciadores oligonucleotídicos podem ser preparados nos quais a mutação conhecida é colocada centralmente e, em segui- da, hibridada para o DNA alvo em condições que permitem a hibrida- ção apenas se uma correspondência perfeita for encontrada (Saiki et al. (1986) Nature 324:163; Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 86:6230). Tais oligonucleotídeos específicos de alelo são hibri- dados com DNA alvo amplificado por PCR ou várias mutações diferen- tes quando os oligonucleotídeos são ligados à membrana de hibrida- ção e hibridados com DNA alvo marcado.

[00521] Alternativamente, a tecnologia de amplificação específica de alelo que depende da amplificação por PCR seletiva pode ser usa- da em conjunto com a presente invenção. Os oligonucleotídeos usa- dos como iniciadores para a amplificação específica podem carregar a mutação de interesse no centro da molécula (de modo que a amplifi- cação dependa da hibridação diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) ou na extremidade 3' extrema de um inicia- dor onde, sob condições apropriadas, a incompatibilidade pode preve- nir ou reduzir a extensão da polimerase (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Além disso, pode ser desejável introduzir um novo sítio de restrição na região da mutação para criar detecção baseada em cliva- gem (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Prevê-se que, em certas modalidades, a amplificação também pode ser realizada usando Taq ligase para amplificação (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). Em tais casos, a ligação ocorrerá apenas se houver uma cor- respondência perfeita na extremidade 3' da sequência 5', tornando possível detectar a presença de uma mutação conhecida em um sítio específico, observando a presença ou ausência de amplificação. Terapias anticâncer

[00522] A eficácia da terapia com anticorpos anti-HHLA2 é predita de acordo com a quantidade e/ou atividade do biomarcador associada a um câncer em um indivíduo de acordo com os métodos aqui descri- tos. Em uma modalidade, essa terapia de anticorpo anti-HHLA2 ou combinações de terapias (por exemplo, uma ou mais terapia de anti- corpo anti-HHLA2 em combinação com uma ou mais terapias anticân- cer adicionais, como outro inibidor de ponto de verificação imune) po-

dem ser administradas, particularmente se um indivíduo foi inicialmen- te indicado como sendo um provável respondedor à terapia com anti- corpos anti-HHLA2. Em outra modalidade, essa terapia de anticorpo anti-HHLA2 pode ser evitada uma vez que um indivíduo é indicado como não sendo provável respondedor à terapia de anticorpo anti- HHLA2 e pode ser administrado com um regime de tratamento alterna- tivo, como terapias anticâncer direcionadas e/ou não direcionadas. As terapias de combinação também são contempladas e podem compre- ender, por exemplo, um ou mais agentes quimioterápicos e radiação, um ou mais agentes quimioterápicos e imunoterapia, ou um ou mais agentes quimioterápicos, radiação e quimioterapia, cada combinação que pode ser com terapia de ponto de verificação anti-imune. Além disso, qualquer modalidade representativa de um agente para modular um alvo particular pode ser adaptada a qualquer outro alvo aqui des- crito e abaixo pelo versado na técnica (por exemplo, inibidores de HHLA2 diretos e indiretos descritos neste documento podem ser apli- cados a outros inibidores de ponto de verificação imune e/ou HHLA2, como anticorpos monoespecíficos, anticorpos biespecíficos, formas não ativadoras, pequenas moléculas, peptídeos, ácidos nucleicos in- terferentes e semelhantes).

[00523] O termo "terapia direcionada" refere-se à administração de agentes que interagem seletivamente com uma biomolécula escolhida para, assim, tratar o câncer. Um exemplo inclui inibidores de ponto de verificação imune, que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, agentes da via anti-CTLA-4, como anticorpos terapêuticos bloqueado- res monoclonais, que são bem conhecidos na técnica e descritos aci- ma, podem ser usados para atingir microambientes tumorais e células que expressam componentes indesejados da via CTLA-4, como ligan- dos de CTLA-4 (por exemplo, CD80 e CD86).

[00524] Por exemplo, o termo "via CTLA-4" refere-se ao receptor

CTLA-4 e seus ligandos, por exemplo, CD80 e CD86. "Inibidores da via CTLA-4" bloqueiam ou reduzem a interação entre CTLA-4 e um ou ambos de seus ligandos, de modo que a sinalização imunoinibitória gerada pela interação seja bloqueada ou reduzida. Os inibidores de ponto de verificação anti-imune podem ser diretos ou indiretos. Inibido- res diretos do ponto de verificação anti-imune bloqueiam ou reduzem a interação entre um ponto de verificação imune e pelo menos um de seus ligandos. Por exemplo, os inibidores de CTLA-4 podem bloquear a ligação de CTLA-4 com um ou ambos de seus ligandos. Os inibido- res diretos da combinação de CTLA-4 são bem conhecidos na técnica, especialmente porque os parceiros de ligação naturais de CTLA-4 (por exemplo, CD80 e CD86) são conhecidos.

[00525] Por exemplo, os agentes que bloqueiam diretamente a inte- ração entre CTLA-4 e um ou mais ligandos CTLA-4 e/ou parceiros de ligação, como um anticorpo biespecífico, podem prevenir a sinalização inibitória e suprarregular uma resposta imune (ou seja, como um inibi- dor da via de CTLA-4). Alternativamente, agentes que bloqueiam indi- retamente a interação entre CTLA-4 e um ou ambos de seus ligandos podem impedir a sinalização inibitória e suprarregular uma resposta imune. Por exemplo, B7-1 ou uma forma solúvel do mesmo, por liga- ção a um polipeptídeo de CTLA-4, reduz indiretamente a concentração eficaz de polipeptídeo de PD-L1 disponível para se ligar à CTLA-4. Agentes exemplificativos incluem anticorpos de bloqueio monoespecí- ficos ou biespecíficos contra CTLA-4 e um ou mais ligandos de CTLA- 4 e/ou parceiros de ligação que bloqueiam a interação entre o receptor e o(s) ligando(s); uma forma não ativadora de CTLA-4 e um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação (por exemplo, um poli- peptídeo dominante negativo ou solúvel), pequenas moléculas ou pep- tídeos que bloqueiam a interação entre CTLA-4 e um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação; proteínas de fusão (por exemplo

, a porção extracelular de CTLA-4 e um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação, fundidos à porção Fc de um anticorpo ou imunoglobulina) que ligam CTLA-4 e um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação e inibem a interação entre o receptor e o(s) ligando(s); uma forma não ativadora de um CTLA-4 natural e um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação, e uma forma solú- vel de um CTLA-4 natural e um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou par- ceiros de ligação.

[00526] Os inibidores de ponto de verificação anti-imune indireto bloqueiam ou reduzem de outra forma a sinalização imunoinibitória gerada pela interação entre o ponto de verificação imune e pelo menos um de seus ligandos. Por exemplo, um inibidor pode bloquear a intera- ção entre CTLA-4 e um ou ambos de seus ligandos sem necessaria- mente bloquear diretamente a interação entre CTLA-4 e um ou ambos de seus ligandos. Por exemplo, os inibidores indiretos incluem intra- corpos que se ligam à porção intracelular de CTLA-4 e/ou um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação necessários para sinali- zar para bloquear ou de outra forma reduzir a sinalização imunoinibitó- ria. Da mesma forma, os ácidos nucleicos que reduzem a expressão de CTLA-4 e/ou um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de li- gação podem inibir indiretamente a interação entre CTLA-4 e um ou ambos de seus ligandos, removendo a disponibilidade de componen- tes para interação. Essas moléculas de ácido nucleico podem bloquear a transcrição ou tradução de CTLA-4 e/ou um ou mais ligandos de CTLA-4 e/ou parceiros de ligação.

[00527] Da mesma forma, os agentes que bloqueiam diretamente a interação entre HHLA2 e receptor(es)/correceptor(es) e HHLA2, tal como um anticorpo anti-HHLA2, um anticorpo que reconhece um ou mais receptor(es)/correceptor(es) de HHLA2, um anticorpo biespecífico de ponto de verificação anti-HHLA2/anti-imune e semelhantes, podem prevenir a sinalização de HHLA2 e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor (es) e suas respostas imunes a jusante. Alternativamente, os agentes que indiretamente bloqueiam a interação entre HHLA2 e/ou seu(s) re- ceptor(es)/correceptor(es) podem prevenir a sinalização de HHLA2 e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor (es) e suas respostas imunes a jusante. Por exemplo, uma forma solúvel de HHLA2, tal como um do- mínio extracelular de HHLA2, por ligação ao seu(s) recep- tor(es)/correceptor(es) reduz indiretamente a concentração efetiva de seu(s) receptor(es)/correceptor(es) disponíveis para se ligar à HHLA2 na superfície celular. Agentes exemplificativos incluem anticorpos de bloqueio monoespecíficos ou biespecíficos contra HHLA2 e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor(es) que bloqueiam a interação entre o recep- tor e o(s) ligando(s); uma forma não ativadora de HHLA2 e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor(es) (por exemplo, um polipeptídeo negativo dominante ou solúvel), pequenas moléculas ou peptídeos que bloquei- am a interação entre HHLA2 e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor(es); proteínas de fusão (por exemplo , a porção extracelular de HHLA2 e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor(es), fundidos à porção Fc de um anticorpo ou imunoglobulina) que se ligam à HHLA2 e/ou seu(s) re- ceptor(es)/correceptor(es) e inibem a interação entre o receptor e o(s) ligando(s); uma forma não ativadora de um HHLA2 natural e/ou seu(s) receptor(es)/correceptor(es) e uma forma solúvel de um HHLA2 natural seu(s) receptor(es)/correceptor(es).

[00528] As imunoterapias que são projetadas para induzir ou ampli- ficar uma resposta imune são chamadas de "imunoterapias de ativa- ção". As imunoterapias destinadas a reduzir ou suprimir uma resposta imune são chamadas de "imunoterapias de supressão". Qualquer agente que se acredite ter um efeito no sistema imune sobre as célu- las cancerígenas transplantadas geneticamente modificadas pode ser testado para determinar se o agente é uma imunoterapia e o efeito que uma determinada modificação genética tem na modulação da resposta imune. Em algumas modalidades, a imunoterapia é específica para células cancerígenas. Em algumas modalidades, a imunoterapia pode ser "não direcionada", que se refere à administração de agentes que não interagem seletivamente com as células do sistema imunológico, mas modula a função do sistema imunológico. Exemplos representati- vos de terapias não direcionadas incluem, sem limitação, quimiotera- pia, terapia genética e radioterapia.

[00529] A imunoterapia pode envolver imunidade passiva para pro- teção de curto prazo de um hospedeiro, alcançada pela administração de anticorpo pré-formado dirigido contra um antígeno de câncer ou an- tígeno de doença (por exemplo, administração de um anticorpo mono- clonal, opcionalmente ligado a um agente quimioterápico ou toxina, a um antígeno tumoral). A imunoterapia também pode se concentrar no uso de epítopos citotóxicos reconhecidos por linfócitos de linhagens celulares de câncer. Alternativamente, polinucleotídeos antissenso, ribozimas, moléculas de interferência de RNA, polinucleotídeos de hé- lice tripla e semelhantes, podem ser usados para modular seletiva- mente biomoléculas que estão ligadas à iniciação, progressão e/ou patologia de um tumor ou câncer.

[00530] Em uma modalidade, a imunoterapia compreende imunote- rapias adotivas baseadas em células. Modalidades imunoterapêuticas baseadas em células adotivas bem conhecidas, incluindo, sem limita- ção, células tumorais autólogas ou alogênicas irradiadas, lisados tu- morais ou células tumorais apoptóticas, imunoterapia baseada em cé- lulas de apresentação de antígeno, imunoterapia baseada em células dendríticas, transferência de células T adotivas, terapia adotiva com células T CAR, terapia de intensificação imunológica autóloga (AIET), vacinas contra o câncer e/ou células de apresentação de antígeno. Essas imunoterapias baseadas em células podem ser modificadas ainda mais para expressar um ou mais produtos de genes para modu- lar ainda mais as respostas imunes, como expressar citocinas como GM-CSF e/ou expressar antígenos associados a tumores (TAA), como Mage-1, gp-100, vacinas de neoantígenos específicos para pacientes e semelhantes.

[00531] Em outra modalidade, a imunoterapia compreende imunote- rapias não baseadas em células. Em uma modalidade, são utilizadas composições compreendendo antígenos com ou sem adjuvantes de intensificação da vacina. Essas composições existem em muitas for- mas bem conhecidas, tais como composições de peptídeos, vírus on- colíticos, antígeno recombinante compreendendo proteínas de fusão e semelhantes. Em ainda outra modalidade, interleucinas imunomodula- tórias, tais como IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-23 e semelhantes, bem como moduladores dos mesmos (por exemplo, anticorpos bloqueado- res ou de formas mais potentes ou de maior duração) são utilizados. Em ainda outra modalidade, citocinas imunomodulatórias, tais como interferons, G-CSF, imiquimod, TNFalpha e semelhantes, bem como moduladores dos mesmos (por exemplo, anticorpos bloqueadores ou formas mais potentes ou de maior duração) são utilizados. Em outra modalidade, quimiocinas imunomodulatórias, tais como CCL3, CCL26 e CXCL7 e semelhantes, bem como moduladores dos mesmos (por exemplo, anticorpos bloqueadores ou formas mais potentes ou de maior duração) são utilizados. Em outra modalidade, moléculas imu- nomodulatórias direcionadas à imunossupressão, tais como modulado- res de sinalização de STAT3, moduladores de sinalização de NFkap- paB e moduladores de ponto de verificação imune, são utilizadas. Os termos "ponto de verificação imune" e "terapia de ponto de verificação imune" são descritos acima.

[00532] Em ainda outra modalidade, drogas imunomodulatórias, como drogas imunocitostáticas, glicocorticoides, citostáticos, imunofili-

nas e moduladores dos mesmos (por exemplo, rapamicina, um inibidor de calcineurina, tacrolimus, ciclosporina (ciclosporina), pimecrolimus, abetimus, gusperimus, ridaforolimus, everolimus, temsirolimus, zotaro- limus, etc.), hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, trian- cinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de deso- xicorticosterona (doca) aldosterona, um esteroide não glicocorticoide, um inibidor da síntese de pirimidina, leflunomida, teriflunomida, um análogo de ácido fólico, metotrexato, globulina anti-timócito, globulina anti-linfócito, talidomida, lenalidomida, pentoxifilina, bupropiona, cur- cumina, catequina, um opioide, um inibidor de IMPDH, ácido micofenó- lico, miriocina, fingolimode, um inibidor de NF-xB, raloxifeno, drotreco- gina alfa, denosumabe, um inibidor de cascata de sinalização NF-xB, dissulfiram, olmesartana, ditiocarbamato, um inibidor de proteassoma, bortezomibe, MG132, Prol, NPI-0052, curcumina, genisteína, resve- ratrol, partenolida, talidomida, lenalidomida, flavopiridol, anti- inflamatórios não esteroides (AINEs), trióxido de arsênio, desidroxime- tilpoxiquinomicina (DHMEQ), I3C (indol-3-carbinol)/DIM (di- indolmetano) (13C/DIM), Bay 11-7082, luteolina, peptídeo permeável às células SN-50, superexpressão de superrepressor de IKBa, oligo- desoxinucleotídeo isca de NFKB (ODN), ou um derivado ou análogo de qualquer um dos mesmos, são usados.

