CN115554399A - 用于免疫疗法的组合组合物 - Google Patents

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methyl
benzyl
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Abstract

本发明涉及包含WNT抑制剂的治疗组合和使用联合疗法治疗癌症的方法。

Description

用于免疫疗法的组合组合物
本申请是基于申请日为2016年5月26日，申请号为201680029634.7，发明名称为“用于免疫疗法的组合组合物”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月31日提交的美国临时专利申请US62/168,904的权益和优先权，该美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包含WNT抑制剂的治疗组合以及使用联合疗法治疗癌症的方法。
背景技术
WNT信号传导对于胚胎形成和成年动物体内的内稳态均非常重要。WNT通路总体上由调节如下过程的蛋白质网络构成，所述过程为：(1)WNT蛋白质的生成和分泌，(2)WNT与细胞受体的结合，以及(3)由相互作用触发的生物化学反应的细胞内转导(Mikels andNusse，2006；MacDonald，2009；Moon，2005)。
由WNT蛋白与细胞表面共受体Frizzled LRP5/6的结合引发的所谓的典型WNT通路导致到达细胞核的β-链蛋白(β-catenin)的数量发生改变，在细胞核中，β-链蛋白与TCF/LEF家族转录因子相互作用而促进特定基因的转录。
由一系列不同的胞内蛋白转导的非典型WNT通路控制昆虫体内的平面细胞极性以及诸如脊椎动物体内的原肠胚形成之类的几个过程。
WNT通路活性的改变可能引起许多疾病。例如，典型WNT通路的超活化可能导致异常细胞生长(Reya和Clevers，2005)。值得注意的是，90％的结肠直肠癌是由结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)基因的缺失引起的，APC是WNT/β-链蛋白通路的抑制剂(Kinzler和Vogelstein,1996)。WNT蛋白表达的提高和通常抑制WNT蛋白功能的细胞外抑制剂的缺失可能引起WNT依赖性肿瘤(Polakis,2007)。另一方面，非典型WNT通路还表现出在某些癌症的发展过程中发挥作用(Camilli和Weeraratna，2010)。最近，WNT信号传导还涉及癌症干细胞(Takahashi-Yanaga和Kahn,2010)。
已有证据表明靶向Wnt介导的信号传导通路可能对多种疾病产生治疗作用(Barker和Clevers,2006)。导致典型Wnt通路组成性活化的APC的突变、β-链蛋白的突变或轴蛋白-1的突变是多种人类癌症中的关键事件，所述人类癌症包括结肠直肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌和其他癌症(Polakis,2007)。采用基因或化学方法阻断多种癌症中的Wnt通路已表现出终止异常细胞生长(Herbst Kolligs,2007)。此外，抑制这一通路可能直接影响维持癌细胞生长和使癌细胞转移的细胞，这些细胞被认为对传统化疗剂具有耐受性。
除了受体的下游基因产物的突变而引起的异常Wnt通路活化之外，其他机制引起的异常Wnt通路活化与多种癌症相关。这些癌症包括但不限于：肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌、膀胱癌、上皮恶性肿瘤、食道癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。本领域已有多种依赖于上调的自分泌或旁分泌的Wnt信号传导的癌细胞的实例，并且来源于骨肉瘤、乳腺癌、头颈癌和卵巢癌的细胞系已显示其通过自分泌或旁分泌的Wnt信号传导而不受细胞凋亡的影响。(Kansara,2009；Bafico,2004；Akiri,2009；DeAlmeida,2007；Chan,2007；Chen,2009；Rhee,2002)。
程序性死亡1(PD-1)是CD28家族受体的成员，其包括CD28,CTLA-4,ICOS,PD-1和BTLA。家族中的初始成员CD28和ICOS通过在添加单克隆抗体之后在增强T细胞增殖方面发挥功能作用而被发现。PD-1的两个细胞表面糖蛋白配体PD-L1和PD-L2已被识别并且表现出在与PD-1结合之后下调T细胞活化和细胞因子分泌。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)均是与PD-1结合的B7同系物。PD-L1也对共刺激分子B7-1具有明显的亲和性。在IFN-γ激活之后，PD-L1在T细胞、NK细胞、巨噬细胞、髓样DC、B细胞、上皮细胞和血管内皮细胞上表达。PD-L1基因启动子区域具有对IRF-1的响应元件，即，干扰素调节因子。I型干扰素也可上调小鼠肝细胞、单核细胞、DC和肿瘤细胞上的PD-L1。
已在若干小鼠癌症和人癌症(包括人肺癌、卵巢癌、结肠癌和各种不同的骨髓瘤)中发现了PD-L1的表达。PD-L1的上调看起来可能允许癌症逃避宿主免疫系统。来自患有肾细胞癌的患者的肿瘤标本的分析发现，高表达PD-LI的肿瘤与肿瘤的侵略性提高有关并且使死亡风险提高4.5倍。较高表达PD-L1的卵巢癌患者相对于具有较低表达PD-L1的那些患者具有显著更差的预后。PD-L1的表达与上皮内CD8+T-淋巴细胞计数反相关，这表明肿瘤细胞上的PD-L1可抑制抗肿瘤的CD8+T细胞。
发明内容
本发明总体上提供包含WNT抑制剂的治疗组合以及使用该组合治疗诸如肿瘤或癌症之类的疾病。
一方面，本发明提供如下组合，其包括：(i)治疗有效量的Porcupine拮抗剂和(ii)治疗有效量的PD-L/PD-1轴拮抗剂。
在一些实施方式中，所述Porcupine拮抗剂包括通式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐：
Figure BDA0003887395370000031
其中：
X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，
Figure BDA0003887395370000041
芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，
Figure BDA0003887395370000042
芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，–S(O)2R5,–C(O)OR5,–C(O)R5,–C(O)NR6R7,C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
在一些实施方式中，所述5元或6元杂芳基选自：
Figure BDA0003887395370000043
其中，
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，–S(O)2R5,–C(O)OR5,–C(O)R5,–C(O)NR6R7,C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；以及
R8是氢或C1-6烷基。
在一些实施方式中，R1和R2被1个或2个R4基团独立地取代。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物或其生理学上可接受的盐：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2'-氟-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1,1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2,7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2,7-萘啶-3-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2'-氟-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1,6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1,3,4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
2'-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2,4'-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺。
在一些实施方式中，Porcupine拮抗剂包括下式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
Figure BDA0003887395370000091
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基或哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2,3'-联吡啶-6'-基)-2-(2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-甲基-3-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
在一些实施方式中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
在一些实施方式中，PD-L/PD-1轴拮抗剂选自：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
在一些实施方式中，PD-L/PD-1轴拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合搭档的结合。
在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和PD-L2这两者的结合。
在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抗体。
在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是MDX-1106，Merck 3745，CT-011，AMP-224或AMP-514。
在一些实施方式中，PD-L/PD-1轴拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-LI与PD-1和B7-I这两者的结合。
在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抗体，例如，选自YW243.55.S70，MPDL3280A，MDX-1105，MEDI-4736，和MSB0010718C的抗体。
在一些实施方式中，PD-L/PD-1轴拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是抗体。
在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘合素。
另一方面，本发明提供用于治疗或延缓个体的癌症恶化的方法，所述方法包括将本文提供的组合给药于所述个体。
在一些实施方式中，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、肠癌、胆管癌、胰腺癌、子宫内膜癌或前列腺癌。
在一些实施方式中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。
通过引用并入
在本说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本文，这如同明确地且单独地表明将各个公开出版物、专利或专利申请通过引用并入本文中。
附图说明
本发明的新颖性特征在所附的权利要求中进行具体说明。通过结合下文列举的对示例性的实施方式的详细描述可更好地理解本发明的特征和优点，在示例性的实施方式中的详细描述利用了本发明的原理，对示例性的实施方式中的附图说明如下：
图1显示了由CGX1321治疗，抗-PD-1治疗和CGX1321/抗PD-1联合治疗的肿瘤生长，8个小鼠/组。TGI：肿瘤生长抑制％。
图2显示了每个治疗组的两个单独的肿瘤生长曲线，8个小鼠/组：(A)：没有治疗，(B)以2mg/kg CGX1321治疗，(C)以10mg/kg抗-PD-1治疗，以及(D)CGX1321(2mg/kg)和抗-PD-1抗体(10mg/kg)联合治疗。每组中的分数代表每组中显示出肿瘤退化的小鼠个数。
图3显示了治疗结束时每组的脾脏中T-细胞群的流式细胞分析。从每个治疗组的四个随机选择的小鼠中收集脾脏。相对于对照组，*p＜0.05。(A)各组的CD8+CH3+T细胞计数；以及(B)：各组的FoxP3+CD4+T细胞群计数。
具体实施方式
下面结合用于举例说明的的示例性应用对本发明的几个方面进行描述。应当理解的是，列举的关系和方法是为了全面理解本发明。然而，本领域普通技术人员将容易地认识到，本发明可不通过具体细节中的一个或多个来实施而可通过其它方法实施。本发明并不限于所举例说明的操作顺序或事件顺序，这是因为一些操作可以不同的顺序发生和/或与其它操作或事件同时发生。
此外，并不要求将所有举例说明的操作或事件用于实施根据本发明的方法。
本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方式，而无意限定本发明。除非另有明确说明，本文所用的单数形式(“a”，“an”和“the”)也意在包括复数形式。此外，术语“包括(including，includes)”、“具有(having，has，with)”或其变体用在具体实施方式和/或权利要求书中，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，该误差范围部分取决于该值是如何被检测或确定的，即，测量系统的限制。例如，本领域中“约”可意味着每次实施在1或大于1的标准偏差范围以内。可选地，“约”可意味着高达给定值的20％的范围，优选地为高达给定值的10％的范围，更优选地为高达给定值的5％的范围，并且还更优选地为高达给定值的1％的范围。可选地，尤其对于生物系统或过程而言，该术语可意味着在某个数量级范围之内，优选地为某个值的5倍之内，更优选地为某个值的2倍之内。在本申请和权利要求书中对具体值进行描述的条件下，除非另有说明，假设术语“约”是指在特定值的可接受的误差范围内。
I.释义和缩写
除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语总体上具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。总体而言，本文所使用的命名法以及细胞培养，分子遗传学，有机化学，核酸化学和杂交中的实验操作是本领域众所周知的和普遍采用的。采用标准技术进行核酸和肽合成。通常依据本领域的常规方法和多种常规参考文献中的常规方法执行技术和操作，各种不同的常规方法和多种参考文献在本文中提供。本文使用的命名法以及下述分析化学和有机合成中的实验操作是本领域公知的和普遍采用的。采用标准技术或其改进进行化学合成和化学分析。
本文使用的“WNT信号传导通路”或“WNT通路”是指WNT蛋白与细胞受体结合导致细胞行为发生改变的通路。WNT通路涉及多种蛋白，包括卷曲蛋白(Frizzled)，蓬乱蛋白(Disheveled)，轴蛋白(Axin)，APC，GSK3β，β-链蛋白，LEF/TCF转录因子，以及涉及WNT蛋白合成和分泌的分子。功能性WNT分泌所涉及的蛋白的实例包括但不限于：wntless/evennessinterrupted(Wls/Evi)，porcupine(Porcn)和Vps35p。Wls/Evi是一个7次跨膜蛋白，其位于高尔基体中并且是Wg(果蝇)、MOM-2(秀丽隐杆线虫)和Wnt3A分泌所必需的。Wls/Evi包含保守结构基序，该基序的结构和功能尚未知。Porcupine(Porcn)是棕榈酰转移酶的膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)家族的成员。Wnt的脂肪酸修饰对于其功能而言至关重要。Wnt在一个或两个高度保守位点被棕榈酰化。因此，Porcn的抑制剂可阻碍所有功能性Wnt信号传导。Vps35是被称为retromer复合物的多蛋白复合物的亚单位，retromer复合物涉及胞内蛋白质转运。Vps35在结合诸如WNT这样的目标蛋白以将其招募进入囊泡方面发挥作用。
本文使用的“Wnt抑制剂”降低Wnt通路的活性。Wnt抑制剂是可抑制Wnt信号传导通路的化合物并且包括PORCN抑制剂。这种抑制可包括，例如，抑制PORCN及其对Wnt的棕榈酰化，或降低包括卷曲蛋白和蓬乱蛋白在内的Wnt通路组分之间的结合。优选地，Wnt抑制剂是PORCN抑制剂。
术语“抑制WNT通路的方法”是指抑制已知的与功能性WNT蛋白的产生相关的或与WNT蛋白的细胞应答相关的生化事件的方法。正如本文所讨论的，根据该定义，有机小分子可抑制WNT应答。
“WNT蛋白”是与卷曲蛋白和LRP5/6共受体结合以活化典型或非典型WNT信号传导的蛋白，WNT蛋白的具体实例包括：WNT-1(NM005430),WNT-2(NM003391),WNT-2B/WNT-13(NM004185),WNT-3(NM030753),WNT3a(NM033131),WNT-4(NM030761),WNT-5A(NM003392),WNT-5B(NM032642),WNT-6(NM006522),WNT-7A(NM004625),WNT-7B(NM058238),WNT-8A(NM058244),WNT-8B(NM003393),WNT-9A/WNT-14(NM003395),WNT-9B/WNT-15(NM003396),WNT-10A(NM025216),WNT-10B(NM003394),WNT-11(NM004626),WNT-16(NM016087)。
“WNT通路紊乱”是一种具有异常WNT信号传导的病症或疾病状态。一方面，异常WNT信号传导是在疑似患病的细胞或组织中WNT信号传导的水平超过正常细胞或组织中的WNT信号传导水平。在一个具体方面，WNT介导的紊乱包括癌症或纤维化。
术语“癌症”是指人体中特征为不受控制的细胞增殖的病理状态。实例包括但不限于：恶性上皮肿瘤(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。癌症的更具体的实例包括但不限于：肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞癌、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。
术语“纤维化”是指人体中典型特征为成纤维细胞不受控制的增殖和组织硬化的病理状态。具体实例包括但不限于：肺纤维化(先天性肺纤维化和辐射诱导的纤维化)、肾脏纤维化和肝纤维化(包括肝硬化)。
