JP2024032865A - Ｈｈｌａ２受容体としてのｋｉｒ３ｄｌ３、抗ｈｈｌａ２抗体、およびその使用 - Google Patents

Ｈｈｌａ２受容体としてのｋｉｒ３ｄｌ３、抗ｈｈｌａ２抗体、およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＨＨＬＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片、ならびにその免疫グロブリン、ポリペプチド、核酸、ならびに診断、予後、および治療目的のためにかかる抗体を使用する方法を提供すること。【解決手段】ナイーブＴ細胞で発現されるＴＭＩＧＤ２は、ＨＨＬＡ２に対する活性化受容体であり、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）連結後に共刺激シグナルを伝達する。ＴＭＩＧＤ２は、反復ＴＣＲ刺激後に下方制御される。【選択図】なし

Description

政府権利の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｐ０１ ＡＩ０５６２９９に基づく政府支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲ、ならびにさらに多くのもの等の免疫チェックポイントは、多数の入力間の複雑なコンビナトリアル相互作用に基づいて免疫応答の進行を負に制御する。免疫チェックポイント阻害剤は、いくつかの対象における免疫応答を調節することができるが、免疫チェックポイント発現および天然結合パートナーとの相互作用は、対象間および対象の組織内で異なる。したがって、介入治療で使用するための新たな免疫チェックポイントを特定する必要性が当該技術分野で高まっている。ＨＨＬＡ２は、Ｔ細胞機能を調節する新たに特定されたＢ７ファミリーメンバーである。ＨＨＬＡ２は、ＴＭＩＧＤ２の特異的リガンドとして特定されており、ＨＨＬＡ２／ＴＭＩＧＤ２相互作用は、ＡＫＴ依存性シグナル伝達カスケードを介してヒトＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を選択的に共刺激する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．４：２０４３、Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６）。共阻害機能を発揮する活性化Ｔ細胞上のＨＨＬＡ２に対する第２の特徴付けられていない受容体がいくつかの研究によって示唆された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：９８７９－９８８４、Ｘｉａｏ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：１２６．１１）。ＨＨＬＡ２は様々なヒトがんで発現され、その共阻害機能により、がん免疫療法の候補となる。
Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．４：２０４３ Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：９８７９－９８８４ Ｘｉａｏ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：１２６．１１
本発明は、Ｂ７遺伝子ファミリーメンバーＨＨＬＡ２が様々な腫瘍および抗原提示細胞で広範に発現され、Ｔ細胞の活性化リガンドおよび阻害リガンドの両方として関与しているという発見に少なくとも部分的に基づいている。ナイーブＴ細胞で発現されるＴＭＩＧＤ２は、ＨＨＬＡ２に対する活性化受容体であり、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）連結後に共刺激シグナルを伝達する。ＴＭＩＧＤ２は、反復ＴＣＲ刺激後に下方制御される。ＨＨＬＡ２に対する推定阻害性受容体が活性化Ｔ細胞上で上方制御されて、Ｔ細胞活性化を調節することが可能である。本発明は、ＨＨＬＡ２がＴ細胞およびＮＫ細胞上の受容体ＫＩＲ３ＤＬ３に結合し、ＨＨＬＡ２：ＫＩＲ３ＤＬ３相互作用の結果がＴ細胞活性化の阻害であるという発見に少なくとも部分的に基づいている。ＨＨＬＡ２が腫瘍で高度に発現され、かつチェックポイントリガンドとしての機能を果たし得るという所見に基づいて、抗ＨＨＬＡ２ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルが候補免疫チェックポイント阻害剤薬剤として生成された。抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの遮断および非遮断が、ＴＭＩＧＤ２トランスフェクト３００．１９マウスプレＢ白血病細胞またはＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクト３００．１９マウスプレＢ白血病細胞に結合する可溶性ヒトＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａを評価することによって特定された。ＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３の両方に結合するＨＨＬＡ２を遮断するか、またはＫＩＲ３ＤＬ３をより選択的に遮断するが、ＴＭＩＧＤ２を遮断しない抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂが、Ｔ細胞アッセイにおけるチェックポイント阻害剤抗体であることが示された。
一態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体は、ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖配列、および／またはｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
別の態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体は、ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列、および／またはｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
なお別の態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体は、ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖配列、および／またはｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに別の態様では、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、モノクローナル抗体は、ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列、および／またはｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
本明細書に記載の本発明のいずれかの態様に適用され得る多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、複合、マウス、またはヒトである。別の実施形態では、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／またはＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディ断片からなる群から選択される。なお別の実施形態では、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、寄託受入番号＿＿＿＿＿＿で寄託されたハイブリドーマ＿＿＿＿＿＿から得ることができる。さらに別の実施形態では、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ａ）ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合、ｂ）ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３の結合、またはｃ）ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２の結合およびＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３の結合を阻害する。Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合を遮断するＨＨＬＡ２ ｍＡｂがチェックポイント遮断剤であることが示されている。別の実施形態では、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＨＨＬＡ２に特異的に結合する。
別の態様では、表２に列記される免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖が提供される。
なお別の態様では、ストリンジェントな条件下で、表２に列記されるポリペプチド配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補体、または表２に列記されるポリペプチド配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列とハイブリダイズする単離された核酸分子が提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載の単離された核酸を含むベクターが提供される。
別の態様では、本明細書に記載の単離された核酸を含むか、本明細書に記載のベクターを含むか、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現するか、または寄託受入番号＿＿＿＿＿＿で入手可能である、宿主細胞が提供される。
なお別の態様では、本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含むデバイスまたはキットであって、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を検出するための標識、またはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を任意に含む、デバイスまたはキットが提供される。
さらに別の態様では、本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、（ｉ）当該モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の発現を可能にするのに好適な条件下で請求項１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉ）発現されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、方法が提供される。
別の態様では、ＨＨＬＡ２ポリペプチドの存在またはレベルを検出する方法であって、試料を得ることと、本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して試料中の当該ポリペプチドを検出することと、を含む、方法。
上述のように、ある特定の実施形態が本明細書に記載のいずれかの方法に適用可能である。例えば、一実施形態では、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＨＨＬＡ２ポリペプチドと複合体を形成し、この複合体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の形態で、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の形態で、免疫化学的に、ウエスタンブロットの形態で、または細胞内フローアッセイを使用して検出される。
別の態様では、対象における異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害の進行を監視するための方法であって、ａ）本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、第１の時点で対象試料中のＨＨＬＡ２レベルを検出することと、ｂ）その後の時点でステップａ）を繰り返すことと、ｃ）ステップａ）で検出されたＨＨＬＡ２レベルとステップｂ）で検出されたＨＨＬＡ２レベルとを比較して、対象における障害の進行を監視することと、を含む、方法が提供される。
上述のように、ある特定の実施形態が本明細書に記載のいずれかの方法に適用可能である。例えば、一実施形態では、第１の時点とその後の時点との間で、対象は、障害を改善するための治療を受けている。
別の態様では、異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害に罹患している対象の臨床転帰を予測するための方法であって、ａ）本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、ｂ）少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、良好な臨床転帰を有する対照対象由来の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、ｃ）対象試料中のＨＨＬＡ２レベルと対照対象由来の試料中のＨＨＬＡ２レベルとを比較することと、を含み、対照対象由来の試料中のレベルと比較して対象試料中の有意により高いＨＨＬＡ２レベルが、対象が不良な臨床転帰を有することを示す、方法が提供される。
なお別の態様では、対象における異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害の療法の有効性を評価する方法であって、ａ）本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、療法の少なくとも一部を対象に施す前に対象から得られた第１の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、ｂ）療法の一部を施した後に対象から得られた第２の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、を含み、第１の試料と比較して第２の試料中の有意により低いＨＨＬＡ２レベルが、療法が対象における障害を抑制するのに有効であることを示す、方法が提供される。
さらに別の態様では、対象における異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害を抑制するための試験化合物の有効性を評価する方法であって、ａ）本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象から得られ、かつ試験化合物に曝露された第１の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、ｂ）対象から得られた第２の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、を含み、第２の試料が試験化合物に曝露されず、第２の試料と比較して有意により低いＨＨＬＡ２レベルが、試験化合物が対象における障害を抑制するのに有効であることを示す、方法が提供される。
上述のように、ある特定の実施形態が本明細書に記載のいずれかの方法に適用可能である。例えば、一実施形態では、第１の試料および第２の試料は、対象から得られた単一試料の一部であるか、または対象から得られたプールされた試料の一部である。別の実施形態では、障害は、がんである。さらに別の実施形態では、がんは、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、乳癌、膵管癌、胸腺腫、Ｂ－ＣＬＬ、白血病、Ｂ細胞リンパ腫、およびＨＨＬＡ２に対する受容体を発現する免疫細胞が浸潤したがんからなる群から選択される。別の実施形態では、試料は、対象から得られた細胞、血清、腫瘍周辺組織、および／または腫瘍内組織を含む。なお別の実施形態では、有意により高いＨＨＬＡ２レベルは、対照対象由来の試料中の正常なＨＨＬＡ２レベルと比較して対象試料中のＨＨＬＡ２レベルの少なくとも２０パーセントの増加を含む。別の実施形態では、有意により低いＨＨＬＡ２レベルは、ＨＨＬＡ２レベルの少なくとも２０パーセントの減少を含む。さらに別の実施形態では、対象は、ヒトである。
さらに別の態様では、がんに罹患している対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法が提供される。
上述のように、ある特定の実施形態が本明細書に記載のいずれかの方法に適用可能である。例えば、一実施形態では、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒性薬剤にコンジュゲートされている。別の実施形態では、細胞毒性薬剤は、化学療法剤、生物学的薬剤、毒素、および放射性同位体からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、がんにおける増殖細胞を減少させ、かつ／またはがんの腫瘍の体積またはサイズを減少させる。別の実施形態では、少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、薬学的に許容される製剤で投与される。なお別の実施形態では、対象に、がんを治療するための治療薬またはレジメンを投与することをさらに含む本明細書に記載の方法。さらに別の実施形態では、対象に、免疫療法、チェックポイント遮断、がんワクチン、キメラ抗原受容体、化学療法、放射線、標的療法、および手術からなる群から選択される追加の療法を投与することをさらに含む、本明細書に記載の方法。別の実施形態では、対象におけるがん細胞および／または腫瘍免疫浸潤細胞は、ＨＨＬＡ２を発現する。さらに別の実施形態では、がんは、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、乳癌、膵管癌、胸腺腫、Ｂ－ＣＬＬ、白血病、Ｂ細胞リンパ腫、およびＨＨＬＡ２に対する受容体を発現する免疫細胞が浸潤したがんからなる群から選択される。別の実施形態では、がんは、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、および子宮癌からなる群から選択される。なお別の実施形態では、対象は、がんの動物モデルである。さらに別の実施形態では、動物モデルは、マウスモデルであり、任意に、マウスモデルは、ヒト化マウスモデルである。別の実施形態では、対象は、哺乳動物である。さらに別の実施形態では、哺乳動物は、ヒト化マウスまたはヒトである。なお別の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
別の態様では、ＨＨＬＡ２とその結合阻害剤受容体ＫＩＲＤＬ３との間の相互作用を阻害することによって免疫応答を調節する方法が提供される。
なお別の態様では、ＨＨＬＡ２とその結合刺激受容体ＴＭＩＧＤ２との間の相互作用を遮断または著しく阻害することなく、ＨＨＬＡ２とその結合阻害剤受容体ＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を選択的に阻害することによって免疫応答を調節する方法が提供される。
上述のように、ある特定の実施形態が本明細書に記載のいずれかの方法に適用可能である。例えば、一実施形態では、ＨＨＬＡ２とＫＩＲＤＬ３との間の相互作用が、チェックポイント遮断がん免疫療法における使用のために遮断される。別の実施形態では、ＨＨＬＡ２とＫＩＲＤＬ３との間の相互作用は、抗ＨＨＬＡ２抗体を使用して阻害または遮断される。なお別の実施形態では、抗ＨＨＬＡ２抗体は、がん免疫療法のためのＴ細胞活性化のチェックポイント阻害剤である。
棒ヒストグラム、曲線、または説明文に関連する他のデータを示すいずれの図についても、各指標について左から右に提示される棒、曲線、または他のデータは、説明文のボックスの上から下に、または左から右に直接かつ順に対応する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体は、
ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖配列、および／または
ｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体は、
ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列、および／または
ｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目３）
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体は、
ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖配列、および／または
ｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目４）
モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体は、
ａ）表２に列記される配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列、および／または
ｂ）表２に列記される配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目５）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、キメラ、ヒト化、複合、マウス、またはヒトである、項目１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目６）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／またはＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディ断片からなる群から選択される、項目１～５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目７）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、寄託受入番号＿＿＿＿＿＿で寄託されたハイブリドーマ＿＿＿＿＿＿から得ることができる、項目１～６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目８）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、ａ）ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合、ｂ）ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合、またはｃ）ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合およびＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合を阻害する、項目１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目９）
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、ＨＨＬＡ２に特異的に結合する、項目１～８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
表２に列記される免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖。
（項目１１）
ストリンジェントな条件下で、表２に列記されるポリペプチド配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補体、または表２に列記されるポリペプチド配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列とハイブリダイズする、単離された核酸分子。
（項目１２）
項目１１に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
（項目１３）
項目１１に記載の単離された核酸を含むか、項目１２に記載のベクターを含むか、項目１～９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現するか、または寄託受入番号＿＿＿＿＿＿で入手可能である、宿主細胞。
（項目１４）
項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含むデバイスまたはキットであって、前記少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を検出するための標識、または前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を任意に含む、デバイスまたはキット。
（項目１５）
項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、（ｉ）前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の発現を可能にするのに好適な条件下で、項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉ）前記発現されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、方法。
（項目１６）
ＨＨＬＡ２ポリペプチドの存在またはレベルを検出する方法であって、試料を得ることと、項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して前記試料中の前記ポリペプチドを検出することと、を含む、方法。
（項目１７）
前記少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、ＨＨＬＡ２ポリペプチドと複合体を形成し、前記複合体が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の形態で、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の形態で、免疫化学的に、ウエスタンブロットの形態で、または細胞内フローアッセイを使用して検出される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
対象における異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害の進行を監視するための方法であって、
ａ）項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、第１の時点で対象試料中のＨＨＬＡ２レベルを検出することと、
ｂ）その後の時点でステップａ）を繰り返すことと、
ｃ）ステップａ）で検出されたＨＨＬＡ２レベルとステップｂ）で検出されたＨＨＬＡ２レベルとを比較して、前記対象における前記障害の進行を監視することと、を含む、方法。
（項目１９）
前記第１の時点と前記その後の時点との間で、前記対象が前記障害を改善するための治療を受けている、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害に罹患している対象の臨床転帰を予測するための方法であって、
ａ）項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、対象試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、
ｂ）前記少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、良好な臨床転帰を有する対照対象由来の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、
ｃ）前記対象試料中のＨＨＬＡ２レベルと前記対照対象由来の前記試料中のＨＨＬＡ２レベルとを比較することと、を含み、
前記対照対象由来の前記試料中のレベルと比較して前記対象試料中の有意により高いＨＨＬＡ２レベルが、前記対象が不良な臨床転帰を有することを示す、方法。
（項目２１）
対象における異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害のための療法の有効性を評価する方法であって、
ａ）項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、前記療法の少なくとも一部を前記対象に施す前に前記対象から得られた第１の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、
ｂ）前記療法の前記一部を施した後に前記対象から得られた第２の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、を含み、
前記第１の試料と比較して前記第２の試料中の有意により低いＨＨＬＡ２レベルが、前記療法が前記対象における前記障害を抑制するのに有効であることを示す、方法。
（項目２２）
対象における異常なＨＨＬＡ２発現に関連する障害を抑制するための試験化合物の有効性を評価する方法であって、
ａ）項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を使用して、前記対象から得られ、かつ前記試験化合物に曝露された第１の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、
ｂ）前記対象から得られた第２の試料中のＨＨＬＡ２レベルを決定することと、を含み、
前記第２の試料が前記試験化合物に曝露されず、前記第２の試料と比較して有意により低いＨＨＬＡ２レベルが、前記試験化合物が前記対象における前記障害を抑制するのに有効であることを示す、方法。
（項目２３）
前記第１の試料および前記第２の試料が、前記対象から得られた単一試料の一部であるか、または前記対象から得られたプールされた試料の一部である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記障害ががんである、項目１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記がんが、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、乳癌、膵管癌、胸腺腫、Ｂ－ＣＬＬ、白血病、Ｂ細胞リンパ腫、およびＨＨＬＡ２に対する受容体を発現する免疫細胞が浸潤したがんからなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記試料が、前記対象から得られた細胞、血清、腫瘍周辺組織、および／または腫瘍内組織を含む、項目１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記有意により高いＨＨＬＡ２レベルが、前記対照対象由来の前記試料の正常なＨＨＬＡ２レベルと比較した前記対象試料中のＨＨＬＡ２レベルの少なくとも２０パーセントの増加を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記有意により低いＨＨＬＡ２レベルが、ＨＨＬＡ２レベルの少なくとも２０パーセントの減少を含む、項目２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記対象がヒトである、項目１８～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
がんに罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、項目１～９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、細胞毒性薬剤にコンジュゲートされている、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞毒性薬剤が、化学療法剤、生物学的薬剤、毒素、および放射性同位体からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、前記がんにおける増殖細胞の数を減少させ、かつ／または前記がんの腫瘍の体積もしくはサイズを減少させる、項目３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記少なくとも１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、薬学的に許容される製剤で投与される、項目３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記対象に、がんを治療するための治療薬またはレジメンを投与することをさらに含む、項目３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記対象に、免疫療法、チェックポイント遮断、がんワクチン、キメラ抗原受容体、化学療法、放射線、標的療法、および手術からなる群から選択される追加の療法を投与することをさらに含む、項目３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記対象におけるがん細胞および／または腫瘍免疫浸潤細胞がＨＨＬＡ２を発現する、項目３０～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記がんが、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、乳癌、膵管癌、胸腺腫、Ｂ－ＣＬＬ、白血病、Ｂ細胞リンパ腫、およびＨＨＬＡ２に対する受容体を発現する免疫細胞が浸潤したがんからなる群から選択される、項目３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記がんが、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、および子宮癌からなる群から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記対象が、がんの動物モデルである、項目３０～３９のいずれか一項に記載の方法。（項目４１）
前記動物モデルがマウスモデルであり、任意に、前記マウスモデルがヒト化マウスモデルである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記対象が哺乳動物である、項目３０～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記哺乳動物がヒト化マウスまたはヒトである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記哺乳動物がヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＨＨＬＡ２とその結合阻害剤受容体ＫＩＲＤＬ３との間の相互作用を阻害することによ
って免疫応答を調節する方法。
（項目４６）
ＨＨＬＡ２とＫＩＲＤＬ３との間の相互作用が、チェックポイント遮断がん免疫療法における使用のために遮断される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
ＨＨＬＡ２とＫＩＲＤＬ３との間の相互作用が、抗ＨＨＬＡ２抗体を使用して阻害または遮断される、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記抗ＨＨＬＡ２抗体が、がん免疫療法のためのＴ細胞活性化のチェックポイント阻害剤である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
ＨＨＬＡ２とその結合刺激受容体ＴＭＩＧＤ２との間の相互作用を遮断または著しく阻害することなく、ＨＨＬＡ２とその結合阻害剤受容体ＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を選択的に阻害することによって免疫応答を調節する方法。
フローサイトメトリーによるＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９マウスプレＢ細胞白血病細胞株に対する抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの結合親和性データを示す。 フローサイトメトリーによるＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９マウスプレＢ細胞白血病細胞株へのＴＭＩＧＤ２－ヒトＩｇＧ結合の抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ遮断を示す。 抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ８Ｄ２（ＩＨＣ ｍＡｂ）でプローブされた９個のヒト腫瘍細胞株由来のタンパク質のウエスタンブロットデータを示す。 正常腎臓に対する明細胞腎臓癌（ｃｃＲＣＣ）における他のチェックポイント阻害剤と比較したＨＨＬＡ２ ｍＲＮＡ発現を示す。 ＴＣＧＡデータベースからの様々ながんにおけるＨＨＬＡ２発現を示す。 陰性対照細胞（３００．１９）、ＨＨＬＡ－２トランスフェクト３００．１９細胞（陽性対照）、ＯＣ１－Ｌｙ１細胞（陰性腫瘍）、およびＨＤＬＭ２（陽性ホジキンリンパ腫細胞株）ＨＨＬＡ２対照細胞におけるＨＨＬＡ２免疫組織化学（ＩＨＣ）結果を示す。 正常腎臓におけるＨＨＬＡ２発現を示す。 マイクロアレイ（ＴＭＡ）からのｃｃＲＣＣにおけるＨＨＬＡ２発現の代表的な画像を示す。 腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）からの異なるｃｃＲＣＣにおけるＨＨＬＡ２発現を欠く代表的な画像を示す。 代表的な約３００個の原形質膜クローンセットの二連でのスクリーニング結果、ならびにＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合を示す確認スクリーンを示す。合計５６８２個の細胞表面受容体膜クローンをスクリーニングした。 ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への選択的結合を示す。 関連バイオマーカーの遺伝子ＩＤおよびＮＣＢＩ受入情報を示す。 Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ受容体遺伝子アッセイの概略図を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞モデルを示す。 腫瘍によって発現され得る阻害性Ｂ７ファミリーメンバーを示す。 Ｔ細胞機能を制御するための２つの受容体（刺激性ＨＨＬＡ２受容体および阻害性ＨＨＬＡ２受容体）とＨＨＬＡ２との相互作用のモデルを示す。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達と同時に、ナイーブＴ細胞上のＴＭＩＧＤ２は、ＡＰＣ上のＨＨＬＡ２と相互作用し、ＡＫＴリン酸化を伴う経路を介してＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を共刺激する。反復Ｔ細胞活性化により、刺激性受容体ＴＭＩＧＤ２の発現が徐々に失われ、阻害性受容体ＫＩＲ３ＤＬ３の発現が優勢になることを可能にする。ＡＰＣまたは腫瘍細胞上のＨＨＬＡ２は、この第２の受容体と相互作用し、共阻害機能を発揮することができる。この図は、Ｘｉａｏ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３から編集されている。 非小細胞肺癌におけるＨＨＬＡ２陽性（すなわち、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂでの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色に基づいてＨＨＬＡ２を発現した肺癌組織）患者の層別化を示す。ＰＤ－Ｌ１陽性および陰性非小細胞肺癌におけるＨＨＬＡ２発現のパーセンテージを、ＨＨＬＡ２およびＰＤ－Ｌ１免疫染色研究に基づいて計算した（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２４：１９５４－１９６４）。 図１２Ａおよび１２Ｂ。トランスフェクト２９３Ｔ細胞におけるＴＭＩＧＤ２（図１２Ａ）またはＫＩＲ３ＤＬ３（図１２Ｂ）の発現を示す。ｐＥＦ－Ｐｕｒｏ発現ベクター中のＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３ ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞中で一過性にトランスフェクトし、４８～７２時間後に、それぞれ、（１）ＴＭＩＧＤ２ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ８３１６２、クローン番号９５３７４３）、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓカタログＦ０１０２Ｂ、または（２）ＫＩＲ３ＤＬ３－ＰＥコンジュゲートｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＦＡＢ８９１９Ｒ、クローン番号１１３６Ｂ）で染色し、フローサイトメトリーによって検出した。 図１２Ａおよび１２Ｂ。トランスフェクト２９３Ｔ細胞におけるＴＭＩＧＤ２（図１２Ａ）またはＫＩＲ３ＤＬ３（図１２Ｂ）の発現を示す。ｐＥＦ－Ｐｕｒｏ発現ベクター中のＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３ ｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞中で一過性にトランスフェクトし、４８～７２時間後に、それぞれ、（１）ＴＭＩＧＤ２ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ８３１６２、クローン番号９５３７４３）、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓカタログＦ０１０２Ｂ、または（２）ＫＩＲ３ＤＬ３－ＰＥコンジュゲートｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＦＡＢ８９１９Ｒ、クローン番号１１３６Ｂ）で染色し、フローサイトメトリーによって検出した。 図１２Ｃおよび１２Ｄ。ＴＭＩＧＤ２（図１２Ｃ）またはＫＩＲ３ＤＬ３（図１２Ｄ）トランスフェクト２９３Ｔ細胞へのＨＨＬＡ２－Ｆｃ結合を示す。ＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３で一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞へのＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ結合を、フローサイトメトリーによってＰＥ標識Ｆａｂ２ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（ヒトＩｇとの交差反応性のために吸収されたもの、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１０８２－０９）を使用して検出した。 図１２Ｃおよび１２Ｄ。ＴＭＩＧＤ２（図１２Ｃ）またはＫＩＲ３ＤＬ３（図１２Ｄ）トランスフェクト２９３Ｔ細胞へのＨＨＬＡ２－Ｆｃ結合を示す。ＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３で一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞へのＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ結合を、フローサイトメトリーによってＰＥ標識Ｆａｂ２ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（ヒトＩｇとの交差反応性のために吸収されたもの、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１０８２－０９）を使用して検出した。 図１３Ａおよび１３Ｂ。ヒトおよびカニクイザルＨＨＬＡ２へのＨＨＬＡ２ ｍＡｂ結合を示す。異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂを、ヒトＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞またはカニクイザルＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞のいずれかと４℃で３０分間インキュベートした。トランスフェクト３００．１９細胞へのＨＨＬＡ２ ｍＡｂ結合を、フローサイトメトリーによってＰｅ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。 図１３Ａおよび１３Ｂ。ヒトおよびカニクイザルＨＨＬＡ２へのＨＨＬＡ２ ｍＡｂ結合を示す。異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂを、ヒトＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞またはカニクイザルＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞のいずれかと４℃で３０分間インキュベートした。トランスフェクト３００．１９細胞へのＨＨＬＡ２ ｍＡｂ結合を、フローサイトメトリーによってＰｅ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。 ＴＭＩＧＤ２／ＨＨＬＡ２ Ｔ細胞共刺激アッセイの概略図を示す。ＴＭＩＧＤ２ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞を、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶまたは抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ＋ＨＨＬＡ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で刺激した。 ＣＨＯ－抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ細胞におけるＨＨＬＡ２発現を示す。抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ＋ＨＨＬＡ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（クローン番号２８）におけるＨＨＬＡ２発現を、フローサイトメトリーによってＰＥコンジュゲート６Ｆ１０ ＨＨＬＡ２ ｍＡｂで検出した。 Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞におけるＴＭＩＧＤ２発現を示す。ＴＭＩＧＤ２トランスフェクトＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞（クローン番号６２）におけるＴＭＩＧＤ２発現を示す。 ＴＭＩＧＤ２媒介性Ｔ細胞共刺激のＨＨＬＡ２ ｍＡｂ遮断を示す。ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に抗ＨＨＬＡ２抗体を添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、ＭＩＧＤ２ ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加した。プレートウェルを混合し、およそ３～６時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を製造業者の推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。 ＫＩＲ３ＤＬ３／ＨＨＬＡ２チェックポイントＴ細胞アッセイの概略図を示す。ＫＩＲ３ＤＬ３ ＪｕｒｋａｔＴ細胞ＩＬ－２プロモータールシフェラーゼレポーター遺伝子細胞を、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶまたは抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ＋ＨＨＬＡ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で刺激した。 図１９。Ｊｕｒｋａｔ－ＩＬ－２レポータークローンにおけるＫＩＲ３ＤＬ３発現を示す。ＫＩＲ３ＤＬ３発現をＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクトＪｕｒｋａｔ ＩＬ－２レポーター細胞クローン１～６、１～７、および２～１２で検出した。 図１９。Ｊｕｒｋａｔ－ＩＬ－２レポータークローンにおけるＫＩＲ３ＤＬ３発現を示す。ＫＩＲ３ＤＬ３発現をＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクトＪｕｒｋａｔ ＩＬ－２レポーター細胞クローン１～６、１～７、および２～１２で検出した。 図２０Ａ～２０Ｃ。ＫＩＲ３ＤＬ３媒介性Ｔ細胞阻害のＨＨＬＡ２ ｍＡｂチェックポイント遮断を示す。ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に抗ＨＨＬＡ２抗体を添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、ＫＩＲ３ＤＬ３＿ＩＬ２＿Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加し、加えて、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号１００１８６）も添加した（１ウェルあたり１００μＬアッセイ混合物中１μｇ／ｍＬの最終濃度。プレートウェルを混合し、およそ５時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。 図２０Ａ～２０Ｃ。ＫＩＲ３ＤＬ３媒介性Ｔ細胞阻害のＨＨＬＡ２ ｍＡｂチェックポイント遮断を示す。ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に抗ＨＨＬＡ２抗体を添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、ＫＩＲ３ＤＬ３＿ＩＬ２＿Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加し、加えて、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号１００１８６）も添加した（１ウェルあたり１００μＬアッセイ混合物中１μｇ／ｍＬの最終濃度。プレートウェルを混合し、およそ５時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。 図２０Ａ～２０Ｃ。ＫＩＲ３ＤＬ３媒介性Ｔ細胞阻害のＨＨＬＡ２ ｍＡｂチェックポイント遮断を示す。ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に抗ＨＨＬＡ２抗体を添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、ＫＩＲ３ＤＬ３＿ＩＬ２＿Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加し、加えて、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号１００１８６）も添加した（１ウェルあたり１００μＬアッセイ混合物中１μｇ／ｍＬの最終濃度。プレートウェルを混合し、およそ５時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。 図２１Ａ～２１Ｃ。Ｊｕｒｋａｔ ＫＩＲ３ＤＬ３阻害アッセイにおけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂの滴定を示す。Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ－２ルシフェラーゼクローン１～６、１～７、および２～１２を使用して、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ２Ｃ４および６Ｆ１０をＪｕｒｋａｔ ＩＬ－２レポータールシフェラーゼアッセイで評価した。 図２１Ａ～２１Ｃ。Ｊｕｒｋａｔ ＫＩＲ３ＤＬ３阻害アッセイにおけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂの滴定を示す。Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ－２ルシフェラーゼクローン１～６、１～７、および２～１２を使用して、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ２Ｃ４および６Ｆ１０をＪｕｒｋａｔ ＩＬ－２レポータールシフェラーゼアッセイで評価した。 図２１Ａ～２１Ｃ。Ｊｕｒｋａｔ ＫＩＲ３ＤＬ３阻害アッセイにおけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂの滴定を示す。Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ－２ルシフェラーゼクローン１～６、１～７、および２～１２を使用して、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ２Ｃ４および６Ｆ１０をＪｕｒｋａｔ ＩＬ－２レポータールシフェラーゼアッセイで評価した。 ＫＩＲ３ＤＬ３－選択的ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ２Ｃ４がＴＭＩＧＤ２媒介性共刺激を遮断しないことを示す。３０μｇ／ｍＬの濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ２Ｃ４をＪｕｒｋａｔ親ＮＦＡＴレポーター細胞中で評価した。ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に抗ＨＨＬＡ２抗体を添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、Ｊｕｒｋａｔ親＿ＮＦＡＴ＿Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加した。プレートウェルを混合し、およそ３～６時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。 図２３Ａ～２３Ｃ。ヒト化ＳＲＧ－１５マウス腫瘍モデル（Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を有する）におけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂがどのように評価され得るかを示す。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂを、ＨＨＬＡ２発現腫瘍細胞を有するヒト化ＳＲＧ－１５マウスに投与し、腫瘍成長阻害を評価する。これらの図は、Ｈｅｒｎｄｌｅｒ－Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）１１４：Ｅ９６２６－Ｅ９６３４から編集されたものである。 図２３Ａ～２３Ｃ。ヒト化ＳＲＧ－１５マウス腫瘍モデル（Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を有する）におけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂがどのように評価され得るかを示す。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂを、ＨＨＬＡ２発現腫瘍細胞を有するヒト化ＳＲＧ－１５マウスに投与し、腫瘍成長阻害を評価する。これらの図は、Ｈｅｒｎｄｌｅｒ－Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）１１４：Ｅ９６２６－Ｅ９６３４から編集されたものである。 図２３Ａ～２３Ｃ。ヒト化ＳＲＧ－１５マウス腫瘍モデル（Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を有する）におけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂがどのように評価され得るかを示す。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂを、ＨＨＬＡ２発現腫瘍細胞を有するヒト化ＳＲＧ－１５マウスに投与し、腫瘍成長阻害を評価する。これらの図は、Ｈｅｒｎｄｌｅｒ－Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）１１４：Ｅ９６２６－Ｅ９６３４から編集されたものである。 図２４Ａおよび２４Ｂ。カニクイザルＴ細胞モデルにおけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂがどのように評価され得るかを示す。カニクイザルにＨＨＬＡ２ ｍＡｂを投与し、ＫＬＨで免疫化し、Ｔ細胞依存性抗体および細胞媒介性応答を評価する。ＮＫ細胞毒性をエクスビボで評価する。 図２４Ａおよび２４Ｂ。カニクイザルＴ細胞モデルにおけるＨＨＬＡ２ ｍＡｂがどのように評価され得るかを示す。カニクイザルにＨＨＬＡ２ ｍＡｂを投与し、ＫＬＨで免疫化し、Ｔ細胞依存性抗体および細胞媒介性応答を評価する。ＮＫ細胞毒性をエクスビボで評価する。
本発明は、Ｂ７遺伝子ファミリーメンバーＨＨＬＡ２が様々な腫瘍および抗原提示細胞で広範に発現され、Ｔ細胞の活性化リガンドおよび阻害リガンドの両方として関与しているという発見に少なくとも部分的に基づいている。ナイーブＴ細胞で発現されるＴＭＩＧＤ２は、ＨＨＬＡ２に対する活性化受容体であり、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）連結後に共刺激シグナルを伝達する。ＴＭＩＧＤ２は、反復ＴＣＲ刺激後に下方制御される。ＨＨＬＡ２が腫瘍で高度に発現され、かつチェックポイントリガンドとしての機能を果たし得るという所見に基づいて、抗ＨＨＬＡ２ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルが候補免疫チェックポイント阻害剤治療薬として生成された。Ｂ７ファミリーメンバーＢ７－１およびＢ７－２の同じリガンド結合ドメインが活性化受容体および阻害性受容体（例えば、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４）の両方に結合することが知られていることを考慮して、ＴＭＩＧＤ２結合を遮断する抗ＨＨＬＡ２モノクローナル抗体がその推定阻害性受容体への結合を遮断する良好な候補としての機能を果たすと考えられている。ＴＭＩＧＤ２トランスフェクト３００．１９マウスプレＢ白血病細胞への可溶性ｈＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ結合を評価することにより、遮断抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂおよび非遮断抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの両方が特定された。ＴＭＩＧＤ２結合を遮断し、それぞれ、０．２５ｕｇ／ｍＬ、０．４４ｕｇ／ｍＬ、および０．２１ｕｇ／ｍＬ（ナノモル範囲）の相対ＥＣ５０結合親和性でＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９細胞に結合した抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ（例えば、６Ｆ１０、４Ｄ１、４Ｅ５、および２Ｇ２）が表２に列記されている。それぞれ、０．６３ｕｇ／ｍＬおよび２２．４９ｕｇ／ｍＬの相対結合親和性でＨＨＬＡ２に結合した非遮断抗体（例えば、１Ｃ８および６Ｄ１０）が表２に列記されている。これらの候補治療的抗ＨＨＬＡ２抗体の可変領域重鎖および軽鎖遺伝子配列が本明細書に記載されている。
抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ １Ｃ８および６Ｄ１０が、良好なホルマリン固定パラフィン包埋免疫組織化学またはウエスタンブロッティング試薬として特定された。ＴＣＧＡデータベースからの原発腫瘍におけるＨＨＬＡ２は、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、および結腸直腸癌、ならびにＡＭＬにおいて高い発現を示し、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、および子宮癌において中レベルの発現を示す。がんにおけるＨＨＬＡ２ ｍＲＮＡ発現は、対応する正常組織よりも高い。
可溶性ヒトＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａを有する３，５００個を超える異なる原形質膜タンパク質を網羅する４５００個を超える全長クローンの細胞表面発現ヒト血漿タンパク質ライブラリのスクリーニングにより、ＫＩＲ３ＤＬ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質尾部、３）がＨＨＬＡ２に対する新たな受容体として特定された。ＫＩＲ３ＤＬ３の細胞質尾部は、がん免疫療法を標的とするチェックポイント受容体としての機能を果たし得るＨＨＬＡ２に対する阻害性受容体を示す配列「ＶＴＹＡＱＬ」から成るＩＴＩＭモチーフを含む。１４個のＫＩＲ受容体（すなわち、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、およびＫＩＲ３ＤＳ１）のパネルを使用した際に他のＫＩＲ受容体への結合が観察されなかったため、ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合の選択性が実証された。
ＨＨＬＡ２が複数のタイプの腫瘍において高レベルで発現されるため、抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂチェックポイント阻害剤治療薬は、チェックポイント阻害剤治療に応答する患者のプールを増加させ得る。さらに、ＰＤ－１療法に対する耐性を発症する患者は、代替の免疫回避戦略としてＨＨＬＡ２を発現する場合があり、ＨＨＬＡ２遮断がＰＤ－１免疫療法に対する耐性を打開するための手段を提供し得る。
したがって、本発明は、ＨＨＬＡ２に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片、ならびにその免疫グロブリン、ポリペプチド、核酸、ならびに診断、予後、および治療目的のためにかかる抗体を使用する方法を提供する。
Ｉ．定義
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素（ａｎ
ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
マーカーの「変化した量」という用語は、対照試料中のマーカーと比較して、ある試料中のマーカーの増加もしくは減少したコピー数および／または特定のマーカー遺伝子（複数可）の増加もしくは減少した核酸レベルを指す。マーカーの「変化した量」という用語は、正常対照試料中のマーカーのタンパク質レベルと比較して、ある試料中のマーカーの増加または減少したタンパク質レベルも含む。
マーカーの「変化した活性」という用語は、正常対照試料中のマーカーの活性と比較して、例えば生体試料中のある病状で増加または減少するマーカーの活性を指す。マーカーの変化した活性は、例えば、マーカーの変化した発現、マーカーの変化したタンパク質レベル、マーカーの変化した構造、または、例えば、マーカーと同じもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との変化した相互作用、または転写活性化因子または阻害剤との変化した相互作用の結果であり得る。
マーカーの「変化した構造」という用語は、正常または野生型遺伝子またはタンパク質と比較して、マーカー遺伝子またはマーカータンパク質中での突然変異または対立遺伝子バリアント、例えば、マーカーの発現または活性に影響を及ぼす突然変異の存在を指す。例えば、突然変異には、置換、欠失、または付加突然変異が含まれるが、これらに限定されない。突然変異は、マーカーのコーディング領域または非コーディング領域に存在し得る。
「活性化受容体」という用語は、抗原、複合抗原（例えば、ＭＨＣポリペプチドとの関連で）、または抗体に結合する免疫細胞受容体を含む。かかる活性化受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体、およびＦｃ受容体を含む。
Ｔ細胞受容体はＴ細胞上に存在し、ＣＤ３ポリペプチドと関連している。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣポリペプチドとの関連で抗原によって（かつポリクローナルＴ細胞活性化試薬によって）刺激される。ＴＣＲを介したＴ細胞活性化により、多数の変化、例えば、タンパク質リン酸化、膜脂質変化、イオン流出、環状ヌクレオチド改変、ＲＮＡ転写変化、タンパク質合成変化、および細胞体積変化がもたらされる。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、所望の抗原特異性を有する操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子によって提示される短ペプチドとの相互作用により特異的抗原を認識する。初期活性化およびクローン増殖について、ナイーブＴ細胞は、追加の共刺激シグナルを提供する専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に依存している。共刺激の不在下でのＴＣＲ活性化により、無応答性およびクローンアネルギーがもたらされ得る。免疫化をバイパスするために、認識特異性がグラフトされた細胞毒性エフェクター細胞を誘導するための異なるアプローチが開発されている。ＴＣＲ関連ＣＤ３複合体の細胞表面成分に特異的な天然リガンドまたは抗体に由来する結合ドメインからなるＣＡＲが構築されている。抗原結合時、かかるキメラ抗原受容体は、エフェクター細胞における内因性シグナル伝達経路に連結し、ＴＣＲ複合体によって開始されるシグナルと同様の活性化シグナルを生成する。キメラ抗原受容体についての最初の報告以来、この概念は着実に改良されており、キメラ受容体の分子設計は最適化されており、いくつもの周知の結合ドメイン、例えば、ｓｃＦＶ、Ｆａｖ、および本明細書に記載の別のタンパク質結合断片が日常的に使用されている。
一般に、ＣＡＲは、本発明による使用のために企図された一種の「細胞療法」（例えば、Ｔ細胞療法）である。ＨＨＬＡ２経路を調節することによって、例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等のＨＨＬＡ２天然結合パートナーとの間の相互作用を調節することによって免疫細胞活性を調節するための薬剤および方法の多数の代表的な実施形態が包含されるが、免疫細胞に基づく療法および方法も包含される。例えば、ＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３のノックアウト、ノックダウン、または増加した発現を有するように操作されたＴ細胞が企図される。同様に、ＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等のＨＨＬＡ２リガンドのノックアウト、ノックダウン、または増加した発現を有するように操作された免疫細胞または他の細胞も企図される。
Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞上に存在する。Ｂ細胞抗原受容体は、膜Ｉｇ（ｍＩｇ）と他の膜貫通ポリペプチド（例えば、ＩｇαおよびＩｇβ）との間の複合体である。ｍＩｇのシグナル伝達機能は、オリゴマー抗原または多量体抗原による受容体ポリペプチドの架橋によって誘発される。Ｂ細胞は、抗免疫グロブリン抗体によって活性化される場合もある。ＢＣＲ活性化時、チロシンリン酸化を含む多数の変化がＢ細胞で生じる。
Ｆｃ受容体は、免疫応答に関与する多くの細胞上に見られる。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、免疫グロブリンポリペプチド（Ｉｇ）のＦｃ部分に対する細胞表面受容体である。これまでに特定されているヒトＦｃＲのうち、ＩｇＧ（Ｆｃγ Ｒに指定）、ＩｇＥ（Ｆｃε
Ｒ１）、ＩｇＡ（Ｆｃα）、および重合ＩｇＭ／Ａ（Ｆｃμα Ｒ）を認識するものがある。ＦｃＲは、以下の細胞型：Ｆｃε Ｒ Ｉ（マスト細胞）、Ｆｃε Ｒ．ＩＩ（多くの白血球）、Ｆｃα Ｒ（好中球）、およびＦｃμα Ｒ（腺上皮、肝細胞）に見られる（Ｈｏｇｇ，Ｎ．（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：１８５－８６）。広く研究されたＦｃγＲは、細胞性免疫防御の中心となり、自己免疫疾患の発病に関与する炎症メディエーターおよび加水分解酵素の放出の刺激に関与する（Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１－８１）。マクロファージ／単球、多形核白血球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃγＲがＩｇＧによって媒介される特異的認識要素を付与するため、ＦｃγＲは、エフェクター細胞とＩｇを分泌するリンパ球との間に重要な関連性を提供する。ヒト白血球は、ＩｇＧに対する少なくとも３つの異なる受容体：ｈ Ｆｃγ ＲＩ（単球／マクロファージに見られる）、ｈＦｃγ ＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、恐らくＢ細胞、およびＫ５６２細胞株に見られる）、およびＦｃγ ＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージに見られる）を有する。
Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞への共刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡによって阻害されないシグナル伝達経路を伴う。加えて、共刺激シグナルは、Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌（例えば、ＩＬ－２および／もしくはＩＬ－１０）を誘導することができ、かつ／または抗原に対する無応答性の誘導、アネルギーの誘導、もしくはＴ細胞における細胞死（欠失）の誘導を阻止することができる。
「活性」という用語は、ポリペプチド、例えば、ＨＨＬＡ２および／またはＨＨＬＡ２天然結合パートナー、例えば、ＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３に関して使用される場合、タンパク質の構造に固有の活性を含む。例えば、ＨＨＬＡ２リガンドに関して、「活性」という用語は、免疫細胞における阻害性シグナルを調節することによって（例えば、免疫細胞上の天然受容体を連結することによって）免疫細胞阻害を調節する能力を含む。当業者であれば、ＨＨＬＡ２リガンドポリペプチドの活性化形態が阻害性受容体に結合すると、阻害性シグナルが免疫細胞で生成されることを認識するであろう。
「阻害性シグナル」という用語は、免疫細胞上のポリペプチドに対する阻害性受容体（例えば、ＨＨＬＡ２、ＫＬＲＢ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１等）を介して伝達されるシグナルを指す。かかるシグナルは、活性化受容体を介して（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、ＴＭＩＧＤ２、またはＦｃポリペプチドを介して）シグナルをアンタゴナイズし、例えば、第２のメッセンジャー生成の阻害、増殖の阻害、免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、例えば、食作用の低減、抗体産生の低減、細胞毒性の低減、免疫細胞がメディエーター（サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）および／またはアレルギー応答メディエーター等）を産生することができないこと、またはアネルギーの発生をもたらし得る。
対象におけるバイオマーカーの量は、バイオマーカーの量が、それぞれ、正常レベルまたは対照レベルよりも、量を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超える量だけ、好ましくはその量よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％高いまたは低い場合、バイオマーカーの正常量よりも「有意に」高いまたは低い。あるいは、対象にけるバイオマーカーの量は、バイオマーカーの量が、それぞれ、バイオマーカーの正常量および／または対照量よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、もしくはそれ以上、または５％～１００％等のそれらの間の任意の範囲高いまたは低い場合、正常量および／または対照量よりも「有意に」高いまたは低いとみなされ得る。かかる有意な調節値は、変化した発現レベル、変化した活性、がん細胞過剰増殖性成長の変化、がん細胞死の変化、バイオマーカー阻害の変化、試験薬剤結合の変化等の本明細書に記載のいずれの測定基準にも適用され得る。
対象におけるマーカーの「量」、例えば、マーカーまたはＭＣＲの発現量もしくはコピー数、またはマーカーのタンパク質レベルは、マーカーの量が、それぞれ、正常レベルよりも、量を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超える量だけ、好ましくはその量の少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上高いまたは低い場合、マーカーの正常量よりも「有意に」高いまたは低い。あるいは、対象におけるマーカーの量は、マーカーの量が、それぞれ、マーカーの正常量よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、４倍、または５倍高いまたは低い場合、正常量よりも「有意に」高いまたは低いとみなされ得る。
マーカーの「変化した発現レベル」という用語は、発現またはコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも高いまたは低い、好ましくは対照試料（例えば、関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーまたは染色体領域の発現レベルまたはコピー数、好ましくはいくつかの対照試料中のマーカーまたは染色体領域の平均発現レベルまたはコピー数の少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、もしくは１０倍、またはそれ以上である、試験試料、例えば、がんに罹患している対象に由来する試料中のマーカーの発現レベルまたはコピー数を指す。変化した発現レベルは、発現量またはコピー数を評価するために用いられるアッセイの標準誤差よりも高くまたは低く、対照試料（例えば、関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベルまたはコピー数、好ましくはいくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、もしくは１０倍、またはそれ以上である。
「免疫療法」という用語は、例えば、がんワクチンおよび／または感作抗原提示細胞の使用を含み得る標的療法の形態を指す。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を無傷のまま残しながらがん細胞に感染して溶解させることができるウイルスであり、それらを免疫調節療法に潜在的に有用なものにする。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞破壊を促進し、腫瘍部位での用量増幅ももたらす。それらは、抗がん遺伝子のベクターとして作用することもでき、それらを腫瘍部位に特異的に送達させる。この免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して産生された予め形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤または毒素に結合しているモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主の短期間保護のための受動免疫を伴い得る。この免疫療法は、がん細胞株の細胞毒性リンパ球によって認識されるエピトープの使用にも焦点を合わせることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチド等を使用して、腫瘍またはがんの発症、進行、および／または病理に関連した生体分子を選択的に調節することができる。上述のように、免疫チェックポイント標的、例えば、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＫＩＲ３ＤＬ３等に対する免疫療法が有用である。
本明細書で別途特定されない限り、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗体の天然に存在する形態（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）および組換え抗体、例えば、一本鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体、ならびに多重特異性抗体、ならびに前述の全ての断片および誘導体（これらの断片および誘導体は少なくとも抗原結合部位を有する）を広範に包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質または化学的部分を含み得る。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはそれらの抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略される）および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略される）および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから成る。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬは各々、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシル末端に配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから成る。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。「不活性化抗体」という用語は、補体系を誘導しない抗体を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨが別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、それらがＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価ポリペプチドを形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、およびＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：７７８を参照のこと）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨ配列およびＶＬ配列は、完全ＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結され得る。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用した免疫グロブリンのＦａｂ断片、Ｆｖ断片、または他の断片の生成にも使用され得る。ダイアボディ等の一本鎖抗体他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用して発現され、それにより、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照のこと）。
なおさらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合によって形成されるより大きい免疫接着ポリペプチドの一部であり得る。かかる免疫接着ポリペプチドの例には、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３－１０１）、および二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片等の抗体部分は、それぞれ、全抗体のパパイン消化またはペプシン消化等の従来の技法を使用して、全抗体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載の標準の組換えＤＮＡ技法を使用して得られ得る。
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、異種、同種、もしくは同系、またはそれらの修飾形態（例えば、ヒト化、キメラ等）であり得る。抗体は、完全にヒトである場合もある。一実施形態では、本発明の抗体は、ＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片に特異的にまたは実質的に特異的に結合する。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる１種のみの抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指し、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる複数の種の抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を呈する。
「体液」という用語は、身体から排泄または分泌される流体、ならびに通常は身体から排泄または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳くそ、カウパー液または前射精液、乳糜、糜粥、糞便、雌性射出液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸膜液、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、腟粘滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。
「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖性障害」という用語は、制御不能な増殖、不死性、転移能、速い成長および増殖速度、ならびにある特定の特有の形態学的特徴等のがんを引き起こす細胞に特有の特性を有する細胞の存在を指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、かかる細胞は、動物に単独で存在し得るか、または白血病細胞等の非腫瘍形成性がん細胞であり得る。がんには、Ｂ細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、およびミュー鎖病等、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、および免疫球性アミロイドーシス、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳癌または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔癌または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、睾丸癌、胆道癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織癌等が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって包含される方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、肝臓癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）、および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、本来、上皮癌であり、がんには、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科癌、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、がんは、乳癌、前立腺癌、肺癌、または結腸癌である。なお他の実施形態では、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮癌は、漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナー、または未分化を含むが、これらに限定されない様々な他の方法で特徴付けられ得る。
