KR20220110176A - 항-kir3dl3 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220110176A
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고든 제이. 프리맨
안토니오 알. 알루라난담
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다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
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Abstract

본 개시내용은, KIR3DL3에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 및 이의 항원-결합 단편; KIR3DL3 및 PD-1에 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편뿐만 아니라; 면역글로불린, 폴리펩타이드, 이의 핵산, 및 예후, 면역요법 및 치료 목적을 위해 이러한 항체를 사용하는 방법의 발견에 부분적으로 기초한다.

Description

항-KIR3DL3 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/910,594호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 그의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
권리의 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에서 지급한 허가 번호 P50CA101942에 따른 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, 부티로필린(butyrophilin), 및 A2aR와 같은, 그리고 이 밖에 다른 많은 면역관문제가 수많은 입력 사이의 복합적 및 결합적 상호작용을 기반으로 면역 반응 진행을 음성적으로 조절한다. 면역관문의 저해제는 일부 대상체에서 면역 반응을 조절할 수 있으나, 면역관문의 발현 및 본래 결합 상대와의 상호작용은 대상체들 사이에 그리고 대상체의 조직들 내에서 다르다. 상당한 비율의 환자가 이 치료에 반응하지 않으며 반응하는 많은 환자는 결국 내성을 전개시킨다. 따라서 PD-1 경로와 중복되지 않는 추가의 면역 경로를 찾아야 하는 중요한 충족되지 않은 요구가 있다.
HERV-H LTR-연관 2(HHLA2, 또한 B7-H5, B7-H7로도 알려짐)는 T 세포 기능을 조절하는 B7 계열 구성원이다. HHLA2는 다양한 종양(예컨대, 원발성 인간 신장세포 암종(RCC)을 포함하는 고형암 및 혈액암) 및 항원 제시 세포에서 광범위하게 발현되고, T 세포에 대한 활성화와 저해 리간드 둘 다로서 연루되어왔다. HHLA2는 TMIGD2(CD28H, IGPR-1)에 대한 특이적 리간드로 확인되었고 HHLA2/TMIGD2 상호작용은 AKT-의존성 신호전달 캐스케이드를 통해 인간 T-세포 성장 및 사이토카인 생산을 선택적으로 공동-자극한다(Zhu et al. (2013) Nat. Comm. 4:2043; Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2359-2366). 미경험(naive) T 세포에서 발현되는 TMIGD2는 HHLA2에 대한 활성화 수용체이며, T 세포 항원 수용체(TCR) 결합 후 공동-자극 신호를 전달한다. TMIGD2는 반복된 TCR 자극 후 하향조절된다. HHLA2에 대한 추정상의 저해 수용체가 T 세포 활성화를 조절하기 위해 활성화 T 세포 상에서 상향조절되는 것이 가능하다.
본 개시내용 이전에, 공동저해 기능을 발휘하는 활성화 T 세포 상의 HHLA2에 대한 특성규명되지 않은 수용체의 존재가 몇몇 연구에서 제안되었다(Zhao et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:9879-9884; Xiao and Freeman et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201-2203; Wang et al. (2014) J. Immunol. 192:126.11). HHLA2가 T 세포 및 NK 세포 상의 수용체인 KIR3DL3에 결합되고, HHLA2-KIR3DL3 상호작용의 결과가 T 세포 및 NK 세포 활성화의 저해인 것이 발견되었다(PCT/US2019/026034). 따라서, 본 개시내용은 KIR3DL3 수용체가 암 면역요법에 대한 후보라는 인식을 포괄하고, 본 명세서에는 면역 반응을 조절하기 위하여 KIR3DL3을 표적화하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
본 개시내용은, KIR3DL3을 표적으로 하는 제제(예컨대, 항체)가 HHLA2-KIR3DL3 상호작용을 특이적으로 차단할 수 있고 면역 반응을 조절하는 방법에 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 중요하게는, KIR3DL3을 표적으로 하는 것이 TMIGD2와의 상호작용을 통해서 면역 반응을 활성화시키는 것을 또한 포함하는 HHLA2의 전체 기능을 방해하지 않는다는 것이 본 명세서에서 제시된다. 따라서, 본 개시내용은, KIR3DL3을 표적으로 하는 것이 HHLA2의 면역 저해 기능만을 차단하는 특이성을 제공함으로써, HHLA2의 면역 활성화 기능을 하향조절하지 않으면서 (예컨대, 암 세포에 대한) 효과적인 면역 반응을 유도한다는 중요하고도 놀라운 발견을 제공한다. HHLA2 경로의 면역 저해 활성을 특이적으로 차단하고 이의 자극 기능을 보존하는 제제의 개발은 암(예컨대, 혈액암 및 투명세포 신장 세포 암종(ccRCC)을 비롯한 고형 종양)을 지닌 환자에서 면역관문 차단에 대한 새로운 접근법을 나타낸다.
본 개시내용은 또한 KIR3DL3 및 PD-1 둘 다를 표적으로 하는 제제가 면역 반응을 조절하고/하거나 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체는, 예컨대, 종양에서 T 및 NK 세포를 활성화시키기 위하여, 관문 면역요법으로서 유용하다. 몇몇 실시형태에서, KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체는 PD-1 또는 PD-L1 또는 다른 관문 면역요법과 상가적 또는 상승작용적이다. 또한, 종양에서의 HHLA2 및/또는 KIR3DL3 발현은 KIR3DL3 mAb 및/또는 KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체 관문 차단에 대한 반응성을 결정하기 위한 유용한 바이오마커이다.
예시적인, 대표적인 항-KIR3DL3 인간 단클론성 항체(mAb)의 패널이 면역관문 저해제로서 본 명세서에서 기재된다. 차단 및 비-차단 항-KIR3DL3 mAb가 식별되었고, KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합을 차단하는 항-KIR3DL3 mAb가 T 세포 및 NK 세포 검정에서 관문 저해제 항체인 것으로 제시되었다.
일 양상에서, a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
다른 양상에서, a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
또 다른 양상에서, a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
더욱 다른 양상에서, a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 개시내용에 의해 포괄되는 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 또한 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화, 합성, 쥐 또는 인간의 것이다. 다른 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, (a) 검출 가능하게 표지되고, (b) 세포독성제, 선택적으로 화학요법제, 생물학적 제제, 독소 및/또는 방사성 동위원소에 접합되고, (c) 효과기(effector) 도메인을 포함하고, (d) Fc 도메인을 포함하고, 그리고/또는 (e) Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 및 다이아바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 기탁 번호 ______ 하에 기탁된 하이브리도마 ______로부터 얻어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3에 대한 HHLA2의 결합을 저해한다. T 세포 활성화 검정에서 KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합을 차단하는 KIR3DL3은 관문 차단제인 것으로 제시되었다. 다른 실시형태에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3에 특이적으로 결합한다.
KIR3DL3 및 PD-1에 결합하는 예시적인, 대표적인 이중특이적 항체의 패널이 면역관문 저해제로서 본 명세서에 기재된다.
일 양상에서, 본 명세서에서는, a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 2, 7 내지 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
다른 양상에서, a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
또 다른 양상에서, a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
더욱 다른 양상에서, a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는 b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 개시내용에 의해 포괄되는 임의의 양상에 적용될 수 있는 다수의 실시형태가 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화, 합성, 쥐 또는 인간의 것이다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, (a) 검출 가능하게 표지되고, (b) 세포독성제, 선택적으로 화학요법제, 생물학적 제제, 독소 및/또는 방사성 동위원소에 접합되고, (c) 효과기 도메인을 포함하고, (d) Fc 도메인을 포함하고, 그리고/또는 (e) Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 및 다이아바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 기탁 번호 ______ 하에 기탁된 하이브리도마 ______로부터 얻어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) KIR3DL3에 대한 HHLA2 및 (b) PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 저해한다. KIR3DL3 및 PD-1 둘 다에 결합하는 이중특이적 항체는 관문 차단제인 것으로 제시되었다. 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3 및 PD-1에 특이적으로 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, a) 표 9에 열거된 중쇄 서열; 및/또는 b) 표 9에 열거된 경쇄 서열을 포함한다.
다른 양상에서, 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄가 제공된다.
또 다른 양상에서, (a) 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 및/또는 본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하고; 그리고/또는 (b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 폴리펩타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 보체, 또는 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 폴리펩타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 적어도 약 95% 상동성을 갖는 서열과, 엄격한 조건 하에서, 혼성화되는 단리된 핵산 분자가 제공된다.
더욱 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 단리된 핵산을 포함하거나, 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하거나, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하거나, 또는 기탁 번호 ______ 하에 이용 가능한 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 포함하는 디바이스 또는 키트, 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검출하는 표지를 선택적으로 포함하는 디바이스 또는 키트, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 복합체가 제공된다.
더욱 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 생산하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (i) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시킬 수 있는 적합한 조건 하에 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산에 의해 형질전환된 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, KIR3DL3 폴리펩타이드의 존재 또는 수준을 검출하는 방법은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 사용하여 샘플에서 상기 폴리펩타이드를 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3 폴리펩타이드와 복합체를 형성하고 상기 복합체는 효소결합면역흡착분석법(ELISA), 방사면역검정법(RIA), 면역화학법, 웨스턴 블롯의 형태로, 또는 세포 내 흐름 검정법을 사용해서 검출된다.
또 다른 양상에서, KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 반응성을 예측하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 a) 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 사용하여 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계; b) 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여, KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 양호한 반응성을 갖는 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 샘플 내 및 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계를 포함하고; 여기서 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 수준과 비교하여 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 동일한 또는 더 높은 수준은, 대상체가 요법에 대해 반응성이 있을 것이라는 표시이다. 일 실시형태에서, 요법은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)사용하여 KIR3DL3을 표적으로 한다.
더욱 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 사용하여 KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 반응성을 예측하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 a) 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계; b) KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 양호한 반응성을 갖는 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 샘플 내 및 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 비교하는 단계를 포함하고; 여기서 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 수준과 비교하여 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 동일한 또는 더 높은 수준은, 대상체가 요법에 대해 반응성이 있을 것이라는 표시이다.
위에서 기재된 바와 같이, 소정의 실시형태는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 적용 가능하다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 샘플은 적어도 하나의 대상체로부터 얻어진 단일 샘플의 일부 또는 적어도 하나의 대상체로부터 얻어진 혼합 샘플의 일부이다. 다른 실시형태에서, 요법은 (a) HHLA2와 KIR3DL3; 및/또는 (b) PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 간의 상호작용 및/또는 신호전달을 차단한다. 또 다른 실시형태에서, 샘플은 세포(예컨대, 대상체로부터 얻어진 T 세포 또는 자연살해(NK) 세포, 혈청, 종양주변 조직, 및/또는 종양내 조직)를 포함한다.
더욱 다른 양상에서, 대상체에게 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
위에서 기재된 바와 같이, 소정의 실시형태는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 적용 가능하다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 (a) 암 내 증식 세포의 수를 감소시키고; (b) 암의 종양 부피 또는 크기를 감소시키고; 그리고/또는 (c) T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킨다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예컨대, 단클론성 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체에게 암을 치료하기 위한 치료제 또는 요법을 투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체에게 면역요법, 관문 차단, 암 백신, 키메라 항원 수용체(예컨대, CD19 표적화 CAR), 화학요법, 방사선, 표적요법 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 요법을 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 대상체의 암 세포 및/또는 종양 면역 침윤 세포는 HHLA2를 발현한다. 또 다른 실시형태에서, 암은 선암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병, 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 신경교종, 교모세포종, 신경아세포종, 유방암, 췌장 관 암종, 흉선종, B-CLL, 백혈병, B 세포 림프종, 및 HHLA2에 대한 수용체를 발현하는 면역 세포로 침윤된 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 암은 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병(AML), 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 대상체는 암의 동물 모델이다. 또 다른 실시형태에서, 동물 모델은 마우스 모델이고, 선택적으로 마우스 모델은 인간화 마우스 모델이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간화 마우스 또는 인간이다.
다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 HHLA2와 이의 결합 저해제 수용체인 KIR3DL3 간의 상호작용을 저해 또는 방해한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성제(예컨대, 화학요법제, 생물학적 제제, 독소 및/또는 방사성 동위원소)에 접합된다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응은 하향조절된다. 다른 실시형태에서, 면역 반응은 상향조절된다. 또 다른 실시형태에서, (a) HHLA2와 KIR3DL3; 및/또는 (b) PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 간의 상호작용이 차단된다. 다른 실시형태에서, 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 암 면역요법을 위한 T 세포 활성화의 관문 저해제이다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응을 조절하는 것은 T 세포 기능 또는 NK 세포 기능(예컨대, HHLA2를 발현하는 암 세포와 같은 암 세포에 대한 것과 같은 세포독성)을 조절하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 암은 선암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병, 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 신경교종, 교모세포종, 신경아세포종, 유방암, 췌장 관 암종, 흉선종, B-CLL, 백혈병, B 세포 림프종, 및 HHLA2에 대한 수용체를 발현하는 면역 세포로 침윤된 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 암은 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병(AML), 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 대상체에게 면역요법, 관문 차단, 암 백신, 키메라 항원 수용체(예컨대, CD19 표적화 CAR), 화학요법, 방사선, 표적요법 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 요법을 투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응은 암의 동물 모델(예컨대, 마우스 모델 및/또는 인간화 동물 모델)에서 조절된다. 다른 실시형태에서, 면역 반응은 인간화 마우스 또는 인간과 같은 포유동물에서 조절된다.
범례와 연관된 막대 히스토그램, 곡선 또는 다른 데이터를 나타내는 임의의 도면에서, 각 표시에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된 막대, 곡선, 또는 다른 데이터는 범례의 위에서 아래, 또는 왼쪽에서 오른쪽의 상자에 직접 대응된다.
도 1A 내지 도 1B는 HHLA2에 대한 수용체로서 KIR3DL3을 식별하는 발현 스크린의 결과를 나타낸다. 도 1A는 HEK293 세포에서 개별적으로 발현되는 표시된 세포 표면 수용체에 결합하는 가용성 HHLA2-mIgG2a(HHLA2-Ig)를 사용한 세포 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸다. HHLA2-Ig는 KIR 패밀리의 다른 구성원인 PD-1, PD-L1 또는 HHLA2이 아니라 TMIGD2, KIR3DL3 및 대조군(FCGR2A)에 결합하는 것을 나타낸다. 도 1B는 표시된 농도의 HHLA2-Ig 또는 아이소타입(isotype) 대조군(0.1 ㎍/㎖ 내지 160 ㎍/㎖)을 사용하여 KIR3DL3, TMIGD2 또는 HHLA2를 안정적으로 발현하는 대조군 300.19 세포 또는 300.19 세포에 대한 HHLA2-Ig 또는 대조군 Ig 결합의 유세포 분석을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2D는 HHLA2에 대한 제2 수용체로서의 KIR3DL3의 식별 및 특성규명을 나타낸다. 도 2A는 384개의 인간 수용체를 발현하고 GFP를 공동 발현하고, HHLA2-Ig에 대한 수용체로서 KIR3DL3을 식별하고(상부 패널), 형질감염 및 스폿 국소화를 위한 대조군으로서 GFP 발현을 나타내는(하부 패널) 세포의 복제 마이크로어레이 슬라이드를 도시한다. 도 2B는, HEK293 세포에서 개별적으로 발현되는 표시된 세포 표면 수용체에 결합하는 가용성 HHLA2-mIgG2a(HHLA2-Ig)를 사용한, 도 1A에 도시된 세포 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸다. HHLA2-Ig는 KIR 패밀리의 다른 구성원인 PD-1, PD-L1 또는 HHLA2이 아니라 TMIGD2, KIR3DL3 및 대조군(FCGR2A)에 결합하는 것을 나타낸다. 도 2C는 도 2B에(그리고 도 1A에) 나타낸 수용체 어레이의 형질감염 대조군(GFP 발현) 결과를 나타낸다. 도 2D는 수용체 어레이의 양성 대조군 처리 결과를 나타낸다. 도 2B 및 도 1A에서와 같이 과발현된 수용체의 동일 패널과 인큐베이션된 가용성 PD-1-Ig 및 PD-L1-Ig를 사용한 세포 마이크로어레이 분석은 KIR이 아니라 FCGR2A, PD-1 및 PD-L1에 대한 결합을 나타낸다. PD-1-Ig에 결합하지 않는 PD-L1 스폿은 대안적으로 스플라이싱된 인산화형(isoform)이다.
도 3A 내지 도 3E는 KIR3DL3 및 HHLA2 mAb의 패널의 특성규명을 나타낸다. (도 3A) KIR3DL3을 발현하는 300.19 세포에 대한 KIR3DL3 mAb의 결합의 유세포 분석. 도 3B는 KIR3DL3을 발현하는 300.19 세포에 대한 HHLA2-Ig의 결합을 차단하는 KIR3DL3 mAb의 능력을 나타낸다. 도 3C는 HHLA2를 발현하는 300.19 세포에 대한 HHLA2 mAb 결합을 나타내는데, 2C4, 2G2 및 6F10은 가장 강한 결합을 나타내고 6D10은 더 적은 결합을 나타낸다. 도 3D는 KIR3DL3을 발현하는 300.19 세포에 대한 HHLA2-Ig의 결합을 차단하는 HHLA2 mAb의 능력을 나타내는데, 2C4, 2G2 및 6F10은 가장 강한 결합을 나타낸다. 도 3E는 TMIGD2를 발현하는 300.19 세포에 대한 HHLA2-Ig의 결합을 차단하는 HHLA2 mAb인 2G2 및 6F10의 능력을 나타낸다.
도 4A 내지 도 4C는 KIR3DL3 및 TMIGD2에 대한 HHLA2-mIgG2a 결합을 나타낸다. 도 4A는 도 1B의 정규화된 결합 데이터를 나타낸다. KIR3DL3(청색) 또는 TMIGD2(사이안) 또는 대조군 HHLA2(적색) 형질감염된 또는 부모 300.19 세포(녹색)에 대한 HHLA2-mIgG2a 결합. 도 4B 및 도 4C는, 유세포 분석에 의한 KIR3DL3-형질감염된 293T 세포(도 4B) 또는 TMIGD2-형질감염된 293T 세포(도 4C)에 대한 HHLA2-mIgG2a 또는 아이소타입 대조군(10 ㎍/㎖) 결합을 나타낸다.
도 5는 유세포 분석에 의한 KIR3DL3 형질감염된 300.19 마우스 전구-B 세포 백혈병 세포주 상의 항-KIR3DL3 mAb에 대한 결합 데이터를 나타낸다.
도 6은 웨스턴 블로팅에 의한 KIR3DL3 상의 항-KIR3DL3 mAb에 대한 결합 데이터를 나타낸다. 특히, KIR3DL3으로 형질감염된 Jurkat 세포를 이용한 KIR3DL3 mAb의 웨스턴 블롯 분석 결과가 제시된다.
도 7은 Jurkat 부모 세포, KIR3DL3로 형질감염된 Jurkat, NK-92 세포 및 NK-92-MI 세포에서의 KIR3DL3 발현을 나타낸다. 용해물은 5 ug/㎖의 항-KIR3DL3 mAb 574.1F12로 블로팅되었다.
도 8은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스(World Wide Web at ebi.ac.uk/gxa/sc/home 상에서 이용 가능한 EMBL-EBI 데이터베이스 및 biorxiv.org/content/10.1101/429589v1에서 World Wide Web 상에서 이용 가능한 명칭이 "Reconstructing the human first trimester fetal-maternal interface using single cell transcriptomics"인 대응하는 간행물 참조)에서 평가된 바와 같은 KIR3DL3 발현의 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석을 나타낸다. KIR3DL3 발현은 우측 패널에 청색 점으로 표시된다. 흑색 박스는 대부분의 KIR3DL3 발현이 나타나는 탈락막 NK 세포를 강조 표시한다.
도 9는 KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합의 항-KIR3DL3 mAb 차단을 나타낸다.
도 10A 내지 도 10D는 활성화된 인간 T-세포 및 NK92-MI 세포 상의 KIR3DL3 발현을 나타낸다. 도 10A는 4개의 정상 공여체의 전혈로부터 정제되고, CD3/CD28 항체 사량체로 활성화되고, 게이팅된 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포에서 KIR3DL3 발현을 평가하기 위하여 표시된 날짜에 이중으로 수행된 FACS 분석을 거친 T 세포의 결과를 나타낸다. 제0일(비활성화)(도 10B) 및 활성화 후 제21일(도 10C)에 KIR3DL3 발현을 나타내는 FACS 플롯. 도 10D는 NK92-MI 상의 KIR3DL3 발현을 나타내지만(좌측 패널), NK-92 세포 상에서는 최소로 발현된다(우측 패널).
도 11A 내지 도 11C는 KIR3DL3이 T 세포에서 저해 수용체이고 T 세포 활성화가 HHLA2/KIR3DL3 차단에 의해 강화되는 것을 나타낸다. 도 11A는 표시된 바와 같이 CD28 mAb의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 scFV를 발현하는 CHO 세포, 항-CD3 scFV 및 HHLA2를 공동 발현하는 CHO 세포, 또는 비형질감염된 CHO 세포와 공동-배양된 KIR3DL3을 발현하는 Jurkat IL-2-리포터 T 세포의 결과를 나타낸다. 루시페라제 활성은 상대 광 단위(RLU)로서 표시된다. 도 11B 및 도 11C는 CD28 mAb 및 HHLA2 mAb(도 11B) 또는 KIR3DL3 mAb(도 11C)의 존재 하에 항-CD3 scFV 및 HHLA2를 공동-발현하는 CHO 세포와 공동-배양된 KIR3DL3을 발현하는 Jurkat IL-2-리포터 T 세포의 결과를 나타낸다. IL-2 리포터 루시페라제 활성의 활성화 배수는 평균±S.D.로서 제시된다(n≥3; **** P≤0.0001).
도 12는 HHLA2/TMIGD2 상호작용이 T 세포 활성화를 강화시키는 것을 나타낸다. TMIGD2를 발현하고 루시페라제에 연결된 NFAT 프로모터를 보유하는 Jurkat T 세포를 항-CD3 scFV CHO 세포 또는 HHLA2-항-CD3 scFV CHO 세포와 공동 배양하고 루시페라제 활성(RLU)을 검정하였다. 정량화는 평균±S.D.로서 제시된다(n≥3; ***P≤0.001).
도 13은 항-CD3-scFV 및 HHLA2-매개 신호에 반응하여 Jurkat-KIR3DL3 T 세포에서 IL-2 프로모터 구동된 루시페라제 발현의 항-KIR3DL3 mAb 강화를 나타낸다.
도 14는 항-CD3-scFV 및 HHLA2-매개 신호에 반응하여 Jurkat-KIR3DL3 T 세포에서 IL-2 프로모터 구동된 루시페라제 발현의 항-HHLA2 mAb 강화를 나타낸다.
도 15A 내지 도 15D는 CD19 및 HHLA2를 발현하는 HeLa 종양에 대한 KIR3DL3-CD19-CAR-T 세포 세포독성을 나타낸다. 도 15A는 KIR3DL3/CAR-19 발현 플라스미드 및 렌티바이러스 생산을 나타낸다. 특히, 도 15A는 PMC456-Ef1a 발현 플라스미드의 개략도를 나타낸다. 도 15B는 KIR3DL3/CD19-CAR-T 세포의 생성 및 확장을 나타낸다. 특히, 도 15B는 KIR3DL3/CAR-19 T 세포(PMC456 세포)의 FACS 프로파일을 나타낸다. 도 15C는 안정적인 HeLa-CD19 및 HeLa-CD19+KIR3DL3 발현 세포의 생성을 나타낸다. 특히, 도 15C는 HeLa-CD19 및 HeLa-CD19-KIR3DL3 종양 세포의 FACS 프로파일을 나타낸다. 도 15D는 HHLA2 mAb가 HHLA2+CD19 형질감염된 HeLa 종양 세포에 대한 KIR3DL3 CD19-CAR-T 세포 세포독성을 강화시키는 것을 나타낸다.
도 16A 내지 도 16C는 HHLA2를 발현하거나 발현하지 않는 HeLa 종양 표적 세포에 대한 KIR3DL3을 발현하는 NK92 세포의 세포독성 검정을 나타낸다. 도 16A는 KIR3DL3 발현 플라스미드 및 렌티바이러스 생산을 나타낸다. 특히, 도 16A는 PMC579 KIR3DL3 발현 플라스미드의 개략도를 나타낸다. 도 16B는 KIR3DL3 형질도입된 NK92 세포의 유도를 나타낸다. 특히 도 16B는 KIR3DL3/NK92 FACS 프로파일을 나타낸다. 도 16C는 HHLA2-형질감염된 또는 형질도입된 K562 및 HeLa 세포의 유도를 각각 나타낸다. 특히, 도 16C는 HHLA2-형질감염된 K562 세포 및 HHLA2 형질도입된 HeLa 종양 세포의 FACS 프로파일을 나타낸다.
도 17A 내지 도 17C는 HeLa 단독 및 HeLa 형질도입된 HHLA2 발현 종양 표적 세포에 대한 NK92 세포독성을 나타낸다. 도 17A는 KIR3DL3 - HHLA2 상호작용/경로에 의한 NK92 세포독성의 저해를 나타낸다. 도 17B는 HHLA2 mAb 및 KIR3DL3 mAb에 의한 NK92-KIR3DL3 세포독성의 강화를 나타낸다. 도 17C는 소정의 세포독성 검정의 개략도를 나타낸다.
도 18은 유세포 분석에 의한 Raji-B2M KO 및 HHLA2 형질감염된 Raji-B2M KO에서의 베타2-마이크로글로불린 및 HHLA2 발현을 나타낸다.
도 19A 내지 도 19E는 KIR3DL3이 NK 세포에서 저해 수용체이고 NK 세포독성이 HHLA2/KIR3DL3 차단에 의해 강화되는 것을 나타낸다. 도 19A는 B2M 결실을 보유하는 Raji 세포(Raji-B2M KO 세포) 및 HHLA2를 발현하는 Raji-B2M KO 세포에 대한 NK92-MI 세포독성을 나타낸다. 도 19B 및 도 19C는 10 ug/㎖의 KIR3DL3 항체(도 19B) 또는 HHLA2 항체(도 19C) 및 아이소타입 대조군의 존재 하에 표시된 E/T 비로 HHLA2를 발현하는 Raji-B2M KO 세포에 대한 NK92-MI 세포독성을 나타낸다. 도 19D는 Raji B2M KO 세포와 또는 표시된 E/T 비로 HHLA2를 과발현하는 Raji B2M KO 세포와 함께 인큐베이션된 NK92-MI 세포의 결과를 나타낸다. 탈과립화는 CD56+ 집단의 CD107a 양성 세포 %로서 측정되었다. 대조군은 효과기 세포 단독 또는 PMA/ION이 있는 효과기 세포였는데, 이는 전체 탈과립화를 초래한다. 도 19E는 아이소타입 대조군과 비교하여 KIR3DL3 mAb(1G7)의 존재 하에 HHLA2를 과발현하는 Raji B2M KO 세포를 표적으로 하는 NK92-MI 세포의 강화된 탈과립화를 나타낸다. 정량화는 평균±S.D.로 제시된다(N≥3; P≥0.05; *P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001; ****P≤0.0001).
도 20은 HHLA2 발현이 PD-L1 발현과는 다른 것임을 나타낸다. 도 20은 TCGA(Cancer Genome Atlas) 샘플로부터의 정상 신장과 비교해서 RCC에서의 B7 유전자 패밀리 구성원의 발현 수준을 나타낸다.
도 21A 내지 도 21B는 HHLA2 경로 모델을 나타낸다. HHLA2는 미경험 T 세포 또는 NK 세포에서 TMIGD2를 통해서 면역 자극 신호를 전달한다. 도 21A는 TMIGD2 발현의 손실 및 KIR3DL3의 획득으로 이어지는 T 세포 활성화를 나타낸다. HHLA2는 활성화된 T 세포에서 KIR3DL3을 통해서 면역 저해 신호를 전달한다. 도 21B는 저해성 및 활성화 수용체에 의해 조절된 NK 세포용해 활성을 나타낸다. 저해 수용체는, 각각 MHC 클래스 I, E 및 G를 인식하는 대부분의 KIR, CD94/NKG2A 및 LILRBI를 포함한다. 활성화 수용체는, ULBP-1, MICA, MICB, B7-H6, HLA-E, HHLA2, 및 기타를 인식하는 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD94/NKG2C 및 TMIGD2를 포함한다. 종양이 MHC 발현을 소실하면(미싱 셀프(missing self)), 저해 신호가 감소되고, 활성화 신호가 우세하여, NK 세포에 의한 종양 용해를 초래한다. 종양 상의 HHLA2는, MHC와는 독립적으로, KIR3DL3-양성 NK 세포에 의한 용해를 저해하는 저해 신호이다.
도 22는 KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체의 작제를 위한 개략도를 나타낸다.
도 23은 Octet 검정에서 KIR3DL3 및 PD-1 인간 IgG4 및 scFV 항체의 결합 센소그램(sensogram)을 나타낸다.
B7 유전자 패밀리 구성원인 HHLA2는 다양한 종양 및 항원 제시 세포에서 광범위하게 발현되고 T 세포에 대한 활성화 및 저해 리간드 둘 다로서 연관되어 왔다. 미경험 T 세포에서 발현되는 TMIGD2는 HHLA2에 대한 활성화 수용체이며 T 세포 항원 수용체(TCR) 관여 후 공동자극 신호를 전달한다. TMIGD2는 반복된 TCR 자극 후 하향조절된다. HHLA2는 T 세포 및 NK 세포에서 발현되는 또 다른 수용체인 KIR3DL3에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은, HHLA2-TMIGD2 상호작용의 면역 활성화 기능과 달리, HHLA2-KIR3DL3 상호작용이 면역 반응을 저해시킬 수 있고, 예를 들어, 암을 비롯한 다양한 질환, 장애 또는 병태에서 조절을 위한 매력적인 표적을 제공한다는 인식을 포괄한다.
본 개시내용은, KIR3DL3을 표적으로 하는 것이 면역 반응을 저해하는 HHLA2-KIR3DL3 상호작용을 특이적으로 차단할 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 중요하게는, KIR3DL3을 표적으로 하는 것은, TMIGD2와의 상호작용을 통한 면역 반응 활성화를 또한 포함하는 HHLA2의 전체적인 기능을 방해하지 않는다. 따라서, KIR3DL3을 정확하게 표적으로 하는 것은 HHLA2의 면역 저해 기능만을 차단하는 특이성을 제공함으로써, HHLA2의 면역 활성화 기능을 하향 조절하지 않고, 예컨대, 암세포에 대한 효과적인 면역 반응을 유도한다.
본 개시내용은 또한 KIR3DL3 및 PD-1 둘 다를 표적으로 하는 제제가 면역 반응을 조절하고/하거나 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체는 종양에서 T 및 NK 세포를 활성화시키는 관문 면역요법이다. 몇몇 실시형태에서, KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체는 PD-1 또는 PD-L1 또는 다른 관문 면역요법과 상가적이거나 또는 상승작용적이다. 또한, 종양에서 HHLA2 및/또는 KIR3DL3 발현은 KIR3DL3 mAb 및/또는 KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체 관문 차단에 대한 반응성을 결정하기 위한 유용한 바이오마커이다.
예시적인, 대표적인 항-KIR3DL3 인간 단클론성 항체(mAb)의 패널은 본 명세서에서 면역관문 저해제로서 기재된다. 차단 및 비-차단 항-KIR3DL3 mAb가 식별되었고, KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합을 차단하는 항-KIR3DL3 mAb는 T 세포 및 NK 세포 검정에서 관문 저해제 항체인 것으로 나타났다. 이들 후보 치료용 항-KIR3DL3 항체에 대한 가변 영역 중쇄 및 경쇄 유전자 서열뿐만 아니라 결합 특성이 본 명세서에 기재되어 있다.
KIR3DL3 및 PD-1 둘 다에 결합하는 예시적인, 대표적인 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 패널은 또한 본 명세서에서 면역관문 저해제로 기재된다. 중첩되지 않는 발현으로 2개의 면역관문을 표적으로 하는 것은 상가적 또는 상승작용적 항-종양 활성을 갖는 병용 요법을 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 KIR3DL3에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 및 이의 항원-결합 단편, KIR3DL3 및 PD-1에 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편뿐만 아니라, 면역글로불린, 폴리펩타이드, 이의 핵산, 및 예컨대, 면역요법 및 치료 목적을 위해 이러한 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
I. 정의
단수 표현은 단수 표현의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에 사용된다. 예를 들어, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나를 초과하는 요소를 의미한다.
마커의 "변경된 양"이라는 용어는, 대조군 샘플의 마커와 비교하여, 샘플 내 증가 또는 감소된 마커의 카피수 및/또는 증가 또는 감소된 특정 마커 유전자 또는 유전자들의 핵산 수준을 지칭한다. 또한, 마커의 "변경된 양"이라는 용어는, 정상, 대조군 샘플의 마커의 단백질 수준과 비교하여, 샘플 내 증가 또는 감소된 마커의 단백질 수준을 포함한다.
마커의 "변경된 활성"이라는 용어는, 정상, 대조군 샘플의 마커의 활성과 비교하여, 질환 상태, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 증가 또는 감소된 마커의 활성을 지칭한다. 마커의 변경된 활성은, 예를 들어, 마커의 변경된 발현, 마커의 변경된 단백질 수준, 마커의 변경된 구조, 또는, 예를 들어, 마커로서 같거나 다른 경로에 포함되는 다른 단백질과의 변경된 상호작용, 또는 전사 활성화제 또는 저해제와의 변경된 상호작용의 결과일 수 있다.
마커의 "변경된 구조"라는 용어는, 정상 또는 야생형 유전자 또는 단백질과 비교하여, 마커 유전자 또는 마커 단백질의 돌연변이 또는 대립유전자 변이, 예를 들어, 마커의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이의 존재에 관련된다. 예를 들어, 돌연변이는 치환, 결실 또는 부가 돌연변이를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 돌연변이는 마커의 암호화 또는 비-암호화 영역 내에 존재할 수 있다.
"활성화 수용체"라는 용어는, (예컨대, MHC 폴리펩타이드의 맥락에서) 항원에 결합하거나, 항원과 복합체화되거나, 또는 항체에 결합하는 면역 세포 수용체를 포함한다. 이러한 활성화 수용체는 T 세포 수용체(TCR), B 세포 수용체(BCR), 사이토카인 수용체, LPS 수용체, 보체 수용체, 및 Fc 수용체를 포함한다.
T 세포 수용체는 T 세포 상에 나타나고 CD3 폴리펩타이드와 연관된다. T 세포 수용체는 MHC 폴리펩타이드의 맥락에서 항원에 의해(뿐만 아니라 다클론성 T 세포 활성화 시약에 의해) 자극된다. TCR을 통한 T 세포 활성화는 수많은 변화, 예를 들어, 단백질 인산화, 막 지질 변화, 이온 플럭스, 고리형 뉴클레오타이드 변화, RNA 전사 변화, 단백질 합성 변화, 및 세포 부피 변화를 초래한다.
"키메라 항원 수용체", "CAR" 또는 "CAR-T"라는 용어는 원하는 항원 특이성을 갖는 조작된 T 세포 수용체(TCR)에 관련된다. T 림프구는 주 조직적합성 복합체(MHC) I형 또는 II형 분자에 의해 제시된 짧은 펩타이드와 T 세포 수용체(TCR)의 상호작용을 통해 특정 항원을 인식한다. 초기 활성화 및 클론 확장을 위해, 미경험 T 세포는 부가적 공동-자극 신호를 제공하는 전문적 항원-제시 세포(APC)에 의존한다. 공동-자극의 부재 상에서 TCR의 활성화는 무반응 및 클론성 아네르기(anergy)을 초래할 수 있다. 면역화를 우회하기 위해, 이식된 인식 특이성을 갖는 세포독성 효과기 세포의 유도를 위한 다른 접근법이 개발되었다. TCR-연관 CD3 복합체의 세포-표면 성분에 특이적인 천연 리간드 또는 항체로부터 파생된 결합 도메인으로 구성된 CAR이 구축되었다. 항원 결합 시, 이러한 키메라 항원 수용체는 효과기 세포의 내인성 신호전달 경로에 연결되고 TCR 복합체에 의해 개시된 것과 유사한 활성화 신호를 생성한다. 예를 들어, 혈액암 세포에서 고도로 발현되는 단백질인 CD19 표적화 CAR은, 우수한 임상 효능을 나타내었다. 키메라 항원 수용체에 관한 첫 보고 이후, 이 컨셉은 꾸준이 개선되었고 키메라 수용체의 분자 설계는 최적화되었으며 scFV, Fav, 및 본 명세서에 기재된 다른 단백질 결합 단편과 같은 많은 잘 알려진 결합 도메인을 일상적으로 사용한다.
일반적으로, CAR은 본 개시내용에 따른 용도를 위해 고려된 "세포 요법"(예컨대, T 세포 요법)의 한 유형이다. KIR3DL3과 HHLA2와 같은 KIR3DL3 천연 결합 상대 간의 상호작용 조절과 같은 KIR3DL3 경로의 조절에 의해 면역 세포 활성을 조절하는 제제 및 방법의 많은 대표적인 실시형태가 있지만, 면역 세포-기반 요법 및 방법 또한 포함된다. 예를 들어, KIR3DL3의 넉아웃, 넉다운 또는 증가된 발현을 갖도록 조작된 T 세포가 고려된다. 유사하게, KIR3DL3, HHLA2에 대한 리간드의 넉아웃, 넉다운 또는 증가된 발현을 갖도록 조작된 면역 세포 또는 다른 세포가 또한 고려된다.
B 세포 수용체(BCR)는 B 세포 상에 제시된다. B 세포 항원 수용체는 막 Ig(mIg) 및 다른 막관통 폴리펩타이드(예컨대, Igα 및 Igβ) 사이의 복합체이다. mIg의 신호 전달 기능은 올리고머 또는 멀티머 항원에 의한 수용체 폴리펩타이드의 교차연결에 의해 촉발된다. 또한 B 세포는 항-면역글로불린 항체에 의해 활성화될 수 있다. BCR 활성화 시, 티로신 인산화를 포함하는 B 세포의 수많은 변화가 발생한다.
Fc 수용체는 면역 반응에 관여하는 많은 세포에서 발견된다. Fc 수용체(FcR)는 면역글로불린 폴리펩타이드(Ig)의 Fc 부분에 대한 세포 표면 수용체이다. 지금까지 확인된 인간 FcR 중에는, IgG(FcγR로 표시), IgE(Fcε R1), IgA(Fcα), 및 중합된 IgM/A(Fcμα R)를 인식하는 것들이 있다. FcR은 다음의 세포 유형에서 발견된다: Fcε RI(비만세포), Fcε R.II(많은 백혈구), Fcα R(호중구), 및 Fcμα R(선상피, 간세포)(Hogg, N. (1988) Immunol. Today 9:185-86). 폭넓게 연구된 FcγR은 세포 면역 방어의 중심이며, 자가면역 질환의 발병에 관련된 염증의 매개체 및 가수분해 효소의 방출을 자극하는 역할을 한다(Unkeless, J. C. et al. (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:251-81). 대식세포/단핵구, 다형핵 백혈구, 및 자연살해(NK) 세포 FcγR이 IgG에 의해 매개되는 특이적 인식 요소를 부여하기 때문에, FcγR은 효과기 세포 및 Ig를 분비하는 림프구 사이에 중요한 연결고리를 제공한다. 인간 백혈구는 IgG에 대한 적어도 3종의 상이한 수용체를 갖는다: h Fcγ RI(단핵구/대식세포 상에서 발견됨), h Fcγ RII(단핵구, 호중구, 호산구, 혈소판, 가능한 B 세포, 및 K562 세포주 상에서), 및 Fcγ RIII(NK 세포, 호중구, 호산구, 및 대식세포 상에서).
T 세포와 관련하여, T 세포로 공동자극 신호를 전달하는 것은 사이클로스포린 A(cyclosporin A)에 의해 저해되지 않는 신호전달 경로를 포함한다. 또한, 공동자극 신호는 T 세포에서 사이토카인 분비(예컨대, IL-2 및/또는 IL-10)를 유도할 수 있고/있거나 항원에 대한 무반응 유도, 아네르기 유도, 또는 T 세포에서 세포사(삭제) 유도를 방지할 수 있다.
폴리펩타이드, 예컨대, KIR3DL3 및/또는 KIR3DL3 천연 결합 상대, 예컨대, HHLA2와 관련하여 사용할 때 "활성"이라는 용어는, 단백질의 구조에 내재된 활성을 포함한다. 예를 들어, HHLA2 리간드와 관련하여, "활성"이라는 용어는 면역 세포에서 저해 신호를 조절하여(예컨대, 면역 세포 상의 천연 수용체와 결합하여) 면역 세포 저해를 조절하는 능력을 포함한다. 당업자라면 HHLA2 리간드 폴리펩타이드의 활성화 형태가 저해 수용체, 예컨대, KIR3DL3에 결합할 때 면역 세포에서 저해 신호가 생성된다는 것을 인식할 것이다.
"저해 신호"라는 용어는 면역 세포 상의 폴리펩타이드에 대한 저해 수용체(예컨대, KLRB1, CTLA4, PD-1 등)를 통해 전달되는 신호에 관련된다. 이러한 신호는 활성화 수용체를 통해(예컨대, TCR, CD3, BCR, TMIGD2 또는 Fc 폴리펩타이드를 통해) 신호를 길항하고 예를 들어, 제2 메신저 생성 저해; 증식 저해; 면역 세포에서 효과기 기능 저해, 예를 들어, 감소된 식세포작용, 감소된 항체 생산, 감소된 세포독성, 면역 세포의 매개체(사이토카인(예컨대, IL-2) 및/또는 알레르기 반응의 매개체) 생산 실패; 또는 아네르기 발생을 초래할 수 있다.
대상체에서 바이오마커의 양이 양을 평가하기 위해 사용된 분석의 표준 편차 보다 큰 양만큼 정상 또는 대조군 수준 보다, 각각, 더 크거나 더 작은 경우, 및 바람직하게는 그 양의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%인 경우, 대상체에서 바이오마커의 양은 정상 양의 바이오마커 보다 "유의하게" 더 높거나 더 낮다. 대안적으로, 대상체에서 바이오마커의 양이 정상 및/또는 대조군의 바이오마커 양보다, 각각, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 그 이상, 또는 사이의 임의의 범위, 예를 들어, 5% 내지 100%, 더 높거나 더 낮은 경우, 대상체에서 바이오마커의 양은 정상 및/또는 대조군의 양보다 "유의하게" 더 높거나 더 낮은 것으로 간주될 수 있다. 이러한 유의한 조절 값은 본 명세서에 기재된 임의의 메트릭, 예를 들어, 발현의 변경된 수준, 변경된 활성, 암 세포의 과증식성 성장에서의 변화, 암 세포의 사멸에서의 변화, 바이오마커 저해에서의 변화, 시험 제제 결합에서의 변화 등에 적용될 수 있다.
마커의 "발현의 변경된 수준"이라는 용어는 시험 샘플, 예를 들어, 암을 앓고 있는 대상체에서 유래된 샘플에서의 마커의 발현 수준 또는 카피수에 관련되며, 이는 발현 또는 카피수를 평가하기 위해 사용된 분석의 표준 편차 보다 더 크거나 더 작고, 바람직하게는 대조군 샘플(예컨대, 연관된 질환을 갖지 않는 건강한 대상체로부터의 샘플)에서 마커 또는 염색체 영역의 발현 수준 또는 카피수, 바람직하게는 몇몇 대조군 샘플에서의 마커 또는 염색체 영역의 평균 발현 수준 또는 카피수에 적어도 2배, 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 또는 그 이상이다. 발현의 변경된 수준은 발현 또는 카피수를 평가하기 위해 사용된 분석의 표준 편차 보다 더 크거나 더 작고, 바람직하게는 대조군 샘플(예컨대, 연관된 질환을 갖지 않는 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 마커의 발현 수준 또는 카피수, 바람직하게는 몇몇 대조군 샘플에서의 마커의 평균 발현 수준 또는 카피수, 보다 적어도 2배, 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 또는 그 이상이다.
본 명세서에서 달리 명시되지 않은 한, "항체"라는 용어는 항체의 자연-발생 형태(예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 재조합 항체, 예를 들어, 단일-사슬 항체, 키메라 및 인간화 항체 및 다중-특이적 항체뿐만 아니라, 전술한 모든 것의 단편 및 유도체로 적어도 하나의 항원 결합 부위를 갖는 단편 및 유도체를 광범위하게 포함한다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질에 관련된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약기) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약기) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초 가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카복실-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. "불활성화 항체"라는 용어는 보체 시스템을 유도하지 않는 항체에 관련된다.
본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 또한 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원(예컨대, KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 영역을 짝지어 1가 폴리펩타이드를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여, 결합될 수 있다(단일사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778] 참조). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 특이적 scFv의 임의의 VH 및 VL 서열은 온전한 IgG 폴리펩타이드 또는 다른 아이소타입을 암호화하는 발현 벡터를 생성하기 위해 인간 면역글로불린 불변 영역 cDNA 또는 게놈 서열에 연결될 수 있다. VH 및 VL은 또한 단백질 화학법 또는 재조합 DNA 기술을 사용한 Fab, Fv 또는 면역글로불린의 다른 단편의 생성에 사용될 수 있다. 다이아바디와 같은 단일 사슬 항체의 다른 형태가 또한 포함된다. 다이아바디는 단일 폴리펩타이드 사슬에 VH 및 VL 도메인이 발현된 2가 이중 특이적 항체이지만, 같은 사슬 상 두 도메인 사이의 결합을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하기 때문에 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 결합하게 만들고 두 항원 결합 부위를 생성한다(예컨대, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
추가로 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유 또는 비공유 결합으로 형성된 더 큰 면역부착 폴리펩타이드의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 폴리펩타이드의 예는 사량체 scFv 폴리펩타이드를 만들기 위해 스트렙타비딘 코어 영역을 사용하는 것(Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)과 2가 및 비오틴화 scFv 폴리펩타이드를 만들기 위해 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 테그를 사용하는 것(Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 전체 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역부착 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다.
항체는 다클론성 또는 단클론성; 이종, 동종이계, 또는 동계; 또는 이의 변형된 형태(예컨대, 인간화, 키메라 등)일 수 있다. 항체는 또한 완전한 인간의 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체는 KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 또는 실질적으로 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서 사용되는 "단클론성 항체" 및 "단클론성 항체 조성물"이라는 용어는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 한 종만을 포함하는 항체 폴리펩타이드의 집단을 지칭하는 반면, "다클론성 항체" 및 "다클론성 항체 조성물"이라는 용어는 특정 항원과 상호작용할 수 있는 항원 결합 부위의 여러 종들을 포함하는 항체 폴리펩타이드의 집단을 지칭한다. 단클론성 항체 조성물은 일반적으로 면역반응하는 특정 항원에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다.
"체액"이라는 용어는 신체로부터 배설되거나 분비되는 액체뿐만 아니라 일반적으로 그렇지 않은 액체(예컨대, 양수, 수양액, 담즙, 혈액 및 혈장, 뇌척수액, 세루멘 및 귀지, 쿠퍼액 또는 사정전 액, 유미(chyle), 유미즙(chyme), 대변, 여성 사정액, 간질액, 세포내 액, 림프, 생리, 모유, 점액, 흉수, 고름, 침, 피지, 정액, 혈청, 땀, 관절액, 눈물, 소변, 질액, 유리체액, 구토물)를 지칭한다.
"암" 또는 "종양" 또는 "과증식성 장애"는 제어되지 않는 증식, 불멸, 전이성 잠재력, 급속한 성장 및 증식률, 및 특정 특징적인 형태적 특징과 같은 암-유발 세포의 전형적인 특징을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양의 형태이지만, 이러한 세포는 동물 내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 백혈병 세포와 같은 비-종양성 암 세포일 수 있다. 암은 B 세포 암, 예를 들어, 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄 질환, 예를 들어, 알파 사슬 질환, 감마 사슬 질환, 및 뮤 사슬 질환, 양성 단클론성 글로불린혈증, 및 면역세포성 아밀로이드증, 흑색종, 유방암, 폐암, 기관지암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추신경계 암, 말초신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 자궁 또는 자궁내막 암, 구강 또는 인두 암, 간암, 신장암, 고환암, 담도암, 소장 또는 맹장 암, 침샘암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 혈액학 조직 암 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법에 적용할 수 있는 암 유형의 다른 비제한적인 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활액종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암종, 기저세포암, 샘암종, 땀샘암종, 피지샘암종, 유두모양암종, 유두선암, 낭종암, 수질암종, 기관지원성암종, 신장세포암종, 담도암종, 간암, 융모막암종, 정상피종, 태생성 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 골암, 뇌종양, 고환암, 폐암종, 폐소세포암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과선종, 혈관모세포종, 청각신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수세포성 백혈병(골수모구성, 전골수세포성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성다혈구증, 림프종(호지킨 질환 및 비-호지킨 질환), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 중쇄 질환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 암은 본질적으로 상피성이고 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 부인과암, 신장암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 또는 피부암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 암은 유방암, 전립선암, 폐암 또는 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 상피암은 비소세포 폐암, 비유두형 신장세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예컨대, 장액성 난소 암종), 또는 유방 암종이다. 상피암은 장액성, 자궁내막모양, 점액성, 투명 세포, 브레너, 또는 비분류를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 다른 방식으로 특징지을 수 있다.
"CDR"이라는 용어는, 3개가 예를 들어, 항체 상에 경쇄 가변 영역의 결합 특성을 구성하고(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3) 3개가 중쇄 가변 영역의 결합 특성을 구성하는(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 상보성 결정 영역(CDR)을 지칭한다. CDR은 항체 분자의 기능적 활성에 기여하며 스캐폴딩 또는 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산 서열로 구분된다. 정확한 정의의 CDR 경계 및 길이는 상이한 분류 및 번호 지정 시스템에 따라 다르다. 따라서 CDR은 Kabat, Chothia, 접촉 또는 임의의 다른 경계 정의로 지칭될 수 있다. 서로 다른 경계에도 불구하고, 이들 시스템 각각은 가변 서열 내에 소위 "초가변 영역"을 구성하는 것에서 어느 정도의 중첩을 갖는다. 이들 시스템에 따른 CDR의 정의는 인접 프레임워크 영역에 관하여 길이 및 경계 구역이 다를 수 있다. 예를 들어, Kabat, Chothia, 및/또는 MacCallum 등의 문헌(Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901; 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732, 이들 각각은 그 전체가 참조로 원용됨)을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "분류하는"이라는 용어는 샘플을 질병 상태와 "연관시키는" 또는 "범주화하는" 것을 포함한다. 특정 사례에서, "분류"는 통계적 증거, 경험적 증거, 또는 이들 모두를 기초로 한다. 소정의 실시형태에서, 분류의 방법 및 시스템은 알려진 질환 상태를 갖는 샘플의 소위 훈련 세트를 사용한다. 일단 확립되면, 훈련 데이터 세트는 샘플의 미지의 질환 상태를 분류하기 위해 미지의 샘플의 특징을 비교하는 기준, 모델, 또는 주형 역할을 한다. 특정 사례에서, 샘플의 분류는 샘플의 질환 상태를 진단하는 것과 유사하다. 특정 다른 사례에서, 샘플의 분류는 다른 질환 상태로부터 샘플의 질환 상태를 구별하는 것과 유사하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "암호화 영역"이라는 용어는 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 지칭하는 반면, "비암호화 영역"이라는 용어는 아미노산 잔기로 번역되지 않는 뉴클레오타이드 서열의 영역(예컨대, 5' 및 3' 비번역 영역)을 지칭한다.
"[에 대한] 보체" 또는 "상보적인"은 두 핵산 가닥의 영역들 사이 또는 같은 핵산 가닥의 두 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 의미한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 제2 핵산 영역의 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행한 이 잔기와 특이적인 수소 결합("염기 페어링")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 제2 핵산 가닥의 잔기가 구아닌인 경우 제1가닥에 역평행한 이 잔기와 염기 페어링할 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역 및 핵산의 제2 영역이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 페어링할 수 있는 경우, 핵산의 제1 영역은 같거나 다른 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 일 실시형태에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이에 의해, 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 부분의 적어도 약 50%, 및 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기 페어링할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기가 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기 페어링할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "복합 항체"는 둘 이상의 비관련 가변 영역으로부터의 생식세포계열 또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 추가로, "복합 인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포계열 또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역 및 둘 이상의 비관련 인간 가변 영역으로부터의 인간 생식세포계열 또는 비-생식세포계열 서열을 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 복합 인간 항체는, 인체 내에서 복합 인간 항체의 항원성이 낮기 때문에 본 개시내용에 따른 치료제의 유효 성분으로서 유용하다.