术语“抑制”或“治疗(treating或treatment)”是指缓解方法、治疗方法和预防或防治方法，其目的是缓解或预防目标病理疾病或病症。在一个实例中，在给药WNT信号传导抑制剂之后，癌症患者可表现出肿瘤尺寸减小。“治疗(treating或treatment)”包括：(1)抑制患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病；(2)改善患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病；和/或，(3)使患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病产生任何可测量的降低。WNT通路抑制剂可在一定程度上阻止癌细胞的生长和/或杀死癌细胞，该抑制剂可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受治者或哺乳动物体内的WNT通路紊乱的WNT通路抑制剂(例如，Porcupine拮抗剂)的量。在癌症案例中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量，降低肿瘤尺寸，抑制癌细胞渗透到周围器官，抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤生长，和/或在一定程度上缓解癌症相关症状中的一个或多个症状。
与一种或多种其他治疗剂“联合”给药包括同时(同步)给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合或组合活性成分而获得的产品，且包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者以单个实体的形式或单个剂型的形式同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者作为分开的实体同时、同步或顺序给药于患者而无特定时间限制，其中这种给药方式在患者体内提供治疗有效水平的活性成分。后一种给药方式也适用于鸡尾酒疗法，例如，给药三种或更多的活性成分。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。实例包括但不限于：吉西他滨、伊立替康、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、三胺硫磷、白消安、细胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春花碱和卡铂。
除非另有规定，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指含有指定数目的碳原子(例如，C1-C10是指1到10个碳原子)的直链或支链或环状烃自由基或其组合，所述直链或支链或环状烃自由基或其组合可为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可包括二价和多价自由基。饱和烃自由基的实例包括但不限于如下基团，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，它们的类似物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于：乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意味着包括那些下文更加详细地定义的烷基的衍生物，例如，“杂烷基”。限定为烃基基因的烷基也被称为“均烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价自由基，例如，但不限于：–CH2CH2CH2CH2-，且进一步包括那些下文如“杂亚烷基”所描述的基团。通常地，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，本发明优选那些具有小于或等于10个碳原子的烷基(或亚烷基)基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有小于或等于8个碳原子的短链烷基或亚烷基基团。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基(或硫代烷氧基)”以其常规含义使用，并且分别是指通过氧原子、氨基或硫原子连接至分子其余部分的那些烷基。
除非另有说明，“杂烷基”其自身或与另一术语组合是指由规定数目的碳原子和选自O,N,Si和S的至少一个杂原子组成的、稳定的直链或支链或环状烃自由基或其组合，其中，所述氮原子和硫原子可被任选地氧化，所述氮杂原子可被任选地季铵化。杂原子O、N、S和Si可位于杂烷基的任何内部位置上，或位于烷基与分子其余部分连接的位置上。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3,-CH2-CH2-NH-CH3,-CH2-CH2-N(CH3)-CH3,-CH2-S-CH2-CH3,-CH2-CH2,-S(O)-CH3,-CH2-CH2-S(O)2-CH3,-CH＝CH-O-CH3,-Si(CH3)3,-CH2-CH＝N-OCH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以相邻，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”自身或作为另一取代基的一部分是指由杂烷基衍生的二价自由基，例如但不限于：-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。在杂亚烷基中，杂原子也可占据链端中的一个末端或两个末端(例如，亚烷基氧、亚烷基二氧、亚烷基氨基、亚烷基二氨基，等)。而且进一步地，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团而言，连接基团的化学式书写方向没有暗示连接基团的取向。例如，分子式-C(O)2R’-代表-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
总体而言，“酰基取代基”也选自上述基团。本文使用的术语“酰基取代基”是指连接至羰基碳且满足羰基碳的化合价的基团，所述羰基碳直接或间接地连接至本发明化合物的多环核心。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或者与其他术语组合分别表示“烷基”或“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基而言，杂原子可以占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。
除非另有说明，术语“卤代”或者“卤素”自身或者作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或者碘原子。此外，诸如“卤代烷基”之类的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于：三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基，等等。
除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和芳香族烃取代基，其可以是单环或者多环(优选1到3个环)，它们稠合在一起或者共价连接。术语“杂芳基”是指含有选自N、O和S的1到4个杂原子的芳基(或者环)，其中氮和硫原子可被任选地氧化，并且氮原子可被任选地季铵化。杂芳基基团可以通过杂原子连接至分子的其余部分。芳基和杂芳基基团的非限定性实例包括：苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基选自下文描述的可接受的取代基。
为了简洁起见，当术语“芳基”与其他术语(例如，芳氧基、芳硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上文定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基连接至烷基的那些自由基(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，所述烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基)已经被例如氧原子替代的那些烷基(例如，苯氧基甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等)。
上文所述的术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的每一个包括上文指出的基团的取代和未取代的形式。每种类型的基团的优选的取代基在下文提供。
烷基和杂烷基自由基(包括通常称作亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基通常分别称作“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，并且它们可以是选自下列多种基团中的一种或多种，但不限于下列基团：-OR’,＝O,＝NR’,＝N-OR’,-NR’R”,-SR’,-卤素,-SiR’R”R”’,-OC(O)R’,-C(O)R’,-CO2R’,-CONR’R”,-OC(O)NR’R”,-NR”C(O)R’,-NR’-C(O)NR”R”’,-NR”C(O)2R’,-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””,-NR-C(NR’R”)＝NR’”,-S(O)R’,-S(O)2R’,-S(O)2NR’R”,-NRSO2R’,-CN和–NO2，所述取代基的数目为0到(2m’+1)，其中m’是这种自由基中碳原子的总数。优选地，R’,R”,R”’和R””每一个独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如，由1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或者硫代烷氧基，或者芳基烷基基团。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，每个R基团如每个R’,R”,R’”和R””(当存在多于一个这些基团时)一样独立地选择。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5-元，6-元或者7-元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。基于上文对取代基的讨论，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括包含连接到不同于氢的基团的碳原子的基团，例如，卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3，等等)。
类似于对烷基自由基的取代基的描述，芳基取代基和杂芳基取代基通常分别称作“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，并且芳基取代基和杂芳基取代基是不同的，选自，例如：卤素，-OR'，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR'R”R”'，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R'，-CONR'R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR'-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R'，-NR-C(NR’R”)＝NR”’，-S(O)R’，-S(O)2R'，-S(O)2NR’R”，-NRSO2R’，-CN和-NO2，-R’，-N3，-CH(Ph)2，氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，所述取代基的数目为0到芳香环系统上开放化合价的总数；并且其中，优选地，R’，R”，R”’和R””独立地选自：氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时，例如，每个R基团如每个R’，R”，R”’和R””(当存在一个以上的这些基团时)一样独立地选择。
芳基或者杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的两个可以任选地被通式-T-C(O)-(CRR')q-U-表示的取代基替代，其中T和U独立地为NR-，-O-，-CRR’-或者单键，q为0到3的整数。可选地，芳基或者杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被通式-A-(CH2)r-B-表示的取代基替代，其中A和B独立地为-CRR'-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR’-或者单键，并且r为1到4的整数。这样形成的新环的单键之一可以被双键任选地替代。可选地，芳基或者杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选用通式-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-表示的取代基替代，其中s和d独立地为0到3的整数，X为-O-，-NR'-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或-S(O)2NR’。优选地，取代基R，R’，R”和R”’独立地选自氢或者取代或未取代的(C1-C6)烷基。
在本文中，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
II.组合物
总体而言，本发明提供治疗组合，药物组合物和使用联合疗法治疗癌症的方法。
一方面，本发明提供如下治疗组合，其包括：(i)治疗有效量的WNT抑制剂(例如，Porcupine拮抗剂)，以及(ii)有效量的PD-L/PD-1轴拮抗剂。
治疗组合可在单个药物组合物中提供，这样，WNT抑制剂和PD-L/PD-1轴拮抗剂化合物可一同给药。在可选的实施方式中，可使用多于一个药物组合物提供治疗组合。在这样的实施方式中，WNT抑制剂化合物可在一种药物组合物中提供并且PD-L/PD-1轴拮抗剂可在另一药物组合物中提供，这样，两种化合物可分开给药，例如，以不同的时间、通过不同的给药途径等等分开给药。因此，可以不同的给药方案提供WNT抑制剂化合物和PD-L/PD-1轴拮抗剂化合物。
除非另有说明，本发明的化合物可包括任何药学上可接受的形式的化合物，包括任何异构体(例如，非对映异构体或对映异构体)，盐，溶剂化物，多晶型物，等等。具体而言，如果化合物是光学活性的，本发明的化合物可包括化合物的各个对映异构体以及对映异构体的外消旋混合物。
A.WNT抑制剂
在一些实施方式中，Wnt抑制剂是适用于人类的Porcupine抑制剂。Wnt抑制剂可以是具有与已知的Porcupine抑制剂(例如，IWP-2,IWP-3或IWP-4)类似的功能的Porcupine抑制剂，所述已知的Porcupine抑制剂由Chen B等人的文章(Chen B等人，(2009)NatureChem.Biol.5:100-107)描述并且可从Miltenyi Biotech买到，例如，StemoleculeTM Wnt抑制剂IWP-2(#130-095-584),StemoleculeTM Wnt抑制剂IWP-3(#130-095-585)以及StemoleculeTM Wnt抑制剂IWP-4。StemoleculeTM IWP-2,StemoleculeTM IWP-3,以及StemoleculeTM IWP-4防止Wnt蛋白被Porcupine(PORCN，膜结合O-酰基转移酶)棕榈酰化。
可选地，Wnt抑制剂可以是药物设计的产物并且可使用本领域已知的多种方法生产。参见，国际申请WO2010/101849，公开日2010年9月10日。用于设计模拟物或本发明使用的其他化合物的各种不同的药物设计方法在Maulik等人，(1997)MolecularBiotechnology:Therapeutic Applications and Strategies.Wiley-Liss,Inc.(其全部内容通过引用并入本文)中公开。Wnt抑制剂可获自分子多样性策略(允许快速构建大的化学上多样化的分子文库的相关策略的组合)，天然或合成化合物的文库，具体而言，Wnt抑制剂可获自化学或组合文库(即，在顺序或尺寸上有差异但具有类似构件的化合物的文库)或者Wnt抑制剂可由合理的、定向的或随机的药物设计获得。参见，例如，Maulik等人，(1997)Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications and Strategies.Wiley-Liss,Inc。在分子多样性策略中，使用生物方法、酶方法或化学方法，由肽、寡核苷酸、天然或合成的类固醇化合物、糖类或天然或合成的有机且非类固醇分子合成大的化合物文库。开发分子多样性策略中的关键参数包括亚单位多样性、分子尺寸和文库多样性。筛选这种文库的总体目的在于顺序应用组合选择以获得对期望的目标具有高亲和性的配体并且随后通过随机或定向设计策略优化目标分子。分子多样性的方法在Maulik等人的文章(Maulik等人，(1997)Molecular Biotechnology:TherapeuticApplications and Strategies.Wiley-Liss,Inc)中详细描述。
另一方面，本发明提供作为Porcupine拮抗剂或抑制剂的化合物。
本文的“PORCN”是指Porcupine，其是一种膜结合酰基转移酶，是Wnt翻译后修饰所需的。除非另有明确说明，本文使用的PORCN是指人PORCN-登录号：NM_017617.3/NP_060087。
树突细胞(DC)中的Wnt信号传导导致免疫抑制。肿瘤通过将Wnt配体(或可能的其他可溶因子)分泌至它们的微环境中活化DC中的Wnt信号传导。DC中的组成性Wnt信号传导也是在健康肠内维持黏膜对食物、共生微生物和自身抗原的耐受性的主要机制。DC中的Wnt信号传导包括：(1)上调DC中的免疫抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达；(2)促进免疫抑制调节性T细胞(Treg)的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)-依赖性发育；以及(3)抑制DC启动肿瘤抗原特异性CD8+效应子T细胞的能力。
在一些实施方式中，Porcupine抑制剂包括通式(I)的结构或其生理学上可接受的盐：
Figure BDA0003887395370000221
其中：
X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；
Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，
Figure BDA0003887395370000222
芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，
Figure BDA0003887395370000223
芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
其中，5元或6元杂芳基包括下列基团但不限于此：
Figure BDA0003887395370000224
R1和R2可被1个至2个R4基团独立地且任选地取代；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，–S(O)2R5,–C(O)OR5,–C(O)R5,–C(O)NR6R7,C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
R8是氢或C1-6烷基。
本文使用的在任何取代基基团(例如，CH2)中的H原子包括所有合适的同位素变体，例如，H，2H和3H。
本文使用的在任何取代基基团中的其他原子包括所有合适的同位素变体，包括但不限于：11C，13C，14C，15N，17O，18O，35S，18F，36I和/或123I。
在一些实施方式中，本发明的化合物的实例包括但不限于下列化合物或其生理学上可接受的盐：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2'-氟-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1,1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2,7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2,7-萘啶-3-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2'-氟-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶e-2-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1,6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1,3,4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
2'-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2,4'-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺。
在一些实施方式中，本发明的化合物的实例包括但不限于WO2014165232A1(其公开的全部内容通过引用并入本文)的实施例1-5提供的化合物以及表1中提供的化合物。本领域技术人员可以清楚地理解并知晓可通过与WO2014165232A1的实施例1-5相同的方案制备其他化合物。
表1.化合物表格
Figure BDA0003887395370000281
Figure BDA0003887395370000291
Figure BDA0003887395370000301
Figure BDA0003887395370000311
Figure BDA0003887395370000321
Figure BDA0003887395370000331
Figure BDA0003887395370000341
Figure BDA0003887395370000351
Figure BDA0003887395370000361
Figure BDA0003887395370000371
Figure BDA0003887395370000381
Figure BDA0003887395370000391
Figure BDA0003887395370000401
Figure BDA0003887395370000411
Figure BDA0003887395370000421
Figure BDA0003887395370000431
Figure BDA0003887395370000441
Figure BDA0003887395370000451
Figure BDA0003887395370000461
Figure BDA0003887395370000471
Figure BDA0003887395370000481
Figure BDA0003887395370000491
在一些实施方式中，本文所述的用于治疗的Porcupine拮抗剂或抑制剂是WO2010/101849 A1(PCT/US10/025813)中公开的任何合适的化合物，优选地为通式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
Figure BDA0003887395370000492
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2,3'-联吡啶-6'-基)-2-(2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-甲基-3-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
在一些实施方式中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
B.PD-L/PD-1轴拮抗剂
总体而言，本文提供的组合包括实体，例如，能够特异性结合特定靶点的PD-L/PD-1轴拮抗剂(例如，PD-L1,PD-L2或PD-1)。所述实体相对于非靶点能够特异性结合或优先结合PD-L1,PD-L2或PD-1。
本文中的“特异性结合”或“优先结合”是指两个结合搭档(例如，靶向部分及其结合搭档)之间的结合对两个结合搭档具有选择性并且可从不想要的或非特异性相互作用中区分出来。例如，抗原结合部分结合特异性抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)或其他本领域技术人员熟悉的技术(例如，表面等离子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000)))和传统的结合分析(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))进行测量。术语“抗-[抗原]抗体”和“结合[抗原]的抗体”是指能够通过足够的亲合力结合各自抗原的抗体，这样，所述抗体用作靶向抗原的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方式中，抗-[抗原]抗体结合不相关的蛋白质的程度小于所测量(例如，通过放射性免疫分析(RIA))的抗体抗原结合程度的约10％。在一些实施方式中，结合[抗原]的抗体的解离常数(KD)小于1μM、小于100nM、小于10nM、小于1nM、小于0.1nM、小于0.01nM或小于0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。应当理解的是，上述定义还可应用于与抗原结合的抗原结合部分。
本文中的“PD-L/PD-1轴拮抗剂”是指如下分子：其抑制PD-L/PD-1轴结合搭档与其结合搭档中的一个或多个发生相互作用，从而消除由PD-L/PD-1信号传导轴上的信号传导而产生的T细胞功能障碍，使T细胞功能(例如，增殖、细胞因子的产生，靶细胞杀伤)恢复或提高。本文使用的PD-L/PD-1轴拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
本文使用的“PD-1结合拮抗剂”是指如下分子：其降低、阻断、抑制、取消或干扰由PD-1与其结合搭档中的一个或多个(例如，PD-L1，PD-L2)的相互作用而产生的信号传导。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其结合搭档结合的分子。在特定的方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗-PD-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘合素，融合蛋白，寡肽以及其他降低、阻断、抑制、取消或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用而产生的信号传导的分子。在一种实施方式中，PD-1结合拮抗剂减弱阴性共刺激信号，从而使功能障碍性T细胞产生较少的功能障碍(例如，提高抗原识别的效应物响应)，其中，所述阴性共刺激信号由或者通过如下过程介导：T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白通过PD-1介导的信号传导。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抗-PD-1抗体。在特定的方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的MDX-1106。在另一特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的Merck3745。在另一特定方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述的CT-011。
本文使用的“PD-L1结合拮抗剂”是指如下分子：其降低、阻断、抑制、取消或干扰由PD-L1与其结合搭档中的一个或多个(例如，PD-1，B7-1)的相互作用而产生的信号传导。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合搭档结合的分子。在特定的方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂包括抗-PD-L1抗体，其抗原结合片段，免疫粘合素，融合蛋白，寡肽和其他降低、阻断、抑制、取消或干扰由PD-L1与其结合搭档中的一个或多个(例如，PD-1，B7-1)的相互作用而产生的信号传导的分子。在一种实施方式中，PD-L1结合拮抗剂减弱阴性共刺激信号，从而使功能障碍性T细胞产生较少的功能障碍(例如，提高抗原识别的效应物响应)，其中，所述阴性共刺激信号由或者通过如下过程介导：T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白通过PD-1介导的信号传导。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抗-PD-L1抗体。在特定的方面，抗-PD-L1抗体是本文所述的YW243.55.S70。在另一特定的方面，抗-PD-L1抗体是本文所述的MDX-1105。在又一特定的方面，抗-PD-L1抗体是本文所述的MPDL3280A。
本文中的“PD-L2结合拮抗剂”是指如下分子：其降低、阻断、抑制、取消或干扰由PD-L2与其结合搭档中的一个或多个(例如，PD-1)的相互作用而产生的信号传导。在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合搭档结合的分子。在特定的方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂包括抗-PD-L2抗体，其抗原结合片段，免疫粘合素，融合蛋白，寡肽和其他降低、阻断、抑制、取消或干扰由PD-L2与其结合搭档中的一个或多个(例如，PD-1)的相互作用而产生的信号传导的分子。在一种实施方式中，PD-L2结合拮抗剂减弱阴性共刺激信号，从而使功能障碍性T细胞产生较少的功能障碍(例如，提高对抗原识别的效应物响应)，其中，所述阴性共刺激信号由或者通过如下过程介导：T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白通过PD-1介导的信号传导。在一些实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘合素。
抗体
在一些实施方式中，靶向部分包括抗体或其功能片段。
本文中的“免疫球蛋白”或“抗体”是指全长(即，天然生成的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，例如抗体片段。在本发明要求保护的范围内，抗体或抗体片段可被偶联或衍生。这些抗体包括IgGl,lgG2a,IgG3,IgG4(以及IgG4亚型)和IgA同种型。
本文的术语“抗体”以其广义使用并包含各种不同的抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性并且包含免疫球蛋白的Fc区域或与该Fc区域等同的区域。本文中可互换使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”是指具有与天然抗体结构基本类似的结构的抗体或者具有含本文定义的Fc区域的重链的抗体。
本文的“天然抗体”是指具有不同结构的天然生成的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由被二硫键连接的两个相同的轻链和两个相同的重链构成。从N端至C端，每一重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，重链之后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每一轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，轻链之后为恒定轻链结构域(CL)，也称为轻链恒定区。基于抗体恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可指定为两种类型(称为κ和λ)中的一种。
本文中的“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，所述分子包含结合抗原的完整抗体的一部分，所述抗原与完整抗体结合。抗体片段的实例包括但不限于：Fv,Fab,Fab',Fab'-SH,F(ab')2,双价抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如，scFv),单结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。关于一些抗体片段的综述请参见，Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述请参见例如，Pliickthun,in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；以及WO 93/16185；和美国专利US5,571,894和US5,587,458。关于含有挽救受体结合表位残基且具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，请参见美国专利US5,869,046。双价抗体是二价的或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。请参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)中描述。单结构域抗体是含有抗体的所有或一部分重链可变结构域或者含有抗体的所有或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方式中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如，美国专利No.6,248,516 Bl)。抗体片段可通过各种不同的技术制备，所述技术包括但不限于：如本文描述的，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)生成。
本文中的“抗原结合结构域”是指包含与全部抗原或抗原的一部分特异性结合且互补的区域的抗体的一部分。抗原结合结构域可通过例如，一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供。具体而言，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
本文中的“可变区”或“可变结构域”是指涉及使抗体与抗原结合的抗体重链结构域或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中，每一结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人,Kuby Immunology,第六版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以带来抗原结合特异性。
本文中的“高变区”或“HVR”是指序列高度可变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的各个区域。一般而言，天然四链抗体包含六个HVR，三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或涉及抗原识别。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区(CDR)”并且与形成抗原结合区的可变区部分有关的这些术语在本文中互换使用。该特定区域已由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)和Chothia等人,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中，当彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，关于抗体的CDR或其变体的任何定义的应用意在本文定义的和本文使用的术语的范围内。包含特定CDR的确切的残基数目随CDR的序列和尺寸的不同而不同。在给出抗体的可变区氨基酸序列的条件下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包含特定CDR。
本发明的抗体可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白。
本文中的“嵌合抗体”是指包含抗体重链和轻链这两者的可变结构域的重组蛋白质，所述可变结构域包括来源于一个物种的抗体(优选地为啮齿动物抗体，更优选地为鼠科动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医应用而言，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种的恒定结构域，所述其它物种例如，类人类灵长类动物、猫或狗。
本文中的“人源化抗体”是指如下重组蛋白：在该重组蛋白中，来自于一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域转移至人重链可变结构域和人轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在一些实施方式中，人源化抗体的框架区的特定残基，尤其是接触或靠近CDR序列的那些特定残基，可被修饰，例如可被来自于原始啮齿动物、类人类灵长类动物的相应残基或其他抗体代替。
