CN110290808B - 1-(4-氨基-5-溴-6-(1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1h-吡唑-4-醇及其在治疗癌症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及5‑溴‑2，6‑二(1H‑吡唑‑1‑基)并嘧啶‑4‑胺的活性代谢物，该活性代谢物调节腺苷A2a受体的活性。特别地，本发明涉及包含1‑(4‑氨基‑5‑溴‑6‑(1H‑吡唑‑1‑基)‑嘧啶‑2‑基)‑1H‑吡唑‑4‑醇的药物组合物、和1‑(4‑氨基‑5‑溴‑6‑(1H‑吡唑‑1‑基)‑嘧啶‑2‑基)‑1H‑吡唑‑4‑醇的制备方法，以及单独的或与一种或多种免疫治疗剂组合的1‑(4‑氨基‑5‑溴‑6‑(1H‑吡唑‑1‑基)‑嘧啶‑2‑基)‑1H‑吡唑‑4‑醇在癌症治疗中的用途。

Description

1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4- 醇及其在治疗癌症中的用途
技术领域
本发明涉及5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶(pyrimindin)-4-胺的活性代谢物，即1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇，该活性代谢物调节腺苷A2a受体。特别地，本发明涉及包含1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的药物组合物、以及1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的制备方法，以及1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇在癌症治疗中的用途。
背景技术
癌症是全世界范围内的主要公共健康问题。它目前是美国和一些发达国家的第二大死亡原因，并且预计在未来几年内将超过心脏病成为死亡的首要原因(Siegel R L等人，Cancer Statistics[癌症统计学]，2015，CA Cancer J Clin[CA：临床医师癌症杂志]2015；65：5-29.VC 2015 American Cancer Society[美国癌症学会]，以及其中的参考文献)。
癌症被认为是由癌细胞内在过程和细胞外在过程二者决定的复杂疾病。在多种体外和动物模型(包括，例如，肺转移、人肺腺癌细胞、鼠黑色素瘤细胞、鼠卵巢癌细胞、鼠乳腺癌细胞)中进行的若干项研究已经证实靶向腺苷能系统对于研发不同治疗具有巨大的潜力。许多条证据强调了腺苷作为在肿瘤性微环境中积累的关键调节性自分泌和旁分泌因子的重要性。细胞外腺苷(通常以高浓度存在于癌组织中)是改变癌症中免疫细胞功能的关键介质。这可能是因为严格调节的免疫细胞腺苷受体途径在肿瘤中发生实质性改变，从而将这些细胞的功能从免疫监视和宿主防御转变为促进癌细胞转化和生长(Antonioli L等人，Immunity，inflammation and cancer：a leading role for adenosine[免疫、炎症和癌症：腺苷的主要作用]，Nature[自然]，842，2013年12月，第13卷，及其参考文献)。
众所周知的是，肿瘤使用大量免疫抑制机制来促进肿瘤生长(Koebel CM.等人，Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state[适应性免疫使隐匿性癌症处于平衡状态]，Nature[自然].2007，450，7171：903-907，和Schreiber RD.等人，Cancer immunoediting：Integrating immunity’s roles in cancer suppressionand promotion[癌症免疫编辑：整合免疫在癌症抑制和促进中的作用]，Science[科学].2011，331，6024：1565-1570)。有研究表明，这样一种机制是由细胞外AMP分解代谢为免疫抑制性腺苷所介导的(Ohta A.等人，A2A adenosine receptor protects tumors fromantitumor T cells[A2A腺苷受体保护肿瘤免受抗肿瘤T细胞的侵害].Proc Natl AcadSci U S A.[美国国家科学院院刊]2006；103：13132-13137，和Ohta A.等人，A2Aadenosine receptor may allow expansion of T cells lacking effector functionsin extracellular adenosine-rich microenvironments[A2A腺苷受体可允许在富含细胞外腺苷的微环境中扩增缺乏效应功能的T细胞].J Immunol.[免疫学杂志]2009，183，9：5487-5493)。首先，细胞外ATP将被胞外酶CD39转化为AMP。AMP通过CD73胞外酶进一步去磷酸化将导致细胞外腺苷产生。
在此过程期间，腺苷激酶的活性也受到抑制，这导致该酶的补救活性受到抑制和腺苷水平增加。例如，在炎症期间或肿瘤微环境内的低氧条件下，腺苷激酶的抑制导致细胞外腺苷水平和细胞内腺苷水平都增加15-20倍(Decking UK.等人，Hypoxia-inducedinhibition of adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release.[缺氧诱导的腺苷激酶抑制增强心脏腺苷释放]Circ.Res.[循环研究]1997；81(2)：154-164.doi：10.1161/01.RES.81.2.154)。所产生的细胞外腺苷与在多种免疫子集(包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突细胞和髓源性抑制细胞(MDSC))上表达的四种已知的细胞表面受体(A1、A2A、A2B和A3)结合。A2A和A2B受体亚型主要负责腺苷的免疫抑制作用。它们共享共同的信号传导途径，二者都导致腺苷酸环化酶的活化和细胞内cAMP的积累。已经进一步提供了若干证据，证明细胞内cAMP是在T细胞受体触发的T细胞活化途径的早期和晚期抑制T细胞受体信号传导的信号传导分子(Ohta A，Sitkovsky M，Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation andprotection from tissue damage[G蛋白偶联腺苷受体在下调炎症和保护免受组织损伤中的作用]，Nature[自然]，2001，414：916-920)。
已经提出，基因消除A2a受体或使用A2a受体拮抗剂抑制A2a受体信号传导防止了抗肿瘤T细胞的抑制并改善了肿瘤排斥(Ohta A.等人，A2a adenosine receptor protectstumors from antitumor T cells.[A2a腺苷受体保护肿瘤免受抗肿瘤T细胞的侵害]ProcNatl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2006；103：13132-13137)。
A2a受体作为活化的T细胞的非冗余负调节物起作用，以保护正常组织免受过度的侧支炎性损伤的侵害。已经提出了A2a受体也可能“错误地(misguidedly)”保护癌组织。有人认为，如果确实如此，则A2a受体的遗传失活或药理学拮抗作用将阻止抗肿瘤T细胞的抑制，并从而通过这些去抑制的T细胞来改善肿瘤排斥(Sitkovsky M.等人，Adenosine A2areceptor antagonists：blockade of adenosinergic effects and T regulatory cells[腺苷A2a受体拮抗剂：阻断腺苷能作用和T调节性细胞]，British Journal ofPharmacology[英国药理学杂志]，2008，153，S457-S464)。
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，并且自1985年以来，无论是在发病率还是死亡率方面，肺癌一直是全世界范围内最常见的癌症。在全球范围内，肺癌是新增癌症诊断(占新增癌症病例总数的12.4％)和癌症死亡(占癌症死亡总数的17.6％)的最大贡献者。
肺癌起源于呼吸道上皮细胞，并且可分为两大类。小细胞肺癌(SCLC)是一种高度恶性的肿瘤，衍生自具有神经内分泌特征的细胞，并且占肺癌病例的15％。非小细胞肺癌(NSCLC)(占其余85％的病例)进一步分为3种主要病理亚型：腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。腺癌本身占所有肺癌病例的38.5％，其中鳞状细胞癌占20％，以及大细胞癌占2.9％。在过去的几十年中，腺癌的发病率大幅增加，并且腺癌已经取代鳞状细胞癌成为最常见的NSCLC类型(De la Cruz，C等人，Lung Cancer：Epidemiology，Etiology，and Prevention[肺癌：流行病学、病因学和预防]，Clin Chest Med.[临床胸腔医学]2011年12月；32(4))。
特别地，在NSCLC的情况下，疾病阶段决定了治疗(包括手术、放射、基于铂的双联化学疗法、以及最近的通过中断负责细胞增殖和存活的信号传导途径进行的靶向疗法)。早期阶段的疾病受益于全身性化学疗法(铂双联、紫杉烷、吉西他滨、培美曲塞)(Azzoli CG.等人，2011Focused Update of 2009 American Society of Clinical OncologyClinical Practice Guideline Update on Chemotherapy for Stage IV Non-Small-Cell Lung Cancer[2011年重点更新的2009年美国临床肿瘤学会临床实践指南更新IV期非小细胞肺癌的化学疗法]，J Oncol Pract.[肿瘤学实践杂志]2012；8：63-6doi：10.1200/JOP.2011.000374)，该疗法产生一定的疗效，因此多模式治疗策略已成为NSCLC患者的重要治疗选择。在一些研究中，两种或更多种药物组合被证明具有优异的疗效，但代价是毒性增加(Yoshida T.等人，Comparison of adverse events and efficacy between gefitiniband erlotinib in patients with non-small-cell lung cancer：a retrospectiveanalysis[患有非小细胞肺癌患者中吉非替尼与厄洛替尼的不良事件及疗效比较：回顾性分析]，Med Oncol.[医学肿瘤学]2013；30：349)。
最近，正在开发若干种方法来增强T细胞的抗癌响应并恢复其检测和攻击癌细胞的能力，其中已经开发出阻断细胞毒性淋巴细胞相关的抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)介导的T细胞事件的mAb。
伊匹单抗(ipilimumab)(一种对抗CTLA4的完全人mAb)在患有SQCLC的患者中已显示出更大临床益处的趋势(Lynch TJ.等人，Ipilimumab in combination withpaclitaxel and carboplatin as first-line treatment in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer：Results from a randomized，double-blind，multicenterphase II study[伊匹单抗与紫杉醇和卡铂组合作为IIIB/IV期非小细胞肺癌的一线治疗：来自随机、双盲、多中心II期研究的结果]，J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]2012；30：2046-54)。PD-1mAb(MEDI4735、BMS-936558、BMS-936559)在重度预治疗的晚期NSCLC患者中已证实了显著的持续肿瘤消退(Brahmer JR.等人，Safety and activity of anti-PD-L1antibody in patients with advanced cancer[抗PD-L1抗体在晚期癌症患者中的安全性和活性]，N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2012；366：2455-65)。
有研究显示引起细胞外肿瘤微环境变化的改变。此类细胞外改变之一是腺苷浓度增加，其损害T细胞介导的排斥并支持血管生成。该研究显示大量表达腺苷A2a受体的肺腺癌，这支持了腺苷A2a受体拮抗剂作为抗癌疗法的测试(Mediavilla-Varela，M等人，Antagonism of adenosine A2a receptor expressed by lung adenocarcinoma tumorcells and cancer associated fibroblasts inhibits their growth[肺腺癌肿瘤细胞和癌相关成纤维细胞表达的腺苷A2a受体的拮抗作用抑制其生长]，Cancer Biology&Therapy[癌症生物学与疗法]，2013年9月，14：9，860-868)。
尽管开发了新的治疗方法，但NSCLC的5年生存率仍然只有14％，这意味着需要继续研究新型治疗(Spira A.等人，Multidisciplinary management of lung cancer[肺癌的多学科管理]，N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2004；350：379-92doi：10.1056/NEJMra035536)。
WO 2011/121418(其相关披露内容通过引用并入本文)披露了一系列作为腺苷A2a受体拮抗剂的氨基嘧啶衍生物，用于在治疗神经变性疾病(如帕金森病)中使用。此外，后来研究了WO 2011/121418中所述的化合物在治疗癌症中的有效性。该类中的特定化合物是5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺，已发现该化合物在治疗癌症方面是有效的。5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的结构如下所示：
Figure BDA0002165858370000061
PCT/IB2016/054834披露了这种化合物(单独或与一种或多种免疫治疗剂组合)用于治疗癌症的用途。
发明内容
本发明涉及5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的活性代谢物(即1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇)或其药学上可接受的盐。本发明进一步提供了处于基本上分离的形式的上述化合物。本发明进一步提供了组合物，这些组合物包含1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的载体。
本发明进一步提供了抑制腺苷A2a受体的方法，该方法包括给予1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐。
本发明进一步提供了治疗需要这种治疗的受试者的癌症的方法，该方法包括给予(单独或与一种或多种免疫治疗剂组合的)1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐。
附图说明
图1展示了水性标准品中的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(MH+：308)的XIC色谱图、Q1和MS/MS谱。
图2展示了人肝微粒体(120分钟)中的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(MH+：308)的XIC色谱图、Q1和MS/MS谱。
图3展示了人肝微粒体(120分钟)中的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的单加氧化产物(MH+：324)的XIC色谱图、Q1和MS/MS谱。