「ＣＤＲ」という用語およびその複数形「ＣＤＲｓ」は、３つが軽鎖可変領域の結合特性（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３）を構成し、３つが重鎖可変領域の結合特性（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）を構成する、相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。ＣＤＲは、抗体分子の機能的活性に寄与し、足場またはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離される。正確な定義ＣＤＲ境界および長さは、異なる分類および番号付けシステムに付される。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触、または任意の他の境界定義によって参照され得る。異なる境界にもかかわらず、これらのシステムは各々、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにある程度の重複を有する。したがって、これらのシステムに従うＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さおよび境界領域の点で異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａ、および／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（各々参照により全体が組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９２、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６２，７３２）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「分類すること」という用語は、試料を病状と「関連付けること」または試料を病状で「カテゴリー化すること」を含む。ある特定の例では、「分類すること」は、統計的証拠、実験的証拠、またはそれらの両方に基づいている。ある特定の実施形態では、分類する方法およびシステムは、いわゆる既知の病状を有する試料の訓練セットを使用する。確立された時点で、訓練データセットは、試料の未知の病状を分類するために、未知の試料の特徴が比較される基礎、モデル、またはテンプレートとしての機能を果たす。ある特定の例では、試料の分類は、試料の病状の診断に似ている。ある特定の他の例では、試料の分類は、試料の病状の別の病状との区別に似ている。
本明細書で使用される場合、「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）を指す。
「［に対する］相補体」または「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基が、残基がチミンまたはウラシルである場合に第１の領域に逆平行の第２の核酸領域の残基と特異的水素結合（「塩基対合」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基が、残基がグアニンである場合に第１の鎖に逆平行の第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。核酸の第１の領域は、第１の領域と第２の領域が逆平行様式で配置されたときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、同じまたは異なる核酸の第２の領域に相補的である。一実施形態では、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、第１の部分と第２の部分が平行様式で配置されたときに、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。別の実施形態では、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
本明細書で使用される場合、「複合抗体」という用語は、２つ以上の非連関可変領域由来の生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を指す。加えて、「複合ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域および２つ以上の非関連ヒト可変領域由来のヒト生殖系列または非生殖系列配列を含む可変領域を有する抗体を指す。複合ヒト抗体は、ヒト体内の複合ヒト抗体の抗原性が低下するため、本発明による治療薬における有効な成分として有用である。
「対照」という用語は、試験試料中の発現産物との比較を提供するのに好適な任意の参照基準を指す。一実施形態では、対照は、発現産物レベルが検出され、試験試料由来の発現産物レベルと比較される「対照試料」を得ることを含む。かかる対照試料は、既知の転帰を有する対照がん患者由来の試料（保管された試料もしくは先行試料測定であり得る）、健常患者もしくはがん患者等の対象から単離された正常組織もしくは細胞、がん患者の同じ臓器もしくは身体位置から得られた正常細胞／組織に隣接する、健常対象もしくはがん患者等の対象から単離された培養初代細胞／組織、健常対象から単離された組織もしくは細胞試料、または寄託所から得られた初代細胞／組織を含むが、これらに限定されない、任意の好適な試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子、正常組織（または他の以前に分析された対照試料）由来の発現産物レベル範囲、ある特定の転帰（例えば、１、２、３、４年等の生存期間）を有するか、またはある特定の治療（例えば、標準治療がん療法）を受けている患者群または一組の患者由来の試験試料中の以前に決定された発現産物レベル範囲を含むが、これらに限定されない、任意の好適な源由来の参照基準発現産物レベルを含み得る。当業者であれば、かかる対照試料および参照基準発現産物レベルが対照として本発明の方法と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。一実施形態では、対照は、正常または非がん性細胞／組織試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、一組の患者、例えば、一組のがん患者の発現レベル、またはある特定の治療を受けている一組のがん患者発現レベル、またはある転帰に対して別の転帰を有する一組の患者の発現レベルを含み得る。前者の場合、各患者の特異的発現産物レベルは、発現のパーセンタイルレベルに割り当てられ得るか、または参照基準発現レベルの平均値もしくは平均よりも高いまたは低いのいずれかとして表され得る。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、併用化学療法で治療された患者由来の細胞、および良性がんを有する患者由来の細胞を含み得る。別の実施形態では、対照は、測定値、例えば、ある集団におけるハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較した同じ集団における特定の遺伝子の平均発現レベルも含み得る。かかる集団は、健常対象、いずれの治療も受けていない（すなわち、未治療）がん患者、標準治療療法を受けているがん患者、または良性がんを有する患者を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、試験試料中の２つの遺伝子の発現産物レベルの比率を決定し、それを参照基準で同じ２つの遺伝子の任意の好適な比率と比較すること、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定し、任意の好適な対照中の発現産物レベルの差を決定すること、および試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定し、それらの発現を試験試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に正規化し、任意の好適な対照と比較することを含むが、これらに限定されない、発現産物レベルの比率変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系統および／またはタイプのものである対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、がんを有する全ての患者等の一組の患者試料中のパーセンタイルとしてまたはそれに基づいて群分けされる発現産物レベルを含み得る。一実施形態では、例えば特定のパーセンタイルと比較してより高いまたはより低い発現産物レベルが転帰を予測するための基礎として使用される対照発現産物レベルが確立される。別の好ましい実施形態では、既知の転帰を有するがん対照患者由来の発現産物レベルを使用して対照発現産物レベルが確立され、試験試料由来の発現産物レベルが転帰を予測する基礎として対照発現産物レベルと比較される。以下のデータによって実証されるように、本発明の方法は、試験試料中の発現産物レベルを対照と比較する際の特定のカットポイントの使用に限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域および可変Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶと定義される。本発明の抗体における使用に好適な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライスされた形態を含む）が含まれ、ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）、およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）で概説されている。今後特定されるものを含む他のＦｃＲも、本明細書における「ＦｃＲ」という用語によって包含される。
分子は、かなりの割合の分子が基質から解離することなく基質が流体（例えば標準のクエン酸生理食塩水、ｐＨ７．４）ですすがれ得るように、分子が基質に共有結合的または非共有結合的に会合している場合、基質に「固定」または「付着（ａｆｆｉｘ）」されている。
本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「機能保存的バリアント」とは、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、あるアミノ酸と同様の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族等）を有するアミノ酸との置換を含むが、これに限定されない、ポリペプチドの全体的な立体配座および機能を改変することなく変化したものである。保存されたものとして示されるもの以外のアミノ酸は、同様の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性パーセントが変化し得るように、タンパク質中で異なり得、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法等のアライメントスキームに従って決定される、７０％～９９％であり得る。「機能保存的バリアント」は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、なお好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつそれが比較される天然または親タンパク質と同じまたは実質的に同様の特性または機能を有するポリペプチドも含む。
本明細書で使用される場合、「異種抗体」という用語は、かかる抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物との関連で定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からなるものではなく、一般にトランスジェニック非ヒト動物種以外の種由来の生物に見られるものに対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指す。
本明細書で使用される「相同」とは、同じ核酸鎖の２つの領域間または２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両領域におけるヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有されている場合、それらの領域は、その位置で相同である。第１の領域は、各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有されている場合、第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有されている２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される。一例として、ヌクレオチド配列５’－ＡＴＴＧＣＣ－３’を有する領域およびヌクレオチド配列５’－ＴＡＴＧＧＣ－３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、それらの部分の各々のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が同じヌクレオチド残基によって占有される。より好ましくは、それらの部分の各々の全てのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有される。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクター等の本発明の核酸が導入される細胞を指すよう意図されている。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義に使用される。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的子孫も指すことを理解されたい。突然変異または環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト細胞によって作製されるであろう抗体により厳密に似るように改変された可変領域および定常領域を有する非ヒト細胞によって作製された抗体を含むよう意図されている。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を改変することにより、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み込む。ヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲにおける、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体も含む。
本明細書で使用されるヒト化マウスとは、機能するヒト遺伝子（例えば、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、および／またはＫＩＲ３ＤＬ３）、細胞、組織、および／または臓器を持つマウスである。ヒト化マウスは、ヒト治療薬のための生物学的および医学的研究で小動物モデルとして一般に使用されている。ヌードマウスおよび重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスがこの目的のために使用され得る。ＮＣＧマウス、ＮＯＧマウス、およびＮＳＧマウスが、ヒト細胞および組織を他のモデルよりも効率的に生着させるために使用され得る。かかるヒト化マウスモデルは、健康および病理学のシナリオでヒト免疫系をモデル化するために使用され得、ヒト生理学に関連するインビボ状況での治療候補の評価を可能にし得る。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列で超可変であり、かつ／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３が６つのＨＶＲのうちで最も多様性を呈し、特にＨ３が抗体への微細特異性の付与に特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，３７－４５、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８，１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３））を参照されたい。実際には、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ類抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ
３６３：４４６－４４８（１９９３）およびＳｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，７３３－７３６を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は造血起源のものであり、免疫細胞には、リンパ球、例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球が含まれる。
本明細書で使用される場合、「免疫障害」という用語には、がん、慢性炎症性疾患および障害（例えば、クローン病、炎症性腸疾患、反応性関節炎、およびライム病等）、インスリン依存性糖尿病、臓器特異的自己免疫（例えば、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、自己免疫性ブドウ膜炎、およびグレーブス病等）、接触性皮膚炎、乾癬、移植片拒絶、移植片対宿主病、サルコイドーシス、アトピー性状態（例えば、喘息およびアレルギー（アレルギー性鼻炎および食品アレルギー等の消化管アレルギーを含むが、これらに限定されない）等）、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、蠕虫等のある特定の病原体易感染性（例えば、リーシュマニア症等）およびある特定のウイルス感染（例えば、ＨＩＶおよび細菌感染（結核および癩腫癩等）等）、ならびにマラリアを含むが、これらに限定されない免疫疾患、状態、およびそれらの素因が含まれる。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示の免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、および細胞毒性が含まれる。加えて、免疫応答という用語には、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的にもたらされる免疫応答が含まれる。
「免疫治療薬」という用語は、対象における腫瘍またはがんに対する免疫応答をもたらすように宿主免疫系を刺激することができる任意の分子、ペプチド、抗体、または他の薬剤を含み得る。様々な免疫治療薬が本明細書に記載の組成物および方法で有用である。
「免疫チェックポイント」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方調節または阻害することによって免疫応答を微調整するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は当該技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、４－ＩＢＢ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲが含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照のこと）。この用語は、生物学的に活性なタンパク質断片、ならびに全長免疫チェックポイントタンパク質およびその生物学的に活性なタンパク質断片をコードする核酸をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この用語は、本明細書に提供される相同性の説明に従う任意の断片をさらに包含する。
免疫チェックポイントおよびそれらの配列は当該技術分野で周知であり、代表的な実施形態が以下に記載される。例えば、「ＰＤ－１」という用語は、既知のリガンドとしてＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を有する共阻害受容体として機能する免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す。ＰＤ－１は、ＴＣＲ誘導性活性化Ｔ細胞死中に上方制御された遺伝子を選択するためのクローニングベースの減算アプローチを使用して以前に特定された。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１に結合するその能力に基づいた分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４と同様に、ＰＤ－１は、抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面上で迅速に誘導される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．２５（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５）。しかしながら、ＣＴＬＡ－４とは対照的に、ＰＤ－１はＢ細胞の表面上でも誘導される（抗ＩｇＭに応答して）。ＰＤ－１は、胸腺細胞および骨髄細胞のサブセット上でも発現される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）（上記参照）、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３）。
本明細書で使用される場合、「阻害すること」という用語およびその文法的等価物は、特定の作用、機能、または相互作用の低減、制限、および／または遮断を指す。一実施形態では、この用語は、所与の出力またはパラメータのレベルを、対応する対照における量よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ未満の量（例えば、背景染色、ＨＨＬＡ２シグナル伝達、ＨＨＬＡ２免疫阻害性機能等）に減少させることを指す。所与の出力またはパラメータのレベルの減少は、出力またはパラメータの絶対不在を意味し得るが、意味する必要はない。本発明は、出力またはパラメータを完全に排除する方法を必要とせず、それに限定されない。所与の出力またはパラメータは、本明細書および実施例で論じられる免疫組織化学的アッセイ、分子生物学的アッセイ、細胞生物学的アッセイ、臨床的アッセイ、および生化学的アッセイを含むが、これらに限定されない当該技術分野で周知の方法を使用して決定され得る。「促進すること」、「増加させること」という反意用語、およびそれらの文法的等価物は、阻害または低減について記載されたものと反対である所与の出力またはパラメータのレベルの増加を指す。
本明細書で使用される場合、「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用を指すとき、分子の互いとの物理的接触（例えば、結合）（例えば、ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合またはＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合）を指す。一般に、かかる相互作用は、当該分子の一方または両方の活性をもたらす（それにより、生物学的効果がもたらされる）。活性は、それらの分子の一方または両方の直接活性（例えば、シグナル伝達）であり得る。あるいは、相互作用における一方または両方の分子は、それらのリガンドへの結合を阻止される場合があり、それ故に、リガンド結合活性（例えば、そのリガンドに結合し、免疫応答を誘発または阻害する）に関して不活性で保持される。かかる相互作用を阻害することにより、相互作用に関与する１つ以上の分子の活性の破壊がもたらされる。かかる相互作用を増強することは、当該物理的接触を延長するか、またはその可能性を高めることであり、当該活性の可能性を延長するか、またはその可能性を高めることである。
「ネオアジュバント療法」という用語は、一次治療の前に施される治療を指す。ネオアジュバント療法の例には、化学療法、放射線療法、およびホルモン療法が挙げられ得る。
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＨＨＬＡ２に特異的に結合し、ＨＨＬＡ２に結合しない抗体を実質的に含まない単離された抗体）を指すよう意図されている。しかしながら、ＨＨＬＡ２に特異的に結合する単離された抗体は、それぞれ、異なる種由来の他のＢ７ファミリータンパク質に対する交差反応性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、この抗体は、少なくとも２つの種、例えば、ヒトおよび非齧歯類動物等の他の動物、または他の哺乳動物もしくは非哺乳動物種に対して特異的結合親和性を維持する。しかしながら、いくつかの実施形態では、この抗体は、ヒトＨＨＬＡ２に対してより高いまたは実際に特異的な親和性および選択性を維持する。加えて、単離された抗体は、典型的には、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施形態では、ヒトＨＨＬＡ２に対する異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせが、明確に定義された組成物中で組み合わせられる。
本明細書で使用される場合、「単離されたタンパク質」とは、他のタンパク質、細胞物質、分離培地、および培養培地（細胞から単離される場合または組換えＤＮＡ技法によって産生される場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質が由来する細胞もしくは組織源由来の細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質が、それが単離されるか、または組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離される標的ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）またはその断片の調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の非標的タンパク質（本明細書で「夾雑タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非標的タンパク質、なおより好ましくは約１０％未満の非標的タンパク質、最も好ましくは約５％未満の非標的タンパク質を有する標的タンパク質またはその断片の調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質、またはそれらの断片、例えば、それらの生物学的に活性な断片が組換え的に産生される場合、これは、好ましくは、培養培地、すなわち、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する培養培地を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指すよう意図されている。開示される本発明の抗体の結合親和性は、標準の抗体－抗原アッセイ、例えば、競合的アッセイ、飽和アッセイ、またはＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ等の標準の免疫アッセイによって測定または決定され得る。
本明細書で使用される場合、「キット」とは、本発明のマーカーの発現を特異的に検出または調節するための少なくとも１つの試薬、例えば、プローブを含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）である。本キットは、本発明の方法を行うための装置として販売促進、流通、または販売され得る。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を呈する抗体を指す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一結合特異性を呈し、かつヒト生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
「マーカー」は、ある組織または細胞での発現レベルの正常または健常組織または細胞におけるその発現レベルからの変化ががん等の病状に関連する遺伝子である。「マーカー核酸」は、本発明のマーカーによってコードされるか、またはそれに対応する核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。かかるマーカー核酸には、配列表に記載の核酸配列のうちのいずれかの全配列もしくは部分配列、またはかかる配列の相補体を含むＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が含まれる。マーカー核酸は、配列表に記載の核酸配列のうちのいずれかの全配列もしくは部分配列、またはかかる配列の相補体を含むＲＮＡも含み、全てのチミジン残基がウリジン残基で置換されている。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカーによってコードされるか、またはそれに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、配列表に記載の配列のうちのいずれかの全配列または部分配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＨＬＡ２の全体がマーカーとして使用される。他の実施形態では、ＨＨＬＡ２の断片がマーカーとして使用される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は同義に使用される。
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、上方制御および下方制御、例えば、応答の増強または阻害を含む。
マーカーの「正常な」発現レベルは、異常なマーカーレベルに関連する疾患または障害に罹患していない対象、例えば、ヒト患者の細胞中のマーカーの発現レベルである。マーカーの「過剰発現」または「有意により高い発現レベル」とは、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超え、かつ対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルの好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５、または１０倍である、試験試料における発現レベルを指す。マーカーの「有意により低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５、または１０倍低い、試験試料における発現レベルを指す。
かかる「有意」レベルは、例えば、発現、阻害、細胞毒性、細胞成長等についての本明細書に記載の任意の他の測定されたパラメータにも適用され得る。
「所定の」バイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）という用語は、ほんの一例として、特定の治療のために選択され得る対象を評価するために、ＨＨＬＡ２モジュレーター等のＨＨＬＡ２経路の１つ以上のモジュレーター、ならびにＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナー等の治療への応答を単独でまたは１つ以上の免疫療法と組み合わせてのいずれかで評価するために、かつ／または病状を評価するために使用されるバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）であり得る。所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、がんを有する患者集団またはがんを有しない患者集団において決定され得る。所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、あらゆる患者に平等に適用可能な単数であり得るか、または所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、特定の患者亜集団により異なり得る。対象の年齢、体重、身長、および他の因子は、その個体の所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）に影響を及ぼし得る。さらに、所定のバイオマーカー量および／または活性は、対象毎に個別に決定され得る。一実施形態では、本明細書に記載の方法で決定および／または比較される量は、絶対測定値に基づいている。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で決定および／または比較される量は、比率（例えば、細胞比、またはハウスキーピングもしくはさもなければ概ね一定のバイオマーカーの発現に正規化された血清バイオマーカー）等の相対測定値に基づいている。所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、任意の好適な基準であり得る。例えば、所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、患者選択が評価される同じまたは異なるヒトから得られ得る。一実施形態では、所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、同じ患者の以前の評価から得られ得る。かかる様式で、患者の選択の経過が経時的に監視され得る。加えて、対照は、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、対象がヒトである場合、選択されたヒト群の評価から得られ得る。かかる様式で、選択が評価されるヒトの選択の程度が、好適な他のヒト、例えば、同様もしくは同じ状態（複数可）に罹患しているヒトおよび／または同じ民族集団のヒト等の目的とするヒトと同様の状況下にある他のヒトと比較され得る。
「予測的」という用語は、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーターを単独でまたは免疫チェックポイント阻害療法等の免疫療法と組み合わせてのいずれかで）等の免疫調節療法に対するがんの応答の可能性を決定するための、療法前、療法中、または療法後のバイオマーカー核酸および／またはタンパク質状態、例えば、過剰または過小活性、出現、発現、成長、寛解、再発、または腫瘍の抵抗性の使用を含む。バイオマーカーのかかる予測的使用は、例えば、（１）増加または減少したコピー数（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨ＋ＳＫＹ、単一分子配列決定（例えば、当該技術分野において少なくともＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２８９－３０１に記載されるもの）、もしくはｑＰＣＲによる）、バイオマーカー核酸の過剰発現もしくは過小発現（例えば、ＩＳＨ、ノーザンブロット、もしくはｑＰＣＲによる）、増加もしくは減少したバイオマーカータンパク質（例えば、ＩＨＣによる）および／もしくはバイオマーカー標的、または増加もしくは減少した活性（例えば、アッセイされたヒトがんタイプまたはがん試料の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％超、またはそれ以上）、（２）生体試料、例えば、がんに罹患している対象、例えば、ヒト由来の組織、全血、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、または骨髄を含有する試料におけるその絶対または比較的調節された存在または不在、（３）がんを有する患者（例えば、特定の免疫調節療法（例えば、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーターを単独でまたは免疫療法と組み合わせてのいずれかで）に応答する患者、またはそれに対する抵抗性を発症する患者）の臨床サブセットにおけるその絶対または比較的調節された存在または不在によって確認され得る。
「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等の用語は、疾患、障害、または状態を有しないが、それを発症する危険性があるか、またはそれに罹患し易い対象における疾患、障害、または状態を発症する可能性を低下させることを指す。
「予後」という用語は、がんの起こり得る経過および転帰または疾患からの回復の可能性の予測を含む。いくつかの実施形態では、統計的アルゴリズムの使用により、個体におけるがんの予後が提供される。例えば、予後は、手術、がんの臨床亜型（例えば、肺癌、黒色腫、および腎細胞癌等の固形腫瘍）の発症、１つ以上の臨床的因子の発症、腸癌の発症、または疾患からの回復であり得る。
「療法に対する応答」（例えば、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーターを単独でまたは免疫チェックポイント阻害療法等の免疫療法と組み合わせてのいずれかで）という用語は、療法に対する任意の応答（例えば、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーターを単独でまたは免疫チェックポイント阻害療法等の免疫療法と組み合わせてのいずれかで）に関し、がんの場合、好ましくは、ネオアジュバントまたはアジュバント化学療法の開始後のがん細胞数、腫瘍質量、および／または体積の変化に関する。過剰増殖性障害応答が、例えば、有効性についてまたはネオアジュバントもしくはアジュバント状況で評価され得、全身介入後の腫瘍サイズが、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、または触診によって測定される初期サイズおよび寸法と比較され得る。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定または病理学検査によっても評価され得る。応答は、腫瘍体積のパーセンテージ変化等の量的様式で、または「病理学的完全寛解」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、もしくは他の質的基準等の質的様式で記録され得る。過剰増殖性障害応答の評価は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または好ましくは数ヶ月後に行われ得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終了時または残留腫瘍細胞および／もしくは腫瘍床の外科的除去時である。これは、典型的には、ネオアジュバント療法開始の３ヶ月後である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的治療の臨床的有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することによって決定され得る。臨床的有用率は、療法終了の少なくとも６ヶ月後の時点での完全寛解（ＣＲ）にある患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数、および安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の合計を決定することによって測定される。この公式の省略表現は、６ヶ月にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、特定のがん治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれ以上である。がん療法に対する応答を評価するための追加の基準は、「生存期間」に関連し、これには、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、または腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発および遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がんおよびそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時または治療開始時）および終了点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、および腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。例えば、適切な閾値を決定するために、特定のがん治療レジメンが対象集団に投与され得、転帰が任意の免疫調節療法の投与前に決定されたバイオマーカー測定値と相関付けられ得る。転帰測定値は、ネオアジュバント状況で施される療法に対する病理学的応答であり得る。あるいは、バイオマーカー測定値が既知である免疫調節療法後の対象について、全生存期間および無病生存期間等の転帰測定値がある期間にわたって監視され得る。ある特定の実施形態では、投与される用量は、当該技術分野で既知のがん治療薬の標準用量である。対象が監視される期間は異なり得る。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヶ月間監視され得る。
「抵抗性」という用語は、免疫調節療法に対するがん試料または哺乳動物の獲得抵抗性または自然抵抗性（すなわち、治療的治療に対して無応答性であるか、または治療的治療に対する低下したまたは限定された応答を有すること）を指し、例えば、治療的治療に対して５％またはそれ以上、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、またはそれ以上低下した応答を有する。応答の低下は、抵抗性が獲得される前に同じがん試料または哺乳動物と比較することによって、または治療的治療に対する抵抗性を有しないことが知られている異なるがん試料または哺乳動物と比較することによって測定され得る。化学療法に対する典型的な獲得抵抗性は、「多剤抵抗性」と呼ばれる。多剤抵抗性は、Ｐ糖タンパク質によって媒介され得るか、または他の機構によって媒介され得るか、または哺乳動物が多剤抵抗性微生物または微生物の組み合わせに感染したときに生じ得る。治療的治療に対する抵抗性の決定は、当該技術分野で通例であり、当業臨床医の技術の範囲内であり、例えば、「感作」として本明細書に記載の細胞増殖性アッセイおよび細胞死アッセイによって測定され得る。いくつかの実施形態では、「抵抗性を逆転させる」という用語は、一次がん療法（例えば、化学療法または放射線療法）単独では治療されていない腫瘍の腫瘍体積と比較して腫瘍体積の統計的に有意な減少をもたらすことができない状況下で、一次がん療法（例えば、化学療法または放射線療法）と組み合わせた第２の薬剤の使用が、治療されていない腫瘍の腫瘍体積と比較して統計的に有意なレベル（例えば、ｐ＜０．０５）で腫瘍体積の有意な減少をもたらすことができることを意味する。これは、一般に、治療されていない腫瘍が対数律動的に成長しているときに行われる腫瘍体積測定に適用される。
「応答」または「応答性」という用語は、療法に対する応答を指す。例えば、抗がん応答には、腫瘍サイズの減少または腫瘍成長の阻害が含まれる。これらの用語は、例えば、再発までの時間（第１のイベントとしての第２の原発性がんもしくは再発の証拠のない死の時点で打ち切る第１の再発までの期間）の延長、または全生存期間（治療から任意の原因による死までの期間）の延長によって反映される、改善された予後も指し得る。応答するまたは応答を有するとは、刺激に曝露されたときに有益なエンドポイントが得られることを意味する。あるいは、陰性症状または有害な症状は、刺激への曝露時に最小限に抑えられるか、緩和されるか、または軽減される。腫瘍または対象が好ましい応答を呈する可能性を評価することが、腫瘍または対象が好ましい応答を呈しない（すなわち、応答の欠如を呈するか、または非応答性である）可能性を評価することと同等であることが理解される。
「耐性」または「無応答性」という用語は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインによる刺激に対する免疫細胞等の細胞の屈折性を含む。無応答性は、例えば、免疫抑制剤への曝露または高用量の抗原への曝露により生じ得る。いくつかの独立した方法が耐性を引き起こし得る。１つの機構は、「アネルギー」と称され、細胞がエフェクター機能を有する細胞に分化するのではなく、非応答性細胞としてインビボで存続する状態として定義される。かかる屈折性は、一般に、抗原特異的であり、耐性化抗原への曝露が終了した後に持続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギーは、ＩＬ－２等のサイトカイン産生の欠如を特徴する。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ－３媒介シグナル）を第２のシグナル（共刺激シグナル）の不在下で受けたときに生じる。これらの条件下で、細胞の同じ抗原への再曝露（再曝露が共刺激ポリペプチドの存在下で生じる場合でさえも）により、サイトカインの産生に失敗し、それ故に、増殖に失敗する。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）で培養された場合、増殖することができる。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡまたは指標細胞株を使用した増殖アッセイによって測定されるＴリンパ球によるＩＬ－２産生の欠如によっても観察され得る。あるいは、レポーター遺伝子構築物が使用され得る。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ－２遺伝子エンハンサーの制御下で異種プロモーターによってまたはエンハンサー中に見られ得るＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩｌ－２遺伝子転写を開始することができない（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１１３４）。別の機構は、「疲弊」と称される。Ｔ細胞疲弊は、多くの慢性感染症およびがん発症中に生じるＴ細胞機能障害の状態である。これは、不良なエフェクター機能、阻害性受容体の持続発現、および機能的エフェクターまたはメモリーＴ細胞とは別個の転写状態によって定義される。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むよう意図されている。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本明細書で使用される場合、ＨＨＬＡ２（例えば、ｍＡｂ ２Ｇ２、４Ｄ１、８Ａ１２、８Ｄ２、１Ｃ８、２Ｃ４、６Ｄ１０、４Ｅ５、および６Ｆ１０、ならびにポリクローナル抗体）に結合する抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して「単離された核酸分子」という用語は、それらの抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＨＨＬＡ２以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列ヒトゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接し得る核酸分子を指すよう意図されている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼした場合、その配列に作動可能に連結される。転写制御配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、必要に応じて、２つのタンパク質コーディング領域を連結するために、隣接してリーディングフレーム内にあることを意味する。スイッチ配列の場合、作動可能に連結されるとは、それらの配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。
マーカーの「過剰発現」または「有意により高い発現レベル」とは、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超え、好ましくは対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、またはそれ以上高い、試験試料中の発現レベルを指す。マーカーの「有意により低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、またはそれ以上低い、試験試料中の発現レベルを指す。
本明細書に記載のかかる抗体は、放射性免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイを含むが、これらに限定されない周知の免疫アッセイ形態のうちのいずれか１つで使用され得る。上述の様々な免疫アッセイおよびそれらの技法の他の変形、例えば、インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害免疫アッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等を、単独でまたはＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳと組み合わせてまたはその代わりに行う際に使用される一般的な技法が、当業者に既知である。
かかる試薬は、臨床試験手順の一環として、例えば、阻害剤の最適投薬量を監視するために、細胞または組織、例えば、白血球またはリンパ球中のタンパク質レベルを監視するためにも使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング（例えば、物理的に連結する）ことによって促進され得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
かかる試薬はまた、任意の数の生体試料とともに使用されてもよい。生体試料は、核酸および／またはタンパク質を含む体液試料、細胞試料、または組織試料を含む患者由来の様々な源から収集され得る。好ましい実施形態では、対象および／または対照試料は、細胞、細胞株、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、生検、全血、乳頭吸引液、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、および骨髄からなる群から選択される。一実施形態では、試料は、血清、血漿、または尿である。別の実施形態では、試料は、血清である。
試料は、長期間にわたって個体から繰り返し収集され得る（例えば、約数日間、数週間、数ヶ月に１回以上、年１回、年２回等）。ある期間にわたって個体から多数の試料を得ることは、早期検出からの結果を検証し、かつ／または生物学的パターンの変化を、例えば、疾患進行、薬物治療等の結果として特定するために使用され得る。例えば、対象試料は、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または本発明による１、２、もしくは３ヶ月間隔の組み合わせで採取および監視され得る。加えて、経時的に得られた対象のバイオマーカー量および／または活性測定値は、監視期間中に、互いに、かつ正常対照のものと好都合に比較され、それにより、対象自身の値を長期監視のための内部対照または個人的対照として提供することができる。
試料は、生細胞／組織、新鮮凍結細胞、新鮮組織、生検、固定細胞／組織、パラフィン等の培地中に包埋された細胞／組織、組織学的スライド、またはそれらの任意の組み合わせを含有し得る。
試料調製および分離は、収集された試料のタイプおよび／またはバイオマーカー測定値（複数可）の分析に応じて、手順のうちのいずれかを含み得る。かかる手順には、ほんの一例として、濃縮、希釈、ｐＨの調整、高濃度ポリペプチド（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、およびトランスフェリン等）の除去、保存料および検量体の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出および精製が含まれる。
試料調製は、非共有結合複合体中で他のタンパク質（例えば、担体タンパク質）に結合した分子を単離することもできる。このプロセスは、特定の担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合した分子を単離し得るか、またはタンパク質変性による、例えば、酸を使用した、全ての担体タンパク質からの結合した分子の放出、その後の担体タンパク質の除去等のより一般的なプロセスを使用し得る。
望ましくないタンパク質（例えば、高濃度の、無益な、または検出不能なタンパク質）の試料からの除去は、高親和性試薬、高分子量フィルター、超遠心分離および／または電気透析を使用して達成され得る。高親和性試薬には、高濃度タンパク質に選択的に結合する抗体または他の試薬（例えば、アプタマー）が含まれる。試料調製には、イオン交換クロマトグラフィー、金属イオン親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、クロマト分画、吸着クロマトグラフィー、等電点分画、および関連技法も含まれ得る。分子量フィルターには、サイズおよび分子量に基づいて分子を分離する膜が含まれる。かかるフィルターは、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、および精密濾過をさらに用い得る。
「ポリペプチド断片」または「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、通常、参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。かかる欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端で内部的に、またはそのカルボキシル末端で、またはあるいはそれらの両方で生じ得る。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８、または１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０、または５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、または少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００、またはそれ以上のアミノ酸長である。それらは、例えば、それらが全長ポリペプチドの長さ未満である限り、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、１０００、１０２０、１０４０、１０６０、１０８０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２２０、１２４０、１２６０、１２８０、１３００、１３２０、１３４０、またはそれ以上の長さであり得、および／またはそれを含み得る。あるいは、それらは、それらが全長ポリペプチドの長さ未満である限り、かかる範囲を超えず、かつ／またはかかる範囲を除外し得る。
「プローブ」という用語は、特異的に意図される標的分子、例えば、マーカーによってコードされるか、またはそれに対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、または適切な生物学的調製物に由来するかのいずれかであり得る。標的分子の検出のために、プローブは、本明細書に記載されるように、標識されるように特異的に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ、完全ＶＨおよびＶＬドメインを本質的にコードする立体配座におけるＤ－ＪまたはＪセグメントに直接隣接して位置付けられている、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較によって特定され得、再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組換えられた七量体／九量体相同性要素を有する。
本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すよう意図されている。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫も指すよう意図されていることを理解されたい。突然変異または環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体（以下にさらに記載される）、（ｂ）形質転換されて抗体を発現する宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列および／または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され得、それ故に、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、かつそれに関連している一方で、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然に存在しない場合がある配列である。
「共刺激する」という用語は、活性化免疫細胞に関して使用される場合、増殖またはエフェクター機能を誘導する第２の非活性化受容体媒介シグナル（「共刺激シグナル」）を提供する共刺激ポリペプチドの能力を含む。例えば、共刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞－受容体媒介性シグナルを受けたＴ細胞におけるサイトカイン分泌をもたらし得る。例えば、活性化受容体を介して細胞－受容体媒介シグナルを受けた免疫細胞は、本明細書で「活性化免疫細胞」と称される。
「共刺激受容体」という用語は、共刺激シグナルを免疫細胞、例えば、ＣＤ２８に伝達する受容体を含む。本明細書で使用される場合、「阻害性受容体」という用語は、負のシグナルを免疫細胞（例えば、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ３ＤＬ３、またはＰＤ－１）に伝達する受容体を含む。阻害性受容体によって伝達された阻害性シグナルは、共刺激受容体（ＣＤ２８等）が免疫細胞上に存在せず、それ故に、単に共刺激ポリペプチドの結合についての阻害性受容体と共刺激受容体との間の競合の機能ではない場合さえも生じ得る（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０５）。阻害性シグナルの免疫細胞への伝達により、免疫細胞に無応答性またはアネルギーまたはプログラム細胞死がもたらされ得る。好ましくは、阻害性シグナルの伝達は、アポトーシスを伴わない機構により動作する。本明細書で使用される場合、「アポトーシス」という用語は、当該技術分野で既知の技法を使用して特徴付けられ得るプログラム細胞死を含む。アポトーシス細胞死は、例えば、結果的に細胞断片化に至る細胞収縮、膜ブレブ形成、およびクロマチン凝縮によって特徴付けられ得る。アポトーシスを受けた細胞は、ヌクレオソーム間ＤＮＡ切断の特徴的パターンも呈する。受容体に結合するポリペプチドの形態に応じて、例えば、１つ以上の天然結合パートナーへの結合についてＨＨＬＡ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３の活性化形態と競合することによって、シグナルが伝達され得る（例えば、ＨＨＬＡ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３ポリペプチドの多価形態によって）か、またはシグナルが阻害され得る（例えば、ＨＨＬＡ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３の可溶性一価形態によって）かのいずれかである。しかしながら、可溶性ポリペプチドが刺激性であり得る例も存在する。調節剤の効果は、本明細書に記載の通例のスクリーニングアッセイを使用して容易に実証され得る。
細胞バイオマーカー発現に関連した「高」、「低」、「中間」、および「陰性」という用語は、１つ以上の参照細胞によるバイオマーカーの細胞発現と比較した発現されたバイオマーカーの量を指す。バイオマーカー発現は、１つ以上のバイオマーカーゲノム核酸、リボ核酸、および／またはポリペプチドの細胞レベル、活性、構造等の分析を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の任意の方法に従って決定され得る。一実施形態では、これらの用語は、バイオマーカーを、それぞれ、最高レベル、中間レベル、または最低レベルで発現する細胞集団の定義されたパーセンテージを指す。かかるパーセンテージは、バイオマーカーを高度にまたは弱くのいずれかで発現する細胞集団の上位０．１％、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、またはそれ以上、またはそれらの間の任意の範囲（境界値も含む）として定義され得る。「低」という用語は、バイオマーカーを検出可能に発現しない細胞を除外し、これは、かかる細胞がバイオマーカー発現に対して「陰性」であるためである。「中間」という用語は、バイオマーカーを発現するが、それを「高」レベルで発現する集団よりも低いレベルで発現する細胞を含む。別の実施形態では、これらの用語は、質的または統計的プロット領域によって特定されたバイオマーカー発現の細胞集団も指し得るか、またはそれを代わりに指し得る。例えば、フローサイトメトリーを使用して選別された細胞集団は、当該技術分野で周知の方法に従って、検出可能な部分の分析に基づいて、例えば、平均蛍光強度等に基づいて別個のプロットを特定することによって、バイオマーカー発現レベルに基づいて区別され得る。かかるプロット領域は、目的とするバイオマーカーについて当該技術分野で周知の方法に基づいて、数、形状、重複等に従って精製され得る。なお別の実施形態では、これらの用語は、追加のバイオマーカーの発現の存在または不在に従って決定される場合もある。
上述のように、「応答」という用語は、概して、例えば、臨床的介入の経過、有効性、または転帰への影響を決定することに関連している。いくつかの実施形態では、応答は、臨床的介入（例えば、抗ＨＨＬＡ２モノクローナル抗体、例えば、２Ｇ２、４Ｄ１、８Ａ１２、８Ｄ２、１Ｃ８、２Ｃ４、６Ｄ１０、４Ｅ５、または６Ｆ１０、およびポリクローナル抗体の投与）開始後の腫瘍質量および／または体積の変化に直接関連している。例えば、過剰増殖性障害応答は、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、または触診によって測定される初期サイズおよび寸法と比較した、全身介入後の腫瘍のサイズに従って評価され得る。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定または病理学的試験によっても評価され得る。応答は、腫瘍体積のパーセンテージ変化等の量的様式で、または「病理学的完全寛解」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、もしくは他の質的基準等の質的様式で記録され得る。評価は、臨床的介入の開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または好ましくは数ヶ月後に行われ得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、臨床的介入の終了時または残留腫瘍細胞および／もしくは腫瘍床の外科的除去時である。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体の所定の抗原への結合を指す。典型的には、抗体は、ヒトＨＨＬＡ２を分析物として、かつ抗体をリガンドとして使用したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ器具における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１０－７Ｍ未満、例えば、およそ１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、もしくは１０－１０Ｍ未満、またはそれよりもさらに低い親和性（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）または密接に関連した抗原への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、もしくは１０．０倍、またはそれ以上高い親和性で所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の健常動物、哺乳動物、もしくはヒト、または異常なマーカーレベルに関連した疾患または障害に罹患している任意の動物、哺乳動物、もしくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と同義である。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等の哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質がタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離された抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質の調製物を含む。一実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質、なおより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質の調製物を含む。
本明細書で使用される場合、「生存期間」という用語には、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、または腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発および遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がんおよびそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時または治療開始時）および終点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、および腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。
「転写ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」とは、本発明のマーカーの転写、ＲＮＡ転写物（存在する場合）の正常転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的なまたはそれと相同のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはかかるＲＮＡもしくはｃＤＮＡの類似体）である。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という用語は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。「抗原提示細胞」という用語は、専門的抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）、ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を含む。
従来のＴ細胞、別名、ＴｃｏｎｖまたはＴｅｆｆは、１つ以上のＴ細胞受容体の発現により免疫応答を増強するためのエフェクター機能（例えば、サイトカイン分泌、細胞毒性活性、抗自己認識等）を有する。ＴｃｏｎまたはＴｅｆｆは、一般に、Ｔｒｅｇではない任意のＴ細胞集団として定義され、それらには、例えば、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、静止Ｔｃｏｎ、または例えばＴｈ１もしくはＴｈ２系統に分化したＴｃｏｎが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｔｅｆｆは、非Ｔｒｅｇ Ｔ細胞のサブセットである。いくつかの実施形態では、Ｔｅｆｆは、ＣＤ４＋ＴｅｆｆまたはＣＤ８＋Ｔｅｆｆ、例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球（例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｆｈ、またはＴｈ１７）およびＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球である。本明細書にさらに記載されるように、細胞毒性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球である。「ナイーブＴｃｏｎ」とは、骨髄で分化しており、胸腺での正および負の中枢選択プロセスを成功させたが、抗原への曝露によって活性化されていないＣＤ４＋Ｔ細胞である。ナイーブＴｃｏｎは、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９等の活性化マーカーの不在、およびＣＤ４５ＲＯ等のメモリーマーカーの不在を一般に特徴としている。したがって、ナイーブＴｃｏｎは、静止状態にあり、非分裂性であり、恒常的生存にインターロイキン－７（ＩＬ－７）およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）を必要とすると考えられている（少なくとも、ＷＯ２０１０／１０１８７０を参照のこと）。かかる細胞の存在および活性は、免疫応答の抑制との関連で望ましくない。Ｔｒｅｇとは異なり、Ｔｃｏｎは、アネルギー性ではなく、抗原ベースのＴ細胞受容体活性化に応答して増殖することができる（Ｌｅｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５６：６２５－６３７）。腫瘍では、疲弊した細胞がアネルギーの特徴を提示し得る。
本明細書で使用される場合、Ｖセグメントに関して「再編成されていない」または「生殖系列立体配置」という用語は、ＶセグメントがＤセグメントまたはＪセグメントに直接隣接するように組換えられていない立体配置を指す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸を指す。１つの種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書で「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、同義に使用され得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むよう意図されている。
核酸について、「実質的相同性」という用語は、２つの核酸またはそれらの指定された配列が、最適にアラインおよび比較されたときに、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、またはそれ以上、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であることを示す。あるいは、実質的相同性は、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存在する。
２つの配列間の同一性パーセントは、それらの２つの配列の最適アライメントのために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有された同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能なもの）内のＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。ＣＭＰ行列、およびギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０、および長さ重み１、２、３、４、５、または６である。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用した、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１ １７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される場合もある。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用した、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能なもの）内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４ ４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定され得る。
本発明の核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を特定するために、公開データベースに対する検索を行うための「問い合わせ配列」としてさらに使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ １０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われ得る。比較のためのギャップ付きアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９ ３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する際に、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る（ＮＣＢＩウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能である）。
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野で周知の他の技法（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）を含む標準の技法によって、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製されたときに、「単離される」または「実質的に純粋にされる」。
「対象に好適な治療レジメンを決定すること」という用語は、本発明による分析の結果に基づいてまたは本質的に基づいてまたは少なくとも部分的に基づいて開始、変更、および／または終了される、対象の治療レジメン（すなわち、対象におけるがんの予防および／または治療のために使用される単回療法または異なる療法の組み合わせ）の決定を意味するとみなされる。一例は、免疫調節療法（例えば、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーター））を提供するためにがんに対する標的療法を提供するかを決定することである。別の例は、再発の危険性を低下させることを目的とする手術後にアジュバント療法を開始することであり、別の例は、特定の化学療法の投薬量を変更することであろう。決定は、本発明による分析の結果に加えて、治療される対象の個人的特徴に基づき得る。多くの場合、対象に好適な治療レジメンの実際の決定は、主治医または医師によって行われるであろう。
ＩＩ．モノクローナル抗体、免疫グロブリン、およびポリペプチド
本発明は、部分的に、ＨＨＬＡ２に対して産生される単離されたモノクローナル抗体またはその断片（本明細書に列記されるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体等）に関する。かかる分子は、部分的に、それらが、診断アッセイ、例えば、免疫組織化学的（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット、細胞間フロー、ＥＬＩＳＡ等においてＨＨＬＡ２タンパク質を認識する能力を呈することを特徴とする。かかる分子は、部分的に、それらが、Ｔ細胞上で発現される受容体（例えば、ＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３）等の受容体へのＨＨＬＡ２の結合を阻害する能力を呈することを特徴とする。
「ＨＨＬＡ２」という用語、別名、ヒト内因性レトロウイルスＨ長末端反復関連タンパク質２、ＨＥＲＶ－Ｈ ＬＴＲ関連２、Ｂ７ｙ、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ７は、Ｂ７ファミリーのメンバーを指す。ＨＨＬＡ２タンパク質は、正常ヒト組織では限定された発現を有するが、ヒトがんでは広範に発現される。ＨＨＬＡ２タンパク質が３つのＩｇ様ドメイン（ＩｇＶ－ＩｇＣ－ＩｇＶ）を有する膜タンパク質である一方で、Ｂ７ファミリーの他のメンバーは、一般に、２つのみのＩｇドメイン（ＩｇＶ－ＩｇＣ）を有する。正常ヒト組織中のＨＨＬＡ２タンパク質は、腎臓、腸、胆嚢、および乳房の上皮、ならびに胎盤栄養膜細胞で発現される。免疫系では、ＨＨＬＡ２タンパク質は、ヒト単球／マクロファージ上で構成的に発現される。ＨＨＬＡ２は、ヒトＴ細胞機能を制御し、例えば、ＨＨＬＡ２は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害し、Ｔ細胞産生およびサイトカイン産生を増加させる。ＨＨＬＡ２は、結腸直腸、腎臓、肺、膵臓、卵巣、および前立腺由来の広範なヒトがんにおいてより高いレベルで発現される。ＨＨＬＡ２は、甲状腺癌、黒色腫、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、および食道癌のヒトがんでも発現される。
上述のＨＨＬＡ２の構造および機能は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｘｉａｏ
ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３、Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６、Ｍａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２１：２３５９－２３６６、Ｆｌａｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．６４：５７１－５９０、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０：９８７９－９８８４、およびＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４：２０４３を参照のこと）。
「ＨＨＬＡ２」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、および誘導体を含むよう意図されている。代表的なヒトＨＨＬＡ２ ｃＤＮＡおよびヒトＨＨＬＡ２タンパク質配列は、当該技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。ヒトＨＨＬＡ２バリアントには、バリアント１（ＮＭ＿００７０７２．３およびＮＰ＿００９００３．１、最長転写物を表し、最長アイソフォームをコードする）、バリアント２（ＮＭ＿００１２８２５５６．１およびＮＰ＿００１２６９４８５．１、代替プロモーターの使用を表し、バリアント１と比較して５’ＵＴＲが異なる）、バリアント３（ＮＭ＿００１２８２５５７．１およびＮＰ＿００１２６９４８６．１、代替プロモーターの使用を表し、バリアント１と比較して５’ＵＴＲが異なる）、バリアント４（ＮＭ＿００１２８２５５８．１およびＮＰ＿００１２６９４８７．１、アイソフォームｂをコードし、代替プロモーターの使用を表し、バリアント１と比較して５’ＵＴＲが異なり、かつ３’コーディング領域内に代替インフレームエクソンを欠き、アイソフォームａよりも短いアイソフォームをもたらす）、およびバリアント５（ＮＭ＿００１２８２５５９．１およびＮＰ＿００１２６９４８８．１、アイソフォームｃをコードし、代替プロモーターの使用を表し、バリアント２と比較して複数の相違点を有し、別個の５’ＵＴＲをもたらし、バリアント１と比較して代替開始コドンで翻訳を開始させ、別個のＮ末端およびアイソフォームａよりも短いアイソフォームをもたらす）が含まれる。ヒト以外の生物中のＨＨＬＡ２オルソログの核酸およびポリペプチド配列が周知であり、例えば、カエルＨＨＬＡ２（ＮＭ＿００１１２８６４４．１およびＮＰ＿００１１２２１１６．１）が含まれる。ＨＨＬＡ２オルソログの代表的な配列が以下の表１に提示される。
ＨＨＬＡ２タンパク質の検出に好適な抗ＨＨＬＡ２抗体が当該技術分野で周知であり、例えば、抗体カタログ番号ａｂ１０７１１９およびａｂ２１４３２７（ａｂｃａｍ）、抗体ＰＡ５－２４１４６およびＰＡ５－６３１３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗体ＭＡＢ８０８４１、ＡＦ８０８４、ＦＡＢ８０８４１Ｒ、ＦＡＢ８０８４１Ｔ、およびＭＡＢ８０８４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗体ＡＰ５２０４２ＰＵ－Ｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、抗体ＮＢＰ２－４９１８７、ＭＡＢ８０８４２、Ｈ０００１１１４８－Ｂ０１Ｐ、およびＮＢＰ２－３２４２０（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、抗体ＧＴＸ５１９８１（ＧｅｎｅＴｅｘ）、抗体ＨＰＡ０５５４７８（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、抗体ＬＳ－Ｃ３２１９４５、ＬＳ－Ｃ３０８２２８、ＬＳ－Ｃ２４６７４２、ＬＳ－Ｃ２４６７４３、ＬＳ－Ｃ２４６７４４、ＬＳ－Ｃ２３６２１０、およびＬＳ－Ｃ２４９１８６（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）等が含まれる。さらに、ＨＨＬＡ２発現を減少させるための複数のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ構築物、例えば、ｓｈＲＮＡ製品番号ＴＬ３１２４６２、ＴＦ３１２４６２、ＴＲ３１２４６２、ＴＧ３１２４６２、およびＴＬ３１２４６２Ｖ、ｓｉＲＮＡ製品番号ＳＲ３２３３５８（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｉＲＮＡ製品番号ｉ００９６１６、ｉ００９６１６ａ、ｉ００９６１６ｂ、ｉ００９６１６ｃ、ｉ００９６１６ｄ、ｉＶ００９６１６、ｉＶ００９６１６ａ、ｉＶ００９６１６ｂ、ｉＶ００９６１６ｃ、ｉＶ００９６１６ｄ、ｉＡＡＶ００９６１６００、ｉＡＡＶ００９６１６０１、ｉＡＡＶ００９６１６０２、ｉＡＡＶ００９６１６０３、ｉＡＡＶ００９６１６０４、ｉＡＡＶ００９６１６０５、ｉＡＡＶ００９６１６０６、ｉＡＡＶ００９６１６０７、ｉＡＡＶ００９６１６０８、およびｉＡＡＶ００９６１６０９、ＣＲＩＳＰＲ製品番号Ｋ０９５０３２１、Ｋ０９５０３０１、Ｋ０９５０３０２、Ｋ０９５０３０３、Ｋ０９５０３０４、Ｋ０９５０３０５、Ｋ０９５０３０６、Ｋ０９５０３０７、Ｋ０９５０３０８、およびＫ０９５０３１１（ａｂｍ）、ｓｉＲＮＡ製品番号ｓｃ－７８４９８、ｓｈＲＮＡ製品番号ｓｃ－７８４９８－Ｖおよびｓｃ－７８４９８－ＳＨ、ＣＲＩＳＰＲ製品番号ｓｃ－４１１５７６、ｓｃ－４１１５７６－ＨＤＲ、ｓｃ－４１１５７６－ＮＩＣ、ｓａｎｄ ｃ－４１１５７６－ＮＩＣ－２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等は、上記の会社の市販製品リストで見つけることができる。この用語がＨＨＬＡ２分子に関して本明細書に記載される特徴の任意の組み合わせを指すためにさらに使用され得ることに留意されたい。例えば、配列組成、同一性パーセンテージ、配列長さ、ドメイン構造、機能的活性等の任意の組み合わせを使用して、本発明のＨＨＬＡ２分子を説明することができる。
「ＨＨＬＡ２経路」という用語は、ＨＨＬＡ２およびＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３等のその天然結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用を含む。
「ＴＭＩＧＤ２」という用語は、２、ＣＤ２８Ｈ、ＩＧＰＲ１、およびＩＧＰＲ－１を含む膜貫通および免疫グロブリンドメインを指し、これは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、およびＰＤ－１と約１０％のアミノ酸同一性を有する膜タンパク質である。ＴＭＩＧＤ２は、１つの細胞外ＩｇＶ様ドメイン、膜貫通領域、および２つのチロシンシグナル伝達モチーフを有するプロリンリッチ細胞質ドメインを有する。ＴＭＩＧＤ２タンパク質は、全てのナイーブＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の大半上で構成的に発現されるが、Ｔ制御性細胞またはＢ細胞上では構成的に発現されない。ＴＭＩＧＤ２発現は、Ｔ細胞の反復刺激により緩徐に失われる。これと一致して、ＴＭＩＧＤ２は、メモリーＴ細胞の約半数のみで発現され、ＴＭＩＧＤ２陰性Ｔ細胞は、末端が分化した老化表現型を有する。ＴＭＩＧＤ２が内皮および上皮細胞で発現され、細胞遊走を減少させる機能を果たし、血管新生中に毛細管形成を促進することも示されている。
上述のＴＭＩＧＤ２の構造および機能は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３、Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４：２０４３、およびＲａｈｉｍｉ（２０１２）Ｃｅｌｌ ２３：１６４６－１６５６）。