Em ainda outra modalida- de, anticorpos imunomodulatórios ou proteínas são usados.

Por exemplo, anticorpos que se ligam a CD40, receptor semelhante a Toll (TLR), OX40, GITR, CD27, ou a 4-1BB, anticorpos biespecíficos de células T, um anticorpo antirreceptor IL-2, um anticorpo anti-CD3, OKT3 (muromonabe), otelixizumabe, teplizumabe, visilizumabe, um anticorpo anti-CD4, clenoliximabe, keliximabe, zanolimumabe, um anti- corpo anti-CD11, efalizumabe, um anticorpo anti-CD18, erlizumabe, rovelizumabe, um anticorpo anti-CD20, ocrelizumabe, ofatumumabe,

pascolizumabe, rituximabe, um anticorpo anti-CD23, lumiliximabe, um anticorpo anti-CD40, teneliximabe, toralizumabe, um anticorpo anti- CD40L, ruplizumabe, um anticorpo anti-CD62L, aselizumabe, um anti- corpo anti-CD80, galiximabe, um anticorpo anti-CD147, gavilimomabe, um anticorpo inibidor de estimulador de linfócitos B (BLyS), belimuma- be, uma proteína de fusão CTLA4-Ig, abatacepte, belatacepte, um an- ticorpo anti-CTLA4, ipilimumabe, tremelimumabe, um anticorpo anti- eotaxina 1, bertilimumabe , um anticorpo anti-integrina a4, natalizuma- be, um anticorpo anti-IL-6R, tocilizumabe, um anticorpo anti-LFA-1, odulimomabe, um anticorpo anti-CD25, basiliximabe, daclizumabe, inolimomabe, um anticorpo anti-CD5, zolimomabe, um anticorpo anti- CD2, siplizumabe, nerelimomabe, faralimomabe, atlizumabe, atoro- limumabe, cedelizumabe, dorlimomabe aritox, dorlixizumabe, fontoli- zumabe, gantenerumabe, gomiliximabe, lebrilizumabe, maslimomabe, morolimumabe, pexelizumabe, reslizumabe, rovelizumabe, talizumabe, telimomabe aritox, vapaliximabe, vepalimomabe, aflibercept, alefacept, rilonacept, um antagonista do receptor IL-1, anakinra, um anticorpo anti-IL-5, mepolizumabe, um inibidor de IgE, omalizumabe, talizumabe, um inibidor de IL12, um inibidor de IL23, ustekinumabe e semelhantes.

[00533] Suplementos nutricionais que aumentam as respostas imu- nes, como vitamina A, vitamina E, vitamina C e semelhantes, são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Pat. U.S. 4.981.844 e

5.230.902 e Publicação PCT WO 2004/004483) pode ser usado nos métodos aqui descritos.

[00534] Da mesma forma, agentes e terapias diferentes da imunote- rapia ou em combinação dos mesmos podem ser usados em combina- ção com anticorpos anti-HHLA2 para estimular uma resposta imune para, assim, tratar uma condição que se beneficiaria com isso. Por exemplo, quimioterapia, radiação, modificadores epigenéticos (por exemplo, modificadores de histona desacetilase (HDAC), modificado-

res de metilação, modificadores de fosforilação e semelhantes), tera- pia direcionada e semelhantes são bem conhecidos na técnica.

[00535] O termo "terapia não direcionada" refere-se à administração de agentes que não interagem seletivamente com uma biomolécula escolhida, mas tratam o câncer. Exemplos representativos de terapias não direcionadas incluem, sem limitação, quimioterapia, terapia gené- tica e radioterapia.

[00536] Em uma modalidade, a quimioterapia é usada. A quimiote- rapia inclui a administração de um agente quimioterápico. Tal agente quimioterápico pode ser, mas não está limitado a, aqueles seleciona- dos entre os seguintes grupos de compostos: compostos de platina, antibióticos citotóxicos, antimetabolidades, agentes antimitóticos, agentes alquilantes, compostos arsênicos, inibidores de topoisomera- se de DNA, taxanos, análogos de nucleosídeos, alcaloides vegetais e toxinas; e derivados sintéticos dos mesmos. Compostos exemplificati- vos incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes: cisplati- na, treossulfano e trofosfamida; alcaloides vegetais: vinblastina, pacli- taxel, docetaxol; inibidores da topoisomerase do DNA: teniposídeo, crisnatol e mitomicina; anti-folatos: metotrexato, ácido micofenólico e hidroxiureia; análogos de pirimidina: 5-fluorouracil, doxifluridina e cito- sina arabinosídeo; análogos de purina: mercaptopurina e tioguanina; antimetabólitos de DNA: 2'-desóxi-5-fluorouridina, glicinato de afidicoli- na e pirazoloimidazol; e agentes antimitóticos: halicondrina, colchicina e rizoxina. As composições compreendendo um ou mais agentes qui- mioterápicos (por exemplo, FLAG, CHOP) também podem ser usadas. FLAG compreende fludarabina, citosina arabinosídeo (Ara-C) e G- CSF. CHOP inclui ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina e predni- sona. Em outras modalidades, inibidores de PARP (por exemplo, PARP-1 e/ou PARP-2) são usados e tais inibidores são bem conheci- dos na técnica (por exemplo, Olaparib, ABT-888, BSI-201, BGP-15 (N-

Gene Research Laboratories, Inc.); INO-1001 (Inotek Pharmaceuticals Inc.); PJ34 (Soriano et al., 2001; Pacher et al., 2002b); 3- aminobenzamida (Trevigen); 4-amino-1,8-naftalimida; (Trevigen); 6 (5H)-fenantridinona (Trevigen); benzamida (Pat. U.S. Re. 36,397); e NU1025 (Bowman et al.). O mecanismo de ação está geralmente re- lacionado à capacidade dos inibidores da PARP de se ligarem à PARP e diminuirem sua atividade. PARP catalisa a conversão de dinucleotí- deo de .beta.-nicotinamida adenina (NAD+) em nicotinamida e poli- ADP-ribose (PAR). Tanto a poli (ADP-ribose) quanto a PARP têm sido associadas à regulação da transcrição, proliferação celular, estabilida- de genômica e carcinogênese (Bouchard V. J. et.al. Experimental He- matology, Volume 31, Number 6, June 2003, pp. 446-454(9); Herceg Z.; Wang Z.-Q. Mutation Research/Fundamental and Molecular Me- chanisms of Mutagenesis, Volume 477, Number 1, 2 Jun. 2001, pp. 97- 110(14)). A poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) é uma molécula chave no reparo de quebras de fita simples de DNA (SSBs) (de Murcia J. et al. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94:7303-7307; Schreiber V, Dantzer F, Ame J C, de Murcia G (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7:517- 528; Wang Z Q, et al. (1997) Genes Dev 11:2347-2358). O knockout do reparo de SSB pela inibição da função PARP1 induz quebras de fita dupla de DNA (DSBs) que podem desencadear letalidade sintética em células cancerígenas com reparo defeituoso de DSB direcionado por homologia (Bryant H E, et al. (2005) Nature 434:913-917; Farmer H, et al. (2005) Nature 434:917-921). Os exemplos anteriores de agentes quimioterápicos são ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

[00537] Em outra modalidade, a terapia de radiação é usada. A ra- diação usada na terapia de radiação pode ser radiação ionizante. A radioterapia também pode ser raios gama, raios X ou feixes de pró- tons. Exemplos de radioterapia incluem, mas não estão limitados a, radioterapia de feixe externo, implantação intersticial de radioisótopos

(I-125, paládio, irídio), radioisótopos como estrôncio-89, radioterapia torácica, radioterapia intraperitoneal P-32, e/ou radioterapia abdominal e pélvica total. Para uma visão geral da terapia de radiação, consulte Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Com- pany, Philadelphia. A radioterapia pode ser administrada como radia- ção de feixe externo ou teleterapia, em que a radiação é direcionada de uma fonte remota. O tratamento com radiação também pode ser administrado como terapia interna ou braquiterapia, em que uma fonte radioativa é colocada dentro do corpo perto de células cancerígenas ou de uma massa tumoral. Também é abrangido o uso de terapia foto- dinâmica compreendendo a administração de fotossensibilizantes, como hematoporfirina e seus derivados, Vertoporfina (BPD-MA), ftalo- cianina, fotossensibilizador Pc4, desmetóxi-hipocrelina A; e 2BA-2- DMHA.

[00538] Em outra modalidade, a intervenção cirúrgica pode ocorrer para remover fisicamente células e/ou tecidos cancerígenos.

[00539] Em ainda outra modalidade, a terapia hormonal é usada. Os tratamentos terapêuticos hormonais podem compreender, por exemplo, agonistas hormonais, antagonistas hormonais (por exemplo, flutamida, bicalutamida, tamoxifeno, raloxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON), antagonistas de LH-RH), inibidores da biossíntese e pro- cessamento de hormônios e esteroides (por exemplo, dexametasona , retinoides, deltoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, desidrotestosterona, glicocorticoides, mineralocorticoides, estrogênio, testosterona, progestinas), derivados da vitamina A (por exemplo, áci- do all-trans retinoico (ATRA)); análogos da vitamina D3; antigestáge- nos (por exemplo, mifepristona, onapristona) ou antiandrógenos (por exemplo, acetato de ciproterona).

[00540] Em ainda outra modalidade, a hipertermia, um procedimen-

to no qual o tecido corporal é exposto a altas temperaturas (até 106°F.) é utilizada. O calor pode ajudar a encolher os tumores, danifi- cando as células ou privando-as de substâncias que elas precisam pa- ra viver. A terapia de hipertermia pode ser hipertermia local, regional e de corpo inteiro, usando dispositivos de aquecimento externo e inter- no. A hipertermia é quase sempre usada com outras formas de terapia (por exemplo, radioterapia, quimioterapia e terapia biológica) para ten- tar aumentar sua eficácia. A hipertermia local refere-se ao calor que é aplicado a uma área muito pequena, como um tumor. A área pode ser aquecida externamente com ondas de alta frequência voltadas para um tumor de um dispositivo fora do corpo. Para obter aquecimento in- terno, pode ser usado um dos vários tipos de sondas estéreis, incluin- do fios finos e aquecidos ou tubos ocos cheios de água morna; ante- nas de micro-ondas implantadas e eletrodos de radiofrequência. Na hipertermia regional, um órgão ou membro é aquecido. Imãs e disposi- tivos que produzem alta energia são colocados sobre a região a ser aquecida. Em outra abordagem, chamada perfusão, parte do sangue do paciente é removida, aquecida e depois bombeada (perfundida) para a região a ser aquecida internamente. O aquecimento de corpo inteiro é usado para tratar o câncer metastático que se espalhou por todo o corpo. Isso pode ser feito usando cobertores de água quente, cera quente, bobinas indutivas (como aquelas em cobertores elétricos) ou câmaras térmicas (semelhantes a grandes incubadoras). A hiper- termia não causa nenhum aumento acentuado nos efeitos colaterais da radiação ou complicações. Calor aplicado diretamente na pele, en- tretanto, pode causar desconforto ou até mesmo dor local significativa em cerca de metade dos pacientes tratados. Também pode causar bolhas, que geralmente cicatrizam rapidamente.

[00541] Em ainda outra modalidade, a terapia fotodinâmica (tam- bém chamada de PDT, terapia de fotorradiação, fototerapia ou foto-

quimioterapia) é usada para o tratamento de alguns tipos de câncer.

É baseado na descoberta de que certos produtos químicos conhecidos como agentes fotossensibilizadores podem matar organismos unicelu- lares quando os organismos são expostos a um tipo específico de luz.

A PDT destrói as células cancerígenas através do uso de uma luz la- ser de frequência fixa em combinação com um agente fotossensibili- zador.

Na PDT, o agente fotossensibilizador é injetado na corrente sanguínea e absorvido por células de todo o corpo.

O agente perma- nece nas células cancerígenas por mais tempo do que nas células normais.

Quando as células cancerígenas tratadas são expostas à luz laser, o agente fotossensibilizador absorve a luz e produz uma forma ativa de oxigênio que destrói as células cancerígenas tratadas.

A ex- posição à luz deve ser cronometrada cuidadosamente para que ocorra quando a maior parte do agente fotossensibilizador tiver deixado as células saudáveis, mas ainda estiver presente nas células canceríge- nas.

A luz laser usada na PDT pode ser dirigida através de uma fibra óptica (um fio de vidro muito fino). A fibra óptica é colocada perto do câncer para fornecer a quantidade adequada de luz.

A fibra óptica po- de ser direcionada através de um broncoscópio para os pulmões para o tratamento do câncer de pulmão ou através de um endoscópio para o esôfago para o tratamento do câncer de esôfago.

Uma vantagem da PDT é que ela causa danos mínimos ao tecido saudável.

No entanto, como a luz laser atualmente em uso não pode passar por mais de cer- ca de 3 centímetros de tecido (um pouco mais de uma polegada e uma oitava polegada), a PDT é usada principalmente para tratar tumores na pele ou logo abaixo dela ou no revestimento interno de órgãos.

A tera- pia fotodinâmica torna a pele e os olhos sensíveis à luz por 6 semanas ou mais após o tratamento.

Os pacientes são aconselhados a evitar a luz solar direta e a luz forte em ambientes internos por pelo menos 6 semanas.

Se os pacientes tiverem que sair, eles precisam usar roupas de proteção, incluindo óculos de sol. Outros efeitos colaterais temporá- rios da PDT estão relacionados ao tratamento de áreas específicas e podem incluir tosse, dificuldade para engolir, dor abdominal e respira- ção dolorosa ou falta de ar. Em dezembro de 1995, a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA aprovou um agente fotossensibilizador denominado porfímero de sódio, ou Photofrin®, para aliviar os sinto- mas do câncer de esôfago que está causando uma obstrução e para o câncer de esôfago que não pode ser tratado satisfatoriamente apenas com lasers. Em janeiro de 1998, a FDA aprovou o porfímero de sódio para o tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas em pacientes para os quais os tratamentos usuais para câncer de pulmão não são apropriados. O National Cancer Institute e outras instituições estão apoiando ensaios clínicos (estudos de pesquisa) para avaliar o uso da terapia fotodinâmica para vários tipos de câncer, incluindo cân- cer de bexiga, cérebro, laringe e cavidade oral.