图4展示了人肝微粒体(120分钟)中的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(1uM；MH+：308)及其单加氧化产物：1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇(1uM；MH+：324)和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇(1uM；MH+：324)以及1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的鉴定(MH+：324)的水性标准品的Q1谱。
本发明的披露内容
因此，本发明在实施例1中涉及以下化合物：1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇：
Figure BDA0002165858370000071
该化合物由动物、人和/或体外细胞测定中5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的代谢形成。
在实施例2中，本发明涉及1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐的分离的形式。
在实施例3中，本发明是药物组合物，该药物组合物包含1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
在实施例4中，本发明是组合，特别是药物组合，该药物组合包含治疗有效量的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐、以及一种或多种免疫治疗剂。
在实施例5中，本发明是治疗需要这种治疗的受试者的癌症的方法，该方法包括：向有需要的受试者给予治疗有效量的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐；单独或与一种或多种免疫治疗剂组合给予。
在实施例6中，本发明涉及1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐；单独或与一种或多种免疫治疗剂组合，用于治疗癌症的用途。
在实施例7中，本发明涉及根据实施例2所述的化合物1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇、或根据实施例3所述的药物组合物，用于在癌症治疗中使用。
在实施例8中，本发明涉及1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇以及一种或多种免疫治疗剂的组合，用于在癌症治疗中使用。
在实施例9中，本发明是抑制受试者的腺苷A2a受体的方法，其中该方法包括向该受试者给予治疗有效量的根据实施例2所述的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇；或向受试者给予根据实施例3所述的药物组合物。
在实施例10中，本发明涉及根据实施例5所述的方法、根据实施例6所述的用途、或根据实施例7所述的用于使用的化合物、或根据实施例8所述的用于使用的组合，其中该癌症选自肺癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、肛门癌、胃食管癌、甲状腺癌、宫颈癌、淋巴细胞增生性疾病或血液学癌症、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、或白血病。
在实施例11中，本发明涉及根据实施例5所述的方法、根据实施例6所述的用途、或根据实施例7所述的用于使用的化合物、或根据实施例8所述的用于使用的组合，其中该癌症是癌(carcinoma)，特别是肺癌，并且更特别是非小细胞肺癌。
在实施例12中，本发明涉及根据实施例5、10或11所述的方法，根据实施例6、10或11所述的用途，或根据实施例9、10或11所述的用于使用的组合，其中一种或多种免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
在实施例13中，本发明涉及根据实施例5、10或11所述的方法，根据实施例6、10或11所述的用途，或根据实施例9、10或11所述的用于使用的组合，其中该免疫治疗剂选自由以下组成的组：伊匹单抗、曲美利木单抗、纳武单抗、帕姆单抗、匹地利珠单抗(CT-011)、AMP-224、AMP-514(MEDI0680-英商梅迪缪思有限公司(Medimmune))、MPDL3280A(基因泰克罗氏公司(Genentech Roche))、MEDI4736、MSB0010718C(默克雪兰诺公司(MerckSerono))、YW243.55.S70和MDX-1105。
在实施例14中，本发明涉及根据实施例5、10或11所述的方法，根据实施例6、10或11所述的用途，或根据实施例9、10或11所述的用于使用的组合，其中该免疫治疗剂是抗PD-1抗体。
在实施例14A中，本发明涉及根据实施例5、10或11所述的方法，根据实施例6、10或11所述的用途，或根据实施例9、10或11所述的用于使用的组合，其中该免疫治疗剂是抗PD-1抗体，该抗体选自Nivulomab、帕姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680(AMP514，英商梅迪缪思有限公司)、AMP224(英商梅迪缪思有限公司)，以及描述于US 2015/0210769中的抗体。
在实施例15中，本发明涉及根据实施例14所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-1抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列、SEQID NO：5的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：15的VLCDR3氨基酸序列；
(b)VH，该VH包含SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：12的VLCDR3氨基酸序列；
(c)VH，该VH包含SEQ ID NO：41的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：15的VLCDR3氨基酸序列；或
(d)VH，该VH包含SEQ ID NO：41的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：12的VLCDR3氨基酸序列。
在实施例16中，本发明涉及根据实施例14所述的方法、用途或用于使用的组合，其中该抗PD-1包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，该VL包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在实施例17中，本发明涉及根据实施例14所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-1抗体包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在实施例18中，本发明涉及根据实施例14所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-1抗体包含VH和VL，该VH包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，该VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在实施例19中，本发明涉及根据实施例14所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-1抗体包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
在实施例20中，本发明涉及根据实施例14-19中任一项所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中将该抗PD-1抗体分子以约300mg的剂量给予，每三周一次。
在实施例21中，本发明涉及根据实施例14-19中任一项所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中将该抗PD-1抗体分子以约400mg的剂量给予，每四周一次。
在实施例22中，本发明涉及根据实施例5、10或11所述的方法，根据实施例6、10或11所述的用途，或根据实施例9、10或11所述的用于使用的组合，其中该免疫治疗剂是抗PD-L1抗体。
在实施例22A中，本发明涉及根据实施例22所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-L1抗体分子选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105和描述于US 2016/0108123中的抗PD-L1抗体。
在实施例23中，本发明涉及根据实施例22所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-L1抗体分子包含：
(a)重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQ ID NO：47的VHCDR1氨基酸序列、SEQID NO：48的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQ ID NO：52的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：53的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：54的VLCDR3氨基酸序列；
(b)VH，该VH包含SEQ ID NO：44的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：45的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：49的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：50的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：51的VLCDR3氨基酸序列；
(c)VH，该VH包含SEQ ID NO：63的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：48的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：52的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：53的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：54的VLCDR3氨基酸序列；或
(d)VH，该VH包含SEQ ID NO：63的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：45的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：49的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：50的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：51的VLCDR3氨基酸序列。
在实施例24中，本发明涉及根据实施例22所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中该抗PD-L1抗体分子包含重链可变结构域和轻链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
在实施例25中，本发明涉及根据实施例12-24中任一项所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中将免疫治疗剂以单一组合物一起给予、或以两种或更多种不同的组合物形式分开给予。
在实施例26中，本发明涉及根据实施例12-24中任一项所述的方法、用途、或用于使用的组合，其中将该免疫治疗剂与该化合物：-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇并行、在其之前或之后给予。
在实施例27中，本发明是一种制造根据实例1所述的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的方法。
定义：
如本文件中所用，术语癌症用于表示一组涉及异常细胞生长的疾病，有侵入或扩散到身体的其他部位的潜力。根据与肿瘤细胞类似并且因此被假定为肿瘤起源的细胞的类型对癌症进行分类。这些类型包括癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。
如本文件中所用，术语癌用于表示衍生自上皮细胞的癌症。该组包括许多最常见的癌症(特别是在老年人中)，并且包括几乎所有在乳腺、前列腺、肺、胰腺和结肠中发展的那些癌症。
例如，术语“癌症”包括但不限实体瘤、血液学癌症(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤))和转移性病灶。在一个实施例中，癌症是实体瘤。实体瘤的实例包括恶性肿瘤，例如肉瘤和癌，例如多种器官系统的腺癌，如影响肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠(例如，结肠)、肛门、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如，脑细胞、神经细胞或神经胶质细胞)、头颈部、皮肤(例如，黑色素瘤)和胰腺的那些腺癌，以及包括恶性肿瘤的腺癌，例如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。癌症可以处于早期、中期、晚期或可以是转移性癌症。
在一个实施例中，癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)(例如，具有鳞状组织学和/或非鳞状组织学的NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑色素瘤(例如，晚期黑色素瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、肝癌、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如，不表达雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu中的一者、二者或全部的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肛门癌、胃食管癌、甲状腺癌、宫颈癌、淋巴细胞增生性疾病(例如，移植后淋巴增生性疾病)或血液学癌症、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病(例如，骨髓性白血病或淋巴性白血病)。
在另一个实施例中，癌症可以是例如，本文所述的癌症，例如肺癌(鳞状)、肺癌(腺癌)、头颈癌、宫颈癌(鳞状)、胃癌、甲状腺癌、黑色素瘤、鼻咽癌(例如，分化的或未分化的转移性或局部复发的鼻咽癌)或乳腺癌。
在另一个实施例中，癌症选自癌(例如，晚期或转移性癌)、黑色素瘤或肺癌(例如，非小细胞肺癌)。
在一个实施例中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
如本文件中所用，术语肺癌(lung cancer)(也称为肺部癌(carcinoma of thelung)或肺癌(pulmonary carcinoma))用于表示恶性肺肿瘤，其特征在于肺组织中不受控制的细胞生长。
如本文件中所用，术语非小细胞肺癌(NSCLC)用于表示除小细胞肺癌(SCLC)之外的任何类型的肺癌。
如本文件中所用，术语免疫治疗性治疗是指被特指用于引发免疫介导的肿瘤细胞破坏的广泛类别的疗法。在所述疗法中使用免疫治疗剂。
如本文件中所用，术语免疫治疗剂是指用于进行癌症的免疫治疗性治疗的化合物，例如选自由以下组成的组的药剂：抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗和曲美利木单抗)、抗PD-1抗体(例如MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224或如WO 2015/112900所述的抗PD-1抗体分子)；和抗PD-L1抗体(例如MEDI4736、MDX-1105或US 2016/0108123中所述的抗PD-L1抗体)。