「ＴＭＩＧＤ２」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、および誘導体を含むよう意図されている。代表的なヒトＴＭＩＧＤ２ ｃＤＮＡおよびヒトＴＭＩＧＤ２タンパク質配列は、当該技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォームには、アイソフォーム１（ＮＭ＿１４４６１５．２およびＮＰ＿６５３２１６．２）、アイソフォーム２（ＮＭ＿００１１６９１２６．１およびＮＰ＿００１１６２５９７．１、バリアント１と比較して３’コーディング領域内で代替インフレームスプライス部位を使用し、アイソフォーム１と比較してより短いアイソフォームをもたらす）、およびアイソフォーム３（ＮＭ＿００１３０８２３２．１およびＮＰ＿００１２９５１６１．１、バリアント１と比較して５’コーディング領域内に代替インフレームエクソンを欠き、アイソフォーム１と比較してより短いアイソフォームをもたらす）が含まれる。ヒト以外の生物中のＴＭＩＧＤ２オルソログの核酸およびポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジーＴＭＩＧＤ２（ＸＭ＿００９４３４３９３．２およびＸＰ＿００９４３２６６８．２、ならびにＸＭ＿００１１３８２２８．４およびＸＰ＿００１１３８２２８．３）、およびウシＴＭＩＧＤ２（ＸＭ＿００５２０８９８０．３およびＸＰ＿００５２０９０３７．１、ＸＭ＿００５２０８９７９．３およびＸＰ＿００５２０９０３６．１、ならびにＸＭ＿００２６８８９３３．５およびＸＰ＿００２６８８９７９．１）が含まれる。ＴＭＩＧＤ２オルソログの代表的な配列が以下の表１に提示される。
ＴＭＩＧＤ２タンパク質の検出に好適な抗ＴＭＩＧＤ２抗体が当該技術分野で周知であり、例えば、抗体カタログ番号ＭＡＢ８３１６、ＭＡＢ８３１６２、ＦＡＢ８３１６Ｒ、ＦＡＢ８３１６２Ｒ、ＦＡＢ８３１６２Ｇ、ＦＡＢ８３１６２Ｎ、ＦＡＢ８３１６２Ｓ、ＦＡＢ８３１６２Ｔ、ＦＡＢ８３１６２Ｕ、およびＦＡＢ８３１６２Ｖ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗体ＴＡ３２６６９５（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、抗体ＰＡ５－５２７８７、およびＰＡ５－３８０５５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗体ＭＡＢ８３１６１およびＮＢＰ１－８１１６４（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）等が含まれる。さらに、ＴＭＩＧＤ２発現を減少させるための複数のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ構築物、例えば、ｓｈＲＮＡ製品番号ＴＦ３１７８２９、ＴＧ３１７８２９、ＴＬ３１７８２９、ＴＲ３１７８２９、およびＴＬ３１７８２９Ｖ、ｓｉＲＮＡ製品番号ＳＲ３１４９１３、ならびにＣＲＩＳＰＲ製品番号ＫＮ２０４９３８、ＫＮ２０４９３８ＬＰ、ＫＮ２０４９３８ＲＢ、およびＫＮ２０４９３８ＢＮ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｓｉＲＮＡ製品番号ｉ０２４９１４、ｉ０２４９１４ａ、ｉ０２４９１４ｂ、ｉ０２４９１４ｃ、ｉ０２４９１４ｄ、ｉＶ０２４９１４、ｉＶ０２４９１４ａ、ｉＶ０２４９１４ｂ、ｉＶ０２４９１４ｃ、ｉＶ０２４９１４ｄ、ｉＡＡＶ０２４９１４００、ｉＡＡＶ０２４９１４０１、ｉＡＡＶ０２４９１４０２、ｉＡＡＶ０２４９１４０３、ｉＡＡＶ０２４９１４０４、ｉＡＡＶ０２４９１４０５、ｉＡＡＶ０２４９１４０６、ｉＡＡＶ０２４９１４０７、ｉＡＡＶ０２４９１４０８、およびｉＡＡＶ０２４９１４０９、ならびにＣＲＩＳＰＲ製品番号Ｋ２４０９３２１、Ｋ２４０９３０１、Ｋ２４０９３０２、Ｋ２４０９３０３、Ｋ２４０９３０４、Ｋ２４０９３０５、Ｋ２４０９３０６、Ｋ２４０９３０７、Ｋ２４０９３０８、およびＫ２４０９３１１（Ａｂｍ）、ｓｉＲＮＡ製品番号ｓｃ－９７７５７、ｓｈＲＮＡ製品番号ｓｃ－９７７５７－ＳＨおよびｓｃ－９７７５７－Ｖ、ならびにＣＲＩＳＰＲ製品番号ｓｃ－４１４２６１、ｓｃ－４１４２６１－ＨＤＲ、ｓｃ－４１４２６１－ＮＩＣ、およびｓｃ－４１４２６１－ＮＩＣ－２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｓｈＲＮＡ製品番号ＳＨ８８８２０８およびＳＨ８７４７２０（Ｖｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等は、上記の会社の市販製品リストで見つけることができる。さらに、ＴＭＩＧＤ２発現を増加させるための複数のＣＲＩＳＰＲ構築物、例えば、ＣＲＩＳＰＲ製品番号Ｋ２４０９３７８、Ｋ２４０９３７７、Ｋ２４０９３７６、Ｋ２４０９３７５、Ｋ２４０９３７４、Ｋ２４０９３７３、Ｋ２４０９３７２、およびＫ２４０９３７１（Ａｂｍ）、ＣＲＩＳＰＲ製品番号ｓｃ－４１４２６１－ＡＣＴ、ｓｃ－４１４２６１－ＡＣＴ－２、ｓｃ－４１４２６１－ＬＡＣ、およびｓｃ－４１４２６１－ＬＡＣ－２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等は、上記の会社の市販製品リストで見つけることができる。この用語がＴＭＩＧＤ２分子に関して本明細書に記載される特徴の任意の組み合わせを指すためにさらに使用され得ることに留意されたい。例えば、配列組成、同一性パーセンテージ、配列長さ、ドメイン構造、機能的活性等の任意の組み合わせを使用して、本発明のＴＭＩＧＤ２分子を説明することができる。
上述のＴＭＩＧＤ２とＨＨＬＡ２との間の相互作用、ならびにそれらの機能は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３、およびＪａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６を参照のこと）。
「ＫＩＲ３ＤＬ３」という用語、別名、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ３、ＣＤ１５８Ｚ、ＫＩＲ３ＤＬ７、ＫＩＲ４４、ＫＩＲＣ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインおよび長い細胞質尾部３とは、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞のサブセットによって発現される膜貫通糖タンパク質ファミリーのメンバーを指す。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）遺伝子は、多型であり、高度に相同であり、それらは、１Ｍｂ白血球受容体複合体（ＬＲＣ）内の染色体１９ｑ１３．４上のクラスターに見られる。ＫＩＲ遺伝子クラスターの遺伝子含有量はハプロタイプ間で異なるが、いくつかの「フレームワーク」遺伝子が全てのハプロタイプに見られる（ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＰ１、ＫＩＲ３ＤＬ４、ＫＩＲ３ＤＬ２）。ＫＩＲタンパク質は、細胞外免疫グロブリンドメイン（２Ｄまたは３Ｄ）の数およびそれらが長い（Ｌ）細胞質ドメインを有するか短い（Ｓ）細胞質ドメインを有するかによって分類される。長い細胞質ドメインを有するＫＩＲタンパク質が免疫チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を介してリガンド結合時に阻害性シグナルを伝達する一方で、短い細胞質ドメインを有するＫＩＲタンパク質はＩＴＩＭモチーフを欠き、その代わりに、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質に結合して、活性化シグナルを伝達する。いくつかのＫＩＲタンパク質のリガンドはＨＬＡクラスＩ分子のサブセットであり、それ故に、ＫＩＲタンパク質が免疫応答の制御に重要な役割を果たすと考えられている。この遺伝子は、全てのハプロタイプに存在する「フレームワーク」遺伝子座のうちの１つである。ＫＩＲ３ＤＬ３タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列、３つのＩｇドメイン、正電荷残基を欠く膜貫通領域、および免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む長い細胞質尾部を有する。ＫＩＲ３ＤＬ３は、他のＫＩＲに見られるストーク領域を欠く。
上述のＫＩＲ３ＤＬ３の構造および機能は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１９０：４０－５２、Ｔｒｏｍｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：４１３５－４１４３、Ｔｒｕｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．５７：９０４－９１６、およびＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．５８：６１４－６２７を参照のこと）。
「ＫＩＲ３ＤＬ３」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、および誘導体を含むよう意図されている。代表的なヒトＫＩＲ３ＤＬ３ ｃＤＮＡおよびヒトＫＩＲ３ＤＬ３タンパク質配列は、当該技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。例えば、少なくとも１つのヒトＫＩＲ３ＤＬ３アイソフォームが既知であり、ヒトＫＩＲ３ＤＬ３（ＮＭ＿１５３４４３．４）は、転写物（ＮＰ＿７０３１４４．３）によってコード可能である。ヒト以外の生物中のＫＩＲ３ＤＬ３オルソログの核酸およびポリペプチド配列が周知であり、例えば、チンパンジーＫＩＲ３ＤＬ３（ＸＭ＿００３３１６６７９．３およびＸＰ＿００３３１６７２７．３）、アカゲザルＫＩＲ３ＤＬ３（ＮＭ＿００１１０４５５２．２およびＮＰ＿００１０９８０２２．１）、マウスＫＩＲ３ＤＬ３（ＮＭ＿００１３１０６９０．１およびＮＰ＿００１２９７６１９．１、ＮＭ＿１７７７４９．４およびＮＰ＿８０８４１７．２、ＮＭ＿１７７７４８．２およびＮＰ＿８０８４１６．１）、ならびにラットＫＩＲ３ＤＬ３（ＮＭ＿１８１４７９．２およびＮＰ＿８５２１４４．１）が含まれる。ＫＩＲ３ＤＬ３オルソログの代表的な配列が以下の表１に提示される。
ＫＩＲ３ＤＬ３タンパク質の検出に好適な抗ＫＩＲ３ＤＬ３抗体が当該技術分野で周知であり、例えば、抗体カタログ番号ＦＡＢ８９１９Ｒ、ＭＡＢ８９１９、ＦＡＢ８９１９Ｇ、ＦＡＢ８９１９Ｎ、ＦＡＢ８９１９Ｓ、ＦＡＢ８９１９Ｔ、ＦＡＢ８９１９Ｕ、およびＦＡＢ８９１９Ｖ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗体ＡＰ５２３７４ＰＵ－Ｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、抗体ＰＡ５－２６１７８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗体ＯＡＡＢ０５７６１、ＯＡＡＦ０８１２５、ＯＡＡＮ０４１２２、ＯＡＣＡ０９１３４、ＯＡＣＡ０９１３５、ＯＡＣＤ０４９８８、およびＯＡＳＧ０１１９０（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）等が含まれる。さらに、ＫＩＲ３ＤＬ３発現を減少させるための複数のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ構築物、例えば、ｓｈＲＮＡ製品番号ＴＦ３０３６８４、ＴＲ３０３６８４、ＴＧ３０３６８４、ＴＬ３０３６８４、ＴＬ３０３６８４Ｖ、ｓｉＲＮＡ製品番号ＳＲ３１４５１６、ならびにＣＲＩＳＰＲ製品番号ＫＮ２２４３８３、ＫＮ２２４３８３ＢＮ、ＫＮ２２４３８３ＲＢ、およびＫＮ２２４３８３ＬＰ（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｓｉＲＮＡ製品番号ｉ０１１６２７、ｉ０１１６２７ａ、ｉ０１１６２７ｂ、ｉ０１１６２７ｃ、ｉ０１１６２７ｄ、ｉＶ０１１６２７、ｉＶ０１１６２７ａ、ｉＶ０１１６２７ｂ、ｉＶ０１１６２７ｃ、ｉＶ０１１６２７ｄ、ｉＡＡＶ０１１６２７００、ｉＡＡＶ０１１６２７０１、ｉＡＡＶ０１１６２７０２、ｉＡＡＶ０１１６２７０３、ｉＡＡＶ０１１６２７０４、ｉＡＡＶ０１１６２７０５、ｉＡＡＶ０１１６２７０６、ｉＡＡＶ０１１６２７０７、ｉＡＡＶ０１１６２７０８、およびｉＡＡＶ０１１６２７０９、ならびにＣＲＩＳＰＲ製品番号Ｋ１１５１４２１、Ｋ１１５１４０１、Ｋ１１５１４０２、Ｋ１１５１４０３、Ｋ１１５１４０４、Ｋ１１５１４０５、Ｋ１１５１４０６、Ｋ１１５１４０７、Ｋ１１５１４０８、およびＫ１１５１４１１（Ａｂｍ）、ｓｉＲＮＡ製品番号ｓｃ－６０８９２、ｓｈＲＮＡ製品番号ｓｃ－６０８９２－ＳＨおよびｓｃ－６０８９２－Ｖ、ならびにＣＲＩＳＰＲ製品番号ｓｃ－４０６２２７、ｓｃ－４０６２２７－ＫＯ－２、ｓｃ－４０６２２７－ＨＤＲ－２、ｓｃ－４０６２２７－ＮＩＣ、およびｓｃ－４０６２２７－ＮＩＣ－２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等は、上記の会社の市販製品リストで見つけることができる。この用語がＫＩＲ３ＤＬ３分子に関して本明細書に記載される特徴の任意の組み合わせを指すためにさらに使用され得ることに留意されたい。例えば、配列組成、同一性パーセンテージ、配列長さ、ドメイン構造、機能的活性等の任意の組み合わせを使用して、本発明のＫＩＲ３ＤＬ３分子を説明することができる。
「末梢血球亜型」という用語は、好酸球、好中球、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞、顆粒球、およびＢ細胞を含むが、これらに限定されない末梢血中に通常見られる細胞型を指す。
「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体（以下にさらに記載される）、（ｂ）形質転換されて抗体を発現する宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列および／または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）に供され得、それ故に、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、かつそれに関連している一方で、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然に存在しない場合がある配列である。
少なくとも１つのバイオマーカーの存在またはレベルを検出または決定するために使用される「試料」という用語は、典型的には、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便（例えば、糞）、涙、および任意の他の体液（例えば、上記の「体液」の定義下で記載されたもの）、または組織試料（例えば、生検）、例えば、小腸、結腸試料、または外科的切除組織である。ある特定の例では、本発明の方法は、試料中の少なくとも１つのマーカーの存在またはレベルの検出または決定前に個体から試料を得ることをさらに含む。
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的バイオマーカー遺伝子の発現に干渉するか、またはそれを阻害する任意の薬剤として定義される。かかるＲＮＡ干渉剤には、本発明の標的バイオマーカー遺伝子と相同のＲＮＡ分子を含む核酸分子またはその断片、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的バイオマーカー核酸の発現に干渉するか、またはそれを阻害する小分子が含まれるが、これらに限定されない。
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」とは、標的バイオマーカー核酸と同一または極めて同様の配列のＲＮＡの発現または導入により、標的とされた遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）がもたらされ（Ｃｏｂｕｒｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．（２００２）Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１８）：９２２５を参照のこと）、それにより、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害する、進化的に保存されたプロセスである。一実施形態では、ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。このプロセスは、植物、脊椎動物、および哺乳類細胞で説明されている。自然界では、ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって開始され、それにより、長いｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡと呼ばれる二本鎖断片への前進的な切断が促進される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識して切断するタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または他のＲＮＡ干渉剤の導入によって開始されて、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害またはサイレンシングすることもできる。本明細書で使用される場合、「標的バイオマーカー核酸発現の阻害」または「マーカー遺伝子発現の阻害」は、標的バイオマーカー核酸または標的バイオマーカー核酸によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルの任意の減少を含む。この減少は、ＲＮＡ干渉剤によって標的とされていない標的バイオマーカー核酸の発現または標的バイオマーカー核酸によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはそれ以上であり得る。
ＲＮＡｉに加えて、ゲノム編集を使用して、目的とするバイオマーカーのコピー数または遺伝子配列、例えば、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等のＨＨＬＡ２経路成分等の目的とするバイオマーカーの構成的または誘導性ノックアウトまたは突然変異を調節することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、ゲノム核酸の正確な編集のために（例えば、非機能的またはヌル突然変異を引き起こすために）使用され得る。かかる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ酵素が発現され得る。例えば、ガイドＲＮＡのみを含むベクターが、Ｃａｓ９酵素に対してトランスジェニックな動物または細胞に投与され得る。同様の戦略が使用され得る（例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼ）。かかる系は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：３４７－３５５、Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ １３９：９４５－９５６、Ｋａｒｇｉｎｏｖ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３７：７、米国特許公開第２０１４／００８７４２６号および同第２０１２／０１７８１６９号、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５－１３６、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２、Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
３２６：１５０１、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１９７２２、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：６３１５－６３２５、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４９－１５３、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３－１４８、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：ｅ４７を参照のこと）。かかる遺伝子戦略は、当該技術分野で周知の方法に従って構成的発現系または誘導性発現系を使用することができる。
「Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）」とは、低分子非コーディングＲＮＡの最大クラスである。ｐｉＲＮＡは、Ｐｉｗｉタンパク質との相互作用によりＲＮＡ－タンパク質複合体を形成する。これらのｐｉＲＮＡ複合体は、生殖系列細胞、特に精子形成時の生殖系列細胞におけるレトロトランスポゾンおよび他の遺伝要素の後成的遺伝子サイレンシングおよび転写後遺伝子サイレンシングの両方に関連している。これらは、サイズ（２１～２４ヌクレオチドではなく２６～３１ヌクレオチド）、配列保存の欠如、および複雑さの増大の点でマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と異なる。しかしながら、他の低分子ＲＮＡと同様に、ｐｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシング、特にトランスポゾンサイレンシングに関与すると考えられている。ｐｉＲＮＡの大半がトランスポゾン配列に対してアンチセンスであり、これは、トランスポゾンがｐｉＲＮＡ標的であることを示唆する。哺乳動物において、トランスポゾンサイレンシング時のｐｉＲＮＡの活性が胚発生中に最も重要であると思われ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトの両方において、ｐｉＲＮＡが精子形成に必要である。ｐｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成によるＲＮＡサイレンシングにおいて役割を果たす。
「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。「核酸アプタマー」とは、様々な分子標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織、および生物に結合するようにインビトロ選択ラウンドの繰り返しまたは同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）により操作された核酸種である。「ペプチドアプタマー」とは、特定の標的分子に結合するように選択または操作された人工タンパク質である。これらのタンパク質は、タンパク質骨格によって呈される可変配列の１つ以上のペプチドループからなる。これらは、典型的には、コンビナトリアルライブラリから単離され、その後、多くの場合、定方向突然変異または可変領域突然変異誘発および選択ラウンドによって改善される。ペプチドアプタマーの進化である「アフィマータンパク質」とは、特定の標的タンパク質に高親和性結合表面を提供するペプチドループを呈するように操作された高度に安定した小さいタンパク質である。これは、シスタチンのシステインプロテアーゼ阻害剤ファミリーに由来する低分子量（１２～１４ｋＤａ）のタンパク質である。アプタマーは、一般に使用される生体分子である抗体と競合する分子認識特性を提供するため、生物工学的用途および治療的用途に有用である。それらの区別認識に加えて、アプタマーは、試験管内で完全に操作され得、化学合成によって容易に産生され、望ましい保管特性を有し、かつ治療的用途において免疫原性をほとんどまたは全く誘発しないため、抗体に優る利点を提供する。
本明細書で「低分子干渉ＲＮＡ」とも称される「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、例えば、ＲＮＡｉによって標的バイオマーカー核酸の発現を阻害する機能を果たす薬剤として定義される。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成され得るか、インビトロ転写によって産生され得るか、または宿主細胞中に産生され得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５～約４０ヌクレオチド長、好ましくは約１５～約２８ヌクレオチド長、より好ましくは約１９～約２５ヌクレオチド長、より好ましくは約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、約０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長を有する３’および／または５’オーバーハングを各鎖に有し得る。オーバーハングの長さは、これらの２つの鎖間で独立しており、すなわち、一方の鎖上のオーバーハングの長さは、第２の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によりＲＮＡ干渉を促進することができる。
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、小ヘアピン（ステムループとも呼ばれる）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは、短い（例えば、１９～２５ヌクレオチドの）アンチセンス鎖、続いて、５～９ヌクレオチドのループ、および類似センス鎖から成る。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行する場合があり、アンチセンス鎖が続き得る。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含まれ得、例えば、ポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモーター、または別のプロモーターから発現され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＲＮＡ Ａｐｒ；９（４）：４９３－５０１を参照のこと）。
ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、がんで過剰発現されるバイオマーカー遺伝子の発現を阻害し、それにより、対象におけるがんを治療、予防、または抑制するために、がんを有するか、またはがんを有する危険性のある患者に投与され得る。
「小分子」という用語は、当該技術分野の用語であり、約１０００分子量未満または約５００分子量未満の分子を含む。一実施形態では、小分子は、ペプチド結合を排他的に含まない。別の実施形態では、小分子は、オリゴマーではない。活性についてスクリーニングされ得る例示の小分子化合物には、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケチド）（Ｃａｎｅ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：６３）、および天然産物抽出物ライブラリが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、これらの化合物は、非ペプチド性有機小分子化合物である。さらなる実施形態では、小分子は、生合成のものではない。
生物学的に活性な薬剤に適用される「選択的モジュレーター」または「選択的に調節する」という用語は、標的との直接または相互作用相互作用により、オフターゲット細胞集団、シグナル伝達活性等と比較して、細胞集団、シグナル伝達活性等の標的を調節する薬剤の能力を指す。例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用をＨＨＬＡ２と別の結合パートナーとの間の別の相互作用よりも選択的に阻害する薬剤、および／または目的とする細胞集団におけるかかる相互作用（複数可）は、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーター、少なくとも１つの他の結合パートナーに対する薬剤の活性の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２倍、またはそれ以上である（例えば、少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１０５倍、１１０倍、１２０倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍、６０００倍、６５００倍、７０００倍、７５００倍、８０００倍、８５００倍、９０００倍、９５００倍、１００００倍、もしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の範囲（境界値も含む）である相互作用）に対する活性を有し得る。かかる測定基準は、典型的には、相互作用／活性を半減させるのに必要な薬剤の相対量の観点で表現される。
より一般には、「選択的」という用語は、優先的な作用または機能を指す。「選択的」という用語は、他の標的と比較した目的とする特定の標的における優先的効果の観点で定量化され得る。例えば、測定変数（例えば、他の細胞（Ｔｃｏｎ等の他の免疫細胞等）に対するＴｒｅｇ／Ｂｒｅｇの調節）は、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、もしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の範囲（境界値も含む）（例えば、５０％～１６倍）であり得、意図されないまたは望ましくない標的に対する目的とする標的では異なる。同じ倍率分析を使用して、所与の組織、細胞集団、測定変数、測定効果等、例えば、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比、Ｂｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比、過剰増殖性細胞成長速度または体積、Ｔｒｅｇ／Ｂｒｅｇ増殖速度または数等における効果の規模を確認することができる。
対照的に、「特異的」という用語は、排他的作用または機能を指す。例えば、ＨＨＬＡ２－ＴＭＩＧＤ２相互作用およびＨＨＬＡ２－ＫＩＲ３ＤＬ３相互作用の特異的調節は、それぞれ、ＨＨＬＡ２／ＴＭＩＤＧ２相互作用およびＨＨＬＡ２／ＫＩＲ３ＤＬ３相互作用の排他的調節を指し、別のリガンドでのＨＨＬＡ２の調節ではない。別の例では、抗体の所定の抗原への特異的結合とは、他の抗原に結合することなく目的とする抗原に結合する抗体の能力を指す。典型的には、抗体は、目的とする抗原を分析物として、かつ抗体をリガンドとして使用したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ器具における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１×１０－７Ｍ未満、例えば、およそ１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ未満、またはそれよりもさらに低い親和性（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）または密接に関連した抗原への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、もしくは１０．０倍、またはそれ以上高い親和性で所定の抗原に結合する。加えて、ＫＤは、ＫＡの逆数である。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義に使用され得る。
「感作させる」という用語は、療法（例えば、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーター）を単独でまたは免疫チェックポイント阻害療法等の免疫療法と組み合わせてのいずれかで）を用いてより有効な治療を可能にする方法で、がん細胞または腫瘍細胞等の細胞を改変することを意味する。いくつかの実施形態では、正常細胞は、療法（例えば、ＨＨＬＡ２経路モジュレーター療法（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーター）を単独でまたは免疫チェックポイント阻害療法等の免疫療法と組み合わせてのいずれかで）によって正常細胞を過度に損傷させる程度に影響を及ぼされない。治療的治療に対する感受性の増加または感受性の低下は、細胞増殖性アッセイ（Ｔａｎｉｇａｗａ Ｎ，Ｋｅｒｎ Ｄ Ｈ，Ｋｉｋａｓａ Ｙ，Ｍｏｒｔｏｎ Ｄ Ｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８２；４２：２１５９－２１６４）、細胞死アッセイ（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ Ｒ Ｈ，Ｍａｒｓｄｅｎ Ｊ Ａ，Ｄｉｌｌ Ｐ Ｌ，Ｂａｋｅｒ Ｊ Ａ，Ｍｏｒａｎ Ｅ Ｍ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８４；９４：１６１－１７３、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｌｉｐｐｍａｎ Ｍ Ｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ １９８５；６９：６１５－６３２、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｉｎ：Ｋａｓｐｅｒｓ Ｇ Ｊ Ｌ，Ｐｉｅｔｅｒｓ Ｒ，Ｔｗｅｎｔｙｍａｎ Ｐ Ｒ，Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｖｅｅｒｍａｎ Ａ Ｊ Ｐ，ｅｄｓ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐ Ａ：Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３：４１５－４３２、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ Ｌ Ｍ，Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ １９９４；１９：８２－９０）を含むが、これらに限定されない、以下の本明細書に記載の特定の治療および方法について当該技術分野で既知の方法に従って測定される。感受性または抵抗性は、腫瘍サイズ減少をある期間、例えば、ヒトの場合６ヶ月およびマウスの場合４～６週間にわたって測定することによって動物においても測定され得る。組成物または方法は、治療感受性の増加または抵抗性の減少が、かかる組成物または方法の不在下での治療感受性または抵抗性と比較して、５％またはそれ以上、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上～２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、またはそれ以上である場合、治療的治療に対する応答を感作させる。治療的治療に対する感受性または抵抗性の決定は、当該技術分野で通例であり、当業臨床医の技術の範囲内である。免疫調節の有効性を増強するための本明細書に記載のいずれの方法も、過剰増殖性またはさもなければがん性細胞（例えば、耐性細胞）を療法に対して感作させる方法に同等に適用され得ることを理解されたい。
「相乗効果」という用語は、２つ以上のＨＨＬＡ２経路モジュレーター、ＨＨＬＡ２経路モジュレーターおよび免疫療法、ＨＨＬＡ２経路モジュレーターを単独でまたは免疫チェックポイント阻害療法等の免疫療法と組み合わせてのいずれか等の２つ以上の治療薬の併用効果が、抗がん剤単独の個別の効果の合計を上回り得ることを指す。
「対象」という用語は、任意の健常動物、哺乳動物、もしくはヒト、または目的とする状態（例えば、がん）に罹患している任意の動物、哺乳動物、もしくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と同義である。
「生存期間」という用語には、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、または腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発および遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がんおよびそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時または治療開始時）および終点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、および腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。
「治療効果」という用語は、薬理学的に活性な物質によって引き起こされる動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトにおける局所または全身効果を指す。したがって、この用語は、動物もしくはヒトにおける疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防、または望ましい身体もしくは精神発達および状態の増強における使用を目的とした任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、いずれの治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でいくらかの所望の局所または全身効果をもたらすかかる物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度等に依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある特定の化合物が、かかる治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。
本明細書で使用される「治療有効量」および「有効量」という用語は、いずれの医学的治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で動物における細胞の少なくとも亜集団にいくらかの所望の治療効果をもたらすのに有効な、化合物、本発明の化合物を含む材料、または組成物の量を意味する。対象化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するための、細胞培養または実験動物における標準の医薬品手順によって決定され得る。高い治療指数を呈する組成物が好ましい。いくつかの実施形態では、ＬＤ５０（致死投薬量）が測定され得、薬剤の投与なしと比較して、薬剤に対して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上減少し得る。同様に、ＥＤ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する濃度）が測定され得、薬剤の投与なしと比較して、薬剤に対して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上増加し得る。また、同様に、ＩＣ５０（すなわち、がん細胞への半最大細胞毒性または細胞増殖抑制効果を達成する濃度）が測定され得、薬剤の投与なしと比較して、薬剤に対して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上増加し得る。いくつかの実施形態では、アッセイにおけるがん細胞成長が、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％阻害され得る。がん細胞死が、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％促進され得る。別の実施形態では、がん細胞数および／または固形悪性腫瘍の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％の減少が達成され得る。
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、タンパク質がタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される、抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質の調製を含む。一実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質、なおより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質の調製物を含む。
「転写ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」とは、本発明のマーカーの転写およびＲＮＡ転写物（存在する場合）の正常転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的なまたはそれと相同のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合部位、またはそれらのバリアント、またはかかるＲＮＡもしくはｃＤＮＡの類似体）である。
「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸を指す。１つの種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書で「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、同義に使用され得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むよう意図されている。
特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝子コード（以下に示される）によって定義されるタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝子コードによって定義される核酸によってコードされるアミノ酸配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。
Figure 2024032865000001
遺伝子コードの重要な周知の特徴は、その冗長性であり、それにより、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の大半には、１つより多くのコーディングヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上で例証される）。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。かかるヌクレオチド配列は、全ての生物における同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ある特定の生物はいくつかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳し得るが）、機能的に同等であるとみなされる。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見られ得る。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
前述を考慮して、バイオマーカー核酸（またはその任意の部分）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳するための遺伝子コードを使用してポリペプチドアミノ酸配列を得るために使用され得る。同様に、ポリペプチドアミノ酸配列について、ポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列が遺伝子コードから推定され得る（その冗長性のため、任意の所与のアミノ酸配列に対して複数の核酸配列がもたらされる）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書における説明および／または開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明および／または開示も含むとみなされるべきである。同様に、本明細書におけるポリペプチドアミノ酸配列の説明および／または開示は、アミノ酸配列をコードすることができる全ての可能なヌクレオチド配列の説明および／または開示も含むとみなされるべきである。
最後に、本発明に有用な核酸およびポリペプチド分子の核酸およびアミノ酸配列情報は、当該技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）等の公的に利用可能なデータベースで容易に入手可能である。例えば、公的に利用可能な配列データベースに由来する例示の核酸およびアミノ酸配列が、以下の表１に提供される。
表１
配列番号１：ヒトＨＨＬＡ２バリアント１ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００７０７２．３、４１５～１６５９位由来のＣＤＳ領域）
配列番号２：ヒトＨＨＬＡ２バリアント１ アミノ酸配列（ＮＰ＿００９００３．１）
配列番号３：ヒトＨＨＬＡ２バリアント２ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１２８２５５６．１、２２４～１４６８位由来のＣＤＳ領域）
配列番号４：ヒトＨＨＬＡ２バリアント２ アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２６９４８５．１）
配列番号５：ヒトＨＨＬＡ２バリアント３ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１２８２５５７．１、１５５～１３９９位由来のＣＤＳ領域）
配列番号６：ヒトＨＨＬＡ２バリアント３ アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２６９４８６．１）
配列番号７：ヒトＨＨＬＡ２バリアント４ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１２８２５５８．１、３０２～１４９５位由来のＣＤＳ領域）
配列番号８：ヒトＨＨＬＡ２バリアント４ アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２６９４８７．１）
配列番号９：ヒトＨＨＬＡ２バリアント５ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１２８２５５９．１、２３２～１２８４位由来のＣＤＳ領域）
配列番号１０：ヒトＨＨＬＡ２バリアント５ アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２６９４８８．１）
配列番号１１：ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォーム１ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿１４４６１５．２、４７～８９５位由来のＣＤＳ領域）
配列番号１２：ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォーム１ アミノ酸配列（ＮＰ＿６５３２１６．２）
配列番号１３：ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォーム２ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１１６９１２６．１、４７～８８３位由来のＣＤＳ領域）
配列番号１４：ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォーム２ アミノ酸配列（ＮＰ＿００１１６２５９７．１）
配列番号１５：ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォーム３ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１３０８２３２．１、４７～５３５位由来のＣＤＳ領域）
配列番号１６：ヒトＴＭＩＧＤ２アイソフォーム３ アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２９５１６１．１）
配列番号１７：ヒトＫＩＲ３ＤＬ３ ｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿１５３４４３．４、５１～１２８３位由来のＣＤＳ領域）
配列番号１８：ヒトＫＩＲ３ＤＬ３ アミノ酸配列（ＮＰ＿７０３１４４．３）
＊ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンがウリジンで置き換えられたもの）、コードされたタンパク質のオルソログをコードする核酸分子、ならびに表１に列記されるいずれかの配列番号の核酸配列またはその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列が表１に含まれる。かかる核酸分子は、本明細書にさらに記載される全長核酸の機能を有し得る。
＊タンパク質のオルソログ、ならびに表１に列記されるいずれかの配列番号のアミノ酸配列またはその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が表１に含まれる。かかるポリペプチドは、本明細書にさらに記載される全長ポリペプチドの機能を有し得る。
＊他の既知のＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３核酸およびアミノ酸配列が表１に含まれる。
刺激性受容体である（すなわち、共刺激シグナルを免疫細胞に伝達する）ことに加えて、ＨＨＬＡ２ポリペプチドは、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達し、それにより、免疫細胞エフェクター機能を阻害することができる阻害性受容体であるか、または、例えば、阻害性受容体または刺激性受容体に結合しているときに、免疫細胞の共刺激を促進することができる。ＨＨＬＡ２は、１つ以上の受容体、例えば、Ｔ細胞上のＴＭＩＧＤ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、および／または他のポリペプチドに結合する。
「ＨＨＬＡ２活性」という用語は、例えば、Ｔ細胞上の天然ＨＨＬＡ２リガンドを連結することによって、活性化免疫細胞における阻害性シグナルを調節するＨＨＬＡ２ポリペプチドの能力を含む。免疫細胞における阻害性シグナルの調節により、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌の調節がもたらされる。したがって、「ＨＨＬＡ２活性」という用語には、ＨＨＬＡ２ポリペプチドのその天然リガンド（複数可）に結合する能力、免疫細胞における共刺激または阻害性シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力が含まれる。
いくつかの実施形態では、がん等の状態は、ＨＨＬＡ２遮断単独に対して応答性である。他の実施形態では、がん等の状態は、ＨＨＬＡ２遮断単独に対して応答性であるが、ＨＨＬＡ２遮断と別の療法との組み合わせで治療された場合、著しくまたは相乗的により応答性である。ＨＨＬＡ２遮断に対して単独でまたは組み合わせで応答性である多くの状態には、黒色腫（例えば、進行性または転移性黒色腫）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌および小細胞肺癌）、乳癌（例えば、ＨＥＲ－２陰性乳癌、エストロゲン受容体陽性／ＨＥＲ－２陰性乳癌、およびトリプルネガティブ乳癌）、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、およびホジキンリンパ腫、ならびに膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、前立腺癌、婦人科癌、結腸直腸癌、卵巣癌、および血液癌が含まれるが、これらに限定されない。
好ましいＢ７ポリペプチドは、共刺激または阻害性シグナルを免疫細胞に提供し、それにより、免疫細胞応答を促進または阻害することができる。例えば、共刺激受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーがＴ細胞活性化および増殖を増加させる一方で、阻害性受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーは共刺激を減少させる。さらに、同じＢ７ファミリーメンバーがＴ細胞共刺激を増加させる場合も減少させる場合もある。例えば、共刺激受容体に結合すると、ＨＨＬＡ２は免疫細胞の共刺激を誘導することができ、あるいは、阻害性受容体に結合すると、ＨＨＬＡ２は免疫細胞を阻害することができる。阻害性受容体に結合すると、ＨＨＬＡ２は、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達することができる。好ましいＢ７ファミリーメンバーには、ＨＨＬＡ２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７ｈ、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２、およびそれらの可溶性断片または誘導体が含まれる。一実施形態では、免疫細胞上の１つ以上の受容体、例えば、ＴＭＩＧＤ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、および／または他の受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーは、受容体に応じて、阻害性シグナルまたは共刺激シグナルを免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞に伝達する能力を有する。
共刺激シグナルの調節により、免疫細胞のエフェクター機能の調節がもたらされる。したがって、「ＨＨＬＡ２リガンド活性」という用語には、ＨＨＬＡ２リガンドポリペプチドのその天然受容体（複数可）（例えばＨＨＬＡ２）に結合する能力、免疫細胞における共刺激または阻害性シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力が含まれる。
ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用の調節により免疫機能が調節され得るように、ＨＨＬＡ２経路が免疫機能の負の制御因子または正の制御因子であることが本明細書で実証される。ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合は、免疫機能の正の制御因子であり得る。ＨＨＬＡ２の阻害性受容体への結合は、免疫機能の負の制御因子である。ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合は、ＨＨＬＡ２のへ阻害性受容体の結合と同様であると考えられる。したがって、ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２への結合を阻害することが、ＨＨＬＡ２の阻害性受容体への結合を阻害すると考えられる。したがって、ＨＨＬＡ２と１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用を調節するＨＨＬＡ２経路モジュレーター（例えば、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用のモジュレーター）である本明細書に記載の本発明の薬剤は、直接的か間接的かにかかわらず、免疫系を上方制御または下方制御し、それにより、免疫応答を上方制御または下方制御することができる。かかる相互作用を調節する薬剤は、直接的または間接的のいずれかでそうすることができる。
ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上のＨＨＬＡ２天然結合パートナーとの間の相互作用により、共刺激または共阻害免疫シグナルの送達がもたらされる。したがって、一実施形態では、かかる相互作用（複数可）を直接遮断する薬剤（例えば、抗ＨＨＬＡ２、抗ＴＭＩＧＤ２、および／または抗ＫＩＲ３ＤＬ３遮断抗体）は、阻害性または刺激性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御または下方制御することができる。あるいは、相互作用（複数可）を間接的に遮断する薬剤は、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる。免疫応答を上方制御するための例示の薬剤には、ＨＨＬＡ２とＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を遮断するＨＨＬＡ２またはＫＩＲ３ＤＬ３に対する抗体、ＨＨＬＡ２またはＫＩＲ３ＤＬ３の非活性化形態（例えば、優性ネガティブポリペプチド）、ＨＨＬＡ２とＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド、それぞれ、ＨＨＬＡ２またはＫＩＲ３ＤＬ３に結合し、ＨＨＬＡ２とＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を阻害する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したＨＨＬＡ２またはＫＩＲ３ＤＬ３の細胞外部分）、ＨＨＬＡ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３転写または翻訳を遮断する核酸分子および／または遺伝的修飾、天然ＨＨＬＡ２リガンドの非活性化形態、ならびに天然ＫＩＲ３ＤＬ３リガンドの可溶性形態が挙げられる。
他の例示の実施形態では、ＨＨＬＡ２ポリペプチドのＫＩＲ３ＤＬ３ポリペプチド等の１つ以上の天然結合パートナーへの結合を促進する薬剤は、免疫細胞への阻害性シグナルを促進する。かかる相互作用を調節する薬剤は、直接的または間接的のいずれかでそうすることができる。したがって、一実施形態では、ＨＨＬＡ２とＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を直接増強する薬剤（ＨＨＬＡ２アゴニストおよび／またはＫＩＲ３ＤＬ３アゴニスト）は、阻害性シグナル伝達を促進し、免疫応答を下方制御することができる。あるいは、ＫＩＲ３ＤＬ３の他の標的への結合を遮断する薬剤は、ＨＨＬＡ２への結合に利用可能なＫＩＲ３ＤＬ３の有効濃度を増加させる。免疫応答を下方制御するための例示の薬剤には、ＨＨＬＡ２とＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を活性化または促進するＨＨＬＡ２またはＫＩＲ３ＤＬ３に対する抗体、ＨＨＬＡ２とＫＩＲ３ＤＬ３との間の相互作用を活性化または促進する小分子またはペプチド、ならびにそれぞれ、ＨＨＬＡ２およびＫＩＲ３ＤＬ３以外のＨＨＬＡ２およびＫＩＲ３ＤＬ３の天然結合パートナーに結合する遮断抗体が挙げられる。これらの関係は、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２との相互作用にも適用される。
本発明の方法で有用な追加の薬剤には、表１に列記されるバイオマーカーを含む本発明のタンパク質バイオマーカーまたはその断片に結合および／またはそれを活性化するか、またはそれを阻害するかのいずれかを行うことができる抗体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然リガンド、および天然リガンドの誘導体；表１に列記されるバイオマーカーを含む本発明のバイオマーカーまたはその断片の発現および／または活性を下方制御することができるＲＮＡ干渉、アンチセンス、核酸アプタマー等が含まれる。
ＨＨＬＡ２に対して産生される単離されたモノクローナル抗体またはその断片が提供される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマによって産生されたｍＡｂは、ブダペスト条約の条項に従って、＿＿＿＿＿＿に寄託番号＿＿＿＿＿＿でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。
抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが抗体の抗原に対する結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たすことが当該技術分野で周知であるため、上述のように調製された本発明の組換えモノクローナル抗体は、好ましくは、本発明の可変領域の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３（例えば、表２の配列またはその一部を含む）を含む。本抗体は、本発明の可変領域のＣＤＲ２（例えば、表２の配列またはその一部を含む）をさらに含み得る。本抗体は、本発明の可変領域のＣＤＲ１（例えば、表２の配列またはその一部を含む）をさらに含み得る。他の実施形態では、本抗体は、これらのＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。
上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２、および／または３領域は、本明細書に開示される本発明の可変領域（例えば、表２の配列またはその一部を含む）として正確なアミノ酸配列（複数可）を含み得る。しかしながら、当業者であれば、ＨＨＬＡ２に有効に結合する抗体の能力（例えば、保存的配列修飾）を依然として保持しながら、正確なＣＤＲ配列からのいくらかの逸脱が可能であり得ることを理解するであろう。したがって、別の実施形態では、操作された抗体は、例えば、本発明の１つ以上のＣＤＲ（例えば、表２の配列またはその一部を含む）と５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一の１つ以上のＣＤＲから成り得る。
既知の非ヒトまたはヒト抗体（例えば、マウスまたは非齧歯類抗ヒトＨＨＬＡ２抗体）の構造的特徴を使用して、ＨＨＬＡ２の結合等の本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する構造的に関連したヒト抗ヒトＨＨＬＡ２抗体（例えば、ｍＡｂ ８Ａ１２、ならびにポリクローナル抗体１．２および２．２）を作製することができる。別の機能的特性には、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける本来の既知の非ヒトまたはヒト抗体の結合の阻害が含まれる。
いくつかの実施形態では、可変ドメインが表２に提示される重鎖可変ドメインＣＤＲ群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む、ヒトＨＨＬＡ２に結合することができるモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ ８Ａ１２、ならびにポリクローナル抗体１．２および２．２）が提供される。
同様に、可変ドメインが表２に提示される軽鎖可変ドメインＣＤＲ群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む、ヒトＨＨＬＡ２に結合することができるモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ ８Ａ１２、ならびにポリクローナル抗体１．２および２．２）も提供される。
可変ドメインが表２に提示される重鎖可変ドメインＣＤＲ群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含み、かつ可変ドメインが表２に提示される軽鎖可変ドメインＣＤＲ群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む、ヒトＨＨＬＡ２に結合することができるモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ ８Ａ１２、ならびにポリクローナル抗体１．２および２．２）も提供される。
当業者であれば、かかる相同性パーセンテージが、所与のＣＤＲ内での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換と同等であり、その保存的アミノ酸置換を導入することによって達成され得ることに留意するであろう。
本発明のモノクローナル抗体は、可変ドメインが表２に提示される重鎖可変ドメインＣＤＲからなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖、および可変ドメインが表２に提示される軽鎖可変ドメインＣＤＲからなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含み得る。
かかるモノクローナル抗体は、可変ドメインが本明細書に記載のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖、および／または可変ドメインが本明細書に記載のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトＨＨＬＡ２に結合することができるモノクローナル抗体は、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含むか、またはそれからなる。
本発明のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインは、表２に記載のｖＨアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得、かつ／または本発明のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインは、表２に記載のｖκアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の任意の技法によって産生および修飾され得る。例えば、かかるモノクローナル抗体は、マウスまたは非齧歯類抗体、例えば、＿＿＿＿＿＿に寄託＿＿＿＿＿＿でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマから入手可能なものであり得る。同様に、かかるモノクローナル抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体であり得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、可変ドメインが、ヒトアクセプターフレームワーク領域、および任意にヒト定常ドメイン（存在する場合）、ならびに上で定義されるマウスまたは非齧歯類ＣＤＲ等の非ヒトドナーＣＤＲを含むようなヒト化抗体である。
本発明は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディが含まれるが、これらに限定されない当該モノクローナル抗体の断片、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体をさらに提供する。例えば、ＨＨＬＡ２、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＫＩＲ３ＤＬ３等のいくつかの免疫阻害性分子は、かかる分子の発現を効率的に特徴付けるために、二重特異的または多重特異的様式で検出され得る。
本発明のモノクローナル抗体の他の断片も企図される。例えば、個別の免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖が提供され、その可変ドメインは、表２に提示される少なくとも１つのＣＤＲを含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、表２に提示される重鎖または軽鎖可変ドメインＣＤＲ群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は、本明細書に記載の（例えば、表２に提示される）軽鎖または重鎖可変ドメインＣＤＲ群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖は、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、またはＣＤＲ－Ｈ３のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインを含む。かかる免疫グロブリン重鎖は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３のうちの少なくとも１つを含み得るか、またはそれからなり得る。かかる免疫グロブリン軽鎖は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のうちの少なくとも１つを含み得るか、またはそれからなり得る。
他の実施形態では、本発明による免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖は、それぞれ、表２に提供されるｖＨ可変ドメイン配列またはｖκ可変ドメイン配列を含むか、またはそれからなる。
本発明は、本明細書に記載のｖＨ可変ドメイン、ｖκ可変ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをさらに提供する。
本発明の抗体、免疫グロブリン、およびポリペプチドは、単離された（例えば、精製された）形態で使用され得るか、または膜もしくは脂質小胞（例えば、リポソーム）等のベクター中に含まれ得る。
表２：ｍＡｂ ８Ａ１２、６Ｄ１０、６Ｆ１０、８Ｄ２、２Ｇ２、２Ｃ４、４Ｄ１、１Ｃ８、および４Ｅ５を含む抗ＨＨＬＡ２モノクローナル抗体のリーダー領域および可変領域の特定および配列決定
８Ａ１２重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５４ＨＣ．１；Ｍ１３ ４９９．５．８Ａ１２．１１．１０．５
ＣＤＲ分析
ＧＦＴＦＮＴＮＶ．．．．＿＿＿ＩＲＴＫＴＮＮＹＡＴ＿＿＿ＶＧＡＭＤＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ
遺伝子座８Ａ１２＿ｖＨ ４０２ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000026
Figure 2024032865000027
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．８Ａ１２．１１．１０．５
起源
シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
Figure 2024032865000028
 （配列番号２１）
／翻訳＝「ＭＬＬＧＬＫＷＩＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣ」（配列番号２２）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000030
 ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号２５）
／翻訳＝「ＧＦＴＦＮＴＮ」（配列番号２６）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号２７）
／翻訳＝「ＶＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩ」（配列番号２８）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２３４）：
（配列番号２９）
／翻訳＝「ＲＴＫＴＮＮＹＡ」（配列番号３０）
フレームワーク３（塩基対２３５～３５７）：
／翻訳＝「ＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＶＧ」（配列番号３２）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５８～３６９）：
（配列番号３３）
／翻訳＝「ＡＭＤＹ」（配列番号３４）
フレームワーク４（塩基対３７０～４０２）：
（配列番号３５）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ」（配列番号３６）
Figure 2024032865000037
 ８Ａ１２軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５４ＬＣ．２；Ｍ１３．４９９．５．８Ａ１２．１１．１０．５
ＣＤＲ分析
ＥＳＶＤＮＳＧＩＮＦ．．＿＿＿ＲＡＳ．．．．．．．＿＿＿ＱＱＳＹＫＤＰＰＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５４ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５４ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ
遺伝子座８Ａ１２＿ｖＬ ３９３ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000038
Figure 2024032865000039
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５４ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５４ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．８Ａ１２．１１．１０．５
起源
Figure 2024032865000040
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号３９）
／翻訳＝「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」（配列番号４０）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
Figure 2024032865000042
 ／翻訳＝「ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＶＳＣ」（配列番号４２）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１７４）：
（配列番号４３）
／翻訳＝「ＲＡＳＥＳＶＤＮＳＧＩＮＦＩＨ」（配列番号４４）
フレームワーク２（塩基対１７５～２１９）：
（配列番号４５）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＬＹ」（配列番号４６）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２２０～２４０）：
（配列番号４７）
／翻訳＝「ＲＡＳＮＬＫＳ」（配列番号４８）
フレームワーク３（塩基対２４１～３３６）：
Figure 2024032865000046
 ／翻訳＝「ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＧＤＶＡＴＹＹＣ」（配列番号５０）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３３７～３６３）：
（配列番号５１）
／翻訳＝「ＱＱＳＹＫＤＰＰＴ」（配列番号５２）
フレームワーク４（塩基対３６４～３９３）：
（配列番号５３）
／翻訳＝「ＦＧＴＧＴＫＬＥＬＫ」（配列番号５４）
Figure 2024032865000049
 ６Ｄ１０重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５５ＨＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．６Ｄ１０．１１．１１．７
ＣＤＲ分析
ＧＦＴＦＮＴＮＶ．．．．＿＿＿ＩＲＴＫＴＮＮＹＡＴ＿＿＿ＶＧＡＭＤＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５５ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５５ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ ４９９．５．６Ｄ１０．１１．１１．７
遺伝子座６Ｄ１０＿ｖＨ ４０２ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000050
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５５ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５５ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｄ１０．１１．１１．７
起源
Figure 2024032865000052
 シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号５７）
／翻訳＝「ＭＬＬＧＬＫＷＩＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣ」（配列番号５８）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000054
 ／翻訳＝「ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳ」（配列番号６０）
ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号６１）
／翻訳＝「ＧＦＴＦＮＴＮ」（配列番号６２）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号６３）
／翻訳＝「ＶＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩ」（配列番号６４）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２３４）：
（配列番号６５）
／翻訳＝「ＲＴＫＴＮＮＹＡ」（配列番号６６）
フレームワーク３（塩基対２３５～３５７）：
Figure 2024032865000058
 ／翻訳＝「ＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＦＲＤＤＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＧ」（配列番号６８）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５８～３６９）：
（配列番号６９）
／翻訳＝「ＡＭＤＹ」（配列番号７０）
フレームワーク４（塩基対３７０～４０２）：
（配列番号７１）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ」（配列番号７２）
Figure 2024032865000061
 ６Ｄ１０軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５５ＬＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．６Ｄ１０．１１．１１．７
ＣＤＲ分析
ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ．．＿＿＿ＲＡＳ．．．．．．．＿＿＿ＱＱＳＳＫＤＰＰＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５５ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５５ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｄ１０．１１．１１．７
遺伝子座６Ｄ１０＿ｖＬ ３９３ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000062
Figure 2024032865000063
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５５ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５５ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｄ１０．１１．１１．７
起源
Figure 2024032865000064
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号７５）
／翻訳＝「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」（配列番号７６）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
Figure 2024032865000066
 ／翻訳＝「ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣ」（配列番号７８）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１７４）：
（配列番号７９）
／翻訳＝「ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＨ」（配列番号８０）
フレームワーク２（塩基対１７５～２１９）：
（配列番号８１）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ」（配列番号８２）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２２０～２４０）：
（配列番号８３）
／翻訳＝「ＲＡＳＮＬＫＳ」（配列番号８４）
フレームワーク３（塩基対２４１～３３６）：
／翻訳＝「ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＧＤＶＡＴＹＹＣ」（配列番号８６）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３３７～３６３）：
（配列番号８７）
／翻訳＝「ＱＱＳＳＫＤＰＰＴ」（配列番号８８）
フレームワーク４（塩基対３６４～３９３）：
（配列番号８９）
／翻訳＝「ＦＧＴＧＴＫＬＥＬＫ」（配列番号９０）
Figure 2024032865000073
 ６Ｆ１０重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５７ＨＣＯ．１；Ｍ１３．４９９．５．６Ｆ１０．Ａ４．１０
ＣＤＲ分析
ＧＹＴＦＴＴＹＴ．．．．＿＿＿ＩＮＰＳＳＧＹＴ．．＿＿＿ＡＲＨＰＷＤＳＤＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５７ＨＣＯ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５７ＨＣＯ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｆ１０．Ａ４．１０
遺伝子座６Ｆ１０＿ｖＨ ４０５ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000074
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５７ＨＣＯ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５７ＨＣＯ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｆ１０．Ａ４．１０
起源
Figure 2024032865000076
 シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号９３）
／翻訳＝「ＭＥＲＨＷＩＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳ」（配列番号９４）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000078
 ／翻訳＝「ＱＶＨＬＱＱＳＡＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ」（配列番号９６）
ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号９７）
／翻訳＝「ＧＹＴＦＴＴＹ」（配列番号９８）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号９９）
／翻訳＝「ＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＨＩ」（配列番号１００）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１－２２８）：
（配列番号１０１）
／翻訳＝「ＮＰＳＳＧＹ」（配列番号１０２）
フレームワーク３（塩基対２２９～３５１）：
／翻訳＝「ＴＤＹＮＱＫＦＫＤＫＴＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲ」（配列番号１０４）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５２～３７２）：
（配列番号１０５）
／翻訳＝「ＨＰＷＤＳＤＹ」（配列番号１０６）
フレームワーク４（塩基対３７３～４０５）：
（配列番号１０７）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ」（配列番号１０８）
Figure 2024032865000085
 ６Ｆ１０軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５７ＬＣ．１；Ｍ１３．
ＣＤＲ分析
ＥＮＩＤＳＹ．．．．．．＿＿＿ＡＡＴ．．．．．．．＿＿＿ＱＨＹＹＩＴＰＦＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５７ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５７ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｆ１０．Ａ４．１０
遺伝子座６Ｆ１０＿ｖＬ ３８１ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000086
Figure 2024032865000087