[00542] Em ainda outra modalidade, a terapia a laser é usada para aproveitar a luz de alta intensidade para destruir as células canceríge- nas. Essa técnica é frequentemente usada para aliviar os sintomas do câncer, como sangramento ou obstrução, especialmente quando o câncer não pode ser curado por outros tratamentos. Também pode ser usado para tratar o câncer, reduzindo ou destruindo tumores. O termo "laser" significa amplificação de luz por emissão estimulada de radia- ção. A luz comum, como a de uma lâmpada, tem muitos comprimentos de onda e se espalha em todas as direções. A luz laser, por outro lado, tem um comprimento de onda específico e é focada em um feixe es- treito. Este tipo de luz de alta intensidade contém muita energia. Os lasers são muito poderosos e podem ser usados para cortar aço ou dar forma a diamantes. Os lasers também podem ser usados para tra- balhos cirúrgicos muito precisos, como reparar uma retina danificada no olho ou cortar tecidos (no lugar de um bisturi). Embora existam vá-

rios tipos diferentes de lasers, apenas três tipos ganharam amplo uso na medicina: Laser de dióxido de carbono (CO2) - esse tipo de laser pode remover camadas finas da superfície da pele sem penetrar nas camadas mais profundas.

Esta técnica é particularmente útil no trata- mento de tumores que não se espalharam profundamente na pele e em certas condições pré-cancerígenas.

Como alternativa à cirurgia tradicional com bisturi, o laser de CO2também é capaz de cortar a pe- le.

O laser é usado dessa forma para remover câncer de pele.

Laser de neodímio:ítrio-alumínio-granada (Nd:YAG) - a luz deste laser pode penetrar mais profundamente no tecido do que a luz de outros tipos de lasers e pode fazer com que o sangue coagule rapidamente.

Pode ser transportado através de fibras ópticas para partes menos acessíveis do corpo.

Este tipo de laser às vezes é usado para tratar câncer de garganta.

Laser de argônio - esse laser pode passar apenas por ca- madas superficiais de tecido e, portanto, é útil em dermatologia e ci- rurgia ocular.

Também é usado com corantes sensíveis à luz para tra- tar tumores em um procedimento conhecido como terapia fotodinâmica (PDT). Os lasers têm várias vantagens sobre as ferramentas cirúrgicas padrão, incluindo: os lasers são mais precisos do que os bisturis.

O tecido próximo a uma incisão é protegido, uma vez que há pouco con- tato com a pele circundante ou outro tecido.

O calor produzido pelos lasers esteriliza o local da cirurgia, reduzindo assim o risco de infec- ção.

Pode ser necessário menos tempo de operação porque a preci- são do laser permite uma incisão menor.

O tempo de cura costuma ser reduzido; como o calor do laser veda os vasos sanguíneos, há menos sangramento, inchaço ou cicatrizes.

A cirurgia a laser pode ser menos complicada.

Por exemplo, com fibra óptica, a luz do laser pode ser di- rigida para partes do corpo sem fazer uma grande incisão.

Mais pro- cedimentos podem ser feitos em ambulatório.

Os lasers podem ser usados de duas maneiras para tratar o câncer: reduzindo ou destruin-

do um tumor com calor, ou ativando uma substância química - conhe- cida como agente fotossensibilizador - que destrói as células cancerí- genas.

Na PDT, um agente fotossensibilizador é retido nas células cancerígenas e pode ser estimulado pela luz para causar uma reação que mata as células cancerígenas.

Lasers CO2 e Nd:YAG são usados para reduzir ou destruir tumores.

Eles podem ser usados com endos- cópios, tubos que permitem aos médicos ver certas áreas do corpo, como a bexiga.

A luz de alguns lasers pode ser transmitida por meio de um endoscópio flexível equipado com fibra óptica.

Isso permite que os médicos vejam e trabalhem em partes do corpo que de outra forma não poderiam ser alcançadas exceto por cirurgia e, portanto, permite um direcionamento muito preciso do feixe de laser.

Os lasers também podem ser usados com microscópios de baixa potência, dando ao mé- dico uma visão clara do local a ser tratado.

Usados com outros instru- mentos, os sistemas a laser podem produzir uma área de corte de até 200 mícrons de diâmetro - menor que a largura de uma linha muito fi- na.

Os lasers são usados para tratar muitos tipos de câncer.

A cirurgia a laser é um tratamento padrão para certos estágios do câncer de glo- te (cordas vocais), cervical, cutâneo, pulmonar, vaginal, vulvar e peni- ano.

Além de seu uso para destruir o câncer, a cirurgia a laser também é usada para ajudar a aliviar os sintomas causados pelo câncer (cui- dados paliativos). Por exemplo, os lasers podem ser usados para re- duzir ou destruir um tumor que está bloqueando a traqueia de um pa- ciente (traqueia), tornando mais fácil respirar.

Às vezes também é usa- do para paliação no câncer colorretal e anal.

A termoterapia intersticial induzida por laser (LITT) é um dos desenvolvimentos mais recentes na terapia a laser.

A LITT usa a mesma ideia de um tratamento de câncer chamado hipertermia; que o calor pode ajudar a reduzir os tumores, danificando as células ou privando-as das substâncias de que preci- sam para viver.

Neste tratamento, os lasers são direcionados para áreas intersticiais (áreas entre órgãos) no corpo. A luz do laser então aumenta a temperatura do tumor, o que danifica ou destrói as células cancerígenas.

[00543] A duração e/ou dose de tratamento com terapias pode vari- ar de acordo com o agente terapêutico particular ou combinação dos mesmos. Um tempo de tratamento apropriado para um agente tera- pêutico de câncer particular será apreciado pelo versado na técnica. A presente invenção contempla a avaliação contínua de esquemas de tratamento ideais para cada agente terapêutico do câncer, em que o fenótipo do câncer do indivíduo, conforme determinado pelos métodos da presente invenção, é um fator na determinação de doses e esque- mas de tratamento ideais.

[00544] Quaisquer meios para a introdução de um polinucleotídeo em mamíferos, humanos ou não humanos, ou células dos mesmos, podem ser adaptados à prática desta invenção para a distribuição dos vários construtos da presente invenção no receptor pretendido. Em uma modalidade da presente invenção, os construtos de DNA são dis- tribuídos às células por transfecção, ou seja, por distribuição de DNA "nu" ou em um complexo com um sistema de dispersão coloidal. Um sistema coloidal inclui complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas à base de lipídeos, incluindo emul- sões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. O siste- ma coloidal preferido desta invenção é um DNA complexado com lípi- deos ou formulado com lipossomas. Na primeira abordagem, antes da formulação de DNA, por exemplo, com lipídeo, um plasmídeo conten- do um transgene contendo os construtos de DNA desejados pode pri- meiro ser experimentalmente otimizado para expressão (por exemplo, inclusão de um íntron na região 5' não traduzida e eliminação de se- quências (Felgner, et al., Ann NY Acad Sci 126-139, 1995). A formu- lação de DNA, por exemplo , com vários materiais lipídicos ou de li-

possomas, pode então ser realizada usando métodos e materiais co- nhecidos e distribuída ao mamífero receptor. Ver, por exemplo, Cano- nico et al, Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994; Tsan et al, Am J Physiol 268; Alton et al., Nat Genet. 5:135-142, 1993 e patente U.S.

5.679.647 por Carson et al.

[00545] O direcionamento dos lipossomas pode ser classificado com base em fatores anatômicos e mecanísticos. A classificação ana- tômica é baseada no nível de seletividade, por exemplo, específica de órgão, específica de célula e específica de organela. O direcionamento mecanístico pode ser distinguido com base no fato de ser passivo ou ativo. O direcionamento passivo utiliza a tendência natural dos lipos- somas de se distribuir para as células do sistema retículo-endotelial (RES) nos órgãos, que contêm capilares sinusoidais. O direcionamen- to ativo, por outro lado, envolve a alteração do lipossoma por acopla- mento do lipossoma a um ligando específico, como um anticorpo mo- noclonal, açúcar, glicolipídeo ou proteína, ou pela alteração da compo- sição ou tamanho do lipossoma a fim de atingir o direcionamento para órgãos e tipos de células diferentes dos sítios de localização de ocor- rência natural.

[00546] A superfície do sistema de distribuição direcionado pode ser modificada de várias maneiras. No caso de um sistema de distri- buição direcionado lipossômico, os grupos lipídicos podem ser incor- porados na bicamada lipídica do lipossoma, a fim de manter o ligando alvo em associação estável com a bicamada lipossômica. Vários gru- pos de ligação podem ser usados para unir as cadeias lipídicas ao li- gando de direcionamento. O DNA nu ou DNA associado a um veículo de distribuição, por exemplo, lipossomas, pode ser administrado a vá- rios sítios em um indivíduo (ver abaixo).

[00547] Os ácidos nucleicos podem ser distribuídos em qualquer vetor desejado. Estes incluem vetores virais ou não virais, incluindo vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores de retrovírus, vetores de lentivírus e vetores de plasmídeo. Tipos exempli- ficativos de vírus incluem HSV (vírus herpes simplex), AAV (vírus ade- noassociado), HIV (vírus da imunodeficiência humana), BIV (vírus da imunodeficiência bovina) e MLV (vírus da leucemia murina). Os ácidos nucleicos podem ser administrados em qualquer formato desejado que forneça níveis de distribuição suficientemente eficientes, incluindo em partículas de vírus, em lipossomas, em nanopartículas e complexados com polímeros.

[00548] Os ácidos nucleicos que codificam uma proteína ou ácido nucleico de interesse podem estar em um plasmídeo ou vetor viral, ou outro vetor como é conhecido na técnica. Tais vetores são bem co- nhecidos e qualquer um pode ser selecionado para uma aplicação par- ticular. Numa modalidade da presente invenção, o veículo de distribui- ção de genes compreende um promotor e uma sequência de codifica- ção de desmetilase. Os promotores preferidos são promotores especí- ficos de tecido e promotores que são ativados por proliferação celular, tais como os promotores da timidina quinase e da timidilato sintase. Outros promotores preferidos incluem promotores que são ativáveis por infecção com um vírus, tais como os promotores do interferon α e β, e promotores que são ativáveis por um hormônio, tal como o estro- gênio. Outros promotores que podem ser usados incluem o LTR do vírus Moloney, o promotor de CMV e o promotor da albumina de ca- mundongo. Um promotor pode ser constitutivo ou indutível.

[00549] Em outra modalidade, as moléculas de polinucleotídeo nu são usadas como veículos de distribuição de genes, conforme descrito em WO 90/11092 e Patente U.S. 5.580.859. Tais veículos de distribui- ção de genes podem ser DNA ou RNA de fator de crescimento e, em certas modalidades, estão ligados ao adenovírus morto. Curiel et al., Hum. Gene. Ther. 3:147-154, 1992. Outros veículos que podem ser opcionalmente usados incluem DNA-ligando (Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989), combinações de lipídeo-DNA (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 7417, 1989), lipossomas (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851-7855, 1987) e microprojéteis (Willi- ams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2726-2730, 1991).

[00550] Um veículo de distribuição de genes pode opcionalmente compreender sequências virais, como uma origem viral de replicação ou sinal de empacotamento. Estas sequências virais podem ser sele- cionadas de vírus, tais como astrovírus, coronavírus, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, parvovírus, picornavírus, poxvírus, retroví- rus, togavírus ou adenovírus. Em uma modalidade preferida, o veículo de distribuição do gene do fator de crescimento é um vetor retroviral recombinante. Retrovírus recombinantes e vários usos dos mesmos foram descritos em numerosas referências incluindo, por exemplo, Mann et al., Cell 33:153, 1983, Cane and Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6349, 1984, Miller et al., Human Gene Therapy 1:5-14, 1990, Patente U.S. 4.405.712, 4.861.719, e 4.980.289, e Pedido PCT WO 89/02.468, WO 89/05.349 e WO 90/02.806. Numerosos veículos de distribuição de genes retrovirais podem ser utilizados na presente invenção, incluindo por exemplo aqueles descritos em EP 0.415.731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente U.S. 5.219.740; WO 9311230; WO 9310218; Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864, 1993; Vile and Hart, Cancer Res. 53:962-967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53:83-88, 1993; Takamiya et al., J. Neu- rosci. Res. 33:493-503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729-735, 1993 (Patente U.S. 4.777.127, GB 2.200.651, EP 0.345.242 e WO91/02805).

[00551] Outros sistemas de vetores virais que podem ser usados para distribuir um polinucleotídeo da presente invenção foram deriva- dos do vírus herpes, por exemplo, vírus Herpes Simplex (Patente U.S.

5.631.236 por Woo et al., emitida em 20 de maio de 1997 e WO 00/08191 por Neurovex), vírus vaccinia (Ridgeway (1988) Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Sto- neham: Butterworth,; Baichwal and Sugden (1986) "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable ex- pression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press; Coupar et al. (1988) Gene, 68:1-10) e vários vírus de RNA. Os vírus preferidos incluem um alfavírus, um poxivírus, um vírus de arena, um vírus vaccinia, um vírus da poliomielite e seme- lhantes. Eles oferecem várias características atrativas para várias célu- las de mamíferos (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1281; Ridge- way, 1988, supra; Baichwal and Sugden, 1986, supra; Coupar et al., 1988; Horwich et al.(1990) J.Virol., 64:642-650).

[00552] Em outras modalidades, o DNA alvo no genoma pode ser manipulado usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exem- plo, o DNA alvo no genoma pode ser manipulado por deleção, inser- ção e/ou mutação são inserção retroviral, técnicas de cromossomo ar- tificial, inserção de gene, inserção aleatória com promotores específi- cos de tecido, direcionamento de gene, elementos transponíveis e/ou qualquer outro método para introduzir DNA estranho ou produzir DNA modificado/DNA nuclear modificado. Outras técnicas de modificação incluem deletar sequências de DNA de um genoma e/ou alterar se- quências de DNA nuclear. As sequências de DNA nuclear, por exem- plo, podem ser alteradas por mutagênese dirigida ao sítio.

[00553] Em outras modalidades, polipeptídeos biomarcadores re- combinantes e fragmentos dos mesmos podem ser administrados a indivíduos. Em algumas modalidades, proteínas de fusão podem ser construídas e administradas e têm propriedades biológicas aprimora- das. Além disso, os polipeptídeos de biomarcador, e fragmentos dos mesmos, podem ser modificados de acordo com métodos farmacológi- cos bem conhecidos na técnica (por exemplo, peguilação, glicosilação, oligomerização, etc.) a fim de aumentar ainda mais as atividades bio- lógicas desejáveis, tais como biodisponibilidade aumentada e diminui- ção da degradação proteolítica. Eficácia clínica

[00554] A eficácia clínica pode ser medida por qualquer método co- nhecido na técnica. Por exemplo, a resposta a uma terapia, tal como terapia com anticorpo anti-HHLA2, refere-se a qualquer resposta do câncer, por exemplo, um tumor, à terapia, de preferência a uma mu- dança na massa e/ou volume do tumor após o início do neoadjuvante ou quimioterapia adjuvante. A resposta do tumor pode ser avaliada em uma situação neoadjuvante ou adjuvante, em que o tamanho de um tumor após a intervenção sistêmica pode ser comparado ao tamanho e dimensões iniciais medidos por CT, PET, mamografia, ultrassom ou palpação e a celularidade de um tumor pode ser estimada histologi- camente e em comparação com a celularidade de uma biópsia de tu- mor feita antes do início do tratamento. As respostas também podem ser avaliadas por medição com compasso ou exame patológico do tu- mor após biópsia ou ressecção cirúrgica. A resposta pode ser registra- da de forma quantitativa, como alteração porcentual no volume do tu- mor ou celularidade ou usando um sistema de pontuação semiquanti- tativo, como a carga residual de câncer (Symmans et al., J. Clin. On- col. (2007) 25:4414-4422) or Miller-Payne score (Ogston et al., (2003) Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327) de uma forma qualitativa como "resposta patológica completa" (pCR), "remissão clínica comple- ta" (cCR), "remissão clínica parcial" (cPR), "doença clínica estável" (cSD), "doença clínica progressiva" (cPD) ou outros critérios qualitati- vos. A avaliação da resposta do tumor pode ser realizada logo após o início da terapia neoadjuvante ou adjuvante, por exemplo, após algu-

mas horas, dias, semanas ou, de preferência, após alguns meses. Um ponto final típico para avaliação de resposta é após o término da qui- mioterapia neoadjuvante ou após a remoção cirúrgica de células tumo- rais residuais e/ou do leito tumoral.