如本文所用，术语“程序性死亡1”或“PD-1”包括同种型，哺乳动物例如人PD-1，人PD-1的物种同源物，和包含至少一个与PD-1的共同表位的类似物。PD-1(例如人PD-1)的氨基酸序列是本领域已知的，例如Shinohara T等人(1994)Genomics[基因组学]23(3)：704-6；Finger LR等人Gene[基因](1997)197(1-2)：177-87。
如本文所用，术语“程序性死亡配体1”或“PD-L1”包括同种型，哺乳动物例如人PD-L1，人PD-1的物种同源物，和包含至少一个与PD-L1的共同表位的类似物。PD-L1(例如人PD-1)的氨基酸序列是本领域已知的，例如Dong等人(1999)Nat Med.[自然医学]5(12)：1365-9；Freeman等人(2000)J Exp Med.[实验医学杂志]192(7)：1027-34)。
“分离的形式”意指化合物在体内代谢形成时不含任何通常伴随该化合物的组分。例如，它不含任何生物学物质，例如血清组分，以及在体内形成的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的其他代谢物。合适地，该化合物是纯化的和分离的形式。“纯化的”意指化合物是有利地大于75％纯的、更有利地大于90％纯的、并且优选地大于95％纯的、并且最优选大于98％纯的。
如本文所用，术语“组合”是指一种剂量单位形式的固定组合，或组合给予，其中具有式I的化合物和组合配偶体(即免疫治疗剂)可以在同一时间独立地给予或在时间间隔内分开地给予，尤其是在这些时间间隔允许组合配偶体显示协作，例如协同效应的情况下。单个组分可以包装在一个试剂盒中或分开包装。可在给予之前将一种或两种组分(例如粉末或液体)重构或稀释至所希望的剂量。
如本文所使用的术语“共同给予”或“组合给予”等意在涵盖将所选择的组合配偶体给予给有需要的单个受试者(例如患者)，并且旨在包括其中药剂不一定通过相同的给予途径给予或同时给予的治疗方案。
如本文所用，术语“药物组合”和“组合产物”可互换地使用，并且是指在一个剂量单位形式中的固定组合或用于组合给予的非固定组合或试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以在同一时间独立地给予或在时间间隔内分开地给予，特别是在这些时间间隔允许组合配偶体显示协作，例如协同效应的情况下。术语“固定组合”意指具有式I的化合物和组合配偶体(即免疫治疗剂)，以单一实体或剂量的形式同时地给予至患者。术语“非固定组合”意指具有式I的化合物和组合配偶体(即免疫治疗剂)，作为分开的实体同时地、并行地或顺序地给予至患者(没有特定的时间限制)，其中这种给予在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或更多种治疗剂的给予。在优选的实施例中，药物组合是非固定组合。
术语“组合疗法”是指给予两种或更多种治疗剂以治疗如本披露内容所述的癌症。这种给予涵盖以基本上同时的方式共同给予这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊给予。可替代地，这种给予涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，片剂、胶囊、粉末、和液体)中共同给予。可以将粉末和/或液体在给予之前重构或稀释到所希望的剂量。此外，这种给予也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明的化合物的生物有效性和特性，并且不是生物学上或其他方面不希望的盐。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐，例如，乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸酯、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐，葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸化物/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸酯、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸酯和三氟乙酸盐。可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。可以衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。可以衍生出盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝；特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺(包括天然存在的取代的胺)，环胺，和碱性离子交换树脂，特别是例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由母体化合物(碱性或酸性部分)合成。通常，此类盐可以通过将这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等)反应来制备，或通过将这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应来制备。此类反应典型地在水或有机溶剂中或在二者的混合物中进行。通常，非水性介质像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、或乙腈(在可行的情况下)是优选的。另外的合适的盐的列表可见于例如：“Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]”，第20版，Mack Publishing Company[马克出版公司]，Easton[伊斯顿]，Pa.[宾夕法尼亚州]，(1985)中以及Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use[药用盐手册：特性、选择和使用]”(Wiley-VCH[威利-VCH出版社]，Weinheim[韦因海姆]，德国，2002)中。
本发明包括本发明的所有药学上可接受的同位素标记的化合物，即第一至第七十实施例的化合物，其中(1)一个或多个原子被如下原子取代，该原子具有相同原子序数但与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数，和/或(2)一个或多个原子的同位素比率与天然存在的比率不同。
适合包含在本发明的化合物中的同位素的实例包括氢的同位素(例如2H和3H)、碳的同位素(例如11C、13C和14C)、氯的同位素(例如36Cl)、氟的同位素(例如18F)、碘的同位素(例如123I和125I)、氮的同位素(例如13N和15N)、氧的同位素(例如15O、17O和18O)、磷的同位素(例如32p)、以及硫的同位素(例如35S)。
第一至第七十实施例的某些同位素标记的化合物(例如掺入放射性同位素的那些)可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)鉴于其易于掺入和容易检测而特别适用于此目的。
用较重的同位素(例如氘，即2H)取代可以提供由更高的代谢稳定性带来的某些治疗优点(例如，体内半衰期延长或剂量需求减少)，并且因此在某些情况下可能是优选的。在第一至第七十实施例的某些化合物中，残基R9、或由R8和R9的组合形成的环可包含一个或多个氘原子以改善化合物在体内的代谢稳定性。
用正电子发射同位素(例如11C、18F、15O和13N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查底物受体占有率。
同位素标记的第一至第七十个实施例的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实例和制备中所述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替未标记的先前使用的试剂来制备。
根据本发明的药学上可接受的溶剂化物包括其中结晶溶剂可以被同位素取代的那些，例如，D2O、d6-丙酮、d6-DMSO。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿氏药物科学]，第18版，Mack Printing Company[马克出版公司]，1990，第1289-1329页)。除了与活性成分不相容的常规载体外，其他常规载体均可以用于治疗或药物组合物中。
术语“治疗有效量”的本发明的化合物是指将引起受试者的生物或医学响应(例如，酶或蛋白活性的减小或抑制，或改善症状、缓解病症、减缓或延迟疾病进展或预防疾病等)的本发明的化合物的量。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的如下量，当给予至受试者时，该量有效地(1)至少部分缓解、抑制、预防和/或改善(i)由其腺苷A2a受体介导的，或(ii)与腺苷或腺苷A2a受体的活性相关的，或(iii)以腺苷A2a受体的异常活性为特征的病症、或障碍或疾病；或(2)降低或抑制其腺苷A2a受体的活性。在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指具有式I的化合物的如下量，当给予至细胞、或组织、或非细胞生物材料或介质时，该量有效地至少部分减少或抑制A2a受体的活性；或至少部分减少或抑制A2a受体的表达。
如本文所用，术语“受试者”是指动物。优选地，该动物是哺乳动物。受试者也是指例如灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在优选的实施例中，该受试者是人。
如本文所用，术语“抑制(inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病症、症状或障碍、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。
如本文所用，在一个实施例中，术语任何疾病或障碍的“治疗(treating或treatment)”是指减轻疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在仍另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)或在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发病或发展或进展。
如本文所用，术语“一个/种(a，an)”，“该(the)”以及在本发明的上下文中使用的类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数二者，本文中除非另外指示或与上下文明显相矛盾。
在本文所述的所有方法能够以任何合适顺序进行，除非本文另外指示或另外与上下文明显相矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。
本发明的化合物以游离形式、作为其盐、或作为其前药衍生物而获得。
本发明还提供了本发明的化合物的前药，该前药在体内转化成本发明的化合物。前药是活性或无活性化合物，在将前药给予至受试者后，该化合物通过体内生理作用(如水解、代谢等)被化学改性成本发明的化合物。制备和使用前药所涉及的适用性和技术是本领域技术人员所熟知的。前药可以在概念上分为两个非排他性类别：生物前体前药和载体前药。参见The Practice of Medicinal Chemistry，[药物化学实践]，第31-32章(Wermuth编辑，Academic Press[学术出版时]，San Diego[圣地亚哥]，加利福尼亚州，2001)。通常，生物前体前药是与相应的活性药物化合物相比无活性或具有低活性的化合物，这些化合物含有一个或多个保护基团并通过代谢或溶剂分解转化成活性形式。活性药物形式和任何释放的代谢产物二者都应具有可接受的低毒性。
载体前药是含有转运部分(例如改善摄取和/或局部递送至一个或多个作用部位的转运部分)的药物化合物。希望地，对于这种载体前药，药物部分和转运部分之间的连接是共价键，该前药无活性或比药物化合物的活性低，并且任何释放的转运部分都是可接受的无毒的。典型地，对于转运部分是旨在增强摄取的前药，该转运部分的释放应该是快速的。在其他情况下，希望的是使用提供缓慢释放的部分，例如某些聚合物或其他部分，如环糊精。例如，载体前药可用于改善以下特性中的一种或多种：增强的亲脂性、增加的药理作用持续时间、增加的位点特异性、降低的毒性和不良反应、和/或药物配制品的改善(例如，稳定性、水溶解度、抑制不期望的感官或生理化学特性)。例如，亲脂性可以通过(a)羟基基团与亲脂性羧酸(例如，具有至少一个亲脂性部分的羧酸)的酯化来增加。
示例性前药是例如醇或芳基醇的O-酰基衍生物。优选的是可在生理条件下通过溶剂分解转化的药学上可接受的酯衍生物。此外，胺被掩蔽为芳基羰氧基甲基取代的衍生物，这些衍生物在体内被酯酶裂解，从而释放游离药物和甲醛(Bundgaard，J.Med.Chem.[药物化学杂志]2503(1989))。此外，已用N-酰氧基甲基基团将含有酸性NH基团的药物(如咪唑、酰亚胺、吲哚等)掩蔽(Bundgaard，Design of Prodrugs[前药的设计]，Elsevier[爱思唯尔](1985))。将羟基基团掩蔽为酯和醚。EP 039,051(Sloan和Little)披露了曼尼希碱异羟肟酸前药、它们的制备和用途。
此外，本发明的化合物(包括它们的盐)还可以按其水合物形式获得，或包括用于其结晶的其他溶剂。
药物组合物、组合、剂量和给予
在另一方面，本发明提供了包含本发明的化合物和载体(例如，药学上可接受的载体)的药物组合物。药物组合物可以配制用于特定的给予途径，例如经口给予、眼睛给予(例如，局部给予、玻璃体内注射、植入(包括玻璃体内、经巩膜、Tenon囊下等)、储库(depot)等)和肠胃外给予等。此外，本发明的药物组合物可以固体形式(包括胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)、或以液体形式(包括溶液、悬浮液或乳液)制成。可以对药物组合物进行常规的制药操作，例如灭菌和/或可以使其含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲液，以及佐剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲液等)。
典型地，药物组合物是包含活性成分及以下项的片剂或明胶胶囊：
a)稀释剂，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；
b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石、硬酯酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包含
c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果希望
d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或
e)吸附剂、着色剂、调味剂及甜味剂。
片剂可以根据本领域已知的方法添加薄膜包衣或肠溶包衣。
用于经口给予的合适的组合物包括有效量的呈片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂形式的本发明的化合物。旨在用于经口用途的组合物是根据本领域中已知用于制造药物组合物的任何方法制备且此类组合物可含有选自由以下组成的组的一种或多种药剂：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上精致且可口的制剂。片剂含有与适用于制造片剂的非毒性、药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂是(例如)惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂及崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；黏结剂，例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。这些片剂是不添加包衣或通过已知技术添加包衣以延迟在胃肠道中的分解及吸收并且由此提供长期持续作用。例如，可以采用时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用于经口用途的配制品可以呈现为硬质明胶胶囊，其中活性成分是与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软质明胶胶囊，其中活性成分是与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