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５７ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５７ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．６Ｆ１０．Ａ４．１０
起源
Figure 2024032865000088
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号１１１）
／翻訳＝「ＭＳＶＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ」（配列番号１１２）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
／翻訳＝「ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣ」（配列番号１１４）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１６２）：
（配列番号１１５）
／翻訳＝「ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ」（配列番号１１６）
フレームワーク２（塩基対１６３～２０７）：
（配列番号１１７）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＱＧＲＳＰＱＬＬＶＹ」（配列番号１１８）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２０８～２２８）：
（配列番号１１９）
／翻訳＝「ＡＡＴＮＬＡＤ」（配列番号１２０）
フレームワーク３（塩基対２２９～３２４）：
／翻訳＝「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＱＩＮＲＬＱＳＥＤＶＡＲＹＹＣ」（配列番号１２２）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３２５～３５１）：
（配列番号１２３）
／翻訳＝「ＱＨＹＹＩＴＰＦＴ」（配列番号１２４）
フレームワーク４（塩基対３５２～３８１）：
（配列番号１２５）
／翻訳＝「ＦＧＳＧＴＫＬＥＩＡ」（配列番号１２６）
Figure 2024032865000097
 ８Ｄ２重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５８ＨＣ．１；Ｍ１３．４９９．８Ｄ２．６．８
ＣＤＲ分析
ＧＦＴＦＮＴＮＶ．．．．＿＿＿ＩＲＴＫＴＮＮＹＡＴ＿＿＿ＶＧＡＭＤＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５８ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５８ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．８Ｄ２．６．８
遺伝子座８Ｄ２＿ｖＨ ４０２ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000098
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５８ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５８ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．８Ｄ２．６．８
起源
Figure 2024032865000100
 シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号１２９）
／翻訳＝「ＭＬＬＧＬＫＷＩＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣ」（配列番号１３０）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
／翻訳＝「ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳ」（配列番号１３２）ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号１３３）
／翻訳＝「ＧＦＴＦＮＴＮ」（配列番号１３４）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
Figure 2024032865000104
 ／翻訳＝「ＶＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩ」（配列番号１３６）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２３４）：
（配列番号１３７）
／翻訳＝「ＲＴＫＴＮＮＹＡ」（配列番号１３８）
フレームワーク３（塩基対２３５～３５７）：
／翻訳＝「ＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＴＹＦＣＶＧ」（配列番号１４０）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５８～３６９）：
（配列番号１４１）
／翻訳＝「ＡＭＤＹ」（配列番号１４２）
フレームワーク４（塩基対３７０～４０２）：
（配列番号１４３）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ」（配列番号１４４）
Figure 2024032865000109
 ８Ｄ２軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５８ＬＣ．２；Ｍ１３．４９９．８Ｄ２．６．８
ＣＤＲ分析
ＥＳＶＤＮＳＧＩＮＦ．．＿＿＿ＲＡＳ．．．．．．．＿＿＿ＱＱＳＹＫＤＰＰＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５８ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５８ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．８Ｄ２．６．８
遺伝子座８Ｄ２＿ｖＬ ３９３ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000110
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５８ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５８ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．８Ｄ２．６．８
起源
Figure 2024032865000112
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号１４７）
／翻訳＝「ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ」（配列番号１４８）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
Figure 2024032865000114
 ／翻訳＝「ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＶＳＣ」（配列番号１５０）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１７４）：
（配列番号１５１）
／翻訳＝「ＲＡＳＥＳＶＤＮＳＧＩＮＦＩＨ」（配列番号１５２）
フレームワーク２（塩基対１７５～２１９）：
（配列番号１５３）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＬＹ」（配列番号１５４）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２２０～２４０）：
（配列番号１５５）
／翻訳＝「ＲＡＳＮＬＫＳ」（配列番号１５６）
フレームワーク３（塩基対２４１～３３６）：
Figure 2024032865000118
 ／翻訳＝「ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＧＤＶＡＴＹＹＣ」（配列番号１５８）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３３７～３６３）：
（配列番号１５９）
／翻訳＝「ＱＱＳＹＫＤＰＰＴ」（配列番号１６０）
フレームワーク４（塩基対３６４～３９３）：
（配列番号１６１）
／翻訳＝「ＦＧＴＧＴＫＬＥＬＫ」（配列番号１６２）
Figure 2024032865000121
 ２Ｇ２重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６１ＨＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．２Ｇ２．１３．３．１０
ＣＤＲ分析
ＧＬＴＦＳＳＹＡ．．．．＿＿＿ＩＳＳＧＧＳＨＴ．．＿＿＿ＴＲＬＧＲＡＦＤＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６１ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６１ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｇ２．１３．３．１０
遺伝子座２Ｇ２＿ｖＨ ４０５ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000122
Figure 2024032865000123
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６１ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６１ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｇ２．１３．３．１０
起源
Figure 2024032865000124
 シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号１６５）
／翻訳＝「ＭＮＦＧＬＳＬＩＦＬＶＬＶＬＫＧＶＱＣ」（配列番号１６６）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000126
 ／翻訳＝「ＥＶＭＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＶＳ」（配列番号１６８）
ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号１６９）
／翻訳＝「ＧＬＴＦＳＳＹ」（配列番号１７０）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号１７１）
／翻訳＝「ＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩ」（配列番号１７２）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２２８）：
（配列番号１７３）
／翻訳＝「ＳＳＧＧＳＨ」（配列番号１７４）
フレームワーク３（塩基対２２９～３５１）：
／翻訳＝「ＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＲ」（配列番号１７６）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５２～３７２）：
（配列番号１７７）
／翻訳＝「ＬＧＲＡＦＤＹ」（配列番号１７８）
フレームワーク４（塩基対３７３～４０５）：
（配列番号１７９）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ」（配列番号１８０）
Figure 2024032865000133
 ２Ｇ２軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６１ＬＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．２Ｇ２．１３．３．１０
ＣＤＲ分析
ＱＤＶＳＴＡ．．．．．．＿＿＿ＷＡＳ．．．．．．．＿＿＿ＱＱＤＹＳＴＰＷＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６１ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６１ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｇ２．１３．３．１０
遺伝子座２Ｇ２＿ｖＬ ３８１ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000134
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６１ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６１ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｇ２．１３．３．１０
起源
Figure 2024032865000136
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号１８３）
／翻訳＝「ＭＥＳＱＩＱＶＦＶＦＶＦＬＷＬＳＧＶＤＧ」（配列番号１８４）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
Figure 2024032865000138
 ／翻訳＝「ＤＩＶＭＴＱＳＨＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣ」（配列番号１８６）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１６２）：
（配列番号１８７）
／翻訳＝「ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ」（配列番号１８８）
フレームワーク２（塩基対１６３～２０７）：
（配列番号１８９）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹ」（配列番号１９０）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２０８～２２８）：
（配列番号１９１）
／翻訳＝「ＷＡＳＴＲＨＴ」（配列番号１９２）
フレームワーク３（塩基対２２９～３２４）：
／翻訳＝「ＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＬＹＹＣ」（配列番号１９４）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３２５～３５１）：
（配列番号１９５）
／翻訳＝「ＱＱＤＹＳＴＰＷＴ」（配列番号１９６）
フレームワーク４（塩基対３５２～３８１）：
（配列番号１９７）
／翻訳＝「ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ」（配列番号１９８）
Figure 2024032865000145
 ２Ｃ４重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６２ＨＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．２Ｃ４．Ｅ６．６．８．１
ＣＤＲ分析
ＧＦＳＦＴＤＹＮ．．．．＿＿＿ＩＤＰＹＹＧＲＩ．．＿＿＿ＡＴＧＡＹＴＳＧＹＳＷＦＡＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６２ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６２ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｃ４．Ｅ６．６．８．１
遺伝子座２Ｃ４＿ｖＨ ４２０ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000146
Figure 2024032865000147
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６２ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６２ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｃ４．Ｅ６．６．８．１
起源
（配列番号２００）
シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号２０１）
／翻訳＝「ＭＧＷＴＷＩＦＩＬＩＬＳＶＴＴＧＶＨＳ」（配列番号２０２）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000150
 ／翻訳＝「ＥＶＨＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＶＳＶＫＩＳＣＫＡＳ」（配列番号２０４）ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号２０５）
／翻訳＝「ＧＦＳＦＴＤＹ」（配列番号２０６）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号２０７）
／翻訳＝「ＮＭＮＷＶＫＱＳＳＧＫＳＬＥＷＩＧＮＩ」（配列番号２０８）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２２８）：
（配列番号２０９）
／翻訳＝「ＤＰＹＹＧＲ」（配列番号２１０）
フレームワーク３（塩基対２２９～３５１）：
／翻訳＝「ＩＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＳＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴ」（配列番号２１２）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５２～３８７）：
（配列番号２１３）
／翻訳＝「ＧＡＹＴＳＧＹＳＷＦＡＹ」（配列番号２１４）
フレームワーク４（塩基対３８８～４２０）：
（配列番号２１５）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ」（配列番号２１６）
Figure 2024032865000157
 ２Ｃ４軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６２ＬＣ．２；Ｍ１３．４９９．５．２Ｃ４．Ｅ６．６．８．１
ＣＤＲ分析
ＳＳＶＳＳＳＹ．．．．．＿＿＿ＲＴＳ．．．．．．．＿＿＿ＱＱＷＳＧＹＰＦＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６２ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６２ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｃ４．Ｅ６．６．８．１
遺伝子座２Ｃ４＿ｖＬ ３９０ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000158
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６２ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６２ＬＣ．２＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．２Ｃ４．Ｅ６．６．８．１
起源
Figure 2024032865000160
 シグナルペプチド（塩基対１～６６）：
Figure 2024032865000161
 ／翻訳＝「ＭＧＬＱＶＱＶＩＳＦＬＬＩＳＶＴＶＩＭＳＲＧ」（配列番号２２０）
フレームワーク１（塩基対６７～１３５）：
／翻訳＝「ＥＮＶＬＴＱＳＰＧＩＭＡＡＳＬＧＥＫＶＴＭＴＣ」（配列番号２２２）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３６～１７１）：
（配列番号２２３）
／翻訳＝「ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ」（配列番号２２４）
フレームワーク２（塩基対１７２～２１６）：
（配列番号２２５）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＲＳＧＡＳＰＫＰＬＩＨ」（配列番号２２６）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２１７～２３７）：
（配列番号２２７）
／翻訳＝「ＲＴＳＮＬＡＳ」（配列番号２２８）
フレームワーク３（塩基対２３８～３３３）：
Figure 2024032865000166
 ／翻訳＝「ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣ」（配列番号２３０）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３３４～３６０）：
（配列番号２３１）
／翻訳＝「ＱＱＷＳＧＹＰＦＴ」（配列番号２３２）
フレームワーク４（塩基対３６１～３９０）：
（配列番号２３３）
／翻訳＝「ＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ」（配列番号２３４）
Figure 2024032865000169
 ４Ｄ１重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６３ＨＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．４Ｄ１．５．１６
ＣＤＲ分析
ＧＹＴＦＴＤＹＡ．．．．＿＿＿ＩＳＴＹＹＧＤＴ．．＿＿＿ＡＲＧＮＹＤＤＷＹＦＮＶＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６３ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６３ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．４Ｄ１．５．１６
遺伝子座４Ｄ１＿ｖＨ ４１４ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000170
Figure 2024032865000171
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６３ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６３ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．４Ｄ１．５．１６
起源
Figure 2024032865000172
シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号２３７）
／翻訳＝「ＭＤＷＳＣＩＩＦＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ」（配列番号２３８）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000174
 ／翻訳＝「ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣＫＧＳ」（配列番号２４０）ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号２４１）
／翻訳＝「ＧＹＴＦＴＤＹ」（配列番号２４２）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号２４３）
／翻訳＝「ＡＭＨＷＶＫＱＳＨＡＫＳＬＥＷＩＧＳＩ」（配列番号２４４）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２２８）：
（配列番号２４５）
／翻訳＝「ＳＴＹＹＧＤ」（配列番号２４６）
フレームワーク３（塩基対２２９～３５１）：
Figure 2024032865000178
 ／翻訳＝「ＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＭＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＡＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲ」（配列番号２４８）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５２～３８１）：
（配列番号２４９）
／翻訳＝「ＧＮＹＤＤＷＹＦＮＶ」（配列番号２５０）
フレームワーク４（塩基対３８２～４１４）：
（配列番号２５１）
／翻訳＝「ＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ」（配列番号２５２）
Figure 2024032865000181
 ４Ｄ１軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６３ＬＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．４Ｄ１．５．１６
ＣＤＲ分析
ＱＤＩＳＧＹ．．．．．．＿＿＿ＳＴＳ．．．．．．．＿＿＿ＬＱＹＡＳＳＰＹＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６３ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６３ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．４Ｄ１．５．１６
遺伝子座４Ｄ１＿ｖＬ ３８１ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000182
Figure 2024032865000183
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６３ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６３ＬＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．４Ｄ１．５．１６
起源
Figure 2024032865000184
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号２５５）
／翻訳＝「ＭＲＩＰＡＨＶＦＧＦＬＬＬＷＦＰＧＡＲＣ」（配列番号２５６）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
Figure 2024032865000186
 ／翻訳＝「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＥＲＶＳＬＴＣ」（配列番号２５８）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１６２）：
（配列番号２５９）
／翻訳＝「ＲＡＳＱＤＩＳＧＹＬＳ」（配列番号２６０）
フレームワーク２（塩基対１６３～２０７）：
（配列番号２６１）
／翻訳＝「ＷＬＱＱＫＰＤＧＴＩＫＲＬＩＹ」（配列番号２６２）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２０８～２２８）：
（配列番号２６３）
／翻訳＝「ＳＴＳＴＬＤＳ」（配列番号２６４）
フレームワーク３（塩基対２２９～３２４）：
／翻訳＝「ＧＶＰＫＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＳＥＤＦＡＤＹＹＣ」（配列番号２６６）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３２５～３５１）：
（配列番号２６７）
／翻訳＝「ＬＱＹＡＳＳＰＹＴ」（配列番号２６８）
フレームワーク４（塩基対３５２～３８１）：
（配列番号２６９）
／翻訳＝「ＦＧＧＧＡＫＬＥＩＫ」（配列番号２７０）
Figure 2024032865000193
 １Ｃ８重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６４ＨＣ．１；Ｍ１３．４９９．５．１Ｃ８．９．１２．２
ＣＤＲ分析
ＧＦＮＩＫＤＴＹ．．．．＿＿＿ＩＤＰＡＮＧＫＴ．．＿＿＿ＡＷＬＬＰＹＹＦＤＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．１Ｃ８．９．１２．２
遺伝子座１Ｃ８＿ｖＨ ４０８ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000194
Figure 2024032865000195
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６４ＨＣ．１＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．１Ｃ８．９．１２．２
起源
Figure 2024032865000196
 シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号２７３）
／翻訳＝「ＭＫＣＳＷＩＩＦＦＬＭＡＶＶＴＧＶＮＳ」（配列番号２７４）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
Figure 2024032865000198
 ／翻訳＝「ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＱＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳ」（配列番号２７６）ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号２７７）
／翻訳＝「ＧＦＮＩＫＤＴ」（配列番号２７８）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
２１０（配列番号２７９）
／翻訳＝「ＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩ」（配列番号２８０）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２２８）：
（配列番号２８１）
／翻訳＝「ＤＰＡＮＧＫ」（配列番号２８２）
フレームワーク３（塩基対２２９～３５１）：
／翻訳＝「ＴＩＦＤＰＫＦＱＶＫＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＶＹＬＨＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＩＹＹＣＡＷ」（配列番号２８４）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５２～３７５）：
（配列番号２８５）
／翻訳＝「ＬＬＰＹＹＦＤＹ」（配列番号２８６）
フレームワーク４（塩基対３７６～４０８）：
（配列番号２８７）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ」（配列番号２８８）
Figure 2024032865000205
 １Ｃ８軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５６４ＬＣＢ．４；Ｍ１３．４９９．５．１Ｃ８．９．１２．２
ＣＤＲ分析
ＳＳＩＳＳＳＮ．．．．．＿＿＿ＧＴＳ．．．．．．．＿＿＿ＱＫＷＳＨＹＰＬＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５６４ＬＣＢ．４＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６４ＬＣＢ．４＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．１Ｃ８．９．１２．２
遺伝子座１Ｃ８＿ｖＬ ３９０ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000206
Figure 2024032865000207
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５６４ＬＣＢ．４＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５６４ＬＣＢ．４＼；Ｍ１３Ｆ．４９９．５．１Ｃ８．９．１２．２
起源
Figure 2024032865000208
 シグナルペプチド（塩基対１～６６）：
Figure 2024032865000209
 ／翻訳＝「ＭＤＦＨＶＱＩＦＳＦＭＬＩＳＶＴＶＭＬＳＳＧ」（配列番号２９２）
フレームワーク１（塩基対６７～１３５）：
Figure 2024032865000210
 ／翻訳＝「ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＶＭＡＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣ」（配列番号２９４）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３６～１７１）：
（配列番号２９５）
／翻訳＝「ＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨ」（配列番号２９６）
フレームワーク２（塩基対１７２～２１６）：
（配列番号２９７）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＬＷＩＹ」（配列番号２９８）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２１７～２３７）：
（配列番号２９９）
／翻訳＝「ＧＴＳＮＬＡＳ」（配列番号３００）
フレームワーク３（塩基対２３８～３３３）：
Figure 2024032865000214
 ／翻訳＝「ＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣ」（配列番号３０２）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３３４～３６０）：
（配列番号３０３）
／翻訳＝「ＱＫＷＳＨＹＰＬＴ」（配列番号３０４）
フレームワーク４（塩基対３６１～３９０）：
（配列番号３０５）
／翻訳＝「ＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ」（配列番号３０６）
Figure 2024032865000217
 ４Ｅ５重鎖可変（ｖＨ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５６ＨＣＮ．１；Ｍ１３．４９９．５．４Ｅ５．２０．２２
ＣＤＲ分析
ＧＹＴＦＴＴＹＴ．．．．＿＿＿ＩＮＰＳＳＧＹＴ．．＿＿＿ＡＲＨＰＷＤＳＮＹ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５６ＨＣＮ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ＭＨＣ２５５６ＨＣＮ．１＼；Ｍ１３Ｆ
遺伝子座４Ｅ５＿ｖＨ ４０５ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000218
Figure 2024032865000219
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５６ＨＣＮ．１＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ＭＨＣ２５５６ＨＣＮ．１＼；Ｍ１３Ｆ
起源
Figure 2024032865000220
 シグナルペプチド（塩基対１～５７）：
（配列番号３０９）
／翻訳＝「ＭＥＲＨＷＩＦＬＦＬＬＳＶＴＡＧＶＨＳ」（配列番号３１０）
フレームワーク１（塩基対５８～１３２）：
／翻訳＝「ＱＶＱＬＱＱＳＡＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ」（配列番号３１２）ＣＤＲ－Ｈ１（塩基対１３３～１５３）：
（配列番号３１３）
／翻訳＝「ＧＹＴＦＴＴＹ」（配列番号３１４）
フレームワーク２（塩基対１５４～２１０）：
（配列番号３１５）
／翻訳＝「ＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＨＩ」（配列番号３１６）
ＣＤＲ－Ｈ２（塩基対２１１～２２８）：
（配列番号３１７）
／翻訳＝「ＮＰＳＳＧＹ」（配列番号３１８）
フレームワーク３（塩基対２２９～３５１）：
Figure 2024032865000226
 ／翻訳＝「ＴＥＹＮＱＫＦＫＤＫＴＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＨＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲ」（配列番号３２０）
ＣＤＲ－Ｈ３（塩基対３５２～３７２）：
（配列番号３２１）
／翻訳＝「ＨＰＷＤＳＮＹ」（配列番号３２２）
フレームワーク４（塩基対３７３～４０５）：
（配列番号３２３）
／翻訳＝「ＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ」（配列番号３２４）
Figure 2024032865000229
 ４Ｅ５軽鎖可変（ｖＬ）ＤＮＡおよびアミノ酸配列＊
ＭＨＣ２５５６ＬＣＮ．２；Ｍ１３．４９９．５．４Ｅ５．２０．２２
ＣＤＲ分析
ＥＮＩＤＳＹ．．．．．．＿＿＿ＡＡＴ．．．．．．．＿＿＿ＱＨＹＹＩＴＰＦＴ
ＦＡＳＴＡ形式でのアミノ酸配列（ＭＨＣ２５５６ＬＣＮ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５６ＬＣＮ．２＼；Ｍ１３Ｆ
遺伝子座４Ｅ５＿ｖＬ ３８１ｂｐの直鎖状ＤＮＡ
Figure 2024032865000230
Figure 2024032865000231
 ＦＡＳＴＡ形式でのヌクレオチド配列（ＭＨＣ２５５６ＬＣＮ．２＼；Ｍ１３Ｆ）
＞ ＭＨＣ２５５６ＬＣＮ．２＼；Ｍ１３Ｆ
起源
Figure 2024032865000232
 シグナルペプチド（塩基対１～６０）：
（配列番号３２７）
／翻訳＝「ＭＳＶＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ」（配列番号３２８）
フレームワーク１（塩基対６１～１２９）：
／翻訳＝「ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣ」（配列番号３３０）
ＣＤＲ－Ｌ１（塩基対１３０～１６２）：
（配列番号３３１）
／翻訳＝「ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ」（配列番号３３２）
フレームワーク２（塩基対１６３～２０７）：
（配列番号３３３）
／翻訳＝「ＷＹＱＱＫＱＧＲＳＰＱＬＬＶＹ」（配列番号３３４）
ＣＤＲ－Ｌ２（塩基対２０８～２２８）：
（配列番号３３５）
／翻訳＝「ＡＡＴＮＬＡＤ」（配列番号３３６）
フレームワーク３（塩基対２２９～３２４）：
／翻訳＝「ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＳＥＤＶＡＲＹＹＣ」（配列番号３３８）
ＣＤＲ－Ｌ３（塩基対３２５～３５１）：
（配列番号３３９）
／翻訳＝「ＱＨＹＹＩＴＰＦＴ」（配列番号３４０）
フレームワーク４（塩基対３５２～３８１）：
（配列番号３４１）
／翻訳＝「ＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ」（配列番号３４２）
Figure 2024032865000241
 ＊ＣＤＲの定義およびＫａｂａｔに従うタンパク質配列の番号付け。ＣＤＲアミノ酸配列には、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の順に下線が引かれている。
Figure 2024032865000242
ＩＩＩ．核酸、ベクター、および組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本発明のモノクローナル抗体およびその断片、免疫グロブリン、ならびにポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
例えば、特定の実施形態では、本発明は、ｍＡｂ ８Ａ１２のｖＨドメインまたはｍＡｂ ８Ａ１２のｖＬドメインをコードする核酸配列に部分的に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、ポリクローナル抗体１．２および／または２．２から単離された少なくとも１つの有効な抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂのｖＨドメインまたはｖＬドメインをコードする核酸配列に部分的に関する。
典型的には、当該核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、またはウイルスベクター等の任意の好適なベクター中に含まれ得るＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入されて、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進し得るビヒクルを意味する。したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
かかるベクターは、対象への投与時に当該ポリペプチドの発現を引き起こすか、または指示するための制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を含み得る。動物細胞の発現ベクターに使用され得るプロモーターおよびエンハンサーの例には、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ Ｊ Ｏ ｅｔ ａｌ．１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｓ
Ｄ ｅｔ ａｌ．１９８３）等が挙げられる。
動物細胞のいずれの発現ベクターも使用され得る。好適なベクターの例には、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．１９８１）、ｐＳＧ１ベータｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）等が挙げられる。プラスミドの他の代表的な例には、複製起点を含む複製プラスミド、または組み込み型プラスミド、例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等が挙げられる。ウイルスベクターの代表的な例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびＡＡＶベクターが挙げられる。かかる組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクションまたはヘルパープラスミドもしくはウイルスでの過渡的トランスフェクション等の当該技術分野で既知の技法によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ陽性細胞、２９３細胞等が挙げられる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、およびＷＯ９４／１９４７８で見つけることができる。
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染、または形質転換された細胞に関する。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、これにより、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、導入された遺伝子または配列によってコードされる所望の物質、典型的には、タンパク質または酵素を産生するようになる。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容および発現する宿主細胞が「形質転換されている」。
本発明の核酸を使用して、好適な発現系において本発明の組換えポリペプチドを産生することができる。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運搬されて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされたタンパク質の発現に好適な条件下での宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
一般的な発現系には、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターが含まれる。宿主細胞の他の例には、原核細胞（細菌等）および真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）、ならびに初代または樹立哺乳類細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生される）が挙げられる。例としては、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損しているＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇ ｅｔ ａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称される）等も挙げられる。キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性がＹＢ２／０細胞で発現されたときに増強されるため、ＹＢ２／０細胞が好ましい。
本発明は、本発明による本発明の抗体またはポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を産生する方法であって、（ｉ）上述の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞にインビトロまたはエクスビボで導入するステップ、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養するステップ、および（ｉｉｉ）任意に、当該抗体またはポリペプチドを発現および／または分泌する細胞を選択するステップからなるステップを含む、方法にも関する。かかる組換え宿主細胞は、本発明の抗体およびポリペプチドの産生に使用され得る。
別の態様では、本発明は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出、および／または定量化に使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリにおける部分長または全長クローンを特定、単離、または増幅することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトもしくは哺乳類核酸ライブラリから単離されるか、またはさもなければヒトもしくは哺乳類核酸ライブラリ由来のｃＤＮＡと相補的なゲノムもしくはｃＤＮＡ配列である。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは、少なくとも８０％の全長配列、好ましくは、少なくとも８５％または９０％の全長配列、より好ましくは、少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリは、珍しい配列の提示を増加させるために正規化され得る。低または中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、排他的ではなく典型的に、相補的配列と比較して配列同一性が減少した配列に用いられる。中程度および高ストリンジェンシー条件は、任意に、より高い同一性の配列に用いられ得る。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガスまたはパラロガス配列を特定するために用いられ得る。任意に、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションのために用いられ得る核酸配列を包含する。例えば、各々参照により本明細書に全体的に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記参照）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ（上記参照）を参照されたい。
ＩＶ．抗体を産生する方法
本発明の抗体およびその断片、免疫グロブリン、ならびにポリペプチドは、単独でまたは組み合わせでのいずれかでの任意の化学的、生物学的、遺伝的、または酵素的技法等であるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の任意の技法によって産生され得る。
所望の配列のアミノ酸配列を知ることにより、当業者であれば、ポリペプチドを産生するための標準技法によって当該抗体またはポリペプチドを容易に産生することができる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは、製造業者の指示に従って市販のペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）製のもの）を使用して合成され得る。あるいは、本発明の抗体および他のポリペプチドは、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法によって合成され得る。例えば、これらの断片は、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現ベクターへの組み込みおよびかかるベクターの所望のポリペプチドを発現する好適な真核または原核宿主への導入後にＤＮＡ発現産物として得られ得、所望のポリペプチドは、周知の技法を使用して後に単離され得る。
具体的には、本発明はさらに、本発明の抗体またはポリペプチドを産生する方法であって、（ｉ）当該抗体またはポリペプチドの発現を可能にするのに好適な条件下で本発明による形質転換宿主細胞を培養するステップ、および（ｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収するステップからなるステップを含む、方法に関する。
本発明の抗体および他のポリペプチドは、例えば、タンパク質Ａ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から好適に分離される。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いられ得る。例えば、各々参照により本明細書に全体的に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１）、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。
本発明のキメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラまたは非齧歯類－ヒトキメラ）は、前述のようにＶＬおよびＶＨドメインをコードする核配列を得て、それらを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞の発現ベクターに挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによってコーディング配列を発現することによって産生され得る。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインは、ＩｇＧクラスまたはそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４等のヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得る。同様に、ヒトキメラ抗体のＣＬは、カッパクラスまたはラムダクラス等のＩｇに属する任意の領域であり得る。標準の組換えＤＮＡ技法を使用して作製され得るヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって、例えば、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、欧州特許出願第１８４，１８７号（Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．）、欧州特許出願第１７１，４９６号（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．）、欧州特許出願第１７３，４９４号（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０１５３３号（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、欧州特許出願第１２５，０２３号（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２－５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０に記載の方法を使用して産生され得る。
加えて、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されるプロトコル等の標準のプロトコルに従って作製され得る。別の実施形態では、抗体鎖または特異的結合対メンバーは、当該技術分野で既知の技法、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，８７１，９０７号、または同第５，７３３，７４３号に記載の技法を使用して、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能なジェネリックディスプレイパッケージの構成成分との融合物をコードする核酸分子を含むベクターと、単一の結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間の組換えによって産生され得る。本発明のヒト化抗体は、前述のようにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得て、それらを、（ｉ）ヒト抗体と同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞の発現ベクターに挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによって遺伝子を発現することによって産生され得る。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別個のベクター上に存在するタイプのもの、またはこれらの両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデムタイプ）のもののいずれかであり得る。
従来の組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション技法に基づいてヒト化抗体を産生するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９８８、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ Ｓ．ｅｔ ａｌ．１９８５を参照のこと）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリングまたはリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ
Ｇ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野で既知の様々な技法を使用してヒト化され得る。かかる抗体を調製するための一般的な組換えＤＮＡ技術も既知である（欧州特許出願第ＥＰ１２５０２３号および国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７６号を参照のこと）。
同様に、本明細書に記載の二重特異性または多重特異性抗体は、標準の手順に従って作製され得る。例えば、トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性または多重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマによって産生される二重特異性および多重特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号に開示されている。かかる抗体は、化学的手段（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６２８、およびＰｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：３５４）、およびハイブリドーマ技術（Ｓｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：１４５３、およびＳｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ７：２４１）によっても構築され得る。あるいは、かかる抗体は、異なる抗体を作製するハイブリドーマまたは他の細胞を融合させることによってヘテロハイブリドーマを作製し、その後、所望の抗体を産生して共集合させるクローンを特定することによっても生成され得る。それらは、完全免疫グロブリン鎖またはＦａｂおよびＦｖ配列等のその一部の化学的または遺伝的コンジュゲーションによっても生成され得る。抗体成分は、本明細書に記載の１つ以上の免疫阻害性バイオマーカーを含む、本発明の１つ以上のバイオマーカーのポリペプチドまたはその断片に結合することができる。
加えて、抗体断片を産生するための方法が周知である。例えば、本発明のＦａｂ断片は、ヒトＨＨＬＡ２と特異的に反応する抗体（例えば、ｍＡｂ ８Ａ１２、ならびにポリクローナル抗体１．２および２．２）をパパイン等のプロテアーゼで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核発現系または真核発現系のベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物（適切な場合）に導入してＦａｂを発現させることによって産生され得る。
同様に、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、ＨＨＬＡ２と特異的に反応する抗体をプロテアーゼ（ペプシン）で処理することによって得られ得る。また、Ｆ（ａｂ’）２断片は、チオエーテル結合またはジスルフィド結合により以下に記載のＦａｂ’に結合することによって産生され得る。
本発明のＦａｂ’断片は、ヒトＨＨＬＡ２と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトールで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂ’断片は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物の発現ベクターまたは真核生物の発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物（適切な場合）に導入してそれを発現させることによって産生され得る。
加えて、本発明のｓｃＦｖは、前述のようにＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核生物の発現ベクターまたは真核生物の発現ベクターに挿入し、その後、その発現ベクターを原核生物または真核生物（適切な場合）に導入してｓｃＦｖを発現させることによって産生され得る。ヒト化ｓｃＦｖ断片を生成するために、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択することと、それらを、既知の三次元構造を有するヒトｓｃＦｖ断片フレームワークにグラフトすることとを含む、ＣＤＲグラフティングと呼ばれる周知の技術が使用され得る（例えば、ＷＯ９８／４５３２２、ＷＯ８７／０２６７１、米国特許第５，８５９，２０５号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第４，８１６，５６７号、ＥＰ０１７３４９４を参照のこと）。
Ｖ．抗体、免疫グロブリン、およびポリペプチドの修飾
本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。ヒト化抗体が非ヒト動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬ内のＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに単にグラフトすることによって産生された場合、抗原結合活性が非ヒト動物に由来する元の抗体と比較して減少することが知られている。ＣＤＲ内のみならずＦＲ内の非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのいくつかのアミノ酸残基が抗原結合活性に直接または間接的に関連するとみなされる。したがって、これらのアミノ酸残基の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基での置換により、結合活性が減少し、アミノ酸を、非ヒト動物に由来する元の抗体のアミノ酸残基で置き換えることによって補正され得る。
修飾および変化が本発明の抗体の構造およびそれらをコードするＤＮＡ配列になされ得、望ましい特徴を有する抗体およびポリペプチドをコードする機能的分子を依然として得ることができる。例えば、ある特定のアミノ酸は、活性の認識可能な損失なしにタンパク質構造における他のアミノ酸によって置換され得る。タンパク質の相互作用的能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を定義するため、ある特定のアミノ酸置換が、タンパク質配列に、ひいては言うまでもなくそのＤＮＡコード配列になされ得、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることもできる。したがって、様々な変化が、それらの生物学的活性の認識可能な損失なしに、本発明の抗体配列または当該ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列になされ得ることが企図される。
一実施形態では、アミノ酸変化は、ＤＮＡ配列内のコドンを変化させて、遺伝子コードの保存に基づいて保存的置換をコードすることによって達成され得る。具体的には、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝子コード（以下に示される）によって定義されるタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝子コード（上記の遺伝子コード図表を参照のこと）によって定義される核酸によってコードされるアミノ酸配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。
上述のように、遺伝子コードの重要な周知の特徴は、その冗長性であり、それにより、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の大半には、１つより多くのコーディングヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上で例証される）。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。かかるヌクレオチド配列は、全ての生物における同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ある特定の生物はいくつかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳し得るが）、機能的に同等であるとみなされる。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見られ得る。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
ポリペプチドのアミノ配列を変化させる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。相互作用的生物学的機能をタンパク質に付与する際の疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、当該技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的疎水性親水性特性が、結果として生じたタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、タンパク質と、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を定義することが認められている。各アミノ酸には、それらの疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられており、それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、トレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパラギン酸（＜ＲＴＩ ３．５）、アスパラギン（－３．５）、リジン（－３．９）、およびアルギニン（－４．５）である。
ある特定のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換されてもよく、同様の生物学的活性を有するタンパク質が依然としてもたらされる、すなわち、機能的に同等の生物学的タンパク質が依然として得られることが当該技術分野で既知である。
したがって、上で概説されるように、アミノ酸置換は、一般に、置換基のアミノ酸側鎖の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づいている。前述の様々な特性を考慮した例示の置換が当業者に周知であり、これらには、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。
本発明の抗体のアミノ酸修飾の別のタイプが、例えば、安定性を増加させるための抗体の元のグリコシル化パターンを改変させる際に有用であり得る。「改変させる」とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合であり得る。「Ｎ結合」とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位について）上に記載されるトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。共有結合的修飾の別のタイプは、グリコシドを抗体に化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に応じて、糖（複数可）が、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合していてもよい。例えば、かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
同様に、抗体上に存在するいずれの炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理により、抗体をインタクトに保った状態で、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除く大半または全ての糖の切断がもたらされる。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ Ｈ．ｅｔ
ａｌ．（１９８７）およびＥｄｇｅ，Ａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって説明されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，Ｎ Ｒ．ｅｔ
ａｌ．（１９８７）によって説明される様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
他の修飾は、イムノコンジュゲートの形成を含み得る。例えば、１つのタイプの共有結合的修飾では、抗体またはタンパク質が、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン等の様々な非タンパク質性ポリマーのうちの１つに共有結合的に連結される。
本発明の抗体または他のタンパク質の異種薬剤とのコンジュゲーションは、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６ジイソシアネート等）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）を含むが、これらに限定されない、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して行われ得る。例えば、炭素標識１－イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示のキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
別の態様では、本発明は、細胞毒素、薬物、および／または放射性同位体等の治療的部分にコンジュゲートされたＨＨＬＡ２に特異的に結合する抗体を特色とする。細胞毒素にコンジュゲートされると、これらの抗体コンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性薬剤には、細胞に有害な（例えば、細胞を死滅させる）任意の薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療薬には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、放射性同位体、例えば、放射性ヨウ素にコンジュゲートされて、がん等の関連障害を治療するための細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。
コンジュゲートされた抗ＨＨＬＡ２抗体を使用して、臨床試験手順の一環として組織中のポリペプチドレベルを診断的または予後的に監視して、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するか、または免疫療法に応答する可能性が最も高い患者を選択することができる。例えば、細胞がフローサイトメトリーアッセイで透過処理されて、ＨＨＬＡ２に結合する抗体（ｍＡｂ ８Ａ１２およびポリクローナル抗体１．２および２．２等）にその認識された細胞内エピトープを標的とさせ、コンジュゲートされた分子から発せられるシグナルを分析することによって結合の検出を可能にすることができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによって促進され得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。本明細書で使用される場合、抗体に関して「標識される」という用語は、検出可能な物質、例えば、放射性薬剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体の直接標識、ならびに検出可能な物質との反応による抗体の間接的標識を包含するよう意図されている。
本発明の抗体コンジュゲートを使用して、所与の生物学的応答を修飾することができる。治療的部分が古典的な化学的治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素またはその活性断片（アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素等）、タンパク質（腫瘍壊死因子またはインターフェロン－ガンマ等）、または生物学的応答修飾因子（例えば、リンフォカイン、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、または他のサイトカインもしくは成長因子等）が含まれ得る。
かかる治療的部分を抗体にコンジュゲートするための技法が周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３ ５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３ ５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５ ５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ
Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３ １６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９ ５８（１９８２）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、細胞における細胞毒性薬剤または成長阻害剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」を使用して行われ得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照のこと）が使用され得る。あるいは、抗体および細胞毒性薬剤または成長阻害剤を含む融合タンパク質が組換え技法またはペプチド合成によって作製され得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されているかのいずれかのコンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含み得る。
ＶＩ．本発明の使用および方法
本明細書に記載の本発明の抗ＨＨＬＡ２抗体、免疫グロブリン、ポリペプチド、および核酸は、ＨＨＬＡ２レベルの検出に基づく多数の予測的医薬アッセイ（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験の監視）で使用され得、いくつかの実施形態では、単独で、または毒性化合物もしくは他の治療薬にコンジュゲートされたときに、治療目的（例えば、治療的および予防的）に有用であり得る。本明細書で使用される「検出」という用語は、対照の参照を伴うまたは伴わない質的および／または量的検出（レベルの測定）を含む。本明細書に記載されるように、本発明のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片は、以下の活性：１）ＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等のその天然結合パートナー（複数可）に結合し、かつまたはその活性を調節すること、２）共免疫阻害性シグナル伝達等の細胞内または細胞間シグナル伝達を調節すること、３）リンパ球の活性化および／または増殖を調節すること、４）生物、例えば、マウス、非齧歯類動物、またはヒト等の哺乳類生物の免疫応答を調節すること、および５）免疫細胞アネルギーを調節することのうちの１つ以上を有する。
したがって、本発明の一態様は、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、または組織）との関連でＨＨＬＡ２ポリペプチドレベルを決定し、それにより、試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドレベルを決定し、個体が障害に罹患しているかを決定し、かつ／またはかかるＨＨＬＡ２レベルによって示されるかかる障害の状態を決定するための診断アッセイに関する。例えば、本発明の抗体は、ＨＨＬＡ２に関連するがん疾患の病期分類に有用である。
本発明は、個体がかかる障害を発症する危険性があるかを決定するための予後（または予測的）アッセイも提供する。本発明の別の態様は、臨床試験におけるＨＨＬＡ２の発現または活性への薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響の監視に関する。
本発明は、ＨＨＬＡ２シグナルを伝達する薬剤を特定するための手段としてＨＨＬＡ２の検出も提供する。ＨＨＬＡ２シグナルを伝達する薬剤は、免疫応答を減弱させ、自己免疫疾患、喘息、および耐性の確立に有用であり得る。
本明細書に記載のいずれの方法においても、ＨＨＬＡ２は、単独で、または他の免疫チェックポイントおよび／もしくは共刺激分子等の他の分子の発現と組み合わせて検出され得る。いくつかの分子のコンビナトリアル検出（例えば、順次または同時）は、治療的介入の相乗作用および／または障害亜型の個別化された高分解能診断に関する有用な情報を提供し得る。いくつかの実施形態では、ＨＨＬＡ２は、もう１つのマーカーでコンビナトリアル的に検出される。
１．診断アッセイ
本発明は、生体試料が細胞制限ＨＨＬＡ２を発現するか、かつ／または細胞制限ＨＨＬＡ２レベルが調節される（例えば、上方制御または下方制御される）かを正確に分類し、それにより、がん等の目的とする障害の状態を示すための方法、システム、およびコードを部分的に提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、統計的アルゴリズムおよび／または経験的データ（例えば、ＨＨＬＡ２の存在、不在、またはレベル）を使用してＨＨＬＡ２によって媒介されるがんまたはその亜型に関連するか、またはその危険性があるものとして試料（例えば、対象由来の）を分類する際に有用である。
ＨＨＬＡ２またはその断片のレベルを検出するための例示の方法であって、それ故に、試料がＨＨＬＡ２またはその臨床亜型の異常な発現（例えば、上方制御または下方制御）によって媒介される疾患または障害に関連するかの分類に有用である、方法は、生体試料を試験対象から得ることと、ＨＨＬＡ２レベルが生体試料中で検出されるように、生体試料を、ＨＨＬＡ２を検出することができる本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させることとを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片が使用され、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のかかる抗体または抗体断片が組み合わせで（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡで）または順次に使用され得る。ある特定の例では、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。例えば、単一の学習統計的分類子システムは、予測値または確率値およびＨＨＬＡ２の存在またはレベルに基づいて試料をＨＨＬＡ２試料として分類するために使用され得る。単一の学習統計的分類子システムの使用により、典型的には、試料が、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の感受性、特異性、陽性予測値、陰性予測値、および／または全体精度を有するＨＨＬＡ２試料として分類される。
他の好適な統計的アルゴリズムが当業者に周知である。例えば、学習統計的分類子システムは、複雑なデータセット（例えば、目的とするマーカーのパネル）に適合し、かかるデータセットに基づいて決定することができる機械学習アルゴリズム技法を含む。いくつかの実施形態では、分類ツリー（例えば、ランダムフォレスト）等の単一の学習統計的分類子システムが使用される。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の学習統計的分類子システムの組み合わせが、好ましくは直列で使用される。学習統計的分類子システムの例には、帰納的学習（例えば、ランダムフォレスト、分類および回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）、ブーストツリー等の決定／分類ツリー）、確率的に近似的に正しい（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロン等のパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの適用、信念ネットワークにおけるベイズ学習等）、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習、および時間差学習等の既知の環境における受動的学習、未知の環境における受動的学習、未知の環境における能動的学習、学習行動値関数、強化学習の適用等）、ならびに遺伝的アルゴリズムおよび進化的プログラミングを使用したものが挙げられるが、これらに限定されない。他の学習統計的分類子システムは、サポートベクトルマシン（例えば、カーネル法）、多変量適応型回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ・マーカートアルゴリズム、ガウス・ニュートンアルゴリズム、ガウスの混合（ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）、勾配降下アルゴリズム、および学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＨＬＡ２試料分類結果を臨床医、例えば、組織病理学者または腫瘍学者に送信することをさらに含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、個体がＨＨＬＡ２に関連する状態または障害を有する確率の形態で診断をさらに提供する。例えば、個体は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上のその状態または障害を有する確率を有し得る。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、個体における状態または障害の予後をさらに提供する。いくつかの事例では、試料をＨＨＬＡ２試料として分類する方法は、試料が得られる個体の症状（例えば、臨床的因子）にさらに基づいている。症状または症状の群は、例えば、リンパ球数、白血球数、赤血球沈降速度、下痢、腹痛、痙攣、発熱、貧血、体重減少、不安、うつ、およびそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ＨＨＬＡ２に関連する状態または障害を有する個体の診断に続いて、個体に、その状態または障害に関連する１つ以上の症状の治療に有用な薬物（例えば、化学療法剤）の治療有効量が投与される。
一実施形態では、本方法は、対照生体試料（例えば、ＨＨＬＡ２によって媒介される状態または障害を有しない対象由来の生体試料）、ＨＨＬＡ２によって媒介される状態または障害の寛解中またはそれを発症した後の対象由来の生体試料、またはＨＨＬＡ２によって媒介される状態または障害を発症する治療中の対象由来の生体試料を得ることをさらに含む。
ＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片の存在または不在を検出するための例示の方法は、ＨＨＬＡ２ポリペプチドに結合することができる本発明の抗体またはその断片、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。かかる薬剤が標識され得る。抗体に関して「標識される」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含するよう意図されている。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出が挙げられる。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および血清等の生体液、ならびに対象に存在する組織、細胞、および体液を含むよう意図されている。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生体試料中のＨＨＬＡ２またはその断片をインビトロで、かつインビボで検出することができる。ＨＨＬＡ２ポリペプチドの検出のためのインビトロ技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学（ＩＨＣ）、細胞内フローサイトメトリーおよび関連技法、ならびに免疫蛍光が含まれる。さらに、ＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片の検出のためのインビボ技法には、対象に標識された抗ＨＨＬＡ２抗体を導入することが含まれる。例えば、本抗体は、放射性、発光、蛍光、または他の同様のマーカーで標識され得、対象におけるその存在および位置が、標準の画像技法によって単独で、または細胞型マーカー（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞マーカー）等の他の分子の画像法と組み合わせてのいずれかで検出され得る。
一実施形態では、生体試料は、試験対象由来のポリペプチド分子を含有する。好ましい生体試料は、従来の手段によって対象から単離される血清、腫瘍微小環境、腫瘍周辺、または腫瘍内である。
別の実施形態では、本方法は、対照対象から対照生体試料を得ることと、ＨＨＬＡ２ポリペプチドもしくはその断片の存在が生体試料中で検出されるように、対照試料を、化合物またはＨＨＬＡ２ポリペプチドもしくはその断片を検出することができる薬剤と接触させることと、対照試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドもしくはその断片の存在を、試験試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドもしくはその断片の存在と比較することとをさらに含む。