本文中的“人抗体”是指例如从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已被“工程化”为响应抗原刺激生成特定的人抗体。在该技术中，人重链基因座和人轻链基因座的元件被引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系包含内源性重链基因座和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于生成分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人,NatureGenet.7:13(1994)，Lonberg等人,Nature 368:856(1994)，Taylor等人,Int.Immun.6:579(1994)描述。完全人抗体还可通过基因转染法或染色体转染法以及噬菌体展示技术来构建，所有这些方法为本领域已知的。请参见例如，McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990)，其中描述了通过来自于未免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外生成人抗体及其片段。在该技术中，抗体可变结构域基因被框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质的选择还导致对编码表现出那些性质的抗体的基因的选择。通过该方式，噬菌体模仿B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，关于噬菌体展示的综述请参见例如，Johnson和Chiswell,Current Opinion inStructural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体还可通过体外活化B细胞产生。请参见美国专利US5,567,610和US5,229,275，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
本文中的“抗体融合蛋白”是指通过重组产生的抗原结合分子，其中，相同或不同的天然抗体、具有相同或不同特异性的单链抗体或抗体片段中的两个或两个以上被连接在一起。融合蛋白包含至少一个特异性结合位点。融合蛋白的化合价表示融合蛋白具有的与抗原或表位结合的结合臂或结合位点的总数，即，单价的、二价的、三价的或多价的。多价的抗体融合蛋白是指该抗体融合蛋白可利用多种与抗原结合的相互作用，因此增加与抗原或不同抗原结合的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能够与多少种不同类型的抗原或表位结合，即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)为二价的，因为其具有两个结合臂，但是其为单特异性的，因为其结合一种类型的抗原或表位。单特异性多价融合蛋白具有一个以上用于相同抗原或表位的结合位点。例如，单特异性双价抗体为具有两个与相同的抗原反应的结合位点的融合蛋白。融合蛋白可包含不同抗体成分的多价或多特异性组合或同一抗体成分的多个拷贝。融合蛋白还可包含治疗剂。
在一些实施方式中，靶向部分包括前抗体(probody)，例如，美国专利US8,518,404；US8,513,390；以及美国专利申请公开US 20120237977A1,US 20120149061A1,US20130150558A1中所公开的那些，这些美国专利以及美国专利申请公开的全部内容通过引用并入本文。
前抗体(probody)是在癌症微环境中被选择性地活化的单克隆抗体，从而使治疗性抗体的活性聚焦于肿瘤并且不会影响健康组织。
总体而言，前抗体(probody)至少包括抗体或其抗体片段(统称为“AB”)，其能够特异性结合靶点，其中，AB被遮盖部分(MM)修饰。当AB被MM修饰且存在靶点时，AB与其靶点的特异性结合相对于未被MM修饰的AB或母体AB与靶点的特异性结合被降低或被抑制。MM与AB的解离常数(Kd)通常大于AB与靶点的Kd。当AB被MM修饰并且存在靶点时，AB与其靶点的特异性结合相对于未修饰的AB与MM的特异性结合或母体AB与靶点的特异性结合被降低或被抑制。当AB连接至MM或被MM修饰时，MM可“遮盖”或降低或抑制AB与其靶点的特异性结合。当AB连接至MM或被MM修饰时，这种连接或修饰可影响如下结构变化，所述结构变化降低或抑制AB与其靶点特异性结合的能力。
本发明涉及包含WNT抑制剂的治疗组合以及使用联合疗法治疗癌症的方法。
在一些实施方式中，前抗体(probody)是可活化的抗体(AA)，在该可活化的抗体中，被MM修饰的AB还可包括一种或多种可裂解的部分(CM)。这种AA表现出可活化地/可转换地结合至AB的靶点。AA通常包括被遮盖部分(MM)修饰或连接至遮盖部分(MM)的抗体或抗体片段(AB)以及可修饰或可裂解部分(CM)。在一些实施方式中，CM包含用作目标蛋白酶的底物的氨基酸序列。在其他实施方式中，CM提供通过还原作用可裂解的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。在其他实施方式中，CM提供通过光解作用可活化的光解底物。
可对AA的CM和AB进行如下选择：AB代表目标靶点的结合部分，CM代表与靶点共同定位于受治者体内的治疗位点的蛋白酶的底物。可选地或此外，CM是半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，该二硫键的还原作用可导致该二硫键裂解。AA包括蛋白酶-可裂解CM或半胱氨酸-半胱氨酸二硫键中的至少一种，并且在一些实施方式中，AA包括两种类型的CM。可选地或进一步地，AA可包括由光源活化的、光致不稳定的底物。例如，在能够裂解CM中的某个位点的蛋白酶在治疗位点的含靶点的组织(例如，患病组织，例如，接受治疗的或诊断出的患病组织)中的水平相对于非治疗位点的组织(例如，健康组织)中的水平相对较高的情况下，本文公开的AA具有特定的用途。例如，在能够还原CM中的某个位点的还原剂在治疗或诊断位点的含靶点的组织中的水平相对于非治疗或非诊断位点的组织中的水平相对较高的情况下，本文公开的AA还具有特定的用途。例如，在能够光解CM中的某个位点的光源(例如，激光的方式)被引入治疗或诊断位点的含靶点的组织中的情况下，本文公开的AA还具有特定的用途。
在一些实施方式中，AA可提供降低的毒性和/或降低的不良副作用，如果AB没有被遮盖或抑制其与靶点的结合，那么在非治疗位点处AB的结合会产生毒性和/或不良副作用。在AA包含如下CM的情况下，当目标靶点存在于理想治疗位点时，这些AA中的AB可选择用于进行AB的活化，这样，治疗位点的环境的还原电势高于例如非治疗位点的环境的还原电势，所述CM是通过促进二硫键还原的还原剂可裂解的，所述理想治疗位点的特征为还原剂水平升高。
总体而言，AA可通过选择目标AB并且构建AA的剩余部分来设计，这样，当受到构象限制时，MM提供对AB的遮盖或降低AB与其靶点的结合。结构设计标准要考虑到提供这种功能特性。
抗-PD-1抗体
在一些实施方式中，TM是单克隆抗-PD-1抗体。
程序性死亡-1(“PD-1”)是PD-L1(也称为CD274，B7-H1或B7-DC)的受体。PD-1是T细胞调节因子的扩展CD28/CTLA4家族中的大约31kD的I型膜蛋白成员(Ishida,Y.等人(1992)EMBO J.11:3887-3895；美国专利申请公开US2007/0202100；US2008/0311117；US2009/00110667；美国专利US6,808,710；US7,101,550；US7,488,802；US7,635,757；US7,722,868；PCT公开WO 01/14557)。与CTLA4相比，PD-1更加广泛地负向调节免疫反应。
PD-1在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达(Agata,Y.等人(1996)Int.Immunol.8(5):765-772；Yamazaki,T.等人(2002J.Immunol.169:5538-5545))并且在自然杀伤(NK)T细胞中以低水平表达(Nishimura,H.等人(2000)J.Exp.Med.191:891-898；Martin-Orozco,N.等人(2007),Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。
PD-1的胞外区域由单独的免疫球蛋白(Ig)V结构域构成，该结构域与CTLA4中相应的结构域具有23％的一致性(Martin-Orozco,N.等人(2007)Semin.Cancer Biol.17(4):288-298)。胞外IgV结构域之后为跨膜区域和胞内尾。胞内尾包含位于基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负向调节TCR信号(Ishida,Y.等人(1992EMBO J.11:3887-3895；Blank,C.等人(Epub 2006Dec.29)Immunol.Immunother.56(5):739-745)。
能够免疫特异性结合鼠科动物PD-1的抗体已被报道(参见，例如，Agata,T.等人(1996)Int.Immunol.8(5):765-772)。
抗-PD-1抗体结合PD-1并且提高T细胞功能，从而上调细胞介导的免疫反应并用于治疗T细胞功能失调性疾病，例如，肿瘤免疫。
在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是MK-3475(之前称为lambrolizumab，Merck)，AMP-514,AMP-224(MedImmune/AstraZeneca)，BMS-936558(MDX-1106,Bristol-MyersSquibb)或CT-011(Curetech)。
派姆单抗(Pembrolizumab)(MK-3475)是人源化的单克隆抗-PD-1抗体，其被设计为重新活化抗肿瘤免疫性。派姆单抗(Pembrolizumab)通过抑制T细胞上PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用而发挥双配体阻断PD-1通路的作用。
在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是US8,354,509和US8,168,757中公开的抗体中的一种，该美国专利文献的全部内容通过引用并入本文。
Nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106)是完全人IgG4单克隆抗体，由Bristol-Myers Squibb研发，用于治疗癌症。
在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是WO2004/056875、US7,488,802和US8,008,449中公开的抗体中的一种，这些专利文献的全部内容通过引用并入本文。
AMP-514和AMP-224是抗-程序性细胞死亡1(PD-1)单克隆抗体(mAb)，其由Amplimmune研发，被MedImmune获得。
在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是美国申请公开US20140044738中公开的抗体中的一种，该美国申请公开的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，六个CDR是：(A)抗-PD-1抗体1E3的三个轻链CDR和三个重链CDR；(B)抗-PD-1抗体1E8的三个轻链CDR和三个重链CDR；或(C)抗PD-1抗体1H3的三个轻链CDR和三个重链CDR。
Pidilizumab(CT-011)是由以色列的Curetech Ltd公司研发的抗-PD-1单克隆抗体。
在一些实施方式中，抗-PD-1抗体是美国专利申请公开US20080025980和US20130022595中公开的抗体中的一种，该美国专利申请公开的全部内容通过引用并入本文。
抗-PD-L1抗体
在一些实施方式中，TM是单克隆抗-PD-L1抗体。
程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274和B7-H1)是PD-1的配体，其在活化的T细胞、B细胞、骨髓细胞和巨噬细胞上被发现。虽然PD-1有两个内源性配体PD-L1和PD-L2，但是抗肿瘤疗法关注抗-PD-L1抗体。PD-1和PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞的增殖并降低免疫反应(Topalian等人,2012,N Engl J Med 366:2443-54；Brahmer等人,2012,N Eng JMed 366:2455-65)。抗-PD-L1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和恶性血液病(Brahmer等人,N Eng J Med 366:2455-65；Ott等人,2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等人,2013,Clin Cancer Res19:5541；Menzies&Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等人,2008,ClinCancer Res 14:13044-51)。PD-L1是B7家族成员，该B7家族成员在包括APC和活化的T细胞在内的许多类型的细胞上表达(Yamazaki等人(2002)J.Immunol.169:5538)。PD-L1与PD-1和B7-1这两者结合。通过PD-L1与T细胞表达的B7-1的结合以及通过B7-1与T细胞表达的PD-L1的结合均导致T细胞受到抑制(Butte等人(2007)Immunity 27:111)。本领域已有证据表明，类似于其他B7家族成员，PD-L1还可向T细胞提供共刺激信号(Subudhi等人(2004)J.Clin.Invest.113:694；Tamura等人(2001)Blood 97:1809)。
除非另有明确说明，本文中的“PD-L1”是指包括具有全长多肽的至少一种生物活性的由细胞自然表达的任何变体或同种型和/或它们的片段。此外，术语“PD-L1”包括PD-L1(Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192:1027)和具有全长多肽的至少一种生物活性的由细胞自然表达的任何变体或同种型和/或它们的片段。例如，本领域已知来自包括人类在内的不同物种的PD-L1序列(参见，例如，Chen等人,美国专利US6,803,192，其公开了人和小鼠PD-L1序列，Wood等人,美国专利US7,105,328,其公开了人PD-L1序列，这两篇参考文献的全部内容通过引用并入本文)。
抗-PD-L1抗体与PD-L1结合并增强T-细胞功能，从而上调细胞介导的免疫反应，用于治疗T细胞功能失调性疾病，例如，肿瘤免疫。
在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是MPDL3280A和YW243.55.S70(Genentech/Roche)，MEDI-4736(MedImmune/AstraZeneca)，BMS-936559(MDX-1105，Bristol-MyersSquibb)和MSB0010718C(EMD Serono/Merck KGaA)。
MPDL3280A(TECENTRIQTM，或atezolizumab，Genentech)是一种设计为靶向在肿瘤细胞和肿瘤浸润的免疫细胞上表达的PD-L1的基因工程抗-PD-L1抗体。MPDL3280A被设计为阻止PD-L1与PD-1和B7.1结合。对PD-L1的这种阻断能够活化T细胞，恢复T细胞检测和攻击肿瘤细胞的能力。MPDL3280A包含设计为通过最小化抗体依赖性细胞毒性(ADCC)优化疗效和安全性的基因工程片段可结晶(Fc)结构域。
在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是US7,943,743中公开的抗体中的一种，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
BMS-936599(MDX-1105,Bristol-Myers Squibb)是抑制PD-L1配体与PD-1和CD80这两者结合的完全人IgG4抗-PD-L1mAb。
在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是US7,943,743中公开的抗体中的一种，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
MSB0010718C(EMD Serono of Merck KGaA)是与PD-L1结合的完全人IgG1单克隆抗体。
在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是WO2013079174A1中公开的抗体中的一种，该专利文献的全部内容通过引用并入本文。
MEDI4736(MedImmune/AstraZeneca)是特异性结合PD-L1，阻止PD-L1与PD-1和CD80结合的人IgG1抗体。
在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是WO2011066389A1和US8,779,108中公开的抗体中的一种，该专利文献的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，抗-PD-L1抗体是US8,552,154中公开的抗体中的一种，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，靶向部分包含Fab，Fab’，F(ab’)2，单结构域抗体，T和Abs二聚物，Fv，scFv，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，微小抗体、双价抗体(diabody)、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或多个CDR的抗体类似物。
包含靶向部分的PD-L/PD-1轴拮抗剂
在一些方面，PD-L/PD-1轴拮抗剂是靶向治疗剂，其包含靶向部分，例如ADC。
本文中的“靶向部分(TM)”或“靶向剂”是指特异性地或选择性地与目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体结合的分子、复合物或聚集体，所述目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体通常称为“靶点”或“标志物”并且本文将进一步详细讨论这些目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体。
在一些实施方式中，靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。
诸如抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)、受体的配体、植物凝集素和糖类以及一些酶的底物之类的示例性的靶向剂在本领域中被识别并且不受限制地用于实施本发明。其他靶向剂包括一类如下化合物：该化合物不包括特异性分子识别基序，该化合物包括将分子质量加至活化部分的纳米颗粒、诸如聚(乙二醇)之类的大分子、多糖，以及聚氨基酸。额外的分子质量影响活化部分的药代动力学，例如血清半衰期。