某些可注射组合物是水性等渗溶液或悬浮液，且栓剂是有利地制备自脂肪乳剂或悬浮液。所述组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液)。此外，它们还可含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法制备，并含有约0.1％-75％，或含有约1％-50％的活性成分。
某些可注射的组合物包括眼部植入物和眼部贮库配制品，它们适用于眼内、眼周、结膜下和/或tenon囊下给予。典型的可注射组合物包含第一至第七十实施例的化合物(与生物相容的或可生物降解的聚合物材料组合)。
本发明进一步提供包含作为活性成分的本发明化合物的无水药物组合物及剂型，因为水可以促进某些化合物的降解。
本发明的无水药物组合物及剂型可以使用无水或低含水量成分及低水分或低湿度条件进行制备。无水药物组合物可以经制备及储存使得保持其无水性质。因此，优选使用已知阻止暴露于水的材料来包装无水组合物，使得它们可以被包括在适合的配制试剂盒中。合适的包装的实例包括但不限于经气密密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装、以及条形包装。
本发明进一步提供包含减小作为活性成分的本发明化合物分解的速率的一种或多种药剂的药物组合物及剂型。此类药剂(本文中称为“稳定剂”)包括但不限于抗氧化剂(如抗坏血酸)、pH缓冲剂、或盐缓冲剂等。
在优选的实施例中，用于在癌症治疗中使用的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或药学上可接受的盐是通过肠胃外或经口途径(优选地，通过经口途径)给予的。
对于约50-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以处于单位剂量为约1-1000mg的一种或多种活性成分，或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg的活性成分。化合物、药物组合物、或其组合的治疗有效剂量取决于该受试者的物种、体重、年龄及治疗中的个别病状、病症或疾病或其严重性。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病进展所必需的每种活性成分的有效量。
使用有利的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)或其分离的器官、组织和制品在体外和体内测试中证明上述剂量特性。本发明的化合物可以溶液的形式(例如，优选地水性溶液)体外给予，及肠内、肠胃外、有利地静脉内，例如，作为悬浮液或在水性溶液中体内给予。体外剂量可以在约10-3摩尔浓度和10-9摩尔浓度之间的范围内。取决于给予途径，体内治疗有效量可以在约0.1-500mg/kg之间，或约1-100mg/kg之间的范围内。
在其他实施例中，提供了药物组合物，其包含根据第一至第七十实施例的至少一种化合物和至少一种载体。
治疗试剂盒
在一个实施例中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含两种或更多种分开的药物组合物，其中至少一种药物组合物含有具有式(I)的化合物。在一个实施例中，该试剂盒包含用于分别保留所述组合物的装置(如容器、分开的瓶子、或分开的箔包装)。这种试剂盒的实例是泡罩包装，如典型地用于片剂、胶囊及类似物的包装。
本发明的试剂盒可以用于给予不同剂型(例如，经口及肠胃外)，用于以不同剂量间隔给予单独组合物或用于相对在彼此滴定单独组合物。为了有助于依从性，本发明的试剂盒典型地包含用于给予的用法说明书。
在本发明的组合疗法中，具有式I的化合物和其他免疫治疗剂可以由相同或不同的制造商制造和/或配制。此外，可以将本发明的化合物和其他治疗剂组合成组合疗法：(i)在将组合产物释放给医师之前(例如，在包含本发明的化合物和其他治疗剂的试剂盒的情况下)；(ii)在给予之前不久，由医师自身(或在医师的指导下)；(iii)例如，在顺序给予本发明的化合物和其他治疗剂的过程中在患者本身中。
因此，本发明提供了1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐用于治疗癌症的用途，其中将药物制备用于与另一种免疫治疗剂一起给予。本发明还提供了免疫治疗剂用于治疗癌症的用途，其中将药物与1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐一起给予。
本发明还提供了1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐，用于在治疗癌症的方法中使用，其中将1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇制备用于与另一种免疫治疗剂一起给予。本发明还提供了另一种免疫治疗剂，用于在治疗癌症的方法中使用，其中将其他免疫治疗剂制备用于与1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇一起给予。本发明还提供了1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇，用于在治疗癌症的方法中使用，其中将1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇与另一种免疫治疗剂一起给予。本发明还提供了另一种免疫治疗剂，用于在治疗癌症的方法中使用，其中将其他治疗剂与1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇一起给予。
本发明还提供了1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇，用于治疗癌症的用途，其中患者先前(例如24小时内)已经用另一种免疫治疗剂进行治疗。本发明还提供了另一种免疫治疗剂用于治疗癌症的用途，其中患者先前(例如24小时内)已经用1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐进行治疗。
组合疗法
在一个实施例中，药物组合(或组合产物)包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶、以及选自由以下组成的组的一种或多种免疫治疗剂：抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗和曲美利木单抗)、抗PD-1抗体(例如MDX-1106(纳武单抗)、MK3475(帕姆单抗)、CT-011(匹地利珠单抗)、AMP-224、AMP-514(MEDI0680英商梅迪缪思有限公司)或如WO2015/112900(US 2015/0210769)所述的抗PD-1抗体分子)；以及抗PD-L1抗体(例如MPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C(Merch Sorono公司)、YW243.55.S70、MDX-1105或US2016/0108123(提交于2015年10月13日，题为“Antibody Molecules to PD-L1 and UsesThereof[PD-L1的抗体分子及其用途]”)中披露的抗PD-L1抗体分子)。
组合产物的组分在相同的配制品中或在单独的配制品中。
在优选的实施例中，组合产物包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶、以及用于治疗癌症(特别地是用于癌症的免疫治疗性治疗)的一种或多种免疫治疗剂，这种药剂选自由以下组成的组：抗PD-1PD-1抗体(例如MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224或如WO 2015/112900(US 2015/0210769)所述的抗PD-1抗体分子)；以及抗PD-L1抗体(例如MPDL3280A、MEDI4736、MDX-1105或US 2016/0108123中披露的抗PD-L1抗体分子)。
抗PD-1抗体分子的实例
在优选的实施例中，组合产物包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶，以及抗PD-1抗体分子(例如本文所述的那些)。
PD-1是CD28/CTLA-4家族成员，其在例如活化的CD4+和CD8+T细胞、Treg、和B细胞上表达。它负调节效应T细胞信号传导和功能。PD-1在肿瘤浸润性T细胞上被诱导，并且可导致功能性衰竭或功能障碍(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年评]26：677-704；Pardoll等人(2012)Nat Rev Cancer[癌症自然评论]12(4)：252-64)。PD-1在与其两种配体(程序性死亡-配体1(PD-L1)或程序性死亡-配体2(PD-L2))之一结合时递送共抑制信号。PD-L1在许多细胞类型(包括T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、B细胞、上皮细胞、血管内皮细胞)以及许多类型的肿瘤上表达。PD-L1在鼠和人肿瘤上的高表达与多种癌症中的不良临床结果相关(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年评]26：677-704；Pardoll等人(2012)Nat Rev Cancer[癌症自然评论]12(4)：252-64)。PD-L2在树突细胞、巨噬细胞和一些肿瘤上表达。已经针对癌症免疫疗法在临床前和临床上验证了阻断PD-1途径。临床前和临床研究都证明，抗PD-1阻断可以恢复效应T细胞的活性，并产生强大的抗肿瘤响应。例如，阻断PD-1途径可以恢复衰竭/功能失调的效应T细胞功能(例如，增殖、IFN-g分泌或细胞溶解功能)和/或抑制Treg细胞功能(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年评]26：677-704；Pardoll等人(2012)Nat Rev Cancer[癌症自然评论]12(4)：252-64)。PD-1途径的阻断可以用抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或PD-1、PD-L1和/或PD-L2的寡肽实现。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子，如题为“Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof[PD-1的抗体分子及其用途]”、提交于2015年7月30日的US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表A(例如，来自表A中披露的BAP049-克隆-E或BAP049-克隆-B的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，CDR根据卡巴特(Kabat)定义(例如，如表A中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚(Chothia)定义(例如，如表A中所列出的)。在一些实施例中，这些CDR根据卡巴特和乔西亚二者的组合CDR定义(例如，如表A中所列出的)。在一个实施例中，VH CDR1的卡巴特和乔西亚CDR的组合包含氨基酸序列GYTFTTYWMH(SEQ ID NO：41)。在一个实施例中，相对于表A中所示的氨基酸序列，或由表A中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列、和SEQID NO：3的VHCDR3氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列、SEQID NO：11的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：12的VLCDR3氨基酸序列，各自披露于表A中。
在一个实施例中，抗体分子包含VH和VL，该VH包含由SEQ ID NO：24的核苷酸序列编码的VHCDR1、由SEQ ID NO：25的核苷酸序列编码的VHCDR2、和由SEQ ID NO：26的核苷酸序列编码的VHCDR3，该VL包含由SEQ ID NO：29的核苷酸序列编码的VLCDR1、由SEQ ID NO：30的核苷酸序列编码的VLCDR2、和由SEQ ID NO：31的核苷酸序列编码的VLCDR3的VL，各自披露于表A中。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VH，该VH包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：6具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VL，该VL包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：20具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VL，该VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：16具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VL和VH，该VL包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，该VH包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VL和VH，该VL包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，该VH包含SEQID NO：16的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体分子包含VH，该VH由SEQ ID NO：7的核苷酸序列，或与SEQID NO：7具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，抗体分子包含VL，该VL由SEQ ID NO：21或17的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：21或17具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列。在一个实施例中，抗体分子包含VL和VH，该VH由SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码，该VL由SEQ ID NO：21或17的核苷酸序列编码。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链，该重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：8具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链，该轻链含有SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或与SEQID NO：22具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链，该轻链含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：18具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体分子包含重链，该重链由SEQ ID NO：9的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：9具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，抗体分子包含轻链，该轻链由SEQ ID NO：23或19的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：23或19具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列。在一个实施例中，抗体分子包含重链和轻链，该重链由SEQ ID NO：9的核苷酸序列编码，该轻链由SEQ ID NO：23或19的核苷酸序列编码。