なお他の実施形態では、本抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにおける抗体の使用のための構成要素またはデバイスと関連付けられる。非限定的な例には、これらのアッセイで使用するために固体表面上に固定化された（例えば、上述のように光または放射線放出に基づいて検出可能な標識に連結および／またはコンジュゲートされた）抗体が挙げられる。他の実施形態では、本抗体は、免疫クロマトグラフィーアッセイまたは免疫化学的アッセイ、例えば、「サンドイッチ」または競合的アッセイ、免疫組織化学、免疫蛍光顕微鏡法等の使用によるＨＨＬＡ２の検出のためのデバイスまたは条片と関連付けられる。かかるデバイスまたは条片の追加の例は、自宅での検査または迅速な臨床現場即時検査用に設計されたものである。さらなる例には、単一試料中の複数の分析物の同時分析用に設計されたものが挙げられる。例えば、本発明の非標識抗体は、生体試料中の「捕捉」ＨＨＬＡ２ポリペプチドに適用され得、捕捉された（または固定化された）ＨＨＬＡ２ポリペプチドは、検出のために本発明の抗ＨＨＬＡ２抗体の標識形態に結合し得る。例えば、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫組織病理学、免疫組織化学、および組織病理学に基づくアッセイを含む免疫アッセイの他の標準の実施形態が当業者に周知である。
２．予後アッセイ
さらに、本明細書に記載の診断法は、ＨＨＬＡ２に関連する障害を有するか、またはそれを発症する危険性のある対象を特定するために利用され得る。本明細書で使用される場合、「異常な」という用語は、正常なＨＨＬＡ２レベルから逸脱するＨＨＬＡ２上方制御または下方制御を含む。異常な発現または活性には、増加または減少した発現または活性、ならびに正常な発現発生パターンまたは細胞内発現パターンに従わない発現または活性が含まれる。例えば、異常なＨＨＬＡ２レベルは、ＨＨＬＡ２遺伝子もしくは制御配列の突然変異またはその染色体ＨＨＬＡ２遺伝子の増幅によりＨＨＬＡ２の上方制御または下方制御が引き起こされる場合を含むよう意図されている。本明細書で使用される場合、「望ましくない」という用語は、免疫細胞活性化等の生物学的応答に関与する望ましくない現象を含む。例えば、望ましくないという用語は、対象において望ましくないＨＨＬＡ２を含む。
実施例でさらに説明されるように、ＨＨＬＡ２に関連する多くの障害が当業者に既知である。ＨＨＬＡ２は、選択リンパ性悪性疾患、ウイルス誘導性がん、および多くの固形腫瘍を含む複数の腫瘍タイプによって発現される。一般に、ＨＨＬＡ２は、それを必要とする状態に対する強力な免疫応答を阻害する免疫チェックポイント制御因子を活性化するため、予後不良マーカーである。しかしながら、いくつかの障害、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患等を治療する際に免疫応答を下方制御するために免疫阻害が所望される。
前述の診断アッセイまたは以下のアッセイ等の本明細書に記載のアッセイを利用して、ＨＨＬＡ２活性化の誤制御に関連する障害を有するか、またはそれを発症する危険性のある対象を特定することができる。したがって、本発明は、異常なまたは望ましくないＨＨＬＡ２活性化に関連する障害を特定するための方法を提供し、本方法において、試験試料が対象から得られ、ＨＨＬＡ２が検出され、ＨＨＬＡ２ポリペプチドの存在が、異常なまたは望ましくないＨＨＬＡ２活性に関連する障害を有するか、またはそれを発症する危険性のある対象の診断に用いられる。本明細書で使用される場合、「試験試料」は、目的とする対象から得られた生体試料を指す。例えば、試験試料は、生体液（例えば、脳脊髄液または血清）、細胞試料、または組織、例えば、腫瘍微小環境、腫瘍周辺領域、および／または腫瘍内領域の組織病理学的スライドであり得る。好ましい実施形態では、試料は、成熟膜結合型ＨＨＬＡ２および／またはＨＨＬＡ２断片を発現する細胞を含む。
さらに、本明細書に記載の予後アッセイを使用して、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補）が対象に投与されて、異常なまたは望ましくないＨＨＬＡ２活性に関連するかかる障害を治療することができるかを決定することができる。例えば、かかる方法を使用して、対象が１つの薬剤または薬剤の組み合わせで有効に治療され得るかを決定することができる。したがって、本発明は、対象が、異常なまたは望ましくないＨＨＬＡ２活性化に関連する障害を治療するための１つ以上の薬剤で有効に治療され得るかを決定するための方法を提供し、本方法において、試験試料が得られ、ＨＨＬＡ２が検出される（例えば、ＨＨＬＡ２ポリペプチドの存在量が、異常なまたは望ましくないＨＨＬＡ２活性化に関連する障害を治療するための薬剤を投与される対象の診断に用いられる）。
本明細書に記載の方法は、例えば、ＨＨＬＡ２を伴う疾患または疾病の症状または家族歴を呈する患者を診断するための臨床状況において好都合に使用され得る、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体試薬を含む予めパッケージングされた診断キットを利用することによって行われ得る。
さらに、ＨＨＬＡ２が発現される任意の細胞型または組織が本明細書に記載の予後アッセイで利用され得る。
本発明の別の態様は、異常なＨＨＬＡ２活性化に関連する障害を有する個体由来の生体試料中のＨＨＬＡ２が分析され、その情報が好ましくは同様の年齢および人種の対照（例えば、その障害を有しない個体であり、対照は、「健常」もしくは「正常」個体とも称され得るか、または所与の経時的研究における初期の時点のもの）と比較される、関連および／または層別化分析のための本明細書に記載の組成物および方法の使用を含む。患者および対照の適切な選択は、関連および／または層別化研究の成功に重要である。したがって、十分に特徴付けられた表現型を有する個体のプールが非常に望ましい。疾患診断、疾患素因スクリーニング、疾患予後、薬物応答性決定（薬理ゲノミクス）、薬物毒性スクリーニング等の基準が本明細書に記載される。
遺伝的関連および／または層別化研究のための異なる研究設計が使用され得る（Ｍｏｄｅｒｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９８），６０９－６２２）。患者の応答が干渉されない観察的研究が最も頻繁に行われている。観察的研究の第１のタイプは、疾患の疑わしい原因が存在するヒトの試料および疑わしい原因が存在しないヒトの別の試料を特定し、その後、２つの試料における疾患の発症頻度が比較される。これらの試料採取された集団はコホートと呼ばれ、この研究は前向き研究である。観察的研究の他のタイプは、症例対照研究または後向き研究である。典型的な症例対照研究では、試料は、疾患のある特定の兆候等の目的とする表現型を有する個体（症例）および結論が導き出される集団（標的集団）におけるその表現型を有しない個体（対照）から収集される。その後、疾患の考えられる原因が後向きに調査される。症例対照研究における試料収集時間および費用が前向き研究よりも大幅に下回るため、症例対照研究は、少なくとも探査および発見段階中の遺伝的関連研究におけるより一般に使用されている研究設計である。
全ての関連表現型および／または遺伝子型情報が得られた後、個体の表現型特性を有する対立遺伝子または遺伝子型の存在間に有意な相関関係が存在するかを決定するための統計的分析が行われる。好ましくは、データの検査および整理が最初に行われ、その後、遺伝的関連のための統計的検定が行われる。試料の疫学的および臨床データが当該技術分野で周知の表およびグラフを用いて記述統計学によって要約され得る。好ましくは、データ完成、一貫性のないエントリ、および外れ値を確認するためのデータ検証が行われる。その後、それぞれ、離散変数および連続変数について症例と対照との間の有意差を確認するためのカイ二乗検定およびｔ－検定（分布が正規分布ではない場合、ウィルコクソンの順位和検定）が使用され得る。
遺伝的関連検定を行う際の重要な決定は、有意レベルの決定であり、それらの検定のｐ値がそのレベルに達したときに有意な関連が断言され得る。陽性ヒットがその後の確証検定で追跡される予備的分析では、例えば、０．２（寛大な有意レベル）未満の未調整ｐ値が、ＨＨＬＡ２レベルの疾患のある特定の表現型特性との有意な関連のための仮説を生み出すために使用され得る。０．０５（当該技術分野で伝統的に使用されている有意レベル）未満のｐ値が疾患との関連を有するとみなされるようにそのレベルが達成されることが好ましい。ヒットが同じ源由来のより多くの試料または異なる源由来の異なる試料における確証的分析で追跡されるとき、複数の検定の調整が、実験ワイズエラー率を０．０５で維持しながら過剰なヒット数を回避するように行われる。複数の検定を調整して異なる種類のエラー率を制御するための異なる方法が存在する一方で、一般に使用されているが、むしろ保守的な方法は、実験ワイズまたはファミリーワイズエラー率を制御するためのボンフェローニ補正である（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｓ，Ｗｅｓｔｆａｌｌ ｅｔ ａｌ，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９９））。偽発見率（ＦＤＲ）を制御するための並べ替え検定がより有力であり得る（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ ５７，１２８９－１３００，１９９５、Ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ－ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｗｅｓｔｆａｌｌ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｗｉｌｅｙ（１９９３））。これらの検定が依存的であり、実験ワイズエラー率の制御とは対照的に偽発見率の制御が十分である場合に、多重度を制御するためのかかる方法が好ましいであろう。
個々の遺伝的または非遺伝的危険因子が疾患の素因になることが見出されると、分類／予測スキームが設定されて、個体の表現型および／または遺伝子型ならびに他の非遺伝的危険因子に応じて個体が属するカテゴリー（例えば、疾患または非疾患）を予測することができる。離散形質のロジスティック回帰および連続形質の線形回帰が、かかる課題のための標準の技法である（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｄｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｗｉｌｅｙ（１９９８））。さらに、他の技法も分類を設定するために使用され得る。かかる技法には、ＭＡＲＴ、ＣＡＲＴ、ニューラルネットワーク、および異なる方法の性能の比較における使用に好適な判別分析が含まれるが、これらに限定されない（Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｈａｓｔｉｅ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ＆Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００２））。
３．臨床試験中の効果の監視
薬剤（例えば、化合物、薬物、または小分子）のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片への影響（例えば、細胞増殖および／または遊走の調節）の監視は、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験でも適用され得る。例えば、ＨＨＬＡ２遺伝子発現を減少させるか、ポリペプチドレベルを減少させるか、またはＨＨＬＡ２活性を下方制御するための本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の有効性は、減少したＨＨＬＡ２遺伝子発現、減少したポリペプチドレベル、または下方制御されたＨＨＬＡ２活性を呈する対象の臨床試験で監視され得るか、または本明細書に記載の抗ＨＨＬＡ２抗体または断片によって検出可能な減少したＨＨＬＡ２発現を呈する対象の臨床試験で監視され得る。かかる臨床試験では、ＨＨＬＡ２遺伝子の発現もしくは活性および／または目的とする障害の症状もしくはマーカーが、特定の細胞、組織、または系の表現型の「読み出し」またはマーカーとして使用され得る。同様に、ＨＨＬＡ２遺伝子発現を増加させるか、ポリペプチドレベルを増加させるか、またはＨＨＬＡ２活性を増加させるための本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の有効性は、増加したＨＨＬＡ２遺伝子発現、増加したポリペプチドレベル、または増加したＨＨＬＡ２活性を呈する対象の臨床試験で監視され得るか、または本明細書に記載の抗ＨＨＬＡ２抗体または断片によって検出可能な増加したＨＨＬＡ２を呈する対象の臨床試験で監視され得る。かかる臨床試験では、ＨＨＬＡ２遺伝子の発現もしくは活性および／または目的とする障害の症状もしくはマーカーが、自己免疫障害等の特定の細胞、組織、または系の表現型の「読み出し」またはマーカーとして使用され得る。
例であって、限定するものではなく、ＨＨＬＡ２活性（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイで特定された）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物、または小分子）での処理によって細胞内で調節されるＨＨＬＡ２を含む遺伝子が特定され得る。したがって、例えば、臨床試験において、異常なＨＨＬＡ２活性化に関連する障害への薬剤の効果を研究するために、細胞が単離され、核酸および／またはタンパク質が調製され、異常なＨＨＬＡ２活性化に関連する障害に関与するＨＨＬＡ２および／または他の遺伝子のレベルについて分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、産生されるポリペプチドの量を測定することによって、本明細書に記載の方法のうちの１つによって、またはＨＨＬＡ２または他の遺伝子のレベルを測定することによって分析される。この方法で、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての機能を果たし得る。したがって、この応答状態は、薬剤での個体の治療前およびその治療中の様々な時点で決定され得る。
好ましい実施形態では、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、または本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって特定される他の薬物候補）での対象の治療の有効性を監視するための方法であって、（ｉ）薬剤の投与前に対象から投与前試料を得るステップと、（ｉｉ）投与前試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片のレベルを検出するステップと、（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試料を得るステップと、（ｉｖ）投与後試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片のレベルを検出するステップと、（ｖ）投与前試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片のレベルを、投与後試料（複数可）中のＨＨＬＡ２ポリペプチドと比較するステップと、（ｖｉ）対象への薬剤の投与を適宜に変更するステップとを含む、方法を提供する。例えば、薬剤の増加した投与は、ＨＨＬＡ２を検出されたレベルよりも低いレベルに低下させる、すなわち、薬剤の有効性を高めるのに望ましくあり得る。かかる実施形態に従って、ＨＨＬＡ２は、観察可能な表現型応答の不在下でさえも薬剤の有効性の指標として使用され得る。同様に、免疫組織化学（ＩＨＣ）等によるＨＨＬＡ２分析を使用して、１つ以上の免疫チェックポイントを阻害するためのＨＨＬＡ２免疫療法を受ける患者を選択することもできる。本明細書に記載されるように、腫瘍がＨＨＬＡ２活性化を有する患者は、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ免疫療法に応答する可能性が高い。この免疫療法により、免疫活性化が最初にもたらされ、活性化Ｔ細胞がＩＦＮ－ガンマを発現し、次いで、ＨＨＬＡ２活性化を上方制御する。通常、これにより、ＨＨＬＡ２の会合および免疫応答の下方制御がもたらされるが、ＨＨＬＡ２が本明細書に記載の抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂによって遮断され得るため、免疫応答は腫瘍等の所望の状態が排除されるまで継続する。対照的に、ＨＨＬＡ２を介して活発にシグナル伝達するｍＡｂは、免疫応答を直接下方制御する。
４．治療的方法および使用
いくつかの実施形態では、本発明の抗体、断片、またはイムノコンジュゲート（例えば、抗ＨＨＬＡ２抗体のみ、または治療的部分にコンジュゲートされたもの）は、異常なまたは望ましくないＨＨＬＡ２活性化に関連する任意の障害（例えば、がん）の治療に有用である。ある特定の実施形態では、治療は、ヒト等の哺乳動物のものである。本発明のかかる抗体は、目的とする障害を治療するために、単独で、または任意の好適な薬剤もしくは適切な療法と組み合わせて使用され得る。例えば、ＨＨＬＡ２および別の免疫チェックポイントまたは共刺激分子を含む細胞を治療したときに治療的相乗作用が現れるようになると考えられる。
治療用モノクローナル抗体が、その抗体によって特異的に認識される抗原を細胞外に有する細胞の枯渇をもたらし得ることが周知である。この枯渇は、少なくとも３つの機構：抗体媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性溶解、および抗体によって標的とされる抗原を介して伝達されるシグナルによる腫瘍成長の直接抗腫瘍阻害によって媒介され得る。
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１の成分の、それらの同族抗原に結合している抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）に記載のＣＤＣアッセイが行われ得る。
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌抗体により、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、標的細胞を死滅させることが可能になる細胞毒性の形態を指す。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。当該技術分野で周知のように、Ｆｃ部分は、Ｆｃ受容体との所望の相互作用を達成するか、またはそれを欠くように操作され得る。
細胞内標的の抗体媒介性結合、中和、および／または調節のために、ある特定の修飾がなされ得る。本明細書に記載されるように、ｓＦｖおよびＦａｂ等のある特定の抗体型式が、抗体様分子の細胞内発現に適している。特定の経路で抗原または分子に対抗する、核、ＥＲ、細胞質、ゴルジ、原形質膜、ミトコンドリアを含む細胞の異なるコンパートメントにおける発現を標的とするためのかかる適合抗体様分子を作製および使用するための方法が周知である（少なくとも、米国特許公開第２００８／０２３３１１０号および同第２００３／０１０４４０２号、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８８９－７８９３、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：５９５－６０１、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：５９３２－５９３６、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２－１５５１、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１－１５、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３１３７－３１４１、およびＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１３１５－１３２４を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「細胞内免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する分泌免疫グロブリンと同じであるが、合成後に細胞内に残存する完全免疫グロブリンである。「細胞内免疫グロブリン断片」とは、細胞内免疫グロブリン分子の一本鎖断片を含む任意の断片を指す。したがって、細胞内免疫グロブリン分子またはその断片は、細胞の外面で分泌または発現されない。一本鎖細胞内免疫グロブリン断片は、本明細書で「一本鎖免疫グロブリン」と称される。本明細書で使用される場合、「細胞内免疫グロブリン分子またはその断片」という用語は、「細胞内免疫グロブリン」、「一本鎖細胞内免疫グロブリン」（またはその断片）、「細胞内免疫グロブリン断片」、「細胞内抗体」（またはその断片）、および「イントラボディ」（またはその断片）を包含すると理解される。したがって、「細胞内免疫グロブリン」、「細胞内Ｉｇ」、「細胞内抗体」、および「イントラボディ」という用語は、本明細書で同義に使用され得、全て「細胞内免疫グロブリン分子またはその断片」の一般的定義によって包含される。本発明の細胞内免疫グロブリン分子またはその断片は、いくつかの実施形態では、２つ以上のサブユニットポリペプチド、例えば、「第１の細胞内免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」および「第２の細胞内免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」を含み得る。しかしながら、他の実施形態では、細胞内免疫グロブリンは、単一のポリペプチドのみを含む「一本鎖細胞内免疫グロブリン」であり得る。本明細書で使用される場合、「一本鎖細胞内免疫グロブリン」は、所望の活性、例えば、抗原への細胞内結合を有する任意の単位断片として定義される。したがって、一本鎖細胞内免疫グロブリンは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含むもの、ならびに抗原に結合する単一の可変領域、例えば、本明細書に記載の「ラクダ化」重鎖可変領域のみを有する一本鎖細胞内免疫グロブリンを包含する。細胞内免疫グロブリンまたはＩｇ断片は、細胞内の実質的に任意の場所で、例えば、細胞質内、細胞膜の内面上、または核、ゴルジ、小胞体、エンドソーム、ミトコンドリア等の細胞内コンパートメント（細胞サブコンパートメントまたは細胞コンパートメントとも称される）内で発現され得る。さらなる細胞サブコンパートメントには、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で周知のものが含まれる。
かかる細胞内免疫グロブリンは、標的とされる抗原を含むレシピエント細胞または宿主細胞で発現される。本発明の宿主細胞は、好ましくは、真核細胞もしくは細胞株、好ましくは、植物、動物、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、マウス、霊長類、またはヒト細胞もしくは細胞株である。
理論によって束縛されることなく、本明細書に記載の免疫グロブリンポリペプチドの細胞内発現により、ＨＨＬＡ２の細胞内標的およびそれへの結合が可能になり、それにより、例えば、阻害性受容体への結合による活性化時にシグナル伝達を伝播するその能力を調節すること等によってシグナル伝達する分子の能力を立体的に調節し、かつ／または複数のＨＨＬＡ２分子の局所有効濃度の増加時にシグナル伝達を調節すると考えられる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、前述の成長阻害剤、細胞毒性薬剤、またはプロドラッグ活性化酵素等の治療的部分にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、当該成長阻害剤、細胞毒性薬剤、またはプロドラッグの、所望のＨＨＬＡ２量を過小または過剰発現する細胞への標的に有用であり得る。
したがって、本発明の目的は、異常なＨＨＬＡ２活性化に関連する障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体、断片、またはイムノコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法に関する。
あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫応答の上方制御に関する診断、予後、および予防用途に加えて、治療的用途に有用である。免疫応答の上方制御は、既存の免疫応答を増強する形態または初期免疫応答を誘発する形態であり得る。例えば、主題の組成物および方法を使用した免疫応答の増強は、がんおよび微生物（例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫）感染に対する免疫学的防御を改善する場合に有用である。例えば、本明細書に記載の免疫応答機能の上方制御または増強は、腫瘍免疫の誘導に有用である。
別の実施形態では、免疫応答は、既存の耐性、クローン欠失、および／または疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）が克服されるように、本明細書に記載の方法によって刺激され得る。例えば、対象が有意な免疫応答を開始することができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原等の自己抗原に対する免疫応答は、免疫応答を上方制御する本明細書に記載の適切な薬剤を投与することによって誘導され得る。一実施形態では、腫瘍特異的抗原等の自己抗原が同時投与され得る。別の実施形態では、免疫応答は、神経学的障害を治療するための抗原（例えば、自己抗原）に対して刺激され得る。別の実施形態では、主題の薬剤は、能動免疫化の過程で外来抗原に対する応答を高めるためのアジュバントとして使用され得る。
ある特定の例では、免疫応答をさらに増強するために、免疫応答を上方制御する他の薬剤、例えば、共刺激受容体を介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーメンバーの形態をさらに投与することが望ましくあり得る。また、免疫応答を上方制御する薬剤が様々なポリペプチド（例えば、病原体に由来するポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に使用され得る。病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫は、適切なアジュバントにおいて免疫応答を上方制御する薬剤とともにウイルスタンパク質をワクチン接種することによって誘導され得る。
あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の抗体および抗原結合断片は、診断、予後、および予防用途に加えて、免疫反応を上方制御する疾患、例えば、喘息、自己免疫疾患（糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性紅斑性狼瘡、慢性リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫無塩酸症（ａｃｈｌｏｒｈｙｄｒａ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存性糖尿病、ランバート・イートン症候群、ルポイド肝炎、いくつかのリンパ球減少症例、混合結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発性動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（またはクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺機能亢進症、Ｂ型インスリン抵抗性、潰瘍性大腸炎、およびヴェグナー肉芽腫症）を抑制するための治療的用途（疾患の治療およびその発症または進行の遅延等）に有用である。
同様に、本発明の抗体および抗原結合断片は、診断、予後、および予防用途に加えて、持続する感染性疾患（例えば、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２）、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２、ならびにインフルエンザウイルスを含むウイルス感染性疾患のための治療的用途（疾患の治療およびその発症または進行の遅延等）に有用である。本明細書に記載されるように使用され得る病原体に関連する他の抗原は、マラリア、好ましくはＮＡＮＰの反復に基づくマラリアペプチドを含む、様々な寄生虫の抗原である。加えて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、およびＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ等の細菌性、真菌性、および他の病原性疾患が含まれる。例示の種には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａ ｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ ｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ ｒａｍｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｂａｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、または真菌、例えば、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等、または他の病原体、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが含まれる。国立アレルギー感染病研究所（ＮＩＡＩＤ）優先病原体も含まれる。これらには、カテゴリーＡ薬剤、例えば、大痘瘡（天然痘）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（疫病）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素（ボツリヌス中毒症）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、フィロウイルス（エボラ出血熱、マールブルグ出血熱）、アレナウイルス（ラッサ（ラッサ熱）、フニンウイルス（アルゼンチン出血熱）、および関連ウイルス）、カテゴリーＢ薬剤、例えば、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、アルファウイルス（ベネズエラ脳脊髄炎、東部および西部ウマ脳脊髄炎）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマシ実）由来のリシン毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのイプシロン毒素、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株Ｏ１５７：Ｈ７、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、カテゴリーＣ薬剤、例えば、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介性出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱、および多剤耐性結核菌、蠕虫、例えば、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＴａｅｎｉａ、ならびに原虫、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（例えば、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍが含まれる。
なお別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、診断、予後、および予防用途に加えて、免疫学的耐性、臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、アレルギー性疾患、およびＨＨＬＡ２によって媒介された免疫反応の減弱によって引き起こされる疾患の誘導に関して治療的用途に有用である。
本発明との関連で、本明細書で使用される「治療すること」または「治療」という用語は、かかる用語が適用される障害もしくは状態、またはかかる障害もしくは状態の１つ以上の症状を逆転させるか、軽減するか、その進行を抑制するか、または予防することを意味する。本明細書で使用される「がんを治療する」という用語は、がんの細胞の成長および／または増殖の抑制を意味する。好ましくは、かかる治療は、腫瘍成長の退縮（すなわち、測定可能な腫瘍のサイズの減少）ももたらす。最も好ましくは、かかる治療は、腫瘍の完全退縮をもたらす。
いくつかの実施形態では、「患者」または「それを必要とする患者」という用語は、異常なＨＨＬＡ２活性化に関連するがんに罹患しているか、または罹患する可能性の高いヒトまたは非ヒト哺乳動物を対象とする。
本発明のポリペプチドの「治療有効量」とは、いずれの医学的治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でがん等の目的とする障害を治療するのに十分な抗体の量を意味する。しかしながら、本発明の抗体および組成物の総１日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者の特定の治療有効用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定の抗体の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食生活；用いられる特定の抗体の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせてまたはそれと同時に使用される薬物；ならびに医学技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベル未満のレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることが当業者に周知である。
本発明の抗体を１つ以上含む治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって保管用に調製される。抗体組成物は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、および投与される。この関連での考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医師に既知の他の因子が含まれる。
治療用量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、および約１００μｇ／ｋｇ体重以下であり得る。当業者であれば、かかるガイドラインが、例えば、抗体断片の使用時または抗体コンジュゲートの使用時に、活性薬剤の分子量に応じて調整されることを理解するであろう。投薬量は、局所投与、例えば、経鼻、吸入等、または全身投与、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内等によっても変化し得る。
本組成物は、活性を増強するか、または別様に治療効果を高める１つ以上の薬剤を必要としないが、任意にそれと製剤化される。これらは、一般に、本明細書で使用される同じ投薬量および投与経路で、またはこれまでに用いられた投薬量の約１～９９％で使用される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、これらには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）、および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。インビボ投与に使用される製剤は、滅菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
これらの活性成分は、例えば、液滴形成技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入される場合もある。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
本明細書に記載の組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻内を含む任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。加えて、本組成物は、特に本抗体の用量の減少に伴うパルス注入によって好適に投与され得る。
疾患の予防または治療のために、抗体の適切な投薬量は、上で定義される治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体が予防のために投与されるか、以前の療法、患者の臨床歴および抗体に対する応答、および主治医の判断に依存するであろう。抗体は、１回または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。
本発明の治療薬は、単独で使用され得るか、または例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤、放射性標識化合物、または手術、凍結療法、および／もしくは放射線療法との併用療法で投与され得る。前述の治療法は、従来の療法と連続して、従来の療法の前に、または従来の療法の後のいずれかで、従来の療法の他の形態（例えば、当業者に周知の標準治療がん治療）と併せて施され得る。例えば、本発明の薬剤は、化学療法剤の治療有効用量と投与され得る。別の実施形態では、本発明の薬剤は、化学療法剤の活性および有効性を増強するために化学療法と併せて投与される。医師用添付文書集（ＰＤＲ）は、様々ながんの治療に使用されている化学療法剤の投薬量を開示している。治療的に有効なこれらの前述の化学療法薬の投薬レジメンおよび投薬量は、治療される特定のがん、疾患の程度、および当該技術分野の医師が精通している他の因子に依存し、医師によって決定され得る。
がんワクチンも、標的療法、例えば、免疫療法と組み合わせて投与され得る。「標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用し、それにより、がんを治療する薬剤の投与を指す。例えば、本発明の方法と組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤の阻害に関する標的療法が有用である。「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方調節または阻害することによって免疫応答を微調整するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子群を意味する。免疫チェックポイントタンパク質は、当該技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＤＧ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、およびＡ２ａＲ（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の阻害により、阻害性シグナル伝達が遮断またはさもなければ中和され、それにより、免疫応答が上方制御されて、がんがより有効に治療され得る。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、および／またはＣＤ４７阻害剤等の１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。
免疫療法は、例えば、追加のがんワクチンおよび／または感作抗原提示細胞の使用を含み得る、標的療法の一形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を無傷のまま残しながらがん細胞に感染して溶解させることができるウイルスであり、それらをがん療法に潜在的に有用なものにする。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞破壊を促進し、腫瘍部位での用量増幅ももたらす。それらは、抗がん遺伝子のベクターとして作用することもでき、それらを腫瘍部位に特異的に送達させる。この免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して産生された予め形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤または毒素に結合しているモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主の短期間保護のための受動免疫を伴い得る。例えば、抗ＶＥＧＦおよびｍＴＯＲ阻害剤は、腎細胞癌の治療に有効であることが既知である。この免疫療法は、がん細胞株の細胞毒性リンパ球によって認識されるエピトープの使用にも焦点を合わせることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチド等を使用して、腫瘍またはがんの発症、進行、および／または病理に関連した生体分子を選択的に調節することができる。
「非標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、がんを治療する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子療法、および放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、化学療法が使用される。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。かかる化学療法剤は、以下の化合物の群：白金化合物、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、抗分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、および毒素、ならびにそれらの合成誘導体から選択されるものであり得るが、これらに限定されない。例示の化合物には、アルキル化剤（シスプラチン、トレオスルファン、およびトロホスファミド）、植物アルカロイド（ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル）、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（テニポシド、クリスナトール、およびマイトマイシン）、抗葉酸剤（メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびヒドロキシウレア）、ピリミジン類似体（５－フルオロウラシル、ドキシフルリジン、およびシトシンアラビノシド）、プリン類似体（メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ＤＮＡ代謝拮抗剤（２’－デオキシ－５－フルオロウリジン、グリシン酸アフィジコリン、およびピラゾロイミダゾール）、ならびに有糸分裂阻害剤（ハリコンドリン、コルヒチン、およびリゾキシン）が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物も使用され得る。ＦＬＡＧには、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、およびＧ－ＣＳＦが含まれる。ＣＨＯＰには、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンが含まれる。化学療法剤の前述の例は例示的なものであり、限定するようには意図されていない。
別の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法で使用される放射線は、電離放射線であり得る。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、または陽子ビームでもあり得る。放射線療法の例には、外部ビーム放射線療法、放射性同位体（Ｉ－１２５、パラジウム、イリジウム）、ストロンチウム－８９等の放射性同位体の間質埋め込み、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ－３２放射線療法、ならびに／または全腹部および骨盤放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。放射線療法の一般概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、放射線が遠隔源から向けられる外部ビーム放射線または遠隔療法として施され得る。放射線治療は、放射性源ががん細胞または腫瘍塊に近接して体内に設置される内部療法または小線源療法として施される場合もある。ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、感光剤Ｐｃ４、デメトキシ－ヒポクレリンＡ、ならびに２ＢＡ－２－ＤＭＨＡ等の感光剤の投与を含む光線力学的療法の使用も包含される。
別の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン治療的治療は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ－ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成および処理阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベータメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））、ビタミンＤ３類似体、抗ゲスターゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。
５．アッセイおよびスクリーニング法
本発明の別の態様は、非細胞ベースのアッセイおよび異種移植片動物モデルアッセイを含むスクリーニングアッセイに関する。一実施形態では、これらのアッセイは、ＨＨＬＡ２シグナル伝達を減少させ、それにより、免疫応答を増加させる薬剤を特定し、かつ／またはＨＨＬＡ２シグナル伝達を増加させ、それにより、免疫応答を減少させる薬剤を特定するために、ヒトまたは動物モデルアッセイ等においてＨＨＬＡ２シグナル伝達を調節する薬剤を特定するための方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３等の本明細書（例えば、表、図、実施例、またはさもなければ本明細書）に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに結合するか、またはその生物学的活性を調節する試験薬剤をスクリーニングするためのアッセイに関する。一実施形態では、かかる薬剤を特定するための方法は、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを調節する、例えば、阻害する薬剤の能力の決定を伴う。
一実施形態では、アッセイは、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを試験薬剤と接触させることと、以下に記載されるように基質の直接結合を測定することまたは間接的パラメータを測定すること等によって、バイオマーカーの酵素活性を調節する（例えば、阻害する）試験薬剤の能力を決定することとを含む、無細胞アッセイまたは細胞ベースのアッセイである。
例えば、直接結合アッセイでは、結合が複合体中の標識タンパク質または分子を検出することによって決定され得るように、バイオマーカータンパク質（またはそれらのそれぞれの標的ポリペプチドまたは分子）が放射性同位体または酵素標識にカップリングされ得る。例えば、標的は、直接的または間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識され得、放射性同位体が放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、標的は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が適切な基質の産物への変換の決定によって検出され得る。バイオマーカーと基質との間の相互作用の決定が標準の結合または酵素分析アッセイを使用して達成される場合もある。上述のアッセイ方法の１つ以上の実施形態では、ポリペプチドまたは分子を固定化して、タンパク質または分子の一方または両方の複合体形成されていない形態からの複合体形成された形態の分離を促進し、かつアッセイの自動化を適応させることが望ましくあり得る。
試験薬剤の標的への結合は、反応物を収容するのに好適な任意の容器内で達成され得る。かかる容器の非限定的な例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。本明細書に記載の抗体の固定化された形態は、多孔性、微孔性（約１ミクロン未満の平均細孔径を有する）またはマクロ多孔性（約１０ミクロン超の平均細孔径を有する）材料、例えば、膜、セルロース、ニトロセルロース、またはガラス繊維；ビーズ、例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドもしくはラテックス製のもの；または皿、プレート、もしくはウェルの表面、例えば、ポリスチレン製のもの等の固相に結合した抗体も含み得る。
代替の実施形態では、バイオマーカーと基質またはバイオマーカーとその天然結合パートナーとの間の相互作用を調節する薬剤の能力決定は、シグナル伝達経路（例えば、フィードバックループ）内のその位置の下流または上流で機能するポリペプチドまたは他の産物の活性を調節する試験薬剤の能力を決定することによって達成され得る。かかるフィードバックループは当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ（２００９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｒｅｓ．２：１－１９を参照のこと）。
ＨＨＬＡ２の状態は、本明細書に記載の抗ＨＨＬＡ２抗体を使用して測定され得る。ＨＨＬＡ２発現の減少は、この薬剤がＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達を阻害することを示し、ＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達の阻害および免疫応答の増加に有用なものとして薬剤を特定する。ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、および／または阻害性受容体への結合の減少は、その薬剤がＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達を阻害することを示し、ＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達の阻害および免疫応答の増加に有用なものとして薬剤を特定する。対照的に、ＨＨＬＡ２発現の増加は、その薬剤がＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達を促進することを示し、ＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達の促進および免疫応答の減少に有用なものとして薬剤を特定する。ＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、および／または阻害性受容体への結合の増加は、その薬剤がＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達を促進することを示し、ＨＨＬＡ２活性／シグナル伝達の促進および免疫応答の減少に有用なものとして薬剤を特定する。
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイによって特定された新規の薬剤に関する。したがって、本明細書に記載されるように特定された薬剤を適切な動物モデル等にさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように特定された薬剤が動物モデルに使用されて、かかる薬剤での治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載されるように特定された抗体が動物モデルに使用されて、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。
本発明の一態様は、非細胞ベースのアッセイおよび異種移植片動物モデルアッセイを含むスクリーニングアッセイに関する。一実施形態では、これらのアッセイは、異種移植片動物モデルアッセイを使用することによってヒト等におけるがんが抗ＨＨＬＡ２抗体療法に応答する可能性があるかを特定し、かつ／または薬剤が抗ＨＨＬＡ２抗体療法に応答する可能性の低いがん細胞の成長を阻害するか、またはそれを死滅させることができるかを特定するための方法を提供する。
６．予防的方法
一態様では、本発明は、対象における、望ましくないまたは決して望ましいとはいえない免疫応答に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。特許請求される薬剤または方法での治療から恩恵を受けるであろう疾患を発症する危険性のある対象が、例えば、当該技術分野で既知の診断アッセイまたは予後アッセイのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせによって特定され得る。予防薬の投与は、望ましくないまたは決して望ましいとはいえない免疫応答に関連する症状の兆候の前に起こり得る。治療に使用される適切な薬剤（例えば、抗体、ペプチド、融合タンパク質、または小分子）は、臨床的適応に基づいて決定され得、例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用して特定され得る。
ＶＩＩ．薬学的組成物
例えば、抗体、ペプチド、融合タンパク質、または小分子を遮断することを含む、ＨＨＬＡ２とＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３等の１つ以上の天然結合パートナーとの間の相互作用を調節する（例えば、阻害または促進する）薬剤が、対象への投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、抗体、ペプチド、融合タンパク質、または小分子、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という言語は、薬学的投与と適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含むよう意図されている。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。いずれの従来の媒体または薬剤も活性化合物と適合性のない場合を除いて、本組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的活性化合物も本組成物に組み込まれ得る。
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸；および張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整され得る。これらの非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアル内に封入され得る。
注射用に好適な薬学的組成物には、滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、本組成物は滅菌でなければならず、容易なシリンジ通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。本組成物は、製造および保管条件下で安定しているべきであり、細菌および真菌等の微生物の混入作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティング剤の使用、必要な粒径の維持（分散剤の場合）、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、本組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、本組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、活性化合物を必要な量で上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒および上に列挙されるもの由来の必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と事前に滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらは、ゼラチンカプセル内に封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。治療的経口投与の目的のために、活性化合物が賦形剤と組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物は、洗口液としての使用のための流体担体を使用して調製される場合もあり、流体担体中の化合物は、経口適用され、口内でグチュグチュされ、吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント材料が、本組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味料のうちのいずれか、または同様の性質を有する化合物を含有し得る。
吸入による投与の場合、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で送達される。
全身投与は、経粘膜または経皮手段による場合もある。経粘膜または経皮投与の場合、浸透される障壁に適切な浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られており、これらには、例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬の使用によって達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野で一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化され得る。
化合物は、坐薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド等の従来の坐薬基剤を用いて）または直腸送達の場合には保持浣腸剤の形態で調製される場合もある。
一実施形態では、調節剤は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤等の体内からの迅速な排除から化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。かかる製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであるはずである。これらの材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的としたリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に既知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製され得る。
投与の簡便性および投薬量の均一性のために経口または非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、治療される対象の単位投薬量に適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の特有の特性、達成される特定の治療効果、および個体の治療のためのかかる活性化合物を化合する当該技術分野に固有の制限によって決定され、かつそれらに直接依存する。
かかる化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって決定され得、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するためのものである。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現され得る。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物が使用され得るが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより、副作用を軽減するために、かかる化合物を罹患組織部位に標的させる送達系を設計する際に注意を払われなければならない。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータが、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量の製剤化に使用され得る。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用されるいずれの化合物についても、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量が動物モデルで製剤化されて、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
上述の調節剤は、当該薬剤をコードする発現可能な核酸の形態で投与され得る。これらが含まれるかかる核酸および組成物も本発明によって包含される。例えば、本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子療法ベクターとして使用され得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４－３０５７を参照のこと）によって対象に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、例えば、レトロウイルスベクターの場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
薬学的組成物は、投与についての指示と一緒に容器、パック、またはディスペンサー内に含まれ得る。
ＶＩＩＩ．薬剤の投与
本発明の免疫調節薬剤は、免疫細胞媒介性免疫応答を増強するか、または抑止するかのいずれかのために、インビボでの医薬品投与に好適な生物学的に適合性の形態で対象に投与される。「インビボ投与に好適な生物学的に適合性の形態」とは、いずれの毒性作用もタンパク質の治療効果を上回る投与されるタンパク質の形態を意味する。「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生きている生物、例えば、哺乳動物を含むよう意図されている。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。本明細書に記載の薬剤の投与は、薬剤の治療的に活性な量を単独でまたは薬学的に許容される担体と組み合わせて含む任意の薬理学的形態であり得る。
本発明の治療的組成物の治療的に活性な量の投与は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の結果を達成するのに有効な量として定義される。例えば、薬剤の治療的に活性な量は、個体の病状、年齢、性別、および体重等の因子、ならびに個体に所望の応答を誘発するペプチドの能力により異なり得る。投薬量レジメンは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割用量が１日１回投与され得るか、または用量は、治療状況の緊急事態によって示されるように比例的に減少し得る。
本明細書に記載の薬剤または本発明は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与等の簡便な様式で投与され得る。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を不活性化し得る酵素、酸、および他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。例えば、薬剤の投与について、非経口投与以外の方法により、薬剤をその不活性化を阻止するための材料でコーティングするか、または薬剤をその材料と同時投与することが望ましくあり得る。
薬剤は、個体に、適切な担体、希釈剤、もしくはアジュバント中で投与されるか、酵素阻害剤と同時投与されるか、またはリポソーム等の適切な担体中で投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。アジュバントは、その最も広い意味で使用され、インターフェロン等の任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書で企図されるアジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＥＰ）、およびトラジロールが含まれる。リポソームには、水中油中水乳剤、ならびに従来のリポソーム（Ｓｔｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）が含まれる。
薬剤は、非経口または腹腔内投与される場合もある。分散剤が、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中で調製される場合もある。通常の保管および使用条件下で、これらの調製物は、微生物増殖を阻止するための保存料を含有し得る。
注射用に好適な薬剤の薬学的組成物には、滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、本組成物は、好ましくは滅菌であり、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流体であるべきである。本組成物は、好ましくは製造および保管条件下で安定しており、細菌および真菌等の微生物の混入作用から保護されるであろう。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティング剤の使用、必要な粒径の維持（分散剤の場合）、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、本組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、本組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、本発明の薬剤（例えば、抗体、ペプチド、融合タンパク質、または小分子）を必要な量で上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒および上に列挙されるもの由来の必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、薬剤と事前に滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。
上述のように薬剤が好適に保護される場合、タンパク質は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と経口投与され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。いずれの従来の媒体または薬剤も活性化合物と適合性のない場合を除いて、治療的組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的活性化合物も本組成物に組み込まれ得る。
投与の簡便性および投薬量の均一性のために非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される「単位剤形」とは、治療される哺乳類対象の単位投薬量に適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのかかる活性化合物を化合する当該技術分野に固有の制限によって決定され、かつそれらに直接依存する。
一実施形態では、本発明の薬剤は、抗体である。本明細書で定義されるように、抗体の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１～１０ｍｇ／ｋｇ、２～９ｍｇ／ｋｇ、３～８ｍｇ／ｋｇ、４～７ｍｇ／ｋｇ、または５～６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者であれば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されないある特定の因子が、対象を有効に治療するのに必要な投薬量に影響を及ぼし得ることを理解する。さらに、抗体の治療有効量での対象の治療は、単回治療を含み得るか、または好ましくは一連の治療を含み得る。好ましい例では、対象は、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体で、約１～１０週間、好ましくは２～８週間、より好ましくは約３～７週間、さらにより好ましくは約４、５、または６週間にわたって週１回治療される。治療に使用される抗体の有効投薬量が特定の治療の過程にわたって増加または減少し得ることも理解されるであろう。投薬量の変化により、診断アッセイの結果がもたらされ得る。
上述のように、いくつかの実施形態では、投与のための薬剤は、細胞ベースである。細胞ベースの薬剤は、対象宿主と免疫適合性関係にあり、任意のかかる関係が本発明による使用のために企図される。例えば、養子Ｔ細胞等の細胞は同系であり得る。「同系」という用語は、特に抗原または免疫学的反応に関して遺伝学的に同一である同じ種に由来するか、それに起源するか、またはそのメンバーである状態を指し得る。これらには、一致するＭＨＣ型を有する同一の双子が含まれる。したがって、「同系移植」とは、ドナーからドナーと遺伝学的に同一であるか、または望ましくない有害な免疫原性応答（例えば、本明細書に記載の免疫学的スクリーニング結果の解釈に反するであろうもの等）なしに移植を可能にするのに十分に免疫学的に適合性であるレシピエントへの細胞の移入を指す。
移入された細胞が同じ対象から得られ、同じ対象に移植される場合、同系移植は、「自己」のものであり得る。「自己移植」は、対象自身の細胞または臓器の採取および再注入または移植を指す。自己細胞の排他的または補足的使用により、細胞の宿主への戻し投与、特定の移植片対宿主反応の多くの有害作用が排除または軽減され得る。
移入された細胞が同じ種から得られ、かつその同じ種の異なるメンバーに移植されるが、有害な免疫原性応答を回避するのに十分に一致した主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原を有する場合、同系移植は、「一致した同種」のものであり得る。ＭＨＣ不一致の程度の決定は、当該技術分野で既知の使用されている標準の試験に従って達成され得る。例えば、ヒトにおいて、移植生物学で重要であると特定されているＭＨＣ遺伝子の少なくとも６つの主要なカテゴリーが存在する。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃは、ＨＬＡクラスＩタンパク質をコードし、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＰは、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質をコードする。これらの群の各々の群内の遺伝子は、ヒト集団に見られる多数のＨＬＡ対立遺伝子またはバリアントに反映されるように高度に多型であり、個体間のこれらの群の差は、移植細胞の免疫応答の強度に関連する。ＭＨＣ一致の程度を決定するための標準方法は、ＨＬＡ－Ｂ群およびＨＬＡ－ＤＲ群、またはＨＬＡ－Ａ群、ＨＬＡ－Ｂ群、およびＨＬＡ－ＤＲ群内の対立遺伝子を試験する。したがって、試験は、それぞれ、２つまたは３つのＨＬＡ群内の少なくとも４つ、さらには５つまたは６つのＭＨＣ抗原からなり得る。血清学的ＭＨＣ試験では、各ＨＬＡ抗原型に対して産生された抗体が１体の対象（例えば、ドナー）由来の細胞と反応して、その抗体と反応するある特定のＭＨＣ抗原の存在または不在を決定する。これは、他の対象（例えば、レシピエント）の反応性プロファイルと比較される。抗体のＭＨＣ抗原との反応は、典型的には、抗体を細胞とインキュベートし、その後、補体を添加して細胞溶解を誘導すること（すなわち、リンパ球毒性試験）によって決定される。反応は、この反応において溶解した細胞の量に従って試験および等級分けされる（例えば、Ｍｉｃｋｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ（１９９９）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，ｐｇ ２８－３７，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｌｄｅｎ，Ｍａｓｓ．を参照のこと）。他の細胞ベースのアッセイには、標識抗体を使用したフローサイトメトリーまたは酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。ＭＨＣ型を決定するための分子法が周知であり、ＨＬＡタンパク質をコードする特定の遺伝子配列を検出するための合成プローブおよび／またはプライマーを一般に用いる。合成オリゴヌクレオチドは、特定のＨＬＡ型に関連する制限断片長多型を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る（Ｖａｕｇｈｎ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ＭＨＣ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．２１０：４５－６０）。あるいは、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはライゲーション連鎖反応により）ＨＬＡ配列を増幅するためのプライマーが使用され得、その産物は、直接ＤＮＡ配列決定、制限断片多型分析（ＲＦＬＰ）、または一連の配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＳＯＰ）とのハイブリダイゼーションによってさらに試験され得る（Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２：３５１５－３５２０、Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９：４２００－４２０６、およびＭｉｄｄｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ＭＨＣ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．２１０：６７－１１２）。
移入された細胞と対象の細胞が、典型的には同系交配により、単一遺伝子座等の定義された遺伝子座で異なる場合、同系移植は、「類遺伝子性」であり得る。「類遺伝子性」という用語は、同じ種に由来するか、それに起源するか、またはそのメンバーであることを指し、これらのメンバーは、小さい遺伝領域、典型的には単一遺伝子座（すなわち、単一遺伝子）を除いて遺伝学的に同一である。「類遺伝子移植」とは、レシピエントが単一遺伝子座を除いてドナーと遺伝学的に同一である、細胞または臓器のドナーからレシピエントへの移入を指す。例えば、ＣＤ４５は、いくつかの対立遺伝子形態で存在し、マウス株がＣＤ４５．１またはＣＤ４５．２対立遺伝子バージョンが発現されるかに関して異なる類遺伝子マウス株が存在する。
対照的に、「不一致同種」とは、有害な免疫原性応答を誘発するのに十分なＭＨＣ抗原の定義されたメンバーの血清学的分析または分子分析等の当該技術分野で使用されている標準のアッセイによって典型的に決定される、非同一の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原（すなわち、タンパク質）を有する同じ種に由来するか、それに起源するか、またはそのメンバーであることを指す。「部分的不一致」とは、メンバー間、典型的にはドナーとレシピエントとの間で試験されたＭＨＣ抗原の部分的一致を指す。例えば、「半不一致」とは、試験されたＭＨＣ抗原の５０％が２つのメンバー間で異なるＭＨＣ抗原型を示すことを指す。「完全（ｆｕｌｌ）」または「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」不一致とは、試験された全てのＭＨＣ抗原が２つのメンバー間で異なることを指す。
同様に、対照的には、「異種」とは、異なる種、例えば、ヒトおよび齧歯類、ヒトおよびブタ、ヒトおよびチンパンジー等に由来するか、それに起源するか、またはそのメンバーであることを指す。「異種移植」とは、レシピエントがドナーの種とは異なる種である、細胞または臓器のドナーからレシピエントへの移入を指す。
加えて、細胞は、単一の源または複数の源（例えば、単一の対象または複数の対象）から得られ得る。複数とは、少なくとも２つ（例えば、１つより多く）を指す。なお別の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、マウスである。目的とする細胞型が得られる動物は、成体、新生児（例えば、４８時間齢未満）、未熟、または子宮内であり得る。目的とする細胞型は、初代がん細胞、がん幹細胞、樹立がん細胞株、不死化初代がん細胞等であり得る。ある特定の実施形態では、宿主対象の免疫系は、移植がん細胞と免疫学的に適合性のあるように操作されるか、または別様に選出され得る。例えば、一実施形態では、対象は、ヒトがん細胞と適合性になるように「ヒト化」され得る。「免疫系ヒト化」という用語は、ヒトＨＳＣ系統細胞ならびにヒト後天性および先天性免疫細胞を含むマウス等の動物が、宿主動物から拒絶されることなく生存し、それにより、ヒト造血ならびに後天性免疫および先天性免疫の両方の宿主動物における再構成を可能にすることを指す。後天性免疫細胞には、Ｔ細胞およびＢ細胞が含まれる。先天性免疫細胞には、マクロファージ、顆粒球（好塩基球、好酸球、好中球）、ＤＣ、ＮＫ細胞、およびマスト細胞が含まれる。代表的な非限定的な例には、ＳＣＩＤ－ｈｕ、Ｈｕ－ＰＢＬ－ＳＣＩＤ、Ｈｕ－ＳＲＣ－ＳＣＩＤ、ＮＳＧ（先天性免疫系、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびサイトカインシグナル伝達を欠くＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２ｒ－ガンマ（ヌル））、ＮＯＧ（ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２ｒ－ガンマ（切断））、ＢＲＧ（ＢＡＬＢ／ｃ－Ｒａｇ２（ヌル）ＩＬ２ｒ－ガンマ（ヌル））、およびＨ２ｄＲＧ（Ｓｔｏｃｋ－Ｈ２ｄ－Ｒａｇ２（ヌル）ＩＬ２ｒ－ガンマ（ヌル））マウス（例えば、Ｓｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１１８、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２１、Ｂｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：８４－９８、ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６３２－１６３９、米国特許第７，９６０，１７５号、および米国特許公開第２００６／０１６１９９６号を参照のこと）、ならびに免疫関連遺伝子の関連ヌル突然変異体、例えば、Ｒａｇ１（Ｂ細胞およびＴ細胞を欠く）、Ｒａｇ２（Ｂ細胞およびＴ細胞を欠く）、ＴＣＲアルファ（Ｔ細胞を欠く）、パーフォリン（ｃＤ８＋Ｔ細胞が細胞毒性機能を欠く）、ＦｏｘＰ３（機能的ＣＤ４＋Ｔ制御性細胞を欠く）、ＩＬ２ｒｇ、またはＰｒｆｌ、ならびにＨＨＬＡ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＴＭＩＧＤ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｉｍ３、および／または２Ｂ４の突然変異体またはノックアウトが挙げられ、マウス等の免疫不全動物のコンパートメント特異的モデルにおけるヒト免疫細胞の効率的な生着を可能にし、かつ／またはそのモデルを提供する（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０６２１３４号を参照のこと）。加えて、ＮＳＧ－ＣＤ３４＋（ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２ｒ－ガンマ（ヌル）ＣＤ３４＋）ヒト化マウスは、マウス等の動物モデルにおけるヒト遺伝子および腫瘍活性の研究に有用である。
本明細書で使用される場合、生物学的材料源から「得られる」とは、ドナー由来の生物学的材料を採取するか、またはその源を分配する任意の従来の方法を意味する。例えば、生物学的材料は、固形腫瘍、末梢血もしくは臍帯血試料等の血液試料から得られ得るか、または骨髄もしくは羊水等の別の体液から採取され得る。かかる試料を得るための方法は、当業者に周知である。本発明では、試料は、新鮮なもの（すなわち、凍結することなくドナーから得られたもの）であり得る。さらに、試料は、増殖前に外来性のまたは望ましくない成分を除去するようにさらに操作され得る。試料は、保存ストックから得られる場合もある。例えば、細胞株または末梢血もしくは臍帯血等の体液の場合、試料は、かかる細胞株または体液の低温貯蔵的にまたは別様に保存されたバンクから採取され得る。かかる試料は、任意の好適なドナーから得られ得る。
得られた細胞集団は、直接使用され得るか、または後日使用するために凍結され得る。凍結保存のための様々な媒体およびプロトコルが当該技術分野で既知である。一般に、凍結媒体は、約５～１０％のＤＭＳＯ、１０～９０％の血清アルブミン、および５０～９０％の培養培地を含む。細胞の保存に有用な他の添加物には、例として、トレハロース等の二糖（Ｓｃｈｅｉｎｋｏｎｉｇｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．３４：５３１－５３６）、またはヘタスターチ（すなわち、ヒドロキシエチルデンプン）等の血漿増量剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水等の等張緩衝溶液が使用され得る。例示の凍結保存組成物は、４％のＨＳＡ、７．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および２％のヘタスターチを有する細胞培養培地を有する。凍結保存のための他の組成物および方法は、当該技術分野で周知であり、説明されている（例えば、Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：６４５－６５０を参照のこと）。細胞は、約－１３５℃未満の最終温度で保存される。
細胞は、対象の体重１キログラムあたり０．１×１０６、０．２×１０６、０．３×１０６、０．４×１０６、０．５×１０６、０．６×１０６、０．７×１０６、０．８×１０６、０．９×１０６、１．０×１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、１．０×１０８、５．０×１０８個の細胞、もしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の範囲もしくはそれらの間の任意の値で投与され得る。移植される細胞の数は、所与の時間量での所望の生着レベルに基づいて調整され得る。一般に、１×１０５～約１×１０９細胞／ｋｇ体重、約１×１０６～約１×１０８細胞／ｋｇ体重、もしくは約１×１０７細胞／ｋｇ体重、またはそれ以上の細胞が必要に応じて移植され得る。いくつかの実施形態では、平均サイズのマウスに対して少なくとも約０．１ｘ１０６、０．５ｘ１０６、１．０×１０６、２．０×１０６、３．０×１０６、４．０×１０６、または５．０×１０６個の総細胞の移植が有効である。
細胞は、注入等の本明細書に記載の任意の好適な経路で投与され得る。細胞は、他の抗がん剤の前に、それと同時に、またはその後に投与される場合もある。
投与は、当該技術分野で一般に既知の方法を使用して達成され得る。細胞を含む薬剤は、直接注射によって、または血管内、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、髄腔内、胸骨内、関節内、滑液嚢内、鞘内、動脈内、心臓内、もしくは筋肉内投与を含むが、これらに限定されない当該技術分野で使用されている任意の他の手段によって所望の部位に導入され得る。例えば、目的とする対象は、様々な経路によって移植細胞と生着し得る。かかる経路には、静脈内投与、皮下投与、特定の組織への投与（例えば、焦点移植）、大腿骨髄腔への注射、脾臓への注射、胎児肝臓の腎被膜下への投与等が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明のがんワクチンは、対象の腫瘍内にまたは皮下に注射される。細胞は、１回の注入で、または所望の効果をもたらすのに十分な定義された期間にわたる順次注入により投与され得る。移植細胞の移植、生着評価、およびマーカー表現型決定分析のための例示の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１５．２１．１－１５．２１．２１、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ
１００：３１７５－３１８２、Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１０４－１０７、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２００５）１０６：１５６５－１５７３、Ｓｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６４７７－６４８９、およびＨｏｌｙｏａｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：１４１８－１４２７を参照のこと）。