"대조군"이라는 용어는 시험 샘플 내 발현 산물과의 비교를 제공하기에 적합한 임의의 참조 표준을 지칭한다. 일 실시형태에서, 대조군은 발현 산물의 수준이 검출되고 시험 샘플로부터의 발현 산물의 수준에 비교되는 "대조군 샘플"을 수득하는 것을 포함한다. 이러한 대조군 샘플은 결과가 알려진 대조군 암 환자의 샘플(보관된 샘플 또는 이전 샘플 측정치일 수 있음); 정상 환자 또는 암 환자와 같은 대상체로부터 단리된 정상 조직 또는 세포, 정상 대상 또는 암 환자와 같은 대상체로부터 단리된 배양된 1차 세포/조직, 암 환자의 동일 기관 또는 신체 위치에서 얻은 인접 정상 세포/조직, 정상 대상체로부터 단리된 조직 또는 세포, 또는 기탁기관에서 얻은 1차 세포/조직을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 샘플을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 하우스키핑 유전자, 정상 조직으로부터의 발현 산물 수준 범위(또는 다른 이전에 분석된 대조군 샘플), 이전에 결정된 환자군의 시험 샘플 내 발현 산물 수준 범위, 또는 특정 결과(예컨대, 1년, 2년, 3년, 4년 등의 기간 동안의 생존)를 갖거나 특정 치료(예컨대, 표준 치료 암 요법)를 받는 환자의 세트를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 공급원으로부터의 참조 표준 발현 산물 수준을 포함할 수 있다. 당업자라면 이러한 대조군 샘플 및 참조 표준 발현 산물 수준은 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법에서 대조군으로서 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일 실시형태에서, 대조군은 정상 또는 비-암성 세포/조직 샘플을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 암 환자의 세트와 같은 환자의 세트에 대한, 또는 특정 치료를 받는 암 환자의 세트에 대한, 또는 하나의 결과 대 다른 결과를 갖는 환자의 세트에 대한 발현 수준을 포함할 수 있다. 전자의 경우, 각 환자의 특이적 발현 산물 수준이 발현의 백분위 수준으로 부여되거나, 또는 참조 표준 발현 수준의 평균 보다 높거나 낮은 것으로 표현될 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 정상 세포, 병용 화학요법으로 치료받은 환자의 세포, 및 양성 암을 갖는 환자의 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 또한 측정된 값, 예를 들어, 동일 집단의 하우스키핑 유전자의 발현 수준과 비교된 집단의 특정 유전자의 발현 평균 수준을 포함할 수 있다. 이러한 집단은 정상 대상, 어떠한 치료도 받지 않은 암 환자(즉, 치료 경험 없음), 표준 치료 요법을 받고 있는 암 환자, 또는 양성 암을 갖는 환자를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 시험 샘플 내 두 유전자의 발현 산물 수준의 비율을 결정하고 이들을 참조 표준 내 같은 두 유전자의 임의의 적합한 비율과 비교하는 것; 시험 샘플 내 둘 이상의 유전자의 발현 산물 수준을 결정하고 임의의 적합한 대조군 내 발현 산물 수준의 차이를 결정하는 것; 및 시험 샘플 내 둘 이상의 유전자의 발현 산물 수준을 결정하고, 이들의 발현을 시험 샘플 내 하우스키핑 유전자의 발현으로 정규화하고, 임의의 적합한 대조군과 비교하는 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 발현 산물 수준의 비율 변환을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 대조군은 시험 샘플과 동일한 계통 및/또는 유형인 대조군 샘플을 포함한다. 다른 실시형태에서, 대조군은 모든 암 환자와 같은 환자 샘플의 세트 내에서 또는 이 세트에 기초한 백분위로 그룹화된 발현 산물 수준을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어, 특정 백분위수에 비해 높거나 낮은 발현 산물 수준이 결과를 예측하기 위한 기초로 사용되는 대조군 발현 산물 수준이 확립된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군 발현 산물 수준은 결과가 알려진 암 대조군 환자의 발현 산물 수준을 사용하여 확립되고, 시험 샘플의 발현 산물 수준은 결과를 예측하기 위한 기준으로서의 대조군 발현 산물 수준과 비교된다. 아래 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법은 시험 샘플 내 발현 산물 수준을 대조군에 비교할 때 특정 컷-포인트의 사용으로 제한되지 않는다.
활성화 면역 세포와 관련하여 사용된 용어 "공동자극"은 증식 또는 효과기 기능을 포함하는 제2, 비-활성화 수용체 매개 신호("공동자극 신호")를 제공하는 공동자극 폴리펩타이드의 능력을 포함한다. 예를 들어, 공동자극 신호는, 예를 들어, T 세포-수용체-매개 신호를 받은 T 세포에서의 사이토카인 분비를 유발할 수 있다. 세포-수용체 매개 신호, 예를 들어, 활성화 수용체를 통한 세포-수용체 매개 신호를 받은 면역 세포는 본 명세서에서 "활성화된 면역 세포"로 지칭된다.
용어 "공동자극 수용체"는 면역 세포에 공동자극 신호를 전달하는 수용체, 예를 들어, CD28을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저해 수용체"는 면역 세포에 음성적인 신호를 전달하는 수용체(예컨대, CTLA4, KIR3DL3 또는 PD-1)를 포함한다. 면역 세포에 공동자극 수용체(예컨대, CD28)가 존재하지 않더라도 저해 수용체에 의해 형질도입된 저해 신호가 발생할 수 있고, 이에 따라, 저해 신호는 단순히 공동자극 폴리펩타이드의 결합을 위한 저해 수용체와 공동자극 수용체 사이의 경쟁의 기능은 아니다(Fallarino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:205). 면역 세포로의 저해 신호 전달은 면역 세포 내 비반응성 또는 아네르기 또는 프로그램화 세포 사멸을 초래할 수 있다. 바람직하게는 저해 신호의 전달은 세포자멸사(apoptosis)와 연관되지 않은 메커니즘을 통해 작동한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세포자멸사"는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 특성규명될 수 있는 프로그램화 세포 사멸을 포함한다. 세포자멸사적 세포 사멸은, 예를 들어, 세포 분절화의 정점에 이르는 세포 수축, 막 수포형성 및 크로마틴 응축으로 특성규명될 수 있다. 또한 세포자멸사를 겪는 세포는 뉴클레오솜 간 DNA 절단의 특징적인 패턴을 나타낸다. 수용체에 결합하는 폴리펩타이드의 형태에 따라, 예를 들어, 하나 이상의 천연 결합 상대에 결합하기 위한 HHLA2 및/또는 KIR3DL3의 활성화 형태와의 경쟁을 통해, 신호가 (예컨대, HHLA2 및/또는 KIR3DL3 폴리펩타이드의 다가 형태에 의해) 전달되거나 신호가 (예컨대, HHLA2 및/또는 KIR3DL3의 가용성, 1가 형태에 의해) 저해될 수 있다. 하지만, 가용성 폴리펩타이드가 자극할 수 있다는 사례가 있다. 조절제의 효과는 본 명세서에 기재된 일반적인 스크리닝 분석법을 사용하여 쉽게 입증될 수 있다.
용어 "대상체를 위한 적절한 치료 요법을 결정하는 것"은 본 개시내용에 따른 분석 결과에 기초하여 또는 본질적으로 기초하여 또는 적어도 부분적으로 기초하여 대상체를 위한 치료 요법(즉, 대상체의 암을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용되는 단일 요법 또는 다른 요법과의 조합)의 시작, 변경 및/또는 종료를 결정하는 것을 의미하는 것으로 간주된다. 일례는 면역조절 요법을 제공하기 위해 암에 대한 표적 요법(예컨대, KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3과 KIR3DL3과 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용의 조절제)을 제공할지를 결정하는 것이다. 다른 실시예는 재발 위험을 줄이기 위한 목적으로 수술 이후 보조요법을 시작하는 것이고, 다른 예는 특정 화학요법의 투여량을 변경하는 것이다. 결정은, 본 개시내용에 따른 분석의 결과에 부가해서, 치료될 대상체의 개인적인 특성을 기반으로 할 수 있다. 대부분의 경우, 실제로 대상체에 적합한 치료 요법을 결정하는 것은 의사가 수행한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Fc 영역"이라는 용어는 천연-서열 Fc 영역 및 변이형 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226 위치의 아미노산 잔기에서부터, 또는 Pro230에서부터, 이의 카복시-말단까지의 범위로 정의된다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체에 사용하기 위해 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)와 결합하고 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것으로, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함하고, FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하고, 주로 이의 세포질 도메인이 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 함유한다(문헌[M. Da
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ron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에서 검토되었다. 장래에 확인될 것을 포함하는 다른 FcR은 본 명세서의 "FcR"이라는 용어에 포함된다.
분자가 기질로부터 해리되는 분자의 실질적인 단편 없이 액체(예컨대, 표준 식염수 구연산염, pH 7.4)로 헹구어질 수 있는 것과 같은 기질과 공유 또는 비-공유적으로 연관되는 경우 분자는 기질에 "고정" 또는 "고착"된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
"기능-보존적 변이체"는 단백질 또는 효소에 주어진 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 전체적인 구조 및 기능을 변경하지 않으면서 변경된 것들로, 아미노산을 유사한 특성을 갖는 것으로 대체하는 것(예컨대, 극성, 수소 결합 포텐셜, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 보존된 것으로 나타낸 것들 이외의 아미노산은 단백질에서 다를 수 있으므로, 유사한 기능의 임의의 두 단백질 사이의 단백질 또는 아미노산 서열 유사성 퍼센트는 다를 수 있고, 예를 들어, 유사성을 MEGALIGN 알고리즘을 기반으로 하는 클러스터 방법에 의한 것과 같은 정렬 방식에 따라 결정되는 것으로 70 내지 99%일 수 있다. "기능-보존적 변이체"는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정된 것으로 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 보다 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 동일성을 갖고, 비교되는 천연 또는 모계 단백질과 같거나 본질적으로 유사한 특성 또는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이종 항체"라는 용어는 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 상기 트랜스제닉 비-인간 동물로 구성되지 않는 유기체, 일반적으로 상기 트랜스제닉 비-인간 동물 이외의 종으로부터, 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 암호화 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
세포적 바이오마커 발현과 관련된 용어 "높은", "낮은", "중간의" 및 "음성적"은 하나 이상의 참조 세포에 의한 바이오마커의 세포 발현에 상대적으로 발현된 바이오마커의 양을 지칭한다. 바이오마커의 발현은 하나 이상의 바이오마커 게놈 핵산, 리보핵산 및/또는 폴리펩타이드의 세포적 수준, 활성, 구조 등의 분석을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 이 용어는 각각 가장 높은, 중간의 또는 가장 낮은 수준에서 바이오마커를 발현하는 세포 집단의 정의된 백분율을 지칭한다. 이러한 백분율은 바이오마커를 높게 발현하거나 약하게 발현하는 세포 집단의 상위 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 또는 그 이상, 또는 사이의, 포함하는, 임의의 범위로 정의될 수 있다. 바이오마커를 검출 가능하게 발현하지 않는 세포는 바이오마커 발현이 "음성"이므로, 용어 "낮은"은 이러한 세포를 제외한다. 용어 "중간"은 바이오마커를 발현하지만 "높은" 수준으로 발현하는 집단 보다 낮은 수준으로 발현하는 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 또한 이 용어는 정성적 또는 통계적 플롯 영역에 의해 확인된 바이오마커 발현의 세포 집단을 지칭, 또는 대안적으로 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유세포분석을 사용하여 분류한 세포 집단은 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 평균 형광 강도를 기반으로 하는 등의 방법과 같은 검출 가능한 모이어티 분석을 기반으로 하는 명확한 플롯을 확인하는 것에 의해 바이오마커 발현 수준을 기준으로 구별될 수 있다. 이러한 플롯 영역은 관심대상 바이오마커에 대한 당해 분야에서 잘 알려진 방법을 기초로 하는 수치, 모양, 중첩 등에 따라 다듬어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이 용어는 또한 부가적인 바이오마커 발현의 존재 또는 부재에 따라 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "상동"은 같은 핵산 가닥의 두 영역 사이 또는 다른 두 핵산 가닥의 영역들 사이의 핵산 서열 유사성을 지칭한다. 두 영역의 뉴클레오타이드 잔기 위치가 같은 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유되면, 이때 상기 영역들은 그 위치에서 상동적이다. 제1 영역과 제2 영역 각각의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 잔기 위치가 같은 잔기에 의해 점유되는 경우, 제1 영역은 제2 영역과 상동적이다. 두 영역 사이의 상동성은 같은 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유되는 두 영역의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 비율로 표현된다. 예를 들어, 5'-ATTGCC-3'의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 영역과 5'-TATGGC-3'의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 각 부분들의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 적어도 약 50%, 및 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%가 같은 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유된다. 보다 바람직하게는, 각 부분들의 모든 뉴클레오타이드 잔기 위치가 같은 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"라는 용어는 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산, 예컨대, 본 개시내용에 의해 포괄되는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. "숙주 세포"라는 용어와 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적인 영향에 의해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간화 항체"라는 용어는 인간 세포에 의해 만들어질 항체에 더 유사하게 변경된 가변 및 불변 영역을 갖는 비-인간 세포에 의해 만들어진 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에서 발견되는 아미노산을 포함하도록 비-인간 항체 아미노산 서열을 변경함으로써. 인간화 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이), 예를 들어, CDR에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간화 항체"라는 용어는 또한 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 인간화 마우스는 기능하는 인간 유전자(예컨대, HHLA2 및/또는 KIR3DL3), 세포, 조직, 및/또는 기관을 운반하는 마우스이다. 인간화 마우스는 일반적으로 인간의 치료제를 위한 생물학적 및 의학적 연구에서 작은 동물 모델로 사용된다. 누드 마우스 및 중증 합병 면역부전증(severe combined immunodeficiency: SCID) 마우스가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. NCG 마우스, NOG 마우스 및 NSG 마우스가 다른 모델들에 비해 보다 효과적으로 인간 세포 및 조직을 이식하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 인간화 마우스 모델은 건강 및 병리적 시나리오에서 인간 면역 시스템을 모델화하기 위해 사용될 수 있고, 인간 생리와 관련된 생체 내 환경에서 치료제 후보의 평가를 가능하게 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하고 CDR을 포함하는 항체-가변 도메인의 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역 세포"라는 용어는 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 지칭한다. 면역 세포는 조혈 기원이며, B 세포 및 T 세포와 같은 림프구; 자연 살해 세포; 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만세포, 호염구, 및 과립구와 같은 골수 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역 장애"라는 용어는 암, 만성 염증성 질환 및 장애(예컨대, 크론병, 염증성 장 질환, 반응성 관절염, 및 라임병 포함), 인슐린-의존성 당뇨병, 장기 특이적 자가면역(예컨대, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 자가면역 포도막염, 및 그레이브병 포함), 접촉성 피부염, 건선, 이식 거부, 이식 편대 숙주 질환, 사르코이드증, 아포티성 상태(예컨대, 알레르기성 비염 및 음식 알레르기와 같은 위장 알레르기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 천식 및 알레르기 포함), 호산구 증가증, 결막염, 사구체 신염, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 기생충성(예컨대, 리슈만편모충증 포함)과 같은 특정 병원체 민감성 및 특정 바이러스 감염(예컨대, HIV 및 결핵균 및 나종나와 같은 박테리아성 감염 포함) 및 말라리아를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 면역 질환, 상태, 및 소인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역 반응"이라는 용어는 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 예시적으로 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어, 사이토카인 생산, 및 세포 독성을 포함한다. 추가로, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 영향받는 면역 반응, 예를 들어, 항체 생산(체액 반응) 및 사이토카인 반응성 세포, 예를 들어, 대식세포의 활성화를 포함한다.
용어 "면역치료제"는 대상체의 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 생성하는 숙주 면역 시스템을 자극할 수 있는 임의의 분자, 펩타이드, 항체 또는 다른 제제를 포함할 수 있다. 다양한 면역치료제가 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용하다.
용어 "면역관문"는 항-종양 면역 반응을 하향-조절하거나 저해하는 면역 반응을 미세 조정하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 표면 상 분자군을 지칭한다. 면역관문 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRPalpha(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 부티로필린, 및 A2aR(예컨대, WO 2012/177624 참조)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이 용어는 또한 생물학적 활성 단백질 단편뿐만 아니라, 면역관문 단백질 전장 및 이의 생물학적 활성 단백질 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이 용어는 또한 본 명세서에서 제공된 상동성 설명에 따른 임의의 단편을 포함한다.
면역관문 및 이들의 서열은 당업계에서 잘 알려져 있으며 대표적인 실시형태를 아래에 설명한다. 예를 들어, 용어 "PD-1"은 공지된 리간드로서 PD-L1 및 PD-L2를 갖는 공동저해 수용체로서 기능하는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리의 구성원을 지칭한다. PD-1은 TCR-유도 활성화 T 세포 사멸 과정에서 상향조절되는 유전자를 선별하기 위한 감산 클로닝 기반 접근법을 사용하여 이전에 확인되었다. PD-1은 PD-L1에 결합하는 능력을 기준으로 하는 분자들 중 CD28/CTLA-4 패밀리의 구성원이다. CTLA-4와 같이, PD-1은 항-CD3에 반응하여 T-세포 표면 상에 빠르게 유도된다(Agata et al. 25 (1996) Int. Immunol. 8:765). 그러나, CTLA-4와 달리, PD-1은 B-세포의 표면 상에도(항-IgM에 반응하여) 유도된다. PD-1은 또한 흉선세포와 골수세포의 하위집단에서도 발현된다(Agata et al. (1996) supra; Nishimura et al. (1996) Int. Immunol. 8:773).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저해"라는 용어 및 이의 문법적으로 같은 용어는 특정 작용, 기능, 또는 상호작용을 감소, 제한, 및/또는 차단하는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 이 용어는 양에 대한 주어진 산출량 또는 파라미터(예컨대, 배경 염색, KIR3DL3 신호전달, KIR3DL3 면역저해 기능 등)의 수준을 상응하는 대조군의 양보다 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이하로 감소시키는 것을 의미한다. 주어진 산출량 또는 파라미터의 감소된 수준은 이 산출량 또는 파라미터의 완전한 부재를 의미할 수 있지만, 이것이 반드시 필요한 것은 아니다. 본 발명은 이 산출량 또는 파라미터를 완전히 제거하는 방법을 요하지 않으며, 이들로 제한되지 않는다. 주어진 산출량 또는 파라미터는 본 명세서 및 실시예에서 논의된 바와 같은, 면역조직화학적, 분자 생물학적, 세포 생물학적, 임상적, 및 생화학적 분석을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 반대 용어 "촉진", "증가", 및 이의 문법적으로 같은 용어는 저해 또는 감소에 대해 설명한 것과 반대로 주어진 산출량 또는 파라미터의 수준을 증가시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상호작용"은, 두 분자 간의 상호작용을 지칭할 때, 분자와 다른 하나의 물리적인 접촉(예컨대, 결합)(예컨대, HHLA2와 TMIGD2의 결합 또는 HHLA2와 KIR3DL3의 결합)을 의미한다. 일반적으로, 이러한 상호작용은 상기 분자들 중 하나 또는 둘 모두의 활성(생물학적 효과를 생산하는)을 초래한다. 이 활성은 이 분자들 중 하나 또는 둘 모두의 직접적인 활성일 수 있다(예컨대, 신호 전달). 대안적으로, 이 상호작용에서 하나 또는 두 분자는 이의 리간드 결합이 차단될 수 있고, 그러므로 리간드 결합 활성에 관하여 불활성으로 유지될 수 있다(예컨대, 이의 리간드에 결합하고 면역 반응을 유발 또는 저해함). 이러한 상호작용을 저해하는 것은 이 상호작용에 적용된 하나 이상의 분자들의 활성 방해를 초래한다. 이러한 상호작용을 강화하는 것은 상기 물리적인 접촉의 가능성을 연장 또는 증가시키는 것이고, 상기 활성의 가능성을 연장 또는 증가시키는 것이다.
용어 "신보조요법"(neoadjuvant therapy)은 주요 치료 전에 주어지는 치료를 지칭한다. 신보조요법의 예는 화학요법, 방사능요법, 및 호르몬요법을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 항체"는 다른 항원 특이성을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예컨대, KIR3DL3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 KIR3DL3에 결합하지 않는 항체들이 실질적으로 없다). 그러나, KIR3DL3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 서로 다른 종들로부터의 다른 KIR 패밀리 단백질에 대해 각각 교차 반응성을 가질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 항체는 적어도 두 종, 예를 들어, 인간과 다른 동물, 예를 들어, 쥣과 동물, 또는 다른 포유동물 또는 비-포유동물 종에 대한 특이적 결합 친화성을 유지한다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 항체는 인간 KIR3DL3에 대해 더 높거나 실제의 특이적 친화력 및 선택성을 유지한다. 또한, 단리된 항체는 일반적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 일 실시형태에서, 인간 KIR3DL3에 대한 서로 다른 특이성을 갖는 "단리된" 단클론성 항체들의 조합은 잘-정의된 조성물로 조합된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단리된 단백질"은 세포로부터 단리되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산되었을 때, 다른 단백질, 세포 물질, 분리 배지, 및 배양 배지가 실질적으로 없는 단백질, 또는 화학적으로 합성되었을 때, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 단백질을 지칭한다. "단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 세포 물질 또는 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질이 유리되는 세포 또는 조직 공급원 유래의 다른 오염 단백질이 없거나, 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. "세포 물질이 실질적으로 없다"는 용어는 단리된 또는 재조합으로 생산된 세포의 성분으로부터 분리된 단백질로 표적 폴리펩타이드(예컨대, 면역글로불린) 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "세포 물질이 실질적으로 없다"는 비-표적 단백질(본 명세서에서는 "오염 단백질"이라고도 지칭함)을 약 30%(건조 중량) 미만으로 갖는, 보다 바람직하게는 비-표적 단백질을 약 20% 미만으로 갖는, 보다 바람직하게는 비-표적 단백질을 약 10% 미만으로 갖는, 가장 바람직하게는 비-표적 단백질을 약 5% 미만으로 갖는, 표적 단백질 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 이의 생물학적 활성 단편이 재조합으로 생산될 때, 바람직하게는 배양 배지 또한 실질적으로 없고, 즉, 배양 배지는 단백질 조제용 물질의 부피의 약 20% 미만이고, 보다 바람직하게는 약 10% 미만인고, 가장 바람직하게는 약 5% 미만이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류(예컨대, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 개시된 발명의 항체의 결합 친화성은 표준 항체-항원 분석법, 예를 들어, 경쟁 분석법, 포화 분석법, 또는 ELISA 또는 RIA와 같은 표준 면역분석법으로 측정 또는 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커의 발현을 특이적으로 검출하거나 조절하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제품(예컨대, 패키지 또는 용기)이다. 키트는 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법을 수행하기 위해 구성 단위로 홍보, 배포 또는 판매될 수 있다.
"마커" 또는 "바이오마커"는 정상 또는 건강한 조직 또는 세포의 발현 수준으로부터 변화된 발현 수준이 질환 상태, 예컨대, 암과 연관되는 유전자 또는 단백질이다. "마커 핵산"은 본 개시내용에 의해 포괄되는의 마커에 의해 암호화되거나 이에 상응하는 핵산(예컨대, mRNA, cDNA)이다. 이러한 마커 핵산은 서열목록에 기재된 임의의 핵산 서열의 전체 또는 부분 서열 또는 이 서열의 상보물을 포함하는 DNA(예컨대, cDNA)를 포함한다. 마커 핵산은 또한 서열목록에 기재된 임의의 핵산 서열의 전체 또는 부분 서열 또는 이 서열의 상보물을 포함하는, 여기서 모든 티미딘 잔기는 우리딘 잔기로 치환된, RNA를 포함한다. "마커 단백질"은 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 의해 암호화되거나 이에 상응하는 단백질이다. 마커 단백질은 서열목록에 기재된 임의의 서열의 전체 또는 부분 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 전체 KIR3DL3 또는HHLA2가 마커로 사용된다. 다른 실시형태에서, KIR3DL3 또는HHLA2의 단편이 마커로 사용된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절하다"는 상향-조절 및 하향-조절, 예를 들어, 반응을 높이는 것 또는 저해하는 것을 포함한다.
용어 "미리-결정된" 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)는, 단지 예로, 특정 치료를 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가하기 위해, KIR3DL3 경로의 하나 이상의 조절제, 예를 들어, KIR3DL3와 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대의 조절제 치료제 단독 또는 하나 이상의 면역치료와의 조합에 대한 반응을 평가하기 위해, 및/또는 질환 상태를 평가하기 위해 사용되는 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)일 수 있다. 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)는 암을 갖는 또는 갖지 않는 환자의 집단에서 결정될 수 있다. 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)는, 모든 환자에 동등하게 적용가능한, 단수일 수 있거나, 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)는 환자의 특정 하위 집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 키, 및 다른 요인들은 개인의 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성은 각 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정 및/또는 비교되는 양은 절대 측정치를 기반으로 한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정된 및/또는 비교된 양은 상대적인 측정, 예를 들어, 비율(예컨대, 세포 비율 또는 하우스키핑 또는 다른 일반적으로 일정한 바이오마커의 발현에 대해 정규화한 혈청 바이오마커)을 기반으로 한다. 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)는 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)는 환자 선택이 평가되는 같거나 다른 인간으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)는 같은 환자의 이전 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식에서, 환자 선택의 경과를 시간에 걸쳐 모니터할 수 있다. 추가로, 대상체가 인간인 경우, 대조군은 다른 사람 또는 여러 사람, 예를 들어, 선택된 인간 군의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식에서, 선택이 평가되는 인간의 선택 정도는 적합한 다른 인간, 예를 들어, 관심 인간과 유사한 입장에 처한 다른 인간, 예를 들어, 유사하거나 같은 병태(들)를 겪는 사람들 및/또는 같은 인종군과 비교될 수 있다.
용어 "예측"은 KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3와 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용의 조절제 단독 또는 하나 이상의 추가의 요법, 예컨대, 면역요법, 예를 들어, 면역관문 저해 요법과의 조합)과 같은 면역조절 요법에 대한 암의 반응 가능성을 결정하기 위한, 바이오마커 핵산 및/또는 단백질 상태, 예를 들어, 요법 이전, 동안 또는 이후 종양의 과다- 또는 하-활성, 발생, 발현, 성장, 경감, 재발 또는 저항의 사용을 포함한다. 이러한 바이오마커의 예측적인 사용은, 예를 들어, (1) (예컨대, FISH, FISH + SKY, 단일-분자 시퀀싱, 예를 들어, 당업계에서 적어도 문헌[J. Biotechnol., 86:289-301]에 기재된 바와 같은 단일-분자 시퀀싱, 또는 qPCR에 의한) 증가 또는 감소된 카피 수, (예컨대, ISH, 노던 블럿, 또는 qPCR에 의한) 바이오마커 핵산의 과발현 또는 부족 발현, (예컨대, IHC에 의한) 증가 또는 감소된 바이오마커 단백질 및/또는 바이오마커 표적, 또는 분석된 인간 암 유형 또는 암 샘플의 증가 또는 감소된, 예를 들어, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상 증가 또는 감소된 활성; (2) 암을 앓는 대상, 예를 들어, 인간로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 구강 스크레이프, 타액, 뇌척수액, 소변, 대변, 또는 골수 샘플 내 이의 완전히 또는 상대적으로 조절된 존재 또는 부재; (3) 암(예컨대, 특정 면역조절 요법(예컨대, KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3과 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용의 조절제 단독 또는 면역요법과의 조합))에 반응하는 것 또는 이들에 저항을 일으키는 것)을 갖는 환자의 임상 하위 집단에서 이의 완전히 또는 상대적으로 조절된 존재 또는 부재에 의해 확인될 수 있다.
용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 및 유사 용어는 질환, 장애 또는 상태를 갖지는 않지만 이의 발생 위험이 있거나 이의 발생을 허용하는 대상체의 질환, 장애 또는 상태의 발생 가능성을 감소시키는 것을 의미한다.
용어 "예후"는 암의 가능한 진행 및 결과 또는 질환으로부터의 회복 가능성의 예측을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 통계학적 알고리즘의 사용은 개인의 암 예후를 제공한다. 예를 들어, 예후는 수술, 암의 임상적 하위유형의 발생(예컨대, 폐암, 흑색종, 및 신장세포 암종과 같은 고형 종양), 하나 이상의 임상적 요인의 발생, 장암의 발생, 또는 질환으로부터의 회복일 수 있다.
참조 폴리펩타이드에 관하여 사용될 때, 용어 "폴리펩타이드 단편" 또는 "단편"은 참조 폴리펩타이드 자체와 비교하여 아미노산 잔기가 결실된 폴리펩타이드를 지칭하지만, 여기서 잔여 아미노산 서열은 일반적으로 참조 폴리펩타이드의 상응하는 위치와 동일하다. 이러한 결실은 참조 폴리펩타이드의 아미노-말단에, 내부적으로, 또는 카복시-말단에, 또는 대안적으로 모두에 발생할 수 있다. 단편은 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산 길이, 적어도 14개의 아미노산 길이, 적어도 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산 길이, 적어도 75개의 아미노산 길이, 또는 적어도 100, 150, 200, 300, 500개 또는 그 이상의 아미노산 길이이다. 이들은, 예를 들어, 전장 폴리펩타이드의 길이 보다 짧은 길이인 한도 내에서 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980, 1000, 1020, 1040, 1060, 1080, 1100, 1120, 1140, 1160, 1180, 1200, 1220, 1240, 1260, 1280, 1300, 1320, 1340 또는 더 길고 및/또는 이 길이를 포함하는 것일 수 있다. 대안적으로, 이들은 전장 폴리펩타이드의 길이 보다 짧은 한도 내에서 상기 범위 보다 길지 않거나 및/또는 상기 범위가 제외된 것일 수 있다.
용어 "프로브"는 특이적으로 의도된 표적 분자, 예를 들어, 뉴클레오타이드 전사체 또는 마커에 의해 암호화되거나 마커에 상응하는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나, 또는 적절한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 표적 분자 검출 목적을 위해, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같이 표지되도록 특이적으로 설계될 수 있다. 프로브로 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재배열"은 V 세그먼트가 본질적으로 각각 완전한 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 형태에서 D-J 또는 J 세그먼트에 바로 인접하게 위치하는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위(locus)의 배치를 지칭한다. 재배열된 면역글로불린 유전자 좌위는 생식세포계열 DNA와 비교를 통해 확인할 수 있다; 재배열된 좌위는 적어도 하나의 재조합 헵타머/노나머 상동 요소를 가질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것을 의미한다. 상기 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 특정 변형이 다음의 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 상기 자손은, 실제로는, 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
용어 "저항"(혹은 내성)(resistance)은 면역조절 요법에 대한 암 샘플 또는 포유동물의 후천적 또는 자연적 저항(즉, 치료에 대해 비응답성으로 되거나 감소된 또는 제한된 반응을 갖는 것), 예를 들어, 치료에 대해 5% 이상, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 그 이상 감소된 반응을 갖는 것을 의미한다. 반응 감소는 저항성이 획득되기 전 같은 암 샘플 또는 포유동물과의 비교, 또는 치료에 대해 저항이 없는 것으로 알려진 다른 암 샘플 또는 포유동물과의 비교를 통해 측정할 수 있다. 화학요법에 대한 전형적인 후천성 저항은 "다제 내성"이라고 부른다. 다제 내성은 P-당단백질 또는 다른 메커니즘에 의해 매개될 수 있고, 또는 포유동물이 다제-내성 미생물 또는 미생물들의 조합에 감염되었을 때 발생할 수 있다. 치료에 대한 저항을 결정하는 것은 당업계에서 일상적이며, 예를 들어, 본 명세서에서 "감작"으로 기재된 바와 같이 세포 증식 분석 및 세포 사멸 분석을 통해 측정할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 용어 "역저항성"(reverses resistance)은 주요 암 요법(예컨대, 화학요법 또는 방사선 요법) 단독으로는 비처리 종양의 부피와 비교하여 통계적으로 유의적인 종양 부피 감소를 나타내지 못하는 상황에서 주요 암 요법(예컨대, 화학요법 또는 방사선 요법)과 조합하여 제2 제제를 사용하는 것이 비처리 종양의 부피와 비교할 때 통계적으로 유의한 수준(예컨대, p<0.05)으로 종양의 부피를 유의적으로 감소시킬 수 있는 것을 의미한다. 이것은 일반적으로 비처리 종양이 대수 성장할 때 종양 부피 측정에 적용된다.
위에서 기재된 바와 같이, 용어 "반응"은 일반적으로, 예를 들어, 임상적인 개입의 진행 상의 효과, 효능 또는 결과를 결정하는 것과 관련된다. 예를 들어, 요법에 대한 반응(예컨대, KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3과 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용의 조절제 단독 또는 면역요법, 예를 들어, 면역관문 저해 요법과의 조합))은 요법(예컨대, KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3과 KIR3DL3과 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용의 조절제 단독 또는 면역요법, 예를 들어, 면역관문 저해 요법과의 조합))에 대한 임의의 반응, 및 암의 경우, 바람직하게는 신보조제 또는 보조제 화학요법의 개시 이후 암 세포 수, 종양 질량, 및/또는 부피의 변화에 관한 것이다. 과증식성 장애 반응은, 예를 들어, 효능을 위해 또는 신보조제 또는 보조제 상황에서 평가할 수 있으며, 여기서 전신성 간섭 이후 종양의 크기는 CT, PET, 유방촬영, 초음파 또는 촉진(palpation)으로 측정하여 초기 크기 및 용적에 비교할 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 수술적 절제 이후 종양의 캘리퍼 측정 또는 병리학적 검사로 평가할 수 있다. 반응은 종양 부피의 백분율 변화와 같은 정량적인 방식 또는 "병리학적 완전 반응"(pCR), "임상적 완전 완화"(cCR), "임상적 부분 완화"(cPR), "임상적 안정적 질환"(cSD), "임상적 진행성 질환"(cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적인 방식으로 기록될 수 있다. 과증식성 장애 반응의 평가는 신보조제 또는 보조제 요법의 시작 이후 초기에, 예를 들어, 몇 시간, 며칠, 몇 주 이후 또는 바람직하게는 몇 달 이후에 수행할 수 있다. 반응 평가의 전형적인 종말점은 신보조제 화학요법의 종료 또는 잔여 종양 세포 및/또는 종양 상(tumor bed)의 수술적인 제거 시기이다. 이는 전형적으로 신보조제 요법의 개시 이후 3개월이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료법의 임상적 효능은 임상적 이익률(CBR)을 측정하여 결정할 수 있다. 임상적 이익률은 요법의 종료점에서부터 적어도 6개월 경과한 시점에서 완전 완화(CR)에 속하는 환자의 백분율, 부분 완화(PR)에 속하는 환자의 수 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수의 합을 결정하여 측정할 수 있다. 이 공식은 6개월에 걸쳐서 CBR=CR+PR+SD이다. 몇몇 실시형태에서, 특정 암 치료 요법에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 그 이상이다. 암 요법에 대한 반응을 평가하기 위한 추가 기준은 다음 모두를 포함하는 "생존"에 관련이 있다: 사망까지의 생존, 전체 생존으로도 알려짐(여기서 상기 사망은 원인과 무관하거나 종양과 관련된 것일 수 있음); "재발없는 생존"(여기서 용어 재발은 국소 및 원발성 재발 모두 포함됨); 무전이 생존; 무질환 생존(여기서 용어 질환은 암 및 이와 연관된 질환을 포함함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작점(예컨대, 진단 또는 치료 시작 시간) 및 종료점(예컨대, 죽음, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산할 수 있다. 추가로, 치료 효능을 위한 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 시기 내의 전이 확률 및 종양 재발 확률을 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 적절한 역치(역치)를 결정하기 위해, 특정 암 치료 요법이 대상 집단에 실시될 수 있고 결과는 임의의 면역조절 요법의 실시 전에 결정된 바이오마커 측정치와 상호관련된 것일 수 있다. 결과 측정치는 신보조제 설정에서 주어진 요법에 대한 병리학적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전체 생존 및 무질환 생존과 같은 결과 정도는 바이오마커 측정 값이 알려진 면역조절 요법을 따르는 대상체에 대한 시간 동안 모니터링될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 투여량은 암 치료제에 대해 당업계에 알려진 표준 투여량이다. 대상체를 모니터하는 시간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개월 동안 모니터링될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 미리 결정된 항원에 결합하는 항체와 관련된다. 전형적으로, 항체는, 피분석물로서 인간 KIR3DL3을 사용하고 리간드로서 항체를 사용하여 BIACORE® 검정 디바이스에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 결정하였을 때 약 10-7M 미만, 예컨대, 약 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 미만 또는 심지어 더 낮은 친화도(KD)로 결합하며, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 다른 비-특이적 항원(예컨대, BSA, 카세인)에 대한 결합 친화도 보다 적어도 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2.0-, 2.5-, 3.0-, 3.5-, 4.0-, 4.5-, 5.0-, 6.0-, 7.0-, 8.0-, 9.0- 또는 10.0-배 또는 그 이상의 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 임의의 건강한 동물, 포유동물 또는 인간, 또는 관심 병태(예컨대, 암)를 앓는 임의의 동물, 포유동물 또는 인간을 지칭한다. 용어 "대상체"는 "환자"와 호환 가능하다. 몇몇 실시형태에서, 이 용어는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체를 포함하도록 의도된다. 대상체의 대표적인 비제한적인 예는 인간, 개, 고양이 마우스, 래트 및 이들의 트랜스제닉(transgenic) 종을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "생존"은 다음 모두를 포함한다: 사망까지의 생존, 전체 생존으로도 알려짐(여기서 상기 사망은 원인과 무관하거나 종양과 관련된 것일 수 있음); "재발-없는 생존"(여기서 용어 재발은 국소 및 원발성 재발을 모두 포함함); 무전이 생존; 무질환 생존(여기서 용어 질환은 암 및 이와 연관된 질환을 포함함). 상기 생존의 기간은 정의된 출발점(예컨대, 진단 시점 또는 치료 시작) 및 종결점(예컨대, 죽음, 재발 또는 전이)을 참조로 계산될 수 있다. 추가로, 치료 효능을 위한 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 시기 내의 전이 확률 및 종양 재발 확률을 포함하도록 확장될 수 있다.
용어 "내성"(tolerance) 또는 "무반응성"은 자극, 예를 들어, 활성화 수용체 또는 사이토카인을 통한 자극에 대한 면역 세포와 같은 세포의 굴절성을 포함한다. 무반응성은, 예를 들어, 면역억제제에의 노출 또는 높은 투여량의 항원에의 노출 때문에 발생할 수 있다. 몇몇 독립적인 방법이 내성을 유도할 수 있다. 하나의 메커니즘은 "아네르기"로 지칭되며, 효과기 기능을 갖는 세포로 분화되지 않고 무반응성 세포로 생체 내에 지속되는 상태로 정의된다. 이러한 굴절성은 일반적으로 항원-특이적이고 내성 항원 노출이 중단된 이후에도 지속된다. 예를 들어, T 세포의 아네르기는 사이토카인 생산, 예를 들어, IL-2가 부족한 특징이 있다. T 세포 아네르기는 T 세포가 항원에 노출되고 두 번째 신호(공동자극 신호)가 없는 상태에서 첫 번째 신호(T 세포 수용체 또는 CD-3 매개 신호)를 받을 때 발생한다. 이러한 조건 하에서, 세포가 같은 항원에 재노출되면(공동자극성 폴리펩타이드의 존재 내에서 재노출이 발생하더라도) 사이토카인 생산을 실패하게 되고, 이에 따라, 증식을 실패하게 된다. 하지만, 아네르기성 T 세포는 사이토카인(예컨대, IL-2)과 함께 배양되면 증식할 수 있다. 예를 들어, T 세포 아네르기는 ELISA 또는 지표 세포주를 사용한 증식 분석으로 측정되는 T 림프구에 의한 IL-2 생산 부족을 통해 관찰될 수도 있다. 대안적으로, 리포터 유전자 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 아네르기성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서(enhancer)의 제어 하에서 이종기원의 프로모터에 의해 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 멀티머(multimer)에 의해 유도되는 IL-2 유전자 전사를 개시하지 못한다(Kang et al. (1992) Science 257:1134). 또 다른 메커니즘은 "탈진"(exhaustion)으로 지칭된다. T 세포 탈진은 많은 만성적 감염 및 암의 과정에서 발생하는 T 세포의 기능장애 상태이다. 이는 빈약한 효과기 기능, 저해 수용체들의 지속적인 발현 및 기능성 효과기 또는 메모리 T 세포의 것과는 다른 전사 상태로 정의된다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사체"는 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커의 전사 및 임의의 경우 RNA 전사체의 일반적인 전사-후 과정(예컨대, 스플라이싱), 및 RNA 전사체의 역전사에 의해 만들어진 완성형 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이거나 이에 상동적인 폴리뉴클레오타이드(예컨대, mRNA, hnRNA, cDNA, 또는 RNA 또는 cDNA의 아날로그)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "T 세포"는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 또한 용어 T 세포는 T 헬퍼 1형 T 세포 및 T 헬퍼 2형 T 세포를 모두 포함한다. 용어 "항원 제시 세포"는 전문적인 항원 제시 세포(예컨대, B 림프구, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포)뿐만 아니라 다른 항원 제시 세포(예컨대, 케라티노사이트, 내피 세포, 별아교세포, 섬유아세포, 올리고덴드로사이트)를 포함한다. Tconv 또는 Teff로도 알려진 전통적인 T 세포는 하나 이상의 T 세포 수용체 발현 능력으로 인해 면역 반응을 증가시키는 효과기 기능(예컨대, 사이토카인 분비, 세포독성, 항-자가-인식 등)을 갖는다. Tconv 또는 Teff는 일반적으로 Treg가 아니고 예를 들어, 미경험 T 세포, 활성화 T 세포, 기억 T 세포, 휴지 Tcon, 또는 Th1 또는 Th2 혈통으로 분화된 Tcon을 포함하는 임의의 T 세포 집단으로 정의된다. 몇몇 실시형태에서, Teff는 비-Treg T 세포의 하위집단이다. 몇몇 실시형태에서, Teff는 CD4+ 헬퍼 T 림프구(예컨대, Th0, Th1, Tfh 또는 Th17) 및 CD8+ 세포독성 T 림프구와 같은 CD4+ Teff 또는 CD8+ Teff이다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 세포독성 T 세포는 CD8+ T 림프구이다. "미경험 Tcon"은 골수에서 분화되고 흉선에서 양성 및 음성 중앙 선별 과정을 성공적으로 겪었지만, 아직 항원 노출에 의해 활성화되지 않은 CD4+ T 세포이다. 미경험 Tcon은 일반적으로 L-셀렉틴(CD62L)의 표면 발현, CD25, CD44 또는 CD69와 같은 활성 마커의 부재 및 CD45RO와 같은 기억 마커의 부재로 특징지워진다. 따라서 미경험 Tcon은 정지되고 분할하지 않고, 항상성 생존을 위해 인터루킨-7(IL-7) 및 인터루킨-15(IL-15)를 필요로 하는 것으로 여겨진다(적어도 WO 2010/101870 참조). 이러한 세포의 존재 및 활성은 면역 반응을 억제하는 맥락에서 바람직하지 않다. Treg와 달리, Tcon은 아네르기성이 아니고 항원-기반 T 세포 수용체 활성화에 반응하여 증식할 수 있다(Lechler et al. (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637). 종양에서, 소모된 세포는 아네르기의 특징을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, V 세그먼트와 관련된 용어 "재배열되지 않은" 또는 "생식세포계열 배열"은 V 세그먼트가 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 배치를 지칭한다.
II. 단클론성 항체, 면역글로불린 및 폴리펩타이드
본 개시내용은 부분적으로는 KIR3DL3에 대한 단리된 단클론성 항체 또는 이의 단편(예컨대, 본 명세서에 열거된 단클론성 항체 및 다클론성 항체)에 관한 것이다. 이러한 분자는 부분적으로 면역조직화학법(IHC), 웨스턴 블롯, 세포간 흐름, ELISA 등과 같은 진단적 분석에서 KIR3DL3 단백질을 인식하는 능력을 나타내는 것으로 특징짓는다. 이러한 분자는 부분적으로 HHLA2와 같은 결합 상대에 결합하는 KIR3DL3을 저해하는 능력을 나타내는 것으로 특징짓는다.
인간 내인성 레트로바이러스-H 긴 말단 반복-관련 단백질 2, HERV-H LTR-관련 2, B7y, B7H7, B7-H5, B7-H7로도 알려진 용어 "HHLA2"는 B7 패밀리의 구성원을 지칭한다. HHLA2 단백질은 정상 인간 조직에서는 발현이 제한적이지만 암에서는 폭넓게 발현된다. HHLA2 단백질은 세 개의 Ig-유사 도메인(IgV-IgC-IgV)을 갖는 단백질 구성원인 반면, B7 패밀리의 다른 구성원은 일반적으로 두 개의 Ig 도메인(IgV-IgC) 만을 갖는다. 정상 인간 조직에서 HHLA2 단백질은 신장, 내장, 담낭 및 유방의 상피와 태반 영양막 세포에 발현된다. 면역 시스템에서, HHLA2 단백질은 인간 단핵구/대식세포에 구성적으로 발현된다. HHLA2가 T-세포 증식 및 사이토카인 생산을 저해하고 T-세포 생산 및 사이토카인 생산을 증가시키는 것을 비롯하여, HHLA2는 인간 T-세포 기능을 조절한다. HHLA2는 대장, 신장, 폐, 췌장, 난소 및 전립선의 넓은 범위의 인간 암에서 높은 수준으로 발현된다. 또한 HHLA2는 갑상선, 흑색종, 간, 방광, 결장, 신장, 유방 및 식도의 인간 암에서 발현된다.
소정의 HHLA2 구조 및 기능은 위에서 기재된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Xiao et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201-2203, Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2359-2366, Mager et al. (1999) Genomics 21:2359-2366, Flajnik et al. (2012) Immunogenet. 64:571-590, Zhao et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110:9879-9884 및 Zhu et al. (2013) Nat. Commun. 4:2043] 참조).
용어 "HHLA2"는 이의 단편, 변이체(예컨대, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 HHLA2 cDNA 및 인간 HHLA2 단백질 서열이 당해 분야에 잘 알려져 있고 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에서 공개적으로 입수할 수 있다. 인간 HHLA2 변이체는 변이체 1(NM_007072.3 및 NP_009003.1, 가장 긴 전사체를 나타내고 가장 긴 동형체 a를 암호화함), 변이체 2(NM_001282556.1 및 NP_001269485.1, 대체 프로모터의 사용을 나타내며 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 차이가 있음), 변이체 3(NM_001282557.1 및 NP_001269486.1, 대체 프로모터의 사용을 나타내며 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 차이가 있음), 변이체 4(NM_001282558.1 및 NP_001269487.1, 동형체 b를 암호화하고, 대체 프로모터의 사용을 나타내며, 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 차이가 있고 3' 코딩 영역 내 대체 인-프레임 엑손이 결손되어, 동형체 a보다 짧은 동형체를 생성함), 및 변이체 5(NM_001282559.1 및 NP_001269488.1, 동형체 c를 암호화하고, 대체 프로모터의 사용을 나타내며, 변이체 2와 비교하여 여러 차이를 가져, 5' UTR이 독특하고 변이체 1과 비교하여 대체 시작 코돈에서 번역이 개시되고, 독특한 N-말단 및 동형체 a보다 짧은 동형체를 생성함)를 포함한다. 인간 이외의 생물체에서 HHLA2 오솔로그(ortholog)의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며 예를 들어, 개구리 HHLA2(NM_001128644.1 및 NP_001122116.1)를 포함한다. HHLA2 오솔로그의 대표적인 서열은 다음 표 1과 같다.
HHLA2 단백질 검출에 적합한 항-HHLA2 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어, Cat #: ab107119 및 ab214327(abcam), 항체 PA5-24146 및 PA5-6313(ThermoFisher Scientific), 항체 MAB80841, AF8084, FAB80841R, FAB80841T 및 MAB8084(R&D systems), 항체 AP52042PU-N(Origene), 항체 NBP2-49187, MAB80842, H00011148-B01P 및 NBP2-32420(Novus Biologicals), 항체 GTX51981(GeneTex), 항체 HPA055478(Atlas Antibodies), 항체 LS-C321945, LS-C308228, LS-C246742, LS-C246743, LS-C246744, LS-C236210 및 LS-C249186(LifeSpan Biosiences) 등을 포함한다. 또한, HHLA2의 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 Origene Technologies의 shRNA 제품 번호 TL312462, TF312462, TR312462, TG312462 및 TL312462V, siRNA 제품 번호 SR323358, abm의 SiRNA 제품 번호 i009616, i009616a, i009616b, i009616c, i009616d, iV009616, iV009616a, iV009616b, iV009616c, iV009616d, iAAV00961600, iAAV00961601, iAAV00961602, iAAV00961603, iAAV00961604, iAAV00961605, iAAV00961606, iAAV00961607, iAAV00961608 및 iAAV00961609, CRISPR 제품 번호 K0950321, K0950301, K0950302, K0950303, K0950304, K0950305, K0950306, K0950307, K0950308 및 K0950311, Santa Cruz Biotechnology의 siRNA 제품 번호 sc-78498, shRNA 제품 번호 sc-78498-V 및 sc-78498-SH, CRISPR 제품 번호 sc-411576, sc-411576-HDR, sc-411576-NIC 및 c-411576-NIC-2 등과 같이 상기 참조된 회사의 상품 리스트에서 찾을 수 있다. 이 용어는 또한 HHLA2 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하는 것으로 사용될 수 있음을 유의해야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 백분율 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 개시내용에 의해 포괄되는 HHLA2 분자를 설명하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "HHLA2 경로"는 HHLA2 및 TMIGD2 및 KIR3DL3와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대와 HHLA2의 상호작용을 포함한다.
용어 "KIR3DL3 경로"는 KIR3DL3 및 HHLA2와 같은 이의 천연 결합 상대 중 하나 이상과의 KIR3DL3의 상호작용을 포함한다.
용어 "TMIGD2"는 CD28, CTLA-4, ICOS 및 PD-1과 약 10%의 아미노산 동일성을 갖는 막 단백질이고, 막관통 및 면역글로불린 도메인 함유 2(transmembrane and immunoglobulin domain containing 2), CD28H, IGPR1 및 IGPR-1을 지칭한다. TMIGD2는 하나의 세포외 IgV-유사 도메인, 막관통 영역 및 두 개의 티로신 신호전달 모티프를 갖는 프롤린-풍부 세포질 도메인을 갖는다. TMIGD2 단백질은 모든 미경험 T 세포 및 대부분의 자연 살해(NK) 세포 상에 구성적으로 발현되지만, 조절 T 세포 또는 B 세포 상에는 발현되지 않는다. TMIGD2 발현은 T 세포의 반복적인 자극으로 서서히 손실된다. 이와 일치하여, TMIGD2는 기억 T 세포의 약 절반에서만 발현되고, TMIGD2-음성 T 세포는 말단 분화, 노화 표현형을 갖는다. 또한 TMIGD2는 내피 및 상피 세포에서 발현되고 세포 이동을 감소시키고 혈관신생 과정에서 모세관 형성을 촉진하는 기능을 하는 것으로 나타났다.
소정의 TMIGD2 구조 및 기능은 위에서 기재된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Xiao et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201-2203, Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2359-2366, Zhu et al. (2013) Nat. Commun. 4:2043 및 Rahimi (2012) Cell 23:1646-1656] 참조).
용어 "TMIGD2"는 이의 단편, 변이체(예컨대, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 TMIGD2 cDNA 및 인간 TMIGD2 단백질 서열은 당해 분야에 잘 알려져 있고 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에서 공개적으로 입수할 수 있다. 인간 TMIGD2 동형체는 동형체 1(NM_144615.2 및 NP_653216.2), 동형체 2(NM_001169126.1 및 NP_001162597.1; 동형체 1과 비교하여 3' 코딩 영역의 대체 인-프레임 스플라이스 사이트를 사용하여, 동형체 1과 비교하여 짧은 동형체를 생성함) 및 동형체 3(NM_001308232.1 및 NP_001295161.1, 동형체 1과 비교하여 5' 코딩 영역에 대체 인-프레임 엑손이 결손되어, 동형체 1과 비교하여 짧은 동형체를 생성함)를 포함한다. 인간 이외 다른 생물의 TMIGD2 오솔로그 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 침팬지 TMIGD2(XM_009434393.2 및 XP_009432668.2, 및 XM_001138228.4 및 XP_001138228.3) 및 소 TMIGD2(XM_005208980.3 및 XP_005209037.1, XM_005208979.3 및 XP_005209036.1, 및 XM_002688933.5 및 XP_002688979.1)를 포함한다. TMIGD2 오솔로그의 대표적인 서열을 아래 표 1에 나타내었다.
TMIGD2 단백질 검출에 적합한 항-TMIGD2 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항체 Cat # MAB8316, MAB83162, FAB8316R, FAB83162R, FAB83162G, FAB83162N, FAB83162S, FAB83162T, FAB83162U 및 FAB83162V(R&D systems), 항체 TA326695(Origene), 항체 PA5-52787 및 PA5-38055(ThermoFisher Scientific), 항체 MAB83161 및 NBP1-81164(Novus Biologicals) 등을 포함한다. 또한, TMIGD2의 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 Origene Technologies의 shRNA 제품 번호 TF317829, TG317829, TL317829, TR317829 및 TL317829V, siRNA 제품 번호 SR314913 및 CRISPR 제품 번호 KN204938, KN204938LP, KN204938RB 및 KN204938BN, Abm의 siRNA 제품 번호 i024914, i024914a, i024914b, i024914c, i024914d, iV024914, iV024914a, iV024914b, iV024914c, iV024914d, iAAV02491400, iAAV02491401, iAAV02491402, iAAV02491403, iAAV02491404, iAAV02491405, iAAV02491406, iAfAV02491407, iAAV02491408 및 iAAV02491409 및 CRISPR 제품 번호 K2409321, K2409301, K2409302, K2409303, K2409304, K2409305, K2409306, K2409307, K2409308 및 K2409311, Santa Cruz Biotechnology의 siRNA 제품 번호 sc-97757, shRNA 제품 번호 sc-97757-SH 및 sc-97757-V 및 CRISPR 제품 번호 sc-414261, sc-414261-HDR, sc-414261-NIC 및 sc-414261-NIC-2, Vigene Biosciences의 shRNA 제품 번호 SH888208 및 SH874720 등과 같이 상기 참조된 회사의 상품 리스트에서 찾을 수 있다. 또한, TMIGD2의 발현을 증가시키기 위한 여러 CRISPR 작제물은 Abm의 CRISPR 제품 번호 K2409378, K2409377, K2409376, K2409375, K2409374, K2409373, K2409372 및 K2409371, Santa Cruz Biotechnology의 CRISPR 제품 번호 sc-414261-ACT, sc-414261-ACT-2, sc-414261-LAC 및 sc-414261-LAC-2 등과 같이 상기 참조된 회사의 상품 리스트에서 찾을 수 있다. 이 용어는 또한 TMIGD2 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하는 것으로 사용될 수 있음을 유의해야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 백분율 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 개시내용에 의해 포괄되는 TMIGD2 분자를 설명하기 위해 사용될 수 있다.