本文所述的这些抗体分子可以通过运载体、宿主细胞、和在US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的方法制得。
定义
VH和VL区可以细分为被称为“互补决定区”(CDR)的高变区，其间插入被称为“框架区”(FR或FW)的更保守的区域。
框架区和CDR的范围已经通过许多方法精确定义(参见，Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学上感兴趣的蛋白序列]，第五版，U.S.Department of Health and Human Services[美国健康与人类服务部]，NIH公开号91-3242；Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196：901-917；以及由牛津分子AbM抗体建模软件(Oxford Molecular’s AbM antibody modelling software)使用的AbM定义)。通常参见例如Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains.[抗体可变结构域的蛋白序列和结构分析]在Antibody EngineeringLab Manual[抗体工程化实验室手册]中(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag[施普林格出版社]，Heidelberg[海德尔堡])。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任何一种来确定，这些方案包括描述于以下的那些：Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学重要性的蛋白序列]”，第5版，Public HealthService[美国国立卫生研究院]，National Institutes of Health[公共卫生事业部]，Bethesda，MD[马里兰州贝塞斯达市](“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB273，927-948(“乔西亚”编号方案)。如本文所用，根据“乔西亚”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。
例如，根据卡巴特，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据乔西亚，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合卡巴特和乔西亚二者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。
通常，除非特别指示，否则抗PD-1抗体分子可包括例如如表A中所述的一种或多种卡巴特CDR和/或乔西亚CDR的任何组合。在一个实施例中，以下定义用于表A中所述的抗PD-1抗体分子：HCDR1，根据卡巴特和乔西亚二者的组合CDR定义以及HCCDR 2-3和LCCDR 1-3，根据卡巴特的CDR定义。根据所有定义，每个VH和VL典型地包括三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如下所述进行序列之间的同源性或序列同一性(这些术语在本文中可互换地使用)的计算。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，在第一氨基酸和第二氨基酸或第一核酸序列和第二核酸序列的一者或二者中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略)。在优选的实施例中，出于比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％、并且甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。
将空位的数量和每个空位的长度考虑在内，两个序列之间的百分比同一性是这些序列共有的相同位置的数量的函数，需要引入这些空位以进行两个序列的最佳比对。
两个序列之间的序列比较和百分比同一性确定可以使用数学算法来完成。在一个优选的实施例中，使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：444-453)算法(该算法已并入GCG软件包中的GAP程序中(可从www.gcg.com获取))，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。在又另一个优选的实施例中，使用GCG软件包中的GAP程序(可从www.gcg.com获取)，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。一组特别优选的参数(以及除非另外指定否则应该使用的参数)是Blossum 62评分矩阵，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。
可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS[生物科学中的计算机应用]4：11-17)的算法(该算法已并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的百分比同一性。
本文所述的核酸序列和蛋白序列可以用作“查询序列”来对公共数据库进行搜索，从而例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来进行这些搜索。可以用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)来进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25：3389-3402中所述使用空位BLAST(GappedBLAST)。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
表A.示例性抗PD-1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0002165858370000321
/>
Figure BDA0002165858370000331
/>
Figure BDA0002165858370000341
/>
Figure BDA0002165858370000351
/>
Figure BDA0002165858370000361
/>
Figure BDA0002165858370000371
/>
Figure BDA0002165858370000381
其他示例性PD-1抑制剂
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是纳武单抗(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))，也称为MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558、或
Figure BDA0002165858370000391
纳武单抗(克隆5C4)和其他抗PD-1抗体披露于US 8,008,449和WO 2006/121168(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：纳武单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表B中所披露的。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是帕姆单抗(默克公司(Merck&Co))，也称为兰罗利珠单抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475、或
Figure BDA0002165858370000392
帕姆单抗和其他抗PD-1抗体披露于Hamid，O.等人，(2013)New England Journal of Medicine[新英格兰医学期刊]369(2)：134-44；US 8,354,509；和WO 2009/114335(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：帕姆单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表B中所披露的。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是匹地利珠单抗(治疗科技公司(CureTech))，也称为CT-011。匹地利珠单抗和其他抗PD-1抗体披露于Rosenblatt，J.等人，(2011)JImmunotherapy[免疫疗法杂志]34(5)：409-18；US 7,695,715；US 7,332,582；和US 8,686,119(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：匹地利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列，例如，如表B中所披露的。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是MEDI0680(英商梅迪缪思有限公司)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体披露于US 9,205,148和WO 2012/145493(将其通过引用以其全文并入)中。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：MEDI0680的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他已知的抗PD-1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/112800、WO2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731、和US 9,102,727(将其通过引用以其全文并入)。
在一个实施例中，抗PD-1抗体是与本文所述的抗PD-1抗体之一竞争与PD-1上的相同表位结合和/或结合PD-1上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是例如如US 8,907,053(将其通过引用以其全文并入)中所述的抑制PD-1信号传导途径的肽。在一个实施例中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一个实施例中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg(安普利公司(Amplimmun))，例如，披露于WO 2010/027827和WO 2011/066342(将其通过引用以其全文并入)中。
表B.其他示例性抗PD-1抗体分子的氨基酸序列
Figure BDA0002165858370000401
/>
Figure BDA0002165858370000411
抗PD-L1抗体分子的实例
在一个实施例中，组合产物包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶，以及抗PD-L1抗体分子(例如本文所述的那些)。
程序性死亡配体1(PD-L1)被描述为免疫抑制受体程序性死亡配体1(PD-1)的配体。PD-L1与PD-1的结合导致T细胞受体介导的淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的抑制(Freeman等人.(2000)J Exp Med[实验医学杂志]192：1027-34)。因此，阻断PD-L1可以导致抗肿瘤免疫力的增强。
若干种细胞类型表达PD-L1。例如，PD-L1在活化的T细胞、树突细胞(DC)、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和血管内皮细胞上表达。PD-L1在许多癌症(包括人肺癌、卵巢癌和结肠癌以及多种骨髓瘤)中表达(Iwai等人(2002)PNAS[美国国家科学院院刊]99：12293-7；Ohigashi等人(2005)Clin Cancer Res[临床癌症研究]11：2947-53；Okazaki等人(2007)Intern.Immun.[国际免疫学]19：813-24；Thompson等人(2006)Cancer Res.[癌症研究]66：3381-5)。PD-L1表达与多种类型的癌症(包括肾脏癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌)的不利预后密切相关。
与正常组织和外周血T淋巴细胞中的T淋巴细胞相比，许多肿瘤浸润性T淋巴细胞主要表达PD-1。这指示在肿瘤反应性T细胞上的PD-1的上调可导致抗肿瘤免疫响应受损(Ahmadzadeh等人(2009)Blood[血液]114：1537-44)。因此，由表达PD-L1的肿瘤细胞介导的PD-L1信号传导与表达PD-1的T细胞相互作用可导致T细胞活化的减弱和免疫监视的逃避(Sharpe等人(2002)Nat Rev Immunol.[自然综述免疫学]2：116-26；Keir等人(2008)AnnuRev Immunol.[免疫学年度评论]26：677-704)。PD-1阻断可通过增强效应T细胞的募集来抑制低免疫原性肿瘤细胞的血源性扩散(Iwai等人(2005)Int.Immunol.[国际免疫学]17：133-144)。
抗PD-L1可以增强T细胞免疫，例如通过阻断其与PD-1和B7-1的抑制性相互作用。抗PD-1还可以经由PD-L2/PD-1进行免疫调节。PD-1和B7-1均在T细胞、B细胞、DC和巨噬细胞上表达，这为这些细胞类型上的B7-1和PD-L1之间的双向相互作用提供了可能性。非造血细胞上的PD-L1可以与B细胞上的B7-1以及PD-1相互作用。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体分子选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、或MDX-1105。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体是MSB0010718C。MSB0010718C(也称为A09-246-2；默克雪兰诺公司)是结合PD-L1的单克隆抗体。MSB0010718C和其他人源化抗PD-L1抗体在WO2013/079174中披露，并且具有本文披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。MSB0010718C的重链和轻链氨基酸序列包括至少以下：
重链(如WO 2013/079174中所披露的SEQ ID NO：24)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：42)
轻链(如WO 2013/079174中所披露的SEQ ID NO：25)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO：43)
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体是描述于WO2010/077634(分别在SEQ ID NO：20和21中显示的重链和轻链可变区序列)中并且具有其中披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)的抗PD-L1。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是MDX-1105。MDX-1105(也称为BMS-936559)是描述于WO 2007/005874中并且具有其中披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)的抗PD-L1抗体。