[00555] Em algumas modalidades, a eficácia clínica dos tratamen- tos terapêuticos aqui descritos pode ser determinada medindo a taxa de benefício clínico (CBR). A taxa de benefício clínico é medida de- terminando a soma da porcentagem de pacientes que estão em remis- são completa (CR), o número de pacientes que estão em remissão parcial (PR) e o número de pacientes com doença estável (SD) em um ponto de tempo pelo menos 6 meses após o final da terapia. A abrevi- ação para esta fórmula é CBR=CR+PR+SD em 6 meses. Em algumas modalidades, a CBR para um determinado regime terapêutico de pon- to de verificação anti-imune é de pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou mais.

[00556] Critérios adicionais para avaliar a resposta às terapias de ponto de verificação imune estão relacionados à "sobrevida", que inclui todos os seguintes itens: sobrevida até a mortalidade, também conhe- cida como sobrevida global (em que a mortalidade pode ser indepen- dente da causa ou relacionada ao tumor); "sobrevida livre de recorrên- cia" (em que o termo recorrência deve incluir recorrência localizada e distante); sobrevida livre de metástases; sobrevida livre de doença (em que o termo doença deve incluir câncer e doenças associadas a ele). A duração da referida sobrevida pode ser calculada por referência a um ponto de início definido (por exemplo, tempo de diagnóstico ou iní- cio do tratamento) e ponto final (por exemplo, morte, recorrência ou metástase). Além disso, os critérios para eficácia do tratamento podem ser expandidos para incluir resposta à quimioterapia, probabilidade de sobrevida, probabilidade de metástase dentro de um determinado pe- ríodo de tempo e probabilidade de recorrência do tumor.

[00557] Por exemplo, para determinar valores limiares apropriados, um regime terapêutico de anticâncer específico pode ser administrado a uma população de indivíduos e o resultado pode ser correlacionado com medições de biomarcadores que foram determinados antes da administração de qualquer terapia de ponto de verificação imune. A medição do resultado pode ser a resposta patológica à terapia admi- nistrada no ambiente neoadjuvante. Alternativamente, medições de resultados, como sobrevida geral e sobrevida livre de doença, podem ser monitoradas durante um período de tempo para indivíduos após terapia de ponto de verificação anti-imune para os quais os valores de medição de biomarcadores são conhecidos. Em certas modalidades, as mesmas doses de agentes de ponto de verificação anti-imune são administradas a cada indivíduo. Em modalidades relacionadas, as do- ses administradas são doses padrão conhecidas na técnica para agen- tes de ponto de verificação anti-imune. O período de tempo durante o qual os indivíduos são monitorados pode variar. Por exemplo, os indi- víduos podem ser monitorados por pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 meses. Os valores de limiar de medição de biomarcador que se correlacionam com o resultado de uma terapia de ponto de verificação anti-imune podem ser determina- dos usando métodos como aqueles descritos na seção de Exemplos. XIII. Kits

[00558] Além disso, a presente invenção também abrange kits para detectar a presença de um polipeptídeo aHHLA2, ou fragmentos dos mesmos, em uma amostra biológica. Por exemplo, o kit pode compre- ender um composto ou agente marcado capaz de detectar um polipep- tídeo de HHLA2, ou fragmentos dos mesmo, em uma amostra biológi- ca; meios para determinar a quantidade do polipeptídeo de HHLA2, ou seus fragmentos, na amostra; e meios para comparar a quantidade do polipeptídeo HHLA2, ou fragmentos dos mesmos, na amostra com um padrão. O composto ou agente pode ser embalado em um recipiente adequado. Por exemplo, a presente invenção fornece kits compreen- dendo pelo menos um anticorpo aqui descrito. Os kits contendo anti- corpos da invenção encontram uso na detecção de HHLA2, ou em en- saios terapêuticos ou de diagnóstico. Os kits da invenção podem con- ter um anticorpo acoplado a um suporte sólido, por exemplo, uma pla- ca de cultura de tecidos ou esferas (por exemplo, esferas de sepharo- se).

[00559] Um kit pode incluir componentes adicionais para facilitar a aplicação específica para a qual o kit foi projetado. Por exemplo, po- dem ser fornecidos kits que contêm anticorpos para detecção e quanti- ficação de HHLA2in vitro, por exemplo, em um ELISA ou Western blot. Agentes exemplificativos adicionais que os kits podem conter incluem meios de detecção do marcador (por exemplo, substratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, conjuntos de filtros para detectar mar- cadores fluorescentes, marcadores secundários apropriados, como um HRP de ovelha anticamundongo, etc.) e reagentes necessários para controles (por exemplo, amostras biológicas de controle ou padrões de proteína HHLA2). Um kit pode incluir adicionalmente tampões e outros reagentes reconhecidos para uso em um método da invenção divulga- da. Os exemplos não limitativos incluem agentes para reduzir a ligação não específica, como uma proteína transportadora ou um detergente. Um kit da presente invenção também pode incluir materiais de instru- ção divulgando ou descrevendo o uso do kit ou de um anticorpo da invenção divulgada em um método da invenção divulgada, conforme fornecido neste documento.

[00560] Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitativos. O conteúdo de to- das as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste pedido, bem como as Figuras, são incorporados neste documento por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Derivação de anticorpos monoclonais anti-HHLA2 hu- mana

[00561] Vários anticorpos monoclonais anti-HHLA2 foram gerados e analisados. Resumidamente, a proteína de fusão HHLA2-mIgG2a hu- mana foi produzida antes da imunização e geração de anticorpos mo- noclonais de camundongo. A região de codificação de HHLA2 humana foi amplificada por PCR usando os iniciadores 5'- TGTTCTGCACAAGACA-3 '(iniciador sentido localizado apenas 5' do início de ATG) e 5'-GTAAGGATGCAGGTCATGAGT-3' (iniciador antis- senso localizado apenas 3' do códon de parada) e introduzido no vetor pEF6 por clonagem de TA. A proteína de fusão HHLA2-mIgG2a foi produzida pela fusão de cDNAs do domínio extracelular de HHLA2 nos domínios da dobradiça e do Fc da IgG2a do camundongo (com muta- ções para reduzir a ligação aos receptores Fc) e clonagem no vetor pEF6. O construto foi introduzido em células CHO e a proteína de fu- são HHLA2-mIgG2a foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína G.

[00562] Cinco camundongos (Balb/c; C57Bl/6; Swiss-Webster), com 4-6 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Todos os animais foram adquiridos e mantidos de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Commit- tee of Harvard Standing Committee on Animals.

[00563] Para a imunização inicial, cinquenta microgramas de prote- ína de fusão HHLA2-mIgG2a recombinante foram suspensos em solu- ção salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS; GIBCO, Grand Island, NY) e emulsionados com igual volume de adjuvante de Freund completo (Sigma Chemical Co., St. Louis , MO). Os camundongos fo- ram imunizados por injeção da emulsão em cinco locais subcutâneos,

onde foram encontrados linfonodos (inguinal, braquial, axilar e cervical superficial) e intraperitonealmente. Quatorze dias após a imunização inicial, os camundongos receberam imunização de reforço com cin- quenta microgramas de proteína de fusão HHLA2-mIgG2a recombi- nante emulsionada com um volume igual de adjuvante de Freund in- completo intraperitonealmente. Quatorze dias depois, os camundon- gos receberam um reforço com cinquenta microgramas de proteína de fusão HHLA2-mIgG2a recombinante emulsionada com um volume igual de adjuvante de Freund incompleto intraperitonealmente. Qua- renta e dois dias depois, os camundongos receberam um reforço com cinquenta microgramas de proteína de fusão HHLA2-mIgG2a recom- binante emulsificada com um volume igual de adjuvante de Freund in- completo e cinquenta microgramas desnaturados de proteína de fusão HHLA2-mIgG2a recombinante intraperitonealmente. A proteína foi desnaturada por fervura durante 5 minutos na presença de dodecilsul- fato de sódio 0,1%. Treze dias depois, os camundongos receberam um reforço com cinquenta microgramas de proteína de fusão HHLA2- mIgG2a recombinante emulsionada com um volume igual de adjuvante de Freund incompleto e cinquenta microgramas desnaturados de pro- teína de fusão HHLA2-mIgG2a recombinante intraperitonealmente. Uma pequena quantidade de sangue foi coletada 10-12 dias após os reforços. A atividade sérica contra HHLA2 foi titulada por citometria de fluxo em células 300.19 transfectadas com cDNA de HHLA2 e células

300.19 não transfectadas. Trinta e seis dias, os camundongos recebe- ram um reforço final por via intraperitoneal e intravenosa com cinquen- ta microgramas de proteína de fusão HHLA2-mIgG2a recombinante desnaturada.

[00564] O camundongo #5 com o título mais alto foi selecionado para fusão 4 dias depois. O baço e os nódulos linfáticos colhidos foram transformados numa suspensão de células e depois lavados com

DMEM. As células do baço/nódulo linfático foram contadas e mistura- das com células de mieloma SP 2/0 que são incapazes de secretar cadeias de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve (Kearney et al. (1979) J. Immunol. 123:1548-1550 and Kilpatricket al. (1997) Hybrido- ma 16:381-389) usando uma razão baço:mieloma de 2:1. As células foram fundidas com polietilenoglicol 1450 em oito placas de cultura de tecidos de 96 poços em meio de seleção HAT de acordo com proce- dimentos padrão (Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497).

[00565] Entre 10 e 21 dias após a fusão, as colônias de hibridoma tornaram-se visíveis e os sobrenadantes da cultura foram colhidos e depois selecionados contra HHLA2 por citometria de fluxo em células

300.19 transfectadas com cDNA de HHLA2 e falta de reatividade em células 300.19 não transfectadas. Exemplo 2: Anticorpos anti-HHLA2

[00566] Vários mAbs anti-HHLA2 foram sequenciados para analisar suas regiões CDR. Resumidamente, RACE (Amplificação rápida de extremidades de cDNA) foi realizada para amplificar DNA para vH e vL (desnaturação de mRNA, síntese de cDNA, reação 5' RACE e resulta- dos de PCR analisados). Para identificar clones positivos, as amostras de reação de PCR foram analisadas em um gel de agarose para visua- lizar os fragmentos de DNA amplificados. Os fragmentos de DNA da região variável do anticorpo corretos devem ter um tamanho entre 500 e 700 pares de bases. As bandas positivas para PCR foram clonadas em TOPO e depois amplificadas por PCR, seguidas de eletroforese em gel, recuperação de gel de fromagarose e sequenciamento. A aná- lise de CDR foi realizada usando dados de sequenciamento (as regi- ões de CDR foram definidas usando VBASE2, consulte a World Wide Web em vbase2.org/)

[00567] A Tabela 2 lista os resultados do sequenciamento de mAb. As cadeias leves dos anticorpos são do tipo kappa. Os anticorpos de camundongo 8A12, 8D2 e 1C8 são isótipos IgG2a, enquanto 2C4, 5H4, 6G8, 6D10, 2G2, 4D1, 4E5 e 6F10 são isótipos IgG1.

[00568] Os anticorpos anti-HHLA2 recentemente identificados foram caracterizados quanto à ligação in vitro e ao bloqueio de TMIGD2.

[00569] Em particular, a afinidade de ligação para cada anticorpo anti-HHLA2 foi testada. O cDNA de HHLA2 e um vetor que codifica a resistência à puromicina foram cotransfectados por eletroporação (300 volts, 1600 microfarads) em células 300.19 de camundongo e selecio- nados com meio contendo 5 µg/ml de puromicina. As células que ex- pressam HHLA2 foram identificadas por coloração com proteína de fusão TMIGD2-Fc humano e anticorpo anti-Fc humano de cabra con- jugado com ficoeritrina e célula única classificada por citometria de flu- xo. A expressão de HHLA2 em clones individuais foi confirmada por citometria de fluxo como descrito acima. As células 300.19 transfecta- das com HHLA2 foram tituladas com mAbs anti-HHLA2 (Figura 1A).

[00570] A Figura 1B mostra os resultados da avaliação do bloqueio de TMIGD2 por citometria de fluxo. Resumidamente, foram realizados ensaios para o bloqueio do mAb anti-HHLA2 da ligação de TMIGD2- IgG humana a células 300.19 transfectadas com células HHLA2 hu- manas. Por exemplo, 20 µl (equivalente a 25.000 de 300,19 células) de estavelmente transfectados com HHLA2 humano foram adiciona- dos por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Cinquenta 50 µl de anticorpo por poço. As diluições não diluídas, 1 a 10 e 1 a 100 foram testadas. As células foram pipetadas para cima e para baixo pa- o ra ressuspender as células em mAb e incubadas a 4 C por 30 min com mistura em uma plataforma rotativa. Vinte µl de 2 µg/ml de proteína de fusão TMIGD2 humana-IgG1 humana (R&DSystems catalog # 8316- TR-050) em tampão FACS (PBS mais 2% de FBS, 0,02% de azida) foram adicionados a cada poço. Um poço de controle negativo de célu- las sem TMIGD2-hIgG e um controle positivo de TMIGD2 com controle de isótipo de IgG de camundongo foram incluídos. A placa foi incuba- o da a 4 C por 30 min com mistura. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS e o sobrenadante removido. Cinquenta µl de 2,5 µg/ml de segundo anticorpo (Fab2 de cabra anti-IgG-PE humana, com absorção cruzada contra Ig de camundongo; Southern Biotech 2043- 09) foram adicionados por poço. As células foram pipetadas para cima e para baixo 3 vezes para ressuspender as células em Ab e incubar a o 4 C por 30 min com mistura. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS e o sobrenadante foi removido. As células foram res- suspensas em 80 µl de PBS mais 2% de formaldeído e a ligação foi analisada em máquina FACS. O tampão FACS (PBS mais 2% FBS, 0,02% azida) foi usado.