TMIGD2와 HHLA2 사이의 상호작용뿐만 아니라 이들의 기능은 위에서 기재된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, Xiao et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2201-2203 및 Janakiram et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21:2359-2366 참조).
용어 "KIR3DL3"는 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(Killer cell immunoglobulin-like receptor) 3DL3, CD158Z, KIR3DL7, KIR44, KIRC1, KIR2DS2, 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(killer cell immunoglobulin like receptor), 3개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 3(three Ig domains and long cytoplasmic tail 3)으로도 알려져 있고, 자연 살해 세포 및 T 세포의 하위집단에 의해 발현되는 막관통 당단백질 패밀리의 구성원을 지칭한다. 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 유전자들은 다형이며 고도로 상동적이고 1 Mb 백혈구 수용체 복합체(LRC) 내의 염색체 19q13.4 상의 클러스터에서 발견된다. 몇몇 "프레임워크" 유전자가 모든 일배체형(KIR3DL3, KIR3DP1, KIR3DL4, KIR3DL2)에서 발견되기는 하지만, KIR 유전자 클러스터의 유전자 내용은 일배체형에 따라 다르다. KIR 단백질은 세포외 면역글로불린 도메인의 수(2D 또는 3D) 및 긴 세포질 도메인(L)을 갖는지 아니면 짧은 세포질 도메인(S)을 갖는지에 따라 분류된다. 긴 세포질 도메인을 갖는 KIR 단백질은 면역 티로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 통한 리간드 결합 시 저해 신호를 전달하는 반면, 짧은 세포질 도메인을 갖는 KIR 단백질은 ITIM 모티프가 결손되고 대신 활성화 신호를 전달하는 TYRO 단백질 티로신 키나아제 결합 단백질과 관련된다. 몇몇 KIR 단백질의 리간드는 HLA 클래스 I 분자의 하위집단이고; 따라서, KIR 단백질은 면역 반응 조절에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 이 유전자는 모든 일배체형에 존재하는 "프레임워크" 좌위 중 하나이다. KIR3DL3 단백질은 N-말단 신호 서열, 3개의 Ig 도메인, 양전하 잔기가 결핍된 막관통 영역 및 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 함유하는 긴 세포질 꼬리를 갖는다. KIR3DL3은 다른 KIR에서 발견되는 줄기 영역(stalk region)을 결여한다.
소정의 KIR3DL3 구조 및 기능은 위에서 기재된 바와 같이 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Hsu et al. (2002) Immunol Rev. 190:40-52, Trompeter et al. (2005) J. Immunol. 174:4135-4143, Trundley et al. (2006) Immunogenet. 57:904-916 및 Jones et al. (2006) Immunogenet. 58:614-627] 참조).
용어 "KIR3DL3"은 이의 단편, 변이체(예컨대, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 KIR3DL3 cDNA 및 인간 KIR3DL3 단백질 서열이 당해 분야에 잘 알려져 있고 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에서 공개적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 인간 KIR3DL3 동형체가 알려져 있다: 인간 KIR3DL3(NM_153443.4)은 전사체(NP_703144.3)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 이외의 생물체에서 KIR3DL3 오솔로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며 예를 들어, 침팬지 KIR3DL3(XM_003316679.3 및 XP_003316727.3), 붉은털원숭이 KIR3DL3(NM_001104552.2 및 NP_001098022.1), 마우스 KIR3DL3(NM_001310690.1 및 NP_001297619.1, NM_177749.4 및 NP_808417.2, NM_177748.2 및 NP_808416.1) 및 래트 KIR3DL3(NM_181479.2 및 NP_852144.1)를 포함한다. 대표적인 KIR3DL3 오솔로그 서열을 아래 표 1에 나타내었다.
KIR3DL3 단백질 검출에 적합한 항-KIR3DL3 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항체 Cat #: FAB8919R, MAB8919, FAB8919G, FAB8919N, FAB8919S, FAB8919T, FAB8919U 및 FAB8919V(R&D systems), 항체 AP52374PU-N(Origene), 항체 PA5-26178(ThermoFisher Scientific), 항체 OAAB05761, OAAF08125, OAAN04122, OACA09134, OACA09135, OACD04988 및 OASG01190(Aviva Systems Biology) 등을 포함한다. 또한, KIR3DL3의 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 Origene Technologies의 shRNA 제품 번호 TF303684, TR303684, TG303684, TL303684, TL303684V, siRNA 제품 번호 SR314516 및 CRISPR 제품 번호 KN224383, KN224383BN, KN224383RB 및 KN224383LP, Abm의 siRNA 제품 번호 i011627, i011627a, i011627b, i011627c, i011627d, iV011627, iV011627a, iV011627b, iV011627c, iV011627d, iAAV01162700, iAAV01162701, iAAV01162702, iAAV01162703, iAAV01162704, iAAV01162705, iAAV01162706, iAAV01162707, iAAV01162708 및 iAAV01162709 및 CRISPR 제품 번호 K1151421, K1151401, K1151402, K1151403, K1151404, K1151405, K1151406, K1151407, K1151408 및 K1151411, Santa Cruz Biotechnology의 siRNA 제품 번호 sc-60892, shRNA 제품 번호 sc-60892-SH 및 sc-60892-V 및 CRISPR 제품 번호 sc-406227, sc-406227-KO-2, sc-406227-HDR-2, sc-406227-NIC 및 sc-406227-NIC-2 등과 같이 상기 참조된 회사의 상품 리스트에서 찾을 수 있다. 이 용어는 또한 KIR3DL3 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하는 것으로 사용될 수 있음을 유의해야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 백분율 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 개시내용에 의해 포괄되는 KIR3DL3 분자를 설명하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "말초 혈액 세포 아형"은 호산구, 호중구, T 세포, 단핵구, NK 세포, 과립구 및 B 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 일반적으로 말초 혈액에서 발견되는 세포 유형을 지칭한다.
용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 면역글로불린 유전자의 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 동물 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(아래에 추가로 설명함)로부터 단리된 항체, (b) 항체 발현을 위해 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어, 트랜스팩토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같이 재조합 수단으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계열 및/또는 비-생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 소정의 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열의 트랜스제닉 동물이 사용되는 경우, 생체 내 신체의 돌연변이유발)이 적용될 수 있고 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이 서열과 관련되지만 생체 내 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
적어도 하나의 바이오마커의 존재 또는 수준을 검출하거나 결정하기 위해 사용되는 용어 "샘플"는 일반적으로 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 눈물 및 임의의 다른 체액(예컨대, "체액"의 정의에 따라 위에서 설명한 것으로), 또는 소장, 결장 샘플 또는 수술 절제 조직과 같은 조직 샘플(예컨대, 생검)이다. 특정 경우에, 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법은 샘플에서 적어도 하나의 마커의 존재 또는 수준을 검출 또는 결정하기 전에 개체로부터 샘플을 얻는 것을 더 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "RNA 간섭제"는 RNA 간섭(RNAi)을 통해 표적 바이오마커에 간섭하거나 발현을 저해하는 임의의 제제로 정의된다. 이러한 RNA 간섭제는 본 개시내용에 의해 포괄되는 표적 바이오마커 유전자에 상동적인 RNA 분자 또는 이의 단편을 포함하는 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 RNA 간섭(RNAi)을 통해 표적 바이오마커 핵산에 간섭하거나 발현을 저해하는 소분자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
"RNA 간섭"(RNAi)은 표적 바이오마커 핵산과 동일하거나 매우 유사한 서열의 RNA의 발현 또는 도입으로 표적화 유전자로부터 전사된 메신저 RNA(mRNA)의 서열 특이적 분해 또는 서열 특이적 전사후 유전자 침묵(PTGS)을 초래하는 진화적으로 보존된 과정으로(Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225 참조), 이로 인해 표적 바이오마커 핵산의 발현이 저해된다. 일 실시형태에서, 이 RNA는 이중 가닥 RNA(dsRNA)이다. 이 과정은 식물, 무척추동물 및 포유류 세포에서 설명되었다. 본래, RNAi는 긴 dsRNA를 siRNA라 부르는 이중 가닥 단편으로 절단하는 것을 촉진하는 dsRNA-특이적 엔도뉴클레아제 다이서(endonuclease Dicer)에 의해 개시된다. siRNA는 표적 mRNA를 인식하고 절단하는 단백질 복합체에 통합된다. 또한 RNAi는 표적 바이오마커 핵산의 발현을 저해 또는 침묵시키기 위한 핵산 분자, 예를 들어, 합성 siRNA, shRNA 또는 다른 RNA 간섭제의 도입에 의해 개시될 수 있다. 본 명세서에 사용된, "표적 바이오마커 핵산 발현의 저해" 또는 "마커 유전자 발현의 저해"는 표적 바이오마커 핵산 또는 표적 바이오마커 핵산에 의해 암호화되는 단백질의 발현 또는 활성 또는 수준의 임의의 감소를 포함한다. 이 감소는 RNA 간섭제에 의해 표적화되지 않은 표적 바이오마커 핵산의 발현 또는 이 표적 바이오마커 핵산에 의해 암호화되는 단백질의 활성 또는 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 이상일 수 있다.
RNAi에 부가해서, KIR3DL3 경로 구성성분, 예를 들어, HHLA2, TMIGD2 및/또는 KIR3DL3과 같은 관심대상 바이오마커의 구성적 또는 유도적 넉아웃(넉아웃) 또는 돌연변이와 같이 관심대상 바이오마커의 카피수 또는 유전자 서열을 조절하기 위해 게놈 편집을 사용할 수 있다. 예를 들어, 게놈 핵산의 정밀한 편집을 위해(예컨대, 비-기능적 또는 삭제(null) 돌연변이를 생성하기 위해) CRISPR-Cas 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas 효소가 발현될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 만이 함유된 벡터를 Cas9 효소의 트랜스제닉 동물 또는 세포에 투여할 수 있다. 유사한 전략(예컨대, 디자이너 징크 핑거, 전사 활성자-유사 효과기(TALE) 또는 호밍 메가뉴클레아제)이 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제8,697,359호; 문헌[Sander and Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov and Hannon (2010) Mol. Cell 37:7; U.S. Pat. Publ. 2014/0087426 and 2012/0178169; Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29:135-136; Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:e19722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315-6325; Zhang et al. (2011) Nat. Biotech. 29:149-153; Miller et al. (2011) Nat. Biotech. 29:143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47] 참조). 이러한 유전적 전략에서 당해 분야에 잘 알려진 방법에 따라 구성적 발현 시스템 또는 유도적 발현 시스템을 사용할 수 있다.
"피위(Piwi)-상호작용 RNA"(piRNA)는 작은 논코딩 RNA 분자의 가장 큰 분류이다. piRNA는 피위 단백질과의 상호작용을 통해 RNA-단백질 복합체를 형성한다. 이 piRNA 복합체는 생식계 세포, 특히 정자형성의 레트로트랜스포존(retrotransposon) 및 다른 유전적 요소의 후성적 및 전사후 유전자 침묵 모두와 연관이 있다. 이들은 크기(21-24 nt가 아닌 26-31 nt), 서열 보전의 결손 및 증가된 복잡성에서 마이크로RNA(miRNA)와는 다르다. 하지만, piRNA는 다른 작은 RNA와 마찬가지로 유전자 침묵, 특히 트랜스포존의 침묵과 연관되는 것으로 생각된다. 대부분의 piRNA는 트랜스포존 서열에 안티센스이고, 이는 트랜스포존이 piRNA 표적임을 시사한다. 포유동물의 배아의 발달에서 트랜스포존의 piRNA 활성이 가장 중요하며, C. elegans 및 인간에서 정자 형성을 위해 piRNA가 필요하다. piRNA는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)의 형성을 통해 RNA를 침묵시키는 역할을 한다.
"압타머"는 특이 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드 분자이다. "핵산 압타머"는 소분자, 단백질, 핵산뿐만 아니라 세포, 조직 및 생물체와 같은 다양한 분자 표적에 결합도록 반복적인 시험간 내 선발 또는 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 통해 제작된 핵산종이다. "펩타이드 압타머"는 특이 표적 분자에 결합하도록 선별 또는 제작된 인공 단백질이다. 이러한 단백질은 단백질 스캐폴드에 의해 표시되는 가변 서열의 하나 이상의 펩타이드 루프로 이루어진다. 이들은 일반적으로 조합 라이브러리로부터 단리된 것이고 종종 이후에 직접적인 돌연변이 또는 가변 영역 돌연변이유발 및 선발 과정을 통해 개선된다. 펩타이드 압타머의 진화인 "아피머 단백질"(Affimer protein)은 특이 표적 단백질에 대한 높은 친화성 결합 표면을 제공하는 펩타이드 루프를 나타내도록 제작된 작고 매우 안정적인 단백질이다. 이는 시스타틴(cystatin)의 시스테인 단백질분해효소 저해제 패밀리로부터 유래된 12 내지 14kDa의 낮은 분자량의 단백질이다. 압타머는 일반적으로 사용되는 생물분자인 항체에 필적하는 분자 인식 특성을 제공하기 때문에 생물공학 및 치료 응용에 유용하다. 차별적인 인식에 더해, 압타머는 완전히 시험관 내에서 제작될 수 있고, 화학적 합성으로 쉽게 생산할 수 있고, 바람직한 저장 특성을 보유하고, 치료적 응용에서 면역원성을 거의 또는 전혀 유발하지 않기 때문에 항체를 뛰어넘는 이점을 제공한다.
본 명세서에서 "소간섭 RNA"로도 지칭하는 "짧은 간섭 RNA"(siRNA)는, 예를 들어, RNAi에 의한 표적 바이오마커 핵산의 발현을 저해하는 작용을 하는 제제로서 정의된다. siRNA는 화학적으로 합성하거나, 시험관 내 전사로 생산하거나, 숙주 세포 내에서 생산할 수 있다. 일 실시형태에서, siRNA는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 15 내지 약 28개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 19, 20, 21 또는 22개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자이고, 각 가닥에 약 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 3' 및/또는 5' 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이 오버행의 길이는 두 가닥 사이에 독립적이고, 즉, 한 가닥의 오버행 길이는 제2 가닥의 오버행 길이에 의존하지 않는다. 바람직하게는 siRNA는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 분해 또는 특이적 전사후 유전자 침묵(PTGS)을 통해 RNA 간섭을 촉진할 수 있다.
다른 실시형태에서, siRNA는 작은 헤어핀(또는 스템루프로 불림) RNA(shRNA)이다. 일 실시형태에서, 이 shRNA는 짧은(예컨대, 19 내지 25 뉴클레오타이드) 안티센스 가닥, 이어서 5 내지 9 뉴클레오타이드 루프 및 유사한 센스 가닥으로 이루어진다. 대안적으로, 센스 가닥이 뉴클레오타이드 루프에 앞서고 안티센스 가닥이 뒤따를 수 있다. 이 shRNA는 플라스미드, 레트로바이러스 및 렌티바이러스에 포함될 수 있고 예를 들어, pol III U6 프로모터 또는 다른 프로모터(예컨대, 문헌[Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501] 참조, 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)로부터 발현될 수 있다.
암에서 과발현되는 바이오마커 유전자의 발현을 저해하여 대상체의 암을 치료, 예방 또는 저해하기 위해 RNA 간섭제, 예를 들어, siRNA 분자를 암을 갖거나 암을 갖을 위험이 있는 환자에 투여할 수 있다.
용어 "소분자"(small molecule)는 이 분야의 용어이며 약 1000의 분자량 미만 또는 약 500의 분자량 미만인 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 소분자는 펩타이드 결합 만을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 소분자는 올리고머가 아니다. 예시적으로 활성을 스크리닝할 수 있는 소분자 화합물은 펩타이드, 펩티도미메틱, 핵산, 탄수화물, 작은 유기 분자(예컨대, 폴리케티드)(Cane et al. 1998. Science 282:63) 및 천연 추출물 라이브러리를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 이 화합물은 작은 유기 비-펩타이드 화합물이다. 추가 실시형태에서, 소분자는 생합성물질이 아니다.
생물학적 활성제에 적용되는 용어 "선택적 조절제" 또는 "선택적 조절"은 표적과의 직접 또는 간접적 상호작용을 통해 비-표적 세포 집단, 신호전달 활성 등과 비교하여 세포 집단, 신호전달 활성 등과 같은 표적을 조절하는 제제의 능력을 지칭한다. 예를 들어, KIR3DL3과 다른 결합 상대 간의 또 다른 상호작용 및/또는 관심 세포 집단 상에서의 이러한 상호작용(들)에 비해서 KIR3DL3과 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용을 선택적으로 저해하는 제제는 KIR3DL3 경로 조절제 요법에 대해 활성을 가질 수 있다(예컨대, KIR3DL3과 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용의 조절제로, 상호작용이 적어도 하나의 다른 결합 상대에 대한 제제의 활성보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 2×(배) 또는 그 이상인 조절제(예컨대, 적어도 약 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 15×, 20×, 25×, 30×, 35×, 40×, 45×, 50×, 55×, 60×, 65×, 70×, 75×, 80×, 85×, 90×, 95×, 100×, 105×, 110×, 120×, 125×, 150×, 200×, 250×, 300×, 350×, 400×, 450×, 500×, 600×, 700×, 800×, 900×, 1000×, 1500×, 2000×, 2500×, 3000×, 3500×, 4000×, 4500×, 5000×, 5500×, 6000×, 6500×, 7000×, 7500×, 8000×, 8500×, 9000×, 9500×, 10000× 또는 그 이상, 또는 사이의 임의의 범위, 포함)). 이러한 지표는 일반적으로 상호작용/활성을 절반으로 줄이는데 필요한 제제의 상대적인 양의 측면에서 표현된다.
보다 일반적으로, 용어 "선택적"은 우선적인 작용 또는 기능을 지칭한다. 용어 "선택적"은 다른 표적에 상대적으로 관심대상 특정 표적에 우선적인 효과의 측면에서 정량화될 수 있다. 예를 들어, 측정된 변수(예컨대, Treg/Breg 대 다른 세포, 예를 들어, Tcon과 같은 다른 면역 세포의 조절)는 관심대상 표적 대 의도하지 않거나 원치않는 표적에서 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 55배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상 또는 포함되는 사이의 임의의 범위(예컨대, 50% 내지 16배)로 다를 수 있다. 같은 배수 분석으로 주어진 조직, 세포 집단, 측정 변수, 측정 효과 등, 예를 들어, Treg:Tcon 비율, Breg:Tcon 비율, 과증식성 세포 성장률 또는 부피, Treg/Breg 증식률 또는 수 등에서 효과의 크기를 확인할 수 있다.
대조적으로, 용어 "특이적"은 독점적인 작용 또는 기능을 지칭한다. 예를 들어, HHLA2-KIR3DL3 상호작용의 특이적 조절은 KIR3DL3과 다른 리간드 간의 상호작용의 조절이 아닌 HHLA2-KIR3DL3 상호작용의 독점적인 조절을 지칭한다. 다른 예에서, 미리 결정된 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 다른 항원과의 결합 없이 관심대상 항원과 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 피분석물로 관심대상 항원을 사용하고 리간드로 항체를 사용하여 BIACORE® 분석 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 결정할 때 대략 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 또는 이 보다 낮은 값 미만과 같은 대략 1×10-7 M 미만의 친화도(KD)로 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 가깝게 연관된 항원 이외의 비-특이적 항원(예컨대, BSA, 카세인)에 대한 결합 친화도에 비해 적어도 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2.0-, 2.5-, 3.0-, 3.5-, 4.0-, 4.5-, 5.0-, 6.0-, 7.0-, 8.0-, 9.0- 또는 10.0-배 또는 그 이상의 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 추가로, KD는 KA의 반대이다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
용어 "감작화하다"(sensitize)는 요법(예컨대, KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3와 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 사이의 상호작용 조절제) 단독 또는 면역관문 저해 요법과 같은 면역요법과의 조합)으로 보다 효과적인 치료를 허용하는 방식으로 암 세포 또는 종양 세포와 같은 세포를 변화시키는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 정상 세포는 요법(예컨대, KIR3DL3 경로 조절제 요법(예컨대, KIR3DL3와 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 사이의 상호작용 조절제) 단독 또는 면역관문 저해 요법과 같은 면역요법과의 조합)에 의해 과도하게 손상될 정도로 영향을 받지 않는다. 요법적 치료에 따라 증가된 민감도 또는 감소된 민감도는 특히 세포 증식 분석법(Tanigawa N, Kern D H, Kikasa Y, Morton D L, Cancer Res 1982; 42: 2159-2164), 세포 사멸 분석법(Weisenthal L M, Shoemaker R H, Marsden J A, Dill P L, Baker J A, Moran E M, Cancer Res 1984; 94: 161-173; Weisenthal L M, Lippman M E, Cancer Treat Rep 1985; 69: 615-632; Weisenthal L M, In: Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993: 415-432; Weisenthal L M, Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 아래 본 명세서에 기재된 치료 및 방법에 대해 당해 분야에 알려진 방법에 따라 측정한다. 또한 민감도 또는 저항성은 일정 기간, 예를 들어, 인간의 경우 6달 및 마우스의 경우 4 내지 6주 동안 종양 크기 감소를 측정하는 방법으로 동물에서 측정할 수 있다. 치료 민감도의 증가 또는 저항성의 감소가 조성물 또는 방법의 부재 하에서의 치료 민감도 또는 저항성과 비교하여 5% 또는 그 이상, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 그 이상까지인 경우, 조성물 또는 방법은 요법적 치료에 대한 반응을 민감화하는 것이다. 요법적 치료에 대한 민감도 또는 저항성을 결정하는 것은 당해 분야에서 그리고 당업자의 기술 내에서 통상적인 것이다. 면역조절의 효능을 강화하기 위한 본 명세서에 기재된 임의의 방법은 과증식성 또는 암성 세포(예컨대, 저항성 세포)를 요법에 대해 민감화하기 위한 방법에 동일하게 적용할 수 있다.
용어 "상승작용 효과"는 항암제 단독의 독립적 효과의 합보다 클 수 있는 둘 이상의 KIR3DL3 경로 조절제, KIR3DL3 경로 조절제와 면역요법, KIR3DL3 경로 조절제 단독 또는 면역관문 저해 요법과 같은 면역요법과의 조합 등과 같은 둘 이상의 치료 물질의 연합된 효과를 지칭한다.
용어 "생존"은 다음의 모두를 포함한다: 사망까지의 생존, 전체 생존이라고도 함(여기서 사망은 원인과 무관하거나 종양과 관련이 있을 수 있음); "재발-없는 생존"(여기서 용어 재발은 국소 및 원발성 재발을 모두 포함함); 무전이 생존; 무질환 생존(여기서 용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함함). 상기 생존의 기간은 정의된 출발점(예컨대, 진단 시점 또는 치료 시작) 및 종결점(예컨대, 죽음, 재발 또는 전이)을 참조로 계산할 수 있다. 추가로, 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 시간 내의 전이 확률 및 종양 재발 확률을 포함하도록 치료 효능의 기준을 확장할 수 있다.
용어 "치료 효과"는 약리학적 활성제에 의해 야기되는 동물, 특히 포유동물, 특히 인간의 국소 또는 전신성 효과를 지칭한다. 그러므로, 이 용어는 동물 또는 인간의 질환 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방에 또는 바람직한 신체적 또는 정신적 발달 및 병태의 향상에 사용하기 위해 의도된 임의의 물질을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료적 유효량" 및 "유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 유익/유해비로 동물의 세포의 적어도 하위집단에 일부 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 효과적인 화합물, 재료 또는 본 개시내용에 의해 포괄되는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 대상 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 및 ED50를 결정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약제학적 절차를 통해 결정할 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 몇몇 실시형태에서, LD50(치사량)은 측정할 수 있고 예를 들어, 제제를 투여하지 않은 경우에 비해 제제에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상 감소될 수 있다. 유사하게, ED50(즉, 증상의 최대-절반 저해를 달성하는 농도)도 측정될 수 있고 예를 들어, 제제를 투여하지 않은 경우에 비해 제제에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상 증가될 수 있다. 또한, 유사하게, IC50(즉, 암세포에서 최대-절반 세포독성 또는 세포증식저해성 효과를 달성하는 농도)도 측정할 수 있고 예를 들어, 제제를 투여하지 않은 경우에 비해 제제에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상 증가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 분석에서 암 세포 성장은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로도 저해될 수 있다. 암세포 사멸은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로도 촉진될 수 있다. 다른 실시형태에서, 암세포의 수 및/또는 고형 악성도가 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로도 달성될 수 있다.
용어 "화학적 전구체 또는 다른 화합물이 실질적으로 없는"은 단백질의 합성과 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화합물로부터 분리된 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질의 제제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 용어 "화학적 전구체 또는 다른 화합물이 실질적으로 없는"은 약 30%(건조중량 기준) 미만의 화학적 전구체 또는 비-항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 화합물을 갖는, 보다 바람직하게는 약 20% 미만의 화학적 전구체 또는 비-항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 화합물을 갖는, 보다 바람직하게는 약 10% 미만의 화학적 전구체 또는 비-항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 화합물을 갖는, 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 화학적 전구체 또는 비-항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 화합물을 갖는, 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질의 제제를 포함한다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사체"는 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커의 전사 및 임의의 경우 RNA 전사체의 일반적인 전사-후 과정(예컨대, 스플라이싱), 및 RNA 전사체의 역전사에 의해 만들어진 완성형 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이거나 이에 상동적인 폴리뉴클레오타이드(예컨대, mRNA, hnRNA, cDNA, 완성형 miRNA, 전구-miRNA, 1차-miRNA, miRNA*, 항-miRNA 또는 miRNA 결합 위치, 또는 이들의 변이체 또는 이러한 RNA 또는 cDNA의 아날로그)이다.
용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산을 지칭한다. 벡터의 일 유형은 부가적인 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 게놈 내에 부가적인 DNA 단편이 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터(예컨대, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다. 다른 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈 내에 통합되고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터" 또는 단순화하여 "발현 벡터"로 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태인 플라스미드로 호환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결여 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
유전자 암호(아래 제시)에 의해 정의되는 것으로, 특정 단백질의 아미노산 서열 및 이 단백질을 암호화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 사이의 알려진 명확한 관련성이 있다. 마찬가지로, 유전자 암호에 의해 정의되는 것으로, 특정 핵산의 뉴클레오타이드 서열 및 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열 사이의 알려진 명확한 관련성이 있다.
유전자 암호
알라닌 (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
아르기닌 (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
아스파라긴 (Asn, N) AAC, AAT
아스파트산 (Asp, D) GAC, GAT
시스테인 (Cys, C) TGC, TGT
글루탐산 (Glu, E) GAA, GAG
글루타민 (Gln, Q) CAA, CAG
글리신 (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
히스티딘 (His, H) CAC, CAT
아이소류신 (Ile, I) ATA, ATC, ATT
류신 (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
라이신 (Lys, K) AAA, AAG
메티오닌 (Met, M) ATG
페닐알라닌 (Phe, F) TTC, TTT
프롤린 (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
세린 (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
트레오닌 (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
트립토판 (Trp, W) TGG
타이로신 (Tyr, Y) TAC, TAT
발린 (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
종결 신호 (말단) TAA, TAG, TGA
유전자 암호의 중요하고 잘 알려진 특징은 중복성이며, 이에 의해서, 단백질을 만들기 위한 대부분의 아미노산에 대해, 하나 이상의 코딩 뉴클레오타이드 트라이플렛이 이용(위에서 예시)될 수 있다. 따라서, 다수의 서로 다른 뉴클레오타이드 서열이 주어진 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열들은 (비록 특정 생물체는 다른 것보다 효율적으로 일부 서열을 번역할 수 있지만) 모든 생물체에서 같은 아미노산 서열을 생성하기 때문에 기능적으로 동등한 것으로 간주된다. 또한, 때때로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화 변이체가 주어진 뉴클레오타이드 서열에서 발견될 수 있다. 이러한 메틸화는 트라이뉴클레오타이드 코돈과 상응하는 아미노산 사이의 암호화 관계에 영향을 미치지 않는다.
이상의 내용을 고려해서, 바이오마커 핵산(또는 이의 임의의 부분)을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA를 아미노산 서열로 번역하기 위한 유전자 암호를 사용하여 폴리펩타이드 아미노산 서열을 유도하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩타이드 아미노산 서열을 위해, 이 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 유전자 암호로부터 추론할 수 있다(그 중복성으로 인해 임의의 주어진 아미노산 서열을 위한 다수의 핵산 서열이 생성될 것이다). 따라서, 본 명세서에서 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 설명 및/또는 개시내용은 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시내용 또한 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로, 본 명세서에서 폴리펩타이드 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시내용은 이 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오타이드 서열의 설명 및/또는 개시내용 또한 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
마지막으로, 본 개시내용에서 유용한 핵산 및 폴리펩타이드 분자에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 쉽게 이용할 수 있다. 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스로부터 유래된 예시적인 핵산 및 아미노산 서열이 아래 표 1에 제공된다.
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* 표 1에는 RNA 핵산 분자(예컨대, 티민이 우리딘으로 대체됨), 암호화 단백질의 오솔로그를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라, 표 1에 열거된 임의의 서열번호의 핵산 서열 전장에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 DNA, cDNA 또는 RNA 핵산 서열, 또는 이들의 일부분이 포함된다. 이러한 핵산 분자는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
* 표 1에는 단백질의 오솔로그뿐만 아니라, 표 1에 열거된 임의의 서열번호의 아미노산 서열 전장에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 분자, 또는 이들의 일부분이 포함된다. 이러한 폴리펩타이드는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 전장 폴리펩타이드의 기능을 가질 수 있다.
* 표 1에는 다른 기지의 HHLA2 및 KIR3DL3 핵산 서열 및 아미노산 서열이 포함된다.
용어 "KIR3DL3 활성"은, 예를 들어, 암세포 상의 천연 HHLA2 리간드를 관여시킴으로써, 활성화 면역 세포에서 저해 신호를 조절하는 KIR3DL3 폴리펩타이드의 능력을 포함한다. 면역 세포에서 저해 신호의 조절은 면역 세포의 증식 및/또는 사이토카인 분비의 조절을 야기한다. 따라서, 용어 "KIR3DL3 활성"은 천연 리간드에 결합하는 KIR3DL3 폴리펩타이드의 능력, 면역 세포 저해 신호를 조절하는 능력 및 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 암과 같은 병태는 KIR3DL3 차단 단독에 반응한다. 다른 실시형태에서, 암과 같은 병태는 KIR3DL3 차단 단독에 반응하지만, KIR3DL3 차단과 적어도 하나의 다른 요법을 조합하여 치료할 때 유의적으로 또는 상승적으로 더 반응한다. KIR3DL3 차단 단독에 또는 조합에 반응하는 병태는 흑색종(예컨대, 진행성 또는 전이성 흑색종), 폐암(예컨대, 비-소 세포 폐암 및 소 세포 폐암), 유방암(예컨대, HER-2 음성 유방암, 에스트로겐-수용체+/HER-2-유방암 및 삼중 음성 유방암), 췌장암(예컨대, 췌장 선암종) 및 호지킨 림프종뿐만 아니라, 방광암, 위암, 두경부암종, 신장암, 전립선암, 부인과암, 결장직장암, 난소암, 선암종, 선암종, 만성 골수성 백혈병(CML) 및 혈액암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 B7 폴리펩타이드는 면역 세포에 공동자극 또는 저해 신호를 제공하여 면역 세포 반응을 촉진 또는 저해할 수 있다. 예를 들어, 공동자극 수용체에 결합하는 B7 패밀리 구성원은 T 세포 활성화 및 증식을 증가시키는 반면, 저해 수용체에 결합하는 B7 패밀리 구성원은 공동자극을 감소시킨다. 또한, 같은 B7 패밀리 구성원은 T 세포 공동자극을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 공동자극 수용체에 결합했을 때, HHLA2는 면역 세포의 공동자극을 유도할 수 있고, 저해 수용체에 결합했을 때, HHLA2는 면역 세포를 저해할 수 있다. 저해 수용체에 결합했을 때, HHLA2는 면역 세포에 저해 신호를 전달할 수 있다. 바람직한 B7 패밀리 구성원은 HHLA2, B7-1, B7-2, B7h, PD-L1 또는 PD-L2 및 이들의 가용성 단편 또는 유도체를 포함한다. 일 실시형태에서, B7 패밀리 구성원은 면역 세포 상 하나 이상의 수용체, 예를 들어, TMIGD2, KIR3DL3, CTLA4, CD28, ICOS, PD-1 및/또는 다른 수용체에 결합하고, 수용체에 따라, 면역 세포, 바람직하게는 T 세포에 저해 신호 또는 공동자극 신호를 전달하는 능력을 갖는다.
공동자극 신호의 조절은 면역 세포의 효과기 기능 조절을 야기한다. 따라서, 용어 "KIR3DL3 리간드 활성"은 천연 수용체(들)(예컨대, HHLA2)에 결합하는 KIR3DL3 리간드 폴리펩타이드의 능력, 면역 세포 공동자극 또는 저해 신호를 조절하는 능력 및 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다.
KIR3DL3 경로는 면역 기능의 음성적 조절자이므로, KIR3DL3과 HHLA2와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용을 조절하는 것은 면역 기능을 조절할 수 있다. 따라서, KIR3DL3과 하나 이상의 천연 결합 상대 간의 상호작용을 조절하는 본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 제제는 직접적이든 간접적이든 면역 시스템을 상향조절 또는 하향조절하여, 면역 반응을 상향조절 또는 하향조절할 수 있다. 이러한 상호작용을 조절하는 제제는 직접적으로 또는 간접적으로 이를 수행할 수 있다.
면역 반응을 상향조절하기 위한 예시적인 제제는 HHLA2와 KIR3DL3 간의 상호작용을 차단하는 HHLA2 또는 KIR3DL3에 대한 항체; HHLA2와 KIR3DL3 간의 상호작용을 차단하는 HHLA2 또는 KIR3DL3의 비-활성화 형태(예컨대, 우성 음성 폴리펩타이드), 소분자 또는 펩타이드; HHLA2 또는 KIR3DL3에 결합하고, HHLA2와 KIR3DL3 간의 상호작용을 저해하는 융합 단백질(예컨대, 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 HHLA2 또는 KIR3DL3의 세포외 부분); HHLA2 및/또는 KIR3DL3의 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자 및/또는 유전적 변형체; 천연 HHLA2 리간드의 비-활성화 형태 및 천연 KIR3DL3 리간드의 가용성 형태를 포함한다.
다른 예시적 실시형태에서, HHLA2 폴리펩타이드가 KIR3DL3 폴리펩타이드와 같은 하나 이상의 천연 결합 상대에 결합하는 것을 촉진하는 제제는 면역 세포에 저해 신호를 촉진한다. 이러한 상호작용을 조절하는 제제는 직접적으로 또는 간접적으로 이를 수행할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, HHLA2와 KIR3DL3 간의 상호작용을 직접적으로 향상시키는 제제(HHLA2 작용제 및/또는 KIR3DL3 작용제)는 저해 신호전달 및 면역 반응 하향조절을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 다른 표적에 대한 KIR3DL3의 결합을 차단하는 제제는 HHLA2에 결합하는데 이용 가능한 KIR3DL3의 유효농도를 증가시킨다. 면역 반응을 하향조절하는 예시적인 제제는 HHLA2와 KIR3DL3 간의 상호작용을 활성화 또는 촉진하는 HHLA2 또는 KIR3DL3에 대한 항체; HHLA2와 KIR3DL3 간의 상호작용을 활성화 또는 촉진하는 소분자 또는 펩타이드; 각각 HHLA2와 KIR3DL3 이외의 다른 HHLA2와 KIR3DL3의 천연 결합 상대에 결합하는 차단 항체를 포함한다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 방법에 유용한 부가적인 제제는 표 1에 열거된 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는, 본 발명의 단백질 바이오마커에 결합할 수 있는 및/또는 본 개시내용에 의해 포괄되는 단백질 바이오마커를 활성화 또는 저해할 수 있는, 항체, 소분자, 펩타이드, 펩티도미메틱스, 천연 리간드 및 이의 유도체; 표 1에 열거된 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는, 본 개시내용에 의해 포괄되는 바이오마커의 발현 및/또는 활성을 하향조절할 수 있는, RNA 간섭, 안티센스, 핵산 압타머 등을 포함한다.
KIR3DL3에 대해 직접적인 단리된 단클론성 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 하이브리도마에 의해 생산된 mAb가 수탁번호 ______로, ______에, 부다페스트 조약의 조건에 따라 미국 균주 기탁 기관인 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있다.
항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당해 분야에 잘 알려져 있으므로, 상기와 같이 제조된 본 개시내용에 의해 포괄되는 재조합 단클론성 항체는 바람직하게는 본 개시내용에 의해 포괄되는 가변 영역의 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함(예컨대, 표 2의 서열 또는 이의 일부분을 포함)한다. 항체는 또한 본 개시내용에 의해 포괄되는 가변 영역의 CDR2를 포함(예컨대, 표 2의 서열 또는 이의 일부분을 포함)할 수 있다. 항체는 또한 본 개시내용에 의해 포괄되는 가변 영역의 CDR1을 포함(예컨대, 표 2의 서열 또는 이의 일부분을 포함)할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체는 CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상기 기재된 조작된 항체의 CDR1, 2 및/또는 3 영역은 본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 가변 영역의 것과 같은 아미노산 서열(들)(예컨대, 표 2의 서열 또는 이의 일부분을 포함)을 포함할 수 있다. 하지만, 통상의 기술자라면 KIR3DL3에 효과적으로 결합하는 항체의 능력을 유지하면서 상기 CDR 서열로부터 일부 편차가 가능할 수 있음(예컨대, 보존적 서열 변경)을 인식할 것이다. 따라서, 다른 실시형태에서, 조작된 항체는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 CDR(예컨대, 표 2의 서열 또는 이의 일부분을 포함)에 예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 이루어질 수 있다.
알려진 비-인간 또는 인간 항체(예컨대, 마우스, 비-설치류 항-인간 KIR3DL3 항체)의 구조직인 특성이 KIR3DL3의 결합과 같은 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체의 적어도 하나의 기능적인 특성을 유지하는 구조적으로 연관된 인간 항-인간 KIR3DL3 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 기능적인 특성은 경쟁 ELISA 분석에서 본래의 알려진 비-인간 또는 인간 항체의 결합을 저해하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 표 2에 제시된 중쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 중쇄를 포함하는, 인간 KIR3DL3과 결합할 수 있는 단클론성 항체가 제공된다.
유사하게, 표 2에 나타낸 경쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 경쇄를 포함하는, 인간 KIR3DL3과 결합할 수 있는 단클론성 항체가 제공된다.
표 2에 나타낸 중쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 중쇄; 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 경쇄를 포함하는, 인간 KIR3DL3과 결합할 수 있는 단클론성 항체가 또한 제공된다.
당업자라면 이러한 백분율 상동성이 주어진 CDR과 동등하고 주어진 CDR 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 보존적인 아미노산 치환을 도입하는 것으로 달성될 수 있음을 인지할 것이다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체는 표 2에 나타낸 중쇄 가변 도메인 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 중쇄 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변 도메인 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 경쇄를 포함할 수 있다.
이러한 단클론성 항체는, 본 명세서에 기재된 바와 같은, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 경쇄; 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 가변 도메인의 중쇄를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 인간 KIR3DL3과 결합할 수 있는 단클론성 항체는, 본 명세서에 기재된 바와 같은, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체의 중쇄 가변 도메인은 표 2에 제시된 vH 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고/있거나 본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체의 경쇄 가변 도메인은 표 2에 제시된 vL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체는 당해 분야에 잘 알려진 임의의 기술로 생산 및 변형될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단클론성 항체는 수탁번호 ______로 ______에 ATCC에 기탁된 하이브리도마로부터 얻을 수 있는 것과 같은 쥣과동물 또는 비-설치류 항체일 수 있다. 유사하게, 이러한 단클론성 항체는 키메라, 바람직하게는 마우스/인간 키메라 항체일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단클론성 항체는 가변 도메인이 인간 억셉터 프레임워크 영역, 및 존재하는 경우 임의로 인간 불변 도메인, 및 상기 정의된 바와 같은 마우스 또는 비-설치류 CDR과 같은 비-인간 공여 CDR을 포함하는 것과 같은 인간화 항체이다.
본 개시내용은 또한 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이아바디(diabody); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 상기 단클론성 항체의 단편을 제공한다. 예를 들어, HHLA2, PD-L2, PD-L1, CTLA-4, KIR3DL3 등과 같은 많은 면역저해 분자는 이 분자의 발현을 효과적으로 특징짓기 위한 이중특이적 또는 다중특이적 방식에서 검출될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체의 다른 단편도 고려된다. 예를 들어, 가변 도메인이 표 2에 나타낸 적어도 하나의 CDR을 포함하는 개별 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄가 제공된다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄는 표 2에 나타낸 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄는 본 명세서에 기재된(예컨대, 표 2에 제시된) 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄는 본 명세서에 기재된 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3 중 적어도 하나를 포함하는 가변 도메인을 포함한다. 이러한 면역글로불린 중쇄는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이러한 면역글로불린 경쇄는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄는 표 2에 제시된 vH 또는 vL 가변 도메인 서열 각각을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 vH 가변 도메인, vL 가변 도메인, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 항체, 면역글로불린 및 폴리펩타이드는 단리된(예컨대, 정제된) 또는 막 또는 지질 소포(예컨대, 리포솜)와 같은 벡터에 함유된 형태로 사용될 수 있다.
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* Kabat에 따른 CDR 정의 및 단백질 서열 넘버링.
* 표 2에는 RNA 핵산 분자(예컨대, 티민이 우리딘으로 대체됨), 암호화 단백질의 오솔로그를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라, 표 2에 열거된 임의의 서열번호의 핵산 서열 전장에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 DNA, cDNA 또는 RNA 핵산 서열, 또는 이들의 일부분이 포함된다. 이러한 핵산 분자는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
III. 핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포
본 개시내용에 의해 포괄되는 추가의 양상은 본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체 및 이의 단편, 면역글로불린, 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다.
전형적으로, 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.
벡터는 대상체에 투여 시 상기 폴리펩타이드의 발현을 일으키거나 유도하기 위한 프로모터, 인핸서, 종결자 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 동물 세포에 대한 발현 벡터에서 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40(Mizukami T. et al. 1987)의 초기 프로모터 및 인핸서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Kuwana Y et al. 1987)의 LTR 프로모터 및 인핸서, 면역글로불린 H쇄의 프로모터(Mason J O et al. 1985) 및 인핸서(Gillies S D et al. 1983) 등을 포함한다.
동물 세포에 대한 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107(Miyaji H et al. 1990), pAGE103(Mizukami T et al. 1987), pHSG274(Brady G et al. 1984), pKCR(O'Hare K et al. 1981), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등을 포함한다. 플라스미드의 다른 대표적인 예는 복제 기점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는, 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 통합 플라스미드를 포함한다. 바이러스 벡터의 대표적인 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 패키징 세포의 형질감염 또는 보조 플라스미드 또는 바이러스의 일시적인 형질감염과 같은, 당해 분야에 알려진 기술로 생산할 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv-양성 세포, 293 세포 등을 포함한다. 이러한 복제-결손 재조합 바이러스를 생산하기 위한 구체적인 프로토콜은, 예를 들어, WO 95/14785, WO 96/22378, 미국 특허 제5,882,877호, 미국 특허 제6,013,516호, 미국 특허 제4,861,719호, 미국 특허 제5,278,056호 및 WO 94/19478에서 찾을 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터로 형질감염, 감염 또는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 용어 "형질전환"은 "외래"(즉, 외인성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포로 도입하여 숙주 세포가 원하는 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 암호화된 단백질 또는 효소를 생산하는 도입된 유전자 또는 서열을 발현하도록 하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"된 것이다.
본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입되는 외래 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건 하의 숙주 세포 및 적합한 벡터를 의미한다.
일반적인 발현 시스템은 대장균 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 배큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는 원핵 세포(예컨대, 박테리아) 및 진핵 세포(예컨대, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 예는 대장균, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예컨대, 베로 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등)뿐만 아니라 1차 또는 확인된 포유동물 세포 배양물(예컨대, 림프아구, 섬유아세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방 세포 등으로부터 생산된)을 포함한다. 그 예는 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 다이히드로엽산 환원효소(이하 "DHFR" 유전자라 함)가 결손된 CHO 세포(Urlaub G et al; 1980), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL 1662, 이후 "YB2/0 세포"라 함) 등도 포함한다. 세포에서 발현될 때 키메라 또는 인간화 항체의 ADCC 활성이 증가하기 때문에 YB2/0 세포가 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 수용성(competent) 숙주 세포로 상기 기재된 바와 같은 재조합 핵산 또는 벡터를 시험관 내 또는 생체 외에서 도입하는 단계, (ii) 얻어진 재조합 숙주 세포를 시험관 내 또는 생체 외에서 배양하는 단계, 및 (iii) 선택적으로, 상기 항체 또는 폴리펩타이드를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선별하는 단계로 이루어지는 단계들을 포함한다. 이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드의 생산을 위해 사용될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 선택적 혼성화 조건 하에서 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이 실시형태의 폴리뉴클레오타이드는 그러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 단리, 검출 및/또는 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 기탁된 라이브러리의 부분적 또는 전체-길이 클론을 동정, 단리 또는 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이 폴리뉴클레오타이드는 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리 cDNA에서 단리된, 또는 상보적인 게놈 또는 cDNA 서열이다. 바람직하게는, 이 cDNA 라이브러리는 적어도 80%의 전체-길이 서열, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%의 전체-길이 서열, 및 보다 바람직하게는 적어도 95%의 전체-길이 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 표현을 증가시키기 위해 정규화될 수 있다. 엄격한 정도가 낮거나 보통인 혼성화 조건은 전형적으로, 그러나 배타적이지는 않게, 상보적 서열에 상대적으로 감소된 서열 동일성을 갖는 서열에 적용된다. 엄격도가 보통 및 높은 조건은 동일성이 큰 서열에 대해 선택적으로 적용될 수 있다. 엄격도가 낮은 조건은 약 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적인 혼성화를 가능하게 하고 오솔로그 또는 파라로그(paralog)한 서열을 동정하기 위해 적용될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 항체의 적어도 일부분을 암호화할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 선택적 혼성화를 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, Ausubel; Colligan 참조, 각각 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨.
IV. 항체 생산 방법
본 발명의 항체 및 이의 단편, 면역글로불린 및 폴리펩타이드는 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기술 각각 또는 이들의 조합과 같은, 하지만 이로 제한되지 않는, 당해 분야에서 알려진 임의의 기술로 생산할 수 있다.
원하는 서열의 아미노산 서열을 알고 있다면, 당업자는 표준 폴리펩타이드 생산 기술로 상기 항체 또는 폴리펩타이드를 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, 잘 알려진 고체상 방법을 사용하여, 바람직하게는 상업적으로 이용 가능한 펩타이드 합성 디바이스(예컨대, Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티 소재)의 디바이스)를 사용하고 제조사의 지침에 따라 합성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 다른 폴리펩타이드는 당해 분야에서 잘 알려진 재조합 DNA 기술로 합성할 수 있다. 예를 들어, 이들 단편은 발현 벡터에 원하는 (폴리)펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 통합하고 이 벡터를 원하는 폴리펩타이드를 발현할 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에 도입한 이후 DNA 발현 산물로 얻을 수 있고, 이들은 잘 알려진 기술을 사용하여 추후 단리할 수 있다.
특히, 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 (i) 상기 항체 또는 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항체 또는 폴리펩타이드를 회수하는 단계로 이루어지는 단계들을 포함한다.
본 발명의 항체 및 다른 폴리펩타이드는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피와 같은 기존의 면역글로불린 정제 절차를 통해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC") 또한 정제를 위해 적용할 수 있다. 예를 들어, Colligan의 문헌[Current Protocols in Immunology] 또는 문헌[Current Protocols in Protein Science](John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참조하며, 각각 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 키메라 항체(예컨대, 마우스-인간 키메라 또는 비-설치류-인간 키메라)는 전술한 바와 같은 VL 및 VH 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 얻고, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 암호화하는 유전자를 갖는 동물 세포 발현 벡터에 이를 삽입하여 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포로 이 발현 벡터를 도입하여 암호화 서열을 발현하여 생산할 수 있다. 인간 키메라 항체의 CH 도메인은 IgG류 또는 이의 하위류, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 인간 면역글로불린에 속하는 임의의 영역일 수 있다. 유사하게, 인간 키메라 항체의 CL은 카파(kappa)류 또는 람다(lambda)류와 같은 Ig에 속하는 임의의 영역일 수 있다. 인간 및 비-인간 부분을 모두 포함하고, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작할 수 있는 키메라 및 인간화 단클론성 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 키메라 및 인간화 단클론성 항체는 당해 분야에 알려진 재조합 DNA 기술, 예를 들어, Robinson 등의 국제 특허 공개 PCT/US86/02269; Akira 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; Taniguchi, M.의 유럽 특허 출원 제171,496호; Morrison 등의 유럽 특허 출원 제173,494호; Neuberger 등의 PCT 출원 WO 86/01533; Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly 등의 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌[Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214]; Winter의 미국 특허 제5,225,539호; 문헌[Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
추가로, 인간화 항체는 미국 특허 제5,565,332호에 개시된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 제작될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체 사슬 또는 특이적 결합 쌍 구성원은 당해 분야에 알려진 기술, 예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호, 제5,871,907호 또는 제5,733,743호에 기재된 바와 같은 기술을 사용한 특이적 결합 쌍 구성원의 폴리펩타이드 사슬과 복제가능한 유전적 디스플레이 패키지의 성분의 융합을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터와 단일 결합 쌍 구성원의 제2 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 벡터 사이의 재조합으로 생산될 수 있다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 인간화 항체는, 전술한 바와 같은, CDR 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 얻고, (i) 인간 항체의 것과 동일한 중쇄 불변 영역 및 (ii) 인간 항체의 것과 동일한 경쇄 불변 영역을 암호화하는 유전자를 갖는 동물 세포를 위한 발현 벡터에 이를 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 이 발현 벡터를 도입하여 이 유전자를 발현하여 생산될 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터는 항체 중쇄를 암호화하는 유전자와 항체 경쇄를 암호화하는 유전자가 별개의 벡터에 존재하는 유형 또는 두 유전자들이 같은 벡터에 존재하는 유형(텐덤 유형)일 수 있다.
기존의 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술을 기반으로 인간화 항체를 생산하는 방법이 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M S. et al. 1985] 참조). 항체는, 예를 들어, CDR-그래프팅(EP 제239,400호; PCT 공개 WO91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 표면처리(EP 제592,106호; EP 제519,596호; 문헌[Padlan EA (1991); Studnicka G M et al. (1994); Roguska M A. et al. (1994)]), 및 사슬 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하는 당해 분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 이러한 항체를 제조하기 위한 일반적인 재조합 DNA 기술 또한 알려져 있다(유럽 특허 출원 EP 제125023호 및 국제 특허 출원 WO 96/02576 참조).
유사하게, 본 명세서에 기재된 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 표준 절차에 따라 만들어질 수 있다. 예를 들어, 트라이오마(trioma) 및 하이브리드 하이브리도마는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 분비할 수 있는 세포 주의 두 가지 예이다. 하이브리드 하이브리도마 또는 트라이오마에 의해 생산된 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 예는 미국 특허 제4,474,893에 개시되어 있다. 이러한 항체는 화학적 수단(Staerz et al. (1985) Nature 314:628 및 Perez et al. (1985) Nature 316:354) 및 하이브리도마 기술(Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453 및 Staerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241)에 의해 구축될 수도 있다. 대안적으로, 이러한 항체는 서로 다른 항체를 만드는 하이브리도마들 또는 다른 세포들의 융합을 통해 헤테로하이브리도마를 만들고, 원하는 항체를 생산하고 공동-조립하는 클론을 식별하는 것으로 생성될 수도 있다. 이들은 완전한 면역글로불린 사슬들 또는 Fab 및 Fv 서열과 같은 이의 일부분들의 화학적 또는 유전적 접합으로 생성될 수도 있다. 항체 성분은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 면역글로불린 바이오마커를 포함하는, 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커의 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 결합할 수 있다.
추가로, 항체 단편을 생산하는 방법이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 의해 포괄되는 Fab 단편은 인간 KIR3DL3과 특이적으로 반응하는 항체를 파파인(papain)과 같은 단백질분해효소로 처리하는 것을 통해 얻어질 수 있다. 또한 Fab는 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물의 발현 시스템 또는 진핵생물의 발현 시스템을 위한 벡터에 삽입하고, Fab를 발현하기 위해 이 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물(적절히)에 도입하는 것을 통해 생산될 수 있다.
유사하게, 본 개시내용에 의해 포괄되는 F(ab')2 단편은 KIR3DL3에 특이적으로 반응하는 항체를 단백질분해효소 펩신으로 처리하여 얻어질 수 있다. 또한, F(ab')2 단편은 티오에터 결합 또는 이황화 결합을 통한 아래 기재된 Fab'의 결합으로 생산될 수 있다.
본 발명의 Fab' 단편은 KIR3DL3에 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 환원제 다이티오트레이톨로 처리하여 얻어질 수 있다. 또한, Fab' 단편은 항체의 Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 원핵생물을 위한 발현 벡터 또는 진핵생물을 위한 발현 벡터에 삽입하고, 이의 발현을 실행하기 위해 이 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물(적절히)에 도입하는 것으로 생산될 수 있다.