２つ以上の細胞型、例えば、細胞ベースの療法と幹細胞の養子細胞移入、がんワクチンと細胞ベースの療法等が組み合わせられ、投与され得る。例えば、養子細胞ベースの免疫療法が本発明の細胞ベースの療法と組み合わせられ得る。照射自己または同種腫瘍細胞、腫瘍溶解物またはアポトーシス腫瘍細胞、抗原提示細胞ベースの免疫療法、樹状細胞ベースの免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲ Ｔ細胞療法、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、および／または抗原提示細胞を含むが、これらに限定されない、周知の養子細胞ベースの免疫療法様式。かかる細胞ベースの免疫療法は、１つ以上の遺伝子産物を発現して免疫応答をさらに調節する、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインを発現するように、かつ／またはＭａｇｅ－１、ｇｐ－１００等の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原を発現するようにさらに修正され得る。本明細書に記載のがんワクチン中のがん細胞の他の細胞型に対する比率は、１：１であり得るが、所望される任意の量で調節され得る（例えば、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１、またはそれ以上）。
移植細胞の生着は、腫瘍体積、サイトカインレベル、投与時間、移植後の１つ以上の時点で対象から得られた目的とする細胞のフローサイトメトリー分析等であるが、これらに限定されない様々な方法のうちのいずれかによって評価され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日待ちの時間ベースの分析、または腫瘍採取時間を示し得る。任意のかかる測定基準は、抗がん免疫療法に対する応答への変数の影響を決定するために周知のパラメータに従って調整され得る変数である。加えて、移植細胞は、他の薬剤、例えば、サイトカイン、細胞外マトリックス、細胞培養支持体等と共移植され得る。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容、ならびに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＩＸ．対象
一実施形態では、ＨＨＬＡ２抗体療法の有効性の予測可能性が決定される対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ヒト化マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、家畜、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）であり、好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は、がんの動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト由来のがんの同所性異種移植片動物モデルであり得る。
本発明の方法の別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、および／または抗免疫チェックポイント療法等の治療を受けていない。なお別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、および／または抗免疫チェックポイント療法等の治療を受けている。
ある特定の実施形態では、対象は、がん性または前がん性組織を取り除くための手術を受けている。他の実施形態では、がん性組織は取り除かれておらず、例えば、がん性組織は、生命に不可欠な組織または外科的手技が患者に危害を及ぼすかなりの危険性を引き起こすであろう領域等の身体の手術不能な領域に位置し得る。
本発明の方法を使用して、本明細書に記載のもの等の対象における多くの異なるがんのＨＨＬＡ２阻害剤療法に対する応答性を決定することができる。
Ｘ．試料の収集、調製、および分離
いくつかの実施形態では、対象由来の試料中のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）が所定の対照（基準）試料と比較される。対象由来の試料は、典型的には、がん細胞または組織等の罹患組織由来である。対照試料は、同じ対象または異なる対象由来であり得る。対照試料は、典型的には、罹患していない正常試料である。しかしながら、いくつかの実施形態では、疾患の病期分類または治療の有効性の評価等のために、対照試料は罹患組織由来であり得る。対照試料は、いくつかの異なる対象由来の試料の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、対象由来のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）が所定のレベルと比較される。この所定のレベルは、典型的には、正常試料から得られる。本明細書に記載される場合、「所定の」バイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、ほんの一例として、治療に選択され得る対象を評価する（例えば、ゲノム突然変異の数および／またはＤＮＡ修復遺伝子の非機能性タンパク質を引き起こすゲノム突然変異の数に基づいて）、抗ＨＨＬＡ２抗体療法に対する応答を評価する、および／または１つ以上の追加の抗がん療法を伴う抗ＨＨＬＡ２抗体療法に対する応答を評価するために使用されるバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）であり得る。所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、がんを有する患者集団またはがんを有しない患者集団において決定され得る。所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、あらゆる患者に平等に適用可能な単数であり得るか、または所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、特定の患者亜集団により異なり得る。対象の年齢、体重、身長、および他の因子は、その個体の所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）に影響を及ぼし得る。さらに、所定のバイオマーカー量および／または活性は、対象毎に個別に決定され得る。一実施形態では、本明細書に記載の方法で決定および／または比較される量は、絶対測定値に基づいている。
別の実施形態では、本明細書に記載の方法で決定および／または比較される量は、比率等の相対的測定（例えば、治療前対治療後のバイオマーカーコピー数、レベル、および／または活性、スパイクまたは人工対照に対するかかるバイオマーカー測定値、ハウスキーピング遺伝子の発現に対するかかるバイオマーカー測定値等）に基づいている。例えば、相対的分析は、治療後バイオマーカー測定と比較した治療前バイオマーカー測定の比率に基づき得る。治療前バイオマーカー測定は、抗がん療法開始前の任意の時点で行われ得る。治療後バイオマーカー測定は、抗がん療法開始後の任意の時点で行われ得る。いくつかの実施形態では、治療後バイオマーカー測定は、抗がん療法開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週間、またはそれ以上後に、継続的監視のために無期限に近いさらに長い期間後に行われる。治療は、１つ以上の抗ＨＨＬＡ２抗体を単独でまたは免疫チェックポイント阻害剤等の他の抗がん剤と組み合わせて含む治療レジメン等の抗がん療法を含み得る。
所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、任意の好適な基準であり得る。例えば、所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、患者選択が評価される同じまたは異なるヒトから得られ得る。一実施形態では、所定のバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）は、同じ患者の以前の評価から得られ得る。かかる様式で、患者の選択の経過が経時的に監視され得る。加えて、対照は、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、対象がヒトである場合、選択されたヒト群の評価から得られ得る。かかる様式で、選択が評価されるヒトの選択の程度が、好適な他のヒト、例えば、同様もしくは同じ状態（複数可）に罹患しているヒトおよび／または同じ民族集団のヒト等の目的とするヒトと同様の状況下にある他のヒトと比較され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、所定のレベルからのバイオマーカー量および／または活性測定値（複数可）の変化は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０倍、またはそれ以上、またはそれらの間の任意の範囲（境界値も含む）である。測定値が相対的変化に基づいている、例えば、治療前バイオマーカー測定を治療後バイオマーカー測定と比較した比率に基づいている場合に、かかるカットオフ値が平等に適用される。
生体試料は、核酸および／またはタンパク質を含む体液試料、細胞試料、または組織試料を含む患者由来の様々な源から収集され得る。「体液」とは、身体から排泄または分泌される流体、ならびに通常は身体から排泄または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳くそ、カウパー液または前射精液、乳糜、糜粥、糞便、雌性射出液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸膜液、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、腟粘滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。好ましい実施形態では、対象試料および／または対照試料は、細胞、細胞株、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、生検、全血、乳頭吸引液、血清、血漿、頬掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、および骨髄からなる群から選択される。一実施形態では、試料は、血清、血漿、または尿である。別の実施形態では、試料は、血清である。
試料は、長期間にわたって個体から繰り返し収集され得る（例えば、約数日間、数週間、数ヶ月に１回以上、年１回、年２回等）。ある期間にわたって個体から多数の試料を得ることは、早期検出からの結果を検証し、かつ／または生物学的パターンの変化を、例えば、疾患進行、薬物治療等の結果として特定するために使用され得る。例えば、対象試料は、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または本発明による１、２、もしくは３ヶ月間隔の組み合わせで採取および監視され得る。加えて、経時的に得られた対象のバイオマーカー量および／または活性測定値は、監視期間中に、互いに、かつ正常対照のものと好都合に比較され、それにより、対象自身の値を長期監視のための内部対照または個人的対照として提供することができる。
試料調製および分離は、収集された試料のタイプおよび／またはバイオマーカー測定値（複数可）の分析に応じて、手順のうちのいずれかを含み得る。かかる手順には、ほんの一例として、濃縮、希釈、ｐＨの調整、高濃度ポリペプチド（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、およびトランスフェリン等）の除去、保存料および検量体の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、ならびに試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出および精製が含まれる。
試料調製は、非共有結合複合体中で他のタンパク質（例えば、担体タンパク質）に結合した分子を単離することもできる。このプロセスは、特定の担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合した分子を単離し得るか、またはタンパク質変性による、例えば、酸を使用した、全ての担体タンパク質からの結合した分子の放出、その後の担体タンパク質の除去等のより一般的なプロセスを使用し得る。
望ましくないタンパク質（例えば、高濃度の、無益な、または検出不能なタンパク質）の試料からの除去は、高親和性試薬、高分子量フィルター、超遠心分離および／または電気透析を使用して達成され得る。高親和性試薬には、高濃度タンパク質に選択的に結合する抗体または他の試薬（例えば、アプタマー）が含まれる。試料調製には、イオン交換クロマトグラフィー、金属イオン親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、クロマト分画、吸着クロマトグラフィー、等電点分画、および関連技法も含まれ得る。分子量フィルターには、サイズおよび分子量に基づいて分子を分離する膜が含まれる。かかるフィルターは、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、および精密濾過をさらに用い得る。
超遠心分離とは、望ましくないポリペプチドを試料から除去するための方法である。超遠心分離とは、光学系で粒子の沈降（またはその欠如）を監視しながら、約１５，０００～６０，０００ｒｐｍで試料を遠心分離することである。電気透析とは、イオンが電位勾配の影響下で半透性膜を通して１つの溶液から別の溶液に輸送されるプロセスにおいて電気膜または半透性膜を使用する手技である。電気透析に使用される膜は、正電荷または負電荷を有するイオンを選択的に輸送するか、反対電荷のイオンを拒絶するか、または種がサイズおよび電荷に基づいて半透性膜を通って移動することを可能にする能力を有し得るため、電気透析を電解質の濃縮、除去、または分離に有用なものにする。
本発明における分離および精製は、当該技術分野で既知の任意の手技、例えば、キャピラリー電気泳動（例えば、キャピラリー内もしくはチップ上）またはクロマトグラフィー（例えば、キャピラリー内、カラム、もしくはチップ上）を含み得る。電気泳動とは、電場の影響下でイオン性分子を分離するために使用され得る方法である。電気泳動は、ゲル中、キャピラリー内、またはチップ上のマイクロチャネル内で行われ得る。電気泳動に使用されるゲルの例には、デンプン、アクリルアミド、ポリエチレンオキシド、アガロース、またはそれらの組み合わせが挙げられる。ゲルは、その架橋結合、洗剤または変性剤の添加、酵素または抗体（アフィニティー電気泳動）または基質（ザイモグラフィー）の固定化、およびｐＨ勾配の組み込みによって修飾され得る。電気泳動に使用されるキャピラリーの例には、エレクトロスプレーと連動するキャピラリーが挙げられる。
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、複合親水性分子と高度に荷電された溶質の分離に好ましい。ＣＥ技術は、マイクロ流体チップ上に実装される場合もある。使用されるキャピラリーおよび緩衝液のタイプに応じて、ＣＥは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ｃＩＴＰ）、およびキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）等の分離技法にさらに分けられ得る。ＣＥ技法をエレクトロスプレーイオン化に連結するための実施形態は、揮発性溶液、例えば、揮発性酸および／または塩基を含有する水性混合物ならびにアルコールまたはアセトニトリル等の有機物の使用を含む。
キャピラリー等速電気泳動（ｃＩＴＰ）とは、分析物がキャピラリーを通って一定速度で移動するが、それにもかかわらずそれらのそれぞれの移動度によって分離される技法である。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、別名、自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）とは、分子上の電荷によって決定される種の電気泳動移動度の差および分子が移動中に遭遇する摩擦抵抗（多くの場合、分子のサイズに正比例する）に基づいている。キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、弱イオン性両性分子がｐＨ勾配で電気泳動によって分離されることを可能にする。ＣＥＣは、伝統的な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＣＥとの間のハイブリッド技法である。
本発明で使用される分離および精製技法は、当該技術分野で既知の任意のクロマトグラフィー手順を含む。クロマトグラフィーは、ある特定の分析物の示差的吸着および溶出または移動相と固定相との間での分析物の分配に基づき得る。クロマトグラフィーの異なる例としては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＸＩ．バイオマーカーポリペプチド
本発明の別の態様は、バイオマーカータンパク質およびその生物学的に活性な部分の使用に関する。一実施形態では、マーカーに対応する天然ポリペプチドは、標準のタンパク質精製技法を使用して適切な精製スキームによって細胞源または組織源から単離され得る。別の実施形態では、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって産生される。組換え発現の代替案として、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、標準のペプチド合成技法を使用して化学的に合成され得る。
バイオマーカーポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本明細書に記載のバイオマーカータンパク質アミノ酸配列と十分に同一であるか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むが、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を呈するポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技法によって調製され、本発明のポリペプチドの天然形態の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
好ましいポリペプチドは、本明細書に記載の核酸分子によってコードされるバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、これらの配列のうちの１つと実質的に同一であり（例えば、少なくとも約４０％、好ましくは５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）、対応する天然に存在するタンパク質のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然対立遺伝子変異または突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列が最適比較目的のためにアラインされる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適アライメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップが導入され得る）。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、それらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／総位置数（例えば、重複している位置）×１００）である。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７にあるように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われ得る。本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行われ得る。比較目的のためにギャップドアライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップドＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ
Ｂｉｏｓｃｉ，４：１１－７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４が使用され得る。局所配列類似性およびアライメントの領域の特定に有用なさらに別のアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためにＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０重み残基表がｋ－タプル値２で使用され得る。
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたはギャップを許容することなく、上述の技法と同様の技法を使用して決定され得る。同一性パーセントを計算する際、正確な一致のみが計数される。
本発明は、バイオマーカータンパク質に対応するキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、マーカーに対応するポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結された本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全てまたは一部（好ましくは、生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質において、「作動可能に連結される」という用語は、本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すよう意図されている。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に融合し得る。
１つの有用な融合タンパク質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドがＧＳＴ配列のカルボキシル末端に融合しているＧＳＴ融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を容易にし得る。
別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列、免疫グロブリン融合タンパク質、毒素、または他の有用なタンパク質配列を含む。本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって産生され得る。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的オーバーハングをもたらすアンカープライマーを使用して行われ得、その後、これがアニールおよび再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明のポリペプチドにインフレームで連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングされ得る。
シグナル配列を使用して、分泌タンパク質または目的とする他のタンパク質の分泌および単離を容易にすることができる。シグナル配列は、典型的には、一般に１つ以上の切断事象において分泌中に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にする処理部位を含む。したがって、本発明は、シグナル配列を有する記載のポリペプチド、ならびにシグナル配列がタンパク質分解的に切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。一実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は、通常は分泌されないか、またはさもなければ単離が困難なタンパク質等の目的とするタンパク質に発現ベクター内で作動可能に連結され得る。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換される真核宿主等からのタンパク質の分泌を指示し、シグナル配列がその後にまたは同時に切断される。その後、タンパク質は、当該技術分野によって認識された方法によって細胞外培地から容易に精製され得る。あるいは、シグナル配列は、ＧＳＴドメイン等の精製を容易にする配列を使用して目的とするタンパク質に連結され得る。
本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーポリペプチドのバリアントにも関する。かかるバリアントは、アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストのいずれかとして機能し得る改変されたアミノ酸配列を有し得る。バリアントは、突然変異誘発、例えば、離散点突然変異または切断によって生成され得る。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じものまたはそのサブセットを保持し得る。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的とするタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することによって、タンパク質の天然に存在する形態の活性のうちの１つ以上を阻害し得る。したがって、特定の生物学的効果が限定された機能を有するバリアントでの処理によって誘発され得る。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有するバリアントでの対象の治療は、タンパク質の天然に存在する形態での治療と比較して対象におけるより少ない副作用を有し得る。
アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストのいずれかとして機能するバイオマーカータンパク質のバリアントは、本発明のタンパク質の突然変異体、例えば、切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリをアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって特定され得る。一実施形態では、バリアントの多様化ライブラリが核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成され、多様化遺伝子ライブラリによってコードされる。バリアントの多様化ライブラリは、潜在的なタンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとしてまたはあるいはより大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイ用に）発現可能であるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的なバリアントのライブラリを産生するために使用され得る様々な方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
加えて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドのコーディング配列の断片のライブラリを使用して、バリアントのスクリーニングおよびその後の選択のためのポリペプチドの多様化集団を生成することができる。例えば、コーディング配列断片のライブラリは、ニッキングが１分子あたり約１回のみ生じる条件下で目的とするコーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、結果として生じた断片ライブラリを発現ベクターにライゲートすることによって生成され得る。この方法により、目的とするタンパク質の様々なサイズのアミノ末端および内部断片をコードする発現ライブラリが得られ得る。
点突然変異または切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、かつ選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該技術分野で既知である。大きい遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのハイスループット分析に従う最も広く使用されている技法は、典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、適切な細胞をベクターの結果として生じたライブラリで形質転換することと、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。ライブラリにおける機能的突然変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）が、本発明のタンパク質のバリアントを特定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１－７８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７－３３１）。
表１に列記されるバイオマーカーまたはその断片を含む本発明の１つ以上のバイオマーカーに対応する単離されたポリペプチドまたはその断片（またはかかるポリペプチドをコードする核酸）は、当該技術分野で周知の方法に従ってポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製するための標準の技法を使用して、当該免疫原に結合する抗体を生成するために、免疫原として使用され得る。抗原ペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産生された抗体がそれぞれの全長分子と特異的免疫複合体を形成するように、それぞれの全長分子中に存在するエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、かかるエピトープは、マウスまたはヒト等の１つの種由来の所与のポリペプチド分子に対して特異的であり得る（すなわち、種にわたって保存されていないポリペプチド分子の領域にわたる抗原ペプチドが免疫原として使用され、かかる保存されていない残基が本明細書に提供されるアライメント等のアライメントを使用して決定され得る）。
一実施形態では、抗体は、ＨＨＬＡ２に実質的に特異的に結合し、例えば、それとＨＨＬＡ２受容体（例えば、ＴＭＩＧＤ２および／またはＫＩＲ３ＤＬ３）との相互作用を妨害することによってその機能を阻害または遮断する。別の実施形態では、抗体は、１つ以上のＨＨＬＡ２受容体に実質的に特異的に結合し、例えば、それとＨＨＬＡ２およびその受容体のうちの少なくとも１つとの相互作用を妨害することによってその機能を阻害または遮断する。
例えば、ポリペプチド免疫原は、典型的には、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ヒト化マウス、または他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、免疫応答が生成される組換え的に発現されたまたは化学的に合成された分子またはその断片を含み得る。この調製物は、フロインド完全もしくは不完全アジュバント等のアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。好適な対象の免疫原性調製物での免疫化により、内部に含まれる抗原ペプチドに対するポリクローナル抗体の応答が誘導される。
ポリクローナル抗体は、好適な対象をポリペプチド免疫原で免疫化することによって上述のように調製され得る。免疫化された対象におけるポリペプチド抗体力価が、固定化ポリペプチドを使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の標準の技法によって経時的に監視され得る。所望の場合、抗原に対して産生された抗体が哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、タンパク質Ａクロマトグラフィー等の周知の技法によってさらに精製されて、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、例えば、抗体力価が最も高い時点で、抗体を産生する細胞を対象から得ることができ、それを使用して、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７によって最初に説明された）（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９－４６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０－８３、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：２９２７－３１、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９－７５も参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）、またはトリオーマ技法等の標準の技法によってモノクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術が周知である（概して、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７－４０２、Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１－３６を参照のこと）。簡潔には、不死細胞株（典型的には、骨髄腫）が上述のように免疫原で免疫化された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）に融合し、結果として生じたハイブリドーマ細胞の培養上清がスクリーニングされて、ポリペプチド抗原に好ましくは特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが特定される。いくつかの実施形態では、免疫化は、目的とする標的抗原のノックアウトを有する（例えば、免疫化前に抗原を産生しない）細胞または動物宿主で行われる。
リンパ球を不死化細胞株に融合させるために使用される多くの周知のプロトコルのうちのいずれか、表１に列記されるバイオマーカーを含む本発明の１つ以上のバイオマーカーまたはその断片に対するモノクローナル抗体を生成する目的のために適用され得る（例えば、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２、Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）（上記参照）、Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）（上記参照）、Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）（上記参照）を参照のこと）。さらに、当業者であれば、同様に有用であろうかかる方法の多くの変形が存在することを理解する。典型的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫化されたマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞株に融合させることによって作製され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のマウス骨髄腫細胞株である。例えば、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４－１、Ｐ３－ｘ６３－Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ－Ａｇ１４骨髄腫株等のいくつかの骨髄腫細胞株のうちのいずれかが、標準の技法に従って融合パートナーとして使用され得る。これらの骨髄腫株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合する。その後、この融合から生じたハイブリドーマ細胞が、融合していない骨髄腫細胞および非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択される（融合していない脾細胞は形質転換されていないため、数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ハイブリドーマ培養上清を所与のポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニングすることによって検出される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代替案として、上述のポリペプチドのうちの１つに特異的なモノクローナルは、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）を適切なポリペプチドでスクリーニングし、それにより、ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することによって特定および単離され得る。ファージディスプレイライブラリを生成およびスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２７－９４００－０１）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号２４０６１２））。加えて、抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングにおける使用に特に従う方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２２３，４０９号）、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号）、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号）、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９２／２０７９１号）、Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９２／１５６７９号）、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９３／０１２８８号）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号）、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９２／０９６９０号）、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号）、Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３６９－１３７２、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３５７６－３５８０、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３７３－１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３－４１３７、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８－７９８２、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４で見つけることができる。
非ヒト抗体またはヒト抗体（例えば、ラット抗マウス／抗ヒト抗体）の構造的特徴を使用して、ＨＨＬＡ２、ＨＨＬＡ２受容体、ＴＭＩＧＤ２、および／またはＫＩＲ３ＤＬ３のうちの１つ以上への結合等の本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する構造的に関連したヒト抗体を作製することができる。別の機能的特性には、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける本来の既知の非ヒトまたはヒト抗体の結合の阻害が含まれる。
いくつかの実施形態では、可変ドメインが、本明細書に提示されるか、またはさもなければ公的に入手可能な重鎖可変ドメインＣＤＲの群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む、ＨＨＬＡ２、ＨＨＬＡ２受容体、ＴＭＩＧＤ２、および／またはＫＩＲ３ＤＬ３のうちの１つ以上に結合し、かつそれを阻害／遮断することができるモノクローナル抗体が提供される。
同様に、可変ドメインが、本明細書に提示されるか、またはさもなければ公的に入手可能な軽鎖可変ドメインＣＤＲの群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む、ＨＨＬＡ２、ＨＨＬＡ２受容体、ＴＭＩＧＤ２、および／またはＫＩＲ３ＤＬ３のうちの１つ以上に結合し、かつそれを阻害／遮断するモノクローナル抗体も提供される。
可変ドメインが、本明細書に提示されるか、またはさもなければ公的に入手可能な重鎖可変ドメインＣＤＲの群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含み、かつ可変ドメインが、本明細書に提示されるか、またはさもなければ公的に入手可能な軽鎖可変ドメインＣＤＲの群と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む、ＨＨＬＡ２、ＨＨＬＡ２受容体、ＴＭＩＧＤ２、および／またはＫＩＲ３ＤＬ３のうちの１つ以上に結合し、かつそれを阻害／遮断することができるモノクローナル抗体も提供される。
当業者であれば、かかる相同性パーセンテージが、所与のＣＤＲ内での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換と同等であり、その保存的アミノ酸置換を導入することによって達成され得ることに留意するであろう。
加えて、完全ヒト抗体が、表１に列記されるバイオマーカーを含む本発明のバイオマーカーまたはその断片に対して作製され得る。完全ヒト抗体は、例えば、Ｈｏｇａｎ，ｅｔ
ａｌ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに従って、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックであるマウスに作製され得る。簡潔には、トランスジェニックマウスは、精製された免疫原で免疫化される。脾臓細胞が採取され、骨髄腫細胞に融合して、ハイブリドーマが産生される。ハイブリドーマは、免疫原に結合する抗体を産生するそれらの能力に基づいて選択される。完全ヒト抗体は、ヒトにおけるかかる抗体の免疫原性を低下させるであろう。
一実施形態では、本発明で使用するための抗体は、二重特異性または多重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチド内に２つの異なる抗原に対する結合部位を有する。抗原結合は、同時または順次であり得る。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマによって産生された二重特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号に開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６２８およびＰｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：３５４）、およびハイブリドーマ技術（Ｓｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：１４５３およびＳｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ７：２４１）によって構築されている。二重特異性抗体は、米国特許第５，９５９，０８４号にも記載されている。二重特異性抗体の断片は、米国特許第５，７９８，２２９号に記載されている。
二重特異性薬剤は、異なる抗体を作製するハイブリドーマまたは他の細胞を融合させることによりヘテロハイブリドーマを作製し、その後、これらの両方の抗体を産生して共集合させるクローンを特定することによっても生成され得る。それらは、完全免疫グロブリン鎖またはＦａｂおよびＦｖ配列等のその一部の化学的または遺伝的コンジュゲーションによっても生成され得る。抗体成分は、表１に列記される１つ以上のバイオマーカーを含む本発明の１つ以上のバイオマーカーまたはその断片のポリペプチドまたはその断片に結合することができる。一実施形態では、二重特異性抗体は、ポリペプチドまたはその断片およびその天然結合パートナー（複数可）またはその断片（複数可）の両方に特異的に結合し得る。
本発明の別の態様では、ペプチドまたはペプチド模倣物を使用して、表１に列記される１つ以上のバイオマーカーを含む本発明の１つ以上のバイオマーカーまたはその断片（複数可）の活性をアンタゴナイズすることができる。一実施形態では、それぞれの全長タンパク質の調節剤として機能する表１に列記される１つ以上のバイオマーカーのバリアントは、突然変異体、例えば、切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリをアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって特定され得る。一実施形態では、バリアントの多様化ライブラリが核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成され、多様化遺伝子ライブラリによってコードされる。バリアントの多様化ライブラリは、潜在的なポリペプチド配列の縮重セットがポリペプチド配列のセットを内部に含む個々のポリペプチドとして発現可能であるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチドバリアントのライブラリを産生するために使用され得る様々な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成が自動ＤＮＡ合成機で行われ、その後、合成遺伝子が適切な発現ベクターにライゲートされ得る。遺伝子の縮重セットの使用により、１つの混合物における、潜在的なポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列の全ての提供が可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
加えて、ポリペプチドコーディング配列の断片のライブラリを使用して、所与のポリペプチドのバリアントのスクリーニングおよびその後の選択のためのポリペプチド断片の多様化集団を生成することができる。一実施形態では、コーディング配列断片のライブラリは、ニッキングが１ポリペプチドあたり約１回のみ生じる条件下でポリペプチドコーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、結果として生じた断片ライブラリを発現ベクターにライゲートすることによって生成され得る。この方法により、ポリペプチドの様々なサイズのＮ末端、Ｃ末端、および内部断片をコードする発現ライブラリが得られ得る。
点突然変異または切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、かつ選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該技術分野で既知である。かかる技法は、ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。大きい遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのハイスループット分析に従う最も広く使用されている技法は、典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、適切な細胞をベクターの結果として生じたライブラリで形質転換することと、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。ライブラリにおける機能的突然変異体の頻度を高める技法である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）が、目的とするバリアントを特定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１－７８１５、Ｄｅｌａｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（３）：３２７－３３１）。一実施形態では、細胞ベースのアッセイが、多様化ポリペプチドライブラリを分析するために利用され得る。例えば、発現ベクターのライブラリは、通常は表１に列記される１つ以上のバイオマーカーを含む本発明の１つ以上のバイオマーカーまたはその断片を合成する細胞株にトランスフェクトされ得る。その後、トランスフェクト細胞は、全長ポリペプチドおよび特定の突然変異体ポリペプチドが産生されるように培養され、細胞上清における全長ポリペプチド活性への突然変異体の発現の影響が、例えば、いくつかの機能的アッセイのうちのいずれかによって検出され得る。その後、プラスミドＤＮＡが、全長ポリペプチド活性の阻害、またはあるいは増強をスコア化する細胞から回収され、個々のクローンがさらに特徴付けられ得る。
ポリペプチドアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ－アミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ－リジンの代わりにＤ－リジン）を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。加えて、目的とするポリペプチドアミノ酸配列または実質的に同一の配列変形を含む制限ペプチドが、当該技術分野で既知の方法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって生成され得る。
本明細書に開示されるアミノ酸配列は、当業者がペプチド配列およびその配列バリアントに対応するポリペプチドを産生することを可能にするであろう。かかるポリペプチドは、多くの場合、より大きいポリペプチドの一部として、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって原核または真核宿主細胞中に産生され得る。あるいは、かかるペプチドは、化学的方法によって合成され得る。組換え宿主で異種タンパク質を発現させるための方法、ポリペプチドの化学的合成、およびインビトロ翻訳は、当該技術分野で周知であり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９），２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．（１９６９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：５０１、Ｃｈａｉｋｅｎ Ｉ．Ｍ．（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２５５、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１８７、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４２、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７、およびＯｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．（１９８０）Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）にさらに記載されている。
ペプチドは、典型的には、直接化学合成によって産生され得る。ペプチドは、非ペプチド部分がＮ末端および／またはＣ末端への共有結合的結合によって結合している修飾ペプチドとして産生され得る。ある特定の好ましい実施形態では、カルボキシ末端もしくはアミノ末端のいずれか、またはそれらの両方が、化学的に修飾されている。末端アミノ基および末端カルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれ、アセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）等のアミノ末端修飾およびアミド化等のカルボキシ末端修飾、ならびに環化を含む他の末端修飾が、本発明の様々な実施形態に組み込まれ得る。コア配列に対するある特定のアミノ末端修飾および／もしくはカルボキシ末端修飾ならびに／またはペプチド伸長により、増強された安定性、増加した効力および／または有効性、血清プロテアーゼに対する抵抗性、望ましい薬物動態学的特性等の有利な物理的、化学的、生化学的、および薬理学的特性が提供され得る。本明細書に開示されるペプチドは、例えば、患者における共刺激を改変することによって、疾患を治療するために治療的に使用され得る。
ペプチド模倣薬（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ ｐ．３９２、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）は、通常、コンピュータ化された分子モデリングを用いて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に同様のペプチド模倣物を使用して、同等の治療または予防効果をもたらすことができる。一般に、ペプチド模倣薬は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に同様であるが、当該技術分野で既知であり、かつ以下の参考文献：各々参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ
Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，“Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”（一般概説）、Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４６３－４６８（一般概説）、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７－１８５（－ＣＨ２ＮＨ－、ＣＨ２ＣＨ２－）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３－１２４９（－ＣＨ２－Ｓ）、Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．３０７－３１４（－ＣＨ－ＣＨ－、シスおよびトランス）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（－ＣＯＣＨ２－）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（－ＣＯＣＨ２－）、Ｓｚｅｌｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ．ＥＰ ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－）、Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８３）２４：４４０１－４４０４（－Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２－）、およびＨｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．（１９８２）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９８２）３１：１８９－１９９（－ＣＨ２－Ｓ－）にさらに記載される方法により、－ＣＨ２ＮＨ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シスおよびトランス）、－ＣＯＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、および－ＣＨ２ＳＯ－からなる群から選択される結合によって任意に置き換えられる１つ以上のペプチド結合を有する。特に好ましい非ペプチド結合は、－ＣＨ２ＮＨ－である。かかるペプチド模倣物は、例えば、より経済的な産生、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性等）、改変された特異性（例えば、生物学的活性の広域スペクトル）、低下した抗原性等を含む、ポリペプチド実施形態に優る重大な利点を有し得る。ペプチド模倣薬の標識は、通常、定量的構造活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣薬上の非干渉位置（複数可）への１つ以上の標識の直接またはスペーサー（例えば、アミド基）を介した共有結合的結合を伴う。かかる非干渉位置は、概して、ペプチド模倣薬が結合して治療効果をもたらすマクロポリペプチド（複数可）との直接接触を形成しない位置である。ペプチド模倣薬の誘導体化（例えば、標識）は、ペプチド模倣薬の所望の生物学的または薬理学的活性に実質的に干渉してはならない。
例えば、本明細書に記載のまたは表１に列記されるバイオマーカーとそれらの天然結合パートナーとの間の相互作用を調節する（増強または阻害のいずれか）ことができる小分子も本発明によって包含される。本発明の小分子は、空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリ法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ方法における多数のアプローチのうちのいずれかを使用して得られ得る。（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリを合成するための方法の例は、当該技術分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ
ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９、Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、およびＧａｌｌｏｐ ｅｔ
ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３で見つけることができる。
化合物のライブラリは、溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２－４２１）、またはビーズ上に（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ
３６４：５５５－５５６）、細菌上に（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ５，２２３，４０９）、胞子上に（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ５，２２３，４０９）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５－１８６９）、またはファージ上に（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０）、（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：４０４－４０６）、（Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８－６３８２）、（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－３１０）、（Ｌａｄｎｅｒ（上記参照））提示され得る。化合物は、細胞ベースのアッセイまたは非細胞ベースのアッセイでスクリーニングされ得る。化合物は、プール中で（例えば、各試験試料中の複数の化合物）または個別の化合物としてスクリーニングされ得る。
本発明は、表１に列記されるバイオマーカーを含む本発明のバイオマーカーまたはその断片のキメラまたは融合タンパク質にも関する。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、それぞれのバイオマーカーと実質的に相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する別のポリペプチドに作動可能に連結された、表１に列記される１つ以上のバイオマーカーを含む本発明の１つ以上のバイオマーカーまたはその断片を含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、表１に列記される１つ以上のバイオマーカーを含む本発明の１つ以上のバイオマーカーまたはその断片の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、「作動可能に連結される」という用語は、融合から独立して発現されたときに呈される機能を保存する方法で、バイオマーカー配列および非バイオマーカー配列が互いにインフレームで融合していることを指すよう意図されている。「別の」配列が、それぞれ、バイオマーカー配列のＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
かかる融合タンパク質は、第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列および第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え発現によって産生され得る。第２のペプチドは、任意に、第１のペプチドの溶解度、親和性、安定性、または原子価を改変する部分、例えば、免疫グロブリン定常領域に対応し得る。別の好ましい実施形態では、第１のペプチドは、生物学的に活性な分子の一部（例えば、ポリペプチドの細胞外部分またはリガンド結合部分）からなる。第２のペプチドは、免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４ドメイン（例えば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１１６，９６４号、同第５，５８０，７５６号、同第５，８４４，０９５号等を参照のこと）を含み得る。かかる定常領域は、エフェクター機能（例えばＦｃ受容体結合）を媒介する領域を保持し得るか、またはエフェクター機能を低下させるように改変され得る。結果として生じた融合タンパク質は、独立して発現された第１のペプチドと比較して改変された溶解度、結合親和性、安定性、および／または原子価（すなわち、１ポリペプチドあたりの利用可能な結合部位の数）を有し得、タンパク質精製の効率を高め得る。組換え技法によって産生された融合タンパク質およびペプチドが分泌され、細胞とそのタンパク質またはペプチドを含有する培地との混合物から単離され得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは、細胞質的に保持され、細胞が採取され、溶解し、タンパク質が単離され得る。細胞培養物は、典型的には、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当該技術分野で周知である。タンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチドを精製するための当該技術分野で既知の技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはそれらの両方から単離され得る。宿主細胞をトランスフェクトするための技法およびタンパク質およびペプチドを精製するための技法は、当該技術分野で既知である。
好ましくは、本発明の融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片が、従来の技法に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端化またはスタッガー末端化末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いて、一緒にインフレームでライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的オーバーハングをもたらすアンカープライマーを使用して行われ得、その後、これがアニールおよび再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
特に好ましいＩｇ融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）にカップリングされた表１に列記される１つ以上のバイオマーカーの細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインを含む。免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン構造に固有のエフェクター活性を低減または排除する遺伝子修飾を含み得る。例えば、目的とするポリペプチドの細胞外部分をコードするＤＮＡは、例えば、ＷＯ９７／２８２６７に教示される部位特異的突然変異誘発によって修飾されたヒトＩｇＧγ１および／またはＩｇＧγ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに連結され得る。
別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および／または分泌が異種シグナル配列の使用により増加し得る。
本発明の融合タンパク質を免疫原として使用して、対象に抗体を産生することができる。かかる抗体は、融合タンパク質が生成されたそれぞれの天然ポリペプチドを精製するために使用され得るか、またはスクリーニングアッセイにおいて１つ以上のバイオマーカーポリペプチドまたはその断片とその天然結合パートナー（複数可）またはその断片（複数可）との間の相互作用を阻害するポリペプチドを特定するために使用され得る。
本明細書に記載の調節剤（例えば、抗体、小分子、ペプチド、融合タンパク質、または小核酸）が薬学的組成物に組み込まれ、インビボで対象に投与され得る。本組成物は、単一のかかる分子もしくは薬剤または本明細書に記載の薬剤の任意の組み合わせを含み得る。本明細書に記載の「単一の活性薬剤」は、本明細書に提供される方法および組成物による当該技術分野で既知の他の薬理学的に活性な化合物（「第２の活性薬剤」）と組み合わせられ得る。
本明細書に記載のバイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチド分子の産生および使用は、標準の組換え技法を使用することによって容易になり得る。いくつかの実施形態では、かかる技法は、バイオマーカーポリペプチドまたはかかるポリペプチドの一部をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターを使用する。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクター、すなわち、発現ベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド（ベクター）の形態である。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むよう意図されている。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、目的とするヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系での、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列（複数可）に連結されることを意味するよう意図されている。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現対照要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう意図されている。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９１）に記載されている。制御配列には、多くの種類の宿主細胞でのヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよびある特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に依存し得ることを理解するであろう。本発明の発現ベクターが宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。
本発明における使用のための組換え発現ベクターは、原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、昆虫細胞｛バキュロウイルス発現ベクターを使用｝、酵母細胞、または哺乳類細胞）での本発明のマーカーに対応するポリペプチドの発現のために設計され得る。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（上記参照）に詳述されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉで行われる。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的には、１）組換えタンパク質の発現を増加させる、２）組換えタンパク質の溶解度を増加させる、および３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けるという３つの目的を果たす。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位が融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されて、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、それぞれ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれる。
好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｐ．６０－８９，Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９１）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的バイオマーカー核酸発現は、ハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的バイオマーカー核酸発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７
ｇｎ１）によって媒介されたＴ７ ｇｎ１０－ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下でＴ７
ｇｎ１遺伝子を保有する常在性プロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌でタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ｐ．１１９－１２８，Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで優先的に利用されるものになるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１－２１１８）。本発明の核酸配列のかかる改変は、標準のＤＮＡ合成技法によって行われ得る。
別の実施形態では、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
あるいは、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。昆虫培養細胞（例えば、Ｓｆ ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス制御要素によって提供される。例えば、一般に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記参照）の第１６章および第１７章を参照されたい。
別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御要素を使用して核酸を発現させる）。組織特異的制御要素は、当該技術分野で既知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、具体的にはＴ細胞受容体プロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）および免疫グロブリンプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３，Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に制御されたプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）およびα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｒ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。
本発明は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされたＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にする様式で制御配列に作動可能に連結される。様々な細胞型でのアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指示する、アンチセンス配向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された制御配列、例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーが選択され得るか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的、もしくは細胞型特異的発現を指示する制御配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得、そこで、アンチセンス核酸が高効率制御領域の制御下で産生され、その活性が、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の制御の考察については、（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）を参照されたい）。
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義に使用される。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。突然変異または環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞は、任意の原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母、もしくは哺乳類細胞）であり得る。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法によって原核または真核細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む、外来核酸を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認識されている技法を指すよう意図されている。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（（上記参照））および他の研究室マニュアルで見つけることができる。
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技法に応じて、わずかな細胞のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むことができることが既知である。これらの組み込み体を特定および選択するために、一般に、（例えば、抗生物質に対する抵抗性のための）選択可能なマーカーをコードする遺伝子が目的とする遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート等の薬物に対する抵抗性を付与するものが含まれる。導入された核酸で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生存する一方で、他の細胞は死ぬ）。
ＸＩＩ．バイオマーカー核酸およびポリペプチドの分析
バイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチドは、本明細書に記載の方法および当業者に既知の技法に従って分析されて、１）バイオマーカー転写物またはポリペプチドのレベルの改変、２）バイオマーカー遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの欠失または付加、４）バイオマーカー遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、５）発現制御領域等のバイオマーカー遺伝子の異常な修飾を含むが、これらに限定されない、本発明に有用な遺伝子改変または発現改変を特定することができる。
ａ．コピー数を検出するための方法
バイオマーカー核酸のコピー数を評価する方法は、当業者に周知である。染色体獲得または喪失の存在または不在は、単に本明細書で特定された領域またはマーカーのコピー数を決定することによって評価され得る。
一実施形態では、生体試料は、ゲノムマーカーを含むゲノム遺伝子座のコピー数変化の存在について試験される。少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０のコピー数が抗ＨＨＬＡ２抗体療法のより不良な転帰を予測する。
バイオマーカー遺伝子座のコピー数を評価する方法には、ハイブリダイゼーションベースのアッセイが含まれるが、これに限定されない。ハイブリダイゼーションベースのアッセイには、伝統的な「直接プローブ」法、例えば、サザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨおよびＦＩＳＨプラスＳＫＹ）法、および「比較プローブ」法、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡベースまたはオリゴヌクレオチドベースのＣＧＨが含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、基質（例えば、膜もしくはガラス）結合方法またはアレイベースのアプローチを含むが、これらに限定されない多種多様の形式で使用され得る。
一実施形態では、試料中のバイオマーカー遺伝子のコピー数の評価は、サザンブロットを伴う。サザンブロットでは、ゲノムＤＮＡ（典型的には、電気泳動ゲル上で断片および分離されたもの）が標的領域に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと、正常ゲノムＤＮＡ（例えば、同じまたは関連細胞、組織、臓器等の非増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの強度の比較により、標的核酸の相対コピー数の推定値が提供される。あるいは、試料中のコード核酸のコピー数を評価するためにノーザンブロットが利用され得る。ノーザンブロットでは、ｍＲＮＡが標的領域に特異的なプローブにハイブリダイズされる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルと、正常ＲＮＡ（例えば、同じまたは関連細胞、組織、臓器等の非増幅部分）の分析からの対照プローブシグナルとの強度の比較により、標的核酸の相対コピー数の推定値が提供される。あるいは、適切な対照（例えば、同じまたは関連細胞組織、臓器等の非増幅部分）と比較してより高いまたはより低い発現により、標的核酸の相対コピー数の推定値が提供されるように、ＲＮＡを検出するための当該技術分野で周知の他の方法が使用され得る。
ゲノムコピー数を決定するための代替手段は、インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：６４９）である。一般に、インサイチュハイブリダイゼーションは、以下のステップ：（１）分析される組織または生物学的構造の固定、（２）標的ＤＮＡのアクセス可能性を高め、かつ非特異的結合を減少させるための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理、（３）生物学的構造または組織における核酸混合物の核酸へのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄、および（５）ハイブリダイズされた核酸断片の検出を含む。これらのステップの各々で使用される試薬および使用条件は、特定の用途に応じて異なる。典型的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞が、固体支持体、典型的には、スライドガラスに固定される。核酸がプローブされる場合、細胞は、典型的には、熱またはアルカリで変性される。その後、これらの細胞は適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触して、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にする。その後、標的（例えば、細胞）は、典型的には、適切なシグナル対ノイズ比が得られるまで所定のストリンジェンシーでまたは増加するストリンジェンシーで洗浄される。プローブは、典型的には、例えば、放射性同位体または蛍光レポーターで標識される。一実施形態では、プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸（複数可）と特異的にハイブリダイズするのに十分に長い。プローブは、一般に、約２００塩基長～約１０００塩基長の範囲である。いくつかの用途では、反復配列のハイブリダイゼーション能力を阻止することが必要である。したがって、いくつかの実施形態では、非特異的ハイブリダイゼーションを阻止するために、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ－Ｉ
ＤＮＡが使用される。
ゲノムコピー数を決定するための代替手段は、比較ゲノムハイブリダイゼーションである。一般に、ゲノムＤＮＡは、正常参照細胞および試験細胞（例えば、腫瘍細胞）から単離され、必要に応じて増幅される。これらの２つの核酸は、差次的に標識され、その後、参照細胞の分裂中期の染色体にインサイチュでハイブリダイズされる。参照ＤＮＡおよび試験ＤＮＡの両方の反復配列は、ある手段によって、例えば、適切な遮断核酸とのプレハイブリダイゼーションによって、かつ／または当該ハイブリダイゼーション中に当該反復配列に対するかかる遮断核酸配列を含むことによって除去されるか、またはそれらのハイブリダイゼーション能力が低下するかのいずれかである。その後、結合した標識ＤＮＡ配列は、必要に応じて、視覚可能な形態にされる。コピー数が増加または減少した試験細胞における染色体領域は、２つのＤＮＡからのシグナル比が変化する領域を検出することによって特定され得る。例えば、試験細胞におけるコピー数が減少した領域は、ゲノムの他の領域と比較して参照よりも試験ＤＮＡから比較的より低いシグナルを示すであろう。試験細胞におけるコピー数が増加した領域は、試験ＤＮＡから比較的より高いシグナルを示すであろう。染色体の欠失または増倍が存在する場合、２つの標識からのシグナルの比率の差が検出され、この比率により、コピー数の尺度が提供される。ＣＧＨの別の実施形態であるアレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、固定化された染色体要素がアレイ上の一群の固体支持体に結合した標的核酸で置き換えられ、ゲノムの大部分または全てが一群の固体支持体に結合した標的に表されることを可能にする。標的核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（例えば、単一ヌクレオチド多型を検出するため）等を含み得る。アレイベースのＣＧＨは、（対照および可能な腫瘍試料を２つの異なる色素で標識し、ハイブリダイゼーション前にそれらを混合し、それにより、アレイ上のプローブの競合的ハイブリダイゼーションに起因する比率がもたらされることとは対照的に）単色標識で行われる場合もある。単色ＣＧＨでは、対照が標識され、１つのアレイにハイブリダイズされ、絶対シグナルが読み取られ、可能な腫瘍試料が標識され、第２のアレイ（同一の含有量）にハイブリダイズされ、絶対シグナルが読み取られる。コピー数の差が２つのアレイからの絶対シグナルに基づいて計算される。固定化された染色体またはアレイを調製する方法および比較ゲノムハイブリダイゼーションを行う方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，３３５，１６７号、同第６，１９７，５０１号、同第５，８３０，６４５号、および同第５，６６５，５４９号、ならびにＡｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１２２７－１２３４、Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１３８－９１４２、欧州特許庁公開第４３０，４０２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３：Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（１９９４）等を参照のこと）。別の実施形態では、Ｐｉｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：２０７－２１１またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：５３２１－５３２５（１９９２）のハイブリダイゼーションプロトコルが使用される。