[00571] A Figura 2 mostra os resultados de Western blotting das linhagens de células tumorais humanas analisadas usando o anticorpo anti-HHLA2 monoclonal 8D2. Resumidamente, os lisados de proteína foram preparados com tampão RIPA de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Scientific), e um coquetel de inibidor de protease foi adicionado ao tampão (comprimidos Ultra completos, mini, sem EDTA, Roche) antes da preparação do lisado. Os lisados de proteína foram feitos a partir de células 300.19 transfectadas de forma estável com HHLA2 humano e a partir das linhagens de células tumorais hu- manas indicadas. L428 e HDLM2 são linhagens de células de linfoma de Hodgkin, OC1-Ly1 é uma linhagem de células de linfoma não Hod- gkin de células B (células grandes difusas), Raji é uma linhagem de células de linfoma de Burkitt, Jurkat E6 é uma linhagem de células de leucemia de células T, THP-1 é uma linhagem de células de leucemia monocítica aguda, MDA231 e SKBR são linhagens de células de tu- mor de mama, CAKI2 é uma linhagem de células de carcinoma de cé- lulas renais de células claras (ccRCC). Oitenta µg de lisados foram carregados em um gel mini-Protean TGX com gradiente de 4-15% (Bi-

oRad) e transferidos por um método semisseco. As membranas foram bloqueadas com solução salina tamponada com Tris com Tween20 (TBST) com 12% de leite desnatado e 1% de soro de cabra normal por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana foi lavada com TBST e incubada com o anticorpo primário (concentração final de 1 µg/mL anti- HHLA2 mAb 499.5.8D2 em TBST e 1% BSA) a 4oC durante a noite. As membranas foram lavadas com TBST três vezes à temperatura ambi- ente e incubadas com anticorpo secundário (1:4000, anticorpo HRP de cabra anticamundongo conjugado com rábano, Southern Biotech Cata- log # 1030-05) em TBST, 6% de leite desnatado e 0,5% de soro de cabra normal por 30 min. Após 3 lavagens adicionais com TBST, uma razão de 1:1 de substrato ECL:intensificador foi adicionada à membra- na (SuperSignal West Pico Stable Peroxide Solution, Supersignal West Pico Luminol/Enhancer Solution, ThermoScientific) e fotografada em filme de autorradiografia Hyblot CL (Denville Scientific). Exemplo 3: Expressão de mRNA de HHLA2 em tecido normal e cancerígeno

[00572] A Figura 3 mostra os resultados da expressão de mRNA de HHLA2 em comparação com outros inibidores de ponto de verificação imune em rim normal vs câncer renal. A expressão dos receptores imunes do membro da família B7 indicados e leucócitos infiltrantes de tumor em rim normal e tumores renais foram avaliados por normaliza- ção de dados de seq de RNA do banco de dados TCGA. Foi observa- da uma expressão aumentada do receptor nos tumores em compara- ção com os tecidos normais para PD-L1, PD-L2, B7-H3, VISTA e HHLA2. Níveis aumentados também foram observados para células infiltrantes de tumor CD8+ e CD14+ em tumores em comparação com o tecido normal.

[00573] Da mesma forma, a Figura 4 mostra os resultados da ex- pressão de HHLA2 em vários cânceres do banco de dados TCGA (Fi-

gura 4). Resumidamente, o perfil de expressão de HHLA2 em vários tipos de câncer foi investigado usando o banco de dados de TCGA (supervisionado pelo National Cancer Institute's Center for Cancer Ge- nomics and the National Human Genome Research Institute) por aná- lise de RNAseq. Como mostrado na Figura 4, a HHLA2 é expressa em altos níveis (negrito e itálico) no carcinoma de células claras e de célu- las renais papilares, adenocarcinoma de pulmão, câncer colorretal e pancreático e moderadamente expressa em AML, cânceres cervical, de cabeça e pescoço, de fígado, ovário, próstata, câncer testicular e carcinoma de células escamosas do pulmão.

[00574] A Figura 5 mostra os resultados da expressão de H HLA2 por imuno-histoquímica, como em arranjos de tumor de câncer renal de linhagens de células positivas e negativas para HHLA2. A expres- são de HHLA2 em arranjos e linhagens de células de tumor de câncer renal foi detectada por imuno-histoquímica. Seções de tecido e linha- gens de células re-hidratadas embebidas em parafina foram fervidas em tampão EDTA pH 8 (Life Technologies) com uma panela de pres- são (Biocare Medical) por 30 segundos a 125oC. Após resfriamento à temperatura ambiente (RT), as seções de tecido foram sucessivamen- te incubadas com um bloco de peroxidase (Dual Endogenous Enzyme Block, Dako) e um bloco de proteína (Serum Free Block, Dako) por 5 minutos cada em RT. As seções foram incubadas em seguida por 1 hora à temperatura ambiente com um anticorpo anti-HHLA-2 de ca- mundongo (1/100, clone 8D2) diluído em diluente de anticorpo com componentes redutores de fundo (Dako). As seções de tecido foram então incubadas durante 30 minutos à TA com o anticorpo anticamun- dongo conjugado com rábano (HRP) (Dako) EnVision®. A visualização da HRP foi realizada aplicando substrato 3,3-diaminobenzidina (DAB+, Dako). Entre cada etapa, na isenção do bloco de proteína e nas eta- pas de incubação do anticorpo primário, as seções de tecido foram lavadas por 5 minutos em tampão de lavagem (Tris 0,1 mM, pH 7,4 + Tween 20 0,05%). Os núcleos foram contrastados com hematoxilina (Figuras 5A-5D).

[00575] A Figura 11 mostra a porcentagem da expressão de HHLA2 em cânceres de pulmão de células não pequenas PD-L1 positivos e negativos calculada com base no estudo de imunocoloração de HHLA2 e PD-L1 (Cheng et al. (2018) Clin. Cancer Res.24:1954-1964). Foi demonstrado que 63% da população total de NSCLC é direcioná- vel com HHLA2. Exemplo 4: Identificação do receptor HHLA2

[00576] HHLA2 foi identificada como um ligando específico para TMIGD2 e a interação HHLA2/TMIGD2 seletivamente coestimula o crescimento de células T humanas e a produção de citocinas através de uma cascata de sinalização dependente de AKT (Zhu et al. (2013) Nat. Comm. 4:2043; Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2359–2366). Um segundo receptor para HHLA2 em células T ativa- das que exerce uma função coinibitória foi sugerido por vários estudos (Zhao et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:9879–9884; Xiao and Freeman et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201–2203; Wang et al. (2014) J. Immunol. 192:126.11). No presente estudo, a ligação de TMIGD2 à HHLA2 foi confirmada e um novo receptor de HHLA2, KIR3DL3, foi identificado. Resumidamente, uma biblioteca de > 4.500 clones de comprimento total cobrindo mais de 3.500 proteínas de membrana plasmática diferentes expressas em células HEK293 e im- pressas em lâminas usando a tecnologia de microarranjo celular (Re- trogenix, Whaley Bridge, Reino Unido) foi avaliada quanto à ligação a proteínas de fusão HHLA2-mIg humanas solúveis.

[00577] As condições do ensaio para ligação foram desenvolvidas primeiro, antes do início da triagem completa. As lâminas impressas com o receptor de controle positivo de TMIGD2 ou as células transfec-

tadas com EGFR de controle negativo ou as células não transferidas foram avaliadas quanto à ligação específica à HHLA2-mIgG2a solúvel em concentrações de 2, 10 e 20 µg/ml, como detectado com um anti- corpo de detecção de IgG anticamundongo marcado com AF647, pré- complexada com HHLA2-mIgG2a na razão molar de 2:1 ou adicionada sequencialmente.

[00578] Para a triagem primária, 4.500+ vetores de expressão, cada um codificando uma proteína de membrana plasmática humana de comprimento total, foram dispostos em duplicata em 13 lâminas de mi- croarranjo ("conjuntos de lâminas"), respectivamente.

[00579] Um vetor de expressão (pIRES-hEGFR-IRES-ZsGreen1) foi localizado em quadruplicado em cada lâmina e foi usado para garantir que um limiar mínimo de eficiência de transfecção tinha sido alcança- do ou excedido em cada lâmina. Este limiar mínimo (sinal ZsGreen1 médio do vetor pIRES-EGFR-ZsGreen1 sobre fundo de 1,5) foi defini- do anteriormente.

[00580] A proteína de fusão HHLA2-mIgG2a humana foi adicionada a lâminas de lâminas de células HEK293 transfectadas e fixas a uma concentração de 20 ug/ml e a proteína foi detectada com um anticorpo de detecção de IgG anticamundongo marcado com AF647. Duas répli- cas de lâminas foram selecionadas para cada um dos 13 conjuntos de lâminas. As imagens fluorescentes foram analisadas e quantificadas (para eficiência de transfecção) usando o software ImageQuant (GE). Um 'hit' de proteína foi definido como pontos duplicados, mostrando um sinal aumentado em comparação com os níveis de fundo. Isso foi obtido por inspeção visual usando as imagens em grade no software ImageQuant.

[00581] Os acertos foram classificados como 'fortes, médios, fracos ou muito fracos', dependendo da intensidade dos pontos duplicados. Todos os vetores que codificam as ocorrências identificadas em uma ou ambas as telas primárias foram sequenciados para verificar suas identidades.

[00582] A fim de determinar quais ocorrências, se houver, eram re- produzíveis e específicas para a HHLA2 humana, todos os vetores que codificam as ocorrências primárias, mais os receptores KIR de controle apropriados, foram organizados em novas lâminas. Lâminas idênticas foram selecionadas com cada ligando de teste, usando as doses e as condições de incubação usadas nas telas primárias e controles positi- vos e negativos apropriados (n = 2 lâminas por tratamento).

[00583] A triagem de mais de > 4500 clones de receptor de superfí- cie celular de comprimento total usando HHLA2-mIgG2a solúvel identi- ficou KIR3DL3 como um sucesso para a ligação de HHLA2. Os resul- tados da triagem de um conjunto representativo de ~ 300 clones da membrana plasmática em duplicados são mostrados na Figura 6A. A adição do anticorpo de detecção de IgG anticamundongo marcado com AF647 na ausência de HHLA2-mIgG2a não produziu sinal.

[00584] A tela de confirmação nas lâminas recém-dispostas mos- trou a ligação do HHLA2 ao KIR3DL3 (Figura 6A). A adição do anticor- po de detecção de IgG anticamundongo marcado com AF647 sozinho na ausência de HHLA2-mIgG2a não produziu sinal. A seletividade da ligação de HHLA2 a KIR3DL3 foi avaliada usando um painel de 14 re- ceptores KIR dispostos em lâminas. A ligação seletiva de HHLA2 a KIR3DL3 foi demonstrada (Tabela 4 e Figuras 6B-6C). Tabela 4 Receptor KIR3 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR2 KIR3 KIR3 KIR3 KIR DL3 DL1 DL2 DL3 DL4 DL5A DL5B DS1 DS2 DS3 DS5 DL1 DS1 DL2 HHLA2 + - - - - - - - - - - - - - Ligação Exemplo 5: Ensaios de ativação de células T para confirmar a ini- bição do ponto de verificação imune de mAbs anti-HHLA2 huma- na A. Construção de plasmídeo

[00585] O ativador de TCR, um anticorpo quimérico ancorado na membrana, foi construído pela fusão do fragmento variável de cadeia única (scFv) de um mAb OKT3 anti-CD3 humano (Kipriyanov et al.(1997)PEDS 10:445-453) para o domínio C-terminal (resíduos 113- 220) de CD8α de camundongo (número de acessão: NP_001074579.1) que inclui domínios de dobradiça, transmembrana e citoplasmático. Ao fazer isso, o scFv anti-CD3 foi ancorado à superfície da célula CHO-K1 como um ativador de células T. A sequência de DNA que codifica o ativador TCR foi sintetizada e inserida no vetor pI- RES-hyg3 (ClonTech) para fazer o construto resultante TCRpIREShyg3.

[00586] A sequência de DNA de HHLA2 humano (número de aces- são:NP_009003.1 e TMIGD2 (número de acessão: NM_144615.2) foi clonada em pIRES-Hyg3 ou pIRES-Neo3 individualmente para fazer HHLA2_pIRESneo3 e TMIGD2_pIREShyg3, respectivamente. A se- quência de DNA de KIR3DL3 (número de acessão: BC143802.1 da Genecopoeia) foi sintetizada e inserida no vetor puroEIF2.

[00587] O repórter NFAT contém um gene da luciferase do pirilam- po sob o controle de quatro cópias do elemento de resposta NFAT se- guido por um promotor mínimo. O repórter IL2 contém um gene da lu- ciferase do pirilampo sob o controle de um promotor IL2 endógeno. A sequência de DNA que codifica os repórteres foi inserida no pcDNA

3.1 para gerar NFAT-Luc-pcDNA e IL2-Luc-pcDNA. B. Linhagens de células e cultura de células

[00588] As células Parental Jurkat (clone E6-1) (ATCC # TIB-152) e CHO-K1 (ATCC # CCL-61) foram obtidas da ATCC. As células Jurkat foram cultivadas a 37°C com 5% de CO2 usando meio RPMI1640 (Life Technologies # A10491-01) suplementado com 10% de FBS (Life Technologies # 26140-079) e 1% de penicilina/estreptomicina (Hyclone #SV30010.01).

[00589] A cultura de linhagem celular estável TMIGD2-NFAT-Jurkat foi suplementada com 1000 µg/ml de Geneticina (Life Technologies # 11811031) e 200 µg/ml de Higromicina (Invitrogen # 10687010) para garantir a expressão recombinante de TMIGD2 e repórter NFAT.

[00590] A cultura da linhagem celular estável KIR3DL3-IL2-Jurkat foi suplementada com 1000 µg/ml de Geneticina e 250 ng/ml de puro- micina (InvivoGen #ant-pr-1) para garantir que a expressão recombi- nante de KIR3DL3 e repórter IL-2 fosse mantida.

[00591] As células CHO foram mantidas em meio F12-K (Hyclone #SH30526.01) suplementado com 10% de FBS e 1% de Penicili- na/Estreptomicina. A cultura da linhagem celular estável HHLA2-TCR- CHO foi suplementada com 1000 µg/ml de Geneticina e 500 µg/ml de Higromicina para assegurar que a expressão recombinante de HHLA2 e ativador de TCR fosse mantida. C. Geração de repórter Jurkat e linhagens de células estáveis

CHO

[00592] Clones Jurkat: Para fazer a linhagem celular estável TMIGD2-NFAT-Jurkat, as células Jurkat (clone E6-1) foram cotransfec- tadas sequencialmente com NFAT_Luc_pcDNA e TMIGD2_pIREShyg3 por eletroporação. Os clones estáveis foram ge- rados por higromicina e dupla seleção de G418 e diluição limitativa. O clone celular estável escolhido foi mantido com meio de cultura celular completo suplementado com higromicina e G418. As células foram mantidas em RPMI + 10% FBS + 1% P/S + 1000 μg/mL G418 + 200 μg/mL Higromicina.