추가로, 본 개시내용에 의해 포괄되는 scFv는 전술한 바와 같은 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 cDNA를 얻고, scFv를 암호화하는 DNA를 구축하고, 이 DNA를 원핵생물을 위한 발현 벡터 또는 진핵생물을 위한 발현 벡터에 삽입하고, scFv를 발현하기 위해 이 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물(적절히)에 도입하는 것으로 생산될 수 있다. 인간화 scFv 단편을 생성하기 위해, 공여 scFv 단편으로부터 상보성 결정 영역(CDR)을 선택하고, 이를 알려진 3차원 구조의 인간 scFv 단편 프레임워크로 그래프팅하는 것이 적용된 CDR 그래프팅으로 잘 알려진 기술이 사용될 수 있다(예컨대, WO98/45322; WO 87/02671; 미국 특허 제5,859,205호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제4,816,567호; EP0173494 참조).
V. 항체, 면역글로불린 및 폴리펩타이드의 변형
본 명세서에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하기 위해 이를 필요로 할 수 있다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 비-인간 동물 유래 항체의 VH 및 VL의 CDR 만을 단순 그래프팅하여 인간화 항체를 생산할 때, 항원 결합 활성이 본래의 비-인간 동물 유래 항체에 비해 감소하는 것이 알려져 있다. 비-인간 항체의 CDR 뿐만 아니라 FR의 VH 및 VL의 몇몇 아미노산 잔기가 항원 결합 활성과 직접 또는 간접적으로 관련이 있다고 생각된다. 따라서, 이들 아미노산 잔기를 인간 항체의 VH 및 VL의 FR 유래의 서로 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것은 결합 활성을 감소시킬 것이고 이 아미노산을 본래의 비-인간 동물 유래 항체의 아미노산 잔기로 치환하여 이를 교정할 수 있다.
변형 및 변화는 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체의 구조에서, 이를 암호화하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있으며, 이를 통해 여전히 원하는 특성을 갖는 항체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 기능적인 분자를 얻을 수 있다. 예를 들어, 활성의 현저한 손실없이 특정 아미노산을 단백질 구조의 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 특성이 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하기 때문에, 특정 아미노산 치환은 단백질 서열 및 당연히 이의 DNA 암호화 서열에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 따라서 생물학적 활성의 현저한 손실없이, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 서열 또는 이에 상응하는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 고려된다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산의 변화는 유전 암호의 보전을 기반으로 보존적인 치환을 암호화하도록 DNA 서열의 코돈을 변경하는 것으로 달성할 수 있다. 구체적으로, (아래에 나타낸) 유전 암호로 정의된 바와 같이, 특정 단백질의 아미노산 서열과 이 단백질을 암호화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 사이에 알려진 명확한 관련성이 있다. 마찬가지로, 유전 암호(상기 유전 암호 목록 참조)로 정의된 바와 같이, 특정 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 이 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열 사이에 알려진 명확한 관련성이 있다.
폴리펩타이드의 아미노산 서열에 변화를 만들 때, 아미노산의 하이드로패스 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 하이드로패스 아미노산 지수가 중요하다는 것이 당해 분야에서 일반적으로 이해된다. 아미노산의 상대적인 하이드로패스 특성이 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 정의하는 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 받아들여진다. 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알리닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파트산(<RTI 3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)과 같이, 각각의 아미노산은 이들의 소수성 및 전하 특성에 따라 하이드로패스 지수가 지정된다.
특정 아미노산이 유사한 하이드로패스 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질이 생성될 수 있다는 것, 즉 여전히 생물학적 기능상 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것이 당해 분야에 알려져 있다.
위에서 설명한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 다양한 전술한 특성을 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며 아르기닌과 라이신; 글루탐산과 아스파트산; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 아이소류신을 포함한다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 항체의 아미노산 변형의 다른 유형은, 예를 들어, 안정성을 증가시키기 위해 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경하는데 유용할 수 있다. "변경"은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 제거하고/하거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결이다. "N-연결"은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착하는 것을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티를 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 항체에 글리코실화 부위를 추가하는 것은 하나 이상의 상기 기재된 (N-연결 글리코실화 부위를 위한) 트라이펩타이드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하는 것을 통해 쉽게 달성된다. 또 다른 유형의 공유결합 변형은 글리코시드를 항체에 화학적 또는 효소적으로 결합하는 것을 포함한다. 이러한 절차는 N- 또는 O-연결 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서의 항체 생산을 필요로하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 결합 방식에 따라, 당은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프하이드릴기(sulfhydryl group), (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아마이드기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 WO87/05330에 기재되어 있다.
유사하게, 항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티를 제거하는 것은 화학적 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화에는 항체를 트라이플루오로메탄설폰산 화합물 또는 이에 동등한 화합물에 노출시키는 것이 필요하다. 이러한 처리는 연결당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 초래하지만, 항체는 그대로 남게 된다. 화학적 탈글리코실화는 문헌[Sojahr H. et al. (1987)] 및 문헌[Edge, A S. et al. (1981)]에 의해 설명된다. 항체 탄수화물 모이어티의 효소적인 절단은 문헌[Thotakura, N R. et al. (1987)]에 의해 설명된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.
다른 변형으로 면역접합체를 형성하는 것이 포함될 수 있다. 예를 들어, 공유결합 변형의 일 유형에서, 항체 또는 단백질은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 명시된 방식으로 다양한 비단백질성 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 공유적으로 연결된다.
본 개시내용의 항체 또는 다른 단백질과 이종 제제의 접합은 N-석신이미딜 (2-피리딜다이티오) 프로피온산(SPDP), 석신이미딜 (N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시산, 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중기능성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCL), 활성화 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베르산염), 알데하이드(글루타르알데하이드와 같은), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6 다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성화 플루오린 화합물(1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 이중기능성 단백질 결합제를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 탄소 표지된 1-아이소티오사이아나토벤질 메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 항체에 방사선뉴클레오타이드를 접합하기 위한 예시적인 킬레이팅제이다(WO 94/11026).
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 세포독소, 약물 및/또는 방사성동위원소와 같은 치료적 모이어티에 접합된 KIR3DL3에 특이적으로 결합하는 항체를 다룬다. 세포독소에 접합될 때, 항체 접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운(예컨대, 세포를 죽이는) 임의의 제제를 포함한다. 그 예는 탁솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 다이하이드록시 안트라신 다이온(dihydroxy anthracin dione), 미토산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 엑티노마이신 D(actinomycin D), 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol) 및 푸로마이신(퓨로마이신) 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료용 제제는 대사길항제(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란(melphalan), 카무스틴(carmustine)(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파마이드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C(mitomycin C) 및 시스-다이클로로다이아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴, 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전 엑티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항-유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 항체는 암과 같은 관련 장애의 치료를 위한 세포독성 방사성약물을 생성하기 위해 방사성동위원소, 예를 들어, 방사성 아이오딘에 접합될 수 있다.
접합된 항-KIR3DL3 항체는 특히 임상 시험 절차의 일부로서 조직에서 폴리펩타이드 수준을 모니터하기 위해, 예를 들어, 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위해 또는 면역요법에 반응할 가능성이 가장 높은 환자를 선별하기 위해 진단적으로 또는 예후적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, KIR3DL3에 결합하는 항체가 인식된 세포 내 에피토프를 표적으로 삼도록 하고 접합된 분자로부터 방사된 신호를 분석하여 결합을 검출하기 위해 세포는 유세포 분석에서 투과될 수 있다. 항체를 검출 가능한 물질에 결합(즉, 물리적으로 연결)하여 검출을 쉽게 할 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 겨자무 과산화효소, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예시는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린(PE)을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다. 본 명세서에서 항체와 관련하여 사용된 용어 "표지"는 항체에 방사성 제제 또는 형광단(예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE) 또는 인도사이아닌(Cy5))과 같은 검출 가능한 물질을 결합(즉, 물리적으로 연결)하여 항체를 직접 표지하는 것뿐만 아니라 검출 가능한 물질과의 반응성으로 항체를 간접 표지하는 것을 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 화학 모이어티는 고전적인 화학적 제제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 종양 괴사 인자 또는 인터페론-.감마.; 또는, 예를 들어, 림포카인(lymphokine), 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 다른 사이토카인 또는 성장 인자와 같은 생물학적 반응 변경제를 포함할 수 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 접합하는 기술은, 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985) 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119 58 (1982)]과 같이 잘 알려져 있다.
몇몇 실시형태에서, 접합은 세포에 세포독성제 또는 성장 저해제의 방출을 쉽게 하는 "절단가능한 링커"를 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(예컨대, 미국 특허 제5,208,020호 참조)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 기술 또는 펩타이드 합성을 통해 항체와 성장 저해제를 포함하는 융합 단백질을 만들 수 있다. DNA는 서로 인접한 접합체의 두 부분을 암호화하는 영역 또는 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩타이드를 암호화하는 영역에 의해 분리된 각각의 영역을 포함할 수 있다.
VI. 용도 및 방법
본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 항-KIR3DL3 항체, 면역글로불린, 폴리펩타이드 및 핵산은 단독으로 또는 다른 치료제 등과 조합하여 KIR3DL3 검출 방법, 치료 목적(예컨대, 치료, 예방 및 면역요법)과 같은 다양한 용도에 유용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 항-KIR3DL3 항체, 면역글로불린, 폴리펩타이드 및 핵산은 KIR3DL3 수준의 검출에 기초한 많은 예측적 의학 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 개체가 소정의 요법(예컨대, KIR3DL3을 표적으로 하는 요법)에 반응할 것인지를 결정하기 위한 예후(또는 예측) 검정을 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시내용에 의해 포괄되는 KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 다음 중 하나 이상의 활성을 갖는다: 1) HHLA2와 같은 천연 결합 상대에 결합하고/결합하거나 이 결합 상대의 활성을 조절; 2) 공동-면역저해 신호전달과 같은 세포 내 또는 세포 간의 신호전달을 조절; 3) T 세포 또는 NK 세포의 활성화 조절; 4) 유기체, 예를 들어, 마우스, 비-설치류 동물 또는 인간과 같은 포유동물 유기체의 면역 반응 조절; 및 5) 면역 세포 아네르기 조절.
본 개시내용은 또한 KIR3DL3 신호를 전달하는 제제를 확인하기 위한 수단으로서의 KIR3DL3 검출을 제공한다. KIR3DL3 신호를 전달하는 제제는 면역 반응을 약화시킬 것이고 자가면역 질환 및 천식에 그리고 내성을 확립하는데 유용할 것이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, KIR3DL3은 단독으로 또는 다른 면역관문 및/또는 공동자극 분자와 같은 다른 분자의 발현과의 조합으로 검출될 수 있다. 여러 분자의 조합 검출(예컨대, 순차적으로 또는 동시에)은 요법 개입의 상승작용 효과 및/또는 개인화, 장애의 하위유형의 고해상도 진단에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, KIR3DL3은 하나 이상의 마커와 함께 조합하여 검출된다.
1. 치료 방법 및 용도
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체, 단편 또는 면역접합체(예컨대, KIR3DL3 항체)는 비정상적 또는 원치 않는 KIR3DL3의 활성과 연관된 임의의 장애(예컨대, 암)의 치료에 유용하다. 소정의 실시형태에서, 치료는 인간과 같은 포유동물의 치료이다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 이러한 항체는 단독으로 또는 관심대상 장애를 치료하는데 임의의 적합한 제제 또는 적절한 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어,치료적 상승작용은, 항-KIR3DL3 mAb 및 다른 면역관문 저해제 또는 세포 요법, 예컨대, CAR을 포함하는 요법으로 세포를 치료할 때 나타날 것으로 여겨진다.
본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 또는 이의 단편은 KIR3DL3과 그의 천연 리간드인 HHLA2 간의 상호작용을 방지하거나 파괴함으로써 면역 반응을 조절하는데 유용하다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 암 세포에 대한 면역 반응 및 T 세포 및/또는 NK 세포 활성을 증가시킴으로써 질환, 예컨대, 암을 치료하는데 유용하다. 따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 목적은 면역 반응을 조절하고/하거나 비정상적 KIR3DL3 활성화와 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체, 이의 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
면역 반응의 상향조절은 존재하는 면역 반응을 강화하거나 초기 면역 반응을 유도하는 형태일 수 있다. 예를 들어, 대상 조성물 및 방법을 사용하여 면역 반응을 강화하는 것은 암 및 미생물(예컨대, 박테리아, 바이러스 또는 기생충) 감염에 대한 면역학적 방어를 개선하는 경우에 유용하다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 면역 반응 기능의 상향조절 또는 강화는 종양 면역성 유도에 유용하다.
또 다른 실시형태에서, 면역 반응은 기존 내성, 클론 결손 및/또는 고갈(예컨대, T 세포 고갈)이 극복되도록, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 자극될 수 있다. 예를 들어, 대상체가 유의적인 면역 반응을 나타낼 수 없는 항원에 대한 면역 반응, 예를 들어, 종양 특이적 항원과 같은 자가 항원에 대한 면역 반응은 면역 반응을 상향조절하는 본 명세서에 기재된 적절한 제제를 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 일 실시형태에서, 종양-특이적 항원과 같은 자가 항원이 공동투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 면역 반응은 신경학적 장애를 치료하기 위해 항원(예컨대, 자가 항원)으로 자극될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 제제는 능동면역화 과정에서 외래 항원에 대한 반응을 높이기 위한 보조제로 사용될 수 있다.
소정 경우에, 면역 반응을 더욱 증강시키기 위하여, 면역 반응을 상향조절하는 다른 제제, 예를 들어, 공동자극 수용체를 통해 신호를 전달하는 다른 B7 패밀리 구성원의 형태를 추가로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 면역 반응을 상향조절하는 제제는 다양한 폴리펩타이드(예컨대, 병원체로부터 유래된 폴리펩타이드)에 대한 백신에 예방적으로 사용될 수 있다. 병원체(예컨대, 바이러스)에 대한 면역성은 적절한 보조제에서 면역 반응을 상향조절하는 제제와 함께 바이러스 단백질을 백신접종하여 유도될 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 및 항원-결합 단편은 면역 작용을 상향조절하는 질환, 예를 들어, 천식, 자가면역 질환(사구체신염, 관절염, 팽창 심근증-유사 질환, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 크론병, 전신성 홍반성 낭창, 만성 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 접촉 피부염, 다발근염, 경피증, 결절성 동맥주위염, 류마티스성 열, 백납, 인슐린 의존성 당뇨병, 베체트병, 하시모토병, 애디슨병, 피부근염, 중증근무력증, 라이터 증후군, 그레이브스병, 악성 빈혈, 굿파스처 증후군, 불임병, 만성 활동 간염, 천포창, 자가면역 혈소판감소성 자반병, 및 자가면역 용혈성 빈혈, 활동성 만성 간염, 애디슨병, 항-인지질 증후군, 아토피성 알레르기, 자가면역 위축성 위염, 무염소증 자가면역, 셀리악병, 쿠싱 증후군, 피부근염, 원판성 루푸스, 홍반(erythematosis), 굿파스처 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 신장근저 위축, 특발성 혈소판감소증, 인슐린-의존성 당뇨병, 램버트-이튼 증후군, 루포이드 간염, 림프구감소증의 몇몇 경우, 혼합결합조직병, 유천포창, 보통천포창, 악성빈혈, 수정체성 포도막염, 결절성 동맥주위염, 다선성 자가증후군, 일차성 담즙성 간경화증, 원발 경화성 담관염, 레이노병, 재발성 다발 연골염, 쉬미트 증후군, 제한된 공피증(또는 크레스트 증후군), 교감성 안염, 전신성 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 관자동맥염, 갑상선중독증, B형 인슐린 저항성, 궤양성 대장염 및 베게너육아종증)을 저해하기 위한 진단적, 예후적 및 예방 적용(치료 및 질환의 시작 또는 진행을 지연하는 것과 같은)에 더해 치료적 적용에 유용하다.
유사하게, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 지속성 감염 질환(예컨대, HPV, HBV, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)와 같은 레트로바이러스, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 거대세포바이러스(CMV), HSV-1 및 HSV-2와 같은 헤르페스바이러스 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스성 감염성 질환)에 대한 진단적, 예후적 및 예방 적용(치료 및 질환의 시작 또는 진행을 지연하는 것과 같은)에 더해 치료적 적용에 유용하다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는 병원체와 관련된 다른 항원은 말라리아, 바람직하게는 NANP 반복 기반 말라리아 펩타이드를 포함하는 다양한 기생충의 항원이다. 추가로, 아스퍼질러스(Aspergillus), 브루지아(Brugia), 칸디다(Candida), 클라미디아(Chlamydia), 콕시디아(Coccidia), 크립토코커스(Cryptococcus), 디로필라리아(Dirofilaria), 고노코커스(Gonococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 리슈마니아(Leishmania), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 파라메시움(Paramecium), 페르투시스(Pertussis), 플라스모디움(Plasmodium), 뉴모코커스(Pneumococcus), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스테필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 톡소플라스마(Toxoplasma) 및 비브리오콜레라(Vibriocholerae)와 같은 박테리아, 진균 및 다른 기생성 질환이 포함된다. 종의 예는 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 헤모필러스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), B군 스트렙토코커스 sp., 마이크로플라스마 호미니스(Microplasma hominis), 헤모필러스 듀크레이(Hemophilus ducreyi), 그래뉼로마 인귀날(Granuloma inguinale), 림포파티아 베네레움(Lymphopathia venereum), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidum), 브루셀라 아보투스(Brucella abortus). 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 페투스 인테스티날리스(Campylobacter fetus intestinalis), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 브루셀라 오비스(Brucella ovis), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci), 트리코모나스 포에투스(Trichomonas foetus), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 엑티노바실러스 에퀼리(Actinobacillus equuli), 살모넬라 아보투스 오비스(Salmonella abortus ovis), 살모넬라 아보투스 에퀴(Salmonella abortus equi), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi), 코리네박테리움 피요제네스(Corynebacterium pyogenes), 엑티오바실러스 세미니스(Actinobaccilus seminis), 마이코플라스마 보비제니탈리움(Mycoplasma bovigenitalium), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 압시디아 라모사(Absidia ramosa), 트리파노소마 이퀴페르둠( Trypanosoma equiperdum), 바베시아 카발리(Babesia caballi), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 보튤리늄(Clostridium botulinum); 또는, 예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)와 같은 진균; 또는 다른 병원체, 예를 들어, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)을 포함한다. 또한 미국 국립 알레르기 전염병 연구소(NIAID) 우선 병원체도 포함된다. 이들은 카테고리 A 제제, 예컨대, 바리올라 마요르(variola major)(두창), 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis)(탄저병), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(흑사병), 클로스트리듐 보튤리늄 톡신(Clostridium botulinum toxin)(보툴리누스중독증), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(야토병), 필로바이러스(filovirus)(에볼라 출혈열, 마버그 출혈열), 아레나바이러스(라싸(Lassa)(라싸열), 후닌(Junin)(아르헨티나 출혈열) 및 관련 바이러스); 카테고리 B 제제, 예컨대, 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti)(Q 열), 부르셀라(Brucella) 종(브루셀라병), 버크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei)(마비저), 알파바이러스(베네수엘라 뇌척수염(Venezuelan encephalomyelitis), 동부 및 서부 말뇌염(eastern & western equine encephalomyelitis)), 피마자(Ricinus communis)의 리신 톡신, 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens)의 엡실론 톡신; 스태필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B), 살모넬라 종, 쉬겔라 다이센테리에(Shigella dysenteriae), 이스케리치아 콜라이 균주(Escherichia coli strain) O157:H7, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum); 카테고리 C 제제, 예컨대, 니파 바이러스, 한타바이러스, 진드기매개 출혈 열 바이러스, 진드기매개 뇌염 바이러스, 황열 및 다제-내성 튜버큘로시스; 쉬스토소마(Schistosoma) 및 타이니아(Taenia)와 같은 연충류; 리슈마니아(예컨대, L. 멕시카나(L. mexicana)) 및 플라스모듐(Plasmodium)과 같은 원생동물을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 또는 항원-결합 단편은 면역학적 내성, 장기 이식 거부, 이식-대-숙주 질환(GVHD), 알레르기성 질환 및 KIR3DL3에 의해 매개되는 면역 반응의 감쇠로 인한 질환에 관한 예후적 및 예방 적용에 부가하여, 치료적 적용에 유용하다.
본 발명의 맥락에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 진행, 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 반전, 경감 또는 저해시키는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "암 치료"는 암 세포의 성장 및/또는 증식을 저해하는 것을 의미한다. 바람직하게는 이러한 치료는 또한 종양 성장의 퇴행(즉, 측정가능한 종양의 크기 감소)을 유도한다. 가장 바람직하게는, 이러한 치료는 종양의 완전한 퇴행을 유도한다.
본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 치료 제형은 보관을 위해 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 부가적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여, 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 항체 조성물은 좋은 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 적량화 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요인은 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 행위자에 알려진 다른 요인을 포함한다.
치료적 투여량은 적어도 약 0.001㎍/kg 체중, 0.005㎍/kg 체중, 0.01㎍/kg 체중, 적어도 약 0.05㎍/kg 체중; 적어도 약 0.1㎍/kg 체중, 적어도 약 0.5㎍/kg 체중, 적어도 약 1㎍/kg 체중, 적어도 약 2.5㎍/kg 체중, 적어도 약 5㎍/kg 체중, 적어도 약 50㎍/kg 체중 및 약 100㎍/kg 체중 이하일 수 있다. 당업자라면, 이러한 지침이 활성제의 분자량에 따라, 예를 들어, 항체 단편의 사용 또는 항체 접합체의 사용에서, 조정될 것임을 이해할 것이다. 투여량은 또한 국소 투여, 예를 들어, 비강내, 흡입 등, 또는 전신 투여, 예를 들어, i.m., i.p., i.v. 등에 따라 다양할 수 있다.
조성물은 그럴 필요는 없지만 선택적으로 활성을 강화하거나 그렇지 않다면 치료 효과를 증가시키는 하나 이상의 제제와 제형화된다.
허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 비-독성이고, 인산염, 구연산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메치오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(옥타데실다이메틸벤질 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔과 같은); 저 분자량(약 10개의 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 당당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 카운터-이온 형성-염; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 생체 내 투여에 사용되는 제형은 반드시 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과로 쉽게 달성할 수 있다.
활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템(예컨대, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀션에서, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐과 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 대한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로, 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내를 포함하는 임의의 적합한 방법으로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 조성물은 특히 항체의 투여량을 감소시킨 펄스 주입으로 적절하게 투여될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적절한 투여량은 위에서 정의된 바와 같은 치료될 질환의 유형, 질환의 심각성 및 경과, 예방 목적으로 항체가 투여되는지의 여부, 이전 요법, 항체에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 및 의사의 재량에 의존할 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에 적절히 투여된다.
KIR3DL3와 HHLA2, 예컨대, 항-HHLA2 항체, 항-KIR3DL3 항체, 항-KIR3DL3/항-면역관문 이중특이적 항체(예컨대, 항-KIR3DL3/PD-1 이중특이적 항체) 등 간의 상호작용을 직접적으로 차단하는 제제는, KIR3DL3 신호전달 및 그의 하류 면역 반응을 방지할 수 있다. 대안적으로, KIR3DL3과 HHLA2 간의 상호작용을 간접적으로 차단하는 제제는 KIR3DL3 신호전달 및 그의 하류 면역 반응을 방지한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, HHLA2에 결합함으로써, KIR3DL3의 가용성 형태, 예컨대, KIR3DL3의 세포외 도메인은, 세포 표면 상의 KIR3DL3에 결합하는 데 이용 가능한 HHLA2의 유효 농도를 간접적으로 감소시킬 수 있다. 예시적인 제제는 수용체와 리간드(들) 간의 상호작용을 차단하는 KIR3DL3 및/또는 HHLA2에 대한 단일특이적 또는 이중특이적 차단 항체; HHLA2 및/또는 KIR3DL3의 비활성화 형태(예컨대, 우세한 음성 또는 가용성 폴리펩타이드), KIR3DL3과 HHLA2 간의 상호작용을 차단하는 소분자 또는 펩타이드; KIR3DL3 및/또는 HHLA2에 결합하고 수용체와 리간드(들) 간의 상호작용을 저해하는 융합 단백질(예컨대, 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된, HHLA2 및/또는 KIR3DL3의 세포외 부분); 천연 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 비활성화 형태 및 천연 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 가용성 형태를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항-KIR3DL3 항체 요법 또는 요법들의 조합(예컨대, 다른 면역관문 저해제와 같은 하나 이상의 추가의 항암 요법과 조합한 하나 이상의 항-KIR3DL3 항체 요법)이 투여될 수 있다. 조합 요법은, 예를 들어, 하나 이상의 화학요법제 및 방사선, 하나 이상의 화학요법제 및 면역요법, 또는 하나 이상의 화학요법제, 방사선 및 화학요법을 포함할 수 있는데, 이들의 각 조합은 항-면역관문 요법과 병용될 수 있다. 또한, 특정 표적을 조절하는 제제의 임의의 실시형태는 당업자에 의해 본 명세서에 그리고 이하에 기재된 임의의 다른 표적에 적용될 수 있다(예컨대, 본 명세서에 기재된 직접 및 간접 KIR3DL3 저해제가 다른 면역관문 저해제 및/또는 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 비활성화 형태, 소분자, 펩타이드, 간섭 핵산 등에 적용될 수 있다).
따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 치료제는 단독으로 사용될 수 있거나 예를 들어, 화학요법제, 호르몬, 항혈관형성제, 방사성표지, 화합물과 함께, 또는 수술, 냉동요법 및/또는 방사능요법과 함께 조합 요법으로 투여될 수 있다. 전술한 치료 방법은 기존 요법의 다른 형태(예컨대, 당업자에게 잘 알려진 암에 대한 표준 치료)와 함께 결합으로, 또는 전- 또는 후-기존 요법과 함께 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 의해 포괄되는 제제는 치료적 유효량의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 제제는 화학요법제의 활성 및 효능을 높이기 위해 화학요법과 함께 투여된다. 의사용 탁상 편람(Physicians' Desk Reference: PDR)은 다양한 암의 치료에 사용되었던 화학요법제의 투여량을 개시한다. 전술한 치료적으로 유효한 화학치료 약물의 투여 요법 및 투여량은 치료될 특정 암, 질환의 정도 및 당업자에게 익숙한 다른 요인에 따라 달라질 것이며, 의사에 의해 결정될 수 있다.
항-KIR3DL3 제제는 또한 표적화된 요법, 예컨대, 면역요법과 조합하여 투여될 수 있다. 면역 반응을 유도하거나 증폭하도록 설계된 면역요법은 "활성화 면역요법"으로 지칭된다. 면역 반응을 감소시키거나 억제하도록 설계된 면역요법은 "억제 면역요법"으로 지칭된다. 제제가 면역요법인지 그리고 주어진 유전적 변형이 면역 반응을 조절하는데 미치는 영향을 결정하기 위해 유전적으로 변형된 이식 암세포 상에서 면역 체계 효과를 갖는 것으로 생각되는 임의의 제제를 분석할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 면역요법은 암세포-특이적이다. 몇몇 실시형태에서, 면역요법은 면역 체계 세포와 선택적으로 상호작용하지 않지만 면역 체계 기능을 조절하는 제제의 투여를 지칭하는 "비표적화"일 수 있다. 비표적화 요법의 대표적인 예는 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "표적화 요법"은, 예를 들어, 선택된 생물분자와 선택적으로 상호작용하여 암을 치료하는 제제의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 면역관문 저해제의 저해에 관한 표적화 요법은 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법과 조합에서 유용하다. 용어 "면역관문 저해제"는 항-종양 면역 반응을 하향-조절하거나 저해함으로써 면역 반응을 미세 조정하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 표면 상 분자군을 의미한다. 면역관문 단백질은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, 2B4, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, TMIDG2, KIR3DL3 및 A2aR(예컨대, WO 2012/177624 참조)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 하나 이상의 면역관문 저해제의 저해는 저해 신호전달을 차단하거나 중화시켜 암을 더 효과적으로 치료하기 위해 면역 반응을 상향조절할 수 있다.
면역요법은, 예를 들어, 하나 이상의 암 백신 및/또는 감작된 항원 제시 세포의 사용을 포함할 수 있는 표적화 요법의 한 형태이다. 예를 들어, 종양세포붕괴성 바이러스는 암세포를 감염 및 용해할 수 있지만 정상 세포에는 무해하여 암 요법에 잠재적으로 유용한 바이러스이다. 종양세포붕괴성 바이러스의 복제는 종양 세포 파괴를 촉진하고 종양 부위에 용량 증폭을 생성한다. 이들은 또한 항암 유전자를 위한 벡터로 작용하여, 항암 유전자를 종양 부위에 특이적으로 전달할 수 있다. 면역요법은 암 항원 또는 질환 항원에 대한 전-형성 항체의 투여로 달성되는 숙주의 단기간 보호를 위한 수동 면역(예컨대, 선택적으로 화학요법제 또는 독소에 연결된, 종양 항원에 대한 단클론성 항체의 투여)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-VEGF 및 mTOR 저해제가 신장세포 암종의 치료에 효과적이라는 것이 알려져 있다. 면역요법은 또한 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 것에 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오타이드 등이 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리와 연관된 생물분자를 선택적으로 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한 면역요법은 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오타이드 등이 종양 또는 암의 시작, 진행, 및/또는 병리에 연결된 생물분자를 선택적으로 조절하기 위해 사용될 수 있다. 위에 기재된 바와 같이, HHLA2, KIR3DL3 등과 같은 면역관문 표적에 대한 면역요법이 유용하다.
몇몇 실시형태에서, 면역요법은 하나 이상의 입양 세포-기반 면역요법을 포함할 수 있다. 제한 없이, 방사선처리된 자가 또는 동종이계 종양 세포, 종양 용해물 또는 자멸사성 종양 세포, 항원-제시 세포-기반 면역요법, 수지상 세포-기반 면역요법, 입양 T 세포 전이, 입양 CAR T 세포 요법, 자가 면역 강화 요법(AIET), 암 백신 및/또는 항원 제시 세포를 포함하는 잘 알려진 입양 세포-기반 면역요법 방식이 사용될 수 있다. 이러한 세포-기반 면역요법들은 면역 반응을 추가로 조절하기 위한 하나 이상의 유전자 산물을 발현하도록, 예를 들어, 사이토카인 유사 GM-CSF 발현 및/또는 Mage-1, gp-100, 환자-특이적 신생항원 백신 등과 같은 종양-관련 항원(TAA) 항원을 발현하도록 추가로 조절될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 면역요법은 하나 이상의 비세포-기반 면역요법을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 백신-강화 보조제와 함께 또는 이 보조제 없이 항원을 포함하는 조성물이 사용된다. 이러한 조성물은 펩타이드 조성물, 종양세포붕괴성 바이러스, 융합 단백질을 포함하는 재조합 항원 등과 같은 많은 잘 알려진 형태로 존재한다. 또 다른 실시형태에서, IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-23 등과 같은 면역조절 인터루킨뿐만 아니라, 이의 조절제(예컨대, 차단 항체 또는 더 강력하거나 오래 지속되는 형태)가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 인터페론, G-CSF, 이미퀴모드, TNF알파 등과 같은 면역조절 사이토카인뿐만 아니라, 이의 조절제(예컨대, 차단 항체 또는 더 강력하거나 오래 지속되는 형태)가 사용된다. 다른 실시형태에서, CCL3, CCL26 및 CXCL7 등과 같은 면역조절 케모카인뿐만 아니라, 이의 조절제(예컨대, 차단 항체 또는 더 강력하거나 오래 지속되는 형태)가 사용된다. 다른 실시형태에서, STAT3 신호전달 조절제, NF카파B 신호전달 조절제 및 면역관문 조절제와 같은 면역억제를 표적으로 하는 면역조절 분자가 사용된다. 용어 "면역관문" 및 "항-면역관문 요법"은 위에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 면역요법 약물, 예컨대, 면역세포분열저해 약물, 글루코코르티코이드, 세포분열저해제, 이뮤노필린 및 이의 조절제(예컨대, 라파마이신, 칼시뉴린 저해제, 타크로리무스, 사이클로스포린, 피메크롤리무스, 아베티무스, 구스페리무스, 리다포로리무스, 에베로리무스, 템시로리무스, 조타롤리무스 등), 히드로코르티손(코르티솔), 코르티손 아세테이트, 프리드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 트라이암시놀론, 베클로메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트(doca), 알도스테론, 비-글루코코르티코이드 스테로이드, 피리미딘 합성 저해제, 레플루노마이드, 테리플루노마이드, 폴산 유사체, 메토트렉세이트, 항-흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 펜톡시필린, 부프로피온, 커큐민, 카테킨, 오피오이드, IMPDH 저해제, 마이코페놀산, 마이리오신, 핑골리모드, NF-xB 저해제, 랄록시펜, 드로트레코긴 알파, 데노수맙, NF-kB 신호전달 캐스케이드 저해제, 다이설피람, 올메사르탄, 다이티오카바메이트, 프로테아좀 저해제, 보르테조밉, MG132, Prol, NPI-0052, 커큐민, 제니스테인, 레스베라트롤, 파르테놀라이드, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 플라보피리돌, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 삼산화 비소, 다이하이드록시메틸에폭시퀴노마이신(DHMEQ), I3C(인돌-3-카비놀)/DIM(다이-인돌메탄)(13C/DIM), Bay 11-7082, 루테올린, 세포 투과 펩타이드 SN-50, IKBa-수퍼 저해제 과발현, NFKB 디코이 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN) 또는 이의 임의의 유도체 또는 유사체와 같은 면역조절 약물이 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 면역조절 항체 또는 단백질이 사용된다. 예를 들어, CD40에 결합하는 항체, Toll-유사 수용체(TLR), OX40, GITR, CD27 또는 4-1BB에 결합하는 항체, T-세포 이중특이적 항체, 항-IL-2 수용체 항체, 항-CD3 항체, OKT3(뮤로모냅), 오테릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙, 항-CD4 항체, 클레놀릭시맙, 켈릭시맙, 자놀리뮤맙, 항-CD11 항체, 에팔리주맙, 항-CD18 항체, 에를리주맙, 로벨리주맙, 항-CD20 항체, 아푸투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 파스콜리주맙, 리툭시맙, 항-CD23 항체, 루밀릭시맙, 항-CD40 항체, 테넬릭시맙, 토랄리주맙, 항-CD40L 항체, 루플리주맙, 항-CD62L 항체, 아셀리주맙, 항-CD80 항체, 갈릭시맙, 항-CD147 항체, 가빌리모맙, B-림프구 자극제(BLyS) 저해 항체, 벨리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질, 아바타셉트, 벨라타셉트, 항-CTLA4 항체, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 항-에오탁신 1 항체, 베르틸리무맙, 항-a4-인테그린 항체, 나탈리주맙, 항-IL-6R 항체, 토실리주맙, 항-LFA-1 항체, 오둘리모맙, 항-CD25 항체, 바실릭시맙, 다클리주맙, 이놀리모맙, 항-CD5 항체, 졸리모맙, 항-CD2 항체, 시플리주맙, 네렐리모맙, 파랄리모맙, 아틀리주맙, 아톨로리무맙, 세델리주맙, 도를리모맙 아리톡스, 도를릭시주맙, 폰톨리주맙, 간테네루맙, 고밀릭시맙, 레브릴리주맙, 마슬리모맙, 모롤리무맙, 펙셀리주맙, 레슬리주맙, 로벨리주맙, 탈리주맙, 텔리모맙, 아리톡스, 바팔릭시맙, 베팔리모맙, 아플리베르셉트, 알레파셉트, 릴로나셉트, IL-1 수용체 길항제, 아나킨라, 항-IL-5 항체, 메폴리주맙, IgE 저해제, 오말리주맙, 탈리주맙, IL12 저해제, IL23 저해제, 우스테키누맙 등이 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 등과 같이, 당해 분야에 잘 알려진, 면역 반응을 강화하는 영양 보충제(예컨대, 미국 특허 제4,981,844호 및 제5,230,902호 및 PCT 공개 제WO 2004/004483호 참조)가 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
유사하게, 면역요법 이외의 제제 및 요법이 면역 반응을 자극하여 이로부터 혜택을 받을 수 있는 병태를 치료하기 위해 항-KIR3DL3 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 화학요법, 방사선, 후생적 변경제(예컨대, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 변경제, 메틸화 변경제, 인산화 변경제 등), 표적 요법 등이 당해 분야에 잘 알려져 있다.
용어 "비표적 요법"은 선택된 생물분자와 선택적으로 상호작용하지 않지만 암을 치료하는 제제의 투여를 지칭한다. 비표적 요법의 대표적인 예는 유전자 요법과 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 화학요법이 사용된다. 화학요법에는 화학요법제의 투여가 포함된다. 이러한 화학요법제는 다음의 화합물 군 중에서 선택된 것일 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 백금 화합물, 세포독성 항생제, 대사길항제, 항-유사분열제, 알킬화제, 비소 화합물, DNA 토포아이소머라제 저해제, 탁산, 뉴클레오사이드 유사체, 식물 알칼로이드 및 독소; 및 이들의 합성 유도체. 예시 화합물은 알킬화제: 시스플라틴, 트레오설판 및 트로포스파마이드; 식물 알칼로이드: 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁솔; DNA 토포아이소머라제 저해제: 테니포사이드, 크리스나톨 및 마이토마이신; 항-엽산염: 메토트렉세이트, 마이코페놀산 및 하이드록시우레아; 피리미딘 유사체: 5-플루오로우라실, 독시플루리딘 및 시토신 아라비노사이드; 퓨린 유사체: 머캅토퓨린 및 티오구아닌; DNA 대사길항제: 2'-데옥시-5-플루오로우리딘, 아피디콜린 글리시네이트 및 피라졸로이미다졸; 및 항유사분열제: 할리콘드린, 콜히친 및 리족신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 화학요법제(예컨대, FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물 또한 사용할 수 있다. FLAG는 플루다라빈, 시토신 아라비노사이드(Ara-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손을 포함한다. 다른 실시형태에서, PARP(예컨대, PARP-1 및/또는 PARP-2) 저해제를 사용하며 이 저해제는 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 올라파립, ABT-888, BSI-201, BGP-15(N-Gene Research Laboratories, Inc.); INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Inc.); PJ34(Soriano et al., 2001; Pacher et al., 2002b); 3-아미노벤즈아마이드(Trevigen); 4-아미노-1,8-나프탈이미드(Trevigen); 6(5H)-페난트리디논(Trevigen); 벤즈아마이드(미국 특허 공개 제36,397호); 및 NU1025(Bowman et al.)). 작용 메커니즘은 일반적으로 PARP에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 PARP 저해제의 능력과 연관된다. PARP는 베타-니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)를 니코틴아마이드 및 폴리-ADP-리보스(PAR)로 전환하는 것을 촉진시킨다. 폴리(ADP-리보스)와 PARP는 둘 다 전사, 세포 증식, 게놈 안정성 및 발암의 조절에 연관된다(Bouchard V. J. et.al. Experimental Hematology, Volume 31, Number 6, June 2003, pp. 446-454(9); Herceg Z.; Wang Z.-Q. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Volume 477, Number 1, 2 Jun. 2001, pp. 97-110(14)). 폴리(ADP-리보스) 중합효소 1(PARP1)은 DNA 단일-가닥 절단(SSB)의 복구에서 핵심 분자이다(de Murcia J. et al. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94:7303-7307; Schreiber V, Dantzer F, Ame J C, de Murcia G (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7:517-528; Wang Z Q, et al. (1997) Genes Dev 11:2347-2358). PARP1 기능의 저해에 의한 SSB 복구의 넉아웃은 상동성-지향 DSB 복구에 결함이 있는 암세포의 합성 치사성을 촉발할 수 있는 DNA 이중-가닥 절단(DSB)을 유도한다(Bryant H E, et al. (2005) Nature 434:913-917; Farmer H, et al. (2005) Nature 434:917-921). 전술한 화학요법제의 예는 예시적인 것이며 제한하려고 의도된 것이 아니다.
다른 실시형태에서, 방사선 요법이 사용된다. 방사선 요법에 사용되는 방사선은 이온화 방사선일 수 있다. 방사선 요법은 또한 감마선, X-선 또는 양성자 빔일 수 있다. 방사선의 예는 외부-빔 방사선 요법, 방사성동위원소(I-125, 팔라듐, 이리듐)의 간질 이식, 스트론튬-89와 같은 방사성동위원소, 흉부 방사선 요법, 복강내 P-32 방사선 요법 및/또는 총 복부 및 골반 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방사선 요법의 일반적인 개요에 대해서는 문헌[Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphia]을 참조할 수 있다. 방사선 요법은 원격 근원에서 발생하는 외부 빔 방사선 또는 원격요법으로서 투여될 수 있다. 방사선 치료는 또한 내부 요법 또는 근접요법으로서 투여될 수 있는데, 여기서 방사성 근원은 암세포 또는 종양 덩어리에 근접한 신체 내부에 배치된다. 또한 헤마토포르피린 및 이의 유도체, 베르토포르핀(BPD-MA), 프탈로사이아닌, 감광제 Pc4, 데메톡시-하이포크렐린 A; 및 2BA-2-DMHA와 같은 감광제의 투여를 포함하는 광역학 요법의 사용도 포함된다.
또 다른 실시형태에서, 호르몬 요법이 사용된다. 호르몬 요법 치료는, 예를 들어, 호르몬 작용제, 호르몬 길항제(예컨대, 플루타마이드, 비칼루타마이드, 타목시펜, 랄록시펜, 류프로라이드 아세테이트(LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 과정의 저해제 및 스테로이드(예컨대, 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄로코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 비타민 A 유도체(예컨대, 올-트랜스 레틴산(ATRA)); 비타민 D3 유사체; 항제스타젠(예컨대, 미페프리스톤, 오나프리스톤), 또는 항안드로겐(예컨대, 시프로테론 아세테이트)를 포함할 수 있다.
요법에 의한 치료의 지속기간 및/또는 투여량은 특정 치료제 또는 이의 조합에 따라 달라질 수 있다. 특정 암 치료제에 대한 적절한 치료 시간은 당업자에 의해 인식될 것이다. 본 발명은 각 암 치료제에 대한 최적 치료 일정의 지속적인 평가를 고려하며, 여기서 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법으로 결정되는 바와 같은 대상체의 암의 표현형은 최적 치료 투여량 및 일정을 결정하는 인자이다.
폴리뉴클레오타이드를 포유동물, 인간 또는 비-인간 또는 이의 세포에 도입하는 임의의 방법은 의도된 수용체에게 본 개시내용에 의해 포괄되는 다양한 작제물을 전달하기 위해 본 발명의 실시에 적합화될 수 있다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 일 실시형태에서, 형질감염으로, 즉 "네이키드" DNA에 의해 또는 콜로이드 분산 시스템과의 복합 전달로, DNA 작제물을 세포에 전달한다. 콜로이드 시스템은 고분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀션, 마이셀(micelle), 혼합 마이셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 본 발명에서 바람직한 콜로이드 시스템은 지질-복합 또는 리포솜-형성 DNA이다. 이전 접근방식에서는, DNA의 제형화, 예를 들어, 지질과의 제형화 전에, 원하는 DNA 작제물을 함유하는 이식유전자 함유 플라스미드를 먼저 발현을 위해 실험적으로 최적화할 수 있다(예컨대, 5' 비번역 영역에 인트론을 포함시키는 것 및 불필요한 서열을 제거하는 것(Felgner, et al., Ann NY Acad Sci 126-139, 1995)). DNA의 제형화, 예를 들어, 다양한 지질 또는 리포솜 재료로 제형화하는 것은 알려진 방법 및 재료를 사용하여 달성할 수 있고 수용 포유동물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Canonico et al, Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994; Tsan et al, Am J Physiol 268; Alton et al., Nat Genet. 5:135-142, 1993] 및 Carson 등의 미국 특허 제5,679,647호를 참조한다.
리포솜 표적화는 해부학 및 기계적 요인을 기반으로 분류될 수 있다. 해부학적 분류는 선택성, 예를 들어, 기관-특이적, 세포-특이적 및 세포기관-특이적 선택성 수준을 기반으로 한다. 기계적 표적화는 수동인지 능동인지를 기반으로 구분할 수 있다. 수동적 표적화는 굴모세혈관을 함유하는 기관 내 세망내피계(RES)의 세포에 분포하는 리포솜의 자연적 경향을 활용한다. 반면, 능동적 표적화는 자연적으로 발생하는 국소화 부위 이외의 기관 및 세포에 대한 표적화를 달성하기 위해 단클론성 항체와 같은 특이적 리간드, 당, 당지질 또는 단백질에 리포솜이 결합하거나, 리포솜의 조성 또는 크기를 바꾸는 리포솜의 변경을 수반한다.
표적화 전달 시스템의 표면은 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 리포솜 표적화 전달 시스템의 경우, 표적 리간드를 리포솜 이중층과 안정한 결합으로 유지하기 위해 지질 그룹을 리포솜의 지질 이중층에 통합시킬 수 있다. 지질 사슬을 표적 리간드에 결합하기 위해 다양한 연결 그룹을 사용할 수 있다. 네이키드 DNA 또는 전달 비히클, 예를 들어, 리포솜과 연합된 DNA를 대상체의 여러 부위에 투여할 수 있다(아래 참조).
핵산은 임의의 원하는 벡터로 전달될 수 있다. 이는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 포함하는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스의 예시적 유형으로 HSV(단순 포진 바이러스), AAV(아데노 관련 바이러스), HIV(인간 면역결핍 바이러스), BIV(소 면역결핍 바이러스) 및 MLV(쥣과 백혈병 바이러스)가 포함된다. 핵산은 바이러스 입자, 리포솜, 나노입자 및 고분자 복합체를 포함하는 충분히 효율적인 전달 수준을 제공하는 임의의 원하는 형식으로 투여될 수 있다.
관심 핵산 또는 단백질을 암호화하는 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 또는 당해 분야에 알려진 다른 벡터에 존재할 수 있다. 이러한 벡터는 잘 알려져 있으며 특정 적용을 위해 임의로 선택될 수 있다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 유전자 전달 비히클은 프로모터 및 데메틸라제 암호화 서열을 포함한다. 바람직한 프로모터는 티미딘 키나제 및 티미딜산 합성효소 프로모터와 같은, 조직-특이적 프로모터 및 세포 증식으로 활성화되는 프로모터이다. 다른 바람직한 프로모터는 α- 및 β-인터페론 프로모터와 같은 바이러스 감염으로 활성화 가능한 프로모터 및 에스트로겐과 같은 호르몬으로 활성화 가능한 프로모터를 포함한다. 사용할 수 있는 다른 프로모터로는 몰로니 바이러스 LTR, CMV 프로모터 및 마우스 알부민 프로모터를 포함한다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
다른 실시형태에서, 네이키드 폴리뉴클레오타이드 분자가, WO 90/11092 및 미국 특허 제5,580,859호에 기재된 바와 같이, 유전자 전달 비히클로 사용될 수 있다. 이러한 유전자 전달 비히클은 성장 인자 DNA 또는 RNA일 수 있고, 소정의 실시형태에서는, 죽은 아데노바이러스에 연결될 수 있다(Curiel et al., Hum. Gene. Ther. 3:147-154, 1992). 선택적으로 사용할 수 있는 다른 비히클은 DNA-리간드(Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989), 지질-DNA 조합(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413　7417, 1989), 리포솜(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851-7855, 1987) 및 미세투사물(Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2726-2730, 1991)을 포함한다.
유전자 전달 비히클은 선택적으로 바이러스 복제 기원 또는 패키징 신호와 같은 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 이러한 바이러스 서열은 아스트로바이러스, 코로나바이러스, 오르토믹소바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 레트로바이러스, 토가바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 성장 인자 유전자 전달 비히클은 재조합 레트로바이러스 벡터이다. 재조합 레트로바이러스 및 이의 다양한 용도는, 예를 들어, 문헌[Mann et al., Cell 33:153, 1983, Cane and Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6349, 1984, Miller et al., Human Gene Therapy 1:5-14, 1990], 미국 특허 제4,405,712호, 제4,861,719호 및 제4,980,289호 및 PCT 출원 WO 89/02,468, WO 89/05,349 및 WO 90/02,806을 포함하는 많은 참조문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, EP 0,415,731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 미국 특허 제5,219,740호; WO 9311230; WO 9310218; 문헌[Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864, 1993; Vile and Hart, Cancer Res. 53:962-967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53:83-88, 1993; Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735, 1993(미국 특허 제4,777,127호, GB 2,200,651, EP 0,345,242 및 WO91/02805)]에 기재된 것들을 포함하는 많은 레트로바이러스 유전자 전달 비히클이 본 발명에 이용될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는데 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터 시스템은 헤르페스 바이러스, 예를 들어, 단순 포진 바이러스(1997년 5월 20일에 발행된 Woo 등의 미국 특허 제5,631,236호 및 Neurovex의 WO 00/08191), 백시니아 바이러스(Ridgeway (1988) Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth,; Baichwal and Sugden (1986) "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press; Coupar et al. (1988) Gene, 68:1-10) 및 여러 RNA 바이러스로부터 유래되었다. 바람직한 바이러스는 알파바이러스, 폭시바이러스, 아레나 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스 등을 포함한다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대한 여러 매력적인 기능을 제공한다(Friedmann (1989) Science, 244:1275-1281; Ridgeway, 1988, 상기 참조; Baichwal and Sugden, 1986, 상기 참조; Coupar et al., 1988; Horwich et al.(1990) J.Virol., 64:642-650).
다른 실시형태에서, 당해 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 게놈 내 표적 DNA를 조작할 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 삽입, 인공 염색체 기술, 유전자 삽입, 조직 특이적 프로모터 무작위 삽입, 유전자 표적화, 전이 인자 및/또는 외래 DNA를 도입하거나 변형된 DNA/변형된 핵 DNA를 생산하기 위한 임의의 다른 방법으로 결실, 삽입 및/또는 돌연변이시켜 게놈 내 표적 DNA를 조작할 수 있다. 다른 변형 기술은 게놈에서 DNA 서열을 삭제하는 것 및/또는 핵 DNA 서열을 변경하는 것을 포함한다. 핵 DNA 서열은, 예를 들어, 위치-지향 돌연변이유발로 변경할 수 있다.
다른 실시형태에서, 재조합 바이오마커 폴리펩타이드 및 이의 단편을 대상체에 투여할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 강화된 생물학적 특성을 갖는 융합 단백질을 제작하고 투여할 수 있다. 추가로, 증가된 생물이용가능성 및 감소된 단백질 분해와 같은 더 강화된 원하는 생물학적 활성을 위해 바이오마커 폴리펩타이드 및 이의 단편을 당해 분야에 잘 알려진 약제학적 방법(예컨대, 페길화, 글리코실화, 올리고머화 등)에 따라 변경할 수 있다.
2. 검정 및 스크리닝 방법
본 개시내용에 의해 포괄되는 다른 양상은 비-세포 기반 분석 및 이종이식 동물 모델 분석을 포함하는 스크리닝 분석에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 분석은 인간 또는 동물 모델 분석에서와 같이, KIR3DL3 신호전달을 감소시켜 면역 반응을 증가시키는 제제 및/또는 KIR3DL3 신호전달을 증가시켜 면역 반응을 감소시키는 제제를 확인하기 위해 KIR3DL3 신호전달을 조절하는 제제를 식별하기 위한 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 HHLA2, TMIGD2 및 KIR3DL3와 같은 본 명세서에(예컨대, 표, 도면, 실시예 또는 명세서에) 기재된 적어도 하나의 바이오마커에 결합하거나 이 바이오마커의 생물학적 활성을 조절하는 제제의 스크리닝 시험을 위한 검정에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 이러한 제제를 식별하기 위한 방법은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커를 조절하는, 예를 들어, 저해하는 제제의 능력을 결정하는 것이 필요하다.
일 실시형태에서, 검정은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커와 시험 작용제를 접촉시키는 것, 및 기질의 직접적 결합을 측정하는 것 또는 아래 기재된 간접적 파라미터를 측정하는 것과 같이 바이오마커의 효소 활성을 조절하는(예컨대, 저해하는) 시험 물질의 능력을 결정하는 것을 포함하는 무세포 또는 세포-기반 분석이다.
예를 들어, 직접적 결합 검정에서, 바이오마커 단백질(또는 이의 개별적 표적 폴리펩타이드 또는 분자)은 방사성동위원소 또는 효소적 표지와 연결될 수 있고 이에 따라 복합체 내 표지 단백질 또는 분자를 검출하는 것을 통해 결합을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표적은 125I, 35S, 14C 또는 3H로, 직접적 또는 간접적으로, 표지될 수 있고, 방사성동위원소는 방사능방출의 직접적 카운팅 또는 신티레이션 카운팅으로 검출할 수 있다. 대안적으로, 표적은, 예를 들어, 겨자무 페록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 루시퍼라제로, 효소적으로 표지될 수 있고, 효소적 표지는 산물에 대한 적절한 기질의 전환을 결정하는 방법을 통해 검출할 수 있다. 바이오마커와 기질 간의 상호작용을 결정하는 것은 표준 결합 또는 효소 분석법을 사용하여 달성될 수 있다. 위에서 기재된 분석법의 하나 이상의 실시형태에서, 단백질 또는 분자의 하나 또는 둘의 비복합체 형태로부터 복합체의 분리를 촉진하고 분석의 자동화를 도모하기 위해 폴리펩타이드 또는 분자를 고정하는 것이 바람직할 수 있다.
시험 제제의 표적 결합은 반응물질을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 수행할 수 있다. 이러한 용기의 비제한적 예는 미세적정 플레이트, 시험관 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 본 명세서에 기재된 항체의 고정된 형태는 또한 막, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스 또는 유리 섬유; 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 또는 라텍스로 만들어진 것과 같은 비드; 또는 폴리스티렌으로 만들어진 것과 같은 접시, 플레이트 또는 웰의 표면과 같은, 다공성, 미세다공성(약 1미크론 미만의 평균 공극 직경을 지님) 또는 거대다공성(약 10미크론 초과의 평균 공극 직경을 지님) 물질과 같은 고체상에 결합된 항체를 포함할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 바이오마커와 기질 사이 또는 바이오마커와 이의 천연 결합 상대 간의 상호작용을 조절하는 제제의 능력을 결정하는 것은 신호전달 경로(예컨대, 피드백 루프) 내 이의 위치의 하류 또는 상류 역할을 하는 폴리펩타이드 또는 다른 산물의 활성을 조절하는 시험 제제의 능력을 결정하여 수행할 수 있다. 이러한 피드백 루프는 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Chen and Guillemin (2009) Int. J. Tryptophan Res. 2:1-19] 참조).