在一些实施方式中，靶向部分为抗体，抗体片段，双特异性抗体或其他基于抗体的分子或化合物。然而，靶向部分的其他实例是本领域已知的并且可使用靶向部分的其他实例，例如，适体、高亲和性多聚体(avimer)、受体结合配体、核酸、生物素-亲和素结合对、结合肽或蛋白质，等等。术语“靶向部分”和“结合部分”在本文中同义使用。
本文中的“靶点”或“标志物”是指能够特异性结合特定的靶向部分的任何实体。在一些实施方式中，靶点与一个或多个特定的细胞或组织类型特异性相关。在一些实施方式中，靶点与一种或多个特定的疾病状态特异性相关。在一些实施方式中，靶点与一种或多个特定的发育阶段特异性相关。例如，细胞类型特异性标志物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍。在一些实施方式中，细胞类型特异性标志物的水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或者至少1,000倍。细胞类型特异性标志物的检测或测量可将一种目标细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区别开。在一些实施方式中，靶点可包含本文所描述的蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。
如果一种物质与核酸靶向部分特异性结合，那么该物质可被认为是为了本文所述的目的而“被靶向的”。在一些实施方式中，核酸靶向部分在严格条件下与靶点特异性结合。如果靶向部分与靶点特异性结合，那么含有靶向部分的本发明的复合物或化合物被认为是“靶向的”，从而将整个复合物或化合物组合物递送至特定的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室。
在某些实施方式中，根据本发明的化合物包含特异性结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室有关的一个或多个靶点(例如，抗原)的靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与特定器官或器官系统有关的靶点的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含特异性结合一个或多个细胞内靶点(例如，细胞器、细胞内蛋白质)的核靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与病态的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室有关的靶点的靶向部分。在一些实施方式中，化合物包含特异性结合与特定细胞类型(例如，内皮细胞、癌细胞、恶性肿瘤细胞、前列腺癌细胞，等等)有关的靶点的靶向部分。
在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多种特定组织类型(例如，肝脏组织和前列腺组织)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多种特定细胞类型(例如，T细胞和B细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多种特定疾病状态(例如，肿瘤细胞和健康细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含与对一种或多种特定发育阶段(例如，干细胞和分化的细胞)具有特异性的靶点结合的靶向部分。
在一些实施方式中，靶点可为标志物，所述标志物仅仅或主要与一种或几种细胞类型、一种或几种疾病和/或一种或几种发育阶段有关。细胞类型特异性标志物在该细胞类型中的表达水平通常是其在参比细胞群中的表达水平的至少两倍，例如，所述参比细胞群可由含有几乎等量的来自多种(例如，5-10种，或者更多)不同的组织或器官的细胞的混合物构成。在一些实施方式中，细胞类型特异性标志物的表达水平是其在参比细胞群中的平均表达水平的至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标志物的检测或测量可将一种目标细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区别开。
在一些实施方式中，靶点包含蛋白质、糖类、脂质和/或核酸。在一些实施方式中，靶点包含蛋白质和/或其特征部分，例如，肿瘤标志物、整联蛋白、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白、糖蛋白，等等。在一些实施方式中，靶点包含糖类和/或其特征部分，例如，糖蛋白，糖(例如，单糖、二糖、多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上富集糖类的外周区域)，等等。在一些实施方式中，靶点包含脂质和/或其特征部分，例如，油、脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素E)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，靶点包含核酸和/或其特征部分，例如，DNA核酸、RNA核酸、修饰的DNA核酸、修饰的RNA核酸、包括DNA、RNA、修饰的DNA和修饰的RNA的任何组合在内的核酸。
本领域已知多种标志物。典型的标志物包括细胞表面蛋白质，例如，受体。示例性的受体包括但不限于：转铁蛋白受体、LDL受体、生长因子受体(例如，表皮生长因子受体家族成员(例如，EGFR、Her2、Her3、Her4))或血管内皮生长因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、整联蛋白、选择素和CD分子。所述标志物可为仅仅存在于或大量存在于恶性肿瘤细胞上的分子，例如，肿瘤抗原。
在一些实施方式中，所述靶向部分相对于非肿瘤细胞特异性结合肿瘤细胞，或者相对于非肿瘤细胞优先结合肿瘤细胞。
靶向部分与肿瘤细胞的结合可使用本领域已知的方法检测。
在一些实施方式中，所述肿瘤细胞为癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经系统癌症细胞。
在一些实施方式中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤抗原，或者相对于非肿瘤抗原优先结合肿瘤抗原。
在一些特定的实施方式中，靶点为肿瘤标志物。在一些实施方式中，肿瘤标志物为存在于肿瘤中的抗原，所述抗原不存在于正常器官、组织和/或细胞中。在一些实施方式中，肿瘤标志物为抗原，所述抗原在肿瘤中比在正常器官、组织和/或细胞中更加普遍。在一些实施方式中，肿瘤标志物为抗原，所述抗原在恶性癌症细胞中比在正常细胞中更加普遍。
在一些实施方式中，靶向部分包含叶酸或其衍生物。
近年来，关于叶酸的研究取得了很大进步。叶酸为一种细胞分裂必需的小分子维生素。肿瘤细胞分裂异常，叶酸盐受体(FR)在肿瘤细胞表面高表达以捕获足以支持细胞分裂的叶酸。
数据显示FR在肿瘤细胞中的表达是其在正常细胞中的表达的20倍至200倍。FR在各种不同的恶性肿瘤中的表达率为：在卵巢癌中为82％，在非小细胞肺癌中为66％，在肾癌中为64％，在结肠癌中为34％，在乳腺癌中为29％(Xia W，Low PS.Late-targetedtherapies for cancer.J Med Chem.2010；14；53(19):6811-24)。FA的表达率和上皮肿瘤浸润和转移的恶性程度正相关。FA通过FR介导的内吞作用进入细胞，并且FA通过其羧基基团与进入细胞的药物形成FA复合物。在酸性(pH值为5)条件下，FR从FA中分离出来，并且FA将药物释放进入细胞质。
临床上，此系统可用于递送选择性攻击肿瘤细胞的药物。叶酸具有小分子量，不具有免疫原性且具有高稳定性，并且叶酸的合成并不昂贵。更重要的是，药物和载体之间的化学偶联简单，因此，使用FA作为靶向分子构建药物递送系统用于癌症治疗已成为研究热点。目前，临床实验中的EC145(FA化疗药物偶联化合物)可有效攻击癌细胞(Pribble P和Edelman MJ.EC145:a novel targeted agent for adenocarcinoma of the lung.ExpertOpin.Investig.Drugs(2012)21:755-761)。
在一些实施方式中，靶向部分包含细胞外结构域(ECD)或PD-1,PDL-1,CTLA4,CD47,BTLA,KIR,TIM3,4-1BB和LAG3的可溶形式，全长的部分表面配体双调蛋白，β动物纤维素，EGF，肝配蛋白，上皮细胞有丝分裂蛋白抗体(Epigen)，上皮调节蛋白，IGF，神经调节蛋白，TGF，TRAIL或VEGF。
在一些实施方式中，所述靶向部分包含Fab、Fab’、F(ab’)2、单结构域抗体、T和Ab二聚体、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微小抗体、双价抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双价抗体、κ(λ)body、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或一个以上CDR的抗体类似物。
在一些实施方式中，靶向部分为抗体或抗体片段，该靶向部分基于其对在目标靶细胞或靶位点上表达的抗原的特异性进行选择。已识别出多种不同的肿瘤特异性抗原或其他疾病特异性抗原，并且那些抗原的抗体已用于或计划用于治疗这些肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可用于本发明的化合物，尤其用于治疗与靶抗原有关的疾病。可被本发明的抗体-连接体-药物偶联物靶定的目标抗原(及其相关疾病)的实例包括：CD2,CD19,CD20,CD22,CD27,CD33,CD37,CD38,CD40,CD44,CD47,CD52,CD56,CD70,CD79，CD137，4-1BB,5T4，AGS-5,AGS-16,血管生成素2,B7.1,B7.2,B7DC,B7H1,B7H2,B7H3,BT-062,BTLA,CAIX,癌胚抗原,CTLA4,Cripto,ED-B,ErbB1,ErbB2,ErbB3,ErbB4,EGFL7,EpCAM,EphA2,EphA3,EphB2,FAP,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯GM3,GD2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR),gp100,gpA33,GPNMB,ICOS,IGF1R,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,KIR,LAG-3,Lewis Y,间皮素,c-MET,MN碳酸酐酶IX,MUC1,MUC16,粘连蛋白-4,NKGD2,NOTCH,OX40,OX40L,PD-1,PDL1,PSCA,PSMA,RANKL,ROR1,ROR2,SLC44A4,多配体蛋白聚糖-1,TACI,TAG-72,腱生蛋白,TIM3,TRAILR1,TRAILR2,VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3。
在一些实施方式中，靶向部分包含颗粒(靶向颗粒)，优选地为纳米颗粒，任选地为连接至靶向分子的靶向纳米颗粒，所述靶向分子可特异性结合或优先结合靶点。在一些实施方式中，靶向颗粒其自身引导本发明的化合物(例如，通过在肿瘤细胞或肿瘤组织中的富集)，而无需与其连接额外的靶向分子。
本文中的“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的任何颗粒。在一些实施方式中，治疗剂和/或靶向分子可与聚合物基体结合。在一些实施方式中，靶向分子可与聚合物基体的表面共价结合。在一些实施方式中，共价结合由连接体介导。在一些实施方式中，治疗剂可与聚合物基体表面结合，封装在聚合物基体内，被聚合物基体包围，和/或分散于整个聚合物基体。美国专利US8,246,968，该美国专利的全部内容在此通过引用并入本文。
总体而言，本发明的纳米颗粒包含任何类型的颗粒。根据本发明可使用任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒是可生物降解的且生物相容的。总体而言，生物相容性物质对细胞无毒。在一些实施方式中，如果将某种物质加至细胞中产生小于细胞死亡的某一阈值的结果，那么认为该物质是生物相容的。在一些实施方式中，如果将某种物质加至细胞中不诱导副作用，那么认为该物质为生物相容的。总体而言，可生物降解的物质是经过治疗相关时间段(例如，数周、数月或者数年)在生理学条件下发生分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质为可通过细胞机制进行分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质是可通过化学过程分解的物质。在一些实施方式中，颗粒是生物相容且可生物降解的物质。在一些实施方式中，颗粒是生物相容性物质，但不是可生物降解的物质。在一些实施方式中，颗粒是可生物降解的物质，但不是生物相容性物质。
在一些实施方式中，颗粒的粒度大于肾排泄极限(例如，直径大于6nm的颗粒)。在一些实施方式中，颗粒尺寸为足以避免通过肝脏从血流中清除该颗粒的大小(例如，直径小于1000nm的颗粒)。总体而言，颗粒的生理化学特性应当允许靶向颗粒通过降低肾排泄和肝脏清除在血浆中长期循环。
通常，理想的是使用尺寸、形状和/或组成相对均匀的颗粒群，这样，每一颗粒具有类似的性质。例如，至少80％的颗粒，至少90％的颗粒或至少95％的颗粒的直径或最大尺寸落入平均直径或最大尺寸加减5％，加减10％或加减20％的范围内。在一些实施方式中，颗粒群的尺寸、形状和/或组成可为不均一的。
ζ(Zeta)电位为颗粒表面电势的测量值。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-50mV至+50mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-25mV至+25mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-10mV至+10mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-5mV至+5mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+50mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+25mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+10mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mV至+5mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-50mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-25mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-10mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-5mV至0mV。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位基本为中性(即，约0mV)。
根据本发明可使用多种不同的颗粒。在一些实施方式中，颗粒为球形或类球形。在一些实施方式中，颗粒为球体或类球体。在一些实施方式中，颗粒为扁平的或板状的。在一些实施方式中，颗粒为立方体或长方体。在一些实施方式中，颗粒为卵形体或椭圆形。在一些实施方式中，颗粒为圆柱体、圆锥体或金字塔形。
在一些实施方式中，颗粒为微颗粒(例如，微球)。总体而言，“微颗粒”是指直径小于1000μm的任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为微微型颗粒(picoparticle)(例如，微微球体)。总体而言，“微微型颗粒”是指直径小于1nm的任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为脂质体。在一些实施方式中，颗粒为胶束。
颗粒可为实心的或中空的并且可包含一个或多个层(例如，纳米壳，纳米环)。在一些实施方式中，每层相对于其他各层具有独特的组成和独特的性质。例如，颗粒可具有核/壳结构，其中，核为一层，壳为另一层。颗粒可包含多个不同的层。在一些实施方式中，一层可为充分交联的，另一层是未充分联的，等等。在一些实施方式中，不同层中的一层，几层或所有层可包含一种或一种以上待递送的治疗剂或诊断剂。在一些实施方式中，一层包含待递送的药剂，另一层不含待递送的药剂，等等。在一些实施方式中，每个单独的层包含不同的待递送的药剂或药剂的集合。
在一些实施方式中，颗粒为多孔的，其是指颗粒包含孔或通道，所述孔或通道通常比颗粒的尺寸小。例如，颗粒可为多孔二氧化硅颗粒，例如，介孔二氧化硅纳米颗粒，或者颗粒可具有介孔二氧化硅涂层(Lin等人,2005,J.Am.Chem.Soc.,17:4570)。颗粒可具有直径为约1nm至约50nm的孔，例如，直径为约1nm至20nm的孔。颗粒体积的约10％至95％可由孔或通道内的空隙构成。
颗粒可具有涂层。例如，如果颗粒包含对细胞具有毒性的物质，那么生物相容性涂层的使用可为有优势的。合适的涂层物质包括但不限于：诸如牛血清白蛋白(BSA)之类的天然蛋白质、诸如聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物之类的生物相容性亲水聚合物、磷脂-(PEG)、二氧化硅、脂质、聚合物、诸如葡萄聚糖之类的糖类、可与本发明的纳米颗粒结合的其他纳米颗粒，等等。涂层可通过诸如浸蘸、使用层-层技术、自组装、共轭作用等的多种方式涂敷或组装。自组装是指自发地组装成较高级结构的过程，该过程依赖于较高级结构的成分(例如，分子)彼此之间的自然吸引作用。该过程通常基于尺寸、形状、组成或化学性质通过分子的随机运动和键的形成而发生。
聚合物的实例包括：聚亚烷基(例如，聚乙烯)，聚碳酸酯(例如，聚(1,3-二恶烷-2酮))，聚酐(例如，聚(癸二酸酐))，聚羟基酸(例如，聚(β-羟基链烷酸酯))，聚延胡索酸酯，聚己酸内酯，聚酰胺(例如，聚己内酰胺)，聚缩醛树脂，聚醚，聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸交酯)，聚(原酸酯)，聚乙烯醇，聚氨酯，聚磷腈，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚脲，聚苯乙烯和聚胺。在一些实施方式中，根据本发明的聚合物包括已由美国食品药品管理局(FDA)根据21 C.F.R.§177.2600批准用于人体的聚合物，包括但不限于：聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸，聚(乳酸-羟基乙酸)，聚己酸内酯，聚戊内酯，聚(1,3-二恶烷-2酮))，聚酐(例如，聚(癸二酸酐))，聚醚(例如，聚乙二醇)，聚氨酯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酸酯和聚氰基丙烯酸酯。