在一个实施例中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(基因秦克公司/罗氏公司(Genentech/Roche))。MDPL3280A是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906中。
在另一个实施例中，PD-L1抑制剂是US 2016/0108123(提交于2015年10月13日，题为“Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof[PD-L1的抗体分子及其用途]”)(将其通过引用以其全文并入)中披露的抗PD-L1抗体分子。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包含恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包含恒定区)、或二者，其包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N、或BAP058-克隆-O中任一项的氨基酸序列；或者如US 2016/0108123的表1所述的氨基酸序列，或由表1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子来自包含本文所述的抗体(例如，选自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N、或BAP058-克隆-O中任一项的抗体)的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)；或者如US 2016/0108123的表1所述，或者由US 2016/0108123的表1中的核苷酸序列编码，或者与前述序列中任一项基本上相同(例如具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。
在又一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体上全部CDR)，该重链可变区包含如US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列或由US 2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由US 2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体上全部CDR)，该轻链可变区包含如US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由US 2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗PD-L1抗体分子包括轻链CDR中的取代，例如轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在另一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表1中所示的氨基酸序列，或由US 2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施例中，相对于US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由US 2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N、或BAP058-克隆-O中任一项的抗体)的重链可变区的根据卡巴特和乔西亚定义的至少一个、两个或三个CDR或高变环(例如，根据如US 2016/0108123的表1中所列出的卡巴特和乔西亚定义的至少一个、两个或三个CDR或高变环)；或者由US 2016/0108123的表1中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列；或者相对于US 2016/0108123的表1中所示的根据卡巴特和/或乔西亚的一个、两个、或三个CDR或高变环具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子可以包含VH CDR1(根据Kabat等人.(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学重要性的蛋白序列]”第5版Public Health Service[美国国立卫生研究院]，National Institutes of Health[公共卫生事业部]，Bethesda，MD[马里兰州贝塞斯达市])或VH高变环1(Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227：799-817)，或其组合(例如，如US 2016/0108123的表1中所示)。在一个实施例中，VH CDR1的卡巴特和乔西亚CDR的组合包含氨基酸序列GYTFTSYWMY(SEQ ID NO：63)，或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，取代、缺失或插入，如保守取代))。抗PD-L1抗体分子可以进一步包含例如根据Kabat等人的VH CDR 2-3和根据Kabat等人的VL CDR 1-3，例如，如US 2016/0108123的表1中所示。
在优选的实施例中，用于在本发明中使用的抗PD-L1抗体分子包含：
(a)重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQ ID NO：47的VHCDR1氨基酸序列、SEQID NO：48的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQ ID NO：52的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：53的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：54的VLCDR3氨基酸序列；
(b)VH，该VH包含SEQ ID NO：44的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：45的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：49的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：50的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：51的VLCDR3氨基酸序列；
(c)VH，该VH包含SEQ ID NO：63的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：48的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：52的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：53的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：54的VLCDR3氨基酸序列；或
(d)VH，该VH包含SEQ ID NO：63的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：45的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：46的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO：52的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：53的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO：54的VLCDR3氨基酸序列。
在前述实施例的一个方面，用于在本发明中使用的抗PD-L1抗体分子包含重链可变结构域和轻链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
在前述实施例的一个方面，用于在本发明中使用的抗PD-L1抗体分子包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。
表C.人源化抗PD-L1 mAb BAP058-hum013的氨基酸和核甘酸序列。显示了重链和轻链CDR、重链和轻链可变区以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
Figure BDA0002165858370000481
/>
Figure BDA0002165858370000491
/>
Figure BDA0002165858370000501
免疫治疗剂的剂量和给予。
免疫治疗剂(例如抗PD-1抗体分子或抗PD-L1分子抗体)能以全身方式(例如口服、肠胃外、皮下、静脉内、直肠、肌肉内、腹膜内、鼻内、透皮、或通过吸入或腔内装置)、局部方式或通过应用于粘膜(如鼻子、喉咙和支气管)向该受试者给予。
免疫治疗剂(例如抗PD-1抗体分子或抗PD-L1抗体分子)的剂量和治疗方案可以由技术人员确定。在某些实施例中，将免疫治疗剂(例如抗PD-1抗体分子)通过注射(例如皮下或静脉内)以约1mg/kg至30mg/kg，例如约5mg/kg至25mg/kg、约10mg/kg至20mg/kg、约1至5mg/kg、或约3mg/kg的剂量给予。给药日程表可以从例如每周一次至每2、3、或4周一次变化。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约10mg/kg至20mg/kg的剂量给予，每两周一次。在另一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约1mg/Kg至10mg/Kg或从约1mg/Kg至5mg/Kg或约3mg/kg的剂量给予，每4周一次。
例如，将抗PD-1抗体分子以平稳或固定剂量给予或使用。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg、或约300mg、或约400mg的剂量(例如平坦剂量)给予。给药日程表(例如，平坦给药日程表)可以从例如每周一次到每2、3、4、5或6周一次变化。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约300mg至400mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每三周一次。
在另一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约300mg至400mg的平坦剂量给予，每三周一次或每四周一次。在该实施例的子集中，将抗PD-1抗体分子以约400mg的平坦剂量给予，每四周一次。在该实施例的又另一个子集中，将抗PD-1抗体分子以约300mg的平坦剂量给予，每三周一次。
实例
以下实例旨在说明本发明，而不应被解释为对其的限制。温度以摄氏度给出。如果没有另外提及，所有蒸发都在减压下进行，优选地在约15mm Hg与100mm Hg(＝20-133mbar)之间。最终产物、中间体和起始材料的结构通过标准分析方法(例如，微量分析和光谱特征(例如，MS、IR、NMR))确认。使用的缩写是本领域常规的缩写。
用于合成本发明的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购获得的或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法制备(Houben-Weyl第4版1952，Methods of Organic Synthesis[有机合成方法]，Thieme[蒂梅出版社]，第21卷)。此外，本发明的化合物可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法制备，如以下实例所示。
本发明通过以下实例进行说明，但这些实例决不限制本发明。
缩写
ACN 乙腈
aq 水性
br 宽
BSA 牛血清白蛋白
CPBA： 3-氯过氧苯甲酸
d 双峰
dd 双重双峰
DCM 二氯甲烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EtOAc 乙酸乙酯
g 克
h 小时
HPLC 高效液相色谱法
IS 内标
LCMS 液相色谱法与质谱法联用
M 摩尔
m 多重峰
MeOH 甲醇
min 分钟
mL 毫升
mmol 毫摩尔
MS 质谱法
m/z 质荷比
NADPH β-烟酰胺二核苷酸磷酸盐，还原型
NMR 核磁共振
ppm 百万分率
rt 室温
Rt 保留时间
s 单峰
sat 饱和的
t 三重峰
THF 四氢呋喃
UPLC方法：
UPLC 2min：Waters UPLC Acquity；柱：Acquity HSS T3，1.8mm，2.1*50mm，在60℃，洗脱液A：水+0.05％HCOOH+3.75mM乙酸铵，B：ACN+0.04％HCOOH，梯度：5％至98％B，在1.4min内，流速：1.0mL/min。
UPLC 10min：Waters UPLC Acquity；柱：Acquity HSS T3，1.8mm，2.1*50mm，在60℃，洗脱液A：水+0.05％HCOOH+3.75mM乙酸铵，B：ACN+0.04％HCOOH，梯度：5％至98％B，在9.4min内保持0.4min，流速：1mL/min)。
实例1：1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的制备
Figure BDA0002165858370000541
5-溴-6-氯-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺
向6-氯-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺(15.0g，85mmol)在DMF(150ml)中的冷却的溶液里分批添加N-溴代丁二酰亚胺(16.7g，94mmol)，伴随在0℃的搅拌。10min后，将反应通过在0℃添加水进行猝灭。将反应混合物用盐水稀释并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用饱和NaHCO3水溶液、然后用盐水洗涤两次，分离，并通过含有Na2SO4的相分离器过滤至干燥。将滤液在真空中浓缩，以给出呈无色固体的标题化合物(18.8g，74mmol，80％产率，92％纯度)，将其不经进一步纯化而用于下一步骤。M/z＝254/256/258[M+H]+，Rt＝0.95min(UPLC2min)，1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.03(br s，1H)，7.25(br s，1H)，2.42(s，3H)。
5-溴-2-(甲硫基)-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺
将5-溴-6-氯-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺(17.8g，70mmol)、1H-吡唑(4.7g，69mmol)和KOtBu(7.9g，70mmol)在DMF(250mL)中的混合物在60℃搅拌16小时。将溶剂在真空中浓缩，并将残余物用饱和的NaHCO3水溶液稀释并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，分离，并通过含有Na2SO4的相分离器过滤至干燥。将滤液在真空中浓缩，以给出标题化合物(20g，64％纯度)，将其不经进一步纯化而用于下一步骤。M/z＝286/288/290[M+H]+，Rt＝0.85min(UPLC 2min)，1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.35(d，J＝2.5Hz，1H)，8.03(br s，1H)，7.81(br s，1H)，7.26(br s，1H)，6.55(s，1H)，2.46(s，3H)。