[00593] Para fazer a linhagem celular estável KIR3DL3-IL2-Jurkat, as células Jurkat (clone E6-1) foram cotransfectadas sequencialmente com IL2_Luc_pcDNA e KIR3DL3_puro por eletroporação. Os clones estáveis foram gerados por puromicina e dupla seleção de G418 e di- luição limitativa. O clone celular estável escolhido foi mantido com meio de cultura celular completo suplementado com puromicina e G418. As células foram mantidas em RPMI + 10% FBS + 1% P/S + 1000 μg/mL G418 + 250 ng/mL Puromicina.

[00594] Clones Jurkat parentais expressando apenas o promotor NFAT (Jurkat-Luciferase) ou IL-2 (Jurkat-IL-2) foram mantidos em RPMI + 10% FBS + 1% P/S + 1000 μg/mL G418 (BPS Biosciences).

[00595] Clones de células CHO: Para fazer a linhagem celular está- vel HHLA2-TCR-CHO, as células CHO-K1 foram cotransfectadas se- quencialmente com TCRa_pIREShyg3 e HHLA2pIRESneo3 por Lipo- fectamine® 2000 (Invitrogen). Os clones estáveis foram gerados por higromicina e dupla seleção de G418 e diluição limitativa. O clone ce- lular estável escolhido foi mantido com meio de cultura celular comple- to suplementado com higromicina e G418. As células foram mantidas em F12-K + 10% FBS + 1% P/S + 1000 μg/mL G418 + 500 μg/mL Hi- gromicina. Os clones CHO parentais que expressam scFv anti-CD3 foram manti- dos em F12-K + 10% FBS + 1% P/S + 500 μg/mL Higromicina (BPS Biosciences). D. Ensaios de gene repórter Jurkat

[00596] Ensaio de coestimulação do gene repórter Jurkat TMIGD2 NFAT e inibição por anticorpos HHLA2:células HHLA2-TCR-CHO fo- ram semeadas a 2 x 104 células / densidade de poço em meio de crescimento CHOK1 em uma placa de 96 poços de fundo opaco bran- co. As células fixaram-se à placa após incubação durante a noite a 37°C com 5% de CO2.No dia seguinte, o meio foi cuidadosamente re- movido de cada poço, o anticorpo anti HHLA2 em 50 µl de meio de células Jurkat foi adicionado e as células HHLA2-TCR-CHO foram in- cubadas por uma hora antes da adição da linhagem de células repór- ter Jurkat TMIGD2_NFAT_Jurkat a 4-5 x 104 células/poço em 50 µl de meio de células Jurkat. O poço da placa foi misturado e incubado du-

rante aproximadamente 3-6 horas. Para desenvolver o sinal de lucife- rase, 100 µl do ONE-Step™ Luciferase Assay System (BPS Bioscien- ce, Cat. #60690) foram adicionados a cada poço, de acordo com o protocolo recomendado. A luminescência foi lida usando um luminô- metro.

[00597] Ensaio de inibição do gene repórter KIR3DL3IL2 Jurkat e reversão por anticorpos HHLA2: as células HHLA2-TCR-CHO foram semeadas em 2 x 104 células/densidade de poço em meio de cresci- mento CHOK1 em uma placa de 96 poços de fundo branco opaco. As células aderiram à placa após incubação durante a noite a 37°C com 5% de CO2.No dia seguinte, o meio foi cuidadosamente removido de cada poço, anticorpo anti HHLA2 em 50 µl de meio de células Jurkat foi adicionado, e células HHLA2-TCR-CHO foram incubadas por uma hora antes da adição da linhagem celular repórter KIR3DL3_IL2_Jurkat em 4-5 x 104 células/poço em 50 µl de meio de células Jurkat, mais 2 µg/mL de anticorpo anti-CD28 (BPS Bioscience #100186) (concentração final de 1 μg/mL em 100 μL de mistura de en- saio por poço. O poço da placa foi misturado e incubado durante apro- ximadamente 5 horas. Para desenvolver o sinal de luciferase, 100 µl do ONE-Step™ Luciferase Assay System (BPS Bioscience, Cat. #60690) foram adicionados a cada poço, de acordo com o protocolo recomendado. A luminescência foi lida usando um luminômetro.

[00598] Usando esses materiais e métodos, os mAbs HHLA2 ou anticorpos de controle de isótipo foram avaliados quanto ao bloqueio de coestimulação no ensaio de coestimulação de células T TMIGD2/HHLA2 como mostrado na Figura 14 e delineado na Tabela 9 abaixo. Tabela 9: esboço do estudo para avaliação de mAbs HHLA2 no ensaio de coestimulação de células T TMIGD2/HHLA2

Células Jurkat NFAT de Célula CHO estimulante Resposta Espera- respondedor da Jurkat NFAT/TMIGD2 Célula CHO-parental Nenhuma Jurkat NFAT/TMIGD2 CHO-Anti-CD3 Fv Ativação Jurkat NFAT/TMIGD2 CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 Ativação intensifi- cada Jurkat NFAT/TMIGD2 CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 Reversão da Ativa- + HHLA2 mAb ção intensificada

[00599] A expressão de HHLA2 em células CHO transfectadas com scFV anti-CD3 e HHLA2 foi detectada (Figura 15). A expressão de TMIGD2 em células repórter Jurkat NFAT transfectadas com TMIGD2 também foi detectada (Figura 16). Células CHO que expressam scFV anti-CD3 e HHLA2 e células repórter Jurkat NFAT que expressam TMIGD2 foram usadas no ensaio de coestimulação de células T. Veri- ficou-se que o mAb HHLA2 (6F10) reverteu a ativação aumentada in- duzida por HHLA2, enquanto o anticorpo de controle do isótipo não teve esse efeito (Figura 17).

[00600] Os mAbs HHLA2 ou anticorpos de controle de isótipo tam- bém foram avaliados quanto ao bloqueio do ponto de verificação no ensaio de inibição de células T KIR3DL3/HHLA2, conforme mostrado na Figura 18 e descrito abaixo na Tabela 10. Tabela 10: Esboço do estudo do ensaio de ponto de verificação de cé- lulas T KIR3DL3/HHLA2 (ensaio do gene repórter de IL-2 de células T Jurkat) Célula NFAT Jurkat Célula CHO estimulante Resposta Esperada de respondedor Jurkat IL-2/ KIR3DL3 Célula CHO-parental Nenhuma Jurkat IL-2/KIR3DL3 CHO-Anti-CD3 Fv Ativação Jurkat IL-2/KIR3DL3 CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 Inibição Jurkat IL-2/KIR3DL3 CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 Reversão da Inibição + HHLA2 mAb

[00601] Foi detectada a expressão de KIR3DL3 em células repórte-

res Jurkat-IL-2 transfectadas com KIR3DL3 (Figuras 19A e 19B). Célu- las CHO que expressam scFV anti-CD3 e HHLA2 e células repórter Jurkat-IL-2 que expressam KIR3DL3 foram usadas no ensaio de inibi- ção de células T. Verificou-se que os mAbs HHLA2 (clone 6F10 e clo- ne 2C4) reverteram a inibição por HHLA2, ao passo que o anticorpo de controle de isótipo não teve esse efeito (Figuras 20A-20C e 21A- 21C).O clone 2C4 do mAb HHLA2 seletivo para KIR3DL3 não bloque- ou a coestimulação mediada por TMIGD2 (Figura 22).

[00602] Os dados aqui descritos demonstram TMIGD2 como um receptor coestimulatório de células T para HHLA2, e foram identifica- dos mAbs de HHLA2 que bloqueiam a coestimulação de TMIGD2. Es- tes dados também demonstram KIR3DL3 como um receptor inibidor de células T para HHLA2, e bloqueadores de ponto de verificação de mAb HHLA2 foram identificados.

[00603] Ensaios adicionais podem ser usados para avaliar os mAbs de HHLA2. Por exemplo, os ensaios de células T de aloestimulação, como aqueles que usam células T CD4 e DCs ou macrófagos deriva- dos de monócitos alogênicos, podem ser usados para confirmar a ini- bição do ponto de verificação imune de mAbs anti-HHLA2 humana. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, como descrito em Wang et al. (2014)Cancer Immunol. Res.2:846 and Brown et al. (2003)J. Immunol. 170:1257.

[00604] Em algumas modalidades, a HHLA2 é expressa em células dendríticas e macrófagos. Os métodos de derivação de culturas de células dendríticas são bem conhecidos na técnica, como em, por exemplo, Zhao et al.(2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110:9879 and Zhu et al.(2013) Nat. Comm. 4:2043.

[00605] Em algumas modalidades, DCs imaturas derivadas de mo- nócitos (iDCs) são geradas por cultura de monócitos isolados de PBMCs usando um kit de purificação de monócitos (Miltenyi Biotec) e cultura por 7 dias com 50 ng/ml de IL-4 e 100 ng/ml de GM-CSF (R&D Systems). As DCs ativadas derivadas de monócitos podem ser gera- das cultivando monócitos isolados de PBMCs usando um kit de purifi- cação de monócitos (Miltenyi Biotec) e cultivando por 7 dias com 1 ug/ml de LPS e 100 ng/ml de IFN-gama ou poli IC.

[00606] Em algumas modalidades, os macrófagos são gerados por cultura de monócitos isolados de PBMCs usando um kit de purificação de monócitos (Miltenyi Biotec) e são cultivados por 3 dias na presença de 100 ng/ml de LPS mais 100 ng/ml de IFN-g ou Poly IC.

[00607] Culturas de células dendríticas e macrófagos podem ser avaliadas quanto à expressão de HHLA2, TMIGD2 (CD28H) e PD-L1 por citometria de fluxo usando anticorpos contra esses antígenos.

[00608] Os ensaios de ativação de células T de aloestimulação po- dem ser usados para medir a proliferação de células T. Resumidamen- te, em algumas modalidades, células T CD4+ (1x 105) e DCs alogêni- cas (1x 104) ou macrófagos derivados como descrito acima são cocul- tivadas em uma razão de 10:1 (T/DC) com e sem anti-HHLA-2 huma- na, PD-1 (nivolumabe) e anticorpos de controle de isótipo por 6 dias. A secreção de IFN-gama em sobrenadantes de cultura no dia 5 é medi- da por ELISA (kits da BD biosciences ou R&D). A proliferação de célu- las T no dia 6 é medida por diluição CFSE usando citometria de fluxo.

[00609] Em algumas modalidades, os níveis de IL-2 e IFN-gama podem ser usados para confirmar a ativação de células T, como o uso de ensaios de ativação de PBMC estimulados por SEB (ver, por exemplo, Wang et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2:846). Por exem- plo, PBMCs (105 células) de doadores saudáveis podem ser coculti- vadas com ou sem concentrações de saturação de anti-HHLA-2 hu- mana, PD-1 (nivolumabe) e anticorpos de controle de isótipo por 3 dias na presença de Staphylococcal enterotoxina B (SEB; Toxin Techno- logy) concentrações de 1, 0,1 e 0,01 ug/ml. Os níveis de IL-2 e IFN-

gama em sobrenadantes de cultura podem ser medidos por ELISA ou análise multiplex (BD Biosciences).

[00610] Em outras modalidades, os ensaios de recuperação de ati- vação de PBMC estimulados por lisado de CMV podem ser usados para confirmar a ativação de células T (ver, por exemplo, Sinclair et al. (2004) Viral Immunol. 17:445 and Wang et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2:846). Por exemplo, PBMCs (2 x105 células) de doadores CMV- positivos podem ser cocultivadas com e sem anti-HHLA-2 humana, PD-1 (nivolumabe) e anticorpos de controle de isótipo e são estimula- das com lisado de células infectadas por CMV (3 ug/ml, Advanced Bio- technologies) por 4 dias. A secreção de IFN-gama em sobrenadantes de cultura pode ser medida por ELISA (kits da BD biosciences ou R&D). A proliferação de células T pode ser medida por diluição de CFSE usando citometria de fluxo.

[00611] Em algumas modalidades, um ensaio de reação de linfóci- tos mistos com base em tumor (MLR) pode ser usado para confirmar a ativação de células T (ver, por exemplo, McWhirter et al. (2006)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.103:1041). Por exemplo, células dendríticas (DC's) podem ser geradas por cultura de monócitos isolados de PBMC's usando um kit de purificação de monócitos (Miltenyi Biotec) e cultivadas por 5 dias com 500 U/ml IL-4, 800 U/ml GM-CSF e 100 ug/ml de IFN-gama. Culturas de linfócitos mistos podem ser configura- das em placas de 24 poços usando células dendríticas (2x 105), célu- las CD3+ alogênicas (1x 106), e células tumorais irradiadas que ex- pressam HHLA2 (2x 105) na presença de mAbs anti-HHLA2 ou contro- les de isótipo (10 ug/ml) por 48 horas. Os sobrenadantes são colhidos e avaliados quanto à produção de citocinas usando um kit de ensaio de citocinas multiplex.

[00612] Em algumas modalidades, os ensaios do gene repórter NFAT-Luc de células T Jurkat podem ser usados para confirmar a ati-

vação de células T (ver, por exemplo, o site de biociência BPS e Wang et al. (2017)J.

Pharm.

Biomed.

Anal. 145:247). Por exemplo, as célu- las T Jurkat transfectadas com o cassete do gene repórter NFAT- Luciferase (BPS bioscience) e o receptor KIR3DL (veja o teste #1 abaixo) ou o receptor TMIGD2 (veja o teste #2 abaixo) são estimula- das com células CHO transfectadas com anti-CD3 scFV transmembra- nar (biociência de BPS) e HHLA2 na presença ou ausência de mAbs anti-HHLA2 (Figura 7). As configurações exemplficativas do ensaio do gene do receptor Jurkat NFAT estão listadas na Tabela 5 abaixo.5x104 células CHO são semeadas em placas de ensaio de 96 poços e culti- vadas durante 12-14 horas.

As células CHO aderentes são pré- incubadas com mAb anti-HHLA2 ou controle de isótipo a 10 ug/ml du- rante 1 hora a 370C. 1x105 células Jurkat são co cultivadas com célu- las CHO por 6 horas e substrato luminescente é adicionado e as uni- dades de luciferase são quantificadas usando um luminômetro.