在一些实施方式中，颗粒可为非聚合颗粒(例如，金属颗粒，量子点，陶瓷颗粒，含有无机材料的聚合物，骨衍生的材料，骨代用品，病毒颗粒，等等)。在一些实施方式中，待递送的治疗剂或诊断剂可与这样的非聚合颗粒的表面结合。在一些实施方式中，非聚合颗粒为非聚合成分的聚集体，例如，金属原子(例如，金原子)的聚集体。在一些实施方式中，待递送的治疗剂或诊断剂可与非聚合成分的聚集体的表面结合和/或封装在非聚合成分的聚集体内、被非聚合成分的聚集体围绕和/或分散于整个非聚合成分的聚集体中。
颗粒(例如，纳米颗粒，微颗粒)可使用本领域已知的任何方法制备。例如，颗粒剂型可通过下列方法以及本领域普通技术人员熟知的其他方法形成：例如纳米沉淀，流动聚焦流体通道，喷雾干燥，单乳液和双乳液溶剂蒸发，溶剂萃取，相分离，研磨，微乳液操作，微制造，纳米制造，牺牲层，简单和复合凝聚。可选地或额外地，已经描述了用于单分散半导体纳米颗粒，导电性纳米颗粒，磁性纳米颗粒，有机纳米颗粒和其他纳米颗粒的水性和有机溶剂合成方法(Pellegrino等人,2005,Small,1:48；Murray等人,2000,Ann.Rev.Mat.Sci.,30:545；以及Trindade等人,2001,Chem.Mat.,13:3843)。
制备用于递送封装的药剂的微颗粒的方法在文献中描述(参见，例如，Doubrow,编辑,“Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,”CRC Press,BocaRaton,1992；Mathiowitz等人,1987,J.Control.Release,5:13；Mathiowitz等人,1987,Reactive Polymers,δ:275；以及Mathiowitz等人,1988,J.Appl.Polymer Sci.,35:755)。
在一些实施方式中，靶向部分包含核酸靶向部分。
总体而言，核酸靶向部分是结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室有关的成分(靶点)的任何多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸靶向部分为适体。
适体通常为与特定目标结构结合的多核苷酸，所述特定目标结构与特定器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内区室有关。总体而言，适体的靶向功能基于适体的三维结构。在一些实施方式中，适体与靶点的结合通常由适体和靶点这两者的二维和/或三维结构之间的相互作用介导。在一些实施方式中，适体与靶点的结合不仅仅基于适体的基本序列，还取决于适体和/或靶点的三维结构。在一些实施方式中，适体通过Watson-Crick互补碱基配对与其靶点结合，所述Watson-Crick碱基配对被破坏碱基配对的结构(例如，发夹环)阻碍。
在一些实施方式中，核酸靶向部分为spiegelmers(PCT公布WO 98/08856,WO 02/100442和WO 06/117217)。总体而言，spiegelmers为合成的镜像核酸，其可特异性结合靶点(即，镜像适体)。Spiegelmers通过如下结构特征表征：所述结构特征使得它们不易受外切-核酸酶和内切-核酸酶的影响。
本领域普通技术人员会意识到的是，根据本发明可使用任何能够特异性结合靶点的核酸靶向部分(例如，适体或spiegelmer)。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定与疾病、失调和/或病症有关的标志物。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定癌相关靶点。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定肿瘤标志物。使用根据本发明的核酸靶向部分可靶定任何类型的癌症标志物和/或任何肿瘤标志物。举例而言，核酸靶向部分可靶定与前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨癌、食管癌、肝癌、胃癌、脑肿瘤、皮肤黑色素瘤和/或白血病有关的标志物。
本发明的核酸(包括核酸靶向部分和/或待递送的功能性RNA，例如，RNAi-诱导实体，核酶，tRNA，等等，下面进一步详细描述)可根据任何可获得的技术制备，包括但不限于：化学合成、酶合成、较长的前体的酶裂解或化学裂解，等等。合成RNA的方法为本领域已知的(参见例如，Gait,M.J.(编辑)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,D.C.:IRL Press,1984；和Herdewijn,P.(编辑)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in molecularbiology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005)。
形成核酸靶向部分的核酸可包含天然生成的核苷，修饰的核苷，具有在一个或一个以上核苷之间插入的烃连接体(例如，亚烷基)或聚醚连接体(例如，PEG连接体)的天然生成的核苷，具有在一个或一个以上核苷之间插入的烃连接体或PEG连接体的修饰的核苷，或它们的组合。在一些实施方式中，核酸靶向部分的核苷酸或修饰的核苷酸可被烃连接体或聚醚连接体取代，只要核酸靶向部分的结合亲合力和选择性基本不会由于取代(例如，核酸靶向部分对靶点的解离常数不应大于约1×10-3M)而降低。
本领域普通技术人员已知，根据本发明的核酸可包含天然生成的核酸中发现的全部类型的核苷酸或者可包括一种或一种以上核苷酸类似物或具有与天然生成的核酸的结构不同的结构。美国专利US6,403,779、US6,399,754、US6,225,460、US6,127,533、US6,031,086、US6,005,087、US5,977,089，这些美国专利中的参考文献公开了多种不同的具体核苷类似物和可使用的修饰。参见Crooke,S.(编辑)Antisense Drug Technology:Principles,Strategies,and Applications(第一版),Marcel Dekker；ISBN:0824705661；第一版(2001)以及其中的参考文献。例如，2'-修饰包括卤代、烷氧基和烯丙氧基。在一些实施方式中，2'-OH基团被选自下列的基团取代：H，OR，R，卤素，SH，SR，NH2，NHR，NR2或CN，其中，R为C1-C6烷基，烯基，或炔基，并且卤素为F，Cl，Br或I。修饰的连接键的实例包括硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接键。
根据本发明，可使用包含多种不同的核苷酸类似物、修饰的骨架或非天然生成的核苷间连接键的核酸。本发明的核酸可包括天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷)或修饰的核苷。修饰的核苷酸的实例包括碱基修饰的核苷(例如，阿糖胞苷(aracytidine)、肌核苷、异鸟苷、水粉荤素(nebularine)、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-脱氮-5-氮杂胞苷、2'-脱氧尿苷、3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫代尿苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、2-硫代尿苷、5-溴代胞苷、5-碘代尿苷、肌核苷、6-氮尿苷、6-氯代嘌呤、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂腺苷、8-叠氮腺苷、苯并咪唑、M1-甲基腺苷、吡咯并嘧啶、2-氨基-6-氯代嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙炔基胞苷、5-丙炔基尿苷、5-溴代尿苷、5-氟代尿苷、5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)，化学或生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)，修饰的糖类(例如，2'-氟代核糖、2'-氨基核糖、2'-叠氮核糖、2'-O-甲基核糖、L-对映异构体核苷阿糖和己糖)，修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接键)以及它们的组合。用于核酸的化学合成的天然核苷酸单体和修饰的核苷酸单体易于获得。在一些情况下，含有这些修饰的核酸相对于仅由天然生成的核苷酸构成的核酸表现出改善的性质。在一些实施方式中，本文所述的核酸修饰被用于降低和/或防止核酸酶(例如，核酸外切酶，核酸内切酶，等等)消化。例如，核酸的结构可通过在一条链或两条链的3'端包括核苷酸类似物以降低消化来稳定。
修饰的核酸不需要沿着分子的全长进行一致性修饰。不同的核苷酸修饰和/或骨架结构可存在于核酸的各个不同位置。本领域普通技术人员可理解的是，核苷酸类似物或其他修饰可位于使核酸的功能基本不受影响的核酸的任何位置。举例而言，修饰可位于使核酸靶向部分特异性结合靶点的能力基本不受影响的核酸靶向部分的任何位置。修饰的区域可位于一条链或两条链的5'端和/或3'端。例如，已使用如下修饰的核酸靶向部分：位于该修饰的核酸靶向部分中的两条链中的任一条链的5'端和/或3'端处的大约1至5个残基为核苷酸类似物和/或具有骨架修饰。所述修饰可为5'或3'末端修饰。一条或两条核酸链可包含至少50％未修饰的核苷酸，至少80％未修饰的核苷酸，至少90％未修饰的核苷酸或100％未修饰的核苷酸。
例如，根据本发明的核酸可包含对糖类、核苷或核苷间连接键的修饰，例如，美国专利申请公开US2003/0175950,US2004/0192626,US2004/0092470,US2005/0020525以及US2005/0032733中描述的那些。本发明包括具有本文所述的修饰中的任何一种或一种以上的任何核酸的应用。例如，已报道了多种末端偶联物(例如，脂质(例如，胆固醇)、石胆酸、月桂酸、长支链烷基)改善细胞摄取。例如，可使用本领域已知的任何合适的测试方法检测类似物和修饰，从而选择使治疗剂或诊断剂的递送得以改善、使核酸的靶向部分与靶点的特异性结合得以改善等等的那些类似物和修饰。在一些实施方式中，根据本发明的核酸可包括一个或一个以上非天然核苷连接键。在一些实施方式中，一个或一个以上位于核酸靶向部分的3'端、5'端或3'端和5'端这两端的内在核苷酸被倒转生成诸如3'-3'连接键或5'-5'连接键之类的连接键。
在一些实施方式中，根据本发明的核酸不是合成的，其为已从其天然环境中分离出来的天然生成的实体。
可使用任何方法来设计新的核酸靶向部分(请参见例如下列美国专利：US6,716,583；US6,465,189；US6,482,594；US 6,458,543；US6,458,539；US6,376,190；US6,344,318；US6,242,246；US6,184,364；US6,001,577；US5,958,691；US5,874,218；US5,853,984；US5,843,732；US5,843,653；US5,817,785；US5,789,163；US5,763,177；US5,696,249；US5,660,985；US5,595,877；US5,567,588和US5,270,163以及下列美国专利申请公开：US2005/0069910,US2004/0072234,US2004/0043923,US2003/0087301,US2003/0054360和US2002/0064780)。本发明提供用于设计新的核酸靶向部分的方法。本发明还提供用于从候选核酸靶向部分的混合物中分离或识别新的核酸靶向部分的方法。
可设计和/或识别与蛋白质、糖类、脂质和/或核酸结合的核酸靶向部分。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与蛋白质和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述蛋白质和/或其特征部分例如，肿瘤标志物、整合素、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白质、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与糖类和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述糖类和/或其特征部分例如，糖蛋白、糖类(例如，单糖、二糖和多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上的糖类富集的外周区域)，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与脂质和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述脂质和/或其特征部分例如，油、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素E)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与核酸和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述核酸和/或其特征部分例如，DNA核酸、RNA核酸、修饰的DNA核酸、修饰的RNA核酸和包括DNA、RNA、修饰的DNA和修饰的RNA的任何组合的核酸，等等。
可使用任何可获得的方法设计和/识别核酸靶向部分(例如，适体或spiegelmer)。在一些实施方式中，核酸靶向部分通过从候选的核酸混合物中识别核酸靶向部分来设计和/或识别。指数富集配体系统进化(SELEX)或其改良方法为从候选的核酸混合物中识别与靶点结合的核酸靶向部分的常用方法。
选择性结合任何靶点的核酸靶向部分可通过SELEX方法或其改良方法分离，条件是所述靶点可用作SELEX方法中的靶点。
III.药物制剂和给药方式
本发明还涉及包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体的药物制剂以及包含本发明的组合的药物制剂。
本文描述的化合物(包括其药学上可接受的载体(例如，其加成盐或水合物))可使用多种不同的给药途径或给药模式递送至患者。合适的给药途径包括但不限于：吸入给药、透皮给药、口服给药、直肠给药、透过粘膜给药、肠道给药和肠胃外给药(包括肌肉内、皮下和静脉注射)。优选地，包含作为靶向部分的抗体或抗体片段的本发明的化合物以肠胃外的方式给药，更优选地，以静脉注射方式给药。
本文使用的术语“给药”意在包括直接和间接地将化合物递送至期望的作用位点的所有方式。
本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或其水合物可单独给药，与本发明的其他化合物联合给药和/或与其他治疗剂联合以混合剂的形式给药。当然，对可与本发明的化合物联合给药的治疗剂的选择部分取决于正在被治疗的病症。
例如，当向患有由依赖于自诱导物的生物体引起的疾病病症的患者给药时，本发明的化合物可以混合剂的形式给药，所述混合剂含有用于治疗疼痛、感染和其他症状以及通常与疾病有关的副作用的药剂。这些药剂包括例如，镇痛剂、抗生素，等等。
当向正在进行癌症治疗的患者给药时，化合物可以混合剂的形式给药，所述混合剂包含抗癌剂和/或补充增效剂。所述化合物还可以含有治疗放疗的副作用的药剂的混合剂的形式给药，所述治疗放疗的副作用的药剂例如，止吐药，防辐射剂，等等。
可与本发明的化合物联合给药的补充增效剂包括例如，三环类抗抑郁药(例如，丙咪嗪(imipramine)、地昔帕明(desipramine)、阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、曲米帕明(trimipramine)、多塞平(doxepin)、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、阿莫沙平(amoxapine)和马普替林(maprotiline))，非三环类抗抑郁药(例如，舍曲林(sertraline)、曲唑酮(trazodone)和西酞普兰(citalopram))，Ca2+拮抗剂(例如，维拉帕米(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、尼群地平(nitrendipine)和卡罗维林(caroverine))，两性霉素，三苯乙醇类似物(例如，它莫昔芬(tamoxifen))，抗心律失常药物(例如，奎尼丁(quinidine))，抗高血压药物(例如，利血平(reserpine))，硫醇消耗物(例如，丁硫氨酸和亚砜亚胺)以及甲酰四氢叶酸钙。
本发明的活性化合物以其自身的形式给药或者以药物组合物的形式给药，在所述药物组合物中，所述活性化合物与一种或一种以上药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。根据本发明使用的药物组合物通常使用一种或一种以上生理学可接受的载体以常规方式配制，所述生理学可接受的载体包含赋形剂和佐剂，所述生理学可接受的载体有利于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
对于透过粘膜给药而言，在剂型中使用适于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常为本领域已知的。
对于口服给药而言，化合物易于通过将活性化合物与本领域已知的药学上可接受的载体结合配制。这些载体能够使本发明的化合物配制成由待治疗的患者口服的片剂、药丸、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆状物和悬浮液。口服的药物制剂可通过如下方式获得：将固体赋形剂与活性化合物混合，任选地研磨得到的混合物，并对颗粒混合物进行加工，如果想要得到片剂或糖衣片芯的话，需要在该过程之前加入合适的佐剂。具体而言，合适的赋形剂为填充剂(例如，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖)，纤维素制剂(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧乙基纤维素钠)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可加入崩解剂，例如，交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。
向糖衣片芯提供合适的包衣。为了实现这个目的，可使用浓缩的糖溶液，该溶液可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加至片剂或糖衣药丸包衣中，用于识别或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合式胶囊和由明胶和增塑剂(例如，丙三醇或山梨糖醇)制成的软的密封的胶囊。推合式胶囊可含有与诸如乳糖之类的填充剂、诸如淀粉之类的粘合剂和/或诸如滑石粉或硬脂酸镁之类的润滑剂和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解于或悬浮于合适的液体中，例如，脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型应当是适于这种给药方式的剂量。