5-溴-2-(甲基亚磺酰基)-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺
向5-溴-2-(甲硫基)-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺(20g，64％纯度)在DCM(100mL)中的悬浮液里逐滴添加3-氯过氧苯甲酸(9.3g，53.7mmol)在DCM(100mL)中的溶液，伴随经20min在0℃的搅拌，并将所得混合物在23℃搅拌16小时。将反应混合物过滤以收集沉淀并用DCM洗涤。将固体在真空中干燥以给出呈无色固体的标题化合物(2.4g，7.6mmol，11％产率，经两个步骤)。M/z＝302/304[M+H]+，Rt＝0.53min(UPLC 2min)，1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.63(br s，1H)，8.38(d，J＝2.3Hz，1H)，7.87(s，1H)，7.72(s，1H)，6.60-6.61(m，1H)，2.86(s，3H)。
(1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)硼酸
在0℃，向5-溴-2-(甲基亚磺酰基)-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺(50mg，0.17mmol)和(1H-吡唑-4-基)硼酸(18mg，0.17mmol)在DMF(1ml)中的混合物里添加Cs2CO3(54mg，0.17mmol)。将所得混合物在23℃搅拌1小时。将反应混合物用水稀释并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用水、然后用盐水洗涤，分离，并通过含有Na2SO4的相分离器过滤至干燥。将滤液在真空中浓缩，以给出标题化合物(30mg，0.066mmol，40％产率)，将其不经进一步纯化而用于下一步骤。M/z＝350/352[M+H]+，Rt＝0.55min(UPLC 2min)。
1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇
在0℃，向(1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)硼酸(30mg，0.066mmol)在THF(1mL)中的剧烈搅拌的溶液里添加25wt％NaOH水溶液(0.021mL，0.13mmol)和30％H2O2水溶液(0.020mL，0.20mmol)。30分钟后，再添加30％H2O2水溶液(0.020mL，0.20mmol)，并将混合物在相同温度总共搅拌2.5小时。将反应用饱和的NH4Cl水溶液猝灭，然后用水稀释，并且用DCM萃取4次并用DCM/MeOH(4/1混合物)萃取3次。将合并的有机相通过相分离器过滤至干燥，并将滤液在真空中浓缩。将粗产物吸收在isolute上并且通过柱色谱法(ISCO，12g-二氧化硅-redisep-柱，流速：30ml/min，溶剂：CH2Cl2∶MeOH(从1∶0保持3min，然后经25min至96∶4)纯化。将产物级分合并、并在真空中浓缩，以给出呈无色固体的标题化合物(14mg，0.040mmol，60％产率)。M/z＝322/324[M+H]+，Rt＝0.58min(UPLC2min)；Rt＝2.27min；在254nm纯度：＞95％(UPLC 10min)，1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ9.23(br s，1H)，8.44(d，J＝2.5Hz，1H)，8.32(br s，1H)，7.94(s，1H)，7.90-7.81(m，1H)，7.46(br s，2H)，6.63-6.50(m，1H)。
可替代的，6-氯-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺可在碱的存在下首先与吡唑反应，以生成2-(甲硫基)-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；随后用NBS处理，以生成5-溴-2-(甲硫基)-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺。
实例1A：1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇的制备
Figure BDA0002165858370000561
5-溴-6-氯-2-(甲基亚磺酰基)嘧啶-4-胺
向5-溴-6-氯-2-(甲硫基)嘧啶-4-胺(13g，52mmol)在450ml DCM中的溶液里缓慢逐滴添加溶解于100ml的DCM中的13g(57mmol)间-氯过苯甲酸(77％)(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))。将溶液在室温搅拌1小时。将形成的白色沉淀过滤，用DCM洗涤若干次并干燥。得到14g(99％)的标题化合物。M/z＝270/272[M+H]+，Rt＝0.56min(UPLC 2min)，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.17(d，2H)，2.78(s，3H)。
5-溴-6-氯-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺
将2g(7.4mmol)的5-溴-6-氯-2-(甲基亚磺酰基)嘧啶-4-胺悬浮在30ml的DMF中。向该悬浮液中添加0.5g(7.4mmol)的1H-吡唑和1.5g(4.4mmol)的碳酸铯。将反应混合物在室温强烈搅拌10min。将溶液倾倒入200ml冷水中。将形成的沉淀过滤、用冷水洗涤并干燥。获得呈白色固体的所希望的产物(1.5g，72％)。M/z＝274/276[M+H]+，Rt＝0.80min(UPLC2min)，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.44(d，1H)，8.15(d，2H)，7.81(d，1H)，6.56(dd，1H)。
(1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)硼酸
将0.10g(0.36mmol)的5-溴-6-氯-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺、0.14g(0.73mmol)的4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑和0.12g(0.36mmol)的碳酸铯在10ml乙腈中的混合物在60℃在密封的玻璃管中搅拌4h。然后将溶剂通过减压除去。将得到的固体用乙醚/戊烷洗涤并干燥。将硼酸和硼酸酯的混合物不经进一步纯化而用于下一步骤。
1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇
向(1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-基)硼酸或5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)-6-(4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺在THF(2.5ml)(冷却至0℃)中的溶液里添加2ml的NaOH 1N和H2O2(30％)(0.23ml，2.32mmol)。将混合物在室温搅拌30min。将反应通过添加1N HCl酸化至pH 3-4，用乙酸乙酯萃取，并经无水Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱法(使用DCM-MeOH(2％-5％))纯化。M/z＝322/324[M+H]+，Rt＝0.58min(UPLC 2min)；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ9.18(br s，1H)，8.57-8.78(m，1H)，8.29(br s，1H)，7.97(s，1H)，7.79(s，1H)，7.54(s，1H)，7.40(br s，1H)，6.55(s，1H)。
实例2-5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺的代谢物的分离/表征：使用液相 色谱法和质谱法在大鼠、狗和人微粒体中进行体外代谢物鉴定
缩写：
ACN：乙腈
CC：校准曲线
IS：内标
DMSO：二甲亚砜
MRM：多重反应监测
NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(还原的)
Rpm：每分钟转数
肝微粒体
大鼠肝微粒体(雄性，合并的，斯普拉格-杜勒(Sprague Dawley))
来源：氙科技有限公司(XenoTech，LLC)(美国堪萨斯州(Kansas))
蛋白含量：20mg/mL
目录号：R I 000，批号：0710623
狗肝微粒体(雄性，合并的，米格鲁(Beagle))
来源：氙科技有限公司(XenoTech，LLC)(美国堪萨斯州(Kansas))
蛋白含量：20mg/mL
目录号：D I 000，批号：0810143
人肝微粒体(混合性别，合并的)
来源：氙科技有限公司(XenoTech，LLC)(美国堪萨斯州(Kansas))
蛋白含量：20mg/mL
目录号：H061 0，批号：101042
储备溶液和试剂
测试项目
在DMSO中制备5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的2mM和0.2mM储备溶液用于体外孵育。肝微粒体孵育中的最终有机物含量为0.5％。
分别在DMSO中制备1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-4-基)-1H-吡唑-6-醇的2.5mM储备溶液。将储备溶液进一步稀释于乙腈中，以获得1uM浓度的1-(6-氨基-2-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-4-基)-1H-吡唑-6-醇，用于色谱法运行。
在DMSO中制备双氯芬酸和维拉帕米的0.1mM储备溶液用于体外孵育。肝微粒体孵育中的最终有机物含量为0.5％。
体外微粒体孵育
将肝微粒体蛋白(对于0.5mg/mL为25uL；对于0.3mg/mL为15uL)、NADPH(100uL，2mM最终浓度)和磷酸盐缓冲液(对于0.5mg/mL为870uL；对于0.3mg/mL为880uL)在定轨振荡孵育器中的微量离心管中孵育10min(维持在37℃)。通过掺入5uL的2mM和0.2mM 5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(10uM最终浓度0.5mg/mL蛋白；1uM最终浓度0.3mg/mL蛋白；0.5％最终DMSO浓度)和样品(在37℃孵育)来引发反应。在0、60和120分钟从反应管中取出等分试样(200uL)并通过添加100uL乙腈猝灭反应。将反应以一式两份进行。将猝灭的样品以14000rpm(大约21000g)离心10分钟(埃彭道夫(Eppendorf)离心机5810R)，并通过LCMS/MS分析上清液。
对于每个物种，以单线态进行对照孵育(未添加NADPH)和空白孵育(未添加测试项目)。将这些样品在0和120min取出并使用乙腈猝灭。分析上清液的任何非微粒体降解和基质干扰。将大鼠和人肝微粒体中的双氯芬酸和狗肝微粒体中的维拉帕米用作阳性对照。反应和对照实验以单线态进行。双氯芬酸和维拉帕米代谢转换数据与内部历史数据相匹配。
分析方法和仪器条件
将样品使用蛋白沉淀法处理，然后通过采用线性梯度(在HPLC中联合串联质谱法(API 4000质谱仪)，运行时间为28min)进行分析。每个样品分别针对Q1(MH+/MH-)和MS/MS进行注射和扫描。
在使用无空白样品的测试项目评估基质干扰后，在Q1扫描中鉴定出不同的可能代谢物峰，并将其根据裂解规律(MSIMS扫描)进行确认。分析方法的概述呈现在表9中。
表9：色谱和质谱条件
Figure BDA0002165858370000601
改进的分析方法：
还开发了另一种分析方法，以增加保留时间并评估除已鉴定的M-1代谢物之外的其他代谢物。
将1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇(1uM)的水溶液用体外培养的样品进行共色谱分离(采用改进的分析方法以确认同一性)。改进的分析方法的概述呈现在表10中。
表10：改进的色谱和质谱条件
Figure BDA0002165858370000611
人肝微粒体中的质量平衡确定
将5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的储备溶液在DMSO中连续稀释，以分别获得1、0.5和0.25mM以及0.5、0.25和0.125mM的加标溶液浓度。
通过将5uL对应的加标溶液掺入到995uL的孵育缓冲液中制备5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的校准标准品，以获得10、5、2.5和1.25uM样品(针对5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺)和5、2.5、1.25和0.625uM样品(针对1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇)。
将200uL5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺和1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇的这些加标样品的等分试样用100uL的乙腈稀释。将这些样品的等分试样(25uL)进一步用100uL的内标(氟哌啶醇，1ug/mL，于乙腈中)稀释。
还通过添加25uL含有100uL内标的猝灭样品制备与校准标准品类似的孵育样品。
然后将孵育样品针对5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇独立地定量(以MRM模式)，并且方法细节呈现在表11中。
表11：色谱和质谱条件-MRM分析
Figure BDA0002165858370000621
结果
评估体外样品中代谢物的存在。具有裂解规律的可能的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺代谢物在不同保留时间的MH+(Q I)和产物离子(MS/MS)呈现在表1和下文中。
表1：母体(5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺)及其代谢物的裂解规律
Figure BDA0002165858370000631
/>
Figure BDA0002165858370000632
M-I(RT 6.2min，R1是H，R2是OH；R2是OH，R1是H)
在不同物种中检测到的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的这些推定代谢物的概述呈现在表2中。
表2：检测到的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺代谢物的概述
Figure BDA0002165858370000633
X指示存在
微粒体样品中母体及其代谢物的相对丰度呈现在表3中。
表3：使用MRM分析在肝脏微生物体中检测到的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(10uM)及其代谢物的相对丰度
Figure BDA0002165858370000634
Figure BDA0002165858370000641
母体是5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺
ND：未检测到；母体及其代谢物的相对丰度是定量值；通过考虑母体及其代谢物的电离效率相似来计算；*剩余值％大于100％被认为是100用于计算。
水性标准品和选定的微粒体样品的提取离子色谱图(XIC)、Q1和MS/MS谱呈现在图1至图3中。