Tabela 5 Ensaio #1: Ensaio KIR3DL3 Célula NFAT Jurkat de Célula CHO estimulante Resposta respondedor Jurkat NFAT/KIR3DL3 (# Célula CHO-parental Sem ativa- de Acessão BC143802.1) ção Jurkat NFAT/KIR3DL3 (# CHO-Anti-CD3 Fv (mesmo clo- Ativação de Acessão BC143802.1) ne anti-CD3 usado para o en- saio PD-1) Jurkat NFAT/KIR3DL3 (# CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 Inibição de Acessão BC143802.1) (mesmo clone anti-CD3 usado para o ensaio PD-1) Jurkat NFAT/KIR3DL3 (# CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 + Reversão de de Acessão BC143802.1) Anti-HHLA2 6F10 mAb Inibição (mesmo clone anti-CD3 usado para o ensaio PD-1) Ensaio #2: Ensaio TMIGD2 Célula NFAT Jurkat de Célula CHO estimulante Resposta respondedor Jurkat NFAT/TMIGD2 Célula CHO-parental Sem ativa- ção Jurkat NFAT/TMIGD2 CHO-Anti-CD3 Fv (mesmo clo- Ativação ne anti-CD3 usado para o en- saio PD-1) Jurkat NFAT/TMIGD2 CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 Ativação in- (mesmo clone anti-CD3 usado tensificada para o ensaio PD-1) Jurkat NFAT/TMIGD2 CHO-Anti-CD3 Fv/HHLA2 + Reversão da Anti-HHLA2 6F10 mAb (mesmo Ativação in- clone anti-CD3 usado para o tensificada ensaio PD-1) Exemplo 6: Confirmação in vivo da atividade de mAbs HHLA2 e desenvolvimento de modelo animal

[00613] Além disso, os métodos de caracterização in vivo de anti- corpos são bem conhecidos na técnica, como descrito em Wang et al.

(2014) Cancer Immunol. Res. 2:846, Brown et al.(2003) J. Immunol. 170:1257, Zhao et al.(2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110:9879,Zhu et al.(2013) Nat. Comm. 4:2043, and Sinclair et al. (2004) Viral Immunol. 17:445).A ausência da via HHLA2 em roedores, cães e outras espécies convencionais para modelos de tumor requer novos modelos de tumor animal ou farmacologia.

[00614] Em algumas modalidades, um modelo de célula T de recep- tor de antígeno quimérico (CAR-T) é usado (Figura 8). Por exemplo, camundongos NSG são implantados com células de linhagem de célu- las de câncer renal humano que expressam anidraseIX carbônica (CAIX), HHLA2 e PD-L1. Células T humanas (CAR-T) que expressam o receptor de antígeno quimérico anticarbônico anidraseIX (CAIX) (cé- lulas T anticaIX CAR) e os receptores PD-1 e KIR3DL são injetados por via intravenosa juntamente com anti-HHLA2 ou KIR3DL mAbse sozinho ou em combinação com mAbs anti-PD-1/L-1. O crescimento do tumor é quantificado por imageamento de bioluminescência após injeção de luciferina IP (por exemplo, conforme descrito em Suarez et al. (2016)Oncotarget 7:34341).

[00615] Em algumas modalidades, o modelo de tumor de células CAR-T em micro SCID é desenvolvido. Os camundongos SCID porta- dores de tumores HeLa-CD19-HHLA2 são doseados com células HHLA2 e células CD19/KIR3DL3 CAR-T, e a inibição do crescimento tumoral é avaliada. São utilizados camundongos SCID fêmeas com seis semanas de idade (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Cada camundongo é injetado por via subcutânea (SC) no dia 0 com 100 μl de PBS estéril contendo 2 x 106 HeLa-CD19, ouHeLa-CD19 +HHLA2 células. As células CAR-T em PBS são injetadas intratumoralmente nos dias 19 (5 x 106 células) e 33 (9 x 106 células), e o crescimento do tumor é seguido diariamente. A dosagem de anticorpos ocorre três ve- zes por semana por meio de dosagem intraperitoneal (IP). O peso cor-

poral é monitorado duas vezes por semana. Os tamanhos dos tumores são medidos diariamente com compassos de calibre e o volume do tumor (em mm3) determinado usando a fórmula W2L /2, onde W é a largura do tumor e L é o comprimento do tumor. A duração do estudo é de aproximadamente 45 dias e 10 camundongos são usados por bra- ço. Os camundongos são administrados com mAbs HHLA2 com base no perfil de PK desses anticorpos.

[00616] No final da experiência, os tumores são excisados, a san- gria terminal é realizada e o soro é armazenado para análise ELISA e FACS. Os tumores são colhidos, pesados e metade do tumor é conge- lado fresco e metade é fixada em paraformaldeído a 4% e, em segui- da, embebida em parafina para coloração H&E e imuno-histoquímica (IHC). As configurações de modelo de tumor de células CAR-T CD19/KIR3DL3 exemplificativas estão listadas na Tabela 12 abaixo. Tabela 12: avaliação de mAbs HHLA2 no modelo de tumor de células CAR-T CD19/KIR3DL3 in vivo Tumor Tratamento Resultados esperados HeLa/CD19/HHLA2 Sem células T Crescimento do tumor HeLa/CD19/HHLA2 CAR-T/aCD19 Inibição do crescimen- to do tumor HeLa/CD19/HHLA2 CAR-T/aCD19/KIR3DL3 Crescimento do tumor + Controle de isótipo HeLa/CD19/HHLA2 CAR-T/aCD19/KIR3DL3 Inibição do crescimen- + HHLA2 mAb to do tumor

[00617] Em algumas modalidades, os mAbs HHLA2 são confirma- dos como tendo atividade in vivo usando um iniciador de antígeno e ensaios de reforço que confirmam a proliferação de células T, citocina e/ou respostas de anticorpos dependentes de células T (TDAR) em macacos cynomolgus. Em algumas modalidades, o modelo de célula T de desafio ao antígeno KLH de macaco cynomolgus é gerado e usado (Figuras 24A e 24B). Por exemplo, macacos cynomolgus dosados por via intravenosa com mAb anti-HHLA2 são imunizados no dia 2 com KLH (0,1 mg) em adjuvante de Freund incompleto e reforçados 14 dias depois com KLH de baixa dose em adjuvante de Freund incompleto. Sangramentos pré e pós-imunização são avaliados para a produção aumentada de anticorpos anti-KLH IgG usando um imunoensaio. Os macacos cynomolgus são tratados com um mAb HHLA2 no dia 1 e recebem uma dosagem IV semanal de um mAb HHLA2 a 2-50 mg / kg. PBMC isoladas de macacos cynomolgus pré e pós-dose de tratamento com mAb anti-HHLA2 são avaliadas para resposta de anticorpo anti- KLH dependente de células T, proliferação de células T e NK por colo- ração Ki67 e citometria de fluxo e citotoxicidade NK por coloração FACS de CD107a in vivoou por citotoxicidade ex vivo contra células K562. Em algumas modalidades, o modelo SIV de macaco cynomol- gus é desenvolvido e usado para avaliar os mAbs HHLA2 in vivo.

[00618] Em algumas modalidades, o modelo de tumor de camun- dongo SRG-15 humanizado é usado e os efeitos dos mAbs HHLA2 em tumores humanos em camundongos SRG-15 (Flavell) ou NSG-15 (Greiner) humanizados são testados (Figuras 23A-23C; Herndler- Brandstetter D et al. (2017) 114:E9626-E9634). Exemplo 7: Ligação de células de mAbs HHLA2 e características de bloqueio de receptor

[00619] As características de ligação e bloqueio do mAb HHLA2 foram analisadas. Por exemplo, foram detectados EC50 para mAbs HHLA2 que se ligam à HHLA2 e IC50 de bloqueio de mAbs HHLA2 de ligação de HHLA2 à TMIGD2 ou KIR3DL3. A expressão de TMIGD2 e KIR3DL3 em células 293T transfectadas foi detectada por citometria de fluxo (Figuras 12A e 12B). A ligação de HHLA2-Fc a células 293T transfectadas com TMIGD2 e KIR3DL3 foi mostrada (Figuras 12C e 12D). Também foram geradas células pre-B 300.19 transfectadas de maneira estável que expressam HHLA2, TMIGD2 ou KIR3DL3.

[00620] As experiências de ligação celular de mAb HHLA2 e blo- queio do receptor foram então realizadas. Numa experiência, diferen- tes concentrações de mAbs HHLA2 foram incubadas com células pré- B 300.19 transfectadas com HHLA2 durante 30 minutos a 4C. A liga- ção do mAb HHLA2 a células 300.19 transfectadas foi detectada com uma IgG de cabra anticamundongo marcada com PE (H+L). Para ex- periências de bloqueio de mAb HHLA2, diferentes concentrações de mAbs HHLA2 foram pré-incubadas com 4 ug/ml de HHLA2-mIgG2a a uma razão de 1:1 por 30 minutos e adicionadas a células 293T trans- fectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3 e incubadas por 30 minutos a 4C. A ligação de HHLA2-mIgG2a a células 293T transfectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3 foi detectada com um anticorpo anti-mIgG2a de cabra Fab2 marcado com PE. As análises EC50 e IC50 foram realiza- das usando o Graph Pad Prism. Os dados são apresentados na Tabe- la 6. Foi demonstrado que o clone 2C4 do mAb HHLA2 tem as propri- edades desejadas de bloqueio KIR3DL3 completo e bloqueio parcial de TMIGD2 (Tabela 6). Tabela 6: Experiência de ligação de células de mAb HHLA2 e bloqueio de receptor #1 1 2 2 mAb HHLA2 Ligação de Bloqueio de Bloqueio de (Isótipo)\ HHLA2 TMIGD2 KIR3DL3 EC50 (ug/ml) IC50 (ug/ml) IC50 (ug/ml) 1C8 (IgG2a) 0,63 + 1,65 + 1,15 2C4 (IgG1) 0,24 +/- 28,2 + 0,52 2G2 (IgG1) 0,21 + 0,85 + 0,53 4D1 (IgG1) 0,44 + 0,56 + 0,68 6D10 (IgG1) 22,5 +/- 11,7 +/- 7,0 6F10 (IgG1) 0,25 + 0,55 + 0,9 1 Ligação do mAb HHLA2 à linhagem de células pré-B de camundongo

300.19 transfectadas com HHLA2 2 Bloqueio de mAb HHLA2 da ligação de HHLA2-mIgG2a a células

293T transfectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3 (transientes)

[00621] Em outra experiência, diferentes concentrações de mAbs HHLA2 foram incubadas com células pré-B 300.19 transfectadas com HHLA2 por 30 minutos a 4C A ligação do mAb HHLA2 a células

300.19 transfectadas foi detectada com uma IgG de cabra anticamun- dongo marcada com PE (H+L). Para experiências de bloqueio de mAb HHLA2, diferentes concentrações de mAbs HHLA2 foram pré- incubadas com 4 ug/ml de HHLA2-mIgG2a a uma razão de 1:1 por 30 minutos e adicionadas a células pré-B 300.19 transfectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3 e incubadas por 30 minutos a 4C. A ligação de HHLA2-mIgG2a a células pré-B 300.19 transfectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3 foi detectada com um anticorpo anti-mIgG2a de cabra Fab2 marcado com PE. As análises EC50 e IC50 foram realizadas usando o Graph Pad Prism. Os dados são apresentados na Tabela 7. Foi de- monstrado que o clone 2C4 do mAb HHLA2 tem as propriedades de- sejadas de bloqueio KIR3DL3 completo e bloqueio parcial de TMIGD2 (Tabela 7). Tabela 7: Experiência de ligação de células de mAb HHLA2 e bloqueio de receptor #2 mAb HHLA2 Ligação de Bloqueio de Bloqueio de (Isótipo)\ 1HHLA2 2TMIGD2 2KIR3DL3 EC50 (ug/ml) IC50 (ug/ml) IC50 (ug/ml) 2C4 (IgG1) 0,29 +/- 7,3 + 0,97 5H4 (IgG1) 2,03 +/- 9,63 + 1,25 6F10 (IgG1) 0,22 + 0,92 + 0,74 6G8 (IgG1) 2,14 +/- 10,85 + 1,18 1 Ligação do mAb HHLA2 à células pré-B de camundongo 300.19 transfectadas com HHLA2 2 Bloqueio de mAb HHLA2 da ligação de HHLA2-mIgG2a a células

300.19 pre-B transfectadas com TMIGD2 ou KIR3DL3

[00622] A ligação de diferentes mAbs HHLA2 à HHLA2 humana e de macaco cynomolgus também foi testada e a análise de ligação EC50 foi conduzida (Figuras 13A e 13B). Diferentes concentrações de mAbs HHLA2 foram incubadas com células pré-B 300.19 transfecta- das com HHLA2 humana ou de macaco cynomolgus durante 30 minu- tos a 4C. A ligação do mAb HHLA2 a células 300.19 transfectadas foi detectada com uma IgG de cabra anticamundongo marcada com PE (H+L). A análise EC50 foi realizada usando o Graph Pad Prism. Os dados são apresentados na Tabela 8. Tabela 8: ligação do mAb HHLA2 à hhla2 humana e de macaco cyno- molgus 1 mAb HHLA2 (Isótipo) Ligação de HHLA2 Ligação de HHLA2 de humana macaco Cynomolgus EC50 (ug/ml) EC50 (ug/ml) 2C4 (IgG1) 0,29 0,47 5H4 (IgG1) 2,03 Sem ligação 6F10 (IgG1) 0,22 0,40 6G8 (IgG1) 2,14 Sem ligação 1 Ligação do mAb HHLA2 à células pré-B de camundongo 300.19 transfectadas com HHLA2 humana 2 Ligação do mAb HHLA2 à células pré-B de camundongo 300.19 transfectadas de macaco cynomolgus Exemplo 8: Confirmação in vitro da atividade de mAbs HHLA2

[00623] Em algumas modalidades, a citotoxicidade de células CAR- T expressando CD19 e KIRDL3 (CAR-T/CD19/KIRDL3) contra células tumorais alvo que expressam HeLa-CD19 e HHLA2 é avaliada na pre- sença ou na ausência de mHbs de HHLA2. Células CAR- T/CD19/KIRDL3 são geradas. Um plasmídeo lentiviral que expressa scFv anti-CD19 e KIR3DL3 é construído e subclonado em um cassete CAR de segunda geração contendo um peptídeo sinal secretor de GM- CSF, uma região de dobradiça, domínio transmembranar e domínio coestimulatório de CD28 e o domínio de ativação CD3ζ. Dez milhões de células HEK293FT com crescimento interrompido são semeadas em frascos T75 e cultivadas durante a noite, em seguida, transfecta- das com a mistura de Lentivector pPACKH1 (System Biosciences, Pa- lo Alto, CA) e 10 μg de cada vetor lentiviral contendo scFv anti-CD19 e KIR3DL3 usando o Kit de transfecção CalPhosTM (Takara, Mountain View, CA). Um dia depois, o meio é substituído por meio fresco e, 48 h depois, o meio contendo lentivírus é coletado. O meio é limpo de resí- duos celulares por centrifugação a 2100 g durante 30 min. As partícu- las de vírus são recolhidas por centrifugação a 112.000 g durante 100 min, aliquotadas e congeladas a -80°C. Os títulos das preparações de vírus são determinados por RT-PCR quantitativo usando o kit Lenti-XTM qRT-PCR.