对于口腔给药而言，组合物可以通过常规方式配制的片剂或含片的形式给药。
对于吸入给药而言，根据本发明使用的化合物便于通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以由加压包或喷雾器提供的喷雾的形式递送。在使用加压喷雾的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如，明胶胶囊和药筒)可被配制为含有化合物和合适粉末基体(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物的剂型。
化合物可被配制为通过注射(例如，快速注射或连续输注)方式肠胃外给药的剂型。注射为本发明的组合物的优选的给药方法。用于注射的剂型可以带有添加的防腐剂的单位剂量形式提供，例如，以安瓶或多剂量容器的形式提供。组合物可采用诸如油性载体或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液之类的形式并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂之类的调配剂(formulatory)，并且可加入例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。
用于肠胃外给药的药物剂型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可包含如下物质：该物质增加悬浮液的粘度，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或药剂，该稳定剂或药剂增加化合物的溶解度，从而制备高度浓缩的溶液。对于注射而言，本发明的药剂可被配制成水性溶液，优选地配制成生理相容性缓冲液(例如，Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)。
可选地，活性成分可为使用前溶解于合适的载体中的粉末形式，所述合适的载体例如，无菌无热原水。
化合物还可被配制成直肠用组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂型，例如含有常规栓剂基体(例如可可油或其他甘油酯)。
除了前述剂型之外，化合物还可被配制成长效制剂。这种长期起效的剂型可通过植入或经皮递送(例如，皮下递送或肌肉内递送)、肌肉内注射或透皮贴剂给药。因此，例如，化合物可通过合适的聚合材料或疏水性材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制或可将化合物配制成微溶衍生物，例如，配制成微溶的盐。
药物组合物还可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇之类的聚合物。
优选的药物组合物为配制成注射剂型的组合物，例如，静脉注射剂型，并且该优选的药物组合物包含基于总的100％重量的药物组合物的约0.01％重量至约100％重量的本发明的化合物。药物配体偶联物可为抗体-细胞毒素偶联物，其中，选择靶向特定癌症的抗体。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物还包含其他治疗剂。
在一些实施方式中，所述其他治疗剂为抗癌剂。
在一些实施方式中，其他抗癌剂选自：抗代谢药物、拓扑异构酶I和拓扑异构酶II的抑制剂、烷基化剂、微管抑制剂、抗雄性激素剂、GNRh调节剂或者它们的混合物。
在一些实施方式中，所述其他治疗剂为化疗剂。
本文中的“化疗剂”是指在治疗癌症中有用的化学化合物。实例包括但不限于：吉西他滨(Gemcitabine),伊立替康(Irinotecan),阿霉素(Doxorubicin),5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil),阿糖胞苷(Cytosine arabinoside，“Ara-C”)，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，塞替派(Thiotepa)，白消安(Busulfan)，细胞毒素，紫杉酚，甲氨蝶呤(Methotrexate)，顺铂(Cisplatin)，美法仑(Melphalan)，长春碱(Vinblastine)和卡铂(Carboplatin)。
在一些实施方式中，第二化疗剂选自：他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，阿那曲唑(anastrozole)，依西美坦(exemestane)，来曲唑(letrozole)，伊马替尼(imatanib)，紫杉醇(paclitaxel)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，洛伐他汀(lovastatin)，含羞草素(minosine)，吉西他滨(gemcitabine)，阿糖胞苷(cytarabine)，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，多西他赛(docetaxel)，戈舍瑞林(goserelin)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，诺考达唑(nocodazole)，替尼泊苷(teniposide)，依托泊苷(etoposide)，吉西他滨，埃博霉素(epothilone)，长春瑞滨(vinorelbine)，喜树碱(camptothecin)，柔红霉素(daunorubicin)，放线菌素D(actinomycin D)，米托蒽醌(mitoxantrone)，吖啶(acridine)，阿霉素(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)或去甲氧基柔红霉素(idarubicin)。
IV.试剂盒
另一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文提供的治疗组合以及使用所述治疗组合的说明书。所述试剂盒还包括容器和任选地一种或一种以上小瓶、测试管、烧瓶、瓶子或注射器。其他形式的试剂盒对于本领域技术人员而言是显而易见的并且在本发明的范围内。
IV.医学和药物用途
另一方面，本发明提供治疗有此治疗需求的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的治疗组合或药物组合物给药于所述受治者。
除了上述组合物和构建体之外，本发明还提供本发明的组合的多种用途。本发明的组合的用途包括：杀死肿瘤细胞或癌细胞或者抑制肿瘤细胞或癌细胞的生长、增殖或复制，治疗癌症、治疗癌前症状、预防肿瘤细胞或癌细胞繁殖、预防癌症、预防表达自体免疫抗体的细胞繁殖。这些用途包括将有效量的本发明的化合物给药于有此需要的诸如哺乳动物或人类之类的动物。
本发明的组合可用于治疗诸如人类之类的受治者体内的疾病(例如，癌症)。本发明提供用于治疗肿瘤的组合及其用途，其中治疗肿瘤通过以药学上可接受的方式向受治者提供药学有效量的本发明的组合物来进行。
本文中的“癌症”是指人体内的病理状态，其特征为不受控制的细胞增殖。实例包括但不限于：癌症、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。癌症的更加具体的实例包括但不限于：肺癌(肺小细胞癌和肺非小细胞癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌性癌症、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性髓细胞白血病(AML)和慢性髓细胞白血病(CML)。
“不受控的生长”包括癌细胞的数量和/或尺寸增加(本文中也称为“增殖”)。“转移”是指癌细胞从受治者体内的原发肿瘤位点移动或迁移(例如，侵入)至受治者体内的一个或多个其他区域(在这些区域中，所述细胞可随后形成继发性肿瘤)。因此，在一种实施方式中，本发明提供用于完全或部分抑制患有癌症的受治者体内的继发性肿瘤形成的化合物和方法。
有利地是，本发明的化合物能够选择性抑制癌细胞的增殖和/或转移。
“选择性”是指本发明的化合物可在比其调节非癌细胞的功能(例如，增殖)更高的程度上抑制癌细胞的增殖和/或转移。优选地，本发明的化合物仅仅抑制癌细胞的增殖和/或转移。
另一方面，本发明提供包含本发明的化合物和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，其中，所述化合物是游离形式或药学上可接受的盐的形式。这样的组合物可以是口服组合物、可注射组合物或栓剂。并且，所述组合物可通过混合、造粒或包被方法以常规方式生产。
在本发明的实施方式中，所述组合物是口服组合物并且其可以是片剂或明胶胶囊。优选地，所述口服组合物包含本发明的化合物以及a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸的镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂而言，该口服组合物包括：c)粘合剂，例如，硅酸镁铝盐、淀粉糊、明胶、tragamayth、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如有需要，该口服组合物还包括d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、褐藻酸或其钠盐或者泡腾混合物；和/或e)添加剂，例如，吸收剂、着色剂、调味剂和/或增甜剂。
在本发明的另一实施方式中，该组合物是注射组合物，且可以是水性等渗溶液或悬浮液。
在本发明的另一实施方式中，该组合物是栓剂，且由脂肪乳剂或悬浮液制备。
优选地，所述组合物是无菌的和/或包括佐剂。所述佐剂可以是防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂和/或它们的任意组合。
可选地或额外地，所述组合物可进一步包括其他治疗上有价值的针对不同应用的物质，例如，增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和/或防腐剂。
在本发明的实施方式中，所述组合物可以是适用于透皮给药的剂型。该剂型包括有效量的本发明的化合物和载体。优选地，所述载体可包括帮助穿透宿主皮肤的可吸收的药学上可接受的溶剂。也可以采用含有所述剂型的透皮装置。该透皮装置可以是绷带形式，其包括背衬层；含有所述化合物和任选载体的贮库；任选地可在一段延长的时间内以控制的和预定的速度将所述化合物传递至宿主皮肤的控速屏障；以及将装置固定于皮肤的工具。此外，也可以采用骨架透皮剂型。
在本发明的另一实施方式中，所述组合物可以是适用于局部(例如，皮肤和眼睛)给药的剂型，且可以是本领域熟知的水溶液、软膏剂、乳剂或凝胶剂。
另一方面，本发明提供一种抑制从细胞分泌WNT的方法。
在一种实施方式中，细胞包含在哺乳动物体内，且给药量是治疗有效量。在另一实施方式中，WNT信号传导的抑制进一步导致细胞生长的抑制。在进一步的实施方式中，所述细胞是癌细胞。在又一实施方式中，所述细胞是纤维化细胞。
细胞增殖采用本领域技术人员已知的方法测量。例如，一种测量细胞增殖的简便方法是购自Promega(Madison,WI)的CellTiter-GloTM分析方法。该分析方法的步骤包括将
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试剂加至多孔培养板上培养的细胞中。由光度计或成像装置测量的发光信号与存在的ATP的量成比例，ATP与培养基中存在的活细胞的数目直接成比例。此外，细胞增殖也可以采用本领域已知的集落形成分析测量。
本发明还提供采用本发明的化合物治疗与WNT信号传导通路有关的癌症或纤维化的方法。本领域技术人员通过采用本领域已知的几种技术中的一种对癌细胞进行分析就很容易确定癌症是否与Wnt通路相关。例如，本领域技术人员可以利用免疫和核酸检测方法在Wnt信号传导中所涉及的蛋白质或mRNA水平上检测癌细胞畸变。
Wnt通路相关的癌症或纤维化包括Wnt信号传导通路中的一种或多种组分的活性相对于基准水平被上调的那些癌症或纤维化。在一种实施方式中，抑制Wnt通路可包括抑制Wnt分泌。在另一实施例中，抑制Wnt通路可包括抑制细胞表面受体的下游组分。在另一实施方式中，抑制WNT分泌可包括抑制功能性WNT分泌所涉及的任何蛋白质的活性。
而且，本发明提供一种通过将治疗有效量的WNT抑制剂给药于受治者来治疗患有疾病的受治者的WNT通路紊乱的方法。在一种实施方式中，所述疾病是与异常的(例如，上升的)WNT信号传导活性相关的细胞增殖紊乱。在另一实施方式中，所述疾病由WNT蛋白的量的增加引起。在又一实施方式中，所述细胞增殖紊乱是癌症，所述癌症包括但不限于：肺癌(肺小细胞癌和肺非小细胞癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞癌、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。在再一实施方式中，所述细胞增殖紊乱是纤维化，所述纤维化包括但不限于肺纤维化(例如，特发性肺纤维化和辐射诱导的纤维化)，肾脏纤维化和肝纤维化(包括肝硬化)。在另一实施方式中，所述疾病是指骨关节炎、帕金森病、视网膜病变、黄斑变性。
对于治疗应用而言，本发明的化合物可以通过本领域已知的任何可接受的方式以治疗有效量单独给药。本文中使用的治疗有效量可以随着疾病的严重程度、受治者的年龄和相对健康状况、所使用的化合物的效力以及其他因素发生很大的变化。总体而言，在约0.03mg/kg受治者体重～2.5mg/kg受治者体重的每日剂量条件下显示出获得全身性满意结果。在一种实施方式中，针对大型哺乳动物(例如，人类)的规定日剂量为约0.5mg～约100mg。优选地，所述化合物以一天最多分成4次的形式给药或以缓释形式给药。在另一实施方式中，用于口服给药的合适的单位剂型包括ca.1～100mg活性成分。
可选地，本发明的化合物可作为活性成分以治疗有效量与一种或多种治疗剂联合(例如，药物组合)给药。当本发明的化合物和本领域已知的化疗剂一起使用时，它们可产生协同效应。共给药的化合物的剂量可基于所采用的共同药物的类型、所采用的具体药物、治疗情况等等而发生改变。
本发明的化合物或其组合物可以任何常规途径给药。在一种实施方式中，本发明的化合物或其组合物肠道给药，例如口服给药，并且以片剂或胶囊的形式给药。在另一实施方式中，本发明的化合物或其组合物肠胃外给药并且以可注射溶液或悬浮液的形式给药。在再一实施方式中，本发明的化合物或其组合物局部给药并且以乳液、凝胶、软膏或霜剂的形式给药，或以鼻喷剂或栓剂形式给药。
另一方面，本发明还提供了一种药物组合，优选为试剂盒，包括：a)第一试剂，即本文所公开的本发明的化合物，游离形式或药学上可接受的盐的形式；和b)至少一种共试剂。此外，该试剂盒可包括给药说明。
本发明的组合可以体内使用或体外使用。优选地，所期望的给药治疗效果可以通过使细胞、组织或器官与包括本发明的化合物以及一种或多种试剂的单一组合物或药物制剂接触来实现，或通过使细胞与两种或多种不同的组合物或制剂接触来实现，其中，一种组合物包括一种试剂，另一种组合物包括另一种试剂。组合中的试剂可以同时给药或在一段时间内分开给药。优选地，分开给药能够达到期望的治疗效果。本发明的化合物能够在数分钟至数周的时间间隔范围内，在其他试剂之前给药，与其他试剂同时给药，和/或在其他试剂之后给药。本领域的技术人员通常可确保每次递送的时间间隔，其中分开给药的试剂仍然能够在细胞、组织或器官上发挥有利的联合作用。在一种实施方式中，本发明还涉及作为候补物质的一种试剂以两种、三种、四种或更多形态几乎同时(即，在小于约1分钟之内)接触细胞、组织或器官。在另一实施方式中，一种或多种试剂在约1分钟到14天的时间内给药。
本文中的“抑制”或“治疗(treating或treatment)”是指缓解方法、治疗方法和预防或防治方法，其目的是缓解或预防目标病理疾病或病症。在一个实例中，在给药本发明的化合物之后，癌症患者可表现出肿瘤尺寸减小。“治疗(treating或treatment)”包括：(1)抑制患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病；(2)改善患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病；和/或，(3)使患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病产生任何可测量的降低。本发明的化合物可在一定程度上阻止癌细胞的生长和/或杀死癌细胞，该化合物可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
本文中的“治疗有效量”是指有效“治疗”受治者或哺乳动物体内的疾病的本文提供的化合物的量。在癌症案例中，药物的治疗有效量可减少癌症细胞的数量，降低肿瘤尺寸，抑制癌细胞渗透到周围器官，抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤生长，和/或在一定程度上缓解一个或多个与癌症相关的症状。
与一种或多种其他治疗试剂“联合”给药包括同时(并行)给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合或结合活性成分而获得的产品，且包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者以单个实体的形式或单个剂型同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者作为分开的实体同时、同步或顺序给药于患者而无特定时间限制，其中这种给药方式在患者体内提供治疗有效水平的活性成分。后一种给药方式也适用于鸡尾酒疗法，例如，给药三种或更多的活性成分。
另一方面，本发明提供治疗受治者体内的肿瘤/癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的化合物给药于所述受治者。在一些实施方式中，肿瘤或癌症可处于任何阶段，例如，早期或晚期，例如，I期，II期，III期，IV期或V期肿瘤或癌症。在一些实施方式中，肿瘤或癌症可以是转移的或非转移的。在转移的情况下，本发明的方法可减缓或抑制原发性肿瘤或癌症转移至其他位点，或抑制转移的肿瘤或癌症在远离原发性肿瘤或癌症治疗的其他位点形成或建立。因此，此外，本发明的方法包括1)减缓或抑制可能或已经发生转移的肿瘤细胞或癌细胞(例如，播散性肿瘤细胞，DTC)的生长、增殖、移动或侵入；2)减缓或抑制从原发肿瘤或癌症向不同于原发肿瘤或癌症的一个或多个其他位点、位置或区域的转移的形成或建立；3)在已形成或已建立转移之后减缓或抑制在一个或多个不同于原发肿瘤或癌症的其他位点、位置或区域的转移的生长或增殖；以及4)在已形成或建立转移之后减缓或抑制其他转移的形成或建立。