KIR3DL3 상태는 본 명세서에 기재된 항-KIR3DL3 항체를 사용하여 측정될 수 있다. HHLA2에 대한 KIR3DL3 결합의 감소는 제제가 KIR3DL3 활성/신호전달을 저해하고, 제제를 KIR3DL3 활성/신호전달을 저해하고 면역 반응을 증가시키는데 유용하다고 식별하는 것을 나타낸다. 이와 대조적으로, HHLA2에 대한 KIR3DL3 결합의 증가는 제제가 KIR3DL3 활성/신호전달을 촉진시키고 제제를 KIR3DL3 활성/신호전달을 촉진시키고 면역 반응을 감소시키는데 유용하다고 식별하는 것을 나타낸다.
본 개시내용은 또한 전술한 스크리닝 분석을 통해 식별된 신규한 제제에 관한 것이다. 따라서, 적절한 동물 모델에서와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 식별된 제제를 사용하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 식별된 제제는 이러한 제제의 치료 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 식별된 항체는 이러한 제제의 작용 메커니즘을 결정하기 위해 동물 모델에 사용될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 일 양상은 비-세포 기반 분석 및 이종이식 동물 모델 분석을 포함하는 스크리닝 분석에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 분석은, 예를 들어, 이종이식 동물 모델 분석을 사용하여 인간에서, 암이 항-KIR3DL3 항체 요법에 반응할 가능성이 있는지 그리고/또는 제제가 항-KIR3DL3 항체 요법에 반응할 가능성이 없는 암 세포의 성장을 저해하거나 이 암 세포를 죽일 수 있는지를 확인하기 위한 방법을 제공한다.
3. 예방 방법
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 원치않는 면역 반응 또는 바람직한 것보다 적은 면역 반응과 관련된 질환 또는 병태를 예방하는 방법을 제공한다. 청구된 제제 또는 방법을 사용한 치료 혜택을 받을 질환에 대한 위험이 있는 대상체를 예를 들어, 당해 분야에 알려진 임의의 진단 또는 예후 검정법 또는 이들의 조합으로 확인할 수 있다. 예방적 제제의 투여는 원치않는 면역 반응 또는 바람직한 것보다 적은 면역 반응과 관련된 증상의 발현의 이전에 발생할 수 있다. 치료에 사용되는 적절한 제제(예컨대, 항체, 펩타이드, 융합 단백질 또는 소분자)는 임상 징후에 따라 결정할 수 있고 예를 들어, 본 명세서에 기재된 스크리닝 검정법을 사용하여 식별될 수 있다.
4. 예후 검정
본 명세서에 기재된 검출 방법은 또한 활성 및/또는 결합 상대, 예컨대, HHLA2와의 상호작용을 조절하기 위한 소정의 요법, 예컨대, KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 반응할 대상체를 식별하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 예후 검정은 너무 많은 또는 너무 적은 KIR3DL3 활성과 연관된 장애를 치료하기 위한 제제(예컨대, 작용제, 길항제, 펩티도미메틱, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 소분자, 또는 다른 약물 후보)가 대상체에게 투여될 수 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 대상체가 하나 또는 제제의 조합으로 효과적으로 치료될 수 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 대상체가 너무 많은 또는 너무 적은 KIR3DL3 활성과 연관된 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 제제로 효과적으로 치료될 수 있는지를 결정하기 위한 방법을 제공하되, 여기서, 시험 샘플이 얻어지고 KIR3DL3이 검출된다. 시험 샘플은 관심 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플일 수 있다. 시험 샘플은 시험 대상체로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 샘플은 생물학적 유체(예컨대, 뇌척수액 또는 혈청), 세포 샘플 또는 조직, 예를 들어, 종양 미세환경의 조직병리학적 슬라이드, 종양 주변 부위 및/또는 종양 내 부위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 시험 샘플은 성숙 막-결합 KIR3DL3 및/또는 KIR3DL3 단편을 발현하는 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 항체를 포함하여, 예컨대, KIR3DL3과 연루된 증상 또는 질환 또는 병의 가족력을 나타내는 환자를 진단하기 위한 임상 환경에서, 편리하게 사용될 수 있는, 사전-포장된 진단 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
또한 KIR3DL3이 발현되는 임의의 세포 유형 또는 조직이 본 명세서에 기재된 예후 검정에 사용될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 너무 많은 또는 너무 적은 KIR3DL3 활성과 연관된 장애를 가진 개체로부터의 생물학적 샘플에서 KIR3DL3이 분석되고 정보가 바람직하게는 유사한 연령 및 인종의 대조군(예컨대, 장애를 갖지 않는 개체; 대조군은 또한 "건강한" 또는 "정상의" 개체 또는 주어진 시간 경과 연구에서 초기 시점을 지칭할 수 있음)의 정보와 비교되는 연관 및/또는 계층 분석을 위하여 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 사용을 포함한다. 대안적으로, 대조군은 너무 많은 또는 너무 적은 KIR3DL3 활성과 연관된 장애를 앓고 있는 개체, KIR3DL3을 표적으로 하는 요법, 예컨대, KIR3DL3의 활성 또는 하나 이상의 결합 상대와 KIR3DL3의 상호작용을 조절하는 요법에 잘 반응하는 자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 환자 및 대조군의 적절한 선택은 연관 및/또는 계층화 연구에 유용하기 때문에, 잘 특성규명된 표현형을 갖는 개체의 풀을 포함하는 것이 매우 바람직할 수 있다. 계층화 연구에는 또 다른 연구 설계가 사용될 수도 있다(Modern Epidemiology, Lippincott Williams & Wilkins (1998), 609-622).
VII. 약제학적 조성물
KIR3DL3과 하나 이상의 천연 결합 상대, 예컨대, HHLA2 간의 상호작용을 조절하는 제제, 예컨대, 차단 항체, 펩타이드, 융합 단백질 또는 소분자는 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 추가의 성분 및/또는 치료제, 예컨대, 본 명세서에 기재된 것들을 더 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 전형적으로 하나 이상의 제제(들) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적 활성화 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 기존 매질 또는 제제가 활성 화합물과 맞지 않는 경우를 제외하고, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예로 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예컨대, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 주사를 위한 물과 같은 멸균 희석제, 염 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 아황산수소 나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염과 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 강장조정제. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만든 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알에 담을 수 있다.
주사 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사 용액의 즉석 제조 또는 분산을 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모퍼(Cremophor) ELTM(BASF, 파시패니, 뉴저지) 또는 인산완충생리식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 무균이어야 하고 주사가 쉬울 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정해야 하고 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산인 경우 필요한 입자 크기 유지, 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등으로 달성할 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당류, 만니톨과 같은 폴리알코올, 솔비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 달성할 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요한 경우 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시키고 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을 기본 분산 매체와 상기 열거된 것들에서 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 원하는 임의의 부가 성분의 분말을 미리 멸균-여과한 이의 용액으로부터 진공 건조 및 동결-건조로 수득하는 것이다.
경구용 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 담거나 정제으로 압축시킬 수 있다. 경구 요법 투여 목적을 위해, 활성 화합물을 부형제와 함께 혼입시키고 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용할 수 있다. 경구용 조성물은 또한 구강세척의 용도를 위해 유동성 담체를 사용하여 제조할 수 있고, 여기서 유동성 담체 내 화합물은 경구적으로 적용되고 헹구고 뱉어지거나 삼켜질 수 있다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 임의의 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정 셀룰로스, 검 트라가칸스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로티스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화 규소와 같은 유동화제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸살리실산염 또는 오렌지 착향료와 같은 향미제.
흡입 투여를 위해, 화합물은 적합한 압축가스, 예를 들어, 이산화탄소를 함유하는 압력 용기 또는 디스펜서에서 에어로졸 스프레이 또는 네뷸라이저 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피적 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위한 세제, 담즙염 및 푸시딘산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 코분무기 또는 좌약을 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물을 당해 분야에 일반적으로 알려진 바와 같은 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화한다.
화합물은 직장 전달을 위해 좌약(예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 기존 좌약 베이스와 함께) 또는 지연 관장제로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 조절제는 이식 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터의 빠른 소거에서 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세트산염, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 고분자가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백해야 한다. 또한 상기 재료들은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals 주식회사로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단클론성 항체와 함께 감염된 세포에 표적화된 리포솜을 포함)은 약제학적으로 허용 가능한 담체로도 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 알려진 방법, 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 투여량 단위의 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용된 투여량 단위는 투여될 대상체를 위한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 투여량 단위 형태에 대한 사항은 활성 화합물의 독특한 특성, 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야의 고유 제한에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 예를 들어, LD50(집단의 50% 치사 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 투여량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 따라 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이고 이는 비율 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 갖는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포의 잠재적 손상을 최소화하기 위해 감염된 조직 부위로 화합물을 표적화하여 부작용을 줄이는 전달 시스템의 설계에 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위해 투여량의 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 적은 독성을 갖거나 독성없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 적용된 투약 형태 및 활용된 투여 경로에 따른 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법에 사용된 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 것과 같은 IC50(즉, 증상의 절반-최대 저해를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 일회량이 동물 모델에 처방될 수 있다. 이러한 정보는 인간에 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피로 측정할 수 있다.
상기 기재된 조절제는 상기 제제를 암호화하는 발현가능한 핵산의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 핵산 및 이를 함유하는 조성물 또한 본 개시내용에 의해 포괄된다. 예를 들어, 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산 분자를 벡터에 삽입하여 유전자 요법 벡터로 사용할 수 있다. 유전자 요법 벡터는, 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여(미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 정위 주사(예컨대, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 참조)로 대상체에 전달할 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약제학적 제제는 허용가능한 희석제 내 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 비히클이 매립된 서방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포로부터 온전히 생산될 수 있는 경우, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서 내에 포함될 수 있다.
VIII. 제제의 투여
본 개시내용에 의해 포괄되는 면역 조절제는 면역 세포 매개 면역 반응을 증가 또는 억제하기 위해 생체 내 약제학적 투여에 적합하고 생물학적으로 적합한 형태로 대상체에 투여된다. "생체 내 투여에 적합하고 생물학적으로 적합한 형태"는 임의의 독성 효과가 단백질의 치료 효과보다 중요한 투여되는 단백질의 형태를 의미한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제의 투여는 치료적 활성량의 제제를 단독으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 포함하는 임의의 약제학적 형태일 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 치료용 조성물의 치료적 활성량의 투여는 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간에 대해 효과적인 양으로 정의된다. 예를 들어, 제제의 치료적 활성량은 질환의 상태, 개체의 연령, 성별 및 무게, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 펩타이드의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투약 요법은 최적 치료적 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러 분할 투여량을 매일 투여하거나 투여량을 치료 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 제제는 주사(피하, 정맥내 등), 경구 투여, 흡입, 경피 적용 또는 직장 투여와 같은 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 화합물을 불활성화할 수 있는 효소, 산 및 기타 천연 상태의 작용으로부터 화합물을 보호하는 재료로 활성 화합물을 코팅할 수 있다. 예를 들어, 비경구적 투여와는 다르게 제제를 투여하기 위해, 제제의 불활성화를 막는 재료와 함께 제제를 코팅하거나, 이 재료와 함께 공동투여하는 것이 바람직할 수 있다.
제제는 적절한 담체, 희석제 또는 보조제에 존재하는 상태로 개체에 투여될 수 있거나, 효소 저해제와 함께 또는 리포솜과 같은 적절한 담체에 존재하는 상태로 공동투여될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 희석제는 염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 보조제는 가장 넓은 의미로 사용되며 인터페론과 같은 임의의 면역 자극 화합물을 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 보조제는 레조르시놀, 폴리옥시에틸렌 올레일 에터 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에터와 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 효소 저해제는 췌장 트립신 저해제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트(DEEP) 및 트라시롤을 포함한다. 수중-유중-수 에멀션뿐만 아니라 기존 리포솜을 포함한다(Sterna et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
분산물은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 내에, 및 오일 내에 분산시켜 제조할 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 차단하는 방부제를 함유할 수 있다.
주사 용도에 적합한 제제의 약제학적 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위해 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서 조성물은 바람직하게는 무균이고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 바람직하게는 제조 및 보관 조건에서 안정하고 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산물인 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용으로 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등으로 달성할 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당류, 만니톨과 같은 폴리알코올, 솔비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 달성할 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요한 경우 위에서 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 본 개시내용에 의해 포괄되는 제제(예컨대, 항체, 펩타이드, 융합 단백질 또는 소분자)를 혼입시키고 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을 기본 분산 매체와 상기 열거된 것들에서 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 제제와 원하는 임의의 부가 성분의 분말을 미리 멸균-여과한 이의 용액으로부터 진공 건조 및 동결-건조로 수득하는 것이다.
위에서 기재된 바와 같이, 제제가 적절하게 보호될 때, 단백질은, 예를 들어, 비활성 희석제 또는 융합가능한 식용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매제, 코팅제, 항생제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 기존 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구적 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 "투여량 단위 형태"는 치료할 포유동물 대상체를 위한 단위의 투여량으로써 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 투여량 단위 형태에 대한 사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체의 민감도 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야의 고유 제한에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 제제는 항체이다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 항체의 치료적 유효량(즉, 유효적 투여량)은 약 0.001 내지 100㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 약 0.01 내지 25㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 20㎎/㎏ 체중, 및 보다 바람직하게는 약 1 내지 10㎎/㎏, 2 내지 9㎎/㎏, 3 내지 8㎎/㎏, 4 내지 7㎎/㎏ 또는 5 내지 6㎎/㎏ 체중의 범위이다. 당업자라면 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이로 제한되지는 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 항체의 치료적 유효량으로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예시에서, 대상체는 약 0.1 내지 20㎎/㎏ 체중 사이 범위에서, 약 1 내지 10주 사이, 바람직하게는 2 내지 8주 사이, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주 사이, 보다 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안의 주당 1회 항체로 치료된다. 또한 치료에 사용되는 항체의 유효 투여량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있다고 인식될 것이다. 진단 분석 결과로 인해 투여량이 변화할 수 있다.
위에서 기재된 바와 같이, 몇몇 실시형태에서, 투여용 제제는 세포-기반이다. 세포-기반 제제는 대상 숙주에 대한 면역적합성 관계를 가지며 임의의 이러한 관계가 본 개시내용에 따른 사용을 위해 고려된다. 예를 들어, 입양 T 세포와 같은 세포는 동계유전적일 수 있다. 용어 "동계유전적"은, 특히 항원 또는 면역학적 반응에 관해, 유전적으로 동일한 같은 종으로부터 유래된 상태, 같은 종에서 기원된 상태, 또는 같은 종의 구성원이 되는 상태를 지칭할 수 있다. 이는 일치하는 MHC 유형을 갖는 같은 쌍을 포함한다. 따라서, "동계유전적 이식"은 세포를 공여체로부터 공여체와 유전적으로 동일하거나 원치않는 유해한 면역원성 반응(예컨대, 본 명세서에 기재된 면역학적 스크린 결과의 해석에 반하는 것) 없이 이식이 가능하도록 충분히 면역학적으로 적합한 수용체에게 전이시키는 것을 지칭한다.
세포를 같은 대상체로부터 얻어 같은 대상체에 이식한 경우 동계유전적 이식은 "자가"일 수 있다. "자가 이식"은 대상 자신의 세포 또는 기관의 수집 및 재주입 또는 이식을 지칭한다. 자가 세포의 배타적 또는 보충적 사용은 세포를 숙주에 되돌리는 투여의 많은 유해한 효과, 특히 이식 편대 숙주 반응을 배제하거나 감소시킬 수 있다.
같은 종의 다른 구성원이지만 유해한 면역원성 반응을 피하는 충분히 일치된 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원을 갖는 구성원으로부터 세포를 얻어 이식하는 경우 동계유전적 이식은 "일치된 동종이계적"일 수 있다. MHC 불일치의 정도를 결정하는 것은 당해 분야에 알려지고 사용되는 표준 시험에 따라 달성할 수 있다. 예를 들어, 이식 생물학에서 중요한 것으로 확인된 인간의 적어도 6개의 주요 MHC 유전자 카테고리가 있다. HLA-A, HLA-B, HLA-C는 HLA 클래스 I 단백질을 암호화하는 반면 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP는 HLA 클래스 II 단백질을 암호화한다. 다수의 HLA 대립유전자 또는 변이체가 인간 개체군에서 발견되고 개체 사이의 이들 군의 차이점이 이식된 세포에 대한 면역 반응의 강도와 관련이 있는 것과 같이, 이들 각 군 내의 유전자는 고도로 다형성이다. MHC 일치 정도를 결정하는 표준 방법은 HLA-B 및　HLA-DR, 또는 HLA-A, HLA-B 및　HLA-DR 군 내의 대립유전자를 검사하는 것이다. 따라서, 시험은 2 또는 3의 HLA 군 내에 각각 적어도 4, 심지어는 5 또는 6의 MHC 항원으로 이루어질 수 있다. 혈청학적 MHC 검사에서, 항체와 반응하는 특정 MHC 항원의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 각 HLA 항원 유형에 대한 항체를 하나의 대상(예컨대, 공여체)의 세포와 반응시킨다. 이것은 다른 대상(예컨대, 수용체)의 반응성 프로파일과 비교된다. MHC 항원과 항체의 반응은 전형적으로 항체를 세포와 세포 용해를 유도하기 위해 첨가하는 보충물과 항온처리하는 방법(즉, 림프구독성 시험)으로 결정된다. 이 반응을 시험하고 반응에서 용해된 세포의 양에 따라 등급화한다(예컨대, 문헌[Mickelson and Petersdorf (1999)　Hematopoietic Cell Transplantation, Thomas, E. D. et al. eds., pg 28-37, Blackwell Scientific, Malden, Mass.] 참조). 다른 세포-기반 분석은 표지된 항체를 사용한 유세포분석 또는 효소 연결 면역분석(ELISA)를 포함한다. MHC 유형을 결정하기 위한 분자적 방법이 잘 알려져 있으며 일반적으로 HLA 단백질을 암호화하는 특이적 유전자 서열을 검출하기 위한 합성 프로브 및/또는 프라이머를 사용한다. 특정 HLA 유형과 관련된 제한효소 단편 길이 다형성을 검출하기 위한 혼성화 프로브로 합성 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다(Vaughn (2002)　Method. Mol. Biol. MHC Protocol.　210:45-60). 대안적으로, HLA 서열을 증폭하기 위해(예컨대, 중합효소 연쇄 반응 또는 결찰 연쇄 반응으로) 프라이머가 사용될 수 있고, 이의 산물을 직접적인 DNA 시퀀싱, 제한효소 단편 다형성 분석(RFLP) 또는 일련의 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머(SSOP)와 혼성화되는 것으로 추가 시험할 수 있다(Petersdorf et al. (1998)　Blood　92:3515-3520; Morishima et al. (2002)　Blood 99:4200-4206; 및 Middleton and　Williams (2002)　Method. Mol. Biol. MHC Protocol.　210:67-112).
이식되는 세포와 대상체의 세포의 정의된 좌위(전형적으로 근친교배에 의한 단일 좌위와 같이)가 다른 경우, 동계유전적 이식은 "유사유전적(congenic)"일 수 있다. 용어 "유사유전적"은 같은 종으로부터 유래하는 것, 같은 종에서 기원되는 것, 또는 같은 종의 구성원이 되는 것을 지칭하며, 여기서 구성원은 작은 유전적 영역, 전형적으로 단일 유전적 좌위(즉, 단일 유전자)를 제외하고 유전적으로 동일하다. "유사유전적 이식"은 세포 또는 기관을 공여체로부터 단일 유전적 좌위를 제외하고 공여체와 유전적으로 동일한 수용체에 전이시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, CD45는 여러 대립유전적 형태에 존재하며 CD45.1 또는 CD45.2 대립유전자 버전이 발현되는지가 다른 유사유전적 마우스주가 존재한다.
반대로, "불일치 동종이계적"은 전형적으로 유해한 면역원성 반응을 배제하기에 충분한 정의된 MHC 항원 수의 혈청학적 또는 분자적 분석과 같은 당해 분야에 사용되는 표준 분석법으로 결정되는 것으로서 동일하지 않은 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원(즉, 단백질)을 갖는 같은 종으로부터 유래되는 것, 같은 종에서 기원되는 것, 또는 같은 종의 구성원이 되는 것을 지칭한다. "부분적 불일치"는 구성원들 사이, 전형적으로 공여체와 수용체의 사이에 시험된 MHC 항원의 부분적 일치를 지칭한다. 예를 들어, "절반 불일치"는 시험된 MHC 항원의 50%가 두 구성원 사이에 다른 MHC 항원 유형을 보이는 것을 지칭한다. "전체" 또는 "완전" 불일치는 시험된 모든 MHC 항원이 두 구성원 사이에서 다른 것을 지칭한다.
유사하게, 대조적으로, "이종"은 다른 종으로부터 유래되는 것, 다른 종에서 기원되는 것, 또는 다른 종의 구성원이 되는 것, 예를 들어, 인간과 설치류, 인간과 돼지, 인간과 침팬지 등을 지칭한다. "이종 이식"은 세포 또는 기관을 공여체로부터 공여체와 다른 종의 수용체에 전이시키는 것을 지칭한다.
추가로, 세포는 단일 근원 또는 복수의 근원으로부터(예컨대, 단일 대상 또는 복수의 대상체로부터) 얻을 수 있다. 복수는 적어도 둘(예컨대, 하나를 초과)을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 비-인간 포유동물은 마우스이다. 관심대상 세포 유형이 얻어지는 동물은 성체, 신생체(예컨대, 48시간 령 미만), 미성숙체 또는 자궁내 개체일 수 있다. 관심대상 세포 유형은 원발 암세포, 암 줄기세포, 확립된 암 세포주, 불멸화 원발 암세포 등일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 숙주 대상체의 면역 체계는 이식되는 암세포에 면역학적으로 적합하도록 조작되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 인간 암세포에 적합하도록 하기 위해 대상체를 "인간화"할 수 있다. 용어 "면역-시스템 인간화"는 숙주 동물로부터 거부당하지 않고 생존하여, 인간 조혈 및 숙주 동물의 후천적 및 선천적 면역성이 재구성되도록 하는, 인간 HSC 계통 세포 및 인간 후천성 및 선천성 면역 세포를 포함하는 마우스와 같은 동물을 지칭한다. 후천성 면역 세포는 T 세포 및 B 세포를 포함한다. 선천성 면역 세포는 대식세포, 과립구(호염구, 호산구, 호중구), DC, NK 세포 및 비만세포를 포함한다. 대표적인, 비제한적 예로 SCID-hu, Hu-PBL-SCID, Hu-SRC-SCID, NSG(NOD-SCID IL2r-감마(널(null)) 결핍 선천적 면역 체계, B 세포, T 세포 및 사이토카인 신호전달), NOG(NOD-SCID IL2r-감마(절단됨(truncated))), BRG(BALB/c-Rag2(널)IL2r-감마(널)), 및 H2dRG(Stock-H2d-Rag2(널)IL2r-감마(널)) 마우스(예컨대, 문헌[Shultz et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:118; Pearson et al. (2008) Curr. Protocol. Immunol. 15:21; Brehm et al. (2010) Clin. Immunol. 135:84-98; McCune et al. (1988) Science 241:1632-1639], 미국 특허 제7,960,175호, 및 미국 공개 특허 제2006/0161996호 참조)뿐만 아니라, Rag1(B 및 T 세포 결핍), Rag2(B 및 T 세포 결핍), TCR 알파(T 세포 결핍), 퍼포린(세포 독성 기능 결핍 cD8+ T 세포), FoxP3(기능성 CD4+ T 조절 세포 결핍), IL2rg, 또는 Prfl과 같은 면역-관련 유전자 관련 널 돌연변이뿐만 아니라, 인간 면역 세포의 효과적인 생착을 가능하게 하고/하거나 마우스와 같은 면역저하 동물의 구획-특이적 모델을 제공하는 HHLA2, KIR3DL3, TMIGD2, PD-1, PD-L1, Tim3, 및/또는 2B4의 돌연변이 또는 넉아웃(예컨대, PCT 공개 WO2013/062134 참조)이 포함된다. 추가로, NSG-CD34+(NOD-SCID IL2r-감마(널) CD34+) 인간화 마우스가 마우스와 같은 동물 모델에서 인간 유전자 및 종양 활성을 연구하는데 유용하다.
본 명세서에 사용된, 생물학적 재료 근원으로부터 "얻어진"은 공여체로부터 생물학적 재료의 근원을 수집하거나 분할하는 임의의 기존 방법을 의미한다. 예를 들어, 생물학적 재료는 고형 종양, 말초 혈액 또는 제대혈 샘플과 같은 혈액 샘플, 또는 골수 또는 양수와 같은 다른 체액으로부터 얻을 수 있다. 이러한 샘플을 얻는 방법은 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 개시내용에서, 샘플은 신선한 것(즉, 얼리지 않고 공여체로부터 얻은 것)일 수 있다. 또한, 샘플은 추가로 확장 전에 관련없거나 원치않는 성분이 제거되도록 처리된 것일 수 있다. 샘플은 또한 보관된 스톡에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 세포주 또는 말초 혈액 또는 제대혈과 같은 체액의 경우, 샘플을 이러한 세포주 또는 체액의 극저온 또는 다르게 보관된 은행으로부터 회수할 수 있다. 이러한 샘플은 임의의 적합한 공여체로부터 얻을 수 있다.
얻어진 세포 집단은 바로 사용하거나 나중에 사용하기 위해 냉동할 수 있다. 냉동 보존을 위한 다양한 배지 및 프로토콜이 당해 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 동결 배지는 약 5 내지 10%의 DMSO, 10 내지 90%의 혈청 알부민 및 50 내지 90%의 배양 배지를 포함한다. 세포를 냉동하는데 유용한 다른 첨가물로, 예시이며 제한하는 것은 아닌, 트레할로스와 같은 이당류(Scheinkoniget al. (2004) Bone Marrow Transplant.　34:531-536), 또는 헤타스타치(즉, 하이드록시에틸 전분)와 같은 혈장증량제가 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 인산염 완충 식염수와 같은 등장 완충 용액이 사용될 수 있다. 예시적인 냉동보존 조성물은 4% HSA, 7.5% 다이메틸 술폭시드(DMSO) 및 2% 헤타스타치를 함유하는 세포-배양 배지를 갖는다. 냉동보존을 위한 다른 조성물 및 방법이 당해 분야에 잘 알려져 있고 기재되어 있다(예컨대, 문헌[Broxmeyer et al. (2003)　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:645-650] 참조). 세포는 약 -135℃의 최종 온도에서 보관된다.
세포는 0.1×106, 0.2×106, 0.3×106, 0.4×106, 0.5×106, 0.6×106, 0.7×106, 0.8×106, 0.9×106, 1.0×106, 5.0×106, 1.0×107, 5.0×107, 1.0×108, 5.0×108, 또는 그 이상, 또는 사이의 임의의 범위 또는 사이의 임의의 값, 세포/대상 체중 킬로그램으로 투여될 수 있다. 이식되는 세포의 수는 주어진 시간 내 원하는 생착 수준을 기반으로 조정될 수 있다. 일반적으로, 1×105 내지 약 1×109　세포/체중kg, 약 1×106 내지 약 1×108　세포/체중kg 또는 약 1×107　세포/체중kg, 또는 필요에 따라 그 이상의 세포를 이식할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 평균 크기 마우스에 대해 적어도 약 0.1×106, 0.5×106, 1.0×106, 2.0×106, 3.0×106, 4.0×106 또는 5.0×106 총 세포의 이식이 효과적이다.
세포는 또한 다른 항암제 전에, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다.
위에서 기재된 바와 같이, 세포와 같은 제제의 투여는, 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척추내, 흉골내, 관절내, 활액내, 초내, 동맥내, 심장내 또는 근육내, 정맥내, 피하, 특정 조직(예컨대, 초점 이식), 대퇴골수강, 비장, 태아간의 신장 캡슐 등에 의한 투여를 비롯하여 당해 분야에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 달성할 수 있다.
이식된 세포의 생착은 종양 부피, 사이토카인 수준, 투여 시간, 이식 후 하나 이상의 시점에 대상체로부터 얻은 관심대상 세포의 유세포분석 등과 같지만 이로 제한되지 않는, 임의의 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28일을 기다리는 시간-기반 분석은 종양 수확 시간을 신호화할 수 있다. 임의의 이러한 메트릭스는 항암 면역요법에 대한 반응 상의 변수의 효과를 결정하기 위한 잘 알려진 파라미터에 따라 조정될 수 있는 변수이다. 추가로, 이식되는 세포는 사이토카인, 세포외 매트릭스, 세포 배양 지지체 등과 같은 다른 제제와 공동-이식될 수 있다.
IX. 대상체
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용(예컨대, 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편)이 요법 또는 면역조절에 사용되는 대상체는 포유동물(예컨대, 마우스, 인간화 마우스, 래트, 영장류, 인간이 아닌 포유동물, 가축, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말 등)이고, 바람직하게는 인간이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 암의 동물 모델이다. 예를 들어, 동물 모델은 인간 유래 암의 동소적 이종이식 동물 모델일 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 방법의 다른 실시형태에서, 대상체는 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 항-면역관문 요법과 같은 치료를 받지 않은 대상체이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 항-면역관문 요법과 같은 치료를 받은 대상체이다.
소정의 실시형태에서, 대상체는 암 또는 전-암성 조직 제거 수술을 받은 대상체이다. 다른 실시형태에서, 암성 조직은 제거되지 않고, 예를 들어, 암성 조직은 생명에 필수적인 조직 내 또는 수술 절차가 환자에 상당한 해칠 끼칠 위험이 있는 영역과 같은 신체의 수술 불가 영역에 위치할 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 방법은 KIR3DL3 요법에 대한 반응성을 결정하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 대상체의 많은 다른 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
X. 샘플 수집, 준비 및 분리
몇몇 실시형태에서, 대상체로부터의 샘플 내 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)을 미리 결정된 대조군(표준) 샘플과 비교한다. 대상체로부터의 샘플은 전형적으로 암세포 또는 조직과 같은 질환 조직으로부터의 것이다. 대조군 샘플은 같은 대상체로부터의 것 또는 다른 대상체로부터의 것일 수 있다. 대조군 샘플은 전형적으로 정상의, 비-질환 샘플이다. 하지만, 질환의 단계 결정 또는 치료 효능 평가를 위한 경우와 같은, 몇몇 실시형태에서, 대조군 샘플은 질환 조직으로부터의 것일 수 있다. 대조군 샘플은 다수의 다른 대상체로부터의 샘플의 조합일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체로부터의 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)를 미리 결정된 수준과 비교할 수 있다. 이 미리 결정된 수준은 전형적으로 정상 샘플로부터 얻어진다. 본 명세서에 기재된, "미리 결정된" 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)은, 단지 예로, 치료를 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가하기 위해(예컨대, 게놈 돌연변이 수 및/또는 DNA 복구 유전자의 비-기능적 단백질을 유발하는 게놈 돌연변이 수 기반), 항-KIR3DL3 항체 요법에 대한 반응을 평가하기 위해, 및/또는 추가적인 항암 요법과 병행하는 항-KIR3DL3 항체 요법에 대한 반응을 평가하기 위해 사용되는 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)일 수 있다. 미리-결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정치(들)는 암을 갖는 또는 갖지 않는 환자의 집단에서 결정될 수 있다. 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)는, 모든 환자에 동등하게 적용가능한, 단수일 수 있거나, 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)는 환자의 특정 하위 집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 키 및 다른 요인이 개체의 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)에 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성은 각 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정 및/또는 비교되는 양은 절대 측정치를 기반으로 한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정 및/또는 비교되는 양은 비율(예컨대, 치료 전 대 치료 후의 바이오마커 카피 수, 수준, 및/또는 활성, 스파이크 또는 인공 대조군에 상대적인 이러한 바이오마커의 측정치, 하우스키핑 유전자의 발현에 상대적인 이러한 바이오마커의 측정치 등)과 같은 상대적인 측정치를 기반으로 한다. 예를 들어, 상대적인 분석은 처리-전 바이오마커 측정치를 처리-후 바이오마커 측정치와 비교한 비율을 기반으로 할 수 있다. 처리-전 바이오마커 측정치는 항암 요법의 개시 전 임의의 시간에 만들어진 것일 수 있다. 처리-후 바이오마커 측정치는 항암 요법의 개시 이후 임의의 시간에 만들어진 것일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 처리-후 바이오마커 측정치는 항암 요법의 개시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20주 또는 그 이상 후(지속적인 모니터링을 위해 무기한으로 더 길어질 수 있음)에 만들어진 것이다. 치료는 하나 이상의 항-KIR3DL3 항체 단독 또는 다른 항암제, 예를 들어, 면역관문 저해제와의 조합을 포함하는 치료 요법과 같은 항암 요법을 포함할 수 있다.
미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)은 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)은 환자 선택을 위해 평가되는 같은 또는 다른 사람으로부터 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)은 같은 환자의 이전 평가로부터 얻을 수 있다. 이러한 방식에서, 환자 선택의 진행은 시간에 걸쳐 모니터될 수 있다. 추가로, 대상체가 인간인 경우, 대조군은 다른 사람 또는 여러 사람, 예를 들어, 선택된 인간 군의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식에서, 선택이 평가되는 인간의 선택 정도는 적합한 다른 인간, 예를 들어, 관심 인간과 유사한 입장에 처한 다른 인간, 예를 들어, 유사하거나 같은 병태(들)를 겪는 사람들 및/또는 같은 인종군과 비교될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 몇몇 실시형태에서 미리 결정된 수준에서 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치(들)의 변화는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 또는 5.0배 또는 그 이상, 또는 이들을 포함하는, 이들 사이의 임의의 범위이다. 처리-전 바이오마커 측정치를 처리-후 바이오마커 측정치와 비교한 비율을 기반으로 하는 것과 같이, 측정치가 상대적인 변화를 기반으로 하는 경우 이러한 컷오프 값은 동등하게 적용된다.
생물학적 샘플은 핵산 및/또는 단백질을 포함하는 체액 샘플, 세포 샘플 또는 조직 샘플을 포함하여 환자의 다양한 근원으로부터 수집될 수 있다. "체액"은 신체로부터 배설되거나 분비되는 액뿐만 아니라 일반적으로 그렇지 않은 액(예컨대, 양수, 수양액, 담즙, 혈액 및 혈장, 뇌척수액, 귀지 및 이구, 쿠퍼액 또는 사정전 액, 유미, 유미즙, 대변, 여성 사출액, 간질액, 세포내액, 림프, 생리, 모유, 점액, 흉막액, 고름, 타액, 피지, 정액, 혈청, 땀, 활액, 눈물, 소변, 질윤활액, 유리체액, 구토물)을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상 및/또는 대조군 샘플은 세포, 세포주, 조직학적 슬라이드, 파라핀 포매된 조직, 생검, 전혈, 유두 흡입물, 혈청, 혈장, 구강 스크레이프, 타액, 뇌척수액, 소변, 대변 및 골수로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 샘플은 혈청, 혈장 또는 소변이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 혈청이다.
샘플은 장시간에 걸쳐(예컨대, 일, 주, 월, 매년, 격년 등의 순서로 한번 이상) 반복적으로 개체로부터 수집될 수 있다. 시간에 걸쳐 개체로부터 다수의 시샘플를 얻는 것은 조기 검출로부터 결과를 확인하기 위해 및/또는, 예를 들어, 질환의 진행, 약물 치료 등의 결과로 인한 생물학적 패턴의 변화를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상 샘플은 본 개시내용에 따라 매달, 매 2달, 또는 1, 2 또는 3달 간격의 조합으로 취하고 모니터될 수 있다. 추가로, 시간에 걸쳐 얻어진 대상체의 바이오마커의 양 및/또는 활성 측정치는 모니터링 기간 동안 서로뿐만 아니라 정상 대조군의 것과 편리하게 비교될 수 있으며, 이에 따라 장기 모니터링을 위한 내부적, 또는 개인적, 대조군으로서 대상 자신의 값을 제공한다.
수집된 샘플의 유형 및/또는 바이오마커 측정치의 분석에 따라, 샘플 준비 및 분리에는 임의의 절차가 포함될 수 있다. 이러한 절차는, 단지 예시적으로, 농축, 희석, pH 조정, 고농도 폴리펩타이드의 제거(예컨대, 알부민, 감마 글로불린 및 트랜스페린 등), 보존제 및 교정제의 첨가, 단백질분해효소 저해제의 첨가, 변성제의 첨가, 샘플의 탈염, 및 샘플 단백질의 농축, 지질의 추출 및 정제를 포함한다.
샘플 준비는 또한 다른 단백질(예컨대, 담체 단백질)에 비-공유 복합으로 결합하는 분자를 분리할 수 있다. 이 과정은 특정 담체 단백질(예컨대, 알부민)에 결합한 분자를 분리하거나, 단백질 변성, 예를 들어, 산을 사용하고 담체 단백질을 제거하는 것을 통해 모든 담체 단백질로부터 결합 분자를 방출하는 것과 같은 보다 일반적인 과정을 사용할 수 있다.
샘플로부터 원치않는 단백질(예컨대, 고농도, 정보가 없는, 또는 검출할 수 없는 단백질)을 제거하는 것은 고 친화성 시약, 고분자량 필터, 초원심분리 및/또는 전기투석을 사용하여 달성될 수 있다. 고 친화성 시약은 고농도 단백질에 선택적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약(예컨대, 압타머)을 포함한다. 샘플 준비는 또한 이온 교환 크로마토그래피, 금속 이온 친화 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 흡착 크로마토그래피, 등전점 포커싱 및 관련 기술을 포함할 수 있다. 분자량 필터는 크기 및 분자량을 기반으로 분자를 나누는 막을 포함한다. 이러한 필터는 역삼투, 나노여과, 한외여과 및 마이크로여과를 추가로 사용할 수 있다.
초원심분리는 샘플에서 원치않는 폴리펩타이드를 제거하는 방법이다. 초원심분리는 입자의 침강을 광학 시스템으로 모니터링하면서 약 15,000 내지 60,000rpm으로 샘플을 원심분리하는 것이다. 전기투석은 잠재적 구배의 영향 하에서 이온이 반투막을 통해 하나의 용액에서 다른 용액으로 전이되는 방법에서 전기막 또는 반투막을 사용하는 방법이다. 전기투석에 사용되는 막은 양전하 또는 음전하를 갖는 이온을 선택적으로 운반하는 능력, 반대 전하의 이온을 거부하는 능력, 또는 종이 크기 및 전하를 기반으로 반투막을 통해 이동하는 것을 가능하게 하는 능력을 가질 수 있으므로, 이는 전기투석을 전해질의 농축, 제거 또는 분리에 유용하도록 만든다.
본 개시내용에서의 분리 및 정제는 (예컨대, 모세관 또는 칩 상에서의) 모세관 전기영동 또는 (예컨대, 모세관, 컬럼 또는 칩 상에서의) 크로마토그래피와 같은 당해 분야에 알려진 임의의 방법을 포함할 수 있다. 전기영동은 전기장의 영향 하에서 이온 분자를 분리하는데 사용될 수 있는 방법이다. 전기영동은 겔, 모세관 또는 칩 상의 마이크로채널에서 수행될 수 있다. 전기영동에 사용되는 겔의 예는 전분, 아크릴아마이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 아가로스 또는 이들의 조합을 포함한다. 겔은 가교, 세제 또는 변성제의 첨가, 효소, 항체(친화성 전기영동) 또는 기질(자이모그래피)의 고정화 및 pH 구배의 적용으로 변경될 수 있다. 전기영동에 사용되는 모세관의 예는 전기분무와 조화시킨 모세관을 포함한다.
모세관 전기영동(CE)은 복잡한 친수성 분자와 고하전된 용질을 분리하는데 바람직하다. CE 기술은 또한 미세유체칩 상에서도 구현될 수 있다. 사용하는 모세관 및 완충액의 유형에 따라, CE는 모세관 띠 전기영동(CZE), 모세관 등전 집중(CIEF), 모세관 등속전기영동(cITP) 및 모세관 전기크로마토그래피(CEC)와 같은 분리 기술로 나뉘어질 수 있다. 전기분무 이온화에 CE 기술을 결합한 실시형태는 휘발성 용액, 예를 들어, 휘발성 산 및/또는 염기와 알코올 또는 아세토나이트릴과 같은 유기물을 함유하는 수성 혼합물의 사용을 포함한다.
모세관 등속전기영동(cITP)은 분석물이 일정한 속도로 모세관을 통해 이동하지만 그럼에도 불구하고 각각의 이동성에 의해 분리되는 기술이다. 무용액 CE(FSCE)로도 알려진, 모세관 띠 전기영동(CZE)은 분자의 전하에 따라 결정되는 종들의 전기영동 이동성 및 종종 직접적으로 분자의 크기에 비례하는 이동 과정의 분자 조우 마찰 저항의 차이를 기반으로 한다. 모세관 등전 집중(CIEF)은 약-이온화 가능한 양쪽성 분자가 pH 구배 전기영동에 의해 분리될 수 있도록 한다. CEC는 전통적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 CE의 하이브리드 기술이다.
본 개시내용에 사용되는 분리 및 정제 기술들은 당해 분야에 알려진 임의의 크로마토그래피 방법을 포함한다. 크로마토그래피는 특정 분석물의 차별적인 흡착 및 용리 또는 이동상 및 고정상 사이의 분석물의 분할을 기반으로 할 수 있다. 크로마토그래피의 다른 예는 액체 크로마토그래피(LC), 가스 크로마토그래피(GC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
XI. 바이오마커 폴리펩타이드
본 개시내용에 의해 포괄되는 다른 양상은 바이오마커 단백질 및 이의 생물학적 활성 부분의 사용에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 마커에 상응하는 천연 폴리펩타이드는 세포 또는 조직 근원으로부터 표준 단백질 정제 기술을 사용한 적합한 정제 계획에 따라 단리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기술로 생산된다. 재조합 발현에 대안적으로, 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드는 표준 펩타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
바이오마커 폴리펩타이드의 생물학적 활성 부분은 전장 단백질보다 적은 아미노산을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 바이오마커 단백질 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하며, 전장 단백질에 상응하는 적어도 하나의 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 상응하는 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 단백질의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어, 10, 25, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산 길이의 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 단백질의 다른 영역이 제거된, 다른 생물학적 활성 부분이 재조합 기술로 제조될 수 있고, 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드의 천연 형태의 기능적 활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화되는 바이오마커 단백질의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 유용한 단백질은 이 서열 중 하나에 실질적으로(예컨대, 적어도 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일하며 자연적 대립유전자 변이 또는 돌연변이유발에 따라 아미노산 서열이 다르더라도 상응하는 천연-발생 단백질의 기능적 활성을 보유한다.
두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 백분율 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교를 위해 정렬한다(예컨대, 둘째 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 첫째 아미노산 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 첫째 서열의 위치를 상응하는 둘째 서열의 위치와 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 차지하는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 백분율 동일성은 서열을 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 #(예컨대, 겹치는 위치) ×100). 일 실시형태에서 두 서열은 같은 길이이다.
두 서열 사이의 백분율 동일성을 결정하는 것은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 두 서열을 비교하기 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직하지만 비제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 탐색은 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산 분자에 상동적인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 점수(score) = 100, 단어길이(wordlength) = 12로 수행할 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 본 개시내용에 의해 포괄되는 단백질 분자에 상동적인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교 목적의 갭화 정렬을 얻으려면, 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 갭화 BLAST를 이용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 분자 사이의 관계를 검출하는 반복 탐색 수행을 위해 사용할 수 있다. BLAST, 갭화 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 서열의 비교에 유용한 수학적 알고리즘의 바람직하지만 비제한적인 예는 문헌[Myers and Miller, (1988) Comput Appl Biosci, 4:11-7]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 부분인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 포함한다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용할 수 있다. 국소 서열 유사성 및 정렬의 영역을 확인하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]에 기재된 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리즘을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표를 예를 들어, 2의 k-투플 값과 함께 사용할 수 있다.
두 서열 사이의 백분율 동일성은, 갭을 허용하거나 허용하지 않고, 상기 기재된 것들과 유사한 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 백분율 동일성 계산에서, 정확하게 일치하는 것 만이 계산된다.
본 개시내용은 또한 바이오마커 단백질에 상응하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종 폴리펩타이드(즉, 마커에 상응하는 폴리펩타이드와 다른 폴리펩타이드)에 작동 가능하게 연결된 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부(바람직하게는 생물학적 활성 부분)를 포함한다. 융합 단백질에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드와 이종 폴리펩타이드가 서로 인-프레임 융합됨을 나타내기 위한 것이다. 이종 폴리펩타이드는 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카복시-말단에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드가 GST 서열의 카복시 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 본 개시내용에 의해 포괄되는 재조합 폴리펩타이드의 정제를 촉진할 수 있다.
다른 실시형태에서, 융합 단백질은 이종 신호 서열, 면역글로불린 융합 단백질, 독소 또는 다른 유용한 단백질 서열을 포함한다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 키메라 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 기존 기술로 합성할 수 있다. 대안적으로, 후속으로 키메라 유전자 서열을 생성하기 위한 어닐링 및 재-증폭을 할 수 있는 두 연속 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있다(예컨대, 문헌[Ausubel et al., 상기 참조] 참조). 또한, 이미 융합 모이어티(예컨대, GST 폴리펩타이드)를 암호화하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 이러한 융합 모이어티가 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드에 인-프레임 연결되도록 이러한 발현 벡터에 클론화할 수 있다.
신호 서열은 분비 단백질 또는 다른 관심대상 단백질의 분비 및 단리를 촉진하기 위해 사용할 수 있다. 신호 서열은 전형적으로 하나 이상의 절단 발생에서 분비되는 동안 일반적으로 성숙 단백질로부터 절단되는 소수성 아미노산 코어로 특징지어진다. 이러한 신호 펩타이드는 분비 경로를 통해 통과될 때 성숙 단백질로부터 신호 서열이 절단되도록 하는 작용 부위를 함유한다. 따라서, 본 개시내용은 신호 서열을 갖는 기재된 폴리펩타이드뿐만 아니라 신호 서열이 단백질분해적으로 절단된 폴리펩타이드(즉, 절단 산물)에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 보통은 분비되지 않거나 단리하기 어려운 단백질과 같은 관심대상 단백질의 발현 벡터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어, 발현 벡터로 형질전환된 진핵 숙주로부터 단백질의 분비를 유도하고, 신호 서열은 후속하여 또는 동시에 절단된다. 이어서, 단백질은 당업계에서 인정된 방법으로 세포 외 배지로부터 쉽게 정제할 수 있다. 대안적으로, GST 도메인과 같은 정제를 촉진하는 서열을 사용하여 신호 서열을 관심대상 단백질에 연결할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 바이오마커 폴리펩타이드의 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 작용제(모방체) 또는 길항제로 기능할 수 있는 샘플된 아미노산 서열을 갖는다. 변이체는 돌연변이유발, 예를 들어, 불연속 점 돌연변이 또는 결절로 생성할 수 있다. 작용제는 천연 발생 단백질 형태의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 일부의 활성을 보유한다. 단백질 길항제는, 예를 들어, 관심대상 단백질을 포함하는 세포 신호전달 캐스케이드의 하류 또는 상류 구성원에 경쟁적 결합하여 자연 발생 단백질 형태의 하나 이상의 활성을 저해할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과를 제한된 기능의 변이체 처리로 유도할 수 있다. 단백질의 천연 발생 형태의 생물학적 활성의 일부를 갖는 변이체로 대상체를 치료하는 것은 단백질의 천연 발생 형태로 치료하는 것에 비해 대상체의 부작용을 더 적게 할 수 있다.
작용제(모방체) 또는 길항제로 기능하는 바이오마커 단백질의 변이체는 작용제 또는 길항제 활성을 위한 본 개시내용에 의해 포괄되는 단백질의 돌연변이체, 예를 들어, 결절 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝하여 확인할 수 있다. 일 실시형태에서, 다양화된 변이체 라이브러리는 핵산 수준의 조합적 돌연변이유발로 생성하며, 다양화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 다양화된 변이체 라이브러리는, 예를 들어, 잠재적 단백질 서열의 디제너레이트 세트(degenerate set)가 (예컨대, 파지 디스플레이를 위해) 개별 폴리펩타이드, 또는 대안적으로 더 큰 융합 단백질로서 발현될 수 있는 유전자 서열에 합성 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 효소적으로 접합하는 것으로 생성할 수 있다. 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드의 잠재적인 변이체 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 당해 분야에 알려져 있다(예컨대, 문헌[Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477] 참조).
추가로, 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 단편 라이브러리를 변이체의 스크리닝 및 후속 선별을 위한 폴리펩타이드의 다양화 집단을 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 암호화 서열 단편의 라이브러리는 관심대상 암호화 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 분자 당 약 1회의 니킹(nicking) 만이 발생하는 조건 하에서 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 다른 닉 생성물로부터의 센스/안티센스 페어를 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA의 형태로 DNA를 복원하고, S1 뉴클레아제 처리로 개질된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 결찰하여 생성할 수 있다. 이 방법에 의하면, 관심대상 단백질의 다양한 크기의 아미노 말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.
점 돌연변이 또는 결절로 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하고, 선택된 특성을 갖는 유전자 산물을 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 기술들이 당해 분야에 알려져 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술로, 높은 처리량 분석이 가능하며, 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 복제가능한 발현 벡터에 유전자 라이브러리를 클로닝하는 것, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환하는 것, 및 원하는 활성의 검출이 산물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 단리를 쉽게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현하는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 높이는 기술인, 순환 앙상블 돌연변이유발(REM)이 본 개시내용에 의해 포괄되는 단백질의 변이체를 확인하기 위한 스크리닝 분석법과 함께 조합으로 사용될 수 있다(Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327-331).
표 1에 열거된 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는, 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커에 상응하는 단리된 폴리펩타이드 또는 이의 단편(또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)은, 당해 분야에 잘 알려진 방법에 따른 다클론성 및 단클론성 항체 제조 표준 기술을 사용하여, 면역원에 결합하는 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 항원성 펩타이드는 적어도 8개의 아미노산 잔기를 포함하고 각각의 전장 분자에 존재하는 에피토프를 포함하여 펩타이드에 대한 항체가 각각의 전장 분자와 특이적 면역 복합체를 형성하도록 한다. 바람직하게는, 항원성 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 이러한 에피토프는 마우스 또는 인간과 같은 하나의 종으로부터의 주어진 폴리펩타이드 분자에 대해 특이적일 수 있다(즉, 종간에 보존되지 않은 폴리펩타이드 분자의 영역에 걸쳐 있는 항원성 펩타이드를 면역원으로 사용하고; 이러한 비 보존된 잔기는 본 명세서에 제공된 것과 같은 정렬을 사용하여 결정할 수 있다).
일 실시형태에서, 항체는 실질적으로 KIR3DL3에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 이의 HHLA2와의 상호작용을 가로막는 등에 의해 이의 기능을 저해 또는 차단한다.
예를 들어, 폴리펩타이드 면역원은 전형적으로 적합한 대상(예컨대, 토끼, 염소, 마우스, 인간화 마우스 또는 다른 포유동물)을 면역원으로 면역화하여 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어, 면역 반응을 생성하는 재조합 발현 또는 화학적으로 합성된 분자 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 제제는 프로인트의 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제, 또는 유사 면역자극 물질을 더 포함할 수 있다. 면역원성 제제로 적합한 대상체를 면역화하는 것은 여기에 함유된 항원성 펩타이드에 반응하는 다클론성 항체를 유도한다.
다클론성 항체는 위에서 설명한 바와 같이 폴리펩타이드 면역원으로 적합한 대상체를 면역화하여 제조할 수 있다. 면역화 대상체의 다클론성 항체 역가는 고정된 폴리펩타이드를 사용한 효소결합면역흡착분석법(ELISA)와 같은 표준 기술로 시간에 걸쳐 모니터할 수 있다. 원하는 경우, 항원에 대한 항체를 포유동물로부터(예컨대, 혈액으로부터) 단리할 수 있고 IgG 분획을 얻기 위해 단백질 A 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술로 추가 정제할 수 있다. 면역화 이후 적절한 시간에, 예를 들어, 항체 역가가 가장 높을 때, 항체-생산 세포를 대상체로부터 얻고 하이브리도마 기술(문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]에 최초로 기술됨)(또한 문헌[Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75] 참조), 보다 최근의 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기술(Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 또는 트라이오마 기술과 같은 표준 기술로 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 단클론성 항체 하이브리도마를 생산하는 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로 문헌[Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36] 참조). 간단히 설명하면, 불멸화 세포주(전형적으로 골수종)를 위에서 설명한 바와 같이 면역원으로 면역화한 포유동물로부터의 림프구(전형적으로 비장세포)와 융합하고, 폴리펩타이드 항원에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하기 위해 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 스크리닝한다. 몇몇 실시형태에서, 면역화는 (예컨대, 면역화 이전에 항원을 생산하지 않는) 관심 표적 항원의 넉아웃 세포 또는 동물 숙주에서 실시한다.