在大鼠、狗和人肝微粒体中产生单加氧化代谢物(M-I，6.22min)。代谢物相对于母体(5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺)的百分比均匀地低。然而，该分析假设代谢物和母体化合物二者的电离效率相等(表3)。
独立地，对肝微粒体(0.3mg/mL蛋白浓度)中5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(1uM)、双氯芬酸(人和大鼠的阳性对照，0.5uM)、维拉帕米(狗的阳性对照，0.5uM)的时间依赖性损失进行了研究。结果呈现在表4和表5中。
表4：在人、狗和大鼠肝微粒体中孵育5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺(1uM)的时间依赖性损失(0.3mg/mL)
Figure BDA0002165858370000642
Figure BDA0002165858370000651
母体化合物是5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺
剩余值％大于100％被认为是100用于计算。
表5：肝微粒体中阳性对照(0.5uM)孵育的时间依赖性损失(0.3mg/mL)
Figure BDA0002165858370000652
发现5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的对照孵育(无NADPH添加)至120min是稳定的，这指示没有非CYP介导的代谢。空白孵育(未添加测试项目)未显示任何基质干扰(表4)。
在测试的物种中，在1uM浓度和0.3mg/mL微粒体蛋白浓度下的5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的相对代谢为DLM＞HLM＞RLM。结果呈现在表6中。
表6：不同物种中5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的相对代谢
Figure BDA0002165858370000653
*通过使用以下公式计算代谢的分析物的浓度(uM)：
代谢的分析物的浓度＝(在120min时代谢％X母体化合物的最终浓度)/100。
母体化合物是5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺
合成1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇。这些化合物的结构在下文中呈现。
Figure BDA0002165858370000661
然后通过与化合物(1-(6-氨基-5-溴-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-基)-1H-吡唑-4-醇和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇)的共色谱法(通过在Q1模式下监测)确定在人微粒体孵育样品中检测到的代谢物的身份。共色谱结果证实在微粒体样品中检测到的代谢物(M-I)的身份为1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇。色谱图呈现在图4中。
使用4点校准曲线标准，以MRM模式在孵育的人肝微粒体样品中对5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺及其代谢物(M-I，1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇)进行定量。与母体孵育60分钟后，人肝微粒体中M-I代谢物的百分比约为15％-20％。对于人肝微粒体中的代谢，实现了约95％至107％的质量平衡。结果呈现在表7中。5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的校准曲线概述呈现在表8中。
表7：人肝微粒体中5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺代谢的质量平衡(使用MRM分析)
Figure BDA0002165858370000662
Figure BDA0002165858370000671
A值在ULOQ的20％+/-范围内(量化的上限)
表8：人肝微粒体中5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺和1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的校准曲线概述
Figure BDA0002165858370000672
在人肝微粒体中形成的M-I代谢物占母体的15％-20％。在大鼠和狗中形成的M-I代谢物不是定量确定的，并且因此该代谢物的形成可能高于或低于人肝微粒体。
总之，5-溴-2，6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺在体外的测试的临床前物种和人微粒体中通过氧化途径代谢，并且通过色谱确认，检测到的代谢物与1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇相同。
实例3：体外hA2A放射性配体结合测定
使用[3H]-ZM241385(ARC，目录号ART0884)作为放射性配体，并使用50mM Tris(pH7.5)、1mM MgCl2、0.1mg/ml BSA、0.2U/ml腺苷脱氨酶作为测定缓冲液从稳定表达人腺苷A2A受体(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)RBHA2AM400UA)的HEK-293细胞制备的膜，通过放射性配体结合(RLB)竞争测定法来确定化合物结合亲和力。在与放射性配体(2nM 3H-ZM241385，0.5ug/孔hA2A膜，50ug/孔YSI WGA，最终浓度)和浓度范围的测试化合物(0.3％DMSO最终浓度)(最终体积为100uL)平衡之前，将膜预先偶联至硅酸钇(YSI)小麦胚凝集素(WGA)SPA珠(珀金埃尔默公司RPNQ0023)。通过10μM XAC确定非特异性结合(NSB)。使用白色384孔测定板(葛莱娜公司(Greiner)号781207)。将测定板在室温孵育直至平衡(1.5小时)，然后离心并在β闪烁计数器(TopCountNXT)中计数，其中将测量值记录为每分钟计数(CPM)。使用以下等式将CPM转换为抑制百分比：
Figure BDA0002165858370000681
其中总结合(TB)是不存在竞争化合物情况下的结合。
使用郑-普鲁萨福方程(Cheng-Prusoff equation)将从浓度响应曲线获得的IC50转换为抑制常数(Ki)。
表11.实例1的h A2A Ki值
实例 h A2A Ki(nM)
1 50
Figure IDA0002165858420000011
Figure IDA0002165858420000021
Figure IDA0002165858420000031
Figure IDA0002165858420000041
Figure IDA0002165858420000051
Figure IDA0002165858420000061
Figure IDA0002165858420000071
Figure IDA0002165858420000081
Figure IDA0002165858420000091
Figure IDA0002165858420000101
Figure IDA0002165858420000111
Figure IDA0002165858420000121
Figure IDA0002165858420000131
Figure IDA0002165858420000141
Figure IDA0002165858420000151
Figure IDA0002165858420000161
Figure IDA0002165858420000171
Figure IDA0002165858420000181
Figure IDA0002165858420000191
Figure IDA0002165858420000201
Figure IDA0002165858420000211
Figure IDA0002165858420000221
Figure IDA0002165858420000231
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Figure IDA0002165858420000251
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Claims (26)

1.一种5-溴-2,6-二(1H-吡唑-1-基)并嘧啶-4-胺的代谢物，该代谢物是如下化合物1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇：
Figure FDA0004189339740000011
或其药学上可接受的盐。
2.化合物1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇，其处于分离的形式。
3.一种药物组合物，该药物组合物包含1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
4.一种组合，该组合包含治疗有效量的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐、以及一种或多种免疫治疗剂。
5.根据权利要求1或2所述的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐在制备用于治疗需要这种治疗的受试者的癌症的药物中的用途。
6.1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或其药学上可接受的盐与一种或多种免疫治疗剂的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
7.根据权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
8.根据权利要求1或2所述的1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇或根据权利要求3所述的药物组合物在制备用于抑制受试者的腺苷A2a受体的药物中的用途。
9.根据权利要求5-7任一项所述的用途，其中该癌症选自肺癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、肛门癌、胃食管癌、甲状腺癌、宫颈癌、淋巴细胞增生性疾病或血液学癌症、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、或白血病。
10.根据权利要求5-7任一项所述的用途，其中该癌症是非小细胞肺癌。
11.根据权利要求6所述的用途，其中一种或多种免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
12.根据权利要求6所述的用途，其中该免疫治疗剂选自由以下组成的组：伊匹单抗、曲美利木单抗、纳武单抗、帕姆单抗、匹地利珠单抗、AMP-224、AMP-514、MPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C、YW243.55.S70和MDX-1105。
13.根据权利要求6所述的用途，其中该免疫治疗剂是抗PD-1抗体。
14.根据权利要求13所述的用途，其中该抗PD-1抗体包含：
(a)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
(b)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
(c)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或
(d)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示；VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
15.根据权利要求13所述的用途，其中该抗PD-1包含重链可变区VH和轻链可变区VL，该重链可变区VH包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，该轻链可变区VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
16.根据权利要求13所述的用途，其中该抗PD-1抗体包含重链和轻链，该重链包含SEQID NO:8的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
17.根据权利要求13所述的用途，其中该抗PD-1抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，该重链可变区VH包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，该轻链可变区VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
18.根据权利要求13所述的用途，其中该抗PD-1抗体包含重链和轻链，该重链包含SEQID NO:8的氨基酸序列，该轻链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
19.根据权利要求13所述的用途，其中将该抗PD-1抗体分子以300mg的剂量给予，每三周一次。
20.根据权利要求13所述的用途，其中将该抗PD-1抗体分子以400mg的剂量给予，每四周一次。
21.根据权利要求6所述的用途，其中该免疫治疗剂是抗PD-L1抗体。
22.根据权利要求21所述的用途，其中该抗PD-L1抗体分子包含:
(a)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示、和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示；
(b)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示；
(c)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示、VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示、和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示；或
(d)重链可变区VH，其中VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示；VHCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；和VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；以及轻链可变区VL，其中VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示、VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示、和VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示。
23.根据权利要求21所述的用途，其中该抗PD-L1抗体分子包含重链可变结构域和轻链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
24.根据权利要求11-23中任一项所述的用途，其中将免疫治疗剂以单一组合物一起给予、或以两种或更多种不同的组合物形式分开给予。
25.根据权利要求11-23中任一项所述的用途，其中将该免疫治疗剂与该化合物：1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇并行、在其之前或之后给予。
26.一种如下制备1-(4-氨基-5-溴-6-(1H-吡唑-1-基)-嘧啶-2-基)-1H-吡唑-4-醇的方法：
Figure FDA0004189339740000041
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