なお別の実施形態では、増幅ベースのアッセイを使用して、コピー数を測定することができる。かかる増幅ベースのアッセイでは、核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において鋳型としての機能を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量に比例するであろう。適切な対照、例えば、健常組織との比較により、コピー数の尺度が提供される。
「定量的」増幅法は、当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同じプライマーを使用して既知の量の対照配列を同時に共増幅することを含む。これにより、ＰＣＲ反応を較正するために使用され得る内部標準が提供される。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に提供されている。定量的ＰＣＲ分析を使用したマイクロサテライト遺伝子座でのＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：５４０５－５４０９に記載されている。遺伝子の既知の核酸配列は、当業者が遺伝子の任意の部分を増幅するためにプライマーを通例的に選択することを可能にするのに十分である。蛍光発生的定量的ＰＣＲも本発明の方法で使用され得る。蛍光発生的定量的ＰＣＲでは、定量は、蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびＳＹＢＲグリーンの量に基づいている。
他の好適な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ等が含まれるが、これらに限定されない。
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）および主要コピー比率（ＭＣＰ）マッピング（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４（１）：６４－７１、Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４，２７６１－４、Ｈａｈｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５，４６７０－５、Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １７，８８－９３、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＭＢＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．９，２０４－２１９）も、増幅または欠失の領域を特定するために使用され得る。
ｂ．バイオマーカー核酸発現を検出するための方法
バイオマーカー発現は、転写分子またはタンパク質の発現を検出するための多種多様の周知の方法のうちのいずれかによって評価され得る。かかる方法の非限定的な例には、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられる。
好ましい実施形態では、特定の遺伝子の活性は、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の尺度、翻訳されたタンパク質の量の尺度、または遺伝子産物活性の尺度によって特徴付けられる。マーカー発現は、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性（これらはいずれも標準の技法を使用して測定され得る）を検出することを含む様々な方法で監視され得る。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性）レベルの定量化を含むか、またはあるいは、具体的には対照レベルと比較した遺伝子発現レベルの質的評価であり得る。検出されるレベルのタイプは、文脈から明らかであろう。
別の実施形態では、バイオマーカーおよびその機能的に同様の相同体（その断片または遺伝子改変を含む）の（例えば、その制御領域またはプロモーター領域における）発現レベルの検出または決定は、目的とするマーカーのＲＮＡレベルを検出または決定することを含む。一実施形態では、１つ以上の細胞が試験される対象から得られ、その細胞からＲＮＡが単離される。好ましい実施形態では、乳房組織細胞の試料が対象から得られる。
一実施形態では、ＲＮＡは、単一細胞から得られる。例えば、細胞は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって組織試料から単離され得る。この技法を使用して、細胞が、染色された組織切片を含む組織切片から単離され、それにより、所望の細胞が単離されることを確実にすることができる（例えば、Ｂｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４８１、Ｅｍｍｅｒｔ－Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９８、Ｆｅｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５４：６１、およびＭｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５８：１３４６を参照のこと）。例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（上記参照）は、事前に免疫染色された組織切片からの細胞の単離について説明している。
対象から細胞を得て、その細胞をインビトロで培養すること、例えば、ＲＮＡが抽出され得るより大きい細胞集団を得ることも可能である。非形質転換細胞の培養物、すなわち、初代細胞培養物を確立するための方法が当該技術分野で既知である。
個体由来の組織試料または細胞からＲＮＡを単離する際に、組織または細胞が対象から除去された後に遺伝子発現のいかなるさらなる変化も阻止することが重要であり得る。発現レベルの変化は、撹乱後に、例えば、熱ショックまたはリポ多糖（ＬＰＳ）もしくは他の試薬での活性化後に急速に変化することが知られている。加えて、組織および細胞中のＲＮＡは、急速に分解し得る。したがって、好ましい実施形態では、対象から得られた組織または細胞は、可能な限り迅速に瞬間凍結される。
ＲＮＡは、様々な方法、例えば、チオシアン酸グアニジウム溶解に続くＣｓＣｌ遠心分離によって組織試料から抽出され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４－５２９９）。単一細胞由来のＲＮＡは、例えば、Ｄｕｌａｃ，Ｃ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６、２４５およびＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０：１９９に記載の単一細胞からｃＤＮＡライブラリを調製するための方法に記載されるように得られ得る。例えば、ＲＮＡｓｉｎの包含により、ＲＮＡ分解を回避するために注意を払われなければならない。
その後、ＲＮＡ試料は、特定の種で濃縮され得る。一実施形態では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＲＮＡ試料から単離される。一般に、かかる精製は、ｍＲＮＡ上のポリ－Ａ尾部を利用する。具体的には、上述のように、ポリ－Ｔオリゴヌクレオチドは、固体支持体内に固定化されて、ｍＲＮＡに対する親和性リガンドとしての機能を果たし得る。この目的のためのキット、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が市販されている。
好ましい実施形態では、ＲＮＡ集団は、マーカー配列で濃縮される。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成によって、またはｃＤＮＡ合成および鋳型特異的インビトロ転写に基づく複数回の線形増幅によって行われ得る（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ ８６、９７１７、Ｄｕｌａｃ ｅｔ ａｌ．（上記参照）、およびＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照のこと）。
特定の種または配列で濃縮されたＲＮＡ集団または濃縮されていないＲＮＡ集団がさらに増幅され得る。本明細書で定義される場合、「増幅プロセス」は、ＲＮＡ中の分子を強化するか、増加させるか、または増大させるように設計されている。例えば、ＲＮＡがｍＲＮＡである場合、シグナルが検出可能であるか、または検出が増強されるように、ＲＴ－ＰＣＲ等の増幅プロセスが利用されて、ｍＲＮＡを増幅することができる。かかる増幅プロセスは、特に生体試料、組織試料、または腫瘍試料のサイズまたは体積が小さい場合に有益である。
様々な増幅法および検出法が使用され得る。例えば、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、または米国特許第５，３２２，７７０号に記載される両ステップでの単一の酵素の使用、またはＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０－８４（１９９４）に記載されるｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写に続く対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＡＧＬＣＲ）は本発明の範囲内である。リアルタイムＰＣＲも使用され得る。
本明細書で利用され得る他の既知の増幅法には、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８（１９９０）に記載されており、かつＮａｔｕｒｅ ３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１－９２（１９９１）にも記載されているいわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技法、公開された欧州特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載のＱ－ベータ増幅、Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９－１３（１９９６）および欧州特許出願第６８４３１５号に記載の鎖置換増幅、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３２２４６１号に記載の標的媒介増幅、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）を参照のこと）、自己持続配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）を参照のこと）、および転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３（１９８９）を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子発現の絶対レベルおよび相対レベルを決定するための多くの技法が当該技術分野で既知であり、本発明での使用に好適な一般に使用されている技法には、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、およびＰＣＲベースの技法、例えば、定量的ＰＣＲおよび差次的発現ＰＣＲが含まれる。例えば、ノーザンブロッティングは、ＲＮＡ調製物を変性アガロースゲル上に泳動させ、それを、活性化セルロース、ニトロセルロース、またはガラスもしくはナイロン膜等の好適な支持体に移送することを含む。その後、放射性標識ｃＤＮＡまたはＲＮＡが調製物にハイブリダイズされ、洗浄され、オートラジオグラフィーによって分析される。
放射活性的に標識されたアンチセンスＲＮＡプローブが生検試料の薄切片とハイブリダイズされ、洗浄され、ＲＮａｓｅで切断され、オートラジオグラフィーのために感受性乳剤に曝露されるインサイチュハイブリダイゼーション視覚化も用いられ得る。試料がヘマトキシリンで染色されると、試料の組織学的組成を示すことができ、好適な光フィルターを用いた暗視野撮像により、現像された乳剤が示される。ジゴキシゲニン等の非放射性標識も使用され得る。
あるいは、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップ、またはマイクロアレイ上で検出され得る。対象から得られた試験試料の標識核酸が、バイオマーカーＤＮＡを含む固体表面にハイブリダイズされ得る。正のハイブリダイゼーションシグナルがバイオマーカー転写物を含有する試料で得られる。ＤＮＡアレイを調製する方法およびそれらを使用する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６１８，６７９６号、同第６，３７９，８９７号、同第６，６６４，３７７号、同第６，４５１，５３６号、同第５４８，２５７号、米国２００３／０１５７４８５号、ならびにＳｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０，４６７－４７０、Ｇｅｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４，１６８－１７３、およびＬｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５，５９－６５を参照のこと）。遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）も行われ得る（例えば、米国特許出願第２００３／０２１５８５８号を参照のこと）。
ｍＲＮＡレベルを監視するために、例えば、ｍＲＮＡが試験される生体試料から抽出され、逆転写され、蛍光標識ｃＤＮＡプローブが生成される。その後、マーカーｃＤＮＡにハイブリダイズすることができるマイクロアレイが標識ｃＤＮＡプローブでプローブされ、スライドがスキャンされ、蛍光強度が測定される。この強度は、ハイブリダイゼーション強度および発現レベルと相関する。
本明細書に記載の方法で使用され得るプローブのタイプには、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、およびゲノムプローブが含まれる。使用されるプローブのタイプは、一般に、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションの場合にはリボプローブおよびノーザンブロッティングの場合にはｃＤＮＡ等の特定の状況によって決定される。一実施形態では、プローブは、ＲＮＡに特有のヌクレオチド領域に向けられる。プローブは、マーカーｍＲＮＡ転写物を差次的に認識するのに必要な程度に短くてもよく、例えば、１５塩基程度に短くてもよいが、少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０塩基、またはそれ以上の塩基のプローブが使用されてもよい。一実施形態では、プライマーおよびプローブは、ストリンジェントな条件下で、マーカーに対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ヌクレオチド配列に少なくとも９５％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。別の実施形態では、「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションは、配列間に少なくとも９７％の同一性が存在する場合に生じる。
プローブの標識の形態は、放射性同位体、例えば、３２Ｐおよび３５Ｓの使用等の任意の適切なものであり得る。好適に標識された塩基の使用により、プローブが化学的に合成されるか生物学的に合成されるかにかかわらず、放射性同位体での標識が達成され得る。
一実施形態では、生体試料は、試験対象由来のポリペプチド分子を含有する。あるいは、生体試料は、試験対象由来のｍＲＮＡ分子または試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。
別の実施形態では、本方法は、対照対象から対照生体試料を得ることと、マーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在が生体試料中で検出されるように、対照試料を、マーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片を検出することができる化合物または薬剤と接触させることと、対照試料中のマーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在を、試験試料中のマーカーポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在と比較することとをさらに含む。
ｃ．バイオマーカータンパク質発現を検出するための方法
バイオマーカータンパク質の活性またはレベルは、発現されたポリペプチドを検出または定量化することによって検出および／または定量化され得る。ポリペプチドは、当業者に周知のいくつかの手段のうちのいずれかによって検出および定量化され得る。バイオマーカー核酸およびその機能的に同様の相同体（その断片または遺伝子改変を含む）によってコードされるポリペプチドの（例えば、その制御領域またはプロモーター領域における）異常なポリペプチド発現レベルは、抗ＨＨＬＡ２抗体療法に対するがんの応答の可能性と関連付けられる。ポリペプチドを検出するための当該技術分野で既知の任意の方法が使用され得る。かかる方法には、免疫拡散、免疫電気泳動、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティング、結合剤リガンドアッセイ、免疫組織化学的技法、凝集、補体アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー等が含まれるが、これらに限定されない（例えば、参照により組み込まれる、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．ｐｐ ２１７－２６２，１９９１）。抗体をエピトープ（複数可）と反応させることと、標識ポリペプチドまたはその誘導体を競合的に置き換えることとを含む、結合剤リガンド免疫アッセイ法が好ましい。ある特定の実施形態では、表２に列記される抗体を使用して、表１に列記されるバイオマーカーを検出および／または定量化する。
例えば、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ手順は、所望のバイオマーカータンパク質標準が（１２５Ｉもしくは３５Ｓ等の放射性同位体、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリ性ホスファターゼ等のアッセイ可能な酵素で）標識され、非標識試料と一緒に、対応する抗体と接触させられるように行われ得、そこで、第２の抗体が第１の抗体に結合するために使用され、放射活性または固定化酵素がアッセイされる（競合的アッセイ）。あるいは、試料中のバイオマーカータンパク質が対応する固定化抗体と反応させられ、放射性同位体標識または酵素標識抗バイオマーカータンパク質抗体がこの系と反応させられ、放射活性または酵素がアッセイされる（ＥＬＩＳＡ－サンドイッチアッセイ）。好適な場合、他の従来の方法も用いられ得る。
上述の技法は、「一段階」アッセイまたは「二段階」アッセイとして本質的に行われ得る。「一段階」アッセイは、抗原を固定化抗体と接触させ、洗浄することなく、混合物を標識抗体と接触させることを含む。「二段階」アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。好適な場合、他の従来の方法も用いられ得る。
一実施形態では、バイオマーカータンパク質レベルを測定するための方法は、生物学的検体を、バイオマーカータンパク質に選択的に結合する抗体またはそのバリアント（例えば、断片）と接触させるステップと、当該抗体またはそのバリアントが当該試料に結合しているかを検出するステップと、それにより、バイオマーカータンパク質レベルを測定するステップとを含む。
バイオマーカータンパク質および／または抗体の酵素標識および放射標識は、従来の手段によって達成され得る。かかる手段は、一般に、特に酵素の活性に悪影響を及ぼさないように、例えば、グルタルアルデヒドによる、問題となっている抗原または抗体への酵素の共有結合的連結を含み、これは、酵素がその基質と依然として相互作用することができなければならないことを意味するが、酵素の全てが活性である必要はないが、但し、アッセイの達成を可能とするのに十分な酵素が活性のままであることを条件とする。実際には、酵素に結合するためのいくつかの技法は非特異的であり（例えば、ホルムアルデヒドを使用して）、ある割合の活性酵素しかもたらさない。
アッセイ系の１つの成分を支持体上に固定化し、それにより、系の他の成分がその１つの成分と接触し、多大な労力と時間を必要とすることなく容易に除去されることを可能にすることが通常望ましい。第２の相が第１の相から離れて固定化されることが可能であるが、通常、１つの相で十分である。
酵素自体を支持体上に固定化することが可能であるが、固相酵素が必要とされる場合、これは、通常、抗体に結合し、その抗体を当該技術分野で周知の支持体、モデル、および系に付着することによって最も良好に達成される。単純なポリエチレンが好適な支持体を提供し得る。
標識に用いられ得る酵素は特に限定されていないが、例えばオキシダーゼ群のメンバーから選択され得る。これらは、それらの基質との反応により過酸化水素の産生を触媒し、グルコースオキシダーゼは、その良好な安定性、入手の容易さおよび安価、ならびにその基質（グルコース）の入手し易さのため、使用されることが多い。オキシダーゼの活性は、当該技術分野で周知の制御された条件下で酵素標識抗体と基質との反応後に形成された過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。
他の技法を使用して、本開示に基づいて専門家の選好に従ってバイオマーカータンパク質を検出することができる。かかる技法の１つは、好適に処理された試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた後にニトロセルロースフィルター等の固体支持体に移すウエスタンブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３５０（１９７９））である。その後、抗バイオマーカータンパク質抗体（非標識）を支持体と接触させ、標識タンパク質Ａまたは抗免疫グロブリン（１２５Ｉ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼを含む好適な標識）等の二次免疫学的試薬によってアッセイする。クロマトグラフ検出も使用され得る。
免疫組織化学を使用して、例えば、生検試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。好適な抗体が、例えば、細胞の薄層と接触させられ、洗浄され、その後、第２の標識抗体と接触させられる。標識は、蛍光マーカー、酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、アビジン、または放射標識により得る。このアッセイは、顕微鏡を使用して視覚的にスコア化される。
イントラボディ等の抗バイオマーカータンパク質抗体（例えば、表２に列記される）も撮像目的のために使用されて、例えば、対象の細胞および組織中のバイオマーカータンパク質の存在を検出することができる。好適な標識には、放射性同位体、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。
インビボ撮像の目的のために、抗体は、それ自体が体外から検出不能であるため、検出を可能にするために標識されるか、または別様に修飾されなければならない。この目的のためのマーカーは、抗体結合を実質的に妨害しないが、外部検出を可能にする任意のマーカーであり得る。好適なマーカーには、Ｘ線ラジオグラフィー、ＮＭＲ、またはＭＲＩによって検出され得るものが含まれ得る。Ｘ線ラジオグラフィー技法の場合、好適なマーカーには、検出可能な放射線を放出するが、対象に明らかに有害ではない任意の放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム等）が含まれる。ＮＭＲおよびＭＲＩに好適なマーカーには、一般に、例えば、関連ハイブリドーマの栄養素の好適な標識によって抗体に組み込まれ得る重水素等の検出可能な特徴的スピンを有するものが含まれる。
対象のサイズおよび使用される撮像システムにより、診断的画像を生成するのに必要な撮像部分の量が決定される。放射性同位体部分の場合、ヒト対象について、注射される放射活性の量は、通常、テクネチウム－９９約５～２０ミリキュリーの範囲である。その後、標識された抗体または抗体断片は、バイオマーカータンパク質を含有する細胞の場所に優先的に蓄積する。その後、標識された抗体または抗体断片が既知の技法を使用して検出され得る。
バイオマーカータンパク質を検出するために使用され得る抗体には、天然であるか合成であるか、全長であるかその断片であるか、モノクローナルであるかポリクローナルであるかにかかわらず、検出されるバイオマーカータンパク質に十分に強くかつ特異的に結合する任意の抗体（例えば、表２に列記される）が含まれる。抗体は、最大約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２ＭのＫｄを有し得る。「特異的に結合する」という語句は、例えば、結合が、同一または同様のエピトープ、抗原、または抗原決定基の第２の調製物で置き換えられ得るか、またはそれと競合され得るような様式での、抗体のエピトープまたは抗原または抗原決定基への結合を指す。抗体は、関連タンパク質等の他のタンパク質と比較してバイオマーカータンパク質に優先的に結合し得る。
抗体は、市販されているか、または当該技術分野で既知の方法に従って調製され得る。
使用され得る抗体およびその誘導体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ、ヒト、ヒト化、霊長類化（ＣＤＲ－グラフト化）、ベニヤ化、または一本鎖抗体、ならびに抗体の機能的断片、すなわち、バイオマーカータンパク質結合断片を包含する。例えば、バイオマーカータンパク質またはその一部（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を含むが、これらに限定されない）に結合することができる抗体断片が使用され得る。かかる断片は、酵素的切断または組換え技法によって産生され得る。例えば、パパインまたはペプシン切断により、それぞれ、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片が生成され得る。必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼもＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を生成するために使用され得る。抗体は、１つ以上の終止コドンが天然終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して様々な切断形態で産生される場合もある。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ、ドメイン、およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計され得る。
合成抗体および操作された抗体は、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０，１２５，０２３号Ｂ１）、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，８１６，３９７号）、Ｂｏｓｓ
ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０，１２０，６９４号Ｂ１）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（ＷＯ８６／０１５３３）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０，１９４，２７６号Ｂ１）、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）、Ｗｉｎｔｅｒ（欧州特許第０，２３９，４００号Ｂ１）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０４５１２１６号Ｂ１）、およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（欧州特許第０５１９５９６号Ａ１）に記載されている。霊長類化抗体についてはＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５－１４６０（１９９２）、一本鎖抗体についてはＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，９４６，７７８号）およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６（１９８８））も参照されたい。ライブラリ、例えば、ファージディスプレイライブラリから産生された抗体も使用され得る。
いくつかの実施形態では、抗体以外のバイオマーカータンパク質に特異的に結合する薬剤、例えば、ペプチドが使用される。バイオマーカータンパク質に特異的に結合するペプチドは、当該技術分野で既知の任意の手段によって特定され得る。例えば、バイオマーカータンパク質の特異的ペプチド結合剤は、ペプチドファージディスプレイライブラリの使用についてスクリーニングされ得る。
ｄ．バイオマーカーの構造的改変を検出するための方法
以下の例証的な方法は、例えば、過剰発現される、過剰機能的である等のＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＫＩＲ３ＤＬ３を特定するために、バイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチド分子の構造的改変の存在を特定するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、改変の検出は、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、またはあるいはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７－１０８０、およびＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６０－３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、バイオマーカー遺伝子等のバイオマーカー核酸の点突然変異の検出に特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５－６８２を参照のこと）。この方法は、対象から細胞試料を収集するステップと、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、またはそれらの両方）を単離するステップと、バイオマーカー遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、核酸試料を、バイオマーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させるステップと、増幅産物の存在または不在を検出するステップ、または増幅産物のサイズを検出して、対照試料と長さを比較するステップとを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲを予備的増幅ステップとして本明細書に記載の突然変異を検出するために使用される技法のうちのいずれかと併せて使用することが望ましくあり得ることが理解される。
代替の増幅法には、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅法が含まれ、その後に、当業者に周知の技法を使用した増幅された分子の検出が続く。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合の核酸分子の検出に特に有用である。
代替の実施形態では、試料細胞由来のバイオマーカー核酸の突然変異は、制限酵素切断パターンの改変によって特定され得る。例えば、試料ＤＮＡおよび対照ＤＮＡが単離され、増幅され（任意に）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと消化され、断片長サイズがゲル電気泳動によって決定され、比較される。試料ＤＮＡと対照ＤＮＡとの間の断片長サイズの差が、試料ＤＮＡの突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失による特異的突然変異の存在についてスコア化することができる。
他の実施形態では、バイオマーカー核酸の遺伝子突然変異は、試料核酸および対照核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを、何百または何千ものオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることによって特定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：２４４－２５５、Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３－７５９）。例えば、バイオマーカーの遺伝子突然変異は、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）（上記参照）に記載されるように、光生成ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイで特定され得る。簡潔には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、試料および対照中のＤＮＡの長いストレッチを走査して、連続的な重複プローブの線形アレイを作製することによって配列間の塩基の変化を特定することができる。このステップにより、点突然変異の特定が可能になる。このステップの後に、検出される全てのバリアントまたは突然変異に相補的なより小さい特殊化されたプローブアレイを使用することによって特異的突然変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。突然変異アレイは各々、並列プローブセットから成り、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は突然変異体遺伝子に相補的である。かかるバイオマーカーの遺伝子突然変異は、例えば、生殖系列および体細胞突然変異を含む様々な状況で特定され得る。
さらに別の実施形態では、当該技術分野で既知の様々な配列決定反応のうちのいずれかを使用して、バイオマーカー遺伝子を直接配列決定し、試料バイオマーカーの配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって突然変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３によって開発された技法に基づくものが挙げられる。質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７－１６２、およびＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７－１５９を参照のこと）を含む、様々な自動配列決定手順のうちのいずれかが、診断アッセイを行う際に利用され得ることも企図される（Ｎａｅｖｅ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８－５３）。
バイオマーカー遺伝子の突然変異を検出するための他の方法には、切断薬剤からの保護を使用してＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、当該技術分野の技法である「ミスマッチ切断」は、野生型バイオマーカー配列を含有する（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを組織試料から得られた潜在的に突然変異のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることによって形成されたヘテロ二重鎖を提供することから開始する。二本鎖二重鎖は、対照鎖と試料鎖との間の塩基対ミスマッチにより存在するもの等の二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖がＲＮａｓｅで処理され、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドがＳＩヌクレアーゼで処理されて、ミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかがヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理されて、ミスマッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域を消化した後、結果として生じた物質が変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離されて、突然変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７およびＳａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６－２９５を参照されたい。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡが検出のために標識され得る。
なお別の実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞試料から得られたバイオマーカーｃＤＮＡの点突然変異を検出およびマッピングするための定義された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７－１６６２）。例示の実施形態に従って、バイオマーカー配列、例えば、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理された野生型バイオマーカーおよび切断産物（存在する場合）に基づくプローブが、電気泳動プロトコル等から検出され得る（例えば、米国特許第５，４５９，０３９号）。
他の実施形態では、電気泳動移動度の改変を使用して、バイオマーカー遺伝子の突然変異を特定することができる。例えば、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）を使用して、突然変異核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５－１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３－７９も参照のこと）。試料および対照バイオマーカー核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は変性され、復元され得る。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、電気泳動移動度の結果として生じた改変は、単一塩基の変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡ断片は、標識プローブで標識または検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化により敏感である（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。好ましい実施形態では、主題の方法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためのヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
さらに別の実施形態では、変性剤勾配を有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異断片または野生型断片の移動が変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥが分析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによっておよそ４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全に変性しないことを確実にするように修飾される。さらなる実施形態では、温度勾配が変性勾配の代わりに使用されて、対照ＤＮＡと試料ＤＮＡとの移動度の差を特定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）。
点突然変異を検出するための他の技法の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の突然変異が中心に配置されるように調製され得、その後、完全マッチが見つけられた場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０）。かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたはいくつかの異なる突然変異にハイブリダイズされる。
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術が、本発明と併せて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、目的とする突然変異を、分子の中心に（これにより、増幅が差次的ハイブリダイゼーションに依存するようになる）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７－２４４８）、または適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減する１つのプライマーの最も３’側に（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）有し得る。加えて、切断ベースの検出を行うために突然変異の領域内に新規制限部位を導入することが望ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。ある特定の実施形態では、増幅が増幅用のＴａｑリガーゼを使用して行われる場合もあることが理解される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１８９）。そのような場合、５’配列の３’末端に完全マッチが存在する場合にのみライゲーションが生じ、増幅の存在または不在を探すことによって特定の部位での既知の突然変異の存在を検出することを可能にする。
抗がん療法
抗ＨＨＬＡ２抗体療法の有効性は、本明細書に記載の方法による対象におけるがんに関連するバイオマーカー量および／または活性に従って予測される。一実施形態では、かかる抗ＨＨＬＡ２抗体療法または療法の組み合わせ（例えば、別の免疫チェックポイント阻害剤等の１つ以上の追加の抗がん療法と組み合わせた１つ以上の抗ＨＨＬＡ２抗体療法）は、特に対象が最初に抗ＨＨＬＡ２抗体療法に応答する可能性の高い者として示された場合に投与され得る。別の実施形態では、かかる抗ＨＨＬＡ２抗体療法は、対象が抗ＨＨＬＡ２抗体療法に応答する可能性の低い者として示されたときに避けられ得、標的および／または非標的抗がん療法等の代替の治療レジメンが投与され得る。併用療法も企図され、これは、例えば、１つ以上の化学療法剤および放射線、１つ以上の化学療法剤および免疫療法、または１つ以上の化学療法剤、放射線、および化学療法を含み得、これらの組み合わせは各々、抗免疫チェックポイント療法との併用であり得る。加えて、特定の標的を調節するための薬剤の任意の代表的な実施形態は、当業者によって本明細書および以下に記載の任意の他の標的に適応され得る（例えば、本明細書に記載の直接および間接的ＨＨＬＡ２阻害剤は、他の免疫チェックポイント阻害剤および／またはＨＨＬＡ２、例えば、単一特異性抗体、二重特異性抗体、非活性化形態、小分子、ペプチド、干渉核酸等に適用され得る）。
「標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用し、それにより、がんを治療する薬剤の投与を指す。一例には、当該技術分野で周知の免疫チェックポイント阻害剤が挙げられる。例えば、当該技術分野で周知であり、かつ上に記載されている治療用モノクローナル遮断抗体等の抗ＣＴＬＡ－４経路剤を使用して、ＣＴＬＡ－４リガンド（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）等のＣＴＬＡ－４経路の望ましくない成分を発現する腫瘍微小環境および細胞を標的とすることができる。
例えば、「ＣＴＬＡ－４経路」という用語は、ＣＴＬＡ－４受容体およびそのリガンド、例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６を指す。「ＣＴＬＡ－４経路阻害剤」は、相互作用によって別様に生成された免疫阻害性シグナル伝達が遮断されるか、またはさもなければ低下するように、ＣＴＬＡ－４とそのリガンドの一方または両方との間の相互作用を遮断するか、またはさもなければ低下させる。抗免疫チェックポイント阻害剤は、直接または間接的であり得る。直接抗免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントとそのリガンドの少なくとも一方との間の相互作用を遮断するか、またはさもなければ低下させる。例えば、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４のそのリガンドの一方または両方との結合を遮断することができる。直接ＣＴＬＡ－４組み合わせ阻害剤は、特にＣＴＬＡ－４の天然結合パートナー（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）が既知であるため、当該技術分野で周知である。
例えば、二重特異性抗体等のＣＴＬＡ－４と１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーとの間の相互作用を直接遮断する薬剤は、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる（すなわち、ＣＴＬＡ－４経路阻害剤として）。あるいは、ＣＴＬＡ－４とそのリガンドの一方または両方との間の相互作用を間接的に遮断する薬剤は、阻害性シグナル伝達を阻止し、免疫応答を上方制御することができる。例えば、Ｂ７－１またはその可溶性形態は、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドへの結合により、ＣＴＬＡ－４への結合に利用可能なＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの有効濃度を間接的に減少させる。例示の薬剤には、受容体とリガンド（複数可）との間の相互作用を遮断するＣＴＬＡ－４および１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーに対する単一特異性または二重特異性遮断抗体、ＣＴＬＡ－４および１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーの非活性化形態（例えば、優性ネガティブまたは可溶性ポリペプチド）、ＣＴＬＡ－４と１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーとの間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド、ＣＴＬＡ－４および１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーに結合し、その受容体とリガンド（複数可）との間の相互作用を阻害する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したＣＴＬＡ－４および１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーの細胞外部分）、天然ＣＴＬＡ－４および１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーの非活性化形態、ならびに天然ＣＴＬＡ－４および１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーの可溶性形態が挙げられる。
間接的抗免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントとそのリガンドの少なくとも一方との間の相互作用によって生成された免疫阻害性シグナル伝達を遮断するか、またはさもなければ低下させる。例えば、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とそのリガンドの一方または両方との間の相互作用を必ずしも直接遮断することなく、ＣＴＬＡ－４とそのリガンドの一方または両方との間の相互作用を遮断することができる。例えば、間接的阻害剤には、免疫阻害性シグナル伝達を遮断するか、またはさもなければ低下させるために、シグナル伝達することを必要とされるＣＴＬＡ－４および／または１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーの細胞内部分に結合するイントラボディが含まれる。同様に、ＣＴＬＡ－４および／または１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーの発現を減少させる核酸は、相互作用のための成分の利用可能性を除去することによって、ＣＴＬＡ－４とそのリガンドの一方または両方との間の相互作用を間接的に阻害することができる。かかる核酸分子は、転写または翻訳のためにＣＴＬＡ－４および／または１つ以上のＣＴＬＡ－４リガンドおよび／または結合パートナーを遮断することができる。
同様に、ＨＨＬＡ２とＨＨＬＡ２受容体（複数可）／共受容体（複数可）との間の相互作用を直接的に遮断する薬剤、例えば、抗ＨＨＬＡ２抗体、１つ以上のＨＨＬＡ２受容体（複数可）／共受容体（複数可）を認識する抗体、抗ＨＨＬＡ２／抗免疫チェックポイント二重特異性抗体等は、ＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）のシグナル伝達およびその下流免疫応答を阻止することができる。あるいは、ＨＨＬＡ２とその受容体（複数可）／共受容体（複数可）との間の相互作用を間接的に遮断する薬剤は、ＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）のシグナル伝達およびその下流免疫応答を阻止することができる。例えば、ＨＨＬＡ２の細胞外ドメイン等のＨＨＬＡ２の可溶性形態は、その受容体（複数可）／共受容体（複数可）への結合により、細胞表面上のＨＨＬＡ２への結合に利用可能なその受容体（複数可）／共受容体（複数可）の有効濃度を間接的に減少させる。例示の薬剤には、受容体とリガンド（複数可）との間の相互作用を遮断するＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）に対する単一特異性または二重特異性遮断抗体、ＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）の非活性化形態（例えば、優性ネガティブまたは可溶性ポリペプチド）、ＨＨＬＡ２とその受容体（複数可）／共受容体（複数可）との間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド、ＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）に結合し、その受容体とリガンド（複数可）との間の相互作用を阻害する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）の細胞外部分）、天然ＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）の非活性化形態、ならびに天然ＨＨＬＡ２および／またはその受容体（複数可）／共受容体（複数可）の可溶性形態が挙げられる。
免疫応答を誘発または増幅するように設計された免疫療法は、「活性化免疫療法」と称される。免疫応答を低下または抑制するように設計された免疫療法は、「抑制免疫療法」と称される。遺伝学的に修飾された移植がん細胞に免疫系効果をもたらすと考えられる任意の薬剤をアッセイして、薬剤が免疫療法であるかを決定し、所与の遺伝子修飾が免疫応答の調節にもたらす効果を決定することができる。いくつかの実施形態では、免疫療法は、がん細胞特異的である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、「非標的」であり得、これは、免疫系細胞と選択的に相互作用しないが、免疫系機能を調節する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子療法、および放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して産生された予め形成された抗体の投与（例えば、任意に化学療法剤または毒素に結合しているモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって達成される宿主の短期間保護のための受動免疫を伴い得る。この免疫療法は、がん細胞株の細胞毒性リンパ球によって認識されるエピトープの使用にも焦点を合わせることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチド等を使用して、腫瘍またはがんの発症、進行、および／または病理に関連した生体分子を選択的に調節することができる。
一実施形態では、免疫療法は、養子細胞ベースの免疫療法を含む。照射自己または同種腫瘍細胞、腫瘍溶解物またはアポトーシス腫瘍細胞、抗原提示細胞ベースの免疫療法、樹状細胞ベースの免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲ Ｔ細胞療法、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、および／または抗原提示細胞を含むが、これらに限定されない、周知の養子細胞ベースの免疫療法様式。かかる細胞ベースの免疫療法は、１つ以上の遺伝子産物を発現して免疫応答をさらに調節する、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインを発現するように、かつ／またはＭａｇｅ－１、ｇｐ－１００、患者特異的ネオ抗原ワクチン等の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原を発現するようにさらに修正され得る。
別の実施形態では、免疫療法は、非細胞ベースの免疫療法を含む。一実施形態では、ワクチン増強アジュバントを有するまたは有しない抗原を含む組成物が使用される。かかる組成物は、ペプチド組成物、腫瘍溶解性ウイルス、融合タンパク質を含む組換え抗原等の多くの周知の形態で存在する。なお別の実施形態では、免疫調節インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３等、ならびにそのモジュレーター（例えば、遮断抗体またはより強力な形態もしくはより長い時間持続する形態）が使用される。さらに別の実施形態では、免疫調節サイトカイン、例えば、インターフェロン、Ｇ－ＣＳＦ、イミキモド、ＴＮＦアルファ等、ならびにそのモジュレーター（例えば、遮断抗体またはより強力な形態もしくはより長い時間持続する形態）が使用される。別の実施形態では、免疫調節ケモカイン、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、およびＣＸＣＬ７等、ならびにそのモジュレーター（例えば、遮断抗体またはより強力な形態もしくはより長い時間持続する形態）が使用される。別の実施形態では、免疫抑制を標的とする免疫調節分子、例えば、ＳＴＡＴ３シグナル伝達モジュレーター、ＮＦカッパＢシグナル伝達モジュレーター、および免疫チェックポイントモジュレーターが使用される。「免疫チェックポイント」および「抗免疫チェックポイント療法」という用語は、上で説明されている。
なお別の実施形態では、免疫調節薬、例えば、免疫細胞増殖抑制薬、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、イムノフィリン、およびそのモジュレーター（例えば、ラパマイシン、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）（シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ））、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、リダフォロリムス、エベロリムス
、テムシロリムス、ゾタロリムス等）、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベータメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｏｃａ）アルドステロン、非グルココルチコイドステロイド、ピリミジン合成阻害剤、レフルノミド、テリフルノミド、葉酸類似体、メトトレキサート、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、サリドマイド、レナリドミド、ペントキシフィリン、ブプロピオン、クルクミン、カテキン、オピオイド、ＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸、ミリオシン、フィンゴリモド、ＮＦ－ｘＢ阻害剤、ラロキシフェン、ドロトレコギンアルファ、デノスマブ、ＮＦ－ｘＢシグナル伝達カスケード阻害剤、ジスルフィラム、オルメサルタン、ジチオカルバメート、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２、Ｐｒｏｌ、ＮＰＩ－００５２、クルクミン、ゲニステイン、レスベラトロル、パルテノリド、サリドマイド、レナリドミド、フラボピリドール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三酸化ヒ素、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、Ｉ３Ｃ（インドール－３－カルビノール）／ＤＩＭ（ジインドールメタン）（１３Ｃ／ＤＩＭ）、Ｂａｙ １１－７０８２、ルテオリン、細胞透過性ペプチドＳＮ－５０、ＩＫＢα－スーパーリプレッサー過剰発現、ＮＦＫＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、またはそれらのいずれかの誘導体もしくは類似体が使用される。さらに別の実施形態では、免疫調節抗体またはタンパク質が使用される。例えば、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、または４－１ＢＢ、Ｔ細胞二重特異性抗体、抗ＩＬ－２受容体抗体、抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、抗ＣＤ４抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ザノリムマブ、抗ＣＤ１１ａ抗体、エファリズマブ、抗ＣＤ１８抗体、エルリズマブ、ロベリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、アフツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、パスコリズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ２３抗体、ルミリキシマブ、抗ＣＤ４０抗体、テネリキシマブ、トラリズマブ、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ルプリズマブ、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、アセリズマブ、抗ＣＤ８０抗体、ガリキシマブ、抗ＣＤ１４７抗体、ガビリモマブ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）阻害抗体、ベリムマブ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質、アバタセプト、ベラタセプト、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、トレメリムマブ、抗エオタキシン１抗体、ベルチリムマブ、抗ａ４－インテグリン抗体、ナタリズマブ、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、トシリズマブ、抗ＬＦＡ－１抗体、オデュリモマブ、抗ＣＤ２５抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ、抗ＣＤ５抗体、ゾリモマブ、抗ＣＤ２抗体、シプリズマブ、ネレリモマブ、ファラリモマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、セデリズマブ、ドルリモマブアリトクス、ドルリキシズマブ、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、レブリリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトクス、バパリキシマブ、ベパリモマブ、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、アナキンラ、抗ＩＬ－５抗体、メポリズマブ、ＩｇＥ阻害剤、オマリズマブ、タリズマブ、ＩＬ１２阻害剤、ＩＬ２３阻害剤、ウステキヌマブ等に結合する抗体。
ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ等の免疫応答を増強する栄養補助剤が当該技術分野で周知であり（例えば、米国特許第４，９８１，８４４号および同第５，２３０，９０２号ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／００４４８３号を参照のこと）、本明細書に記載の方法で使用され得る。
同様に、薬剤および免疫療法以外の療法またはそれらの組み合わせを抗ＨＨＬＡ２抗体と組み合わせて使用して、免疫応答を刺激し、それにより、それから恩恵を受けるであろう状態を治療することができる。例えば、化学療法、放射線、後成的修飾因子（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）修飾因子、メチル化修飾因子、リン酸化修飾因子等）、標的療法等が当該技術分野で周知である。
「非標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、がんを治療する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例には、化学療法、遺伝子療法、および放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、化学療法が使用される。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。かかる化学療法剤は、以下の化合物の群：白金化合物、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、抗分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、および毒素、ならびにそれらの合成誘導体から選択されるものであり得るが、これらに限定されない。例示の化合物には、アルキル化剤（シスプラチン、トレオスルファン、およびトロホスファミド）、植物アルカロイド（ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル）、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（テニポシド、クリスナトール、およびマイトマイシン）、抗葉酸剤（メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびヒドロキシウレア）、ピリミジン類似体（５－フルオロウラシル、ドキシフルリジン、およびシトシンアラビノシド）、プリン類似体（メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ＤＮＡ代謝拮抗剤（２’－デオキシ－５－フルオロウリジン、グリシン酸アフィジコリン、およびピラゾロイミダゾール）、ならびに有糸分裂阻害剤（ハリコンドリン、コルヒチン、およびリゾキシン）が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物も使用され得る。ＦＬＡＧには、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）、およびＧ－ＣＳＦが含まれる。ＣＨＯＰには、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンが含まれる。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ－１および／またはＰＡＲＰ－２）阻害剤が使用され、かかる阻害剤は当該技術分野で周知である（例えば、Ｏｌａｐａｒｉｂ、ＡＢＴ－８８８、ＢＳＩ－２０１、ＢＧＰ－１５（Ｎ－Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＩＮＯ－１００１（Ｉｎｏｔｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ
ａｌ．，２００１、Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ）、３－アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、４－アミノ－１，８－ナフタルイミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、６（５Ｈ）－フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、ベンズアミド（米国特許Ｒｅ第３６，３９７号）、およびＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．）。作用機構は、一般に、ＰＡＲＰに結合し、その活性を低下させるＰＡＲＰ阻害剤の能力に関連する。ＰＡＲＰは、ベータ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のニコチンアミドおよびポリ－ＡＤＰ－リボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰ－リボース）およびＰＡＲＰはいずれも、転写制御、細胞増殖、ゲノム安定性、および発がんに関連付けられている（Ｂｏｕｃｈａｒｄ Ｖ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２００３，ｐｐ．４４６－４５４（９）、Ｈｅｒｃｅｇ Ｚ．；Ｗａｎｇ Ｚ．－Ｑ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４７７，Ｎｕｍｂｅｒ １，２ Ｊｕｎ．２００１，ｐｐ．９７－１１０（１４））。ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖破壊（ＳＳＢ）の修復における重要な分子である（ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：７３０３－７３０７、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ Ｖ，Ｄａｎｔｚｅｒ Ｆ，Ａｍｅ Ｊ Ｃ，ｄｅ Ｍｕｒｃｉａ Ｇ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：５１７－５２８、Ｗａｎｇ Ｚ Ｑ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １１：２３４７－２３５８）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトにより、相同性指向ＤＳＢ修復に欠陥のあるがん細胞における合成致死を誘発し得るＤＮＡ二本鎖破壊（ＤＳＢ）が誘導される（Ｂｒｙａｎｔ Ｈ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３４：９１３－９１７、Ｆａｒｍｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３４：９１７－９２１）。化学療法剤の前述の例は例示的なものであり、限定するようには意図されていない。
別の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法で使用される放射線は、電離放射線であり得る。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、または陽子ビームでもあり得る。放射線療法の例には、外部ビーム放射線療法、放射性同位体（Ｉ－１２５、パラジウム、イリジウム）、ストロンチウム－８９等の放射性同位体の間質埋め込み、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ－３２放射線療法、ならびに／または全腹部および骨盤放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。放射線療法の一般概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、放射線が遠隔源から向けられる外部ビーム放射線または遠隔療法として施され得る。放射線治療は、放射性源ががん細胞または腫瘍塊に近接して体内に設置される内部療法または小線源療法として施される場合もある。ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、感光剤Ｐｃ４、デメトキシ－ヒポクレリンＡ、ならびに２ＢＡ－２－ＤＭＨＡ等の感光剤の投与を含む光線力学的療法の使用も包含される。
別の実施形態では、がん性細胞および／または組織を物理的に取り除くために外科的介入が行われ得る。
なお別の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン治療的治療は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ－ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成および処理阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベータメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））、ビタミンＤ３類似体、抗ゲスターゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。
さらに別の実施形態では、身体組織が高温（最大１０６°Ｆ）に曝露される手技である温熱療法が使用される。熱は、細胞を損傷するか、またはそれらが生きるのに必要な物質をそれらから取り除くことによって腫瘍を縮小させる助けとなり得る。温熱療法は、外部および内部加熱デバイスを使用した局部、局所、および全身温熱療法であり得る。温熱療法は、ほとんどの場合、他の療法形態（例えば、放射線療法、化学療法、および生物学的療法）とともに使用されて、それらの有効性を向上させるよう試みる。局部温熱とは、腫瘍等の非常に小さい領域に適用される熱を指す。その領域は、体外のデバイスから腫瘍に向けられた高周波で外部から加熱され得る。内部加熱を達成するために、細い加熱ワイヤまたは温水が充填された中空管、埋め込み型マイクロ波アンテナ、および高周波電極を含む滅菌プローブのいくつかのタイプのうちの１つが使用され得る。局所温熱療法では、臓器または肢が加熱される。高エネルギーを生み出す磁石およびデバイスが加熱される領域上に配置される。灌流と呼ばれる別のアプローチでは、患者の血液のいくらかが取り除かれ、加熱され、その後、内部加熱される領域にポンプ注入（灌流）される。全身加熱は、全身に広がった転移がんを治療するために使用される。これは、温水毛布、温ワックス、誘導コイル（電気毛布中のもの等）、または熱チャンバ（大型インキュベーターと同様のもの）を使用して達成され得る。温熱療法は、放射線副作用または合併症の著しい増加を引き起こさない。しかしながら、皮膚に直接適用される熱は、治療される患者の約半数に不快感またはさらには著しい局所疼痛をもたらし得る。これは、通常は急速に治癒する水疱も引き起こし得る。
なお別の実施形態では、光線力学的療法（別名、ＰＤＴ、光線照射療法、光線療法、または光化学療法）が、いくつかのがんタイプの治療に使用される。これは、単細胞生物が特定のタイプの光に曝露されたときに感光剤として既知のある特定の化学物質がその生物を死滅させることができるという発見に基づいている。ＰＤＴは、感光剤と組み合わせて固定周波数レーザー光を使用することによってがん細胞を破壊する。ＰＤＴでは、感光剤は、血流に注射され、全身の細胞によって吸収される。この薬剤は、正常細胞で残存するよりも長い時間にわたってがん細胞で残存する。処理されたがん細胞がレーザー光に曝露されると、感光剤は光を吸収し、処理されたがん細胞を破壊する酸素の活性形態を産生する。露光は、感光剤の大半が健常細胞を去っているが、依然としてがん細胞中に存在しているときに生じるように、慎重に時間調節されなければならない。ＰＤＴで使用されるレーザー光は、光ファイバー（極細ガラスストランド）を通して方向付けられ得る。光ファイバーは、適切な量の光を送達するためにがんに近接して設置される。光ファイバーは、肺癌の治療の場合には気管支鏡を通して肺内に方向付けられ得、食道癌の治療の場合には内視鏡を通して食道内に方向付けられ得る。ＰＤＴの利点は、健常組織に最小限の損傷しか引き起こさないことである。しかしながら、現在使用されているレーザー光が約３センチメートル（１と１／８インチをわずかに超える）を超える組織を通過することができないため、ＰＤＴは、皮膚上もしくは皮膚真下または内臓器官の内膜上の腫瘍の治療に主に使用されている。光線力学的療法により、治療後６週間以上にわたって皮膚および目が光に敏感になる。患者は、直射日光および明るい室内照明を少なくとも６週間避けるよう忠告される。患者が屋外に出なければならない場合、サングラスを含む防護衣類を着用しなければならない。ＰＤＴの他の一時的な副作用は、特定の領域の治療に関連しており、咳嗽、嚥下困難、腹痛、および痛みを伴う呼吸または息切れが含まれ得る。１９９５年１２月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、閉塞を引き起こしている食道癌およびレーザーのみでは満足に治療することができない食道癌の症状を緩和するためのポルフィマーナトリウムと呼ばれる感光剤またはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）を承認した。１９９８年１月、ＦＤＡは、通常の肺癌治療が適切ではない患者における早期非小細胞肺癌の治療のためにポルフィマーナトリウムを承認した。国立がん研究所および他の機関は、膀胱癌、脳癌、喉頭癌、および口腔癌を含むいくつかのがんタイプに対する光線力学的療法の使用を評価するための臨床試験（調査研究）を支援している。
さらに別の実施形態では、レーザー療法は、高強度光を利用してがん細胞を破壊するために使用される。この技法は、多くの場合、特にがんが他の治療によって治癒されない場合に、出血または閉塞等のがんの症状を緩和するために使用される。この技法は、腫瘍を縮小または破壊することによってがんを治療するためにも使用され得る。「レーザー」という用語は、励起誘導放射による光増幅を表す。電球からの光等の常光は、多くの波長を有し、全ての方向に広がる。その一方で、レーザー光は、特定波長を有し、狭ビームに集中する。このタイプの高強度光は、多くのエネルギーを含んでいる。レーザーは、非常に強力であり、鋼鉄の切断またはダイヤモンドの成形に使用され得る。レーザーは、眼内の損傷網膜の修復または組織の切断（外科用メスの代わりに）等の非常に精密な外科的作業にも使用され得る。いくつかの異なる種類のレーザーが存在するが、医学分野で３種類のみが広く使用されている。二酸化炭素（ＣＯ２）レーザー：このタイプのレーザーは、深層を貫通することなく皮膚表面から薄層を取り除くことができる。この技法は、皮膚の深部に広がっていない腫瘍およびある特定の前がん性状態を治療する際に特に有用である。伝統的な外科用メス手術の代替案として、ＣＯ２レーザーも皮膚を切断することができる。レーザーをこの方法で使用して、皮膚癌を取り除く。ネオジム：イットリウム－アルミニウム－ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザー：このレーザーからの光は、他のタイプのレーザーよりも深く組織に透過することができ、血液を素早く凝固させることができる。これは、光ファイバーを通じて身体の到達しにくい部分に運ばれ得る。このタイプのレーザーは、咽喉癌の治療に使用されることもある。アルゴンレーザー：このレーザーは、組織の表層のみを通過することができ、したがって、皮膚科学および眼の手術に有用である。これは、光線力学的療法（ＰＤＴ）として既知の手技において腫瘍を治療するために感光性色素とともに使用される。レーザーは、以下を含む標準の手術道具に優るいくつかの利点を有する。レーザーは、外科用メスよりも精密である。周辺皮膚または他の組織とほとんど接触しないため、切開付近の組織が保護される。レーザーによって生成された熱が手術部位を滅菌するため、感染の危険性を低下させる。レーザーの精度がより小さい切開を可能にするため、より短い手術時間しか要しない場合がある。多くの場合、治癒時間が短縮され、レーザー熱が血管を閉鎖するため、出血、腫脹、または瘢痕が軽減される。レーザー手術はあまり複雑ではない場合がある。例えば、光ファイバーを用いて、レーザー光は、大きく切開することなく、身体部分に方向付けられ得る。より多くの手技が外来で行われ得る。レーザーを２つの方法で使用して、すなわち、熱で腫瘍を縮小もしくは破壊することによって、またはがん細胞を破壊する感光剤として既知の化学物質を活性化することによって、がんを治療することができる。ＰＤＴでは、感光剤はがん細胞で保持され、がん細胞を死滅させる反応を引き起こす光によって刺激され得る。ＣＯ２およびＮｄ：ＹＡＧレーザーは、腫瘍を縮小または破壊するために使用される。これらは、医師が膀胱等の身体のある特定の領域を覗き込むことを可能にする管である内視鏡とともに使用され得る。いくつかのレーザーからの光は、光ファイバーを装着したフレキシブル内視鏡を通して伝達され得る。これにより、医師が手術を除いては別様に到達することのできない身体部分を見て作業することが可能になり、それ故に、レーザービームの非常に精密な照準が可能になる。レーザーは、低出力顕微鏡とともに使用される場合もあり、医師は治療をされている部位をはっきりと見ることができる。他の器具とともに使用して、レーザーシステムは、極細糸の幅未満である直径最小２００ミクロンの切断領域を生成することができる。レーザーは、多くのがんタイプを治療するために使用される。レーザー手術は、声門（声帯）癌、子宮頸癌、皮膚癌、肺癌、膣癌、外陰癌、および陰茎癌のある特定の病期に対する標準の治療である。がんを破壊するための使用に加えて、レーザー手術は、がんによって引き起こされる症状の緩和（緩和ケア）を助けるためにも使用される。例えば、レーザーを使用して、患者の気管（ｔｒａｃｈｅａ）（気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ））を封鎖している腫瘍を縮小または破壊し、呼吸を容易にすることができる。これは、結腸直腸癌および肛門癌の緩和に使用されることもある。レーザー誘起間質温熱療法（ＬＩＴＴ）は、レーザー療法における最新の開発のうちの１つである。ＬＩＴＴは、熱が、細胞を損傷するか、またはそれらが生きるのに必要な物質をそれらから取り除くことによって腫瘍を縮小させる助けとなり得る、温熱療法と呼ばれるがん治療と同じ発想を使用する。この治療では、レーザーは、体内の間質領域（臓器間の領域）に方向付けられる。その後、レーザー光が腫瘍の温度を上昇させ、これにより、がん細胞が損傷または破壊される。
療法を用いた治療の持続期間および／または用量は、特定の治療薬またはそれらの組み合わせによって異なり得る。当業者であれば、特定のがん治療薬の適切な治療時間を理解するであろう。本発明は、各がん治療薬の最適治療スケジュールの継続的な評価を企図し、ここで、本発明の方法によって決定される対象のがんの表現型が、最適治療用量およびスケジュールを決定する要因である。
ポリヌクレオチドを哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト、またはそれらの細胞に導入するための任意の手段は、本発明の様々な構築物を対象とするレシピエントに送達するための本発明の実施に適応され得る。本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションによって、すなわち、「ネイキッド」ＤＮＡの送達によって、またはでコロイド分散系との複合体で細胞に送達される。コロイド系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系、例えば、水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化ＤＮＡまたはリポソーム製剤化ＤＮＡである。前者のアプローチでは、例えば、脂質でのＤＮＡの製剤化の前に、所望のＤＮＡ構築物を有するトランス遺伝子を含むプラスミドが発現（例えば、イントロンの５’非翻訳領域への包含および不要な配列の排除（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２６－１３９，１９９５）について最初に実験的に最適化され得る。その後、例えば、様々な脂質またはリポソーム材料でのＤＮＡの製剤化が、既知の方法および材料を使用して達成され得、レシピエント哺乳動物に送達され得る。例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０：２４－２９，１９９４、Ｔｓａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６８、Ａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．５：１３５－１４２，１９９３、および米国特許第５，６７９，６４７号（Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。
リポソームの標的は、解剖学的要因および機構的要因に基づいて分類され得る。解剖学的分類は、選択性レベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、および細胞小器官特異的に基づいている。機構的標的は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別され得る。受動的標的は、洞様毛細血管を含む臓器内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの生来の傾向を利用する。その一方で、能動的標的は、天然に存在する局在化部位以外の臓器および細胞型への標的を達成するために、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質等の特異的リガンドに結合することによる、またはリポソームの組成またはサイズを変化させることによるリポソームの改変を伴う。
標的とされた送達系の表面は、様々な方法で修飾され得る。リポソーム標的送達系の場合、脂質基は、標的リガンドをリポソーム二重層と安定した会合で維持するために、リポソームの脂質二重層に組み込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドに連結するために様々な連結基が使用され得る。送達ビヒクル、例えば、リポソームと会合したネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡは、対象におけるいくつかの部位に投与され得る（以下を参照のこと）。
核酸は、任意の所望のベクターで送達され得る。これらには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびプラスミドベクターを含むウイルスまたは非ウイルスベクターが含まれる。例示のウイルスタイプには、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が挙げられる。核酸は、十分に効率的な送達レベルを提供する任意の所望の形式で、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子で投与され、ポリマーに複合体化され得る。