림프구와 불멸화 세포주의 융합에 사용되는 잘 알려진 많은 프로토콜 중 임의의 프로토콜이 표 1에 열거된 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커에 대한 단클론성 항체를 생성하기 위해 적용될 수 있다(예컨대, 문헌[Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. (1977) 상기 참조; Lerner (1981) 상기 참조; Kenneth (1980) 상기 참조] 참조). 또한, 당업자라면 이러한 유용한 방법의 다양한 변형이 있음을 인식할 것이다. 전형적으로, 불멸화 세포주(예컨대, 골수종 세포주)는 림프구와 같은 포유동물 종으로부터 유래하는 것이다. 예를 들어, 쥣과 하이브리도마는 본 개시내용에 의해 포괄되는 면역원성 제제로 면역화한 마우스로부터의 림프구를 불멸화 마우스 세포주와 융합하여 만들 수 있다. 바람직한 불멸화 세포주는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지("HAT 배지")에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 여러 골수종 세포주, 예를 들어, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주 중 임의의 세포주가 표준 기술에 따른 융합 상대로 사용될 수 있다. 이들 골수종 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, 메릴랜드주 록빌 소재)에서 이용가능하다. 전형적으로, 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 HAT-민감성 마우스 골수종 세포를 마우스 비장세포에 융합시킨다. 이어서, 융합되지 않고 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 죽이는 HAT 배지를 사용하여 융합으로 생성되는 하이브리도마 세포를 선별한다(융합되지 않은 비장세포는 형질전환되 않았기 때문에 몇일 후 죽는다). 본 개시내용에 의해 포괄되는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 예를 들어, 표준 ELISA 분석법을 사용하여 주어진 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 위한 하이브리도마 배양 상청액 스크리닝으로 검출된다.
단클론성 항체-분비 하이브리도마를 제조하기 위한 대안으로, 폴리펩타이드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 단리하기 위해 적절한 폴리펩타이드로 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예컨대, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 상기 기재된 폴리펩타이드 중 하나에 특이적인 단클론성를 확인 및 단리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 키트를 상업적으로 이용할 수 있다(예컨대, Pharmacia의 Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene의 SurfZAP TM Phage Display Kit, 카탈로그 번호 240612). 추가적으로, 특히 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는데 사용할 수 있는 방법 및 시약의 예는, 예를 들어, 문헌[Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호; Kang 등의 국제 공개 특허 제WO 92/18619호; Dower 등의 국제 공개 특허 제WO 91/17271호; Winter 등의 국제 공개 특허 제WO 92/20791호; Markland 등의 국제 공개 특허 제WO 92/15679호; Breitling 등의 국제 공개 특허 제WO 93/01288호; McCafferty 등의 국제 공개 특허 제WO 92/01047호; Garrard 등의 국제 공개 특허 제WO 92/09690호; Ladner 등의 국제 공개 특허 제WO 90/02809호; 문헌[Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; 및 McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554]에서 찾을 수 있다.
비-인간 또는 인간 항체(예컨대, 래트 항-마우스/항-인간 항체)의 구조적 특징은 KIR3DL3에 결합하는 것과 같은 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 연관된 인간 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 기능적 특성은 경쟁 ELISA 분석법에서 본래 알려진 비-인간 또는 인간 항체의 결합을 저해하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, KIR3DL3에 결합할 수 있고 리를 저해/차단할 수 있는 단클론성 항체가 제공되되, 해당 항체는 가변 도메인이 본 명세서에 나타낸 또는 공개적으로 이용 가능한 중쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함한다.
유사하게, KIR3DL3에 결합할 수 있고 이를 저해/차단할 수 있는 단클론성 항체가 또한 제공되되, 해당 항체는 가변 도메인이 본 명세서에 나타낸 또는 공개적으로 이용 가능한 경쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.
KIR3DL3에 결합할 수 있고 저해/차단할 수 있는 단클론성 항체가 또한 제공되되, 해당 항체는, 가변 도메인이 본 명세서에 나타낸 또는 공개적으로 이용 가능한 중쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고; 가변 도메인이 본 명세서에 나타낸 또는 공개적으로 이용 가능한 경쇄 가변 도메인 CDR의 군과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다.
당업자라면 이러한 백분율 상동성이 주어진 CDR 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 보존된 아미노산 치환의 도입과 동등하고 이로 달성될 수 있다는 것에 주목할 것이다.
추가적으로, 표 1에 열거된 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는, 본 개시내용에 의해 포괄되는 바이오마커에 대한 완전한 인간 항체가 만들어질 수 있다. 완전한 인간 항체는, 예를 들어, 문헌[Hogan, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manuel," Cold Spring Harbor Laboratory]에 따라, 인간 면역글로불린 유전자 트랜스제닉 마우스에서 만들어질 수 있다. 간단히 설명하면, 트랜스제닉 마우스를 정제된 면역원으로 면역화한다. 비장 세포를 수집하고 하이브리도마를 생산하기 위해 골수종 세포에 융합한다. 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 능력을 기반으로 하이브리도마를 선별한다. 완전한 인간 항체는 인간에서 면역원성을 감소시킬 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 단일 항체 폴리펩타이드 내에 2종의 다른 항원에 대한 결합 부위를 갖는다. 항원 결합은 동시 또는 순차적일 수 있다. 트라이오마 및 하이브리드 하이브리도마는 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 세포주의 예이다. 하이브리드 하이브리도마 또는 트라이오마에 의해 생산되는 이중특이적 항체의 예가 미국 특허 제4,474,893호에 개시되어 있다. 이중특이적 항체는 화학적 방법(Staerz et al. (1985) Nature 314:628, 및 Perez et al. (1985) Nature 316:354)과 하이브리도마 기술(Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, 및 Staerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241)로 제작되었다. 이중특이적 항체는 미국 특허 제5,959,084호에도 기재되어 있다. 이중특이적 항체의 단편은 미국 특허 제5,798,229호에 기재되어 있다.
또한, 하이브리도마 또는 다른 항체를 만드는 다른 세포를 융합하여 헤테로하이브리도마를 만든 다음 두 항체 모두를 생산하고 공동-조립하는 클론을 식별함으로써 이중특이적 물질이 생성될 수 있다. 이들은 또한 완전한 면역글로불린 사슬 또는 Fab 및 Fv 서열과 같은 이의 부분의 화학적 또는 유전적 접합에 의해 생성될 수 있다. 항체 성분은 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커의 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 이중특이적 항체는 폴리펩타이드 또는 이의 단편 및 이의 천연 결합 상대 또는 이의 단편 모두에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커의 활성에 대항하기 위해 펩타이드 또는 펩타이드 모방체가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 각각의 전장 단백질에 대한 조절 물질로 기능하는 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 변이체는 길항제 활성에 대한 돌연변이체, 예를 들어, 결절 돌연변이체의 조합 라이브러리 스크리닝으로 확인할 수 있다. 일 실시형태에서, 변이체의 다양화 라이브러리는 핵산 수준의 조합 돌연변이유발로 생성되고 다양화 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 변이체의 다양화 라이브러리는, 예를 들어, 잠재적 폴리펩타이드 서열의 디제너레이트 세트가 폴리펩타이드 서열의 세트를 함유하는 개별 폴리펩타이드로 발현될 수 있는 유전자 서열에 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 효소적으로 결찰하여 생산할 수 있다. 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 폴리펩타이드 변이체의 라이브러리를 생성하기 위해 사용할 수 있는 다양한 방법들이 있다. 자동화 DNA 합성기에서 디제너레이트 유전자 서열의 화학적 합성을 수행하고, 이어서, 합성 유전자를 적절한 발현 벡터에 결찰할 수 있다. 유전자 디제너레이트 세트를 사용하면 잠재적 폴리펩타이드 서열의 원하는 세트를 암호화하는 모든 서열을, 하나의 혼합물로, 제공할 수 있다. 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참조).
추가로, 주어진 폴리펩타이드의 변이체 스크리닝 및 후속 선별을 위한 폴리펩타이드 단편의 다양화 집단을 생성하기 위해 폴리펩타이드 암호화 서열의 단편 라이브러리가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 암호화 서열 단편의 라이브러리는 폴리펩타이드 당 약 한번만 니킹이 발생하는 조건 하에서 폴리펩타이드 암호화 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 다른 닉 산물로부터의 센스/안티센스 페어를 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA 형태로 DNA를 복원하고, S1 뉴클레아제를 처리하여 개질된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 결찰하여 생성할 수 있다. 이 방법에 의하면, 폴리펩타이드의 다양한 크기의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.
점 돌연변이 또는 결절로 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하고, 선택된 특성을 갖는 유전자 산물을 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 기술들이 당해 분야에 알려져 있다. 이러한 기술들은 폴리펩타이드의 조합 돌연변이유발로 생성되는 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합하다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술로, 높은 처리량 분석이 가능하며, 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 복제가능한 발현 벡터에 유전자 라이브러리를 클로닝하는 것, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환하는 것, 및 원하는 활성의 검출이 산물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 단리를 쉽게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현하는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 높이는 기술인, 순환 앙상블 돌연변이유발(REM)이 관심대상 변이체를 확인하기 위한 스크리닝 분석법과 함께 조합으로 사용될 수 있다(Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331). 일 실시형태에서, 다양화 폴리펩타이드 라이브러리를 분석하기 위해 세포 기반 분석을 활용할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터 라이브러리를 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커를 통상적으로 합성하는 세포주에 형질감염할 수 있다. 이어서, 형질감염된 세포를 배양하여 전장 폴리펩타이드 및 특정 돌연변이 폴리펩타이드가 생산되도록 하고 세포 상청액 내 전장 폴리펩타이드 활성 상 돌연변이의 발현 효과를, 예를 들어, 여러 기능적 분석법 중 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 이후 저해 또는 대안적으로 전장 폴리펩타이드 활성의 상승을 기록한 세포로부터 플라스미드 DNA를 회수하고, 개별 클론을 추가로 특징지을 수 있다.
보다 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산을 체계적으로 같은 유형의 D-아미노산으로 치환(예컨대, L-라이신의 위치에 D-라이신)하는 방법을 사용할 수 있다. 추가로, 관심대상 폴리펩타이드 아미노산 서열 또는 실질적으로 동일한 서열 변이를 포함하는 한정된 펩타이드는 당해 분야에 알려진 방법, 예를 들어, 펩타이드를 환형화하는 분자내 이황화 연결 형성이 가능하도록 내부 시스테인 잔기를 추가하여 생성할 수 있다(Rizo and Gierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387, 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
본 명세서에 기재된 아미노산 서열은 당업자가 펩타이드 서열에 상응하는 폴리펩타이드 및 이의 서열 변이체를 생산할 수 있도록 할 것이다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 종종 더 큰 폴리펩타이드의 일부로서 펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하여 이러한 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 대안적으로, 이러한 펩타이드는 화학적인 방법으로 합성할 수 있다. 재조합 숙주에서의 이종 단백질 발현, 폴리펩타이드의 화학적 합성, 및 시험관 내 번역을 위한 방법들이 당해 분야에 잘 알려져 있으며 문헌[Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; 및 Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing](이들 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)에도 기재되어 있다.
전형적으로 직접 화학적 합성으로 펩타이드를 생산할 수 있다. 펩타이드를 비펩타이드 모이어티가 N-말단 및/또는 C-말단에 공유 결합으로 부착된 변형 펩타이드로 생산할 수 있다. 특정 바람직한 실시형태에서, 카복시-말단 또는 아미노-말단 중 하나, 또는 모두가 화학적으로 변형된다. 가장 일반적인 말단 아미노 및 카복시 그룹의 변형은 각각 아세틸화 및 아마이드화이다. 아실화(예컨대, 아세틸화) 또는 알킬화(예컨대, 메틸화)와 같은 아미노-말단 변형 및 아마이드화와 같은 카복시-말단 변형뿐만 아니라, 환형화를 포함하는 다른 말단 변형이 본 개시내용에 의해 포괄되는 다양한 실시형태에 포함될 수 있다. 특정 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 변형 및/또는 코어 서열에 대한 펩타이드 확장은 안정성 향상, 잠재력 및/또는 효능 증가, 혈청 단백질분해효소에 대한 저항성, 원하는 약동학적 특성 등과 같은 유리한 물리적, 화학적, 생화학적 및 약리학적 특성을 제공할 수 있다. 본 명세서에 나타낸 펩타이드는, 예를 들어, 환자의 공동자극을 변화시켜 질환을 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다.
펩티도미메틱(문헌[Fauchere (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS p.392; 및 Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229], 이 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)은 일반적으로 컴퓨터 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 동등한 치료적 또는 예방적 효과를 위해 치료적으로 유용한 펩타이드에 구조적으로 유사한 펩타이드 미메틱을 사용할 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 패러다임 폴리펩타이드(즉, 생물학적 또는 약리적 활성을 갖는 폴리펩타이드)에 구조적으로 유사하지만, 당해 분야에 알려진, 추가로 다음의 참고문헌에 기재된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 연결로 선택적으로 치환된 하나 이상의 펩타이드 연결을 갖는다: 문헌[Spatola, A. F. in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins" Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (general review); Morley, J. S. (1980) Trends Pharm. Sci. pp. 463-468 (general review); Hudson, D. et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F. et al. (1986) Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M. (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314 (-CH-CH-, cis and trans); Almquist, R. G. et al. (190) J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C. et al. (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M. et al. European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)(-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W. et al. (1983) Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); 및 Hruby, V. J. (1982) Life Sci. (1982) 31:189-199 (-CH2-S-)]; 이들 각각 본 명세서에 참조에 의해 원용됨. 특히 바람직한 비-펩타이드 연결은 -CH2NH-이다. 이러한 펩타이드 미메틱은, 예를 들어, 보다 경제적인 생산, 우수한 화학적 안정성, 향상된 약리적 특성(반감기, 흡수, 잠재력, 효능 등), 변화된 특이성(예컨대, 광범위한 생물학적 활성), 감소된 항원성 등을 포함하는 폴리펩타이드 실시형태를 뛰어 넘는 상당한 이점을 가질 수 있다. 펩티도미메틱의 표지는 일반적으로 정량적 구조-활성 데이터 및/또는 분자 모델링을 통해 예측되는 펩티도미메틱 상의 비-간섭 위치(들)에 직접적 또는 스페이서(예컨대, 아마이드기)를 통해 하나 이상의 표지를 공유 부착하는 것을 포함한다. 이러한 비-간섭 위치는 일반적으로 펩티도미메틱이 치료 효과를 위해 결합하는 마크로폴리펩타이드(들)과 직접 접촉을 형성하지 않는 위치이다. 펩티도미메틱의 유도체화(예컨대, 표지)는 펩티도미메틱의 원하는 생물학적 또는 약리적 활성을 실질적으로 방해해서는 안된다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 또는 표 1에 열거된 바이오마커와 이의 천연 결합 상대 간의 상호작용을 조절(향상시키거나 저해)할 수 있는 소분자 또한 본 개시내용에 의해 포괄된다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 소분자는 공간적으로 지정가능한 병렬 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션이 필요한 합성 라이브러리 방법; '원-비드 원-컴파운드' 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리 방법(Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)을 포함하는 당해 분야에 알려진 조합 라이브러리 방법의 많은 접근법 중 임의의 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
분자 라이브러리의 합성 방법의 예는, 당해 분야에서, 예를 들어, 문헌[DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233]에서 찾을 수 있다.
화합물의 라이브러리는 용액 내에(예컨대, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), 또는 비드(Lam (1991) Nature 354:82-84), 칩(Fodor (1993) Nature 364:555-556), 박테리아(Ladner USP 5,223,409), 포자(Ladner USP '409), 플라스미드(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) 또는 파지(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; 상기 Ladner의 문헌) 상에 존재할 수 있다. 화합물은 세포 기반 또는 비-세포 기반 분석법으로 스크리닝할 수 있다. 화합물은 풀(예컨대, 각 시험 샘플 내 다수의 화합물)로 또는 개별 화합물로 스크리닝할 수 있다.
또한 본 발명은 표 1에 열거된 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 바이오마커의 키메라 또는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 각 바이오마커에 실질적으로 상동적이지 않은 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 다른 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결된, 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 융합 단백질은 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커 또는 이의 단편을 포함하는 본 개시내용에 의해 포괄되는 하나 이상의 바이오마커의 적어도 하나의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 융합 단백질에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 바이오마커 서열 및 비-바이오마커 서열이 융합과 독립적으로 발현될 때 나타나는 기능을 보존하는 방식으로 서로 인-프레임 융합됨을 나타내기 위한 것이다. "다른" 서열이 바이오마커 서열의 N-말단 또는 C-말단에 각각 융합될 수 있다.
이러한 융합 단백질은 제1 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 제2 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 재조합 발현으로 생산할 수 있다. 이 제2 펩타이드는 선택적으로 제1 펩타이드의 용해성, 친화성, 안정성 또는 원자가를 변경하는 모이어티, 예를 들어, 면역글로불린 불변 영역에 해당할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 제1 펩타이드는 생물학적 활성 분자의 일 부분(예컨대, 폴리펩타이드의 세포외 부분 또는 리간드 결합 부분)으로 이루어진다. 제2 펩타이드는 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어, 인간 Cγ1 도메인 또는 Cγ4 도메인(예컨대, 인간 IgCγ1 또는 인간 IgCγ4의 힌지, CH2 및 CH3 영역, 예를 들어, Capon et al. 미국 특허 제5,116,964호; 제5,580,756호; 제5,844,095호 등 참조, 이들 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)을 포함할 수 있다. 이러한 불변 영역은 효과기 기능(예컨대, Fc 수용체 결합)을 매개하는 영역을 보유할 수 있거나 효과기 기능이 감소되도록 변경될 수 있다. 생성된 융합 단백질은 독립적으로 발현된 제1 펩타이드에 비교하여 변경된 용해성, 결합 친화성, 안정성 및/또는 원자가(즉, 폴리펩타이드당 이용 가능한 결합 부위의 수)를 가질 수 있고, 단백질 정제 효율을 증가시킬 수 있다. 제조합 기술로 생산된 융합 단백질 및 펩타이드는 단백질 또는 펩타이드가 함유된 세포 및 배지의 혼합물로부터 분비 및 단리할 수 있다. 대안적으로, 단백질 또는 펩타이드가 세포질에 유지될 수 있도록 하고, 세포를 수집, 용해하고, 단백질을 단리할 수 있다. 세포 배양물은 전형적으로 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양을 위한 적합한 배지는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 단백질 및 펩타이드는 단백질 및 펩타이드를 정제하기 위한 당해 분야에 알려진 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 모두로부터 단리할 수 있다. 숙주 세포를 형질감염하고 단백질 및 펩타이드를 정제하는 기술이 당해 분야에 알려져 있다.
바람직하게는, 본 개시내용에 의해 포괄되는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술로 생산한다. 예를 들어, 서로 다른 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 단편들을 기존 기술, 예를 들어, 결찰을 위해 블런트-말단 또는 스태거-말단을 사용하는 것, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한효소처리, 결합 말단을 적절히 채우는 것, 원치않는 결합을 피하기 위한 알칼라인 포스파타제 처리, 및 효소적 결찰에 따라 인-프레임으로 결찰한다. 다른 실시형태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 기존 기술로 합성할 수 있다. 대안적으로, 후속으로 키메라 유전자 서열을 생성하기 위한 어닐링 및 재-증폭을 할 수 있는 두 연속 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있다(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992] 참조).
특히 바람직한 Ig 융합 단백질은 면역글로불린 불변 영역(예컨대, Fc 영역)에 결합된 표 1에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 세포외 도메인 부분 또는 가변 영역-유사 도메인을 포함한다. 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 구조 고유의 효과기 활성이 감소 또는 제거된 유전적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 관심대상 폴리펩타이드의 세포외 부분을 암호화하는 DNA를 위치 지정 돌연변이유발, 예를 들어, WO 97/28267에서 교시하는 바와 같은 돌연변이유발로 변형된 인간 IgGγ1 및/또는 IgGγ4의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 암호화하는 DNA에 결합할 수 있다.
다른 실시형태에서, 융합 단백질은 N-말단에 이종 신호 서열을 함유한다. 특정 숙주 세포(예컨대, 포유동물 숙주 세포)에서, 폴리펩타이드의 발현 및/또는 분비가 이종 신호 서열의 사용을 통해 증가될 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 융합 단백질을 대상체에서 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 이러한 항체를 융합 단백질 각각에 대한 천연 폴리펩타이드를 정제하기 위해, 또는 하나 이상의 바이오마커 폴리펩타이드 또는 이의 단편과 이의 천연 결합 상대(들) 또는 이의 단편(들) 간의 상호작용을 저해하는 폴리펩타이드를 확인하기 위한 스크리닝 분석에 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조절 물질(예컨대, 항체, 소분자, 펩타이드, 융합 단백질 또는 작은 핵산)은 약제학적 조성물에 포함될 수 있고 대상체에 생체 내로 투여될 수 있다. 조성물은 이러한 분자 또는 물질을 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 물질들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 "단일 활성제"을 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에 따라 당해 분야에 알려진 다른 약제학적 활성 화합물("제2의 활성제")과 결합할 수 있다.
표준 재조합 기술의 사용으로 인해 본 명세서에 기재된 바이오마커 핵산 및/또는 바이오마커 폴리펩타이드 분자의 생산 및 사용이 쉬워질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 기술은 바이오마커 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 일부분을 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 사용한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일 유형은 부가적인 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 게놈 내에 부가적인 DNA 단편이 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터(예컨대, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다. 다른 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈 내에 통합되고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드(벡터) 형태이다. 하지만, 본 개시내용은 동등한 기능을 제공하는, 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은, 발현 벡터의 다른 형태를 포함하는 것을 의도한다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산을 포함한다. 이는 재조합 발현 벡터가, 발현에 사용되는 숙주 세포에 따라 선택되며 발현되는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심대상 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현이 가능한 방식(예컨대, 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주 세포 내에 벡터를 도입한 경우 숙주 세포에서)으로 조절 서열(들)에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology vol.185, Academic Press, San Diego, CA (1991)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 조직적인 발현을 지시하는 것 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 것(예컨대, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 당업자라면 형질전환할 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 이러한 요인에 따라 발현 벡터를 설계할 수 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 암호화되는 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.
본 개시내용에서 사용하기 위한 재조합 발현 벡터는 원핵(예컨대, 대장균) 또는 진핵 세포(예컨대, 곤충 세포{베큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여}, 효모 세포 또는 포유동물 세포)에서 본 개시내용에 의해 포괄되는 마커에 해당하는 폴리펩타이드를 발현하기 위해 설계될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 상기 Goeddel의 문헌에서 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 시험관 내에서, 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 전사 및 번역될 수 있다.
원핵생물에서의 단백질 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 대장균에서 가장 자주 수행한다. 융합 벡터는 암호화 단백질에, 일반적으로 재조합 단백질의 아미노 말단에, 다수의 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키기 위해; 2) 재조합 단백질의 용해성을 높이기 위해; 및 3) 친화 정제에서 리간드로 작용하여 재조합 단백질의 정제를 돕기 위한 3가지 목적으로 사용된다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 단백질의 정제 이후에 재조합 단백질을 융합 모이어티로부터 분리할 수있도록 하기 위해 융합 모이어티와 재조합 단백질의 접합 부위에 단백질분해성 절단 부위를 도입한다. 이러한 효소, 및 이의 동족 인식 서열은 Factor Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터는 표적 재조합 단백질에 각각 글루타치온 S-전달효소(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 융합하는 pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL(New England Biolabs, 매사추세츠주 베벌리 소재) 및 pRIT5(Pharmacia, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다.
적합한 유도가능한 비-융합 대장균 발현 벡터의 예는 pTrc(Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) 및 pET 11d(Studier et al., p. 60-89, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol.185, Academic Press, San Diego, CA, 1991)를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 바이오마커 핵산 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 바이오마커 핵산 발현은 공동-발현되는 바이러스 RNA 중합효소(T7 gn1)로 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 조절 하에서 T7 gn1 유전자를 보유하는 내재 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 제공된다.
대장균에서 재조합 단백질 발현을 최대화하는 하나의 전략은 재조합 단백질을 단백질분해적으로 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현하는 것이다((Gottesman, p. 119-128, In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990). 다른 전략은 발현 벡터에 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변경하여 각 아미노산에 대한 개별 코돈이 대장균에서 우선적으로 사용되는 것이 되도록 하는 것이다(Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기술로 달성할 수 있다.
다른 실시형태에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스 세레비시애(S. cerevisiae)에서의 발현 벡터의 예는 pYepSec1(Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa(Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2(Invitrogen Corporation, 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 pPicZ(Invitrogen Corp, 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 포함한다.
대안적으로, 발현 벡터는 베큘로바이러스 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포(예컨대, Sf 9 세포)에서 단백질을 발현하는데 이용 가능한 베큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39)를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 포유동물 발현 벡터를 사용하여 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산을 포유동물 세포에서 발현시킨다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8(Seed, 1987, Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용하는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 대개 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40에서 유래한다. 원핵 및 진핵 세포 모두를 위한 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는 상기 Sambrook 등의 문헌의 16장 및 17장을 참고할 수 있다.
다른 실시형태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 바람직하게는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 지시할 수 있다(예컨대, 핵산의 발현을 위해 조직-특이적 조절 요소가 사용된다). 조직-특이적 조절 요소는 당해 분야에 알려져 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적 예는 알부민 프로모터(간-특이적; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), 림프구-특이적 프로모터(Calame and Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), 특히 T 세포 수용체 및 면역글로불린의 프로모터(Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733 및 Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), 뉴런-특이적 프로모터(예컨대, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터(Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), 및 젖샘-특이적 프로모터(예컨대, 유청 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)를 포함한다. 발달적-조절 프로모터, 예를 들어, 쥣과 혹스(hox) 프로모터(Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379) 및 α-페토프로틴 프로모터(Camper and Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546)가 또한 포괄된다.
본 개시내용은 또한 발현 벡터에 안티센스 방향으로 클론화된 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 본 개시내용에 의해 포괄되는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 발현이 가능한 방식으로 조절 서열이 작동 가능하게 연결된다. 안티센스 방향으로 클론화되는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 조절 서열로 다양한 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 연속적인 발현을 지시하는 것, 예를 들어, 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서를 선택하거나, 안티센스 RNA의 구성적, 조직-특이적 또는 세포 유형 특이적 발현을 지시하는 것을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 고효율 조절 영역(이의 활성은 벡터를 도입하는 세포 유형에 따라 결정할 수 있음)의 조절 하에서 안티센스 핵산이 생산되도록 재조합 플라스미드, 파지미드(phagemid) 또는 약화된 바이러스의 형태로 존재할 수 있다. 안티센스 유전자를 사용한 유전자 발현의 조절에 대해서는 문헌[Weintraub et al., 1986, Trends in Genetics, Vol. 1(1)]를 참고할 수 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 다른 양상은 본 개시내용에 의해 포괄되는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포"라는 용어와 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손 또한 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적인 영향에 의해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵(예컨대, 대장균) 또는 진핵 세포(예컨대, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포)일 수 있다.
기존의 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 벡터 DNA를 원핵 또는 진핵 세포에 도입할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션 또는 일렉트로포레이션을 포함하는 숙주 세포에 외래 핵산을 도입하는 당해 분야에서 인정된 다양한 기술을 지칭하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염하는 적합한 방법은 Sambrook 등의 문헌(상기 참조) 및 다른 실험 메뉴얼에서 찾을 수 있다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라, 세포의 극히 일부만이 외래 DNA를 게놈에 통합할 수 있음이 알려져 있다. 이러한 통합체를 확인 및 선별하기 위해, 일반적으로 선별가능한 마커(예컨대, 항생제에 대한 저항성)를 암호화하는 유전자를 관심대상 유전자와 함께 숙주 세포에 도입한다. 바람직한 선별 마커는 G418, 하이그로마이신(하이그로마이신) 및 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 것을 포함한다. 핵산 도입으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선별을 통해 확인할 수 있다(예컨대, 선별 마커 유전자를 갖는 세포는 생존하는 반면 다른 세포는 죽을 것이다).
XII. 바이오마커 핵산 및 폴리펩타이드 분석
1) 바이오마커 전사체 또는 폴리펩타이드 수준에서의 변화, 2) 바이오마커 유전자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 부가, 4) 바이오마커 유전자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 5) 발현 조절 영역과 같은 바이오마커 유전자의 비정상적인 변형 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 개시내용에 유용한 유전적 또는 발현 변화를 확인하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 당업자에게 알려진 기술에 따라 바이오마커 핵산 및/또는 바이오마커 폴리펩타이드를 분석할 수 있다.
a. 카피수 검출 방법
바이오마커 핵산의 카피수를 평가하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 염색체적인 획득 또는 손실의 유무는 본 명세서에서 확인된 영역 또는 마커의 카피수 결정을 통해 간단하게 평가할 수 있다.
바이오마커 좌위의 카피수를 평가하는 방법은 혼성화-기반 분석법을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 혼성화-기반 분석은 서던 블롯과 같은 전통적인 "직접 프로브" 방법, 인시츄(in situ) 혼성화(예컨대, FISH 및 FISH+SKY) 방법, 및 상대적 게놈 혼성화(CGH), 예를 들어, cDNA-기반 또는 올리고뉴클레오타이드-기반 CGH와 같은 "상대적 프로브" 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이 방법들은 기질(예컨대, 막 또는 유리) 결합 방법 또는 어레이-기반 접근법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 형식으로 사용할 수 있다.
일 실시형태에서, 샘플 내 바이오마커 유전자 카피수 평가는 서던 블롯을 포함한다. 서던 블롯에서, 게놈 DNA(전형적으로 전기영동 겔 상에 단편화 및 분리된)는 표적 영역에 특이적인 프로브와 혼성화된다. 정상 게놈 DNA 분석의 대조군 프로브 신호(예컨대, 같거나 관련된 세포, 조직, 기관 등의 비-증폭 부분)와 표적 영역에 대한 프로브 혼성화 신호의 강도 비교로 표적 핵산의 상대적인 카피수의 추정치를 얻을 수 있다. 대안적으로, 샘플 내 암호화 핵산의 카피수를 평가하기 위해 노던 블롯을 사용할 수 있다. 노던 블롯에서, mRNA는 표적 영역에 특이적 프로브와 혼성화한다. 정상 RNA 분석의 대조군 프로브 신호와 표적 영역에 대한 프로브의 혼성화 신호의 강도 비교로 표적 핵산의 상대적인 카피수 추정치를 얻을 수 있다. 대안적으로, RNA 검출을 위한 당해 분야에 잘 알려진 다른 방법을 사용하여, 적절한 대조군에 대해 상대적으로 높거나 낮은 발현으로 표적 핵산의 상대적인 카피수 추정치를 얻을 수 있다.
게놈 카피수를 결정하기 위한 대안적인 방법은 인시츄 혼성화(예컨대, Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649)이다. 일반적으로, 인시츄 혼성화는 다음의 단계를 포함한다: (1) 분석할 조직 또는 생물학적 구조물의 고정화; (2) 표적 DNA의 접근성을 높이고 비특이적 결합을 줄이기 위한 생물학적 구조물의 전-혼성화 처리; (3) 핵산 혼합물과 생물학적 구조물 또는 조직 내 핵산의 혼성화; (4) 혼성화에서 결합하지 않은 핵산 단편을 제거하기 위한 혼성화-후 세척 및 (5) 혼성화된 핵산 단편의 검출. 이들 각 단계에서 사용되는 시약 및 조건은 특정 응용에 따라 달라진다. 전형적인 인시츄 혼성화 분석에서, 세포를 고체 지지체, 전형적으로 유리 슬라이드에 고정한다. 핵산을 프로브로 조사하는 경우, 전형적으로 세포를 열 또는 알칼리로 변성시킨다. 이어서, 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적인 표지된 프로브의 어닐링(annealing)을 허용하기 위해 적당한 온도에서 세포를 혼성화 용액과 접촉시킨다. 이어서, 전형적으로 적절한 신호 대 잡음 비율이 얻어질 때까지 미리 결정된 강도 또는 강도를 증가시켜 표적(예컨대, 세포)을 세척한다. 전형적으로 프로브는, 예를 들어, 방사성 동위원소 또는 상청 리포터로 표지한다. 일 실시형태에서, 프로브는 엄격한 조건 하에서 표적 핵산(들)과 특이적으로 혼성화시키기에 충분히 길도록 한다. 프로브는 일반적으로 약 200 베이스 내지 약 1000 베이스의 길이 범위이다. 일부 적용에서, 반복 서열의 혼성화능을 차단하는 것이 필요하다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, tRNA, 인간 게놈 DNA 또는 Cot-I DNA를 비-특이적 혼성화를 차단하기 위해 사용한다.
게놈 카피수를 결정하기 위한 대안적인 방법은 상대적 게놈 혼성화이다. 일반적으로, 정상 참조 세포와 시험 세포(예컨대, 종양 세포)로부터 게놈 DNA를 단리하고 필요한 경우 증폭한다. 두 핵산을 다르게 표지하고 참조 세포의 중기(metaphase) 염색체와 인시츄 혼성화한다. 참조 및 시험 DNA 모두에서 반복 서열을 제거하거나 일부 방법, 예를 들어, 상기 혼성화 동안 상기 반복 서열에 대한 적절한 차단 핵산 및/또는 이 차단 핵산 서열을 포함하는 것으로 전-혼성화하여 반복 서열의 혼성화능을 줄인다. 이어서, 필요한 경우, 결합된, 표지된 DNA 서열을 가시화 형태로 만든다. 카피수가 증가 또는 감소한 시험 세포 내 염색체 영역은 두 DNA의 신호 비율이 변화한 영역을 검출하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 시험 세포에서 카피수가 감소한 영역은 게놈의 다른 영역과 비교하여 참조 보다 시험 DNA의 신호가 상대적으로 낮게 나타날 것이다. 시험 세포에서 카피수가 증가한 영역은 시험 DNA의 신호가 상대적으로 더 높게 나타낼 것이다. 염색체의 결실 또는 증가가 있는 곳에서, 두 표지 신호의 비율 차이가 검출될 것이고 비율은 카피수의 측정치를 제공할 것이다. CGH, 분석 CGH(aCGH)의 다른 실시형태에서, 고정화된 염색체 요소는 어레이 상의 고형 지지체 결합 표적 핵산의 모음으로 대체되며, 이 고형 지지체 결합 표적의 모음에 게놈을 넓은 또는 완전한 비율로 나타내는 것이 가능하다. 표적 핵산은 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 단일 뉴클레오타이드 다형성을 검출하기 위해) 등을 포함할 수 있다. 어레이-기반 CGH는 단일-색 표지(대조군과 가능한 종양 샘플을 두 가지의 서로 다른 염료로 표지하고 혼성화 전에 이들을 혼합하는 것과는 대조적으로, 어레이 상의 프로브의 경쟁적 혼성화에 따른 비율이 산출될 것임)로도 수행할 수 있다. 단일 색 CGH에서, 대조군을 하나의 어레이로 표지 및 혼성화하고 절대 신호를 읽으며, 가능한 종양 샘플을 둘째 어레이(동일한 내용으로)로 표지 및 혼성화하고 절대 신호를 읽는다. 카피수 차이는 두 어레이의 절대 신호를 기반으로 계산한다. 고정화 염색체 또는 어레이를 준비하고 상대적인 게놈 혼성화를 수행하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제6,335,167호; 제6,197,501호; 제5,830,645호; 및 제5,665,549호 및 문헌[Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; 유럽 공개 특허 제430,402호; Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994)] 등 참조). 다른 실시형태에서, 문헌[Pinkel, et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211] 또는 문헌[Kallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325 (1992)]의 혼성화 프로토콜을 사용한다.
또 다른 실시형태에서, 카피수를 측정하기 위해 증폭-기반 분석을 사용할 수 있다. 이러한 증폭-기반 분석에서, 핵산 서열은 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응(PCR))의 주형으로 작용한다. 양적인 증폭에서, 증폭 산물의 양은 본래 샘플 내 주형의 양에 비례할 것이다. 적절한 대조군, 예를 들어, 건강한 조직과의 비교로 카피수의 측정치를 얻을 수 있다.
"양적인" 증폭 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 양적인 PCR은 같은 프라이머를 사용하여 양을 알고 있는 대조군 서열을 동시에 공동-증폭하는 것을 포함한다. 이는 PCR 반응 대조에 사용할 수 있는 내부 표준을 제공한다. 양적인 PCR의 세부 프로토콜은 문헌[Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.]에서 제공한다. 양적인 PCR 분석법을 사용하여 미세부수체 좌위에서 DNA 카피수를 측정하는 것은 문헌[Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60:5405-5409]에 기재되어 있다. 유전자의 알려진 핵산 서열은 당업자가 유전자의 임의의 부분을 증폭하기 위해 통상적으로 프라이머를 선택할 수 있도록 하기에 충분하다. 형광발생 양적 PCR 또한 본 개시내용에 의해 포괄되는 방법에 사용할 수 있다. 형광발생 양적 PCR에서, 측량은 형광 신호, 예를 들어, TaqMan 및 SYBR 그린의 양을 기반으로 한다.
다른 적합한 증폭 방법은 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077, 및 Barringer et al. (1990) Gene 89: 117 참조), 전사 증폭(Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), 자가-지속 서열 복제(Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), 닷 PCR(dot PCR) 및 링커 어댑터 PCR 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이형접합성 상실(LOH) 및 주요 카피 비율(MCP) 매핑(Wang, Z.C., et al. (2004) Cancer Res 64(1):64-71; Seymour, A. B., et al. (1994) Cancer Res 54, 2761-4; Hahn, S. A., et al. (1995) Cancer Res 55, 4670-5; Kimura, M., et al. (1996) Genes Chromosomes Cancer 17, 88-93; Li et al., (2008) MBC Bioinform. 9, 204-219) 또한 증폭 또는 결실 영역을 확인하기 위해 사용할 수 있다.
b. 바이오마커 핵산 발현 검출 방법
바이오마커 발현은 전사된 분자 또는 단백질의 발현을 검출하기 위한 다양한 잘 알려진 방법들 중 임의의 방법으로 평가할 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 분비되는 단백질, 세포-표면의 단백질, 세포질 단백질 또는 핵 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법, 단백질 정제 방법, 단백질 기능 또는 활성 분석법, 핵산 혼성화 방법, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 특정 유전자의 활성은 유전자 전사체(예컨대, mRNA)의 척도, 번역된 단백질 양의 척도, 또는 유전자 산물 활성의 척도로 특징짓는다. 마커 발현은 mRNA 수준, 단백질 수준 또는 단백질 활성, 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있는 것 중 임의의 것의 검출을 포함하는 다양한 방법으로 모니터할 수 있다. 검출은 유전자 발현 수준(예컨대, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 단백질 또는 효소 활성)의 정량화를 포함할 수 있거나, 대안적으로, 유전자 발현 수준의 정성적 평가, 특히 대조군 수준과의 비교 평가가 될 수 있다. 검출되는 수준의 유형은 문맥으로부터 명확할 것이다.
다른 실시형태에서, 바이오마커 및 이의 단편 또는 유전적 변이체(예컨대, 이의 조절 또는 프로모터 영역의 유전적 변이체)를 포함하는 기능적으로 유사한 이의 상동체의 발현 수준을 검출 또는 결정하는 것은 관심대상 마커에 대한 RNA 수준을 검출 또는 결정하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 시험할 대상체로부터 하나 이상의 세포를 얻고 이 세포로부터 RNA를 단리한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체로부터 유방 조직 세포의 샘플을 얻는다.
일 실시형태에서, RNA는 단일 세포로부터 얻어진다.예를 들어, 레이저 포착 현미해부(LCM)로 조직 샘플에서 세포를 단리할 수 있다. 이 기술을 사용하면, 염색된 조직 절편을 포함하는 조직 절편에서 세포를 단리하여 원하는 세포가 단리되도록 할 수 있다(예컨대, 문헌[Bonner et al. (1997) Science 278: 1481; Emmert-Buck et al. (1996) Science 274:998; Fend et al. (1999) Am. J. Path. 154: 61 및 Murakami et al. (2000) Kidney Int. 58:1346] 참조). 예를 들어, 상기 Murakami 등의 문헌에 사전에 면역염색된 조직 절편으로부터 세포를 단리하는 방법이 기재되어 있다.
RNA를 추출할 수 있는 큰 세포 집단을 얻는 것과 같이 대상체로부터 세포를 얻고 시험관 내에서 배양하는 것 또한 가능하다. 비-형질전환 세포의 배양, 즉 1차 세포 배양을 확립하는 방법이 당해 분야에 알려져 있다.
개체의 조직 샘플 또는 세포로부터 RNA를 단리하는 경우, 대상체로부터 조직 또는 세포가 제거된 이후 유전자 발현에서의 임의의 추가 변화를 차단하는 것이 중요하다. 발현 수준의 변화는 작은 변화, 예를 들어, 열충격 또는 지질다당류(LPS) 또는 다른 시약에 의한 활성화에 따라 빠르게 변화하는 것으로 알려져 있다. 추가로, 조직 및 세포의 RNA는 빠르게 분해될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 조직 또는 세포를 가능한 빠르게 급속 냉동한다.
RNA는 다양한 방법, 예를 들어, 구아니디움 티오사이안산염 용해 후 CsCl 원심분리로 조직 샘플로부터 추출할 수 있다(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299). 단일 세포로부터는 문헌[Dulac, C. (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36, 245 및 Jena et al. (1996) J. Immunol. Methods 190:199]에 기재된 것과 같이, 단일 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제작하는 방법에 기재된 방법으로 얻을 수 있다. 예컨대, RNAsin의 내포에 의해, RNA 분해를 방지하기 위해 주의를 기울여야 한다.
이어서, RNA 샘플을 특정 종에 농축시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리(A)+ RNA를 RNA 샘플로부터 단리한다. 일반적으로, 이러한 정제는 mRNA 상 폴리-A 테일을 이용한다. 특히 위에서 언급된 바와 같이, mRNA에 대한 친화 리간드로 제공하기 위해 폴리-T 올리뉴클레오타이드를 고형 지지체 상에 고정시킬 수 있다. 이 목적을 위한 키트, 예를 들어, MessageMaker kit(Life Technologies, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)를 상업적으로 이용할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, RNA 집단을 마커 서열로 농축한다. 농축은, 예를 들어, 프라이머-특이적 cDNA 합성, 또는 cDNA 합성 기반 여러 회의 선형 증폭 및 주형-유도 시험관 내 전사로 수행할 수 있다(예컨대, Wang et al. (1989) PNAS 86, 9717; 상기 Dulac 등의 문헌, 및 상기 Jena 등의 문헌 참조).
특정 종 또는 서열로 농축하거나 그렇지 않은 RNA 집단을 추가로 증폭할 수 있다. 본 명세서에 정의된, "증폭 과정"은 RNA 내 분자를 강화, 증가 또는 증대시키는 것을 뜻한다. 예를 들어, RNA가 mRNA인 경우, mRNA를 증폭하기 위해 RT-PCR과 같은 증폭 과정을 이용하여, 신호를 검출하거나 검출을 강화할 수 있다. 이러한 증폭 과정은 특히 생물학적, 조직 또는 종양 샘플의 크기 또는 부피가 작은 경우에 유익하다.
다양한 증폭 및 검출 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, mRNA를 cDNA로 역전사하고 중합효소 연쇄 반응하는 것(RT-PCR); 또는 미국 특허 제5,322,770에 기재된 바와 같이 두 단계를 위해 단일 효소를 사용하는 것, 또는 문헌[R. L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994)]에 기재된 바와 같이 mRNA를 cDNA로 역전사하고 대칭적 갭 리가제 연쇄 반응하는 것(RT-AGLCR)이 본 개시내용에 의해 포괄되는 범위 내에 포함된다. 실시간 PCR도 사용할 수 있다.
본 명세서에서 이용될 수 있는 다른 알려진 증폭 방법은 문헌[PNAS USA 87: 1874-1878 (1990)] 및 문헌[Nature 350 (No. 6313): 91-92 (1991)]에 기재된 "NASBA" 또는 "3SR"로 불리는 기술; 유럽 공개 특허 출원(EPA) 제4544610호에 기재된 Q-베타 증폭; 문헌[G. T. Walker et al., Clin. Chem. 42: 9-13 (1996)] 및 유럽 특허 출원 제684315호에 기재된 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification); PCT 공개 제WO9322461호에 기재된 표적 매개 증폭; PCR; 리가제 연쇄 반응(LCR)(예컨대, 문헌[Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)] 참조); 자가-유지 서열 복제(self-sustained sequence replication: SSR)(예컨대, 문헌[Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)] 참조); 및 전사 증폭(예컨대, 문헌[Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)] 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유전자 발현의 절대적 및 상대적 수준을 결정하기 위한 많은 기술들이 당해 분야에 알려져 있고, 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 일반적으로 사용되는 기술들은 노던 분석, RNase 보호 분석(RPA), 마이크로어레이 및 정량적 PCR 및 차등 디스플레이 PCR과 같은 PCR-기반 기술들을 포함한다. 예를 들어, 노던 블롯은 변성 아가로스 겔 상에 RNA 제조물을 영동하는 것, 및 이를 활성화 셀룰로스, 나이트로셀룰로스 또는 유리 또는 나일론 막과 같은 적합한 지지체로 옮기는 것을 포함한다. 이어서, 방사성표지된 cDNA 또는 RNA를 제조물과 혼성화하고, 세척하고 오토라디오그래피로 분석한다.
인시츄 혼성화 가시화도 이용될 수 있는데, 여기서 방사성 표지된 안티센스 RNA 프로브를 생검 샘플의 얇은 절편과 혼성화하며, 세척하고, RNase로 절단하고, 오토라디오그래피를 위해 감광액에 노출시킨다. 샘플의 조직학적 구성을 입증하기 위해 샘플을 헤마톡실린으로 염색할 수 있고, 적합한 광 필터를 사용한 암 시야 이미징으로 현상된 에멀션을 볼 수 있다. 다이곡시게닌과 같은 비-방사성 표지도 사용할 수 있다.
대안적으로, mRNA 발현은 DNA 어레이, 칩 또는 마이크로어레이로 검출할 수 있다. 대상체에서 얻은 시험 샘플의 표지된 핵산을 바이오마커 DNA를 포함하는 고체 표면에 혼성화할 수 있다. 바이오마커 전사체를 함유하는 샘플로 양성 혼성화 신호를 얻는다. DNA 어레이를 준비하고 이를 사용하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제6,618,6796호; 제6,379,897호; 제6,664,377호; 제6,451,536호; 제548,257호; U.S. 20030157485 및 문헌[Schena et al. (1995) Science 20, 467-470; Gerhold et al. (1999) Trends In Biochem. Sci. 24, 168-173; 및 Lennon et al. (2000) Drug Discovery Today 5, 59-65] 참조, 이들 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 유전자 발현 연속 분석(SAGE) 또한 수행할 수 있다(예컨대, 미국 특허 출원 공개 제20030215858호 참조).
mRNA 수준을 모니터하기 위해, 예를 들어, mRNA를 시험할 생물학적 샘플로부터 추출하고, 역전사하고, 형광-표지 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 표지된 cDNA 프로브로 마커 cDNA에 혼성화할 수 있는 마이크로어레이를 수행하여 프로브 조사하고, 슬라이드를 스캔하고, 형광 강도를 측정한다. 이 강도는 혼성화 강도 및 발현 수준과 연관된다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용할 수 있는 프로브의 유형은 cDNA, 리보프로브, 합성 올리고뉴클레오타이드 및 게놈 프로브를 포함한다. 예를 들어, 인시츄 혼성화를 위한 리보프로브, 노던 블롯을 위한 cDNA와 같이, 사용되는 프로브의 유형은 일반적으로 특정 상황에 따라 결정된다. 일 실시형태에서, 프로브는 RNA에 대해 독특한 뉴클레오타이드 영역으로 향한다. 프로브는 마커 mRNA 전사체를 차별적으로 인식하는데 필요한 만큼 짧을 수 있고, 예를 들어, 15 베이스로 짧을 수 있지만, 적어도 17, 18, 19 또는 20 이상의 베이스의 프로브를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 프라이머 및 프로브는 엄격한 조건 하에서 마커에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 단편에 특이적으로 혼성화한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "엄격한 조건"은 적어도 95%의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있는 경우에만 발생하는 혼성화를 의미한다. 다른 실시형태에서, "엄격한 조건" 하에서의 혼성화는 적어도 97%의 서열 간 동일성이 있는 경우에 발생한다.
프로브의 표지 형식은 방사성동위원소, 예를 들어, 32P 및 35S를 사용하는 것과 같은 적절한 임의의 형식일 수 있다. 방사성동위원소 표지는 적합한 표지 베이스를 사용하여 화학적으로 또는 생물학적으로 프로브를 합성하는 방법으로 달성할 수 있다.
일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 시험 대상체의 폴리펩타이드 분자를 함유한다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 시험 대상체의 mRNA 분자 또는 게놈 DNA 분자를 함유할 수 있다.
다른 실시형태에서, 이 방법은 대조군 대상체에서 대조 생물 샘플을 얻는 것, 대조 샘플을 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 화합물 또는 물질과 접촉시켜, 생물학적 샘플 내 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편이 검출되도록 하는 것, 대조 샘플 내 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편의 존재와 시험 샘플 내 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편의 존재를 비교하는 것을 추가로 포함한다.
c. 바이오마커 단백질 발현 검출 방법
바이오마커 단백질의 활성 또는 수준은 발현된 폴리펩타이드를 검출 또는 정량화하여 검출 및/또는 정량할 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법 중 임의의 방법으로 폴리펩타이드를 검출 및 정량할 수 있다. 바이오마커 핵산 및 기능적으로 유사한 이의 상동체(단편 또는 이의 유전적 변형(예컨대, 이의 조절 또는 프로모터 영역의 변형)을 포함하는)를 암호화하는 폴리펩타이드의 비정상적인 발현 수준은 항-KIR3DL3 항체 요법에 대한 암의 반응 가능성과 관련이 있다. 폴리펩타이드를 검출하기 위한 당해 분야에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 면역확산법, 면역전기영동법, 방사성면역분석법(RIA), 효소-결합 면역흡착제 분석법(ELISA), 면역형광 분석법, 웨스턴 블롯, 바인더-리간드 분석법, 면역조직화학적 기술, 교착법, 상보적 분석법, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 하이퍼디퓨전 크로마토그래피 등(예컨대, 문헌[Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991], 이는 참조에 의해 원용됨)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 것은 항체를 에피토프 또는 에피토프들과 반응시키는 것 및 표지된 폴리펩타이드 또는 이의 유도체를 경쟁적으로 치환하는 것을 포함하는 바인더-리간드 면역분석 방법이다. 소정의 실시형태에서, 표 2에 열거된 항체를 표 1에 열거된 바이오마커를 검출 및/또는 정량하는데 이용한다.
예를 들어, ELISA 및 RIA 방법을 수행하여 원하는 바이오마커 단백질 표준을 표지(125I 또는 35S와 같은 방사성동위원소 또는 겨자무과산화수소 또는 알칼라인 포스파타제와 같은 분석가능한 효소로)하고, 비표지 샘플과 함께, 상응하는 항체와 접촉시킬 수 있으며, 여기서 2차 항체는 1차와 결합하는데 사용되며, 방사성 또는 고정된 효소를 분석(경쟁적 분석)한다. 대안적으로, 샘플 내 바이오마커 단백질이 해당 고정 항체와 반응하도록 하고, 방사성동위원소- 또는 효소-표지 항-바이오마커 단백질 항체가 이 시스템과 반응하도록 하고, 방사성 또는 효소를 분석(ELISA-샌드위치 분석)한다. 다른 통상적인 방법도 적합하게 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체는 방사면역검정법, 웨스턴블롯 분석법, 면역형광 분석법, 효소 면역분석법, 면역침전 분석법, 화학발광 분석법, 면역조직화학적 분석법, 도트 블롯 분석법, 또는 슬롯 블롯 분석법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 잘 알려진 면역분석 형태 중 임의의 하나에서 사용될 수 있다. 인시츄 근접 결찰 분석법(PLA), 형광 편광 면역분석법(FPIA), 형광 면역분석법(FIA), 효소 면역분석법(EIA), 혼탁 저해 면역분석법(NIA), 효소결합면역흡착분석법(ELISA), 및 방사면역검정법(RIA), ELISA, 등의 단독 또는 NMR, MALDI-TOF, LC-MS/MS와 조합 또는 대안적 적용과 같은 위에서 언급한 다양한 면역분석법 및 기술의 다른 변형을 수행하는데 사용되는 일반적인 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
이러한 시약은, 예를 들어, 저해제의 최적 투여량을 모니터하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서, 세포 또는 조직, 예를 들어, 백혈구 또는 림프구, 내 단백질 수준을 모니터하기 위해 사용될 수도 있다. 검출은 항체와 검출 가능 물질의 결합(예컨대, 물리적인 연결)을 통해 촉진할 수 있다. 검출 가능 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 겨자무과산화수소, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리드린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
상기 기술은 본질적으로 "1단계" 또는 "2단계" 분석으로 수행할 수 있다. "1단계" 분석은 항원을 고정 항체와 접촉시키고, 세척없이, 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. "2단계" 분석은 혼합물과 표지 항체를 접촉시키기 전에 세척하는 것을 포함한다. 다른 통상적인 방법도 적합하게 사용할 수 있다.
일 실시형태에서, 바이오마커 단백질 수준을 측정하는 방법은 생물학적 표본을 바이오마커 단백질에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 변이체(예컨대, 단편)와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 변이체가 상기 샘플에 결합하였는지를 검출하고 이에 따라 바이오마커 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
바이오마커 단백질 및/또는 항체의 효소적 및 방사성표지는 통상적인 방법으로 실행할 수 있다. 이러한 방법은, 글루타르알데하이드와 같이, 일반적으로 문제의 항원 또는 항체에 효소를, 효소의 활성에 악영향을 미치지 않도록(효소가 여전히 기질과 상호작용할 수 있는 것을 의미) 특이적으로, 비록 모든 효소가 활성화될 필요는 없지만, 실행할 분석을 수행할 수 있을 정도의 충분한 활성을 제공하도록, 공유 연결하는 것을 포함할 것이다. 실제로, 효소를 결합하기 위한 일부 기술들은 (예컨대, 포름알데하이드를 사용하여) 비-특이적이고, 활성 단백질의 일부만을 생성할 것이다.