在一些实施方式中，所述肿瘤或癌症是实体或液体细胞团块。“实体”肿瘤是指通常聚集在一起并形成团块的癌症、瘤或转移。具体的非限定性实例包括乳腺肿瘤/癌、卵巢肿瘤/癌、子宫肿瘤/癌、子宫颈肿瘤/癌、胃肿瘤/癌、肺肿瘤/癌、胃肿瘤/癌、结肠肿瘤/癌、膀胱肿瘤/癌、神经胶质肿瘤/癌和子宫内膜肿瘤/癌，等等。“液体肿瘤”是指瘤形成，其本质上是分散性或弥散性的，因为其通常不形成实体团块。具体实例包括网状内皮组织或造血系统的瘤形成，例如，淋巴瘤，骨髓瘤和白血病。白血病的非限定性实例包括急性和慢性淋巴母细胞白血病，成髓细胞白血病和多发性骨髓瘤。通常，这些疾病起源于分化较差的急性白血病，例如，红白血病和急性巨核细胞性白血病。具体的骨髓疾病包括但不限于：急性早幼粒细胞白血病(APML)，急性粒细胞性白血病(AML)和慢性粒细胞性白血病(CML)。淋巴系统恶性肿瘤包括但不限于：急性淋巴母细胞性白血病(ALL)(其包括B-谱系ALL(B-ALL)和T-谱系ALL(T-ALL))，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，幼淋巴细胞性白血病(PLL)，毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦(Waldenstroem)巨球蛋白白血病(WM)。具体的恶性淋巴瘤包括：非霍奇金氏淋巴瘤和变体，外周T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)，霍奇金氏疾病和Reed-Sternberg疾病。
在一些实施方式中，异常增殖的细胞是癌细胞。
在一些实施方式中，癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。
在一些实施方式中，本发明的方法可与其他治疗或疗法(例如，手术切除术，放疗，离子或化学放射疗法，化疗，免疫疗法，局部或区域热(过热)疗法或免疫)一同实施。这些其他治疗或疗法可在给药本发明的化合物之前，与给药本发明的化合物基本同时(分开或以混合物的形式)，或在给药本发明的化合物之后进行。
在一些实施方式中，本发明的方法包括将治疗有效量的本发明的化合物与其他治疗剂联合给药。在一些实施方式中，其他治疗剂是抗癌剂/抗肿瘤剂。在一些实施方式中，其他治疗剂是抗代谢剂，I型和II型拓扑异构酶的抑制剂，烷基化剂，微管抑制剂，抗雄激素剂，GNRh调节剂或其混合物。在一些实施方式中，其他治疗剂选自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,环磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱,长春碱,噻氨酯哒唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素,长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱,道诺霉素(daunorubicin),放线菌素D,米托蒽醌,吖啶,阿霉素,表柔比星,或去甲氧基柔红霉素。
与一种或多种其他治疗试剂“联合”给药包括同时(并行)给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合或结合活性成分而获得的产品，且包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者以单个实体的形式或单个剂型同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者作为分开的实体同时、并行或顺序给药于患者而无特定时间限制，其中这种给药方式在患者体内提供治疗有效水平的活性成分。后一种给药方式也适用于鸡尾酒疗法，例如，给药三种或更多的活性成分。
在一些实施方式中，本发明提供用于杀伤细胞的化合物。所述化合物以足以杀伤所述细胞的量给药于细胞。在示例性的实施方式中，所述化合物给药于带有所述细胞的受治者。在进一步的示例性的实施方式中，所述给药使得包括所述细胞(例如，所述细胞可以是肿瘤细胞)的肿瘤的生长减慢或停止。对于使生长减慢的给药而言，细胞的生长速率应当比给药之前的生长速率慢至少10％。优选地，生长速率将减慢至少20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或完全停止。
此外，本发明提供用作药物的本发明的化合物或药物组合物。本发明还提供用于杀伤、抑制或延迟肿瘤细胞或癌细胞的增殖或者用于治疗疾病的化合物或药物组合物。
有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括包含治疗有效量的活性成分的组合物，所述治疗有效量即为有效实现期望目的的量。对特定应用有效的实际量将(尤其)取决于治疗中的病症。有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力范围内(尤其是根据本文具体公开的内容)。
对于本文所述的任何化合物而言，治疗有效量可最先通过细胞培养检测法确定。目标血药浓度为能够抑制细胞生长或分裂的活性化合物的浓度。在优选的实施方式中，细胞活性的至少25％被抑制。能够诱导至少约30％、50％、75％或甚至90％或者更高的细胞活性抑制的活性化合物的目标血药浓度为目前优选的。可监测患者体内的细胞活性抑制的百分数，从而评估所达到的血药浓度的适当性，并且可上调或下调剂量以实现期望的抑制百分数。
如本领域已知的，用于人体的治疗有效量还可通过动物模型来确定。例如，用于人体的剂量可被配制成实现已在动物体内发现的有效循环浓度。如上所述，人体内的剂量可通过监测细胞抑制和上调或下调剂量来调节。
治疗有效剂量还可通过已知的表现出类似药理学活性的化合物的人体数据来确定。所使用的剂量可基于与已知化合物比较的所给药的化合物的相对生物利用度和效力来调节。
基于上述方法和本领域熟知的其他方法为实现人体内的最大效力对剂量进行调节恰好在本领域普通技术人员的能力范围内。
在局部给药的情况下，所给药的化合物的全身循环浓度不是特别重要。在这种情况下，给药化合物以达到在局部区域有效实现期望的结果的浓度。
对于用于预防和/或治疗与异常细胞增殖有关的疾病而言，给药的化合物的循环浓度优选地为约0.001μM至20μM，优选地为约0.01μM至5μM。
用于口服给药本文所述的化合物的患者剂量通常为约1mg/天至约10,000mg/天，更加通常而言，约10mg/天至约1,000mg/天，并且最通常而言，约50mg/天至约500mg/天。根据患者体重计算，通常剂量为约0.01至约150mg/kg/天,更加通常而言，约0.1至约15mg/kg/天,并且最通常而言，约1至10mg/kg/天,例如，5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在至少一些实施方式中，减缓或抑制肿瘤生长的患者剂量可以是1μmol/kg/天或更少。例如，患者剂量可以是0.9μmol/kg/天,0.6μmol/kg/天,0.5μmol/kg/天,0.45μmol/kg/天,0.3μmol/kg/天,0.2μmol/kg/天,0.15μmol/kg/天,或0.1μmol/kg/天或更少(是指药物的摩尔数)。优选地，当以每日剂量给药持续至少五天的时间段时，带有药物偶联物的抗体使肿瘤生长减缓。
对于其他给药模式而言，剂量和间隔可单独进行调节以提供对正在治疗的特定临床病症有效的给药的化合物的血药水平。例如，在一种实施方式中，根据本发明的化合物可以相对较高的浓度每天给药多次。可选地，更加理想的是，以最小有效浓度给药本发明的化合物并且使用较低频率的给药方案。这将提供与个体疾病的严重程度相称的治疗方案。
利用本文提供的教导，有效治疗方案可计划为不引起大量的毒性并且完全有效治疗特定患者表现出的临床症状。这种计划应当包括通过考虑诸如化合物效力，相关生物利用度，患者体重，副作用的存在和严重程度，优选的给药模式和所选择的试剂的毒性特征之类的因素谨慎选择活性化合物。
虽然本发明的优选实施方式已在本文显示并进行描述，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。应当理解的是，本文所述的本发明的各种可选实施方式可用于实践本发明。所附的权利要求意在限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方法和等同物也被所附的权利要求涵盖。
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实施例
本发明进一步通过下述实施例举例说明，但不限于此。下述实施例举例说明本发明的化合物的制备方法。
实施例1
CT26鼠类肿瘤同源小鼠模型的体内评估
材料和方法
动物：物种：小家鼠；品种：BALB/c；年龄：6-8周龄(接种时估计)；性别：雌性；体重：18-20g；动物供应商：北京HFK生物技术有限公司(HFK，北京，中国)。
动物饲养：在如下条件下将动物养在单独的通风笼中(每个笼子最多5只小鼠)：
温度：20-26℃
湿度：30-70％
光线循环：12小时光照和12小时黑暗
聚砜IVC笼：尺寸为325mm x 210mm x 180mm
垫底材料：玉米棒
饮食：小鼠饮食，C060辐射杀菌的干燥颗粒食物。在整个研究过程中动物自由获取食物。
水：纯净水(RO水)，使用前高压蒸汽处理。动物自由获取消毒的饮用水。
笼子识别标签：动物数量，性别，品种，收到日期，治疗，研究编号，组编号以及治疗的起始日期，等等
动物识别：在一个耳朵上编码0耳标签标记动物
适应环境：使动物适应饲养设施至少7天。
肿瘤接种：在移植之前采用异氟烷轻微麻醉所有动物，并且随后在每个小鼠的右下侧皮下植入0.1ml PBS中的CT-26肿瘤细胞(3x10-4个)，用于肿瘤发育。在接种时开始CGX1321的治疗。在接种后5天或当平均肿瘤尺寸达到约50mm3(无论哪个先达到)时开始抗-PD-1的治疗。分组的日期表示为分组后第0天(PG-D0)。
评估CGX1321与PD-1抗体联合的疗效
产物识别：PD-1抗体(克隆RMP1-14，BioXCell，批号：5311-2/1214)。
主要端点是看肿瘤生长是否延缓或衰退。采用卡尺每周测量两次肿瘤，肿瘤体积根据如下公式估算：TV＝a x b2/2，其中，a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。
肿瘤生长抑制(TGI)：TGI％是抗肿瘤有效性的指标并且表达为TGI(％)＝100x(1-T/C)。T和C分别为在指定天治疗组和对照组的平均肿瘤体积(或重量)。
接种肿瘤细胞之后，每天检查动物的发病率和死亡率。在进行常规监测时，检查肿瘤生长和治疗对动物的正常行为的任何作用，例如，移动性，视觉估计对食物和水的消耗，体重增加/减少(每周测量两次体重)，眼睛/毛发缠结和任何其他异常效果。每个动物的死亡和观察到的临床指症详细记录在数据页的备注中。
流式细胞分析：在治疗结束时，分离来自脾脏和肿瘤的淋巴细胞并进行抗体标记处理。采用CD3，CD4，CD8HE FOXP3的小鼠抗体对细胞进行染色。

Claims (28)

1.包含如下成分的组合：
(i)治疗有效量的Porcup拮抗剂，和
(ii)治疗有效量的PD-L/PD-1轴拮抗剂。
2.如权利要求1所述的组合，其中，所述Porcup拮抗剂包括通式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐：
Figure FDA0003887395360000011
其中：
X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，
Figure FDA0003887395360000012
芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，
Figure FDA0003887395360000013
芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，–S(O)2R5,–C(O)OR5,–C(O)R5,–C(O)NR6R7,C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
3.如权利要求2所述的组合，其中，所述5元或6元杂芳基选自：
Figure FDA0003887395360000021
其中，
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，–S(O)2R5,–C(O)OR5,–C(O)R5,–C(O)NR6R7,C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；以及
R8是氢或C1-6烷基。
4.如权利要求2或3所述的组合，其中，R1和R2被1个或2个R4基团独立地取代。
5.如权利要求2至4中任一项所述的组合，其中，所述化合物选自如下化合物或其生理学上可接受的盐：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2'-氟-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2,7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2,7-萘啶-3-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2'-氟-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2,7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉-1,1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1,6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1,6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4,3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1,3,4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2,7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2,7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶-1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-2,7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2,7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2'-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺；
2'-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2,4'-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2,7-萘啶-1-胺。
6.如权利要求1所述的组合，其中，所述Porcupine拮抗剂包括通式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
Figure FDA0003887395360000071
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
7.如权利要求6所述的组合，其中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2,3'-联吡啶-6'-基)-2-(2',3-二甲基-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-甲基-3-(三氟甲基)-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2'-氟-3-甲基-2,4'-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
8.如权利要求6所述的组合，其中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合，其中，所述PD-L/PD-1轴拮抗剂选自：PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
10.如权利要求9所述的组合，其中，所述PD-L/PD-1轴拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。
11.如权利要求10所述的组合，其中，所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合搭档的结合。
12.如权利要求10所述的组合，其中，所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。
13.如权利要求10所述的组合，其中，所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。
14.如权利要求10所述的组合，其中，所述PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和PD-L2这两者的结合。
15.如权利要求9所述的组合，其中，所述PD-1结合拮抗剂是抗体。
16.如权利要求15所述的组合，其中，所述PD-1结合拮抗剂是MDX-1106，Merck 3745，CT-011，AMP-224或AMP-514。
17.如权利要求9所述的组合，其中，所述PD-L/PD-1轴拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
18.如权利要求17所述的组合，其中，所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。
19.如权利要求17所述组合，其中，所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。
20.如权利要求17所述的组合，其中，所述PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和B7-1这两者的结合。
21.如权利要求17所述组合，其中，所述PD-L1结合拮抗剂是抗体。
22.如权利要求18所述的组合，其中，所述PD-L1结合拮抗剂选自：YW243.55.S70,MPDL3280A,MDX-1105,MEDI-4736,和MSB0010718C。
23.如权利要求22所述的组合，其中，所述PD-L/PD-1轴拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。
24.如权利要求23所述的组合，其中，所述PD-L2结合拮抗剂是抗体。
25.如权利要求23所述的组合，其中，所述PD-L2结合拮抗剂是免疫粘合素。
26.一种用于治疗或延缓个体的癌症恶化的方法，所述方法包括将权利要求1至25中任一项所述的组合给药于所述个体。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、肠癌、胆管癌、胰腺癌、子宫内膜癌或前列腺癌。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。
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