目的とするタンパク質または核酸をコードする核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクター、または当該技術分野で既知の他のベクターに存在し得る。かかるベクターは周知であり、任意のベクターが特定の用途のために選択され得る。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびデメチラーゼコーディング配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターおよび細胞増殖によって活性化されるプロモーター、例えば、チミジンキナーゼおよびチミジル酸シンターゼプロモーターである。他の好ましいプロモーターには、ウイルス感染によって活性化可能なプロモーター、例えば、α－およびβ－インターフェロンプロモーター、ならびにエストロゲン等のホルモンによって活性化可能なプロモーターが含まれる。使用され得る他のプロモーターには、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが含まれる。プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。
別の実施形態では、ネイキッドポリヌクレオチド分子が、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように遺伝子送達ビヒクルとして使用される。かかる遺伝子送達ビヒクルは、成長因子ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得、ある特定の実施形態では、死滅アデノウイルスに連結される。Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７－１５４，１９９２。任意に使用され得る他のビヒクルには、ＤＮＡ－リガンド（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５－１６９８７，１９８９）、脂質－ＤＮＡ組み合わせ（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３ ７４１７，１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１－７８５５，１９８７）、およびマイクロプロジェクタイル（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６－２７３０，１９９１）が含まれる。
遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス複製起源またはパッケージングシグナル等のウイルス配列を任意に含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、またはアデノウイルス等のウイルスから選択され得る。好ましい実施形態では、成長因子遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびその様々な使用が、多数の参考文献、例えば、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９８３，Ｃａｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９，１９８４、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５－１４，１９９０、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、および同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２，４６８号、同第ＷＯ８９／０５，３４９号、および同第ＷＯ９０／０２，８０６号に記載されている。例えば、ＥＰ０，４１５，７３１、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、米国特許第５，２１９，７４０号、ＷＯ９３１１２３０、ＷＯ９３１０２１８、Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０－３８６４，１９９３、Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２－９６７，１９９３、Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，１９９３、Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３－５０３，１９９２、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９－７３５，１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２、およびＷＯ９１／０２８０５）に記載のものを含む、多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが本発明で利用され得る。
本発明のポリヌクレオチドを送達するために使用され得る他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（米国特許第５，６３１，２３６号（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．、１９９７年５月２０日発行）およびＷＯ００／０８１９１（Ｎｅｕｒｏｖｅｘ））、ワクチニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８）Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｉｎ： Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ Ｌ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ Ｄ Ｔ，ｅｄ．Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ（１９８６）“Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ，”Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，６８：１－１０）、およびいくつかのＲＮＡウイルスに由来している。好ましいウイルスには、アルファウイルス、ポキシウイルス、アレナウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。それらは、様々な哺乳類細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５－１２８１、Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８（上記参照）、Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ
Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６（上記参照）、Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．１９８８、Ｈｏｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：６４２－６５０）。
他の実施形態では、ゲノム中の標的ＤＮＡは、当該技術分野で周知の方法を使用して操作され得る。例えば、ゲノム中の標的ＤＮＡは、欠失、挿入、および／または突然変異によって操作され得、これらは、レトロウイルス挿入、人工染色体技法、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターによるランダム挿入、遺伝子標的、転移性因子、および／または外来ＤＮＡを導入するためのまたは修飾ＤＮＡ／修飾核ＤＮＡを産生するための任意の他の方法である。他の修飾技法は、ＤＮＡ配列をゲノムから欠失させることおよび／または核ＤＮＡ配列を改変することを含む。例えば、核ＤＮＡ配列は、部位特異的突然変異誘発によって改変され得る。
他の実施形態では、組換えバイオマーカーポリペプチドおよびその断片が対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、増強された生物学的特性を有する融合タンパク質が構築および投与され得る。加えて、バイオマーカーポリペプチドおよびその断片は、増加したバイオアベイラビリティおよび減少したタンパク質分解等の望ましい生物学的活性をさらに増強するために、当該技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化等）に従って修飾され得る。
臨床的有効性
臨床的有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって測定され得る。例えば、抗ＨＨＬＡ２抗体療法等の療法に対する応答は、がん、例えば、腫瘍のその療法に対する任意の応答、好ましくは、ネオアジュバントまたはアジュバント化学療法の開始後の腫瘍質量および／または体積の変化に関連する。腫瘍応答は、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、または触診によって測定される全身介入後の腫瘍サイズが初期サイズおよび寸法と比較され得るネオアジュバントまたはアジュバント状況下で評価され得、腫瘍の細胞充実度が組織学的に推定され得、治療開始前に採取された腫瘍生検の細胞充実度と比較され得る。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定または病理学的試験によっても評価され得る。応答は、腫瘍体積もしくは細胞充実度のパーセンテージ変化等の定量様式で記録され得るか、または残留がん組織量等の半定量スコア化システム（Ｓｙｍｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００７）２５：４４１４－４４２２）もしくはミラー・ペインスコア（Ｏｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｒｅａｓｔ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）１２：３２０－３２７）を使用して、「病理学的完全応答」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、または他の質的基準等の質的様式で記録され得る。腫瘍応答の評価は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または好ましくは数ヶ月後に行われ得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終了時または残留腫瘍細胞および／もしくは腫瘍床の外科的除去時である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療的治療の臨床的有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することによって決定され得る。臨床的有用率は、療法終了の少なくとも６ヶ月後の時点での完全寛解（ＣＲ）にある患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）にある患者の数、および安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の合計を決定することによって測定される。この公式の省略表現は、６ヶ月にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、特定の抗免疫チェックポイント治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれ以上である。
抗免疫チェックポイント療法に対する応答を評価するための追加の基準は、「生存期間」に関連し、これには、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、または腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発および遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がんおよびそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時または治療開始時）および終了点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、および腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。
例えば、適切な閾値を決定するために、特定の抗がん治療レジメンが対象集団に投与され得、転帰が任意の抗免疫チェックポイント療法の投与前に決定されたバイオマーカー測定値と相関付けられ得る。転帰測定値は、ネオアジュバント状況で施される療法に対する病理学的応答であり得る。あるいは、バイオマーカー測定値が既知である抗免疫チェックポイント療法後の対象について、全生存期間および無病生存期間等の転帰測定値がある期間にわたって監視され得る。ある特定の実施形態では、同じ用量の抗免疫チェックポイント薬剤が各対象に投与される。関連実施形態では、投与される用量は、抗免疫チェックポイント薬剤の当該技術分野で既知の標準用量である。対象が監視される期間は異なり得る。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヶ月間監視され得る。抗免疫チェックポイント療法の転帰と相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例の節に記載の方法等の方法を使用して決定され得る。
ＸＩＩＩ．キット
加えて、本発明は、生体試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片の存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、生体試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片を検出することができる標識化合物または薬剤、試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片の量を決定するための手段、および試料中のＨＨＬＡ２ポリペプチドまたはその断片の量を標準と比較するための手段を含み得る。化合物または薬剤は、好適な容器内にパッケージングされ得る。例えば、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含むキットは、ＨＨＬＡ２の検出または治療もしくは診断アッセイで使用され得る。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合した抗体を含み得る。
キットは、キットが設計される特定の用途を容易にするために追加の成分を含み得る。例えば、インビトロでの、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットでのＨＨＬＡ２の検出および定量化のための抗体を含むキットが提供され得る。キットが含み得る追加の例示の薬剤には、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウス－ＨＲＰ等の適切な二次標識等）および対照に必要な試薬（例えば、対照生体試料またはＨＨＬＡ２タンパク質標準）が挙げられる。キットは、開示される本発明の方法での使用が認められている緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。非限定的な例には、担体タンパク質または洗剤等の非特異的結合を減少させる薬剤が挙げられる。本発明のキットは、本明細書に提供される開示される本発明の方法における開示される本発明のキットまたは抗体の使用を開示または記載する教材も含み得る。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、これらは、限定するものと解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容、ならびに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１：抗ヒトＨＨＬＡ２モノクローナル抗体の誘導
いくつかの抗ＨＨＬＡ２モノクローナル抗体を生成および分析した。簡潔には、マウスモノクローナル抗体の免疫化および生成前にヒトＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質を産生した。ヒトＨＨＬＡ２のコーディング領域を、プライマー５’－ＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣＡ－３’（ＡＴＧ開始のすぐ５’側に位置するセンスプライマー）および５’－ＧＴＡＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴ－３’（終止コドンのすぐ３’側に位置する抗センスプライマー）を使用してＰＣＲ増幅し、ＴＡクローニングによりｐＥＦ６ベクターに導入した。ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質を、ｃＤＮＡのＨＨＬＡ２細胞外ドメインをマウスＩｇＧ２ａヒンジおよびＦｃドメイン（Ｆｃ受容体への結合を減少させる突然変異を有する）に融合させ、ｐＥＦ６ベクターにクローニングすることによって作製した。構築物をＣＨＯ細胞に導入し、ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質をタンパク質Ｇカラム上で親和性クロマトグラフィーにより精製した。
４～６週間齢の５匹のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。全ての動物を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ
Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓのガイドラインに従って入手および維持した。
初回免疫化のために、５０マイクログラムの組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に懸濁し、等体積の完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で乳化した。マウスを、リンパ節が見られる５つの皮下部位（鼠径、腕、腋窩、および浅頸）への乳剤の注射によって、かつ腹腔内で免疫した。初回免疫化の１４日後に、マウスを、等体積の不完全フロイントアジュバントで乳化した５０マイクログラムの組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質で腹腔内追加免疫した。１４日後、マウスを、等体積の不完全フロイントアジュバントで乳化した５０マイクログラムの組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質で腹腔内追加免疫した。４２日後、マウスを、等体積の不完全フロイントアジュバントで乳化した５０マイクログラムの組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質および５０マイクログラムの変性組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質で腹腔内追加免疫した。タンパク質を、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で５分間沸騰させることによって変性させた。１３日後、マウスを、等体積の不完全フロイントアジュバントで乳化した５０マイクログラムの組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質および５０マイクログラムの変性組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質で腹腔内追加免疫した。追加免疫の１０～１２日後に少量の血液を収集した。ＨＨＬＡ２に対する血清活性を、ＨＨＬＡ２ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた３００．１９細胞およびトランスフェクトされていない３００．１９細胞上でフローサイトメトリーにより滴定した。３６日目に、マウスを最後に５０マイクログラムの変性組換えＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質で腹腔内および静脈内追加免疫した。
最も高い滴定量を有するマウス番号５を、４日後の融合のために選択した。採取した脾臓およびリンパ節を細胞懸濁液にし、その後、ＤＭＥＭで洗浄した。脾臓／リンパ節細胞を計数し、２：１の脾臓：骨髄腫比を使用して、重鎖免疫グロブリン鎖も軽鎖免疫グロブリン鎖もいずれも分泌することができないＳＰ ２／０骨髄腫細胞と混合した（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８－１５５０およびＫｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３８１－３８９）。細胞を、標準手順（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）に従ってＨＡＴ選択培地中の８個の９６ウェル組織培養プレート内でポリエチレングリコール１４５０と融合させた。
融合の１０～２１日後、ハイブリドーマコロニーが可視になり、培養上清を収集し、その後、ＨＨＬＡ２ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた３００．１９細胞上でフローサイトメトリーによってＨＨＬＡ２に対して、かつトランスフェクトされていない３００．１９細胞上で反応性の欠如に対してスクリーニングした。
実施例２：抗ＨＨＬＡ２抗体
いくつかの抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂを配列決定して、それらのＣＤＲ領域を分析した。簡潔には、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端迅速増幅）を行い、ｖＨおよびｖＬのＤＮＡを増幅した（ｍＲＮＡ変性、ｃＤＮＡ合成、５’ＲＡＣＥ反応、およびＰＣＲ結果の分析）。陽性クローンを特定するために、ＰＣＲ反応試料をアガロースゲル上で分析して、増幅ＤＮＡ断片を可視化した。正しい抗体可変領域ＤＮＡ断片は、５００～７００塩基対のサイズを有するはずである。ＰＣＲ陽性バンドをＴＯＰＯクローニングし、その後、ＰＣＲ増幅した後、ゲル電気泳動、アガロースゲルからの回収、および配列決定を行った。配列決定データを使用してＣＤＲ分析を行った（ＶＢＡＳＥ２を使用してＣＤＲ領域を定義、ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／のワールドワイドウェブを参照のこと）。
表２は、ｍＡｂ配列決定の結果を列記する。抗体の軽鎖は、カッパ型である。マウス抗体８Ａ１２、８Ｄ２、および１Ｃ８は、ＩｇＧ２ａアイソタイプであり、２Ｃ４、５Ｈ４、６Ｇ８、６Ｄ１０、２Ｇ２、４Ｄ１、４Ｅ５、および６Ｆ１０は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
新たに特定された抗ＨＨＬＡ２抗体を、インビトロ結合およびＴＭＩＧＤ２遮断について特徴付けた。
具体的には、各抗ＨＨＬＡ２抗体の結合親和性をアッセイした。ＨＨＬＡ２ ｃＤＮＡおよびピューロマイシン耐性をコードするベクターを、電気穿孔（３００ボルト、１６００マイクロファラッド）によりマウス３００．１９細胞に同時トランスフェクトし、５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有する培地で選択した。ＨＨＬＡ２を発現する細胞を、ＴＭＩＧＤ２－ヒトＦｃ融合タンパク質での染色により特定し、フィコエリトリンにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＦｃ抗体および単一細胞をフローサイトメトリーにより選別した。個々のクローンでのＨＨＬＡ２の発現を、上述のようにフローサイトメトリーによって確認した。ＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９細胞を抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂで滴定した（図１Ａ）。
図１Ｂは、フローサイトメトリーによるＴＭＩＧＤ２遮断の評価結果を示す。簡潔には、ヒトＨＨＬＡ２細胞でトランスフェクトされた３００．１９細胞へのＴＭＩＧＤ２－ヒトＩｇＧの結合の抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ遮断についてのアッセイを行った。例えば、９６ウェル丸底プレートの１ウェルあたり２０μＬ（２５，０００個の３００．１９細胞と同等）のヒトＨＨＬＡ２で安定してトランスフェクトされた３００．１９細胞を添加した。１ウェルあたり５０μＬの抗体であった。未希釈物、１～１０倍希釈物、および１～１００倍希釈物をアッセイした。細胞を上下にピペットして細胞をｍＡｂ中に再懸濁し、回転台上で混合しながら４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ、０．０２％アジド）中２０μＬの２μｇ／ｍＬヒトＴＭＩＧＤ２－ヒトＩｇＧ１融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号８３１６－ＴＲ－０５０）を各ウェルに添加した。ＴＭＩＧＤ２－ｈＩｇＧを有しない細胞の陰性対照ウェルおよびマウスＩｇＧアイソタイプ対照を有するＴＭＩＧＤ２の陽性対照を含めた。プレートを混合しながら４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、上清を除去した。５０μＬの２．５μｇ／ｍＬ第２の抗体（マウスＩｇに対して交差吸収されたＦａｂ２ヤギ抗ヒト－ＩｇＧ－ＰＥ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４３－０９）を各ウェルに添加した。細胞を上下に３回ピペットして細胞をＡｂ中に再懸濁し、混合しながら４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、上清を除去した。細胞を８０μＬのＰＢＳ＋２％ホルムアルデヒド中に再懸濁し、結合をＦＡＣＳ機で分析した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ、０．０２％アジド）を使用した。
図２は、抗ＨＨＬＡ２モノクローナル抗体８Ｄ２を使用して分析したヒト腫瘍細胞株のウエスタンブロッティング結果を示す。簡潔には、タンパク質溶解物を製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従ってＲＩＰＡ緩衝液で調製し、溶解物の調製前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを緩衝液（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｕｌｔｒａ ｔａｂｌｅｔｓ、小型、ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ）に添加した。タンパク質溶解物を、ヒトＨＨＬＡ２で安定してトランスフェクトされた３００．１９細胞および示されるヒト腫瘍細胞株から作製した。Ｌ４２８およびＨＤＬＭ２は、ホジキンリンパ腫細胞株であり、ＯＣ１－Ｌｙ１は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞）細胞株であり、Ｒａｊｉは、バーキットリンパ腫細胞株であり、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６は、Ｔ細胞白血病細胞株であり、ＴＨＰ－１は、急性単球性白血病細胞株であり、ＭＤＡ２３１およびＳＫＢＲは、乳房腫瘍細胞株であり、ＣＡＫＩ２は、ヒト明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）細胞株である。８０μｇの溶解物を４～１５％勾配ミニプロティアンＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ）に装填し、半乾燥法によって移動させた。膜を、Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）、１２％無脂肪乳、および１％正常ヤギ血清を有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で、室温で１時間遮断した。膜をＴＢＳＴで洗浄し、一次抗体（ＴＢＳＴおよび１％ＢＳＡ中最終濃度１μｇ／ｍＬの抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ ４９９．５．８Ｄ２）と４℃で一晩インキュベートした。膜を室温のＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体（１：４０００、西洋ワサビコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ抗体、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１０３０－０５）と、ＴＢＳＴ、６％無脂肪乳、および０．５％正常ヤギ血清中で３０分間インキュベートした。ＴＢＳＴでさらに３回洗浄した後、１：１比のＥＣＬ基質：エンハンサーを膜に添加し（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｈｙｂｌｏｔ ＣＬオートラジオグラフィーフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で画像化した。
実施例３：正常組織およびがん組織におけるＨＨＬＡ２ ｍＲＮＡ発現
図３は、正常腎臓に対する腎臓癌における他のチェックポイント阻害剤と比較したＨＨＬＡ２ ｍＲＮＡ発現の結果を示す。正常腎臓および腎臓腫瘍における示されるＢ７ファミリーメンバー免疫受容体および腫瘍浸潤白血球の発現を、ＴＣＧＡデータベースからのＲＮＡｓｅｑデータを正規化することによって評価した。正常組織と比較して腫瘍において増加した受容体発現が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、ＶＩＳＴＡ、およびＨＨＬＡ２で観察された。正常組織と比較して腫瘍において増加したレベルもＣＤ８＋およびＣＤ１４＋腫瘍浸潤細胞で観察された。
同様に、図４は、ＴＣＧＡデータベースからの様々ながんにおけるＨＨＬＡ２発現の結果を示す（図４）。簡潔には、様々ながんタイプにおけるＨＨＬＡ２の発現プロファイルを、ＲＮＡｓｅｑ分析によるＴＣＧＡデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによる監督）を使用して調査した。図４に示されるように、ＨＨＬＡ２は、明細胞および乳頭状腎細胞癌、肺腺癌、結腸直腸癌、および膵臓癌で高レベル（太字イタリック体）で発現し、ＡＭＬ、子宮頸癌、頭頸部癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、および肺扁平上皮癌で中程度に発現する。
図５は、ＨＨＬＡ２陽性および陰性細胞株腎臓癌腫瘍アレイ等における免疫組織化学によるＨＨＬＡ２発現の結果を示す。腎臓癌腫瘍アレイおよび細胞株におけるＨＨＬＡ２発現を免疫組織化学によって検出した。再水和パラフィン包埋組織切片および細胞株切片を、圧力鍋（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いてＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１２５℃で３０秒間煮沸した。室温に冷却した後、組織切片をペルオキシダーゼ遮断溶液（二重内因性酵素遮断溶液、Ｄａｋｏ）およびタンパク質遮断溶液（無血清遮断溶液、Ｄａｋｏ）と室温で各々５分間連続してインキュベートした。次に、切片を抗体希釈剤中バックグラウンド低減成分（Ｄａｋｏ）で希釈したマウス抗ＨＨＬＡ－２抗体（１／１００、クローン８Ｄ２）と室温で１時間インキュベートした。その後、組織切片をＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）抗マウス西洋ワサビ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｄａｋｏ）と室温で３０分間インキュベートした。３，３－ジアミノベンジジン基質（ＤＡＢ＋、Ｄａｋｏ）を適用することによってＨＲＰ視覚化を行った。各ステップ間で、タンパク質遮断ステップおよび一次抗体インキュベーションステップの免除時に、組織切片を洗浄緩衝液（０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で５分間洗浄した。核をヘマトキシリンで対比染色した（図５Ａ～５Ｄ）。
図１１は、ＨＨＬＡ２およびＰＤ－Ｌ１免疫染色研究（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２４：１９５４－１９６４）に基づいて計算したＰＤ－Ｌ１陽性および陰性非小細胞肺癌におけるＨＨＬＡ２発現のパーセンテージを示す。全ＮＳＣＬＣ集団の６３％がＨＨＬＡ２で標的可能であることが示された。
実施例４：ＨＨＬＡ２受容体の特定
ＨＨＬＡ２は、ＴＭＩＧＤ２に対する特異的リガンドとして特定されており、ＨＨＬＡ２／ＴＭＩＧＤ２相互作用は、ＡＫＴ依存性シグナル伝達カスケードを介してヒトＴ細胞成長およびサイトカイン産生を選択的に共刺激する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．４：２０４３、Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６）。共阻害機能を果たす活性化Ｔ細胞におけるＨＨＬＡ２に対する第２の受容体がいくつかの研究によって示唆されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：９８７９－９８８４、Ｘｉａｏ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２０１－２２０３、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：１２６．１１）。本研究では、ＴＭＩＧＤ２のＨＨＬＡ２への結合を確認し、新たなＨＨＬＡ２受容体であるＫＩＲ３ＤＬ３が特定された。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞上で発現され、かつ細胞マイクロアレイ技術（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ，Ｗｈａｌｅｙ Ｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用してスライド上にインプリントされた３，５００個超の異なる原形質膜タンパク質を包含する４５００個超の全長クローンのライブラリを、可溶性ヒトＨＨＬＡ２－ｍＩｇ融合タンパク質への結合について評価した。
フルスクリーンの開始前に結合のアッセイ条件を最初に発生させた。陽性対照受容体ＴＭＩＧＤ２または陰性対照ＥＧＦＲトランスフェクト細胞または非トランスフェクト細胞でインプリントされたスライドを、２：１のモル比でＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａと予め複合体化されたか、または連続して添加されたかのいずれかのＡＦ６４７標識抗マウスＩｇＧ検出抗体で検出された、２、１０、および２０ｕｇ／ｍＬの濃度で可溶性ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａへの特異的結合について評価した。
一次スクリーニングについて、各々全長ヒト原形質膜タンパク質をコードする４，５００個超の発現ベクターを、それぞれ、１３個のマイクロアレイスライド（「スライドセット」）にわたって二連でアレイした。
発現ベクター（ｐＩＲＥＳ－ｈＥＧＦＲ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１）を全てのスライド上で四連でスポッティングし、これを使用して、全てのスライド上でトランスフェクション効率の最小閾値が達成または超過されたことを確実にした。この最小閾値（１．５のバックグラウンドにわたるｐＩＲＥＳ－ＥＧＦＲ－ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターからの平均ＺｓＧｒｅｅｎ１シグナル）は以前に定義されている。
ヒトＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質を固定トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞スライドのスライドに２０ｕｇ／ｍＬの濃度で添加し、タンパク質をＡＦ６４７標識抗マウスＩｇＧ検出抗体で検出した。２つの複製スライドを１３個のスライドセット毎にスクリーニングした。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を使用して分析および定量した（トランスフェクション効率について）。タンパク質「ヒット」を、バックグラウンドレベルと比較して上昇したシグナルを示す重複スポットとして定義した。これを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア上にグリッドされた画像を使用して目視検査によって達成した。
重複スポットの強度に応じて、ヒットを、「強い、中間、弱い、または非常に弱い」に分類した。２つの一次スクリーンの一方または両方で特定されたヒットをコードする全てのベクターを配列決定して、それらの同一性を二重確認した。
どのヒット（複数可）（存在する場合）が再現可能であり、かつヒトＨＨＬＡ２に特異的であるかを決定するために、一次ヒットをコードする全てのベクター、および適切な対照ＫＩＲ受容体を新たなスライド上にアレイした。同一のスライドを、一次スクリーンで使用した用量およびインキュベーション条件を使用して、各試験リガンドでスクリーニングし、適切な陽性および陰性対照（ｎ＝１処理あたり２つのスライド）でスクリーニングした。
可溶性ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａを使用した４５００個超の全長細胞表面受容体クローンのスクリーニングにより、ＫＩＲ３ＤＬ３をＨＨＬＡ２結合のヒットとして特定した。二連での約３００個の原形質膜クローンの代表的なセットのスクリーニング結果を図６Ａに示す。ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａの不在下でのＡＦ６４７標識抗マウスＩｇＧ検出抗体の添加はシグナルを生成しなかった。
新たにアレイされたスライド上の確認スクリーンは、ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合を示した（図６Ａ）。ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａの不在下でのＡＦ６４７標識抗マウスＩｇＧ検出抗体のみの添加はシグナルを生成しなかった。ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への結合の選択性を、スライド上にアレイされた１４個のＫＩＲ受容体を使用して評価した。ＨＨＬＡ２のＫＩＲ３ＤＬ３への選択的結合が実証された（表４および図６Ｂ～６Ｃ）。
Figure 2024032865000243
実施例５：抗ヒトＨＨＬＡ２ ｍＡｂの免疫チェックポイント阻害を確認するためのＴ細胞活性化アッセイ
Ａ．プラスミドの構築
膜アンカーキメラ抗体であるＴＣＲ活性化因子を、抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ ＯＫＴ３（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＰＥＤＳ １０：４４５－４５３）の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含むマウスＣＤ８α（受入番号：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のＣ末端ドメイン（残基１１３～２２０）に融合させることによって構築した。これを行うことにより、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖがＴ細胞活性化因子としてＣＨＯ－Ｋ１細胞表面にアンカーされた。ＴＣＲ活性化因子をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＩＲＥＳ－ｈｙｇ３ベクター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）に挿入して、結果として得られる構築物ＴＣＲα ｐＩＲＥＳｈｙｇ３を作製した。
ヒトＨＨＬＡ２（受入番号：ＮＰ＿００９００３．１およびＴＭＩＧＤ２（受入番号：ＮＭ＿１４４６１５．２）のＤＮＡ配列をｐＩＲＥＳ－Ｈｙｇ３またはｐＩＲＥＳ－Ｎｅｏ３に個別にクローニングして、それぞれ、ＨＨＬＡ２＿ｐＩＲＥＳｎｅｏ３およびＴＭＩＧＤ２＿ｐＩＲＥＳｈｙｇ３を作製した。ＫＩＲ３ＤＬ３（受入番号：ＢＣ１４３８０２．１、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社製）のＤＮＡ配列を合成し、ｐｕｒｏＥＩＦ２ベクターに挿入した。
ＮＦＡＴレポーターは、ＮＦＡＴ応答要素の４つのコピーの制御下で蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含み、その後に最小プロモーターが続く。ＩＬ２レポーターは、内因性ＩＬ２プロモーターの制御下で蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらのレポーターをコードするＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡ ３．１に挿入して、ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ｐｃＤＮＡおよびＩＬ２－Ｌｕｃ－ｐｃＤＮＡを生成した。
Ｂ．細胞株および細胞培養
親Ｊｕｒｋａｔ（クローンＥ６－１）（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ－１５２）細胞およびＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－６１）細胞をＡＴＣＣから入手した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号２６１４０－０７９）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ番号ＳＶ３００１０．０１）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号Ａ１０４９１－０１）を使用して、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
ＴＭＩＧＤ２－ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ安定細胞株培養物に１０００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号１１８１１０３１）および２００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１０６８７０１０）を補充して、ＴＭＩＧＤ２およびＮＦＡＴレポーターの組換え発現が維持されることを確実にした。
ＫＩＲ３ＤＬ３－ＩＬ２－Ｊｕｒｋａｔ安定細胞株培養物に１０００μｇ／ｍＬのジェネティシンおよび２５０ｎｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ番号ａｎｔ－ｐｒ－１）を補充して、ＫＩＲ３ＤＬ３およびＩＬ－２レポーターの組換え発現が維持されることを確実にした。
ＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＦ１２－Ｋ（Ｈｙｃｌｏｎｅ番号ＳＨ３０５２６．０１）培地中で維持した。ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ安定細胞株培養物に１０００μｇ／ｍＬのジェネティシンおよび５００μｇ／ｍのハイグロマイシンを補充して、ＨＨＬＡ２およびＴＣＲ活性化因子の組換え発現が維持されることを確実にした。
Ｃ．ＪｕｒｋａｔレポーターおよびＣＨＯ安定細胞株の生成
Ｊｕｒｋａｔクローン：ＴＭＩＧＤ２－ＮＦＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ安定細胞株を作製するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６－１）を電気穿孔によってＮＦＡＴ＿Ｌｕｃ＿ｐｃＤＮＡおよびＴＭＩＧＤ２＿ｐＩＲＥＳｈｙｇ３で順次に同時トランスフェクトした。安定したクローンをハイグロマイシンならびにＧ４１８二重選択および限界希釈によって生成した。選択された安定した細胞クローンを、ハイグロマイシンおよびＧ４１８を補充した完全細胞培養培地で維持した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋１０００μｇ／ｍＬのＧ４１８＋２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で維持した。
ＫＩＲ３ＤＬ３－ＩＬ２－Ｊｕｒｋａｔ安定細胞株を作製するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６－１）を電気穿孔によってＩＬ２＿Ｌｕｃ＿ｐｃＤＮＡおよびＫＩＲ３ＤＬ３＿ｐｕｒｏで順次に同時トランスフェクトした。安定したクローンをピューロマイシンならびにＧ４１８二重選択および限界希釈によって生成した。選択された安定した細胞クローンを、ピューロマイシンおよびＧ４１８を補充した完全細胞培養培地で維持した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋１０００μｇ／ｍＬのＧ４１８＋２５０ｎｇ／ｍＬのピューロマイシン中で維持した。
ＮＦＡＴ（Ｊｕｒｋａｔ－ルシフェラーゼ）またはＩＬ－２プロモーター（Ｊｕｒｋａｔ－ＩＬ－２）のみを発現する親ＪｕｒｋａｔクローンをＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋１０００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で維持した。
ＣＨＯ細胞クローン：ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ安定細胞株を作製するために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＴＣＲａ＿ｐＩＲＥＳｈｙｇ３およびＨＨＬＡ２ ｐＩＲＥＳｎｅｏ３で順次に同時トランスフェクトした。安定したクローンをハイグロマイシンならびにＧ４１８二重選択および限界希釈によって生成した。選択された安定した細胞クローンを、ハイグロマイシンおよびＧ４１８を補充した完全細胞培養培地で維持した。細胞をＦ１２－Ｋ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋１０００μｇ／ｍＬのＧ４１８＋５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で維持した。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現する親ＣＨＯクローンをＦ１２－Ｋ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で維持した。
Ｄ．Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイ
ＴＭＩＧＤ２ ＮＦＡＴ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子共刺激アッセイおよびＨＨＬＡ２抗体による阻害：ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、抗ＨＨＬＡ２抗体を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、ＴＭＩＧＤ２＿ＮＦＡＴ＿Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加した。プレートウェルを混合し、およそ３～６時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。
ＫＩＲ３ＤＬ３ ＩＬ２ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子阻害アッセイおよびＨＨＬＡ２抗体による逆転：ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を、白色の底の不透明な９６ウェルプレート中のＣＨＯＫ１成長培地中に２×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、細胞がプレートに付着した。翌日、培地を各ウェルから慎重に取り除き、抗ＨＨＬＡ２抗体を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に添加し、ＨＨＬＡ２－ＴＣＲ－ＣＨＯ細胞を１時間インキュベートした後、ＫＩＲ３ＤＬ３＿ＩＬ２＿Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株を５０μＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地中に４～５×１０４細胞／ウェルで添加し、加えて、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号１００１８６）も添加した（１ウェルあたり１００μＬのアッセイ混合物中１μｇ／ｍＬの最終濃度）。プレートウェルを混合し、およそ５時間インキュベートした。ルシフェラーゼシグナルを発生させるために、ＯＮＥ－Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６０６９０）を推奨プロトコルに従って各ウェルに１００μＬ添加した。照度計を使用して発光を読み取った。
これらの材料および方法を使用して、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照抗体を、図１４に示され、かつ以下の表９に概説されるようにＴＭＩＧＤ２／ＨＨＬＡ２ Ｔ細胞共刺激アッセイにおいて共刺激遮断について評価した。
Figure 2024032865000244
抗ＣＤ３ ｓｃＦＶおよびＨＨＬＡ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞でのＨＨＬＡ２の発現を検出した（図１５）。ＴＭＩＧＤ２でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ
ＮＦＡＴレポーター細胞でのＴＭＩＧＤ２の発現も検出された（図１６）。抗ＣＤ３ ｓｃＦＶおよびＨＨＬＡ２を発現するＣＨＯ細胞ならびにＴＭＩＧＤ２を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞をＴ細胞共刺激アッセイで使用した。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ（６Ｆ１０）がＨＨＬＡ２によって誘導された増強された活性化を逆転させた一方で、アイソタイプ対照抗体がかかる作用を及ぼさなかったことが見出された（図１７）。
ＨＨＬＡ２ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照抗体を、図１８に示され、かつ以下の表１０に概説されるようにＫＩＲ３ＤＬ３／ＨＨＬＡ２ Ｔ細胞阻害アッセイにおいてチェックポイント遮断についても評価した。
Figure 2024032865000245
ＫＩＲ３ＤＬ３でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ－ＩＬ－２レポーター細胞でのＫＩＲ３ＤＬ３の発現を検出した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。抗ＣＤ３ ｓｃＦＶおよびＨＨＬＡ２を発現するＣＨＯ細胞ならびにＫＩＲ３ＤＬ３を発現するＪｕｒｋａｔ－ＩＬ－２レポーター細胞をＴ細胞阻害アッセイで使用した。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ（クローン６Ｆ１０およびクローン２Ｃ４）がＨＨＬＡ２による阻害を逆転させた一方で、アイソタイプ対照抗体がかかる作用を及ぼさなかったことが見出された（図２０Ａ～２０Ｃおよび図２１Ａ～２１Ｃ）。ＫＩＲ３ＤＬ３選択的ＨＨＬＡ２ ｍＡｂクローン２Ｃ４は、ＴＭＩＧＤ２によって媒介された共刺激遮断しなかった（図２２）。
本明細書に記載のデータは、ＴＭＩＧＤ２をＨＨＬＡ２に対するＴ細胞共刺激受容体として実証し、ＴＭＩＧＤ２共刺激を遮断するＨＨＬＡ２ ｍＡｂが特定された。これらのデータは、ＫＩＲ３ＤＬ３もＨＨＬＡ２に対するＴ細胞阻害性受容体として実証し、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂチェックポイント遮断剤が特定された。
追加のアッセイを使用して、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂを評価することができる。例えば、アロ刺激Ｔ細胞アッセイ、例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞および同種単球由来のＤＣまたはマクロファージを使用したアッセイを使用して、抗ヒトＨＨＬＡ２ ｍＡｂの免疫チェックポイント阻害を確認することができる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２：８４６およびＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７等に記載のかかる方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、ＨＨＬＡ２は、樹状細胞およびマクロファージで発現される。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０：９８７９およびＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．４：２０４３等の樹状細胞培養物を誘導する方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、単球由来の未熟ＤＣ（ｉＤＣ）を、単球精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから単離された単球を培養し、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４および１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で７日間培養することによって生成する。単球由来の活性化ＤＣを、単球精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから単離された単球を培養し、１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－ガンマまたはポリＩＣで７日間培養することによって生成することができる。
いくつかの実施形態では、マクロファージを、単球精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから単離された単球を培養することによって生成し、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－ｇまたはポリＩＣの存在下で３日間培養する。
樹状細胞およびマクロファージ培養物を、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２（ＣＤ２８Ｈ）、およびＰＤ－Ｌ１の発現について、これらの抗原に対する抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価することができる。
アロ刺激Ｔ細胞活性化アッセイを使用して、Ｔ細胞増殖を測定することができる。簡潔には、いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５）および上述のように誘導された同種ＤＣ（１×１０４）またはマクロファージを、１０：１（Ｔ／ＤＣ）比で、抗ヒトＨＨＬＡ－２、ＰＤ－１（ニボルマブ）、およびアイソタイプ対照抗体ありおよびなしで６日間共培養する。５日目の培養上清中のＩＦＮ－ガンマ分泌をＥＬＩＳＡ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのキット）によって測定する。６日目のＴ細胞増殖を、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ希釈によって測定する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマレベルを使用して、Ｔ細胞活性化を、例えば、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣ活性化アッセイを使用して、確認することができる（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２：８４６を参照のこと）。例えば、健常ドナー由来のＰＢＭＣ（１０５細胞）を、１、０．１、および０．０１ｕｇ／ｍＬの濃度のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下で、飽和濃度の抗ヒトＨＨＬＡ－２、ＰＤ－１（ニボルマブ）、およびアイソタイプ対照抗体ありまたはなしで３日間共培養することができる。培養上清中のＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマレベルをＥＬＩＳＡまたは多重分析（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定することができる。
他の実施形態では、ＣＭＶ溶解物刺激ＰＢＭＣ活性化リコールアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化を確認することができる（例えば、Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：４４５およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２：８４６を参照のこと）。例えば、ＣＭＶ陽性ドナー由来のＰＢＭＣ（２×１０５細胞）を、抗ヒトＨＨＬＡ－２、ＰＤ－１（ニボルマブ）、およびアイソタイプ対照抗体ありおよびなしで共培養することができ、ＣＭＶ感染細胞（３ｕｇ／ｍＬ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）由来の溶解物で４日間刺激する。培養上清中でのＩＦＮ－ガンマ分泌をＥＬＩＳＡ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのキット）によって測定することができる。Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ希釈によって測定することができる。
いくつかの実施形態では、腫瘍ベースの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、Ｔ細胞活性化を確認することができる（例えば、ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１０４１を参照のこと）。例えば、樹状細胞（ＤＣ）を、単球精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから単離された単球を培養することによって生成することができ、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－４、８００Ｕ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、および１００ｕｇ／ｍＬのＩＦＮ－ガンマで５日間培養する。混合リンパ球培養物を、抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照（１０ｕｇ／ｍＬ）の存在下で、樹状細胞（２×１０５）、同種ＣＤ３＋Ｔ細胞（１×１０６）、およびＨＨＬＡ２を発現する照射腫瘍細胞（２×１０５）を使用して２４ウェルプレート内に４８時間配置することができる。上清を収集し、多重サイトカインアッセイキットを使用してサイトカイン産生について評価する。
いくつかの実施形態では、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイを使用して、Ｔ細胞活性化を確認することができる（例えば、ＢＰＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのウェブサイトおよびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１４５：２４７を参照のこと）。例えば、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子カセット（ＢＰＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＫＩＲ３ＤＬ受容体（以下のアッセイ番号１を参照のこと）またはＴＭＩＧＤ２受容体（以下のアッセイ番号２を参照のこと）でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの存在下または不在下で、膜貫通抗ＣＤ３ ｓｃＦＶ（ＢＰＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＨＨＬＡ２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で刺激する（図７）。例示のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ受容体遺伝子アッセイ構成を以下の表５に列記する。５×１０４個のＣＨＯ細胞を９６ウェルアッセイプレート中に播種し、１２～１４時間培養する。付着ＣＨＯ細胞を、１０ｕｇ／ｍＬで抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂまたはアイソタイプ対照と３７℃で１時間プレインキュベートする。１×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ細胞と６時間共培養し、発光基質を添加し、照度計を使用してルシフェラーゼ単位を定量する。
Figure 2024032865000246
実施例６：ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ活性のインビボ確認および動物モデルの開発
加えて、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２：８４６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０：９８７９、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．４：２０４３、およびＳｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：４４５）等に記載の抗体をインビボで特徴付けする方法が当該技術分野で周知である。腫瘍モデル用の齧歯類、イヌ、および他の従来の種におけるＨＨＬＡ２経路の不在により、新たな動物腫瘍または薬理学モデルが必要とされる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）モデルを使用する（図８）。例えば、ＮＳＧマウスに、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＨＨＬＡ２、およびＰＤ－Ｌ１を発現するヒト腎臓癌細胞株細胞を移植する。抗炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）標的キメラ抗原受容体（抗ＣＡＩＸ ＣＡＲ Ｔ細胞）ならびにＰＤ－１およびＫＩＲ３ＤＬ受容体を発現するヒトＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を、抗ＨＨＬＡ２またはＫＩＲ３ＤＬ ｍＡｂとともに単独でまたは抗ＰＤ－１／Ｌ－１ ｍＡｂと組み合わせてのいずれかで静脈内注射する。腫瘍成長を、（例えば、Ｓｕａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７：３４３４１に記載されるように）ルシフェリンＩＰ注射後に生物発光画像法によって定量化する。
いくつかの実施形態では、ＳＣＩＤマウスにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞腫瘍モデルを開発する。ＨｅＬａ－ＣＤ１９－ＨＨＬＡ２腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにＨＨＬＡ２ ｍａｂおよびＣＤ１９／ＫＩＲ３ＤＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、腫瘍成長阻害を評価する。６週齢の雌ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を利用する。０日目に、各マウスに、２×１０６個のＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞またはＨｅＬａ－ＣＤ１９＋ＨＨＬＡ２細胞を含有する滅菌ＰＢＳを１００μＬ皮下（ＳＣ）注射する。ＰＢＳ中のＣＡＲ－Ｔ細胞を１９日目（５×１０６細胞）および３３日目（９×１０６細胞）に腫瘍内注射し、腫瘍成長を毎日追跡する。抗体を腹腔内（ＩＰ）投与により週に３回投与する。体重を週に２回監視する。腫瘍サイズをキャリパーで毎日測定し、式Ｗ２Ｌ／２（式中、Ｗが腫瘍の幅であり、Ｌが腫瘍の長さである）を使用して腫瘍体積（ｍｍ３単位）を決定する。研究期間はおよそ４５日間であり、１アームあたり１０匹のマウスを使用する。マウスに、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂをこれらの抗体のＰＫプロファイルに基づいて投与する。
この実験の最後に、腫瘍を切除し、末端出血を行い、血清をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析のために保管する。腫瘍を採取し、秤量し、腫瘍の半分を新たに凍結し、半分を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、その後、Ｈ＆Ｅ染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）のためにパラフィンに包埋する。例示のＣＤ１９／ＫＩＲ３ＤＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞腫瘍モデル構成を以下の表１２に列記する。
Figure 2024032865000247
いくつかの実施形態では、カニクイザルにおけるＴ細胞増殖、サイトカイン、および／またはＴ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）を確認する抗原刺激および追加免疫アッセイを使用してＨＨＬＡ２ ｍＡｂがインビボ活性を有することが確認される。いくつかの実施形態では、カニクイザルＫＬＨ抗原チャレンジＴ細胞モデルを生成および使用する（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。例えば、抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂを静脈内投与したカニクイザルを２日目にフロイント不完全アジュバント中のＫＬＨ（０．１ｍｇ）で免疫化し、１４日後にフロイント不完全アジュバント中の低用量ＫＬＨで追加免疫する。免疫前および免疫後の出血を、免疫アッセイを使用して抗ＫＬＨ ＩｇＧ抗体の増強された産生について評価する。カニクイザルを１日目にＨＨＬＡ２ ｍＡｂで処理し、２～５０ｍｇ／ｋｇでＨＨＬＡ２ ｍＡｂを毎週ＩＶ投与する。抗ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ処理前および処理後のカニクイザルから単離されたＰＢＭＣを、Ｔ細胞依存性抗ＫＬＨ抗体応答、Ｋｉ６７染色およびフローサイトメトリーによるＴ細胞およびＮＫ細胞増殖、ならびにインビボでのＣＤ１０７ａ ＦＡＣＳ染色によるＮＫ細胞毒性またはエクスビボでのＫ５６２細胞に対する細胞毒性について評価する。いくつかの実施形態では、カニクイザルＳＩＶモデルを開発し、これを使用して、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂをインビボで評価する。
いくつかの実施形態では、ヒト化ＳＲＧ－１５マウス腫瘍モデルを使用し、ＨＨＬＡ２
ｍＡｂのヒト化ＳＲＧ－１５（Ｆｌａｖｅｌｌ）マウスまたはＮＳＧ－１５（Ｇｒｅｉｎｅｒ）マウスにおけるヒト腫瘍への影響を試験する（図２３Ａ～２３Ｃ、Ｈｅｒｎｄｌｅｒ－Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ．（２０１７）１１４：Ｅ９６２６－Ｅ９６３４）。
実施例７：ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの細胞結合および受容体遮断特性
ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの結合および遮断特性を分析した。例えば、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂのＨＨＬＡ２への結合のＥＣ５０、およびＨＨＬＡ２のＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３への結合のＨＨＬＡ２ ｍＡｂ遮断のＩＣ５０を検出した。トランスフェクト２９３Ｔ細胞でのＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３の発現をフローサイトメトリーによって検出した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＨＨＬＡ２－ＦｃのＴＭＩＧＤ２およびＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクト２９３Ｔ細胞への結合を示した（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、またはＫＩＲ３ＤＬ３を発現する安定してトランスフェクトされた３００．１９プレＢ細胞も生成した。
その後、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの細胞結合および受容体遮断実験を行った。ある実験では、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂをＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞と４℃で３０分間インキュベートした。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂのトランスフェクト３００．１９細胞への結合をＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで検出した（Ｈ＋Ｌ）。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ遮断実験の場合、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂを４ｕｇ／ｍＬのＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａと１：１比で３０分間プレインキュベートし、ＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクト２９３Ｔ細胞のいずれかに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａのＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクト２９３Ｔ細胞への結合をＰＥ標識Ｆａｂ２ヤギ抗ｍＩｇＧ２ａ抗体で検出した。ＥＣ５０およびＩＣ５０分析を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。データを表６に示す。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂクローン２Ｃ４が完全ＫＩＲ３ＤＬ３遮断および部分的ＴＭＩＧＤ２遮断の所望の特性を有することが示された（表６）。
Figure 2024032865000248
別の実験では、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂをＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞と４℃で３０分間インキュベートした。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂのトランスフェクト３００．１９細胞への結合をＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで検出した（Ｈ＋Ｌ）。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ遮断実験の場合、異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂを４ｕｇ／ｍＬのＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａと１：１比で３０分間プレインキュベートし、ＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞のいずれかに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＨＨＬＡ２－ｍＩｇＧ２ａのＴＭＩＧＤ２またはＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞への結合をＰＥ標識Ｆａｂ２ヤギ抗ｍＩｇＧ２ａ抗体で検出した。ＥＣ５０およびＩＣ５０分析を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。データを表７に示す。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂクローン２Ｃ４が完全ＫＩＲ３ＤＬ３遮断および部分的ＴＭＩＧＤ２遮断の所望の特性を有することが示された（表７）。
Figure 2024032865000249
異なるＨＨＬＡ２ ｍＡｂのヒトおよびカニクイザルＨＨＬＡ２への結合も試験し、ＥＣ５０結合分析を行った（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。異なる濃度のＨＨＬＡ２ ｍＡｂをヒトまたはカニクイザルＨＨＬＡ２トランスフェクト３００．１９プレＢ細胞のいずれかと４℃で３０分間インキュベートした。ＨＨＬＡ２ ｍＡｂのトランスフェクト３００．１９細胞への結合をＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで検出した（Ｈ＋Ｌ）。ＥＣ５０分析を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。データを表８に示す。
Figure 2024032865000250
実施例８：ＨＨＬＡ２ ｍＡｂ活性のインビトロ確認
いくつかの実施形態では、ＨｅＬａ－ＣＤ１９およびＨＨＬＡ２を発現する標的腫瘍細胞に対するＣＤ１９およびＫＩＲＤＬ３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ１９／ＫＩＲＤＬ３）の細胞毒性をＨＨＬＡ２ ｍＡｂの存在下または不在下のいずれかで評価する。ＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ１９／ＫＩＲＤＬ３細胞を生成する。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖおよびＫＩＲ３ＤＬ３を発現するレンチウイルスプラスミドを構築し、ＧＭ－ＣＳＦ由来の分泌シグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、およびＣＤ２８由来の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ活性化ドメインを含む第二世代ＣＡＲカセットにサブクローニングする。１０００万個の成長停止ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＴ７５フラスコに播種し、一晩培養し、その後、ＣａｌＰｈｏｓ（商標）トランスフェクションキット（Ｔａｋａｒａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用してｐＰＡＣＫＨ１ Ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｍｉｘ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）ならびに抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖおよびＫＩＲ３ＤＬ３を含有する各レンチウイルスベクター１０μｇでトランスフェクトする。１日後、培地を新鮮な培地と交換し、４８時間後にレンチウイルス含有培地を収集する。２１００ｇで３０分間の遠心分離によって培地から細胞残屑を除去する。１１２，０００ｇで１００分間の遠心分離によってウイルス粒子を収集し、アリコートし、－８０℃で凍結させる。ウイルス調製物の力価を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ｑＲＴ－ＰＣＲキットを使用して定量的ＲＴ－ＰＣＲによって決定する。
ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含有するＡＩＭ Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁されたヒト末梢血単核細胞（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによってその承認ＩＲＢプロトコルに従って提供されたもの）から単離し、等数（１：１比）のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合し、未処理２４ウェルプレート中で培養する（０．５ｍＬ／ウェル）。２４時間および４８時間時点で、レンチウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）５で１μＬのＴｒａｎｓＰｌｕｓ（商標）形質導入エンハンサー（ＡｌＳｔｅｍ）とともに培養物に添加する。Ｔ細胞が次の２週間にわたって増殖するにつれて、細胞を２～３日毎に計数し、３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を有する新鮮な培地を培養物に添加して、細胞密度を１～３×１０６細胞／ｍＬで維持する。ＣＡＲ発現を、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ１９抗体を使用してフローサイトメトリーによって評価する。したがって、形質導入の前に、抗ＣＤ２８抗体共刺激と組み合わせて抗ＣＤ３抗体を使用してＴ細胞を活性化する。培養下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の急速な増殖は、一般に、２週間以内に達成され、外因性ＩＬ－２の存在によって駆動される。このＣＡＲを、以下でＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ１９／ＫＩＲＤＬ３と呼ぶ。
ＨＨＬＡ２トランスフェクトＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞を生成する。ＨｅＬａ－ＣＤ１９発現細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨＨＬＡ２＿ｐＩＲＥＳｎｅｏ３でトランスフェクトする。安定したクローンをＧ４１８選択および限界希釈によって生成し、フローサイトメトリーによってＨＨＬＡ２発現について評価する。
リアルタイム細胞毒性アッセイ（ＲＴＣＡ）におけるインビトロでの初代Ｔ細胞のＫＩＲ３ＤＬ３阻害を行う。付着標的細胞（ＨｅＬａまたはＨｅＬａ－ＣＤ１９）を９６ウェルＥ－プレート（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に１×１０４細胞／ウェルで播種し、インピーダンスベースのリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて培養下で一晩監視する。翌日、三連で、培地を取り除き、１０％ＦＢＳ±１×１０５個のエフェクター細胞（ＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ１９／ＫＩＲＤＬ３細胞または非形質導入Ｔ細胞）を含有するＡＩＭ Ｖ－ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）培地と交換する。Ｅ－プレート中の細胞をＲＴＣＡシステムでさらに２～３日間監視し、インピーダンスを経時的にプロットする。細胞溶解を、（エフェクター細胞なしの標的細胞のインピーダンス－エフェクター細胞ありの標的細胞のインピーダンス）×１００／エフェクター細胞なしの標的細胞のインピーダンスとして計算する。
サイトカイン分泌も評価する。いくつかの実施形態では、サイトカイン誘導アッセイを行う。例えば、ＨｅＬａ－ＣＤ１９／ＨＨＬＡ２標的細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＡＩＭ Ｖ－ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）培地２００ｍＬを有するＵ底９６ウェルプレート中に、エフェクターＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ１９／ＫＩＲＤＬ３細胞または非形質導入Ｔ細胞と１：１比（各々１×１０４細胞）で三連で培養する。１６時間後、培地の上部１５０ｍＬをＶ底９６ウェルプレートに移し、３００ｇで５分間遠心分離して、いずれの残留細胞もペレットにする。上清の上部１２０ｍＬを新たな９６ウェルプレートに移し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のキットを製造業者のプロトコルに従って使用してＥＬＩＳＡによってヒトＩＦＮ－γおよびＩＬ－２レベルについて分析する。
例示のＣＡＲ－Ｔ細胞毒性モデルインビトロ立体配置を以下の表１１に列記する。
Figure 2024032865000251
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞毒性のＫＩＲ３ＤＬ３阻害アッセイを行う。ＫＩＲ３ＤＬ３トランスフェクトＮＫ９２細胞を生成する。例えば、ＮＫ９２細胞をＫＩＲ３ＤＬ３ ｐｕｒｏＥＩＦ２ベクターでトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性のために選択し、ＫＩＲ３ＤＬ３発現をフローサイトメトリーによって検出する。
ＨＨＬＡ２トランスフェクトＫ５６２標的細胞を生成する。例えば、標的Ｋ５６２細胞をＨＨＬＡ２ ｐＩＲＥＳｎｅｏ３でトランスフェクトし、ネオマイシン耐性のために選択し、ＨＨＬＡ２発現をフローサイトメトリーによって検出した。
ＫＩＲ３ＤＬ３でトランスフェクトされたＮＫ９２細胞を、４時間細胞毒性アッセイにおいて、ＨＨＬＡ２ ｍＡｂの存在下または不在下で、Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞毒性（＋または－ＨＨＬＡ２）について異なるＥ／Ｔ比で評価する。例示のＣＡＲ－Ｔ細胞毒性モデルインビトロ立体配置を以下の表１３に列記する。
Figure 2024032865000252
いくつかの実施形態では、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＫＩＲ３ＤＬ３シグナル伝達経路を研究する。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書のいずれの定義も含む本出願が支配する。
Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）のワールドワイドウェブｔｉｇｒ．ｏｒｇおよび／またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖによって管理されているもの等の公開データベースのエントリと相関する受入番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も参照によりそれらの全体が組み込まれる。
等価物
当業者であれば、通例の実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確定することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図されている。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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