일반적으로 분석 시스템 중 하나의 성분을 지지체 상에 고정하여 시스템의 다른 성분이 이 성분과 접촉하도록 하고 힘들고 시간-소모적인 노동없이 쉽게 제거 제거되도록 하는 것이 바람직하다. 두번째 단계를 첫번째 단계로부터 떨어져서 고정되도록 하는 것이 가능하지만, 일반적으로 하나의 단계면 충분하다.
지지체 상에 효소 자신을 고정하는 것이 가능하지만, 고체상 효소가 필요한 경우, 일반적으로 항체에 결합하고 항체를 당해 분야에 잘 알려진 지지체, 모델 및 시스템에 붙이는 것으로 달성된다. 단순 폴리에틸렌이 적합한 지지체를 제공할 수 있다.
표지에 사용가능한 효소는 특별히 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어, 산화효소 군의 구성원으로부터 선택할 수 있다. 이들은 기질과의 반응을 통해 과산화수소의 생산을 촉진하며, 글루코스 산화효소가 이의 우수한 안정성, 이용의 용이성 및 낮은 가격뿐만 아니라, 이의 기질(글루코스)을 쉽게 이용할 수 있다는 점 때문에 종종 사용된다. 산화효소의 활성은 당해 분야에 잘 알려진 조절된 조건 하에서 효소-표지 항체와 기질의 반응 이후 형성된 과산화수소의 농도를 측정하여 분석할 수 있다.
본 명세서에 기초한 의사의 선호도에 따라 바이오마커 단백질을 검출하기 위해 다른 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술의 하나가 웨스턴 블롯(Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979))이며, 여기서 나이트로셀룰로스 필터와 같은 고형 지지체로 전이하기 전에 적절하게 처리된 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에 영동한다. 이어서, 항-바이오마커 단백질 항체(표지되지 않은)가 지지체와 접촉하도록 하고 표지된 단백질 A 또는 항-면역글로불린(125I, 겨자무과산화수소 또는 알칼라인 포스파타제를 포함하는 적절한 표지)과 같은 2차 면역학적 시약으로 분석한다. 크로마토그래피 검출도 사용할 수 있다.
예를 들어, 생검 샘플에서 바이오마커 단백질의 발현을 검출하기 위해 면역조직화학법을 사용할 수 있다. 적합한 항체가 예를 들어, 세포의 얇은 세포층과 접촉하도록 하고, 세척하고, 이어서 2차 표지 항체와 접촉시킨다. 표지는 형광 마커, 과산화효소와 같은 효소, 아비딘 또는 방사표지로 수행할 수 있다. 분석은 현미경법을 사용하여 시각적으로 채점한다.
인트라바디(intrabody)와 같은, 항-바이오마커 단백질 항체(예컨대, 표 2에 열거된) 또한 이미지화 목적, 예를 들어, 대상체의 세포 및 조직 내 바이오마커 단백질의 존재를 검출하기 위한 목적을 위해 사용할 수 있다. 적합한 표지는 방사성동위원소, 아이오딘(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99mTc), 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 표지, 및 비오틴을 포함한다.
생체 내 이미지화 목적을 위해, 항체를 신체 외부에서 검출할 수 없으므로, 검출을 가능하게 하기 위해 표지하거나 변형시켜야 한다. 이 목적을 위한 마커는 항체 결합에 실질적으로 간섭하지 않지만 외부 검출을 가능하게 하는 임의의 것일 수 있다. 적합한 마커로는 X-방사선촬영, NMR 또는 MRI로 검출되는 것이 포함될 수 있다. X-방사선촬영 기술을 위한, 적합한 마커는 검출 가능한 방사선을 방출하지만 대상체에 명백하게 해롭지 않은 임의의 방사성동위원소, 예를 들어, 바륨 또는 세슘 같은 것을 포함한다. NMR 및 MRI에 적합한 마커는 일반적으로 듀테륨과 같은 검출 가능한 특징적인 스핀을 갖는 것들, 예를 들어, 관련 하이브리도마 영양소의 적합한 표지로 항체에 포함될 수 있는 것을 포함한다.
대상체의 크기 및 사용된 이미지화 시스템은 진단 이미지 생성에 필요한 이미지화 모이어티의 양을 결정할 것이다. 대상체가 인간이고, 방사성동위원소 모이어티를 사용하는 경우, 주사되는 방사능의 양은 일반적으로 약 5 내지 20 밀리쿼리 범위의 테크네튬-99일 것이다. 이어서, 표지된 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 바이오마커 단백질이 함유된 세포 위치에 축적될 것이다. 이어서, 알려진 기술을 사용하여 표지된 항체 또는 항체 단편을 검출할 수 있다.
바이오마커 단백질을 검출하는데 사용할 수 있는 항체는 검출할 바이오마커 단백질에 충분히 강하고 특이적으로 결합하는 천연적 또는 합성적, 전장 또는 이의 단편인, 단클론성 또는 다클론성인 임의의 항체(예컨대, 표 2에 열거)를 포함한다. 항체는 최대 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M의 Kd를 가질 수 있다. 어구 "특이적 결합"은, 예를 들어, 제2의 동일하거나 유사한 에피토프, 항원 또는 항원성 결정요인의 제제로 치환될 수 있거나 이와 경쟁할 수 있는 방식으로 항체가 에피토프 또는 항원 또는 항원성 결정요인에 결합하는 것을 지칭한다. 항체는 관련 단백질과 같은 다른 단백질에 비해 바이오마커 단백질에 우선적으로 결합할 수 있다.
항체는 상업적으로 이용할 수 있거나 당해 분야에 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다.
사용할 수 있는 항체 및 이의 유도체는 다클론 또는 단클론성 항체, 키메라, 인간, 인간화, 영장류화(CDR-이식), 베니어된 또는 단일-사슬 항체뿐만 아니라 항체의 기능적 단편, 즉 바이오마커 단백질 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab') 2 단편을 포함하지만 이로 제한되지 않는 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 항체 단편을 사용할 수 있다. 이러한 단편은 효소적 절단 또는 재조합 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 파파인 또는 펩신 절단으로 각각 Fab 또는 F(ab') 2 단편을 생성할 수 있다. 필요한 기질 특이성을 갖는 다른 단백질분해효소도 Fab 또는 F(ab') 2 단편을 생성하는데 사용할 수 있다. 항체는 또한 천연 종결 위치의 상류에 하나 이상의 종결 코돈을 도입한 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단 형태로 생산할 수 있다. 예를 들어, F(ab') 2 중쇄 부분을 암호화하는 키메라 유전자가 중쇄의 CH, 도메인 및 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하도록 설계할 수 있다.
합성 및 조작 항체는, 예를 들어, 문헌[Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly 등의 유럽 특허 제0,125,023 B1호; Boss 등의 미국 특허 제4,816,397호; Boss 등의 유럽 특허 제0,120,694 B1호; Neuberger, M. S. 등의 WO 86/01533; Neuberger, M. S. 등의 유럽 특허 제0,194,276 B1호; Winter의 미국 특허 제5,225,539호; Winter의 유럽 특허 제0,239,400 B1호; Queen 등의 유럽 특허 제0451216 B1호; 및 Padlan, E. A. 등의 EP 0519596 A1]에 기재되어 있다. 또한 영장류화 항체에 관해서는 문헌[Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992)]에 기재되어 있으며, 단일-사슬 항체에 관해서는 Ladner 등의 미국 특허 제4,946,778호 및 문헌[Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)]에 기재되어 있다. 라이브러리, 예를 드러아 파지 디스플레이 라이브러리로 생산되는 항체도 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체 이외의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 펩타이드를 사용한다. 바이오마커에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 당해 분야에 알려진 임의의 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 파지 디스플레이트 라이브러리를 사용하여 바이오마커 단백질의 특이적 펩타이드 결합체를 스크리닝할 수 있다.
d. 바이오마커의 구조적 변경 검출 방법
다음의 예시적인 방법은, 예를 들어, 과발현, 과기능 등의 특징을 갖는 HHLA2 또는 KIR3DL3를 확인하기 위해, 바이오마커 핵산 및/또는 바이오마커 폴리펩타이드 분자에서 구조적 변경의 존재를 확인하는데 사용할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 변경의 검출은 앵커 PCR 또는 RACE PCR과 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)(예컨대, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조)에서, 또는 대안적으로, 결찰 연쇄 반응(LCR)(예컨대, 문헌[Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; 및 Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364] 참조)에서 프로브/프라이머를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 후자는 바이오마커 유전자와 같은 바이오마커 핵산에서 점 돌연변이를 검출하는데 특히 유용하다(문헌[Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682] 참조). 이 방법은 대상체에서 세포 샘플을 수집하는 단계, 샘플의 세포에서 핵산(예컨대, 게놈, mRNA 또는 둘 모두)을 단리하는 단계, 조건 하에서 바이오마커 유전자에 특이적으로 혼성화되는 하나 이상의 프라이머와 핵산 샘플을 접촉시켜 바이오마커 유전자(존재하는 경우)의 혼성화 및 증폭을 발생시키는 단계, 및 증폭 산물의 유무를 검출하는 단계, 또는 증폭 산물의 크기를 검출하고 길이를 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 돌연변이 검출에 사용되는 임의의 기술과의 결합에서 PCR 및/또는 LCR을 예비 증폭 단계로 사용하는 것이 바람직할 것으로 예상된다.
대안적인 증폭 방법은 다음을 포함한다: 자가-지속 서열 복제(Guatelli, J. C. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh, D. Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 복제효소(Lizardi, P. M. et al. (1988) Bio-Technology 6:1197), 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법, 이어서, 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 증폭된 분자를 검출하는 방법. 이러한 검출 계획은 특히 핵산 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우의 검출에 유용하다.
대안적인 실시형태에서, 제한 효소 절단 패턴의 변화를 통해 샘플 세포 바이오마커 핵산의 돌연변이를 확인할 수 있다. 예를 들어, 샘플 및 대조군 DNA를 단리하고, 증폭하고(선택적으로), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, 겔 전기영동으로 단편 길이 크기를 결정하고 비교한다. 샘플 및 대조군 DNA 사이의 단편 길이 크기 차이는 샘플 DNA의 돌연변이를 나타낸다. 또한, 서열 특이적 리보자임(예컨대, 미국 특허 제5,498,531호)을 리보자임 절단 부위의 생성 또는 결실에 의한 특이적 돌연변이의 존재를 채점하기 위해 사용할 수 있다.
다른 실시형태에서, 수백 또는 수천의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 함유하는 고밀도 어레이로 샘플 및 대조군 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA을 혼성화하여 바이오마커 핵산 내 유전적 돌연변이를 확인할 수 있다(Cronin, M. T. et al. (1996) Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal, M. J. et al. (1996) Nat. Med. 2:753-759). 예를 들어, 상기 Cronin et al.의 문헌(1996)에 기재된 바와 같이 광-생성 DNA 프로브를 함유하는 2차원 어레이에서 바이오마커 유전적 돌연변이를 확인할 수 있다. 간단히 설명하면, 연속되고 겹치는 프로브의 선형 어레이를 만들어 서열 간 염기 변화를 식별하도록 샘플 및 대조군 내 DNA의 긴 스트레치에 걸쳐 스캔하기 위해 프로브의 첫번째 혼성화 어레이를 사용할 수 있다. 이 단계는 점 돌연변이의 식별을 가능하게 한다. 이 단계에 이어 검출된 모든 변이체 또는 돌연변이체에 상보적인 더 작고 특화된 프로브 어레이를 이용하여 특정 돌연변이의 특성규명을 가능하게 하는 2차 혼성화 어레이가 뒤따른다. 각 돌연변이 어레이는 야생형 유전자에 상보적인 프로브 세트 및 돌연변이 유전자에 상보적인 프로브 세트의 병렬 프로브 세트로 이루어진다. 이러한 바이오마커 유전적 돌연변이는, 예를 들어, 생식세포계열 및 체세포 돌연변이를 포함하는 다양한 상황에서 확인할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 바이오마커 유전자를 직접 시퀀싱하고 샘플 바이오마커의 서열을 해당 야생형(대조군) 서열과 비교하여 돌연변이를 검출하기 위해 당해 분야에 알려진 다양한 시퀀싱 반응을 사용할 수 있다. 시퀀싱 반응의 예는 맥삼 및 길버트(Maxam and Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560 또는 Sanger (1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74:5463)에 의해 개발된 기술을 기반으로 하는 것을 포함한다. 질량분석법에 의한 시퀀싱(예컨대, PCT 국제 공개 제WO 94/16101호; 문헌[Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; 및 Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159])을 포함하여 진단 어레이(Naeve (1995) Biotechniques 19:448-53)를 수행할 때 유용할 수 있는 다양한 자동 시퀀싱 방법 중 임의의 방법이 또한 고려된다.
바이오마커 유전자 내 돌연변이를 검출하는 다른 방법은 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 이종듀플렉스 내 미스매치를 검출하는데 사용하는 절단 물질로부터의 보호 방법을 포함한다(Myers et al. (1985) Science 230:1242). 일반적으로, "미스매치 절단" 기술은 야생형 바이오마커 서열을 함유하는 RNA 또는 DNA를 조직 샘플에서 얻은 잠재적인 돌연변이 RNA 또는 DNA와 혼성화(표지)하여 형성되는 이종듀플렉스를 제공하는 것에서 시작한다. 대조군과 샘플 가닥 사이의 염기쌍 미스매치로 인해 존재하는 것과 같은 듀플렉스의 단일-가닥 영역을 절단하는 작용제로 이중-가닥 듀플렉스를 처리한다. 예를 들어, 미스매치 영역을 효소적으로 소화시키기 위해 RNA/DNA 듀플렉스를 RNase로 처리하고 DNA/DNA 혼성체를 SI 뉴클레아제로 처리할 수 있다. 다른 실시형태에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 듀플렉스를 히드록실아민 또는 사산화 오스뮴으로 처리하고 미스매치 영역을 소화시키기 위해 피페리딘으로 처리할 수 있다. 미스매치 영역을 소화시킨 후, 이어서, 얻어진 물질을 돌연변이 위치를 결정하기 위해 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 크기 별로 분리한다. 예를 들어, 문헌[Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397 및 Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295]을 참조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 검출을 위해 대조군 DNA 또는 RNA를 표지할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 미스매치 절단 반응은 세포 샘플에서 얻은 바이오마커 cDNA의 점 돌연변이를 검출하고 매핑하기 위한 시스템에서 이중-가닥 DNA 내 미스매치 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질("DNA 미스매치 복구" 효소라고 부른다)을 사용한다. 예를 들어, 대장균의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하고 HeLa 세포의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 자른다(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). 예시적인 실시형태에 따라, 바이오마커 서열, 예를 들어, DNA 미스매치 복구 효소로 처리된 야생형 바이오마커, 및 절단 산물 기반 프로브는, 만약 있다면, 전기영동 프로토콜 등(예컨대, 미국 특허 제5,459,039호)으로부터 검출할 수 있다.
다른 실시형태에서, 바이오마커 유전자에서 돌연변이를 확인하기 위해 전기영동의 이동성 변화를 사용할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 및 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동성의 차이를 검출하기 위해 단일 가닥 구조 다형성(SSCP)를 사용할 수 있다(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766; see also Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144 및 Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). 샘플 및 대조군 바이오마커 핵산의 단일-가닥 DNA 단편은 변성되고 재생될 수 있을 것이다. 단일-가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 바뀌며, 그 결과로 전기영동 이동성의 변화는 단일 염기 변화도 검출할 수 있다. DNA 단편은 표지되거나 표지된 프로브로 검출할 수 있다. 분석 민감도는 2차 구조가 서열 변화에 더 민감한 RNA(DNA 보다는)를 사용하여 향상시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이 방법은 전기영동 이동성의 변화를 기초로 이중 가닥 이종듀플렉스 분자를 분리하기 위해 이종듀플렉스 분석을 이용한다(Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5).
또 다른 실시형태에서, 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 사용하여 변성제 구배를 함유하는 폴리아크릴아마이드 겔 내 돌연변이 또는 야생형 단편의 움직임을 분석한다(Myers et al. (1985) Nature 313:495). 분석 방법으로 DGGE를 사용하는 경우, DNA는, 예를 들어, PCR로 약 40bp의 고-융점 GC-풍부 DNA의 GC 클램프를 추가하는 것을 통해 완전히 변성되지 않도록 변형될 것이다. 추가 실시형태에서, 대조군 및 샘플 DNA의 이동성 차이를 확인하기 위해 변성 구배 대신 온도 구배를 사용한다(Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753).
점 돌연변이를 검출하는 다른 기술의 예는 선택적 올리고뉴클레오타이드 혼성화, 선택적 증폭 또는 선택적 프라이머 연장을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 알려진 돌연변이를 중앙에 배치하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제조하고, 이어서, 완전한 매치가 발견되는 경우에만 혼성화가 이루어지는 조건 하에서 표적 DNA와 혼성화할 수 있다(Saiki et al. (1986) Nature 324:163; Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). 올리고뉴클레오타이드가 혼성화 막에 부착되고 표지된 표적 DNA와 혼성화될 때, 이러한 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드는 PCR 증폭 표적 DNA 또는 다수의 다른 돌연변이와 혼성화된다.
대안적으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립유전자 특이적 증폭 기술을 본 발명과 결합하여 사용할 수 있다. 특이적 증폭용 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 분자의 중심(이에 따라 증폭은 차별적 혼성화에 의존함)(Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) 또는 하나의 프라이머의 적절한 조건 하에서 미스매치가 중합효소 연장을 차단하거나 감소시킬 수 있는 위치(Prossner (1993) Tibtech 11:238)의 3' 최말단에 관심대상 돌연변이를 가질 수 있다. 추가로, 절단-기반 검출을 위해 돌연변이의 영역 내 신규 제한 부위를 도입하는 것이 바람직할 수 있다(Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). 소정의 실시형태에서, 증폭은 Taq 리가제를 사용하여 수행할 수 있을 것으로 예상된다(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). 이러한 경우에, 결찰은 증폭 유무를 확인하여 특정 위치에 알려진 돌연변이의 존재를 검출할 수 있게 하는 5' 서열의 3' 말단에서 정확한 일치가 있는 경우에만 발생할 것이다.
XIII. 임상 효능
임상 효능은 당해 분야에 알려진 임의의 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 항-KIR3DL3 항체 요법과 같은 요법에 대한 반응은 요법에 대한 암, 예컨대, 종양의 임의의 반응, 바람직하게는 신보조제 또는 보조제 화학요법의 개시 이후 종양 크기 및/또는 부피의 변화와 관계된다. 종양 반응은 전신성 개입 이후 종양의 크기를 CT, PET, 유방조영상, 초음파 또는 촉진으로 측정하여 초기 크기 및 치수와 비교할 수 있고 종양의 세포성을 조직학적으로 추산하고 치료 시작 전에 얻은 종양 생검의 세포성과 비교할 수 있는 신보조제 또는 보조제 상황에서 평가할 수 있다. 반응은 생검 또는 수술적 절제 이후 종양의 캘리퍼 측정 또는 병리학적 검사로도 평가할 수 있다. 반응은, 종양 부피 또는 세포성에서의 백분율 변화와 같은 정량적인 방식으로 또는 "병리학적 완전 반응"(pCR), "임상적 완전 완화"(cCR), "임상적 부분 완화"(cPR), "임상적 안정 질환"(cSD), "임상적 진행 질환"(cPD) 또는 다른 정량적 기준과 같은 정량적인 방식에서 잔여 암 부담(Symmans et al., J. Clin. Oncol. (2007) 25:4414-4422) 또는 밀러-페인 스코어(Miller-Payne score)(Ogston et al., (2003) Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327)와 같은 반-정량적 채점을 사용하여 기록할 수 있다. 신보조제 또는 보조요법의 시작 이후 초기, 예를 들어, 몇 시간, 며칠, 몇 주 또는 바람직하게는 몇 달 후에 종양 반응의 평가를 수행할 수 있다. 반응 평가의 전형적인 종료점은 신보조제 화학요법의 종료 시기 또는 잔여 종양 세포 및/또는 종양 상의 수술적 제거 시기이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 요법적 치료의 임상적 효능은 임상적 이익률(CBR)을 측정하여 결정할 수 있다. 임상적 이익률은 요법의 종료점에서 적어도 6개월의 시점에 완전 완화(CR)에 속하는 환자의 백분율, 부분 완화(PR)에 속하는 환자의 수 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수의 합을 결정하여 측정한다. 이 공식은 6개월에 걸쳐서 CBR=CR+PR+SD이다. 몇몇 실시형태에서, 특정 항-면역관문 치료 요법에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 그 이상이다.
항-면역관문 요법에 대한 반응을 평가하는 추가적인 기준은 다음의 모두를 포함하는 "생존"과 관련된다: 전반적인 생존으로도 알려진 사망까지의 생존(여기서 상기 사망은 원인 또는 관련 종양에 관계없는 것일 수 있음); "재발없는 생존"(여기서 용어 재발은 국소 및 원거리 재발을 모두 포함해야 함); 무전이 생존; 무질환 생존(여기서 용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함해야 함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작점(예컨대, 진단 시간 또는 치료 시작) 및 종료점(예컨대, 죽음, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산할 수 있다. 추가로, 치료 효능의 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 확률, 주어진 시간 내의 전이 확률 및 종양 재발 확률을 포함하도록 확장할 수 있다.
예를 들어, 적절한 역치를 결정하기 위해, 대상 집단에 특정 항-암 치료 요법을 집행할 수 있으며 결과를 임의의 항-면역관문 요법의 집행 전에 결정된 바이오마커 측정치와 관련시킬 수 있다. 결과 측정치는 신보조제 설정에서 주어진 요법에 대한 병리학적 반응일 수 있다. 대안적으로, 바이오마커 측정치가 알려진 항-면역관문 요법을 따르는 대상체에 대해 일정 시간 동안 전체 생존 및 질환-없는 생존과 같은 결과 측정치를 모니터할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항-면역관문 제제의 동일 투여량을 각 대상체에 투여한다. 관련된 실시형태에서, 투여된 투여량은 항-면역관문 제제에 대해 당해 분야에 알려진 표준 투여량이다. 대상체를 모니터하는 시간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개월 동안 대상체를 모니터할 수 있다. 실시예 부분에 기재된 것들과 같은 방법을 사용하여 항-면역관문 요법의 결과에 상관되는 바이오마커 측정 역치를 결정할 수 있다.
XIV. 키트
또한, 본 개시내용은 또한 생물학적 샘플에서 KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플샘플에서 KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 검출 가능한 표지된 화합물 또는 물질; 샘플에서 KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 양을 결정하기 위한 수단; 및 샘플샘플의 KIR3DL3 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 양을 표준과 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 예후, 치료 및/또는 면역요법 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 항-KIR3DL3 항체 및/또는 항-HHLA2 항체(예컨대, 본 명세서에 기재된 것들)를 포함할 수 있다. 화합물 또는 작용제는 적합한 용기에 포장될 수 있다. 본 개시내용에 의해 포괄되는 키트는 고체 지지체, 예컨대, 조직 배양 플레이트 또는 비드(예컨대, 세파로스 비드)에 커플링된 항체를 함유할 수 있다.
키트는 설계된 특정 적용에 용이하도록 추가 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시험관 내, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 KIR3DL3의 검출 및 정량화를 위한 항체를 함유하는 키트로 제공될 수 있다. 추가로, 키트에 함유될 수 있는 예시적인 물질은 표지 검출 수단(예컨대, 효소적 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 양 항-마우스-HRP와 같은 적절한 2차 표지 등) 및 대조군을 위해 필요한 시약(예컨대, 대조군 생물학적 샘플 또는 KIR3DL3 단백질 표준)을 포함한다. 키트는 개시된 발명의 방법에서 사용하기 위한 것으로 인식되는 완충제 및 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 예는 담체 단백질 또는 세제와 같은 비특이적 결합을 줄이는 물질을 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 본 명세서에 제공된 기재된 발명의 방법에서 기재된 발명의 키트 또는 항체의 사용을 나타내거나 기술한 교육용 재료를 포함할 수 있다.
다음의 실시예를 통해 본 발명을 추가로 설명하며, 이 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서를 통해 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용뿐만 아니라, 도면들은 본 명세서에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
HHLA2에 대한 새로운 수용체를 식별하기 위한 발현 스크린
새로운 HHLA2 수용체를 식별하기 위하여 세포 마이크로어레이 기술(Retrogenix, 영국 하이피크 소재)을 사용하였다. 3,500개 초과의 상이한 원형질막 단백질을 포함하는 대략 5500개의 전장 cDNA 클론의 라이브러리를 13개 마이크로어레이 슬라이드("슬라이드 세트")에 걸쳐서 이중으로 배열하였다. cDNA 클론 위에서 인간 HEK293 세포를 성장시키고 역-형질감염시켰다. 발현 벡터(pIRES-hEGFR-IRES-ZsGreen1)를 매 슬라이드마다 사중으로 스포팅하고, 매 슬라이드 상에서 형질감염 효율의 최소 역치가 달성되었는지 또는 초과되었는지를 확인하는데 사용하였다. 얻어진 세포 마이크로어레이는 가용성 인간 HHLA2-mIgG2a 융합 단백질에 대한 결합에 대해 평가되었다.
인간 HHLA2-mIgG2a 융합 단백질을 고정된 세포 마이크로 슬라이드에 20 ㎍/㎖ 농도로 첨가하고, AF647 표지된 항-마우스 IgG 검출 항체로 결합 상호작용을 검출하였다. 13개 슬라이드 세트 각각에 대해 2개의 복제 슬라이드를 스크리닝하였다. ImageQuant 소프트웨어(GE)를 사용하여 형광 이미지를 분석하고 (형질감염 효율을 위해) 정량하였다. 단백질 '히트'는 배경 수준과 비교하여 상승된 신호를 보이는 중복 스폿으로 정의되었다. 이것은 ImageQuant 소프트웨어 상에 격자화된 이미지를 사용하여 가시적 검사로 달성하였다.
어느 히트(들)가, 만약 있다면, 재현 가능하고 인간 HHLA2에 특이적인지를 결정하기 위하여, 적절한 대조군 KIR 수용체에 더해서 모든 라이브러리 스크리닝 히트를 암호화하는 벡터를 배열하고, 새로운 슬라이드 상에서 HEK293 세포에 발현시켰다. 라이브러리 스크린 또는 적절한 양성 및 음성 대조군 처리에 사용된 용량 및 인큐베이션 조건을 사용하여, 동일한 슬라이드를 가용성 HHLA2-mIgG2a로 스크리닝하였다(n = 2개 슬라이드/처리).
KIR3DL3 항체 특이성 검정
완전한 KIR 패밀리 cDNA 패널을 발현하는 복제 마이크로어레이 슬라이드를 고정시키고, PBS/0.5% BSA를 함유하는 완충액으로 차단하고, PBS/0.1% BSA 중에서 개별 KIR3DL3 mAb 하이브리도마 상청액과 1:5, 1:25 및 1:250 희석으로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 어레이를 PBS로 세척하고, AF647-접합된 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Life Technologies, A21235)를 함유하는 PBS/0.1% BSA에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 건조시키고, ZsGreen1 및 AF647 형광을 위하여 이미지화하였다. HHLA2-mIgG2a(20 ㎍/㎖)는 스포팅된 어레이 상에서 KIR3DL3 및 TMIGD2에 대한 결합을 검출하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
수용체 결합 및 차단 검정
KIR3DL3 mAb를 KIR3DL3 형질감염된 300.19 세포와 4℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션시켰다. HHLA2-마우스 IgG2a(IgG2a L235E, E318A, K320A, K322A)(10 ㎍/㎖ 중 25㎕)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 계속 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고 HHLA2-마우스 IgG2a의 결합을 5 ㎍/㎖ Alexa 647 접합된 298.6F8 mAb(L235E, E318A, K320A, K322A에서 돌연변이된 마우스 IgG2a에 대해서 특이적인 마우스 항체)로 검출하였다. EC50 및 IC50 분석은 GraphPad Prism® 8을 사용하여 수행하였다.
세포주 및 세포 배양
Raji 세포주(ATCC CCL-86), Jurkat(클론 E6-1)(ATCC TIB-152), CHO-K1(ATCC CCL-61), A498(ATCC HTB-44), 786-O(ATCC CRL-1932) 및 K562(ATCC CCL-243) 및 NK-92 MI(ATCC CRL-2408) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 얻었다. 786-O, A498, Raji, Jurkat 및 K562 세포를 10% 소태아 혈청(FBS, Life Technologies 26140-079), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone SV30010.01)이 보충된 RPMI1640 배지(Life Technologies A10491-01) 중에서 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. NK-92MI 세포를 10% FBS(Life Technologies 26140-079)가 보충되고 그리고 10% 인간 혈청(Sigma Aldrich H3667-100ML), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone SV30010.01)이 보충된 X-VIVO 15™ 혈청 무함유 조혈 세포 배지(Lonza 04-418Q)를 사용하여 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 표시된 경우, 세포를 IFN-γ(R&D #285-IF/CF; 10 ng/㎖), IL-10(R&D #1064-IF/CF; 10 ng/㎖) 또는 TGF-β1(R&D #4454-BH; 10 ng/㎖)로 처리하였다.
TMIGD2-NFAT-Jurkat 안정 세포주 배양물에 TMIGD2 및 NFAT 리포터의 재조합 발현이 유지되는 것을 확보하기 위하여 1000 ㎍/㎖의 Geneticin™(Life Technologies 11811031) 및 200 ㎍/㎖ 하이그로마이신(Invitrogen 10687010)을 보충하였다. KIR3DL3-IL2-Jurkat 안정 세포주 배양물에 KIR3DL3 및 IL-2 리포터의 발현이 유지되는 것을 확보하기 위하여 1000 ㎍/㎖의 Geneticin™ 및 0.25 ㎍/㎖ 퓨로마이신(InvivoGen ant-pr-1)을 보충하였다. K562 HHLA2 안정 세포주에 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 보충하였다. CHO 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 F12-K(Hyclone SH30526.01) 배지에서 유지시켰다. HHLA2-항-CD3 scFV-CHO 안정 세포주 배양물을 HHLA2 및 TCR 활성체의 재조합 발현이 유지되는 것을 확보하기 위하여 1000 ㎍/㎖의 Geneticin™ 및 500 ㎍/㎖의 하이그로마이신으로 보충하였다.
인간 T 및 NK 세포의 활성화 및 배양
RosetteSep™ 인간 T 세포 농축 칵테일(Stemcell# 15021)을 사용하여 건강한 공여체의 혈액으로부터 음성 선택에 의해 T 세포를 단리시켰다. 제조사의 권장 프로토콜(Stemcell 10971)에 따라서 ImmunoCult™ 인간 CD3/CD28 T 세포 활성체 사량체를 사용하여 T 세포를 활성화시키고 100 U/㎖의 IL-2(Peprotech # 200-02)의 존재 하에 ImmunoCult™-XF T 세포 확장 배지(Stemcell 10981)를 사용하여 배양하였다. 표시된 시간에, T 세포를 다음 항체로 염색하였다: Alexa 647 1G7 항체(KIR3DL3 항체) 또는 Alexa 647 마우스 IgG2b, κ 아이소타입 대조군(Biolegend# 400330) 5ug/㎖, BV785 항 인간 CD3(Biolegend #344842), PE/Cyanine7 항-인간 CD8 항체(Biolegend #344712), PE/Cyanine7 항-인간 CD4 항체(Biolgend #317414), PE/Cyanine7 마우스 IgG2b, κ 아이소타입(Biolegend # 400325), PE/Cyanine7 마우스 IgG1, κ 아이소타입(Biolegend# 400125) 및 BV785 마우스 IgG1, κ 아이소타입(Biolegend# 400169).
NK-92(ATCC CRL-2407) 및 NK-92 MI(ATCC CRL-2408) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 얻었다. NK-92MI 세포를 10% FBS(Life Technologies 26140-079)가 보충되고 10% 인간 혈청(Sigma Aldrich H3667-100ML), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone SV30010.01)이 보충된 X-VIVO 15™ 혈청 무함유 조혈 세포 배지(Lonza 04-418Q)를 사용하여 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다.
플라스미드 작제
TCR 활성체인 막-고정 키메라 항체는, 마우스 CD8α(수탁번호: NP_001074579.1)의 C-말단 도메인(113 내지 220)에 인간 CD3 mAb OKT3 (Kipriyanov et al. 1997, PEDS 10:445-453)의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 융합시킴으로써 작제하였다. TCR 활성체를 암호화하는 DNA 서열을 합성하고 pIRES-hyg3 벡터(ClonTech)에 삽입하여 작제물 TCRa_pIREShyg3을 작제하였다. 인간 HHLA2(수탁번호: NM_009003), TMIGD2(수탁번호: NM_144615) 및 KIR3DL3(KIR3DL3*00402 대립유전자에 대응하는 Genbank 수탁번호 BC143802.1)의 DNA 서열을 합성하고 pIRES-Hyg3 또는 pIRES-Neo3에 개별적으로 삽입하여 HHLA2_pIRESneo3, TMIGD2_pIREShyg3 및 KIR3DL3_pIREShyg3을 제작하였다. NFAT 리포터는 4 카피의 NFAT 반응 요소에 이은 최소 프로모터의 조절 하의 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 함유한다. IL2 리포터는 내생적 IL2 프로모터의 조절 하의 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 함유한다. 리포터를 암호화하는 DNA 서열을 pcDNA 3.1에 삽입하여 NFAT-Luc-pcDNA 및 IL2-Luc-pcDNA를 생성하였다.
안정적인 세포주의 생성
Jurkat 세포(클론 E6-1)를 전기천공에 의해 NFAT_Luc_pcDNA 및 TMIGD2_pIREShyg3으로 순차 공동-형질감염시켰다. 하이그로마이신(200 ㎍/㎖) 및 G418(1000 ㎍/㎖) 이중 선택 및 제한 희석에 의해 안정적인 클론을 생성시켰다. 선택된 안정적인 세포 클론을 하이그로마이신 및 G418이 보충된 완전한 세포 배양 배지에서 유지시켰다. Jurkat 세포(클론 E6-1)를 전기천공에 의해 IL2_Luc_pcDNA 및 KIR3DL3_puro로 순차 공동-형질감염시켰다. 퓨로마이신(0.25 ㎍/㎖) 및 G418 (1000 ㎍/㎖) 이중 선택 및 제한 희석에 의해 안정적인 클론을 생성시켰다. 선택된 안정적인 세포 클론을 퓨로마이신 및 G418이 보충된 완전한 세포 배양 배지에서 유지시켰다. CHO-K1 세포를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)에 의해 TCRa_pIREShyg3 및 HHLA2_pIRESneo3으로 순차 공동-형질감염시켰다. 하이그로마이신 및 G418 이중 선택 및 제한 희석에 의해 안정적인 클론을 생성시켰다. 선택된 안정적인 세포 클론을 하이그로마이신 및 G418이 보충된 완전한 세포 배양 배지에서 유지시켰다.
인간 β2-마이크로글로불린 유전자(5'-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC)(World Wide Web at addgene.org/84381/)를 표적으로 하는 sgRNA는 첫 번째 및 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸 3' 포스포로티오네이트 변형을 가진 상태로 Synthego로부터 구입하였다. 2㎕의 66.88μM의 Cas9 뉴클레아제(Aldevron, SpyFi Cas9 뉴클레아제 9214-0.25MG)를 3㎕의 100μM sgRNA와 혼합하였다. Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA를 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. Raji 세포에 대해서 Lonza 권장 설정에 따라서 Lonza 4D Nucleofector를 사용하여 Cas9 RNP로 Raji 세포를 전기천공하였다. Raji 세포를 48시간 동안 배양하고, 이어서 인간 β2-마이크로글로불린 항체(Biolegend 395711)를 사용하여 β2-마이크로글로불린 음성에 대해서 분류하였다. 순수한 β2-마이크로글로불린 음성 세포 집단이 얻어질 때까지 여러 번 β2-마이크로글로불린 음성 세포를 배양하고 재분류하였다.
리포터 검정
TMIGD2_NFAT_Jurkat 리포터 활성:
HHLA2-TCR-CHO 및 TCR-CHO 세포를 백색 불투명한 바닥 96-웰 플레이트에서 CHOK1 성장 배지 중 2×104개 세포/웰 밀도로 파종하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 다음날, 배지를 제거하고, 50㎕ Jurkat 세포 배지에서 4 내지 5×104 세포/웰에 TMIGD2_NFAT_Jurkat 리포터 세포주(클론 # 62)의 첨가 전에 세포를 50㎕의 Jurkat 세포 배지에서 HHLA2 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양물을 3 내지 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라서 100㎕ ONE-Step™ 루시페라제 검정 시스템(BPS Bioscience, 60690)을 첨가함으로써 루시페라제 신호를 생성시키고, 루미노미터에서 발광을 측정하였다.
KIR3DL3_IL2_Jurkat 리포터 활성
HHLA2-TCR-CHO(클론 # 28) 또는 TCR-CHO 세포를 백색 불투명한 바닥 96-웰 플레이트에서 CHO-K1 성장 배지 중 2×104개 세포/웰 밀도로 파종하고, 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 다음날, 배지를 제거하고, 웰당 100㎕ 검정 혼합물(클론 9.3, BioXcell BE0248) 중에 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 CD28 항체와 함께 50㎕ Jurkat 세포 배지에서 4 내지 5×104 세포/웰에 KIR3DL3_IL2_Jurkat 리포터 세포주(Clone # 2-12)의 첨가 전에 세포를 50㎕ Jurkat 세포 배지에서 HHLA2 또는 KIR3DL3 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라서 100㎕ ONE-Step™ 루시페라제 검정 시스템(BPS Bioscience, 60690)을 첨가함으로써 루시페라제 신호를 생성시키고, 루미노미터에서 발광을 측정하였다.
항체 생성
HHLA2 mAb: BALB/c 마우스를 완전 프로인트 항원보강제 중 50㎍의 재조합 HHLA2-mIg2a로 피하 주사에 의해 프라이밍한 후 50㎍의 재조합 HHLA2-mIgG2a로 3 내지 4회 부스팅하고 나서 불완전 프로인트 항원보강제 중 변성 HHLA2-mIgG2a로 복강내 주사하였다. 최고 HHLA2 항체 역가를 보이는 마우스로부터의 비장 및 림프절 세포를 SP2/0 골수종 세포에 융합시키고, 하이브리도마 상청액을 HHLA2 형질감염된 부모 300.19 세포 상에서 유세포 분석에 의해 스크리닝하였다.
KIR3DL3 mAb: BALB/c 마우스를 카디오톡신(50㎕의 10 mM)으로 근육내 주사에 의해 프라이밍하고 KIR3DL3 cDNA를 함유하는 100㎍ 플라스미드로 동일한 주사 경로에 의해 면역화시켰다. 추가로 2회의 카디오톡신 전처리 및 KIR3DL3 플라스미드 DNA 및 KIR3DL3 형질감염된 NIH-3T3 세포에 의한 부스팅을 수행하였다. 최고 KIR3DL3 항체 역가를 나타낸 마우스로부터의 비장 및 림프절 세포를 SP2/0 골수종 세포에 융합시키고, 하이브리도마 상청액을 KIR3DL3 형질감염된 부모 300.19 세포 사에서 유세포 분석에 의해 스크리닝하였다.
NK 세포독성 검정
KILR 검출 키트(Eurofins/Discoverx 97-0001M)를 사용하여 NK92-MI 세포 세포독성을 결정하였다. 제조사의 권장을 사용하여, 표적 세포인, K562 세포를 KILR Retroparticles(KILR® Retroparticles for Adherent & Suspension 세포(G418), Eurofins/Discoverx 97-0006)로 감염시켰다. 감염된 세포를 500 ㎍/㎖ G418에 선택하였다. NK92-MI(효과기) 세포를 1:1, 3:1 및 5:1의 효과기-대-표적(E:T) 비로 104개 K562 표적 세포로 96-웰 플레이트에서 37℃에서 4시간 동안 공동-배양하였다. 효과기 세포 또는 표적 세포에 실온에서 100㎕ KILR 검출 시약을 첨가한 1시간 후에 루미노미터 상에서 세포 용해를 검출하였다. 표시된 경우, NK92-MI(효과기) 세포를 0.1, 1.0 및 10 ㎍/㎖ 농도로 HHLA2 또는 KIR3DL3 차단 항체 및 적절한 아이소타입 대조군과 인큐베이션시키고, 3:1의 고정된 효과기-대-표적(E:T) 비로 K562 (표적) 세포와 37℃에서 4시간 동안 공동-배양하였다. 특이적 용해 백분율(percentage specific lysis)은 다음과 같이 계산하였다:
특이적 용해(%) = [광학 밀도(OD) 실험군-OD 표적 세포 천연 방출 대조군]/(OD 표적 세포 최대 방출 대조군-OD 표적 세포 천연 방출 대조군)×100. 최대 방출은 제조사에 의해 제공된 용해제로 처리 후 측정하였다.
Raji 및 HHLA-2 형질감염된 Raji 세포(β2-마이크로글로불린 넉아웃)를 PBS 중 1μM 칼세인 AM(BioLegend 425201)으로 실온에서 20분 동안 염색하고 나서, PBS로 2회 세척하고 2×106/㎖의 RPMI 완전 배지에 재현탁시켰다. 5×104 Raji 표적 세포 및 NK-92 MI 효과기 세포를 1:1, 2:1 및 3:1 E/T 비로 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 5% CO2와 함께 37℃에서 4시간 동안 HHLA2 또는 KIR3DL3 항체 또는 아이소타입 대조군의 존재 하에 배양하였다. 이어서, 플레이트를 얼음 위에 놓고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 분석은 FlowJo를 사용하여 수행하였다. 세포 용해 퍼센트는 다음과 같이 계산하였다: 세포독성 % = 효과기 부재 하의 칼세인 AM+표적 세포 %(100%) - 효과기의 존재 하의 칼세인 AM+표적 세포 %(E/T비+1).
CD107 탈과립화 검정
Raji β2-마이크로글로불린 KO 및 HHLA-2 형질감염된 Raji β2-마이크로글로불린 KO를 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 1:1, 2:1 및 3:1의 효과기 대 표적비(E:T)로 NK-92 MI와 함께 5% CO2와 함께 37℃에서 3시간 동안 공동-배양하였다. 항-KIR3DL3 항체(1G7) 및 마우스 IgG2b 아이소타입은 10 ㎍/㎖로 사용하였다. 항체 BV421 항 인간 CD107a(Biolegend # 328625), APC 항-인간 CD56(Biolegend #362503), APC 마우스 IgG1, κ 아이소타입 Ctrl(Biolegend #400121) 및 BV421 마우스 IgG1, κ 아이소타입 Ctrl(Biolegend # 400157)은 1:100 희석으로 사용하였다. Monensin Solution(1,000X)(Biolegend #420701)은 1:1000 희석으로 사용하고, 세포 자극 칵테일, PMA/Ionomycin(Biolegend #423301)은 1:500 희석으로 사용하였다. 이어서, 플레이트를 얼음 위에 놓고, 유세포 분석 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 CD56 게이팅된 세포 상에서 CD107a 발현에 대해서 세포를 분석하였다.
HHLA2 형질감염된 K562 및 RAJI BETA-2 마이크로글로불린 넉아웃 표적 세포의 유도:
K562 세포를 10% 소태아 혈청(FBS, Life Technologies 26140-079), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone SV30010.01)이 보충된 RPMI1640 배지(Life Technologies A10491-01)에서 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션시켰다.
K562 세포를 pEF-Puro 벡터에서 50 ug의 Mlu I 선형화된 HHLA2 cDNA로 전기천공하고(300 볼트, 1600 마이크로패럿(uFarad)), 퓨로마이신 내성에 대해서 선택하고, PE-접합된 HHLA2 mab 6F10로 염색하고, 분류하고, 단일 세포 클로닝하였다. K562 HHLA2 안정 세포주를 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신이 보충된 위에서 나타낸 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
웨스턴 블롯 분석
단백질 용해물을 제조사의 지시에 따라서 프로테아제 저해제 칵테일(Thermo Scientific; 완전 Ultra 정제, mini, EDTA-무함유, Roche)과 함께 RIPA 완충액으로 제조하였다. 용해물을 단일 폭 레인 4 내지 15% 구배 mini-Protean TGX 겔(Biorad)에 장입하고, 반건조 방법에 의해 전환시켰다. 막을 Tween20(TBST)을 지닌 Tris-완충 식염수 중 12% 무지방 우유 및 1% 정상 염소 혈청으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 막을 TBST로 세척하고, 다중벽-미니-블로터에서 TBST 및 1% BSA 중 5 ug/㎖의 574.1F12, 항-KIR3DL3 mAb와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 막을 TBST로 3회 실온에서 세척하고, TBST 중 2차 항체(1:4000, HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG, Southern Biotech), 6% 무지방 우유 및 0.5% 정상 염소 혈청과 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. TBST로 3회 추가로 세척 후, 1:1비의 ECL 기질:인핸서를 막(SuperSignal West Pico 안정 퍼옥사이드 용액, Supersignal West Pico 루미놀/인핸서 용액, ThermoScientific)에 첨가하고 Hyblot CL 오토라디오그래피 필름(Denville Scientific) 상에 이미지화하였다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR
Purelink RNA 미니 키트(ThermoFisher)를 사용하여 세포 펠릿으로부터 총RNA를 추출하였다. 제조사의 권장에 따라서 High Capacity RNA-to-cDNA 키트(Applied Biosystems, ThermoFisher)로 cDNA 합성을 수행하였다. 제조사의 권장에 따라서 Power SYBR™ Green PCR Master Mix를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기를 포함하였다:
Figure pct00051
18S는 각 샘플에 대해서 내부 대조군으로서 사용하였다. 상대 mRNA 수준은 2-ΔΔCT 공식으로 결정하였고, 실험은 3회 반복하였다.
ccRCC 환자에서의 mRNA 발현의 분석
TCGA 신장 투명 세포 환자에 대한 TCGA RSEM RNASeqV2 데이터는 gdac.broadinstitute.org/runs/stddata__2016_01_28/data/ KIRC/20160128/gdac.broadinstitute.org_KIRC.Merge_rnaseqv2__illuminahiseq_rnaseqv2__unc_edu__Level_3__RSEM_genes__data.Level_3.2016012800.0.0.tar.gz)에서 World Wide Web에서 TCGA GDAC로부터 다운로드하였다. TPM(Transcripts per Million)을 도출하기 위하여, "scaled_estimate" 출력값에 106을 곱하였다. 이들 TPM값을 log2(TPM+1)로 변환하고, Wilcoxon 순위 합계 시험을 사용해서 각 유전자에 대해서 종양 및 정상 발현을 비교하였다.
세포분석:
세포를 Gallios 유세포분석기(Configuration: 488㎚, 561㎚, 405㎚, 355㎚ 및 635㎚) 또는 BD Fortessa 유세포분석기 상에서 분석하였다. 데이터를 FlowJo로 또는 Kaluza 소프트웨어로 분석하였다. 각 실험에 대해서, 10,000 내지 20,000개의 세포를 분석하였다.
통계:
달리 나타내지 않는 한, GraphPad Prism® 소프트웨어 7을 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 데이터는 달리 기술된 경우를 제외하고 평균±S.D.(오차 막대)로서 제시된다(도면 범례 참조). 스튜던트의 t 검정 및 이원 ANOVA는 범례에 표시된 바와 같이 사용되었다(유의하지 않음(ns), P≥0.05; *P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001; ****P≤0.0001).
실시예 2: HHLA2에 대해서 제2 수용체로서의 KIR3DL3의 식별 및 특성규명
HHLA2에 대한 저해 수용체를 식별하기 위하여, 유리 슬라이드 상에서 HEK293 세포에서 개별적으로 각각 발현되는 대략 5500 세포 표면 수용체의 라이브러리 상에서 가용성 인간 HHLA2-mIgG2a 융합 단백질(HHLA2-Ig)을 사용하여 수용체 스크린을 수행하였다. 스크린은 HHLA2 결합에 대한 양성 신호로서 KIR3DL3을 식별하였다(도 1A 및 도 2A). 예상대로, HHLA2-Ig는 또한 TMIGD2 및 Fc 수용체인 FCGR2A에 결합되었지만, EGFR, PD-1 또는 PD-L1에는 결합되지 않았다(도 1A). KIR3DL3은 리간드가 아직 기재되지 않은 KIR 유전자 패밀리의 구성원이다. KIR 패밀리의 다른 구성원은 KIR3DL3만 식별하는 5500 cDNA 스크린에 존재했지만, 특이성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 KIR3DL3 및 KIR 유전자 패밀리의 다른 구성원에 대한 HHLA2-Ig 결합을 개별적으로 시험하였다. HHLA2-Ig는 KIR3DL3에만 결합되었고, KIR 패밀리의 다른 구성원에는 결합되지 않았다(도 1A 및 도 2A).
HHLA2/KIR3DL3 및 HHLA2/TMIGD2 상호작용을 확인하기 위하여, TMIGD2 및 KIR3DL3을 발현하는 세포에 대한 HHLA2-Ig의 결합을 시험하였다. KIR3DL3 및 TMIGD2는 300.19 마우스 전구-B 세포 백혈병 세포주에서 안정적으로 과발현되었고 형질감염된 세포를 HHLA2-mIgG2a와 함께 인큐베이션시키고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 본 명세서에서 HHLA2의 두 수용체인 KIR3DL3 및 TMIGD2에 대한 용량 의존적 결합이 매우 유사한 50% 최대 결합 수준으로 발견되었는데, 이는 이들 두 수용체에 대해서 유사한 결합 친화성을 나타낸다(도 1B 및 도 4A). 형질감염되지 않은 300.19 세포에 대한 또는 HHLA2 자체(HHLA2로 형질감염된 300.19 세포)에 대한 결합은 없었다. 유사한 특이적 결합이 KIR3DL3 및 TMIGD2가 일시적으로 형질감염된 293T 세포에서 관찰되었다(도 4B 및 도 4C).
실시예 3: KIR3DL3 단클론성 항체의 유도
다수의 항-KIR3DL3 단클론성 항체를 생성하고 분석하였다. 간략히 말하면, 인간 KIR3DL3 cDNA 플라스미드 및 KIR3DL3 형질감염된 3T3 또는 300.19 세포를 생산하고 KIR3DL3 마우스 단클론성 항체의 유도를 위하여 마우스를 면역화하기 위하여 사용하였다. 4 내지 6주령의 다섯 마리의 마우스(Balb/c; C57Bl/6; Swiss-Webster)를 Charles River Laboratories(매사추세츠주 윌밍턴 소재)에서 얻었다. 하버드 동물 상임위원회의 동물 관리 및 사용 위원회의 가이드라인에 따라 모든 동물을 획득 및 유지하였다. 마우스를 플라스미드 DNA의 근육내 주사 전 5일에 50ul의 10mM 카디오톡신(Naja nigricollis venom; Latoxan Laboratories, 프랑스 소재)의 사전 주사로 경골근에서 프라이밍시켰다. 마우스를 마취시키고, 둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS; GIBCO, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에 현탁된 100 마이크로그램의 cDNA를 양 경골근(각각 50 ul)에 주사하였다. 카디오톡신 전처치 및 cDNA 부스트를 제14일 및 제28일에 반복하였다. 5주 후에 마우스를 PBS 중 KIR3DL3 형질감염된 300.19 세포로 면역화시켰다. 2주 후에 마우스를 PBS 중 KIR3DL3 형질감염된 NIH-3T3 세포로 면역화시켰다. 10일 후에 마우스를 채혈하고, 유세포 분석에 의해 KIR3DL3 형질감염된 세포에 대해서 혈청 KIR3DL3 mAb 역가를 평가하였다. 최고 혈청 KIR3DL3 mAb 역가를 나타낸 Balb/C 마우스 동물 #2가 융합을 위하여 선택되었다. 이전의 면역 5일 후, 마우스 #2를 PBS 중 KIR3DL3 형질감염된 NIH-3T3 세포로 부스팅하고 4일 후 융합시켰다. 수거한 비장 및 림프절을 세포 현탁물로 만들고 DMEM으로 세척하였다. 비장/림프절 세포를 계수하고, 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 사슬을 분비하지 못하는 SP 2/0 골수종 세포(Kearney et al. (1979) J. Immunol. 123:1548-1550 및 Kilpatrick et al. (1997) Hybridoma 16:381-389)와 2:1의 비장:골수종 비율로 혼합하였다. 표준 절차(Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)에 따라 세포를 HAT 선택 배지 중 8개의 96-웰 조직 배양 플레이트에서 폴리에틸렌 글리콜 1450과 융합시켰다. 융합 후 10일 내지 21일 사이에, 하이브리도마 콜로니가 보이게 되었고 배양 상청액을 수거하고, 이어서 KIR3DL3 cDNA로 형질감염된 300.19 세포에 대한 유세포 분석에 의해 KIR3DL3 결합에 대해 그리고 형질감염되지 않은 300.19 세포의 반응성 부족에 대해 스크리닝하였다.
유도된 KIR3DL3 mAb의 결합 특성, 예컨대, 결합 친화성은 표 3에 요약되어 있다.
실시예 4: KIR3DL3 mAb의 결합 및 선택성
도 5는 KIR3DL3 mAb가 KIR3DL3-양성 세포에 결합하는 것을 나타낸다. 표시된 농도의 KIR3DL3 mAb를 KIR3DL3 형질감염된 300.19 pre-B 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 형질감염된 300.19 세포에 대한 KIR3DL3 mAb 결합은 10 ㎍/㎖의 PE-표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L)로 검출되었다. 따라서, KIR3DL3 mAb는 세포에 의해 발현된 KIR3DL3에 결합한다.