[00624] PBMC são isolados de células mononucleares de sangue periférico humano (fornecidos por Dana Farber Cancer Institute de acordo com seu protocolo IRB aprovado) suspensos a 1 x 106 célu- las/ml em meio AIM V contendo 10% de FBS e 300 U/ml de IL-2, mis- turado com um número igual (razão de 1:1) de Dynabeads CD3/CD28 (Thermo Fisher), e cultivadas em placas de 24 poços não tratadas (0,5 ml por poço). Em 24 e 48 horas, lentivírus é adicionado às culturas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5, juntamente com 1 μl de in- tensificador de transdução TransPlusTM(AlStem). À medida que as cé- lulas T proliferam ao longo das duas semanas seguintes, as células são contadas a cada 2-3 dias e meio fresco com 300 U/ml IL-2 foi adi- cionado às culturas para manter a densidade celular em 1-3 x 106 cé- lulas/ml. A expressão de CAR é avaliada por citometria de fluxo usan- do anticorpos anti-CD4, CD8 e CD19. Assim, antes da transdução, as células T são ativadas usando um anticorpo anti-CD3 em combinação com coestimulação de anticorpo anti-CD28. A rápida expansão das células CAR-T em cultura é geralmente alcançada dentro de duas se- manas, impulsionada pela presença de IL-2 exógena. Este CAR é da-

qui em diante denominado CAR-T/CD19/KIRDL3.

[00625] Células HeLa-CD19 transfectadas com HHLA2 são gera- das. Células que expressam HeLa-CD19 são transfectadas com HHLA2_pIRESneo3 por Lipofectamine® 2000 (Invitrogen). Os clones estáveis são gerados por seleção de G418 e diluição limitante e avali- ados quanto à expressão de HHLA2 por citometria de fluxo.

[00626] É realizada a inibição KIR3DL3 de células T primárias in vitro em ensaio de citotoxicidade em tempo real (RTCA). As células alvo aderentes (HeLa ou HeLa-CD19) são semeadas em placas E de 96 poços (Acea Biosciences, San Diego, CA) a 1 x 104 células por po- ço e monitoradas em cultura durante a noite com a análise de células em tempo real baseada em impedância (RTCA) Sistema xCELLigence (Acea Biosciences). No dia seguinte, o meio é removido e substituído por meio AIM V-AlbuMAX® contendo 10% de FBS ± 1 x 105 células efetoras (células CAR-T/CD19/KIRDL3 ou células T não transduzidas), em triplicado. As células nas placas E são monitoradas por mais 2-3 dias com o sistema RTCA e a impedância é representada ao longo do tempo. A citólise é calculada como (impedância das células alvo sem células efetoras - impedância das células alvo com células efetoras) x100/impedância das células alvo sem células efetoras.

[00627] A secreção de citocinas também é avaliada. Em algumas modalidades, o ensaio de indução de citocina é realizado. Por exem- plo, as células alvo HeLa-CD19/HHLA2 são cultivadas com células efetoras CAR-T/CD19/KIRDL3 ou células T não transduzidas em uma razão de 1:1 ( (1 x 104 células cada) emplacas de 96 poços de fundo em U com 200 ml de meio AIM V-AlbuMAX® contendo FBS a 10%, em triplicado. Após 16 h, os 150 ml superiores de meio são transferidos para placas de 96 poços com fundo em V e centrifugados a 300 g por 5 min para peletizar quaisquer células residuais. Os 120 ml superiores do sobrenadante são transferidos para uma nova placa de 96 poços e analisados por ELISA para os níveis de IFN- e IL-2 humanas usando kits da Thermo Fisher de acordo com o protocolo do fabricante.

[00628] Configurações de modelos de citotoxicidade de células CAR-T exemplificativas in vitro estão listadas na Tabela 11 abaixo. Tabela 11: Avaliação de mAbs HHLA2 no modelo de citotoxicidade de células CAR-T in vitro Tumor Tratamento Resultados espera- dos HeLa/CD19/HHLA2 Sem células T Sem ativação HeLa/CD19/HHLA2 CAR-T/aCD19 Ativação de células T HeLa/CD19/HHLA2 CAR-T/aCD19/KIR3DL3 Inibição da ativação + Controle de isótipo de células T HeLa/CD19/HHLA2 CAR-T/aCD19/KIR3DL3 Reversão da ativação + HHLA2 mAb das células T

[00629] Em algumas modalidades, a inibição de KIR3DL3 do ensaio de citotoxicidade NK é realizada.

[00630] São geradas células NK92 transfectadas com KIR3DL3. Por exemplo, as células NK92 são transfectadas com o vetor KIR3DL3 puroEIF2 e selecionadas para resistência à puromicina, e a expressão de KIR3DL3 é detectada por citometria de fluxo.

[00631] As células alvo K562 transfectadas com HHLA2 são gera- das. Por exemplo, as células alvo K562 são transfectadas com HHLA2 pIRESneo3 e selecionadas quanto à resistência à neomicina, e a ex- pressão de HHLA2 foi detectada por citometria de fluxo.

[00632] As células NK92 transfectadas com KIR3DL3 são avaliadas quanto à citotoxicidade NK contra células K562 (+ ou - HHLA2) em di- ferentes razões E / T na presença ou ausência de mAbs HHLA2 em um ensaio de citotoxicidade de 4 horas. Configurações de modelos de citotoxicidade de células CAR-T exemplificativasin vitroestão listadas na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13: Avaliação de mAbs HHLA2 no modelo de citotoxicidade NK Células efetoras NK Célula alvo K562 Resposta Esperada NK92/KIRDL3 K562 Citotoxicidade NK92/KIRDL3 Controle de isótipo Inibição de citotoxici- K562/HHLA2 + dade NK92/KIRDL3 K562/HHLA2+ HHLA2 Citotoxicidade mAb

[00633] Em algumas modalidades, a via de sinalização de KIR3DL3 em células T Jurkat é estudada. Incorporação por referência

[00634] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados neste documento são incorporados neste documento por referência em sua totalidade, como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições aqui contidas, preva- lecerá.

[00635] Também incorporadas por referência na íntegra estão as sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos que referenciam um número de acessão correlacionado a uma entrada em um banco de dados público, como as mantidas pelo The Institute for Genomic Re- search (TIGR) na World Wide Web em tigr.org e/ou o National Center for Biotechnology Information (NCBI) na World Wide Web em ncbi.nlm.nih.gov. Equivalentes

[00636] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de confirmar usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da presente invenção descri- tas no presente documento. Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims (48)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma sequência de cadeia pesada com pelo menos cerca de 95% de identidade para uma sequência de cadeia pesada selecio- nada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de cadeia leve com pelo menos cerca de 95% de identidade para uma sequência de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2.

2. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma sequência de CDR de cadeia pesada com pelo me- nos cerca de 95% de identidade para uma sequência de CDR de ca- deia pesada selecionada do grupo que consiste nas sequências lista- das na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de CDR de cadeia leve com pelo menos cerca de 95% de identidade para uma sequência de CDR de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2.

3. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma sequência de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2.

4. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma sequência de CDR de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2; e/ou b) uma sequência de CDR de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas sequências listadas na Tabela 2.

5. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal, ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, é quimérico, humanizado, com- pósito, murino ou humano.

6. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal, ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, é marcado de forma detectável, compreende um domínio efetor, compreende um domínio de Fc e/ou é selecionado do grupo que consiste em fragmentos Fv, Fav, F(ab’)2), Fab’, dsFv, scFv, sc(Fv)2 e fragmentos de diabodies.

7. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal, ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, inibe a) a ligação de HHLA2 a TMIGD2; b) a ligação de HHLA2 a KIR3DL3, ou c) a ligação de HHLA2 a TMIGD2 e a ligação de HHLA2 a KIR3DL3.

8. Anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal, ou fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo, liga especificamente HHLA2.

9. Cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina, caracteriza- da pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em sequên- cias de cadeia pesada e leve de imunoglobulina listadas na Tabela 2.

10. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que hibridiza, sob condições rigorosas, com o complemento de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em sequências de polipeptídeos listadas na Tabela 2 ou uma sequência com pelo menos cerca de 95% de homologia para um ácido nucleico codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste nas sequências de polipeptídeos listadas na Tabela 2.

11. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 10.

12. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 10, compreende o vetor, como definido na reivindicação 11, expressa o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

13. Dispositivo ou kit, caracterizado pelo fato de que com- preende pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, o referido dispositivo ou kit compreendendo opcio- nalmente um marcador para detectar o pelo menos um anticorpo mo- noclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um com- plexo compreendendo o anticorpo monoclonal, ou fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo.

14. Método para produzir pelo menos um anticorpo mono- clonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) cultivar uma célula hospedeira trans- formada que foi transformada por um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando pelo menos um anticorpo monoclonal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 sob condi- ções adequadas para permitir expressão do referido anticorpo mono- clonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e (ii) recuperar o anticorpo monoclonal expresso, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

15. Método para detectar a presença ou o nível de um poli-

peptídeo de HHLA2, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma amostra e detectar o referido polipeptídeo na amostra por uso de pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um anticorpo monoclonal, ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, forma um complexo com um polipeptídeo de HHLA2 e o complexo é detectado na forma de um en- saio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio radioimune (RIA), imunoquimicamente, Western blot ou usando um ensaio de flu- xo intracelular.

17. Método para monitorar a progressão de um distúrbio associado à expressão de HHLA2 aberrante em um indivíduo, caracte- rizado pelo fato de que compreende: a) detectar em uma amostra de indivíduo em um primeiro ponto no tempo,, o nível de HHLA2 usando pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8; b) repetir a etapa a) em um ponto no tempo subsequente; e c) comparar o nível de HHLA2 detectado nas etapas a) eb) para monitorar a progressão do distúrbio no indivíduo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que entre o primeiro ponto no tempo e o ponto no tem- po subsequente, o indivíduo sofreu tratamento para melhorar o distúr- bio.

19. Método para predizer o resultado clínico de um indiví- duo afligido por um distúrbio associado à expressão de HHLA2 aber- rante, caracterizado pelo fato de que compreende: a) determinar o nível de HHLA2 em uma amostra de indiví-

duo usando pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 8; b) determinar o nível de HHLA2 em uma amostra de um in- divíduo de controle tendo um bom resultado clínico usando o pelo me- nos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e c) comparar o nível de HHLA2 na amostra do indivíduo e na amostra do indivíduo de controle; em que um nível significativamente mais alto de HHLA2 na amostra do indivíduo, em comparação com o nível na amostra do indi- víduo de controle, é uma indicação de que o indivíduo tem um resulta- do clínico ruim.

20. Método para avaliar a eficácia de uma terapia para um distúrbio associado à expressão de HHLA2 aberrante em um indiví- duo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) determinar o nível de HHLA2 usando pelo menos um an- ticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em uma primeira amostra obtida do indivíduo antes de fornecer pelo menos uma porção da terapia ao assunto, e b) determinar o nível de HHLA2 em uma segunda amostra obtida do indivíduo em seguida ao fornecimento da porção da terapia, em que um nível significativamente mais baixo de HHLA2 na segunda amostra, em relação à primeira amostra, é uma indicação de que a terapia é eficaz para inibir o distúrbio no indivíduo.

21. Método para avaliar a eficácia de um composto de teste para inibir um distúrbio associado à expressão de HHLA2 aberrante em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) determinar o nível de HHLA2 usando pelo menos um an-

ticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em uma primeira amostra obtida do indivíduo e exposta ao composto de teste; e b) determinar o nível de HHLA2 em uma segunda amostra obtida do indivíduo, em que a segunda amostra não é exposta ao composto de teste e um nível significativamente mais baixo de HHLA2, em relação à segunda amostra, é uma indicação de que o composto de teste é efi- caz para inibir o distúrbio no indivíduo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que a primeira e a segunda amostras são porções de uma única amostra obtida do indivíduo ou porções de amostras agru- padas obtidas do indivíduo.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer uterino, gliomas, glioblastoma, neuroblastoma, câncer de mama, carcinoma ductal pan- creático, timoma, B-CLL, leucemia, linfoma de célula B e um câncer infiltrado com células imunes expressando um receptor para HHLA2.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 15 a 24, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende células, soro, tecido peritumoral e/ou tecido intratumoral obtido do indi- víduo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que o referido nível significativamente mais alto de

HHLA2 compreende um aumento de pelo menos vinte por cento entre o nível de HHLA2 na amostra do indivíduo em relação ao nível normal de HHLA2 na amostra do indivíduo de controle.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 25, caracterizado pelo fato de que o referido nível significati- vamente mais baixo de HHLA2 compreende uma diminuição de pelo menos vinte por cento do nível de HHLA2.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser hu- mano.

29. Método para tratar um indivíduo afligido com câncer, ca- racterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que o pelo menos um anticorpo monoclonal, ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado a um agente citotóxico.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste em um agente quimioterapêutico, um agente biológico, uma toxina e um isótopo radioativo.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 31, caracterizado pelo fato de que pelo menos um anticorpo monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, reduz o número de células em proliferação no câncer e/ou reduz o volume ou tamanho de um tumor do câncer.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticor- po monoclonal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é administrado em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 33, caracterizado pelo fato de que compreender ainda ad- ministrar ao indivíduo um agente ou regime terapêutico para tratar câncer.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 34, caracterizado pelo fato de que compreende ainda admi- nistrar ao indivíduo uma terapia adicional selecionada do grupo que consiste em imunoterapia, bloqueio de ponto de verificação, vacinas de câncer, receptores de antígeno quiméricos, quimioterapia, radiação, terapia alvo e cirurgia.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 35, caracterizado pelo fato de que células de câncer e/ou células infiltrantes imunes a tumores no indivíduo expressam HHLA2.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 36, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de prós- tata, câncer uterino, gliomas, glioblastoma, neuroblastoma, câncer de mama, carcinoma ductal pancreático, timoma, B-CLL, leucemia, linfo- ma de célula B e um câncer infiltrado com células imunes expressando um receptor para HHLA2.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer renal, câncer pancreático, câncer colorretal, leucemia mieloide aguda (LMA), carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de próstata e câncer uteri- no.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 29 a 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um modelo animal de câncer.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que o modelo animal é um modelo de camundongo, opcionalmente em que o modelo de camundongo é um modelo de ca- mundongo humanizado.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 29 a 40, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífe- ro.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que o mamífero é um camundongo humanizado ou um ser humano.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

44. Método para modular uma resposta imune, caracteriza- do pelo fato de que compreende inibir a interação entre HHLA2 e seu receptor de inibidor de ligação, KIRDL3.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a interação entre HHLA2 e KIRDL3 é bloqueada para uso em imunoterapia de câncer de bloqueio de ponto de verifica- ção.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, carac- terizado pelo fato de que a interação entre HHLA2 e KIRDL3 é inibida ou bloqueada usando um anticorpo anti-HHLA2.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo anti-HHLA2 é um inibidor de ponto de verificação de ativação de célula T para imunoterapia de câncer.

48. Método para modular uma resposta imune, caracteriza- do pelo fato de que compreende inibir seletivamente a interação entre HHLA2 e seu receptor de inibidor de ligação, KIR3DL3, sem bloquear ou inibir significativamente a interação entre HHLA2 e seu receptor es- timulador de ligação, TMIGD2.