표 4는 대부분의 KIR3DL3 mAb가 KIR3DL3에 특이적으로 결합하지만 KIR 패밀리의 다른 구성원에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 몇몇 KIR3DL3 mAb는 또한 KIR3DL1, KIR2DL5A 및/또는 KIR2DL5B에 대한 약한 결합 내지 중간 결합을 보였다. KIR 패밀리 유전자를 암호화하는 cDNA 플라스미드의 패널을 인간 HEK293 세포를 함유하는 유리 슬라이드 상에 스포팅하고, HEK293 세포에 역형질감염시켜 세포 표면 KIR 분자를 발현시켰다. 1:5, 1:25 및 1:250의 희석의 KIR3DL3 mAb 하이브리도마 상청액을 KIR 분자 패널 상에서 인큐베이션시키고, 결합은AlexaFlour647 표지된 항-마우스 IgG (H+L) 항체를 사용하고 검출하고 나서 형광에 대해 이미지화하였다(표 4). HHLA2-mIgG2a(20 ug/㎖)는 스포팅된 어레이 상에서의 KIR3DL3 및 TMIGD2에 대한 결합을 검출하는 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 6은 KIR3DL3 mAb가 웨스턴 블롯 상의 KIR3DL3에 결합하는 것을 나타낸다. KIR3DL3 형질감염된 Jurkat 세포의 단백질 용해물은 제조사의 지시에 따라서 RIPA 완충액(Thermo Scientific)으로 제조하고, 프로테아제 저해제 칵테일을 용해물 제조 전에 완충액(완전 울트라 정제(complete Ultra tablets), mini, EDTA-무함유, Roche)에 첨가하였다. 인간 KIR3DL3으로 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포로부터 단백질 용해물을 만들었다. 700㎍의 용해물을 단일 폭 레인 4-15% 구배 mini-Protean TGX 겔(Biorad)에 장입하고, 반건조 방법에 의해 전환시켰다. 막을 Tween20(TBST)을 지닌 Tris-완충 식염수 중 12% 무지방 우유 및 1% 정상 염소 혈청으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 막을 TBST로 세척하고, 다중벽-미니-블로터에서 TBST 및 1% BSA 중 1차 항체(1 내지 10, 1 내지 30, 및 1 내지 90의 하이브리도마 상청액 항-KIR3DL3 mAb의 최종 희석액)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 막을 TBST로 3회 실온에서 세척하고, TBST 중 2차 항체(1:4000, HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG, Southern Biotech), 6% 무지방 우유 및 0.5% 정상 염소 혈청과 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. TBST로 3회 추가로 세척 후, 1:1비의 ECL 기질:인핸서를 막(SuperSignal West Pico 안정 퍼옥사이드 용액, Supersignal West Pico 루미놀/인핸서 용액, ThermoScientific)에 첨가하고 Hyblot CL 오토라디오그래피 필름(Denville Scientific) 상에 이미지화하였다.
도 3A 내지 도 3E 및 표 5는 항원에 대한 항체의 결합 및 KIR3DL3 또는 TMIGD2 중 하나에 대한 HHLA2 결합을 차단하는 능력의 추가의 특성 규명을 나타낸다. KIR3DL3 및 HHLA2 항체의 용량 의존적 결합이 각각 KIR3DL3 및 HHLA2 형질감염된 300.19 세포에 대해서 관찰되었다(도 3A 및 도 3C). 6D10을 제외한 모든 HHLA2 항체는 그들의 항원에 대해 높은 친화성 결합을 나타내었다. 차단 및 비차단 항체가 식별되었다. HHLA2 항체 2G2 및 6F10은 HHLA2의 KIR3DL3 및 TMIGD2 둘 다와의 상호작용을 차단한 반면, 2C4 및 6D10 항체는 HHLA2/KIR3DL3 상호작용만 차단했지만 HHLA2/TMIGD2 상호작용을 차단하지 않았다(도 3D 및 도 3E, 표 5). KIR3DL3 mAb인 1G7, 2F11 및 8F7은 용량-의존적 방식으로 KIR3DL3에 대한 강력한 결합을 나타내었다(도 3A). 1G7 및 2F11은 KIR3DL3과 HHLA2의 상호작용을 차단한 반면, 8F7은 상호작용을 단지 약하게 차단하였다(도 3B 및 표 5). 모든 KIR3DL3 항체는 KIR3DL3에 특이적으로 결합했고, KIR2DL5A에 대한 약한 결합을 나타낸 2F11 항체를 제외하고 어떠한 다른 KIR 패밀리 구성원에도 특이적으로 결합하지 않았다(표 4).
실시예 5: KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합의 KIR3DL3 mAb 차단
도 9는 KIR3DL3 mAb가 KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합을 차단하는 것을 나타낸다. 표시된 농도의 KIR3DL3 mAb를 KIR3DL3 형질감염된 300.19 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션시켰다. HHLA2-마우스 IgG2a(IgG2a L235E, E318A, K320A, K322A에서 돌연변이됨)(10 ug/㎖의 25 ul)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 계속 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, HHLA2-마우스 IgG2a의 결합은 5 ug/㎖ Alexa647 접합된 298.6F8 mAb(L235E, E318A, K320A, K322A에서 돌연변이된 마우스 IgG2a에 대해서 특이적인 마우스 항체)로 검출되었다. EC50 및 IC50 분석은 GraphPad Prism®을 사용하여 수행하였다.
Figure pct00052
Figure pct00053
표 4에서, (도 1A, 도 2B 및 도 2C에서와 같이) KIR 패밀리 cDNA 패널을 발현하는 복제 마이크로어레이 슬라이드를 고정시키고, PBS/0.5% BSA를 함유하는ㄴ 완충액으로 차단하고, PBS/0.1% BSA 중에 1:5, 1:25 및 1:250 희석의 개별적인 KIR3DL3 mAb 하이브리도마 상청액으로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 어레이를 PBS로 세척하고, AF647-접합된 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Life Technologies, A21235)를 함유하는 PBS/0.1% BSA 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 건조시키고, ZsGreen1 및 AF647 형광에 대해서 이미지화하였다.
실시예 6: KIR3DL3는 T 세포 활성화 후에 몇몇 T 세포에서 유도되고 NK92-MI 세포에서 발현된다
앞서 발표된 연구는 TMIGD2가 미경험 T 및 NK 세포에서 발현되고 활성화로 하향조절되는 것을 나타내었다. NKG2A 및 KIR 수용체와 같은 몇몇 NK 세포 수용체는 CD8 림프구에서 발현될 수 있다. T 세포에서의 KIR3DL3의 발현이 평가되었다. T 세포를 공여체 전혈로부터 정제하고, CD3/CD28 항체 사량체로 활성화시키고, KIR3DL3 발현을 게이팅된 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포에서 결정하였다(도 10A). 최소 KIR3DL3 발현(0.26%의 CD4+ 세포 및 0.39%의 CD8+ 세포)이 제0일에 관찰되었고(비활성화)(도 10B), 제3일 및 제10일에 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에서 KIR3DL3 발현의 증가가 있었고 활성화 후 제21일에 피크로 되었다(6.60%의 CD4+ 세포 및 5.69%의 CD8+ 세포)(도 10C).
KIR3DL3을 내생적으로 발현하는 NK 세포주인 NK92-MI가 본 명세서에서 식별되었다. NK92-MI는 IL-2 cDNA의 형질감염에 의해 원래의 NK92에서 유도되었고, IL-2를 과발현하여, IL-2의 외인성 적용을 필요로 하지 않는다. KIR3DL3은 소수의 부모 NK92 세포에서 발현되었지만 유세포 분석 및 웨스턴 블롯에 의해 NK92-MI 세포에서 확인되었다(도 10D 및 도 7). 또한, KIR3DL3 발현은 탈락막 NK 세포에서 보고된 바 있고, 이것은 공개적으로 접근 가능한 데이터베이스에서 단일 세포 RNA 데이터를 분석함으로써 본 명세서에서 확인되었다(도 8).
실시예 7: KIR3DL3은 HHLA2에 대한 면역저해 관문 수용체이고 차단 항체는 T 세포 및 NK 활성을 강화시킨다
KIR3DL3의 세포질 도메인은 하나의 ITIM 모티프를 함유하고 면역저해 기능을 가질 것으로 예측된다. HHLA2/KIR3DL3 상호작용의 기능을 평가하기 위해, KIR3DL3을 발현하는 Jurkat T 세포와 루시퍼라제 리포터 유전자를 구동하는 NFAT, AP-1 및 NFkB 반응 요소를 함유하는 IL-2 프로모터를 세포 표면 항-CD3 scFV를 단독으로 또는 HHLA2와 조합하여 안정적으로 발현하는 CHO 세포와 공동 배양하였다. 강력한 공동자극 신호를 제공하기 위하여 가용성 항-CD28 mAb를 첨가하였고 루시페라제 활성을 평가하였다. 예상대로, CD3 신호는 T 세포 활성화에 필요했고, CD28 공동자극 신호는 IL-2 리포터 활성을 유의하게 증가시켰다(도 11A). KIR3DL3을 통한 HHLA2-매개 신호가 IL-2 리포터 활성에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 활성화의 유의한 감소를 초래하는 것이 본 명세서에서 관찰되었다. 이러한 결과는 KIR3DL3이 저해성 관문 수용체임을 나타낸다.
HHLA2 관여 및 항-CD3 mAb 활성화 후 TMIGD2 신호전달의 효과를 평가하기 위하여, TMIGD2는 루시퍼라제 리포터 유전자를 구동하는 NFAT 반응 요소를 발현하는 Jurkat 세포에서 과발현되었다. TMIGD2-형질감염된 Jurkat 세포가 세포 표면 항-CD3 scFV를 단독으로 또는 HHLA2와 조합하여 안정적으로 발현하는 CHO 세포와 함께 공동-배양되었을 때, 본 발명자들은 HHLA2가 CD3 신호전달 단독에 비해서 T 세포 활성화를 증가시킨 것을 관찰하였는데(도 12), 이는 TMIGD2의 보고된 공동자극 활성과 일치한다.
HHLA2/KIR3DL3 상호작용을 차단하는 기능적 결과를 평가하기 위하여, 수용체 차단 및 비-차단 HHLA2 및 KIR3DL3 항체 둘 다는 KIR3DL3 Jurkat 리포터 유전자 검정에 평가되었다. 차단 HHLA2 mAb인 2C4, 2G2 및 6F10은, 수용체 차단 활성과 일관되게, IL-2 리포터 활성을 강화시키는 한편, 약한 차단제 6D10은 강화시키지 않았다(도 11B). 유사하게, KIR3DL3 mAb인 1G7 및 2F11은 수용체 차단 활성과 일관되게 IL-2 리포터 활성 및 T 세포 활성화를 강화시키는 한편 약한 차단제 8F7은 강화시키지 않았다(도 11C 및 표 5). 2F11 mAb는 1G7의 결합 활성(binding avidity)이 더 높았지만 1G7과 비교하여 IL-2 리포터 활성의 더 높은 유도 배수를 보였다.
실시예 8: KIR3DL3 mAb 또는 HHLA2 mAb는 T 세포 활성화를 촉진시킨다
도 13은 KIR3DL3 mAb가 항-CD3-scFV 및 HHLA2-매개 신호에 반응하여 Jurkat-KIR3DL3 T 세포에서 IL-2 프로모터 구동 루시페라제 발현을 강화시키는 것을 나타낸다. CHO-항-CD3 scFv-HHLA2 세포 또는 CHO-항-CD3 scFV 세포를 0.15㎖ 배지에서 3.5×104의 농도로 96 웰 플레이트에 파종하고, A1은 단지 0.15의 배지를 함유하는 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 다음날, 항-KIR3DL3 또는 대조군 MOPC21 항체의 8가지 연속 2배 희석액을 적절한 웰에 첨가하였다. 1행에는 다른 음성 대조군으로서 항체가 첨가되지 않았다. 항체를 첨가한 후, 이 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에, 16㎍/㎖의 항-CD28 항체 25㎕를 적절한 웰에 첨가하였다. 음성 대조군 행에는 항-CD28이 첨가되지 않았다. KIR3DL3 및 IL-2 프로모터 구동 루시페라제 유전자를 발현하는 Jurkat 세포를 수거하고, 회전시키고, 세척하고, 배지에 2×106/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 마지막으로, 25ul의 배지 내 50,000개 Jurkat 세포를 각 웰에 첨가하고(음성 대조군 A1은 제외), 웰들을 혼합하였다. 모든 첨가물의 최종 용적은 100ul였다. 이 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 6시간의 인큐베이션 기간 후에, BPS Bioscience사의 ONE-Step™ 루시페라제 검정 시스템으로부터의 시약을 해동시키고 알루미늄 포일로 덮인 튜브(시약은 광-민감성임)로 제조사의 지시에 따라서 적절한 비율로 혼합하였다. 100㎕의 시약 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 이어서 플레이트를 오비탈 진탕기 위에서 실온에서 15분 동안 요동시켰다. 플레이트를 요동시킨 직후, 루미노미터 상에서 판독하였다.
도 14는 HHLA2 mAb가 항-CD3-scFV 및 HHLA2-매개 신호에 반응하여 Jurkat-KIR3DL3 T 세포에서 IL-2 프로모터 구동 루시페라제 발현을 강화시키는 것을 나타낸다. CHO-항-CD3 scFv-HHLA2 세포 또는 CHO-항-CD3 scFV 세포를 0.15㎖ 배지에서 3.5×104의 농도로 96 웰 플레이트에 파종하고, A1은 단지 0.15의 배지를 함유하는 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 다음날, 항-HHLA2 또는 대조군 MOPC21 항체의 8가지 연속 2배 희석액을 적절한 웰에 첨가하였다. 1행에는 다른 음성 대조군으로서 항체가 첨가되지 않았다. 항체가 첨가된 후, 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에, 16㎍/㎖의 항-CD28 항체 25㎕를 적절한 웰에 첨가하였다. 음성 대조군 행에는 항-CD28이 첨가되지 않았다. KIR3DL3 및 IL-2 프로모터 구동 루시페라제 유전자를 발현하는 Jurkat 세포를 수거하고, 회전시키고, 세척하고, 배지에 2×106/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 마지막으로, 25ul의 배지 내 50,000개 Jurkat 세포를 각 웰에 첨가하고(음성 대조군 A1은 제외), 웰들을 혼합하였다. 모든 첨가물의 최종 용적은 100ul였다. 이 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 6시간의 인큐베이션 기간 후에, BPS Bioscience사의 ONE-Step™ 루시페라제 검정 시스템으로부터의 시약을 해동시키고 알루미늄 포일로 덮인 튜브(시약은 광-민감성임)로 제조사의 지시에 따라서 적절한 비율로 혼합하였다. 100㎕의 시약 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 이어서 플레이트를 오비탈 진탕기 위에서 실온에서 15분 동안 요동시켰다. 플레이트를 요동시킨 직후, 루미노미터 상에서 판독하였다.
실시예 9: HHLA2-KIR3DL3 상호작용의 차단은 종양 세포에 대한 CD19 CAR-T 세포의 세포독성을 강화시킨다
도 15A는 KIR3DL3/CAR-19 발현 플라스미드 및 렌티바이러스 생산을 나타낸다. KIR3DL3을 암호화하는 DNA 및 CD19 CAR(FMC63 마우스 항-CD19 scFv 함유)를 EF-1a 프로모터, GM-CSF로부터의 신호전달 펩타이드, 힌지 영역, CD28 및 CD3제타 활성화 도메인으로부터의 막관통 및 공동자극 도메인을 함유하는 제2 세대 CAR 카세트에 삽입하였다. KIR3DL3 cDNA를, 자가 절단 가능한 T2A 리보솜-스키핑 서열에 의해 분리된 CAR 뒤에 삽입하였다. KIR3DL3/CD19 CAR DNA를 제3 세대 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하여 PMC456 발현 플라스미드를 생성시켰다. HEK293 세포를 인산칼슘 형질감염 키트(Takara, 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)를 사용하여 PMC456 플라스미드 및 pPACKH1 렌티벡터 패키징 믹스로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액을 48시간 후에 수거하고 10분 동안 110Kg에서 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하고, 이어서 AIM V-AlbuMAX® 배지(Thermo Fisher)에 재현탁시키고, 분취하여 -80℃에서 동결시켰다. 바이러스 역가는 Lenti-X™ qRT-PCR 키트(Takara) 및 7099HT 써멀 사이클러(Thermo Fisher)를 사용한 정량적 RT-PCR에 의해 결정하였다.
도 15B는 KIR3DL3/CD19-CAR-T 세포의 생성과 확장, 그리고 KIR3DL3/CD19 CAR-T 세포(PMC456 세포)의 FACS 프로파일을 나타낸다. PBMC를 인간 말초 혈액 버피 코트로부터 단리시키고, 10% FBS 및 100 IU/㎖의 IL-2를 함유하는 AIM V™ 배지에 1×106개 세포/㎖로 현탁시켰다. T 세포를 CD3/CD28 Dynabeads™(Thermo Fisher)로 하룻밤 활성화시키고, 이어서 DEAE 덱스트란(5 ug/㎖)으로 처리하고, 24시간 및 48시간 후 KIR3DL3/CAR19 렌티바이러스로 감염시켰다(10의 MOI). 세포를 8일에 걸쳐 2 내지 3일마다 계수하고 1 내지 3×106개 세포/㎖의 세포 밀도를 유지하기 위해 IL-2를 함유하는 새로운 배지로 보충하였다. 제10일에, CAR-T 세포를, 바이오틴화 항-FMC63 항체로 코팅된 자기 비드에 순차적으로 결합시킴으로써 단리시켰다. 제10일째 세포를 항-KIR3DL3 mAb 1G7과 바이오틴화 항-FMC63 항체의 혼합물로 CAR-T 세포 단리 전 후에 염색하였다. 헹군 후, 세포를 APC-접합된 염소 항-마우스 IgG와 PE-접합된 스트렙타비딘의 혼합물로 염색하였다. 세포를 헹구고 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 15C는 안정적인 HeLa-CD19 및 HeLa-CD19+HHLA2 발현 종양 세포의 생성 및 이들의 FACS 프로파일을 나타낸다. HeLa 세포를 인간 CD19를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입시켜 HeLa-CD19 세포를 생성시켰다. 별도로, HeLa 세포를 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 HHLA2를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고, 1 mg/㎖의 G418을 사용하여 네오마이신 내성에 대해서 선택하였다. 이어서, 이들 세포를 인간 CD19를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입시켜 HeLa-CD19+HHLA2 발현 세포를 생성시켰다. 종양 세포를 PE-접합된 항-HHLA2 6F10 mAb, 항-CD19 mAb 또는 아이소타입 대조군(마우스 IgG1) mAb로 염색하였다. 세포를 헹구고 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 15D는 HHLA2 mAb를 사용하여 HHLA2-KIR3DL3 상호작용을 차단하는 것이 HHLA2+CD19 형질감염된 HeLa 종양 세포에 대한 KIR3DL3 CD19-CAR-T 세포 세포독성을 강화시키는 것을 나타낸다. 실시간 세포 분석(RTCA®)을 사용하여 농축된 KIR3DL3/CAR19 T 세포의 세포용해 활성을 측정하였다. 부착 HeLa-CD19-HHLA2 세포를 1×104개 세포/웰에 96-웰 E-plates®(Acea Biosciences)에 파종하고, 임피던스-기반 xCELLigence® 시스템(Acea Biosciences)으로 배양물에서 하룻밤 모니터링하였다. 그 다음날, 배지를 제거하고 3×104 또는 1×105개 효과기 세포(KIR3DL3/CAR19 T 세포 또는 비-형질도입된 T 세포) 및 표시된 HHLA2 mAb 또는 아이소타입 대조군을 함유하는 배지로 삼중으로 교체하였다. E-plates®는 RTCA® 시스템으로 다음날 모니터링하고, 종양 세포 단층의 임피던스를 시간 경과에 따라서 플로팅하였다. 세포독성 퍼센트(%)는 (효과기 세포 없는 표적 세포의 임피던스 - 효과기 세포를 가진 표적 세포의 임피던스)/효과기 세포 없는 표적 세포의 임피던스×100으로 계산하였다.
실시예 10: 차단 HHLA2-KIR3DL3 상호작용은 종양 세포에 대한 NK 세포 세포독성을 강화시킨다
도 16A는 KIR3DL3 발현 플라스미드 및 렌티바이러스 생산을 나타낸다. KIR3DL3 cDNA를 제3 세대 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하여 PMC579 발현 플라스미드를 생성시켰다. 플라스미드는 또한 PGK 프로모터 하에 eGFP cDNA를 함유하였다. 렌티바이러스는 선행하는 부문에 기재된 바와 같이 준비하고 인간 NK 세포주 NK-92를 형질도입하는데 사용하였다.
도 16B는 KIR3DL3 형질도입된 NK92 세포의 유도를 나타낸다. 3백만개의 NK92 세포를 10의 MOI로 KIR3DL3 발현 렌티바이러스(MNDU3 프로모터를 함유하는 PMC579 발현 플라스미드)로 형질도입시키고, 20% FBS 및 50 ng/㎖ IL-2를 가진 RPMI 배지에서 10일 동안 배양물에서 확장시키고, 그 후 세포의 일부(1천9백만개)를 GFP 발현 수준에 의해 분류하였다. 이들 세포를 20% FBS 및 50 ng/㎖ IL-2를 가진 RPMI 배지에서 더욱 10일 동안 도로 배양물에 놓았다.
도 16C는 HHLA2 형질감염된 K562 및 HeLa 종양 세포의 유도를 나타낸다. K562 세포를 pEF-Puro 벡터에서 50 ug의 Mlu I 선형화된 HHLA2 cDNA로 전기천공하고(300 볼트, 1600 마이크로패럿), 퓨로마이신 내성에 대해서 선택하고, PE-접합된 HHLA2 mab 6F10로 염색하고, 분류하고, 단일 세포 클로닝하였다. HeLa 종양 세포는 HHLA2 암호화 렌티바이러스로 형질도입되었다.
도 17A는 KIR3DL3-HHLA 상호작용/경로에 의한 NK92 세포독성의 저해를 나타낸다. NK92 부모 세포 또는 KIR3DL3 형질도입된 NK92 세포를 HeLa 단독 또는 HeLa+HHLA2 발현 세포에 대한 NK 세포독성 검정에 사용하였다. NK 매개 세포 살해는 Acea xCelligence® 임피던스 검정에서 0.5:1의 효과기 대 표적(E/T)비에서 NK 세포를 배양함으로써 측정하였다. 표적 세포를 96-well E-plates®(20 thousand HeLa, HeLa-HHLA2)에 첨가하고 임피던스를 하룻밤 모니터링한다. 그 다음날, 배지를 제거하고, NK-92 배지 중 150 ul의 NK-KIR3DL3 또는 NK-NV(바이러스 벡터 없음) 세포를 각 웰에 첨가한다. 플레이트는 임피던스의 변화에 대해서 하룻밤 모니터링한다.
도 17B는 HHLA2 mAb 및 KIR3DL3 mAb에 의한 NK92 세포독성의 강화를 나타낸다. 차단 HHLA2 mAb 2G2, 2C4 및 KIR3DL3 mAb 1C7 및 2F11은 HHLA2에 의한 NK92 세포독성의 저해를 역전시킨다. 비차단 HHLA2 mAb 6G8 및 KIR3DL3 mAb 8F7은 HHLA2에 의한 NK92 세포독성의 저해를 역전시키지 않았다. 도 17C는 세포독성 검정의 개략도를 도시한다.
실시예 11: HHLA2-KIR3DL3 상호작용은 HHLA2 또는 KIR3DL3 항체에 의해 역전 가능한 NK 세포 세포용해 활성을 저해한다
NK 세포독성에 대한 HHLA2-KIR3DL3 상호작용의 영향을 평가하기 위하여, IL2를 내생적으로 생산하고 KIR3DL3을 발현하는 NK 세포주인 NK92-MI를 사용하였다(도 10B). HHLA2 발현이 NK 세포독성을 저해하는 것을 확인하기 위하여, Raji 세포를 먼저 NK 세포에 대한 좋은 표적이 되도록 β2-마이크로글로불린(B2M)의 CRISPR-매개 결실에 의해 MHC 클래스 I의 표면 발현을 제거하도록 조작하였다. NK 세포는 표적 세포 상에 MHC 클래스 I의 부존재에 의해 활성화되는데, 본 명세서에서 Raji-B2M KO 세포가 NK92-MI 세포에 의해 효율적으로 용해된 것을 확인하였다(도 18). HHLA2를 발현하도록 Raji-B2M KO 세포를 조작하였고, 도 19A는 Raji-B2M KO 세포에서의 HHLA2 발현이 모든 효과기 대 표적비에서 NK-92-MI 세포에 의한 세포독성을 저해하는 것을 나타낸다.
NK 세포독성의 HHLA2 매개 저해에 대한 HHLA2 또는 KIR3DL3 항체의 효과를 평가하기 위하여, HHLA2-Raji-B2M KO 모델을 다양한 E/T비, 고정된 농도의 KIR3DL3 항체인 1G7 및 2F11에서 NK92-MI 세포와 함께 인큐베이션시켰다.
KIR3DL3 차단 mAb인 1G7 및 2F11은 아이소타입 대조군과 비교하여 NK 세포독성을 강화시켰다(도 19B). 또한, HHLA2 차단 항체인 2C4 및 2G2는 NK 세포독성을 강화시켰다(도 19C). KIR3DL3:HHLA2 상호작용의 약한 차단제인, KIR3DL3 항체인 8F7 및 HHLA2 항체인 6D10은 세포독성을 강화시키지 못하였다(도 19B 및 도 19C).
NK 세포 용해 활성을 조절함에 있어서 KIR3DL3의 역할을 조사하기 위하여, CD107a 탈과립화 검정을 수행하였다. NK92-MI 세포 표면에서의 CD107a 발현(탈과립화)에 의해 측정된 바, Raji B2M KO 세포에서의 HHLA2 발현은 NK92-MI 탈과립화를 저해하고(도 19D), 1G7 mAb에 의한 KIR3DL3의 차단은 이들 NK 세포의 강화된 탈과립화를 초래하였다(도 19E).
실시예 12: HHLA2는 RCC 종양에서 발현되고 PD-L1 발현과는 별개이다
범암 전사체 분석은 HHLA2가 여러 종양 유형으로 발현되고, 신장세포 암종(RCC)이 정상 조직에 비해 가장 높은 수준의 발현을 나타내는 것을 입증하였다. TCGA에서 B7 패밀리 구성원의 mRNA 발현의 분석에서, HHLA2가 정상 신장 조직과 비교하여 ccRCC에서 가장 고도로 상향조절된 B7 패밀리 구성원임이 본 명세서에서 발견되었다(도 20). PD-L1, PD-L2, B7-H3 및 VISTA 전사체는 정상 신장과 비교하여 ccRCC에서 단지 약간 더 높았고 B7-H4 전사체는 ccRCC에서 현저하게 저감되었다. 예상대로, CD8 전사체는 정상 신장과 비교하여 ccRCC에서 상향조절되었으며, 이는 ccRCC에서 높은 면역 침윤물을 반영한다. 특히 종양 내에서 PD-L1 발현과 HHLA2 발현 간의 부정적인 연관이 있었다.
HHLA2는 면역 자극 기능 및 저해 기능 둘 다를 지닌 B7 패밀리 구성원이다. TMIGD2는 T 및 NK 세포 둘 다에서 HHLA2에 대한 면역 자극 수용체로서 이미 특성 규명되었지만 HHLA2가 T 및 NK를 저해할 수 있는 메커니즘은 알려져 있지 않았다(도 21A 및 도 21B). 이 효과를 매개할 수 있는 저해 수용체의 존재가 본 명세서에서 가정되었다. 세포 표면 수용체의 어레이에서 가용성 재조합 HHLA2-mIgG2a를 사용하여 추가의 HHLA2 수용체에 대한 스크리닝을 본 명세서에서 수행하고, HHLA2에 대한 새로운 수용체로서 KIR3DL3을 식별하였다. KIR3DL3은 수용체의 KIR 패밀리의 구성원이지만 현재까지 그의 리간드는 알려져 있지 않았다. HHLA2-KIR3DL3 상호작용이 T 및 NK 세포에서 면역 저해이고 이 상호작용을 차단하는 항체가 면역 저해를 역전시킨다는 것이 본 명세서에서 입증된다. RCC 환자 종양에서 HHLA2 발현에 대한 분석은 PD-L1과 크게 겹치지 않는 발현 패턴을 나타낸다. 종합하면, 이러한 지견은 KIR3DL3/HHLA2 상호작용의 차단이 암 면역요법에 대한 새로운 접근법을 제시할 수 있음을 입증한다.
살해-세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR)는 NK 세포 및 T 세포에 의한 발현을 통해 선천 및 적응 면역 반응 둘 다에 기여한다. HLA 클래스 I 리간드는 13개 중 9개의 KIR에 대해 식별되었지만 KIR3DL3에 대한 HLA 리간드는 식별되지 않았다. KIR 패밀리의 구성원은 2 또는 3개의 세포외 Ig 도메인과 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프(ITIM)를 함유하는 짧은(활성화 DS 형태) 또는 긴 세포내 도메인(저해 DL 형태)을 가진 유사한 단백질 구조를 갖는다. KIR3DL3 유전자는 3개의 세포외 Ig 도메인을 암호화하고, 단지 하나의 ITIM을 갖고 Ig 도메인과 막관통 영역 사이의 줄기를 암호화하는 엑손을 결여한다. KIR3DL3의 구조가 저해 수용체를 암시하지만, KIR3DL3의 기능은 입증되지 않았고, 동족 리간드는 식별되지 않았다.
KIR 유전자 패밀리는 저해 또는 활성화 수용체를 암호화하는 13개의 유전자로 이루어진다. 개별 KIR 유전자의 발현은 주어진 KIR 레퍼토리를 발현하는 NK 및 T 세포의 일부만으로 클론적으로 분포된다. 개체에서, 13개의 KIR 유전자는 그의 존재 및 카피수가 다양하지만 KIR3DL3은 모든 개체에서 존재하기 때문에 KIR 패밀리에서 고유하다. KIR3DL3 프로모터는 KIR 프로모터 중 가장 강력하지만 일반적으로 메틸화에 의해 침묵된다. KIR3DL3은 고도로 다형성이지만; 그러나, 157개의 다형성 잔기의 대부분이 KIR3DL3 구조 모델을 기반으로 하는 다른 KIR의 공지된 HLA 리간드 결합 부위와 구별되는 부위에 매핑된다. 이것은 이러한 다형성이 HHLA2 리간드 결합에 영향을 미칠 가능성이 없음을 나타낸다.
KIR3DL3은 태반 탈락막 NK 세포 및 활성화 NK 세포를 제외하고 정상 조직에서는 거의 발현되지 않는다. HHLA2는 태반 영양막에서 고도로 발현된다. 이 발현 패턴은 태반 영양막 및 기타 면역 특혜 부위에서의 PD-L1 발현과 유사하며 면역 억제의 1차 자연적 역할과 일치한다. HHLA2가 KIR3DL3에 대한 리간드이고 NK 및 T 세포에서 저해 수용체로 기능한다는 것이 본 명세서에서 처음으로 입증되었다.
HHLA2/KIR3DL3 상호작용이 T 세포에서 CD28 의존성 CD3 신호전달을 저해한다는 현재 관찰과 일관되게, Reider 등은 또한 HHLA2-Fc가 CD3 및 CD28 신호전달 및 ERK2 티로신 인산화에 의해 매개된 T 세포 활성화를 저해하는 것을 나타내었다. 이러한 관찰은 PD-L1/PD-1 상호작용이 티로신 인산화 및 MEK-1/ERK2 활성화에 의존하는 CD3 신호전달 경로를 저해한다는 것을 나타내는 결과와 유사하다. PD-L1에 의한 CD3 신호전달의 저해는 PD-1 ITSM 모티프의 티로신 인산화 및 TCR 및 CD28 경로의 근위 신호전달 분자를 탈인산화하는 SHP-2 포스파타제의 동원을 통해 이루어진다. 종합하면, 상기 결과는 PD-1과 KIR3DL3이 T 세포 활성화 후 유사한 경로를 공유할 수 있고 두 경로의 저해가 상가적일 수 있음을 나타낸다.
T 세포에 대한 저해 면역 수용체의 발현은 활성화와 함께 동적으로 조절된다. HHLA2:KIR3DL3 경로는 B7:CTLA-4 경로와 유사하다. 휴면 T 세포는 CD28(CD80/86의 경우) 및 TMIGD2(HHLA2의 경우)와 같은 면역 자극 수용체를 발현한다. TMIGD2는 주로 미경험 T 세포에서 발현되고 T 세포 활성화 시 하향 조절되며 기억 22%의 CD4+ T 세포 및 29%의 기억 CD8+ T 세포에서만 발현된다. 유사하게, CD28은 항원 경험이 있는 인간 CD8 T 세포의 50%에서만 발현된다. 활성화 시, T 세포는 본 명세서에서 제시된 바와 같이 CTLA-4, PD-1 및 KIR3DL3을 비롯한 저해 수용체의 발현을 상향조절한다. 본 발명자들은 KIR3DL3 발현이 활성화되지 않은 T 세포에서 드물고 항-CD3 및 CD28 mAb로 자극한 후 CD4 및 CD8 T 세포의 적당한 하위집단에서 유도된다는 것을 나타낸다. T 세포 활성화 후 초기 PD-1 발현과 달리, KIR3DL3은 나중에 발현되고 T 세포 활성화 후 제21일경에 피크에 도달한다. 이러한 조절 패턴은 신생항원 경험이 있는 T 세포가 활성화 후 상이한 시간에 면역저해 수용체의 우세를 발현할 것이라고 예측한다. 동족 리간드(B7 또는 HHLA2)가 존재한다면, T 세포 저해는 우세한 성과로 될 수 있다.
RCC는 최근에 많은 치료가 발전한 악성 종양이다. RCC는 면역 침윤성이 높으며 역사적으로 면역 반응이었다. IL-2 요법은 1992년 이래로 환자를 위한 면역 옵션이었다. 보다 최근에, PD-1 경로의 저해제가 단독 요법으로서 활성을 보였을 뿐만 아니라 VEGFR TKI 요법 또는 CTLA-4와의 조합으로도 승인되었다. 그러나, 많은 환자에서 요법에 대한 내성이 나타나며 새로운 치료 옵션이 필요로 된다.
HHLA2 발현 및 PD-L1 발현이 RCC에서 중첩되지 않음이 본 명세서에서 입증된다. 이것은 종양 샘플의 64%가 HHLA2 양성이고 이 중 67%가 PD-L1 음성이었던 비소세포폐암(NSCLC)에 대한 이전 보고서와 일치한다. 이 연구는 본 명세서에서 제시된 ccRCC의 HHLA2 및 PD-L1 발현 연구와 함께 HHLA2 저해 경로가 연루된 이러한 암 및 기타 암에서 단독으로 또는 PD-1 저해제와 조합하여 HHLA2/KIR3DL3 면역관문 경로를 표적으로 하는 근거를 제공한다.
이 연구의 주요 성과 중 하나는 HHLA2에 대한 저해 수용체로서의 KIR3DL3의 식별과 T 및 NK 세포에서 HHLA2-KIR3DL3-매개 저해를 역전시키는 관문 저해제 항체의 생성이다. 이 연구 이전에, TMIGD2 및 KIR3DL3에 대한 HHLA2의 결합이 하나의 공통 중첩 에피토프를 통해 발생했는지 또는 별개의 상호작용 부위를 통해 발생했는지는 알려져 있지 않았다. 본 발명의 지견은 대부분의 HHLA2 항체가 TIMGD2 및 KIR3DL3 둘 다에 대한 HHLA2의 결합을 차단함을 나타낸다. 이들 두 수용체 상호작용 중 단지 하나만 차단하는 항체는 드물었기 때문에, TMIGD2 및 KIR3DL3에 대한 HHLA2 결합 부위는 중첩되지만 동일하지 않은 것으로 보인다. KIR3DL3 - HHLA2 상호작용을 차단하지만 TMIGD2 자극 신호를 보존하는 HHLA2 항체가 치료 개발을 위한 하나의 옵션이라는 것이 본 명세서에서 입증되었다. 또한, KIR3DL3-HHLA2 상호작용을 선택적으로 차단하는 KIR3DL3 항체도 치료제 개발을 위한 매력적인 후보이다.
많은 면역 조합이 전임상 모델에서 시험되었고, 여러 후보가 임상 시험으로 진행되었다. 대부분은 아직 뛰어난 임상 활성을 나타내지 않았다. 이 제한된 효능에 대한 한 가지 가설은 많은 경로가 발현의 상향 조절을 위한 PD-L1 공유 메커니즘과 공동 표적화된다는 점이다. 예를 들어, 암에서의 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO) 저해는 관심을 끌었지만, IDO-PD-1 조합의 임상 시험에서는 유망한 결과를 수득하지 못하였다. IFN-γ는 IDO 및 PD-L1 발현 둘 다를 상향 조절한다. HHLA2 발현이 IFN-γ에 의해 조절되지 않고 따라서 종양 면역 회피의 독립적으로 조절되는 메커니즘을 나타낸다는 것이 본 명세서에서 입증된다. 또한, HHLA2 면역 신호전달은 T 세포뿐만 아니라 NK 세포에서도 중요하며, KIR3DL3을 통한 HHLA2 신호전달의 저해는 선천 및 적응 면역 반응을 둘 다 매개하는 면역 미세 환경의 다양한 림프구 세트에 영향을 미칠 수 있다. 종양에서, HHLA2 및 PD-L1 발현은 중첩되지 않고 독립적으로 조절되는 것으로 보인다.
HHLA2-KIR3DL3-TMIGD2 경로의 수용체와 리간드는 둘 다 영장류에서 발현되고, 설치류를 비롯한 여러 다른 포유동물에서는 발견되지 않으며, 이는 B7 및 CD28 패밀리 내에서 고유하다. 따라서, 이 경로의 기능적 연구는 인간 세포주 및 1차 면역 세포를 사용하는 시험관내 모델로 제한된다. 이 경로의 생체내 역할을 평가하기 위하여, 인간화 모델을 개발해야 할 필요가 있다. 삼중 넉인 접근법은 수용체와 리간드는 둘 다 쥐 오솔로그가 없기 때문에 게놈 조절 영역과 완전한 유전자를 포함하는 삼중 넉인 접근법이 필요로 될 것이다.
PD-1 경로의 면역관문 저해는 이제는 암의 면역 요법에 대한 초석이다. PD-1 저해의 성공에도 불구하고, 많은 환자는 내성을 전개시키고, 신규한, 중복되지 않는(non-redundant), 면역 저해 경로의 식별이 이 분야에서 중요한 요구사항이다. 면역 저해 및 자극 경로의 균형을 저해에서 멀리 이동시키면 항-종양 면역 반응을 최적화시킬 수 있다. 요약하면, KIR3DL3은 본 명세서에서 HHLA2에 대한 면역 저해 수용체로서 식별된다. 또한 면역 저해 활성을 특이적으로 차단하지만 TMIGD2의 공동자극 활성을 모면하게 하는 HHLA2 및 KIR3DL3 항체가 또한 본 명세서에서 개발된다(도 21A 및 도 21B). HHLA2 경로 저해의 안전성 및 예비 효능을 시험하는 제I상 임상 시험이 현재 개발 중이다.
실시예 13: KIR3DL3 x PD-1 mAb IgG-scFV 이중특이적 항체의 유도
KIR3DL3 mAb 574.2.2F11(2F11이라 지칭됨) 및 PD-1 mAb EH13.2A11(EH13이라 지칭됨) 마우스 하이브리도마 클론은 이중특이적 항체를 작제하기 위하여 선택되었다. 2F11 및 EH13 클론은 표적에 대한 그들의 높은 친화성 및 T 세포에서 관문 저해를 위한 역가에 기초하여 선택되었다. 제1 단계로서 2F11 및 EH13 VH 및 VL 유전자가 인간 IgG4 또는 scFv 항체로서 발현되고, 표 6 방법에 기재된 바와 같은 Octet 결합 검정에서 각각 그들의 항원인 KIR3DL3 및 PD-1에 대한 결합에 대해서 시험되었다. 결합 친화성은 각각의 부모 하이브리도마 클론과 비교되었다. 표 6 및 도 23에 도시된 바와 같이, KIR3DL3 mAb 2F11 인간 IgG4 및 scFV 포맷에 대한 KD는 대조군 부모 하이브리도마 클론(0.29nM 내지 0.51nM)의 2 내지 3배 이내였다. PD-1 mAb EH13 인간 IgG4는 대조군 하이브리도마(6.9nM 내지 7.1nM)에 비해서 1 내지 2배 이내에서 유사한 결합을 나타내었다. 그러나, EH13 scFV는 부모 대조군 하이브리도마에 비해서 4 내지 5배 더 낮은 친화성(31.6nM 대 6.88nM)을 나타내었다.
이들 결과에 기초하여, PD-1 mAb EH13 인간 IgG4 및 KIR3DL3 mAb 2F11 scFV로 구성된 이중특이적 항체 포맷이 이중특이적 항체의 작제를 위하여 선택되었다.
PD-1 및 KIR3DL3 IgG4, scFV 및 이중특이적 항체에 대한 아미노산 서열은 각각 표 7, 표 8 및 표 9에 나타낸다.
KIR3DL3과 PD-1을 둘 다 표적으로 하는 제제는 면역 반응을 조절하고/하거나 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체는 종양에서 T 및 NK 세포를 활성화시키는 관문 면역요법이다. 몇몇 경우에, KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체는 PD-1 또는 PD-L1 또는 다른 관문 면역요법과 상가적 또는 상승작용적이다. 또한, 종양에서 HHLA2 또는 KIR3DL3 발현은 KIR3DL3 mAb 및/또는 KIR3DL3 x PD-1 이중특이적 항체 관문 차단에 대한 반응성의 유용한 바이오마커이다.
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표 5에서, HHLA2 또는 KIR3DL3 형질감염된 300.19 세포에 대한 HHLA2(상부) 또는 KIR3DL3(하부) mAb 결합은 EC50 값으로 표시된다. HHLA2 및 KIR3DL3 mAb에 의한 KIR3DL3 및 TMIGD2 형질감염된 세포에 대한 HHLA2-mIgG2a 결합의 차단은 IC50 값으로 표시된다.
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몇몇 실시형태에서, 중쇄/Fc 작제물은, 문헌[Cai et al. (2011) Biotechnol Bioeng, 108(2):404-12]에 언급된 바와 같이, 더욱 균질한 산물을 생성하기 위하여 C-말단 라이신이 제거된 채로 설계된다. 표 8에 제시된 서열은 말단 라이신이 제거된 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 서열은 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화된다.
몇몇 실시형태에서, 열거된 요소 및 태그를 가진 유전자 삽입물은 발현을 위한 최종 작제물에 포함될 것이다. 몇몇 실시형태에서, 전체 삽입물은 고발현 포유동물 벡터에 클로닝될 것이다.
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몇몇 실시형태에서, 중쇄/Fc 작제물은, 문헌[Cai et al. (2011) Biotechnol Bioeng, 108(2):404-12]에 언급된 바와 같이, 더욱 균질한 산물을 생성하기 위하여 C-말단 라이신이 제거된 채로 설계된다. 표 9에 제시된 서열은 말단 라이신이 제거된 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 서열은 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화된다. 표 9에서의 서열은 SR-18230에서 이미 코돈 최적화되고 작제되었다.
몇몇 실시형태에서, 열거된 요소 및 태그를 가진 유전자 삽입물은 발현을 위한 최종 작제물에 포함될 것이다. 몇몇 실시형태에서, 전체 삽입물은 고발현 포유동물 벡터에 클로닝될 것이다.
참고 문헌
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참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 마치 각 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참조에 의해 원용되는 것으로 표시되는 것과 같이 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선한다.
또한 TIGR(The Institute for Genomic Research)에 의해 tigr.org 웹 상에 유지관리되는 것 및/또는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 의해 ncbi.nlm.nih.gov 웹 상에 유지관리되는 것과 같이, 공개 데이터베이스 등록과 관련된 등록 번호를 참조하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열도 그 전체가 참조에 의해 원용된다.
등가물
당업자라면 본 명세서에 기재된 본 개시내용에 의해 포괄되는 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. <120> ANTI-KIR3DL3 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> DFS-277.25 <140> PCT/US2020/054063 <141> 2020-10-02 <150> 62/910,594 <151> 2019-10-04 <160> 147 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2679 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agttctcttc aagtcatgta atcgactttt ttgaattagt tttcagtttc attttgtttt 60 ccctaattca agttgggaac acttcatttt ccccaattca agttgggaac acttccttgg 120 tatttccttg ctacatggac tttagcaaat gctactttac tctccttcca gctactcagg 180 aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggaggcggag gttacagtga gccttttcct 240 agttttactg ttggaagcct aactcacagg agagattatg caatacagtc ctgaagtcaa 300 gggaggagag catgtaggag aatactaacc ctgcacagat tgtgatggtg atgtggaata 360 tactaaagcc tagaacgcac ctcctctgca tgactaatat gttctgcaca agacatgaag 420 gcacagacag cactgtcttt cttcctcatt ctcataacat ctctgagtgg atctcaaggc 480 atattccctt tggctttctt catttatgtt cctatgaatg aacaaatcgt cattggaaga 540 cttgatgaag atataattct cccttcttca tttgagaggg gatccgaagt cgtaatacac 600 tggaagtatc 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peptide <400> 22 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys 20 25 30 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Asn Pro Tyr Asn Asp Gly 1 5 <210> 35 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp 1 5 10 15 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 20 25 30 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Pro Ser Met Val Thr Ala Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 39 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peptide <400> 55 Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr 1 5 10 15 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu 1 5 <210> 60 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Gly Met Pro Ser Arg Phe 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 63 gacgtgaagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctattgca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtaatta catctactat 180 ccggacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagggggt 300 tacgacgaga ggtactttga ctactggggc caaggcacca ttctcacagt ctcctca 357 <210> 64 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 1 5 <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 1 5 10 15 Ala Glu Ile <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala 1 5 <210> 70 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 1 5 10 15 Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu 20 25 30 Asp Thr Gly Ile Phe Tyr Cys Thr Pro 35 40 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Phe Tyr Gly Ser Ser Phe Pro Tyr 1 5 <210> 72 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Tyr Thr Ser Ile Leu Gln Leu 1 5 <210> 76 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 79 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Glu Leu Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Phe 85 90 95 Tyr Cys Thr Pro Phe Tyr Gly Ser Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr 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polynucleotide <400> 116 caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggata cgccttcaat aattacttga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagtg atcaatcctg gaagtggtgg tactaacgac 180 aatgagaagt tcaggggcaa ggctaccctg actgcagaca catcctccag cactgcctac 240 atgcagctca ccagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagagggaat 300 tactacggta ctcgcgactg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 117 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Ile Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 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Synthetic primer <400> 138 aggtgtaaat tccttcgtcc aga 23 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 tggcatttgc tgaacgcatt t 21 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 140 tgcagccagg tctaattgtt tt 22 <210> 141 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 141 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Pro Tyr Gly Lys Gly Asp Tyr Tyr Ala 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Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 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580 585 590 Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg 595 600 605 Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Arg Thr Ala Val Ala 610 615 620 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Leu 625 630 635 640 Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 645 650 655 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp 660 665 670 Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu Thr Phe 675 680 685 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 690 695

Claims (69)

  1. 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 경쇄 서열
    을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열
    을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2, 표 7 및 표 8에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화, 합성, 쥐 또는 인간의 것인, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, (a) 검출 가능하게 표지되고, (b) 세포독성제, 선택적으로, 화학요법제, 생물학적 제제, 독소 및/또는 방사성 동위원소에 접합되고, (c) 효과기 도메인을 포함하고, (d) Fc 도메인을 포함하고, 그리고/또는 (e) Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 및 다이아바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 기탁 번호 ______ 하에 기탁된 하이브리도마 ______로부터 얻어질 수 있는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, KIR3DL3에 대한 HHLA2의 결합을 저해하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3에 특이적으로 결합하는, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 2, 7 내지 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 경쇄 서열
    을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열과 각각 적어도 약 95% 동일성을 갖는 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열
    을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열; 및/또는
    b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 서열들로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열
    을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라, 인간화, 합성, 쥐 또는 인간의 것인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, (a) 검출 가능하게 표지되고, (b) 세포독성제, 선택적으로, 화학요법제, 생물학적 제제, 독소 및/또는 방사성 동위원소에 접합되고, (c) 효과기 도메인을 포함하고, (d) Fc 도메인을 포함하고, 그리고/또는 (e) Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 및 다이아바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 기탁 번호 ______ 하에 기탁된 하이브리도마 ______로부터 얻어질 수 있는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) KIR3DL3에 대한 HHLA2 및 (b) PD-L1 및/또는 PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 저해하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3 및 PD-1에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    a) 표 9에 열거된 중쇄 서열; 및/또는
    b) 표 9에 열거된 경쇄 서열
    을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄.
  21. 단리된 핵산 분자로서, (a) 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 및/또는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편를 암호화하고; 그리고/또는 (b) 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 폴리펩타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 보체, 또는 표 2 및 표 7 내지 표 9에 열거된 폴리펩타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 적어도 약 95% 상동성을 갖는 서열과, 엄격한 조건 하에서, 혼성화되는, 단리된 핵산 분자.
  22. 제21항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  23. 제21항의 단리된 핵산을 포함하거나, 제22항의 벡터를 포함하거나, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하거나, 또는 기탁 번호 ______ 하에 이용 가능한, 숙주 세포.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 디바이스 또는 키트로서, 상기 디바이스 또는 키트는 선택적으로 상기 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 검출하기 위한 표지, 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 복합체를 포함하는, 디바이스 또는 키트.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, (i) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환된 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
  26. KIR3DL3 폴리펩타이드의 존재 또는 수준을 검출하는 방법으로서, 제1항 또는 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 샘플에서 상기 폴리펩타이드를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 KIR3DL3 폴리펩타이드와 복합체를 형성하고 상기 복합체는 효소결합면역흡착분석법(ELISA), 방사면역검정법(RIA), 면역화학법, 웨스턴 블롯의 형태로, 또는 세포 내 흐름 검정법을 사용해서 검출되는, 방법.
  28. KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 반응성을 예측하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계;
    b) 상기 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여, KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 양호한 반응성을 갖는 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 대상체 샘플 내 및 상기 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계
    를 포함하되; 상기 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 수준과 비교하여 상기 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 동일한 또는 더 높은 수준은, 상기 대상체가 상기 요법에 대해 반응성이 있을 것이라는 표시인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 요법은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 KIR3DL3을 표적으로 하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 반응성을 예측하는 방법으로서,
    a) 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계;
    b) KIR3DL3을 표적으로 하는 요법에 대한 양호한 반응성을 갖는 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 대상체 샘플 내 및 상기 대조군 대상체로부터의 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 수준을 비교하는 단계
    를 포함하되; 상기 적어도 하나의 대조군 대상체로부터의 샘플 내 수준과 비교하여 상기 대상체 샘플 내 KIR3DL3 및/또는 HHLA2의 동일한 또는 더 높은 수준은, 상기 대상체가 상기 요법에 대해 반응성이 있을 것이라는 표시인, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 적어도 하나의 대상체로부터 얻어진 단일 샘플 또는 적어도 하나의 대상체로부터 얻어진 혼합 샘플의 일부인, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 (a) HHLA2과 KIR3DL3; 그리고/또는 (b) PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 간의 상호작용 및/또는 신호전달을 차단하는, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 얻어진 세포, 혈청, 종양주변 조직 및/또는 종양내 조직을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 세포는 T 세포 또는 자연살해(NK) 세포인, 방법.
  35. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, (a) 상기 암 내 증식 세포의 수를 감소시키고; (b) 상기 암의 종양 부피 또는 크기를 감소시키고; 그리고/또는 (c) T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는, 방법.
  37. 제35항 내지 제36항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 투여되는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 암 치료를 위한 치료제 또는 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 면역요법, 관문 차단, 암 백신, 키메라 항원 수용체, 화학요법, 방사선, 표적요법 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 CD19를 표적으로 하는, 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 암 세포 및/또는 종양 면역 침윤 세포가 HHLA2를 발현하는, 방법.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 선암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병, 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 신경교종, 교모세포종, 신경아세포종, 유방암, 췌장 관 암종, 흉선종, B-CLL, 백혈병, B 세포 림프종, 및 HHLA2에 대한 수용체를 발현하는 면역 세포로 침윤된 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 암은 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병(AML), 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암의 동물 모델인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 동물 모델은 마우스 모델이고, 선택적으로 상기 마우스 모델은 인간화 마우스 모델인, 방법.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 포유동물은 인간화 마우스 또는 인간인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 방법.
  49. 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 면역 반응을 조절하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, HHLA2와 이의 저해제 수용체인 KIR3DL3 간의 상호작용을 저해하거나 파괴하는, 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성제에 접합되는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세포독성제는 화학요법제, 생물학적 제제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 하향조절 또는 상향조절되는, 방법.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 것인, 방법.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, (a) HHLA2와 KIR3DL3; 및/또는 (b) PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 간의 상호작용이 차단되는, 방법.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-KIR3DL3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 암 면역요법을 위한 T 세포 활성화의 관문 저해제인, 방법.
  57. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 조절하는 것은 T 세포 기능 또는 NK 세포 기능을 조절하는 것을 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 T 세포 기능 또는 NK 세포 기능은 세포독성 활성을 포함하는, 방법.
  59. 제58에 있어서, 상기 세포독성 활성은 암 세포에 대한 것인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 암 세포는 HHLA2를 발현하는, 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 선암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병, 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 신경교종, 교모세포종, 신경아세포종, 유방암, 췌장 관 암종, 흉선종, B-CLL, 백혈병, B 세포 림프종, 및 HHLA2에 대한 수용체를 발현하는 면역 세포로 침윤된 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 암은 폐암, 신장암, 췌장암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병(AML), 두경부암종, 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  63. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 면역요법, 관문 차단, 암 백신, 키메라 항원 수용체, 화학요법, 방사선, 표적요법 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 요법을 더 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 CD19를 표적으로 하는, 방법.
  65. 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 암의 동물 모델에서 조절되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 동물 모델은 마우스 모델이고, 선택적으로 상기 마우스 모델은 인간화 마우스 모델인, 방법.
  67. 제49항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 포유동물에서 조절되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 포유동물은 인간화 마우스 또는 인간인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 방법.
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